エリスロポエチン受容体作動薬の安定な粒子製剤
粒子製剤にエリスロポエチン受容体作動薬、緩衝剤および糖を含有させ、前記エリスロポエチン受容体作動薬が起こす凝集に対抗するように、前記緩衝剤および糖がそれを安定にする。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明は、一般に、高温で長期間に渡って安定な薬製剤に関する。
【０００２】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、主に腎臓で産出される多面的糖蛋白ホルモンである。ＥＰＯは骨髄による赤血球生成を促進しかつ骨髄の外側では組織保護効果、例えば神経防護作用などを及ぼす。ＥＰＯはこれの細胞表面受容体と結合することで生物学的効果を及ぼす。ＥＰＯ受容体作動薬（ＥＲＡ）はＥＰＯ受容体を活性化し得る種類の組換え型分子である。ＥＲＡの種類の組換え型分子は生来のヒトＥＰＯ（ｈＥＰＯ）に相同性を示す配列を含有しているか或は含有していなくてもよい。生来のｈＥＰＯに相同性を示す配列を含有するＥＲＡクラスに入る製品の例を以下の表１に示す。
【０００３】
【表１】
【０００４】
ＥＲＡ製品は、慢性腎不全による貧血、癌の化学療法および手術に伴う貧血およびエイズのＡＺＴ治療に続発性の貧血の治療で処方されている。現在市場に出ているＥＲＡ製品は週に３回（ＥＰＲＥＸ（Ｒ）， ＥＲＹＰＯ（Ｒ）およびＰＲＯＣＲＩＴ（Ｒ））または週に１回（ＡＲＡＮＥＳＰ（Ｒ））の皮下または筋肉内注射で患者に投与される。ＥＲＡを持続放出送達プラットフォーム、例えばポンプインプラント（ｐｕｍｐ ｉｍｐｌａｎｔｓ）および蓄積注射など、または非侵襲性送達プラットフォーム、例えば経皮パッチなどによる送達に適するように調製することができれば、そのような頻度で注射を行う必要がなくなるであろう。
【０００５】
持続放出送達プラットフォームは、一般に、高温、例えば３７℃以上の温度で長期間、例えば数週間または数カ月に渡って貯蔵した時に安定である製剤を必要とする。現在市場に出ている数種のＥＲＡ製品は液状であり、２から８℃で貯蔵する必要がありかつ室温および高温で不安定である。ＥＲＡは凝集する傾向があることから、それによって生物学的活性が危うくなりかつ望まれない副作用、例えば免疫原性などが誘発される可能性がある。
【０００６】
前記から、高温、例えば３７℃以上の温度で長期間、例えば数週間または数カ月に渡って貯蔵した時に安定であるＥＲＡ製剤が望まれている。
【発明の開示】
【０００７】
発明の要約
本発明は、１つの面において、エリスロポエチン受容体作動薬、緩衝剤および糖を含んで成っていて前記緩衝剤および糖が前記エリスロポエチン受容体作動薬が凝集しないよう
にそれを安定にしている粒子製剤に関する。
【０００８】
別の面において、本発明は、エリスロポエチン受容体作動薬、クエン酸塩およびヒスチジンから成る群から選択される緩衝剤および糖を含んで成っていて４０℃で１カ月の間に生じる可溶性凝集物の総量が３％未満である粒子製剤に関する。
【０００９】
以下の説明から本発明の他の特徴および利点が明らかになるであろう。
【００１０】
発明の詳細な説明
ここに、添付図に示す如き好適な態様をいくつか言及することで本発明を詳細に説明する。以下に行う説明では、本発明を完全に理解することができるように数多くの具体的詳細を挙げる。しかしながら、本発明はそのような具体的な詳細のいくつかまたは全部を用いなくても実施することができることは本分野の技術者に明らかであろう。他の例として、良く知られている特徴および／または工程段階の詳細な説明は行わないが、これは本発明を不必要に曖昧にするものではない。以下の図の言及および考察によって本発明の特徴および利点がより良好に理解されるであろう。
【００１１】
本発明は、高温で長期間に渡って安定なＥＲＡ粒子製剤を提供するものである。本発明の態様に従う粒子製剤は、例えば、４０℃で少なくとも１カ月および３７℃で少なくとも３カ月（送達条件）に渡って物理的および化学的に安定である。化学的経路、例えばアミド分解（通常は加水分解による）または酸化などで生じる劣化生成物のパーセントが受け入れられるならば、そのような粒子製剤は化学的に安定であると見なすことができる。例えば、送達条件下で３カ月の間に生じる分解生成物の量が３５％未満、好適には約２０％以下であるならば、そのような製剤は化学的に安定であると見なすことができる。生じる凝集物（例えば二量体および他の高分子量産物）のパーセントが受け入れられるパーセントであるならば、そのような粒子製剤は物理的に安定であると見なすことができる。例えば、送達条件下で３カ月の間に生じる凝集物の量が１５％未満、好適には１０％以下、より好適には３％未満であるならば、そのような製剤は物理的に安定であると見なすことができる。
【００１２】
高温における安定性は温度がより低い時の安定性が促進されたものであり得ることから、本発明の態様に従う粒子製剤はまた低い方の温度、例えば室温および冷蔵温度でも安定であると期待する。本粒子製剤には、緩衝剤および安定剤（糖を包含）によって凝集に対抗する安定化を受けているＥＲＡが入っている。本粒子製剤の調製は、凍結乾燥、噴霧乾燥または本技術分野で利用可能な他の方法を用いて成分の混合物から粒子を生じさせることで実施可能である。噴霧乾燥を受けさせた製剤の方が凍結乾燥を受けさせた製剤よりも有利であり得る、と言うのは、そのような方法の方が迅速でありかつ粒径が小さくて分布が狭い結果としてさらなる粉砕工程を行う必要がないからである。本発明の態様に従う粒子製剤の水分含有量は低く、典型的に５重量％未満である。本発明の態様に従う粒子製剤を持続放出または非侵襲性送達プラットフォームによる送達に適した媒体に入れて懸濁させることも可能である。
【００１３】
用語「ＥＲＡ」または「エリスロポエチン受容体作動薬」は、ＥＰＯ受容体を活性化させ得る種類の組換え型分子を指す。そのような組換え型分子は生来のｈＥＰＯに相同性を示す配列を含有しているか或は含有していなくてもよい。本発明の１つの態様に従うＥＲＡは、組換え型ｈＥＰＯの生物学的活性を有するポリペプチドおよび蛋白質、ＥＰＯ類似物、ＥＰＯアイソフォーム、ＥＰＯ疑似物、ＥＰＯフラグメント、ハイブリッドＥＰＯ蛋白質、融合蛋白質オリゴマーおよび前記の多量体、前記の同族体、前記のグリコシル化パターン変形、前記の変異体およびこの上に挙げた主要でない修飾形を含有するＥＰＯ分子から成る群から選択可能である。本発明に従うＥＲＡは合成方法によっても製造方法によ
っても限定されず、組換え（ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから生じさせるか否かに拘わらず）、合成、遺伝子組換えおよび遺伝子活性化方法で合成または製造されたそれらが含まれる。
【００１４】
特に好適なＥＲＡは、哺乳動物における赤血球生成を促進し得るＥＲＡである。哺乳動物における赤血球生成を促進し得るＥＲＡの例には、これらに限定するものでないが、エポエチンアルファ（商標名ＥＰＲＥＸ（Ｒ）， ＥＲＹＰＯ（Ｒ）， ＰＲＯＣＲＩＴ（Ｒ））， エポエチンベータ（商標名ＮＥＯＲＥＣＯＲＭＯＮ（Ｒ））およびダーベポエチンアルファ（商標名ＮＥＳＰＴＭ， ＡＲＡＮＥＳＰ（Ｒ））が含まれる。ダーベポエチンアルファの１つの形態がＰＣＴ公開ＷＯ ９５／０５４６５ （Ａｍｇｅｎ， Ｉｎｃ．）に記述されており、これの個別の内容は引用することによって本明細書に組み入れられる。そのＷＯ ９５／０５４６５ 公開に示されているダーベポエチンアルファには、グリコシル化用追加的部位を少なくとも１個含有するか或はそれ用の部位が少なくとも１個転位しているアミノ酸配列を含んで成るｈＥＰＯ類似物が含まれる。そのグリコシル化部位は炭化水素鎖がＮ結合もしくはＯ結合するための部位である。
【００１５】
哺乳動物における赤血球生成を促進し得るとして示された他のＥＲＡには、ｈＥＰＯ類似物、例えばＰＣＴ公開ＷＯ ９９／６６０５４ （Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓ Ｃｏｒｐ）（これの個別の内容は引用することによって本明細書に組み入れら）に記述されているヒト血清アルブミン融合蛋白質など、およびＥＰＯ変異体、例えばＰＣＴ公開ＷＯ ９９／３８８９０ （Ｂｅｔｈ Ｉｓｒａｅｌ Ｄｅａｃｏｎｅｓｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）（これの個別の内容は引用することによって本明細書に組み入れら）に記述されているＥＰＯ変異体などが含まれる。そのＷＯ ９９／３８８９０公開に示されているＥＰＯ変異体には、ＥＰＯをコードする単離された核酸が含まれ、その場合の核酸は、非コード領域の中に変異を１個以上有しかつＥＰＯの生物学的活性が変化している。１つの態様における変異は５１非コード領域の中に存在する。
