オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子の送達
本発明は、オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子を送達するための組成物および方法に関する。本開示は、オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子および経皮ビヒクル含む組成物を、それを必要とする患者の皮膚に投与するステップを含む、オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子の送達方法も提供する。一態様において、オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子の送達は、経皮的である。別の態様において、オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子の送達は、局所的である。別の態様において、オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子の送達は、局所的適用後の表皮および真皮にである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００９年６月１７日に出願された米国仮出願第６１／１８７，７５９号の、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ． § １１９（ｅ）のもとの優先権の利益を主張し、また本出願は、２００９年１月８日に出願された米国仮出願第６１／１４３，２９３号および２００９年４月１５日に出願された米国仮出願第６１／１６９，３８４号の、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ． § １１９（ｅ）のもとの優先権の利益を主張する、２０１０年１月８日に出願された米国仮出願第１２／６８４，８３６号の一部継続出願であり、それらの全ての開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府権益に関する記述
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）より与えられた助成金番号５ＤＰ１ ＯＤ０００２８５およびＵ５４ ＣＡ０１１９３４１のもと、政府の援助を受けて行われた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子（ＯＮ−ＮＰ）抱合体ならびに細菌タンパク質生成の阻害方法を対象とする。本発明はまた、オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子を送達する組成物および方法にも関する。
【背景技術】
【０００４】
遺伝子発現を制御するための遺伝的物質の細胞および組織への導入は、遺伝子経路および機能に関与する研究に大きく影響し、治療用途に有望である。遺伝子レベルのアプローチは、大多数の薬物では得られない固有の特異性を有する。ｓｉＲＮＡは、潜在的な治療手段としての有望性が高く、現在、癌を含む広範な臨床問題を対象とする臨床試験中である。遺伝子発現抑制は、さらに費用効率が高く、小分子阻害剤より大きな潜在的特異性で、タンパク質発現および機能の下方調節をもたらす。特に、ｓｉＲＮＡ治療は、遺伝子内の一点変異を標的とすることができ、一方小分子療法は、これまで変異体と正常遺伝子産物とを正確に区別していない。ホットスポット変異の識別、直接的遺伝子配列決定、または遺伝子増幅のためのアッセイにより、各メラノーマにおける特異的な遺伝子の変化を決定する能力を鑑みて、メラノーマに、特異的遺伝子標識を指定することができる。ｓｉＲＮＡは、多くの細胞によって取り込まれるかもしれないが、変異遺伝子または活性化シグナル伝達タンパク質を有する細胞のみが、標的遺伝子療法の影響を受け、これによって、正常な細胞に悪影響を及ぼすことなく、メラノーマにおいてシグナル伝達する経路の正常化を可能にする。
【０００５】
多くのタンパク質の送達と同様に、核酸の分解および消化管からの生体利用性の低さが、ｓｉＲＮＡの経口送達に対する大きなハードルである。静脈内送達でさえ、従来のｓｉＲＮＡは血清因子によって迅速に分解され、その標的に到達しない。核酸の局所適用は、病変皮膚における遺伝子の抑制（例えば、これに限定されないが、皮膚における転移の治療のため）、および内部標的への経皮送達の両方に、大きな治療の利点を呈する。適用は無痛であり、制御が容易であり、皮膚は非常に接触しやすい。表皮における効果的な物理的障壁は、主に、表皮の最も外側の領域である角質層に、そして、それほどではないが、深部表皮に局在する。この表皮障壁は、大量の水分損失（内側から外側）および核酸を含む環境中の物質の進入（外側から内側）に対して保護する。超音波、レーザー、および注射等の機械的アプローチが、マウス角質層を通る浸透を促進し、ｓｉＲＮＡを皮膚内に入れるために使用されてきたが、特殊な装置を必要とし、送達範囲を限定し、皮膚を損傷する可能性がある。これらの課題は、角質層を通過できる抑制型核酸を送達するための、適用が容易な経皮システムの必要性を強調している。
【０００６】
皮膚疾患の直接的標的化は、遺伝子抑制療法において理想的なモデルである。しかしながら、生体外で遺伝子を抑制するための商業的に入手可能な物質は、良くても、角化細胞（ＫＣ）およびメラニン細胞等の一次培養細胞の中に遺伝子物質を送達するのにわずかに成功しただけであった。さらに、皮膚機能の外層は、従来、核酸およびタンパク質の皮膚への、および真皮から循環流への透過を防止する細胞学的障壁として機能する［非特許文献１］。よって、十分な量のオリゴヌクレオチドを移動させるためにこの層を横断することは、困難な課題であった。
【０００７】
皮膚は、身体のうちで最も広い器官であり、表皮、真皮、および皮下組織の３つの層を含む。表皮は皮膚の外層である。表皮の厚さは、異なる種類の皮膚により異なる。眼瞼は最も薄く．０５ｍｍであり、手掌および足底は最も厚く１．５ｍｍである。表皮は、進行的により分化細胞である４つの主層を含む。底層から上層まで、層は、
●基底層
●有棘層
●顆粒層
●角質層と名付けられる。
【０００８】
底層の基底層は、円柱のような形状の細胞を有する。本層において、細胞は分裂し、既に形成された細胞を上層に押し上げる。細胞は上層に移動するにつれて平らになり、より成熟し、最終的には「死」に、剥がれる。表皮の上層の角質層は、剥がれた平らな皮膚細胞から成り、基底層の細胞から角質層に達し、その後剥がれるまでに約４週間かかる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｐｒａｕｓｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２６：１２６１−１２６８（２００８）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本開示は、オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子を送達するための組成物および方法を提供する。
【００１１】
幾つかの実施形態において、本開示は、オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子（ＯＮ−ＮＰ）および経皮ビヒクル含む経皮組成物を提供する。
【００１２】
本開示は、オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子および経皮ビヒクル含む組成物を、それを必要とする患者の皮膚に投与するステップを含む、オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子の送達方法も提供する。
【００１３】
一態様において、オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子の送達は、経皮的である。別の態様において、オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子の送達は、局所的である。別の態様において、オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子の送達は、局所的適用後の表皮および真皮にである。
【００１４】
幾つかの実施形態において、経皮ビヒクルは軟膏を含む。幾つかの態様において、軟膏はＡｑｕａｐｈｏｒである。
【００１５】
別の実施形態において、オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子が標的とハイブリッド形成し、遺伝子発現を調節する条件下で、オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子を含む治療上有効量の組成物を皮膚に投与するステップを含む、遺伝子発現の調節方法を提供する。
【００１６】
幾つかの態様において、標的は、ポリヌクレオチドである。関連する態様において、ポリヌクレオチドはＲＮＡである。幾つかの態様において、標的はポリペプチドである。
【００１７】
本開示のさらなる実施形態において、組成物の投与は皮膚疾患を軽減する。
【００１８】
種々の実施形態において、皮膚疾患は、癌、遺伝的疾患、老化、炎症、感染、および美容上の変形から成る群から選択される。
【００１９】
幾つかの態様において、癌は、扁平上皮癌、基底細胞癌、乳癌、およびメラノーマから成る群から選択される。
【００２０】
またさらなる実施形態において、標的は、Ｒａｓ、ＩｋＢα、ヘッジホッグ、Ｂ−Ｒａｆ、Ａｋｔ、およびサイクリンＤから成る群から選択される遺伝子により発現する遺伝子産物である。
【００２１】
幾つかの態様において、遺伝的疾患は、単純性表皮水疱症、水疱性魚鱗癬、先天性爪肥厚症、コステロ症候群、および結節性硬化症から成る群から選択される。さらなる態様において、標的は変異を含む遺伝子産物であり、前記遺伝子産物は、Ｋ５、Ｋ１４、Ｋ１、Ｋ１０、Ｈ−Ｒａｓ、およびｍ−Ｔｏｒから成る群から選択される遺伝子により発現する。
【００２２】
幾つかの実施形態において、老化性疾患は、ＵＶ損傷および早老症から成る群から選択される。幾つかの態様において、標的は、マトリックスメタロプロテアーゼ−１およびプロジェリンから成る群から選択される遺伝子により発現する遺伝子産物である。
【００２３】
幾つかの実施形態において、炎症は、乾癬によるものである。幾つかの態様において、標的はインターロイキン−２３である。
【００２４】
一実施形態において、ウイルス感染は、疣贅をもたらす。幾つかの態様において、標的はＥ６／Ｅ７である。
【００２５】
さらなる実施形態において、美容上の変形は、脂漏性角化症、表皮母斑、および色素性母斑から成る群から選択される。種々の態様において、標的は変異を含む遺伝子産物であり、前記遺伝子産物は、ＦＧＦＲ３、Ｋ１０、およびＢ−Ｒａｆから成る群から選択される遺伝子により発現する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】プロモーター複合体結合（Ａ）および完全なｍＲＮＡ転写物形成（Ｂ）の形成を阻害する、オリゴヌクレオチド金ナノ粒子（Ａｕ−ＮＰ）抱合体の概略図を示す。
【図２】抱合体処理後の大腸菌の電子顕微鏡像を示す。
【図３】ナノ粒子の使用による、細菌ルシフェラーゼ発現の阻害についての結果の要約を示す。ナンセンスは、大腸菌ゲノムまたは形質移入されたプラスミド上に相補領域を持たない配列を表す。アンチセンスは、配列標的ルシフェラーゼを表す。相対的なルシフェラーゼ活性は、棒内のパーセンテージとして示され、ウミシイタケ発現に基準化される。
【図４】二重鎖侵入スキームを示す。Ａ）ナノ粒子による二重鎖（二重鎖の末端のフルオレセインと隣接するダブシル）の侵入により蛍光シグナルを発する概略図。Ｂ）結果は、短い（２０塩基対）二重鎖と長い（４０塩基対）二重鎖の両方において、二重鎖の侵入とともに蛍光が増大したことを例証する（灰色の棒はナンセンス配列を表し、黒色の棒はアンチセンス配列を表す）。
【図５】適用後２４時間内の、約２５ｎＭのｓｉＲＮＡ−金ナノ粒子の表皮、真皮、および皮下組織への浸透を示す。Ａ）マウス皮膚におけるｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰの共焦点像。左側のパネル＝Ｃｙ３。明るい色は、角質層（外側皮膚層）であり、これは、密度の高い粒子蓄積および自然蛍光の両方による明るい蛍光であり得る。毛（卵胞内の縦断面に見られる）も強い蛍光である、中央＝核のＤＡＰＩ染色、右＝重複像。画像は、約１００％の表皮細胞における蛍光ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰの取り込みを示す。Ｂ）下層間葉組織（＋）の脂肪細胞（矢印）および線維芽細胞も、ほぼ全体に蛍光粒子を取り込む。棒＝２０μｍ。
【図６】ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰを用いた４週間の治療後のＣ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＵＢＣ−ＧＦＰ）３０Ｓｃｈａ／ＪマウスにおけるＧＦＰノックダウンを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
局所的に、または全身送達のために経皮的に投与することができるナノ粒子送達システムを、本明細書に開示する。幾つかの実施形態において、本システムは、ナノ粒子（ｓｉＲＮＡ−ＮＰ）の表面上に濃密に詰められるｓｉＲＮＡ二重鎖を利用する。これらの抱合体は、生物学的条件下でのオリゴヌクレオチド殻の保持を含むが、これに限定されない多くの独特の特性を示し、同時に形質移入および遺伝子調節できる単一薬剤をもたらす。オリゴヌクレオチド−ＮＰ（ＯＮ−ＮＰ）は、有害な形質移入試薬を添加せずに細胞膜を容易に横断することができる。重要なことは、これらの構造は、核酸送達のビヒクルとして単に機能しないが、細胞内で構造体として抱合されたままである。蛍光分光試験は、チオール化されたオリゴヌクレオチドが、細胞内在化後、ＮＰに結合されたままであることを示し、ナノ物質の複合特性をうまく利用することができる。ＯＮ−ＮＰが示す別の特性は、生理学的環境におけるそれらのけた外れた安定性である。他のナノ物質および遺伝子形質移入試薬と違い、オリゴヌクレオチド−ＮＰは、生物学的に意義のある条件下で容易に操作することができる。これらは、高低塩濃度、極端なｐＨ、および温度変動を含む。ＯＮ−ＮＰのさらなる特性は、ヌクレアーゼによる分解に対するそれらの耐性である。エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼは、体液中に存在し、外来遺伝子物質を破壊するように機能するため、核酸の酵素安定性を増加するための方法は、非常に重要である。核酸の酵素安定性を増加するための先だっての戦略は、化学修飾に依存するが、オリゴヌクレオチド−ＮＰの増強した耐性は、ナノ粒子表面の高濃度機能付与に基づくという点で独特である。本環境は、ナノ粒子表面の近隣内に高局所誘電体を作製し、よって、高親和性標的認識および酵素分解に対する耐性の両方を提供する。ＯＮ−ＮＰが示すさらなる特性は、補助試薬を使用せずに、「形質移入が困難な」一次細胞を含む、種々の細胞種に進入するそれらの能力である。ＯＮ−ＮＰの別の特性は、明らかな毒性がないことである。これらのナノ抱合体は、独特の大きさ、電荷、および表面機能を有し、特性はオリゴヌクレオチドとＮＰの組み合わせに由来する。これらの独特な物質についての予備的な毒性学スクリーニングは、動物モデルの高用量で、急性毒性を示さなかった。
【００２８】
ＯＮ−ＮＰの局所的適用が、損傷性皮膚、リンパ節に対する、または内部標的への経皮送達のために循環流の中への選択的遺伝子抑制を送達するための新規手段であることを、本明細書に開示する。一実施形態において、ＯＮ−ＮＰを損傷性皮膚に直接送達することにより、副作用の可能性を最小に抑えながら、最大腫瘍量の部位でオリゴヌクレオチド−ＮＰ濃度を最大にする。
【００２９】
一態様において、本開示は、抗菌性組成物およびその使用方法を提供する。一態様において、抗菌性組成物は、オリゴヌクレオチドを含むように修飾されたナノ粒子を含み、オリゴヌクレオチドが、ハイブリッド形成を可能にする条件下で標的とハイブリッド形成するように、オリゴヌクレオチドは、原核生物遺伝子の標的非コード配列に十分に相補的である。本ハイブリッド形成により、抗菌性組成物は、標的原核生物細胞の成長を阻害する。標的細胞における特定の態様において、ハイブリッド形成は、標的配列によりコードされる機能タンパク質の発現を阻害する。種々の態様において、標的配列によりコードされる原核生物タンパク質の転写、翻訳、または両方は、阻害される。本開示はさらに、細胞を抗菌性組成物と接触させるステップを含む、細胞での標的原核生物遺伝子産物の生成を阻害するために、本明細書に開示される抗菌性組成物を利用する用法を提供し、該組成物のナノ粒子と関連するオリゴヌクレオチドは、ハイブリッド形成を可能にする条件下で、細菌遺伝子の標的非コード配列と十分に相補的であり、ハイブリッド形成は、標的遺伝子によりコードされる機能原核生物遺伝子産物の阻害をもたらす。標的原核生物配列の転写または翻訳のいずれか、または転写および翻訳の両方の阻害は、標的原核生物配列によりコードされる機能タンパク質の生成の阻害をもたらすことを、当業者は理解するであろう。
【００３０】
オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子および標的原核生物配列のハイブリッド形成は、本明細書に定義されるように、「複合体」を形成する。本明細書に使用される、「複合体」とは、二本鎖（または二重鎖）複合体、または三本鎖（または三重鎖）複合体のいずれかである。本明細書において、三重鎖複合体および二重鎖複合体は、標的細菌原核生物酸の翻訳または転写を阻害することが意図される。
【００３１】
本明細書に使用される、「非コード配列」とは、当該分野において認められる意味を有する。一般に、非コード配列は、遺伝子によりコードされるタンパク質を翻訳するためのコドンを含有しないポリヌクレオチド配列を表現する。幾つかの態様において、非コード配列は染色体である。幾つかの態様において、非コード配列は染色体外である。一態様において、非コード配列は、遺伝子のコード配列全てまたはその一部に相補的である。非コード配列は、発現のプロモーター、エンハンサー、およびサイレンサー等の調節要素を含む。非コード配列の例は、５’非コード配列および３’非コード配列である。「５’非コード配列」とは、コード配列に対して５’（上流）に位置するポリヌクレオチド配列を指す。５’非コード配列は、開始コドンの完全に処理されたｍＲＮＡ上流に存在し得、ＲＮＡへの一次転写物、ｍＲＮＡの安定性、または翻訳効率の処理に影響を及ぼす場合がある。「３’非コード配列」とは、コード配列に対して３’（下流）に位置するヌクレオチド配列を指し、ｍＲＮＡ処理または遺伝子発現に影響を及ぼすことができるポリアデニル化シグナル配列および他の配列コードシグナルを含む。ポリアデニル化シグナルは、通常、ポリアデニル酸配列のｍＲＮＡ前駆体の３’端への付加に影響を及ぼすその能力を特徴とする。
【００３２】
一実施形態において、非コード配列はプロモーターを含む。「プロモーター」とは、構造遺伝子の転写を方向づけるポリヌクレオチド配列である。典型的に、プロモーターは、構造遺伝子の転写開始部位に近い、遺伝子の５’非コード配列に位置する。転写の開始に機能するプロモーター内の配列要素は、多くの場合、コンセンサスヌクレオチド配列を特徴とする。これらのプロモーター要素は、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位、ＴＡＴＡ配位列、ＣＡＡＴ配列、分化特異的要素［ＤＳＥｓ；ＭｃＧｅｈｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．７：５５１（１９９３）］、環式ＡＭＰ応答要素（ＣＲＥ）、血清応答要素［ＳＲＥｓ；Ｔｒｅｉｓｍａｎ，Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．１：４７（１９９０）］、糖質コルチコイド応答要素（ＧＲＥ）、およびＣＲＥ／ＡＴＦ［Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１９９３８（１９９２）］、ＡＰ２［Ｙｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５７２８（１９９４）］、ＳＰ１、ｃＡＭＰ応答要素結合タンパク質［ＣＲＥＢ；Ｌｏｅｋｅｎ，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ．３：２５３（１９９３）］、およびオクタマー因子［一般に、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，４ｔｈ ｅｄ．（Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．１９８７）、およびＬｅｍａｉｇｒｅ ａｎｄ Ｒｏｕｓｓｅａｕ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０３：１ （１９９４）を参照］等の他の転写因子の結合部位を含む。プロモーターが誘導性プロモーターである場合、転写速度は、誘発剤に応じて増加する。逆に、プロモーターが構成プロモーターである場合、転写速度は、誘発剤により調節されない。抑制プロモーターも公知である。「コアプロモーター」は、ＴＡＴＡボックスおよび転写開始を含む、プロモーター機能に必須であるヌクレオチド配列を含有する。本定義により、コアプロモーターは、活性を強化する、または組織特異的活性を付与してもよい特定の配列の不在下で、検出可能な活性を有しても、有さなくてもよい。
【００３３】
別の実施形態において、非コード配列は調節要素を含む。「調節要素」は、コアプロモーターの活性を調節するポリヌクレオチド配列である。例えば、調節要素は、特定の原核生物において、排他的に、または優先的に転写を可能にする細胞因子と結合するポリヌクレオチド配列を含んでもよい。
【００３４】
別の実施形態において、非コード配列はエンハンサーを含む。「エンハンサー」は、転写の開始部位に対するエンハンサーの距離または配向に関わらず、転写の効率を増大することができる調節要素の種類である。
【００３５】
本明細書および付属の特許請求の範囲に使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、特に明確に記載のない限り、複数形の参照を含むことを、ここに記載しておく。
【００３６】
「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書において互換的に使用され、当該分野に認められる意味を有することを記載しておく。
【００３７】
「結合される」、「抱合される」、「修飾される」、および「機能化される」という用語も、本明細書において互換的に使用され、オリゴヌクレオチドのナノ粒子との結合を指すことをさらに記載しておく。
【００３８】
「ハイブリッド形成」とは、ワトソン−クリックＤＮＡ相補性、フーグスティーン結合、または当該分野に公知の他の配列特異的結合の規則に従う水素結合により、核酸の二本鎖間または三本鎖間の相互作用を意味する。ハイブリッド形成は、当該分野に公知の異なる厳密性条件下で実施することができる。
【００３９】
「オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子」および「ナノ抱合体」という用語は、本明細書において互換的に使用される。
【００４０】
本明細書に使用される、融解温度または「Ｔｍ」は、ハイブリッド形成される２つの特定の核酸が、５０％解離する温度である。
【００４１】
本明細書に使用される、「真皮」という用語は、皮膚またはそれに関連する意味であり、本明細書において「皮膚（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ）」と互換的に使用される。本明細書に使用される、「経皮」は、皮膚を超えて皮下組織まで、多くの場合は、全身血管またはリンパ循環内までを意味する。本明細書に使用される「局所的」という用語は、皮膚に関する意味である。よって、組成物が局所的に適用される時、皮膚に適用される。しかしながら、「局所的」という用語は、必ずしも組成物がどこに留まるかではなく、むしろどのように適用されるかを指すことを当業者は理解するであろう。
【００４２】
本開示の組成物および方法は、種々の実施形態において、これに限定されないが、例えば、特定の関心標的に応じて、異なる深度の皮膚を標的とするように意図される。種々の実施形態において、本開示の組成物は、表皮を標的とする。幾つかの実施形態において、本開示の組成物は真皮を標的とする。さらなる実施形態において、本開示の組成物は、経皮的に移動し、皮下組織、全身血管、またはリンパ循環に達する。
【００４３】
本開示の組成物の浸透の深度に影響を及ぼす要因および方法は、ナノ粒子の大きさ、およびナノ粒子の表面上の機能化されたオリゴヌクレオチドの密度を含むが、これらに限定されない。これらの態様は、以下で本明細書にさらに詳細に記載される。よって、幾つかの態様において、本開示は、本開示の組成物が移動できる深度をオリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子自体が促進することを意図する。幾つかの態様において、組成物中のビヒクルは、本開示の組成物が移動できる深度を促進する。またさらなる態様において、ビヒクルとオリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子の組み合わせは、本開示の組成物が移動できる深度を一緒に促進する。
【００４４】
メラノーマは、発癌性変異およびゲノム増幅の異なるパターンを有する、不均一な腫瘍群を表す。色素性母斑等の前駆体病変からメラノーマへの進行は、シグナル伝達経路の活性化につながる遺伝的変化を伴う段階的経路をたどると考えられる。ＲＡＳ／ＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路の活性化が最も一般的である（約６０％のメラノーマが、活性化ＢＲＡＦ変異および２５％ＮＲＡＳ変異を有する）。日光に曝された部位は、最も一般的にＢＲＡＦ変異を示し、一方、粘膜または肢端部位では、ＢＲＡＦ変異は稀であった。
【００４５】
ＢＲＡＦ変異の９５％以上［Ｄｈｏｍｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ ２３，５２９−５４５，ｉｘ（２００９）］は、バリンをグルタミン酸（Ｖ６００Ｅ）に置換する点変異（Ｔ１７９９Ａ）であり、ＢＲＡＦ活性化を５００倍増加する。この変異は、マウスモデルにおいて、機能亢進性メラニン細胞ＥＲＫシグナル伝達および移植された腫瘍の成長因子依存性増殖をもたらす［Ｗｅｌｌｂｒｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４（７）：２３３８−４２（２００４）］。
【００４６】
しかしながら、ＢＲＡＦ／ＥＲＫ経路のみの活性化は、メラノーマ形質転換を説明しない。実際、転移性メラノーマは、１つ以上の遺伝子変化を持つ傾向にあり［Ｇｏｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２８：２２８９−２２９８（２００９）］（以下の表Ａを参照）、ＢＲＡＦ／ＥＲＫ活性化に加え、最も一般的に、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／タンパク質キナーゼＢ（ＡＫＴ）経路の活性化につながる（散発性メラノーマの約７０％）［Ｃｈｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ６８：３４２９−３４３９（２００８）］。メラノーマのＢＲＡＦＶ６００Ｅ変異媒介進行における恒常的ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ活性化の重要な役割は、現在、生体外およびマウス研究の両方で例証されている。ＢＲＡＦ変異は、ＰＴＥＮ損失／不活性化（細胞株の約３０％およびメラノーマ転移の少なくとも５８％）（Ｂｉｒｃｋ ｅｔ ａｌ．，２０００）またはＡＫＴ３変異の活性化（４３−５０％のメラノーマ）［Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ９９：１２６５−１２６８（２００８）、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ６８：６６４−６７３（２００８）、Ｓｔａｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ６４：７００２−７０１０（２００４）、Ｔｓａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ１２２：３３７−３４１（２００４）］のいずれかとの組み合わせで頻繁に発見される。
【００４７】
【表Ａ】
【００４８】
抗菌性組成物
幾つかの実施形態において、本開示は、オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子およびビヒクルを含む抗菌性組成物を提供し、該オリゴヌクレオチドは、ハイブリッド形成を可能にする条件下で、標的とハイブリッド形成する原核生物遺伝子の標的非コード配列に十分に相補的である。種々の実施形態において、抗菌性組成物は、原核生物細胞感染の治療のために、それを必要とする哺乳類に治療上有効量で投与するために製剤化される。幾つかの態様において、哺乳類はヒトである。
【００４９】
種々の実施形態において、オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子の原核生物遺伝子とのハイブリッド形成は、原核生物細胞の成長を阻害（または防止）することを意図する。よって、オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子の原核生物遺伝子とのハイブリッド形成は、原核生物細胞が細菌である態様において、静菌作用または殺菌効果をもたらすことを意図する。ハイブリッド形成が生体内で生じる態様において、原核生物細胞の成長は、オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子と接触がない原核生物細胞の成長と比較して、約５％阻害される。種々の態様において、原核生物細胞の成長は、オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子と接触がない原核生物細胞の成長と比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、またはそれ以上阻害される。
【００５０】
ハイブリッド形成が生体外で生じる態様において、原核生物細胞の成長は、オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子と接触がない原核生物細胞の成長と比較して、約５％阻害される。種々の態様において、原核生物細胞の成長は、オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子と接触がない原核生物細胞の成長と比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、またはそれ以上阻害される。
【００５１】
阻害が生体内または生体外であるかどうかに関わらず、当業者は、慣用的な技法を使用して、原核生物の細胞成長の阻害レベルを決定することができる。例えば、原核生物細胞数の直接的定量化は、試料が一定期間にわたり収集される一連の試料を得（例えば、生体内阻害の場合には体液、生体外阻害の場合には液体培養試料）、固体の成長許容培地上で試料を培養し、成長することができる原核生物細胞の得られた数を数えることにより行われる。初期の時間点の原核生物細胞数に対する後期の時間点の原核生物細胞数により、原核生物細胞成長の阻害パーセントを得る。
【００５２】
幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子の原核生物遺伝子とのハイブリッド形成は、原核生物遺伝子によりコードされる機能化原核生物タンパク質の発現を阻害する。本明細書に使用される、「機能化原核生物タンパク質」とは、原核生物遺伝子によりコードされる完全長野生型タンパク質を指す。一態様において、機能化原核生物タンパク質の発現は、オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子と接触がない細胞と比較して、約５％阻害される。種々の態様において、機能化原核生物タンパク質の発現は、オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子と接触がない細胞と比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、またはそれ以上阻害される。つまり、提供される方法は、標的遺伝子産物の発現の任意の阻害の程度をもたらす方法を包含する。
【００５３】
関連する態様において、オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子の原核生物遺伝子とのハイブリッド形成は、原核生物細胞成長に必須の機能タンパク質の発現を阻害する。一態様において、原核生物細胞成長に必須の機能性原核生物タンパク質の発現は、オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子と接触がない細胞と比較して、約５％阻害される。種々の態様において、原核生物細胞成長に必須の機能性原核生物タンパク質の発現は、オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子と接触がない細胞と比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、またはそれ以上阻害される。
【００５４】
成長に必須の原核生物タンパク質は、グラム陰性遺伝子産物、グラム陽性遺伝子産物、細胞周期遺伝子産物、ＤＮＡ複製に関与する遺伝子産物、細胞分裂遺伝子産物、タンパク質合成に関与する遺伝子産物、細菌ジャイレース、およびアシル担体遺伝子産物を含むが、これらに限定されない。これらのクラスは、以下で本明細書に詳細に記載される。
【００５５】
本開示は、原核生物遺伝子の標的非コード配列とのハイブリッド形成が、活性変化を伴う原核生物遺伝子によりコードされるタンパク質の発現をもたらす抗菌性組成物にも関する。一態様において、原核生物遺伝子によりコードされるタンパク質の活性は、オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子と接触がない原核生物細胞のタンパク質の活性と比較して、約５％低下する。種々の態様において、原核生物タンパク質の活性は、オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子と接触がない原核生物細胞のタンパク質の活性と比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約１００％阻害される。別の態様において、原核生物遺伝子によりコードされるタンパク質の活性は、オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子と接触がない原核生物細胞のタンパク質の活性と比較して、約５％増加する。種々の態様において、原核生物タンパク質の発現は、オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子と接触がない原核生物細胞のタンパク質の活性と比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、またはそれ以上増加する。
【００５６】
原核生物細胞のタンパク質の活性は、ナノ粒子に結合するオリゴヌクレオチドの配列、標的にされる原核生物遺伝子（および遺伝子によりコードされるタンパク質）、およびナノ粒子の大きさを含むが、これらに限定されない幾つかのパラメータの機能として増加または低下する。
【００５７】
種々の実施形態において、本開示の抗菌性組成物は、原核生物遺伝子の転写を阻害することを意図する。幾つかの実施形態において、本開示の抗菌性組成物は、原核生物遺伝子の翻訳を阻害することを意図する。
【００５８】
幾つかの実施形態において、抗菌性組成物は、抗生物質耐性を付与する原核生物遺伝子の標的非コード配列とハイブリッド形成する。これらの遺伝子は、当業者に公知であり、例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ３７：Ｄ４４３-Ｄ４４７，２００９（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される。幾つかの態様において、抗菌性組成物の、抗生物質に耐性を付与する原核生物遺伝子の標的非コード配列とのハイブリッド形成は、原核生物の抗生物質への感受性の増加をもたらす。一態様において、原核生物の抗生物質への感受性は、抗菌性組成物と接触しなかった原核生物の感受性と比較して、約５％増加する。種々の態様において、原核生物の抗生物質への感受性は、抗菌性組成物と接触しなかった原核生物の感受性と比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、またはそれ以上増加する。抗生物質に対する相対的感受性は、本明細書に記載される、慣用的な技法を使用して、当業者が決定することができる。
【００５９】
抗生物質との併用療法
幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子抱合体を含む抗菌性組成物は、抗生剤との組み合わせで、投与用に製剤化され、各抗生剤は治療上有効量である。
【００６０】
本明細書に使用される、「抗生剤」という用語は、細菌および他の微生物の成長を阻害する、またはそれを死滅させる能力を有し、主に感染症の治療に使用される化学物質の任意の群を意味する。例えば、米国特許第７，６３８，５５７号を参照のこと（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。抗生剤の例としては、ペニシリンＧ、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、アンピシリン、アモキシリン、チカルシリン、カルベニシリン、メズロシリン、アズロシリン、ピペラシリン、イミペネム、アズトレオナム、セファロチン、セファクロル、セフォキシチン、セフロキシム、セフォニシド、セフメタゾール、セフォテタン、セフプロジル、ロラカルベフ、セフェタメト、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフタジジム、セフェピム、セフィキシム、セフポドキシム、セフスロジン、フレロキサシン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、シプロフロキサシン、オフロキサシン、エノキサシン、ロメフロキサシン、シノキサシン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、テトラサイクリン、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネチルマイシン、トブラマイシン、ストレプトマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、エリスロマイシンエストレート、エチルコハク酸エリスロマイシン、グルコヘプタン酸エリスロマイシン、ラクトビオン酸エリスロマイシン、ステアリン酸エリスロマイシン、バンコマイシン、テイコプラニン、クロラムフェニコロール、クリンダマイシン、トリメトプリム、スルファメトキサゾール、ニトロフラントイン、リファンピン、ムピロシン、メトロニダゾール、セファレキシン、ロキシスロマイシン、Ｃｏ−アモキシクラブラン酸、ピペラシリンとタゾバクタムの組み合わせ、ならびにこれらの種々の塩、酸、塩基、および他の誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。抗菌抗生剤は、ペニシリン、セファロスポリン、カルバセフェム、セファマイシン、カルバペネム、モノバクタム、アミノグリコシド、グリコペプチド、キノロン、テトラサイクリン、マクロライド、およびフルオロキノロンを含むが、これらに限定されない。
【００６１】
用量および薬学的組成物
本明細書に使用される、「治療上有効量」という用語は、識別された疾病または病状を治療する、軽減する、もしくは防止する、または認識できる治療効果、予防効果、もしくは阻害作用を示すのに十分な組成物の量を指す。効果は、例えば、臨床状態の改善、症状の低減、または本明細書に記載されるアッセイにより認めることができる。対象に対する正確な有効量は、対象の体重、体の大きさ、および一般の健康状態、病状の性質および程度、ならびに投与に選択される抗菌性組成物または組成物の組み合わせに依存する。所与の状態の治療上有効量は、臨床医の技能および判断の内である日常の実験により決定することができる。
【００６２】
本明細書に記載される組成物は、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤とともに、薬学的組成物に製剤化されてもよい。化合物または組成物は、原核生物感染または病状の治療を可能にする任意の経路により投与することができる。本明細書に記載されるように、局所適用に有用であるＯＮ−ＮＰおよびビヒクルを含む、本開示の組成物を提供する。さらなる投与経路は経口投与である。加えて、化合物または組成物は、任意の標準投与経路を使用して、患者に送達されてもよく、静脈内、腹腔内、肺内、皮下的、もしくは筋肉内等の非経口的、くも膜下内、経皮的、直腸的、経口的、経鼻的、または吸引を含む。徐放製剤も、胃腸管の体液と接触する活性剤の放出制御を達成するために、および血漿中に十分に一定した、有効レベルの活性剤を提供するために、本明細書に記載される薬剤から調製されてもよい。本目的のために、生物分解性重合体、水溶性重合体、またはその両方の混合物の重合体マトリックス、および任意に適切な界面活性剤に結晶形態を埋め込んでもよい。本内容において、埋め込みとは、重合体のマトリックスへのマイクロ粒子の組み込みを意味してもよい。放出制御製剤も、既知の分散剤またはエマルジョンコーティング技術を介して、分散されたマイクロ粒子または乳化マイクロ液体粒子のカプセル封入により得られる。
【００６３】
投与は、単回投与の形態を取るか、または実施形態の化合物は、分割量で、または連続放出製剤もしくは投与方法（例えば、ポンプ）のいずれかで、一定期間にわたり投与することができる。しかしながら、実施形態の化合物は対象に投与され、投与された化合物の量および選択された投与経路は、疾病状態の効果的な治療を可能にするように選択されなければならない。
【００６４】
ある実施形態において、薬学的組成物は、特定の投与形式および投与形態に応じて、担体、溶媒、安定剤、アジュバント、希釈剤等の薬学的に許容される賦形剤とともに製剤化することができる。薬学的組成物は、一般に、生理学的に相溶性のｐＨを達成するように製剤化されるべきであり、製剤および投与経路に応じて、約３のｐＨ〜約１１のｐＨ、好ましくは約ｐＨ３〜約ｐＨ７の範囲であってもよい。代替の実施形態において、ｐＨが約ｐＨ５．０〜約ｐＨ８の範囲に調節されることが好ましい場合がある。より具体的には、薬学的組成物は、種々の態様において、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤とともに、治療上有効量または予防的有効量の、本明細書に記載される少なくとも１つの組成物を含む。本明細書に記載される、薬学的組成物は、任意に、本明細書に記載される化合物の組み合わせを含んでもよい。
【００６５】
「薬学的に許容される賦形剤」とは、本明細書に記載される化合物等の、薬学的薬剤の投与用の賦形剤を指す。本用語は、過度の毒性なしに投与され得る任意の薬学的賦形剤を指す。
【００６６】
薬学的に許容される賦形剤は、一部には、投与される特定の組成物ならびに該組成物を投与するために使用される特定の方法により決定される。したがって、広範な薬学的組成物の適切な製剤が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓを参照のこと）。
【００６７】
適切な賦形剤は、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸共重合体、および不活性ウイルス粒子等の、大きく、ゆっくり代謝される巨大分子を含む担体分子であってもよい。他の例示的な賦形剤は、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、炭水化物（例えば、デキストリン、ヒドロキシアルキルセルロース、および／またはヒドロキシアルキルメチルセルロース）、ステアリン酸、液体（例えば、油、生理食塩水、グリセロールおよび／またはエタノール）、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質等を含む。リポソームも薬学的に許容される賦形剤の定義内に含まれる。
【００６８】
加えて、薬学的組成物は、減菌の注入可能な水性エマルジョンまたは油性懸濁液等の、減菌の注入可能な調製物の形態であってもよい。本エマルジョンまたは懸濁液は、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用して、当業者により調合されてもよい。減菌の注入可能な調製物も、１，２−プロパン−ジオール中の溶液等、非毒性の非経口的に許容される希釈液または溶媒中の減菌の注入可能な溶液または懸濁液であってもよい。
【００６９】
減菌の注入可能な調製物は、凍結乾燥された粉末としても調製することができる。利用されてもよい許容される溶媒は、水、リンゲル液、および等張塩化ナトリウム液である。加えて、減菌の固定油は、溶媒または懸濁媒体として利用することができる。本目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含む、任意の無刺激性固定油が利用されてもよい。加えて、同様に、脂肪酸（例えば、オレイン酸）も、注入可能物の調製に使用することができる。
【００７０】
原核生物タンパク質の阻害
幾つかの態様において、本開示は、特定の核酸を標的にする方法を提供する。あらゆる種の原核生物核酸が標的とされてもよく、本方法は、例えば、機能性原核生物遺伝子産物の生成を阻害するために使用することができる。本発明の方法により標的とさえ得る核酸の例としては、遺伝子および原核生物ＲＮＡまたはＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
種々の態様における、原核生物標的核酸について、核酸は、ゲノムＤＮＡからＲＮＡ転写される。
【００７２】
阻害の程度は、例えば、標的原核生物が見つかり、原核生物タンパク質の阻害が望ましい個人の体液試料から、または標的原核生物が見つかり、原核生物タンパク質の阻害が望ましい個人における、当該分野に周知の撮像技術により、生体内で判断される。代替的に、阻害の程度は、初期の時間点での細胞培養物または生物に存在した原核生物の量と比較して、細胞培養物または生物に残存する原核生物の量を定量化することにより生体内で判断される。
【００７３】
三重鎖複合体が形成される実施形態において、変異は原核ゲノムに導入されることが意図される。これらの実施形態において、オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子抱合体は変異を含み、三重鎖複合体の形成は、ナノ粒子に結合されるオリゴヌクレオチドと原核生物ゲノムの鎖との間の組み換え事象を開始する。
【００７４】
オリゴヌクレオチドハイブリッド形成および設計
本開示のオリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチド配列とハイブリッド形成する時、少なくとも約４５℃、典型的に、約５０℃〜６０℃の間のＴｍを有するが、Ｔｍは、例えば、６５℃等、高くてもよい。標的が原核生物ポリヌクレオチドである態様において、原核生物標的ポリヌクレオチド配列、および原核生物ｍＲＮＡ標的ポリヌクレオチド配列の選択は、以下に本明細書で考慮される。
【００７５】
