オンコスタチンＭ受容体シグナリング制御によるメタボリック症候群の治療
【課題】 メタボリック症候群に関連するインスリン抵抗性及び／又は脂肪組織の炎症に起因する疾患の治療又は予防のための医薬、及び該医薬のスクリーニング方法の提供を目的とする。
【解決手段】 本発明は、従来報告されていたオンコスタチンＭの生物学的活性とは、全く異なる新規な活性を見出したことに基づき、オンコスタチンＭ受容体アゴニストを有効成分とすることを特徴とする医薬、及び該受容体に対する結合及び／又は活性作用を指標とすることを特徴とするスクリーニング方法を提供するものである。
【解決手段】 本発明は、従来報告されていたオンコスタチンＭの生物学的活性とは、全く異なる新規な活性を見出したことに基づき、オンコスタチンＭ受容体アゴニストを有効成分とすることを特徴とする医薬、及び該受容体に対する結合及び／又は活性作用を指標とすることを特徴とするスクリーニング方法を提供するものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メタボリック症候群に関連するインスリン抵抗性及び／又は脂肪組織の炎症に起因する疾患の治療又は予防のための医薬、及び該医薬のスクリーニング方法に関する。より詳細には、オンコスタチン受容体アゴニストを有効成分とすることを特徴とする医薬、及び該受容体に対する結合及び／又は活性作用を指標とすることを特徴とするスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現代社会において、メタボリック症候群の患者数の増加は著しく、その予防及び治療のために必要とされる社会的、経済的コストは莫大な金額に上り、医療分野における重大問題として、早期解決が望まれている。
【０００３】
メタボリック症候群は、内臓脂肪型肥満（内臓肥満・腹部肥満）に高血糖・高血圧・高脂血症のうち２つ以上を合併した状態として定義され、以前よりシンドロームＸ、死の四重奏、インスリン抵抗性症候群、マルチプルリスクファクター症候群、内臓脂肪症候群、等と呼称されてきた病態を統合整理した概念である。「肥満」、「高血糖」、「高血圧」、「高脂血症」は動脈硬化の危険因子であり、これらを発症している患者は心筋梗塞や脳梗塞を併発し易い。該症候群の主要な機序は、インスリン抵抗性(非特許文献１及び２)、腹部肥満（非特許文献３及び４）、炎症（非特許文献５及び６）等によると考えられている。よって、機序として想定されるこれらの症状を緩和することが、メタボリック症候群の治療及び予防に重要であると考えられている。
【０００４】
インスリン抵抗性とは、血糖値を低下させる働きを有するホルモンであるインスリンの自己分泌は十分であるにもかかわらず、インスリンが十分効果を発揮せず、血糖値が下がりづらい特性のことである。インスリン抵抗性の原因は、相対的なエネルギー過剰状態であるため、治療方法は低カロリー食と運動が中心である。インスリン抵抗性改善薬にはＰＰＡＲ−γ（ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体γ）作働薬等があるが、該改善薬には、心疾患のリスク亢進、浮腫の誘発等の副作用が知られており、治療薬として必ずしも十分ではない。
【０００５】
一般にメタボリック症候群の基盤病態として，全身の軽度の炎症反応が指摘されている（非特許文献７）。すなわち、肥満とインスリン抵抗性の間にＴＮＦαによって誘発される炎症が介在し、脂肪組織の炎症及びインスリン抵抗性を介して糖尿病や心臓血管病といったメタボリック症候群に至ることが提唱されている（非特許文献８）。また、肥満の早期よりＴリンパ球が内臓脂肪の炎症を調節し、該炎症を抑制すると、全身の代謝異常も改善することが知られており（非特許文献９）、このことから、脂肪組織の炎症抑制がメタボリック症候群の新しい治療薬の開発につながることが期待されているが、今のところ、このような機序を持つメタボリック症候群治療薬は存在しない。
【０００６】
以上より、インスリン抵抗性の抑制及び／又は脂肪組織の炎症抑制といった新たな作用機序を有するメタボリック症候群改善薬の開発が強く望まれている。
【０００７】
ところで、オンコスタチンＭは、分子量２６ｋＤａのサイトカイン（２２７アミノ酸）であり、インターロイキン６，インターロイキン１１，白血球抑制因子、毛様体神経栄養因子等からなるインターロイキン６のサブファミリーに属し、特に、構造的、機能的及び遺伝的に白血病抑制因子に類似している。機能としては、増殖制御、分化、遺伝子発現、細胞生存といった様々な現象に関与することが知られており、例えば、Ａ３７５メラノーマ等の細胞の成長に抑制的に働くが、正常繊維芽細胞、ＡＩＤＳに関連するカポシ肉腫細胞では成長を増大させる。該サイトカインは、炎症反応、造血、組織の再形成、発生等にも関与しており、特に炎症反応については、急性炎症反応の特徴である肝臓からのａｃｕｔｅ ｐｈａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＰＰ）の産生を誘導し、内皮細胞でのインターロイキン６産生を刺激する。インターロイキン６は、炎症反応を強く促進し、該サイトカイン欠損マウスではＡＰＰ産生の減少や、傷害を加えた肝臓の回復遅延等が認められたことより、オンコスタチンＭはインターロイキン６の産生を介して炎症反応に関与している可能性も考えられる。これに加えて、オンコスタチンＭは、ＲＡＳ／ＥＲＫ及びＳＴＡＴ５シグナル伝達系を介して脂肪形成を阻害することも報告されている（非特許文献１０）。このようにオンコスタチンＭは、メタボリック症候群発症の機序の可能性の１つとして考えられている脂肪組織や炎症への関係が示唆されているものの、具体的な関与を示す知見は何ら得られていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｒｅａｖｅｎ Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３７： １５９５−１６０７ １９８８
【非特許文献２】ＤｅＦｒｏｎｚｏ等 Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ １４： １７３−１９４ １９９１
【非特許文献３】Ｋａｐｌａｎ Ａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ １４９： １５１４−１５２０ １９８９
【非特許文献４】Ｌｅｍｉｅｕｘ等 Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０２： １７９−１８４ ２０００
【非特許文献５】Ｒｉｄｋｅｒ等 Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０９： ２８１８−２８２５ ２００４
【非特許文献６】Ｄａｎｄｏｎａ等 Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１１： １４４８−１４５４ ２００５
【非特許文献７】Ｄａｎｄｏｎａ等 Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ： ２５： ４−７ ２００４
【非特許文献８】Ｈｏｔａｍｉｓｌｉｇｉｌ等 Ｓｃｉｅｎｃｅ： ２５９：８７−９１ １９９３
【非特許文献９】Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ等 Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ： １５： ９１４−９２０ ２００９
【非特許文献１０】Ｍｉｙａｏｋａ等 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ： ２８１： ３７９１３−３７９２０ ２００６
【非特許文献１１】Ｔａｎａｋａ等 Ｂｌｏｏｄ： １０２： ３１５４−３１６２ ２００３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、上記事情に鑑み、オンコスタチンＭとメタボリック症候群に関係する諸症状（肥満及びインスリン抵抗性）との関連について、肥満モデル動物等を用いて鋭意研究を行った結果、オンコスタチンＭが肥満における脂肪組織の炎症及びインスリン抵抗性を改善することを見出し、該改善効果が、オンコスタチンＭ受容体を介した作用であることを明らかにした。
よって、本発明は、インスリン抵抗性及び／又は脂肪組織の炎症に起因する疾患の治療又は予防のための医薬、及び該医薬のスクリーニング方法の提供を目的とする。
さらに、上記医薬を用いたインスリン抵抗性及び／又は脂肪組織の炎症に起因する疾患の治療又は予防法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（６）に関する。
（１）オンコスタチンＭ受容体に対するアゴニストを含んでなる、インスリン抵抗性の改善薬。
（２）オンコスタチンＭ受容体に対するアゴニストを含んでなる、脂肪組織の抗炎症薬。
（３）前記オンコスタチンＭ受容体アゴニストが、以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるポリペプチドである（１）乃至（２）のいずれかに記載の医薬。
（ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、かつ、オンコスタチンＭ受容体への活性作用を有するポリペプチド
（４）前記オンコスタチンＭ受容体アゴニストが、以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるポリペプチドを有効成分とする（１）乃至（２）のいずれかに記載の医薬。
（ａ）配列番号４から７のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号４から７のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、かつ、オンコスタチンＭ受容体への活性作用を有するポリペプチド
（５）（１）乃至（４）のいずれかに記載の医薬のスクリーニング方法であって、オンコスタチンＭ受容体への結合を指標とすることを特徴とするスクリーニング方法。
（６）（１）乃至（４）のいずれかに記載の医薬のスクリーニング方法であって、オンコスタチンＭ受容体に対する活性作用を指標とすることを特徴とするスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係る医薬を用いることにより、インスリン抵抗性及び／又は脂肪組織の炎症に起因する疾患の治療又は予防が可能となる。
また、本発明に係るスクリーニング方法を用いることにより、インスリン抵抗性及び／又は脂肪組織の炎症に起因する疾患の治療又は予防のための医薬の開発を行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】肥満モデルマウスの脂肪組織におけるオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）の発現。Ａは、肥満モデルマウスの脂肪組織に存在するＯＳＭのウエスタンブロッティングによる解析結果である。Ｂ−Ｄは、各々、脂肪組織（Ｂ）、アディポサイト画分（Ｃ）及びＳＶＦ（間質血管細胞画分;stromal vascular fraction）（Ｄ）におけるタンパク質発現の定量分析の結果である。ＯＳＭのバンド強度は、チューブリンに対し標準化し、コントロール（白バー）に対する％で示した。データは、平均値±ＳＥＭ。＊Ｐ＜０．０５、スチューデント ｔテスト。Ｅ−Ｌは、肥満モデルマウスの脂肪組織を、ＯＳＭ、Ｆ４／８０及びｃａｖｅｏｌｉｎ−１で三重染色した図である。 通常食マウス及び正常マウスに比べ、高脂肪食マウス及び遺伝的肥満マウスｏｂ／ｏｂの脂肪組織において、ＯＳＭタンパクの有意な増加が確認された。
【図２】肥満モデルマウスの脂肪組織におけるＯＳＭ受容体サブユニット（ＯＳＭＲβ）の発現。Ａは、肥満モデルマウスの脂肪組織に存在するＯＳＭＲβのウエスタンブロッティングによる解析結果である。Ｂ及びＣは、各々、脂肪組織（Ｂ）及びＳＶＦ（間質血管細胞画分;stromal vascular fraction）（Ｃ）におけるタンパク質発現の定量分析の結果である。ＯＳＭＲβのバンド強度は、チューブリンに対し標準化し、コントロール（白バー）に対する％で示した。データは、平均値±ＳＥＭ、＊Ｐ＜０．０５。スチューデント ｔテスト。Ｄ−Ｋは、肥満モデルマウスの脂肪組織を、ＯＳＭＲβ、Ｆ４／８０及びｃａｖｅｏｌｉｎ−１で三重染色した図である。 通常食マウス及び正常マウスに比べ、高脂肪食マウス及び遺伝的肥満マウスｏｂ／ｏｂの脂肪組織において、ＯＳＭＲβの有意な増加が確認された。また、ＯＳＭＲβは主に脂肪組織マクロファージで発現していた。
【図３】肥満モデルマウスへのＯＳＭ投与による食餌量及び体重、脂肪組織重量および肝重量に対する効果。Ａは、ＰＢＳ又はＯＳＭを投与したｏｂ／ｏｂマウスの体重変化。Ｂは、ＰＢＳ又はＯＳＭを投与したｏｂ／ｏｂマウスの食餌量変化。Ｃは、ＰＢＳ又はＯＳＭを投与したｏｂ／ｏｂマウスの代表的な体内図。Ｄは、ＰＢＳ又はＯＳＭを投与したｏｂ／ｏｂマウスの組織重量変化。Ｅ−Hは、ＰＢＳ又はＯＳＭを投与したｏｂ／ｏｂマウスの脂肪組織（Ｅ及びＦ）及び肝臓組織（Ｇ及びＨ）切片の組織学的分析結果。 遺伝的肥満マウスｏｂ／ｏｂの腹腔内へのＯＳＭ投与により、該肥満マウスの食餌量は減少したが、体重、脂肪組織重量及び肝重量に変化は生じなかった。
【図４】肥満モデルマウスへのＯＳＭ投与による高血糖及び高インスリン血症に対する効果。Ａは、ＰＢＳ又はＯＳＭを投与したｏｂ／ｏｂマウスの血中のグルコースレベル。Ｂは、ＰＢＳ又はＯＳＭを投与したｏｂ／ｏｂマウスの血清中のインスリンレベル。Ｃは、ＰＢＳ又はＯＳＭを投与したｏｂ／ｏｂマウスの腹腔内ブドウ糖負荷試験（ｉｐＧＴＴ）。Ｄは、ＰＢＳ又はＯＳＭを投与したｏｂ／ｏｂマウスのインスリン負荷試験（ＩＴＴ）。データは、平均値±ＳＥＭ。＊Ｐ＜０．０５、スチューデント ｔテスト（Ａ及びＢ）。分散分析及び、多重比較検定（ボンフェローニテスト）（C及びD）。 遺伝的肥満マウスｏｂ／ｏｂの腹腔内へのＯＳＭ投与により、該肥満マウスでの高血糖及び高インスリン血症が改善した。