【００１６】
哺乳動物における赤血球生成を促進し得るとして示された他のＥＲＡには、ＥＰＯオメガ［これは米国特許第５，６８８，６７９号（Ｐｏｗｅｌｌ） （これの個別の内容は引用することによって本明細書に組み入れら）に記述されているｈＥＰＯ遺伝子のＡｐａ Ｉ制限フラグメントから生じ得る］、および変化したグリコシル化ｈＥＰＯ、例えばＰＣＴ公開ＷＯ ９９／１１７８１ （Ｈｏｅｃｈｓｔ Ｍａｒｉｏｎ Ｒｏｕｓｓｅｌ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧＭＢＨ）（これの個別の内容は引用することによって本明細書に組み入れら）に記述されているそれらが含まれる。そのＷＯ ９９／１１７８１公開に示されている変化したグリコシル化ｈＥＰＯには、ＥＰＯの主構造形態の一部または全部を有するポリペプチドが含まれ、それは外因性ＤＮＡ配列の真核生物発現の産物である。
【００１７】
哺乳動物における赤血球生成を促進し得るとして示された別のＥＲＡには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）接合エリスロポエチン類似物が含まれ、それは例えばＰＣＴ公開ＷＯ ９８／０５３６３ （Ｏｒｔｈｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ） （これの個別の内容は引用することによって本明細書に組み入れら）およびＷＯ ０１／７６６４０ （Ａｍｇｅｎ， Ｉｎｃ．） （これの個別の内容は引用することによって本明細書に組み入れら）および米国特許第５，６４３，５７５号（Ｍａｒｔｉｎｅｚ他） （これの内容は引用することによって本明細書に組み入れら）などに記述されている。
【００１８】
他の例には、ＰＣＴ公開ＷＯ ９９／０５２６８ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＧＭＢＨ） （これの個別の内容は引用することによって本明細書に組み入れら）およびＷＯ ９４／１２６５０ （Ｔｒａｎｓｋａｒｙｏｔｉｃ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ， Ｉｎｃ．） （これの個別の内容は引用することによって本明細書に組み入れら）
に記述されている如き内因性ヒトＥＰＯの発現が修飾を受けた細胞株が含まれる。また、ＥＲＡの組織および細胞保護形態も考えられる。
【００１９】
本発明に従うＥＲＡには、また、長期に作用するＥＰＯ形態も含まれ得る。本明細書で用いる如き「長期に作用するＥＰＯ」には、循環半減期が長い持続放出型ＥＰＯ組成物および製剤が含まれ、これらは典型的に免疫原性およびクリアランス値の低下などの如き修飾、およびＥＰＯを重合体微小球の中に封じ込めることなどで達成される。
【００２０】
長期に作用するＥＰＯの一例がＰＣＴ公開ＷＯ ０２／４９６７３ （Ｆ． Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ ＡＧ） （これの内容は引用することによって本明細書に組み入れら）に開示されている。そのＷＯ ０２／４９６７３公開には、Ｎ末端にアルファ−アミノ基を有するエリスロポエチン糖蛋白を含んで成る接合体が記述されており、それはｈＥＰＯまたはｈＥＰＯの配列を有する類似物から選択されるが、そのような類似物では、糖蛋白がＰＥＧ基と共有結合するようにグリコシル化部位が１−６個付加しているか或はグリコシル化部位が転位していることによる修飾を受けている。
【００２１】
長期に作用するＥＰＯの他の例には、これらに限定するものでないが、ＰＣＴ公開ＷＯ
０２／３２９５７ （中外製薬株式会社）に開示されているＰＥＧ修飾ＥＰＯ、ＰＣＴ公開ＷＯ ９４／２８０２４ （Ｅｎｚｏｎ， Ｉｎｃ．）に開示されている非抗原性重合体と共有結合している酸化された炭水化物部分を少なくとも１個有していてエリスロポエチン活性を示す糖蛋白質接合体、およびスクシニミジルカルボキシメチル化ＰＥＧ（ＳＣＭ−ＰＥＧ）、スクシニミジルプロピオネートＰＥＧ（ＳＰＡ−ＰＥＧ）およびＳＢＡ−ＰＥＧを用いて作られた他のＰＥＧ−ＥＰＯが含まれる。
【００２２】
本発明の１つの態様に従う粒子製剤は、ＥＲＡを固体全体の中に０．１から９９．９重量％、好適には固体全体の中に１から３０重量％含有し得る。１つの態様において、本粒子製剤に入っているＥＲＡは安定剤および緩衝剤によって凝集に対抗する安定化を受けている。１つの態様において、本粒子製剤で用いる安定剤には糖が含まれる。そのような糖を本粒子製剤に０．１から９９．９重量％の範囲の量で存在させてもよい。本粒子製剤に含有させることができる糖の例には、これらに限定するものでないが、スクロース、トレハロース、グルコース、ラクトース、マルトースおよびフルクトースが含まれる。１つの態様では、本粒子製剤で用いる緩衝剤を０．１から９９．８重量％の範囲の量で存在させる。そのような緩衝剤が有するｐＨ値は、好適には５．０から８．０、より好適には５．５から７．５の範囲である。１つの態様では、溶液中の緩衝剤の濃度を５ｍＭから５０ｍＭの範囲内にする。緩衝剤の例には、これらに限定するものでないが、クエン酸塩、ヒスチジン、燐酸塩、こはく酸塩、マレイン酸塩、トリス、酢酸塩、炭酸塩およびグリ−グリ（ｇｌｙ−ｇｌｙ）が含まれる。これらの例の中でクエン酸塩およびヒスチジン緩衝剤が最も好適である。ＥＲＡに対する安定剤の比率は多様であり得る。クエン酸塩緩衝剤を用いる場合、ＥＲＡに対する安定剤の比率を好適には２．０より高くする。
【００２３】
本発明の他の態様において、本粒子製剤で用いる安定剤に、糖に加えて、アミノ酸、ポリオールおよび重合体から成る群から選択した１種以上の成分を含めることも可能である。本粒子製剤にアミノ酸を０から９９．９重量％、ポリオールを０から９９．９重量％および重合体を０から９９．９重量％含有させてもよい。本粒子製剤に入れることができるアミノ酸の例には、これらに限定するものでないが、ヒスチジン、グリシン、アラニン、Ｌ−ロイシン、グルタミン酸、イソロイシン、メチオニン、Ｌ−トレオニン、２−フェニルアミンおよびアルギニンが含まれる。本粒子製剤に入れることができるポリオールの例には、これらに限定するものでないが、ソルビトールおよびマンニトールが含まれる。本粒子製剤に入れることができる重合体の例には、これらに限定するものでないが、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、デキストランおよびプロピレングリコールが含まれる。
【００２４】
本粒子製剤に他の賦形剤、例えば界面活性剤、充填剤および塩などから選択した他の賦形剤を含有させることも可能である。本粒子製剤に界面活性剤を０から１０重量％、好適には０から５重量％、充填剤を０から９９．９重量％、好適には０から７０重量％、および塩を０から９９．９重量％、好適には０から７０重量％含有させてもよい。本粒子製剤に含有させる界面活性剤はイオン性または非イオン性であってもよい。界面活性剤の例には、これらに限定するものでないが、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（商標名 ＴＷＥＥＮ（Ｒ） ２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（商標名 ＴＷＥＥＮ（Ｒ） ８０）、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレングリコール（商標名 ＰＬＵＲＯＮＩＣ（Ｒ） Ｆ６８）およびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が含まれる。充填剤の例には、これらに限定するものでないが、マンニトールおよびグリシンが含まれる。塩の例には、これらに限定するものでないが、塩化ナトリウム、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムが含まれる。