一実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、生理学的条件下で、標的オリゴヌクレオチド配列とハイブリッド形成されるように設計され、Ｔｍは、実質的に３７℃を超え、例えば、少なくとも４５℃、幾つかの態様において、約６０℃〜８０℃である。オリゴヌクレオチドは、核酸に対して高結合親和性を有するように設計され、一態様において、標的オリゴヌクレオチド配列に１００％相補的であるか、またはミスマッチを含んでもよい。オリゴヌクレオチドが、標的オリゴヌクレオチド配列に９５％を超えて相補的である、標的オリゴヌクレオチド配列に９０％を超えて相補的である、標的オリゴヌクレオチド配列に８０％を超えて相補的である、標的オリゴヌクレオチド配列に７５％を超えて相補的である、標的オリゴヌクレオチド配列に７０％を超えて相補的である、標的オリゴヌクレオチド配列に６５％を超えて相補的である、標的オリゴヌクレオチド配列に６０％を超えて相補的である、標的オリゴヌクレオチド配列に５５％を超えて相補的である、または標的オリゴヌクレオチド配列に５０％相補的である方法を提供する。
【００７６】
当業者は、オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子抱合体のための適切な標的を容易に判断し、当該分野に公知の技法を使用して、オリゴヌクレオチドを設計し合成してもよいことを理解するであろう。標的は、例えば、関心の標的核酸の配列を得（例えば、ＧｅｎＢａｎｋから）、例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ６．０プログラム、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム、ＢＬＯＳＵＭ３０マトリックス、およびデフォルトパラメータを使用することにより、それを他の核酸と整合することにより識別することができ、これは、核酸整合について、１０の開始ギャップペナルティーおよび５．０の伸長ギャップペナルティーを含む。
【００７７】
任意の不可欠な原核生物遺伝子は、本開示の方法を使用することにより、標的遺伝子として意図される。上述のように、任意の原核生物種の不可欠な原核生物遺伝子は、大腸菌についてＧｅｒｄｅｓによって説明されるものを含む、種々の方法を使用して決定することができる［Ｇｅｒｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８５（１９）：５６７３−８４，２００３］。多くの不可欠な遺伝子は、細菌界全域で保存され、よって、標的の選択において、さらなるガイダンスを提供する。標的遺伝子配列は、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）により維持されるもの等、容易に利用可能な生物情報科学の手段を使用して識別することができる。多数の微生物種の完全な基準ゲノム配列を得ることができ、不可欠な細菌遺伝子の配列を識別することができる。一態様において、細菌株は、米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）からも入手することができる。任意の所与の種に適切な培養培地と条件を使用することにより、簡単な細胞培養法を確立して、オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子抱合体の抗菌活性を決定することができる。
【００７８】
次いで、最適な活性を示すオリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子抱合体は、ヒトの感染の治療に使用される前に、動物モデルまたは獣医動物で試験される。
【００７９】
治療上の標的
細胞分裂および細胞周期標的タンパク質の標的配列
本開示のオリゴヌクレオチドは、不可欠な原核細胞遺伝子をコードする原核生物核酸の配列とハイブリッド形成するように設計される。例示的な遺伝子は、細胞分裂、細胞周期タンパク質に必要なもの、または脂質生合成もしくは核酸の複製に必要な遺伝子を含むが、これらに限定されない。遺伝子の必須性が決定されると、任意の不可欠な細菌遺伝子は標的である。生物のどの遺伝子が不可欠であるかを決定するためのアプローチの１つは、記載されるように［Ｇｅｒｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８５（１９）：５６７３−８４，２００３、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる］、遺伝子フットプリント技術を使用することである。本報告において、６２０大腸菌遺伝子は、健全な好気成長の培養条件下で成長に不可欠であると識別され、３，１２６遺伝子は、不要であると識別された。進化的状況分析は、細菌界全体で、十分な数の不可欠な大腸菌遺伝子、特に、ＤＮＡ複製、細胞分裂、およびタンパク質合成等の主要な細胞プロセスのサブセットが保存されたことを実証した。
【００８０】
種々の態様において、本開示は、以下を含む不可欠な細菌タンパク質をコードする標的配列に、安定的かつ特異的に結合するのに有効な核酸配列であるオリゴヌクレオチドを提供する：（１）食中毒に関係する大腸菌株、例えば、Ｏ１５７：Ｈ７（米国特許出願第２００８０１９４４６３号の表１を参照、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）等の所与の細菌種の特定株に特異的な配列、（２）２つ以上の細菌種に共通する配列、（３）２つの関連する細菌属に共通する配列（すなわち、類似する系統発生起源の細菌属）、（４）グラム陰性細菌の中で一般に保存される配列、（５）グラム陽性細菌の中で一般に保存される（配列）、または（６）一般に、不可欠な細菌タンパク質コード核酸配列のコンセンサス配列。
【００８１】
一般に、本開示の方法を使用する、遺伝子発現の調節のための標的は、細胞分裂の遺伝子および細胞壁合成（分裂細胞壁またはｄｃｗ）遺伝子クラスターから転写されたｍＲＮＡ配列等の、活性原核生物成長または複製中に発現する原核生物核酸を含み、ｚｉｐＡ、ｓｕｌＡ、ｓｅｃＡ、ｄｉｃＡ、ｄｉｃＢ、ｄｉｃＣ、ｄｉｃＦ、ｆｔｓＡ、ｆｔｓＩ、ｆｔｓＮ、ｆｔｓＫ、ｆｔｓＬ、ｆｔｓＱ、ｆｔｓＷ、ｆｔｓＺ、ｍｕｒＣ、ｍｕｒＤ、ｍｕｒＥ、ｍｕｒＦ、ｍｕｒｇ、ｍｉｎＣ、ｍｉｎＤ、ｍｉｎＥ、ｍｒａＹ、ｍｒａＷ、ｍｒａＺ、ｓｅｑＡ、およびｄｄｌＢを含むが、これらに限定されない。大腸菌の細菌細胞分裂および細胞周期の一般的な報告については、それぞれ、［Ｂｒａｍｈｉｌｌ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．１３：３９５−４２４，１９９７］および［Ｄｏｎａｃｈｉｅ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４７：１９９−２３０，１９９３］を参照し、両方とも、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。さらなる標的は、脂質生合成（例えば、ａｃｐＰ）および複製（例えば、ｇｙｒＡ）に関与する遺伝子を含む。
【００８２】
大腸菌の細胞分裂は、細胞表層の全３層（細胞膜、剛性ペプチドグリカン層、および外膜）の協調された陥入を含む。中隔の収縮は、細胞を２つの区画に切断し、複製されたＤＮＡを分離する。少なくとも９つの不可欠な遺伝子産物が、本プロセスに関与する：ｆｔｓＺ、ｆｔｓＡ、ｆｔｓＱ、ｆｔｓＬ、ｆｔｓＩ、ｆｔｓＮ、ｆｔｓＫ、ｆｔｓＷ、およびｚｉｐＡ［Ｈａｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１（１）：１６７−７６，１９９９］。意図されるタンパク質標的は、以下に記述される３つであり、特に、以下に記載されるＧｙｒＡおよび標的である。
【００８３】
大腸菌の最も初期の不可欠な細胞分裂遺伝子の１つであるＦｔｓＺは、細菌細胞の分裂部位で膜関連環を形成する可溶性のチューブリン様ＧＴＰａｓｅである。環は、細胞収縮を促進すると考えられ、細胞壁陥入に影響を及ぼすように思われる。ＦｔｓＺは、大腸菌の細胞分裂を媒介する中隔環構造の必須区画である、ｚｉｐＡと呼ばれる大腸菌の新しい内膜内在性タンパク質に直接結合する［Ｌｕｔｋｅｎｈａｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ．６６：９３−１１６，１９９７］。
【００８４】
ＧｙｒＡは、細菌ジャイレース酵素のサブユニット、したがって、遺伝子を指す。細菌ジャイレースは、細胞のＤＮＡの高次コイルのレベルを制御する細菌ＤＮＡトポイソメラーゼの１つであり、ＤＮＡ複製に必要である。
【００８５】
ＡｃｐＰは、脂質生合成において不可欠な補助因子である、アシル担体タンパク質をコードする。脂肪酸生合成経路は、熱に安定した補助因子であるアシル担体タンパク質が、経路の中間体を結合することを必要とする。
【００８６】
これらの３つのタンパク質のそれぞれについて、米国特許出願第２００８０１９４４６３号の表１は、多数の重要な病原菌のそれぞれについての標的配列を含有する例示的な細菌配列を提供する。遺伝子配列は、各細菌株において、ＧｅｎＢａｎｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅの完全ゲノム配列に由来する。
【００８７】
原核生物１６ＳリボソームＲＮＡの標的配列
一実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、生理学的条件下で、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ核酸配列をコードする配列とハイブリッド形成されるように設計され、Ｔｍは、実質的に、３７℃を超え、例えば、少なくとも４５℃、好ましくは６０℃〜８０℃である。
【００８８】
より具体的には、オリゴヌクレオチドは、１つ以上の以下の特徴を有する標的１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列に、安定的かつ特異的に結合するのに有効である配列を有する：（１）１６ｓ ｒＲＮＡの二本鎖配列に見られる配列、例えば、ペプチジルトランスフェラーゼ中心、α−サルシナループ、および１６Ｓ ｒＲＮＡ配列のｍＲＮＡ結合配列、（２）細菌１６ｓ ｒＲＮＡの一本鎖配列に見られる配列、（３）所与の細菌種の特定株に特異的な配列、すなわち、食中毒に関連する大腸菌株、（４）特定の細菌種に特異的な配列、（５）２つ以上の細菌種に共通する配列、（６）２つの関連する細菌属に共通の配列（すなわち、類似する系統発生起源の細菌属）、（７）グラム陰性細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ配列の中で一般に保存される配列、（６）グラム陽性細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ配列の中で一般に保存される配列、または（７）一般に、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ配列のコンセンサス配列。
【００８９】
１６Ｓ ｒＲＮＡ 配列についての例示的な細菌および関連するＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号は、米国特許第６，６７７，１５３号の表１に提供され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００９０】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、胃腸管の常在菌叢の一部である、グラム陰性細菌である。数百の大腸菌株が存在し、大半は無害であり、健康なヒトおよび動物の胃腸管に生存する。現在、ヒトに胃腸炎を引き起こす、認識される腸病原性大腸菌（「ＥＥＣ群」）のクラスが４つ存在する。これらの中には、腸病原性（ＥＰＥＣ）株、および病原性メカニズムが典型的な大腸菌エンテロトキシンの排出に関連するものを含む。そのような大腸菌株は、胃腸管および尿管の感染、敗血症、肺炎、および髄膜炎に関連するものを含む、種々の疾病を引き起こす可能性がある。抗生物質は、幾つかの株に対して効果がなく、感染の再発を必ずしも防止しない。
【００９１】
例えば、大腸菌株０１５７：Ｈ７は、毎年、米国において、１０，０００〜２０，０００件の感染を引き起こすと推定される（疾病予防管理センター）（Ｆｅｄｅｒａｌ Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）。出血性大腸炎は、大腸菌株Ｏ１５７：Ｈ７によって引き起こされる急性疾病の名称である。就学前の児童および高齢者は、重篤な合併症のリスクが最も高い。大腸菌株０１５７：Ｈ７は、近年、太平洋北西のファーストフードレストランからの調理不足のハンバーガーを食べた４人の子供の死亡の原因として報告された［例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．１２０（１）：１７−２０，１９９８を参照］。
【００９２】
腸病原性大腸菌株の例示的な配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号Ｘ９７５４２、ＡＦ０７４６１３、Ｙ１１２７５およびＡＪ００７７１６を含む。
【００９３】
ネズミチフス菌は、臨床的に、局所的な胃腸感染である胃腸炎（下痢、腹部疝痛、および発熱）から重篤な全身疾患である腸熱（腸チフスを含む）までに及ぶ、種々の病状を引き起こすグラム陰性細菌である。サルモネラ感染は、実質的な家畜の損失も引き起こす。
【００９４】
グラム陰性桿菌に特有である、サルモネラｓｐｐ．の細胞壁は、細胞の溶解によって遊離された複雑なリポ多糖（ＬＰＳ）構造を含有し、内毒素として機能する場合があり、これは生物の病原性に寄与する。
【００９５】
汚染食品は、完全に調理されない肉類および畜産物にサルモネラが残存するという事実により、非チフス性感染における主な伝染様式である。数多くの他の家畜および野生動物に加え、最も一般的な動物源は、ニワトリ、シチメンチョウ、ブタ、およびウシである。サルモネラｓｐｐ．により引き起こされた腸チフスおよび他の腸熱の疫学は、ヒトの糞便で汚染された水と関係する。
【００９６】
腸チフスに対するワクチンが入手可能であり、一部有効であるが、非チフス性サルモネラ感染に対するワクチンは入手不可能である。非チフス性サルモネラ症は、衛生的な食肉処理の実践ならびに食品の調理および冷凍を通して制御される。抗生物質は、全身疾患について示され、ある程度の成功のため、アンピシリンが使用されている。しかしながら、過剰な量の抗生物質を用いた治療下の患者において、胃手術後に免疫抑制剤を用いた治療下の患者において、および溶血性貧血、白血病、リンパ腫、またはＡＩＤＳ、サルモネラ感染の患者において、医療上の問題が残る。
【００９７】
シュードモナスｓｐｐ．は、多くの抗生物質に耐性であり、病院内（院内）感染の主な原因のため、臨床的に重要である、運動型のグラム陰性桿体である。感染は、易感染性の個人、やけどの被害者、呼吸器を使用している個人、留置カテーテルを有する個人、ＩＶ麻酔使用者、および慢性の肺疾患（例えば、嚢胞性線維症）を有する個人に多くみられる。感染は健康な個人においては稀であるが、多くの部位で生じ、尿管感染、敗血症、肺炎、咽頭炎、および数多くの他の問題につながる可能性があり、治療は、多くの場合、役に立たず、死亡率は非常に顕著である。
【００９８】
緑膿菌は、単極運動性を伴うグラム陰性の好気性桿体形状の細菌である。日和見性ヒト病原菌である緑膿菌は、植物の日和見性病原菌でもある。他のシュードモナス菌と同様、緑膿菌は、種々の色素を分泌する。緑膿菌の決定的な臨床識別は、ピオシアニンおよびフルオレセイン両方の生成を識別すること、ならびに菌の４２℃で成長する能力を含む。緑膿菌は、ディーゼルおよびジェット燃料で成長することもでき、そのため、炭化水素資化微生物（または「ＨＵＭムシ」）として知られ、細菌性腐食を引き起こす。
【００９９】
コレラ菌は、ヒトに感染するグラム陰性桿体であり、衛生状態の不良により広がる疾病であるコレラの原因であり、給水の汚染となる。コレラ菌は、ヒトの小腸にコロニーを形成することができ、そこで、粘膜にわたってイオン輸送を妨害する毒素を生成する。コレラ菌に感染した個人は、電解質を含有する溶液を用いて静脈内または経口的のいずれかで水分補強する必要がある。疾病は、一般に自己限定であるが、脱水症状および必須の電解質の欠乏により死亡する可能性がある。テトラサイクリン等の抗生物質は、疾病の経過を短くすることが実証されており、現在、経口ワクチンが開発途中である。
【０１００】
淋菌は、グラム陰性球菌であり、これは、一般的な性交感染症の起因菌である淋病である。淋菌は、その表面抗原を変化させることができ、再感染のための免疫の発生を防止する。およそ７５０，０００件の淋病が、毎年、米国で報告されており、さらに７５０，０００件が、毎年、未報告であると推定され、その大部分は１０代の若者および若年成人である。アンピシリン、アモキシリン、またはペニシリンの幾つかの種類が、淋病の治療に推奨されていた。しかしながら、ペニシリン耐性淋病の発生率が増加し、注入による新しい抗生物質、例えば、セフトリアキソンまたはスペクチノマイシンが、現在、ほとんどの淋菌感染の治療に使用されている。
【０１０１】
黄色ブドウ球菌は、通常、ヒトの鼻にコロニーを形成するグラム陽性球菌であり、時折、皮膚で見られる。ブドウ球菌は、血流感染、肺炎、および院内感染を引き起こす可能性がある。黄色ブドウ球菌は、重度の食中毒を引き起こす可能性があり、多くの株は、食品中で成長し、外毒素を生成する。一般的な抗生物質、例えば、バンコマイシンに耐性のブドウ球菌が、地域および病院内の両方の主要な公共衛生問題として、米国および国外に出現した。近年、バンコマイシン耐性ブドウ球菌単離体（ｉｓｏｌａｔｅ）も、日本で確認された。
【０１０２】
結核菌は、結核の起因菌であるグラム陽性細菌であり、時折、致命的な、死に至る疾病である。結核は増えており、世界的であり、単一感染症からの主要な死因である（現在、毎年、３００万人の死亡率である）。脳、腎臓、および骨を含む、ヒト身体の幾つかの器官に影響を及ぼす可能性があるが、最も一般的には、肺に影響を及ぼす。
【０１０３】
米国において、陽性の皮膚試験により示されるように、約１０００万人が結核菌に感染し、毎年、約２６，０００件が新しい活動性疾病である。結核（ＴＢ）症例の増加は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、ホームレス、薬物乱用、および活動性感染を有する個人の移民と関連している。全てのＴＢ病原菌を単一薬剤で破壊できないため、薬物に影響されやすいＴＢに対する現在の治療プログラムは、６〜９ヶ月の間、２つまたは４つの薬物（例えば、イソニアジド、リファンピン、プラジナミド、エタンブトール、またはストレプトマイシン）を服用することを含む。加えて、薬物耐性および多剤耐性の結核菌株の記録は増加している。
【０１０４】
ピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）は、胃の裏層に感染する、らせん状またはＳ字形態の、微好気性でグラム陰性の低成長鞭毛生物である。ピロリ菌は、胃腺癌をもたらす慢性表層性胃炎、消化性潰瘍、および慢性萎縮性胃炎に関連するヒト胃病原菌である。ピロリ菌は、ヒトにおいて最も一般的な慢性細菌感染の１つであり、活動性胃炎を有する患者の９０％に見られる。現在の治療法は、大半の症例において、ピロリ菌を根絶する、ビスマス、メトロニダゾール、およびテトラサイクリンまたはアモキシリンのいずれかを用いた三剤療法を含む。三剤療法を用いた問題は、患者のコンプライアンス、副作用、およびメトロニダゾール耐性を含む。有望な二剤療法の代替レジメンは、アモキシリンとメトロニダゾール、またはオメプラゾールとアモキシリンである。
【０１０５】
肺炎球菌は、グラム陽性球菌であり、細菌性肺炎ならびに中耳感染（中耳炎）および髄膜炎の最も一般的な原因の１つである。米国において、毎年、肺炎球菌疾病は、約５０，０００件の菌血症、３，０００件の髄膜炎、１００，０００〜１３５，０００件の入院、および７００万件の中耳炎の原因である。肺炎球菌感染は、米国において、毎年、推定４０，０００人の死亡を引き起こす。２歳未満の子供、６５歳以上の成人、および例えば、鬱血性心臓病、糖尿病、気腫、肝臓病、鎌状赤血球、ＨＩＶを含む、基礎疾患を有するいずれの年齢の個人、および特殊環境、例えば、養護施設および長期療養施設等で生活するものは、感染のリスクが最も高い。
【０１０６】
薬物耐性肺炎球菌株は、米国で一般的になっており、多くのペニシリン耐性肺炎球菌は、エリスロマイシンまたはトリメトプリム−スルファメトキサゾール等の他の抗菌剤にも耐性である。
【０１０７】
梅毒トレポネーマは、梅毒を引き起こすスピロヘータである。梅毒トレポネーマは、排他的に、梅毒、いちご腫、および非性病の地方病性梅毒またはピンタを引き起こす病原菌である。梅毒トレポネーマは、生体外で成長することができないが、哺乳類細胞なしで増殖する。初感染は、感染部位で潰瘍を引き起こすが、細菌は、全身に移動し、時間とともに多くの臓器を損傷する。その後期段階で、未治療の梅毒は、感染性ではないが、重篤な心臓異常、精神疾患、失明、他の神経性問題、および死を引き起こす可能性がある。
【０１０８】
梅毒は、通常、ペニシリンで治療され、注入により投与される。他の抗生物質は、ペニシリンにアレルギーがある患者、または常用量のペニシリンに応答しない患者に利用可能である。梅毒の全段階において、適切な治療は、疾病を治癒するが、後期の梅毒において、既に身体器官を損傷し、反転させることができない。
【０１０９】
クラミジアトラコマティスは、米国において、最も一般的な細菌の性感染症であり、毎年、４００万件の新しい症例が生じると推定される。最も高い感染率は、１５〜１９歳である。クラミジアは、非淋菌性尿道炎（ＮＧＵ）、子宮頚炎、細菌性膣炎、および骨盤内炎症性疾患（ＰＩＤ）の主な原因である。クラミジア感染症は、非常に軽度の症状であるか、または症状がないかもしれないが、治療しないままだと、クラミジア感染症は、特に女性の生殖器官に重篤な損傷をもたらす可能性がある。アジスロマイシン、エリスロマイシン、オフロキサシン、アモキシリン、またはドキシサイクリン等の抗生物質が、典型的に、クラミジア感染を治療するために処方される。
【０１１０】
ヘンセラ菌ネコ引っかき熱（ＣＳＦ）もしくはネコ引っかき病（ＣＳＤ）は、ネコとの接触を通してもたらされるヒトの疾病であり、もともとはロシャメリアヘンセラと名付けられ、現在はヘンセラ菌として知られる、グラム陰性桿体により引き起こされる。症状は、発熱およびリンパ節の腫大を含み、ＣＳＦは、一般に、比較的良性で、個人の自己限定性疾病であるが、ヘンセラ菌感染は、易感染性の個人に明確な臨床症状を生じ、菌血症を伴う急性熱病、細菌性血管腫症、肝臓紫斑病、細菌性脾炎、およびＡＩＤＳ脳症等の他の慢性疾病徴候を含む。疾病は、ドキシサイクリン、エリスロマイシン、リファンピン、ペニシリン、ゲンタマイシン、セフトリアキソン、シプロフロキサシン、およびアジスロマイシン等の抗生物質で治療される。
【０１１１】
インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）は、グラム陰性細菌のファミリーであり、６種が知られており、最もインフルエンザ菌に関連する疾病は、Ｂ型または「ＨＩＢ」により引き起こされる。ＨＩＢのワクチンが開発されるまで、ＨＩＢは、中耳炎、副鼻腔感染、気管支炎の一般的な原因であり、髄膜炎の最も一般的な原因であり、肺炎、敗血症性関節炎（関節感染）、蜂巣炎（軟組織の感染）、および心膜炎（心臓を囲む膜の感染）の場合には、頻繁な原因であった。インフルエンザ菌Ｂ型細菌はヒトに広まり、通常、疾病を引き起こさずに喉および鼻に生存する。５歳未満のワクチン接種をしていない子供は、ＨＩＢ疾病のリスクがある。インフルエンザ菌感染により引き起こされる髄膜炎および他の重篤な感染は、脳損傷または死に至る。
【０１１２】
志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓ．）は、赤痢を引き起こすグラム陰性桿体である。結腸において、細菌は、粘膜細胞に進入し、粘膜細胞内で分裂し、大規模な炎症性応答をもたらす。赤痢菌感染は、脱水症状につながる重度の下痢を引き起こす可能性があり、きわめて若年な、きわめて老年な、または慢性的に病気の人にとっては危険である可能性がある。志賀赤痢菌は、強力な毒素（志賀毒素）を形成し、これは細胞毒性、腸管毒性、神経毒性であり、タンパク質合成の阻害剤として作用する。アンピシリンおよびＴＭＰ−ＳＭＸ等の抗生物質への耐性が発達したが、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン、およびエノキサシン等の新しく、高価な抗生物質は、有効である。
【０１１３】
リステリアは、ヒトおよび動物の糞便にみられる、グラム陽性の運動性細菌である。リステリア菌は、リステリア症、髄膜脳炎、および髄膜炎等の疾病を引き起こす。この菌は、特に妊娠中の女性、新生児、高齢者、および易感染性の個人において、食物媒介性病原菌による死亡の主な原因の１つである。植物質の腐食、下水、水、および土壌等の環境で発見され、両極限温度で生存し、塩濃度は、特に再加熱されない食物において、菌を非常に危険な植物食物媒介性病原菌にさせる。細菌は、腸の感染部位から中枢神経系および胎児−胎盤部に広がる可能性がある。髄膜炎、胃腸炎、および敗血症は、感染の結果起こる。ウシおよびヒツジにおいて、リステリア感染は、脳炎および自然流産を引き起こす。
【０１１４】
プロテウスミラビリスは、腸内グラム陰性共生菌であり、大腸菌の遠縁に当たる。通常、ヒトの尿道にコロニーを形成するが、カテーテル処置された個人の尿路感染の主な原因である日和見病原性菌である。プロテウスミラビリスは、例外的な特徴が２つある：１）非常に迅速な運動性を有し、これは、培養プレート上で、群泳現象として自身を示す、および２）ウレアーゼを生成し、これは、それに尿素を分解し、尿生殖器管で生存する能力を付与する。
【０１１５】
ペスト菌は、疫病の起因菌であり（腺および肺）、世界中で数百万の死者を出した壊滅的な疾病である。病原菌は、感染したノミの咬合を介してラットからヒトに、または広がった感染中の空気を介してヒトからヒトに伝播し得る。ペスト菌は、疾病を発症させるのに非常に少ない数を必要とする、非常に病原性の菌であり、多くの場合、治療せずに放置すると、致命的である。菌は腸管侵入性であり、宿主全体に全身的に広がる前に、マクロファージで生存し、増殖する。
【０１１６】
炭疽菌は炭疽病としても知られる。ヒトは、汚染された動物と接触すると感染する。炭疽病は、ヒトとヒトの接触により伝播されない。疾病の３つの形態は、皮膚性（皮膚）、肺性（肺）、および腸管を含む感染部位を示す。肺および腸管感染は、治療せずに放置すると、多くの場合、致命的である。胞子は、マクロファージにより取り込まれ、ファゴリソソーム（膜区画）の中に内部移行し、発芽が開始する。細菌は、感染したマクロファージが溶解すると、血流の中に放出され、急速に増殖し、敗血性ショック、呼吸困難、および臓器不全をもたらすプロセスである、循環系統およびリンパ系全体に広がる。本病原菌の胞子は、テロ兵器として使用された。
【０１１７】
鼻疽菌は、主に、ウマ、ラバ、およびロバに生じる感染症である、鼻疽を引き起こすグラム陰性の好気性の細菌である。ヒト感染とはほとんど関係がなく、一般には、家畜に見られる。この菌は、類鼻疽菌に類似し、非運動性であることによって区別される。病原体は、宿主適応であり、その宿主の外部の環境では見られない。鼻疽は、抗生物質で治療されないと、多くの場合、致命的であり、伝播は、空気を通して、またはより一般的には、感染した動物と接触すると起こる可能性がある。迅速な発症の肺炎、菌血症（血液を通した病原菌の蔓延）、嚢胞、および死亡は、感染中の一般的な結果である。サルモネラ菌のものと類似するＩＩＩ型分泌系が必要であるが、病原性のメカニズムは、良く理解されていない。生物テロ物質としての可能性を有すると考えられる、この潜在的に危険な菌のワクチンは存在しない。本病原菌のゲノムは、関連する類鼻疽菌（以下）と比較すると、多数の挿入配列、および細胞表面タンパク質の抗原変異において機能してもよい多数の単純配列反復を持つ。
【０１１８】
類鼻疽菌は、ヒトおよび動物に類鼻疽を引き起こす、グラム陰性細菌である。類鼻疽は、アジア、タイ、およびオーストラリアの特定地域に見られる疾病である。類鼻疽は、典型的に、土壌菌であり、水田および湿性熱帯土壌から回収されたが、日和見病原体として、真性糖尿病を患うもの等の、感受性の高い個人に疾病を引き起こす可能性がある。菌は、細胞内に存在し、肺炎および菌血症（血流を通した細菌の蔓延）を引き起こす可能性がある。潜伏期は非常に長く、感染は疾病を数十年先行する場合があり、治療は、数ヶ月の抗生物質の使用を要し、再発は、一般的に見られる現象である。細胞内蔓延は、細胞の一極でのアクチン重合の誘発を介して生じる場合があり、細胞質を通した、および細胞から細胞の移動を可能にする。本菌は、鼻疽菌ゲノムで見られるものと類似する抗原変異を促進する場合がある、多数の小さい配列反復を持つ。
【０１１９】
セパシア菌は、少なくとも７つの異なる亜種からなるグラム陰性細菌であり、バークホルデリアマルティボランス、バークホルデリアベトナミエンシス、バークホルデリアスタビリス、バークホルデリアセノセファシア、およびバークホルデリアアムビファリアを含む。セパシア菌は、基礎肺疾患（（慢性肉芽腫症等の）嚢胞性線維症または免疫問題等）を有する個人に多くの場合、肺炎を引き起こす、重要なヒト病原体である。セパシア菌は、典型的に、水および土壌で発見され、湿潤環境で長期間生存することができる。ヒトからヒトへの感染が記録されており、結果として、嚢胞性線維症を有する患者のための多くの病院、クリニック、およびキャンプは、セパシア菌の厳密な隔離予防を実行した。細菌を有する個人は、多くの場合、蔓延を制限するために、細菌を保有しない個人とは別の場所で治療される。これは、セパシア菌の感染が、死をもたらす肺機能の急激な低下につながる可能性があるためである。セパシア菌の診断は、喀痰培養物から細菌を単離することを含む。セパシア菌は、アミノグリコシド（トブラマイシン等）を含む、多くの一般的な抗生物質に自然に耐性であるため、治療は困難である。治療は、典型的に、複数の抗生物質を含み、セフタジジム、ドキシサイクリン、ピペラシリン、クロラムフェニコロール、およびコトリモキサゾールを含んでもよい。
【０１２０】
野兎病菌は、Ｅｄｗａｒｄ Ｆｒａｎｃｉｓにより、２０世紀初期に、カルフォルニアのトゥーレアリ郡のリスに感染した、疫病様疾病の起因菌として最初に認められた。病原菌は、今や、その同名を持つ。疾病は、野兎病（ｔｕｌａｒｅｍｉａ）と呼ばれ、履歴全体にわたって記述された。菌は、感染したダニまたはアブから、感染した肉を通して、またはエアロゾルを介してヒトに伝播することができ、よって、生物テロ物質の可能性がある。水性菌であり、原虫内での生存が発見でき、レジオネラで認められるものと類似する。感染率が高く、食作用細胞および非食作用細胞に侵入することができ、急速に増殖する。マクロファージ内に入ると、菌は、ファゴソームを逃れ、細胞基質に生存する。
【０１２１】
獣医適用
家畜の胃腸管の健康な細菌叢は、健康および関連する食品の対応する産生にきわめて重要である。ヒトと同様、健康な動物の胃腸管は、多数の種類の細菌（すなわち、大腸菌、緑膿菌およびサルモネラｓｐｐ．）を含有し、相互と生態的均衡に生存する。本均衡は、飼料の変化、ストレス、または抗生物質もしくは他の治療上の処置に応答して乱される場合があり、サルモネラ、カンピロバクター、腸球菌、野兎病、および大腸菌等の、細菌により一般に引き起こされる細菌病を動物にもたらす。これらの動物の細菌感染は、多くの場合、治療的介入を必要とし、これは、治療費がかかり、また頻繁に生産能の低下に関係する。
【０１２２】
結果として、家畜を抗生物質で慣用的に治療し、胃腸管の叢のバランスを維持する。本アプローチの欠点は、抗生物質耐性菌が発生し、そのような抗生物質および耐性菌が、ヒトが消費する食品に持ち越されることである。
【０１２３】
皮膚疾患を軽減するための標的
本開示の幾つかの実施形態において、本明細書に開示されるＯＮ−ＮＰを含む組成物を投与し、標的遺伝子の発現を調節することが意図される。種々の実施形態において、組成物は皮膚疾患を軽減するために投与される。
【０１２４】
幾つかの態様において、軽減される皮膚疾患は、過剰増殖疾患、腫瘍性疾患、遺伝的疾患、老化、炎症、感染、および美容上の変形を含むが、これらに限定されない。さらなる態様において、皮膚疾患は、癌を含むが、これに限定されない。またさらなる態様において、癌は、扁平上皮癌、基底細胞癌、メラノーマ、および乳癌を含むが、これらに限定されない。関連する態様において、本発明の組成物により標的にされる遺伝子産物は、Ｒａｓ、ＩｋＢα、ヘッジホッグ、Ｂ−Ｒａｆ、ＡｋｔおよびサイクリンＤを含むが、これらに限定されない。
【０１２５】
幾つかの実施形態において、本開示の組成物は、単純性表皮水疱症、水疱性魚鱗癬、先天性爪肥厚症、コステロ症候群、および結節性硬化症を含むが、これらに限定されない遺伝的疾患を軽減するために投与される。幾つかの態様において、投与された組成物により標的にされる遺伝子産物は、変異を含む遺伝子産物であり、該遺伝子産物は、Ｋ５、Ｋ１４、Ｋ１、Ｋ１０、Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、Ｋ−Ｒａｓ、ＮＦ−ｋＢ、Ａｋｔ、Ｂ−ｒａｆ、ＥＲＫ、Ｍｅｋ１、Ｍｅｋ２およびｍ−Ｔｏｒを含むが、これらに限定されない遺伝子により発現する。
【０１２６】
幾つかの実施形態において、本開示の組成物は、ＵＶ損傷および早老を含むが、これらに限定されない老化による疾患を軽減するために投与される。幾つかの態様において、投与された組成物により標的にされる遺伝子産物は、マトリックスメタロプロテアーゼ−１およびプロジェリンを含むが、これらに限定されない。
【０１２７】
さらなる実施形態において、本開示の組成物は、アトピー性皮膚炎および乾癬を含むが、これらに限定されない炎症性疾患を軽減するために投与される。幾つかの態様において、投与された組成物により標的にされる遺伝子産物は、インターロイキン−２３を含むが、これに限定されない。種々の態様において、投与された組成物により標的にされる遺伝子産物は、ＩＬ１−ａ、ＩＬ１−β、ＩＬ６、ＴＮＦ−ａ、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、ＩＦＮ−γ、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ＴＧＦ−β、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−８を含むが、これらに限定されない。
【０１２８】
またさらなる実施形態において、本開示の組成物は、感染を軽減するために投与される。幾つかの態様において、感染はウイルス感染である。幾つかの態様において、感染は、本明細書に開示される細菌感染である。感染はウイルス感染である幾つかの態様において、ウイルス感染は疣贅をもたらすと考えられる。これらの態様において、投与された組成物により標的にされる遺伝子産物は、Ｅ６／Ｅ７を含むが、これに限定されない。
【０１２９】
幾つかの実施形態において、本開示の組成物は、脂漏性角化症、表皮母斑、および色素性母斑を含むが、これらに限定されない美容上の変形を軽減するために投与される。幾つかの態様において、投与された組成物により標的にされる遺伝子産物は、変異を含む遺伝子産物であり、該遺伝子産物は、ＦＧＦＲ３、Ｋ１０、およびＢ−Ｒａｆを含むが、これらに限定されない遺伝子により発現する。
【０１３０】
ビヒクル
幾つかの実施形態において、本開示のＯＮ−ＮＰ組成物および方法はビヒクルを含む。本明細書に使用される、「ビヒクル」とは、オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子が関連する塩基化合物である。
【０１３１】
本開示の組成物および方法に有用なビヒクルは、当該分野の当業者に公知であり、軟膏、クリーム、ローション、ゲル、泡状物、緩衝液、または水を含むが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、ビヒクルは、角質層への浸透を強化する、サリチル酸、α−ヒドロキシ酸、または尿素を含むが、これらに限定されない、１つ以上の追加物質を含む。
【０１３２】
種々の態様において、本開示の組成物および方法の使用に意図されるビヒクルは、Ａｑｕａｐｈｏｒ（登録商標）治癒軟膏、Ａ＋Ｄ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、グリセロール、鉱物油、バセリン集中ケアクリーム（鉱物油およびグリセリンを含む）、石油ゼリー、ＤＭＬ（ワセリン、グリセリン、およびＰＥＧ２０を含む）、ＤＭＬ（ワセリン、グリセリン、およびＰＥＧ１００を含む）、Ｅｕｃｅｒｉｎ保湿クリーム、セタフィル（ワセリン、グリセロール、およびＰＥＧ３０を含む）、セタフィルＣｅｒａＶｅ（ワセリンおよびグリセリンを含む）、ＣｅｒａＶｅ（グリセリン、ＥＤＴＡ、およびコレステロールを含む）、Ｊｅｒｇｅｎｓ（ワセリン、グリセリン、および鉱物油を含む）、およびＮｉｖｅａ（ワセリン、グリセリン、および鉱物油を含む）を含むが、これらに限定されない。当業者は、上記のリストから、追加のビヒクルは、本開示の組成物および方法に有用であることを理解するであろう。
【０１３３】
本明細書に使用される、軟膏は油中水型の製剤である。本明細書に使用される、クリームは水中油型の製剤である。一般に、ローションは、クリームまたは軟膏より水分が多く、ゲルはアルコールを含み、泡状物は気泡を液体中に閉じ込めることにより形成される物質である。これらの用語は、当業者に理解される。
【０１３４】
ナノ粒子
それに結合されるポリヌクレオチドを有するように機能化されるナノ粒子を提供する。ナノ粒子の大きさ、形状、および化学組成は、得られるポリヌクレオチド機能化ナノ粒子の特性の一因となる。これらの特性は、例えば、光学特性、光電子特性、電気化学特性、電子特性、種々の溶液における安定性、磁気特性、および細孔およびチャネルの大きさの変化を含む。異なる大きさ、形状、および／または化学組成を有するナノ粒子の混合物、ならびに均一な大きさ、形状、および化学組成を有するナノ粒子の使用、したがって、特性の混合が意図される。適切な粒子の例としては、その開示が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，２３８，４７２号および国際公開第ＷＯ２００３／０８５３９号に記載されるもの等、集合粒子、等方性粒子（球形粒子等）、異方性粒子（非球形桿体、四面体、および／または角柱等）、およびコア−シェル粒子を含むが、これらに限定されない。
【０１３５】
一実施形態において、ナノ粒子は金属性であり、種々の態様において、ナノ粒子はコロイド性金属である。よって、種々の実施形態において、本発明のナノ粒子は、金属（例えば、銀、金、白金、アルミニウム、パラジウム、銅、コバルト、インジウム、ニッケル、またはナノ粒子形成に受け入れられる任意の他の金属を含むが、これらに限定されない）、半導体（例えば、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、およびＣｄＳまたはＺｎＳでコーティングされるＣｄＳｅを含むが、これらに限定されない）、および磁性（例えば、強磁性）コロイド性物質が挙げられる。
【０１３６】
また、米国特許公開第２００３／０１４７９６６号に記載されるように、本発明のナノ粒子は、商業的に入手可能なもの、ならびに合成されるもの、例えば、溶液中の進行性核形成から（例えば、コロイド反応により）、またはスパッタ蒸着法等の種々の物理および化学蒸着プロセスにより生成されるものを含む。例えば、ＨａＶａｓｈｉ，Ｖａｃ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ａ５（４）：１３７５−８４（１９８７）、Ｈａｙａｓｈｉ，Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｔｏｄａｙ，４４−６０（１９８７）、ＭＲＳ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，Ｊａｎｕａｒｙ １９９０，１６−４７を参照のこと。米国特許公開第２００３／０１４７９６６号にさらに記載されるように、意図されるナノ粒子は、代替的に、当該分野に公知の方法を使用して、ＨＡｕＣｌ４およびクエン酸還元剤を使用して生成される。例えば、Ｍａｒｉｎａｋｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．１１：３４−３７（１９９９）、Ｍａｒｉｎａｋｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．１０：１２１４−１９（１９９８）、Ｅｎｕｓｔｕｎ ＆ Ｔｕｒｋｅｖｉｃｈ， Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５： ３３１７（１９６３）を参照のこと。
【０１３７】
幾つかの実施形態において、ナノ粒子の大きさは、皮膚に浸透するその能力に関連する。一般に、ナノ粒子の直径が小さいほど、皮膚の中にまたは皮膚を通してより深く浸透する。一態様において、ナノ粒子の直径は、ＯＮ−ＮＰが皮膚を横断し、血液に進入することを可能にし、ＯＮ−ＮＰの全身送達を達成する。別の態様において、ナノ粒子の直径は、ＯＮ−ＮＰが皮膚を横断することを防止し、ＯＮ−ＮＰは皮膚の表面で保持される。種々の態様において、ナノ粒子の大きさは、投与されるＯＮ−ＮＰの所望の浸透深度を達成するように調節することができることを、当業者は理解する。
【０１３８】
ナノ粒子は、大きさが、平均直径約１ｎｍ〜約２５０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約２４０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約２３０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約２２０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約２１０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約２００ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約１９０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約１８０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約１７０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約１６０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約１５０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約１４０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約１３０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約１２０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約１１０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約１００ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約９０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約８０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約７０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約６０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約５０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約４０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約３０ｎｍ、または平均直径約１ｎｍ〜約２０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約１０ｎｍの範囲であり得る。他の態様において、ナノ粒子の大きさは、約５ｎｍ〜約１５０ｎｍ（平均直径）、約５〜約５０ｎｍ、約１０〜約３０ｎｍ、約１０〜１５０ｎｍ、約１０〜約１００ｎｍ、または約１０〜約５０ｎｍである。ナノ粒子の大きさは、約５ｎｍ〜約１５０ｎｍ（平均直径）、約３０〜約１００ｎｍ、約４０〜約８０ｎｍである。本方法に使用されるナノ粒子の大きさは、それらの特定の使用または用途に応じて変動する。大きさの変動は、ナノ粒子の特定の物理的特徴、例えば、本明細書に記載されるように機能化することができる、光学特性または表面積の量を最適化するように有利に使用される。
【０１３９】
オリゴヌクレオチド
本明細書に使用される、「ヌクレオチド」という用語、またはその複数形は、本明細書に記載されるように、修飾形態と代替可能であり、そうでなければ当該分野において公知である。特定の場合において、当該技術は、自然に生じるヌクレオチドを包含する「核酸塩基」という用語、および修飾ヌクレオチドを含む非天然ヌクレオチドを使用する。よって、ヌクレオチドまたは核酸塩基は、Ｂｅｎｎｅｒらの米国特許第５，４３２，２７２号およびＳｕｓａｎ Ｍ．Ｆｒｅｉｅｒ ａｎｄ Ｋａｒｌ−Ｈｅｉｎｚ Ａｌｔｍａｎｎ，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．２５：ｐｐ４４２９−４４４３に記載される、自然に生じる核酸塩基アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）を意味する。非天然核酸塩基は、例えば、キサンチン、ジアミノプリン、８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニン、７−デアザキサンチン、７−デアザグアニン、Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン、Ｎ’，Ｎ’−エタノ−２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン（ｍＣ）、５−（Ｃ３-Ｃ６）−アルキニル−シトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、プソイドイソシトシン、２−ヒドロキシ−５−メチル−４−トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシン、および「非天然」核酸塩基を含むが、これらに限定されない。「核酸塩基」という用語はまた、既知のプリンおよびピリミジン複素環だけでなく、複素環式類似体およびその互変異性体も含む。さらなる自然に生じる、および非天然の核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号（Ｍｅｒｉｇａｎ，ｅｔ ａｌ．）、Ｃｈａｐｔｅｒ １５ ｂｙ Ｓａｎｇｈｖｉ，ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｄ． Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ ａｎｄ Ｂ．Ｌｅｂｌｅｕ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３、ｉｎ Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，３０：６１３−７２２（特に、ページ６２２および６２３、およびＣｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｊ．Ｉ．Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０，ページ８５８−８５９，Ｃｏｏｋ，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ １９９１，６，５８５−６０７を参照し、それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるものを含む。種々の態様において、ポリヌクレオチドは、核酸塩基のように機能できる複素環式化合物等の化合物を含む、非天然ヌクレオチドの分類である、１つ以上の「ヌクレオシド塩基」または「塩基部」も含み、最も伝統的な意味でヌクレオシド塩基ではないが、ヌクレオシド塩基として機能する、特定の「普遍的塩基」を含む。普遍的塩基は、３−ニトロピロール、任意に、置換インドール（例えば、５−ニトロインドール）、および任意に、置換ヒポキサンチンを含む。他の望ましい普遍的塩基は、ピロール、ジアゾール、またはトリアゾール誘導体を含み、当該分野に公知のこれらの普遍的塩基を含む。
