エリスロポエチン低応答性貧血を治療する方法
本発明は、貧血を治療するためのＥＰＯ模倣ペプチドを含む組成物を使用する方法に関する。本発明は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）による血液中の赤血球及びヘモグロブリンの不十分な量によってか、又はアルファ若しくはベータサラセミア、又は鎌状赤血球病等の異常ヘモグロビン症に特徴がある疾患を治療する方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００８年１月７日に出願された米国出願第６１／０１９，３６７号に対する優先権を請求し、この内容は、参照することにより、その全体として本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、ＥＰＯ模倣ペプチド組成物を使用して、遺伝的病因とされる貧血、及び慢性疾患に続発するそれらを治療する方法を提供する。本発明は、特に、貧血が組み換えヒトエリスロポエチンに対して低応答性である状態での貧血の治療を意図する。
【背景技術】
【０００３】
（関連技術の説明）
貧血は、複数の病因を有し、食物摂取不足、例えば、鉄、又は先天性異常によって引き起こされ得るか、又は慢性腎疾患、癌、若しくはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症等の他の病理に関連し得る。同様に、貧血は、末期腎疾患、癌、又はＨＩＶ感染症を伴う患者において罹患率及び死亡率の増加に関連する。貧血のそれぞれの場合のための最も適切な治療を特定することは、貧血の病因、及び存在する場合は原因となる医学的状態の理解を必要とする。慢性腎疾患を伴う貧血は、ホルモン、エリスロポエチンを含む天然赤血球生成の低下による。巨赤芽球性貧血等の他の例では、不十分な赤血球生成は、ビタミン、又は葉酸欠乏症による。貧血の多様な提示は、同等に多様な薬理学的及び支持的治療法を必要とする。
【０００４】
自然発生のエリスロポエチン（ＥＰＯ）は、赤血球の産生（赤血球生成）を仲介する主要成長因子である糖タンパク質ホルモンである。赤血球生成の刺激により作用する現在承認されている製品としては、組み換えヒトエリスロポエチン（ＥＰＲＥＸ（商標）、ＰＲＯＣＲＩＴ（商標）、エポチンアルファ、Ｎｅｏｒｅｃｏｒｍｏｎ（商標）、エポチンベータ）、及びダルベポエチンアルファ（エリスロポエチンの高度にグリコシル化された変異型である組み換え技術によって産生されたタンパク質）を含む製品を含む。これら、いわゆる赤血球生成促進剤（ＥＳＡ）は、癌化学療法及び慢性腎疾患（ＣＫＤ）に続発する貧血における輸血を回避するために承認される。赤血球生成を刺激するための多数の他の組成物が、探求されている。ＥＳＡは、エリスロポエチン受容体（ＥＰＯ−Ｒ）、例えば、ＥＭＰ−１及び変異型（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８及びＷｒｉｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６）、及びＰＥＧ化された合成ペプチド由来の作成物（Ｆａｎ ｅｔ ａｌ ２００６、米国特許第６７０３４８０号、同第７０８４２４５号）に結合し、それを活性化する組成物のためのペプチドライブラリのスクリーニングによって特定されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
癌化学療法及びＣＫＤにおいて、ＥＳＡを投与する論理的根拠は、成熟赤血球を維持又は補充するために、損失したか、又は不十分なレベルで存在する内因性エリスロポエチンの交換又は補給である。しかしながら、恐らく癌化学療法患者の５０％以上は、毎週４００，０００単位の承認されているＥＳＡ、エリスロポエチン、及び２週間おきの２００マイクログラムのダルベポエチンの従来の投与量に対して十分に応答できず（Ｖａｓｕ ｅｔ ａｌ．，２００６）、ＣＫＤ患者の１５％が、制限された利益しか得ていない（Ｒｏｓｓｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００７）。承認されているＥＳＡは、異常ヘモグロビン症、例えば、ベータサラセミア（Ｍａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００１及びＫｏｈｌｉ−Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，２００２）、鎌状赤血球貧血（Ｒｏｄｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３）において、及び骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）（Ｍｕｎｄｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００６及びＭｕｓｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００６）において「認可されてない」状態でも使用されている。これらの病状において、貧血は、赤血球産生欠損又は短い赤血球寿命から生じ、承認されているＥＳＡは、制限された治療的成功を有している。したがって、より予測可能な応答性を提供し、ＥＰＯ又はＥＰＯ由来のＥＳＡに対して耐性又は低応答性である貧血における治療的有効性を提供するＥＳＡの必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
異常ヘモグロビン症又は骨髄異形成によって引き起こされる貧血として特徴付けられる低血中ヘモグロビン値又は血中の赤血球の低レベルに特徴がある疾患を有する対象を治療する方法であって、方法は、患者の造血組織を、二量体ポリペプチドを含む化合物の治療的有効量に接触させるステップを含み、各ポリペプチドは、エリスロポエチン模倣ペプチド（ＥＭＰ）及びヒト免疫グロブリンドメインを含み、二量体ポリペプチド組成物は、エリスロポエチン依存性細胞を増殖させることが可能である、方法。本発明の特定の実施形態では、異常ヘモグロビン症は、鎌状赤血球病を有するか、又はＨｇｂＳを発現する対象、又はベータサラセミアを有する対象によって引き起こされる。別の実施形態では、患者は、貧血につながる骨髄異形成を引き起こす腎臓の慢性疾患を患っている。更に別の実施形態では、患者は、貧血につながる骨髄異形成を引き起こす造血組織幹細胞因子受容体の欠陥を有する。
【０００７】
対象における貧血を治療する方法の一実施形態では、造血組織は、生体内で接触され、本発明の組成物は、対象に投与される。貧血を治療する方法の別の実施形態では、造血組織は、生体外で、本発明の組成物と接触される。
【０００８】
本発明の一実施形態では、ＥＭＰは、ＥＭＰ−１に指定される。本発明の特定の実施形態では、組成物は、配列番号２又は配列番号３のジスルフィド結合したポリペプチドのホモ二量体を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】Ｃ５７／Ｂｌ対Ｔｇ１９７マウスにおけるＨｇｂに対するＥＰＯの効果を示すグラフであり、ヒト腫瘍壊死因子−αの発現は、慢性炎症性疾患による貧血を形に表す。
【図２】同等のＵＴ７活性単位の単回ｓ．ｃ．注射投与後の、Ｔｇ１９７マウスにおける血清Ｈｇｂに対する、エポエチン−α及びダルベポエチンアルファ（ダルべ）と比較した、ＣＮＴＯ ５３０の効果を示すグラフ。
【図３】ＳＣＦ受容体欠乏症のモデルであるｃ−ｋｉｔ欠損（Ｗ／Ｗｖ）マウスにおけるＨｇｂに対するエポエチン−αの効果を示すグラフ。
【図４】ｃ−ｋｉｔ欠損（Ｗ／Ｗｖ）マウスにおけるヘモグロビンに対する、エポエチン−αと比較した、ＣＮＴＯ ５３０の効果を示すグラフ。
【図５】ベータサラセミアのモデルであるＴｈ３＋／Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＨｇｂに対するＣＮＴＯ ５３０、エポエチン−α及びダルベポエチン投与量（ＵＴ−７単位／ｋｇとして表される）の効果を示すグラフ。
【図６】イオン交換クロマトグラフィによって測定された、ヒトＨｂＳ遺伝子導入マウスにおけるＨｂＦに対するＣＮＴＯ ５３０（０．３ｍｇ／ｋｇ）の効果を示すグラフであり、ピーク画分（４）を使用して投薬前／後比率を評価。
【図７】ＣＮＴＯ５３０（０．３ｍｇ／ｋｇ）による治療前及び治療後９日目の遺伝子導入マウスにおける見本からの赤血球溶解物で充填された染色された酸性アガロース電気泳動ゲル、及びＨｇｂ標準で充填された第３のラインを示し、Ｆ＝ＨｂＦ、Ａ＝ＨｂＡ、Ｓ＝ＨｂＳ、Ｃ＝ＨｂＣ。
【００１０】
【表１】
【発明を実施するための形態】
【００１１】
略語
ＥＭＰエリスロポエチン模倣ペプチド；ＥＰＯヒトエリスロポエチン；ＥＰＯ−Ｒエリスロポエチン受容体；ＥＳＡ赤血球生成促進剤；Ｈｇｂヘモグロビン；Ｈｃｔヘマトクリット；ＨＰＦＨ遺伝性高胎児ヘモグロビン症；ＳＣＦ幹細胞因子；ＩＬインターロイキン；ＧＨ成長ホルモン；ＧＭ−ＣＳＦ顆粒球マクロファージコロニー刺激因子；ＭＣＨ平均（赤）細胞ヘモグロビン；ＭＣＶ平均（赤）細胞体積；ＲＢＣ赤血球、赤血球；ＴＮＦ−α腫瘍壊死因子アルファ；
【００１２】
定義
「貧血」は、概して、正常値以下であり、衰弱、めまい、息切れ、及びより重度の病的状態のリスクを含む個人の健康及び行動への影響に関連する血中のヘモグロビン値を意味する。低血清Ｈｇｂは、正常より少ない赤血球数又はＲＢＣにおける正常より少ないＨｇｂの結果であり得、それらを非常に小さくするか（小赤血球、低ＭＣＶ）、又は不十分に色素沈着させる（低色素性、低ＭＣＨ）。低い数の正常に形成されたＲＢＣは、血中ヘマトクリット（Ｈｃｔ、ＲＢＣによって占有される血液量の割合）を低下させる。したがって、血清Ｈｇｂレベルの発現は、赤血球数及び赤血球Ｈｇｂ補体の全ての可能な事態を包含し、通常、ｇｍ Ｈｇｂ／ｄＬ血液で与えられる。成人における正常Ｈｇｂの定義は、異なるが、成人男性に対する平均Ｈｇｂは、１３〜１４ｇｍ／ｄＬであり、女性に対しては、１１．６〜１２．３ｇｍ／ｄＬであり、これらの低レベル以下の値は、貧血とみなされることがある（Ｂｅｕｔｌｅｒ ａｎｄ Ｗａａｌｅｎ ２００６ Ｂｌｏｏｄ １０７：１７４７〜１７５０）。年齢、遺伝的背景、及び個人が居住する標高等の他の要因は、良い健康及び行動のために必要とされる血清Ｈｇｂの量に影響を与え得る。貧血療法に対する反応性は、血清Ｈｇｂ濃度の増加として測定される。
【００１３】
「ＥＰＯ」又は「エリスロポエチン」又は「ｒｈＥＰＯ」は、配列番号１、単離天然エリスロポエチンの同一アミノ酸配列において、及びＵｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｐ０１５８８成熟鎖において示される１６６のアミノ酸配列を有する、人体において合成されるか、又は組み換え技術によって作製されるポリペプチド鎖モノマーである組成物を意味する。ＥＰＯは、活性分解産物、特にＣ末端切断を含み、グリコシル化若しくは非グリコシル化されるか、又はそうでなければＰＥＧ化、若しくはポリペプチド鎖上の特異的又は非特異的部位でのカルバモイル化（国際公開第ＷＯ２００４００３１７６号参照）等によって修飾されてもよい。体内では、ＥＰＯは、主に腎臓において、及びより少ない程度で肝臓において作製される。組み換え技術によって作製されたヒトＥＰＯ及び組み換え修飾ＥＰＯ組成物は、赤血球生成以外に生物活性を提示することが示されている（Ｂｕｎｎ，ＨＦ ２００７．Ｂｌｏｏｄ １０９：８６８〜８７３）。
【００１４】
「ＥＰＯ由来の」ＥＳＡは、ＥＰＯとの相当な配列同一性を有する、組み換え技術によって作製されることが可能であるポリペプチド鎖モノマーである組成物を意味する。相当な配列同一性は、配列整合アルゴリズムを使用して、ＥＰＯ由来のＥＳＡ及びＥＰＯの配列が一致することができ、２つの配列の間の割合同一性が８０％以上であることを意味する。ＥＰＯ由来の生成物の例としては、米国特許第７２１７６８９号に記載される配列番号１（ＥＰＯ）の変異型ポリペプチド鎖配列を含むダルベポエチンアルファ（ＡＲＡＮＥＳＰ（商標）、Ａｍｇｅｎ、ＣＡ）、その構造が大きいポリマー鎖を組込み、それに延長した半減期を提供するＥＳＡである、化学名メトキシポリエチレングリコールエポエチンベータ（ＭＩＣＥＲＡ、ＲＲｏｃｈｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で周知でもあるＣ．Ｅ．Ｒ．Ａ．（持続性エリスロポエチン受容体活性化剤）、及びその他（欧州特許第１１９６４４３Ｂ１号）を含む。
【００１５】
「ＥＰＯ模倣ペプチド」は、それによって、実質的に配列は、自然発生のＥＰＯと整合することはできないが、ＥＰＯ模倣ペプチドは、ＥＰＯ−Ｒ特異的結合、及びＵＴ７細胞増殖の刺激等であるが、それらに限定されない、ＥＰＯと同様である赤血球生成活性を示す、配列において接続される天然、又は天然及び非天然アミノ酸残基の組み合わせを有する組成物を意味する（Ｋｏｍａｔｓｕ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ８２（２），４５６〜４６４，１９９３）。ＥＰＯ模倣ペプチドの例としては、配列ＧＧＴＹＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫＰＱＧＧ（配列番号２及び３の残基４〜２３）によって与えられる。
【００１６】
ヒトＥＰＯ受容体即ち「ＥＰＯ−Ｒ」は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿０００１１２（配列番号４）によって与えられるアミノ酸配列を有し、成熟鎖は、残基２５〜５０８によって表され、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを有する。
【００１７】
「赤血球生成」、また「赤血球形成」は、それによって、多能性造血幹細胞（ＨＳＣ）が、主として成熟ヘモグロビン四量体からなる無核細胞である成熟赤血球（赤血球）に分化する過程を意味する。赤血球の前駆細胞は、骨髄又は脾臓の間質細胞からの信号に応答する。赤血球生成の過程は、赤芽球が、赤血球前駆細胞によって囲まれるマクロファージからなる赤芽球島として組織される骨髄において行われる。マクロファージは、赤血球生成活性を制御する細胞伝達物質、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、及び幹細胞因子（ＳＣＦ）（コロニー形成単位赤血球マクロファージ顆粒球巨核球（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）及びバースト形成単位赤血球（ＢＦＵ−Ｅ）を生成する）の多くを提供するが、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−アルファ（Ｄｕｆｏｕｒ ｅｔ ａｌ．２００３ Ｂｌｏｏｄ １０２：２０５３〜２０５９）、及びＭＩＰ１−アルファは、細胞周期活性及びＢＦＵ−Ｅ成長を阻害する。ＥＰＯは、コロニー形成単位赤血球系（ＣＦＵ−Ｅ）細胞の増幅を誘導し、多くの赤血球特異的イベントによる分化、概して２日の期間にわたって伸展する過程を開始する。ＳＣＦ及びＥＰＯは、ヒト赤芽球前駆細胞及び前駆体の増殖を駆動するように相乗作用を与える。
【００１８】
組成物
ＣＮＴＯ ５２８及びＣＮＴＯ ５３０は、ＥＰＯ模倣ペプチド抗体融合タンパク質であり、それらの成熟形において、ＥＭＰ１ペプチドの２つの複製、及びヒトＩｇＧ抗体の部分を含む（米国特許第７２４１７３３号、米国特許第２００４９３５００５号、国際公開第ＷＯ２００４００２４２４ Ａ２号、同第ＷＯ２００５０３２４６０号）。ＣＮＴＯ５２８は、配列番号２において示されるポリペプチドのホモ二量体であり、ＣＮＴＯ５３０は、配列番号３のホモ二量体であり、両方とも分子の免疫グロブリン由来部分に存在するシステイン残基を介するジスルフィド結合によって共有結合し、グリコシル化されるか、又はされない場合がある。米国特許第６７０３４８０号及び同第７０８４２４５号に記載されるもの等の他の二量体ペプチド由来の作成物は、本発明の方法においても有用であってもよい。
【００１９】
ＣＮＴＯ ５２８、ＣＮＴＯ ５３０、及びＨＥＭＡＴＩＤＥは、様々な生体外及び生体内の検査システムにおいて薬理活性である。単量体ＥＭＰ−１は、約２００ｎＭのＥＰＯ−Ｒに対する結合親和性を有するが、ＣＮＴＯ ５２８及びＣＮＴＯ ５３０は、約１０ｎＭの結合定数でＥＰＯ受容体と結合し、アポトーシスを抑制し、赤血球生成の様々な生体外モデルにおいて細胞成長を刺激する際に活性であり、生体内で動物モデルにおける赤血球生成を刺激する。ＥＰＯ−Ｒ結合ペプチド、ペプチド誘導体、及び他のＥＰＯ模倣物質の二量体形は、二重結合ドメインが、適切に配向される時に（Ｂａｌｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ．１９９８．Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌ ５：９３８〜９４０）、情報伝達複合体を形成するように、その場でのＥＰＯ−Ｒの細胞外ドメインを適切な近接及び配向へ移動させる際に、ＥＰＯ−Ｒを活性化する際のモノマーより強力であることがある（Ｌｉｖｎａｈ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．１９９６．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：４６４〜４７１；Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．１９９７．Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ４：９３９〜５０）ことが認識されている。したがって、配列番号２及び３の二量体形を含むもの等であるが、それらに限定されない、双対又は二量体形で存在する、ヒトＥＰＯのアミノ酸配列と実質的に同一ではないＥＳＡは、本発明の対象組成物である。
【００２０】
配列番号２及び３の二量体形は、Ｇクラス免疫グロブリン（Ｆｃ）のパパイン分解から生じる結晶化可能フラグメントに類似することが周知である構造を更に含む。抗体のＦｃ領域は、補体に結合し、それと相互作用する能力、免疫系の循環及び非循環細胞及び組織上のＦｃ特異的受容体に結合し、それを活性化する能力等の、ある非抗原結合機能を提供する。組成物のＦｃ領域は、血流の血漿区画内に留まり、腎臓ろ過に抵抗し、ＦｃＲｎ受容体を含む、周知及び非周知の受容体によって細胞膜にわたって運搬される能力に関係する利点も付与する。配列番号２及び３の二量体形の複雑な構造によって付与されるこれら、及び他の利点は、抗体工学の分野のそれらの施術者によって認識される。したがって、成熟構造のＦｃ領域特性と組み合わせて前述されたＥＭＰペプチドの二量体提示は、配列番号２及び３の二量体形によって証明される赤血球生成刺激の方法の履行に比類なく好適である。
【００２１】
組成物の赤血球生成活性を試験し、投薬する方法
ＥＰＯ活性の「国際単位」又は「ＩＵ」は、５マイクログラムのコバルトと同量の赤血球刺激を与えるＥＰＯ（配列番号１）の量として定義される。コバルト、鉄及びニッケルのものと同様の特性を伴う天然元素は、エリスロポエチン遺伝のより効率的な転写による顕著かつ安定した赤血球増加応答を誘導する。ＥＰＯ検定のための国際参照基準は、単離ヒト尿中ＥＰを使用する。ＥＰＯ標準は、参照ＥＰＯ製剤、特に、Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＨＯ）又はＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＮＩＢＳＣ）によって供給されるＳｅｃｏｎｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ ｆｏｒ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ−Ｄｅｒｉｖｅｄ ＥＰＯに対して検査される。活性の単位は、５ミクロモルのコバルトと同量の赤血球刺激を与えるＥＰＯの量として定義される。しかしながら、通常、ＥＰＯ製剤は、参照基準に対する生物学的検定において検査される。ヒト尿中ＥＰＯは、典型的に、約７０，０００Ｕ／ｍｇのタンパク質の特異的活性を有するが、ヒト組み換えＥＰＯに関して報告される値は、生成物の炭水化物（グリコシル化）含有量によって、１００，０００〜２００，０００Ｕ／ｍｇの範囲にあってもよい。
【００２２】
他の生体内及び生体外検定を使用して、赤血球生成活性の量を評価することができる。例えば、赤血球生成活性は、造血系の細胞株、例えば、骨髄又は脾臓由来の細胞（ＦＤＣ−Ｐ１／ＥＲ、ＥＰＯ−Ｒが安定に導入された、よく特徴付けられた非形質転換マウス骨髄由来の細胞株（Ｄｅｘｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９８０ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５２：１０３６〜１０４７）、又はＴＦ１（Ｋｉｔａｍｕｒａ，ｅｔ ａｌ．，１９８９ Ｂｌｏｏｄ ７３：３７５〜３８０）若しくはＵＴ７細胞（Ｋｉｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．１９８９．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４０：３２３；Ｋｏｍａｔｓｕ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ８２（２），４５６〜４６４，１９９３）等のＥＰＯ反応性腫瘍細胞株、又は成長に対してＥＰＯに依存するように操作された細胞株の短期培養において生体外で測定することができる。