【００２５】
ｐＨ、緩衝剤の種類（クエン酸塩、ヒスチジン、トリス）、塩（ＮａＣｌ）、金属錯体（酢酸亜鉛および塩化カルシウム）、アミノ酸（アルギニン）および糖（スクロース）がＥＰＯ（エポエチンアルファ）が溶液中で示す安定性に対して示す影響を評価する目的で予備調製試験を実施した。ＥＰＯが溶液中で示す安定性の評価をサイズエクスクルーシブクロマトグラフィー（Ｓｉｚｅ Ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（ＳＥＣ）を用いて実施した。その安定性の評価を溶解性凝集物総量に換算して実施し、これは、単量体よりも大きくかつ水に溶解し得るＥＰＯ関連化合物のパーセントである。
【００２６】
以下の実施例は説明の目的で示すものであり、本明細書に特に記述しない限り、本発明を限定するとして解釈されるべきではない。
【実施例１】
【００２７】
ＥＰＯのバルク溶液を濃度が約３．１ｍｇ／ｍｌの凍結溶液として得た。そのＥＰＯ溶液の４サンプルに緩衝溶液を用いた透析を受けさせることでｐＨがそれぞれ４．８、５．８、７．０および７．７の最終的溶液を生じさせた。そのｐＨが４．８、５．８、７．０および７．７の溶液に入っているＥＰＯの安定性を４０℃で７４日間に渡って評価した。その結果を図１Ａに示す。７４日目の可溶凝集物の総量は、ｐＨが４．８の溶液の場合には１００％であり、ｐＨが５．８および７．０の溶液の場合には１０％未満でありそしてｐＨが７．７の溶液の場合には２０％より若干高い。
【実施例２】
【００２８】
ＥＰＯのバルク溶液を濃度が約３．１ｍｇ／ｍｌの凍結溶液として得た。そのＥＰＯ溶液の３サンプルにクエン酸塩緩衝液、ヒスチジン緩衝液およびトリス緩衝液のそれぞれを用いた透析を受けさせたが、各緩衝液のｐＨは７．０であった。そのクエン酸塩緩衝液、ヒスチジン緩衝液およびトリス緩衝液に入っているＥＰＯの安定性を４０℃で７４日間に渡って評価した。その結果を図１Ｂに示す。７４日目の可溶凝集物の総量は、クエン酸塩緩衝液を用いた場合には４％より若干高く、ヒスチジン緩衝液を用いた場合には８％に相当しそしてトリス緩衝液を用いた場合には１８％より若干高い。
【実施例３】
【００２９】
ＥＰＯのバルク溶液を濃度が約３．１ｍｇ／ｍｌの凍結溶液として得た。そのサンプルの中の２つにＮａＣｌをそれぞれ５０ｍＭおよび１００ｍＭの濃度で添加することで、ＥＰＯ溶液の３サンプルを調製した。これらの溶液に入っているＥＰＯの安定性を４０℃で７４日間に渡って評価した。その結果を図１Ｃに示す。７４日目の可溶凝集物の総量は、ＮａＣｌ無しの場合には４％より若干高く、ＮａＣｌが５０ｍＭの場合には約４．５％でありそしてＮａＣｌが１００ｍＭの場合には約５．５％である。この結果から可溶凝集物の総量はＮａＣｌの濃度に伴って高くなることが分かる。
【実施例４】
【００３０】
ＥＰＯのバルク溶液を濃度が約３．１ｍｇ／ｍｌの凍結溶液として得た。そのサンプルの中の１つにＴＷＥＥＮ（商標）２０（界面活性剤）を０．０１重量／体積％の量で添加することで、ＥＰＯ溶液の２サンプルを調製した。これらの溶液に入っているＥＰＯの安定性を４０℃で７４日間に渡って評価した。その結果を図１Ｄに示す。７４日目の可溶凝集物の総量は、界面活性剤無しの場合には４％より若干高くそして界面活性剤を用いた場合には約７．５％である。
【実施例５】
【００３１】
ＥＰＯのバルク溶液を濃度が約３．１ｍｇ／ｍｌの凍結溶液として得た。そのサンプルの中の２つに酢酸亜鉛および塩化カルシウム（金属錯体）のそれぞれを添加することで、ＥＰＯ溶液の３サンプルを調製した。これらの溶液に入っているＥＰＯの安定性を４０℃で７４日間に渡って評価した。その結果を図１Ｅに示す。７４日目の可溶凝集物の総量は、金属錯体無しの場合には約４％であり、酢酸亜鉛を用いた場合には約９．５％でありそして塩化カルシウムを用いた場合には約８％である。
【実施例６】
【００３２】
ＥＰＯのバルク溶液を濃度が約３．１ｍｇ／ｍｌの凍結溶液として得た。ＥＰＯ溶液の２サンプルを調製した。一方のサンプルにはアルギニン（アミノ酸）を入れる一方、もう一方のサンプルにはアルギニンを入れなかった。これらの溶液に入っているＥＰＯの安定性を４０℃で７４日間に渡って評価した。その結果を図１Ｆに示す。７４日目の可溶凝集物の総量は、アルギニン無しの場合には約４％でありそしてアルギニンを用いた場合には約５．３％である。
【実施例７】
【００３３】
ＥＰＯのバルク溶液を濃度が約３．１ｍｇ／ｍｌの凍結溶液として得た。ＥＰＯ溶液の４サンプルを調製した。スクロースをサンプルに添加することでスクロースとＥＰＯの比率がそれぞれ０：１、２．５：１、５：１および１０：１の最終的溶液を生じさせた。そのスクロース溶液に入っているＥＰＯの安定性を４０℃で７４日間に渡って評価した。その結果を図１Ｇに示す。７４日目の可溶凝集物の総量は、スクロース：ＥＰＯの比率が０：１の場合には約４．２％であり、スクロース：エリスロポエチンの比率が２．５：１の場合には約２．７％であり、スクロース：ＥＰＯの比率が５：１の場合には約２．６％でありそしてスクロース：ＥＰＯの比率が１０：１の場合には約２．２％である。この結果から可溶凝集物の総量はＥＰＯに対するスクロースの比率を高くするにつれて減少することが分かる。
【００３４】
本発明の態様に従う粒子製剤の安定性を評価する検定を実施した。粒子製剤の調製を凍結乾燥または噴霧乾燥で実施した。これらの粒子製剤の安定性をＳＥＣで評価した。その安定性をＥＰＯ充填率および可溶凝集物総量に換算して評価した。ＥＰＯ充填率は凍結乾燥もしくは噴霧乾燥製剤に入っている可溶ＥＰＯ全体（単量体、二量体および他の高分子量生成物を包含）のパーセントである。ＥＰＯ充填率は、不溶な蛋白質が貯蔵中に有意な量で生じたか否かに関する情報をいくらか与えるものである。可溶凝集物総量は、単量体より大きくかつ水に溶解するＥＰＯ関連化合物のパーセントである。
【００３５】
この検定では、ＥＰＯのバルク溶液を濃度が約３．１ｍｇ／ｍｌの凍結溶液として得た。そのＥＰＯ溶液の異なるサンプルに緩衝溶液を用いた透析を受けさせた。その透析を受けさせたＥＰＯ溶液に安定剤および場合により界面活性剤を添加することで、最終的なエリスロポエチンと安定剤と界面活性剤の比率を所望の比率にした。その溶液に凍結乾燥を以下の表１に示す凍結乾燥サイクルに従って受けさせた。
【００３６】
【表２】
【００３７】
以下の実施例は説明の目的で示すものであり、本明細書で特に明記しない限り、本発明の限定として解釈されるべきではない。
【実施例８】
【００３８】
クエン酸塩を緩衝剤として用い、スクロースを安定剤として用いかつＴＷＥＥＮ（商標）２０を界面活性剤として用いて１０種類の凍結乾燥製剤をこの上に記述した如く調製した。以下の表２に凍結乾燥製剤を示す。
【００３９】
【表３】
【００４０】
表２に示した凍結乾燥製剤の貯蔵を４０℃で４週間および３７℃で３カ月間実施した。以下の表３に、初期、４０℃で８日目および４週目および３７℃で３カ月目のＥＰＯ充填率を示す。また、これらの安定性を示した時点のＥＰＯ充填率を図２にも示す。この結果から前記製剤を４０℃で４週間および３７℃で３カ月間貯蔵した時にＥＰＯ充填率が低下する傾向が全くないことが分かり、このことは、不溶な蛋白質が有意な量で生じることはないことを示している。
【００４１】
【表４】
【００４２】
以下の表４に、初期、４０℃で８日目および４週目および３７℃で３カ月目の可溶凝集物総量を示す。また、これらの安定性を示した時点の可溶凝集物総量を図３にも示す。４０℃で４週間貯蔵した時の可溶凝集物総量は、製剤Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨおよびＪの場合には０％であった。３７℃で３カ月間貯蔵した時の可溶凝集物総量は、製剤Ｃ、Ｄ、ＧおよびＨの場合には０．１％未満であった。
【００４３】
【表５】
【００４４】