【図５】肥満モデルマウスへのＯＳＭ投与による脂肪組織炎症に対する効果。Ａは、ＰＢＳ又はＯＳＭを投与したｏｂ／ｏｂマウスの脂肪組織中のマクロファージの表現型のマーカーをウエスタンブロッティングで解析した結果である。Ｂは、ｉＮＯＳ、ＣＤ２０６及びＣＤ１６３タンパク質発現の定量的解析結果である。各タンパク質のバンド強度は、チューブリンに対し標準化し、ＰＢＳを投与したコントロール（白バー）に対する％で示した。Ｃ及びＤは、ＰＢＳ又はＯＳＭを投与したｏｂ／ｏｂマウスの脂肪組織中におけるＴＮＦ−α及びＩＬ−６の発現量を調べた結果である。ＴＮＦ−α及びＩＬ−６の濃度はＥＬＩＳＡにより測定した。Ｅは、ＰＢＳ又はＯＳＭを投与したｏｂ／ｏｂマウスの脂肪組織中におけるＩＬ−１０ ｍＲＮＡの発現量を定量的リアルタイムＰＣＲで定量した結果である。Ｆは、ＰＢＳ又はＯＳＭを投与したｏｂ／ｏｂマウスのアディポネクチンの血清レベルを測定した結果である。測定はＥＬＩＳＡにより行った。データは、平均値±ＳＥＭ。＊Ｐ＜０．０５、スチューデント ｔテスト。遺伝的肥満マウスｏｂ／ｏｂの腹腔内へのＯＳＭ投与により、該肥満マウスでの脂肪組織炎症が改善した。
【図６】ＯＳＭ受容体のサブユニット（ＯＳＭＲβ）を欠損させたノックアウトマウスの通常食摂取後におけるインスリン抵抗性の評価。Ａは、ＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウスにＮＤ（通常食）を与えた場合の体重変化。Ｂは、ＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウスの食餌量。Ｃは、ＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウスにＮＤを与えた場合の組織重量の変化。Ｄ−Ｇは、ＮＤを与えたＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウスのグルコース代謝を示す結果である。Ｄは、血中グルコースレベル、Ｅは、血清インスリンレベルを示す。また、ＦはｉｐＧＴＴを、ＧはＩＴＴの変動を示す。データは、平均値±ＳＥＭ、＊Ｐ＜０．０５、スチューデント ｔテスト（Ｂ及びＣ）。分散分析及び、多重比較検定（ボンフェローニテスト）（Ａ及びＤ−Ｇ）。 正常マウスに比べ、該サブユニットノックアウトマウスではインスリン抵抗性が生じていた。
【図７】ＯＳＭＲβを欠損させたノックアウトマウスの通常食摂取後における脂肪組織マクロファージのタイプ評価。 Ａは、ＮＤを与えたＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウスの脂肪組織中のマクロファージ表現型マーカー（ｉＮＯＳ、ＣＤ２０６及びＣＤ１６３）についてウエスタンブロッティングにより解析した結果である。Ｂは、ｉＮＯＳ、ＣＤ２０６及びＣＤ１６３の発現量を定量的に分析した結果である。各タンパク質のバンド強度は、チューブリンに対し標準化し、ＯＳＭＲβ−／−マウス（白バー）に対する％で示した。Ｃ及びＤは、ＮＤを与えたＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウスの脂肪組織について、Ｆ４／８０及びｃａｖｅｏｌｉｎ−１で二重染色した結果である。Ｅは、ＮＤを与えたＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウスのＳＶＦにおけるＦ４／８０陽性細胞の全細胞に対する比率を示す。Ｆは、ＮＤを与えたＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウスの精巣上体脂肪体中のＦ４／８０陽性細胞の総数を示す。Ｇは、ＮＤを与えたＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウスのＦ４／８０陽性細胞中のＣＤ１１ｃ陽性細胞の比率を示す。Ｈは、ＮＤを与えたＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウスのＦ４／８０陽性細胞中のＣＤ２０６陽性細胞の比率を示す。Ｉは、ＮＤを与えたＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウスのＦ４／８０陽性細胞中のＣＤ２０６陽性細胞に対するＣＤ１１ｃ陽性細胞の割合を示す。データは、平均値±ＳＥＭ。＊Ｐ＜０．０５、スチューデント ｔテスト。 正常マウスに比べ、該サブユニットノックアウトマウスではＭ１マクロファージ数／Ｍ２マクロファージ数が増加していた。
【図８】ＯＳＭＲβを欠損させたノックアウトマウスの通常食摂取後における脂肪組織内ＴＮＦ−α及びＩＬ−１０含量の評価。Ａ及びＢは、各々、ＮＤを与えたＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウス脂肪組織中のＴＮＦ−α（Ａ）及びＩＬ−６（Ｂ）の発現量を示す。Ｃは、ＮＤを与えたＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウスの脂肪組織中のＩＬ−１０ ｍＲＮＡ発現量を示す。Ｄは、ＮＤを与えたＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウスのアディポネクチンの血清レベルを示す。データは、平均値±ＳＥＭ。＊Ｐ＜０．０５、スチューデント ｔテスト。 正常マウスに比べ、該サブユニットノックアウトマウスではＴＮＦ−α含量が増加し、ＩＬ−１０が減少していた。
【図９】マウスの腹腔浸出マクロファージ（ＰＥＭ）及びマウスマクロファージ由来の細胞株（ＲＡＷ２６４．７細胞）へのＯＳＭ処理による反応。Ａは、ＰＥＭ中のｐＣＲＥＢ及びｐＥＲＫのウエスタンブロッティングによる解析結果である。Ｂは、ＰＥＭ中において、ＯＳＭ及びＩＬ−４により誘導されたＩＬ−１０ ｍＲＮＡ量を定量的リアルタイムＰＣＲで定量した結果である。Ｃは、全細胞抽出液に対し、抗ｉＮＯＳ抗体、抗アルギナーゼＩ抗体及び抗ＣＤ２０６抗体によりウエスタンブロッティングを行った結果である。Ｄは、アルギナーゼＩ及びＣＤ２０６のタンパク発現を定量的に解析した結果である。各タンパク質のバンド強度は、チューブリンに対し標準化し、コントロール（白バー）に対する％で示した。データは、平均値±ＳＥＭ、＊Ｐ＜０．０５、分散分析及び、多重比較検定（ボンフェローニテスト）（Ｂ）スチューデント ｔテスト（Ｄ）。 ＯＳＭ処理を施すことにより、ＩＬ−１０、アルギナーゼＩ及びＣＤ２０６含量が増加した。
【図１０】ＯＳＭＲβを欠損させたノックアウトマウスの高脂肪食摂取後におけるインスリン抵抗性の評価。 ＨＦＤを与えたＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウスの血中グルコースレベル（Ａ）、血清インスリンレベル（Ｂ）、ｉｐＧＴＴ（Ｃ）及びＩＴＴ（Ｄ）を調べた。データは、平均値±ＳＥＭ。＊Ｐ＜０．０５、分散分析及び、多重比較検定（ボンフェローニテスト）。 正常マウスに比べ、該サブユニットノックアウトマウスではインスリン抵抗性が生じていた。
【図１１】ＯＳＭＲβを欠損させたノックアウトマウスの高脂肪食摂取後における脂肪組織マクロファージのタイプ評価。 Ａは、ＨＦＤを与えたＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウスの脂肪組織中のマクロファージ表現型マーカー（ｉＮＯＳ、ＣＤ２０６及びＣＤ１６３）についてウエスタンブロッティングにより解析した結果である。Ｂは、ｉＮＯＳ、ＣＤ２０６及びＣＤ１６３の発現量を定量的に分析した結果である。各タンパク質のバンド強度は、チューブリンに対し標準化し、ＯＳＭＲβ−／−マウス（白バー）に対する％で示した。Ｃ及びＤは、ＨＦＤを与えたＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウスの脂肪組織について、Ｆ４／８０及びｃａｖｅｏｌｉｎ−１で二重染色した結果である。Ｅは、ＨＦＤを与えたＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウスのＳＶＦにおけるＦ４／８０陽性細胞の全細胞に対する比率を示す。Ｆは、ＨＦＤを与えたＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウスの精巣上体脂肪体中のＦ４／８０陽性細胞の総数を示す。Ｇは、ＨＦＤを与えたＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウスのＦ４／８０陽性細胞中のＣＤ２０６陽性細胞の比率を示す。Ｈは、ＨＦＤを与えたＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウスのＦ４／８０陽性細胞中のＣＤ１１c陽性細胞の比率を示す。Ｉは、ＨＦＤを与えたＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウスのＦ４／８０陽性細胞中のＣＤ２０６陽性細胞に対するＣＤ１１ｃ陽性細胞の割合を示す。データは、平均値±ＳＥＭ。＊Ｐ＜０．０５、スチューデント ｔテスト。 正常マウスに比べ、該サブユニットノックアウトマウスではＭ１マクロファージ数／Ｍ２マクロファージ数が増加していた。
【図１２】ＯＳＭＲβを欠損させたノックアウトマウスの高脂肪食摂取後における脂肪組織内ＴＮＦ−α及びＩＬ−１０含量の評価。Ａ及びＢは、各々、ＨＦＤを与えたＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウス脂肪組織中のＴＮＦ−α（Ａ）及びＩＬ−６（Ｂ）の発現量を示す。Ｃは、ＨＦＤを与えたＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウスのアディポネクチンの血清レベルを示す。データは、平均値±ＳＥＭ。＊Ｐ＜０．０５、スチューデント ｔテスト。正常マウスに比べ、該サブユニットノックアウトマウスではＴＮＦ−α含量が増加していた。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明者らは、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）とメタボリック症候群との関連性を検討するべく、肥満モデル動物の脂肪組織におけるオンコスタチンＭの発現を調べたところ、有意に増加しており、該ペプチドは脂肪細胞に局在していることを見出した（図１参照）。
さらに肥満モデル動物の腹腔内にＯＳＭを投与したところ、脂肪組織及び肝臓組織の重量及び体重には変化はなかったものの、モデル動物の高血糖及びインスリン抵抗性は顕著に改善した（図３，４参照）。
以上の点から、ＯＳＭはインスリン抵抗性を改善する効果を有し、インスリン抵抗性に起因する疾患の治療又は予防のための医薬となりうることが示唆された。
【００１４】
本発明の第１の態様は、オンコスタチンＭ受容体に対するアゴニストを含んでなるインスリン抵抗性改善薬、又は、脂肪組織の炎症抑制薬である。
ここで、本発明のＯＳＭは、いかなる動物由来のものであってもよく、例えば、ほ乳類由来のものをさし、好ましくは、ヒト、ラット、マウス、ウシ、ウマ、ヒツジ、ニワトリ、イヌ、ネコなど由来をさし、更に好ましくは、配列番号３、４、５、６、７でそれぞれ表されるアミノ酸配列からなるヒト、マウス、ラット、ウシ、イヌ由来をさし、最も好ましくは、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるヒトＯＳＭをさす。
【００１５】
また、本発明におけるＯＳＭポリペプチドは、配列番号３から７のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。ここで、「実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド」とは、配列番号３から７のいずれかで表わされるアミノ酸配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，最も好ましくは約９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつＯＳＭ受容体に対する結合及び／又は活性作用を指標とすることを特徴とするポリペプチドである。
【００１６】
あるいは、「配列番号３から７のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、かつ、オンコスタチンＭ受容体への活性作用を有するポリペプチド」とは、配列番号３から７のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、更に好ましくは１〜５個程度のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、かつ、オンコスタチンＭ受容体への活性作用を有するポリペプチドである。
上記アミノ酸の欠失、付加及び置換は、単離した天然ポリペプチドに存在していてもよく、また、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって新たに導入したものでもよい。例えば、特定のアミノ酸残基の置換は、市販のキット等を使用し、Ｇｕｐｐｅｄｄｕｐｌｅｘ法やＫｕｎｋｅｌ法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法により塩基の置換を行なうことによって達成することができる。
【００１７】
また、ＯＳＭのＣ末端は、通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）又はカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、当該カルボキシル基は、アミド（−ＣＯＮＨ２）やエステル（−ＣＯＯＲ）等に化学修飾されていてもよい。ここで、エステル中のＲとしては、Ｃ１−６アルキル基（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル）、Ｃ３−８シクロアルキル基（例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル）、Ｃ１−６アリール基（例えば、フェニル、α−ナフチル）、フェニル−Ｃ１−２アルキル基（例えば、ベンジル、フェネチル）、α−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基（例えば、α−ナフチルメチル）等が挙げられる。その他、経口用エステルとして汎用されているピバロイルオキシメチルエステルとすることも可能である。該ポリペプチドがＣ末端以外にもそのポリペプチド鎖中にカルボキシル基を有する場合には、当該カルボキシル基がアミド化又はエステル化されているものもＯＳＭに含まれる。この場合のエステルとしては上記の各エステルが挙げられる。同様に、ＯＳＭのＮ末端は、通常アミノ基（−ＮＨ２）であるが、当該アミノ基は、ホルミル基、アセチル基等のＣ１−６アシル基等で化学修飾されていてもよい。その他、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したものや、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な官能基（例えば、ホルミル基、アセチル等）で化学修飾されているものや糖鎖の結合しているものもＯＳＭに含まれる。
