エンテロウイルスの血清型同定法
【課題】 エンテロウイルスの迅速かつ簡易な血清型同定法を提供する。
【解決手段】 エンテロウイルスのＶＰ４全領域の塩基配列に基づいて分子系統解析を行い、エンテロウイルスの血清型を同定する。特に、試料からＲＮＡを調製し、調製されたＲＮＡからｃＤＮＡを得、得られたｃＤＮＡからＰＣＲによってＶＰ４領域の塩基配列を含む塩基配列を増幅し、増幅された産物を用いて塩基配列解析を行うことにより、前記ＶＰ４全領域の塩基配列を得ることによって、試料中のエンテロウイルスの血清型を迅速かつ簡易に同定することができる。
【解決手段】 エンテロウイルスのＶＰ４全領域の塩基配列に基づいて分子系統解析を行い、エンテロウイルスの血清型を同定する。特に、試料からＲＮＡを調製し、調製されたＲＮＡからｃＤＮＡを得、得られたｃＤＮＡからＰＣＲによってＶＰ４領域の塩基配列を含む塩基配列を増幅し、増幅された産物を用いて塩基配列解析を行うことにより、前記ＶＰ４全領域の塩基配列を得ることによって、試料中のエンテロウイルスの血清型を迅速かつ簡易に同定することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンテロウイルスの血清型同定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エンテロウイルスは、"intestine"を意味するギリシャ語である"enteron"にその命名が由来するように、主として腸管系細胞に感染し、小児麻痺、無菌性髄膜炎、ヘルパンギーナ、上気道炎、手足口病、下痢症、発疹症、心筋炎、肺炎や気管支炎など多彩な臨床症状を引き起こす原因ウイルスである。エンテロウイルスは酸に耐性であるため容易に胃を通過してその増殖の場である腸管部(lower intestinal tract)に到達することができる。また、肝炎の病因であったり(CAV4, CAV9)、EV70やCAV24変異株のように急性出血性結膜炎の世界的大流行を引き起こしたりすることもある。一つのウイルス属がこれほどの多くの異なった臨床症状を引き起こす例は他にない。従って、このウイルスは、ウイルス検査機関で分離されることが最も多いウイルスの一つで、国内での分離報告は毎年およそ4000〜6000件にのぼる。
【０００３】
エンテロウイルスは、ピコルナウイルス科(family Picornaviridae)エンテロウイルス属(genus Enterovirus)に含まれるプラス一本鎖ＲＮＡをゲノムに持つ小形球形ウイルスである。ヒトでは、ポリオウイルス１〜３型、コクサッキーウイルスA1〜A22およびA24、コクサッキーウイルスB1〜B6、エコーウイルス1〜9、11〜27および29〜34、エンテロウイルス68〜71の６８種の血清型に分類されている。コクサッキーウイルスA23はエコーウイルス9、エコーウイルス10はレオウイルスタイプ１、エコーウイルス28はヒトライノウイルス1Aであることが後に判明し、これらは現在欠番になっている。臨床症状からこれらのウイルスの血清型を推定することは困難で、分離ウイルスの同定は型特異的免疫血清を用いた中和試験によって行われている。
【０００４】
エンテロウイルスは他の多くのＲＮＡウイルス同様、ウイルスの遺伝子自体がコードするＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって複製される。しかしながら、この酵素は校正(proofreading)機能を持たないためＲＮＡ合成の過程で生じた塩基変異は子孫ウイルスの遺伝子内に蓄積される。従って、アミノ酸変異を伴った塩基変異がウイルス構造蛋白質領域に生じた場合、いわゆる難中和性ウイルスが生じる可能性がある。これは、表現型(phenotype)を指標にした中和試験に常に付きまとう固有の問題点である。
【０００５】
一方、エンテロウイルスの分子生物学的見地からの分類が試みられているが（非特許文献１〜４）、血清型を同定するには十分なものとは言えず、特に、P. Muirらによれば、エンテロウイルスの遺伝型の系統樹による分類は血清型を反映しないとされている。
【非特許文献１】P. Muir et al., 1998, Clin. Microbiol. Rev., 11: 202-227
【非特許文献２】R.R. Rueckert, 1996, Fields Virolgy, 3rd. ed., Lippincott-Raven Publishers, 609-654
【非特許文献３】T. Poyry et al., 1996, J. Gen. Virol., 77: 1699-1717
【非特許文献４】T. Pulli et al., 1995, Virology, 212: 30-38
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記の様な問題点のないエンテロウイルスの迅速かつ簡易な血清型同定法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、日本の流行で分離が報告されているエンテロウイルスのＶＰ４全領域の塩基配列を解析したところ、この塩基配列の分子系統解析により血清型が同定できるという知見を得、この知見に基づき、本発明を完成するに至った。
【０００８】
かくして、本発明は、エンテロウイルスのＶＰ４領域の塩基配列に基づいて分子系統解析を行い、エンテロウイルスの血清型を同定することを特徴とするエンテロウイルスの血清型同定法（以下、本発明同定法ともいう）を提供する。