【０１４０】
修飾されたヌクレオチドは、第ＥＰ１ ０７２ ６７９号および国際公開ＷＯ９７／１２８９６号に記載されており、それらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。修飾された核酸塩基は、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチルおよび他のアデニンとグアニンのアルキル誘導体、２−プロピルおよび他のアデニンとグアニンのアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシンならびに他のピリミジン塩基のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルならびに他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルならびに他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンを含むが、これらに限定されない。さらなる修飾された塩基は、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）等の三環ピリミジン、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）等のＧ−クランプ、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）を含む。修飾された塩基は、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環、例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン、および２−ピリドンと置換されるものも含んでもよい。さらなる核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されるもの、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ページ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，３０：６１３に開示されるもの、およびｔｈｏｓｅ ｄｉｓｃｌｏｓｅｄ ｂｙ Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ１５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ． ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３に開示されるものを含む。これらの塩基の幾つかは、結合親和性を増大するのに有用であり、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンを含み、これは、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンを含む。５−メチルシトシン置換は、０．６〜１．２℃で核酸二重鎖安定性を増加することを示しており、特定の態様において、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされる。それらの開示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第３，６８７，８０８号、米国特許第４，８４５，２０５号、第５，１３０，３０２号、第５，１３４，０６６号、第５，１７５，２７３号、第５，３６７，０６６号、第５，４３２，２７２号、第５，４５７，１８７号、第５，４５９，２５５号、第５，４８４，９０８号、第５，５０２，１７７号、第５，５２５，７１１号、第５，５５２，５４０号、第５，５８７，４６９号、第５，５９４，１２１，第５，５９６，０９１号、第５，６１４，６１７号、第５，６４５，９８５号、第５，８３０，６５３号、第５，７６３，５８８号、第６，００５，０９６号、第５，７５０，６９２号、および第５，６８１，９４１号を参照のこと。
【０１４１】
所定の配列のポリヌクレオチドを作製する方法は周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．１９８９）およびＦ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（ｅｄ．）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，１ｓｔ Ｅｄ．（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）を参照のこと。固相合成は、ポリリボヌクレオチドおよびポリデオキシリボヌクレオチドの両方に好適である（周知のＤＮＡ合成方法も、ＲＮＡ合成に有用である）。ポリリボヌクレオチドは、酵素的に調製することもできる。非天然核酸塩基は、ポリヌクレオチドの中に組み込むこともできる。例えば、米国特許第７，２２３，８３３号、Ｋａｔｚ， Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７４：２２３８（１９５１）、Ｙａｍａｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８３：２５９９（１９６１）、Ｋｏｓｔｕｒｋｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：３９４９（１９７４）、Ｔｈｏｍａｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７６：６０３２（１９５４）、Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２７：７４−７５（２００５）、およびＺｉｍｍｅｒｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２４：１３６８４−１３６８５（２００２）を参照のこと。
【０１４２】
ポリヌクレオチドで機能化される、またはその修飾形態であるナノ粒子が提供され、本明細書に定義されるドメインは、一般に、長さが約５ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドのポリヌクレオチドを含む。より具体的には、ナノ粒子は、長さが約５〜約９０ヌクレオチド、長さが約５〜約８０ヌクレオチド、長さが約５〜約７０ヌクレオチド、長さが約５〜約６０ヌクレオチド、長さが約５〜約５０ヌクレオチド、長さが約５〜約４５ヌクレオチド、長さが約５〜約４０ヌクレオチド、長さが約５〜約３５ヌクレオチド、長さが約５〜約３０ヌクレオチド、長さが約５〜約２５ヌクレオチド、長さが約５〜約２０ヌクレオチド、長さが約５〜約１５ヌクレオチド、長さが約５〜約１０ヌクレオチド、およびポリヌクレオチドが所望の結果を達成することができる範囲において特に開示される大きさの長さの全ポリヌクレオチド中間体であるポリヌクレオチドで機能化される。したがって、長さが５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００またはそれ以上のヌクレオチドのポリヌクレオチドが意図される。
【０１４３】
幾つかの態様において、ナノ粒子が細胞によって取り込まれる効率に影響を及ぼすドメインをさらに含むオリゴヌクレオチドが、ナノ粒子と結合される、それに結合されるオリゴヌクレオチドを有するナノ粒子を提供する。したがって、ドメインは、効率を増加または低下させる。本明細書に使用される、「効率」とは、細胞における／細胞によるナノ粒子の取り込みの数または割合を指す。ナノ粒子の細胞への進入およびそこからの退出のプロセスは、動的なものであるため、効率は、多くのナノ粒子を取りこむことにより、または細胞に進入するそれらのナノ粒子を長期間保持することにより増加することができる。同様に、効率は、少ないナノ粒子を取りこむことにより、または細胞に進入するそれらのナノ粒子を短期間保持することにより低下させることができる。
【０１４４】
幾つかの態様において、ドメインは、オリゴヌクレオチドと隣接／共線的であり、ナノ粒子に対して近位に位置する。幾つかの態様において、ドメインは、オリゴヌクレオチドと隣接／共線的であり、ナノ粒子に対して遠位に位置する。「近位」および「遠位」という用語は、オリゴヌクレオチドの中間点に対する位置を指す。幾つかの態様において、ドメインは、オリゴヌクレオチド内の内部領域に位置する。さらなる態様において、ドメインは、ナノ粒子に結合される第２のオリゴヌクレオチド上に位置する。したがって、幾つかの実施形態において、ドメインは、オリゴヌクレオチドとは個別の実体として、ナノ粒子に結合されるように意図される。
【０１４５】
幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載される位置のいずれかに位置する、１つ以上のドメインを含むことをさらに意図する
【０１４６】
幾つかの実施形態において、ドメインは、細胞によるオリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子の取り込みの効率を増加させる。幾つかの態様において、ドメインは、チミジン残基（ポリＴ）またはウリジン残基（ポリＵ）の配列を含む。さらなる態様において、ポリＴまたはポリＵ配列は、２つのチミジンまたはウリジンを含む。種々の態様において、ポリＴまたはポリＵ配列は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、またはそれ以上のチミジンもしくはウリジン残基を含む。
【０１４７】
幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドおよびドメインで機能化されるナノ粒子は、同じオリゴヌクレオチドで機能化されるが、ドメインを欠損するナノ粒子より多大な効率で、細胞によって取り込まれることを意図する。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドおよびドメインで機能化されるナノ粒子は、同じオリゴヌクレオチドで機能化されるが、ドメインを欠損するナノ粒子より１％より効率的に細胞によって取り込まれる。種々の態様において、オリゴヌクレオチドおよびドメインで機能化されるナノ粒子は、同じオリゴヌクレオチドで機能化されるが、ドメインを欠損するナノ粒子より２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％，３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約２０倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍、約１００倍、またはそれ以上、より効率的に細胞によって取り込まれる。
【０１４８】
幾つかの実施形態において、ドメインは、細胞によるオリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子の取り込みの効率を低下させる。幾つかの態様において、ドメインは、２つのリン酸から成るリン酸重合体（Ｃ３残基）を含む。種々の態様において、Ｃ３残基は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、またはそれ以上のリン酸を含む。
【０１４９】
幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドおよびドメインで機能化されるナノ粒子は、同じオリゴヌクレオチドで機能化されるが、ドメインを欠損するナノ粒子より低い効率で、細胞により取り込まれることを意図する。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドおよびドメインで機能化されるナノ粒子は、同じオリゴヌクレオチドで機能化されるが、ドメインを欠損するナノ粒子より１％低い効率で細胞により取り込まれる。種々の態様において、オリゴヌクレオチドおよびドメインで機能化されるナノ粒子は、同じオリゴヌクレオチドで機能化されるが、ドメインを欠損するナノ粒子より２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％，３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約２０倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍、約１００倍、またはそれ以上、低い効率で細胞によって取り込まれる。
【０１５０】
ナノ粒子への結合について意図されるポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドから発現する遺伝子産物の発現を調節するものを含む。本開示により意図されるポリヌクレオチドは、以下で本明細書に定義される、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびその修飾された形態を含む。したがって、種々の態様において、標的ポリヌクレオチドとハイブリッド形成し、標的ヌクレオチドの転写または翻訳の低下を開始するポリヌクレオチド、二本鎖ポリヌクレオチドとハイブリッド形成し、転写を阻害する三重らせん形成ポリヌクレオチド、および標的ポリヌクレオチドとハイブリッド形成し、翻訳を阻害するリボザイムが意図される。
【０１５１】
種々の態様において、特定のポリヌクレオチドが標的にされる場合、単一の機能化オリゴヌクレオチド−ナノ粒子組成物は、同じ転写物の複数のコピーに結合する能力を有する。一態様において、同一ポリヌクレオチド、すなわち、各ポリヌクレオチドが同じ長さであり、同じ配列であるポリヌクレオチドで機能化されるナノ粒子を提供する。他の態様において、ナノ粒子は、同一でない２つ以上のポリヌクレオチド、すなわち、異なる長さ、および／または異なる配列を有するという点で、結合したポリヌクレオチドの少なくとも１つが、少なくとも１つの他の結合したポリヌクレオチドと異なるポリヌクレオチドで機能化される。異なるポリヌクレオチドがナノ粒子に結合される態様において、これらの異なるポリヌクレオチドは、同じ単一標的ポリヌクレオチドだが、異なる位置で結合するか、または異なる遺伝子産物をコードする異なる標的ポリヌクレオチドに結合する。
【０１５２】
修飾されたオリゴヌクレオチド
上述のように、ナノ粒子を機能化するために、修飾されたオリゴヌクレオチドが意図される。種々の態様において、ナノ粒子上で機能化されたオリゴヌクレオチドは、完全に修飾されるか、部分的に修飾される。よって、種々の態様において、１つ以上もしくは全ての糖類および／またはポリヌクレオチドにおけるヌクレオチド部の１つ以上もしくは全てのヌクレオチド間結合は、「非天然」群と置換される。
【０１５３】
一態様において、本実施形態は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を意図する。ＰＮＡ化合物において、ポリヌクレオチドの糖骨格は、骨格を含有するアミドと置換される。それらの開示が参照により本明細書に組み込まれる、例えば、米国特許第５，５３９，０８２号、第５，７１４，３３１号、および第５，７１９，２６２号ならびにＮｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００を参照のこと。
【０１５４】
開示されるポリヌクレオチドについて意図されるヌクレオチドと非天然ヌクレオチドとの間の他の結合は、米国特許第４，９８１，９５７号、第５，１１８，８００号、第５，３１９，０８０号、第５，３５９，０４４号、第５，３９３，８７８号、第５，４４６，１３７号、第５，４６６，７８６号、第５，５１４，７８５号、第５，５１９，１３４号、第５，５６７，８１１号、第５，５７６，４２７号、第５，５９１，７２２号、第５，５９７，９０９号、第５，６１０，３００号、第５，６２７，０５３号、第５，６３９，８７３号、第５，６４６，２６５号、第５，６５８，８７３号、第５，６７０，６３３号、第５，７９２，７４７号、および第５，７００，９２０号、米国特許公開第２００４０２１９５６５号、国際特許公開第ＷＯ９８／３９３５２号および第ＷＯ９９／１４２２６号、Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ ｅｔ． ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５：３４３−３５５（１９９５）ならびにＳｕｓａｎ Ｍ．Ｆｒｅｉｅｒ ａｎｄ Ｋａｒｌ−Ｈｅｉｎｚ Ａｌｔｍａｎｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５：４４２９−４４４３（１９９７）に記載されているものを含み、それらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５５】
オリゴヌクレオチドの特定の例としては、修飾された骨格または非天然ヌクレオシド間結合を含有するものが挙げられる。修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドは、骨格にリン原子を保持するもの、および骨格にリン原子を持たないものを含む。それらのヌクレオシド間骨格にリン原子を持たない修飾されたオリゴヌクレオチドは、「オリゴヌクレオチド」の意味内であるとみなされる。
【０１５６】
リン原子を含有する修飾されたオリゴヌクレオチド骨格は、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネート、およびキラルホスホネートを含む他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、正常３’−５’結合を有するセレノホスフェートおよびボラノホスフェート、それらの２’−５’結合類似体、ならびに１つ以上のヌクレオチド間結合が３’〜３’、５’〜５’または２’〜２’結合である反転極性を有するものを含む。３’末端ヌクレオチド間結合で単一３’〜３’結合を含む反転極性を有するポリヌクレオチド、すなわち、非塩基であってもよい（ヌクレオチドが欠損しているか、またはその位置にヒドロキシル基を有する）単一の反転ヌクレオシド残基が意図される。塩類、混合塩、および遊離酸形態も意図される。
【０１５７】
上記のリン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許は、米国特許第３，６８７，８０８号、第４，４６９，８６３号、第４，４７６，３０１号、第５，０２３，２４３号、第５，１７７，１９６号、第５，１８８，８９７号、第５，２６４，４２３号、第５，２７６，０１９号、第５，２７８，３０２号、第５，２８６，７１７号、第５，３２１，１３１号、第５，３９９，６７６号、第５，４０５，９３９号、第５，４５３，４９６号、第５，４５５，２３３号、第５，４６６，６７７号、第５，４７６，９２５号、第５，５１９，１２６号、第５，５３６，８２１号、第５，５４１，３０６号、第５，５５０，１１１号、第５，５６３，２５３号、第５，５７１，７９９号、第５，５８７，３６１号、第５，１９４，５９９号、第５，５６５，５５５号、第５，５２７，８９９号、第５，７２１，２１８号、第５，６７２，６９７号および第５，６２５，０５０号を含み、それらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５８】
リン原子を含まない修飾されたポリヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間結合により形成される骨格を有する。これらは、モルホリノ結合、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、リボアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、スルホネートおよびスルホンアミド骨格、アミド骨格、および混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成要素を有する他のものを有するものを含む。また他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格を用いて提供され、オリゴヌクレオシドはヘテロ原子を用いて提供され、米国特許第５，４８９，６７７号および第５，６０２，２４０号に記載される、-ＣＨ２-ＮＨ-Ｏ-ＣＨ２-、-ＣＨ２-Ｎ（ＣＨ３）-Ｏ-ＣＨ２-、-ＣＨ２-Ｏ-Ｎ（ＣＨ３）-ＣＨ２-、-ＣＨ２-Ｎ（ＣＨ３）-Ｎ（ＣＨ３）-ＣＨ２-および-Ｏ-Ｎ（ＣＨ３）-ＣＨ２-ＣＨ２-を含む。例えば、それらの開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，０３４，５０６号、第５，１６６，３１５号、第５，１８５，４４４号、第５，２１４，１３４号、第５，２１６，１４１号、第５，２３５，０３３号、第５，２６４，５６２号、第５，２６４，５６４号、第５，４０５，９３８号、第５，４３４，２５７号、第５，４６６，６７７号、第５，４７０，９６７号、第５，４８９，６７７号、第５，５４１，３０７号、第５，５６１，２２５号、第５，５９６，０８６号、第５，６０２，２４０号、第５，６１０，２８９号、第５，６０２，２４０号、第５，６０８，０４６号、第５，６１０，２８９号、第５，６１８，７０４号、第５，６２３，０７０号、第５，６６３，３１２号、第５，６３３，３６０号、第５，６７７，４３７号、第５，７９２，６０８号、第５，６４６，２６９号および第５，６７７，４３９号を参照のこと。
【０１５９】
種々の形態において、オリゴの２つの連続したモノマー間の結合は、-ＣＨ２、--Ｏ-、-Ｓ-、-ＮＲＨ-、＞Ｃ＝Ｏ、＞Ｃ＝ＮＲＨ、＞Ｃ＝Ｓ、-Ｓｉ（Ｒ”）２-、-ＳＯ-、-Ｓ（Ｏ）２-、-Ｐ（Ｏ）２-、-ＰＯ（ＢＨ３）-、-Ｐ（Ｏ，Ｓ）-、-Ｐ（Ｓ）２-、-ＰＯ（Ｒ”）-、-ＰＯ（ＯＣＨ３）-、および-ＰＯ（ＮＨＲＨ）-から選択される、２〜４、望ましくは、３基／原子から成り、ＲＨは、水素およびＣ１−４−アルキルから選択され、Ｒ”は、Ｃ１−６−アルキルおよびフェニルから選択される。そのような結合の例示的な例は、-ＣＨ２-ＣＨ２-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＣＯ-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＣＨＯＨ-ＣＨ２-、-Ｏ-ＣＨ２-Ｏ-、-Ｏ-ＣＨ２-ＣＨ２-、-Ｏ-ＣＨ２-ＣＨ＝（後続モノマーへの結合として使用される時、Ｒ５を含む）、-ＣＨ２-ＣＨ２-Ｏ-、-ＮＲＨ-ＣＨ２-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＣＨ２-ＮＲＨ-、-ＣＨ２-ＮＲＨ-ＣＨ２-−、-Ｏ-ＣＨ２-ＣＨ２-ＮＲＨ-、-ＮＲＨ-ＣＯ-Ｏ-、-ＮＲＨ-ＣＯ-ＮＲＨ-、-ＮＲＨ-ＣＳ-ＮＲＨ-、-ＮＲＨ-Ｃ（＝ＮＲＨ）-ＮＲＨ-、-ＮＲＨ-ＣＯ-ＣＨ２-ＮＲＨ-Ｏ-ＣＯ-Ｏ-、-Ｏ-ＣＯ-ＣＨ２-Ｏ-、-Ｏ-ＣＨ２-ＣＯ-Ｏ-、-ＣＨ２-ＣＯ-ＮＲＨ-、-Ｏ-ＣＯ-ＮＲＨ-、-ＮＲＨ-ＣＯ-ＣＨ２-、-Ｏ-ＣＨ２-ＣＯ-ＮＲＨ-、-Ｏ-ＣＨ２-ＣＨ２-ＮＲＨ-、-ＣＨ＝Ｎ-Ｏ-、-ＣＨ２-ＮＲＨ-Ｏ-、-ＣＨ２-Ｏ-Ｎ＝（後続モノマーへの結合として使用される時、Ｒ５を含む）、-ＣＨ２-Ｏ-ＮＲＨ-、-ＣＯ-ＮＲＨ-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＮＲＨ-Ｏ-、-ＣＨ２-ＮＲＨ-ＣＯ-、-Ｏ-ＮＲＨ-ＣＨ２-、-Ｏ-ＮＲＨ、-Ｏ-ＣＨ２-Ｓ-、-Ｓ-ＣＨ２-Ｏ-、-ＣＨ２-ＣＨ２-Ｓ-、-Ｏ-ＣＨ２-ＣＨ２-Ｓ-、-Ｓ-ＣＨ２-ＣＨ＝（後続モノマーへの結合として使用される時、Ｒ５を含む）、-Ｓ-ＣＨ２-ＣＨ２-、-Ｓ-ＣＨ２-ＣＨ２−Ｏ-、-Ｓ-ＣＨ２-ＣＨ２-Ｓ-、-ＣＨ２-Ｓ-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＳＯ-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＳＯ２-ＣＨ２-、-Ｏ-ＳＯ-Ｏ-、-Ｏ-Ｓ（Ｏ）２-Ｏ-、-Ｏ-Ｓ（Ｏ）２-ＣＨ２-、-Ｏ-Ｓ（Ｏ）２-ＮＲＨ-、-ＮＲＨ-Ｓ（Ｏ）２-ＣＨ２-；-Ｏ-Ｓ（Ｏ）２-ＣＨ２-、-Ｏ-Ｐ（Ｏ）２-Ｏ-、-Ｏ-Ｐ（Ｏ，Ｓ）-Ｏ-、-Ｏ-Ｐ（Ｓ）２-Ｏ-、-Ｓ-Ｐ（Ｏ）２-Ｏ-、-Ｓ-Ｐ（Ｏ，Ｓ）-Ｏ-、-Ｓ-Ｐ（Ｓ）２-Ｏ-、-Ｏ-Ｐ（Ｏ）２-Ｓ-、-Ｏ-Ｐ（Ｏ，Ｓ）-Ｓ-、-Ｏ-Ｐ（Ｓ）２-Ｓ-、-Ｓ-Ｐ（Ｏ）２-Ｓ-、-Ｓ-Ｐ（Ｏ，Ｓ）-Ｓ-、-Ｓ-Ｐ（Ｓ）２-Ｓ-、-Ｏ-ＰＯ（Ｒ”）-Ｏ-、-Ｏ-ＰＯ（ＯＣＨ３）-Ｏ-、-Ｏ-ＰＯ（Ｏ ＣＨ２ＣＨ３）-Ｏ-、-Ｏ-ＰＯ（Ｏ ＣＨ２ＣＨ２Ｓ-Ｒ）-Ｏ-、-Ｏ-ＰＯ（ＢＨ３）-Ｏ-、-Ｏ-ＰＯ（ＮＨＲＮ）-Ｏ-、-Ｏ-Ｐ（Ｏ）２-ＮＲＨ Ｈ-、-ＮＲＨ-Ｐ（Ｏ）２-Ｏ-、-Ｏ-Ｐ（Ｏ，ＮＲＨ）-Ｏ-、-ＣＨ２-Ｐ（Ｏ）２-Ｏ-、-Ｏ-Ｐ（Ｏ）２-ＣＨ２-、および-Ｏ-Ｓｉ（Ｒ”）２-Ｏ-であり；その中でも、-ＣＨ２-ＣＯ-ＮＲＨ-、-ＣＨ２-ＮＲＨ-Ｏ-、-Ｓ-ＣＨ２-Ｏ-、-Ｏ-Ｐ（Ｏ）２-Ｏ-Ｏ-Ｐ（−Ｏ，Ｓ）-Ｏ-、-Ｏ-Ｐ（Ｓ）２-Ｏ-、-ＮＲＨ Ｐ（Ｏ）２-Ｏ-、-Ｏ-Ｐ（Ｏ，ＮＲＨ）-Ｏ-、-Ｏ-ＰＯ（Ｒ”）-Ｏ-、-Ｏ-ＰＯ（ＣＨ３）-Ｏ-、および-Ｏ-ＰＯ（ＮＨＲＮ）-Ｏ-が意図され、ＲＨは、水素およびＣ１−４−アルキルから選択され、Ｒ”は、Ｃ１−６−アルキルおよびフェニルから選択される。さらなる例示的な例は、Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ ｅｔ． ａｌ．，１９９５，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５：３４３−３５５およびＳｕｓａｎ Ｍ．Ｆｒｅｉｅｒ ａｎｄ Ｋａｒｌ−Ｈｅｉｎｚ Ａｌｔｍａｎｎ，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ ２５：ｐｐ４４２９−４４４３に記載される。
【０１６０】
またポリヌクレオチドの他の修飾された形態は、米国特許出願第２００４０２１９５６５号に詳細に記載されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１６１】
修飾されたポリヌクレオチドは、１つ以上の置換糖部分も含有してもよい。特定の態様において、ポリヌクレオチドは、２’位置で、次の：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、ＳもしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルの１つを含み、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換された、または非置換されたＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであってもよい。他の実施形態は、ｎおよびｍが１〜約１０である時、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２を含む。他のポリヌクレオチドは、２’位置で、以下の１つを含む：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、介入物、ポリヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、またはポリヌクレオチドの薬物動力特性を改善するための基、および類似する特性を有する他の置換基。一態様において、修飾は２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られる）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，７８：４８６−５０４）、すなわち、アルコキシアルコキシ基を含む。他の修飾は、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られる、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該分野で、２’−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち、２’−Ｏ-ＣＨ２-Ｏ-ＣＨ２-Ｎ（ＣＨ３）２を含む。
【０１６２】
また他の修飾は、２’−メトキシ（２’−Ｏ-ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’−アリル（２’−ＣＨ２-ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ-ＣＨ２-ＣＨ＝ＣＨ２）、および２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。２’−修飾は、アラビノ（上）位置またはリボ（下）位置であってもよい。一態様において、２’−アラビノ修飾は２’−Ｆである。同様の修飾は、ポリヌクレオチド上の他の位置、例えば、３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位置、または２’−５’結合ポリヌクレオチドおよび５’末端ヌクレオチドの５’位置でも行われ得る。ポリヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分等の糖模擬体も有してもよい。例えば、それらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第４，９８１，９５７号、第５，１１８，８００号、第５，３１９，０８０号、第５，３５９，０４４号、第５，３９３，８７８号、第５，４４６，１３７号、第５，４６６，７８６号、第５，５１４，７８５号、第５，５１９，１３４号、第５，５６７，８１１号、第５，５７６，４２７号、第５，５９１，７２２号、第５，５９７，９０９号、第５，６１０，３００号、第５，６２７，０５３号、第５，６３９，８７３号、第５，６４６，２６５号、第５，６５８，８７３号、第５，６７０，６３３号、第５，７９２，７４７号、および第５，７００，９２０号を参照のこと。
【０１６３】
一態様において、糖修飾は、２’−ヒドロキシル基が糖環の３’または４’炭素原子に結合され、これによって二環式糖部分を形成する、ロックされた核酸（ＬＮＡ）を含む。特定の態様において、結合は、２’酸素原子と４’炭素原子を架橋するメチレン（-ＣＨ２-）ｎ基であり、ｎは、１または２である。ＬＮＡおよびその調製物は、国際公開第ＷＯ９８／３９３５２号および第ＷＯ９９／１４２２６号に記載されており、それらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６４】
ポリペプチド
本明細書に使用される、「ポリペプチド」という用語は、天然由来の、合成生成された、または組み換えにより生成される、ペプチド、タンパク質、アミノ酸の重合体、ホルモン、ウイルス、および抗体を指す。
【０１６５】
幾つかの実施形態において、本開示の組成物は、標的ポリペプチドの活性を調節する。したがって、種々の態様において、ナノ粒子は、アプタマーで機能化される。本明細書に使用される、「アプタマー」とは、特定の標的分子に結合する、オリゴヌクレオチドまたはペプチド分子である。よって、幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子は、標的ポリペプチドに結合し、その活性を調節する。
【０１６６】
一態様において、標的ポリペプチドの活性は、オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子と接触しない細胞と比較して、約５％阻害される。種々の態様において、標的ポリペプチドの発現は、オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子と接触しない細胞と比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、９９％、またはそれ以上阻害される。つまり、提供される方法は、標的ポリペプチドの活性の任意の阻害の程度をもたらすものを包含する。
【０１６７】
面密度
ＮＰの表面上のオリゴヌクレオチドの密度は、所与の用途のために調節することができる。例えば、Ｓｅｆｅｒｏｓらの研究［Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．，９（１）：３０８-３１１，２００９］は、ＮＰ表面上のＤＮＡの密度が、ヌクレアーゼにより分解される速度に影響を及ぼしたことを例証した。本密度修飾は、例えば、薬物およびＯＮ−ＮＰが細胞に進入し、ＯＮが制御された速度で分解される、ＮＰベースの薬物送達系で使用されるが、これに限定されない。
【０１６８】
本明細書に提供されるナノ粒子は、ナノ粒子の表面上に圧縮密度のポリヌクレオチドを有し、種々の態様において、ナノ粒子間および単一ナノ粒子上のポリヌクレオチド鎖間の協同作用をもたらすのに十分である。別の態様において、ナノ粒子間の協同作用は、ポリヌクレオチドのヌクレアーゼ分解への耐性を増大する。さらに別の態様において、細胞によるナノ粒子の取り込みは、ナノ粒子と結合するポリヌクレオチドの密度により影響を受ける。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／６５３６６号に記載されるように、ナノ粒子の表面上の高密度のポリヌクレオチドは、細胞によるナノ粒子の取り込みの増加と関連する。
【０１６９】
幾つかの実施形態において、ＮＰの表面上のオリゴヌクレオチドの面密度は、皮膚に浸透するその能力に関連する。一般に、ＯＮ−ＮＰの表面上の面密度が高いほど、皮膚の中に、または皮膚を通してより深く浸透する。幾つかの態様において、面密度は、ＯＮ−ＮＰが皮膚を横断し、血液に入ることを可能にし、ＯＮ−ＮＰの全身送達を達成する。別の態様において、面密度は、ＯＮ−ＮＰが皮膚を横断することを防止し、ＯＮ−ＮＰは皮膚の表面で保持される。種々の態様において、ナノ粒子の表面上のオリゴヌクレオチドの面密度は、投与されるＯＮ−ＮＰの所望の浸透深度を達成するように調節することができることを、当業者は理解する。
【０１７０】
ナノ粒子とポリヌクレオチドの所望の組み合わせについて、ナノ粒子を安定させるのに適した面密度、およびそれを得るために必要な条件は、経験的に判断することができる。一般に、少なくとも２ピコモル／ｃｍ２の面密度が、安定したナノ粒子−オリゴヌクレオチド組成物を提供するのに適している。幾つかの態様において、面密度は、少なくとも１５ピコモル／ｃｍ２である。ポリヌクレオチオが、少なくとも２ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも３ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも４ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも６ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも７ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも８ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも９ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも１０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約２０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約３０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約３５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約４０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約４５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約５５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約６０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約６５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約７０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約７５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約８０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約８５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約９０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約９５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１７５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約２００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約２５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約３００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約３５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約４００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約４５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約５００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約５５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約６００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約６５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約７００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約７５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約８００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約８５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約９００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約９５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約約１０００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、またはそれ以上の面密度でナノ粒子に結合される方法も提供する。
【０１７１】
ナノ粒子へのオリゴヌクレオチド結合
本方法に使用するために意図されるオリゴヌクレオチドは、任意の手段によりナノ粒子に結合されるものを含む。オリゴヌクレオチドがナノ粒子に結合される手段に関わらず、種々の態様における結合は、５’結合、３’結合、内部結合の一種、またはそれらの結合の任意の組み合わせを通してもたらされる。
【０１７２】
結合方法は、当業者に公知であり、米国公開第２００９／０２０９６２９号に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＲＮＡをナノ粒子に結合する方法は、一般に、第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／６５８２２号に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。したがって、幾つかの実施形態において、本開示は、ナノ粒子に結合されるポリヌクレオチドは、ＲＮＡであることを意図する。
【０１７３】
幾つかの態様において、ドメインをさらに含むオリゴヌクレオチドが、ナノ粒子と結合される、それに結合されるオリゴヌクレオチドを有するナノ粒子を提供する。幾つかの態様において、ドメインはポリチミジン配列である。他の態様において、ドメインは、リン酸重合体（Ｃ３残基）である。
【０１７４】
幾つかの実施形態において、ナノ粒子に結合されるオリゴヌクレオチドはＤＮＡである。ＤＮＡがナノ粒子に結合される時、ナノ粒子に結合されるＤＮＡオリゴヌクレオチドおよび標的ポリヌクレオチドのハイブリッド形成が生じるように、ＤＮＡはポリヌクレオチドの標的配列に十分に相補的である配列から成り、これによって、標的ポリヌクレオチドをナノ粒子に結合する。二本鎖分子が、標的ポリヌクレオチドの単一鎖配列とハイブリッド形成する単鎖配列も含む限り、種々の態様におけるＤＮＡは、一本鎖または二本鎖である。幾つかの態様において、ナノ粒子上で機能化されたオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成は、二本鎖標的ポリヌクレオチドと三重鎖構造を形成することができる。別の態様において、三重鎖構造は、ナノ粒子上で機能化された二本鎖オリゴヌクレオチドの単鎖標的ポリヌクレオチドとのハイブリッド形成により形成することができる。
【０１７５】
スペーサー
特定の態様において、オリゴヌクレオチドおよびドメインがスペーサーを介してナノ粒子に結合されるものを含む、機能化ナノ粒子が意図される。本明細書に記載される、「スペーサー」とは、遺伝子発現自体の調節に関与しないが、複数のコピーにおいてナノ粒子に結合される時、ナノ粒子と機能オリゴヌクレオチドとの間の距離を増加するように、または個別のオリゴヌクレオチド間の距離を増加するように機能する部分を意味する。よって、オリゴヌクレオチドが同じ配列を有するか、または異なる配列を有するかに関わらず、スペーサーは、直列型で個別のオリゴヌクレオチド間に位置するように意図される。ドメインがナノ粒子に直接結合される本発明の態様において、ドメインは、任意に、スペーサーを介してナノ粒子に機能化される。直列型のドメインがナノ粒子に機能化される態様において、スペーサーは、任意に、直列型構造のドメイン単位の幾つかまたは全ての間に存在する。一態様において、スペーサーは、存在する場合、有機部分である。別の態様において、スペーサーは重合体であり、水溶性重合体、核酸、ポリペプチド、オリゴ糖、炭水化物、脂質、エチルグリコール、またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【０１７６】
特定の態様において、ポリヌクレオチドは、ナノ粒子に共有結合的に結合されるスペーサーを有する。これらのポリヌクレオチドは、上述と同じポリヌクレオチドである。スペーサーのナノ粒子との結合の結果として、ポリヌクレオチドは、ナノ粒子の表面から離れ、その標的とのハイブリッド形成に利用できる。スペーサーがポリヌクレオチドである場合において、種々の実施形態におけるスペーサーの長さは、少なくとも約１０ヌクレオチド、１０〜３０ヌクレオチド、または３０ヌクレオチド以上でさえある。スペーサーは、ポリヌクレオチドのナノ粒子または標的ポリヌクレオチドと結合する能力に干渉しない、任意の配列を有してもよい。スペーサーは、相互に、またはオリゴヌクレオチドのそれに相補的な配列を有するべきではないが、標的ポリヌクレオチドに完全に、または部分的に相補的であってもよい。特定の態様において、ポリヌクレオチドスペーサの塩基は、全てアデニン、全てチミン、全てシチジン、全てグアニン、全てウラシル、または全て他の何らかの修飾塩基である。
【実施例】
【０１７７】
実施例１
ナノ粒子の調製
公開された手順を使用して、クエン酸塩安定化された金ナノ粒子（１〜２５０ｎｍ）を調製する［Ｇ．Ｆｒｅｎｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９７３，２４１，２０］。本実施例では、１３および５ｎｍの大きさが使用されたが、他の実施例は、１ｎｍ〜５００ｎｍの大きさのナノ粒子を含む。つまり、テトラクロロ金酸は、還流水中のクエン酸塩を用いた処理により還元される。透過型電子顕微鏡法およびｕｖ／ｖｉｓ吸光分光法を使用して、粒子の大きさおよび分散度を確認することができる。チオール化されたオリゴヌクレオチドは、標準固相ホスホラミダイト法を使用して合成される［Ｐｏｎ，Ｒ．Ｔ．Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｓｕｐｐｏｒｔｓ ｆｏｒ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）（１９９３），２０（Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ），４６５−４９６］。チオール修飾されたオリゴヌクレオチドは、次に、１０ｎＭコロイドの１ｍＬ当り３ｎｍｏｌのオリゴヌクレオチドの濃度で、１３±１および５ｎｍ金コロイドに添加され、一晩、振蘯される。１２時間後、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液（１０％）を混合物に添加し、０．１％ＳＤＳ濃度とし、リン酸緩衝剤（０．１Ｍ、ｐＨ＝７．４）を混合物に添加し、０．０１リン酸濃度とし、塩化ナトリウム溶液（２．０Ｍ）を混合物に添加し、０．１Ｍ塩化ナトリウム濃度とする。次いで、塩化ナトリウム溶液（２．０Ｍ）の６つのアリコートを８時間にわたって混合物に添加し、０．３Ｍの最終塩化ナトリウム濃度とし、一晩、振蘯して、機能化プロセスを完了する。溶液を遠心分離し（１３，０００ｒｐｍ、２０分）、減菌リン酸緩衝生理食塩水に３回再懸濁して、精製された抱合体を生成する。
【０１７８】
実施例２
オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子抱合方法
本実施例のオリゴヌクレオチド設計は、２つの可能な作用メカニズムを含む。第１に、配列は、アンピシリン耐性（ＡｍｐＲ）遺伝子β−ラクタマーゼのプロモーター部位のセンス鎖と優先的にハイブリッド形成する、公開されたプラスミド配列を使用して設計された。これは、抱合体が細菌ゲノムのＡｍｐＲのプロモーター配列と優先的にハイブリッド形成する（好適な結合定数および／または患者の細胞内濃度により付与される）利点を利用することにより、細菌をアンピシリンに対して感作させる。これは、プロモーター複合体がその標的部位に結合することを防止し、ｍＲＮＡ転写物（Ａｍｐ耐性遺伝子）の転写を防止し、したがって、細菌をアンピシリンに対して感作させる。使用された配列は、５’−ＡＴ ＴＧＴ ＣＴＣ ＡＴＧ ＡＧＣ ＧＧＡ ＴＡＣ ＡＴＡ ＴＴＴ ＧＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ Ａ−ＳＨ−３’（配列番号１）および５’−ＡＴ ＴＧＴ ＣＴＣ ＡＴＧ ＡＧＣ ＧＧＡ ＴＡＣ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ Ａ−ＳＨ−３’（配列番号２）であった。
【０１７９】
第２の戦略は、ＡｍｐＲ遺伝子の内部領域とハイブリッド形成するように設計された配列を利用する。そうすることにより、これは、完全なｍＲＮＡ転写の完了を防止する。これの下流作用は、機能ｍＲＮＡ転写物（Ａｍｐ耐性遺伝子）の完全な転写を防止し、よって、細菌をアンピシリンに対して感作させることである。本戦略において、センス鎖は、標的二重鎖ＤＮＡとハイブリッド形成するように選択される。これの配列は、５’−ＡＣＴ ＴＴＴ ＡＡＡ ＧＴＴ ＣＴＧ ＣＴＡ ＴＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡ−ＳＨ−３’（配列番号３）であった。両戦略のスキームを図１に表す。代替的に、従来のアンチセンス戦略を使用して、ｍＲＮＡを結合し、タンパク質生成を防止し、よって細菌を抗生物質に対して感作させる。