【００２３】
本発明の方法において有用な組成物を特定し、検査する際に特に有用なのは、ＵＴ７細胞増殖検定である。ＵＴ７は、ＥＰＯ依存性になるように適合されたヒト白血病細胞株である。低血中ヘモグロビン含有量を有する対象に投与される組成物又は投与量の選択のためにＵＴ７細胞増殖検定を使用するために、細胞を、通常培地が無くなるように洗浄し、検定前２４時間ＥＰＯ不足にさせる。例えば、ＵＴ−７細胞飢餓は、添加Ｌ−グルタミン酸及び５％でのＦＢＳ（Ｉ５Ｑ）を伴うＩＭＤＭ培地において開始することができる。その後、細胞は調製され、６×１０5細胞／ｍＬの最終濃度まで適切な培地において懸濁される（９６ウェルチャンバにつき３０，０００細胞の最終濃度を産生する）。ＥＰＯ標準は、ＥＰＯストックを５ｎｇ／ｍＬに希釈し、Ｉ５Ｑ培地において０．００９８ｎｇ／ｍＬの濃度まで１：２連続希釈法によって調製される。得られた希釈物は、２．５ｎｇ／ｍＬ〜０．００２４ｎｇ／ｍＬの濃度の標準を提供する（試験ウェル内での最終ｒ倍希釈後）。試験試料は、同様の方法で希釈される。ＵＴ−７細胞懸濁液の５０マイクロＬアリコートは、対応するウェルに移動され、プレートは、３７℃で４８時間培養された。細胞増殖は、メーカーの使用説明書に従って、ＰｒｏｍｅｇａのＭＴＳ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）等の生体染色法を使用して評価される。ＥＣ５０は、発色団の吸光度及び他の信号の増加によって測定される濃度対増殖の曲線適合から計算される。未修飾ＥＰＯに対するＥＣ５０は、約１．８×１０-11Ｍである。この値を使用して、他の薬剤のためのＵＴ７単位は、ＥＰＯに標準化される。
【００２４】
ＵＴ−７ｒＨｕＥＰＯ同等物を計算する。
【００２５】
ＵＴ−７単位／μｇ＝Ｍｏｌ ｗｔ×Ｃ／試験化合物に対するＥＣ50であり、Ｃは、同じ検定条件下でｒＨｕ ＥＰＯの活性から算出される定数であり、ｒＨｕ ＥＰＯの周知の薬理学的特異的活性は、周知である（例えば、１２０Ｕ／μｇ）。
【００２６】
【数１】
【００２７】
試験化合物に対するＥＣ50は、ＵＴ−７生死判別検定を使用して、濃度対応答に適合される曲線から算出され、５０％最大細胞増殖活性での濃度を見つけることが到達される。したがって、投与されるＥＳＡの投与量は、それぞれのｍｇ／ｋｇ投与量を、各化合物の生体外活性で乗ずることによって、ｍｇ／ｋｇからＵＴ−７Ｕ／ｋｇへ変換されてもよい。
【００２８】
赤血球生成は、生体外で反復され、半固体の細胞培養におけるＢＦＵ−ｅ及びＣＦＵ−ｅによる研究は、この過程の我々の理解に加えたが、骨髄間質細胞及びマクロファージは、幹細胞及び赤芽球島のための微環境を作製することに重要な役割をそれぞれ果たす（Ｓａｄａｈｉｒａ ａｎｄ Ｍｏｒｉ，１９９９）。これらの細胞は、様々なサイトカイン及び接着分子を発現し、マクロファージは、赤芽球のためのナース細胞として作用するように想定される。骨髄マクロファージは、通常、相当量のフェリチンを含有するため、それらは鉄代謝に対する影響も有する可能性がある。調製及び培養技術によって、これらの細胞及びそれらのサイトカインの機能は、生体外系において損失され得る。したがって、生体外で行われる観察は、生体内設定へ直接翻訳されない場合がある。
【００２９】
赤血球生成活性のための生体内生物学的検定は、赤血球生成を修飾する他の化合物及び内因性物質によって更に影響され得る。これらの理由で、動物を使用する生体内検定は、注意深く制御されなければならない。これらの本来的な相違を反映し、食事による鉄の摂取量、炎症の有無、他の成長因子、ステロイドホルモン等のパラメーターを制御する疾病のモデルを使用して、赤血球生成及び療法に対する応答の特徴を研究することができる。
【００３０】
配列番号２及び３のホモ二量体構造によって例示され、本明細書に記載されるＥＰＯ模倣物質融合タンパク質の投与量は、０．１単位／ｍＬ〜２０単位／ｍＬ、好ましくは０．５単位／ｍＬ〜２単位／ｍＬ、又はその中の任意の範囲又は値で使用することができるＥＰＯと活性において同等に投与されてもよい。赤血球生成又は非赤血球生成のいずれかであるＥＰＯ模倣物質融合タンパク質の使用の他の用途において、投与される投与量は、赤血球生成単位に関連する必要はない。
【００３１】
出願人は、ＥＰＯ模倣ペプチドの二量体作成物を含む非エリスロポエチン由来のＥＳＡを使用してこれらの疾病を有利に治療し得ることを、異常ヘモグロビン症及び骨髄異形成の動物モデルを使用して思いがけなく発見した。加えて、出願人は、ＣＮＴＯ５２８及びＣＮＴＯ５３０が、同じモデルにおける他のＥＳＡと比較して、生体外ＥＰＯ依存性細胞増殖活性に基づいてより大きい程度及び／又はより持続した期間、血中Ｈｇｂの増加として証明される赤血球生成及び造血を刺激することを、生体内モデルを使用して示している。
【００３２】
組成物を使用する方法
慢性腎疾患を伴う患者の約５〜１０％は、皮下経路によって投与される週１回の３００ＩＵ／ｋｇのエリスロポエチン又は週１回の１．５μｇ／ｋｇのダルベポエチンの連続的な必要性として定義される、ＥＳＡに対する低応答性を証明する。そのような低応答性は、慢性腎疾患における罹患率、死亡率、及び医療経済的負担の著しい一因であり、重要な診断上及び管理挑戦を提示する。ＥＳＡ耐性の最も一般的な原因は、ノンコンプライアンス、絶対的、又は機能的鉄欠乏症及び炎症である。十分な鉄貯蔵を維持することは、ＥＳＡに対する必要条件を減少させ、それの有効性を高めるために重要であることが広く受け入れられている。ＥＳＡ低応答性は、ＥＳＡ組成物又は宿主因子に特異的な様々な要因のためであり得る。ＥＳＡ低応答性のいくつかの確立した原因は、不十分な透析、副甲状腺機能高進症、栄養不足（ビタミンＢ１２、葉酸、ビタミンＣ、カルチニン）、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシン受容体遮断薬、アルミニウム過剰、抗体仲介赤芽球癆、原発性骨髄疾患、骨髄抑制薬剤、異常ヘモグロビン症、溶血及び脾機能高進症（概説のために、Ｊｏｈｎｓｏｎ，ＤＷ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ ｈｙｐｏｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ．Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ １２（４），３２１〜３３０を参照）を含む。
【００３３】
いずれの１つの動作理論に拘束されたくないが、ある機械論的考察は、ＥＰＯ模倣ペプチド組成物と一本鎖ポリペプチド組成物との間の相違を定義する。造血成長ホルモン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）の機能的模倣は、ＥＭＰ−１ペプチドのある二量体提示によって到達することができる。ＥＰＯ受容体の細胞外ドメインを伴うこの作動ペプチドの複合体の０．０００２８μｍ（２．８オングストローム）解像度での結晶構造は、ＥＭＰ−１ペプチド二量体が受容体の二量化を誘導することを明らかにする。ＥＰＯ−Ｒ及びヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）受容体は、ある構造的特徴を共有するが、ｈＧＨ受容体リガンド複合体は、ＥＰＯ−ＥＰＯＲ二量体錯体と異なり、二量化の２つ以上の様式が、信号伝達及び細胞増殖を誘導することが可能であってもよいことを示唆する（Ｌｉｖｎａｈ，ｅｔ ａｌ．１９９６ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３（５２７４）：４６４〜４７１）。結合領域に、及び配列番号２及び３等であるが、それらに限定されない免疫グロブリンＧクラス定常ドメインに融合したＥＭＰ−１のホモ二量体を表すＣＮＴＯ５２８及びＣＮＴＯ５３０は、ＥＰＯ受容体信号伝達を誘導するように空間的配向に到達し（配列番号４）、赤血球生成を刺激するが（国際公開第ＷＯ０４／００２４２４号；Ｂｕｇｅｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｌｏｏｄ １０６（１１）：Ａｂｓｔｒａｃｔ ４２６１；Ｆｒａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｌｏｏｄ １０６（１１）：Ａｂｓｔｒａｃｔ ４２８３；国際公開第ＷＯ０５０３２４６０Ａ２号を参照）、これらの作成物及び得られたホモ二量体３次元構造に特有の性質により、ＥＰＯ受容体と相互作用するそれらの能力に特有の特徴は、天然ＥＰＯと異なる活性スペクトルをこれらの分子に提供してもよい。加えて、ＣＮＴＯ５３０及びＣＮＴＯ５２８を含む、ペプチド模倣物質ＥＳＡの１次、２次、３次、及び４次構造は、天然ＥＰＯと異なるため、作成物は、分布、代謝、及び抗原性の異なるパターン、又はそれらの不足を有する。出願人は、ＥＭＰ１を含む作成物が、組み換えヒトＥＰＯの単一ポリペプチド鎖又は天然ＥＰＯタンパク質配列の単一ポリペプチド鎖変異型（ダルベポエチン）の生体外に基づく生物活性単位（ＥＳＡ依存性細胞増殖）と比較して、ヘモグロビン応答の程度及び／又は持続時間に関して、高められた赤血球生成を誘発することを、異常ヘモグロビン症及び骨髄異形成から生じるヒト貧血の動物モデルを使用して、思いがけなく見出している。
【００３４】
異常ヘモグロビン症
ヒトヘモグロビンは、２つのしっかりと結合された遺伝子クラスタ、染色体１６上のアルファ様グロビン遺伝子及び染色体１１上のベータ様遺伝子においてコードされる。重要な調節配列は、各遺伝子の両側に位置し、プロモータ要素は上流にある。ガンマ及びベータ遺伝子の５’隣接領域における配列は、これらの遺伝子の正確な発生的調節に不可欠であると考えられるが、古典的なエンハンサ及びサイレンサのように機能する要素は、３’隣接領域にある。更に上流に位置する遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）要素は、各クラスタの発現の全体的なレベルを制御すると考えられる。これらの要素は、トランス作用転写因子と相互作用することによって、それらの調節作用に到達する。後者は、ヘム生合成のための酵素をコードする遺伝子等の、赤血球生成中に特異的に発現する遺伝子を調節するとも考えられる。正常な赤血球（ＲＢＣ）分化のために、グロビン遺伝子が、ヘム及び鉄代謝に関与する遺伝子と協調して発現する必要がある。
【００３５】
異常ヘモグロビン症の５つの主要なクラスが存在し、構造的（例えば、鎌状細胞）、変異型（例えば、変化したＯ2親和性を伴う）、サラセミア（変化したか、又は誤協調的なヘモグロビン鎖合成）、遺伝性高胎児ヘモグロビン症（ＨＰＦＨ）、及び先天性（例えば、メトヘモグロビン）、クラスがある。サラセミアヘモグロビン変異型は、サラセミア（例えば、異常グロビン生合成）及び構造的異常ヘモグロビン症（例えば、異常アミノ酸配列）の特徴を組み合わせる。
【００３６】
鎌状赤血球症候群は、第６のアミノ酸を、グルタミン酸からバリン及び指定されたヘモグロビンＳ（ＨｇｂＳ）へ変化させるベータグロビン遺伝子における点変異によって引き起こされる。ＨｇｂＳは、脱酸素化される時、可逆的に重合され、赤血球膜の硬化及び特徴的な鎌状形状を引き起こす。鎌状赤血球は、粘着性及び非可塑性であり、相互及び血管内皮に粘着する。これらの異常は、明らかな溶血による、及び脾臓による除去のための両方で、微小血管血管閉塞症及び未熟ＲＢＣ破壊の予測不可能な症状の発現を誘発する。著名な兆候は、脾臓、中枢神経系、骨、肝臓、腎臓、及び肺における虚血性疼痛（即ち、痛みを伴う転換点）及び虚血性機能不全、又は明らかな梗塞の症状の発現を含む。
【００３７】
サラセミア症候群は、アルファ又はベータグロビン生合成の遺伝性疾患である。サラセミアを引き起こす突然変異は、転写、ｍＲＮＡ前駆体の処理、翻訳、及びグロビンポリペプチド鎖の翻訳後代謝の、グロビン遺伝子発現の経路における任意のステップに影響を与えることがある。最も一般的な型は、ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを混乱させるか、又はｍＲＮＡの翻訳を時期尚早に終了させる突然変異から生じる。グロビンサブユニットの不平衡な蓄積は、影響を受けていないグロビンの合成が、正常率で進展するために生じる。完全ヘモグロビン四量体（アルファ2ベータ2）の産生の減少は、赤血球血色素減少症及び小赤血球症を引き起こす。臨床的重症度は、影響を受けたグロビンの合成が正常に機能しない程度、他のグロビン鎖の変化した合成、及び他の異常グロビン対立遺伝子の共同相続によって大きく異なる。ベータ遺伝子由来及びアルファ遺伝子由来のアルファ及びベータサラセミアは、両方とも、周知であり、特徴付けられている。サラセミアの最も一般的な型は、クーリー貧血とも称される重症型ベータサラセミアであり、２００以上の突然変異によって引き起こされ、ヘモグロブリンのベータ鎖の変化した産生につながる。他の型は、軽症型ベータサラセミア、及び中間型ベータサラセミアを含むが、それらに限定されない。
【００３８】
ＨＰＦＨは、成人期におけるＨｇｂＦ、高胎児ヘモグロビンの高レベルの連続合成に特徴がある。産生されるヘモグロビンの全てがＨｇｂＦであっても、悪影響は見られない。したがって、鎌状赤血球貧血及びサラセミア等における、アルファ又はベータ遺伝子における遺伝的欠陥を持つ患者におけるＨｇｂＦ形成及びそれらの処理を促進する任意の刺激は、有効であることを証明することができる。
【００３９】
骨髄不全
骨髄異形成、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、再生不良性貧血、赤芽球癆（ＰＲＣＡ）、及び骨髄癆は、骨髄不全に特徴がある疾病である。骨髄異形成症候群（ＭＤＳ、以前は「前白血病」として周知）は、血球の無効な産生、及び急性骨髄性白血病への形質転換の様々なリスクに特徴がある血液学的病状の多様な集合である。ＭＤＳは、血液学的腫瘍内分類される。常習的な輸血を必要とする貧血は、頻繁に存在する。低増殖性貧血は、正色素性、正球性、又は大球性であり、低網状赤血球数に特徴がある。ＲＢＣの不完全な産生は、感染症、炎症、及び癌に続発し得る、骨髄損傷及び機能不全によって生じる。これらの疾患における貧血は、しばしば、孤立性又は主要な血液学的所見でさえもない。ＭＤＳの骨髄不全は、貧血、白血球減少症、及び血小板減少症の汎血球減少症をもたらし得る。
【００４０】
造血（時折、血液生成でもある）は、血液細胞成分の形成である。血液の細胞成分の全ては、造血幹細胞に由来する。糖タンパク質成長因子は、髄質から血液へ入る細胞の増殖及び成熟を調節し、１つ以上の関係した細胞株における細胞を増殖及び成熟させることが周知である。一般的な骨髄性前駆細胞、多能性幹細胞は、赤血球生成と称される過程である、赤血球系細胞及び赤血球を産生するために、ＳＣＦ、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＥＰＯを含む成長因子に応答する。赤血球生成は、低酸素症に応答して腎臓において産生されるＥＰＯに大きく依存しする。しかしながら、ＥＰＯ受容体は、骨髄性前駆細胞に加えて他の細胞型上で見られ、前述のとおり、様々な下流信号伝達イベントが、リガンドによるＰＯ受容体活性化から生じる。赤血球生成活性が無効である、ある誘導体、エリスロポエチン誘導体、リジンカルバミル化エリスロポエチンによる非赤血球生成関連心臓及び神経組織防御も、言及されている（Ｌｅｉｓｔ ｅｔ ａｌ．２００４ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５：２３９）。
【００４１】
治療適用
本発明は、細胞、組織、器官、動物、又は患者において貧血を調節又は治療する方法を提供し、小児及び／又は成人癌関連貧血、癌治療関連貧血、放射線治療又は化学療法関連貧血、寄生生物、ウイルス、又は細菌性感染症関連貧血、腎損傷又は不全による貧血、未熟児貧血、異常ヘモグロビン症による貧血、又は骨髄不全による貧血の任意の貧血の少なくとも１つを含むが、それらに限定されない。より具体的には、貧血は、リンパ腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、ＡＩＤＳ、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）、透析、慢性腎不全に関連する貧血、先天性形成不良性貧血、ファンコーニ貧血等の造血疾病、ベータサラセミア及びアルファサラセミアを含むが、それらに限定されないサラセミア、及び鎌状赤血球病を含む、癌又は感染症による１次又は２次影響に関連し得る。
【００４２】
本発明のＥＳＡ組成物は、例えば、慢性感染症、炎症過程、放射線療法、及び細胞増殖抑制剤治療によって誘導されるか、又は骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、及び慢性病が骨髄及び赤血球生成を抑制する他の病状によって包含される貧血の非腎臓型のために使用することもできる。
【００４３】
本発明は、細胞、組織、器官、動物、又は患者において感染症に関連する貧血を示す患者を調節又は治療するための方法も提供し、急性又は慢性細菌感染、細菌、ウイルス、及び菌感染を含む急性及び慢性寄生又は感染プロセス、ＨＩＶ感染／ＨＩＶ神経障害、髄膜炎、肝炎、敗血症性関節炎、腹膜炎、肺炎、喉頭蓋炎、大腸菌０１５７：ｈ７、溶血性尿毒症症候群、塞栓性血小板減少性紫斑病、マラリア、デング出血熱、リーシュマニア症、ハンセン病、中毒性ショック症候群、連鎖球菌筋炎、ガス壊疽、ヒト型結核菌、トリ型結核菌、ニューモシスティス・カリニ肺炎、骨盤感染症、精巣炎／精巣上体炎、レジオネラ、ライム病、Ａ型インフルエンザ、エプスタイン・バーウイルス、ウイルス関連血球貪食症候群、ウイルス性脳炎／無菌性髄膜炎等のうちの少なくとも１つを含むが、それらに限定されない。
【００４４】
本発明は、細胞、組織、臓器における癌の存在に関連する貧血を示す患者を調節又は治療するための方法も提供し、白血病、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞、Ｔ細胞、又はＢ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、リンパ腫、ホジキン病、悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、カポジ肉腫、直腸結腸癌、膵臓癌、鼻咽頭癌、悪性組織球増殖症、悪性の腫瘍随伴症候群／高カルシウム血症、固形腫瘍、腺癌、肉腫、悪性黒色腫等を含むが、それらに限定されない。
【００４５】
本発明は、細胞、組織、臓器における神経変性病に関連する貧血を示す患者を調節又は治療するための方法も提供し、多発性硬化症、片頭痛、ＡＩＤＳによる認知症、多発性硬化症及び急性横断性脊髄炎等の脱髄疾患、皮質脊髄系の病変等の錐体外路系及び小脳疾患、大脳基底核又は小脳疾患の疾患、ハンチントン舞踏病及び老人性舞踏病等の運動過剰疾患、ＣＮＳドーパミン受容体を遮断する薬剤によって誘導されるもの等の薬物誘発性運動疾患、パーキンソン病等の運動低下疾患、進行性核上性麻痺、小脳の構造病変、脊髄性運動失調症、フリードライヒ運動失調症、小脳皮質変性症、多系統変性症（Ｍｅｎｃｅｌ、Ｄｅｊｅｒｉｎｅ−Ｔｈｏｍａｓ、Ｓｈｉ−Ｄｒａｇｅｒ、及びＭａｃｈａｄｏ−Ｊｏｓｅｐｈ）等の髄小脳変性症、全身性疾患（レフサム病、無ベータリポタンパク質血症、運動失調、毛細血管拡張症、及びミトコンドリア多系統疾患）、多発性硬化症、急性横断性脊髄炎等の脱髄性中核疾患、及び神経原性筋萎縮症等の運動単位の疾患（筋萎縮性側索硬化症、乳児脊髄性筋萎縮症、及び若年性脊髄性筋萎縮症等の前角細胞変性）、アルツハイマー病、中年におけるダウン症候群、びまん性レビー小体病、レビー小体型老年性認知症、ウェルニッケ・コルサコフ症候群、慢性アルコール依存症、クロイツフェルト・ヤコブ疾病、亜急性硬化性全汎脳炎、ハレルフォルデン・スパッツ病、及び拳闘家認知症等を含むが、それらに限定されない。
【００４６】
本発明は、心臓血管疾患に関連する貧血を示す患者を調節又は治療するための方法も提供し、心失神症候群、心筋梗塞、うっ血性心不全、脳卒中、虚血性脳卒中、出血、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性アテリオスクレロティック疾患、高血圧、動脈性高血圧、腎血管性高血圧、失神、ショック、心血管系梅毒、心不全、肺性心、原発性肺高血、心不整脈、心房異所性拍動、心房粗動、心房細動（持続性又は発作性）、多源性又は多発性心房頻拍、一定狭幅ＱＲＳ頻拍、特異的不整脈、心室細動、ヒス束不整脈、房室ブロック、脚ブロック、虚血性心筋疾患、冠動脈疾患、狭心症、心筋梗塞、心筋症、拡張型鬱血性心筋症、拘束型心筋症、心臓弁膜症、心内膜炎、心膜疾患、心臓腫瘍、大動脈及び末梢動脈瘤、大動脈解離、大動脈の炎症、腹部大動脈及びその分岐の閉塞、末梢血管疾患、閉塞性動脈疾患、末梢アテローム硬化性疾患、閉塞性血栓血管炎、機能性末梢動脈疾患、レイノー現象及びレイノー病、肢端チアノーゼ、肢端紅痛症、静脈疾患、静脈血栓症、静脈瘤、動静脈瘻、リンパ浮腫、脂肪性浮腫、不安定狭心症、再かん流傷害、ポストポンプ症候群、虚血再灌流障害等を含むが、それらに限定されない。
【００４７】