スクロースとエリスロポエチンの比率およびＴＷＥＥＮ（商標）２０の濃度およびクエン酸塩の濃度が可溶凝集物総量に対して示す影響を統計学的分析ソフトウエアを用いて分析した。この分析の結果を図４に示す。この結果から凍結乾燥中および４０℃で貯蔵している間のＥＰＯ製剤はＥＰＯに対するスクロースの比率を高くすると安定になることが分かる。ＴＷＥＥＮ（商標）２０を添加すると凍結乾燥中に製剤が起こす凝集の度合は低下するが、４０℃で貯蔵している時の安定性は改善されない。クエン酸塩の濃度が凍結乾燥中のＥＰＯの安定性に対して示す影響はほとんどない。しかしながら、クエン酸塩の濃度を低くすると４０℃で貯蔵している時の安定性がより良好になることが分かる。
【実施例９】
【００４５】
ヒスチジンを緩衝剤として用い、スクロースを安定剤として用いかつＴＷＥＥＮ（商標）２０を界面活性剤として用いて６種類の凍結乾燥製剤をこの上に記述した如く調製した。以下の表５に凍結乾燥製剤を示す。
【００４６】
【表６】
【００４７】
前記凍結乾燥製剤の貯蔵を４０℃で４週間および３７℃で３カ月間実施した。以下の表６に、初期、４０℃で８日目および４週目および３７℃で３カ月目のＥＰＯ充填率を示す。また、これらの安定性を示した時点のＥＰＯ充填率を図５にも示す。この結果から前記製剤を４０℃で４週間および３７℃で３カ月間貯蔵した時にＥＰＯ充填率が低下する傾向が全くないことが分かる。
【００４８】
【表７】
【００４９】
以下の表７に、初期、４０℃で８日目および４週目および３７℃で３カ月目の可溶凝集物総量を示す。また、これらの安定性を示した時点の可溶凝集物総量を図６にも示す。これらのヒスチジン製剤を４０℃で４週間貯蔵した時および３７℃で３カ月間貯蔵した時の可溶凝集物総量は、それらの全部で０．２％未満である。製剤ＬおよびＯを４０℃で４週間貯蔵した時および３７℃で３カ月間貯蔵した時にそれらが示した可溶凝集物総量は０％である。
【００５０】
【表８】
【実施例１０】
【００５１】
ＥＰＯのバルク溶液を濃度が約３．１ｍｇ／ｍｌの凍結溶液として得た。そのＥＰＯ溶液に１０ｍＭのヒスチジン緩衝液を用いた透析を受けさせた。その透析を受けさせたＥＰＯ溶液にスクロース（安定剤）およびＴＷＥＥＮ（商標）２０（界面活性剤）を添加することでＥＰＯとスクロースと界面活性剤の比率を所望の比率にした。その緩衝剤を添加した溶液に噴霧乾燥を受けさせることでＥＰＯ：スクロース：ＴＷＥＥＮ（商標）２０：１０ｍＭのヒスチジンの比率が１：４．５３：０．０３：０．５０に相当し、ｐＨが６．９でありそしてＥＰＯ充填率が１６．５％の固体状粒子を得た。その噴霧乾燥を受けさせたＥＰＯ製剤を４０℃で３カ月間貯蔵した。これらのサンプルにＳＥＣを用いた分析を初期、１カ月、２カ月および３カ月目のそれぞれで受けさせた。初期時点のＥＰＯ粉末が示した平均粒径は約４．５μｍであり、ガラス転移温度は５４．９±５．６℃でありかつ水分含有量は１．１６±０．０１％であった。以下の表８に安定性の結果を示す。この結果から前記ＥＰＯ粉末はこれを４０℃で３カ月間貯蔵した時に凝集に対抗する安定化を受けていることが分かる。
【００５２】
【表９】
【００５３】
本発明を限られた数の態様に関して記述してきたが、本開示の利点を習得した本分野の技術者は、本明細書に開示した如き本発明の範囲から逸脱することのない他の態様を考案することができることを理解するであろう。従って、本発明の範囲が限定されるのは添付請求項によってのみである。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１Ａ】図１Ａに、ＥＰＯが溶液中で示す安定性に対するｐＨの影響を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂに、ＥＰＯが溶液中で示す安定性に対する緩衝剤の種類の影響を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃに、ＥＰＯが溶液中で示す安定性に対するＮａＣｌの影響を示す。
【図１Ｄ】図１Ｄに、ＥＰＯが溶液中で示す安定性に対する界面活性剤の影響を示す。
【図１Ｅ】図１Ａに、ＥＰＯが溶液中で示す安定性に対する金属錯体の影響を示す。
【図１Ｆ】図１Ｆに、ＥＰＯが溶液中で示す安定性に対するアルギニンの影響を示す。
【図１Ｇ】図１Ｇに、ＥＰＯが溶液中で示す安定性に対するスクロースの影響を示す。
【図２】図２に、本発明の態様に従うクエン酸塩緩衝製剤凍結乾燥品が初期、４０℃で８日目および４週目および３７℃で３カ月目に示したＥＰＯ充填率を示す。
【図３】図３に、本発明の態様に従うクエン酸塩緩衝製剤凍結乾燥品が初期、４０℃で８日目および４週目および３７℃で３カ月目に示した可溶凝集物総量を示す。
【図４】図４に、本発明の態様に従うクエン酸塩緩衝製剤凍結乾燥品が示す可溶凝集物総量に対するスクロースとＥＰＯの比率、界面活性剤濃度および緩衝剤濃度の影響を示す。
【図５】図５に、本発明の態様に従うヒスチジン緩衝製剤凍結乾燥品が初期、４０℃で８日目および４週目および３７℃で３カ月目に示したＥＰＯ充填率を示す。
【図６】図６に、本発明の態様に従うヒスチジン緩衝製剤凍結乾燥品が初期、４０℃で８日目および４週目および３７℃で３カ月目に示した可溶凝集物総量を示す。
【背景技術】
【０００１】
本発明は、一般に、高温で長期間に渡って安定な薬製剤に関する。
【０００２】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、主に腎臓で産出される多面的糖蛋白ホルモンである。ＥＰＯは骨髄による赤血球生成を促進しかつ骨髄の外側では組織保護効果、例えば神経防護作用などを及ぼす。ＥＰＯはこれの細胞表面受容体と結合することで生物学的効果を及ぼす。ＥＰＯ受容体作動薬（ＥＲＡ）はＥＰＯ受容体を活性化し得る種類の組換え型分子である。ＥＲＡの種類の組換え型分子は生来のヒトＥＰＯ（ｈＥＰＯ）に相同性を示す配列を含有しているか或は含有していなくてもよい。生来のｈＥＰＯに相同性を示す配列を含有するＥＲＡクラスに入る製品の例を以下の表１に示す。
【０００３】
【表１】
【０００４】
ＥＲＡ製品は、慢性腎不全による貧血、癌の化学療法および手術に伴う貧血およびエイズのＡＺＴ治療に続発性の貧血の治療で処方されている。現在市場に出ているＥＲＡ製品は週に３回（ＥＰＲＥＸ（Ｒ）， ＥＲＹＰＯ（Ｒ）およびＰＲＯＣＲＩＴ（Ｒ））または週に１回（ＡＲＡＮＥＳＰ（Ｒ））の皮下または筋肉内注射で患者に投与される。ＥＲＡを持続放出送達プラットフォーム、例えばポンプインプラント（ｐｕｍｐ ｉｍｐｌａｎｔｓ）および蓄積注射など、または非侵襲性送達プラットフォーム、例えば経皮パッチなどによる送達に適するように調製することができれば、そのような頻度で注射を行う必要がなくなるであろう。
【０００５】
持続放出送達プラットフォームは、一般に、高温、例えば３７℃以上の温度で長期間、例えば数週間または数カ月に渡って貯蔵した時に安定である製剤を必要とする。現在市場に出ている数種のＥＲＡ製品は液状であり、２から８℃で貯蔵する必要がありかつ室温および高温で不安定である。ＥＲＡは凝集する傾向があることから、それによって生物学的活性が危うくなりかつ望まれない副作用、例えば免疫原性などが誘発される可能性がある。
【０００６】
前記から、高温、例えば３７℃以上の温度で長期間、例えば数週間または数カ月に渡って貯蔵した時に安定であるＥＲＡ製剤が望まれている。
【発明の開示】
【０００７】
発明の要約
本発明は、１つの面において、エリスロポエチン受容体作動薬、緩衝剤および糖を含んで成っていて前記緩衝剤および糖が前記エリスロポエチン受容体作動薬が凝集しないよう
にそれを安定にしている粒子製剤に関する。
【０００８】
別の面において、本発明は、エリスロポエチン受容体作動薬、クエン酸塩およびヒスチジンから成る群から選択される緩衝剤および糖を含んで成っていて４０℃で１カ月の間に生じる可溶性凝集物の総量が３％未満である粒子製剤に関する。
【０００９】
以下の説明から本発明の他の特徴および利点が明らかになるであろう。
【００１０】
発明の詳細な説明
ここに、添付図に示す如き好適な態様をいくつか言及することで本発明を詳細に説明する。以下に行う説明では、本発明を完全に理解することができるように数多くの具体的詳細を挙げる。しかしながら、本発明はそのような具体的な詳細のいくつかまたは全部を用いなくても実施することができることは本分野の技術者に明らかであろう。他の例として、良く知られている特徴および／または工程段階の詳細な説明は行わないが、これは本発明を不必要に曖昧にするものではない。以下の図の言及および考察によって本発明の特徴および利点がより良好に理解されるであろう。