【０１８０】
公開された手順に従い（ＰｒｏｍｅｇａおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、アンピシリン含有プラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ社のｐｓｉＣＨＥＣＫ ２またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のｐＳｃｒｅｅｎ−ｉＴのいずれか）を使用して、ＪＭ１０９大腸菌コンピテント細胞を形質転換し、抗生物質含有（Ａｍｐ）プレート上で成長させた。コロニーを１つ選択し、１２時間、アンピシリンを有する液体培地で成長させた。本培養物は、後続の実験に使用するために、凍結（１０％グリセロール）保存物を形成するために使用された。
【０１８１】
大腸菌の保存物を解凍した後、以下に記載するように、少量を、アンピシリンを有する、または有さないいずれかの液体ブロス中で成長させ、対応するＬＢプレート上で平板培養した。一実施例において、５μＬの冷凍細菌ブロスを、３０ｎＭの粒子を有する１ｍＬのＬＢブロス中で５．５時間成長させた。この１ｍＬから、１００μＬを平板培養し、一晩、成長させた。透過型電子顕微鏡法を使用して、細菌の進入を確認した（図２）。
【０１８２】
数時間、ナノ粒子で処理した後、少量のバクテリアを、アンピシリン陽性またはアンピシリン陰性プレートのいずれか上で平均培養した。さらに１２時間、細菌をこれらのプレート上で成長させ、各条件下で成長したコロニーの数を評価した。以下に結果を以下の表１に要約する。本戦略を使用して、細菌成長の６６％阻害を得た。日常的な条件の最適化により、１００％の良好な細菌の感作を得られることが予測される。
【０１８３】
【表１】
プロトコル：３０ｎＭ粒子を有する１ｍＬブロス中の５μＬの細菌ブロスを、３．５時間成長させた。１００μＬを平均培養し、一晩、成長させた。
【表２】
プロトコル：３０ｎＭ粒子を有する１ｍＬブロス中の５μＬの細菌ブロスを、５．５時間成長させた。１００μＬを平均培養し、一晩、成長させた。
【０１８４】
実施例３
オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子抱合体は転写ノックダウンをもたらす
さらなる戦略を利用して、プラスミド由来のルシフェラーゼ遺伝子において転写ノックダウンを検査する。本モデルは、ルシフェラーゼノックダウンを、ウミシイタケ発現をコードするプラスミド上の個別の領域と区別することにより、部位選択性遺伝子ノックダウンを例証するために使用された。本作用をアッセイするために、二重ルシフェラーゼリポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した。本モデルに利用された戦略は、ルシフェラーゼ遺伝子の完全なｍＲＮＡ転写物の形成を遮断することであった。これは、ウミシイタケに関して、ルシフェラーゼシグナルの減少をもたらす。これに使用された配列は、５’−ＣＣＣ ＧＡＧ ＣＡＡ ＣＧＣ ＡＡＡ ＣＧＣ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡ−ＳＨ−３’（配列番号４）であった。代替的に、プロモーター複合体がその標的部位を結合することを遮断するように、上に使用されたものに類似する戦略を使用することができる。本実施例において、５ｎｍ粒子が使用された。３００ｎＭ濃度の粒子を使用した、１２時間後に得られたノックダウンは、５９％であった（ｐ値＝０．０００４）。これらの結果は、転写レベルでの遺伝子調節をもたらす別の方法を例証する。データの要約を図３に示す。
【０１８５】
実施例４
オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子抱合体は転写を遮断する
二本鎖ゲノムＤＮＡとハイブリッド形成することにより、転写および後続のタンパク質生成を遮断するこれらの抱合体の能力を例証するために、生体外転写アッセイを行った。オリゴヌクレオチド機能化金ナノ粒子を、ルシフェラーゼ遺伝子をコードする二本鎖プラスミドＤＮＡを含有する生体外転写反応（Ｐｒｏｍｅｇａ）に添加した。オリゴヌクレオチド配列は、ルシフェラーゼ遺伝子のセンス鎖を標的にし、よって、転写のみを遮断することができ、翻訳は遮断しない。対照として、非相補的配列で機能化されたナノ粒子抱合体も、同じ方式で使用された。転写反応を進行させ、市販のキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ遺伝子を標的にするナノ粒子抱合体を含有した試料において、非相補的配列を有するナノ粒子抱合体を含有する対照反応物と比較して、ルシフェラーゼ活性の有意な減少（＞７５％）が観察された。
【０１８６】
加えて、ノックダウンの基礎原理を明らかにするために、緩衝剤中で実験を行い、予備成形された二重鎖のオリゴヌクレオチド金ナノ粒子抱合体の侵入を検査した。概略的な、得られたデータを図４（ＡおよびＢ）に示す。粒子は、予備成形された二重鎖（三重鎖形成）を結合してもよい。代替的に、粒子は、標的配列のそのより高い結合定数を介して、予備成形された二重鎖を置換してもよい。次いで、粒子を１３，０００ＲＰＭで遠心分離し、ＰＢＳ中で３回洗浄し、ＫＣＮで酸化させた。結合鎖の蛍光度を測定した。理論によって拘束されることなく、これは、フルオレセインキャップされたオリゴヌクレオチド（アンチセンス鎖）の解放、および蛍光シグナルの増加をもたらすと推測される。ナノ粒子の添加前に、消光剤（ダブシル、センス鎖）およびフルオロフォア（フルオレセイン、アンチセンス鎖）を有する二重鎖を形成した。濃度範囲に渡って、本戦略において配列特異性が見られる。
【０１８７】
実施例５
生体外で毒性のない遺伝子抑制
ＤＮＡ−Ａｕ ＮＰおよびｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰの両方は、生体外の複数の細胞において、遺伝子機能を抑制することを示した。例えば、サバイビンに対するｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰは、Ｔ−２４およびＨＴ−１３７６膀胱癌細胞の細胞死をもたらした。加えて、ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰは、単回治療後、培養物中、４日にわたり、ＨｅＬａ細胞におけるルシフェラーゼの発現を斬進的に低減し、一方、ルシフェラーゼ発現は、従来のｓｉＲＮＡで治療した後、４日でベースラインレベルまで戻った［Ｇｉｌｊｏｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １３１：２０７２−２０７３（２００９）］。細胞毒性は、遺伝子発現抑制に必要な濃度で観察されず、免疫媒介作用は、従来の核酸よりも顕著に低い。オリゴヌクレオチド−Ａｕ ＮＰを用いた１つ以上の遺伝子の同時抑制も示され、ガングリオシド生合成の２つの酵素（ＧＭ２／ＧＤ２シンターゼおよびＧＤ３シンターゼ）に対するＤＮＡ−Ａｕ ＮＰの培養したケラチノサイト（ＫＣ）への同時添加は、開始後３日で、ケラチノサイト膜でＧＭ３基質の蓄積をもたらし、目に見える膜発現が、アンチセンス封鎖後、少なくとも１週間継続した。
【０１８８】
これらのナノ抱合体に対する細胞応答を検査するために、１３ｎｍのクエン酸塩安定化された金ナノ粒子およびオリゴヌクレオチド修飾された粒子を比較した。クエン酸塩安定化された粒子は、ＨｅＬａ細胞（１２７遺伝子上方または下方制御）の遺伝子発現プロファイルにおいて、有意な変化を含んだが、組み換えｓｉＲＮＡまたはＤＮＡ機能化ナノ粒子は、遺伝子発現プロファイルにおいて、有意な変化を示さなかった。
【０１８９】
実施例６
ナノ粒子抱合体は、局所適用後、経皮的に送達される
ＤＮＡ−Ａｕ ＮＰまたはｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰを使用した試験は、一次ヒトケラチノサイトが、２時間以内に約１００％の効率で、ＤＮＡ−Ａｕ ＮＰおよびｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰを取りこむことを示す。金ナノ粒子の取り込みを測定するために、誘電結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）を使用し［Ｇｉｌｊｏｈａｎｎｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ７：３８１８−３８２１（２００７）］、ＤＮＡ−Ａｕ ＮＰの培養されたケラチノサイトによる取り込みは、任意の他の細胞の取り込みより少なくとも１０倍大きく、ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰのＫＣへの取り込みは、他の細胞種より２０倍高かったことが分かった。例えば、低カルシウム培地中のＫＣを用いた、５０ｐＭのｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰの６時間のインキュベーションは、細胞当り約６×１０５ＮＰの取り込みをもたらし、従来のｓｉＲＮＡの細胞取り込みより非常に高い。
【０１９０】
混合の容易性、適用部位での保持性、およびナノ抱合体の安定性（ナノ粒子の特徴のある赤色の持続性により決定される）を確実にする、可能性のある局所的送達用の軟膏、クリーム、およびローションの群を識別した。Ｃｙ５標識センスＤＮＡ−Ａｕ ＮＰ軟膏（Ａｑｕａｐｈｏｒ ｏｉｎｔｍｅｎｔ（登録商標）のＤＮＡ−Ａｕ ＮＰ）のマウスの背側皮膚への適用は、単回適用後、２時間で、角質層を通って表皮への浸透、６〜８時間で、上部真皮への浸透、および２４および４８時間で、真皮全体にわたる広域の分布を示した。例証される蛍光の持続性は、ＩＣＰ−ＭＳにより測定されるように、組織中の金ナノ粒子の持続性と良く相関した。同様に、Ｃｙ３修飾されたｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰ軟膏は、マウスの皮膚を通して迅速に取り込まれ、適用後２４時間で、表皮の基部から、真皮を通って皮下組織までの優れた浸透を示す（図５Ａ、Ｂ）。これらの試験は、ナノ粒子が、角質層に浸透し、表皮を横断し、その脈管構造を有する真皮に達したことを示した。
【０１９１】
局所適用は、毒性の痕跡を示さなかった。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの背側皮膚への１ヶ月の１５ｎＭの組み換えｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰの適用は、認められる全身または皮膚の臨床変化をもたらさなかった。対照（ビヒクルの適用または未治療）と比較して、金粒子蓄積は、メラノーマ転移の部位：皮膚、リンパ節、肺、および程度は低いが、肝臓および腎臓で最も著しかった。組織切片は、炎症、アポトーシスの痕跡、または増殖／皮膚の厚さにおける変化を示さなかった。予備毒性試験において、５０ｎＭ〜５００ｎＭ（各群にｎ＝５）の範囲の用量で、組み換えｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰを局所的に適用し、１０日間、毎日、マウスを治療した。皮膚、リンパ節、肝臓、胃腸管、および糞便で金粒子を検出し、これらの臓器で、適用されたナノ粒子の濃度に比例して、濃度は増加した。
【０１９２】
実施例７
局所適用されたｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰは、遺伝子発現を抑制する
局所アプローチを使用する遺伝子発現を標的にする試験において、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が、導入遺伝子（Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＵＢＣ−ＧＦＰ）３０Ｓｃｈａ／Ｊ）を遍在的に発現するマウスにおいて標的にされた。Ａｑｕａｐｈｏｒビヒクルを使用して、ＧＦＰに対してｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰを１５ｎＭ濃度で局所的に適用した。マウスを、４週間、連続して３回治療し、マウスの背部の半分を抗ＧＦＰ ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰで治療し、もう半分を組み換えｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰで治療した。治療した皮膚を単離した後、対照群と抗ＧＦＰ ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰで治療された群との間のＧＦＰレベルを比較するために、蛍光定量法を使用した。治療されたマウス（ｎ＝５）において、本レジメンは、蛍光的に測定された時、ＧＦＰ発現において４３％の減少をもたらした（ｐ＜０．００３６）（図６）。組み換え（対照）ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰで半分を治療されたマウスの皮膚から見られる約１２％のノックダウンは、抗ＧＦＰ ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰの全身取り込みを示した。
【０１９３】
実施例８
治療標的としての転移性メラノーマ
異なる遺伝子型のヒトメラノーマ細胞株（例えば、ＳＫ−ＭＥＬ−２８、１２０５Ｌｕ、Ａ３７５Ｐ、Ｃ８１６１、およびＷＭ３２１１株）およびヒトメラノーマ組織の試験から、転移性細胞は、ガングリオシドＧＭ３の独特の脱アセチル化形態の存在により、非転移性メラノーマ細胞および正常なメラニン細胞と区別できることが分かった。脱Ｎ−アセチルＧＭ３は、抗原的に明確なマーカーであるだけでなく、細胞移動および侵入も促進する［Ｌｉｕ Ｊ ｄｅ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ ＧＭ３ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｖｉａ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−２ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ （２００９）］。移植片マウスモデルを用いた試験は、マウスの転移性株の肺および肝臓への転移の蔓延の抑制において、脱Ｎ−アシルＧＭ３の有用性を検証した。これらの試験の間、皮膚および転移性メラノーマの確立の時間推移は、２つのＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ／ ＰＴＥＮ欠損モデルである、ＳＫ−ＭＥＬ−２８および１２０５Ｌｕを用いた移植片モデルで調査された。これらのモデルにおいて、１０６細胞の皮下接種は、肉眼、顕微鏡、およびＲＴ−ＰＣＲ評価により、接種後、数週間内で大半のマウスに皮膚腫瘍および肺および肝臓への転移をもたらす。ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰのメラノーマ細胞に浸透し、サバイビンの発現を抑制する能力も試験された。ＳＫ−ＭＥＬ ２８メラノーマ細胞株を使用して、ｓｉＲＮＡ Ａｕ−ＮＰは、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）により測定された時、サバイビンｍＲＮＡレベルを９１％低下させることを示した。
【０１９４】
実施例９
既知の遺伝子を標的にする多機能ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰは、組み合わせの生体外アプローチを使用する転移性メラノーマに関与する
遺伝的にシグナル伝達経路を標的にする多機能ナノ粒子の能力を検討する。抱合体を設計し、組み合わせ形式で複数の変異を標的にするように例証する。比率測定基準アプローチを使用して、複数の遺伝子を同時に調節する目的のために、機能化された抱合体を最適化する。
【０１９５】
複数のシグナル伝達経路、特にＢＲＡＦ／ＥＲＫおよびＡＫＴ３シグナル伝達は、転移性メラノーマにおいて上方制御されることが知られている。組み合わせアプローチを使用して、共通のＢＲＡＦ変異および活性化されたＡＫＴ３を標的にする。加えて、各実験において、ＢＲＡＦ Ｖ６００ＥおよびＡＫＴ３ ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰによるノックダウンの結果を、非相補的対照ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰの結果と比較した。これは、遺伝子ノックダウンの特異性を決定し、共役毒性の評価を可能にする。
【０１９６】
これらの２つのメラノーマ標的を個別に標的にする最適な戦略を決定する。第１に、ｓｉＲＮＡ抱合体は、ＢＲＡＦにおいて、Ｔ１７９９Ａ（Ｖ６００Ｅ）変異を標的にするように設計される。ｓｉＲＮＡ設計アルゴリズムを使用して、または文献からの選択を介して［Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ６５：２４１２−２４２１（２００５）］、標的毎に少なくとも３つの配列を設計する。ＢＲＡＦ抱合体を個別に評価して、ＢｒａｆＶＥ Ｐｔｅｎｌｏｘマウス細胞株、ヒトＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ含有細胞株３つ（Ａ３７５Ｐ、ＳＫ−ＭＥＬ−２８、１２０５Ｌｕ）、ならびに陰性対照として、正常なメラニン細胞（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、および野生型ＢＲＡＦのみを示すＣ８１６１転移性メラノーマ細胞株において、遺伝子ノックダウンに最適な濃度を決定する（表Ａを参照）。
【０１９７】
第２の配列は、ＡＫＴ３を標的にするように設計され［Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ１５：１６７４−１６８５（２００９）］、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ含有細胞株３つ、同様にＡＫＴ活性を有するＣ８１６１株、および対照として、正常なヒトメラニン細胞において試験された。ＢｒａｆＶＥ発現を誘発するために、遺伝子導入マウス株からの細胞を４−ＨＴ（および対照として、４−ＨＴなし）の存在下で成長させた。ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰ治療後の特定の時間点で細胞を収集した後、ｑＲＴ−ＰＣＲおよびウエスタンブロット解析を使用して、ヒトならびにマウスのＢＲＡＦ Ｖ６００ＥおよびＡＫＴ３のｍＲＮＡとタンパク質発現のレベルを決定する［Ｄａｎｋｏｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ４１：５４４−５５２（２００９）、Ｄａｎｋｏｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ２１：３７９−３８４（２００７）］。ノックダウンの特異性を確認するために、ｑＲＴ−ＰＣＲおよび免疫ブロットにより、ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰ治療の効果を野生型ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦ、ＡＫＴ１、およびＡＫＴ２で評価した［Ｓｔａｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ６４：７００２−７０１０（２００４）］。技法は、ＮＲＡＳ（例えば、Ｑ６１Ｌ）またはｃ−ＫＩＴ等における、ＥＲＫ活性の増加をもたらす頻度が低い変異の標的も可能にする。
【０１９８】
金ナノ粒子は、分子結合の足場として機能するため、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ およびＡＫＴ３を同時に標的にするための組み合わせアプローチの使用を検討する。各変異を標的にするｓｉＲＮＡ二重鎖を、異なる割合でナノ粒子に添加する。抱合体の化学量を制御する能力を使用して、ｓｉＲＮＡの細胞への送達は厳密に作用され、各標的の量は微調節されるため、ノックダウンおよび細胞応答の調査を可能にする。
【０１９９】
実施例１０
シグナル伝達経路変更および細胞機能の評価
選択された個別の、および多機能のｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰのシグナル伝達および細胞の生物学的様態への影響が、記載されるように比較される［Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ１１９：１０７−１１７（２００２）、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ１２６：２６８７−２６９６（２００６）、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２７６：４４５０４−４４５１１（２００１）、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２７８：２５５９１−２５５９９（２００３）］。ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ／ＡＫＴ３ ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰは、ＥＲＫリン酸化ならびにＡＫＴ発現およびリン酸化の両方を抑制する。これは、ｐＥＲＫ、ＥＲＫ、ｐＡＫＴ、およびＡＫＴに対する抗体を用いた免疫ブロットにより確認される。メラノーマ細胞増殖の増加および生存におけるＢＲＡＦ／ＥＲＫおよびＡＫＴシグナル伝達の主要な役割を考えると、生体外メラノーマ細胞機能における著明な変化は、ノックダウンの結果として生じる。アポトーシスの誘発は、ＰＡＲＰ切断を判定するための免疫ブロットおよびアネキシンＶ流動試験により判断される。ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ抑制およびＡＫＴ３抑制の相対的な役割は、Ｂｉｍ（ＢＲＡＦ活性化により誘発される）、ＢＣＬ−２（ＡＫＴ活性化により誘発される）、およびＢＡＤ（ＡＫＴ活性により抑制される）のタンパク質発現を特定することにより分析される。組み換え配列を有する対照における誘発されたアポトーシスの欠損は、アポトーシスがｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰ毒性ではなく意図される標的に起因することを確実にする。増殖は、細胞計数およびＷＳＴ−１［（４−［３−（４−インドフェニル）−２−（４−ニトロフェニル）−２Ｈ−５−テトラゾリオ］−１，３−ベンゼンジスルホネート）］アッセイにより判定され、サイクリンＤ１発現は、免疫ブロットにより評価される。メラノーマ細胞は、血管新生（特に、ＩＬ−８およびＶＥＧＦ）および侵入（特に、ＭＭＰ−２）の一因となる因子を発現する［Ｌｉｕ Ｊ ｅｔ ａｌ．， ｄｅ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ ＧＭ３ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｖｉａ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−２ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２００９）］。腫瘍ＶＥＧＦ、Ｈｉｆ−１α、およびＭＭＰ−２の発現は、免疫ブロット細胞計数および上澄みにより判定され、培養物の上澄みのＭＭＰ−２機能酵素電気泳動アッセイの判定は、前述のように行われる［Ｌｉｕ Ｊ ｅｔ ａｌ．， ｄｅ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ ＧＭ３ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｖｉａ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−２ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２００９）、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２７８：２５５９１−２５５９９（２００３）］。ＩＬ−８発現は、ＥＬＩＳＡにより、細胞の上澄みで判定される［Ｃｒａｗｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ７：４９２−４９９（２００８）］。細胞侵入アッセイは、マトリゲル浸潤チャンバを使用して行われる［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２７８：２５５９１−２５５９９（２００３）］。
【０２００】
多機能ｓｉＲＮＡ−ＡｕＮＰは、別の遺伝子変異を標的にするための（ＷＭ１３６６細胞株等における）、または追加の標的ｓｉＲＮＡをＢＲＡＦ Ｖ６００ＥおよびＡＫＴ３を標的にする多機能ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰに追加するための機会を提供する。したがって、細胞株のそれぞれの遺伝子プロファイルならびにそれらの既知の遺伝子変異を使用する、３つ以上の遺伝子を標的にする能力も意図される（表Ａ）。例えば、ＳＫ−ＭＥＬ−２８および１２０５Ｌｕ細胞の両方は、特定のＣＤＫ４点変異を有し、これらの変異は、ＢＲＡＦ抑制に対する応答に影響を及ぼすように見えないが、追加の標的は、これらの変異の機能的作用の探索を可能にする。同様に、ＳＫ−ＭＥＬ−２８および１２０５Ｌｕは、転移性メラノーマ形質転換および進行におけるそれらの有意性を探索するように標的にされる、ｐ５３（ＳＫ−ＭＥＬ−２８）およびＣＤＫＮ２Ａ（１２０５Ｌｕ）において、追加の標識変異を有する。これらの細胞株は、両方とも生体内異種移植モデルに広範に使用されている。
【０２０１】
実施例１１
ｓｉＲＮＡナノ抱合体の経皮および静脈内送達のための条件、安全性、および体内分布
静脈内および経皮的に投与される組み換えｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰの送達、クリアランス、および毒性を、免疫応答性マウスで比較する。加えて、抱合体の毒性および薬物動態プロファイルを判定する。多機能ナノ粒子は、本明細書に上述される、ヒトの皮膚に浸透するようにも最適化される。
【０２０２】
ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰは、経皮送達により全身に送達され、それらの動態を金粒子の蓄積により追跡する。臓器中の金粒子のレベルは、前述のように、ＩＣＰ−ＭＳにより測定される［Ｇｉｌｊｏｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ７：３８１８−３８２１（２００７）］。これらの試験において、６匹のマウスを、各ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰ治療群で試験し、対照として、各パラメータの２匹のマウスにビヒクルを適用する。体内分布試験において、送達は、メラノーマ転移の最も一般的な部位であり、局所投与を用いた試験においてｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰが到達する部位である、肝臓、肺、皮膚、およびリンパ節に焦点を当てる。腎臓、脾臓、副腎、および胃腸管（毒性の可能性がある部位）も監視され、脳（到達するのが困難である、ヒトにおける偶発的な転移部位）も監視される。これらの試験で、５００ｎＭのｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰを投与するが、これは、本濃度が経皮送達を通して良好に内部標的に達するためである。
【０２０３】
経皮送達
表皮、真皮、および皮下細胞による２５ｎＭのフルオロフォア抱合ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰの広範な取り込みは、適用後、２４時間内（図５）示され、僅か１５ｎＭの非機能性ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰの適用後でも、金粒子の皮膚、リンパ節、肺、肝臓、および腎臓への送達が示された。試験は、形質転換マウスメラノーマモデルにおいて治療が開始する週齢である、７〜８週齢の免疫応答性Ｃ５７ＢＬ／６マウスで行われる。
【０２０４】
単回投与での送達、クリアランスおよび毒性
多機能ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰを用いた時間経過実験は、１）経皮浸透の時間経過および効率性、２）内部臓器への送達の有効性、３）単回適用後のクリアランス、および４）刺激性および毒性の可能性を判断するために行われる。マウスを一度治療した後、治療後２時間〜７週までの８つの時間点で安楽死させる。これらの試験において、初期時間点（すなわち、２、４、２４、および７２時間）でのｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰの分布は、皮膚への浸透、臓器への送達、およびクリアランスを確実にするために比較される。局所的に治療されたマウスにおいて、皮膚の治療部位は、金粒子濃度を定量化するためのＩＣＰ−ＭＳ用に、および−８０℃での保存用（例えば、後のＥＬＩＳＡアッセイ用）に毒性がないことを確実にするために、組織学分析用に３等分される。ＩＣＰ−ＭＳ用の皮膚切片を短時間６０℃の水に曝し、血管新生化された真皮から表皮を単離し、これによって、真皮／皮下送達に対する表皮送達を判断する。致死する時に、金含有量について、臓器（上に記述する）および遠隔の皮膚をＩＣＰ−ＭＳにより判定し、組織学判定（以下を参照）のために各臓器の一部を取り出した。
【０２０５】
反復投与での蓄積
マウスが提案された実験において、単に単回適用ではなく繰り返し治療されることから、これらの試験も、金ナノ粒子の蓄積を定量化するために、１０日、４週間、および７週間の間、毎週２〜３回治療されるマウス（単回適用後の皮膚における金粒子の持続性に基づく）を用いて行われる。
【０２０６】
毒性の判定
２日に１回マウスの体重を量り、眼に見える皮膚の変化または行動の変化を観察する。有害な影響を検査するために、臓器レベルで組織学および免疫組織化学評価を行った。特に、全組織および皮膚における壊死および炎症の存在、表皮成熟の変化、およびメラニン沈着の存在（色素ダンピング）を判断した。皮膚および内臓の萎縮の痕跡が見られる場合、細胞増殖は、Ｋｉ６７の検出により、免疫組織化学的に判定される。疑わしいアポトーシスの存在が免疫組織化学的に確認される（ＡｐｏｐＴａｇ Ｉｎ Ｓｉｔｕアポトーシス検出）［Ｌａｎｎｕｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７（２３）：５２７７−８０（１９９７）］。皮膚が先天性免疫臓器であり、アポトーシス促進性サイトカインを発現できることから、治療された皮膚で、表皮アポトーシスが見られる場合、対照治療された皮膚に対するｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰ皮膚において、ＴＮＦ−α発現用のＥＬＩＳＡアッセイが行われる。
【０２０７】
最終段階前に、心穿刺により、全動物において血液を得る。単回用量試験において、必要に応じて、後の分析のために血清を凍結する。１０日以上治療されたマウスからの血液を、血球数、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（肝臓機能）、およびクレアチニンレベル（腎臓機能）について分析する（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ）。
【０２０８】
ヒトの皮膚における経皮送達
フランツ拡散セルを用いた生体外実験を行うために、腹壁形成術からの正常なヒトの皮膚を使用して、ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰのヒトの皮膚を横断する能力を試験する。これらのフランツセルは、過去数十年間、ヒトの皮膚を通る流束（ｆｌｕｘ）を検査するための判断基準であった。これらは、ヒトの生体内条件に一致するように、そして重要な点は、浸透圧勾配視入レーション皮膚を提供するように、温度および湿度制御される。ｓｉＲＮＡおよび金粒子は抱合されたままであるため、ヒトの皮膚を通した金粒子の輸送は、浸透のマーカーとして、ＩＣＰ−ＭＳにより定量化される。真皮から角質層／表皮を分離した後、再構成された皮膚を得る。再構成されたヒトの皮膚試料の整合性は、解剖顕微鏡下で、視覚的に確認される。組織が無損傷であることをさらに確認するために、組織が無損傷である場合、最初の３０分内で、回収された試料中で金は検出できないという想定のもとに、最初の３０分に、受容液試料を回収する。皮膚をフランツセルに搭載した後、ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰ（５００ｎＭから始め、１００ｐＭの低さまで減らす）を、対照としてのＡｑｕａｐｈｏｒとともに適用する。試験は、少なくとも三通りで、少なくとも３回行われる。これらの試験は、時間とともにｃｍ２の皮膚表面全体を通過する薬物の量（ｎｇ／ｃｍ２／時間）である、ヒトの表皮を通る流束を示す。６時間および２４時間の終わりに、皮膚を刻み、組織中の残留Ａｕ ＮＰを測定するために、ＩＣＰ−ＭＳ測定用に金粒子を抽出する。
【０２０９】
実施例１２
マウスモデルの確立
前述のように、６週齢で、左および右の脇腹に、３日間連続でＤＭＳＯ中５ｍＭの４−ＨＴを局所投与することにより、メラノーマを誘発する［Ｄａｎｋｏｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ４１：５４４−５５２（２００９）］。これらの有色メラノーマは、有色腫瘍と同様に、最初に、形質転換されたモデルにおいて、４−ＨＴ投与後７〜１０日で、明らかになる［Ｄａｎｋｏｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ４１：５４４−５５２（２００９）］。マウスモデルを生成するための試験において、溶媒のみの適用は対照として使用される。少なくとも皮膚の腫瘍が最初に検出されるまで療法が始まらない、ヒト疾病をシミュレーションするために、メラノーマが目に見えるか、または少なくとも５ｍｍ２の最低領域で明白になるまで、療法の開始は、両方のマウスモデルで保留される。
【０２１０】
用量設定試験
５０ｎＭから５００ｎＭの間の３用量のそれぞれで、８匹のマウスを試験する。用量設定試験の対照は、組み換えｓｉＲＮＡおよびＡｑｕａｐｈｏｒ単独を含む。検死のために、療法後７週間で、マウスを致死した。原発性メラノーマおよび任意の皮膚の転移の写真を撮り、カリパスで各治療の時に容積を測定する。目に見える、または明白な皮膚転移の数を記述する。肺、肝臓、リンパ節、腎臓、および脳の肉眼の転移を数え（それらは暗褐色のため容易である）、微視的転移の痕跡について、各臓器全体の複数の個所で、組織学的に臓器を検査する。微視的転移は、顕微鏡的に容易に目に見えるが、必要に応じて、色素沈着をさらに顕著にするために、フォンタナ−マッソン染色を使用する。任意の毒性の痕跡なしに転移を低減するのに最も効果的な用量が、後続の試験に使用される。
【０２１１】
転移の発生の時間経過およびｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰ療法によるその変化
前回の試験に基づく用量および頻度で、ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰ、組み換えｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰ、または対照ビヒクル（局所Ａｑｕａｐｈｏｒ）をマウスに投与する。一組各８匹のマウスを、治療の開始後、１、３、５および７週で致死し、上述のように、肉眼で、および組織学的に内臓転移を評価する。
【０２１２】
ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰの作用のメカニズム
原発性腫瘍を、定期的な組織学試験と免疫組織化学試験、免疫ブロット分析とｑＰＣＲのために分けた。これらの試験における対照は、組み換えｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰまたはビヒクルで治療されたマウスからの腫瘍、および正常／未治療皮膚（例えば、形質転換マウスの上背部からの皮膚）である。以下を調査する：ｉ）Ｋｉ６７染色を用いた腫瘍細胞増殖、ｉｉ）抗ＣＤ３１抗体を用いた腫瘍周囲の血管増生、ｉｉｉ）ＴＵＮＥＬアッセイまたはカスパーゼ３染色を用いた腫瘍細胞アポトーシス、ｉｖ）前述のプライマーを用いるｑＰＣＲを使用した、形質転換モデルにおけるＢｒａｆＶＥ、野生型Ｂｒａｆ、およびＡｋｔ３の発現の直接的抑制［Ｄａｎｋｏｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ４１：５４４−５５２（２００９）、Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ１５：１６７４−１６８５（２００９）、Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ６６：８２００−８２０９（２００６）、Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ６５：２４１２−２４２１（２００５）］、およびｖ）全Ｂｒａｆ；Ｃｒａｆ；ｐ−Ａｋｔ／全Ａｋｔ；およびｐ−ＥＲＫ１／２／全ＥＲＫ１／２のタンパク質発現の変化。血管新生および侵入のマーカーについて（ＶＥＧＦ、ＭＭＰ−２、およびＨｉｆ−１）、免疫ブロットにより腫瘍試料から抽出したタンパク質をアッセイする。ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰの最終投与後２時間の致死でのベースライン眼球内出血および心穿刺は、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−８レベルを判定するために行われる［Ｃｒａｗｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ７：４９２−４９９（２００８）］。免疫応答性形質転換モデルにおいて、Ｂｒａｆおよび／またはＡｋｔ３活性の抑制が免疫応答に影響を与え、細胞毒性を促進するかどうかに関わらずＴ細胞機能も判定される。これらの試験は、未治療または組み換えｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰ治療したマウスからの細胞ＢｒａｆＶＥ Ａｋｔ３ ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰ治療した形質転換マウスと比較する。免疫組織化学検査を使用して、腫瘍切片のＦｏｘｐ３＋（調節Ｔ細胞）およびＣＴＬＡ４＋／ＣＤ１５２（細胞毒性ＣＤ８＋Ｔ細胞）の数を数える。抗体の視覚化を確実にするために、ＡＥＣ色素原（赤色）を使用する。腫瘍浸潤性リンパ球を皮膚の腫瘍［Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ１８２：６０９５−６１０４（２００９）］、および治療開始後１、４、および７週で致死したマウスから抽出する。ＣＤ４、ＣＤ２５、Ｆｏｘｐ３、ＣＤ８、およびＣＴＬＡ４に対して、蛍光色素抱合された抗体を用いて染色した後、細胞はＦＡＣＳ分析を受ける。
【０２１３】
ｓｉＲＮＡ抑制の持続
個別の試験において、原発生腫瘍成長および転移を制御するために、マウスを７週間、ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰで治療する。マウスの半分（ｎ＝１２）は、療法を中断する。治療なしのマウスおよび治療を継続する同齢集団を、２、４、８、および１２週後に致死する。原発性メラノーマを毎週２回測定し、終了時に内臓転移を数える。加えて、皮膚および内臓腫瘍において、Ａｕ−ＮＰを定量化し、それらのクリアランスがどのように腫瘍抑制の反転と相関するかを判断する。
【０２１４】
生存期間の延長
形質転換マウスは、２５〜５０日で安楽死を要する［Ｄａｎｋｏｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ４１：５４４−５５２（２００９）］（例えば、腫瘍がその最大直径で２ｃｍに達するか、または栄養不良、１週間で２０％の体重の損失、もしくは２週間連続で１０％の体重の損失、異常呼吸、または痛みを示す体勢を示す等、マウスが病的であるかのいずれかの時）。ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰの作用を判定するための上述の試験において、マウスは、最高１０週の時間点で致死される。マウスの治療を継続し、最高３ヶ月の生存試験のために、未治療および組み換えｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰ治療したマウスとの比較を行う。マウス生存率は、カプラン−マイヤー生存曲線を使用してプロットされる。
【０２１５】
毒性の判定
２日に１回マウスの体重を量り、行動または食欲の変化の痕跡を観察する。定期的な病理組織学的染色法によって、組織毒性の痕跡（例えば、アポトーシスまたは炎症）について、肝臓および腎臓組織を判定し、当該分野に公知の方法に従い、骨髄、肝臓、および腎臓機能のスクリーニング血液試験を行う。毒性の痕跡が疑われる場合、さらなる免疫組織化学評価（ＴＵＮＥＬおよびＫｉ６７等）を行う。ｓｉＲＮＡ誘発の非特異的作用は、全ゲノム配列（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を行うために、心穿刺により得られる血清で判定される。遺伝子整列試験は、少なくとも７週間、ＢｒａｆＶＥ Ａｋｔ ３ ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰに曝されたマウスおよびそれらの対照群からの試料で、少なくとも三通りで行われ、試料を保存（ｂａｎｋｅｄ）し、非特異的作用が検出される場合、整列は、曝露が短いマウスで行われる。
【０２１６】
統計分析
合成抱合体の遺伝子をノックダウンし、タンパク質発現に影響を与える能力を、Ｐ＜０．０５の有意性を有する両側スチューデントｔ検定を使用して判定する。ノンパラメトリックマン−ウィットニーＵ検定およびＰＲＩＳＭソフトウェアを使用して、皮膚メラノーマの大きさの差の有意性ならびに肺および肝臓転移の数を決定する。生存試験における有意性は、生存プロットのログランク検定により判断される。
【０２１７】
本発明は、種々の実施形態および実施例に関して説明されたが、当業者には、変形および改善が生じることは理解されるであろう。したがって、特許請求の範囲に示されるそのような制限のみが、本発明に提示されるべきである。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００９年６月１７日に出願された米国仮出願第６１／１８７，７５９号の、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ． § １１９（ｅ）のもとの優先権の利益を主張し、また本出願は、２００９年１月８日に出願された米国仮出願第６１／１４３，２９３号および２００９年４月１５日に出願された米国仮出願第６１／１６９，３８４号の、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ． § １１９（ｅ）のもとの優先権の利益を主張する、２０１０年１月８日に出願された米国仮出願第１２／６８４，８３６号の一部継続出願であり、それらの全ての開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府権益に関する記述
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）より与えられた助成金番号５ＤＰ１ ＯＤ０００２８５およびＵ５４ ＣＡ０１１９３４１のもと、政府の援助を受けて行われた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子（ＯＮ−ＮＰ）抱合体ならびに細菌タンパク質生成の阻害方法を対象とする。本発明はまた、オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子を送達する組成物および方法にも関する。
【背景技術】
【０００４】
遺伝子発現を制御するための遺伝的物質の細胞および組織への導入は、遺伝子経路および機能に関与する研究に大きく影響し、治療用途に有望である。遺伝子レベルのアプローチは、大多数の薬物では得られない固有の特異性を有する。ｓｉＲＮＡは、潜在的な治療手段としての有望性が高く、現在、癌を含む広範な臨床問題を対象とする臨床試験中である。遺伝子発現抑制は、さらに費用効率が高く、小分子阻害剤より大きな潜在的特異性で、タンパク質発現および機能の下方調節をもたらす。特に、ｓｉＲＮＡ治療は、遺伝子内の一点変異を標的とすることができ、一方小分子療法は、これまで変異体と正常遺伝子産物とを正確に区別していない。ホットスポット変異の識別、直接的遺伝子配列決定、または遺伝子増幅のためのアッセイにより、各メラノーマにおける特異的な遺伝子の変化を決定する能力を鑑みて、メラノーマに、特異的遺伝子標識を指定することができる。ｓｉＲＮＡは、多くの細胞によって取り込まれるかもしれないが、変異遺伝子または活性化シグナル伝達タンパク質を有する細胞のみが、標的遺伝子療法の影響を受け、これによって、正常な細胞に悪影響を及ぼすことなく、メラノーマにおいてシグナル伝達する経路の正常化を可能にする。
【０００５】
多くのタンパク質の送達と同様に、核酸の分解および消化管からの生体利用性の低さが、ｓｉＲＮＡの経口送達に対する大きなハードルである。静脈内送達でさえ、従来のｓｉＲＮＡは血清因子によって迅速に分解され、その標的に到達しない。核酸の局所適用は、病変皮膚における遺伝子の抑制（例えば、これに限定されないが、皮膚における転移の治療のため）、および内部標的への経皮送達の両方に、大きな治療の利点を呈する。適用は無痛であり、制御が容易であり、皮膚は非常に接触しやすい。表皮における効果的な物理的障壁は、主に、表皮の最も外側の領域である角質層に、そして、それほどではないが、深部表皮に局在する。この表皮障壁は、大量の水分損失（内側から外側）および核酸を含む環境中の物質の進入（外側から内側）に対して保護する。超音波、レーザー、および注射等の機械的アプローチが、マウス角質層を通る浸透を促進し、ｓｉＲＮＡを皮膚内に入れるために使用されてきたが、特殊な装置を必要とし、送達範囲を限定し、皮膚を損傷する可能性がある。これらの課題は、角質層を通過できる抑制型核酸を送達するための、適用が容易な経皮システムの必要性を強調している。
【０００６】
皮膚疾患の直接的標的化は、遺伝子抑制療法において理想的なモデルである。しかしながら、生体外で遺伝子を抑制するための商業的に入手可能な物質は、良くても、角化細胞（ＫＣ）およびメラニン細胞等の一次培養細胞の中に遺伝子物質を送達するのにわずかに成功しただけであった。さらに、皮膚機能の外層は、従来、核酸およびタンパク質の皮膚への、および真皮から循環流への透過を防止する細胞学的障壁として機能する［非特許文献１］。よって、十分な量のオリゴヌクレオチドを移動させるためにこの層を横断することは、困難な課題であった。
【０００７】
皮膚は、身体のうちで最も広い器官であり、表皮、真皮、および皮下組織の３つの層を含む。表皮は皮膚の外層である。表皮の厚さは、異なる種類の皮膚により異なる。眼瞼は最も薄く．０５ｍｍであり、手掌および足底は最も厚く１．５ｍｍである。表皮は、進行的により分化細胞である４つの主層を含む。底層から上層まで、層は、
●基底層
●有棘層
●顆粒層
●角質層と名付けられる。
【０００８】