【０００９】
本発明同定法において、ＶＰ４領域の塩基配列は、試料からＲＮＡを調製し、調製されたＲＮＡからｃＤＮＡを得、得られたｃＤＮＡからＰＣＲによってＶＰ４領域の塩基配列を含む塩基配列を増幅し、増幅された産物を用いて塩基配列解析を行うことにより得ることができる。
【００１０】
ＰＣＲに使用されるプライマーとしては、配列番号１に示す塩基配列を有するプライマーおよび配列番号２に示す塩基配列を有するプライマーが挙げられる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によって、エンテロウイルスの血清型を、エンテロウイルスの分離培養を要することなく、塩基配列の分子系統解析により決定することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明同定法は、エンテロウイルスの血清型を同定するために、エンテロウイルスのＶＰ４領域の塩基配列に基づいて分子系統解析を行うことを特徴とする。
【００１３】
本明細書において、ＶＰ４領域とは、エンテロウイルスのキャプシドを形成するタンパク質の一つであるＶＰ４タンパク質（６９アミノ酸）をコードする領域（２０７ｂｐ）を意味する。また、ＶＰ４領域の塩基配列とは、ＶＰ４領域の全領域の塩基配列または血清型を反映するのに十分な長さ（通常、２０ｂｐ以上）を有するその一部を意味する。
【００１４】
ＶＰ４領域の塩基配列を得る方法は特に限定されないが、血清型の未同定のエンテロウイルスを含む試料からＶＰ４領域の塩基配列を得る場合には、以下の方法によることが好ましい。すなわち、試料からＲＮＡを調製し、調製されたＲＮＡからｃＤＮＡを得、得られたｃＤＮＡからＰＣＲによってＶＰ４領域の塩基配列を含む塩基配列を増幅し、増幅された産物を用いて塩基配列解析を行う方法である。
【００１５】
試料は、エンテロウイルスを含むかまたは含む可能性があるものであれば特に限定されないが、例としては、咽頭拭い液、髄液、水泡内容物などの臨床材料、または、これらの臨床材料より分離されたウイルス培養液などを挙げることができる。これらの試料からのＲＮＡの調製は公知の方法により行うことができる。また、ＲＮＡからのｃＤＮＡの調製方法も公知である。ＰＣＲは、このｃＤＮＡを鋳型とし、ＶＰ４領域の塩基配列を含む塩基配列を増幅できるように選択されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして、公知のＰＣＲの方法に従って行うことができる。また、ＲＮＡから逆転写(RT)-PCRにより同一反応系でｃＤＮＡの取得及びＤＮＡの増幅を行うこともできる。
【００１６】
増幅産物の取得は、アガロースゲル電気泳動で分離し、ゲルから切り出して抽出精製するなどの公知の方法で行うことができる。通常には、エンテロウイルスの既知の塩基配列と、用いたプライマーの塩基配列とから予測できる長さの増幅産物を取得する。
【００１７】
ＶＰ４領域の全領域を含む塩基配列を増幅できるように選択されたオリゴヌクレオチドの例としては、配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に
示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００１８】
ＰＣＲによる増幅は２段階で行ってもよく、例えば、配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて第１回目のＰＣＲを行った後、配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて第２回目のＰＣＲを行ってもよい。２段階の増幅を行うことによって、一層特異的に目的の塩基配列を増幅することが可能になる。
【００１９】
増幅産物の塩基配列の決定は公知の方法によって行うことができる。決定された塩基配列の内、ＶＰ４領域の塩基配列を系統解析に用いる。
本発明同定法において、ＶＰ４領域の塩基配列に基づく系統解析は、公知の系統解析法によって行うことができる。このような方法としては、Higgins法、ならびに、２−パラメーター法を用いたUPGMA法およびN-J法などが挙げられ、また、これらの方法により系統解析を行うためのソフトウェアが市販されている（DNASIS(日立ソフトウェアエンジニアリング)、SINCA(富士通)など）。
【００２０】
血清型は、系統解析においてそれぞれの血清型の標準株と一定値以上のホモロジーを示す、または、一定値以上の確率で他の血清型のクラスターと区別されるか否かによって決定できる。一定値とは、系統解析により得られた系統樹において各血清型に属する株がそれぞれ単一のクラスターを形成するような値であればよい。
【００２１】
より具体的には、ホモロジーで８０％以上、ブーツストラップ法で他のクラスターから区別される確率が９０％以上という値があげられる。例えば、エンテロウイルス標準株４４血清型（６０株）の系統解析によると、血清型は８４％のホモロジーで区別され、分離株を加えたブーツストラップでは、１００％の確率で他の血清型と区別された。
【実施例】
【００２２】
次に、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、下記実施例は本発明について具体的な認識を得る一助としてのみ挙げたものであり、これによって本発明の範囲が何ら限定されるものではない。
【００２３】