【００１８】
発明者らは、更にＯＳＭによるインスリン抵抗性の改善効果を解明するために、肥満モデル動物の脂肪組織におけるＯＳＭ受容体のサブユニットの発現を調べたところ、有意に増加しており、該サブユニットは脂肪組織マクロファージに局在していることを見出した（図２参照）。また、ＯＳＭ受容体のサブユニット（ＯＳＭＲβ）を欠損させたノックアウトマウスを作成し、通常食又は高脂肪食を摂取させた後に、インスリン抵抗性を評価したところ、通常食、高脂肪食とも正常マウスに比べ、該サブユニットノックアウトマウスではインスリン抵抗性を有することを確認した（図６，１０参照）。
このことより、ＯＳＭ投与によるインスリン抵抗性の改善効果は、ＯＳＭ受容体を介して発揮されることが示唆された。
【００１９】
ここで、ＯＳＭ受容体は、いかなる動物由来のものであってもよく、例えば、ほ乳類由来のものを指し、好ましくは、ヒト、ラット、マウス、ウシ、ウマ、ヒツジ、ニワトリ、イヌ、ネコ等由来のものを指し、更に好ましくは、ヒト、マウス、ラット、ウシ、イヌ、ネコ由来のものを指し、最も好ましくは、ヒトＯＳＭ受容体を指す。ヒトＯＳＭ受容体には２種類のタイプが存在している。すなわち、ｇｐ１３０及びＬＩＦＲβからなる高親和性ＬＩＦ受容体と同一のもの（タイプＩ）とｇｐ１３０及びＯＳＭ特異的なサブユニット（ＯＳＭＲβ）からなるＯＳＭ特異的なもの（タイプＩＩ）である。ヒトＯＳＭ受容体としては、いずれのものであってもよく、好ましくは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるｇｐ１３０と、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＯＳＭＲβから構成されるヒトＯＳＭ受容体（タイプＩＩ）を指す。
【００２０】
ＯＳＭ受容体のサブユニットにリガンドが結合すると、該サブユニットは他のサブユニットと会合し、以下の経路で細胞内へシグナルを伝える；
ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路
ＯＳＭがＯＳＭ受容体に結合するとサブユニットの１つであるｇｐ１３０のチロシン残基に結合しているＪＡＫが活性化し、ｇｐ１３０のチロシンリン酸化を行う。このｇｐ１３０のリン酸化チロシン残基がＳＴＡＴのＳＨ２ドメインとの結合部位となる。転写因子であるＳＴＡＴはＳＨ２ドメインを介したホモあるいはヘテロの二量体を形成して活性化し、核内へ移行した後にＤＮＡ上の配列に結合することにより転写活性化を引き起こす。
ＭＡＰキナーゼ経路
ｇｐ１３０のチロシン残基にＳｈｐ２が結合するとアダプタータンパク質であるＧｒｂ２を介してＳｏｓ１を活性化させる。Ｓｏｓ１はＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応により細胞膜と結合している低分子Ｇタンパク質であるＲａｓを活性体に変換する。さらにＲａｓはＲａｆ−１を活性化し、Ｒａｆ−１はＭＥＫを、ＭＥＫはＥＲＫをというように、ＭＡＰキナーゼ経路に次々とシグナルを伝えていく。ＭＡＰキナーゼ経路の下流には転写因子であるＣＲＥＢが存在し、ＣＲＥＢはリン酸化されることで活性化され、ＤＮＡ上の特定配列に結合することにより遺伝子発現調節を行う。
【００２１】
「ＯＳＭ受容体アゴニスト」としては、前記ＯＳＭ受容体のいずれかの作用を活性化させる働きを有する物質が該当する。ここで、本明細書中における「アゴニスト」には、内在性のＯＳＭポリペプチドの生物学的活性（リガンドの結合により、上記ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路及び／又はＭＡＰキナーゼ経路を介した活性） を誘導する分子のいずれもが含まれる。
【００２２】
発明者らはマウスの腹腔浸出マクロファージ及びマウスマクロファージ由来の細胞株（ＲＡＷ２６４．７細胞）にＯＳＭ処理することにより、ＥＲＫ及びＣＲＥＢが活性化することを確認している（図９）。
【００２３】
インスリン抵抗性とは、上記した通り、血糖値を低下させる働きを有するホルモンであるインスリンの自己分泌が十分であるにもかかわらず、インスリンが十分効果を発揮せず、血糖値が下がりづらい特性のことである。そして、インスリン抵抗性が関連する疾患としては、メタボリック症候群、脂肪代謝異常、肥満症、高血糖、高インスリン血症、高中性脂肪血症、高尿酸血症、糖尿病、高血圧症、非アルコール性肝炎、痛風、尿路結石、骨粗鬆症、多嚢胞性卵巣症候群、又は脳梗塞、脳出血、脳血栓症、くも膜下出血、狭心症、心筋梗塞、深部静脈血栓症、閉塞性動脈硬化症等の動脈硬化性疾患等であり、好ましくは、メタボリック症候群、インスリン非依存性糖尿病、肥満症、更に好ましくは、インスリン非依存性糖尿病が該当する。
【００２４】
脂肪組織の炎症とは、脂肪組織にかけて，リンパ球やマクロファージ、好中球等の浸潤や細静脈における血管壁への白血球のローリング及び接着等の病理知見が認められる症状である。該症状においては、免疫を活性化するＭ１マクロファージの増加及び免疫抑制性のＭ２マクロファージの減少、それに伴い、ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ α（ＴＮＦα）やインターロイキン６（ＩＬ−６）に代表される炎症性アディポサイトカインの産生亢進及びインターロイキン１０（ＩＬ−１０），アディポネクチンのような抗炎症性アディポサイトカインの産生減少が知られている。脂肪組織の炎症が関連する疾患としては、メタボリック症候群、糖尿病、動脈硬化性疾患、脂肪代謝異常、肥満症、インスリン抵抗性、蜂窩織炎、又は結節性紅班、硬結性紅班、皮下脂肪肉芽腫症、深在 性エリテマトーデス、ウェーバー・クリスチャン病、ステロイド後脂肪織炎、寒冷脂肪織炎、外傷性脂肪織炎、注射後脂肪織炎等の脂肪組織炎等であり、好ましくは、メタボリック症候群、インスリン非依存性糖尿病、肥満症、更に好ましくは、肥満症が該当する。
【００２５】
発明者らは、ＯＳＭによる脂肪組織の炎症の改善効果を解明するために、肥満モデル動物の腹腔内にＯＳＭを投与したところ、該モデル動物脂肪組織中のＭ１マクロファージ数の減少及びＭ２マクロファージ数の増加とＴＮＦα含量の減少及びＩＬ−１０含量の増加が認められ、脂肪組織の炎症が顕著に改善した（図５参照）。
以上の点から、ＯＳＭは脂肪組織の炎症を改善する効果を有し、該症状に起因する疾患の治療又は予防のための医薬となりうることが示唆された。
さらに、ＯＳＭＲβを欠損させたノックアウトマウスに通常食又は高脂肪食を摂取させた後に、脂肪組織の炎症を示す指標を評価したところ、通常食、高脂肪食とも正常マウスに比べ、該サブユニットノックアウトマウスではより高いＭ１マクロファージ数／Ｍ２マクロファージ数の比率を示し（図７，１１参照）、ＴＮＦα含量の増加を確認した（図１２参照）。
このことより、ＯＳＭ投与による脂肪組織の炎症の改善効果は、ＯＳＭ受容体を介して発揮されることが示唆された。
【００２６】
そこで、本発明の第２の態様は、オンコスタチンＭ受容体に対するアゴニストを含んでなる、インスリン抵抗性に起因する疾患の治療又は予防のための医薬、あるいは、脂肪組織の炎症に起因する疾患の治療又は予防のための医薬である。
【００２７】
「治療」とは、疾患に罹患するおそれがあるか又は罹患したほ乳動物において、該疾患の病態の進行を阻止又は緩和することを意味し、治療的処置のみならず予防的処置をも含む広い意味として使用される。また、「疾患」には、インスリン抵抗性又は脂肪組織の炎症によって引き起こされる病態の全てが含まれ、例えば、メタボリック症候群、非インシュリン抵抗性糖尿病、肥満症などが含まれる。また、「予防」とは、疾患の発症を予め阻止することである。
ここで、治療又は予防の対象となるのはヒトのみならず「ほ乳動物」全般である。「ほ乳動物」とは、ほ乳類に分類される任意の動物を意味し、特に限定はしないが、例えば、ヒトの他、イヌ、ネコなどのペット動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマなどの家畜動物などのことである。特に好ましい「ほ乳動物」は、ヒトである。
【００２８】
本発明の医薬は、インスリン抵抗性及び／又は脂肪組織の炎症に起因する疾患の治療又は予防のための医薬であり、ＯＳＭ受容体アゴニストを有効成分として含有し、更に必要に応じてその他の成分を含有してなる。
ここで、前記ＯＳＭ受容体アゴニストとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知のＯＳＭ受容体アゴニスト（ＯＳＭ）を使用してもよいし、後述する本発明のスクリーニング方法により、ＯＳＭ受容体に対する結合能力及び／又は該受容体に対する活性作用を有すると評価された物質を使用してもよい。
【００２９】
前記医薬中の前記ＯＳＭ受容体アゴニストの含有量は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、また、前記医薬は前記ＯＳＭ受容体アゴニストそのものであってもよい。
【００３０】
前記その他の成分としては、特に制限はなく、本発明の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、医薬的に許容され得る担体などが挙げられる。前記担体としても、特に制限はなく、例えば、後述する前記医薬の剤型等に応じて適宜選択することができる。また、前記医薬中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３１】
前記医薬の剤型としては、特に制限はなく、例えば、所望の投与方法に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤（錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等）、経口液剤（内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等）、注射剤（溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤等）、坐剤、軟膏剤、貼付剤、ゲル剤、クリーム剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤などが挙げられる。
【００３２】
前記経口固形剤としては、例えば、前記ＯＳＭ受容体アゴニストに、賦形剤、更には必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
前記賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸などが挙げられる。前記結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。前記崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などが挙げられる。前記滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。前記着色剤としては、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
【００３３】
前記経口液剤としては、例えば、前記ＯＳＭ受容体アゴニストに、矯味・矯臭剤、緩衝剤、安定化剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチンなどが挙げられる。
【００３４】
前記注射剤としては、例えば、前記ＯＳＭ受容体アゴニストに、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下用、筋肉内用、静脈内用等の注射剤を製造することができる。
前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。前記等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。前記局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。
【００３５】
前記坐剤としては、例えば、前記ＯＳＭ受容体アゴニストに、ポリエチレングリコール、ラノリン、カカオ脂、脂肪酸トリグリセリド等の公知の坐剤製剤用担体と、必要に応じてツイーン（ＴＷＥＥＮ：登録商標）等の界面活性剤などを加えた後、常法により製造することができる。
【００３６】
前記軟膏剤としては、例えば、前記ＯＳＭ受容体アゴニストに、公知の基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤等を配合し、常法により混合し、製造することができる。
前記基剤としては、例えば、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィンなどが挙げられる。前記保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピルなどが挙げられる。
【００３７】
前記貼付剤としては、例えば、公知の支持体に前記軟膏剤としてのクリーム剤、ゲル剤、ペースト剤等を、常法により塗布し、製造することができる。前記支持体としては、例えば、綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布、軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタン等のフィルム、発泡体シートなどが挙げられる。
【００３８】
前記医薬の投与方法としては、特に制限はなく、前記医薬の剤型等に応じて適宜選択することができ、例えば、経口投与、注射による投与などが挙げられる。
また、前記医薬の投与量としては、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、性別、症状等に応じて適宜選択することができるが、当業者であれば、容易に最適化することが可能である。
注射投与の場合は、例えば、一日に患者の体重あたり約０．１μｇ／ｋｇから約５００ｍｇ／ｋｇを投与するのが好ましく、一般に一回又は複数回に分けて投与され得るであろう。好ましくは、投与量レベルは、一日に約０．１μｇ／ｋｇから約２５０ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは一日に約０．５〜約１００ｍｇ／ｋｇである。
経口投与の場合は、組成物は、好ましくは１．０から１０００ｍｇの活性成分を含む錠剤の形態で提供され、好ましくは活性成分が１．０，５．０，１０．０，１５．０，２０．０，２５．０，５０．０，７５．０，１００．０，１５０．０，２００．０，２５０．０，３００．０，４００．０，５００．０，６００．０，７５０．０，８００．０，９００．０及び１０００．０ｍｇである。化合物は一日に１〜４回の投与計画で、好ましくは一日に一回又は二回投与される。