底層の基底層は、円柱のような形状の細胞を有する。本層において、細胞は分裂し、既に形成された細胞を上層に押し上げる。細胞は上層に移動するにつれて平らになり、より成熟し、最終的には「死」に、剥がれる。表皮の上層の角質層は、剥がれた平らな皮膚細胞から成り、基底層の細胞から角質層に達し、その後剥がれるまでに約４週間かかる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｐｒａｕｓｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２６：１２６１−１２６８（２００８）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本開示は、オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子を送達するための組成物および方法を提供する。
【００１１】
幾つかの実施形態において、本開示は、オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子（ＯＮ−ＮＰ）および経皮ビヒクル含む経皮組成物を提供する。
【００１２】
本開示は、オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子および経皮ビヒクル含む組成物を、それを必要とする患者の皮膚に投与するステップを含む、オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子の送達方法も提供する。
【００１３】
一態様において、オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子の送達は、経皮的である。別の態様において、オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子の送達は、局所的である。別の態様において、オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子の送達は、局所的適用後の表皮および真皮にである。
【００１４】
幾つかの実施形態において、経皮ビヒクルは軟膏を含む。幾つかの態様において、軟膏はＡｑｕａｐｈｏｒである。
【００１５】
別の実施形態において、オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子が標的とハイブリッド形成し、遺伝子発現を調節する条件下で、オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子を含む治療上有効量の組成物を皮膚に投与するステップを含む、遺伝子発現の調節方法を提供する。
【００１６】
幾つかの態様において、標的は、ポリヌクレオチドである。関連する態様において、ポリヌクレオチドはＲＮＡである。幾つかの態様において、標的はポリペプチドである。
【００１７】
本開示のさらなる実施形態において、組成物の投与は皮膚疾患を軽減する。
【００１８】
種々の実施形態において、皮膚疾患は、癌、遺伝的疾患、老化、炎症、感染、および美容上の変形から成る群から選択される。
【００１９】
幾つかの態様において、癌は、扁平上皮癌、基底細胞癌、乳癌、およびメラノーマから成る群から選択される。
【００２０】
またさらなる実施形態において、標的は、Ｒａｓ、ＩｋＢα、ヘッジホッグ、Ｂ−Ｒａｆ、Ａｋｔ、およびサイクリンＤから成る群から選択される遺伝子により発現する遺伝子産物である。
【００２１】
幾つかの態様において、遺伝的疾患は、単純性表皮水疱症、水疱性魚鱗癬、先天性爪肥厚症、コステロ症候群、および結節性硬化症から成る群から選択される。さらなる態様において、標的は変異を含む遺伝子産物であり、前記遺伝子産物は、Ｋ５、Ｋ１４、Ｋ１、Ｋ１０、Ｈ−Ｒａｓ、およびｍ−Ｔｏｒから成る群から選択される遺伝子により発現する。
【００２２】
幾つかの実施形態において、老化性疾患は、ＵＶ損傷および早老症から成る群から選択される。幾つかの態様において、標的は、マトリックスメタロプロテアーゼ−１およびプロジェリンから成る群から選択される遺伝子により発現する遺伝子産物である。
【００２３】
幾つかの実施形態において、炎症は、乾癬によるものである。幾つかの態様において、標的はインターロイキン−２３である。
【００２４】
一実施形態において、ウイルス感染は、疣贅をもたらす。幾つかの態様において、標的はＥ６／Ｅ７である。
【００２５】
さらなる実施形態において、美容上の変形は、脂漏性角化症、表皮母斑、および色素性母斑から成る群から選択される。種々の態様において、標的は変異を含む遺伝子産物であり、前記遺伝子産物は、ＦＧＦＲ３、Ｋ１０、およびＢ−Ｒａｆから成る群から選択される遺伝子により発現する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】プロモーター複合体結合（Ａ）および完全なｍＲＮＡ転写物形成（Ｂ）の形成を阻害する、オリゴヌクレオチド金ナノ粒子（Ａｕ−ＮＰ）抱合体の概略図を示す。
【図２】抱合体処理後の大腸菌の電子顕微鏡像を示す。
【図３】ナノ粒子の使用による、細菌ルシフェラーゼ発現の阻害についての結果の要約を示す。ナンセンスは、大腸菌ゲノムまたは形質移入されたプラスミド上に相補領域を持たない配列を表す。アンチセンスは、配列標的ルシフェラーゼを表す。相対的なルシフェラーゼ活性は、棒内のパーセンテージとして示され、ウミシイタケ発現に基準化される。
【図４】二重鎖侵入スキームを示す。Ａ）ナノ粒子による二重鎖（二重鎖の末端のフルオレセインと隣接するダブシル）の侵入により蛍光シグナルを発する概略図。Ｂ）結果は、短い（２０塩基対）二重鎖と長い（４０塩基対）二重鎖の両方において、二重鎖の侵入とともに蛍光が増大したことを例証する（灰色の棒はナンセンス配列を表し、黒色の棒はアンチセンス配列を表す）。
【図５】適用後２４時間内の、約２５ｎＭのｓｉＲＮＡ−金ナノ粒子の表皮、真皮、および皮下組織への浸透を示す。Ａ）マウス皮膚におけるｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰの共焦点像。左側のパネル＝Ｃｙ３。明るい色は、角質層（外側皮膚層）であり、これは、密度の高い粒子蓄積および自然蛍光の両方による明るい蛍光であり得る。毛（卵胞内の縦断面に見られる）も強い蛍光である、中央＝核のＤＡＰＩ染色、右＝重複像。画像は、約１００％の表皮細胞における蛍光ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰの取り込みを示す。Ｂ）下層間葉組織（＋）の脂肪細胞（矢印）および線維芽細胞も、ほぼ全体に蛍光粒子を取り込む。棒＝２０μｍ。
【図６】ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰを用いた４週間の治療後のＣ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＵＢＣ−ＧＦＰ）３０Ｓｃｈａ／ＪマウスにおけるＧＦＰノックダウンを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
局所的に、または全身送達のために経皮的に投与することができるナノ粒子送達システムを、本明細書に開示する。幾つかの実施形態において、本システムは、ナノ粒子（ｓｉＲＮＡ−ＮＰ）の表面上に濃密に詰められるｓｉＲＮＡ二重鎖を利用する。これらの抱合体は、生物学的条件下でのオリゴヌクレオチド殻の保持を含むが、これに限定されない多くの独特の特性を示し、同時に形質移入および遺伝子調節できる単一薬剤をもたらす。オリゴヌクレオチド−ＮＰ（ＯＮ−ＮＰ）は、有害な形質移入試薬を添加せずに細胞膜を容易に横断することができる。重要なことは、これらの構造は、核酸送達のビヒクルとして単に機能しないが、細胞内で構造体として抱合されたままである。蛍光分光試験は、チオール化されたオリゴヌクレオチドが、細胞内在化後、ＮＰに結合されたままであることを示し、ナノ物質の複合特性をうまく利用することができる。ＯＮ−ＮＰが示す別の特性は、生理学的環境におけるそれらのけた外れた安定性である。他のナノ物質および遺伝子形質移入試薬と違い、オリゴヌクレオチド−ＮＰは、生物学的に意義のある条件下で容易に操作することができる。これらは、高低塩濃度、極端なｐＨ、および温度変動を含む。ＯＮ−ＮＰのさらなる特性は、ヌクレアーゼによる分解に対するそれらの耐性である。エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼは、体液中に存在し、外来遺伝子物質を破壊するように機能するため、核酸の酵素安定性を増加するための方法は、非常に重要である。核酸の酵素安定性を増加するための先だっての戦略は、化学修飾に依存するが、オリゴヌクレオチド−ＮＰの増強した耐性は、ナノ粒子表面の高濃度機能付与に基づくという点で独特である。本環境は、ナノ粒子表面の近隣内に高局所誘電体を作製し、よって、高親和性標的認識および酵素分解に対する耐性の両方を提供する。ＯＮ−ＮＰが示すさらなる特性は、補助試薬を使用せずに、「形質移入が困難な」一次細胞を含む、種々の細胞種に進入するそれらの能力である。ＯＮ−ＮＰの別の特性は、明らかな毒性がないことである。これらのナノ抱合体は、独特の大きさ、電荷、および表面機能を有し、特性はオリゴヌクレオチドとＮＰの組み合わせに由来する。これらの独特な物質についての予備的な毒性学スクリーニングは、動物モデルの高用量で、急性毒性を示さなかった。
【００２８】
ＯＮ−ＮＰの局所的適用が、損傷性皮膚、リンパ節に対する、または内部標的への経皮送達のために循環流の中への選択的遺伝子抑制を送達するための新規手段であることを、本明細書に開示する。一実施形態において、ＯＮ−ＮＰを損傷性皮膚に直接送達することにより、副作用の可能性を最小に抑えながら、最大腫瘍量の部位でオリゴヌクレオチド−ＮＰ濃度を最大にする。
【００２９】
一態様において、本開示は、抗菌性組成物およびその使用方法を提供する。一態様において、抗菌性組成物は、オリゴヌクレオチドを含むように修飾されたナノ粒子を含み、オリゴヌクレオチドが、ハイブリッド形成を可能にする条件下で標的とハイブリッド形成するように、オリゴヌクレオチドは、原核生物遺伝子の標的非コード配列に十分に相補的である。本ハイブリッド形成により、抗菌性組成物は、標的原核生物細胞の成長を阻害する。標的細胞における特定の態様において、ハイブリッド形成は、標的配列によりコードされる機能タンパク質の発現を阻害する。種々の態様において、標的配列によりコードされる原核生物タンパク質の転写、翻訳、または両方は、阻害される。本開示はさらに、細胞を抗菌性組成物と接触させるステップを含む、細胞での標的原核生物遺伝子産物の生成を阻害するために、本明細書に開示される抗菌性組成物を利用する用法を提供し、該組成物のナノ粒子と関連するオリゴヌクレオチドは、ハイブリッド形成を可能にする条件下で、細菌遺伝子の標的非コード配列と十分に相補的であり、ハイブリッド形成は、標的遺伝子によりコードされる機能原核生物遺伝子産物の阻害をもたらす。標的原核生物配列の転写または翻訳のいずれか、または転写および翻訳の両方の阻害は、標的原核生物配列によりコードされる機能タンパク質の生成の阻害をもたらすことを、当業者は理解するであろう。
【００３０】
オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子および標的原核生物配列のハイブリッド形成は、本明細書に定義されるように、「複合体」を形成する。本明細書に使用される、「複合体」とは、二本鎖（または二重鎖）複合体、または三本鎖（または三重鎖）複合体のいずれかである。本明細書において、三重鎖複合体および二重鎖複合体は、標的細菌原核生物酸の翻訳または転写を阻害することが意図される。
【００３１】
本明細書に使用される、「非コード配列」とは、当該分野において認められる意味を有する。一般に、非コード配列は、遺伝子によりコードされるタンパク質を翻訳するためのコドンを含有しないポリヌクレオチド配列を表現する。幾つかの態様において、非コード配列は染色体である。幾つかの態様において、非コード配列は染色体外である。一態様において、非コード配列は、遺伝子のコード配列全てまたはその一部に相補的である。非コード配列は、発現のプロモーター、エンハンサー、およびサイレンサー等の調節要素を含む。非コード配列の例は、５’非コード配列および３’非コード配列である。「５’非コード配列」とは、コード配列に対して５’（上流）に位置するポリヌクレオチド配列を指す。５’非コード配列は、開始コドンの完全に処理されたｍＲＮＡ上流に存在し得、ＲＮＡへの一次転写物、ｍＲＮＡの安定性、または翻訳効率の処理に影響を及ぼす場合がある。「３’非コード配列」とは、コード配列に対して３’（下流）に位置するヌクレオチド配列を指し、ｍＲＮＡ処理または遺伝子発現に影響を及ぼすことができるポリアデニル化シグナル配列および他の配列コードシグナルを含む。ポリアデニル化シグナルは、通常、ポリアデニル酸配列のｍＲＮＡ前駆体の３’端への付加に影響を及ぼすその能力を特徴とする。
【００３２】
一実施形態において、非コード配列はプロモーターを含む。「プロモーター」とは、構造遺伝子の転写を方向づけるポリヌクレオチド配列である。典型的に、プロモーターは、構造遺伝子の転写開始部位に近い、遺伝子の５’非コード配列に位置する。転写の開始に機能するプロモーター内の配列要素は、多くの場合、コンセンサスヌクレオチド配列を特徴とする。これらのプロモーター要素は、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位、ＴＡＴＡ配位列、ＣＡＡＴ配列、分化特異的要素［ＤＳＥｓ；ＭｃＧｅｈｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．７：５５１（１９９３）］、環式ＡＭＰ応答要素（ＣＲＥ）、血清応答要素［ＳＲＥｓ；Ｔｒｅｉｓｍａｎ，Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．１：４７（１９９０）］、糖質コルチコイド応答要素（ＧＲＥ）、およびＣＲＥ／ＡＴＦ［Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１９９３８（１９９２）］、ＡＰ２［Ｙｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５７２８（１９９４）］、ＳＰ１、ｃＡＭＰ応答要素結合タンパク質［ＣＲＥＢ；Ｌｏｅｋｅｎ，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ．３：２５３（１９９３）］、およびオクタマー因子［一般に、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，４ｔｈ ｅｄ．（Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．１９８７）、およびＬｅｍａｉｇｒｅ ａｎｄ Ｒｏｕｓｓｅａｕ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０３：１ （１９９４）を参照］等の他の転写因子の結合部位を含む。プロモーターが誘導性プロモーターである場合、転写速度は、誘発剤に応じて増加する。逆に、プロモーターが構成プロモーターである場合、転写速度は、誘発剤により調節されない。抑制プロモーターも公知である。「コアプロモーター」は、ＴＡＴＡボックスおよび転写開始を含む、プロモーター機能に必須であるヌクレオチド配列を含有する。本定義により、コアプロモーターは、活性を強化する、または組織特異的活性を付与してもよい特定の配列の不在下で、検出可能な活性を有しても、有さなくてもよい。
【００３３】
別の実施形態において、非コード配列は調節要素を含む。「調節要素」は、コアプロモーターの活性を調節するポリヌクレオチド配列である。例えば、調節要素は、特定の原核生物において、排他的に、または優先的に転写を可能にする細胞因子と結合するポリヌクレオチド配列を含んでもよい。
【００３４】
別の実施形態において、非コード配列はエンハンサーを含む。「エンハンサー」は、転写の開始部位に対するエンハンサーの距離または配向に関わらず、転写の効率を増大することができる調節要素の種類である。
【００３５】
本明細書および付属の特許請求の範囲に使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、特に明確に記載のない限り、複数形の参照を含むことを、ここに記載しておく。
【００３６】
「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書において互換的に使用され、当該分野に認められる意味を有することを記載しておく。
【００３７】
「結合される」、「抱合される」、「修飾される」、および「機能化される」という用語も、本明細書において互換的に使用され、オリゴヌクレオチドのナノ粒子との結合を指すことをさらに記載しておく。
【００３８】
「ハイブリッド形成」とは、ワトソン−クリックＤＮＡ相補性、フーグスティーン結合、または当該分野に公知の他の配列特異的結合の規則に従う水素結合により、核酸の二本鎖間または三本鎖間の相互作用を意味する。ハイブリッド形成は、当該分野に公知の異なる厳密性条件下で実施することができる。
【００３９】
「オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子」および「ナノ抱合体」という用語は、本明細書において互換的に使用される。
【００４０】
本明細書に使用される、融解温度または「Ｔｍ」は、ハイブリッド形成される２つの特定の核酸が、５０％解離する温度である。
【００４１】
本明細書に使用される、「真皮」という用語は、皮膚またはそれに関連する意味であり、本明細書において「皮膚（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ）」と互換的に使用される。本明細書に使用される、「経皮」は、皮膚を超えて皮下組織まで、多くの場合は、全身血管またはリンパ循環内までを意味する。本明細書に使用される「局所的」という用語は、皮膚に関する意味である。よって、組成物が局所的に適用される時、皮膚に適用される。しかしながら、「局所的」という用語は、必ずしも組成物がどこに留まるかではなく、むしろどのように適用されるかを指すことを当業者は理解するであろう。
【００４２】
本開示の組成物および方法は、種々の実施形態において、これに限定されないが、例えば、特定の関心標的に応じて、異なる深度の皮膚を標的とするように意図される。種々の実施形態において、本開示の組成物は、表皮を標的とする。幾つかの実施形態において、本開示の組成物は真皮を標的とする。さらなる実施形態において、本開示の組成物は、経皮的に移動し、皮下組織、全身血管、またはリンパ循環に達する。
【００４３】
本開示の組成物の浸透の深度に影響を及ぼす要因および方法は、ナノ粒子の大きさ、およびナノ粒子の表面上の機能化されたオリゴヌクレオチドの密度を含むが、これらに限定されない。これらの態様は、以下で本明細書にさらに詳細に記載される。よって、幾つかの態様において、本開示は、本開示の組成物が移動できる深度をオリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子自体が促進することを意図する。幾つかの態様において、組成物中のビヒクルは、本開示の組成物が移動できる深度を促進する。またさらなる態様において、ビヒクルとオリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子の組み合わせは、本開示の組成物が移動できる深度を一緒に促進する。
【００４４】
メラノーマは、発癌性変異およびゲノム増幅の異なるパターンを有する、不均一な腫瘍群を表す。色素性母斑等の前駆体病変からメラノーマへの進行は、シグナル伝達経路の活性化につながる遺伝的変化を伴う段階的経路をたどると考えられる。ＲＡＳ／ＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路の活性化が最も一般的である（約６０％のメラノーマが、活性化ＢＲＡＦ変異および２５％ＮＲＡＳ変異を有する）。日光に曝された部位は、最も一般的にＢＲＡＦ変異を示し、一方、粘膜または肢端部位では、ＢＲＡＦ変異は稀であった。
【００４５】
ＢＲＡＦ変異の９５％以上［Ｄｈｏｍｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ ２３，５２９−５４５，ｉｘ（２００９）］は、バリンをグルタミン酸（Ｖ６００Ｅ）に置換する点変異（Ｔ１７９９Ａ）であり、ＢＲＡＦ活性化を５００倍増加する。この変異は、マウスモデルにおいて、機能亢進性メラニン細胞ＥＲＫシグナル伝達および移植された腫瘍の成長因子依存性増殖をもたらす［Ｗｅｌｌｂｒｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４（７）：２３３８−４２（２００４）］。
【００４６】
しかしながら、ＢＲＡＦ／ＥＲＫ経路のみの活性化は、メラノーマ形質転換を説明しない。実際、転移性メラノーマは、１つ以上の遺伝子変化を持つ傾向にあり［Ｇｏｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２８：２２８９−２２９８（２００９）］（以下の表Ａを参照）、ＢＲＡＦ／ＥＲＫ活性化に加え、最も一般的に、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／タンパク質キナーゼＢ（ＡＫＴ）経路の活性化につながる（散発性メラノーマの約７０％）［Ｃｈｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ６８：３４２９−３４３９（２００８）］。メラノーマのＢＲＡＦＶ６００Ｅ変異媒介進行における恒常的ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ活性化の重要な役割は、現在、生体外およびマウス研究の両方で例証されている。ＢＲＡＦ変異は、ＰＴＥＮ損失／不活性化（細胞株の約３０％およびメラノーマ転移の少なくとも５８％）（Ｂｉｒｃｋ ｅｔ ａｌ．，２０００）またはＡＫＴ３変異の活性化（４３−５０％のメラノーマ）［Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ９９：１２６５−１２６８（２００８）、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ６８：６６４−６７３（２００８）、Ｓｔａｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ６４：７００２−７０１０（２００４）、Ｔｓａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ１２２：３３７−３４１（２００４）］のいずれかとの組み合わせで頻繁に発見される。
【００４７】
【表Ａ】
【００４８】
抗菌性組成物
幾つかの実施形態において、本開示は、オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子およびビヒクルを含む抗菌性組成物を提供し、該オリゴヌクレオチドは、ハイブリッド形成を可能にする条件下で、標的とハイブリッド形成する原核生物遺伝子の標的非コード配列に十分に相補的である。種々の実施形態において、抗菌性組成物は、原核生物細胞感染の治療のために、それを必要とする哺乳類に治療上有効量で投与するために製剤化される。幾つかの態様において、哺乳類はヒトである。
【００４９】
種々の実施形態において、オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子の原核生物遺伝子とのハイブリッド形成は、原核生物細胞の成長を阻害（または防止）することを意図する。よって、オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子の原核生物遺伝子とのハイブリッド形成は、原核生物細胞が細菌である態様において、静菌作用または殺菌効果をもたらすことを意図する。ハイブリッド形成が生体内で生じる態様において、原核生物細胞の成長は、オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子と接触がない原核生物細胞の成長と比較して、約５％阻害される。種々の態様において、原核生物細胞の成長は、オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子と接触がない原核生物細胞の成長と比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、またはそれ以上阻害される。
【００５０】
ハイブリッド形成が生体外で生じる態様において、原核生物細胞の成長は、オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子と接触がない原核生物細胞の成長と比較して、約５％阻害される。種々の態様において、原核生物細胞の成長は、オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子と接触がない原核生物細胞の成長と比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、またはそれ以上阻害される。
【００５１】
阻害が生体内または生体外であるかどうかに関わらず、当業者は、慣用的な技法を使用して、原核生物の細胞成長の阻害レベルを決定することができる。例えば、原核生物細胞数の直接的定量化は、試料が一定期間にわたり収集される一連の試料を得（例えば、生体内阻害の場合には体液、生体外阻害の場合には液体培養試料）、固体の成長許容培地上で試料を培養し、成長することができる原核生物細胞の得られた数を数えることにより行われる。初期の時間点の原核生物細胞数に対する後期の時間点の原核生物細胞数により、原核生物細胞成長の阻害パーセントを得る。
【００５２】
幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子の原核生物遺伝子とのハイブリッド形成は、原核生物遺伝子によりコードされる機能化原核生物タンパク質の発現を阻害する。本明細書に使用される、「機能化原核生物タンパク質」とは、原核生物遺伝子によりコードされる完全長野生型タンパク質を指す。一態様において、機能化原核生物タンパク質の発現は、オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子と接触がない細胞と比較して、約５％阻害される。種々の態様において、機能化原核生物タンパク質の発現は、オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子と接触がない細胞と比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、またはそれ以上阻害される。つまり、提供される方法は、標的遺伝子産物の発現の任意の阻害の程度をもたらす方法を包含する。
【００５３】
関連する態様において、オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子の原核生物遺伝子とのハイブリッド形成は、原核生物細胞成長に必須の機能タンパク質の発現を阻害する。一態様において、原核生物細胞成長に必須の機能性原核生物タンパク質の発現は、オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子と接触がない細胞と比較して、約５％阻害される。種々の態様において、原核生物細胞成長に必須の機能性原核生物タンパク質の発現は、オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子と接触がない細胞と比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、またはそれ以上阻害される。
【００５４】
成長に必須の原核生物タンパク質は、グラム陰性遺伝子産物、グラム陽性遺伝子産物、細胞周期遺伝子産物、ＤＮＡ複製に関与する遺伝子産物、細胞分裂遺伝子産物、タンパク質合成に関与する遺伝子産物、細菌ジャイレース、およびアシル担体遺伝子産物を含むが、これらに限定されない。これらのクラスは、以下で本明細書に詳細に記載される。
【００５５】
本開示は、原核生物遺伝子の標的非コード配列とのハイブリッド形成が、活性変化を伴う原核生物遺伝子によりコードされるタンパク質の発現をもたらす抗菌性組成物にも関する。一態様において、原核生物遺伝子によりコードされるタンパク質の活性は、オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子と接触がない原核生物細胞のタンパク質の活性と比較して、約５％低下する。種々の態様において、原核生物タンパク質の活性は、オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子と接触がない原核生物細胞のタンパク質の活性と比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約１００％阻害される。別の態様において、原核生物遺伝子によりコードされるタンパク質の活性は、オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子と接触がない原核生物細胞のタンパク質の活性と比較して、約５％増加する。種々の態様において、原核生物タンパク質の発現は、オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子と接触がない原核生物細胞のタンパク質の活性と比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、またはそれ以上増加する。
【００５６】
原核生物細胞のタンパク質の活性は、ナノ粒子に結合するオリゴヌクレオチドの配列、標的にされる原核生物遺伝子（および遺伝子によりコードされるタンパク質）、およびナノ粒子の大きさを含むが、これらに限定されない幾つかのパラメータの機能として増加または低下する。
【００５７】
種々の実施形態において、本開示の抗菌性組成物は、原核生物遺伝子の転写を阻害することを意図する。幾つかの実施形態において、本開示の抗菌性組成物は、原核生物遺伝子の翻訳を阻害することを意図する。
【００５８】
幾つかの実施形態において、抗菌性組成物は、抗生物質耐性を付与する原核生物遺伝子の標的非コード配列とハイブリッド形成する。これらの遺伝子は、当業者に公知であり、例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ３７：Ｄ４４３-Ｄ４４７，２００９（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される。幾つかの態様において、抗菌性組成物の、抗生物質に耐性を付与する原核生物遺伝子の標的非コード配列とのハイブリッド形成は、原核生物の抗生物質への感受性の増加をもたらす。一態様において、原核生物の抗生物質への感受性は、抗菌性組成物と接触しなかった原核生物の感受性と比較して、約５％増加する。種々の態様において、原核生物の抗生物質への感受性は、抗菌性組成物と接触しなかった原核生物の感受性と比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、またはそれ以上増加する。抗生物質に対する相対的感受性は、本明細書に記載される、慣用的な技法を使用して、当業者が決定することができる。
【００５９】
抗生物質との併用療法
幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子抱合体を含む抗菌性組成物は、抗生剤との組み合わせで、投与用に製剤化され、各抗生剤は治療上有効量である。
【００６０】
本明細書に使用される、「抗生剤」という用語は、細菌および他の微生物の成長を阻害する、またはそれを死滅させる能力を有し、主に感染症の治療に使用される化学物質の任意の群を意味する。例えば、米国特許第７，６３８，５５７号を参照のこと（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。抗生剤の例としては、ペニシリンＧ、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、アンピシリン、アモキシリン、チカルシリン、カルベニシリン、メズロシリン、アズロシリン、ピペラシリン、イミペネム、アズトレオナム、セファロチン、セファクロル、セフォキシチン、セフロキシム、セフォニシド、セフメタゾール、セフォテタン、セフプロジル、ロラカルベフ、セフェタメト、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフタジジム、セフェピム、セフィキシム、セフポドキシム、セフスロジン、フレロキサシン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、シプロフロキサシン、オフロキサシン、エノキサシン、ロメフロキサシン、シノキサシン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、テトラサイクリン、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネチルマイシン、トブラマイシン、ストレプトマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、エリスロマイシンエストレート、エチルコハク酸エリスロマイシン、グルコヘプタン酸エリスロマイシン、ラクトビオン酸エリスロマイシン、ステアリン酸エリスロマイシン、バンコマイシン、テイコプラニン、クロラムフェニコロール、クリンダマイシン、トリメトプリム、スルファメトキサゾール、ニトロフラントイン、リファンピン、ムピロシン、メトロニダゾール、セファレキシン、ロキシスロマイシン、Ｃｏ−アモキシクラブラン酸、ピペラシリンとタゾバクタムの組み合わせ、ならびにこれらの種々の塩、酸、塩基、および他の誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。抗菌抗生剤は、ペニシリン、セファロスポリン、カルバセフェム、セファマイシン、カルバペネム、モノバクタム、アミノグリコシド、グリコペプチド、キノロン、テトラサイクリン、マクロライド、およびフルオロキノロンを含むが、これらに限定されない。
【００６１】
用量および薬学的組成物
本明細書に使用される、「治療上有効量」という用語は、識別された疾病または病状を治療する、軽減する、もしくは防止する、または認識できる治療効果、予防効果、もしくは阻害作用を示すのに十分な組成物の量を指す。効果は、例えば、臨床状態の改善、症状の低減、または本明細書に記載されるアッセイにより認めることができる。対象に対する正確な有効量は、対象の体重、体の大きさ、および一般の健康状態、病状の性質および程度、ならびに投与に選択される抗菌性組成物または組成物の組み合わせに依存する。所与の状態の治療上有効量は、臨床医の技能および判断の内である日常の実験により決定することができる。
【００６２】
本明細書に記載される組成物は、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤とともに、薬学的組成物に製剤化されてもよい。化合物または組成物は、原核生物感染または病状の治療を可能にする任意の経路により投与することができる。本明細書に記載されるように、局所適用に有用であるＯＮ−ＮＰおよびビヒクルを含む、本開示の組成物を提供する。さらなる投与経路は経口投与である。加えて、化合物または組成物は、任意の標準投与経路を使用して、患者に送達されてもよく、静脈内、腹腔内、肺内、皮下的、もしくは筋肉内等の非経口的、くも膜下内、経皮的、直腸的、経口的、経鼻的、または吸引を含む。徐放製剤も、胃腸管の体液と接触する活性剤の放出制御を達成するために、および血漿中に十分に一定した、有効レベルの活性剤を提供するために、本明細書に記載される薬剤から調製されてもよい。本目的のために、生物分解性重合体、水溶性重合体、またはその両方の混合物の重合体マトリックス、および任意に適切な界面活性剤に結晶形態を埋め込んでもよい。本内容において、埋め込みとは、重合体のマトリックスへのマイクロ粒子の組み込みを意味してもよい。放出制御製剤も、既知の分散剤またはエマルジョンコーティング技術を介して、分散されたマイクロ粒子または乳化マイクロ液体粒子のカプセル封入により得られる。
【００６３】
投与は、単回投与の形態を取るか、または実施形態の化合物は、分割量で、または連続放出製剤もしくは投与方法（例えば、ポンプ）のいずれかで、一定期間にわたり投与することができる。しかしながら、実施形態の化合物は対象に投与され、投与された化合物の量および選択された投与経路は、疾病状態の効果的な治療を可能にするように選択されなければならない。
【００６４】
ある実施形態において、薬学的組成物は、特定の投与形式および投与形態に応じて、担体、溶媒、安定剤、アジュバント、希釈剤等の薬学的に許容される賦形剤とともに製剤化することができる。薬学的組成物は、一般に、生理学的に相溶性のｐＨを達成するように製剤化されるべきであり、製剤および投与経路に応じて、約３のｐＨ〜約１１のｐＨ、好ましくは約ｐＨ３〜約ｐＨ７の範囲であってもよい。代替の実施形態において、ｐＨが約ｐＨ５．０〜約ｐＨ８の範囲に調節されることが好ましい場合がある。より具体的には、薬学的組成物は、種々の態様において、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤とともに、治療上有効量または予防的有効量の、本明細書に記載される少なくとも１つの組成物を含む。本明細書に記載される、薬学的組成物は、任意に、本明細書に記載される化合物の組み合わせを含んでもよい。
【００６５】
「薬学的に許容される賦形剤」とは、本明細書に記載される化合物等の、薬学的薬剤の投与用の賦形剤を指す。本用語は、過度の毒性なしに投与され得る任意の薬学的賦形剤を指す。
【００６６】
薬学的に許容される賦形剤は、一部には、投与される特定の組成物ならびに該組成物を投与するために使用される特定の方法により決定される。したがって、広範な薬学的組成物の適切な製剤が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓを参照のこと）。
【００６７】
適切な賦形剤は、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸共重合体、および不活性ウイルス粒子等の、大きく、ゆっくり代謝される巨大分子を含む担体分子であってもよい。他の例示的な賦形剤は、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、炭水化物（例えば、デキストリン、ヒドロキシアルキルセルロース、および／またはヒドロキシアルキルメチルセルロース）、ステアリン酸、液体（例えば、油、生理食塩水、グリセロールおよび／またはエタノール）、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質等を含む。リポソームも薬学的に許容される賦形剤の定義内に含まれる。
【００６８】
加えて、薬学的組成物は、減菌の注入可能な水性エマルジョンまたは油性懸濁液等の、減菌の注入可能な調製物の形態であってもよい。本エマルジョンまたは懸濁液は、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用して、当業者により調合されてもよい。減菌の注入可能な調製物も、１，２−プロパン−ジオール中の溶液等、非毒性の非経口的に許容される希釈液または溶媒中の減菌の注入可能な溶液または懸濁液であってもよい。
【００６９】
減菌の注入可能な調製物は、凍結乾燥された粉末としても調製することができる。利用されてもよい許容される溶媒は、水、リンゲル液、および等張塩化ナトリウム液である。加えて、減菌の固定油は、溶媒または懸濁媒体として利用することができる。本目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含む、任意の無刺激性固定油が利用されてもよい。加えて、同様に、脂肪酸（例えば、オレイン酸）も、注入可能物の調製に使用することができる。
【００７０】
原核生物タンパク質の阻害
幾つかの態様において、本開示は、特定の核酸を標的にする方法を提供する。あらゆる種の原核生物核酸が標的とされてもよく、本方法は、例えば、機能性原核生物遺伝子産物の生成を阻害するために使用することができる。本発明の方法により標的とさえ得る核酸の例としては、遺伝子および原核生物ＲＮＡまたはＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
種々の態様における、原核生物標的核酸について、核酸は、ゲノムＤＮＡからＲＮＡ転写される。
【００７２】
阻害の程度は、例えば、標的原核生物が見つかり、原核生物タンパク質の阻害が望ましい個人の体液試料から、または標的原核生物が見つかり、原核生物タンパク質の阻害が望ましい個人における、当該分野に周知の撮像技術により、生体内で判断される。代替的に、阻害の程度は、初期の時間点での細胞培養物または生物に存在した原核生物の量と比較して、細胞培養物または生物に残存する原核生物の量を定量化することにより生体内で判断される。
【００７３】
三重鎖複合体が形成される実施形態において、変異は原核ゲノムに導入されることが意図される。これらの実施形態において、オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子抱合体は変異を含み、三重鎖複合体の形成は、ナノ粒子に結合されるオリゴヌクレオチドと原核生物ゲノムの鎖との間の組み換え事象を開始する。
【００７４】
オリゴヌクレオチドハイブリッド形成および設計
本開示のオリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチド配列とハイブリッド形成する時、少なくとも約４５℃、典型的に、約５０℃〜６０℃の間のＴｍを有するが、Ｔｍは、例えば、６５℃等、高くてもよい。標的が原核生物ポリヌクレオチドである態様において、原核生物標的ポリヌクレオチド配列、および原核生物ｍＲＮＡ標的ポリヌクレオチド配列の選択は、以下に本明細書で考慮される。
【００７５】
一実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、生理学的条件下で、標的オリゴヌクレオチド配列とハイブリッド形成されるように設計され、Ｔｍは、実質的に３７℃を超え、例えば、少なくとも４５℃、幾つかの態様において、約６０℃〜８０℃である。オリゴヌクレオチドは、核酸に対して高結合親和性を有するように設計され、一態様において、標的オリゴヌクレオチド配列に１００％相補的であるか、またはミスマッチを含んでもよい。オリゴヌクレオチドが、標的オリゴヌクレオチド配列に９５％を超えて相補的である、標的オリゴヌクレオチド配列に９０％を超えて相補的である、標的オリゴヌクレオチド配列に８０％を超えて相補的である、標的オリゴヌクレオチド配列に７５％を超えて相補的である、標的オリゴヌクレオチド配列に７０％を超えて相補的である、標的オリゴヌクレオチド配列に６５％を超えて相補的である、標的オリゴヌクレオチド配列に６０％を超えて相補的である、標的オリゴヌクレオチド配列に５５％を超えて相補的である、または標的オリゴヌクレオチド配列に５０％相補的である方法を提供する。
【００７６】
当業者は、オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子抱合体のための適切な標的を容易に判断し、当該分野に公知の技法を使用して、オリゴヌクレオチドを設計し合成してもよいことを理解するであろう。標的は、例えば、関心の標的核酸の配列を得（例えば、ＧｅｎＢａｎｋから）、例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ６．０プログラム、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム、ＢＬＯＳＵＭ３０マトリックス、およびデフォルトパラメータを使用することにより、それを他の核酸と整合することにより識別することができ、これは、核酸整合について、１０の開始ギャップペナルティーおよび５．０の伸長ギャップペナルティーを含む。
【００７７】
任意の不可欠な原核生物遺伝子は、本開示の方法を使用することにより、標的遺伝子として意図される。上述のように、任意の原核生物種の不可欠な原核生物遺伝子は、大腸菌についてＧｅｒｄｅｓによって説明されるものを含む、種々の方法を使用して決定することができる［Ｇｅｒｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８５（１９）：５６７３−８４，２００３］。多くの不可欠な遺伝子は、細菌界全域で保存され、よって、標的の選択において、さらなるガイダンスを提供する。標的遺伝子配列は、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）により維持されるもの等、容易に利用可能な生物情報科学の手段を使用して識別することができる。多数の微生物種の完全な基準ゲノム配列を得ることができ、不可欠な細菌遺伝子の配列を識別することができる。一態様において、細菌株は、米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）からも入手することができる。任意の所与の種に適切な培養培地と条件を使用することにより、簡単な細胞培養法を確立して、オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子抱合体の抗菌活性を決定することができる。
【００７８】
次いで、最適な活性を示すオリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子抱合体は、ヒトの感染の治療に使用される前に、動物モデルまたは獣医動物で試験される。
【００７９】
治療上の標的
細胞分裂および細胞周期標的タンパク質の標的配列
本開示のオリゴヌクレオチドは、不可欠な原核細胞遺伝子をコードする原核生物核酸の配列とハイブリッド形成するように設計される。例示的な遺伝子は、細胞分裂、細胞周期タンパク質に必要なもの、または脂質生合成もしくは核酸の複製に必要な遺伝子を含むが、これらに限定されない。遺伝子の必須性が決定されると、任意の不可欠な細菌遺伝子は標的である。生物のどの遺伝子が不可欠であるかを決定するためのアプローチの１つは、記載されるように［Ｇｅｒｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８５（１９）：５６７３−８４，２００３、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる］、遺伝子フットプリント技術を使用することである。本報告において、６２０大腸菌遺伝子は、健全な好気成長の培養条件下で成長に不可欠であると識別され、３，１２６遺伝子は、不要であると識別された。進化的状況分析は、細菌界全体で、十分な数の不可欠な大腸菌遺伝子、特に、ＤＮＡ複製、細胞分裂、およびタンパク質合成等の主要な細胞プロセスのサブセットが保存されたことを実証した。
【００８０】
種々の態様において、本開示は、以下を含む不可欠な細菌タンパク質をコードする標的配列に、安定的かつ特異的に結合するのに有効な核酸配列であるオリゴヌクレオチドを提供する：（１）食中毒に関係する大腸菌株、例えば、Ｏ１５７：Ｈ７（米国特許出願第２００８０１９４４６３号の表１を参照、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）等の所与の細菌種の特定株に特異的な配列、（２）２つ以上の細菌種に共通する配列、（３）２つの関連する細菌属に共通する配列（すなわち、類似する系統発生起源の細菌属）、（４）グラム陰性細菌の中で一般に保存される配列、（５）グラム陽性細菌の中で一般に保存される（配列）、または（６）一般に、不可欠な細菌タンパク質コード核酸配列のコンセンサス配列。
【００８１】
一般に、本開示の方法を使用する、遺伝子発現の調節のための標的は、細胞分裂の遺伝子および細胞壁合成（分裂細胞壁またはｄｃｗ）遺伝子クラスターから転写されたｍＲＮＡ配列等の、活性原核生物成長または複製中に発現する原核生物核酸を含み、ｚｉｐＡ、ｓｕｌＡ、ｓｅｃＡ、ｄｉｃＡ、ｄｉｃＢ、ｄｉｃＣ、ｄｉｃＦ、ｆｔｓＡ、ｆｔｓＩ、ｆｔｓＮ、ｆｔｓＫ、ｆｔｓＬ、ｆｔｓＱ、ｆｔｓＷ、ｆｔｓＺ、ｍｕｒＣ、ｍｕｒＤ、ｍｕｒＥ、ｍｕｒＦ、ｍｕｒｇ、ｍｉｎＣ、ｍｉｎＤ、ｍｉｎＥ、ｍｒａＹ、ｍｒａＷ、ｍｒａＺ、ｓｅｑＡ、およびｄｄｌＢを含むが、これらに限定されない。大腸菌の細菌細胞分裂および細胞周期の一般的な報告については、それぞれ、［Ｂｒａｍｈｉｌｌ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．１３：３９５−４２４，１９９７］および［Ｄｏｎａｃｈｉｅ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４７：１９９−２３０，１９９３］を参照し、両方とも、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。さらなる標的は、脂質生合成（例えば、ａｃｐＰ）および複製（例えば、ｇｙｒＡ）に関与する遺伝子を含む。