［実施例１］ エンテロウイルスＶＰ４全領域の塩基配列解析
日本の流行で分離が報告されているエンテロウイルスのＶＰ４全領域の塩基配列解析をするために、ウイルスとして、以下の標準株、すなわち、コクサッキーA群ウイルス(CAV)として、CAV2、CAV3、CAV4、CAV5、CAV6、CAV7、CAV8およびCAV10の８株、コクサッキーB群ウイルス(CBV)として、CBV2およびCBV6の２株、ならびに、エコーウイルス(ECV)として、ECV1、ECV2、ECV3、ECV4、ECV5、ECV7、ECV13、ECV14、ECV17、ECV18、ECV19、ECV20、ECV24、ECV25およびECV30の１６株、総計２６の血清型株を用いた。
【００２４】
臨床検体として、咽頭拭い液、髄液、水泡内容物、および、これらの臨床材料より分離されたウイルス培養液を用いた。咽頭拭い液および水泡内容物はそれぞれ１．５ｍｌのＴＥ溶液(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 8.0))に懸濁し、−８０℃で保存して用いた。
【００２５】
それぞれの検体１００μｌからスマイテストＲキット（住友金属工業）を用いて、ＲＮＡを抽出し、乾固後のＲＮＡに、８μｌのRNaseフリーの蒸留水と、１μｌのリボヌクレアーゼインヒビター（40 U/μl）(Promega)と、１μｌの５０μＭ下流プライマー（OL68-1、5'GGTAA(C/T)TTCCACCACCA(A/G/C/T)CC3'、20mer(配列番号１)）とを加え溶解させた。１００℃で１分間加熱後、氷中にて急冷した。これに、１０×Taq緩衝液（100 M Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2, 0.01%(w/v) gelatin）２μｌ、10 mM dNTPs２μｌ
、Ｍ−ＭＬＶ由来の逆転写酵素(200 U/μl)(BRL)１μｌ、および、RNaseフリーの蒸留水４μｌを加え、３７℃、６０分間の反応条件でｃＤＮＡを合成した。
【００２６】
ウイルスのＶＰ４全領域の塩基配列を増幅するため、エンテロウイルスに共通な配列のある5'非翻訳領域およびVP2領域に設定したプライマーを用いてＰＣＲを行った。第１回(1st)ＰＣＲは、上記で得られた反応液５μｌに、１０×Taq緩衝液４．５μｌ、４０μＭ上流プライマー（EVP2、5'CCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAAT3'、25mer(配列番号２)）０．５μｌ、蒸留水３９．７５μｌおよびAmpli Taq DNAポリメラーゼ(5U/μl)(Roche Diagnostic
Systems)０．２５μｌを加え、ミネラルオイルを重層し、GeneAmp PCR System 9600(PERKIN ELMER)を用いて、９５℃３０秒で変性、５５℃３０秒でアニーリングおよび７２℃１分間で伸長のサイクルを４０サイクルの条件で行った。第２回(2nd)ＰＣＲは、1st ＰＣＲで得られた反応液５μｌに１０×Taq緩衝液４．５μｌ、１０ｍＭｄＮＴＰｓ１μｌ、５０μＭ上流プライマー(EVP4、5'CTACTTTGGGTGTCCGTGTT3'、20mer(配列番号３))０．５μｌ、５０μＭ下流プライマー(OL68-1)０．５μｌ、蒸留水３８．２５μｌおよびAmpli Taq DNAポリメラーゼ(5U/μl)０．２５μｌを加え、1st ＰＣＲと同じ条件で行った。ＰＣＲ産物は、３％アガロースゲル電気泳動で分離し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線で検出した。
【００２７】
この条件でのＰＣＲでは、1st ＰＣＲで約７５０ｂｐ、2nd ＰＣＲで約６５０ｂｐ（5'非翻訳領域の一部、ＶＰ４全領域およびＶＰ２領域のＮ末端側約１／３を含む）が増幅される。今回用いた全ての標準株および分離ウイルス株において増幅が確認できた。
【００２８】
また、咽頭拭い液の臨床検体からは、上記の増幅の他に、2nd ＰＣＲで約６２０ｂｐの増幅も認められた。これは、エンテロウイルスと同じピコルナウイルス科に属するライノウイルスと考えられ、今回用いたプライマー配列を有するが、5'非翻訳領域に一部塩基配列の欠失を持つため、その増幅産物の長さからエンテロウイルスとは容易に区別ができた。
【００２９】
このようにして得られた、ＶＰ４全領域を含むＰＣＲ産物の塩基配列を解析した。ＰＣＲ産物は、QIAquick PCR purificationキット(QIAGEN)を用いて、未反応のプライマーとｄＮＴＰｓを除去し、ＤＮＡ濃度が５ｎｇ／μｌ以上になるように蒸留水に溶解した。塩基配列解析用に、ＶＰ４領域上流のエンテロウイルスに共通の塩基配列に基づいて、プライマー(SEVP1、5'TGGCTGCTTATGGTGACAAT3'、20mer(配列番号４))を設計した。塩基配列の解析は、ダイデオキシターミネーターサイクルシークエンスキット(PERKIN ELMER)を用いて、９５℃１０秒、５０℃５秒および６０℃４分のサイクルで２５サイクル反応を行い、373A DNAオートシーケンサー(PERKIN ELMER)で塩基配列を決定した。
【００３０】
塩基配列を決定した結果、エンテロウイルスの標準株、分離ウイルス株、臨床検体のいずれの株についても、塩基配列に挿入や欠失は認められず、ＶＰ４領域は２０７ｂｐの長さで一様であった。
【００３１】