【００３９】
さらに、前記医薬の投与時期についても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、対象疾患の発症前に予防的に投与されてもよいし、該疾患の発症後に治療的に投与されてもよい。前記医薬は、発症前の投与、及び発症後の投与のいずれにおいても、前記対象疾患に対して優れた効果を奏することができる。
【００４０】
前記医薬における医薬組成物又は製剤は、一定の投与量を保障すべく、均一単位投与量により構成されなくてはならない。単位投与量は、患者の治療に有効な一回の投与量を含み、薬剤的に受容可能な担体と共に製剤化された一単位のことである。前記医薬の単位投与量を決定する場合には、製剤化される化合物の物理的、化学的特徴、期待される治療上の効果、及び該化合物に特有な製剤化における留意事項等により影響を受ける。
【００４１】
さらに、本発明には、前記医薬における医薬組成物又は製剤を治療対象に投与することにより、インスリン抵抗性に起因する疾患、あるいは、脂肪組織の炎症に起因する疾患に罹患した、又は罹患する危険性のある哺乳動物の該疾患を予防又は治療する方法が含まれる。
治療の対象となる「哺乳動物」は、哺乳類に分類される任意の動物を意味し、特に限定はしないが、例えば、ヒトの他、マウス、ラットなどの実験動物、イヌ、ネコなどのペット動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマなどの家畜動物などのことである。特に好ましい「哺乳動物」は、ヒトである。
【００４２】
本発明のスクリーニング方法は、本発明の前記医薬をスクリーニングするための方法であり、例えば、ＯＳＭ受容体への結合を指標とする方法（第１のスクリーニング方法）、及び、ＯＳＭ受容体に対する活性作用を指標とする方法（第２のスクリーニング方法）が挙げられる。
【００４３】
＜第１のスクリーニング方法（結合を指標）＞
前記第１のスクリーニング方法としては、前記ＯＳＭ受容体への結合を指標とする方法であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、（ａ）被験物質のＯＳＭ受容体への結合能力を評価する工程、及び、（ｂ）前記工程（ａ）で前記ＯＳＭ受容体への結合能力を有すると評価された前記被験物質を選択する工程、を含む方法などが挙げられる。
なお、前記被験物質としては、特に制限はなく、例えば、前記医薬の候補物質の中から、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４４】
−（ａ）評価工程−
前記評価工程における、前記被験物質の前記ＯＳＭ受容体への結合能力の評価方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＯＳＭ受容体タンパク質を発現させた細胞株と前記被験物質との結合アッセイによる方法などが挙げられる。
なお、例えば、ＯＳＭ受容体の発現に関してのみ相違のある２種類の細胞株への前記被験物質の結合の程度に差があるという結果が得られた場合、前記被験物質は、前記ＯＳＭ受容体に対して結合能力を有していると評価することができる。
−（ｂ）選択工程−
前記選択工程では、前記工程（ａ）で前記ＯＳＭ受容体への結合能力を有すると評価された前記被験物質を選択する。
【００４５】
＜第２のスクリーニング方法（活性作用を指標）＞
前記第２のスクリーニング方法としては、前記ＯＳＭ受容体に対する活性作用を指標とする方法であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、（ａ’）被験物質のＯＳＭ受容体に対する活性作用を評価する工程、及び（ｂ’）前記工程（ａ’）で前記ＯＳＭ受容体に対する活性作用を有すると評価された前記被験物質を選択する工程、を含む方法などが挙げられる。
【００４６】
−（ａ’）評価工程−
前記評価工程における、前記被験物質の前記ＯＳＭ受容体に対する活性作用を評価する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記被験物質存在下での、細胞内ＥＲＫ活性化量、細胞内ＣＲＥＢ活性化量等の変化を調べる方法などが挙げられる。前記各種変化は、例えば、従来公知の手法を用いて調べることができる。
なお、例えば、前記被験物質存在下では、前記被験物質非存在下と比較して、細胞内ＥＲＫ活性化量が増加し、及び／又は細胞内ＣＲＥＢ活性化量が増加するという結果が得られた場合、前記被験物質は、前記ＯＳＭ受容体に対する活性作用を有していると評価することができる。
−（ｂ’）選択工程−
前記選択工程では、前記工程（ａ’）で前記ＯＳＭ受容体に対する活性作用を有すると評価された前記被験物質を選択する。
【００４７】
前記スクリーニング方法としては、前記第１のスクリーニング及び前記第２のスクリーニングのいずれかのみを行ってもよいし、両者を行ってもよいが、効率的に前記医薬を選択することができる点で、両者を行うことが好ましい。この場合、前記第１のスクリーニング及び前記第２のスクリーニングをこの順に行うことにより、より効率的に前記医薬を選択することができる。
【００４８】
以下に実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００４９】
１．材料及び方法について
１−１．動物
オスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（８週齢）は、ＮiｈｏｎＳＬＣから購入した。オスのＣ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドのｌｅａｎ（正常）及びｏｂ／ｏｂマウス（８週齢）を準備した。ノックアウトマウス等については、既報に従って準備した（非特許文献１１）。
１−２．高脂肪食（ＨＦＤ）
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ＯＳＭＲβ＋／＋マウス、及びＯＳＭＲβ−／−マウスは、脂肪由来のカロリーを５６．７％含むＨＦＤ（High Fat Diet 32; CLEA Japan, Tokyo, Japan）で飼育した。
【００５０】
１−３．ＳＶＦ（stromal vascular fraction）の調製
マウス由来の脂肪組織の切片をタイプ２コラゲナーゼ（２％ＦＣＳを含むＰＢＳ中）中にて、３７℃、２０分間高速で混合し、処理を行った。処理後のサンプルは、１００μｍのメッシュを通過させ、室温にて、５分間遠心（１２００ｒｐｍ）を行い分画した。アディポサイト画分として浮遊細胞を回収し、沈殿はＳＶＦとして回収した。
１−４．ＰＥＭｓ（peritoneal exudate macrophages）の調製
ＰＥＭｓの調製は、既報に従って行った。調製したＰＥＭｓは、ＯＳＭ及びＩＬ−４処理に先立ち、０．７５％ＢＳＡを含むＤＭＥＭ中において、１６時間飢餓状態においた。その後、ＰＥＭをＰＢＳ、２５ｎg／ml ＩＬ−４、又は、１００ｎｇ／ｍｌ 組換えマウスＯＳＭで処理し、適当な時間維持した。
【００５１】
２．結果
２−１．肥満マウスの脂肪組織中のＯＳＭの発現
肥満モデルマウスの脂肪組織中のＯＳＭの発現量を調べるために、ＨＦＤを与えた肥満マウスと遺伝的な肥満マウスであるｏｂ／ｏｂマウス（ｏｂ遺伝子を欠損しているマウス）の２種類のモデルマウスを使用した。ＯＳＭタンパク質に対応する２３ｋＤａのバンドは、ＮＤを与えたマウス及び野生型のｏｂ遺伝子を有するlean（正常）マウスのいずれの脂肪組織中においても検出された（図１Ａ）。ＮＤを与えたマウス及びlean（正常）マウスに比べて、ＨＦＤを与えたマウス及びｏｂ／ｏｂマウスの脂肪組織中において、ＯＳＭタンパク質の顕著な増加が認められた（図１Ｂ）。脂肪組織中のＯＳＭの局在を調べるため、脂肪組織をアディポサイト画分とＳＶＦ（stromal vascular fraction）画分に分けて検討したところ、ＮＤを与えたマウスとlean（正常）マウスでは、いずれの画分においても、若干量の存在が認められた（図１Ａ、Ｃ及びＤ）。これに対し、ＨＦＤを与えたマウスとｏｂ／ｏｂマウスのアディポサイト画分ではＯＳＭの顕著な増加が認められ（図１Ｃ）、また、ＳＶＦ画分では中程度の増加が認められた（図１Ｄ）。ＨＦＤを与えたマウスとｏｂ／ｏｂマウスでは、免疫蛍光染色の結果から、ｃａｖｅｏｌｉｎ−１とＦ４／８０がＯＳＭと局在を一にすることが明かとなった（図１Ｅ−Ｌ）。
【００５２】
２−２．肥満マウスの脂肪組織中のＯＳＭＲβの発現
肥満マウスの脂肪組織中におけるＯＳＭＲβの発現を調べた。ＯＳＭＲβタンパク質に対応する１８０ｋＤａのバンドがＮＤ及びlean（正常）マウスの脂肪組織中に認められた（図２Ａ）。脂肪組織中におけるＯＳＭＲβの発現は、ＮＤを与えたマウス及びlean（正常）マウスに比べてＨＦＤを与えたマウス及びｏｂ／ｏｂマウスの方が増大していた（図２Ｂ）。また、ＨＦＤを与えたマウス及びｏｂ／ｏｂマウスのＳＶＦにＯＳＭＲβの局在が認められたが（図２Ｃ）、アディポサイト画分には認められなかった（図２Ａ）。ＨＦＤを与えたマウス及びｏｂ／ｏｂマウスにおける、ＯＳＭＲβの脂肪組織における局在は、Ｆ４／８０と一致しており（図２Ｄ−Ｋ）、ＯＳＭＲβは主として肥満マウスのＡＴＭｓ（adipose tissue macrophages）において発現していることが示された。
【００５３】
２−３．ｏｂ／ｏｂマウスのメタボリックパラメーターに対するＯＳＭの影響
肥満マウスの代謝系疾患に対するＯＳＭの影響を検討するために、１日に２回、一週間ｏｂ／ｏｂマウスの腹腔内にＯＳＭを投与した。ＰＢＳを投与したコントロールのｏｂ／ｏｂマウスに比較して、ＯＳＭを投与したｏｂ／ｏｂマウスにおいては、摂食量が減少したが（図３Ｂ）、体重及び組織重量の差は無かった（図３Ａ及びＤ）。ＰＢＳを投与したｏｂ／ｏｂマウスとＯＳＭを投与したｏｂ／ｏｂマウスに間で、アディポサイトのサイズ及び数の差は生じていなかった（図３Ｅ及びＦ）。これに対し、ＰＢＳを投与したｏｂ／ｏｂマウスにおいてみられた重度の脂肪肝は、ＯＳＭを投与したｏｂ／ｏｂマウスにおいては改善していた（図３Ｃ、Ｇ及びＨ）。さらに、ＰＢＳを投与したｏｂ／ｏｂマウスにおいてみられる高血糖と高インスリン血症は、ＯＳＭを投与したｏｂ／ｏｂマウスにおいては顕著に改善していた（図４Ａ及びＢ）。
【００５４】
２−４．ｏｂ／ｏｂマウスの脂肪組織炎症に対するＯＳＭの影響
ＡＴＭｓの表現型に対するＯＳＭの影響を検討するために、Ｍ１マーカーとしてｉＮＯＳを、また、Ｍ２マーカーとしてＣＤ２０６及びＣＤ１６３を使用した。ｉＮＯＳの発現は、ＰＢＳを投与したｏｂ／ｏｂマウスに比較して、ＯＳＭを投与したｏｂ／ｏｂマウスの脂肪組織において減少していた（図５Ａ及びＢ）。これに対し、ＣＤ２０６及びＣＤ１６３の発現は、ＯＳＭを投与したｏｂ／ｏｂマウスの脂肪組織中において増加していた（図５Ａ及びＢ）。これらの結果から、ＯＳＭがマクロファージのＭ２型への分化傾向を促進していることが示唆された。
Ｍ１マクロファージは、ＴＮＦ−α及びＩＬ−６を含む炎症性サイトカインを産生することが知られている。ＴＮＦ−αの発現は、ＰＢＳを投与したｏｂ／ｏｂマウスの脂肪組織と比較して、ＯＳＭを投与したｏｂ／ｏｂマウスの脂肪組織において減少していた（図５Ｃ）。しかしながら、ＩＬ−６の発現量は、ＰＢＳを投与したｏｂ／ｏｂマウスとＯＳＭを投与したｏｂ／ｏｂマウスの間で有意差は認められなかった（図５Ｄ）。Ｍ１マクロファージとは異なり、Ｍ２マクロファージは抗炎症性サイトカインであるＩＬ−１０を産生するが、ＩＬ−１０の発現は、ｏｂ／ｏｂマウスの脂肪組織において、ＯＳＭにより増強された（図５Ｅ）。血清中のアディポネクチンのレベルは、ＰＢＳ投与ｏｂ／ｏｂマウスとＯＳＭ投与ｏｂ／ｏｂマウスとの間で差は認められなかった（図５Ｆ）。
【００５５】
２−５．ＮＤを与えたＯＳＭＲβ−／−マウスの解析
ＯＳＭとメタボリック症候群との関連性をさらに検討するために、ＮＤを与えたＯＳＭＲβ−／−マウスを用いて解析を行った。ＮＤを与えたＯＳＭＲβ＋／＋マウスとＯＳＭＲβ−／−マウスとの間において、１６週齢に至るまでの間、体重及び組織重量における有意差は認められなかった（図６Ａ及びＣ）また、摂食量の差も認められなかった（図６Ｂ）。
【００５６】
２−６．ＮＤを与えたＯＳＭＲβ−／−マウスにおけるグルコース代謝
ＮＤを与えたＯＳＭＲβ＋／＋マウスとＯＳＭＲβ−／−マウスのグルコース代謝を調べるために、８週間にわたり週に１度血中グルコースと血清中のインスリンレベルを測定した。ＯＳＭＲβ＋／＋マウスとＯＳＭＲβ−／−マウスにおいて、血中グルコースレベルに有意差は認められなかったが（図６Ｄ）、血清中のインスリンレベルは、ＯＳＭＲβ−／−マウスの方が高かった（図６Ｅ）。次に、グルコース耐性とインスリン抵抗性について、調べた。グルコースを腹腔内に投与した後、ＯＳＭＲβ−／−マウスの血中グルコースレベルは、ＯＳＭＲβ＋／＋マウスよりも高かった（図６Ｆ）。さらに、ＮＤを与えた状態において、インスリンを腹腔内に投与すると、ＯＳＭＲβ−／−マウスの血中グルコースレベルは、ＯＳＭＲβ＋／＋マウスよりも高かった（図６Ｇ）。これらの結果より、ＯＳＭＲβ−／−マウスは、ＮＤを与えた状態では、インスリン抵抗性を示すことが示唆された。
【００５７】
２−７．ＮＤを与えたＯＳＭＲβ−／−マウスの脂肪組織炎症
ＯＳＭＲβ−／−マウスの脂肪組織中のマクロファージの表現型を検討するために、Ｍ１及びＭ２マクロファージの発現型マーカーをウエスタンブロッティングで調べた。ＯＳＭＲβ−／−マウスの脂肪組織中のｉＮＯＳの発現量は、ＯＳＭＲβ＋／＋マウスの発現量より増加していた（図７Ａ及びＢ）。これに対し、ＣＤ２０６及びＣＤ６３は、ＯＳＭＲβ−／−マウスにおいて減少していた（図７Ａ及びＢ）。次に、ＯＳＭＲβ−／−マウスのＡＴＭｓの表現型についてフローサイトメトリを用いて解析した。Ｆ４／８０陽性マクロファージの数は、ＯＳＭＲβ＋／＋マウスと比較して、ＮＤを与えたＯＳＭＲβ−／−マウスの脂肪組織において増加していた（図７Ｃ−Ｆ）。ＮＤを与えたＯＳＭＲβ−／−マウスの全ＡＴＭｓ中のＣＤ１１ｃ陽性Ｍ１マクロファージの割合は、ＯＳＭＲβ＋／＋マウスよりも高かったが（図７Ｇ）、ＣＤ２０６陽性Ｍ２マクロファージの割合は、ＯＳＭＲβ＋／＋マウスよりも低かった（図７Ｈ）。これらの変動により、ＮＤを与えたＯＳＭＲβ−／−マウスにおいては、Ｍ２ＡＴＭｓに対するＭ１の割合は、ＯＳＭＲβ＋／＋マウスに比べて増大した（図７Ｉ）。