【００８２】
大腸菌の細胞分裂は、細胞表層の全３層（細胞膜、剛性ペプチドグリカン層、および外膜）の協調された陥入を含む。中隔の収縮は、細胞を２つの区画に切断し、複製されたＤＮＡを分離する。少なくとも９つの不可欠な遺伝子産物が、本プロセスに関与する：ｆｔｓＺ、ｆｔｓＡ、ｆｔｓＱ、ｆｔｓＬ、ｆｔｓＩ、ｆｔｓＮ、ｆｔｓＫ、ｆｔｓＷ、およびｚｉｐＡ［Ｈａｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１（１）：１６７−７６，１９９９］。意図されるタンパク質標的は、以下に記述される３つであり、特に、以下に記載されるＧｙｒＡおよび標的である。
【００８３】
大腸菌の最も初期の不可欠な細胞分裂遺伝子の１つであるＦｔｓＺは、細菌細胞の分裂部位で膜関連環を形成する可溶性のチューブリン様ＧＴＰａｓｅである。環は、細胞収縮を促進すると考えられ、細胞壁陥入に影響を及ぼすように思われる。ＦｔｓＺは、大腸菌の細胞分裂を媒介する中隔環構造の必須区画である、ｚｉｐＡと呼ばれる大腸菌の新しい内膜内在性タンパク質に直接結合する［Ｌｕｔｋｅｎｈａｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ．６６：９３−１１６，１９９７］。
【００８４】
ＧｙｒＡは、細菌ジャイレース酵素のサブユニット、したがって、遺伝子を指す。細菌ジャイレースは、細胞のＤＮＡの高次コイルのレベルを制御する細菌ＤＮＡトポイソメラーゼの１つであり、ＤＮＡ複製に必要である。
【００８５】
ＡｃｐＰは、脂質生合成において不可欠な補助因子である、アシル担体タンパク質をコードする。脂肪酸生合成経路は、熱に安定した補助因子であるアシル担体タンパク質が、経路の中間体を結合することを必要とする。
【００８６】
これらの３つのタンパク質のそれぞれについて、米国特許出願第２００８０１９４４６３号の表１は、多数の重要な病原菌のそれぞれについての標的配列を含有する例示的な細菌配列を提供する。遺伝子配列は、各細菌株において、ＧｅｎＢａｎｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅの完全ゲノム配列に由来する。
【００８７】
原核生物１６ＳリボソームＲＮＡの標的配列
一実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、生理学的条件下で、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ核酸配列をコードする配列とハイブリッド形成されるように設計され、Ｔｍは、実質的に、３７℃を超え、例えば、少なくとも４５℃、好ましくは６０℃〜８０℃である。
【００８８】
より具体的には、オリゴヌクレオチドは、１つ以上の以下の特徴を有する標的１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列に、安定的かつ特異的に結合するのに有効である配列を有する：（１）１６ｓ ｒＲＮＡの二本鎖配列に見られる配列、例えば、ペプチジルトランスフェラーゼ中心、α−サルシナループ、および１６Ｓ ｒＲＮＡ配列のｍＲＮＡ結合配列、（２）細菌１６ｓ ｒＲＮＡの一本鎖配列に見られる配列、（３）所与の細菌種の特定株に特異的な配列、すなわち、食中毒に関連する大腸菌株、（４）特定の細菌種に特異的な配列、（５）２つ以上の細菌種に共通する配列、（６）２つの関連する細菌属に共通の配列（すなわち、類似する系統発生起源の細菌属）、（７）グラム陰性細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ配列の中で一般に保存される配列、（６）グラム陽性細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ配列の中で一般に保存される配列、または（７）一般に、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ配列のコンセンサス配列。
【００８９】
１６Ｓ ｒＲＮＡ 配列についての例示的な細菌および関連するＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号は、米国特許第６，６７７，１５３号の表１に提供され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００９０】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、胃腸管の常在菌叢の一部である、グラム陰性細菌である。数百の大腸菌株が存在し、大半は無害であり、健康なヒトおよび動物の胃腸管に生存する。現在、ヒトに胃腸炎を引き起こす、認識される腸病原性大腸菌（「ＥＥＣ群」）のクラスが４つ存在する。これらの中には、腸病原性（ＥＰＥＣ）株、および病原性メカニズムが典型的な大腸菌エンテロトキシンの排出に関連するものを含む。そのような大腸菌株は、胃腸管および尿管の感染、敗血症、肺炎、および髄膜炎に関連するものを含む、種々の疾病を引き起こす可能性がある。抗生物質は、幾つかの株に対して効果がなく、感染の再発を必ずしも防止しない。
【００９１】
例えば、大腸菌株０１５７：Ｈ７は、毎年、米国において、１０，０００〜２０，０００件の感染を引き起こすと推定される（疾病予防管理センター）（Ｆｅｄｅｒａｌ Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）。出血性大腸炎は、大腸菌株Ｏ１５７：Ｈ７によって引き起こされる急性疾病の名称である。就学前の児童および高齢者は、重篤な合併症のリスクが最も高い。大腸菌株０１５７：Ｈ７は、近年、太平洋北西のファーストフードレストランからの調理不足のハンバーガーを食べた４人の子供の死亡の原因として報告された［例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．１２０（１）：１７−２０，１９９８を参照］。
【００９２】
腸病原性大腸菌株の例示的な配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号Ｘ９７５４２、ＡＦ０７４６１３、Ｙ１１２７５およびＡＪ００７７１６を含む。
【００９３】
ネズミチフス菌は、臨床的に、局所的な胃腸感染である胃腸炎（下痢、腹部疝痛、および発熱）から重篤な全身疾患である腸熱（腸チフスを含む）までに及ぶ、種々の病状を引き起こすグラム陰性細菌である。サルモネラ感染は、実質的な家畜の損失も引き起こす。
【００９４】
グラム陰性桿菌に特有である、サルモネラｓｐｐ．の細胞壁は、細胞の溶解によって遊離された複雑なリポ多糖（ＬＰＳ）構造を含有し、内毒素として機能する場合があり、これは生物の病原性に寄与する。
【００９５】
汚染食品は、完全に調理されない肉類および畜産物にサルモネラが残存するという事実により、非チフス性感染における主な伝染様式である。数多くの他の家畜および野生動物に加え、最も一般的な動物源は、ニワトリ、シチメンチョウ、ブタ、およびウシである。サルモネラｓｐｐ．により引き起こされた腸チフスおよび他の腸熱の疫学は、ヒトの糞便で汚染された水と関係する。
【００９６】
腸チフスに対するワクチンが入手可能であり、一部有効であるが、非チフス性サルモネラ感染に対するワクチンは入手不可能である。非チフス性サルモネラ症は、衛生的な食肉処理の実践ならびに食品の調理および冷凍を通して制御される。抗生物質は、全身疾患について示され、ある程度の成功のため、アンピシリンが使用されている。しかしながら、過剰な量の抗生物質を用いた治療下の患者において、胃手術後に免疫抑制剤を用いた治療下の患者において、および溶血性貧血、白血病、リンパ腫、またはＡＩＤＳ、サルモネラ感染の患者において、医療上の問題が残る。
【００９７】
シュードモナスｓｐｐ．は、多くの抗生物質に耐性であり、病院内（院内）感染の主な原因のため、臨床的に重要である、運動型のグラム陰性桿体である。感染は、易感染性の個人、やけどの被害者、呼吸器を使用している個人、留置カテーテルを有する個人、ＩＶ麻酔使用者、および慢性の肺疾患（例えば、嚢胞性線維症）を有する個人に多くみられる。感染は健康な個人においては稀であるが、多くの部位で生じ、尿管感染、敗血症、肺炎、咽頭炎、および数多くの他の問題につながる可能性があり、治療は、多くの場合、役に立たず、死亡率は非常に顕著である。
【００９８】
緑膿菌は、単極運動性を伴うグラム陰性の好気性桿体形状の細菌である。日和見性ヒト病原菌である緑膿菌は、植物の日和見性病原菌でもある。他のシュードモナス菌と同様、緑膿菌は、種々の色素を分泌する。緑膿菌の決定的な臨床識別は、ピオシアニンおよびフルオレセイン両方の生成を識別すること、ならびに菌の４２℃で成長する能力を含む。緑膿菌は、ディーゼルおよびジェット燃料で成長することもでき、そのため、炭化水素資化微生物（または「ＨＵＭムシ」）として知られ、細菌性腐食を引き起こす。
【００９９】
コレラ菌は、ヒトに感染するグラム陰性桿体であり、衛生状態の不良により広がる疾病であるコレラの原因であり、給水の汚染となる。コレラ菌は、ヒトの小腸にコロニーを形成することができ、そこで、粘膜にわたってイオン輸送を妨害する毒素を生成する。コレラ菌に感染した個人は、電解質を含有する溶液を用いて静脈内または経口的のいずれかで水分補強する必要がある。疾病は、一般に自己限定であるが、脱水症状および必須の電解質の欠乏により死亡する可能性がある。テトラサイクリン等の抗生物質は、疾病の経過を短くすることが実証されており、現在、経口ワクチンが開発途中である。
【０１００】
淋菌は、グラム陰性球菌であり、これは、一般的な性交感染症の起因菌である淋病である。淋菌は、その表面抗原を変化させることができ、再感染のための免疫の発生を防止する。およそ７５０，０００件の淋病が、毎年、米国で報告されており、さらに７５０，０００件が、毎年、未報告であると推定され、その大部分は１０代の若者および若年成人である。アンピシリン、アモキシリン、またはペニシリンの幾つかの種類が、淋病の治療に推奨されていた。しかしながら、ペニシリン耐性淋病の発生率が増加し、注入による新しい抗生物質、例えば、セフトリアキソンまたはスペクチノマイシンが、現在、ほとんどの淋菌感染の治療に使用されている。
【０１０１】
黄色ブドウ球菌は、通常、ヒトの鼻にコロニーを形成するグラム陽性球菌であり、時折、皮膚で見られる。ブドウ球菌は、血流感染、肺炎、および院内感染を引き起こす可能性がある。黄色ブドウ球菌は、重度の食中毒を引き起こす可能性があり、多くの株は、食品中で成長し、外毒素を生成する。一般的な抗生物質、例えば、バンコマイシンに耐性のブドウ球菌が、地域および病院内の両方の主要な公共衛生問題として、米国および国外に出現した。近年、バンコマイシン耐性ブドウ球菌単離体（ｉｓｏｌａｔｅ）も、日本で確認された。
【０１０２】
結核菌は、結核の起因菌であるグラム陽性細菌であり、時折、致命的な、死に至る疾病である。結核は増えており、世界的であり、単一感染症からの主要な死因である（現在、毎年、３００万人の死亡率である）。脳、腎臓、および骨を含む、ヒト身体の幾つかの器官に影響を及ぼす可能性があるが、最も一般的には、肺に影響を及ぼす。
【０１０３】
米国において、陽性の皮膚試験により示されるように、約１０００万人が結核菌に感染し、毎年、約２６，０００件が新しい活動性疾病である。結核（ＴＢ）症例の増加は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、ホームレス、薬物乱用、および活動性感染を有する個人の移民と関連している。全てのＴＢ病原菌を単一薬剤で破壊できないため、薬物に影響されやすいＴＢに対する現在の治療プログラムは、６〜９ヶ月の間、２つまたは４つの薬物（例えば、イソニアジド、リファンピン、プラジナミド、エタンブトール、またはストレプトマイシン）を服用することを含む。加えて、薬物耐性および多剤耐性の結核菌株の記録は増加している。
【０１０４】
ピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）は、胃の裏層に感染する、らせん状またはＳ字形態の、微好気性でグラム陰性の低成長鞭毛生物である。ピロリ菌は、胃腺癌をもたらす慢性表層性胃炎、消化性潰瘍、および慢性萎縮性胃炎に関連するヒト胃病原菌である。ピロリ菌は、ヒトにおいて最も一般的な慢性細菌感染の１つであり、活動性胃炎を有する患者の９０％に見られる。現在の治療法は、大半の症例において、ピロリ菌を根絶する、ビスマス、メトロニダゾール、およびテトラサイクリンまたはアモキシリンのいずれかを用いた三剤療法を含む。三剤療法を用いた問題は、患者のコンプライアンス、副作用、およびメトロニダゾール耐性を含む。有望な二剤療法の代替レジメンは、アモキシリンとメトロニダゾール、またはオメプラゾールとアモキシリンである。
【０１０５】
肺炎球菌は、グラム陽性球菌であり、細菌性肺炎ならびに中耳感染（中耳炎）および髄膜炎の最も一般的な原因の１つである。米国において、毎年、肺炎球菌疾病は、約５０，０００件の菌血症、３，０００件の髄膜炎、１００，０００〜１３５，０００件の入院、および７００万件の中耳炎の原因である。肺炎球菌感染は、米国において、毎年、推定４０，０００人の死亡を引き起こす。２歳未満の子供、６５歳以上の成人、および例えば、鬱血性心臓病、糖尿病、気腫、肝臓病、鎌状赤血球、ＨＩＶを含む、基礎疾患を有するいずれの年齢の個人、および特殊環境、例えば、養護施設および長期療養施設等で生活するものは、感染のリスクが最も高い。
【０１０６】
薬物耐性肺炎球菌株は、米国で一般的になっており、多くのペニシリン耐性肺炎球菌は、エリスロマイシンまたはトリメトプリム−スルファメトキサゾール等の他の抗菌剤にも耐性である。
【０１０７】
梅毒トレポネーマは、梅毒を引き起こすスピロヘータである。梅毒トレポネーマは、排他的に、梅毒、いちご腫、および非性病の地方病性梅毒またはピンタを引き起こす病原菌である。梅毒トレポネーマは、生体外で成長することができないが、哺乳類細胞なしで増殖する。初感染は、感染部位で潰瘍を引き起こすが、細菌は、全身に移動し、時間とともに多くの臓器を損傷する。その後期段階で、未治療の梅毒は、感染性ではないが、重篤な心臓異常、精神疾患、失明、他の神経性問題、および死を引き起こす可能性がある。
【０１０８】
梅毒は、通常、ペニシリンで治療され、注入により投与される。他の抗生物質は、ペニシリンにアレルギーがある患者、または常用量のペニシリンに応答しない患者に利用可能である。梅毒の全段階において、適切な治療は、疾病を治癒するが、後期の梅毒において、既に身体器官を損傷し、反転させることができない。
【０１０９】
クラミジアトラコマティスは、米国において、最も一般的な細菌の性感染症であり、毎年、４００万件の新しい症例が生じると推定される。最も高い感染率は、１５〜１９歳である。クラミジアは、非淋菌性尿道炎（ＮＧＵ）、子宮頚炎、細菌性膣炎、および骨盤内炎症性疾患（ＰＩＤ）の主な原因である。クラミジア感染症は、非常に軽度の症状であるか、または症状がないかもしれないが、治療しないままだと、クラミジア感染症は、特に女性の生殖器官に重篤な損傷をもたらす可能性がある。アジスロマイシン、エリスロマイシン、オフロキサシン、アモキシリン、またはドキシサイクリン等の抗生物質が、典型的に、クラミジア感染を治療するために処方される。
【０１１０】
ヘンセラ菌ネコ引っかき熱（ＣＳＦ）もしくはネコ引っかき病（ＣＳＤ）は、ネコとの接触を通してもたらされるヒトの疾病であり、もともとはロシャメリアヘンセラと名付けられ、現在はヘンセラ菌として知られる、グラム陰性桿体により引き起こされる。症状は、発熱およびリンパ節の腫大を含み、ＣＳＦは、一般に、比較的良性で、個人の自己限定性疾病であるが、ヘンセラ菌感染は、易感染性の個人に明確な臨床症状を生じ、菌血症を伴う急性熱病、細菌性血管腫症、肝臓紫斑病、細菌性脾炎、およびＡＩＤＳ脳症等の他の慢性疾病徴候を含む。疾病は、ドキシサイクリン、エリスロマイシン、リファンピン、ペニシリン、ゲンタマイシン、セフトリアキソン、シプロフロキサシン、およびアジスロマイシン等の抗生物質で治療される。
【０１１１】
インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）は、グラム陰性細菌のファミリーであり、６種が知られており、最もインフルエンザ菌に関連する疾病は、Ｂ型または「ＨＩＢ」により引き起こされる。ＨＩＢのワクチンが開発されるまで、ＨＩＢは、中耳炎、副鼻腔感染、気管支炎の一般的な原因であり、髄膜炎の最も一般的な原因であり、肺炎、敗血症性関節炎（関節感染）、蜂巣炎（軟組織の感染）、および心膜炎（心臓を囲む膜の感染）の場合には、頻繁な原因であった。インフルエンザ菌Ｂ型細菌はヒトに広まり、通常、疾病を引き起こさずに喉および鼻に生存する。５歳未満のワクチン接種をしていない子供は、ＨＩＢ疾病のリスクがある。インフルエンザ菌感染により引き起こされる髄膜炎および他の重篤な感染は、脳損傷または死に至る。
【０１１２】
志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓ．）は、赤痢を引き起こすグラム陰性桿体である。結腸において、細菌は、粘膜細胞に進入し、粘膜細胞内で分裂し、大規模な炎症性応答をもたらす。赤痢菌感染は、脱水症状につながる重度の下痢を引き起こす可能性があり、きわめて若年な、きわめて老年な、または慢性的に病気の人にとっては危険である可能性がある。志賀赤痢菌は、強力な毒素（志賀毒素）を形成し、これは細胞毒性、腸管毒性、神経毒性であり、タンパク質合成の阻害剤として作用する。アンピシリンおよびＴＭＰ−ＳＭＸ等の抗生物質への耐性が発達したが、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン、およびエノキサシン等の新しく、高価な抗生物質は、有効である。
【０１１３】
リステリアは、ヒトおよび動物の糞便にみられる、グラム陽性の運動性細菌である。リステリア菌は、リステリア症、髄膜脳炎、および髄膜炎等の疾病を引き起こす。この菌は、特に妊娠中の女性、新生児、高齢者、および易感染性の個人において、食物媒介性病原菌による死亡の主な原因の１つである。植物質の腐食、下水、水、および土壌等の環境で発見され、両極限温度で生存し、塩濃度は、特に再加熱されない食物において、菌を非常に危険な植物食物媒介性病原菌にさせる。細菌は、腸の感染部位から中枢神経系および胎児−胎盤部に広がる可能性がある。髄膜炎、胃腸炎、および敗血症は、感染の結果起こる。ウシおよびヒツジにおいて、リステリア感染は、脳炎および自然流産を引き起こす。
【０１１４】
プロテウスミラビリスは、腸内グラム陰性共生菌であり、大腸菌の遠縁に当たる。通常、ヒトの尿道にコロニーを形成するが、カテーテル処置された個人の尿路感染の主な原因である日和見病原性菌である。プロテウスミラビリスは、例外的な特徴が２つある：１）非常に迅速な運動性を有し、これは、培養プレート上で、群泳現象として自身を示す、および２）ウレアーゼを生成し、これは、それに尿素を分解し、尿生殖器管で生存する能力を付与する。
【０１１５】
ペスト菌は、疫病の起因菌であり（腺および肺）、世界中で数百万の死者を出した壊滅的な疾病である。病原菌は、感染したノミの咬合を介してラットからヒトに、または広がった感染中の空気を介してヒトからヒトに伝播し得る。ペスト菌は、疾病を発症させるのに非常に少ない数を必要とする、非常に病原性の菌であり、多くの場合、治療せずに放置すると、致命的である。菌は腸管侵入性であり、宿主全体に全身的に広がる前に、マクロファージで生存し、増殖する。
【０１１６】
炭疽菌は炭疽病としても知られる。ヒトは、汚染された動物と接触すると感染する。炭疽病は、ヒトとヒトの接触により伝播されない。疾病の３つの形態は、皮膚性（皮膚）、肺性（肺）、および腸管を含む感染部位を示す。肺および腸管感染は、治療せずに放置すると、多くの場合、致命的である。胞子は、マクロファージにより取り込まれ、ファゴリソソーム（膜区画）の中に内部移行し、発芽が開始する。細菌は、感染したマクロファージが溶解すると、血流の中に放出され、急速に増殖し、敗血性ショック、呼吸困難、および臓器不全をもたらすプロセスである、循環系統およびリンパ系全体に広がる。本病原菌の胞子は、テロ兵器として使用された。
【０１１７】
鼻疽菌は、主に、ウマ、ラバ、およびロバに生じる感染症である、鼻疽を引き起こすグラム陰性の好気性の細菌である。ヒト感染とはほとんど関係がなく、一般には、家畜に見られる。この菌は、類鼻疽菌に類似し、非運動性であることによって区別される。病原体は、宿主適応であり、その宿主の外部の環境では見られない。鼻疽は、抗生物質で治療されないと、多くの場合、致命的であり、伝播は、空気を通して、またはより一般的には、感染した動物と接触すると起こる可能性がある。迅速な発症の肺炎、菌血症（血液を通した病原菌の蔓延）、嚢胞、および死亡は、感染中の一般的な結果である。サルモネラ菌のものと類似するＩＩＩ型分泌系が必要であるが、病原性のメカニズムは、良く理解されていない。生物テロ物質としての可能性を有すると考えられる、この潜在的に危険な菌のワクチンは存在しない。本病原菌のゲノムは、関連する類鼻疽菌（以下）と比較すると、多数の挿入配列、および細胞表面タンパク質の抗原変異において機能してもよい多数の単純配列反復を持つ。
【０１１８】
類鼻疽菌は、ヒトおよび動物に類鼻疽を引き起こす、グラム陰性細菌である。類鼻疽は、アジア、タイ、およびオーストラリアの特定地域に見られる疾病である。類鼻疽は、典型的に、土壌菌であり、水田および湿性熱帯土壌から回収されたが、日和見病原体として、真性糖尿病を患うもの等の、感受性の高い個人に疾病を引き起こす可能性がある。菌は、細胞内に存在し、肺炎および菌血症（血流を通した細菌の蔓延）を引き起こす可能性がある。潜伏期は非常に長く、感染は疾病を数十年先行する場合があり、治療は、数ヶ月の抗生物質の使用を要し、再発は、一般的に見られる現象である。細胞内蔓延は、細胞の一極でのアクチン重合の誘発を介して生じる場合があり、細胞質を通した、および細胞から細胞の移動を可能にする。本菌は、鼻疽菌ゲノムで見られるものと類似する抗原変異を促進する場合がある、多数の小さい配列反復を持つ。
【０１１９】
セパシア菌は、少なくとも７つの異なる亜種からなるグラム陰性細菌であり、バークホルデリアマルティボランス、バークホルデリアベトナミエンシス、バークホルデリアスタビリス、バークホルデリアセノセファシア、およびバークホルデリアアムビファリアを含む。セパシア菌は、基礎肺疾患（（慢性肉芽腫症等の）嚢胞性線維症または免疫問題等）を有する個人に多くの場合、肺炎を引き起こす、重要なヒト病原体である。セパシア菌は、典型的に、水および土壌で発見され、湿潤環境で長期間生存することができる。ヒトからヒトへの感染が記録されており、結果として、嚢胞性線維症を有する患者のための多くの病院、クリニック、およびキャンプは、セパシア菌の厳密な隔離予防を実行した。細菌を有する個人は、多くの場合、蔓延を制限するために、細菌を保有しない個人とは別の場所で治療される。これは、セパシア菌の感染が、死をもたらす肺機能の急激な低下につながる可能性があるためである。セパシア菌の診断は、喀痰培養物から細菌を単離することを含む。セパシア菌は、アミノグリコシド（トブラマイシン等）を含む、多くの一般的な抗生物質に自然に耐性であるため、治療は困難である。治療は、典型的に、複数の抗生物質を含み、セフタジジム、ドキシサイクリン、ピペラシリン、クロラムフェニコロール、およびコトリモキサゾールを含んでもよい。
【０１２０】
野兎病菌は、Ｅｄｗａｒｄ Ｆｒａｎｃｉｓにより、２０世紀初期に、カルフォルニアのトゥーレアリ郡のリスに感染した、疫病様疾病の起因菌として最初に認められた。病原菌は、今や、その同名を持つ。疾病は、野兎病（ｔｕｌａｒｅｍｉａ）と呼ばれ、履歴全体にわたって記述された。菌は、感染したダニまたはアブから、感染した肉を通して、またはエアロゾルを介してヒトに伝播することができ、よって、生物テロ物質の可能性がある。水性菌であり、原虫内での生存が発見でき、レジオネラで認められるものと類似する。感染率が高く、食作用細胞および非食作用細胞に侵入することができ、急速に増殖する。マクロファージ内に入ると、菌は、ファゴソームを逃れ、細胞基質に生存する。
【０１２１】
獣医適用
家畜の胃腸管の健康な細菌叢は、健康および関連する食品の対応する産生にきわめて重要である。ヒトと同様、健康な動物の胃腸管は、多数の種類の細菌（すなわち、大腸菌、緑膿菌およびサルモネラｓｐｐ．）を含有し、相互と生態的均衡に生存する。本均衡は、飼料の変化、ストレス、または抗生物質もしくは他の治療上の処置に応答して乱される場合があり、サルモネラ、カンピロバクター、腸球菌、野兎病、および大腸菌等の、細菌により一般に引き起こされる細菌病を動物にもたらす。これらの動物の細菌感染は、多くの場合、治療的介入を必要とし、これは、治療費がかかり、また頻繁に生産能の低下に関係する。
【０１２２】
結果として、家畜を抗生物質で慣用的に治療し、胃腸管の叢のバランスを維持する。本アプローチの欠点は、抗生物質耐性菌が発生し、そのような抗生物質および耐性菌が、ヒトが消費する食品に持ち越されることである。
【０１２３】
皮膚疾患を軽減するための標的
本開示の幾つかの実施形態において、本明細書に開示されるＯＮ−ＮＰを含む組成物を投与し、標的遺伝子の発現を調節することが意図される。種々の実施形態において、組成物は皮膚疾患を軽減するために投与される。
【０１２４】
幾つかの態様において、軽減される皮膚疾患は、過剰増殖疾患、腫瘍性疾患、遺伝的疾患、老化、炎症、感染、および美容上の変形を含むが、これらに限定されない。さらなる態様において、皮膚疾患は、癌を含むが、これに限定されない。またさらなる態様において、癌は、扁平上皮癌、基底細胞癌、メラノーマ、および乳癌を含むが、これらに限定されない。関連する態様において、本発明の組成物により標的にされる遺伝子産物は、Ｒａｓ、ＩｋＢα、ヘッジホッグ、Ｂ−Ｒａｆ、ＡｋｔおよびサイクリンＤを含むが、これらに限定されない。
【０１２５】
幾つかの実施形態において、本開示の組成物は、単純性表皮水疱症、水疱性魚鱗癬、先天性爪肥厚症、コステロ症候群、および結節性硬化症を含むが、これらに限定されない遺伝的疾患を軽減するために投与される。幾つかの態様において、投与された組成物により標的にされる遺伝子産物は、変異を含む遺伝子産物であり、該遺伝子産物は、Ｋ５、Ｋ１４、Ｋ１、Ｋ１０、Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、Ｋ−Ｒａｓ、ＮＦ−ｋＢ、Ａｋｔ、Ｂ−ｒａｆ、ＥＲＫ、Ｍｅｋ１、Ｍｅｋ２およびｍ−Ｔｏｒを含むが、これらに限定されない遺伝子により発現する。
【０１２６】
幾つかの実施形態において、本開示の組成物は、ＵＶ損傷および早老を含むが、これらに限定されない老化による疾患を軽減するために投与される。幾つかの態様において、投与された組成物により標的にされる遺伝子産物は、マトリックスメタロプロテアーゼ−１およびプロジェリンを含むが、これらに限定されない。
【０１２７】
さらなる実施形態において、本開示の組成物は、アトピー性皮膚炎および乾癬を含むが、これらに限定されない炎症性疾患を軽減するために投与される。幾つかの態様において、投与された組成物により標的にされる遺伝子産物は、インターロイキン−２３を含むが、これに限定されない。種々の態様において、投与された組成物により標的にされる遺伝子産物は、ＩＬ１−ａ、ＩＬ１−β、ＩＬ６、ＴＮＦ−ａ、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、ＩＦＮ−γ、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ＴＧＦ−β、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−８を含むが、これらに限定されない。
【０１２８】
またさらなる実施形態において、本開示の組成物は、感染を軽減するために投与される。幾つかの態様において、感染はウイルス感染である。幾つかの態様において、感染は、本明細書に開示される細菌感染である。感染はウイルス感染である幾つかの態様において、ウイルス感染は疣贅をもたらすと考えられる。これらの態様において、投与された組成物により標的にされる遺伝子産物は、Ｅ６／Ｅ７を含むが、これに限定されない。
【０１２９】
幾つかの実施形態において、本開示の組成物は、脂漏性角化症、表皮母斑、および色素性母斑を含むが、これらに限定されない美容上の変形を軽減するために投与される。幾つかの態様において、投与された組成物により標的にされる遺伝子産物は、変異を含む遺伝子産物であり、該遺伝子産物は、ＦＧＦＲ３、Ｋ１０、およびＢ−Ｒａｆを含むが、これらに限定されない遺伝子により発現する。
【０１３０】
ビヒクル
幾つかの実施形態において、本開示のＯＮ−ＮＰ組成物および方法はビヒクルを含む。本明細書に使用される、「ビヒクル」とは、オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子が関連する塩基化合物である。
【０１３１】
本開示の組成物および方法に有用なビヒクルは、当該分野の当業者に公知であり、軟膏、クリーム、ローション、ゲル、泡状物、緩衝液、または水を含むが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、ビヒクルは、角質層への浸透を強化する、サリチル酸、α−ヒドロキシ酸、または尿素を含むが、これらに限定されない、１つ以上の追加物質を含む。
【０１３２】
種々の態様において、本開示の組成物および方法の使用に意図されるビヒクルは、Ａｑｕａｐｈｏｒ（登録商標）治癒軟膏、Ａ＋Ｄ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、グリセロール、鉱物油、バセリン集中ケアクリーム（鉱物油およびグリセリンを含む）、石油ゼリー、ＤＭＬ（ワセリン、グリセリン、およびＰＥＧ２０を含む）、ＤＭＬ（ワセリン、グリセリン、およびＰＥＧ１００を含む）、Ｅｕｃｅｒｉｎ保湿クリーム、セタフィル（ワセリン、グリセロール、およびＰＥＧ３０を含む）、セタフィルＣｅｒａＶｅ（ワセリンおよびグリセリンを含む）、ＣｅｒａＶｅ（グリセリン、ＥＤＴＡ、およびコレステロールを含む）、Ｊｅｒｇｅｎｓ（ワセリン、グリセリン、および鉱物油を含む）、およびＮｉｖｅａ（ワセリン、グリセリン、および鉱物油を含む）を含むが、これらに限定されない。当業者は、上記のリストから、追加のビヒクルは、本開示の組成物および方法に有用であることを理解するであろう。
【０１３３】
本明細書に使用される、軟膏は油中水型の製剤である。本明細書に使用される、クリームは水中油型の製剤である。一般に、ローションは、クリームまたは軟膏より水分が多く、ゲルはアルコールを含み、泡状物は気泡を液体中に閉じ込めることにより形成される物質である。これらの用語は、当業者に理解される。
【０１３４】
ナノ粒子
それに結合されるポリヌクレオチドを有するように機能化されるナノ粒子を提供する。ナノ粒子の大きさ、形状、および化学組成は、得られるポリヌクレオチド機能化ナノ粒子の特性の一因となる。これらの特性は、例えば、光学特性、光電子特性、電気化学特性、電子特性、種々の溶液における安定性、磁気特性、および細孔およびチャネルの大きさの変化を含む。異なる大きさ、形状、および／または化学組成を有するナノ粒子の混合物、ならびに均一な大きさ、形状、および化学組成を有するナノ粒子の使用、したがって、特性の混合が意図される。適切な粒子の例としては、その開示が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，２３８，４７２号および国際公開第ＷＯ２００３／０８５３９号に記載されるもの等、集合粒子、等方性粒子（球形粒子等）、異方性粒子（非球形桿体、四面体、および／または角柱等）、およびコア−シェル粒子を含むが、これらに限定されない。
【０１３５】
一実施形態において、ナノ粒子は金属性であり、種々の態様において、ナノ粒子はコロイド性金属である。よって、種々の実施形態において、本発明のナノ粒子は、金属（例えば、銀、金、白金、アルミニウム、パラジウム、銅、コバルト、インジウム、ニッケル、またはナノ粒子形成に受け入れられる任意の他の金属を含むが、これらに限定されない）、半導体（例えば、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、およびＣｄＳまたはＺｎＳでコーティングされるＣｄＳｅを含むが、これらに限定されない）、および磁性（例えば、強磁性）コロイド性物質が挙げられる。
【０１３６】
また、米国特許公開第２００３／０１４７９６６号に記載されるように、本発明のナノ粒子は、商業的に入手可能なもの、ならびに合成されるもの、例えば、溶液中の進行性核形成から（例えば、コロイド反応により）、またはスパッタ蒸着法等の種々の物理および化学蒸着プロセスにより生成されるものを含む。例えば、ＨａＶａｓｈｉ，Ｖａｃ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ａ５（４）：１３７５−８４（１９８７）、Ｈａｙａｓｈｉ，Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｔｏｄａｙ，４４−６０（１９８７）、ＭＲＳ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，Ｊａｎｕａｒｙ １９９０，１６−４７を参照のこと。米国特許公開第２００３／０１４７９６６号にさらに記載されるように、意図されるナノ粒子は、代替的に、当該分野に公知の方法を使用して、ＨＡｕＣｌ４およびクエン酸還元剤を使用して生成される。例えば、Ｍａｒｉｎａｋｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．１１：３４−３７（１９９９）、Ｍａｒｉｎａｋｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．１０：１２１４−１９（１９９８）、Ｅｎｕｓｔｕｎ ＆ Ｔｕｒｋｅｖｉｃｈ， Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５： ３３１７（１９６３）を参照のこと。
【０１３７】
幾つかの実施形態において、ナノ粒子の大きさは、皮膚に浸透するその能力に関連する。一般に、ナノ粒子の直径が小さいほど、皮膚の中にまたは皮膚を通してより深く浸透する。一態様において、ナノ粒子の直径は、ＯＮ−ＮＰが皮膚を横断し、血液に進入することを可能にし、ＯＮ−ＮＰの全身送達を達成する。別の態様において、ナノ粒子の直径は、ＯＮ−ＮＰが皮膚を横断することを防止し、ＯＮ−ＮＰは皮膚の表面で保持される。種々の態様において、ナノ粒子の大きさは、投与されるＯＮ−ＮＰの所望の浸透深度を達成するように調節することができることを、当業者は理解する。
【０１３８】
ナノ粒子は、大きさが、平均直径約１ｎｍ〜約２５０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約２４０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約２３０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約２２０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約２１０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約２００ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約１９０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約１８０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約１７０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約１６０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約１５０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約１４０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約１３０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約１２０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約１１０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約１００ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約９０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約８０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約７０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約６０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約５０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約４０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約３０ｎｍ、または平均直径約１ｎｍ〜約２０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約１０ｎｍの範囲であり得る。他の態様において、ナノ粒子の大きさは、約５ｎｍ〜約１５０ｎｍ（平均直径）、約５〜約５０ｎｍ、約１０〜約３０ｎｍ、約１０〜１５０ｎｍ、約１０〜約１００ｎｍ、または約１０〜約５０ｎｍである。ナノ粒子の大きさは、約５ｎｍ〜約１５０ｎｍ（平均直径）、約３０〜約１００ｎｍ、約４０〜約８０ｎｍである。本方法に使用されるナノ粒子の大きさは、それらの特定の使用または用途に応じて変動する。大きさの変動は、ナノ粒子の特定の物理的特徴、例えば、本明細書に記載されるように機能化することができる、光学特性または表面積の量を最適化するように有利に使用される。
【０１３９】
オリゴヌクレオチド
本明細書に使用される、「ヌクレオチド」という用語、またはその複数形は、本明細書に記載されるように、修飾形態と代替可能であり、そうでなければ当該分野において公知である。特定の場合において、当該技術は、自然に生じるヌクレオチドを包含する「核酸塩基」という用語、および修飾ヌクレオチドを含む非天然ヌクレオチドを使用する。よって、ヌクレオチドまたは核酸塩基は、Ｂｅｎｎｅｒらの米国特許第５，４３２，２７２号およびＳｕｓａｎ Ｍ．Ｆｒｅｉｅｒ ａｎｄ Ｋａｒｌ−Ｈｅｉｎｚ Ａｌｔｍａｎｎ，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．２５：ｐｐ４４２９−４４４３に記載される、自然に生じる核酸塩基アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）を意味する。非天然核酸塩基は、例えば、キサンチン、ジアミノプリン、８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニン、７−デアザキサンチン、７−デアザグアニン、Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン、Ｎ’，Ｎ’−エタノ−２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン（ｍＣ）、５−（Ｃ３-Ｃ６）−アルキニル−シトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、プソイドイソシトシン、２−ヒドロキシ−５−メチル−４−トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシン、および「非天然」核酸塩基を含むが、これらに限定されない。「核酸塩基」という用語はまた、既知のプリンおよびピリミジン複素環だけでなく、複素環式類似体およびその互変異性体も含む。さらなる自然に生じる、および非天然の核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号（Ｍｅｒｉｇａｎ，ｅｔ ａｌ．）、Ｃｈａｐｔｅｒ １５ ｂｙ Ｓａｎｇｈｖｉ，ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｄ． Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ ａｎｄ Ｂ．Ｌｅｂｌｅｕ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３、ｉｎ Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，３０：６１３−７２２（特に、ページ６２２および６２３、およびＣｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｊ．Ｉ．Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０，ページ８５８−８５９，Ｃｏｏｋ，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ １９９１，６，５８５−６０７を参照し、それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるものを含む。種々の態様において、ポリヌクレオチドは、核酸塩基のように機能できる複素環式化合物等の化合物を含む、非天然ヌクレオチドの分類である、１つ以上の「ヌクレオシド塩基」または「塩基部」も含み、最も伝統的な意味でヌクレオシド塩基ではないが、ヌクレオシド塩基として機能する、特定の「普遍的塩基」を含む。普遍的塩基は、３−ニトロピロール、任意に、置換インドール（例えば、５−ニトロインドール）、および任意に、置換ヒポキサンチンを含む。他の望ましい普遍的塩基は、ピロール、ジアゾール、またはトリアゾール誘導体を含み、当該分野に公知のこれらの普遍的塩基を含む。
【０１４０】
修飾されたヌクレオチドは、第ＥＰ１ ０７２ ６７９号および国際公開ＷＯ９７／１２８９６号に記載されており、それらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。修飾された核酸塩基は、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチルおよび他のアデニンとグアニンのアルキル誘導体、２−プロピルおよび他のアデニンとグアニンのアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシンならびに他のピリミジン塩基のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルならびに他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルならびに他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンを含むが、これらに限定されない。さらなる修飾された塩基は、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）等の三環ピリミジン、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）等のＧ−クランプ、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）を含む。修飾された塩基は、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環、例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン、および２−ピリドンと置換されるものも含んでもよい。さらなる核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されるもの、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ページ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，３０：６１３に開示されるもの、およびｔｈｏｓｅ ｄｉｓｃｌｏｓｅｄ ｂｙ Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ１５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ． ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３に開示されるものを含む。これらの塩基の幾つかは、結合親和性を増大するのに有用であり、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンを含み、これは、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンを含む。５−メチルシトシン置換は、０．６〜１．２℃で核酸二重鎖安定性を増加することを示しており、特定の態様において、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされる。それらの開示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第３，６８７，８０８号、米国特許第４，８４５，２０５号、第５，１３０，３０２号、第５，１３４，０６６号、第５，１７５，２７３号、第５，３６７，０６６号、第５，４３２，２７２号、第５，４５７，１８７号、第５，４５９，２５５号、第５，４８４，９０８号、第５，５０２，１７７号、第５，５２５，７１１号、第５，５５２，５４０号、第５，５８７，４６９号、第５，５９４，１２１，第５，５９６，０９１号、第５，６１４，６１７号、第５，６４５，９８５号、第５，８３０，６５３号、第５，７６３，５８８号、第６，００５，０９６号、第５，７５０，６９２号、および第５，６８１，９４１号を参照のこと。
【０１４１】
所定の配列のポリヌクレオチドを作製する方法は周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．１９８９）およびＦ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（ｅｄ．）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，１ｓｔ Ｅｄ．（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）を参照のこと。固相合成は、ポリリボヌクレオチドおよびポリデオキシリボヌクレオチドの両方に好適である（周知のＤＮＡ合成方法も、ＲＮＡ合成に有用である）。ポリリボヌクレオチドは、酵素的に調製することもできる。非天然核酸塩基は、ポリヌクレオチドの中に組み込むこともできる。例えば、米国特許第７，２２３，８３３号、Ｋａｔｚ， Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７４：２２３８（１９５１）、Ｙａｍａｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８３：２５９９（１９６１）、Ｋｏｓｔｕｒｋｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：３９４９（１９７４）、Ｔｈｏｍａｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７６：６０３２（１９５４）、Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２７：７４−７５（２００５）、およびＺｉｍｍｅｒｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２４：１３６８４−１３６８５（２００２）を参照のこと。
【０１４２】