CAV2-8、CAV10、CBV2、CBV6、ECV1-5、ECV7、ECV13、ECV14、ECV17-21、ECV24、ECV25およびECV30（２６血清型）が、今回初めてＶＰ４全領域の塩基配列を解析したウイルス標準株であり、CAV9、CAV16、CAV21、CAV24、CBV1、CBV3-5、ECV6、ECV9、ECV11、ECV12、ECV16、EV70、EV71、PV1-3（１８血清型３５株）がGenBankに登録されている標準株である。これら４４血清型のエンテロウイルス標準株のＶＰ４領域は、６６〜８４％のホモロジーを有し、８０％のホモロジーで血清型が区別できた。
【００３２】
上記の条件のRT-PCRによれば、0.1TCID50の検出感度で、咽頭拭い液、髄液などの臨床材料からウイルスゲノムを直接増幅することが可能である。従って、分離培養することな
く、エンテロウイルスの血清型の迅速同定が可能になる。
【００３３】
［実施例２］ 系統解析による臨床分離株の血清型同定
実施例１で新たに塩基配列を解析した標準株２６株、ならびに、GenBankに登録されているCAV9、CAV16、CAV21、CAV24、CBV1、CBV3、CBV4、CBV5、ECV6、ECV9、ECV11、ECV12、ECV16、EV70、EV71およびPV1-3（１８血清型３５株）のＶＰ４領域の塩基配列を選出した。系統樹は、Higgins法(DNASIS、日立ソフトウェアエンジニアリング)、ならびに、２−パラメーター法を用いたUPGMA法およびN-J法(SINCA、富士通)の両ソフトウェアにより作成し、作成された系統樹の確かさは、ブーツストラップ法(SINCA)を用いて統計的評価を行った。
【００３４】
臨床分離株の塩基配列を標準株と共に系統解析を行って得られた系統樹の枝分かれとブーツストラップ解析とより血清型同定を行った。
先ず、標準株のＶＰ４領域の全領域の塩基配列による系統樹を作成した結果、エンテロウイルスの遺伝子型は約６０％のホモロジーで５群に分かれた。すなわち、CAV2-8、CAV10の第１群、CAV16、EV71の第２群、CBV1-6、CAV9、エコーウイルス(ECV)の第３群、ポリオウイルス(PV)、CAV21、CAV24の第４群およびEV70の第５群の各群である。これは、UPGMA法およびN-J法のいずれも同様な結果となり、ピコルナウイルス科内のゲノムにおける系統樹と矛盾を生じず、さらにPeter Muirらが示したVP4-VP2のアミノ酸配列の系統樹によるグループ分けとよく似ていた。
【００３５】
次に、同様に手足口病の臨床分離株３６株の系統解析を行ったところ、血清型の同定されたCAV16およびEV71は、それぞれの血清型の標準株と８０％以上のホモロジーを示し、ブーツストラップ法において１００％の確率で、交差することなくそれぞれCAV16およびEV71の単一の血清型のクラスターを形成した。さらに、血清型が未同定な株についても単一のクラスターを形成していた。
【００３６】
また、同様にECV30の分離株１４株について系統解析を行うと、ECV30の標準株と８０％以上のホモロジーを示し、ブーツストラップ法で１００％の確率で交差することなく単一のクラスターを形成していた。
【００３７】
さらに、コクサッキーウイルスＡ２４変異株(CAV24v)の各分離株についても、同様に系統解析を行うと、標準株と単一のクラスター（８５％以上のホモロジー）を形成したうえに、ブーツストラップ法で１００％の確率で交差することなく単一のクラスターを形成し、他の血清型のエンテロウイルスと容易に鑑別された。急性出血性結膜炎(AHC)の原因ウイルスとして、CAV24vとEV70の二つのウイルスが知られており、従って、AHCの原因ウイルスを分離培養することなく、迅速に同定できることが確認された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンテロウイルスの血清型同定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エンテロウイルスは、"intestine"を意味するギリシャ語である"enteron"にその命名が由来するように、主として腸管系細胞に感染し、小児麻痺、無菌性髄膜炎、ヘルパンギーナ、上気道炎、手足口病、下痢症、発疹症、心筋炎、肺炎や気管支炎など多彩な臨床症状を引き起こす原因ウイルスである。エンテロウイルスは酸に耐性であるため容易に胃を通過してその増殖の場である腸管部(lower intestinal tract)に到達することができる。また、肝炎の病因であったり(CAV4, CAV9)、EV70やCAV24変異株のように急性出血性結膜炎の世界的大流行を引き起こしたりすることもある。一つのウイルス属がこれほどの多くの異なった臨床症状を引き起こす例は他にない。従って、このウイルスは、ウイルス検査機関で分離されることが最も多いウイルスの一つで、国内での分離報告は毎年およそ4000〜6000件にのぼる。
【０００３】
エンテロウイルスは、ピコルナウイルス科(family Picornaviridae)エンテロウイルス属(genus Enterovirus)に含まれるプラス一本鎖ＲＮＡをゲノムに持つ小形球形ウイルスである。ヒトでは、ポリオウイルス１〜３型、コクサッキーウイルスA1〜A22およびA24、コクサッキーウイルスB1〜B6、エコーウイルス1〜9、11〜27および29〜34、エンテロウイルス68〜71の６８種の血清型に分類されている。コクサッキーウイルスA23はエコーウイルス9、エコーウイルス10はレオウイルスタイプ１、エコーウイルス28はヒトライノウイルス1Aであることが後に判明し、これらは現在欠番になっている。臨床症状からこれらのウイルスの血清型を推定することは困難で、分離ウイルスの同定は型特異的免疫血清を用いた中和試験によって行われている。