そのような方法は、配列番号２又は３、又はそのような調節、治療、又は療法を必要とする細胞、組織、臓器、動物又は患者に特異的な部分又は変異型を含むが、それらに限定されない、本発明のＣＨ１欠損ＥＭＰ−１ペプチド免疫グロブリン融合タンパク質等であるが、それに限定されない少なくとも１つのＥＳＡ組成物を含む少なくとも１つ組成物又は医薬組成物の有効量を投与するステップを任意で含むことができる。ＣＮＴＯ５２８（配列番号２のホモ二量体）は、５つの用量コホートにおける４４人の対象の無作為化単純盲検及びプラシーボ（ＰＢＯ）対照試験（０．０３、０．０９、０．３、０．９ｍｇ／ｋｇのＣＮＴＯ ５２８又はＰＢＯの単回ＩＶ投与を受けた１期の３５人の対象、３及び５日目にＣＮＴＯ ５２８又はＰＢＯの分割ＩＶ投与（０．０９ｍｇ／ｋｇ又はＰＢＯの３回の点滴）を受けた２期の９人の対象）において、耐容性良好であることを示し、顕著に低い対象間変動性を伴う長期用量依存性赤血球生成応答をもたらしている。ＩＶ ＣＮＴＯ５２８の薬物動態学は、直線的であり、ほぼ用量に比例した。ヘモグロビン（Ｈｇｂ）濃度は、用量依存的に増加し、２２日目に最大効果が生じた。平均Ｈｇｂ濃度は、単回投与の約２．５カ月後の最後の測定で０．４ｇ／ｄＬ基礎値を超えて留まった。ＲＢＣ数における用量依存性の増加は、正常範囲内で全てのＲＢＣ指標（ＭＣＶ、ＭＣＨ、ＭＣＨＣ）に見られ、正球性の正色素性ＲＢＣの増加を示した。全てのＣＮＴＯ５２８で治療した対象において、可溶性トランスフェリン受容体濃度における用量依存性の増加が見られた。内因性ＥＰＯ濃度における用量依存性の増加、その後、内因性ＥＰＯ濃度における用量依存性の低下が見られた。免疫原性は見られなかった。このデータは、赤血球生成模倣物質抗体融合タンパク質による赤血球生成応答及び内因性ＥＰＯレベルの上方制御に対する、ヒトにおける概念実証を提供する（Ｆｒａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２００５）Ｂｌｏｏｄ １０６（１１）：Ａｂｓｔｒａｃｔ ４２８３）。
【００４８】
組成物を含むＥＰＯ模倣ペプチドは、自己骨髄培養において等、生体外で使用することもできる。その後、治療された髄質は、任意で患者が別の薬剤又は電離放射線等のモダリティで治療された後に患者に戻される。組成物、及び任意で他の幹細胞増殖及び分化因子を含むＥＰＯ模倣ペプチドは、髄質又は末梢血前駆（ＰＢＰＣ）細胞の生体外増幅のために使用することもできる。任意で、組成物を含むＥＰＯ模倣ペプチドは、任意で後に患者に戻される細胞を高密度培養へ分化し、増殖させるように、ＳＣＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、又はＩＬ−１１を含むが、それらに限定されない１つ又はそれ以上の他のサイトカインと組み合わせて使用することができる。
【００４９】
本発明は一般的な用語で説明したが、本発明の実施形態は、以下の実施例において更に開示される。
【００５０】
組成物のための背景非臨床薬理学
生体外で、ＣＮＴＯ ５２８は、ＵＴ−７ＥＰＯ細胞の成長を刺激する際、組み換えヒトＥＰＯ（ｒｈＥＰＯ）より、モル基準で約１０分の１有力であった。低い生体外効力にもかかわらず、正常ラットにおけるｒｈＥＰＯ及びダルベポエチンと比較して、ＣＮＴＯ ５２８の単回皮下投与は、より長く持続する網状赤血球増加及びヘモグロビンのより長く持続する増加を引き起こした。フローサイトメトリー方法によって測定されたように、ＣＮＴＯ ５２８は、赤血球分布幅（ＲＤＷ）又は平均細胞体積（ＭＣＶ）の小さな変化のみを引き起こし、成熟網状赤血球の放出をもたらし、平均血小板容積（ＭＰＶ）に対する効果は有さなかった。ＣＮＴＯ ５２８は、貧血のラットモデル及び赤芽球癆のラットモデルにおいて有効であることが示された（Ｂｕｇｅｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｌｏｏｄ １０６：（１１）Ａｂｓｔｒａｃｔ ４２６１）。
【００５１】
ＥＰＯ−Ｒを表示し、増殖のためにＥＳＡを必要とするＵＴ−７細胞を使用して、阻害されたＣＮＴＯ ５３０と125Ｉ−ＥＰＯとの間のヒトＥＰＯ−Ｒのための競合的結合を測定した。ＣＮＴＯ ５３０は、約６０ｎＭのＩＣ５０により、ＥＰＯ（０．５ｎＭ）が細胞に結合することを防止した。ＣＮＴＯ ５３０は、ＵＴ−７細胞、及びアポトーシスからＥＰＯを奪われたＣＮＴＯ ５３０救出細胞を使用した単一増殖検定におけるモル基準でｒＨｕＥＰＯより約２４分の１倍有力であり（ＣＮＴＯ ５３０のＥＣ５０は、約２１ｐＭ）、より高い濃度で、ＣＮＴＯ ５３０は、増殖の頑強な誘導を引き起こした（ＣＮＴＯ ５３０のＥＣ５０は、約５５ｐＭ）。
【００５２】
ヒト骨髄において、コロニー形成検定を使用して、赤血球前駆細胞成長及び分化に対するその効果を決定した。ＣＮＴＯ ５３０は、赤血球コロニー形成における濃度依存性の増加を誘導した。
【００５３】
正常動物における生体内非臨床的薬理学的研究は、ＣＮＴＯ ５３０が０、０．０１、０．３、０．１、又は０．３ｍｇ／ｋｇで皮下投与された時に正常雌Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいて赤血球生成の用量反応性刺激を引き起こしたことを証明した。好塩基性赤芽球は、髄質における最も敏感な細胞であり、好塩基性赤芽球に対するＣＮＴＯ ５３０の無効果投与量は、０．０１ｍｇ／ｋｇであった。髄質における非赤血球系細胞に対する効果はなかった。組み換えヒトエリスロポエチン及びダルベポエチンと比較して、ＣＮＴＯ ５３０は、より効果的であり、赤血球生成に対するより長く続く効果を有した。０、０．０１、０．０３、０．１、０．３、又は１ｍｇ／ｋｇでの正常雌Ｓｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットへのＣＮＴＯ ５３０の単回皮下投与を使用して、ＣＮＴＯ ５３０は、網状赤血球における迅速な用量依存性の一過性増加、及びＲＢＣ、Ｈｃｔ、及びＨｇｂにおける持続性増加を引き起こした。網状赤血球を増加させるためのＣＮＴＯ ５３０の無効果投与量は、＜０．０１ｍｇ／ｋｇであった。Ｈｇｂを増加させるために、無効果投与量は、０．０１ｍｇ／ｋｇであり、ＥＤ５０は、０．１ｍｇ／ｋｇであった。ＣＮＴＯ ５３０は、白血球数（ＷＢＣ）における一過性の非用量反応性の（１．５倍まで）増加も引き起こした。ＷＢＣを増加させるための無効果投与量は、０．０１ｍｇ／ｋｇであった。１ｍｇ／ｋｇの投与量で、ＣＮＴＯ ５３０は、平均血小板容積（ＭＰＶ）における一過性の（１．５倍まで）増加を引き起こした。ＭＰＶを増加させるための無効果投与量は、０．３ｍｇ／ｋｇであった。ＣＮＴＯ ５３０の高いＩＶ及びＳＣ投与量（０、０．３、３、及び３０ｍｇ／ｋｇ）を与える時、雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットは、網状赤血球における一過性の非用量反応性の増加、赤血球数（ＲＢＣ）、ヘモグロビン（Ｈｇｂ）、及びヘマトクリット（Ｈｃｔ）における持続する増加、ＷＢＣにおける一過性の非用量反応性の増加、血小板数及び平均血小板容積（ＭＰＶ）における一過性の用量反応性の増加を示した。
【００５４】
正常雌ウサギにおいて、０、０．３、３、又は３０ｍｇ／ｋｇでの皮下のＣＮＴＯ ５３０は、網状赤血球における一過性の非用量反応性の増加、及びＲＢＣ、Ｈｃｔ、及びＨｇｂにおけるより長く持続する増加を引き起こした。ＣＮＴＯ ５３０は、平均血小板容積（ＭＰＶ）における増加を引き起こした。ＭＰＶに対する効果は、０．３〜３ｍｇ／ｋｇの間で用量反応性であったが、３０ｍｇ／ｋｇの投与量は、３ｍｇ／ｋｇと同様の効果を有した。
【００５５】
雄及び雌カニクイザルにおいて、０、０．０３、０．１、０．３、又は３．０ｍｇ／ｋｇのＩＶで与えられたＣＮＴＯ ５３０は、網状赤血球数、ＲＢＣ、Ｈｃｔ、及びＨｇｂにおける用量依存性の増加を引き起こした。無効果投与量は、０．１ｍｇ／ｋｇであった。正常雄カニクイザルにおける高投与量ＩＶ及び皮下のＣＮＴＯ ５３０（ＩＶ０、３、及び３０ｍｇ／ｋｇ）は、網状赤血球数における一過性の用量反応性の増加、及び赤血球数（ＲＢＣ）、ヘモグロビン（Ｈｇｂ）、及びヘマトクリット（Ｈｃｔ）における持続する非用量反応性の増加、血小板数における一過性の非用量反応性の増加、及び平均血小板容積（ＭＰＶ）における持続する非用量反応性の増加を引き起こした。
【実施例】
【００５６】
実施例１：骨髄異形成に関連する慢性疾患のモデル
このモデルにおいて、３’非翻訳領域がＣ５７Ｂｌ／６背景上のベータグロビン遺伝子の３’非翻訳領域からの配列によって置換されたヒトＴＮＦアルファ導入遺伝子を持つＴｇ１９７マウスは、無秩序なヒトＴＮＦα遺伝子発現を示す。Ｃ５７Ｂｌ／６及びＴｇ１９７マウスにおけるエポエチン−αの薬理学を最初に比較した。次に、Ｔｇ１９７マウスにおけるＣＮＴＯ ５３０、エポエチン−α、及びダルベポエチンを比較した。
【００５７】
材料及び方法。９週齢のヘテロ接合Ｔｇ１９７−ＣＢＡ Ｆ１遺伝子導入マウス、年齢を適合させたＣ５７Ｂｌ／６マウス、及び年齢を適合させたＣＢＡ−Ｃ５７Ｂｌ／６ Ｆ１ハイブリッド（ＣＢＦ１）マウスは、Ａｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｏｙｅｒｔｏｗｎ、ＰＡ）、Ａｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ａｎｄ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）からそれぞれ入手した。トランスジェニックコロニーのための創始Ｔｇ１９７マウスは、Ｇ．Ｋｏｌｌｉａｓから入手した。種畜は、ホモ接合体として維持され、それらの関節炎を制御するために、マウス抗ヒトＴＮＦａ抗体（１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）の毎週の注入を受けた。これらの実験のために、ホモ接合性Ｔｇ１９７雄を、ＣＢＡ雌に繁殖させた。ＣＢＦ１マウスは、それらの疾病がホモ接合性のＴｇ１９７マウスにおいて見られるそれより遅く進行するため、使用した。マウスは、上部をフィルタで覆われたプラスチックの靴箱型ケージで群ごとに収容した（１ケージにつき４匹）。動物は、耳標いより個々に特定され、研究開始少なくとも１週間前に配置した。餌及び水は、自由に摂取可能であり、部屋は、１２時間明／暗周期を有した。全てのマウスは、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ Ｒ＆Ｄ，Ｉｎｃ．、Ｒａｄｎｏｒ ＰＡの無菌生態動物園において維持した。ＣｅｎｔｏｃｏｒのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅは、全ての関連する処置を承認した。
【００５８】
ＣＮＴＯ ５３０、組み換えヒトエリスロポエチン（エポエチン−α、ＯｒｔｈｏＢｉｏｔｅｃｈ、Ｒａｒｉｔｉａｎ ＮＪ）、ダルベポエチン（Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ、ＣＡ）、及びＰＢＳ。投与量は、ｍｇ／ｋｇ、又はＵＴ−７単位／ｋｇ（Ｕ／ｋｇ）として表した。
【００５９】
Ｃ５７Ｂｌ／６及びＴｇ１９７マウスにおけるエポエチン−αの薬理学を比較するために、研究動物は、表１に示される群に割り当てた。０日目、マウスは、被験物質（在庫から新たに希釈された）又はＰＢＳの重量調整された皮下注入を受けた。マウスは、ＣＯ2窒息によって安楽死させ、血液を各試料のために収集した。
【００６０】
【表２】
【００６１】
Ｔｇ１９７マウスにおけるＣＮＴＯ ５３０、エポエチン−α、及びダルベポエチンの比較薬理学：研究動物は、表２に示される群に割り当てた。０日目、マウスは、被験物質（在庫から新たに希釈された）又はＰＢＳの重量調整された皮下注入を受けた。マウスの群は、ＣＯ２窒息によって安楽死させ、血液／骨髄を収集した。
【００６２】
【表３】
【００６３】
血液学：モデル特徴付け及び薬理学研究におけるマウスからの血液試料は、表１及び２に示される時間で収集した。血液は、市販のＥＤＴＡでコーティングされたミクロチューブへ開胸心穿刺を介してＣＯ２混合物で麻酔されたマウスから収集した。血液解析は、ＡＤＶＩＡ１２０血液分析器（Ｂａｙｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、ＮＹ）を使用して全血に対して実施した。データを群平均±標準偏差として表す。
【００６４】
結果：データを群平均及び標準偏差としてか、又は対照からの群平均変化として表す。ＰＢＳ対照マウスの平均値は、１日目基準として使用した。図示するために、名目上の日は、採血の実際の日と１日異なる場合がある。
【００６５】
３０匹のＣＢＦ１及び５０匹のＴｇ１９７ＰＢＳ対照マウス（９〜１３週齢）に関する平均（±標準偏差）血液学的データを表３に示す。Ｔｇ１９７マウスは、年齢を適合させたＣＢＦ１マウスと比較して、わずかに低下したＨｇｂ（１ｇ／ｄＬ）及びＨｃｔ（２％）を示した。正常網状赤血球及び赤血球数、ＭＣＶ、及びわずかに低下したＭＣＨに基づいて、Ｔｇ１９７マウスは、軽度の代償性、正球性、低色素性の貧血を提示しているように説明することができる。
【００６６】
結果：Ｃ５７Ｂｌ／６及びＴｇ１９７マウスにおけるエポエチン−αの薬理学の比較の結果を図１に示す。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいて、エポエチン−αは、ヘモグロビンにおける用量依存性の増加を引き起こした。対照的に、Ｔｇ１９７マウスにおいて、０．０３〜０．３ｍｇ／ｋｇの間で用量反応はほとんどなかった。また、Ｔｇ１９７マウスにおける０．３ｍｇ／ｋｇのエポエチン−αに対するＨｇｂ反応は、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいて見られた、１５日目まで基準に戻らなかったＨｇｂにおける約１．５ｇ／ｄＬの増加と比較して、短期間であり（８日目までに基準まで戻った）、鈍化していた（〜１ｇ／ｄＬ）。
【００６７】
【表４】
【００６８】
Ｔｇ１９７マウスにおける薬理学研究の結果を図２に要約する。ＣＮＴＯ ５３０、エポエチン−α、及びダルベポエチンの間の直接比較を可能にするために、投与量をＵＴ−７単位／ｋｇに変換した。ＣＮＴＯ ５３０は、慢性疾患のＥＰＯ耐性貧血のモデルにおけるエポエチン−α又はダルベポエチンのいずれかより、Ｈｇｂにおけるより強い、かつより長く持続する反応を引き起こした。
【００６９】
実施例２．幹細胞因子受容体欠乏におけるＥＰＯ耐性
ｃ−ｋｉｔ、肝細胞因子のための受容体が不足しているマウスを使用して、造血過程における補助受容体の効果を証明した。
【００７０】
材料及び方法。雄及び雌ＷＢＢ６Ｆ１／Ｊ−ＫｉｔＷ／ＫｉｔＷ−ｖ（黒目、白毛、罹患、関連遺伝子型ａｌａ ＫｉｔＷ／ＫｉｔＷ−ｖ）（Ｗ／Ｗｖ）マウスは、５〜７週の年齢でＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥから入手した。これらのマウスは、ｃ−ｋｉｔ、ＳＣＦに対する受容体が不足している。マウスは、上部をフィルタで覆われたプラスチックの靴箱型ケージで群ごとに収容した。ＣＮＴＯ ５３０（３０ＵＴ−７単位／μｇ）及びエポエチン−α（１２０ＵＴ−７単位／μｇ）を試験し、ＰＢＳ、ｐＨ７．４を対照物質をして使用した。
【００７１】
研究設計：１日目、マウスは、表４に従ってエポエチン−α、ＣＮＴＯ ５３０、又はＰＢＳ（１０ｍＬ／ｋｇ）の重量調整された皮下（ｓ．ｃ．）投与量を受けた。性別ごとに３匹のマウスは、表４に従って指定の時点で各群ごとに出血させた。４、９、１４、及び２８（雄）、又は３０（雌）日目、マウスはＣＯ２で麻酔させ、血液試料（〜０．４ｍＬ）を血液学のために開胸心穿刺を介して取った。血液は、ＥＤＴＡで調製したチューブへ直接収集し、約１０秒間完全に混合し、凝固を防止するためのロッカー上に配置した。全血をＡＤＶＩＡ１２０血液分析器を使用して分析した。
【００７２】
【表５】
【００７３】
結果。データを群平均及び標準偏差としてか、又は対照からの群平均変化として表す。ＰＢＳ対照マウスの平均値は、１日目基準として使用した。図示するために、名目上の日は、採血の実際の日と１日異なる場合がある。
【００７４】
ＰＢＳを受けたａｌａ＋／＋及びＷ／Ｗｖマウスの血液学的分析は、Ｗ／Ｗｖマウスが軽度の大球性の正色素性貧血を有したことを明らかにした（表５）。Ｗ／Ｗｖマウスにおける％網状赤血球及び高ＲＮＡ含有量の網状赤血球の数は、ａｌａ＋／＋対照マウスより約２倍高かったが、網状赤血球の絶対数は、同様であった。これらをもとに、ＭＣＶ、ＭＣＨ、及び高ＲＮＡ網状赤血球数、並びに正常総網状赤血球数の増加は、肝細胞のレベルでの欠乏に加えて、これらのマウスが、ＥＢＣ成熟の後期における欠陥も有することを示唆した。
【００７５】
【表６】
【００７６】
ｃ−ｋｉｔ欠乏マウスが、エポエチン−αに対して低応答性であることを裏付けるデータを図３に示す。正常ａｌａ＋／＋同腹子におけるエポエチン−αの単回皮下投与後のＨｇｂにおける約２ｇ／ｄＬの増加と対照的に、Ｗ／ＷｖマウスにおいてＨｇｂにおける１ｇ／ｄＬ未満の増加があった。ＥＳＡに対するＷ／Ｗｖマウスの相対的ヘモグロビン応答を図４に示す。１２，０００Ｕ／ｋｇの投与量のＣＮＴＯ ５３０の単回皮下投与は、エポエチン−αに応答して見られるＨｇｂにおける１ｇ／ｄＬ未満の短期間の増加と比較して、ヘモグロビンにおける持続する約２ｇ／ｄＬの増加を引き起こした。したがって、ＣＮＴＯ ５３０は、幹細胞欠陥に続発する貧血のこのＥＰＯ耐性モデルにおいて、ｒＨｕＥＰＯよりもＨｇｂにおける強い、かつ長く持続する応答を引き起こした。
【００７７】
実施例３：Ｂ−サラセミアのＥＰＯ耐性モデル
Ｔｈ３＋／Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ｂ１及びｂ２グロビン遺伝子両方の欠失に対してヘテロ接合であるため（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．１９９５．Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，ＵＳＡ，９２：１１６０８〜１１６１２）、ベータサラセミアに関連する貧血につながるヘモグロビン合成の異常調節（異常ヘモグロビン症）の原型を作製する際に有用である。
【００７８】
材料及び方法。無菌生態動物園に維持される雄及び雌Ｔｈ３＋／Ｃ５７ＢＬ／６（ヘテロ接合）マウス。コロニーのための創始Ｔｈ３＋／Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ペンシルベニア大学から入手した。種畜は、ヘテロ接合体として維持された。Ｔｈ３＋／Ｃ５７ＢＬ／６を、血の気がない外観及び脾腫に基づいて薬理学研究のために選択した。選択戦略を予備的研究において検証した（以下参照）。ＣＮＴＯ５３０、組み換えヒトエリスロポエチン（エポエチン−α）（ＯｒｔｈｏＢｉｏｔｅｃｈ、Ｒａｒｉｔｉａｎ ＮＪ）、ダルベポエチン（ＡＲＡＮＥＳＰ（商標）、Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ、ＣＡ）を試験した。投与量は、ｍｇ／ｋｇ又はＵＴ−７単位／ｋｇ（Ｕ／ｋｇ）として表した。
【００７９】
予備的研究設計：７匹のＴｈ３＋／Ｃ５７ＢＬ／６及び７匹の正常同腹子は、ＣＯ2で麻酔させ、血液試料（０．４ｍＬ）を血液学のために開胸心穿刺を介して取った。血液は、ＥＤＴＡで調製したチューブへ直接収集し、約１０秒間完全に混合し、凝固を防止するためのロッカー上に配置した。全血をＡＤＶＩＡ １２０血液分析器を使用して分析した。
【００８０】
Ｔｈ３＋／Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＣＮＴＯ ５３０、エポエチン−α、及びダルベポエチンの比較薬理学の研究：０日目、マウスは、被験物質（在庫から新たに希釈された）又はＰＢＳの重量調整された皮下注入を受けた。１日目、８匹のマウスの群は、表６に従ってｒｈＥＰＯ、ＣＮＴＯ ５３０、エポエチン−α、又はダルベポエチンＣＮＴＯ ５３０調製緩衝液（１０ｍＬ／ｋｇ）の重量調整された皮下（ｓ．ｃ．）投与量を受けた。
【００８１】
【表７】
【００８２】
血液学：モデル特徴付け予備的研究におけるマウスからの血液試料は、単一時点で収集した。薬理学研究におけるマウスからの血液試料は、表６に示される時間で収集した。血液は、市販のＥＤＴＡでコーティングされたミクロチューブへ開胸心穿刺を介してＣＯ２混合物で麻酔されたマウスから収集した。血液解析は、ＡＤＶＩＡ １２０血液分析器（Ｂａｙｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、ＮＹ）を使用して全血に対して実施した。データを群平均±標準偏差として表す。データを群平均及び標準偏差としてか、又は対照からの群平均変化として表す。ＰＢＳ対照マウスの平均値は、１日目基準として使用した。図示するために、名目上の日は、採血の実際の日と１日異なる場合がある。
【００８３】
結果
Ｃ５７ＢＬ／６及びＴｈ３＋／Ｃ５７ＢＬ／６同腹子の血液学的分析の結果を表７に示す。Ｔｈ３＋／Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、年齢を適合させたＣ５７ＢＬ／６マウスと比較してＲＢＣ、Ｈｇｂ、及びＨｃｔ（２％）の低下を示し、Ｔｈ３＋／Ｃ５７ＢＬ／６としてのそれらの任務を確認した。著しい網状赤血球数、％網状赤血球、及び高ＲＮＡ網状赤血球数の増加に基づき、これらのマウスがそれらの貧血を修正しようしていることが明白である。この試みは効果がないということは、より小さい平均細胞体積（ＭＣＶ）、赤血球分布幅（ＲＤＷ）の増加、及び細胞ヘモグロビン指標の低下によって反映される。したがって、Ｔｈ３＋／Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、著しい小赤血球性の低色素性再生貧血を伴って提示するとして説明することができる。