ＯＳＭＲβ−／−マウスの脂肪組織の炎症について検討するために、炎症性サイトカインであるＴＮＦ−α及びＩＬ−６の発現量について調べた。ＴＮＦ−αの発現は、ＯＳＭＲβ＋／＋マウスと比較すると、ＮＤを与えたＯＳＭＲβ−／−マウスの脂肪組織において増大していた（図８Ａ）。これに対し、ＩＬ−６の発現量は、ＯＳＭＲβ＋／＋マウスとＯＳＭＲβ−／−マウスとの間で差は認められなかった（図８Ｂ）。抗炎症性サイトカインであるＩＬ−１０については、ＮＤを与えた状態において、ＯＳＭＲβ−／−マウスの脂肪組織中での発現が低かった（図８Ｃ）。血清中のアディポネクチンのレベルは、ＯＳＭＲβ＋／＋マウスとＯＳＭＲβ−／−マウスとの間で差は認められなかった（図８Ｄ）。
【００５８】
２−８．マクロファージにおけるＯＳＭの役割
ＯＳＭのマクロファージに対する直接的な影響を検討するために、マウスの腹腔内滲出マクロファージ（ＰＥＭｓ；peritoneal exudate macrophages）及びＲＡＷ２６４．７細胞を使用した。図９Ａに示すように、ＯＳＭはｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質（CREB）とSTAT3を活性化した。また、ＯＳＭＲβ＋／＋マウス由来のＰＥＭｓにおいてＩＬ−４がＩＬ−１０の発現を誘導した（図９Ｂ）。しかしながら、ＯＳＭＲβ−／−マウス由来のＰＥＭｓにおけるＩＬ−４によるＩＬ−１０の発現の増加は、ＯＳＭＲβ＋／＋マウス由来のＰＥＭｓと比べると、弱くなっていた（図９Ｂ）。ＩＬ−４の効果と同様に、ＯＳＭＲβ＋／＋マウス由来のＰＥＭｓにおいては、ＩＬ−１０の発現は、ＯＳＭ処理１時間後から認められ、２時間後にピークを迎え、４時間後まで高いレベルが維持されていた（図９Ｂ）。他方、ＯＳＭＲβ−／−マウス由来のＰＥＭｓ中のＩＬ−１０の発現については、ＯＳＭの効果は認められなかった（図９Ｂ）。これらの結果は、ＯＳＭは、ＰＥＭｓ中のＩＬ−１０の発現を直接誘導することを示す。さらに、ＯＳＭは、ＯＳＭＲβ＋／＋マウス由来のＰＥＭｓ中で、Ｍ２マーカー（アルギナーゼ１及びＣＤ２０６）の発現を誘導するが、ＩＬ−４と同様に、ＯＳＭＲβ−／−マウス由来のＰＥＭｓ中では誘導しなかった（図９Ｃ及びＤ）。ｉＮＯＳの発現は、ＯＳＭ及びＩＬ−４いずれの処理によっても観察されなかった（図９Ｃ）。
【００５９】
２−９．ＨＦＤを与えたＯＳＭＲβ−／−マウスにおけるグルコース代謝
図１０Ａは、ＯＳＭＲβ−／−マウスの血中グルコースレベルがＨＦＤを与えてから６週間後に増加し始めたことを示す。ＯＳＭＲβ−／−マウスの血清インスリンレベルは、ＨＦＤを与えてから１週間後に増加し始め、８週間増加し続けた（図１０Ｂ）。腹腔内へのグルコースの投与の後、ＨＦＤを与えたＯＳＭＲβ−／−マウスの血中グルコースレベルは、ＯＳＭＲβ＋／＋マウスのレベルよりも非常に高かった（図１０Ｃ）。さらに、ＨＦＤを与えた状態で腹腔内へインスリンを投与した後、ＯＳＭＲβ−／−マウスの血中グルコースレベルは、ＯＳＭＲβ＋／＋マウスのレベルよりも高かった（図１０Ｄ）。これらの結果は、ＯＳＭＲβ−／−マウスは、ＨＦＤを与えた状態において、重篤なインスリン抵抗性を示すことを示唆する。
【００６０】
２−１０．ＨＦＤを与えたＯＳＭＲβ−／−マウスの脂肪組織炎症
ＨＦＤを与えた場合、ｉＮＯＳの発現は、ＯＳＭＲβ＋／＋マウスと比較して、ＯＳＭＲβ−／−マウスの脂肪組織中において増加していた（図１１Ａ及びＢ）。これに対し、ＣＤ２０６及びＣＤ１６３は、ＯＳＭＲβ−／−マウスにおいて減少していた（図１１Ａ及びＢ）。Ｆ４／８０陽性マクロファージの数は、ＨＦＤを与えた状態において、ＯＳＭＲβ＋／＋マウスと比較して、ＯＳＭＲβ−／−マウスの脂肪組織中において増加していた（図１１Ｃ−Ｆ）。さらに、ＯＳＭＲβ−／−マウスのＣＤ１１ｃ陽性Ｍ１マクロファージ及びＣＤ２０６陽性Ｍ２マクロファージの％は、ＨＦＤを与えた状態において、ＯＳＭＲβ＋／＋マウスの割合よりも高かった（図１１Ｇ及びＨ）。さらに、Ｍ２ＡＴＭｓに対するＭ１ＡＴＭｓの割合は、ＯＳＭＲβ＋／＋マウスよりもＨＦＤを与えたＯＳＭＲβ−／−マウスにおいて増大していた（図１１Ｉ）
ＴＮＦ−αの発現は、ＯＳＭＲβ＋／＋マウスと比較して、ＯＳＭＲβ−／−マウスの脂肪組織中において増加した（図１２Ａ）。これに対し、ＩＬ−６の発現量は、ＯＳＭＲβ＋／＋マウスとＨＦＤを与えたＯＳＭＲβ−／−マウスとの間で有意な差は認められなかった（図１２Ｂ）。ＯＳＭＲβ＋／＋マウスとＯＳＭＲβ−／−マウスとの間で、血清アディポネクチンレベルも有意な差は認められなかった（図１２Ｃ）。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明は、インスリン抵抗性及び／又は脂肪組織の炎症に起因する疾患の治療又は予防の用途に適用することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メタボリック症候群に関連するインスリン抵抗性及び／又は脂肪組織の炎症に起因する疾患の治療又は予防のための医薬、及び該医薬のスクリーニング方法に関する。より詳細には、オンコスタチン受容体アゴニストを有効成分とすることを特徴とする医薬、及び該受容体に対する結合及び／又は活性作用を指標とすることを特徴とするスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現代社会において、メタボリック症候群の患者数の増加は著しく、その予防及び治療のために必要とされる社会的、経済的コストは莫大な金額に上り、医療分野における重大問題として、早期解決が望まれている。
【０００３】
メタボリック症候群は、内臓脂肪型肥満（内臓肥満・腹部肥満）に高血糖・高血圧・高脂血症のうち２つ以上を合併した状態として定義され、以前よりシンドロームＸ、死の四重奏、インスリン抵抗性症候群、マルチプルリスクファクター症候群、内臓脂肪症候群、等と呼称されてきた病態を統合整理した概念である。「肥満」、「高血糖」、「高血圧」、「高脂血症」は動脈硬化の危険因子であり、これらを発症している患者は心筋梗塞や脳梗塞を併発し易い。該症候群の主要な機序は、インスリン抵抗性(非特許文献１及び２)、腹部肥満（非特許文献３及び４）、炎症（非特許文献５及び６）等によると考えられている。よって、機序として想定されるこれらの症状を緩和することが、メタボリック症候群の治療及び予防に重要であると考えられている。
【０００４】
インスリン抵抗性とは、血糖値を低下させる働きを有するホルモンであるインスリンの自己分泌は十分であるにもかかわらず、インスリンが十分効果を発揮せず、血糖値が下がりづらい特性のことである。インスリン抵抗性の原因は、相対的なエネルギー過剰状態であるため、治療方法は低カロリー食と運動が中心である。インスリン抵抗性改善薬にはＰＰＡＲ−γ（ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体γ）作働薬等があるが、該改善薬には、心疾患のリスク亢進、浮腫の誘発等の副作用が知られており、治療薬として必ずしも十分ではない。
【０００５】
一般にメタボリック症候群の基盤病態として，全身の軽度の炎症反応が指摘されている（非特許文献７）。すなわち、肥満とインスリン抵抗性の間にＴＮＦαによって誘発される炎症が介在し、脂肪組織の炎症及びインスリン抵抗性を介して糖尿病や心臓血管病といったメタボリック症候群に至ることが提唱されている（非特許文献８）。また、肥満の早期よりＴリンパ球が内臓脂肪の炎症を調節し、該炎症を抑制すると、全身の代謝異常も改善することが知られており（非特許文献９）、このことから、脂肪組織の炎症抑制がメタボリック症候群の新しい治療薬の開発につながることが期待されているが、今のところ、このような機序を持つメタボリック症候群治療薬は存在しない。
【０００６】
以上より、インスリン抵抗性の抑制及び／又は脂肪組織の炎症抑制といった新たな作用機序を有するメタボリック症候群改善薬の開発が強く望まれている。
【０００７】
ところで、オンコスタチンＭは、分子量２６ｋＤａのサイトカイン（２２７アミノ酸）であり、インターロイキン６，インターロイキン１１，白血球抑制因子、毛様体神経栄養因子等からなるインターロイキン６のサブファミリーに属し、特に、構造的、機能的及び遺伝的に白血病抑制因子に類似している。機能としては、増殖制御、分化、遺伝子発現、細胞生存といった様々な現象に関与することが知られており、例えば、Ａ３７５メラノーマ等の細胞の成長に抑制的に働くが、正常繊維芽細胞、ＡＩＤＳに関連するカポシ肉腫細胞では成長を増大させる。該サイトカインは、炎症反応、造血、組織の再形成、発生等にも関与しており、特に炎症反応については、急性炎症反応の特徴である肝臓からのａｃｕｔｅ ｐｈａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＰＰ）の産生を誘導し、内皮細胞でのインターロイキン６産生を刺激する。インターロイキン６は、炎症反応を強く促進し、該サイトカイン欠損マウスではＡＰＰ産生の減少や、傷害を加えた肝臓の回復遅延等が認められたことより、オンコスタチンＭはインターロイキン６の産生を介して炎症反応に関与している可能性も考えられる。これに加えて、オンコスタチンＭは、ＲＡＳ／ＥＲＫ及びＳＴＡＴ５シグナル伝達系を介して脂肪形成を阻害することも報告されている（非特許文献１０）。このようにオンコスタチンＭは、メタボリック症候群発症の機序の可能性の１つとして考えられている脂肪組織や炎症への関係が示唆されているものの、具体的な関与を示す知見は何ら得られていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｒｅａｖｅｎ Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３７： １５９５−１６０７ １９８８
【非特許文献２】ＤｅＦｒｏｎｚｏ等 Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ １４： １７３−１９４ １９９１
【非特許文献３】Ｋａｐｌａｎ Ａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ １４９： １５１４−１５２０ １９８９
【非特許文献４】Ｌｅｍｉｅｕｘ等 Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０２： １７９−１８４ ２０００
【非特許文献５】Ｒｉｄｋｅｒ等 Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０９： ２８１８−２８２５ ２００４
【非特許文献６】Ｄａｎｄｏｎａ等 Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１１： １４４８−１４５４ ２００５
【非特許文献７】Ｄａｎｄｏｎａ等 Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ： ２５： ４−７ ２００４
【非特許文献８】Ｈｏｔａｍｉｓｌｉｇｉｌ等 Ｓｃｉｅｎｃｅ： ２５９：８７−９１ １９９３
【非特許文献９】Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ等 Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ： １５： ９１４−９２０ ２００９
【非特許文献１０】Ｍｉｙａｏｋａ等 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ： ２８１： ３７９１３−３７９２０ ２００６
【非特許文献１１】Ｔａｎａｋａ等 Ｂｌｏｏｄ： １０２： ３１５４−３１６２ ２００３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、上記事情に鑑み、オンコスタチンＭとメタボリック症候群に関係する諸症状（肥満及びインスリン抵抗性）との関連について、肥満モデル動物等を用いて鋭意研究を行った結果、オンコスタチンＭが肥満における脂肪組織の炎症及びインスリン抵抗性を改善することを見出し、該改善効果が、オンコスタチンＭ受容体を介した作用であることを明らかにした。
よって、本発明は、インスリン抵抗性及び／又は脂肪組織の炎症に起因する疾患の治療又は予防のための医薬、及び該医薬のスクリーニング方法の提供を目的とする。
さらに、上記医薬を用いたインスリン抵抗性及び／又は脂肪組織の炎症に起因する疾患の治療又は予防法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（６）に関する。
（１）オンコスタチンＭ受容体に対するアゴニストを含んでなる、インスリン抵抗性の改善薬。
（２）オンコスタチンＭ受容体に対するアゴニストを含んでなる、脂肪組織の抗炎症薬。
（３）前記オンコスタチンＭ受容体アゴニストが、以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるポリペプチドである（１）乃至（２）のいずれかに記載の医薬。
（ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、かつ、オンコスタチンＭ受容体への活性作用を有するポリペプチド
（４）前記オンコスタチンＭ受容体アゴニストが、以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるポリペプチドを有効成分とする（１）乃至（２）のいずれかに記載の医薬。
（ａ）配列番号４から７のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号４から７のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、かつ、オンコスタチンＭ受容体への活性作用を有するポリペプチド
（５）（１）乃至（４）のいずれかに記載の医薬のスクリーニング方法であって、オンコスタチンＭ受容体への結合を指標とすることを特徴とするスクリーニング方法。
（６）（１）乃至（４）のいずれかに記載の医薬のスクリーニング方法であって、オンコスタチンＭ受容体に対する活性作用を指標とすることを特徴とするスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係る医薬を用いることにより、インスリン抵抗性及び／又は脂肪組織の炎症に起因する疾患の治療又は予防が可能となる。
また、本発明に係るスクリーニング方法を用いることにより、インスリン抵抗性及び／又は脂肪組織の炎症に起因する疾患の治療又は予防のための医薬の開発を行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】肥満モデルマウスの脂肪組織におけるオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）の発現。Ａは、肥満モデルマウスの脂肪組織に存在するＯＳＭのウエスタンブロッティングによる解析結果である。Ｂ−Ｄは、各々、脂肪組織（Ｂ）、アディポサイト画分（Ｃ）及びＳＶＦ（間質血管細胞画分;stromal vascular fraction）（Ｄ）におけるタンパク質発現の定量分析の結果である。ＯＳＭのバンド強度は、チューブリンに対し標準化し、コントロール（白バー）に対する％で示した。データは、平均値±ＳＥＭ。＊Ｐ＜０．０５、スチューデント ｔテスト。Ｅ−Ｌは、肥満モデルマウスの脂肪組織を、ＯＳＭ、Ｆ４／８０及びｃａｖｅｏｌｉｎ−１で三重染色した図である。 通常食マウス及び正常マウスに比べ、高脂肪食マウス及び遺伝的肥満マウスｏｂ／ｏｂの脂肪組織において、ＯＳＭタンパクの有意な増加が確認された。