【０００４】
エンテロウイルスは他の多くのＲＮＡウイルス同様、ウイルスの遺伝子自体がコードするＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって複製される。しかしながら、この酵素は校正(proofreading)機能を持たないためＲＮＡ合成の過程で生じた塩基変異は子孫ウイルスの遺伝子内に蓄積される。従って、アミノ酸変異を伴った塩基変異がウイルス構造蛋白質領域に生じた場合、いわゆる難中和性ウイルスが生じる可能性がある。これは、表現型(phenotype)を指標にした中和試験に常に付きまとう固有の問題点である。
【０００５】
一方、エンテロウイルスの分子生物学的見地からの分類が試みられているが（非特許文献１〜４）、血清型を同定するには十分なものとは言えず、特に、P. Muirらによれば、エンテロウイルスの遺伝型の系統樹による分類は血清型を反映しないとされている。
【非特許文献１】P. Muir et al., 1998, Clin. Microbiol. Rev., 11: 202-227
【非特許文献２】R.R. Rueckert, 1996, Fields Virolgy, 3rd. ed., Lippincott-Raven Publishers, 609-654
【非特許文献３】T. Poyry et al., 1996, J. Gen. Virol., 77: 1699-1717
【非特許文献４】T. Pulli et al., 1995, Virology, 212: 30-38
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記の様な問題点のないエンテロウイルスの迅速かつ簡易な血清型同定法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、日本の流行で分離が報告されているエンテロウイルスのＶＰ４全領域の塩基配列を解析したところ、この塩基配列の分子系統解析により血清型が同定できるという知見を得、この知見に基づき、本発明を完成するに至った。
【０００８】
かくして、本発明は、エンテロウイルスのＶＰ４領域の塩基配列に基づいて分子系統解析を行い、エンテロウイルスの血清型を同定することを特徴とするエンテロウイルスの血清型同定法（以下、本発明同定法ともいう）を提供する。
【０００９】
本発明同定法において、ＶＰ４領域の塩基配列は、試料からＲＮＡを調製し、調製されたＲＮＡからｃＤＮＡを得、得られたｃＤＮＡからＰＣＲによってＶＰ４領域の塩基配列を含む塩基配列を増幅し、増幅された産物を用いて塩基配列解析を行うことにより得ることができる。
【００１０】
ＰＣＲに使用されるプライマーとしては、配列番号１に示す塩基配列を有するプライマーおよび配列番号２に示す塩基配列を有するプライマーが挙げられる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によって、エンテロウイルスの血清型を、エンテロウイルスの分離培養を要することなく、塩基配列の分子系統解析により決定することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明同定法は、エンテロウイルスの血清型を同定するために、エンテロウイルスのＶＰ４領域の塩基配列に基づいて分子系統解析を行うことを特徴とする。
【００１３】
本明細書において、ＶＰ４領域とは、エンテロウイルスのキャプシドを形成するタンパク質の一つであるＶＰ４タンパク質（６９アミノ酸）をコードする領域（２０７ｂｐ）を意味する。また、ＶＰ４領域の塩基配列とは、ＶＰ４領域の全領域の塩基配列または血清型を反映するのに十分な長さ（通常、２０ｂｐ以上）を有するその一部を意味する。
【００１４】
ＶＰ４領域の塩基配列を得る方法は特に限定されないが、血清型の未同定のエンテロウイルスを含む試料からＶＰ４領域の塩基配列を得る場合には、以下の方法によることが好ましい。すなわち、試料からＲＮＡを調製し、調製されたＲＮＡからｃＤＮＡを得、得られたｃＤＮＡからＰＣＲによってＶＰ４領域の塩基配列を含む塩基配列を増幅し、増幅された産物を用いて塩基配列解析を行う方法である。
【００１５】
試料は、エンテロウイルスを含むかまたは含む可能性があるものであれば特に限定されないが、例としては、咽頭拭い液、髄液、水泡内容物などの臨床材料、または、これらの臨床材料より分離されたウイルス培養液などを挙げることができる。これらの試料からのＲＮＡの調製は公知の方法により行うことができる。また、ＲＮＡからのｃＤＮＡの調製方法も公知である。ＰＣＲは、このｃＤＮＡを鋳型とし、ＶＰ４領域の塩基配列を含む塩基配列を増幅できるように選択されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして、公知のＰＣＲの方法に従って行うことができる。また、ＲＮＡから逆転写(RT)-PCRにより同一反応系でｃＤＮＡの取得及びＤＮＡの増幅を行うこともできる。
【００１６】