【００８４】
【表８】
【００８５】
Ｔｈ３＋／Ｃ５７ＢＬ／６におけるＣＮＴＯ ５３０、エポエチン−α、及びダルベポエチンの薬理学：結果を図５においてグラフを使用して示す。ＣＮＴＯ ５３０、エポエチン−α、及びダルベポエチンの間の直接比較を可能にするために、投与量をＵＴ−７単位／ｋｇとして表す。１０，０００Ｕ／ｋｇの投与量のＣＮＴＯ ５３０の単回皮下投与は、エポエチン−α又はダルベポエチンに応答して見られるＨｇｂにおける１ｇ／ｄＬ未満の短期間の増加と比較して、ヘモグロビンにおける持続する約４ｇ／ｄＬの増加を引き起こした。したがって、ＣＮＴＯ ５３０は、ｂ−サラセミアのこのＥＰＯ低応答性のモデルにおいて、エポエチン−αよりもＨｇｂにおける強い、かつ長く持続する応答を引き起こした。
【００８６】
実施例４：鎌状赤血球病の動物モデルにおけるＣＮＴＯ５３０
鎌状赤血球病において、貧血は、赤血球産生欠損又は短い赤血球寿命から生じる。鎌状赤血球ヘモグロビンによって引き起こされる赤色細胞への損傷の改善又は予防のための可能な方法は、胎児性ヘモグロビンが赤血球ヘモグロビンの少なくとも一部を交換するか、又は表すことである。胎児性ヘモグロビン合成を刺激するＣＮＴＯ５３０の能力を検査した。
【００８７】
材料及び方法
１０匹の１６週齢のＨｂａ Ｈｂａｔｍ１Ｐ ｔｍ１Ｐａｚ ａｚ Ｈｂ Ｈｂｂｔｍ１Ｔ ｔｍ１Ｔｏｗ Ｔｇ（ＨＢＡ−ＨＢＢ（ＨＢＢｓ）４）４１Ｐ １Ｐａｚ／Ｊａｚ／マウスは、Ａｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｏｙｅｒｔｏｗｎ、ＰＡ）から入手した。トランスジェニックコロニーのための創始マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ ＭＥ）から入手した。Ｐａｓｚｔｙ ｅｔ ａｌ（Ｐａｓｚｔｙ ｅｔ ａｌ．１９９７ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：８７６〜８７８）によって最初に説明されたように、マウスアルファ及びベータグロビンのための遺伝子は、崩壊（ノックアウト）され、ヒトアルファ、ベータ（鎌状）及びガンマグロビン遺伝子に対してトランスジェニックである。したがって、それらは、ヒトヘモグロビンＡ（ＨｂＡｓｉｃｋｌｅ）（又は鎌状ヘモグロビン、ＨｂＳ）を排他的に発現し、ヒト胎児性ヘモグロビン（ＨｂＦ）も発現することができる。
【００８８】
マウスは、上部をフィルタで覆われたプラスチックの靴箱型ケージで群ごとに収容した。計７匹のマウスを使用した。実験は、３部で実施した。７日目、マウスは、ＣＯ2混合物で麻酔させ、ＨｂＦ（イオン交換クロマトグラフィグラフィ及び電気泳動による）評価及び％ＲＢＣ含有ＨｂＦ（フローサイトメトリーによる）の計数のために、ＥＤＴＡでコーティングされたミクロチューブへ眼窩後血管叢から毛細管により出血させた。１日目、マウスは、ＣＮＴＯ ５３０（在庫から新たに希釈された）の重量調整された皮下注入を受けた。投与量は、ｍｇ／ｋｇとして表した。９日目、血液は、ＥＤＴＡでコーティングされたミクロチューブへ開胸心穿刺を介してＣＯ2混合物で麻酔されたマウスから収集した。
【００８９】
ＡＤＶＩＡ １２０血液分析器（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、ＮＹ）を使用して、血液学的分析を９日目に全血に対して実施した。血液分析器からの総Ｈｇｂ値及び分光光度法で測定された全血希釈系列の結果（ＯＤ ４１５）を使用して、投与前の総Ｈｇｂ及び総Ｈｇｂの変化を計算した（以下参照）。
【００９０】
ＨｂＦのイオン交換クロマトグラフ分析は、Ｍｏｒｉｎ及びＢａｒｔｏｎの方法（Ｍｏｒｉｎ ａｎｄ Ｂａｒｔｏｎ １９８７）の後に実施した。つまり、５０μＬの新鮮な全血を２００μＬの蒸留Ｈ2Ｏ含有０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００及び２００ｍＭのＫＣＮ中で溶解し、凍結させ、−７０℃で保存した。分析の日、投与前後の試料を解凍し、１ｍＬの吸収緩衝液を添加した。吸収緩衝液は、２００ｍＭのビス−トリアセテート（ｐＨ４．５）、２００ｍＭのＫＣＮ、及び防腐剤として微量のトリクロロブタノールを含有した。１ｃｍの使い捨てミニカラムを３ｍＬのＳｅｐｈａｄｅｘ ＣＭ−５０（１０ｇ／吸収緩衝液中の４００ｍＬ）のスラリーで充填した。カラムは、最小限の真空下で排水させ、充填物はガラス原料で覆い、吸収緩衝液で洗浄した。
【００９１】
１ｍＬの溶解全血を充填物上に層状にした。投与前後の試料は、同時に動作させた。カラムは、非結合ヘモグロビンを除去するために、吸収緩衝液の１ｍＬアリコート２個で洗浄した。カラムを溶出緩衝液の２ｍＬアリコートで溶出し、２ｍＬの画分を重力下で収集した。（溶出緩衝液は、１００ｍＭのビス−トリアセテート（ｐＨ６）、４．８ｇ／Ｌのマグネシウムアセテート、２００ｍＭのＫＣＮ、及び防腐剤として微量のトリクロロブタノールを含有した。）
収集された画分（０．３３ｍＬ）のアリコートを９６ウェルプレートに移動させ、ＯＤ ４１５（Ｈｇｂのソーレーピーク）をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３４０ＰＣ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）上で読み取った。投与前後のＨｂＦ比率を各動物に対するピーク値（画分４）を使用して計算した。データを平均±標準偏差として表す。統計的有意性は、ｔ−検定によって決定した。Ｐ値＜０．０５を有意として認めた。
【００９２】
総ヘモグロビン濃度を計算するために、２５０μＬの残りの全血溶解物を２ｍＬに希釈し、一連の２倍希釈物を吸収緩衝液中で調製した。これらの希釈物（０．３３ｍＬ）のアリコートを９６ウェルプレートに移動させ、４１５ｎｍでのＯＤを記録した。これらの値を、血液分析器によって測定された総Ｈｇｂとともに使用して、投与前の値及び総Ｈｇｂにおける薬物性変化を計算した。データを平均±標準偏差として表す。統計的有意性は、ｔ−検定によって決定した。Ｐ値＜０．０５を有意として認めた。
【００９３】
胎児性ヘモグロビンを発現するＲＢＣ及び網状赤血球のフローサイトメトリー分析を、Ｂ Ｄａｖｉｓ及びＫ Ｄａｖｉｓの方法（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，２００４）の後に実施した。つまり、約２５×１０6ＲＢＣを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１ｍＬの冷却０．０５％グルタルアルデヒドで１０分間固定した。細胞を、ＰＢＳ中の２ｍＬの０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）０．１％アジ化ナトリウム（ＢＳＡ−ＰＢＳ）で洗浄し、５００μＬの０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００（ＢＳＡ−ＰＢＳ）で３〜５分間透過処理し、洗浄し、５００μＬのＢＳＡ−ＰＢＳ中で再懸濁した。１０μＬアリコートを、９６ウェル丸底プレートにおいて抗ＨｂＦ抗体（８０μＬのＢＳＡ−ＰＢＳ中の５μＬにおいて）で１５分間染色した（マウスモノクローナル抗ヒトＨｂＦ、クローンＨｂＦ−１（１２）Ｃｙ５（ＴＲＩ−ＣＯＬＯＲ（登録商標）、ＴＣ）（カタログ番号ＨＦＨ−０６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））。細胞を洗浄し、２００μＬのチアゾールオレンジ（Ｒｅｔｉｃ−Ｃｏｕｎｔ（商標）Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、カタログ番号３４９２０４）中で１５〜３０分間再懸濁した。染色は、Ｆｅｔａｌ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｋｉｔ（Ｆｅｔａｌｔｒｏｌ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＦＨ１０２、及びＢＤ Ｒｅｔｉｃ−Ｃｏｕｎｔ（商標）Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｋｉｔ（Ｔｒｉ−Ｌｅｖｅｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ）、カタログ番号３４０９９９で制御した。
【００９４】
データは、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ上で取得した。単分散細胞は、前方及び側方散乱に基づいてゲートで制御した。ＨｂＦ−１で染色された細胞は、ＨｂＦ＋として数え、チアゾールオレンジで染色された細胞は、網状赤血球として数えた。
【００９５】
データを％ＨｂＦ＋網状赤血球及び％ＨｂＦ＋総ＲＢＣに対する平均±標準偏差として表す。データは、正常に分布されたかったため、それらは、ｔ−検定による統計分析のために変形された記録である。Ｐ値＜０．０５を有意として認めた。
【００９６】
ヘモグロビンの電気泳動分析は、ＱｕｉｃｋＧｅｌ（登録商標）酸性ヘモグロビンキット（カタログ番号３５１９）、ＱｕｉｃｋＧｅｌ（登録商標）チャンバ（カタログ番号１２８４）、及びＴｉｔａｎ Ｐｌｕｓパワーサプライ（カタログ番号１５０４）（Ｈｅｌｅｎａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｅａｕｍｏｎｔ、Ｔｅｘａｓ）により実施した。全ての試薬は、ゲルを３４μＬの溶解物で充填し、１４０ボルトで２３分間動作させたことを除き、メーカーの使用説明書に従って供給された通りに使用した。ＡＦＳＣ Ｈｅｍｏ Ｃｏｎｔｒｏｌ（カタログ番号５３３１）を対照として使用した。
【００９７】
結果
総Ｈｇｂに対するＣＮＴＯ ５３０の効果を表８に示す。ＣＮＴＯ ５３０（０．３ｍｇ／ｋｇ）の単回ｓｃ投与量を受けた９日後、総Ｈｇｂにおける統計的に有意な（５．８ｇ／ｄＬ）増加があった。
【００９８】
【表９】
*投与前より統計的に大きい（Ｐ＝０．０１１、ｔ−検定）
【００９９】
ＨｂＦ（イオン交換クロマトグラフィグラフィ）に対するＣＮＴＯ ５３０の効果：イオン交換クロマトグラフィグラフィの結果を図６及び表９に示す。ＣＮＴＯ ５３０（０．３ｍｇ／ｋｇ）の単回ｓｃ投与量を受けた９日後、ＨｇＦにおける統計的に有意な増加があった。総Ｈｇｂにおける倍増加とＨｂＦにおける倍増加との間に有意差はなかった（ｔ−検定）。
【０１００】
【表１０】
【０１０１】
Ｈｇｂ電気泳動の結果を図７及び表１０に示す。ＣＮＴＯ ５３０（０．３ｍｇ／ｋｇ）の単回ｓｃ投与量を受けた９日後、ＨｂＦバンドは弱すぎて定量できなかったが、全ての７匹のマウスに対するＨｂＳ及びＨｂＦバンドにおいて認識できる増加があった。
【０１０２】
【表１１】
【０１０３】
ＨｂＦ＋細胞に対するＣＮＴＯ ５３０の効果：ＨｂＦ＋細胞のフローサイトメトリー分析の結果を表１１及び１２に示す。ＣＮＴＯ ５３０（０．３ｍｇ／ｋｇ）の単回ｓｃ投与量を受けた９日後、％ＨｂＦ＋網状赤血球における増加（４．５倍）及び総％ＨｂＦ＋細胞（網状赤血球及びＲＢＣ）における統計的に有意な増加（３．７倍）への傾向があった。
【０１０４】
【表１２】
*投与前より統計的に大きい（Ｐ＝０．０１１、ｔ−検定）
【０１０５】
【表１３】
*投与前より統計的に大きい（Ｐ＝０．０４４、ｔ−検定）
【０１０６】
（概要）
ＣＮＴＯ ５３０の単回ｓｃ投与量は、投与９日後に鎌状赤血球貧血のマウスモデルにおける胎児性ヘモグロビン（ＨｂＦ）の発現を増加させる。ＨｂＦの発現の増加は、鎌状赤血球マウスにおける臓器機能の増加（Ｆａｂｒｙ ｅｔ ａｌ．２００１ Ｂｌｏｏｄ ９７：４１０〜４１８）及び鎌状赤血球危機の発生の低下（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．２０００ Ｈｅｍａｔｏｌ ６４：２６〜３１）に関連する。したがって、ＣＮＴＯ ５３０による長期治療は、鎌状赤血球病の貧血を改善し、鎌状赤血球危機の発生を低下させるとみなすことができる。
【０１０７】
参照
Ｆｏｏｔｅ，Ｍａｒｙ Ａｎｎ；Ｃｏｌｏｗｉｃｋ，Ａｌａｎ；Ｇｏｏｄｋｉｎ，Ｄａｖｉｄ Ａ．Ａｍｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ，ＵＳＡ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎｌｙ ｅｎｃｏｕｎｔｅｒｅｄ ａｎｅｍｉａｓ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００２），７（２），４９〜５９．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｍａｒｔｉｎ Ｄｕｎｉｔｚ Ｌｔｄ．
Ｑ．Ｆａｎ，Ｋ．Ｌｅｕｔｈｅｒ，Ｃ．Ｈｏｌｍｅｓ，Ｋ．Ｆｏｎｇ，Ｊ．Ｚｈａｎｇ，Ｓ．Ｖｅｌｋｏｖｓｋａ，Ｍ．Ｃｈｅｎ，Ｒ．Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎ，Ｋ．Ｌｅｕ，Ｊ．Ｇｒｅｅｎ．２００６．Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｍａｔｉｄｅ，ａ ｎｏｖｅｌｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ，ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｅｍｉａ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ３４，Ｉｓｓｕｅ １０，Ｐａｇｅｓ １３０３〜１３１１
Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍｉｍｉｃｒｙ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｏｒｍｏｎｅ ｂｙ ａ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｇｏｎｉｓｔ：ｔｈｅ ＥＰＯ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｔ ２．８ ＡＮＧ．Ｌｉｖｎａｈ，Ｏｄｅｄ；Ｓｔｕｒａ，Ｅｎｒｉｃｏ Ａ．；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄａｎａ Ｌ．；Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，Ｓｔｅｖｅｎ Ａ．；Ｍｕｌｃａｈｙ，Ｌｉｎｄａ Ｓ．；Ｗｒｉｇｈｔｏｎ，Ｎｉｃｈｏｌａｓ Ｃ．；Ｄｏｗｅｒ，Ｗｉｌｌｉａｍ Ｊ．；Ｊｏｌｌｉｆｆｅ，Ｌｉｎｄａ Ｋ．；Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉａｎ Ａ．Ｄｅｐ．ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）（１９９６），２７３（５２７４），４６４〜４７１．
Ｙａｎｇ Ｂ，Ｓｕｚａｎｎｅ Ｋ，Ｌｅｗｉｓ Ｊ，Ｄｅｔｌｏｆｆ ＰＪ，Ｍａｅｄａ Ｎ，ａｎｄ Ｓｍｉｔｈｉｅｓ Ｏ，Ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｂ−ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，ＵＳＡ，Ｖｏｌ ９２：１１６０８〜１１６１２，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９５．
Ｔ．Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ａ．Ｔｏｊｏ，Ｔ．Ｋｕｗａｋｉ，Ｓ．Ｃｈｉｂａ，Ｋ．Ｍｉｙａｚｏｎｏ，Ａ．Ｕｒａｂｅ ａｎｄ Ｆ．Ｔａｋａｋｕ，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｏｎ ａ ｆａｃｔｏｒ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ，ＴＦ−１，Ｂｌｏｏｄ ７３：３７５〜３８０（１９８９）．
Ｄｕｆｏｕｒ Ｃ，Ｃｏｒｃｉｏｎｅ Ａ，Ｓｖａｈｎ Ｊ，ｅｔ ａｌ．ＴＮＦ−ａｌｐｈａ ａｎｄ ＩＦＮ−ｇａｍｍａ ａｒｅ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｏｆ Ｆａｎｃｏｎｉ ａｎｅｍｉａ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｎｄ ＴＮＦ−ａｌｐｈａ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｂｌｏｏｄ ２００３；１０２：２０５３〜２０５９．
Ｍｕｎｕｇａｌａｖａｄｌａ Ｖ，Ｄｏｒｅ ＬＣ，Ｔａｎ ＢＬ，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃ−ｋｉｔ ａｎｄ ｉｔｓ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｂｙ ＧＡＴＡ−１ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００５；２５：６７４７〜６７５９．
Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ Ｌｏｃａｔｅｌｌｉ，Ｂｒｕｎｏ Ｒｅｉｇｎｅｒ．Ｃ．Ｅ．Ｒ．Ａ．：ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ，ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｈｒｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇｓ，Ｏｃｔｏｂｅｒ ２００７，Ｖｏｌ．１６，Ｎｏ．１０，Ｐａｇｅｓ １６４９〜１６６１（ｄｏｉ：１ ０．１５１７／１３５４３７８４．１６．１０．１６４９）
Ｗｏｏｄｂｕｒｎ ＫＷ，Ｆａｎ Ｑ，Ｌｅｕｔｈｅｒ ＫＫ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｍａｔｉｄｅ［ＴＭ］，ａ ｎｏｖｅｌ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｇｏｎｉｓｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｅｍｉａ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｋｉｄｎｅｙ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｂｌｏｏｄ．２００４；１０４：２９０４．
Ｓｔｅａｄ ＲＢ，Ｌａｍｂｅｒｔ Ｊ，Ｗｅｓｓｅｌｓ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ Ｈｅｍａｔｉｄｅ，ａ ｎｏｖｅｌ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｃ ａｇｅｎｔ，ｉｎ ａ ｐｈａｓｅ １，ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ，ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，ｄｏｓｅ−ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ．Ｂｌｏｏｄ．２００６；１０８：１８３０〜１８３４．
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ＦｉｂｒｏＧｅｎ Ｒｅｐｏｒｔｓ Ｐｈａｓｅ １ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｏｒａｌ Ａｎｅｍｉａ Ｔｈｅｒａｐｙ，ＦＧ−２２１６，ａｎｄ Ｎｅｗ Ｄａｔａ ｆｒｏｍ Ｐｈａｓｅ ２Ａ Ｓｔｕｄｙ ｉｎ Ａｎｅｍｉｃ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｐａｔｉｅｎｔｓ．ｗｗｗ．ｆｉｂｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｎｅｗｓ／ｆｇ２００４１２０６．ｈｔｍｌで閲覧可能。２００７年５月９日にアクセスした。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００８年１月７日に出願された米国出願第６１／０１９，３６７号に対する優先権を請求し、この内容は、参照することにより、その全体として本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、ＥＰＯ模倣ペプチド組成物を使用して、遺伝的病因とされる貧血、及び慢性疾患に続発するそれらを治療する方法を提供する。本発明は、特に、貧血が組み換えヒトエリスロポエチンに対して低応答性である状態での貧血の治療を意図する。
【背景技術】
【０００３】
（関連技術の説明）