【００１１】
本発明は、高温で長期間に渡って安定なＥＲＡ粒子製剤を提供するものである。本発明の態様に従う粒子製剤は、例えば、４０℃で少なくとも１カ月および３７℃で少なくとも３カ月（送達条件）に渡って物理的および化学的に安定である。化学的経路、例えばアミド分解（通常は加水分解による）または酸化などで生じる劣化生成物のパーセントが受け入れられるならば、そのような粒子製剤は化学的に安定であると見なすことができる。例えば、送達条件下で３カ月の間に生じる分解生成物の量が３５％未満、好適には約２０％以下であるならば、そのような製剤は化学的に安定であると見なすことができる。生じる凝集物（例えば二量体および他の高分子量産物）のパーセントが受け入れられるパーセントであるならば、そのような粒子製剤は物理的に安定であると見なすことができる。例えば、送達条件下で３カ月の間に生じる凝集物の量が１５％未満、好適には１０％以下、より好適には３％未満であるならば、そのような製剤は物理的に安定であると見なすことができる。
【００１２】
高温における安定性は温度がより低い時の安定性が促進されたものであり得ることから、本発明の態様に従う粒子製剤はまた低い方の温度、例えば室温および冷蔵温度でも安定であると期待する。本粒子製剤には、緩衝剤および安定剤（糖を包含）によって凝集に対抗する安定化を受けているＥＲＡが入っている。本粒子製剤の調製は、凍結乾燥、噴霧乾燥または本技術分野で利用可能な他の方法を用いて成分の混合物から粒子を生じさせることで実施可能である。噴霧乾燥を受けさせた製剤の方が凍結乾燥を受けさせた製剤よりも有利であり得る、と言うのは、そのような方法の方が迅速でありかつ粒径が小さくて分布が狭い結果としてさらなる粉砕工程を行う必要がないからである。本発明の態様に従う粒子製剤の水分含有量は低く、典型的に５重量％未満である。本発明の態様に従う粒子製剤を持続放出または非侵襲性送達プラットフォームによる送達に適した媒体に入れて懸濁させることも可能である。
【００１３】
用語「ＥＲＡ」または「エリスロポエチン受容体作動薬」は、ＥＰＯ受容体を活性化させ得る種類の組換え型分子を指す。そのような組換え型分子は生来のｈＥＰＯに相同性を示す配列を含有しているか或は含有していなくてもよい。本発明の１つの態様に従うＥＲＡは、組換え型ｈＥＰＯの生物学的活性を有するポリペプチドおよび蛋白質、ＥＰＯ類似物、ＥＰＯアイソフォーム、ＥＰＯ疑似物、ＥＰＯフラグメント、ハイブリッドＥＰＯ蛋白質、融合蛋白質オリゴマーおよび前記の多量体、前記の同族体、前記のグリコシル化パターン変形、前記の変異体およびこの上に挙げた主要でない修飾形を含有するＥＰＯ分子から成る群から選択可能である。本発明に従うＥＲＡは合成方法によっても製造方法によ
っても限定されず、組換え（ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから生じさせるか否かに拘わらず）、合成、遺伝子組換えおよび遺伝子活性化方法で合成または製造されたそれらが含まれる。
【００１４】
特に好適なＥＲＡは、哺乳動物における赤血球生成を促進し得るＥＲＡである。哺乳動物における赤血球生成を促進し得るＥＲＡの例には、これらに限定するものでないが、エポエチンアルファ（商標名ＥＰＲＥＸ（Ｒ）， ＥＲＹＰＯ（Ｒ）， ＰＲＯＣＲＩＴ（Ｒ））， エポエチンベータ（商標名ＮＥＯＲＥＣＯＲＭＯＮ（Ｒ））およびダーベポエチンアルファ（商標名ＮＥＳＰＴＭ， ＡＲＡＮＥＳＰ（Ｒ））が含まれる。ダーベポエチンアルファの１つの形態がＰＣＴ公開ＷＯ ９５／０５４６５ （Ａｍｇｅｎ， Ｉｎｃ．）に記述されており、これの個別の内容は引用することによって本明細書に組み入れられる。そのＷＯ ９５／０５４６５ 公開に示されているダーベポエチンアルファには、グリコシル化用追加的部位を少なくとも１個含有するか或はそれ用の部位が少なくとも１個転位しているアミノ酸配列を含んで成るｈＥＰＯ類似物が含まれる。そのグリコシル化部位は炭化水素鎖がＮ結合もしくはＯ結合するための部位である。
【００１５】
哺乳動物における赤血球生成を促進し得るとして示された他のＥＲＡには、ｈＥＰＯ類似物、例えばＰＣＴ公開ＷＯ ９９／６６０５４ （Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓ Ｃｏｒｐ）（これの個別の内容は引用することによって本明細書に組み入れら）に記述されているヒト血清アルブミン融合蛋白質など、およびＥＰＯ変異体、例えばＰＣＴ公開ＷＯ ９９／３８８９０ （Ｂｅｔｈ Ｉｓｒａｅｌ Ｄｅａｃｏｎｅｓｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）（これの個別の内容は引用することによって本明細書に組み入れら）に記述されているＥＰＯ変異体などが含まれる。そのＷＯ ９９／３８８９０公開に示されているＥＰＯ変異体には、ＥＰＯをコードする単離された核酸が含まれ、その場合の核酸は、非コード領域の中に変異を１個以上有しかつＥＰＯの生物学的活性が変化している。１つの態様における変異は５１非コード領域の中に存在する。
【００１６】
哺乳動物における赤血球生成を促進し得るとして示された他のＥＲＡには、ＥＰＯオメガ［これは米国特許第５，６８８，６７９号（Ｐｏｗｅｌｌ） （これの個別の内容は引用することによって本明細書に組み入れら）に記述されているｈＥＰＯ遺伝子のＡｐａ Ｉ制限フラグメントから生じ得る］、および変化したグリコシル化ｈＥＰＯ、例えばＰＣＴ公開ＷＯ ９９／１１７８１ （Ｈｏｅｃｈｓｔ Ｍａｒｉｏｎ Ｒｏｕｓｓｅｌ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧＭＢＨ）（これの個別の内容は引用することによって本明細書に組み入れら）に記述されているそれらが含まれる。そのＷＯ ９９／１１７８１公開に示されている変化したグリコシル化ｈＥＰＯには、ＥＰＯの主構造形態の一部または全部を有するポリペプチドが含まれ、それは外因性ＤＮＡ配列の真核生物発現の産物である。
【００１７】
哺乳動物における赤血球生成を促進し得るとして示された別のＥＲＡには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）接合エリスロポエチン類似物が含まれ、それは例えばＰＣＴ公開ＷＯ ９８／０５３６３ （Ｏｒｔｈｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ） （これの個別の内容は引用することによって本明細書に組み入れら）およびＷＯ ０１／７６６４０ （Ａｍｇｅｎ， Ｉｎｃ．） （これの個別の内容は引用することによって本明細書に組み入れら）および米国特許第５，６４３，５７５号（Ｍａｒｔｉｎｅｚ他） （これの内容は引用することによって本明細書に組み入れら）などに記述されている。
【００１８】
他の例には、ＰＣＴ公開ＷＯ ９９／０５２６８ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＧＭＢＨ） （これの個別の内容は引用することによって本明細書に組み入れら）およびＷＯ ９４／１２６５０ （Ｔｒａｎｓｋａｒｙｏｔｉｃ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ， Ｉｎｃ．） （これの個別の内容は引用することによって本明細書に組み入れら）
に記述されている如き内因性ヒトＥＰＯの発現が修飾を受けた細胞株が含まれる。また、ＥＲＡの組織および細胞保護形態も考えられる。
【００１９】
本発明に従うＥＲＡには、また、長期に作用するＥＰＯ形態も含まれ得る。本明細書で用いる如き「長期に作用するＥＰＯ」には、循環半減期が長い持続放出型ＥＰＯ組成物および製剤が含まれ、これらは典型的に免疫原性およびクリアランス値の低下などの如き修飾、およびＥＰＯを重合体微小球の中に封じ込めることなどで達成される。
【００２０】
長期に作用するＥＰＯの一例がＰＣＴ公開ＷＯ ０２／４９６７３ （Ｆ． Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ ＡＧ） （これの内容は引用することによって本明細書に組み入れら）に開示されている。そのＷＯ ０２／４９６７３公開には、Ｎ末端にアルファ−アミノ基を有するエリスロポエチン糖蛋白を含んで成る接合体が記述されており、それはｈＥＰＯまたはｈＥＰＯの配列を有する類似物から選択されるが、そのような類似物では、糖蛋白がＰＥＧ基と共有結合するようにグリコシル化部位が１−６個付加しているか或はグリコシル化部位が転位していることによる修飾を受けている。