増幅産物の取得は、アガロースゲル電気泳動で分離し、ゲルから切り出して抽出精製するなどの公知の方法で行うことができる。通常には、エンテロウイルスの既知の塩基配列と、用いたプライマーの塩基配列とから予測できる長さの増幅産物を取得する。
【００１７】
ＶＰ４領域の全領域を含む塩基配列を増幅できるように選択されたオリゴヌクレオチドの例としては、配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に
示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００１８】
ＰＣＲによる増幅は２段階で行ってもよく、例えば、配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて第１回目のＰＣＲを行った後、配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて第２回目のＰＣＲを行ってもよい。２段階の増幅を行うことによって、一層特異的に目的の塩基配列を増幅することが可能になる。
【００１９】
増幅産物の塩基配列の決定は公知の方法によって行うことができる。決定された塩基配列の内、ＶＰ４領域の塩基配列を系統解析に用いる。
本発明同定法において、ＶＰ４領域の塩基配列に基づく系統解析は、公知の系統解析法によって行うことができる。このような方法としては、Higgins法、ならびに、２−パラメーター法を用いたUPGMA法およびN-J法などが挙げられ、また、これらの方法により系統解析を行うためのソフトウェアが市販されている（DNASIS(日立ソフトウェアエンジニアリング)、SINCA(富士通)など）。
【００２０】
血清型は、系統解析においてそれぞれの血清型の標準株と一定値以上のホモロジーを示す、または、一定値以上の確率で他の血清型のクラスターと区別されるか否かによって決定できる。一定値とは、系統解析により得られた系統樹において各血清型に属する株がそれぞれ単一のクラスターを形成するような値であればよい。
【００２１】
より具体的には、ホモロジーで８０％以上、ブーツストラップ法で他のクラスターから区別される確率が９０％以上という値があげられる。例えば、エンテロウイルス標準株４４血清型（６０株）の系統解析によると、血清型は８４％のホモロジーで区別され、分離株を加えたブーツストラップでは、１００％の確率で他の血清型と区別された。
【実施例】
【００２２】
次に、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、下記実施例は本発明について具体的な認識を得る一助としてのみ挙げたものであり、これによって本発明の範囲が何ら限定されるものではない。
【００２３】
［実施例１］ エンテロウイルスＶＰ４全領域の塩基配列解析
日本の流行で分離が報告されているエンテロウイルスのＶＰ４全領域の塩基配列解析をするために、ウイルスとして、以下の標準株、すなわち、コクサッキーA群ウイルス(CAV)として、CAV2、CAV3、CAV4、CAV5、CAV6、CAV7、CAV8およびCAV10の８株、コクサッキーB群ウイルス(CBV)として、CBV2およびCBV6の２株、ならびに、エコーウイルス(ECV)として、ECV1、ECV2、ECV3、ECV4、ECV5、ECV7、ECV13、ECV14、ECV17、ECV18、ECV19、ECV20、ECV24、ECV25およびECV30の１６株、総計２６の血清型株を用いた。
【００２４】
臨床検体として、咽頭拭い液、髄液、水泡内容物、および、これらの臨床材料より分離されたウイルス培養液を用いた。咽頭拭い液および水泡内容物はそれぞれ１．５ｍｌのＴＥ溶液(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 8.0))に懸濁し、−８０℃で保存して用いた。
【００２５】
それぞれの検体１００μｌからスマイテストＲキット（住友金属工業）を用いて、ＲＮＡを抽出し、乾固後のＲＮＡに、８μｌのRNaseフリーの蒸留水と、１μｌのリボヌクレアーゼインヒビター（40 U/μl）(Promega)と、１μｌの５０μＭ下流プライマー（OL68-1、5'GGTAA(C/T)TTCCACCACCA(A/G/C/T)CC3'、20mer(配列番号１)）とを加え溶解させた。１００℃で１分間加熱後、氷中にて急冷した。これに、１０×Taq緩衝液（100 M Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2, 0.01%(w/v) gelatin）２μｌ、10 mM dNTPs２μｌ
、Ｍ−ＭＬＶ由来の逆転写酵素(200 U/μl)(BRL)１μｌ、および、RNaseフリーの蒸留水４μｌを加え、３７℃、６０分間の反応条件でｃＤＮＡを合成した。
【００２６】
ウイルスのＶＰ４全領域の塩基配列を増幅するため、エンテロウイルスに共通な配列のある5'非翻訳領域およびVP2領域に設定したプライマーを用いてＰＣＲを行った。第１回(1st)ＰＣＲは、上記で得られた反応液５μｌに、１０×Taq緩衝液４．５μｌ、４０μＭ上流プライマー（EVP2、5'CCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAAT3'、25mer(配列番号２)）０．５μｌ、蒸留水３９．７５μｌおよびAmpli Taq DNAポリメラーゼ(5U/μl)(Roche Diagnostic