【図２】肥満モデルマウスの脂肪組織におけるＯＳＭ受容体サブユニット（ＯＳＭＲβ）の発現。Ａは、肥満モデルマウスの脂肪組織に存在するＯＳＭＲβのウエスタンブロッティングによる解析結果である。Ｂ及びＣは、各々、脂肪組織（Ｂ）及びＳＶＦ（間質血管細胞画分;stromal vascular fraction）（Ｃ）におけるタンパク質発現の定量分析の結果である。ＯＳＭＲβのバンド強度は、チューブリンに対し標準化し、コントロール（白バー）に対する％で示した。データは、平均値±ＳＥＭ、＊Ｐ＜０．０５。スチューデント ｔテスト。Ｄ−Ｋは、肥満モデルマウスの脂肪組織を、ＯＳＭＲβ、Ｆ４／８０及びｃａｖｅｏｌｉｎ−１で三重染色した図である。 通常食マウス及び正常マウスに比べ、高脂肪食マウス及び遺伝的肥満マウスｏｂ／ｏｂの脂肪組織において、ＯＳＭＲβの有意な増加が確認された。また、ＯＳＭＲβは主に脂肪組織マクロファージで発現していた。
【図３】肥満モデルマウスへのＯＳＭ投与による食餌量及び体重、脂肪組織重量および肝重量に対する効果。Ａは、ＰＢＳ又はＯＳＭを投与したｏｂ／ｏｂマウスの体重変化。Ｂは、ＰＢＳ又はＯＳＭを投与したｏｂ／ｏｂマウスの食餌量変化。Ｃは、ＰＢＳ又はＯＳＭを投与したｏｂ／ｏｂマウスの代表的な体内図。Ｄは、ＰＢＳ又はＯＳＭを投与したｏｂ／ｏｂマウスの組織重量変化。Ｅ−Hは、ＰＢＳ又はＯＳＭを投与したｏｂ／ｏｂマウスの脂肪組織（Ｅ及びＦ）及び肝臓組織（Ｇ及びＨ）切片の組織学的分析結果。 遺伝的肥満マウスｏｂ／ｏｂの腹腔内へのＯＳＭ投与により、該肥満マウスの食餌量は減少したが、体重、脂肪組織重量及び肝重量に変化は生じなかった。
【図４】肥満モデルマウスへのＯＳＭ投与による高血糖及び高インスリン血症に対する効果。Ａは、ＰＢＳ又はＯＳＭを投与したｏｂ／ｏｂマウスの血中のグルコースレベル。Ｂは、ＰＢＳ又はＯＳＭを投与したｏｂ／ｏｂマウスの血清中のインスリンレベル。Ｃは、ＰＢＳ又はＯＳＭを投与したｏｂ／ｏｂマウスの腹腔内ブドウ糖負荷試験（ｉｐＧＴＴ）。Ｄは、ＰＢＳ又はＯＳＭを投与したｏｂ／ｏｂマウスのインスリン負荷試験（ＩＴＴ）。データは、平均値±ＳＥＭ。＊Ｐ＜０．０５、スチューデント ｔテスト（Ａ及びＢ）。分散分析及び、多重比較検定（ボンフェローニテスト）（C及びD）。 遺伝的肥満マウスｏｂ／ｏｂの腹腔内へのＯＳＭ投与により、該肥満マウスでの高血糖及び高インスリン血症が改善した。
【図５】肥満モデルマウスへのＯＳＭ投与による脂肪組織炎症に対する効果。Ａは、ＰＢＳ又はＯＳＭを投与したｏｂ／ｏｂマウスの脂肪組織中のマクロファージの表現型のマーカーをウエスタンブロッティングで解析した結果である。Ｂは、ｉＮＯＳ、ＣＤ２０６及びＣＤ１６３タンパク質発現の定量的解析結果である。各タンパク質のバンド強度は、チューブリンに対し標準化し、ＰＢＳを投与したコントロール（白バー）に対する％で示した。Ｃ及びＤは、ＰＢＳ又はＯＳＭを投与したｏｂ／ｏｂマウスの脂肪組織中におけるＴＮＦ−α及びＩＬ−６の発現量を調べた結果である。ＴＮＦ−α及びＩＬ−６の濃度はＥＬＩＳＡにより測定した。Ｅは、ＰＢＳ又はＯＳＭを投与したｏｂ／ｏｂマウスの脂肪組織中におけるＩＬ−１０ ｍＲＮＡの発現量を定量的リアルタイムＰＣＲで定量した結果である。Ｆは、ＰＢＳ又はＯＳＭを投与したｏｂ／ｏｂマウスのアディポネクチンの血清レベルを測定した結果である。測定はＥＬＩＳＡにより行った。データは、平均値±ＳＥＭ。＊Ｐ＜０．０５、スチューデント ｔテスト。遺伝的肥満マウスｏｂ／ｏｂの腹腔内へのＯＳＭ投与により、該肥満マウスでの脂肪組織炎症が改善した。
【図６】ＯＳＭ受容体のサブユニット（ＯＳＭＲβ）を欠損させたノックアウトマウスの通常食摂取後におけるインスリン抵抗性の評価。Ａは、ＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウスにＮＤ（通常食）を与えた場合の体重変化。Ｂは、ＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウスの食餌量。Ｃは、ＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウスにＮＤを与えた場合の組織重量の変化。Ｄ−Ｇは、ＮＤを与えたＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウスのグルコース代謝を示す結果である。Ｄは、血中グルコースレベル、Ｅは、血清インスリンレベルを示す。また、ＦはｉｐＧＴＴを、ＧはＩＴＴの変動を示す。データは、平均値±ＳＥＭ、＊Ｐ＜０．０５、スチューデント ｔテスト（Ｂ及びＣ）。分散分析及び、多重比較検定（ボンフェローニテスト）（Ａ及びＤ−Ｇ）。 正常マウスに比べ、該サブユニットノックアウトマウスではインスリン抵抗性が生じていた。
【図７】ＯＳＭＲβを欠損させたノックアウトマウスの通常食摂取後における脂肪組織マクロファージのタイプ評価。 Ａは、ＮＤを与えたＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウスの脂肪組織中のマクロファージ表現型マーカー（ｉＮＯＳ、ＣＤ２０６及びＣＤ１６３）についてウエスタンブロッティングにより解析した結果である。Ｂは、ｉＮＯＳ、ＣＤ２０６及びＣＤ１６３の発現量を定量的に分析した結果である。各タンパク質のバンド強度は、チューブリンに対し標準化し、ＯＳＭＲβ−／−マウス（白バー）に対する％で示した。Ｃ及びＤは、ＮＤを与えたＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウスの脂肪組織について、Ｆ４／８０及びｃａｖｅｏｌｉｎ−１で二重染色した結果である。Ｅは、ＮＤを与えたＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウスのＳＶＦにおけるＦ４／８０陽性細胞の全細胞に対する比率を示す。Ｆは、ＮＤを与えたＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウスの精巣上体脂肪体中のＦ４／８０陽性細胞の総数を示す。Ｇは、ＮＤを与えたＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウスのＦ４／８０陽性細胞中のＣＤ１１ｃ陽性細胞の比率を示す。Ｈは、ＮＤを与えたＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウスのＦ４／８０陽性細胞中のＣＤ２０６陽性細胞の比率を示す。Ｉは、ＮＤを与えたＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウスのＦ４／８０陽性細胞中のＣＤ２０６陽性細胞に対するＣＤ１１ｃ陽性細胞の割合を示す。データは、平均値±ＳＥＭ。＊Ｐ＜０．０５、スチューデント ｔテスト。 正常マウスに比べ、該サブユニットノックアウトマウスではＭ１マクロファージ数／Ｍ２マクロファージ数が増加していた。
【図８】ＯＳＭＲβを欠損させたノックアウトマウスの通常食摂取後における脂肪組織内ＴＮＦ−α及びＩＬ−１０含量の評価。Ａ及びＢは、各々、ＮＤを与えたＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウス脂肪組織中のＴＮＦ−α（Ａ）及びＩＬ−６（Ｂ）の発現量を示す。Ｃは、ＮＤを与えたＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウスの脂肪組織中のＩＬ−１０ ｍＲＮＡ発現量を示す。Ｄは、ＮＤを与えたＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウスのアディポネクチンの血清レベルを示す。データは、平均値±ＳＥＭ。＊Ｐ＜０．０５、スチューデント ｔテスト。 正常マウスに比べ、該サブユニットノックアウトマウスではＴＮＦ−α含量が増加し、ＩＬ−１０が減少していた。
【図９】マウスの腹腔浸出マクロファージ（ＰＥＭ）及びマウスマクロファージ由来の細胞株（ＲＡＷ２６４．７細胞）へのＯＳＭ処理による反応。Ａは、ＰＥＭ中のｐＣＲＥＢ及びｐＥＲＫのウエスタンブロッティングによる解析結果である。Ｂは、ＰＥＭ中において、ＯＳＭ及びＩＬ−４により誘導されたＩＬ−１０ ｍＲＮＡ量を定量的リアルタイムＰＣＲで定量した結果である。Ｃは、全細胞抽出液に対し、抗ｉＮＯＳ抗体、抗アルギナーゼＩ抗体及び抗ＣＤ２０６抗体によりウエスタンブロッティングを行った結果である。Ｄは、アルギナーゼＩ及びＣＤ２０６のタンパク発現を定量的に解析した結果である。各タンパク質のバンド強度は、チューブリンに対し標準化し、コントロール（白バー）に対する％で示した。データは、平均値±ＳＥＭ、＊Ｐ＜０．０５、分散分析及び、多重比較検定（ボンフェローニテスト）（Ｂ）スチューデント ｔテスト（Ｄ）。 ＯＳＭ処理を施すことにより、ＩＬ−１０、アルギナーゼＩ及びＣＤ２０６含量が増加した。
【図１０】ＯＳＭＲβを欠損させたノックアウトマウスの高脂肪食摂取後におけるインスリン抵抗性の評価。 ＨＦＤを与えたＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウスの血中グルコースレベル（Ａ）、血清インスリンレベル（Ｂ）、ｉｐＧＴＴ（Ｃ）及びＩＴＴ（Ｄ）を調べた。データは、平均値±ＳＥＭ。＊Ｐ＜０．０５、分散分析及び、多重比較検定（ボンフェローニテスト）。 正常マウスに比べ、該サブユニットノックアウトマウスではインスリン抵抗性が生じていた。
【図１１】ＯＳＭＲβを欠損させたノックアウトマウスの高脂肪食摂取後における脂肪組織マクロファージのタイプ評価。 Ａは、ＨＦＤを与えたＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウスの脂肪組織中のマクロファージ表現型マーカー（ｉＮＯＳ、ＣＤ２０６及びＣＤ１６３）についてウエスタンブロッティングにより解析した結果である。Ｂは、ｉＮＯＳ、ＣＤ２０６及びＣＤ１６３の発現量を定量的に分析した結果である。各タンパク質のバンド強度は、チューブリンに対し標準化し、ＯＳＭＲβ−／−マウス（白バー）に対する％で示した。Ｃ及びＤは、ＨＦＤを与えたＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウスの脂肪組織について、Ｆ４／８０及びｃａｖｅｏｌｉｎ−１で二重染色した結果である。Ｅは、ＨＦＤを与えたＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウスのＳＶＦにおけるＦ４／８０陽性細胞の全細胞に対する比率を示す。Ｆは、ＨＦＤを与えたＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウスの精巣上体脂肪体中のＦ４／８０陽性細胞の総数を示す。Ｇは、ＨＦＤを与えたＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウスのＦ４／８０陽性細胞中のＣＤ２０６陽性細胞の比率を示す。Ｈは、ＨＦＤを与えたＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウスのＦ４／８０陽性細胞中のＣＤ１１c陽性細胞の比率を示す。Ｉは、ＨＦＤを与えたＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウスのＦ４／８０陽性細胞中のＣＤ２０６陽性細胞に対するＣＤ１１ｃ陽性細胞の割合を示す。データは、平均値±ＳＥＭ。＊Ｐ＜０．０５、スチューデント ｔテスト。 正常マウスに比べ、該サブユニットノックアウトマウスではＭ１マクロファージ数／Ｍ２マクロファージ数が増加していた。
【図１２】ＯＳＭＲβを欠損させたノックアウトマウスの高脂肪食摂取後における脂肪組織内ＴＮＦ−α及びＩＬ−１０含量の評価。Ａ及びＢは、各々、ＨＦＤを与えたＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウス脂肪組織中のＴＮＦ−α（Ａ）及びＩＬ−６（Ｂ）の発現量を示す。Ｃは、ＨＦＤを与えたＯＳＭＲβ＋／＋及びＯＳＭＲβ−／−マウスのアディポネクチンの血清レベルを示す。データは、平均値±ＳＥＭ。＊Ｐ＜０．０５、スチューデント ｔテスト。正常マウスに比べ、該サブユニットノックアウトマウスではＴＮＦ−α含量が増加していた。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明者らは、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）とメタボリック症候群との関連性を検討するべく、肥満モデル動物の脂肪組織におけるオンコスタチンＭの発現を調べたところ、有意に増加しており、該ペプチドは脂肪細胞に局在していることを見出した（図１参照）。
さらに肥満モデル動物の腹腔内にＯＳＭを投与したところ、脂肪組織及び肝臓組織の重量及び体重には変化はなかったものの、モデル動物の高血糖及びインスリン抵抗性は顕著に改善した（図３，４参照）。
以上の点から、ＯＳＭはインスリン抵抗性を改善する効果を有し、インスリン抵抗性に起因する疾患の治療又は予防のための医薬となりうることが示唆された。
【００１４】
本発明の第１の態様は、オンコスタチンＭ受容体に対するアゴニストを含んでなるインスリン抵抗性改善薬、又は、脂肪組織の炎症抑制薬である。
ここで、本発明のＯＳＭは、いかなる動物由来のものであってもよく、例えば、ほ乳類由来のものをさし、好ましくは、ヒト、ラット、マウス、ウシ、ウマ、ヒツジ、ニワトリ、イヌ、ネコなど由来をさし、更に好ましくは、配列番号３、４、５、６、７でそれぞれ表されるアミノ酸配列からなるヒト、マウス、ラット、ウシ、イヌ由来をさし、最も好ましくは、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるヒトＯＳＭをさす。
【００１５】