【００２１】
長期に作用するＥＰＯの他の例には、これらに限定するものでないが、ＰＣＴ公開ＷＯ
０２／３２９５７ （中外製薬株式会社）に開示されているＰＥＧ修飾ＥＰＯ、ＰＣＴ公開ＷＯ ９４／２８０２４ （Ｅｎｚｏｎ， Ｉｎｃ．）に開示されている非抗原性重合体と共有結合している酸化された炭水化物部分を少なくとも１個有していてエリスロポエチン活性を示す糖蛋白質接合体、およびスクシニミジルカルボキシメチル化ＰＥＧ（ＳＣＭ−ＰＥＧ）、スクシニミジルプロピオネートＰＥＧ（ＳＰＡ−ＰＥＧ）およびＳＢＡ−ＰＥＧを用いて作られた他のＰＥＧ−ＥＰＯが含まれる。
【００２２】
本発明の１つの態様に従う粒子製剤は、ＥＲＡを固体全体の中に０．１から９９．９重量％、好適には固体全体の中に１から３０重量％含有し得る。１つの態様において、本粒子製剤に入っているＥＲＡは安定剤および緩衝剤によって凝集に対抗する安定化を受けている。１つの態様において、本粒子製剤で用いる安定剤には糖が含まれる。そのような糖を本粒子製剤に０．１から９９．９重量％の範囲の量で存在させてもよい。本粒子製剤に含有させることができる糖の例には、これらに限定するものでないが、スクロース、トレハロース、グルコース、ラクトース、マルトースおよびフルクトースが含まれる。１つの態様では、本粒子製剤で用いる緩衝剤を０．１から９９．８重量％の範囲の量で存在させる。そのような緩衝剤が有するｐＨ値は、好適には５．０から８．０、より好適には５．５から７．５の範囲である。１つの態様では、溶液中の緩衝剤の濃度を５ｍＭから５０ｍＭの範囲内にする。緩衝剤の例には、これらに限定するものでないが、クエン酸塩、ヒスチジン、燐酸塩、こはく酸塩、マレイン酸塩、トリス、酢酸塩、炭酸塩およびグリ−グリ（ｇｌｙ−ｇｌｙ）が含まれる。これらの例の中でクエン酸塩およびヒスチジン緩衝剤が最も好適である。ＥＲＡに対する安定剤の比率は多様であり得る。クエン酸塩緩衝剤を用いる場合、ＥＲＡに対する安定剤の比率を好適には２．０より高くする。
【００２３】
本発明の他の態様において、本粒子製剤で用いる安定剤に、糖に加えて、アミノ酸、ポリオールおよび重合体から成る群から選択した１種以上の成分を含めることも可能である。本粒子製剤にアミノ酸を０から９９．９重量％、ポリオールを０から９９．９重量％および重合体を０から９９．９重量％含有させてもよい。本粒子製剤に入れることができるアミノ酸の例には、これらに限定するものでないが、ヒスチジン、グリシン、アラニン、Ｌ−ロイシン、グルタミン酸、イソロイシン、メチオニン、Ｌ−トレオニン、２−フェニルアミンおよびアルギニンが含まれる。本粒子製剤に入れることができるポリオールの例には、これらに限定するものでないが、ソルビトールおよびマンニトールが含まれる。本粒子製剤に入れることができる重合体の例には、これらに限定するものでないが、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、デキストランおよびプロピレングリコールが含まれる。
【００２４】
本粒子製剤に他の賦形剤、例えば界面活性剤、充填剤および塩などから選択した他の賦形剤を含有させることも可能である。本粒子製剤に界面活性剤を０から１０重量％、好適には０から５重量％、充填剤を０から９９．９重量％、好適には０から７０重量％、および塩を０から９９．９重量％、好適には０から７０重量％含有させてもよい。本粒子製剤に含有させる界面活性剤はイオン性または非イオン性であってもよい。界面活性剤の例には、これらに限定するものでないが、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（商標名 ＴＷＥＥＮ（Ｒ） ２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（商標名 ＴＷＥＥＮ（Ｒ） ８０）、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレングリコール（商標名 ＰＬＵＲＯＮＩＣ（Ｒ） Ｆ６８）およびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が含まれる。充填剤の例には、これらに限定するものでないが、マンニトールおよびグリシンが含まれる。塩の例には、これらに限定するものでないが、塩化ナトリウム、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムが含まれる。
【００２５】
ｐＨ、緩衝剤の種類（クエン酸塩、ヒスチジン、トリス）、塩（ＮａＣｌ）、金属錯体（酢酸亜鉛および塩化カルシウム）、アミノ酸（アルギニン）および糖（スクロース）がＥＰＯ（エポエチンアルファ）が溶液中で示す安定性に対して示す影響を評価する目的で予備調製試験を実施した。ＥＰＯが溶液中で示す安定性の評価をサイズエクスクルーシブクロマトグラフィー（Ｓｉｚｅ Ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（ＳＥＣ）を用いて実施した。その安定性の評価を溶解性凝集物総量に換算して実施し、これは、単量体よりも大きくかつ水に溶解し得るＥＰＯ関連化合物のパーセントである。
【００２６】
以下の実施例は説明の目的で示すものであり、本明細書に特に記述しない限り、本発明を限定するとして解釈されるべきではない。
【実施例１】
【００２７】
ＥＰＯのバルク溶液を濃度が約３．１ｍｇ／ｍｌの凍結溶液として得た。そのＥＰＯ溶液の４サンプルに緩衝溶液を用いた透析を受けさせることでｐＨがそれぞれ４．８、５．８、７．０および７．７の最終的溶液を生じさせた。そのｐＨが４．８、５．８、７．０および７．７の溶液に入っているＥＰＯの安定性を４０℃で７４日間に渡って評価した。その結果を図１Ａに示す。７４日目の可溶凝集物の総量は、ｐＨが４．８の溶液の場合には１００％であり、ｐＨが５．８および７．０の溶液の場合には１０％未満でありそしてｐＨが７．７の溶液の場合には２０％より若干高い。
【実施例２】
【００２８】
ＥＰＯのバルク溶液を濃度が約３．１ｍｇ／ｍｌの凍結溶液として得た。そのＥＰＯ溶液の３サンプルにクエン酸塩緩衝液、ヒスチジン緩衝液およびトリス緩衝液のそれぞれを用いた透析を受けさせたが、各緩衝液のｐＨは７．０であった。そのクエン酸塩緩衝液、ヒスチジン緩衝液およびトリス緩衝液に入っているＥＰＯの安定性を４０℃で７４日間に渡って評価した。その結果を図１Ｂに示す。７４日目の可溶凝集物の総量は、クエン酸塩緩衝液を用いた場合には４％より若干高く、ヒスチジン緩衝液を用いた場合には８％に相当しそしてトリス緩衝液を用いた場合には１８％より若干高い。
【実施例３】
【００２９】
ＥＰＯのバルク溶液を濃度が約３．１ｍｇ／ｍｌの凍結溶液として得た。そのサンプルの中の２つにＮａＣｌをそれぞれ５０ｍＭおよび１００ｍＭの濃度で添加することで、ＥＰＯ溶液の３サンプルを調製した。これらの溶液に入っているＥＰＯの安定性を４０℃で７４日間に渡って評価した。その結果を図１Ｃに示す。７４日目の可溶凝集物の総量は、ＮａＣｌ無しの場合には４％より若干高く、ＮａＣｌが５０ｍＭの場合には約４．５％でありそしてＮａＣｌが１００ｍＭの場合には約５．５％である。この結果から可溶凝集物の総量はＮａＣｌの濃度に伴って高くなることが分かる。
【実施例４】
【００３０】
ＥＰＯのバルク溶液を濃度が約３．１ｍｇ／ｍｌの凍結溶液として得た。そのサンプルの中の１つにＴＷＥＥＮ（商標）２０（界面活性剤）を０．０１重量／体積％の量で添加することで、ＥＰＯ溶液の２サンプルを調製した。これらの溶液に入っているＥＰＯの安定性を４０℃で７４日間に渡って評価した。その結果を図１Ｄに示す。７４日目の可溶凝集物の総量は、界面活性剤無しの場合には４％より若干高くそして界面活性剤を用いた場合には約７．５％である。
【実施例５】
【００３１】