Systems)０．２５μｌを加え、ミネラルオイルを重層し、GeneAmp PCR System 9600(PERKIN ELMER)を用いて、９５℃３０秒で変性、５５℃３０秒でアニーリングおよび７２℃１分間で伸長のサイクルを４０サイクルの条件で行った。第２回(2nd)ＰＣＲは、1st ＰＣＲで得られた反応液５μｌに１０×Taq緩衝液４．５μｌ、１０ｍＭｄＮＴＰｓ１μｌ、５０μＭ上流プライマー(EVP4、5'CTACTTTGGGTGTCCGTGTT3'、20mer(配列番号３))０．５μｌ、５０μＭ下流プライマー(OL68-1)０．５μｌ、蒸留水３８．２５μｌおよびAmpli Taq DNAポリメラーゼ(5U/μl)０．２５μｌを加え、1st ＰＣＲと同じ条件で行った。ＰＣＲ産物は、３％アガロースゲル電気泳動で分離し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線で検出した。
【００２７】
この条件でのＰＣＲでは、1st ＰＣＲで約７５０ｂｐ、2nd ＰＣＲで約６５０ｂｐ（5'非翻訳領域の一部、ＶＰ４全領域およびＶＰ２領域のＮ末端側約１／３を含む）が増幅される。今回用いた全ての標準株および分離ウイルス株において増幅が確認できた。
【００２８】
また、咽頭拭い液の臨床検体からは、上記の増幅の他に、2nd ＰＣＲで約６２０ｂｐの増幅も認められた。これは、エンテロウイルスと同じピコルナウイルス科に属するライノウイルスと考えられ、今回用いたプライマー配列を有するが、5'非翻訳領域に一部塩基配列の欠失を持つため、その増幅産物の長さからエンテロウイルスとは容易に区別ができた。
【００２９】
このようにして得られた、ＶＰ４全領域を含むＰＣＲ産物の塩基配列を解析した。ＰＣＲ産物は、QIAquick PCR purificationキット(QIAGEN)を用いて、未反応のプライマーとｄＮＴＰｓを除去し、ＤＮＡ濃度が５ｎｇ／μｌ以上になるように蒸留水に溶解した。塩基配列解析用に、ＶＰ４領域上流のエンテロウイルスに共通の塩基配列に基づいて、プライマー(SEVP1、5'TGGCTGCTTATGGTGACAAT3'、20mer(配列番号４))を設計した。塩基配列の解析は、ダイデオキシターミネーターサイクルシークエンスキット(PERKIN ELMER)を用いて、９５℃１０秒、５０℃５秒および６０℃４分のサイクルで２５サイクル反応を行い、373A DNAオートシーケンサー(PERKIN ELMER)で塩基配列を決定した。
【００３０】
塩基配列を決定した結果、エンテロウイルスの標準株、分離ウイルス株、臨床検体のいずれの株についても、塩基配列に挿入や欠失は認められず、ＶＰ４領域は２０７ｂｐの長さで一様であった。
【００３１】
CAV2-8、CAV10、CBV2、CBV6、ECV1-5、ECV7、ECV13、ECV14、ECV17-21、ECV24、ECV25およびECV30（２６血清型）が、今回初めてＶＰ４全領域の塩基配列を解析したウイルス標準株であり、CAV9、CAV16、CAV21、CAV24、CBV1、CBV3-5、ECV6、ECV9、ECV11、ECV12、ECV16、EV70、EV71、PV1-3（１８血清型３５株）がGenBankに登録されている標準株である。これら４４血清型のエンテロウイルス標準株のＶＰ４領域は、６６〜８４％のホモロジーを有し、８０％のホモロジーで血清型が区別できた。
【００３２】
上記の条件のRT-PCRによれば、0.1TCID50の検出感度で、咽頭拭い液、髄液などの臨床材料からウイルスゲノムを直接増幅することが可能である。従って、分離培養することな
く、エンテロウイルスの血清型の迅速同定が可能になる。
【００３３】
［実施例２］ 系統解析による臨床分離株の血清型同定
実施例１で新たに塩基配列を解析した標準株２６株、ならびに、GenBankに登録されているCAV9、CAV16、CAV21、CAV24、CBV1、CBV3、CBV4、CBV5、ECV6、ECV9、ECV11、ECV12、ECV16、EV70、EV71およびPV1-3（１８血清型３５株）のＶＰ４領域の塩基配列を選出した。系統樹は、Higgins法(DNASIS、日立ソフトウェアエンジニアリング)、ならびに、２−パラメーター法を用いたUPGMA法およびN-J法(SINCA、富士通)の両ソフトウェアにより作成し、作成された系統樹の確かさは、ブーツストラップ法(SINCA)を用いて統計的評価を行った。
【００３４】
臨床分離株の塩基配列を標準株と共に系統解析を行って得られた系統樹の枝分かれとブーツストラップ解析とより血清型同定を行った。
先ず、標準株のＶＰ４領域の全領域の塩基配列による系統樹を作成した結果、エンテロウイルスの遺伝子型は約６０％のホモロジーで５群に分かれた。すなわち、CAV2-8、CAV10の第１群、CAV16、EV71の第２群、CBV1-6、CAV9、エコーウイルス(ECV)の第３群、ポリオウイルス(PV)、CAV21、CAV24の第４群およびEV70の第５群の各群である。これは、UPGMA法およびN-J法のいずれも同様な結果となり、ピコルナウイルス科内のゲノムにおける系統樹と矛盾を生じず、さらにPeter Muirらが示したVP4-VP2のアミノ酸配列の系統樹によるグループ分けとよく似ていた。
【００３５】
次に、同様に手足口病の臨床分離株３６株の系統解析を行ったところ、血清型の同定されたCAV16およびEV71は、それぞれの血清型の標準株と８０％以上のホモロジーを示し、ブーツストラップ法において１００％の確率で、交差することなくそれぞれCAV16およびEV71の単一の血清型のクラスターを形成した。さらに、血清型が未同定な株についても単一のクラスターを形成していた。