ポリヌクレオチドで機能化される、またはその修飾形態であるナノ粒子が提供され、本明細書に定義されるドメインは、一般に、長さが約５ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドのポリヌクレオチドを含む。より具体的には、ナノ粒子は、長さが約５〜約９０ヌクレオチド、長さが約５〜約８０ヌクレオチド、長さが約５〜約７０ヌクレオチド、長さが約５〜約６０ヌクレオチド、長さが約５〜約５０ヌクレオチド、長さが約５〜約４５ヌクレオチド、長さが約５〜約４０ヌクレオチド、長さが約５〜約３５ヌクレオチド、長さが約５〜約３０ヌクレオチド、長さが約５〜約２５ヌクレオチド、長さが約５〜約２０ヌクレオチド、長さが約５〜約１５ヌクレオチド、長さが約５〜約１０ヌクレオチド、およびポリヌクレオチドが所望の結果を達成することができる範囲において特に開示される大きさの長さの全ポリヌクレオチド中間体であるポリヌクレオチドで機能化される。したがって、長さが５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００またはそれ以上のヌクレオチドのポリヌクレオチドが意図される。
【０１４３】
幾つかの態様において、ナノ粒子が細胞によって取り込まれる効率に影響を及ぼすドメインをさらに含むオリゴヌクレオチドが、ナノ粒子と結合される、それに結合されるオリゴヌクレオチドを有するナノ粒子を提供する。したがって、ドメインは、効率を増加または低下させる。本明細書に使用される、「効率」とは、細胞における／細胞によるナノ粒子の取り込みの数または割合を指す。ナノ粒子の細胞への進入およびそこからの退出のプロセスは、動的なものであるため、効率は、多くのナノ粒子を取りこむことにより、または細胞に進入するそれらのナノ粒子を長期間保持することにより増加することができる。同様に、効率は、少ないナノ粒子を取りこむことにより、または細胞に進入するそれらのナノ粒子を短期間保持することにより低下させることができる。
【０１４４】
幾つかの態様において、ドメインは、オリゴヌクレオチドと隣接／共線的であり、ナノ粒子に対して近位に位置する。幾つかの態様において、ドメインは、オリゴヌクレオチドと隣接／共線的であり、ナノ粒子に対して遠位に位置する。「近位」および「遠位」という用語は、オリゴヌクレオチドの中間点に対する位置を指す。幾つかの態様において、ドメインは、オリゴヌクレオチド内の内部領域に位置する。さらなる態様において、ドメインは、ナノ粒子に結合される第２のオリゴヌクレオチド上に位置する。したがって、幾つかの実施形態において、ドメインは、オリゴヌクレオチドとは個別の実体として、ナノ粒子に結合されるように意図される。
【０１４５】
幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載される位置のいずれかに位置する、１つ以上のドメインを含むことをさらに意図する
【０１４６】
幾つかの実施形態において、ドメインは、細胞によるオリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子の取り込みの効率を増加させる。幾つかの態様において、ドメインは、チミジン残基（ポリＴ）またはウリジン残基（ポリＵ）の配列を含む。さらなる態様において、ポリＴまたはポリＵ配列は、２つのチミジンまたはウリジンを含む。種々の態様において、ポリＴまたはポリＵ配列は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、またはそれ以上のチミジンもしくはウリジン残基を含む。
【０１４７】
幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドおよびドメインで機能化されるナノ粒子は、同じオリゴヌクレオチドで機能化されるが、ドメインを欠損するナノ粒子より多大な効率で、細胞によって取り込まれることを意図する。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドおよびドメインで機能化されるナノ粒子は、同じオリゴヌクレオチドで機能化されるが、ドメインを欠損するナノ粒子より１％より効率的に細胞によって取り込まれる。種々の態様において、オリゴヌクレオチドおよびドメインで機能化されるナノ粒子は、同じオリゴヌクレオチドで機能化されるが、ドメインを欠損するナノ粒子より２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％，３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約２０倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍、約１００倍、またはそれ以上、より効率的に細胞によって取り込まれる。
【０１４８】
幾つかの実施形態において、ドメインは、細胞によるオリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子の取り込みの効率を低下させる。幾つかの態様において、ドメインは、２つのリン酸から成るリン酸重合体（Ｃ３残基）を含む。種々の態様において、Ｃ３残基は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、またはそれ以上のリン酸を含む。
【０１４９】
幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドおよびドメインで機能化されるナノ粒子は、同じオリゴヌクレオチドで機能化されるが、ドメインを欠損するナノ粒子より低い効率で、細胞により取り込まれることを意図する。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドおよびドメインで機能化されるナノ粒子は、同じオリゴヌクレオチドで機能化されるが、ドメインを欠損するナノ粒子より１％低い効率で細胞により取り込まれる。種々の態様において、オリゴヌクレオチドおよびドメインで機能化されるナノ粒子は、同じオリゴヌクレオチドで機能化されるが、ドメインを欠損するナノ粒子より２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％，３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約２０倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍、約１００倍、またはそれ以上、低い効率で細胞によって取り込まれる。
【０１５０】
ナノ粒子への結合について意図されるポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドから発現する遺伝子産物の発現を調節するものを含む。本開示により意図されるポリヌクレオチドは、以下で本明細書に定義される、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびその修飾された形態を含む。したがって、種々の態様において、標的ポリヌクレオチドとハイブリッド形成し、標的ヌクレオチドの転写または翻訳の低下を開始するポリヌクレオチド、二本鎖ポリヌクレオチドとハイブリッド形成し、転写を阻害する三重らせん形成ポリヌクレオチド、および標的ポリヌクレオチドとハイブリッド形成し、翻訳を阻害するリボザイムが意図される。
【０１５１】
種々の態様において、特定のポリヌクレオチドが標的にされる場合、単一の機能化オリゴヌクレオチド−ナノ粒子組成物は、同じ転写物の複数のコピーに結合する能力を有する。一態様において、同一ポリヌクレオチド、すなわち、各ポリヌクレオチドが同じ長さであり、同じ配列であるポリヌクレオチドで機能化されるナノ粒子を提供する。他の態様において、ナノ粒子は、同一でない２つ以上のポリヌクレオチド、すなわち、異なる長さ、および／または異なる配列を有するという点で、結合したポリヌクレオチドの少なくとも１つが、少なくとも１つの他の結合したポリヌクレオチドと異なるポリヌクレオチドで機能化される。異なるポリヌクレオチドがナノ粒子に結合される態様において、これらの異なるポリヌクレオチドは、同じ単一標的ポリヌクレオチドだが、異なる位置で結合するか、または異なる遺伝子産物をコードする異なる標的ポリヌクレオチドに結合する。
【０１５２】
修飾されたオリゴヌクレオチド
上述のように、ナノ粒子を機能化するために、修飾されたオリゴヌクレオチドが意図される。種々の態様において、ナノ粒子上で機能化されたオリゴヌクレオチドは、完全に修飾されるか、部分的に修飾される。よって、種々の態様において、１つ以上もしくは全ての糖類および／またはポリヌクレオチドにおけるヌクレオチド部の１つ以上もしくは全てのヌクレオチド間結合は、「非天然」群と置換される。
【０１５３】
一態様において、本実施形態は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を意図する。ＰＮＡ化合物において、ポリヌクレオチドの糖骨格は、骨格を含有するアミドと置換される。それらの開示が参照により本明細書に組み込まれる、例えば、米国特許第５，５３９，０８２号、第５，７１４，３３１号、および第５，７１９，２６２号ならびにＮｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００を参照のこと。
【０１５４】
開示されるポリヌクレオチドについて意図されるヌクレオチドと非天然ヌクレオチドとの間の他の結合は、米国特許第４，９８１，９５７号、第５，１１８，８００号、第５，３１９，０８０号、第５，３５９，０４４号、第５，３９３，８７８号、第５，４４６，１３７号、第５，４６６，７８６号、第５，５１４，７８５号、第５，５１９，１３４号、第５，５６７，８１１号、第５，５７６，４２７号、第５，５９１，７２２号、第５，５９７，９０９号、第５，６１０，３００号、第５，６２７，０５３号、第５，６３９，８７３号、第５，６４６，２６５号、第５，６５８，８７３号、第５，６７０，６３３号、第５，７９２，７４７号、および第５，７００，９２０号、米国特許公開第２００４０２１９５６５号、国際特許公開第ＷＯ９８／３９３５２号および第ＷＯ９９／１４２２６号、Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ ｅｔ． ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５：３４３−３５５（１９９５）ならびにＳｕｓａｎ Ｍ．Ｆｒｅｉｅｒ ａｎｄ Ｋａｒｌ−Ｈｅｉｎｚ Ａｌｔｍａｎｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５：４４２９−４４４３（１９９７）に記載されているものを含み、それらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５５】
オリゴヌクレオチドの特定の例としては、修飾された骨格または非天然ヌクレオシド間結合を含有するものが挙げられる。修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドは、骨格にリン原子を保持するもの、および骨格にリン原子を持たないものを含む。それらのヌクレオシド間骨格にリン原子を持たない修飾されたオリゴヌクレオチドは、「オリゴヌクレオチド」の意味内であるとみなされる。
【０１５６】
リン原子を含有する修飾されたオリゴヌクレオチド骨格は、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネート、およびキラルホスホネートを含む他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、正常３’−５’結合を有するセレノホスフェートおよびボラノホスフェート、それらの２’−５’結合類似体、ならびに１つ以上のヌクレオチド間結合が３’〜３’、５’〜５’または２’〜２’結合である反転極性を有するものを含む。３’末端ヌクレオチド間結合で単一３’〜３’結合を含む反転極性を有するポリヌクレオチド、すなわち、非塩基であってもよい（ヌクレオチドが欠損しているか、またはその位置にヒドロキシル基を有する）単一の反転ヌクレオシド残基が意図される。塩類、混合塩、および遊離酸形態も意図される。
【０１５７】
上記のリン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許は、米国特許第３，６８７，８０８号、第４，４６９，８６３号、第４，４７６，３０１号、第５，０２３，２４３号、第５，１７７，１９６号、第５，１８８，８９７号、第５，２６４，４２３号、第５，２７６，０１９号、第５，２７８，３０２号、第５，２８６，７１７号、第５，３２１，１３１号、第５，３９９，６７６号、第５，４０５，９３９号、第５，４５３，４９６号、第５，４５５，２３３号、第５，４６６，６７７号、第５，４７６，９２５号、第５，５１９，１２６号、第５，５３６，８２１号、第５，５４１，３０６号、第５，５５０，１１１号、第５，５６３，２５３号、第５，５７１，７９９号、第５，５８７，３６１号、第５，１９４，５９９号、第５，５６５，５５５号、第５，５２７，８９９号、第５，７２１，２１８号、第５，６７２，６９７号および第５，６２５，０５０号を含み、それらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５８】
リン原子を含まない修飾されたポリヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間結合により形成される骨格を有する。これらは、モルホリノ結合、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、リボアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、スルホネートおよびスルホンアミド骨格、アミド骨格、および混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成要素を有する他のものを有するものを含む。また他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格を用いて提供され、オリゴヌクレオシドはヘテロ原子を用いて提供され、米国特許第５，４８９，６７７号および第５，６０２，２４０号に記載される、-ＣＨ２-ＮＨ-Ｏ-ＣＨ２-、-ＣＨ２-Ｎ（ＣＨ３）-Ｏ-ＣＨ２-、-ＣＨ２-Ｏ-Ｎ（ＣＨ３）-ＣＨ２-、-ＣＨ２-Ｎ（ＣＨ３）-Ｎ（ＣＨ３）-ＣＨ２-および-Ｏ-Ｎ（ＣＨ３）-ＣＨ２-ＣＨ２-を含む。例えば、それらの開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，０３４，５０６号、第５，１６６，３１５号、第５，１８５，４４４号、第５，２１４，１３４号、第５，２１６，１４１号、第５，２３５，０３３号、第５，２６４，５６２号、第５，２６４，５６４号、第５，４０５，９３８号、第５，４３４，２５７号、第５，４６６，６７７号、第５，４７０，９６７号、第５，４８９，６７７号、第５，５４１，３０７号、第５，５６１，２２５号、第５，５９６，０８６号、第５，６０２，２４０号、第５，６１０，２８９号、第５，６０２，２４０号、第５，６０８，０４６号、第５，６１０，２８９号、第５，６１８，７０４号、第５，６２３，０７０号、第５，６６３，３１２号、第５，６３３，３６０号、第５，６７７，４３７号、第５，７９２，６０８号、第５，６４６，２６９号および第５，６７７，４３９号を参照のこと。
【０１５９】
種々の形態において、オリゴの２つの連続したモノマー間の結合は、-ＣＨ２、--Ｏ-、-Ｓ-、-ＮＲＨ-、＞Ｃ＝Ｏ、＞Ｃ＝ＮＲＨ、＞Ｃ＝Ｓ、-Ｓｉ（Ｒ”）２-、-ＳＯ-、-Ｓ（Ｏ）２-、-Ｐ（Ｏ）２-、-ＰＯ（ＢＨ３）-、-Ｐ（Ｏ，Ｓ）-、-Ｐ（Ｓ）２-、-ＰＯ（Ｒ”）-、-ＰＯ（ＯＣＨ３）-、および-ＰＯ（ＮＨＲＨ）-から選択される、２〜４、望ましくは、３基／原子から成り、ＲＨは、水素およびＣ１−４−アルキルから選択され、Ｒ”は、Ｃ１−６−アルキルおよびフェニルから選択される。そのような結合の例示的な例は、-ＣＨ２-ＣＨ２-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＣＯ-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＣＨＯＨ-ＣＨ２-、-Ｏ-ＣＨ２-Ｏ-、-Ｏ-ＣＨ２-ＣＨ２-、-Ｏ-ＣＨ２-ＣＨ＝（後続モノマーへの結合として使用される時、Ｒ５を含む）、-ＣＨ２-ＣＨ２-Ｏ-、-ＮＲＨ-ＣＨ２-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＣＨ２-ＮＲＨ-、-ＣＨ２-ＮＲＨ-ＣＨ２-−、-Ｏ-ＣＨ２-ＣＨ２-ＮＲＨ-、-ＮＲＨ-ＣＯ-Ｏ-、-ＮＲＨ-ＣＯ-ＮＲＨ-、-ＮＲＨ-ＣＳ-ＮＲＨ-、-ＮＲＨ-Ｃ（＝ＮＲＨ）-ＮＲＨ-、-ＮＲＨ-ＣＯ-ＣＨ２-ＮＲＨ-Ｏ-ＣＯ-Ｏ-、-Ｏ-ＣＯ-ＣＨ２-Ｏ-、-Ｏ-ＣＨ２-ＣＯ-Ｏ-、-ＣＨ２-ＣＯ-ＮＲＨ-、-Ｏ-ＣＯ-ＮＲＨ-、-ＮＲＨ-ＣＯ-ＣＨ２-、-Ｏ-ＣＨ２-ＣＯ-ＮＲＨ-、-Ｏ-ＣＨ２-ＣＨ２-ＮＲＨ-、-ＣＨ＝Ｎ-Ｏ-、-ＣＨ２-ＮＲＨ-Ｏ-、-ＣＨ２-Ｏ-Ｎ＝（後続モノマーへの結合として使用される時、Ｒ５を含む）、-ＣＨ２-Ｏ-ＮＲＨ-、-ＣＯ-ＮＲＨ-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＮＲＨ-Ｏ-、-ＣＨ２-ＮＲＨ-ＣＯ-、-Ｏ-ＮＲＨ-ＣＨ２-、-Ｏ-ＮＲＨ、-Ｏ-ＣＨ２-Ｓ-、-Ｓ-ＣＨ２-Ｏ-、-ＣＨ２-ＣＨ２-Ｓ-、-Ｏ-ＣＨ２-ＣＨ２-Ｓ-、-Ｓ-ＣＨ２-ＣＨ＝（後続モノマーへの結合として使用される時、Ｒ５を含む）、-Ｓ-ＣＨ２-ＣＨ２-、-Ｓ-ＣＨ２-ＣＨ２−Ｏ-、-Ｓ-ＣＨ２-ＣＨ２-Ｓ-、-ＣＨ２-Ｓ-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＳＯ-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＳＯ２-ＣＨ２-、-Ｏ-ＳＯ-Ｏ-、-Ｏ-Ｓ（Ｏ）２-Ｏ-、-Ｏ-Ｓ（Ｏ）２-ＣＨ２-、-Ｏ-Ｓ（Ｏ）２-ＮＲＨ-、-ＮＲＨ-Ｓ（Ｏ）２-ＣＨ２-；-Ｏ-Ｓ（Ｏ）２-ＣＨ２-、-Ｏ-Ｐ（Ｏ）２-Ｏ-、-Ｏ-Ｐ（Ｏ，Ｓ）-Ｏ-、-Ｏ-Ｐ（Ｓ）２-Ｏ-、-Ｓ-Ｐ（Ｏ）２-Ｏ-、-Ｓ-Ｐ（Ｏ，Ｓ）-Ｏ-、-Ｓ-Ｐ（Ｓ）２-Ｏ-、-Ｏ-Ｐ（Ｏ）２-Ｓ-、-Ｏ-Ｐ（Ｏ，Ｓ）-Ｓ-、-Ｏ-Ｐ（Ｓ）２-Ｓ-、-Ｓ-Ｐ（Ｏ）２-Ｓ-、-Ｓ-Ｐ（Ｏ，Ｓ）-Ｓ-、-Ｓ-Ｐ（Ｓ）２-Ｓ-、-Ｏ-ＰＯ（Ｒ”）-Ｏ-、-Ｏ-ＰＯ（ＯＣＨ３）-Ｏ-、-Ｏ-ＰＯ（Ｏ ＣＨ２ＣＨ３）-Ｏ-、-Ｏ-ＰＯ（Ｏ ＣＨ２ＣＨ２Ｓ-Ｒ）-Ｏ-、-Ｏ-ＰＯ（ＢＨ３）-Ｏ-、-Ｏ-ＰＯ（ＮＨＲＮ）-Ｏ-、-Ｏ-Ｐ（Ｏ）２-ＮＲＨ Ｈ-、-ＮＲＨ-Ｐ（Ｏ）２-Ｏ-、-Ｏ-Ｐ（Ｏ，ＮＲＨ）-Ｏ-、-ＣＨ２-Ｐ（Ｏ）２-Ｏ-、-Ｏ-Ｐ（Ｏ）２-ＣＨ２-、および-Ｏ-Ｓｉ（Ｒ”）２-Ｏ-であり；その中でも、-ＣＨ２-ＣＯ-ＮＲＨ-、-ＣＨ２-ＮＲＨ-Ｏ-、-Ｓ-ＣＨ２-Ｏ-、-Ｏ-Ｐ（Ｏ）２-Ｏ-Ｏ-Ｐ（−Ｏ，Ｓ）-Ｏ-、-Ｏ-Ｐ（Ｓ）２-Ｏ-、-ＮＲＨ Ｐ（Ｏ）２-Ｏ-、-Ｏ-Ｐ（Ｏ，ＮＲＨ）-Ｏ-、-Ｏ-ＰＯ（Ｒ”）-Ｏ-、-Ｏ-ＰＯ（ＣＨ３）-Ｏ-、および-Ｏ-ＰＯ（ＮＨＲＮ）-Ｏ-が意図され、ＲＨは、水素およびＣ１−４−アルキルから選択され、Ｒ”は、Ｃ１−６−アルキルおよびフェニルから選択される。さらなる例示的な例は、Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ ｅｔ． ａｌ．，１９９５，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５：３４３−３５５およびＳｕｓａｎ Ｍ．Ｆｒｅｉｅｒ ａｎｄ Ｋａｒｌ−Ｈｅｉｎｚ Ａｌｔｍａｎｎ，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ ２５：ｐｐ４４２９−４４４３に記載される。
【０１６０】
またポリヌクレオチドの他の修飾された形態は、米国特許出願第２００４０２１９５６５号に詳細に記載されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１６１】
修飾されたポリヌクレオチドは、１つ以上の置換糖部分も含有してもよい。特定の態様において、ポリヌクレオチドは、２’位置で、次の：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、ＳもしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルの１つを含み、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換された、または非置換されたＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであってもよい。他の実施形態は、ｎおよびｍが１〜約１０である時、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２を含む。他のポリヌクレオチドは、２’位置で、以下の１つを含む：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、介入物、ポリヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、またはポリヌクレオチドの薬物動力特性を改善するための基、および類似する特性を有する他の置換基。一態様において、修飾は２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られる）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，７８：４８６−５０４）、すなわち、アルコキシアルコキシ基を含む。他の修飾は、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られる、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該分野で、２’−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち、２’−Ｏ-ＣＨ２-Ｏ-ＣＨ２-Ｎ（ＣＨ３）２を含む。
【０１６２】
また他の修飾は、２’−メトキシ（２’−Ｏ-ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’−アリル（２’−ＣＨ２-ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ-ＣＨ２-ＣＨ＝ＣＨ２）、および２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。２’−修飾は、アラビノ（上）位置またはリボ（下）位置であってもよい。一態様において、２’−アラビノ修飾は２’−Ｆである。同様の修飾は、ポリヌクレオチド上の他の位置、例えば、３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位置、または２’−５’結合ポリヌクレオチドおよび５’末端ヌクレオチドの５’位置でも行われ得る。ポリヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分等の糖模擬体も有してもよい。例えば、それらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第４，９８１，９５７号、第５，１１８，８００号、第５，３１９，０８０号、第５，３５９，０４４号、第５，３９３，８７８号、第５，４４６，１３７号、第５，４６６，７８６号、第５，５１４，７８５号、第５，５１９，１３４号、第５，５６７，８１１号、第５，５７６，４２７号、第５，５９１，７２２号、第５，５９７，９０９号、第５，６１０，３００号、第５，６２７，０５３号、第５，６３９，８７３号、第５，６４６，２６５号、第５，６５８，８７３号、第５，６７０，６３３号、第５，７９２，７４７号、および第５，７００，９２０号を参照のこと。
【０１６３】
一態様において、糖修飾は、２’−ヒドロキシル基が糖環の３’または４’炭素原子に結合され、これによって二環式糖部分を形成する、ロックされた核酸（ＬＮＡ）を含む。特定の態様において、結合は、２’酸素原子と４’炭素原子を架橋するメチレン（-ＣＨ２-）ｎ基であり、ｎは、１または２である。ＬＮＡおよびその調製物は、国際公開第ＷＯ９８／３９３５２号および第ＷＯ９９／１４２２６号に記載されており、それらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６４】
ポリペプチド
本明細書に使用される、「ポリペプチド」という用語は、天然由来の、合成生成された、または組み換えにより生成される、ペプチド、タンパク質、アミノ酸の重合体、ホルモン、ウイルス、および抗体を指す。
【０１６５】
幾つかの実施形態において、本開示の組成物は、標的ポリペプチドの活性を調節する。したがって、種々の態様において、ナノ粒子は、アプタマーで機能化される。本明細書に使用される、「アプタマー」とは、特定の標的分子に結合する、オリゴヌクレオチドまたはペプチド分子である。よって、幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子は、標的ポリペプチドに結合し、その活性を調節する。
【０１６６】
一態様において、標的ポリペプチドの活性は、オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子と接触しない細胞と比較して、約５％阻害される。種々の態様において、標的ポリペプチドの発現は、オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子と接触しない細胞と比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、９９％、またはそれ以上阻害される。つまり、提供される方法は、標的ポリペプチドの活性の任意の阻害の程度をもたらすものを包含する。
【０１６７】
面密度
ＮＰの表面上のオリゴヌクレオチドの密度は、所与の用途のために調節することができる。例えば、Ｓｅｆｅｒｏｓらの研究［Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．，９（１）：３０８-３１１，２００９］は、ＮＰ表面上のＤＮＡの密度が、ヌクレアーゼにより分解される速度に影響を及ぼしたことを例証した。本密度修飾は、例えば、薬物およびＯＮ−ＮＰが細胞に進入し、ＯＮが制御された速度で分解される、ＮＰベースの薬物送達系で使用されるが、これに限定されない。
【０１６８】
本明細書に提供されるナノ粒子は、ナノ粒子の表面上に圧縮密度のポリヌクレオチドを有し、種々の態様において、ナノ粒子間および単一ナノ粒子上のポリヌクレオチド鎖間の協同作用をもたらすのに十分である。別の態様において、ナノ粒子間の協同作用は、ポリヌクレオチドのヌクレアーゼ分解への耐性を増大する。さらに別の態様において、細胞によるナノ粒子の取り込みは、ナノ粒子と結合するポリヌクレオチドの密度により影響を受ける。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／６５３６６号に記載されるように、ナノ粒子の表面上の高密度のポリヌクレオチドは、細胞によるナノ粒子の取り込みの増加と関連する。
【０１６９】
幾つかの実施形態において、ＮＰの表面上のオリゴヌクレオチドの面密度は、皮膚に浸透するその能力に関連する。一般に、ＯＮ−ＮＰの表面上の面密度が高いほど、皮膚の中に、または皮膚を通してより深く浸透する。幾つかの態様において、面密度は、ＯＮ−ＮＰが皮膚を横断し、血液に入ることを可能にし、ＯＮ−ＮＰの全身送達を達成する。別の態様において、面密度は、ＯＮ−ＮＰが皮膚を横断することを防止し、ＯＮ−ＮＰは皮膚の表面で保持される。種々の態様において、ナノ粒子の表面上のオリゴヌクレオチドの面密度は、投与されるＯＮ−ＮＰの所望の浸透深度を達成するように調節することができることを、当業者は理解する。
【０１７０】
ナノ粒子とポリヌクレオチドの所望の組み合わせについて、ナノ粒子を安定させるのに適した面密度、およびそれを得るために必要な条件は、経験的に判断することができる。一般に、少なくとも２ピコモル／ｃｍ２の面密度が、安定したナノ粒子−オリゴヌクレオチド組成物を提供するのに適している。幾つかの態様において、面密度は、少なくとも１５ピコモル／ｃｍ２である。ポリヌクレオチオが、少なくとも２ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも３ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも４ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも６ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも７ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも８ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも９ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも１０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約２０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約３０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約３５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約４０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約４５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約５５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約６０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約６５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約７０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約７５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約８０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約８５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約９０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約９５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１７５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約２００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約２５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約３００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約３５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約４００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約４５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約５００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約５５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約６００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約６５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約７００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約７５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約８００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約８５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約９００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約９５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約約１０００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、またはそれ以上の面密度でナノ粒子に結合される方法も提供する。
【０１７１】
ナノ粒子へのオリゴヌクレオチド結合
本方法に使用するために意図されるオリゴヌクレオチドは、任意の手段によりナノ粒子に結合されるものを含む。オリゴヌクレオチドがナノ粒子に結合される手段に関わらず、種々の態様における結合は、５’結合、３’結合、内部結合の一種、またはそれらの結合の任意の組み合わせを通してもたらされる。
【０１７２】
結合方法は、当業者に公知であり、米国公開第２００９／０２０９６２９号に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＲＮＡをナノ粒子に結合する方法は、一般に、第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／６５８２２号に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。したがって、幾つかの実施形態において、本開示は、ナノ粒子に結合されるポリヌクレオチドは、ＲＮＡであることを意図する。
【０１７３】
幾つかの態様において、ドメインをさらに含むオリゴヌクレオチドが、ナノ粒子と結合される、それに結合されるオリゴヌクレオチドを有するナノ粒子を提供する。幾つかの態様において、ドメインはポリチミジン配列である。他の態様において、ドメインは、リン酸重合体（Ｃ３残基）である。
【０１７４】
幾つかの実施形態において、ナノ粒子に結合されるオリゴヌクレオチドはＤＮＡである。ＤＮＡがナノ粒子に結合される時、ナノ粒子に結合されるＤＮＡオリゴヌクレオチドおよび標的ポリヌクレオチドのハイブリッド形成が生じるように、ＤＮＡはポリヌクレオチドの標的配列に十分に相補的である配列から成り、これによって、標的ポリヌクレオチドをナノ粒子に結合する。二本鎖分子が、標的ポリヌクレオチドの単一鎖配列とハイブリッド形成する単鎖配列も含む限り、種々の態様におけるＤＮＡは、一本鎖または二本鎖である。幾つかの態様において、ナノ粒子上で機能化されたオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成は、二本鎖標的ポリヌクレオチドと三重鎖構造を形成することができる。別の態様において、三重鎖構造は、ナノ粒子上で機能化された二本鎖オリゴヌクレオチドの単鎖標的ポリヌクレオチドとのハイブリッド形成により形成することができる。
【０１７５】
スペーサー
特定の態様において、オリゴヌクレオチドおよびドメインがスペーサーを介してナノ粒子に結合されるものを含む、機能化ナノ粒子が意図される。本明細書に記載される、「スペーサー」とは、遺伝子発現自体の調節に関与しないが、複数のコピーにおいてナノ粒子に結合される時、ナノ粒子と機能オリゴヌクレオチドとの間の距離を増加するように、または個別のオリゴヌクレオチド間の距離を増加するように機能する部分を意味する。よって、オリゴヌクレオチドが同じ配列を有するか、または異なる配列を有するかに関わらず、スペーサーは、直列型で個別のオリゴヌクレオチド間に位置するように意図される。ドメインがナノ粒子に直接結合される本発明の態様において、ドメインは、任意に、スペーサーを介してナノ粒子に機能化される。直列型のドメインがナノ粒子に機能化される態様において、スペーサーは、任意に、直列型構造のドメイン単位の幾つかまたは全ての間に存在する。一態様において、スペーサーは、存在する場合、有機部分である。別の態様において、スペーサーは重合体であり、水溶性重合体、核酸、ポリペプチド、オリゴ糖、炭水化物、脂質、エチルグリコール、またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【０１７６】
特定の態様において、ポリヌクレオチドは、ナノ粒子に共有結合的に結合されるスペーサーを有する。これらのポリヌクレオチドは、上述と同じポリヌクレオチドである。スペーサーのナノ粒子との結合の結果として、ポリヌクレオチドは、ナノ粒子の表面から離れ、その標的とのハイブリッド形成に利用できる。スペーサーがポリヌクレオチドである場合において、種々の実施形態におけるスペーサーの長さは、少なくとも約１０ヌクレオチド、１０〜３０ヌクレオチド、または３０ヌクレオチド以上でさえある。スペーサーは、ポリヌクレオチドのナノ粒子または標的ポリヌクレオチドと結合する能力に干渉しない、任意の配列を有してもよい。スペーサーは、相互に、またはオリゴヌクレオチドのそれに相補的な配列を有するべきではないが、標的ポリヌクレオチドに完全に、または部分的に相補的であってもよい。特定の態様において、ポリヌクレオチドスペーサの塩基は、全てアデニン、全てチミン、全てシチジン、全てグアニン、全てウラシル、または全て他の何らかの修飾塩基である。
【実施例】
【０１７７】
実施例１
ナノ粒子の調製
公開された手順を使用して、クエン酸塩安定化された金ナノ粒子（１〜２５０ｎｍ）を調製する［Ｇ．Ｆｒｅｎｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９７３，２４１，２０］。本実施例では、１３および５ｎｍの大きさが使用されたが、他の実施例は、１ｎｍ〜５００ｎｍの大きさのナノ粒子を含む。つまり、テトラクロロ金酸は、還流水中のクエン酸塩を用いた処理により還元される。透過型電子顕微鏡法およびｕｖ／ｖｉｓ吸光分光法を使用して、粒子の大きさおよび分散度を確認することができる。チオール化されたオリゴヌクレオチドは、標準固相ホスホラミダイト法を使用して合成される［Ｐｏｎ，Ｒ．Ｔ．Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｓｕｐｐｏｒｔｓ ｆｏｒ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）（１９９３），２０（Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ），４６５−４９６］。チオール修飾されたオリゴヌクレオチドは、次に、１０ｎＭコロイドの１ｍＬ当り３ｎｍｏｌのオリゴヌクレオチドの濃度で、１３±１および５ｎｍ金コロイドに添加され、一晩、振蘯される。１２時間後、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液（１０％）を混合物に添加し、０．１％ＳＤＳ濃度とし、リン酸緩衝剤（０．１Ｍ、ｐＨ＝７．４）を混合物に添加し、０．０１リン酸濃度とし、塩化ナトリウム溶液（２．０Ｍ）を混合物に添加し、０．１Ｍ塩化ナトリウム濃度とする。次いで、塩化ナトリウム溶液（２．０Ｍ）の６つのアリコートを８時間にわたって混合物に添加し、０．３Ｍの最終塩化ナトリウム濃度とし、一晩、振蘯して、機能化プロセスを完了する。溶液を遠心分離し（１３，０００ｒｐｍ、２０分）、減菌リン酸緩衝生理食塩水に３回再懸濁して、精製された抱合体を生成する。
【０１７８】
実施例２
オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子抱合方法
本実施例のオリゴヌクレオチド設計は、２つの可能な作用メカニズムを含む。第１に、配列は、アンピシリン耐性（ＡｍｐＲ）遺伝子β−ラクタマーゼのプロモーター部位のセンス鎖と優先的にハイブリッド形成する、公開されたプラスミド配列を使用して設計された。これは、抱合体が細菌ゲノムのＡｍｐＲのプロモーター配列と優先的にハイブリッド形成する（好適な結合定数および／または患者の細胞内濃度により付与される）利点を利用することにより、細菌をアンピシリンに対して感作させる。これは、プロモーター複合体がその標的部位に結合することを防止し、ｍＲＮＡ転写物（Ａｍｐ耐性遺伝子）の転写を防止し、したがって、細菌をアンピシリンに対して感作させる。使用された配列は、５’−ＡＴ ＴＧＴ ＣＴＣ ＡＴＧ ＡＧＣ ＧＧＡ ＴＡＣ ＡＴＡ ＴＴＴ ＧＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ Ａ−ＳＨ−３’（配列番号１）および５’−ＡＴ ＴＧＴ ＣＴＣ ＡＴＧ ＡＧＣ ＧＧＡ ＴＡＣ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ Ａ−ＳＨ−３’（配列番号２）であった。
【０１７９】
第２の戦略は、ＡｍｐＲ遺伝子の内部領域とハイブリッド形成するように設計された配列を利用する。そうすることにより、これは、完全なｍＲＮＡ転写の完了を防止する。これの下流作用は、機能ｍＲＮＡ転写物（Ａｍｐ耐性遺伝子）の完全な転写を防止し、よって、細菌をアンピシリンに対して感作させることである。本戦略において、センス鎖は、標的二重鎖ＤＮＡとハイブリッド形成するように選択される。これの配列は、５’−ＡＣＴ ＴＴＴ ＡＡＡ ＧＴＴ ＣＴＧ ＣＴＡ ＴＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡ−ＳＨ−３’（配列番号３）であった。両戦略のスキームを図１に表す。代替的に、従来のアンチセンス戦略を使用して、ｍＲＮＡを結合し、タンパク質生成を防止し、よって細菌を抗生物質に対して感作させる。
【０１８０】
公開された手順に従い（ＰｒｏｍｅｇａおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、アンピシリン含有プラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ社のｐｓｉＣＨＥＣＫ ２またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のｐＳｃｒｅｅｎ−ｉＴのいずれか）を使用して、ＪＭ１０９大腸菌コンピテント細胞を形質転換し、抗生物質含有（Ａｍｐ）プレート上で成長させた。コロニーを１つ選択し、１２時間、アンピシリンを有する液体培地で成長させた。本培養物は、後続の実験に使用するために、凍結（１０％グリセロール）保存物を形成するために使用された。
【０１８１】
大腸菌の保存物を解凍した後、以下に記載するように、少量を、アンピシリンを有する、または有さないいずれかの液体ブロス中で成長させ、対応するＬＢプレート上で平板培養した。一実施例において、５μＬの冷凍細菌ブロスを、３０ｎＭの粒子を有する１ｍＬのＬＢブロス中で５．５時間成長させた。この１ｍＬから、１００μＬを平板培養し、一晩、成長させた。透過型電子顕微鏡法を使用して、細菌の進入を確認した（図２）。
【０１８２】
数時間、ナノ粒子で処理した後、少量のバクテリアを、アンピシリン陽性またはアンピシリン陰性プレートのいずれか上で平均培養した。さらに１２時間、細菌をこれらのプレート上で成長させ、各条件下で成長したコロニーの数を評価した。以下に結果を以下の表１に要約する。本戦略を使用して、細菌成長の６６％阻害を得た。日常的な条件の最適化により、１００％の良好な細菌の感作を得られることが予測される。
【０１８３】
【表１】
プロトコル：３０ｎＭ粒子を有する１ｍＬブロス中の５μＬの細菌ブロスを、３．５時間成長させた。１００μＬを平均培養し、一晩、成長させた。
【表２】
プロトコル：３０ｎＭ粒子を有する１ｍＬブロス中の５μＬの細菌ブロスを、５．５時間成長させた。１００μＬを平均培養し、一晩、成長させた。
【０１８４】
実施例３
オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子抱合体は転写ノックダウンをもたらす
さらなる戦略を利用して、プラスミド由来のルシフェラーゼ遺伝子において転写ノックダウンを検査する。本モデルは、ルシフェラーゼノックダウンを、ウミシイタケ発現をコードするプラスミド上の個別の領域と区別することにより、部位選択性遺伝子ノックダウンを例証するために使用された。本作用をアッセイするために、二重ルシフェラーゼリポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した。本モデルに利用された戦略は、ルシフェラーゼ遺伝子の完全なｍＲＮＡ転写物の形成を遮断することであった。これは、ウミシイタケに関して、ルシフェラーゼシグナルの減少をもたらす。これに使用された配列は、５’−ＣＣＣ ＧＡＧ ＣＡＡ ＣＧＣ ＡＡＡ ＣＧＣ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡ−ＳＨ−３’（配列番号４）であった。代替的に、プロモーター複合体がその標的部位を結合することを遮断するように、上に使用されたものに類似する戦略を使用することができる。本実施例において、５ｎｍ粒子が使用された。３００ｎＭ濃度の粒子を使用した、１２時間後に得られたノックダウンは、５９％であった（ｐ値＝０．０００４）。これらの結果は、転写レベルでの遺伝子調節をもたらす別の方法を例証する。データの要約を図３に示す。
【０１８５】
実施例４
オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子抱合体は転写を遮断する
二本鎖ゲノムＤＮＡとハイブリッド形成することにより、転写および後続のタンパク質生成を遮断するこれらの抱合体の能力を例証するために、生体外転写アッセイを行った。オリゴヌクレオチド機能化金ナノ粒子を、ルシフェラーゼ遺伝子をコードする二本鎖プラスミドＤＮＡを含有する生体外転写反応（Ｐｒｏｍｅｇａ）に添加した。オリゴヌクレオチド配列は、ルシフェラーゼ遺伝子のセンス鎖を標的にし、よって、転写のみを遮断することができ、翻訳は遮断しない。対照として、非相補的配列で機能化されたナノ粒子抱合体も、同じ方式で使用された。転写反応を進行させ、市販のキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ遺伝子を標的にするナノ粒子抱合体を含有した試料において、非相補的配列を有するナノ粒子抱合体を含有する対照反応物と比較して、ルシフェラーゼ活性の有意な減少（＞７５％）が観察された。
【０１８６】
加えて、ノックダウンの基礎原理を明らかにするために、緩衝剤中で実験を行い、予備成形された二重鎖のオリゴヌクレオチド金ナノ粒子抱合体の侵入を検査した。概略的な、得られたデータを図４（ＡおよびＢ）に示す。粒子は、予備成形された二重鎖（三重鎖形成）を結合してもよい。代替的に、粒子は、標的配列のそのより高い結合定数を介して、予備成形された二重鎖を置換してもよい。次いで、粒子を１３，０００ＲＰＭで遠心分離し、ＰＢＳ中で３回洗浄し、ＫＣＮで酸化させた。結合鎖の蛍光度を測定した。理論によって拘束されることなく、これは、フルオレセインキャップされたオリゴヌクレオチド（アンチセンス鎖）の解放、および蛍光シグナルの増加をもたらすと推測される。ナノ粒子の添加前に、消光剤（ダブシル、センス鎖）およびフルオロフォア（フルオレセイン、アンチセンス鎖）を有する二重鎖を形成した。濃度範囲に渡って、本戦略において配列特異性が見られる。
【０１８７】
実施例５
生体外で毒性のない遺伝子抑制