また、本発明におけるＯＳＭポリペプチドは、配列番号３から７のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。ここで、「実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド」とは、配列番号３から７のいずれかで表わされるアミノ酸配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，最も好ましくは約９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつＯＳＭ受容体に対する結合及び／又は活性作用を指標とすることを特徴とするポリペプチドである。
【００１６】
あるいは、「配列番号３から７のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、かつ、オンコスタチンＭ受容体への活性作用を有するポリペプチド」とは、配列番号３から７のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、更に好ましくは１〜５個程度のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、かつ、オンコスタチンＭ受容体への活性作用を有するポリペプチドである。
上記アミノ酸の欠失、付加及び置換は、単離した天然ポリペプチドに存在していてもよく、また、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって新たに導入したものでもよい。例えば、特定のアミノ酸残基の置換は、市販のキット等を使用し、Ｇｕｐｐｅｄｄｕｐｌｅｘ法やＫｕｎｋｅｌ法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法により塩基の置換を行なうことによって達成することができる。
【００１７】
また、ＯＳＭのＣ末端は、通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）又はカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、当該カルボキシル基は、アミド（−ＣＯＮＨ２）やエステル（−ＣＯＯＲ）等に化学修飾されていてもよい。ここで、エステル中のＲとしては、Ｃ１−６アルキル基（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル）、Ｃ３−８シクロアルキル基（例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル）、Ｃ１−６アリール基（例えば、フェニル、α−ナフチル）、フェニル−Ｃ１−２アルキル基（例えば、ベンジル、フェネチル）、α−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基（例えば、α−ナフチルメチル）等が挙げられる。その他、経口用エステルとして汎用されているピバロイルオキシメチルエステルとすることも可能である。該ポリペプチドがＣ末端以外にもそのポリペプチド鎖中にカルボキシル基を有する場合には、当該カルボキシル基がアミド化又はエステル化されているものもＯＳＭに含まれる。この場合のエステルとしては上記の各エステルが挙げられる。同様に、ＯＳＭのＮ末端は、通常アミノ基（−ＮＨ２）であるが、当該アミノ基は、ホルミル基、アセチル基等のＣ１−６アシル基等で化学修飾されていてもよい。その他、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したものや、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な官能基（例えば、ホルミル基、アセチル等）で化学修飾されているものや糖鎖の結合しているものもＯＳＭに含まれる。
【００１８】
発明者らは、更にＯＳＭによるインスリン抵抗性の改善効果を解明するために、肥満モデル動物の脂肪組織におけるＯＳＭ受容体のサブユニットの発現を調べたところ、有意に増加しており、該サブユニットは脂肪組織マクロファージに局在していることを見出した（図２参照）。また、ＯＳＭ受容体のサブユニット（ＯＳＭＲβ）を欠損させたノックアウトマウスを作成し、通常食又は高脂肪食を摂取させた後に、インスリン抵抗性を評価したところ、通常食、高脂肪食とも正常マウスに比べ、該サブユニットノックアウトマウスではインスリン抵抗性を有することを確認した（図６，１０参照）。
このことより、ＯＳＭ投与によるインスリン抵抗性の改善効果は、ＯＳＭ受容体を介して発揮されることが示唆された。
【００１９】
ここで、ＯＳＭ受容体は、いかなる動物由来のものであってもよく、例えば、ほ乳類由来のものを指し、好ましくは、ヒト、ラット、マウス、ウシ、ウマ、ヒツジ、ニワトリ、イヌ、ネコ等由来のものを指し、更に好ましくは、ヒト、マウス、ラット、ウシ、イヌ、ネコ由来のものを指し、最も好ましくは、ヒトＯＳＭ受容体を指す。ヒトＯＳＭ受容体には２種類のタイプが存在している。すなわち、ｇｐ１３０及びＬＩＦＲβからなる高親和性ＬＩＦ受容体と同一のもの（タイプＩ）とｇｐ１３０及びＯＳＭ特異的なサブユニット（ＯＳＭＲβ）からなるＯＳＭ特異的なもの（タイプＩＩ）である。ヒトＯＳＭ受容体としては、いずれのものであってもよく、好ましくは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるｇｐ１３０と、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＯＳＭＲβから構成されるヒトＯＳＭ受容体（タイプＩＩ）を指す。
【００２０】
ＯＳＭ受容体のサブユニットにリガンドが結合すると、該サブユニットは他のサブユニットと会合し、以下の経路で細胞内へシグナルを伝える；
ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路
ＯＳＭがＯＳＭ受容体に結合するとサブユニットの１つであるｇｐ１３０のチロシン残基に結合しているＪＡＫが活性化し、ｇｐ１３０のチロシンリン酸化を行う。このｇｐ１３０のリン酸化チロシン残基がＳＴＡＴのＳＨ２ドメインとの結合部位となる。転写因子であるＳＴＡＴはＳＨ２ドメインを介したホモあるいはヘテロの二量体を形成して活性化し、核内へ移行した後にＤＮＡ上の配列に結合することにより転写活性化を引き起こす。
ＭＡＰキナーゼ経路
ｇｐ１３０のチロシン残基にＳｈｐ２が結合するとアダプタータンパク質であるＧｒｂ２を介してＳｏｓ１を活性化させる。Ｓｏｓ１はＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応により細胞膜と結合している低分子Ｇタンパク質であるＲａｓを活性体に変換する。さらにＲａｓはＲａｆ−１を活性化し、Ｒａｆ−１はＭＥＫを、ＭＥＫはＥＲＫをというように、ＭＡＰキナーゼ経路に次々とシグナルを伝えていく。ＭＡＰキナーゼ経路の下流には転写因子であるＣＲＥＢが存在し、ＣＲＥＢはリン酸化されることで活性化され、ＤＮＡ上の特定配列に結合することにより遺伝子発現調節を行う。
【００２１】
「ＯＳＭ受容体アゴニスト」としては、前記ＯＳＭ受容体のいずれかの作用を活性化させる働きを有する物質が該当する。ここで、本明細書中における「アゴニスト」には、内在性のＯＳＭポリペプチドの生物学的活性（リガンドの結合により、上記ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路及び／又はＭＡＰキナーゼ経路を介した活性） を誘導する分子のいずれもが含まれる。
【００２２】
発明者らはマウスの腹腔浸出マクロファージ及びマウスマクロファージ由来の細胞株（ＲＡＷ２６４．７細胞）にＯＳＭ処理することにより、ＥＲＫ及びＣＲＥＢが活性化することを確認している（図９）。
【００２３】
インスリン抵抗性とは、上記した通り、血糖値を低下させる働きを有するホルモンであるインスリンの自己分泌が十分であるにもかかわらず、インスリンが十分効果を発揮せず、血糖値が下がりづらい特性のことである。そして、インスリン抵抗性が関連する疾患としては、メタボリック症候群、脂肪代謝異常、肥満症、高血糖、高インスリン血症、高中性脂肪血症、高尿酸血症、糖尿病、高血圧症、非アルコール性肝炎、痛風、尿路結石、骨粗鬆症、多嚢胞性卵巣症候群、又は脳梗塞、脳出血、脳血栓症、くも膜下出血、狭心症、心筋梗塞、深部静脈血栓症、閉塞性動脈硬化症等の動脈硬化性疾患等であり、好ましくは、メタボリック症候群、インスリン非依存性糖尿病、肥満症、更に好ましくは、インスリン非依存性糖尿病が該当する。
【００２４】
脂肪組織の炎症とは、脂肪組織にかけて，リンパ球やマクロファージ、好中球等の浸潤や細静脈における血管壁への白血球のローリング及び接着等の病理知見が認められる症状である。該症状においては、免疫を活性化するＭ１マクロファージの増加及び免疫抑制性のＭ２マクロファージの減少、それに伴い、ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ α（ＴＮＦα）やインターロイキン６（ＩＬ−６）に代表される炎症性アディポサイトカインの産生亢進及びインターロイキン１０（ＩＬ−１０），アディポネクチンのような抗炎症性アディポサイトカインの産生減少が知られている。脂肪組織の炎症が関連する疾患としては、メタボリック症候群、糖尿病、動脈硬化性疾患、脂肪代謝異常、肥満症、インスリン抵抗性、蜂窩織炎、又は結節性紅班、硬結性紅班、皮下脂肪肉芽腫症、深在 性エリテマトーデス、ウェーバー・クリスチャン病、ステロイド後脂肪織炎、寒冷脂肪織炎、外傷性脂肪織炎、注射後脂肪織炎等の脂肪組織炎等であり、好ましくは、メタボリック症候群、インスリン非依存性糖尿病、肥満症、更に好ましくは、肥満症が該当する。
【００２５】
発明者らは、ＯＳＭによる脂肪組織の炎症の改善効果を解明するために、肥満モデル動物の腹腔内にＯＳＭを投与したところ、該モデル動物脂肪組織中のＭ１マクロファージ数の減少及びＭ２マクロファージ数の増加とＴＮＦα含量の減少及びＩＬ−１０含量の増加が認められ、脂肪組織の炎症が顕著に改善した（図５参照）。
以上の点から、ＯＳＭは脂肪組織の炎症を改善する効果を有し、該症状に起因する疾患の治療又は予防のための医薬となりうることが示唆された。
さらに、ＯＳＭＲβを欠損させたノックアウトマウスに通常食又は高脂肪食を摂取させた後に、脂肪組織の炎症を示す指標を評価したところ、通常食、高脂肪食とも正常マウスに比べ、該サブユニットノックアウトマウスではより高いＭ１マクロファージ数／Ｍ２マクロファージ数の比率を示し（図７，１１参照）、ＴＮＦα含量の増加を確認した（図１２参照）。
このことより、ＯＳＭ投与による脂肪組織の炎症の改善効果は、ＯＳＭ受容体を介して発揮されることが示唆された。
【００２６】
そこで、本発明の第２の態様は、オンコスタチンＭ受容体に対するアゴニストを含んでなる、インスリン抵抗性に起因する疾患の治療又は予防のための医薬、あるいは、脂肪組織の炎症に起因する疾患の治療又は予防のための医薬である。
【００２７】
「治療」とは、疾患に罹患するおそれがあるか又は罹患したほ乳動物において、該疾患の病態の進行を阻止又は緩和することを意味し、治療的処置のみならず予防的処置をも含む広い意味として使用される。また、「疾患」には、インスリン抵抗性又は脂肪組織の炎症によって引き起こされる病態の全てが含まれ、例えば、メタボリック症候群、非インシュリン抵抗性糖尿病、肥満症などが含まれる。また、「予防」とは、疾患の発症を予め阻止することである。
ここで、治療又は予防の対象となるのはヒトのみならず「ほ乳動物」全般である。「ほ乳動物」とは、ほ乳類に分類される任意の動物を意味し、特に限定はしないが、例えば、ヒトの他、イヌ、ネコなどのペット動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマなどの家畜動物などのことである。特に好ましい「ほ乳動物」は、ヒトである。
【００２８】
本発明の医薬は、インスリン抵抗性及び／又は脂肪組織の炎症に起因する疾患の治療又は予防のための医薬であり、ＯＳＭ受容体アゴニストを有効成分として含有し、更に必要に応じてその他の成分を含有してなる。
ここで、前記ＯＳＭ受容体アゴニストとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知のＯＳＭ受容体アゴニスト（ＯＳＭ）を使用してもよいし、後述する本発明のスクリーニング方法により、ＯＳＭ受容体に対する結合能力及び／又は該受容体に対する活性作用を有すると評価された物質を使用してもよい。
【００２９】
前記医薬中の前記ＯＳＭ受容体アゴニストの含有量は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、また、前記医薬は前記ＯＳＭ受容体アゴニストそのものであってもよい。
【００３０】
前記その他の成分としては、特に制限はなく、本発明の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、医薬的に許容され得る担体などが挙げられる。前記担体としても、特に制限はなく、例えば、後述する前記医薬の剤型等に応じて適宜選択することができる。また、前記医薬中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３１】
前記医薬の剤型としては、特に制限はなく、例えば、所望の投与方法に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤（錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等）、経口液剤（内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等）、注射剤（溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤等）、坐剤、軟膏剤、貼付剤、ゲル剤、クリーム剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤などが挙げられる。
【００３２】
前記経口固形剤としては、例えば、前記ＯＳＭ受容体アゴニストに、賦形剤、更には必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
前記賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸などが挙げられる。前記結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。前記崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などが挙げられる。前記滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。前記着色剤としては、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
【００３３】