貧血は、複数の病因を有し、食物摂取不足、例えば、鉄、又は先天性異常によって引き起こされ得るか、又は慢性腎疾患、癌、若しくはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症等の他の病理に関連し得る。同様に、貧血は、末期腎疾患、癌、又はＨＩＶ感染症を伴う患者において罹患率及び死亡率の増加に関連する。貧血のそれぞれの場合のための最も適切な治療を特定することは、貧血の病因、及び存在する場合は原因となる医学的状態の理解を必要とする。慢性腎疾患を伴う貧血は、ホルモン、エリスロポエチンを含む天然赤血球生成の低下による。巨赤芽球性貧血等の他の例では、不十分な赤血球生成は、ビタミン、又は葉酸欠乏症による。貧血の多様な提示は、同等に多様な薬理学的及び支持的治療法を必要とする。
【０００４】
自然発生のエリスロポエチン（ＥＰＯ）は、赤血球の産生（赤血球生成）を仲介する主要成長因子である糖タンパク質ホルモンである。赤血球生成の刺激により作用する現在承認されている製品としては、組み換えヒトエリスロポエチン（ＥＰＲＥＸ（商標）、ＰＲＯＣＲＩＴ（商標）、エポチンアルファ、Ｎｅｏｒｅｃｏｒｍｏｎ（商標）、エポチンベータ）、及びダルベポエチンアルファ（エリスロポエチンの高度にグリコシル化された変異型である組み換え技術によって産生されたタンパク質）を含む製品を含む。これら、いわゆる赤血球生成促進剤（ＥＳＡ）は、癌化学療法及び慢性腎疾患（ＣＫＤ）に続発する貧血における輸血を回避するために承認される。赤血球生成を刺激するための多数の他の組成物が、探求されている。ＥＳＡは、エリスロポエチン受容体（ＥＰＯ−Ｒ）、例えば、ＥＭＰ−１及び変異型（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８及びＷｒｉｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６）、及びＰＥＧ化された合成ペプチド由来の作成物（Ｆａｎ ｅｔ ａｌ ２００６、米国特許第６７０３４８０号、同第７０８４２４５号）に結合し、それを活性化する組成物のためのペプチドライブラリのスクリーニングによって特定されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
癌化学療法及びＣＫＤにおいて、ＥＳＡを投与する論理的根拠は、成熟赤血球を維持又は補充するために、損失したか、又は不十分なレベルで存在する内因性エリスロポエチンの交換又は補給である。しかしながら、恐らく癌化学療法患者の５０％以上は、毎週４００，０００単位の承認されているＥＳＡ、エリスロポエチン、及び２週間おきの２００マイクログラムのダルベポエチンの従来の投与量に対して十分に応答できず（Ｖａｓｕ ｅｔ ａｌ．，２００６）、ＣＫＤ患者の１５％が、制限された利益しか得ていない（Ｒｏｓｓｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００７）。承認されているＥＳＡは、異常ヘモグロビン症、例えば、ベータサラセミア（Ｍａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００１及びＫｏｈｌｉ−Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，２００２）、鎌状赤血球貧血（Ｒｏｄｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３）において、及び骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）（Ｍｕｎｄｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００６及びＭｕｓｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００６）において「認可されてない」状態でも使用されている。これらの病状において、貧血は、赤血球産生欠損又は短い赤血球寿命から生じ、承認されているＥＳＡは、制限された治療的成功を有している。したがって、より予測可能な応答性を提供し、ＥＰＯ又はＥＰＯ由来のＥＳＡに対して耐性又は低応答性である貧血における治療的有効性を提供するＥＳＡの必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
異常ヘモグロビン症又は骨髄異形成によって引き起こされる貧血として特徴付けられる低血中ヘモグロビン値又は血中の赤血球の低レベルに特徴がある疾患を有する対象を治療する方法であって、方法は、患者の造血組織を、二量体ポリペプチドを含む化合物の治療的有効量に接触させるステップを含み、各ポリペプチドは、エリスロポエチン模倣ペプチド（ＥＭＰ）及びヒト免疫グロブリンドメインを含み、二量体ポリペプチド組成物は、エリスロポエチン依存性細胞を増殖させることが可能である、方法。本発明の特定の実施形態では、異常ヘモグロビン症は、鎌状赤血球病を有するか、又はＨｇｂＳを発現する対象、又はベータサラセミアを有する対象によって引き起こされる。別の実施形態では、患者は、貧血につながる骨髄異形成を引き起こす腎臓の慢性疾患を患っている。更に別の実施形態では、患者は、貧血につながる骨髄異形成を引き起こす造血組織幹細胞因子受容体の欠陥を有する。
【０００７】
対象における貧血を治療する方法の一実施形態では、造血組織は、生体内で接触され、本発明の組成物は、対象に投与される。貧血を治療する方法の別の実施形態では、造血組織は、生体外で、本発明の組成物と接触される。
【０００８】
本発明の一実施形態では、ＥＭＰは、ＥＭＰ−１に指定される。本発明の特定の実施形態では、組成物は、配列番号２又は配列番号３のジスルフィド結合したポリペプチドのホモ二量体を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】Ｃ５７／Ｂｌ対Ｔｇ１９７マウスにおけるＨｇｂに対するＥＰＯの効果を示すグラフであり、ヒト腫瘍壊死因子−αの発現は、慢性炎症性疾患による貧血を形に表す。
【図２】同等のＵＴ７活性単位の単回ｓ．ｃ．注射投与後の、Ｔｇ１９７マウスにおける血清Ｈｇｂに対する、エポエチン−α及びダルベポエチンアルファ（ダルべ）と比較した、ＣＮＴＯ ５３０の効果を示すグラフ。
【図３】ＳＣＦ受容体欠乏症のモデルであるｃ−ｋｉｔ欠損（Ｗ／Ｗｖ）マウスにおけるＨｇｂに対するエポエチン−αの効果を示すグラフ。
【図４】ｃ−ｋｉｔ欠損（Ｗ／Ｗｖ）マウスにおけるヘモグロビンに対する、エポエチン−αと比較した、ＣＮＴＯ ５３０の効果を示すグラフ。
【図５】ベータサラセミアのモデルであるＴｈ３＋／Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＨｇｂに対するＣＮＴＯ ５３０、エポエチン−α及びダルベポエチン投与量（ＵＴ−７単位／ｋｇとして表される）の効果を示すグラフ。
【図６】イオン交換クロマトグラフィによって測定された、ヒトＨｂＳ遺伝子導入マウスにおけるＨｂＦに対するＣＮＴＯ ５３０（０．３ｍｇ／ｋｇ）の効果を示すグラフであり、ピーク画分（４）を使用して投薬前／後比率を評価。
【図７】ＣＮＴＯ５３０（０．３ｍｇ／ｋｇ）による治療前及び治療後９日目の遺伝子導入マウスにおける見本からの赤血球溶解物で充填された染色された酸性アガロース電気泳動ゲル、及びＨｇｂ標準で充填された第３のラインを示し、Ｆ＝ＨｂＦ、Ａ＝ＨｂＡ、Ｓ＝ＨｂＳ、Ｃ＝ＨｂＣ。
【００１０】
【表１】
【発明を実施するための形態】
【００１１】
略語
ＥＭＰエリスロポエチン模倣ペプチド；ＥＰＯヒトエリスロポエチン；ＥＰＯ−Ｒエリスロポエチン受容体；ＥＳＡ赤血球生成促進剤；Ｈｇｂヘモグロビン；Ｈｃｔヘマトクリット；ＨＰＦＨ遺伝性高胎児ヘモグロビン症；ＳＣＦ幹細胞因子；ＩＬインターロイキン；ＧＨ成長ホルモン；ＧＭ−ＣＳＦ顆粒球マクロファージコロニー刺激因子；ＭＣＨ平均（赤）細胞ヘモグロビン；ＭＣＶ平均（赤）細胞体積；ＲＢＣ赤血球、赤血球；ＴＮＦ−α腫瘍壊死因子アルファ；
【００１２】
定義
「貧血」は、概して、正常値以下であり、衰弱、めまい、息切れ、及びより重度の病的状態のリスクを含む個人の健康及び行動への影響に関連する血中のヘモグロビン値を意味する。低血清Ｈｇｂは、正常より少ない赤血球数又はＲＢＣにおける正常より少ないＨｇｂの結果であり得、それらを非常に小さくするか（小赤血球、低ＭＣＶ）、又は不十分に色素沈着させる（低色素性、低ＭＣＨ）。低い数の正常に形成されたＲＢＣは、血中ヘマトクリット（Ｈｃｔ、ＲＢＣによって占有される血液量の割合）を低下させる。したがって、血清Ｈｇｂレベルの発現は、赤血球数及び赤血球Ｈｇｂ補体の全ての可能な事態を包含し、通常、ｇｍ Ｈｇｂ／ｄＬ血液で与えられる。成人における正常Ｈｇｂの定義は、異なるが、成人男性に対する平均Ｈｇｂは、１３〜１４ｇｍ／ｄＬであり、女性に対しては、１１．６〜１２．３ｇｍ／ｄＬであり、これらの低レベル以下の値は、貧血とみなされることがある（Ｂｅｕｔｌｅｒ ａｎｄ Ｗａａｌｅｎ ２００６ Ｂｌｏｏｄ １０７：１７４７〜１７５０）。年齢、遺伝的背景、及び個人が居住する標高等の他の要因は、良い健康及び行動のために必要とされる血清Ｈｇｂの量に影響を与え得る。貧血療法に対する反応性は、血清Ｈｇｂ濃度の増加として測定される。
【００１３】
「ＥＰＯ」又は「エリスロポエチン」又は「ｒｈＥＰＯ」は、配列番号１、単離天然エリスロポエチンの同一アミノ酸配列において、及びＵｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｐ０１５８８成熟鎖において示される１６６のアミノ酸配列を有する、人体において合成されるか、又は組み換え技術によって作製されるポリペプチド鎖モノマーである組成物を意味する。ＥＰＯは、活性分解産物、特にＣ末端切断を含み、グリコシル化若しくは非グリコシル化されるか、又はそうでなければＰＥＧ化、若しくはポリペプチド鎖上の特異的又は非特異的部位でのカルバモイル化（国際公開第ＷＯ２００４００３１７６号参照）等によって修飾されてもよい。体内では、ＥＰＯは、主に腎臓において、及びより少ない程度で肝臓において作製される。組み換え技術によって作製されたヒトＥＰＯ及び組み換え修飾ＥＰＯ組成物は、赤血球生成以外に生物活性を提示することが示されている（Ｂｕｎｎ，ＨＦ ２００７．Ｂｌｏｏｄ １０９：８６８〜８７３）。
【００１４】
「ＥＰＯ由来の」ＥＳＡは、ＥＰＯとの相当な配列同一性を有する、組み換え技術によって作製されることが可能であるポリペプチド鎖モノマーである組成物を意味する。相当な配列同一性は、配列整合アルゴリズムを使用して、ＥＰＯ由来のＥＳＡ及びＥＰＯの配列が一致することができ、２つの配列の間の割合同一性が８０％以上であることを意味する。ＥＰＯ由来の生成物の例としては、米国特許第７２１７６８９号に記載される配列番号１（ＥＰＯ）の変異型ポリペプチド鎖配列を含むダルベポエチンアルファ（ＡＲＡＮＥＳＰ（商標）、Ａｍｇｅｎ、ＣＡ）、その構造が大きいポリマー鎖を組込み、それに延長した半減期を提供するＥＳＡである、化学名メトキシポリエチレングリコールエポエチンベータ（ＭＩＣＥＲＡ、ＲＲｏｃｈｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で周知でもあるＣ．Ｅ．Ｒ．Ａ．（持続性エリスロポエチン受容体活性化剤）、及びその他（欧州特許第１１９６４４３Ｂ１号）を含む。
【００１５】
「ＥＰＯ模倣ペプチド」は、それによって、実質的に配列は、自然発生のＥＰＯと整合することはできないが、ＥＰＯ模倣ペプチドは、ＥＰＯ−Ｒ特異的結合、及びＵＴ７細胞増殖の刺激等であるが、それらに限定されない、ＥＰＯと同様である赤血球生成活性を示す、配列において接続される天然、又は天然及び非天然アミノ酸残基の組み合わせを有する組成物を意味する（Ｋｏｍａｔｓｕ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ８２（２），４５６〜４６４，１９９３）。ＥＰＯ模倣ペプチドの例としては、配列ＧＧＴＹＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫＰＱＧＧ（配列番号２及び３の残基４〜２３）によって与えられる。
【００１６】
ヒトＥＰＯ受容体即ち「ＥＰＯ−Ｒ」は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿０００１１２（配列番号４）によって与えられるアミノ酸配列を有し、成熟鎖は、残基２５〜５０８によって表され、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを有する。
【００１７】
「赤血球生成」、また「赤血球形成」は、それによって、多能性造血幹細胞（ＨＳＣ）が、主として成熟ヘモグロビン四量体からなる無核細胞である成熟赤血球（赤血球）に分化する過程を意味する。赤血球の前駆細胞は、骨髄又は脾臓の間質細胞からの信号に応答する。赤血球生成の過程は、赤芽球が、赤血球前駆細胞によって囲まれるマクロファージからなる赤芽球島として組織される骨髄において行われる。マクロファージは、赤血球生成活性を制御する細胞伝達物質、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、及び幹細胞因子（ＳＣＦ）（コロニー形成単位赤血球マクロファージ顆粒球巨核球（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）及びバースト形成単位赤血球（ＢＦＵ−Ｅ）を生成する）の多くを提供するが、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−アルファ（Ｄｕｆｏｕｒ ｅｔ ａｌ．２００３ Ｂｌｏｏｄ １０２：２０５３〜２０５９）、及びＭＩＰ１−アルファは、細胞周期活性及びＢＦＵ−Ｅ成長を阻害する。ＥＰＯは、コロニー形成単位赤血球系（ＣＦＵ−Ｅ）細胞の増幅を誘導し、多くの赤血球特異的イベントによる分化、概して２日の期間にわたって伸展する過程を開始する。ＳＣＦ及びＥＰＯは、ヒト赤芽球前駆細胞及び前駆体の増殖を駆動するように相乗作用を与える。
【００１８】
組成物
ＣＮＴＯ ５２８及びＣＮＴＯ ５３０は、ＥＰＯ模倣ペプチド抗体融合タンパク質であり、それらの成熟形において、ＥＭＰ１ペプチドの２つの複製、及びヒトＩｇＧ抗体の部分を含む（米国特許第７２４１７３３号、米国特許第２００４９３５００５号、国際公開第ＷＯ２００４００２４２４ Ａ２号、同第ＷＯ２００５０３２４６０号）。ＣＮＴＯ５２８は、配列番号２において示されるポリペプチドのホモ二量体であり、ＣＮＴＯ５３０は、配列番号３のホモ二量体であり、両方とも分子の免疫グロブリン由来部分に存在するシステイン残基を介するジスルフィド結合によって共有結合し、グリコシル化されるか、又はされない場合がある。米国特許第６７０３４８０号及び同第７０８４２４５号に記載されるもの等の他の二量体ペプチド由来の作成物は、本発明の方法においても有用であってもよい。
【００１９】
ＣＮＴＯ ５２８、ＣＮＴＯ ５３０、及びＨＥＭＡＴＩＤＥは、様々な生体外及び生体内の検査システムにおいて薬理活性である。単量体ＥＭＰ−１は、約２００ｎＭのＥＰＯ−Ｒに対する結合親和性を有するが、ＣＮＴＯ ５２８及びＣＮＴＯ ５３０は、約１０ｎＭの結合定数でＥＰＯ受容体と結合し、アポトーシスを抑制し、赤血球生成の様々な生体外モデルにおいて細胞成長を刺激する際に活性であり、生体内で動物モデルにおける赤血球生成を刺激する。ＥＰＯ−Ｒ結合ペプチド、ペプチド誘導体、及び他のＥＰＯ模倣物質の二量体形は、二重結合ドメインが、適切に配向される時に（Ｂａｌｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ．１９９８．Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌ ５：９３８〜９４０）、情報伝達複合体を形成するように、その場でのＥＰＯ−Ｒの細胞外ドメインを適切な近接及び配向へ移動させる際に、ＥＰＯ−Ｒを活性化する際のモノマーより強力であることがある（Ｌｉｖｎａｈ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．１９９６．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：４６４〜４７１；Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．１９９７．Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ４：９３９〜５０）ことが認識されている。したがって、配列番号２及び３の二量体形を含むもの等であるが、それらに限定されない、双対又は二量体形で存在する、ヒトＥＰＯのアミノ酸配列と実質的に同一ではないＥＳＡは、本発明の対象組成物である。
【００２０】
配列番号２及び３の二量体形は、Ｇクラス免疫グロブリン（Ｆｃ）のパパイン分解から生じる結晶化可能フラグメントに類似することが周知である構造を更に含む。抗体のＦｃ領域は、補体に結合し、それと相互作用する能力、免疫系の循環及び非循環細胞及び組織上のＦｃ特異的受容体に結合し、それを活性化する能力等の、ある非抗原結合機能を提供する。組成物のＦｃ領域は、血流の血漿区画内に留まり、腎臓ろ過に抵抗し、ＦｃＲｎ受容体を含む、周知及び非周知の受容体によって細胞膜にわたって運搬される能力に関係する利点も付与する。配列番号２及び３の二量体形の複雑な構造によって付与されるこれら、及び他の利点は、抗体工学の分野のそれらの施術者によって認識される。したがって、成熟構造のＦｃ領域特性と組み合わせて前述されたＥＭＰペプチドの二量体提示は、配列番号２及び３の二量体形によって証明される赤血球生成刺激の方法の履行に比類なく好適である。
【００２１】
組成物の赤血球生成活性を試験し、投薬する方法
ＥＰＯ活性の「国際単位」又は「ＩＵ」は、５マイクログラムのコバルトと同量の赤血球刺激を与えるＥＰＯ（配列番号１）の量として定義される。コバルト、鉄及びニッケルのものと同様の特性を伴う天然元素は、エリスロポエチン遺伝のより効率的な転写による顕著かつ安定した赤血球増加応答を誘導する。ＥＰＯ検定のための国際参照基準は、単離ヒト尿中ＥＰを使用する。ＥＰＯ標準は、参照ＥＰＯ製剤、特に、Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＨＯ）又はＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＮＩＢＳＣ）によって供給されるＳｅｃｏｎｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ ｆｏｒ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ−Ｄｅｒｉｖｅｄ ＥＰＯに対して検査される。活性の単位は、５ミクロモルのコバルトと同量の赤血球刺激を与えるＥＰＯの量として定義される。しかしながら、通常、ＥＰＯ製剤は、参照基準に対する生物学的検定において検査される。ヒト尿中ＥＰＯは、典型的に、約７０，０００Ｕ／ｍｇのタンパク質の特異的活性を有するが、ヒト組み換えＥＰＯに関して報告される値は、生成物の炭水化物（グリコシル化）含有量によって、１００，０００〜２００，０００Ｕ／ｍｇの範囲にあってもよい。
【００２２】
他の生体内及び生体外検定を使用して、赤血球生成活性の量を評価することができる。例えば、赤血球生成活性は、造血系の細胞株、例えば、骨髄又は脾臓由来の細胞（ＦＤＣ−Ｐ１／ＥＲ、ＥＰＯ−Ｒが安定に導入された、よく特徴付けられた非形質転換マウス骨髄由来の細胞株（Ｄｅｘｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９８０ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５２：１０３６〜１０４７）、又はＴＦ１（Ｋｉｔａｍｕｒａ，ｅｔ ａｌ．，１９８９ Ｂｌｏｏｄ ７３：３７５〜３８０）若しくはＵＴ７細胞（Ｋｉｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．１９８９．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４０：３２３；Ｋｏｍａｔｓｕ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ８２（２），４５６〜４６４，１９９３）等のＥＰＯ反応性腫瘍細胞株、又は成長に対してＥＰＯに依存するように操作された細胞株の短期培養において生体外で測定することができる。
【００２３】
本発明の方法において有用な組成物を特定し、検査する際に特に有用なのは、ＵＴ７細胞増殖検定である。ＵＴ７は、ＥＰＯ依存性になるように適合されたヒト白血病細胞株である。低血中ヘモグロビン含有量を有する対象に投与される組成物又は投与量の選択のためにＵＴ７細胞増殖検定を使用するために、細胞を、通常培地が無くなるように洗浄し、検定前２４時間ＥＰＯ不足にさせる。例えば、ＵＴ−７細胞飢餓は、添加Ｌ−グルタミン酸及び５％でのＦＢＳ（Ｉ５Ｑ）を伴うＩＭＤＭ培地において開始することができる。その後、細胞は調製され、６×１０5細胞／ｍＬの最終濃度まで適切な培地において懸濁される（９６ウェルチャンバにつき３０，０００細胞の最終濃度を産生する）。ＥＰＯ標準は、ＥＰＯストックを５ｎｇ／ｍＬに希釈し、Ｉ５Ｑ培地において０．００９８ｎｇ／ｍＬの濃度まで１：２連続希釈法によって調製される。得られた希釈物は、２．５ｎｇ／ｍＬ〜０．００２４ｎｇ／ｍＬの濃度の標準を提供する（試験ウェル内での最終ｒ倍希釈後）。試験試料は、同様の方法で希釈される。ＵＴ−７細胞懸濁液の５０マイクロＬアリコートは、対応するウェルに移動され、プレートは、３７℃で４８時間培養された。細胞増殖は、メーカーの使用説明書に従って、ＰｒｏｍｅｇａのＭＴＳ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）等の生体染色法を使用して評価される。ＥＣ５０は、発色団の吸光度及び他の信号の増加によって測定される濃度対増殖の曲線適合から計算される。未修飾ＥＰＯに対するＥＣ５０は、約１．８×１０-11Ｍである。この値を使用して、他の薬剤のためのＵＴ７単位は、ＥＰＯに標準化される。