ＤＮＡ−Ａｕ ＮＰおよびｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰの両方は、生体外の複数の細胞において、遺伝子機能を抑制することを示した。例えば、サバイビンに対するｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰは、Ｔ−２４およびＨＴ−１３７６膀胱癌細胞の細胞死をもたらした。加えて、ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰは、単回治療後、培養物中、４日にわたり、ＨｅＬａ細胞におけるルシフェラーゼの発現を斬進的に低減し、一方、ルシフェラーゼ発現は、従来のｓｉＲＮＡで治療した後、４日でベースラインレベルまで戻った［Ｇｉｌｊｏｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １３１：２０７２−２０７３（２００９）］。細胞毒性は、遺伝子発現抑制に必要な濃度で観察されず、免疫媒介作用は、従来の核酸よりも顕著に低い。オリゴヌクレオチド−Ａｕ ＮＰを用いた１つ以上の遺伝子の同時抑制も示され、ガングリオシド生合成の２つの酵素（ＧＭ２／ＧＤ２シンターゼおよびＧＤ３シンターゼ）に対するＤＮＡ−Ａｕ ＮＰの培養したケラチノサイト（ＫＣ）への同時添加は、開始後３日で、ケラチノサイト膜でＧＭ３基質の蓄積をもたらし、目に見える膜発現が、アンチセンス封鎖後、少なくとも１週間継続した。
【０１８８】
これらのナノ抱合体に対する細胞応答を検査するために、１３ｎｍのクエン酸塩安定化された金ナノ粒子およびオリゴヌクレオチド修飾された粒子を比較した。クエン酸塩安定化された粒子は、ＨｅＬａ細胞（１２７遺伝子上方または下方制御）の遺伝子発現プロファイルにおいて、有意な変化を含んだが、組み換えｓｉＲＮＡまたはＤＮＡ機能化ナノ粒子は、遺伝子発現プロファイルにおいて、有意な変化を示さなかった。
【０１８９】
実施例６
ナノ粒子抱合体は、局所適用後、経皮的に送達される
ＤＮＡ−Ａｕ ＮＰまたはｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰを使用した試験は、一次ヒトケラチノサイトが、２時間以内に約１００％の効率で、ＤＮＡ−Ａｕ ＮＰおよびｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰを取りこむことを示す。金ナノ粒子の取り込みを測定するために、誘電結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）を使用し［Ｇｉｌｊｏｈａｎｎｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ７：３８１８−３８２１（２００７）］、ＤＮＡ−Ａｕ ＮＰの培養されたケラチノサイトによる取り込みは、任意の他の細胞の取り込みより少なくとも１０倍大きく、ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰのＫＣへの取り込みは、他の細胞種より２０倍高かったことが分かった。例えば、低カルシウム培地中のＫＣを用いた、５０ｐＭのｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰの６時間のインキュベーションは、細胞当り約６×１０５ＮＰの取り込みをもたらし、従来のｓｉＲＮＡの細胞取り込みより非常に高い。
【０１９０】
混合の容易性、適用部位での保持性、およびナノ抱合体の安定性（ナノ粒子の特徴のある赤色の持続性により決定される）を確実にする、可能性のある局所的送達用の軟膏、クリーム、およびローションの群を識別した。Ｃｙ５標識センスＤＮＡ−Ａｕ ＮＰ軟膏（Ａｑｕａｐｈｏｒ ｏｉｎｔｍｅｎｔ（登録商標）のＤＮＡ−Ａｕ ＮＰ）のマウスの背側皮膚への適用は、単回適用後、２時間で、角質層を通って表皮への浸透、６〜８時間で、上部真皮への浸透、および２４および４８時間で、真皮全体にわたる広域の分布を示した。例証される蛍光の持続性は、ＩＣＰ−ＭＳにより測定されるように、組織中の金ナノ粒子の持続性と良く相関した。同様に、Ｃｙ３修飾されたｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰ軟膏は、マウスの皮膚を通して迅速に取り込まれ、適用後２４時間で、表皮の基部から、真皮を通って皮下組織までの優れた浸透を示す（図５Ａ、Ｂ）。これらの試験は、ナノ粒子が、角質層に浸透し、表皮を横断し、その脈管構造を有する真皮に達したことを示した。
【０１９１】
局所適用は、毒性の痕跡を示さなかった。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの背側皮膚への１ヶ月の１５ｎＭの組み換えｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰの適用は、認められる全身または皮膚の臨床変化をもたらさなかった。対照（ビヒクルの適用または未治療）と比較して、金粒子蓄積は、メラノーマ転移の部位：皮膚、リンパ節、肺、および程度は低いが、肝臓および腎臓で最も著しかった。組織切片は、炎症、アポトーシスの痕跡、または増殖／皮膚の厚さにおける変化を示さなかった。予備毒性試験において、５０ｎＭ〜５００ｎＭ（各群にｎ＝５）の範囲の用量で、組み換えｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰを局所的に適用し、１０日間、毎日、マウスを治療した。皮膚、リンパ節、肝臓、胃腸管、および糞便で金粒子を検出し、これらの臓器で、適用されたナノ粒子の濃度に比例して、濃度は増加した。
【０１９２】
実施例７
局所適用されたｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰは、遺伝子発現を抑制する
局所アプローチを使用する遺伝子発現を標的にする試験において、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が、導入遺伝子（Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＵＢＣ−ＧＦＰ）３０Ｓｃｈａ／Ｊ）を遍在的に発現するマウスにおいて標的にされた。Ａｑｕａｐｈｏｒビヒクルを使用して、ＧＦＰに対してｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰを１５ｎＭ濃度で局所的に適用した。マウスを、４週間、連続して３回治療し、マウスの背部の半分を抗ＧＦＰ ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰで治療し、もう半分を組み換えｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰで治療した。治療した皮膚を単離した後、対照群と抗ＧＦＰ ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰで治療された群との間のＧＦＰレベルを比較するために、蛍光定量法を使用した。治療されたマウス（ｎ＝５）において、本レジメンは、蛍光的に測定された時、ＧＦＰ発現において４３％の減少をもたらした（ｐ＜０．００３６）（図６）。組み換え（対照）ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰで半分を治療されたマウスの皮膚から見られる約１２％のノックダウンは、抗ＧＦＰ ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰの全身取り込みを示した。
【０１９３】
実施例８
治療標的としての転移性メラノーマ
異なる遺伝子型のヒトメラノーマ細胞株（例えば、ＳＫ−ＭＥＬ−２８、１２０５Ｌｕ、Ａ３７５Ｐ、Ｃ８１６１、およびＷＭ３２１１株）およびヒトメラノーマ組織の試験から、転移性細胞は、ガングリオシドＧＭ３の独特の脱アセチル化形態の存在により、非転移性メラノーマ細胞および正常なメラニン細胞と区別できることが分かった。脱Ｎ−アセチルＧＭ３は、抗原的に明確なマーカーであるだけでなく、細胞移動および侵入も促進する［Ｌｉｕ Ｊ ｄｅ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ ＧＭ３ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｖｉａ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−２ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ （２００９）］。移植片マウスモデルを用いた試験は、マウスの転移性株の肺および肝臓への転移の蔓延の抑制において、脱Ｎ−アシルＧＭ３の有用性を検証した。これらの試験の間、皮膚および転移性メラノーマの確立の時間推移は、２つのＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ／ ＰＴＥＮ欠損モデルである、ＳＫ−ＭＥＬ−２８および１２０５Ｌｕを用いた移植片モデルで調査された。これらのモデルにおいて、１０６細胞の皮下接種は、肉眼、顕微鏡、およびＲＴ−ＰＣＲ評価により、接種後、数週間内で大半のマウスに皮膚腫瘍および肺および肝臓への転移をもたらす。ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰのメラノーマ細胞に浸透し、サバイビンの発現を抑制する能力も試験された。ＳＫ−ＭＥＬ ２８メラノーマ細胞株を使用して、ｓｉＲＮＡ Ａｕ−ＮＰは、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）により測定された時、サバイビンｍＲＮＡレベルを９１％低下させることを示した。
【０１９４】
実施例９
既知の遺伝子を標的にする多機能ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰは、組み合わせの生体外アプローチを使用する転移性メラノーマに関与する
遺伝的にシグナル伝達経路を標的にする多機能ナノ粒子の能力を検討する。抱合体を設計し、組み合わせ形式で複数の変異を標的にするように例証する。比率測定基準アプローチを使用して、複数の遺伝子を同時に調節する目的のために、機能化された抱合体を最適化する。
【０１９５】
複数のシグナル伝達経路、特にＢＲＡＦ／ＥＲＫおよびＡＫＴ３シグナル伝達は、転移性メラノーマにおいて上方制御されることが知られている。組み合わせアプローチを使用して、共通のＢＲＡＦ変異および活性化されたＡＫＴ３を標的にする。加えて、各実験において、ＢＲＡＦ Ｖ６００ＥおよびＡＫＴ３ ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰによるノックダウンの結果を、非相補的対照ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰの結果と比較した。これは、遺伝子ノックダウンの特異性を決定し、共役毒性の評価を可能にする。
【０１９６】
これらの２つのメラノーマ標的を個別に標的にする最適な戦略を決定する。第１に、ｓｉＲＮＡ抱合体は、ＢＲＡＦにおいて、Ｔ１７９９Ａ（Ｖ６００Ｅ）変異を標的にするように設計される。ｓｉＲＮＡ設計アルゴリズムを使用して、または文献からの選択を介して［Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ６５：２４１２−２４２１（２００５）］、標的毎に少なくとも３つの配列を設計する。ＢＲＡＦ抱合体を個別に評価して、ＢｒａｆＶＥ Ｐｔｅｎｌｏｘマウス細胞株、ヒトＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ含有細胞株３つ（Ａ３７５Ｐ、ＳＫ−ＭＥＬ−２８、１２０５Ｌｕ）、ならびに陰性対照として、正常なメラニン細胞（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、および野生型ＢＲＡＦのみを示すＣ８１６１転移性メラノーマ細胞株において、遺伝子ノックダウンに最適な濃度を決定する（表Ａを参照）。
【０１９７】
第２の配列は、ＡＫＴ３を標的にするように設計され［Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ１５：１６７４−１６８５（２００９）］、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ含有細胞株３つ、同様にＡＫＴ活性を有するＣ８１６１株、および対照として、正常なヒトメラニン細胞において試験された。ＢｒａｆＶＥ発現を誘発するために、遺伝子導入マウス株からの細胞を４−ＨＴ（および対照として、４−ＨＴなし）の存在下で成長させた。ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰ治療後の特定の時間点で細胞を収集した後、ｑＲＴ−ＰＣＲおよびウエスタンブロット解析を使用して、ヒトならびにマウスのＢＲＡＦ Ｖ６００ＥおよびＡＫＴ３のｍＲＮＡとタンパク質発現のレベルを決定する［Ｄａｎｋｏｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ４１：５４４−５５２（２００９）、Ｄａｎｋｏｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ２１：３７９−３８４（２００７）］。ノックダウンの特異性を確認するために、ｑＲＴ−ＰＣＲおよび免疫ブロットにより、ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰ治療の効果を野生型ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦ、ＡＫＴ１、およびＡＫＴ２で評価した［Ｓｔａｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ６４：７００２−７０１０（２００４）］。技法は、ＮＲＡＳ（例えば、Ｑ６１Ｌ）またはｃ−ＫＩＴ等における、ＥＲＫ活性の増加をもたらす頻度が低い変異の標的も可能にする。
【０１９８】
金ナノ粒子は、分子結合の足場として機能するため、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ およびＡＫＴ３を同時に標的にするための組み合わせアプローチの使用を検討する。各変異を標的にするｓｉＲＮＡ二重鎖を、異なる割合でナノ粒子に添加する。抱合体の化学量を制御する能力を使用して、ｓｉＲＮＡの細胞への送達は厳密に作用され、各標的の量は微調節されるため、ノックダウンおよび細胞応答の調査を可能にする。
【０１９９】
実施例１０
シグナル伝達経路変更および細胞機能の評価
選択された個別の、および多機能のｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰのシグナル伝達および細胞の生物学的様態への影響が、記載されるように比較される［Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ１１９：１０７−１１７（２００２）、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ１２６：２６８７−２６９６（２００６）、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２７６：４４５０４−４４５１１（２００１）、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２７８：２５５９１−２５５９９（２００３）］。ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ／ＡＫＴ３ ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰは、ＥＲＫリン酸化ならびにＡＫＴ発現およびリン酸化の両方を抑制する。これは、ｐＥＲＫ、ＥＲＫ、ｐＡＫＴ、およびＡＫＴに対する抗体を用いた免疫ブロットにより確認される。メラノーマ細胞増殖の増加および生存におけるＢＲＡＦ／ＥＲＫおよびＡＫＴシグナル伝達の主要な役割を考えると、生体外メラノーマ細胞機能における著明な変化は、ノックダウンの結果として生じる。アポトーシスの誘発は、ＰＡＲＰ切断を判定するための免疫ブロットおよびアネキシンＶ流動試験により判断される。ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ抑制およびＡＫＴ３抑制の相対的な役割は、Ｂｉｍ（ＢＲＡＦ活性化により誘発される）、ＢＣＬ−２（ＡＫＴ活性化により誘発される）、およびＢＡＤ（ＡＫＴ活性により抑制される）のタンパク質発現を特定することにより分析される。組み換え配列を有する対照における誘発されたアポトーシスの欠損は、アポトーシスがｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰ毒性ではなく意図される標的に起因することを確実にする。増殖は、細胞計数およびＷＳＴ−１［（４−［３−（４−インドフェニル）−２−（４−ニトロフェニル）−２Ｈ−５−テトラゾリオ］−１，３−ベンゼンジスルホネート）］アッセイにより判定され、サイクリンＤ１発現は、免疫ブロットにより評価される。メラノーマ細胞は、血管新生（特に、ＩＬ−８およびＶＥＧＦ）および侵入（特に、ＭＭＰ−２）の一因となる因子を発現する［Ｌｉｕ Ｊ ｅｔ ａｌ．， ｄｅ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ ＧＭ３ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｖｉａ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−２ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２００９）］。腫瘍ＶＥＧＦ、Ｈｉｆ−１α、およびＭＭＰ−２の発現は、免疫ブロット細胞計数および上澄みにより判定され、培養物の上澄みのＭＭＰ−２機能酵素電気泳動アッセイの判定は、前述のように行われる［Ｌｉｕ Ｊ ｅｔ ａｌ．， ｄｅ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ ＧＭ３ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｖｉａ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−２ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２００９）、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２７８：２５５９１−２５５９９（２００３）］。ＩＬ−８発現は、ＥＬＩＳＡにより、細胞の上澄みで判定される［Ｃｒａｗｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ７：４９２−４９９（２００８）］。細胞侵入アッセイは、マトリゲル浸潤チャンバを使用して行われる［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２７８：２５５９１−２５５９９（２００３）］。
【０２００】
多機能ｓｉＲＮＡ−ＡｕＮＰは、別の遺伝子変異を標的にするための（ＷＭ１３６６細胞株等における）、または追加の標的ｓｉＲＮＡをＢＲＡＦ Ｖ６００ＥおよびＡＫＴ３を標的にする多機能ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰに追加するための機会を提供する。したがって、細胞株のそれぞれの遺伝子プロファイルならびにそれらの既知の遺伝子変異を使用する、３つ以上の遺伝子を標的にする能力も意図される（表Ａ）。例えば、ＳＫ−ＭＥＬ−２８および１２０５Ｌｕ細胞の両方は、特定のＣＤＫ４点変異を有し、これらの変異は、ＢＲＡＦ抑制に対する応答に影響を及ぼすように見えないが、追加の標的は、これらの変異の機能的作用の探索を可能にする。同様に、ＳＫ−ＭＥＬ−２８および１２０５Ｌｕは、転移性メラノーマ形質転換および進行におけるそれらの有意性を探索するように標的にされる、ｐ５３（ＳＫ−ＭＥＬ−２８）およびＣＤＫＮ２Ａ（１２０５Ｌｕ）において、追加の標識変異を有する。これらの細胞株は、両方とも生体内異種移植モデルに広範に使用されている。
【０２０１】
実施例１１
ｓｉＲＮＡナノ抱合体の経皮および静脈内送達のための条件、安全性、および体内分布
静脈内および経皮的に投与される組み換えｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰの送達、クリアランス、および毒性を、免疫応答性マウスで比較する。加えて、抱合体の毒性および薬物動態プロファイルを判定する。多機能ナノ粒子は、本明細書に上述される、ヒトの皮膚に浸透するようにも最適化される。
【０２０２】
ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰは、経皮送達により全身に送達され、それらの動態を金粒子の蓄積により追跡する。臓器中の金粒子のレベルは、前述のように、ＩＣＰ−ＭＳにより測定される［Ｇｉｌｊｏｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ７：３８１８−３８２１（２００７）］。これらの試験において、６匹のマウスを、各ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰ治療群で試験し、対照として、各パラメータの２匹のマウスにビヒクルを適用する。体内分布試験において、送達は、メラノーマ転移の最も一般的な部位であり、局所投与を用いた試験においてｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰが到達する部位である、肝臓、肺、皮膚、およびリンパ節に焦点を当てる。腎臓、脾臓、副腎、および胃腸管（毒性の可能性がある部位）も監視され、脳（到達するのが困難である、ヒトにおける偶発的な転移部位）も監視される。これらの試験で、５００ｎＭのｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰを投与するが、これは、本濃度が経皮送達を通して良好に内部標的に達するためである。
【０２０３】
経皮送達
表皮、真皮、および皮下細胞による２５ｎＭのフルオロフォア抱合ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰの広範な取り込みは、適用後、２４時間内（図５）示され、僅か１５ｎＭの非機能性ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰの適用後でも、金粒子の皮膚、リンパ節、肺、肝臓、および腎臓への送達が示された。試験は、形質転換マウスメラノーマモデルにおいて治療が開始する週齢である、７〜８週齢の免疫応答性Ｃ５７ＢＬ／６マウスで行われる。
【０２０４】
単回投与での送達、クリアランスおよび毒性
多機能ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰを用いた時間経過実験は、１）経皮浸透の時間経過および効率性、２）内部臓器への送達の有効性、３）単回適用後のクリアランス、および４）刺激性および毒性の可能性を判断するために行われる。マウスを一度治療した後、治療後２時間〜７週までの８つの時間点で安楽死させる。これらの試験において、初期時間点（すなわち、２、４、２４、および７２時間）でのｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰの分布は、皮膚への浸透、臓器への送達、およびクリアランスを確実にするために比較される。局所的に治療されたマウスにおいて、皮膚の治療部位は、金粒子濃度を定量化するためのＩＣＰ−ＭＳ用に、および−８０℃での保存用（例えば、後のＥＬＩＳＡアッセイ用）に毒性がないことを確実にするために、組織学分析用に３等分される。ＩＣＰ−ＭＳ用の皮膚切片を短時間６０℃の水に曝し、血管新生化された真皮から表皮を単離し、これによって、真皮／皮下送達に対する表皮送達を判断する。致死する時に、金含有量について、臓器（上に記述する）および遠隔の皮膚をＩＣＰ−ＭＳにより判定し、組織学判定（以下を参照）のために各臓器の一部を取り出した。
【０２０５】
反復投与での蓄積
マウスが提案された実験において、単に単回適用ではなく繰り返し治療されることから、これらの試験も、金ナノ粒子の蓄積を定量化するために、１０日、４週間、および７週間の間、毎週２〜３回治療されるマウス（単回適用後の皮膚における金粒子の持続性に基づく）を用いて行われる。
【０２０６】
毒性の判定
２日に１回マウスの体重を量り、眼に見える皮膚の変化または行動の変化を観察する。有害な影響を検査するために、臓器レベルで組織学および免疫組織化学評価を行った。特に、全組織および皮膚における壊死および炎症の存在、表皮成熟の変化、およびメラニン沈着の存在（色素ダンピング）を判断した。皮膚および内臓の萎縮の痕跡が見られる場合、細胞増殖は、Ｋｉ６７の検出により、免疫組織化学的に判定される。疑わしいアポトーシスの存在が免疫組織化学的に確認される（ＡｐｏｐＴａｇ Ｉｎ Ｓｉｔｕアポトーシス検出）［Ｌａｎｎｕｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７（２３）：５２７７−８０（１９９７）］。皮膚が先天性免疫臓器であり、アポトーシス促進性サイトカインを発現できることから、治療された皮膚で、表皮アポトーシスが見られる場合、対照治療された皮膚に対するｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰ皮膚において、ＴＮＦ−α発現用のＥＬＩＳＡアッセイが行われる。
【０２０７】
最終段階前に、心穿刺により、全動物において血液を得る。単回用量試験において、必要に応じて、後の分析のために血清を凍結する。１０日以上治療されたマウスからの血液を、血球数、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（肝臓機能）、およびクレアチニンレベル（腎臓機能）について分析する（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ）。
【０２０８】
ヒトの皮膚における経皮送達
フランツ拡散セルを用いた生体外実験を行うために、腹壁形成術からの正常なヒトの皮膚を使用して、ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰのヒトの皮膚を横断する能力を試験する。これらのフランツセルは、過去数十年間、ヒトの皮膚を通る流束（ｆｌｕｘ）を検査するための判断基準であった。これらは、ヒトの生体内条件に一致するように、そして重要な点は、浸透圧勾配視入レーション皮膚を提供するように、温度および湿度制御される。ｓｉＲＮＡおよび金粒子は抱合されたままであるため、ヒトの皮膚を通した金粒子の輸送は、浸透のマーカーとして、ＩＣＰ−ＭＳにより定量化される。真皮から角質層／表皮を分離した後、再構成された皮膚を得る。再構成されたヒトの皮膚試料の整合性は、解剖顕微鏡下で、視覚的に確認される。組織が無損傷であることをさらに確認するために、組織が無損傷である場合、最初の３０分内で、回収された試料中で金は検出できないという想定のもとに、最初の３０分に、受容液試料を回収する。皮膚をフランツセルに搭載した後、ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰ（５００ｎＭから始め、１００ｐＭの低さまで減らす）を、対照としてのＡｑｕａｐｈｏｒとともに適用する。試験は、少なくとも三通りで、少なくとも３回行われる。これらの試験は、時間とともにｃｍ２の皮膚表面全体を通過する薬物の量（ｎｇ／ｃｍ２／時間）である、ヒトの表皮を通る流束を示す。６時間および２４時間の終わりに、皮膚を刻み、組織中の残留Ａｕ ＮＰを測定するために、ＩＣＰ−ＭＳ測定用に金粒子を抽出する。
【０２０９】
実施例１２
マウスモデルの確立
前述のように、６週齢で、左および右の脇腹に、３日間連続でＤＭＳＯ中５ｍＭの４−ＨＴを局所投与することにより、メラノーマを誘発する［Ｄａｎｋｏｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ４１：５４４−５５２（２００９）］。これらの有色メラノーマは、有色腫瘍と同様に、最初に、形質転換されたモデルにおいて、４−ＨＴ投与後７〜１０日で、明らかになる［Ｄａｎｋｏｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ４１：５４４−５５２（２００９）］。マウスモデルを生成するための試験において、溶媒のみの適用は対照として使用される。少なくとも皮膚の腫瘍が最初に検出されるまで療法が始まらない、ヒト疾病をシミュレーションするために、メラノーマが目に見えるか、または少なくとも５ｍｍ２の最低領域で明白になるまで、療法の開始は、両方のマウスモデルで保留される。
【０２１０】
用量設定試験
５０ｎＭから５００ｎＭの間の３用量のそれぞれで、８匹のマウスを試験する。用量設定試験の対照は、組み換えｓｉＲＮＡおよびＡｑｕａｐｈｏｒ単独を含む。検死のために、療法後７週間で、マウスを致死した。原発性メラノーマおよび任意の皮膚の転移の写真を撮り、カリパスで各治療の時に容積を測定する。目に見える、または明白な皮膚転移の数を記述する。肺、肝臓、リンパ節、腎臓、および脳の肉眼の転移を数え（それらは暗褐色のため容易である）、微視的転移の痕跡について、各臓器全体の複数の個所で、組織学的に臓器を検査する。微視的転移は、顕微鏡的に容易に目に見えるが、必要に応じて、色素沈着をさらに顕著にするために、フォンタナ−マッソン染色を使用する。任意の毒性の痕跡なしに転移を低減するのに最も効果的な用量が、後続の試験に使用される。
【０２１１】
転移の発生の時間経過およびｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰ療法によるその変化
前回の試験に基づく用量および頻度で、ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰ、組み換えｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰ、または対照ビヒクル（局所Ａｑｕａｐｈｏｒ）をマウスに投与する。一組各８匹のマウスを、治療の開始後、１、３、５および７週で致死し、上述のように、肉眼で、および組織学的に内臓転移を評価する。
【０２１２】
ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰの作用のメカニズム
原発性腫瘍を、定期的な組織学試験と免疫組織化学試験、免疫ブロット分析とｑＰＣＲのために分けた。これらの試験における対照は、組み換えｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰまたはビヒクルで治療されたマウスからの腫瘍、および正常／未治療皮膚（例えば、形質転換マウスの上背部からの皮膚）である。以下を調査する：ｉ）Ｋｉ６７染色を用いた腫瘍細胞増殖、ｉｉ）抗ＣＤ３１抗体を用いた腫瘍周囲の血管増生、ｉｉｉ）ＴＵＮＥＬアッセイまたはカスパーゼ３染色を用いた腫瘍細胞アポトーシス、ｉｖ）前述のプライマーを用いるｑＰＣＲを使用した、形質転換モデルにおけるＢｒａｆＶＥ、野生型Ｂｒａｆ、およびＡｋｔ３の発現の直接的抑制［Ｄａｎｋｏｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ４１：５４４−５５２（２００９）、Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ１５：１６７４−１６８５（２００９）、Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ６６：８２００−８２０９（２００６）、Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ６５：２４１２−２４２１（２００５）］、およびｖ）全Ｂｒａｆ；Ｃｒａｆ；ｐ−Ａｋｔ／全Ａｋｔ；およびｐ−ＥＲＫ１／２／全ＥＲＫ１／２のタンパク質発現の変化。血管新生および侵入のマーカーについて（ＶＥＧＦ、ＭＭＰ−２、およびＨｉｆ−１）、免疫ブロットにより腫瘍試料から抽出したタンパク質をアッセイする。ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰの最終投与後２時間の致死でのベースライン眼球内出血および心穿刺は、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−８レベルを判定するために行われる［Ｃｒａｗｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ７：４９２−４９９（２００８）］。免疫応答性形質転換モデルにおいて、Ｂｒａｆおよび／またはＡｋｔ３活性の抑制が免疫応答に影響を与え、細胞毒性を促進するかどうかに関わらずＴ細胞機能も判定される。これらの試験は、未治療または組み換えｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰ治療したマウスからの細胞ＢｒａｆＶＥ Ａｋｔ３ ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰ治療した形質転換マウスと比較する。免疫組織化学検査を使用して、腫瘍切片のＦｏｘｐ３＋（調節Ｔ細胞）およびＣＴＬＡ４＋／ＣＤ１５２（細胞毒性ＣＤ８＋Ｔ細胞）の数を数える。抗体の視覚化を確実にするために、ＡＥＣ色素原（赤色）を使用する。腫瘍浸潤性リンパ球を皮膚の腫瘍［Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ１８２：６０９５−６１０４（２００９）］、および治療開始後１、４、および７週で致死したマウスから抽出する。ＣＤ４、ＣＤ２５、Ｆｏｘｐ３、ＣＤ８、およびＣＴＬＡ４に対して、蛍光色素抱合された抗体を用いて染色した後、細胞はＦＡＣＳ分析を受ける。
【０２１３】
ｓｉＲＮＡ抑制の持続
個別の試験において、原発生腫瘍成長および転移を制御するために、マウスを７週間、ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰで治療する。マウスの半分（ｎ＝１２）は、療法を中断する。治療なしのマウスおよび治療を継続する同齢集団を、２、４、８、および１２週後に致死する。原発性メラノーマを毎週２回測定し、終了時に内臓転移を数える。加えて、皮膚および内臓腫瘍において、Ａｕ−ＮＰを定量化し、それらのクリアランスがどのように腫瘍抑制の反転と相関するかを判断する。
【０２１４】
生存期間の延長
形質転換マウスは、２５〜５０日で安楽死を要する［Ｄａｎｋｏｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ４１：５４４−５５２（２００９）］（例えば、腫瘍がその最大直径で２ｃｍに達するか、または栄養不良、１週間で２０％の体重の損失、もしくは２週間連続で１０％の体重の損失、異常呼吸、または痛みを示す体勢を示す等、マウスが病的であるかのいずれかの時）。ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰの作用を判定するための上述の試験において、マウスは、最高１０週の時間点で致死される。マウスの治療を継続し、最高３ヶ月の生存試験のために、未治療および組み換えｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰ治療したマウスとの比較を行う。マウス生存率は、カプラン−マイヤー生存曲線を使用してプロットされる。
【０２１５】
毒性の判定
２日に１回マウスの体重を量り、行動または食欲の変化の痕跡を観察する。定期的な病理組織学的染色法によって、組織毒性の痕跡（例えば、アポトーシスまたは炎症）について、肝臓および腎臓組織を判定し、当該分野に公知の方法に従い、骨髄、肝臓、および腎臓機能のスクリーニング血液試験を行う。毒性の痕跡が疑われる場合、さらなる免疫組織化学評価（ＴＵＮＥＬおよびＫｉ６７等）を行う。ｓｉＲＮＡ誘発の非特異的作用は、全ゲノム配列（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を行うために、心穿刺により得られる血清で判定される。遺伝子整列試験は、少なくとも７週間、ＢｒａｆＶＥ Ａｋｔ ３ ｓｉＲＮＡ−Ａｕ ＮＰに曝されたマウスおよびそれらの対照群からの試料で、少なくとも三通りで行われ、試料を保存（ｂａｎｋｅｄ）し、非特異的作用が検出される場合、整列は、曝露が短いマウスで行われる。
【０２１６】
統計分析
合成抱合体の遺伝子をノックダウンし、タンパク質発現に影響を与える能力を、Ｐ＜０．０５の有意性を有する両側スチューデントｔ検定を使用して判定する。ノンパラメトリックマン−ウィットニーＵ検定およびＰＲＩＳＭソフトウェアを使用して、皮膚メラノーマの大きさの差の有意性ならびに肺および肝臓転移の数を決定する。生存試験における有意性は、生存プロットのログランク検定により判断される。
【０２１７】
本発明は、種々の実施形態および実施例に関して説明されたが、当業者には、変形および改善が生じることは理解されるであろう。したがって、特許請求の範囲に示されるそのような制限のみが、本発明に提示されるべきである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子の経皮送達の方法であって、前記オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子および経皮ビヒクルを含む治療上有効量の組成物を、それを必要とする患者の皮膚に投与するステップを含む、方法。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子の送達は経皮的である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子の送達は局所的である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記経皮ビヒクルは軟膏である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記軟膏は、Ａｑｕａｐｈｏｒである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
遺伝子発現を調節する方法であって、オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子を含む治療上有効量の組成物を、前記オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子が標的とハイブリッド形成し、遺伝子発現を調節する条件下で皮膚に投与するステップを含む、方法。
【請求項７】
前記標的はポリペプチドである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記標的はポリヌクレオチドである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドはＲＮＡである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記組成物の投与は、皮膚疾患を軽減する、請求項１または請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記皮膚疾患は、癌、遺伝的疾患、老化、炎症、感染、および美容上の変形から成る群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記癌は、扁平上皮癌、基底細胞癌、乳癌、およびメラノーマから成る群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的は、Ｒａｓ、ＩｋＢα、ヘッジホッグ、Ｂ−Ｒａｆ、Ａｋｔ、およびサイクリンＤから成る群から選択される遺伝子により発現する遺伝子産物である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記遺伝的疾患は、単純性表皮水疱症、水疱性魚鱗癬、先天性爪肥厚症、コステロ症候群、および結節性硬化症から成る群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記標的は、変異を含む遺伝子産物であって、前記遺伝子産物は、Ｋ５、Ｋ１４、Ｋ１、Ｋ１０、Ｈ−Ｒａｓ、およびｍ−Ｔｏｒから成る群から選択される遺伝子により発現する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記老化性疾患は、ＵＶ損傷および早老症から成る群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記標的は、マトリックスメタロプロテアーゼ１およびプロジェリンから成る群から選択される遺伝子により発現する遺伝子産物である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記炎症は乾癬によるものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的はインターロイキン−２３である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ウイルス感染は疣贅をもたらす、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的はＥ６／Ｅ７である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記美容上の変形は、脂漏性角化症、表皮母斑、および色素性母斑から成る群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項２３】
前記標的は、変異を含む遺伝子産物であって、前記遺伝子産物は、ＦＧＦＲ３、Ｋ１０、およびＢ−Ｒａｆから成る群から選択される遺伝子により発現する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子および経皮ビヒクルを含む、経皮組成物。
【請求項２５】
請求項２４に記載の組成物を使用する、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子の経皮送達の方法であって、前記オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子および経皮ビヒクルを含む治療上有効量の組成物を、それを必要とする患者の皮膚に投与するステップを含む、方法。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子の送達は経皮的である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子の送達は局所的である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記経皮ビヒクルは軟膏である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記軟膏は、Ａｑｕａｐｈｏｒである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
遺伝子発現を調節する方法であって、オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子を含む治療上有効量の組成物を、前記オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子が標的とハイブリッド形成し、遺伝子発現を調節する条件下で皮膚に投与するステップを含む、方法。
【請求項７】
前記標的はポリペプチドである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記標的はポリヌクレオチドである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドはＲＮＡである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記組成物の投与は、皮膚疾患を軽減する、請求項１または請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記皮膚疾患は、癌、遺伝的疾患、老化、炎症、感染、および美容上の変形から成る群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記癌は、扁平上皮癌、基底細胞癌、乳癌、およびメラノーマから成る群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的は、Ｒａｓ、ＩｋＢα、ヘッジホッグ、Ｂ−Ｒａｆ、Ａｋｔ、およびサイクリンＤから成る群から選択される遺伝子により発現する遺伝子産物である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記遺伝的疾患は、単純性表皮水疱症、水疱性魚鱗癬、先天性爪肥厚症、コステロ症候群、および結節性硬化症から成る群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記標的は、変異を含む遺伝子産物であって、前記遺伝子産物は、Ｋ５、Ｋ１４、Ｋ１、Ｋ１０、Ｈ−Ｒａｓ、およびｍ−Ｔｏｒから成る群から選択される遺伝子により発現する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記老化性疾患は、ＵＶ損傷および早老症から成る群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記標的は、マトリックスメタロプロテアーゼ１およびプロジェリンから成る群から選択される遺伝子により発現する遺伝子産物である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記炎症は乾癬によるものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的はインターロイキン−２３である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ウイルス感染は疣贅をもたらす、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的はＥ６／Ｅ７である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記美容上の変形は、脂漏性角化症、表皮母斑、および色素性母斑から成る群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項２３】
前記標的は、変異を含む遺伝子産物であって、前記遺伝子産物は、ＦＧＦＲ３、Ｋ１０、およびＢ−Ｒａｆから成る群から選択される遺伝子により発現する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子および経皮ビヒクルを含む、経皮組成物。
【請求項２５】
請求項２４に記載の組成物を使用する、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【図１】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図２】
【公表番号】特表２０１２−５２４０６７（Ｐ２０１２−５２４０６７Ａ）
【公表日】平成２４年１０月１１日（２０１２．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０５９０３（Ｐ２０１２−５０５９０３）
【出願日】平成２２年３月１５日（２０１０．３．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２７３６３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２０４２０
【国際公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【出願人】（５１１１２４１８３）ノースウェスタン ユニバーシティ (9)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１０月１１日（２０１２．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月１５日（２０１０．３．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２７３６３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２０４２０
【国際公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【出願人】（５１１１２４１８３）ノースウェスタン ユニバーシティ (9)
【Ｆターム（参考）】
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