【００３６】
また、同様にECV30の分離株１４株について系統解析を行うと、ECV30の標準株と８０％以上のホモロジーを示し、ブーツストラップ法で１００％の確率で交差することなく単一のクラスターを形成していた。
【００３７】
さらに、コクサッキーウイルスＡ２４変異株(CAV24v)の各分離株についても、同様に系統解析を行うと、標準株と単一のクラスター（８５％以上のホモロジー）を形成したうえに、ブーツストラップ法で１００％の確率で交差することなく単一のクラスターを形成し、他の血清型のエンテロウイルスと容易に鑑別された。急性出血性結膜炎(AHC)の原因ウイルスとして、CAV24vとEV70の二つのウイルスが知られており、従って、AHCの原因ウイルスを分離培養することなく、迅速に同定できることが確認された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のエンテロウイルスのＶＰ４全領域の塩基配列を増幅し、増幅された産物の塩基配列を決定することにより前記ＶＰ４全領域の塩基配列を得、得られた塩基配列について血清型標準株の同領域の塩基配列に基づく分子系統解析を行い、試料中のエンテロウイルスの血清型を同定することを特徴とするエンテロウイルスの血清型同定法。
【請求項２】
試料中のエンテロウィルスがエンテロウィルスの標準株または分離株であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
塩基配列の増幅が、試料からＲＮＡを調製し、調製されたＲＮＡからｃＤＮＡを得、得られたｃＤＮＡを鋳型とし、ＶＰ４全領域の塩基配列を含む塩基配列が増幅できるように選択されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして行なわれることを特徴とする請求項１又は２に記載の血清型同定法。
【請求項４】
プライマーが、配列番号１に示す塩基配列を含むプライマーと配列番号２に示す塩基配列を含むことを特徴とする請求項３に記載の血清型同定法。
【請求項５】
標準株が、エンテロウイルス群に属する全ての標準株であることを特徴とする請求項１ないし３の何れか１項に記載の血清型同定法。
【請求項６】
血清型の同定法が、前記分子系統解析において、それぞれの血清型の標準株と８０％以上のホモロジーを示すか、または、ブーツストラップ法で単一のクラスター形成する値以上で単一のクラスターを形成することを指標として行われることを特徴とする請求項１ないし５の何れか１項に記載の血清型同定法。
【請求項１】
試料中のエンテロウイルスのＶＰ４全領域の塩基配列を増幅し、増幅された産物の塩基配列を決定することにより前記ＶＰ４全領域の塩基配列を得、得られた塩基配列について血清型標準株の同領域の塩基配列に基づく分子系統解析を行い、試料中のエンテロウイルスの血清型を同定することを特徴とするエンテロウイルスの血清型同定法。
【請求項２】
試料中のエンテロウィルスがエンテロウィルスの標準株または分離株であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
塩基配列の増幅が、試料からＲＮＡを調製し、調製されたＲＮＡからｃＤＮＡを得、得られたｃＤＮＡを鋳型とし、ＶＰ４全領域の塩基配列を含む塩基配列が増幅できるように選択されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして行なわれることを特徴とする請求項１又は２に記載の血清型同定法。
【請求項４】
プライマーが、配列番号１に示す塩基配列を含むプライマーと配列番号２に示す塩基配列を含むことを特徴とする請求項３に記載の血清型同定法。
【請求項５】
標準株が、エンテロウイルス群に属する全ての標準株であることを特徴とする請求項１ないし３の何れか１項に記載の血清型同定法。
【請求項６】
血清型の同定法が、前記分子系統解析において、それぞれの血清型の標準株と８０％以上のホモロジーを示すか、または、ブーツストラップ法で単一のクラスター形成する値以上で単一のクラスターを形成することを指標として行われることを特徴とする請求項１ないし５の何れか１項に記載の血清型同定法。
【公開番号】特開２００８−２９５４６０（Ｐ２００８−２９５４６０Ａ）
【公開日】平成２０年１２月１１日（２００８．１２．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２１５６７２（Ｐ２００８−２１５６７２）
【出願日】平成２０年８月２５日（２００８．８．２５）
【分割の表示】特願平１０−１５６３８７の分割
【原出願日】平成１０年６月４日（１９９８．６．４）
【出願人】（５９１１２２９５６）三菱化学メディエンス株式会社 (45)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１２月１１日（２００８．１２．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月２５日（２００８．８．２５）
【分割の表示】特願平１０−１５６３８７の分割
【原出願日】平成１０年６月４日（１９９８．６．４）
【出願人】（５９１１２２９５６）三菱化学メディエンス株式会社 (45)
【Ｆターム（参考）】
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