【００２４】
ＵＴ−７ｒＨｕＥＰＯ同等物を計算する。
【００２５】
ＵＴ−７単位／μｇ＝Ｍｏｌ ｗｔ×Ｃ／試験化合物に対するＥＣ50であり、Ｃは、同じ検定条件下でｒＨｕ ＥＰＯの活性から算出される定数であり、ｒＨｕ ＥＰＯの周知の薬理学的特異的活性は、周知である（例えば、１２０Ｕ／μｇ）。
【００２６】
【数１】
【００２７】
試験化合物に対するＥＣ50は、ＵＴ−７生死判別検定を使用して、濃度対応答に適合される曲線から算出され、５０％最大細胞増殖活性での濃度を見つけることが到達される。したがって、投与されるＥＳＡの投与量は、それぞれのｍｇ／ｋｇ投与量を、各化合物の生体外活性で乗ずることによって、ｍｇ／ｋｇからＵＴ−７Ｕ／ｋｇへ変換されてもよい。
【００２８】
赤血球生成は、生体外で反復され、半固体の細胞培養におけるＢＦＵ−ｅ及びＣＦＵ−ｅによる研究は、この過程の我々の理解に加えたが、骨髄間質細胞及びマクロファージは、幹細胞及び赤芽球島のための微環境を作製することに重要な役割をそれぞれ果たす（Ｓａｄａｈｉｒａ ａｎｄ Ｍｏｒｉ，１９９９）。これらの細胞は、様々なサイトカイン及び接着分子を発現し、マクロファージは、赤芽球のためのナース細胞として作用するように想定される。骨髄マクロファージは、通常、相当量のフェリチンを含有するため、それらは鉄代謝に対する影響も有する可能性がある。調製及び培養技術によって、これらの細胞及びそれらのサイトカインの機能は、生体外系において損失され得る。したがって、生体外で行われる観察は、生体内設定へ直接翻訳されない場合がある。
【００２９】
赤血球生成活性のための生体内生物学的検定は、赤血球生成を修飾する他の化合物及び内因性物質によって更に影響され得る。これらの理由で、動物を使用する生体内検定は、注意深く制御されなければならない。これらの本来的な相違を反映し、食事による鉄の摂取量、炎症の有無、他の成長因子、ステロイドホルモン等のパラメーターを制御する疾病のモデルを使用して、赤血球生成及び療法に対する応答の特徴を研究することができる。
【００３０】
配列番号２及び３のホモ二量体構造によって例示され、本明細書に記載されるＥＰＯ模倣物質融合タンパク質の投与量は、０．１単位／ｍＬ〜２０単位／ｍＬ、好ましくは０．５単位／ｍＬ〜２単位／ｍＬ、又はその中の任意の範囲又は値で使用することができるＥＰＯと活性において同等に投与されてもよい。赤血球生成又は非赤血球生成のいずれかであるＥＰＯ模倣物質融合タンパク質の使用の他の用途において、投与される投与量は、赤血球生成単位に関連する必要はない。
【００３１】
出願人は、ＥＰＯ模倣ペプチドの二量体作成物を含む非エリスロポエチン由来のＥＳＡを使用してこれらの疾病を有利に治療し得ることを、異常ヘモグロビン症及び骨髄異形成の動物モデルを使用して思いがけなく発見した。加えて、出願人は、ＣＮＴＯ５２８及びＣＮＴＯ５３０が、同じモデルにおける他のＥＳＡと比較して、生体外ＥＰＯ依存性細胞増殖活性に基づいてより大きい程度及び／又はより持続した期間、血中Ｈｇｂの増加として証明される赤血球生成及び造血を刺激することを、生体内モデルを使用して示している。
【００３２】
組成物を使用する方法
慢性腎疾患を伴う患者の約５〜１０％は、皮下経路によって投与される週１回の３００ＩＵ／ｋｇのエリスロポエチン又は週１回の１．５μｇ／ｋｇのダルベポエチンの連続的な必要性として定義される、ＥＳＡに対する低応答性を証明する。そのような低応答性は、慢性腎疾患における罹患率、死亡率、及び医療経済的負担の著しい一因であり、重要な診断上及び管理挑戦を提示する。ＥＳＡ耐性の最も一般的な原因は、ノンコンプライアンス、絶対的、又は機能的鉄欠乏症及び炎症である。十分な鉄貯蔵を維持することは、ＥＳＡに対する必要条件を減少させ、それの有効性を高めるために重要であることが広く受け入れられている。ＥＳＡ低応答性は、ＥＳＡ組成物又は宿主因子に特異的な様々な要因のためであり得る。ＥＳＡ低応答性のいくつかの確立した原因は、不十分な透析、副甲状腺機能高進症、栄養不足（ビタミンＢ１２、葉酸、ビタミンＣ、カルチニン）、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシン受容体遮断薬、アルミニウム過剰、抗体仲介赤芽球癆、原発性骨髄疾患、骨髄抑制薬剤、異常ヘモグロビン症、溶血及び脾機能高進症（概説のために、Ｊｏｈｎｓｏｎ，ＤＷ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ ｈｙｐｏｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ．Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ １２（４），３２１〜３３０を参照）を含む。
【００３３】
いずれの１つの動作理論に拘束されたくないが、ある機械論的考察は、ＥＰＯ模倣ペプチド組成物と一本鎖ポリペプチド組成物との間の相違を定義する。造血成長ホルモン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）の機能的模倣は、ＥＭＰ−１ペプチドのある二量体提示によって到達することができる。ＥＰＯ受容体の細胞外ドメインを伴うこの作動ペプチドの複合体の０．０００２８μｍ（２．８オングストローム）解像度での結晶構造は、ＥＭＰ−１ペプチド二量体が受容体の二量化を誘導することを明らかにする。ＥＰＯ−Ｒ及びヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）受容体は、ある構造的特徴を共有するが、ｈＧＨ受容体リガンド複合体は、ＥＰＯ−ＥＰＯＲ二量体錯体と異なり、二量化の２つ以上の様式が、信号伝達及び細胞増殖を誘導することが可能であってもよいことを示唆する（Ｌｉｖｎａｈ，ｅｔ ａｌ．１９９６ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３（５２７４）：４６４〜４７１）。結合領域に、及び配列番号２及び３等であるが、それらに限定されない免疫グロブリンＧクラス定常ドメインに融合したＥＭＰ−１のホモ二量体を表すＣＮＴＯ５２８及びＣＮＴＯ５３０は、ＥＰＯ受容体信号伝達を誘導するように空間的配向に到達し（配列番号４）、赤血球生成を刺激するが（国際公開第ＷＯ０４／００２４２４号；Ｂｕｇｅｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｌｏｏｄ １０６（１１）：Ａｂｓｔｒａｃｔ ４２６１；Ｆｒａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｌｏｏｄ １０６（１１）：Ａｂｓｔｒａｃｔ ４２８３；国際公開第ＷＯ０５０３２４６０Ａ２号を参照）、これらの作成物及び得られたホモ二量体３次元構造に特有の性質により、ＥＰＯ受容体と相互作用するそれらの能力に特有の特徴は、天然ＥＰＯと異なる活性スペクトルをこれらの分子に提供してもよい。加えて、ＣＮＴＯ５３０及びＣＮＴＯ５２８を含む、ペプチド模倣物質ＥＳＡの１次、２次、３次、及び４次構造は、天然ＥＰＯと異なるため、作成物は、分布、代謝、及び抗原性の異なるパターン、又はそれらの不足を有する。出願人は、ＥＭＰ１を含む作成物が、組み換えヒトＥＰＯの単一ポリペプチド鎖又は天然ＥＰＯタンパク質配列の単一ポリペプチド鎖変異型（ダルベポエチン）の生体外に基づく生物活性単位（ＥＳＡ依存性細胞増殖）と比較して、ヘモグロビン応答の程度及び／又は持続時間に関して、高められた赤血球生成を誘発することを、異常ヘモグロビン症及び骨髄異形成から生じるヒト貧血の動物モデルを使用して、思いがけなく見出している。
【００３４】
異常ヘモグロビン症
ヒトヘモグロビンは、２つのしっかりと結合された遺伝子クラスタ、染色体１６上のアルファ様グロビン遺伝子及び染色体１１上のベータ様遺伝子においてコードされる。重要な調節配列は、各遺伝子の両側に位置し、プロモータ要素は上流にある。ガンマ及びベータ遺伝子の５’隣接領域における配列は、これらの遺伝子の正確な発生的調節に不可欠であると考えられるが、古典的なエンハンサ及びサイレンサのように機能する要素は、３’隣接領域にある。更に上流に位置する遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）要素は、各クラスタの発現の全体的なレベルを制御すると考えられる。これらの要素は、トランス作用転写因子と相互作用することによって、それらの調節作用に到達する。後者は、ヘム生合成のための酵素をコードする遺伝子等の、赤血球生成中に特異的に発現する遺伝子を調節するとも考えられる。正常な赤血球（ＲＢＣ）分化のために、グロビン遺伝子が、ヘム及び鉄代謝に関与する遺伝子と協調して発現する必要がある。
【００３５】
異常ヘモグロビン症の５つの主要なクラスが存在し、構造的（例えば、鎌状細胞）、変異型（例えば、変化したＯ2親和性を伴う）、サラセミア（変化したか、又は誤協調的なヘモグロビン鎖合成）、遺伝性高胎児ヘモグロビン症（ＨＰＦＨ）、及び先天性（例えば、メトヘモグロビン）、クラスがある。サラセミアヘモグロビン変異型は、サラセミア（例えば、異常グロビン生合成）及び構造的異常ヘモグロビン症（例えば、異常アミノ酸配列）の特徴を組み合わせる。
【００３６】
鎌状赤血球症候群は、第６のアミノ酸を、グルタミン酸からバリン及び指定されたヘモグロビンＳ（ＨｇｂＳ）へ変化させるベータグロビン遺伝子における点変異によって引き起こされる。ＨｇｂＳは、脱酸素化される時、可逆的に重合され、赤血球膜の硬化及び特徴的な鎌状形状を引き起こす。鎌状赤血球は、粘着性及び非可塑性であり、相互及び血管内皮に粘着する。これらの異常は、明らかな溶血による、及び脾臓による除去のための両方で、微小血管血管閉塞症及び未熟ＲＢＣ破壊の予測不可能な症状の発現を誘発する。著名な兆候は、脾臓、中枢神経系、骨、肝臓、腎臓、及び肺における虚血性疼痛（即ち、痛みを伴う転換点）及び虚血性機能不全、又は明らかな梗塞の症状の発現を含む。
【００３７】
サラセミア症候群は、アルファ又はベータグロビン生合成の遺伝性疾患である。サラセミアを引き起こす突然変異は、転写、ｍＲＮＡ前駆体の処理、翻訳、及びグロビンポリペプチド鎖の翻訳後代謝の、グロビン遺伝子発現の経路における任意のステップに影響を与えることがある。最も一般的な型は、ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを混乱させるか、又はｍＲＮＡの翻訳を時期尚早に終了させる突然変異から生じる。グロビンサブユニットの不平衡な蓄積は、影響を受けていないグロビンの合成が、正常率で進展するために生じる。完全ヘモグロビン四量体（アルファ2ベータ2）の産生の減少は、赤血球血色素減少症及び小赤血球症を引き起こす。臨床的重症度は、影響を受けたグロビンの合成が正常に機能しない程度、他のグロビン鎖の変化した合成、及び他の異常グロビン対立遺伝子の共同相続によって大きく異なる。ベータ遺伝子由来及びアルファ遺伝子由来のアルファ及びベータサラセミアは、両方とも、周知であり、特徴付けられている。サラセミアの最も一般的な型は、クーリー貧血とも称される重症型ベータサラセミアであり、２００以上の突然変異によって引き起こされ、ヘモグロブリンのベータ鎖の変化した産生につながる。他の型は、軽症型ベータサラセミア、及び中間型ベータサラセミアを含むが、それらに限定されない。
【００３８】
ＨＰＦＨは、成人期におけるＨｇｂＦ、高胎児ヘモグロビンの高レベルの連続合成に特徴がある。産生されるヘモグロビンの全てがＨｇｂＦであっても、悪影響は見られない。したがって、鎌状赤血球貧血及びサラセミア等における、アルファ又はベータ遺伝子における遺伝的欠陥を持つ患者におけるＨｇｂＦ形成及びそれらの処理を促進する任意の刺激は、有効であることを証明することができる。
【００３９】
骨髄不全
骨髄異形成、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、再生不良性貧血、赤芽球癆（ＰＲＣＡ）、及び骨髄癆は、骨髄不全に特徴がある疾病である。骨髄異形成症候群（ＭＤＳ、以前は「前白血病」として周知）は、血球の無効な産生、及び急性骨髄性白血病への形質転換の様々なリスクに特徴がある血液学的病状の多様な集合である。ＭＤＳは、血液学的腫瘍内分類される。常習的な輸血を必要とする貧血は、頻繁に存在する。低増殖性貧血は、正色素性、正球性、又は大球性であり、低網状赤血球数に特徴がある。ＲＢＣの不完全な産生は、感染症、炎症、及び癌に続発し得る、骨髄損傷及び機能不全によって生じる。これらの疾患における貧血は、しばしば、孤立性又は主要な血液学的所見でさえもない。ＭＤＳの骨髄不全は、貧血、白血球減少症、及び血小板減少症の汎血球減少症をもたらし得る。
【００４０】
造血（時折、血液生成でもある）は、血液細胞成分の形成である。血液の細胞成分の全ては、造血幹細胞に由来する。糖タンパク質成長因子は、髄質から血液へ入る細胞の増殖及び成熟を調節し、１つ以上の関係した細胞株における細胞を増殖及び成熟させることが周知である。一般的な骨髄性前駆細胞、多能性幹細胞は、赤血球生成と称される過程である、赤血球系細胞及び赤血球を産生するために、ＳＣＦ、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＥＰＯを含む成長因子に応答する。赤血球生成は、低酸素症に応答して腎臓において産生されるＥＰＯに大きく依存しする。しかしながら、ＥＰＯ受容体は、骨髄性前駆細胞に加えて他の細胞型上で見られ、前述のとおり、様々な下流信号伝達イベントが、リガンドによるＰＯ受容体活性化から生じる。赤血球生成活性が無効である、ある誘導体、エリスロポエチン誘導体、リジンカルバミル化エリスロポエチンによる非赤血球生成関連心臓及び神経組織防御も、言及されている（Ｌｅｉｓｔ ｅｔ ａｌ．２００４ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５：２３９）。
【００４１】
治療適用
本発明は、細胞、組織、器官、動物、又は患者において貧血を調節又は治療する方法を提供し、小児及び／又は成人癌関連貧血、癌治療関連貧血、放射線治療又は化学療法関連貧血、寄生生物、ウイルス、又は細菌性感染症関連貧血、腎損傷又は不全による貧血、未熟児貧血、異常ヘモグロビン症による貧血、又は骨髄不全による貧血の任意の貧血の少なくとも１つを含むが、それらに限定されない。より具体的には、貧血は、リンパ腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、ＡＩＤＳ、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）、透析、慢性腎不全に関連する貧血、先天性形成不良性貧血、ファンコーニ貧血等の造血疾病、ベータサラセミア及びアルファサラセミアを含むが、それらに限定されないサラセミア、及び鎌状赤血球病を含む、癌又は感染症による１次又は２次影響に関連し得る。
【００４２】
本発明のＥＳＡ組成物は、例えば、慢性感染症、炎症過程、放射線療法、及び細胞増殖抑制剤治療によって誘導されるか、又は骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、及び慢性病が骨髄及び赤血球生成を抑制する他の病状によって包含される貧血の非腎臓型のために使用することもできる。
【００４３】
本発明は、細胞、組織、器官、動物、又は患者において感染症に関連する貧血を示す患者を調節又は治療するための方法も提供し、急性又は慢性細菌感染、細菌、ウイルス、及び菌感染を含む急性及び慢性寄生又は感染プロセス、ＨＩＶ感染／ＨＩＶ神経障害、髄膜炎、肝炎、敗血症性関節炎、腹膜炎、肺炎、喉頭蓋炎、大腸菌０１５７：ｈ７、溶血性尿毒症症候群、塞栓性血小板減少性紫斑病、マラリア、デング出血熱、リーシュマニア症、ハンセン病、中毒性ショック症候群、連鎖球菌筋炎、ガス壊疽、ヒト型結核菌、トリ型結核菌、ニューモシスティス・カリニ肺炎、骨盤感染症、精巣炎／精巣上体炎、レジオネラ、ライム病、Ａ型インフルエンザ、エプスタイン・バーウイルス、ウイルス関連血球貪食症候群、ウイルス性脳炎／無菌性髄膜炎等のうちの少なくとも１つを含むが、それらに限定されない。
【００４４】
本発明は、細胞、組織、臓器における癌の存在に関連する貧血を示す患者を調節又は治療するための方法も提供し、白血病、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞、Ｔ細胞、又はＢ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、リンパ腫、ホジキン病、悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、カポジ肉腫、直腸結腸癌、膵臓癌、鼻咽頭癌、悪性組織球増殖症、悪性の腫瘍随伴症候群／高カルシウム血症、固形腫瘍、腺癌、肉腫、悪性黒色腫等を含むが、それらに限定されない。
【００４５】
本発明は、細胞、組織、臓器における神経変性病に関連する貧血を示す患者を調節又は治療するための方法も提供し、多発性硬化症、片頭痛、ＡＩＤＳによる認知症、多発性硬化症及び急性横断性脊髄炎等の脱髄疾患、皮質脊髄系の病変等の錐体外路系及び小脳疾患、大脳基底核又は小脳疾患の疾患、ハンチントン舞踏病及び老人性舞踏病等の運動過剰疾患、ＣＮＳドーパミン受容体を遮断する薬剤によって誘導されるもの等の薬物誘発性運動疾患、パーキンソン病等の運動低下疾患、進行性核上性麻痺、小脳の構造病変、脊髄性運動失調症、フリードライヒ運動失調症、小脳皮質変性症、多系統変性症（Ｍｅｎｃｅｌ、Ｄｅｊｅｒｉｎｅ−Ｔｈｏｍａｓ、Ｓｈｉ−Ｄｒａｇｅｒ、及びＭａｃｈａｄｏ−Ｊｏｓｅｐｈ）等の髄小脳変性症、全身性疾患（レフサム病、無ベータリポタンパク質血症、運動失調、毛細血管拡張症、及びミトコンドリア多系統疾患）、多発性硬化症、急性横断性脊髄炎等の脱髄性中核疾患、及び神経原性筋萎縮症等の運動単位の疾患（筋萎縮性側索硬化症、乳児脊髄性筋萎縮症、及び若年性脊髄性筋萎縮症等の前角細胞変性）、アルツハイマー病、中年におけるダウン症候群、びまん性レビー小体病、レビー小体型老年性認知症、ウェルニッケ・コルサコフ症候群、慢性アルコール依存症、クロイツフェルト・ヤコブ疾病、亜急性硬化性全汎脳炎、ハレルフォルデン・スパッツ病、及び拳闘家認知症等を含むが、それらに限定されない。
【００４６】
本発明は、心臓血管疾患に関連する貧血を示す患者を調節又は治療するための方法も提供し、心失神症候群、心筋梗塞、うっ血性心不全、脳卒中、虚血性脳卒中、出血、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性アテリオスクレロティック疾患、高血圧、動脈性高血圧、腎血管性高血圧、失神、ショック、心血管系梅毒、心不全、肺性心、原発性肺高血、心不整脈、心房異所性拍動、心房粗動、心房細動（持続性又は発作性）、多源性又は多発性心房頻拍、一定狭幅ＱＲＳ頻拍、特異的不整脈、心室細動、ヒス束不整脈、房室ブロック、脚ブロック、虚血性心筋疾患、冠動脈疾患、狭心症、心筋梗塞、心筋症、拡張型鬱血性心筋症、拘束型心筋症、心臓弁膜症、心内膜炎、心膜疾患、心臓腫瘍、大動脈及び末梢動脈瘤、大動脈解離、大動脈の炎症、腹部大動脈及びその分岐の閉塞、末梢血管疾患、閉塞性動脈疾患、末梢アテローム硬化性疾患、閉塞性血栓血管炎、機能性末梢動脈疾患、レイノー現象及びレイノー病、肢端チアノーゼ、肢端紅痛症、静脈疾患、静脈血栓症、静脈瘤、動静脈瘻、リンパ浮腫、脂肪性浮腫、不安定狭心症、再かん流傷害、ポストポンプ症候群、虚血再灌流障害等を含むが、それらに限定されない。
【００４７】
そのような方法は、配列番号２又は３、又はそのような調節、治療、又は療法を必要とする細胞、組織、臓器、動物又は患者に特異的な部分又は変異型を含むが、それらに限定されない、本発明のＣＨ１欠損ＥＭＰ−１ペプチド免疫グロブリン融合タンパク質等であるが、それに限定されない少なくとも１つのＥＳＡ組成物を含む少なくとも１つ組成物又は医薬組成物の有効量を投与するステップを任意で含むことができる。ＣＮＴＯ５２８（配列番号２のホモ二量体）は、５つの用量コホートにおける４４人の対象の無作為化単純盲検及びプラシーボ（ＰＢＯ）対照試験（０．０３、０．０９、０．３、０．９ｍｇ／ｋｇのＣＮＴＯ ５２８又はＰＢＯの単回ＩＶ投与を受けた１期の３５人の対象、３及び５日目にＣＮＴＯ ５２８又はＰＢＯの分割ＩＶ投与（０．０９ｍｇ／ｋｇ又はＰＢＯの３回の点滴）を受けた２期の９人の対象）において、耐容性良好であることを示し、顕著に低い対象間変動性を伴う長期用量依存性赤血球生成応答をもたらしている。ＩＶ ＣＮＴＯ５２８の薬物動態学は、直線的であり、ほぼ用量に比例した。ヘモグロビン（Ｈｇｂ）濃度は、用量依存的に増加し、２２日目に最大効果が生じた。平均Ｈｇｂ濃度は、単回投与の約２．５カ月後の最後の測定で０．４ｇ／ｄＬ基礎値を超えて留まった。ＲＢＣ数における用量依存性の増加は、正常範囲内で全てのＲＢＣ指標（ＭＣＶ、ＭＣＨ、ＭＣＨＣ）に見られ、正球性の正色素性ＲＢＣの増加を示した。全てのＣＮＴＯ５２８で治療した対象において、可溶性トランスフェリン受容体濃度における用量依存性の増加が見られた。内因性ＥＰＯ濃度における用量依存性の増加、その後、内因性ＥＰＯ濃度における用量依存性の低下が見られた。免疫原性は見られなかった。このデータは、赤血球生成模倣物質抗体融合タンパク質による赤血球生成応答及び内因性ＥＰＯレベルの上方制御に対する、ヒトにおける概念実証を提供する（Ｆｒａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２００５）Ｂｌｏｏｄ １０６（１１）：Ａｂｓｔｒａｃｔ ４２８３）。