ＥＰＯのバルク溶液を濃度が約３．１ｍｇ／ｍｌの凍結溶液として得た。そのサンプルの中の２つに酢酸亜鉛および塩化カルシウム（金属錯体）のそれぞれを添加することで、ＥＰＯ溶液の３サンプルを調製した。これらの溶液に入っているＥＰＯの安定性を４０℃で７４日間に渡って評価した。その結果を図１Ｅに示す。７４日目の可溶凝集物の総量は、金属錯体無しの場合には約４％であり、酢酸亜鉛を用いた場合には約９．５％でありそして塩化カルシウムを用いた場合には約８％である。
【実施例６】
【００３２】
ＥＰＯのバルク溶液を濃度が約３．１ｍｇ／ｍｌの凍結溶液として得た。ＥＰＯ溶液の２サンプルを調製した。一方のサンプルにはアルギニン（アミノ酸）を入れる一方、もう一方のサンプルにはアルギニンを入れなかった。これらの溶液に入っているＥＰＯの安定性を４０℃で７４日間に渡って評価した。その結果を図１Ｆに示す。７４日目の可溶凝集物の総量は、アルギニン無しの場合には約４％でありそしてアルギニンを用いた場合には約５．３％である。
【実施例７】
【００３３】
ＥＰＯのバルク溶液を濃度が約３．１ｍｇ／ｍｌの凍結溶液として得た。ＥＰＯ溶液の４サンプルを調製した。スクロースをサンプルに添加することでスクロースとＥＰＯの比率がそれぞれ０：１、２．５：１、５：１および１０：１の最終的溶液を生じさせた。そのスクロース溶液に入っているＥＰＯの安定性を４０℃で７４日間に渡って評価した。その結果を図１Ｇに示す。７４日目の可溶凝集物の総量は、スクロース：ＥＰＯの比率が０：１の場合には約４．２％であり、スクロース：エリスロポエチンの比率が２．５：１の場合には約２．７％であり、スクロース：ＥＰＯの比率が５：１の場合には約２．６％でありそしてスクロース：ＥＰＯの比率が１０：１の場合には約２．２％である。この結果から可溶凝集物の総量はＥＰＯに対するスクロースの比率を高くするにつれて減少することが分かる。
【００３４】
本発明の態様に従う粒子製剤の安定性を評価する検定を実施した。粒子製剤の調製を凍結乾燥または噴霧乾燥で実施した。これらの粒子製剤の安定性をＳＥＣで評価した。その安定性をＥＰＯ充填率および可溶凝集物総量に換算して評価した。ＥＰＯ充填率は凍結乾燥もしくは噴霧乾燥製剤に入っている可溶ＥＰＯ全体（単量体、二量体および他の高分子量生成物を包含）のパーセントである。ＥＰＯ充填率は、不溶な蛋白質が貯蔵中に有意な量で生じたか否かに関する情報をいくらか与えるものである。可溶凝集物総量は、単量体より大きくかつ水に溶解するＥＰＯ関連化合物のパーセントである。
【００３５】
この検定では、ＥＰＯのバルク溶液を濃度が約３．１ｍｇ／ｍｌの凍結溶液として得た。そのＥＰＯ溶液の異なるサンプルに緩衝溶液を用いた透析を受けさせた。その透析を受けさせたＥＰＯ溶液に安定剤および場合により界面活性剤を添加することで、最終的なエリスロポエチンと安定剤と界面活性剤の比率を所望の比率にした。その溶液に凍結乾燥を以下の表１に示す凍結乾燥サイクルに従って受けさせた。
【００３６】
【表２】
【００３７】
以下の実施例は説明の目的で示すものであり、本明細書で特に明記しない限り、本発明の限定として解釈されるべきではない。
【実施例８】
【００３８】
クエン酸塩を緩衝剤として用い、スクロースを安定剤として用いかつＴＷＥＥＮ（商標）２０を界面活性剤として用いて１０種類の凍結乾燥製剤をこの上に記述した如く調製した。以下の表２に凍結乾燥製剤を示す。
【００３９】
【表３】
【００４０】
表２に示した凍結乾燥製剤の貯蔵を４０℃で４週間および３７℃で３カ月間実施した。以下の表３に、初期、４０℃で８日目および４週目および３７℃で３カ月目のＥＰＯ充填率を示す。また、これらの安定性を示した時点のＥＰＯ充填率を図２にも示す。この結果から前記製剤を４０℃で４週間および３７℃で３カ月間貯蔵した時にＥＰＯ充填率が低下する傾向が全くないことが分かり、このことは、不溶な蛋白質が有意な量で生じることはないことを示している。
【００４１】
【表４】
【００４２】
以下の表４に、初期、４０℃で８日目および４週目および３７℃で３カ月目の可溶凝集物総量を示す。また、これらの安定性を示した時点の可溶凝集物総量を図３にも示す。４０℃で４週間貯蔵した時の可溶凝集物総量は、製剤Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨおよびＪの場合には０％であった。３７℃で３カ月間貯蔵した時の可溶凝集物総量は、製剤Ｃ、Ｄ、ＧおよびＨの場合には０．１％未満であった。
【００４３】
【表５】
【００４４】
スクロースとエリスロポエチンの比率およびＴＷＥＥＮ（商標）２０の濃度およびクエン酸塩の濃度が可溶凝集物総量に対して示す影響を統計学的分析ソフトウエアを用いて分析した。この分析の結果を図４に示す。この結果から凍結乾燥中および４０℃で貯蔵している間のＥＰＯ製剤はＥＰＯに対するスクロースの比率を高くすると安定になることが分かる。ＴＷＥＥＮ（商標）２０を添加すると凍結乾燥中に製剤が起こす凝集の度合は低下するが、４０℃で貯蔵している時の安定性は改善されない。クエン酸塩の濃度が凍結乾燥中のＥＰＯの安定性に対して示す影響はほとんどない。しかしながら、クエン酸塩の濃度を低くすると４０℃で貯蔵している時の安定性がより良好になることが分かる。
【実施例９】
【００４５】
ヒスチジンを緩衝剤として用い、スクロースを安定剤として用いかつＴＷＥＥＮ（商標）２０を界面活性剤として用いて６種類の凍結乾燥製剤をこの上に記述した如く調製した。以下の表５に凍結乾燥製剤を示す。
【００４６】
【表６】
【００４７】
前記凍結乾燥製剤の貯蔵を４０℃で４週間および３７℃で３カ月間実施した。以下の表６に、初期、４０℃で８日目および４週目および３７℃で３カ月目のＥＰＯ充填率を示す。また、これらの安定性を示した時点のＥＰＯ充填率を図５にも示す。この結果から前記製剤を４０℃で４週間および３７℃で３カ月間貯蔵した時にＥＰＯ充填率が低下する傾向が全くないことが分かる。
【００４８】
【表７】
【００４９】
以下の表７に、初期、４０℃で８日目および４週目および３７℃で３カ月目の可溶凝集物総量を示す。また、これらの安定性を示した時点の可溶凝集物総量を図６にも示す。これらのヒスチジン製剤を４０℃で４週間貯蔵した時および３７℃で３カ月間貯蔵した時の可溶凝集物総量は、それらの全部で０．２％未満である。製剤ＬおよびＯを４０℃で４週間貯蔵した時および３７℃で３カ月間貯蔵した時にそれらが示した可溶凝集物総量は０％である。
【００５０】
【表８】
【実施例１０】
【００５１】
ＥＰＯのバルク溶液を濃度が約３．１ｍｇ／ｍｌの凍結溶液として得た。そのＥＰＯ溶液に１０ｍＭのヒスチジン緩衝液を用いた透析を受けさせた。その透析を受けさせたＥＰＯ溶液にスクロース（安定剤）およびＴＷＥＥＮ（商標）２０（界面活性剤）を添加することでＥＰＯとスクロースと界面活性剤の比率を所望の比率にした。その緩衝剤を添加した溶液に噴霧乾燥を受けさせることでＥＰＯ：スクロース：ＴＷＥＥＮ（商標）２０：１０ｍＭのヒスチジンの比率が１：４．５３：０．０３：０．５０に相当し、ｐＨが６．９でありそしてＥＰＯ充填率が１６．５％の固体状粒子を得た。その噴霧乾燥を受けさせたＥＰＯ製剤を４０℃で３カ月間貯蔵した。これらのサンプルにＳＥＣを用いた分析を初期、１カ月、２カ月および３カ月目のそれぞれで受けさせた。初期時点のＥＰＯ粉末が示した平均粒径は約４．５μｍであり、ガラス転移温度は５４．９±５．６℃でありかつ水分含有量は１．１６±０．０１％であった。以下の表８に安定性の結果を示す。この結果から前記ＥＰＯ粉末はこれを４０℃で３カ月間貯蔵した時に凝集に対抗する安定化を受けていることが分かる。
【００５２】
【表９】
【００５３】
本発明を限られた数の態様に関して記述してきたが、本開示の利点を習得した本分野の技術者は、本明細書に開示した如き本発明の範囲から逸脱することのない他の態様を考案することができることを理解するであろう。従って、本発明の範囲が限定されるのは添付請求項によってのみである。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１Ａ】図１Ａに、ＥＰＯが溶液中で示す安定性に対するｐＨの影響を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂに、ＥＰＯが溶液中で示す安定性に対する緩衝剤の種類の影響を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃに、ＥＰＯが溶液中で示す安定性に対するＮａＣｌの影響を示す。
【図１Ｄ】図１Ｄに、ＥＰＯが溶液中で示す安定性に対する界面活性剤の影響を示す。