【００４８】
組成物を含むＥＰＯ模倣ペプチドは、自己骨髄培養において等、生体外で使用することもできる。その後、治療された髄質は、任意で患者が別の薬剤又は電離放射線等のモダリティで治療された後に患者に戻される。組成物、及び任意で他の幹細胞増殖及び分化因子を含むＥＰＯ模倣ペプチドは、髄質又は末梢血前駆（ＰＢＰＣ）細胞の生体外増幅のために使用することもできる。任意で、組成物を含むＥＰＯ模倣ペプチドは、任意で後に患者に戻される細胞を高密度培養へ分化し、増殖させるように、ＳＣＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、又はＩＬ−１１を含むが、それらに限定されない１つ又はそれ以上の他のサイトカインと組み合わせて使用することができる。
【００４９】
本発明は一般的な用語で説明したが、本発明の実施形態は、以下の実施例において更に開示される。
【００５０】
組成物のための背景非臨床薬理学
生体外で、ＣＮＴＯ ５２８は、ＵＴ−７ＥＰＯ細胞の成長を刺激する際、組み換えヒトＥＰＯ（ｒｈＥＰＯ）より、モル基準で約１０分の１有力であった。低い生体外効力にもかかわらず、正常ラットにおけるｒｈＥＰＯ及びダルベポエチンと比較して、ＣＮＴＯ ５２８の単回皮下投与は、より長く持続する網状赤血球増加及びヘモグロビンのより長く持続する増加を引き起こした。フローサイトメトリー方法によって測定されたように、ＣＮＴＯ ５２８は、赤血球分布幅（ＲＤＷ）又は平均細胞体積（ＭＣＶ）の小さな変化のみを引き起こし、成熟網状赤血球の放出をもたらし、平均血小板容積（ＭＰＶ）に対する効果は有さなかった。ＣＮＴＯ ５２８は、貧血のラットモデル及び赤芽球癆のラットモデルにおいて有効であることが示された（Ｂｕｇｅｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｌｏｏｄ １０６：（１１）Ａｂｓｔｒａｃｔ ４２６１）。
【００５１】
ＥＰＯ−Ｒを表示し、増殖のためにＥＳＡを必要とするＵＴ−７細胞を使用して、阻害されたＣＮＴＯ ５３０と125Ｉ−ＥＰＯとの間のヒトＥＰＯ−Ｒのための競合的結合を測定した。ＣＮＴＯ ５３０は、約６０ｎＭのＩＣ５０により、ＥＰＯ（０．５ｎＭ）が細胞に結合することを防止した。ＣＮＴＯ ５３０は、ＵＴ−７細胞、及びアポトーシスからＥＰＯを奪われたＣＮＴＯ ５３０救出細胞を使用した単一増殖検定におけるモル基準でｒＨｕＥＰＯより約２４分の１倍有力であり（ＣＮＴＯ ５３０のＥＣ５０は、約２１ｐＭ）、より高い濃度で、ＣＮＴＯ ５３０は、増殖の頑強な誘導を引き起こした（ＣＮＴＯ ５３０のＥＣ５０は、約５５ｐＭ）。
【００５２】
ヒト骨髄において、コロニー形成検定を使用して、赤血球前駆細胞成長及び分化に対するその効果を決定した。ＣＮＴＯ ５３０は、赤血球コロニー形成における濃度依存性の増加を誘導した。
【００５３】
正常動物における生体内非臨床的薬理学的研究は、ＣＮＴＯ ５３０が０、０．０１、０．３、０．１、又は０．３ｍｇ／ｋｇで皮下投与された時に正常雌Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいて赤血球生成の用量反応性刺激を引き起こしたことを証明した。好塩基性赤芽球は、髄質における最も敏感な細胞であり、好塩基性赤芽球に対するＣＮＴＯ ５３０の無効果投与量は、０．０１ｍｇ／ｋｇであった。髄質における非赤血球系細胞に対する効果はなかった。組み換えヒトエリスロポエチン及びダルベポエチンと比較して、ＣＮＴＯ ５３０は、より効果的であり、赤血球生成に対するより長く続く効果を有した。０、０．０１、０．０３、０．１、０．３、又は１ｍｇ／ｋｇでの正常雌Ｓｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットへのＣＮＴＯ ５３０の単回皮下投与を使用して、ＣＮＴＯ ５３０は、網状赤血球における迅速な用量依存性の一過性増加、及びＲＢＣ、Ｈｃｔ、及びＨｇｂにおける持続性増加を引き起こした。網状赤血球を増加させるためのＣＮＴＯ ５３０の無効果投与量は、＜０．０１ｍｇ／ｋｇであった。Ｈｇｂを増加させるために、無効果投与量は、０．０１ｍｇ／ｋｇであり、ＥＤ５０は、０．１ｍｇ／ｋｇであった。ＣＮＴＯ ５３０は、白血球数（ＷＢＣ）における一過性の非用量反応性の（１．５倍まで）増加も引き起こした。ＷＢＣを増加させるための無効果投与量は、０．０１ｍｇ／ｋｇであった。１ｍｇ／ｋｇの投与量で、ＣＮＴＯ ５３０は、平均血小板容積（ＭＰＶ）における一過性の（１．５倍まで）増加を引き起こした。ＭＰＶを増加させるための無効果投与量は、０．３ｍｇ／ｋｇであった。ＣＮＴＯ ５３０の高いＩＶ及びＳＣ投与量（０、０．３、３、及び３０ｍｇ／ｋｇ）を与える時、雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットは、網状赤血球における一過性の非用量反応性の増加、赤血球数（ＲＢＣ）、ヘモグロビン（Ｈｇｂ）、及びヘマトクリット（Ｈｃｔ）における持続する増加、ＷＢＣにおける一過性の非用量反応性の増加、血小板数及び平均血小板容積（ＭＰＶ）における一過性の用量反応性の増加を示した。
【００５４】
正常雌ウサギにおいて、０、０．３、３、又は３０ｍｇ／ｋｇでの皮下のＣＮＴＯ ５３０は、網状赤血球における一過性の非用量反応性の増加、及びＲＢＣ、Ｈｃｔ、及びＨｇｂにおけるより長く持続する増加を引き起こした。ＣＮＴＯ ５３０は、平均血小板容積（ＭＰＶ）における増加を引き起こした。ＭＰＶに対する効果は、０．３〜３ｍｇ／ｋｇの間で用量反応性であったが、３０ｍｇ／ｋｇの投与量は、３ｍｇ／ｋｇと同様の効果を有した。
【００５５】
雄及び雌カニクイザルにおいて、０、０．０３、０．１、０．３、又は３．０ｍｇ／ｋｇのＩＶで与えられたＣＮＴＯ ５３０は、網状赤血球数、ＲＢＣ、Ｈｃｔ、及びＨｇｂにおける用量依存性の増加を引き起こした。無効果投与量は、０．１ｍｇ／ｋｇであった。正常雄カニクイザルにおける高投与量ＩＶ及び皮下のＣＮＴＯ ５３０（ＩＶ０、３、及び３０ｍｇ／ｋｇ）は、網状赤血球数における一過性の用量反応性の増加、及び赤血球数（ＲＢＣ）、ヘモグロビン（Ｈｇｂ）、及びヘマトクリット（Ｈｃｔ）における持続する非用量反応性の増加、血小板数における一過性の非用量反応性の増加、及び平均血小板容積（ＭＰＶ）における持続する非用量反応性の増加を引き起こした。
【実施例】
【００５６】
実施例１：骨髄異形成に関連する慢性疾患のモデル
このモデルにおいて、３’非翻訳領域がＣ５７Ｂｌ／６背景上のベータグロビン遺伝子の３’非翻訳領域からの配列によって置換されたヒトＴＮＦアルファ導入遺伝子を持つＴｇ１９７マウスは、無秩序なヒトＴＮＦα遺伝子発現を示す。Ｃ５７Ｂｌ／６及びＴｇ１９７マウスにおけるエポエチン−αの薬理学を最初に比較した。次に、Ｔｇ１９７マウスにおけるＣＮＴＯ ５３０、エポエチン−α、及びダルベポエチンを比較した。
【００５７】
材料及び方法。９週齢のヘテロ接合Ｔｇ１９７−ＣＢＡ Ｆ１遺伝子導入マウス、年齢を適合させたＣ５７Ｂｌ／６マウス、及び年齢を適合させたＣＢＡ−Ｃ５７Ｂｌ／６ Ｆ１ハイブリッド（ＣＢＦ１）マウスは、Ａｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｏｙｅｒｔｏｗｎ、ＰＡ）、Ａｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ａｎｄ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）からそれぞれ入手した。トランスジェニックコロニーのための創始Ｔｇ１９７マウスは、Ｇ．Ｋｏｌｌｉａｓから入手した。種畜は、ホモ接合体として維持され、それらの関節炎を制御するために、マウス抗ヒトＴＮＦａ抗体（１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）の毎週の注入を受けた。これらの実験のために、ホモ接合性Ｔｇ１９７雄を、ＣＢＡ雌に繁殖させた。ＣＢＦ１マウスは、それらの疾病がホモ接合性のＴｇ１９７マウスにおいて見られるそれより遅く進行するため、使用した。マウスは、上部をフィルタで覆われたプラスチックの靴箱型ケージで群ごとに収容した（１ケージにつき４匹）。動物は、耳標いより個々に特定され、研究開始少なくとも１週間前に配置した。餌及び水は、自由に摂取可能であり、部屋は、１２時間明／暗周期を有した。全てのマウスは、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ Ｒ＆Ｄ，Ｉｎｃ．、Ｒａｄｎｏｒ ＰＡの無菌生態動物園において維持した。ＣｅｎｔｏｃｏｒのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅは、全ての関連する処置を承認した。
【００５８】
ＣＮＴＯ ５３０、組み換えヒトエリスロポエチン（エポエチン−α、ＯｒｔｈｏＢｉｏｔｅｃｈ、Ｒａｒｉｔｉａｎ ＮＪ）、ダルベポエチン（Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ、ＣＡ）、及びＰＢＳ。投与量は、ｍｇ／ｋｇ、又はＵＴ−７単位／ｋｇ（Ｕ／ｋｇ）として表した。
【００５９】
Ｃ５７Ｂｌ／６及びＴｇ１９７マウスにおけるエポエチン−αの薬理学を比較するために、研究動物は、表１に示される群に割り当てた。０日目、マウスは、被験物質（在庫から新たに希釈された）又はＰＢＳの重量調整された皮下注入を受けた。マウスは、ＣＯ2窒息によって安楽死させ、血液を各試料のために収集した。
【００６０】
【表２】
【００６１】
Ｔｇ１９７マウスにおけるＣＮＴＯ ５３０、エポエチン−α、及びダルベポエチンの比較薬理学：研究動物は、表２に示される群に割り当てた。０日目、マウスは、被験物質（在庫から新たに希釈された）又はＰＢＳの重量調整された皮下注入を受けた。マウスの群は、ＣＯ２窒息によって安楽死させ、血液／骨髄を収集した。
【００６２】
【表３】
【００６３】
血液学：モデル特徴付け及び薬理学研究におけるマウスからの血液試料は、表１及び２に示される時間で収集した。血液は、市販のＥＤＴＡでコーティングされたミクロチューブへ開胸心穿刺を介してＣＯ２混合物で麻酔されたマウスから収集した。血液解析は、ＡＤＶＩＡ１２０血液分析器（Ｂａｙｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、ＮＹ）を使用して全血に対して実施した。データを群平均±標準偏差として表す。
【００６４】
結果：データを群平均及び標準偏差としてか、又は対照からの群平均変化として表す。ＰＢＳ対照マウスの平均値は、１日目基準として使用した。図示するために、名目上の日は、採血の実際の日と１日異なる場合がある。
【００６５】
３０匹のＣＢＦ１及び５０匹のＴｇ１９７ＰＢＳ対照マウス（９〜１３週齢）に関する平均（±標準偏差）血液学的データを表３に示す。Ｔｇ１９７マウスは、年齢を適合させたＣＢＦ１マウスと比較して、わずかに低下したＨｇｂ（１ｇ／ｄＬ）及びＨｃｔ（２％）を示した。正常網状赤血球及び赤血球数、ＭＣＶ、及びわずかに低下したＭＣＨに基づいて、Ｔｇ１９７マウスは、軽度の代償性、正球性、低色素性の貧血を提示しているように説明することができる。
【００６６】
結果：Ｃ５７Ｂｌ／６及びＴｇ１９７マウスにおけるエポエチン−αの薬理学の比較の結果を図１に示す。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいて、エポエチン−αは、ヘモグロビンにおける用量依存性の増加を引き起こした。対照的に、Ｔｇ１９７マウスにおいて、０．０３〜０．３ｍｇ／ｋｇの間で用量反応はほとんどなかった。また、Ｔｇ１９７マウスにおける０．３ｍｇ／ｋｇのエポエチン−αに対するＨｇｂ反応は、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいて見られた、１５日目まで基準に戻らなかったＨｇｂにおける約１．５ｇ／ｄＬの増加と比較して、短期間であり（８日目までに基準まで戻った）、鈍化していた（〜１ｇ／ｄＬ）。
【００６７】
【表４】
【００６８】
Ｔｇ１９７マウスにおける薬理学研究の結果を図２に要約する。ＣＮＴＯ ５３０、エポエチン−α、及びダルベポエチンの間の直接比較を可能にするために、投与量をＵＴ−７単位／ｋｇに変換した。ＣＮＴＯ ５３０は、慢性疾患のＥＰＯ耐性貧血のモデルにおけるエポエチン−α又はダルベポエチンのいずれかより、Ｈｇｂにおけるより強い、かつより長く持続する反応を引き起こした。
【００６９】
実施例２．幹細胞因子受容体欠乏におけるＥＰＯ耐性
ｃ−ｋｉｔ、肝細胞因子のための受容体が不足しているマウスを使用して、造血過程における補助受容体の効果を証明した。
【００７０】
材料及び方法。雄及び雌ＷＢＢ６Ｆ１／Ｊ−ＫｉｔＷ／ＫｉｔＷ−ｖ（黒目、白毛、罹患、関連遺伝子型ａｌａ ＫｉｔＷ／ＫｉｔＷ−ｖ）（Ｗ／Ｗｖ）マウスは、５〜７週の年齢でＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥから入手した。これらのマウスは、ｃ−ｋｉｔ、ＳＣＦに対する受容体が不足している。マウスは、上部をフィルタで覆われたプラスチックの靴箱型ケージで群ごとに収容した。ＣＮＴＯ ５３０（３０ＵＴ−７単位／μｇ）及びエポエチン−α（１２０ＵＴ−７単位／μｇ）を試験し、ＰＢＳ、ｐＨ７．４を対照物質をして使用した。
【００７１】
研究設計：１日目、マウスは、表４に従ってエポエチン−α、ＣＮＴＯ ５３０、又はＰＢＳ（１０ｍＬ／ｋｇ）の重量調整された皮下（ｓ．ｃ．）投与量を受けた。性別ごとに３匹のマウスは、表４に従って指定の時点で各群ごとに出血させた。４、９、１４、及び２８（雄）、又は３０（雌）日目、マウスはＣＯ２で麻酔させ、血液試料（〜０．４ｍＬ）を血液学のために開胸心穿刺を介して取った。血液は、ＥＤＴＡで調製したチューブへ直接収集し、約１０秒間完全に混合し、凝固を防止するためのロッカー上に配置した。全血をＡＤＶＩＡ１２０血液分析器を使用して分析した。
【００７２】
【表５】
【００７３】
結果。データを群平均及び標準偏差としてか、又は対照からの群平均変化として表す。ＰＢＳ対照マウスの平均値は、１日目基準として使用した。図示するために、名目上の日は、採血の実際の日と１日異なる場合がある。
【００７４】
ＰＢＳを受けたａｌａ＋／＋及びＷ／Ｗｖマウスの血液学的分析は、Ｗ／Ｗｖマウスが軽度の大球性の正色素性貧血を有したことを明らかにした（表５）。Ｗ／Ｗｖマウスにおける％網状赤血球及び高ＲＮＡ含有量の網状赤血球の数は、ａｌａ＋／＋対照マウスより約２倍高かったが、網状赤血球の絶対数は、同様であった。これらをもとに、ＭＣＶ、ＭＣＨ、及び高ＲＮＡ網状赤血球数、並びに正常総網状赤血球数の増加は、肝細胞のレベルでの欠乏に加えて、これらのマウスが、ＥＢＣ成熟の後期における欠陥も有することを示唆した。
【００７５】
【表６】
【００７６】
ｃ−ｋｉｔ欠乏マウスが、エポエチン−αに対して低応答性であることを裏付けるデータを図３に示す。正常ａｌａ＋／＋同腹子におけるエポエチン−αの単回皮下投与後のＨｇｂにおける約２ｇ／ｄＬの増加と対照的に、Ｗ／ＷｖマウスにおいてＨｇｂにおける１ｇ／ｄＬ未満の増加があった。ＥＳＡに対するＷ／Ｗｖマウスの相対的ヘモグロビン応答を図４に示す。１２，０００Ｕ／ｋｇの投与量のＣＮＴＯ ５３０の単回皮下投与は、エポエチン−αに応答して見られるＨｇｂにおける１ｇ／ｄＬ未満の短期間の増加と比較して、ヘモグロビンにおける持続する約２ｇ／ｄＬの増加を引き起こした。したがって、ＣＮＴＯ ５３０は、幹細胞欠陥に続発する貧血のこのＥＰＯ耐性モデルにおいて、ｒＨｕＥＰＯよりもＨｇｂにおける強い、かつ長く持続する応答を引き起こした。
【００７７】
実施例３：Ｂ−サラセミアのＥＰＯ耐性モデル
Ｔｈ３＋／Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ｂ１及びｂ２グロビン遺伝子両方の欠失に対してヘテロ接合であるため（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．１９９５．Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，ＵＳＡ，９２：１１６０８〜１１６１２）、ベータサラセミアに関連する貧血につながるヘモグロビン合成の異常調節（異常ヘモグロビン症）の原型を作製する際に有用である。
【００７８】
材料及び方法。無菌生態動物園に維持される雄及び雌Ｔｈ３＋／Ｃ５７ＢＬ／６（ヘテロ接合）マウス。コロニーのための創始Ｔｈ３＋／Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ペンシルベニア大学から入手した。種畜は、ヘテロ接合体として維持された。Ｔｈ３＋／Ｃ５７ＢＬ／６を、血の気がない外観及び脾腫に基づいて薬理学研究のために選択した。選択戦略を予備的研究において検証した（以下参照）。ＣＮＴＯ５３０、組み換えヒトエリスロポエチン（エポエチン−α）（ＯｒｔｈｏＢｉｏｔｅｃｈ、Ｒａｒｉｔｉａｎ ＮＪ）、ダルベポエチン（ＡＲＡＮＥＳＰ（商標）、Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ、ＣＡ）を試験した。投与量は、ｍｇ／ｋｇ又はＵＴ−７単位／ｋｇ（Ｕ／ｋｇ）として表した。
【００７９】
予備的研究設計：７匹のＴｈ３＋／Ｃ５７ＢＬ／６及び７匹の正常同腹子は、ＣＯ2で麻酔させ、血液試料（０．４ｍＬ）を血液学のために開胸心穿刺を介して取った。血液は、ＥＤＴＡで調製したチューブへ直接収集し、約１０秒間完全に混合し、凝固を防止するためのロッカー上に配置した。全血をＡＤＶＩＡ １２０血液分析器を使用して分析した。
【００８０】
Ｔｈ３＋／Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＣＮＴＯ ５３０、エポエチン−α、及びダルベポエチンの比較薬理学の研究：０日目、マウスは、被験物質（在庫から新たに希釈された）又はＰＢＳの重量調整された皮下注入を受けた。１日目、８匹のマウスの群は、表６に従ってｒｈＥＰＯ、ＣＮＴＯ ５３０、エポエチン−α、又はダルベポエチンＣＮＴＯ ５３０調製緩衝液（１０ｍＬ／ｋｇ）の重量調整された皮下（ｓ．ｃ．）投与量を受けた。
【００８１】
【表７】
【００８２】
血液学：モデル特徴付け予備的研究におけるマウスからの血液試料は、単一時点で収集した。薬理学研究におけるマウスからの血液試料は、表６に示される時間で収集した。血液は、市販のＥＤＴＡでコーティングされたミクロチューブへ開胸心穿刺を介してＣＯ２混合物で麻酔されたマウスから収集した。血液解析は、ＡＤＶＩＡ １２０血液分析器（Ｂａｙｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、ＮＹ）を使用して全血に対して実施した。データを群平均±標準偏差として表す。データを群平均及び標準偏差としてか、又は対照からの群平均変化として表す。ＰＢＳ対照マウスの平均値は、１日目基準として使用した。図示するために、名目上の日は、採血の実際の日と１日異なる場合がある。
【００８３】
結果
Ｃ５７ＢＬ／６及びＴｈ３＋／Ｃ５７ＢＬ／６同腹子の血液学的分析の結果を表７に示す。Ｔｈ３＋／Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、年齢を適合させたＣ５７ＢＬ／６マウスと比較してＲＢＣ、Ｈｇｂ、及びＨｃｔ（２％）の低下を示し、Ｔｈ３＋／Ｃ５７ＢＬ／６としてのそれらの任務を確認した。著しい網状赤血球数、％網状赤血球、及び高ＲＮＡ網状赤血球数の増加に基づき、これらのマウスがそれらの貧血を修正しようしていることが明白である。この試みは効果がないということは、より小さい平均細胞体積（ＭＣＶ）、赤血球分布幅（ＲＤＷ）の増加、及び細胞ヘモグロビン指標の低下によって反映される。したがって、Ｔｈ３＋／Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、著しい小赤血球性の低色素性再生貧血を伴って提示するとして説明することができる。
【００８４】
【表８】
【００８５】
Ｔｈ３＋／Ｃ５７ＢＬ／６におけるＣＮＴＯ ５３０、エポエチン−α、及びダルベポエチンの薬理学：結果を図５においてグラフを使用して示す。ＣＮＴＯ ５３０、エポエチン−α、及びダルベポエチンの間の直接比較を可能にするために、投与量をＵＴ−７単位／ｋｇとして表す。１０，０００Ｕ／ｋｇの投与量のＣＮＴＯ ５３０の単回皮下投与は、エポエチン−α又はダルベポエチンに応答して見られるＨｇｂにおける１ｇ／ｄＬ未満の短期間の増加と比較して、ヘモグロビンにおける持続する約４ｇ／ｄＬの増加を引き起こした。したがって、ＣＮＴＯ ５３０は、ｂ−サラセミアのこのＥＰＯ低応答性のモデルにおいて、エポエチン−αよりもＨｇｂにおける強い、かつ長く持続する応答を引き起こした。
【００８６】
実施例４：鎌状赤血球病の動物モデルにおけるＣＮＴＯ５３０
鎌状赤血球病において、貧血は、赤血球産生欠損又は短い赤血球寿命から生じる。鎌状赤血球ヘモグロビンによって引き起こされる赤色細胞への損傷の改善又は予防のための可能な方法は、胎児性ヘモグロビンが赤血球ヘモグロビンの少なくとも一部を交換するか、又は表すことである。胎児性ヘモグロビン合成を刺激するＣＮＴＯ５３０の能力を検査した。
【００８７】
材料及び方法
１０匹の１６週齢のＨｂａ Ｈｂａｔｍ１Ｐ ｔｍ１Ｐａｚ ａｚ Ｈｂ Ｈｂｂｔｍ１Ｔ ｔｍ１Ｔｏｗ Ｔｇ（ＨＢＡ−ＨＢＢ（ＨＢＢｓ）４）４１Ｐ １Ｐａｚ／Ｊａｚ／マウスは、Ａｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｏｙｅｒｔｏｗｎ、ＰＡ）から入手した。トランスジェニックコロニーのための創始マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ ＭＥ）から入手した。Ｐａｓｚｔｙ ｅｔ ａｌ（Ｐａｓｚｔｙ ｅｔ ａｌ．１９９７ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：８７６〜８７８）によって最初に説明されたように、マウスアルファ及びベータグロビンのための遺伝子は、崩壊（ノックアウト）され、ヒトアルファ、ベータ（鎌状）及びガンマグロビン遺伝子に対してトランスジェニックである。したがって、それらは、ヒトヘモグロビンＡ（ＨｂＡｓｉｃｋｌｅ）（又は鎌状ヘモグロビン、ＨｂＳ）を排他的に発現し、ヒト胎児性ヘモグロビン（ＨｂＦ）も発現することができる。
【００８８】
マウスは、上部をフィルタで覆われたプラスチックの靴箱型ケージで群ごとに収容した。計７匹のマウスを使用した。実験は、３部で実施した。７日目、マウスは、ＣＯ2混合物で麻酔させ、ＨｂＦ（イオン交換クロマトグラフィグラフィ及び電気泳動による）評価及び％ＲＢＣ含有ＨｂＦ（フローサイトメトリーによる）の計数のために、ＥＤＴＡでコーティングされたミクロチューブへ眼窩後血管叢から毛細管により出血させた。１日目、マウスは、ＣＮＴＯ ５３０（在庫から新たに希釈された）の重量調整された皮下注入を受けた。投与量は、ｍｇ／ｋｇとして表した。９日目、血液は、ＥＤＴＡでコーティングされたミクロチューブへ開胸心穿刺を介してＣＯ2混合物で麻酔されたマウスから収集した。
【００８９】
ＡＤＶＩＡ １２０血液分析器（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、ＮＹ）を使用して、血液学的分析を９日目に全血に対して実施した。血液分析器からの総Ｈｇｂ値及び分光光度法で測定された全血希釈系列の結果（ＯＤ ４１５）を使用して、投与前の総Ｈｇｂ及び総Ｈｇｂの変化を計算した（以下参照）。
【００９０】
ＨｂＦのイオン交換クロマトグラフ分析は、Ｍｏｒｉｎ及びＢａｒｔｏｎの方法（Ｍｏｒｉｎ ａｎｄ Ｂａｒｔｏｎ １９８７）の後に実施した。つまり、５０μＬの新鮮な全血を２００μＬの蒸留Ｈ2Ｏ含有０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００及び２００ｍＭのＫＣＮ中で溶解し、凍結させ、−７０℃で保存した。分析の日、投与前後の試料を解凍し、１ｍＬの吸収緩衝液を添加した。吸収緩衝液は、２００ｍＭのビス−トリアセテート（ｐＨ４．５）、２００ｍＭのＫＣＮ、及び防腐剤として微量のトリクロロブタノールを含有した。１ｃｍの使い捨てミニカラムを３ｍＬのＳｅｐｈａｄｅｘ ＣＭ−５０（１０ｇ／吸収緩衝液中の４００ｍＬ）のスラリーで充填した。カラムは、最小限の真空下で排水させ、充填物はガラス原料で覆い、吸収緩衝液で洗浄した。
【００９１】
１ｍＬの溶解全血を充填物上に層状にした。投与前後の試料は、同時に動作させた。カラムは、非結合ヘモグロビンを除去するために、吸収緩衝液の１ｍＬアリコート２個で洗浄した。カラムを溶出緩衝液の２ｍＬアリコートで溶出し、２ｍＬの画分を重力下で収集した。（溶出緩衝液は、１００ｍＭのビス−トリアセテート（ｐＨ６）、４．８ｇ／Ｌのマグネシウムアセテート、２００ｍＭのＫＣＮ、及び防腐剤として微量のトリクロロブタノールを含有した。）
収集された画分（０．３３ｍＬ）のアリコートを９６ウェルプレートに移動させ、ＯＤ ４１５（Ｈｇｂのソーレーピーク）をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３４０ＰＣ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）上で読み取った。投与前後のＨｂＦ比率を各動物に対するピーク値（画分４）を使用して計算した。データを平均±標準偏差として表す。統計的有意性は、ｔ−検定によって決定した。Ｐ値＜０．０５を有意として認めた。
【００９２】
総ヘモグロビン濃度を計算するために、２５０μＬの残りの全血溶解物を２ｍＬに希釈し、一連の２倍希釈物を吸収緩衝液中で調製した。これらの希釈物（０．３３ｍＬ）のアリコートを９６ウェルプレートに移動させ、４１５ｎｍでのＯＤを記録した。これらの値を、血液分析器によって測定された総Ｈｇｂとともに使用して、投与前の値及び総Ｈｇｂにおける薬物性変化を計算した。データを平均±標準偏差として表す。統計的有意性は、ｔ−検定によって決定した。Ｐ値＜０．０５を有意として認めた。
【００９３】
胎児性ヘモグロビンを発現するＲＢＣ及び網状赤血球のフローサイトメトリー分析を、Ｂ Ｄａｖｉｓ及びＫ Ｄａｖｉｓの方法（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，２００４）の後に実施した。つまり、約２５×１０6ＲＢＣを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１ｍＬの冷却０．０５％グルタルアルデヒドで１０分間固定した。細胞を、ＰＢＳ中の２ｍＬの０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）０．１％アジ化ナトリウム（ＢＳＡ−ＰＢＳ）で洗浄し、５００μＬの０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００（ＢＳＡ−ＰＢＳ）で３〜５分間透過処理し、洗浄し、５００μＬのＢＳＡ−ＰＢＳ中で再懸濁した。１０μＬアリコートを、９６ウェル丸底プレートにおいて抗ＨｂＦ抗体（８０μＬのＢＳＡ−ＰＢＳ中の５μＬにおいて）で１５分間染色した（マウスモノクローナル抗ヒトＨｂＦ、クローンＨｂＦ−１（１２）Ｃｙ５（ＴＲＩ−ＣＯＬＯＲ（登録商標）、ＴＣ）（カタログ番号ＨＦＨ−０６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））。細胞を洗浄し、２００μＬのチアゾールオレンジ（Ｒｅｔｉｃ−Ｃｏｕｎｔ（商標）Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、カタログ番号３４９２０４）中で１５〜３０分間再懸濁した。染色は、Ｆｅｔａｌ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｋｉｔ（Ｆｅｔａｌｔｒｏｌ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＦＨ１０２、及びＢＤ Ｒｅｔｉｃ−Ｃｏｕｎｔ（商標）Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｋｉｔ（Ｔｒｉ−Ｌｅｖｅｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ）、カタログ番号３４０９９９で制御した。
【００９４】
データは、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ上で取得した。単分散細胞は、前方及び側方散乱に基づいてゲートで制御した。ＨｂＦ−１で染色された細胞は、ＨｂＦ＋として数え、チアゾールオレンジで染色された細胞は、網状赤血球として数えた。
【００９５】
データを％ＨｂＦ＋網状赤血球及び％ＨｂＦ＋総ＲＢＣに対する平均±標準偏差として表す。データは、正常に分布されたかったため、それらは、ｔ−検定による統計分析のために変形された記録である。Ｐ値＜０．０５を有意として認めた。
【００９６】
ヘモグロビンの電気泳動分析は、ＱｕｉｃｋＧｅｌ（登録商標）酸性ヘモグロビンキット（カタログ番号３５１９）、ＱｕｉｃｋＧｅｌ（登録商標）チャンバ（カタログ番号１２８４）、及びＴｉｔａｎ Ｐｌｕｓパワーサプライ（カタログ番号１５０４）（Ｈｅｌｅｎａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｅａｕｍｏｎｔ、Ｔｅｘａｓ）により実施した。全ての試薬は、ゲルを３４μＬの溶解物で充填し、１４０ボルトで２３分間動作させたことを除き、メーカーの使用説明書に従って供給された通りに使用した。ＡＦＳＣ Ｈｅｍｏ Ｃｏｎｔｒｏｌ（カタログ番号５３３１）を対照として使用した。
【００９７】
結果
総Ｈｇｂに対するＣＮＴＯ ５３０の効果を表８に示す。ＣＮＴＯ ５３０（０．３ｍｇ／ｋｇ）の単回ｓｃ投与量を受けた９日後、総Ｈｇｂにおける統計的に有意な（５．８ｇ／ｄＬ）増加があった。
【００９８】
【表９】
*投与前より統計的に大きい（Ｐ＝０．０１１、ｔ−検定）
【００９９】
ＨｂＦ（イオン交換クロマトグラフィグラフィ）に対するＣＮＴＯ ５３０の効果：イオン交換クロマトグラフィグラフィの結果を図６及び表９に示す。ＣＮＴＯ ５３０（０．３ｍｇ／ｋｇ）の単回ｓｃ投与量を受けた９日後、ＨｇＦにおける統計的に有意な増加があった。総Ｈｇｂにおける倍増加とＨｂＦにおける倍増加との間に有意差はなかった（ｔ−検定）。
【０１００】
【表１０】
【０１０１】
Ｈｇｂ電気泳動の結果を図７及び表１０に示す。ＣＮＴＯ ５３０（０．３ｍｇ／ｋｇ）の単回ｓｃ投与量を受けた９日後、ＨｂＦバンドは弱すぎて定量できなかったが、全ての７匹のマウスに対するＨｂＳ及びＨｂＦバンドにおいて認識できる増加があった。
【０１０２】
【表１１】
【０１０３】
ＨｂＦ＋細胞に対するＣＮＴＯ ５３０の効果：ＨｂＦ＋細胞のフローサイトメトリー分析の結果を表１１及び１２に示す。ＣＮＴＯ ５３０（０．３ｍｇ／ｋｇ）の単回ｓｃ投与量を受けた９日後、％ＨｂＦ＋網状赤血球における増加（４．５倍）及び総％ＨｂＦ＋細胞（網状赤血球及びＲＢＣ）における統計的に有意な増加（３．７倍）への傾向があった。
【０１０４】
【表１２】
*投与前より統計的に大きい（Ｐ＝０．０１１、ｔ−検定）
【０１０５】
【表１３】
*投与前より統計的に大きい（Ｐ＝０．０４４、ｔ−検定）
【０１０６】
（概要）
ＣＮＴＯ ５３０の単回ｓｃ投与量は、投与９日後に鎌状赤血球貧血のマウスモデルにおける胎児性ヘモグロビン（ＨｂＦ）の発現を増加させる。ＨｂＦの発現の増加は、鎌状赤血球マウスにおける臓器機能の増加（Ｆａｂｒｙ ｅｔ ａｌ．２００１ Ｂｌｏｏｄ ９７：４１０〜４１８）及び鎌状赤血球危機の発生の低下（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．２０００ Ｈｅｍａｔｏｌ ６４：２６〜３１）に関連する。したがって、ＣＮＴＯ ５３０による長期治療は、鎌状赤血球病の貧血を改善し、鎌状赤血球危機の発生を低下させるとみなすことができる。
【０１０７】
参照
Ｆｏｏｔｅ，Ｍａｒｙ Ａｎｎ；Ｃｏｌｏｗｉｃｋ，Ａｌａｎ；Ｇｏｏｄｋｉｎ，Ｄａｖｉｄ Ａ．Ａｍｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ，ＵＳＡ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎｌｙ ｅｎｃｏｕｎｔｅｒｅｄ ａｎｅｍｉａｓ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００２），７（２），４９〜５９．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｍａｒｔｉｎ Ｄｕｎｉｔｚ Ｌｔｄ．
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Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍｉｍｉｃｒｙ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｏｒｍｏｎｅ ｂｙ ａ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｇｏｎｉｓｔ：ｔｈｅ ＥＰＯ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｔ ２．８ ＡＮＧ．Ｌｉｖｎａｈ，Ｏｄｅｄ；Ｓｔｕｒａ，Ｅｎｒｉｃｏ Ａ．；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄａｎａ Ｌ．；Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，Ｓｔｅｖｅｎ Ａ．；Ｍｕｌｃａｈｙ，Ｌｉｎｄａ Ｓ．；Ｗｒｉｇｈｔｏｎ，Ｎｉｃｈｏｌａｓ Ｃ．；Ｄｏｗｅｒ，Ｗｉｌｌｉａｍ Ｊ．；Ｊｏｌｌｉｆｆｅ，Ｌｉｎｄａ Ｋ．；Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉａｎ Ａ．Ｄｅｐ．ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）（１９９６），２７３（５２７４），４６４〜４７１．
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ＦｉｂｒｏＧｅｎ Ｒｅｐｏｒｔｓ Ｐｈａｓｅ １ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｏｒａｌ Ａｎｅｍｉａ Ｔｈｅｒａｐｙ，ＦＧ−２２１６，ａｎｄ Ｎｅｗ Ｄａｔａ ｆｒｏｍ Ｐｈａｓｅ ２Ａ Ｓｔｕｄｙ ｉｎ Ａｎｅｍｉｃ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｐａｔｉｅｎｔｓ．ｗｗｗ．ｆｉｂｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｎｅｗｓ／ｆｇ２００４１２０６．ｈｔｍｌで閲覧可能。２００７年５月９日にアクセスした。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異常ヘモグロビン症又は骨髄異形成によって引き起こされる貧血として特徴付けられる低血中ヘモグロビン値又は血液中の赤血球の低レベルに特徴がある疾患を有する患者を治療するための方法であって、該患者の造血組織を、二量体ポリペプチドを含む化合物の治療的有効量と接触させるステップを含み、各ポリペプチドは、エリスロポエチン模倣ペプチド（ＥＭＰ）及びヒト免疫グロブリンドメインを含み、該二量体ポリペプチド組成物は、エリスロポエチン依存性細胞を増殖させることが可能である、方法。
【請求項２】
前記貧血の原因が、末期腎不全又は透析、ＡＩＤＳ、自己免疫疾患に関連する貧血、ベータサラセミア、鎌状赤血球病、嚢胞性線維症、慢性炎症性疾患に関連する貧血、加齢による貧血、及び腫瘍性疾患からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＥＭＰ組成物が、幹細胞因子受容体における欠陥又は欠乏に特徴がある病状に由来する貧血を治療する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＥＰＯ模倣ペプチド組成物が、鎌状赤血球貧血、サラセミア、後天性である異常ヘモグロビン症、又はヒトヘモグロビンの構造的変異型に関連する異常ヘモグロビン症からなる群より選択される異常ヘモグロビン症を治療する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＥＰＯ模倣ペプチド組成物が、配列番号２又は３のいずれかのホモ二量化ジスルフィド結合ポリペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記二量体ＥＭＰポリペプチド組成物の前記治療的有効量が、ＵＴ７細胞増殖検定を使用してｒｈＥＰＯに対して計算される、請求項１〜５に記載の方法。
【請求項７】
前記貧血が、骨髄不全によって引き起こされ、前記患者の造血組織は、生体外で前記二量体ＥＭＰポリペプチド組成物と接触した骨髄である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記骨髄組織が、前記患者へ前記組織を戻す前に生体外で培養される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記骨髄組織が、ＳＣＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、又はＩＬ−１１のうちの少なくとも１つを含む付加的な造血刺激因子によって接触される、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記患者が、鉄の供給源を追加的に投与される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１】
異常ヘモグロビン症又は骨髄異形成によって引き起こされる貧血として特徴付けられる低血中ヘモグロビン値又は血液中の赤血球の低レベルに特徴がある疾患を有する患者を治療するための方法であって、該患者の造血組織を、二量体ポリペプチドを含む化合物の治療的有効量と接触させるステップを含み、各ポリペプチドは、エリスロポエチン模倣ペプチド（ＥＭＰ）及びヒト免疫グロブリンドメインを含み、該二量体ポリペプチド組成物は、エリスロポエチン依存性細胞を増殖させることが可能である、方法。
【請求項２】
前記貧血の原因が、末期腎不全又は透析、ＡＩＤＳ、自己免疫疾患に関連する貧血、ベータサラセミア、鎌状赤血球病、嚢胞性線維症、慢性炎症性疾患に関連する貧血、加齢による貧血、及び腫瘍性疾患からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＥＭＰ組成物が、幹細胞因子受容体における欠陥又は欠乏に特徴がある病状に由来する貧血を治療する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＥＰＯ模倣ペプチド組成物が、鎌状赤血球貧血、サラセミア、後天性である異常ヘモグロビン症、又はヒトヘモグロビンの構造的変異型に関連する異常ヘモグロビン症からなる群より選択される異常ヘモグロビン症を治療する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＥＰＯ模倣ペプチド組成物が、配列番号２又は３のいずれかのホモ二量化ジスルフィド結合ポリペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記二量体ＥＭＰポリペプチド組成物の前記治療的有効量が、ＵＴ７細胞増殖検定を使用してｒｈＥＰＯに対して計算される、請求項１〜５に記載の方法。
【請求項７】
前記貧血が、骨髄不全によって引き起こされ、前記患者の造血組織は、生体外で前記二量体ＥＭＰポリペプチド組成物と接触した骨髄である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記骨髄組織が、前記患者へ前記組織を戻す前に生体外で培養される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記骨髄組織が、ＳＣＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、又はＩＬ−１１のうちの少なくとも１つを含む付加的な造血刺激因子によって接触される、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記患者が、鉄の供給源を追加的に投与される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１１−５０８７７７（Ｐ２０１１−５０８７７７Ａ）
【公表日】平成２３年３月１７日（２０１１．３．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４１４６０（Ｐ２０１０−５４１４６０）
【出願日】平成２０年１１月２４日（２００８．１１．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８４４９７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８８５７２
【国際公開日】平成２１年７月１６日（２００９．７．１６）
【出願人】（５０９０８７７５９）セントコア・オーソ・バイオテツク・インコーポレーテツド (77)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月１７日（２０１１．３．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月２４日（２００８．１１．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８４４９７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８８５７２
【国際公開日】平成２１年７月１６日（２００９．７．１６）
【出願人】（５０９０８７７５９）セントコア・オーソ・バイオテツク・インコーポレーテツド (77)
【Ｆターム（参考）】
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