【図１Ｅ】図１Ａに、ＥＰＯが溶液中で示す安定性に対する金属錯体の影響を示す。
【図１Ｆ】図１Ｆに、ＥＰＯが溶液中で示す安定性に対するアルギニンの影響を示す。
【図１Ｇ】図１Ｇに、ＥＰＯが溶液中で示す安定性に対するスクロースの影響を示す。
【図２】図２に、本発明の態様に従うクエン酸塩緩衝製剤凍結乾燥品が初期、４０℃で８日目および４週目および３７℃で３カ月目に示したＥＰＯ充填率を示す。
【図３】図３に、本発明の態様に従うクエン酸塩緩衝製剤凍結乾燥品が初期、４０℃で８日目および４週目および３７℃で３カ月目に示した可溶凝集物総量を示す。
【図４】図４に、本発明の態様に従うクエン酸塩緩衝製剤凍結乾燥品が示す可溶凝集物総量に対するスクロースとＥＰＯの比率、界面活性剤濃度および緩衝剤濃度の影響を示す。
【図５】図５に、本発明の態様に従うヒスチジン緩衝製剤凍結乾燥品が初期、４０℃で８日目および４週目および３７℃で３カ月目に示したＥＰＯ充填率を示す。
【図６】図６に、本発明の態様に従うヒスチジン緩衝製剤凍結乾燥品が初期、４０℃で８日目および４週目および３７℃で３カ月目に示した可溶凝集物総量を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エリスロポエチン受容体作動薬、
緩衝剤、および
糖
を含んで成り、かつ、前記緩衝剤および糖が凝集に対して前記エリスロポエチン受容体作動薬を安定にしている、粒子製剤。
【請求項２】
４０℃で少なくとも１カ月に渡って安定である請求項１記載の粒子製剤。
【請求項３】
３７℃で少なくとも３カ月に渡って安定である請求項１記載の粒子製剤。
【請求項４】
凍結乾燥または噴霧乾燥品である請求項１記載の粒子製剤。
【請求項５】
エリスロポエチン受容体作動薬が０．１から９９．９重量％の範囲の量で存在する請求項１記載の粒子製剤。
【請求項６】
エリスロポエチン受容体作動薬が０．１から３０重量％の範囲の量で存在する請求項１記載の粒子製剤。
【請求項７】
エリスロポエチン受容体作動薬がエリスロポエチンである請求項１記載の粒子製剤。
【請求項８】
糖がスクロースでありそして緩衝剤がクエン酸塩またはヒスチジンである請求項１記載の粒子製剤。
【請求項９】
糖がスクロースであり、緩衝剤がクエン酸塩でありそして前記エリスロポエチン受容体作動薬に対する糖の重量比が２．０より大きい請求項１記載の粒子製剤。
【請求項１０】
緩衝剤が５．０から８．０の範囲内のｐＨ値を有する請求項１記載の粒子製剤。
【請求項１１】
緩衝剤が５．５から７．５の範囲内のｐＨ値を有する請求項１記載の粒子製剤。
【請求項１２】
緩衝剤が０．１から９９．８重量％の範囲の量で存在する請求項１記載の粒子製剤。
【請求項１３】
更に界面活性剤も１０重量％以下の量で含んで成る請求項１記載の粒子製剤。
【請求項１４】
更に界面活性剤、充填剤および塩から成る群から選択される１種以上の成分も含んで成る請求項１記載の粒子製剤。
【請求項１５】
更にアミノ酸、ポリオールおよび重合体から成る群から選択される安定化用成分も含んで成る請求項１記載の粒子製剤。
【請求項１６】
３７℃で３カ月の間に生じる可溶性凝集物の総量が３％未満である請求項１記載の粒子製剤。
【請求項１７】
４０℃で３カ月の間に生じる二量体の量が３％未満である請求項１記載の粒子製剤。
【請求項１８】
エリスロポエチン受容体作動薬、
クエン酸塩およびヒスチジンから成る群から選択される緩衝剤、および
糖、
を含んで成り、かつ、４０℃で１カ月の間に生じる可溶性凝集物の総量が３％未満である粒子製剤。
【請求項１９】
糖がスクロースである請求項１８記載の粒子製剤。
【請求項２０】
更に界面活性剤も１０重量％以下の量で含んで成る請求項１８記載の粒子製剤。
【請求項１】
エリスロポエチン受容体作動薬、
緩衝剤、および
糖
を含んで成り、かつ、前記緩衝剤および糖が凝集に対して前記エリスロポエチン受容体作動薬を安定にしている、粒子製剤。
【請求項２】
４０℃で少なくとも１カ月に渡って安定である請求項１記載の粒子製剤。
【請求項３】
３７℃で少なくとも３カ月に渡って安定である請求項１記載の粒子製剤。
【請求項４】
凍結乾燥または噴霧乾燥品である請求項１記載の粒子製剤。
【請求項５】
エリスロポエチン受容体作動薬が０．１から９９．９重量％の範囲の量で存在する請求項１記載の粒子製剤。
【請求項６】
エリスロポエチン受容体作動薬が０．１から３０重量％の範囲の量で存在する請求項１記載の粒子製剤。
【請求項７】
エリスロポエチン受容体作動薬がエリスロポエチンである請求項１記載の粒子製剤。
【請求項８】
糖がスクロースでありそして緩衝剤がクエン酸塩またはヒスチジンである請求項１記載の粒子製剤。
【請求項９】
糖がスクロースであり、緩衝剤がクエン酸塩でありそして前記エリスロポエチン受容体作動薬に対する糖の重量比が２．０より大きい請求項１記載の粒子製剤。
【請求項１０】
緩衝剤が５．０から８．０の範囲内のｐＨ値を有する請求項１記載の粒子製剤。
【請求項１１】
緩衝剤が５．５から７．５の範囲内のｐＨ値を有する請求項１記載の粒子製剤。
【請求項１２】
緩衝剤が０．１から９９．８重量％の範囲の量で存在する請求項１記載の粒子製剤。
【請求項１３】
更に界面活性剤も１０重量％以下の量で含んで成る請求項１記載の粒子製剤。
【請求項１４】
更に界面活性剤、充填剤および塩から成る群から選択される１種以上の成分も含んで成る請求項１記載の粒子製剤。
【請求項１５】
更にアミノ酸、ポリオールおよび重合体から成る群から選択される安定化用成分も含んで成る請求項１記載の粒子製剤。
【請求項１６】
３７℃で３カ月の間に生じる可溶性凝集物の総量が３％未満である請求項１記載の粒子製剤。
【請求項１７】
４０℃で３カ月の間に生じる二量体の量が３％未満である請求項１記載の粒子製剤。
【請求項１８】
エリスロポエチン受容体作動薬、
クエン酸塩およびヒスチジンから成る群から選択される緩衝剤、および
糖、
を含んで成り、かつ、４０℃で１カ月の間に生じる可溶性凝集物の総量が３％未満である粒子製剤。
【請求項１９】
糖がスクロースである請求項１８記載の粒子製剤。
【請求項２０】
更に界面活性剤も１０重量％以下の量で含んで成る請求項１８記載の粒子製剤。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図１Ｇ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図１Ｇ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００８−５０９１６１（Ｐ２００８−５０９１６１Ａ）
【公表日】平成２０年３月２７日（２００８．３．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２５０４５（Ｐ２００７−５２５０４５）
【出願日】平成１７年８月４日（２００５．８．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２７９６６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０１７７７３
【国際公開日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【出願人】（５０３０７３７８７）アルザ・コーポレーシヨン (113)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年３月２７日（２００８．３．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年８月４日（２００５．８．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２７９６６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０１７７７３
【国際公開日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【出願人】（５０３０７３７８７）アルザ・コーポレーシヨン (113)
【Ｆターム（参考）】
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