前記経口液剤としては、例えば、前記ＯＳＭ受容体アゴニストに、矯味・矯臭剤、緩衝剤、安定化剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチンなどが挙げられる。
【００３４】
前記注射剤としては、例えば、前記ＯＳＭ受容体アゴニストに、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下用、筋肉内用、静脈内用等の注射剤を製造することができる。
前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。前記等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。前記局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。
【００３５】
前記坐剤としては、例えば、前記ＯＳＭ受容体アゴニストに、ポリエチレングリコール、ラノリン、カカオ脂、脂肪酸トリグリセリド等の公知の坐剤製剤用担体と、必要に応じてツイーン（ＴＷＥＥＮ：登録商標）等の界面活性剤などを加えた後、常法により製造することができる。
【００３６】
前記軟膏剤としては、例えば、前記ＯＳＭ受容体アゴニストに、公知の基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤等を配合し、常法により混合し、製造することができる。
前記基剤としては、例えば、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィンなどが挙げられる。前記保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピルなどが挙げられる。
【００３７】
前記貼付剤としては、例えば、公知の支持体に前記軟膏剤としてのクリーム剤、ゲル剤、ペースト剤等を、常法により塗布し、製造することができる。前記支持体としては、例えば、綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布、軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタン等のフィルム、発泡体シートなどが挙げられる。
【００３８】
前記医薬の投与方法としては、特に制限はなく、前記医薬の剤型等に応じて適宜選択することができ、例えば、経口投与、注射による投与などが挙げられる。
また、前記医薬の投与量としては、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、性別、症状等に応じて適宜選択することができるが、当業者であれば、容易に最適化することが可能である。
注射投与の場合は、例えば、一日に患者の体重あたり約０．１μｇ／ｋｇから約５００ｍｇ／ｋｇを投与するのが好ましく、一般に一回又は複数回に分けて投与され得るであろう。好ましくは、投与量レベルは、一日に約０．１μｇ／ｋｇから約２５０ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは一日に約０．５〜約１００ｍｇ／ｋｇである。
経口投与の場合は、組成物は、好ましくは１．０から１０００ｍｇの活性成分を含む錠剤の形態で提供され、好ましくは活性成分が１．０，５．０，１０．０，１５．０，２０．０，２５．０，５０．０，７５．０，１００．０，１５０．０，２００．０，２５０．０，３００．０，４００．０，５００．０，６００．０，７５０．０，８００．０，９００．０及び１０００．０ｍｇである。化合物は一日に１〜４回の投与計画で、好ましくは一日に一回又は二回投与される。
【００３９】
さらに、前記医薬の投与時期についても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、対象疾患の発症前に予防的に投与されてもよいし、該疾患の発症後に治療的に投与されてもよい。前記医薬は、発症前の投与、及び発症後の投与のいずれにおいても、前記対象疾患に対して優れた効果を奏することができる。
【００４０】
前記医薬における医薬組成物又は製剤は、一定の投与量を保障すべく、均一単位投与量により構成されなくてはならない。単位投与量は、患者の治療に有効な一回の投与量を含み、薬剤的に受容可能な担体と共に製剤化された一単位のことである。前記医薬の単位投与量を決定する場合には、製剤化される化合物の物理的、化学的特徴、期待される治療上の効果、及び該化合物に特有な製剤化における留意事項等により影響を受ける。
【００４１】
さらに、本発明には、前記医薬における医薬組成物又は製剤を治療対象に投与することにより、インスリン抵抗性に起因する疾患、あるいは、脂肪組織の炎症に起因する疾患に罹患した、又は罹患する危険性のある哺乳動物の該疾患を予防又は治療する方法が含まれる。
治療の対象となる「哺乳動物」は、哺乳類に分類される任意の動物を意味し、特に限定はしないが、例えば、ヒトの他、マウス、ラットなどの実験動物、イヌ、ネコなどのペット動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマなどの家畜動物などのことである。特に好ましい「哺乳動物」は、ヒトである。
【００４２】
本発明のスクリーニング方法は、本発明の前記医薬をスクリーニングするための方法であり、例えば、ＯＳＭ受容体への結合を指標とする方法（第１のスクリーニング方法）、及び、ＯＳＭ受容体に対する活性作用を指標とする方法（第２のスクリーニング方法）が挙げられる。
【００４３】
＜第１のスクリーニング方法（結合を指標）＞
前記第１のスクリーニング方法としては、前記ＯＳＭ受容体への結合を指標とする方法であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、（ａ）被験物質のＯＳＭ受容体への結合能力を評価する工程、及び、（ｂ）前記工程（ａ）で前記ＯＳＭ受容体への結合能力を有すると評価された前記被験物質を選択する工程、を含む方法などが挙げられる。
なお、前記被験物質としては、特に制限はなく、例えば、前記医薬の候補物質の中から、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４４】
−（ａ）評価工程−
前記評価工程における、前記被験物質の前記ＯＳＭ受容体への結合能力の評価方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＯＳＭ受容体タンパク質を発現させた細胞株と前記被験物質との結合アッセイによる方法などが挙げられる。
なお、例えば、ＯＳＭ受容体の発現に関してのみ相違のある２種類の細胞株への前記被験物質の結合の程度に差があるという結果が得られた場合、前記被験物質は、前記ＯＳＭ受容体に対して結合能力を有していると評価することができる。
−（ｂ）選択工程−
前記選択工程では、前記工程（ａ）で前記ＯＳＭ受容体への結合能力を有すると評価された前記被験物質を選択する。
【００４５】
＜第２のスクリーニング方法（活性作用を指標）＞
前記第２のスクリーニング方法としては、前記ＯＳＭ受容体に対する活性作用を指標とする方法であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、（ａ’）被験物質のＯＳＭ受容体に対する活性作用を評価する工程、及び（ｂ’）前記工程（ａ’）で前記ＯＳＭ受容体に対する活性作用を有すると評価された前記被験物質を選択する工程、を含む方法などが挙げられる。
【００４６】
−（ａ’）評価工程−
前記評価工程における、前記被験物質の前記ＯＳＭ受容体に対する活性作用を評価する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記被験物質存在下での、細胞内ＥＲＫ活性化量、細胞内ＣＲＥＢ活性化量等の変化を調べる方法などが挙げられる。前記各種変化は、例えば、従来公知の手法を用いて調べることができる。
なお、例えば、前記被験物質存在下では、前記被験物質非存在下と比較して、細胞内ＥＲＫ活性化量が増加し、及び／又は細胞内ＣＲＥＢ活性化量が増加するという結果が得られた場合、前記被験物質は、前記ＯＳＭ受容体に対する活性作用を有していると評価することができる。
−（ｂ’）選択工程−
前記選択工程では、前記工程（ａ’）で前記ＯＳＭ受容体に対する活性作用を有すると評価された前記被験物質を選択する。
【００４７】
前記スクリーニング方法としては、前記第１のスクリーニング及び前記第２のスクリーニングのいずれかのみを行ってもよいし、両者を行ってもよいが、効率的に前記医薬を選択することができる点で、両者を行うことが好ましい。この場合、前記第１のスクリーニング及び前記第２のスクリーニングをこの順に行うことにより、より効率的に前記医薬を選択することができる。
【００４８】
以下に実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００４９】
１．材料及び方法について
１−１．動物
オスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（８週齢）は、ＮiｈｏｎＳＬＣから購入した。オスのＣ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドのｌｅａｎ（正常）及びｏｂ／ｏｂマウス（８週齢）を準備した。ノックアウトマウス等については、既報に従って準備した（非特許文献１１）。
１−２．高脂肪食（ＨＦＤ）
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ＯＳＭＲβ＋／＋マウス、及びＯＳＭＲβ−／−マウスは、脂肪由来のカロリーを５６．７％含むＨＦＤ（High Fat Diet 32; CLEA Japan, Tokyo, Japan）で飼育した。
【００５０】
１−３．ＳＶＦ（stromal vascular fraction）の調製
マウス由来の脂肪組織の切片をタイプ２コラゲナーゼ（２％ＦＣＳを含むＰＢＳ中）中にて、３７℃、２０分間高速で混合し、処理を行った。処理後のサンプルは、１００μｍのメッシュを通過させ、室温にて、５分間遠心（１２００ｒｐｍ）を行い分画した。アディポサイト画分として浮遊細胞を回収し、沈殿はＳＶＦとして回収した。
１−４．ＰＥＭｓ（peritoneal exudate macrophages）の調製
ＰＥＭｓの調製は、既報に従って行った。調製したＰＥＭｓは、ＯＳＭ及びＩＬ−４処理に先立ち、０．７５％ＢＳＡを含むＤＭＥＭ中において、１６時間飢餓状態においた。その後、ＰＥＭをＰＢＳ、２５ｎg／ml ＩＬ−４、又は、１００ｎｇ／ｍｌ 組換えマウスＯＳＭで処理し、適当な時間維持した。
【００５１】
２．結果
２−１．肥満マウスの脂肪組織中のＯＳＭの発現
肥満モデルマウスの脂肪組織中のＯＳＭの発現量を調べるために、ＨＦＤを与えた肥満マウスと遺伝的な肥満マウスであるｏｂ／ｏｂマウス（ｏｂ遺伝子を欠損しているマウス）の２種類のモデルマウスを使用した。ＯＳＭタンパク質に対応する２３ｋＤａのバンドは、ＮＤを与えたマウス及び野生型のｏｂ遺伝子を有するlean（正常）マウスのいずれの脂肪組織中においても検出された（図１Ａ）。ＮＤを与えたマウス及びlean（正常）マウスに比べて、ＨＦＤを与えたマウス及びｏｂ／ｏｂマウスの脂肪組織中において、ＯＳＭタンパク質の顕著な増加が認められた（図１Ｂ）。脂肪組織中のＯＳＭの局在を調べるため、脂肪組織をアディポサイト画分とＳＶＦ（stromal vascular fraction）画分に分けて検討したところ、ＮＤを与えたマウスとlean（正常）マウスでは、いずれの画分においても、若干量の存在が認められた（図１Ａ、Ｃ及びＤ）。これに対し、ＨＦＤを与えたマウスとｏｂ／ｏｂマウスのアディポサイト画分ではＯＳＭの顕著な増加が認められ（図１Ｃ）、また、ＳＶＦ画分では中程度の増加が認められた（図１Ｄ）。ＨＦＤを与えたマウスとｏｂ／ｏｂマウスでは、免疫蛍光染色の結果から、ｃａｖｅｏｌｉｎ−１とＦ４／８０がＯＳＭと局在を一にすることが明かとなった（図１Ｅ−Ｌ）。
【００５２】
２−２．肥満マウスの脂肪組織中のＯＳＭＲβの発現
肥満マウスの脂肪組織中におけるＯＳＭＲβの発現を調べた。ＯＳＭＲβタンパク質に対応する１８０ｋＤａのバンドがＮＤ及びlean（正常）マウスの脂肪組織中に認められた（図２Ａ）。脂肪組織中におけるＯＳＭＲβの発現は、ＮＤを与えたマウス及びlean（正常）マウスに比べてＨＦＤを与えたマウス及びｏｂ／ｏｂマウスの方が増大していた（図２Ｂ）。また、ＨＦＤを与えたマウス及びｏｂ／ｏｂマウスのＳＶＦにＯＳＭＲβの局在が認められたが（図２Ｃ）、アディポサイト画分には認められなかった（図２Ａ）。ＨＦＤを与えたマウス及びｏｂ／ｏｂマウスにおける、ＯＳＭＲβの脂肪組織における局在は、Ｆ４／８０と一致しており（図２Ｄ−Ｋ）、ＯＳＭＲβは主として肥満マウスのＡＴＭｓ（adipose tissue macrophages）において発現していることが示された。
【００５３】
２−３．ｏｂ／ｏｂマウスのメタボリックパラメーターに対するＯＳＭの影響
肥満マウスの代謝系疾患に対するＯＳＭの影響を検討するために、１日に２回、一週間ｏｂ／ｏｂマウスの腹腔内にＯＳＭを投与した。ＰＢＳを投与したコントロールのｏｂ／ｏｂマウスに比較して、ＯＳＭを投与したｏｂ／ｏｂマウスにおいては、摂食量が減少したが（図３Ｂ）、体重及び組織重量の差は無かった（図３Ａ及びＤ）。ＰＢＳを投与したｏｂ／ｏｂマウスとＯＳＭを投与したｏｂ／ｏｂマウスに間で、アディポサイトのサイズ及び数の差は生じていなかった（図３Ｅ及びＦ）。これに対し、ＰＢＳを投与したｏｂ／ｏｂマウスにおいてみられた重度の脂肪肝は、ＯＳＭを投与したｏｂ／ｏｂマウスにおいては改善していた（図３Ｃ、Ｇ及びＨ）。さらに、ＰＢＳを投与したｏｂ／ｏｂマウスにおいてみられる高血糖と高インスリン血症は、ＯＳＭを投与したｏｂ／ｏｂマウスにおいては顕著に改善していた（図４Ａ及びＢ）。
【００５４】
２−４．ｏｂ／ｏｂマウスの脂肪組織炎症に対するＯＳＭの影響
ＡＴＭｓの表現型に対するＯＳＭの影響を検討するために、Ｍ１マーカーとしてｉＮＯＳを、また、Ｍ２マーカーとしてＣＤ２０６及びＣＤ１６３を使用した。ｉＮＯＳの発現は、ＰＢＳを投与したｏｂ／ｏｂマウスに比較して、ＯＳＭを投与したｏｂ／ｏｂマウスの脂肪組織において減少していた（図５Ａ及びＢ）。これに対し、ＣＤ２０６及びＣＤ１６３の発現は、ＯＳＭを投与したｏｂ／ｏｂマウスの脂肪組織中において増加していた（図５Ａ及びＢ）。これらの結果から、ＯＳＭがマクロファージのＭ２型への分化傾向を促進していることが示唆された。
Ｍ１マクロファージは、ＴＮＦ−α及びＩＬ−６を含む炎症性サイトカインを産生することが知られている。ＴＮＦ−αの発現は、ＰＢＳを投与したｏｂ／ｏｂマウスの脂肪組織と比較して、ＯＳＭを投与したｏｂ／ｏｂマウスの脂肪組織において減少していた（図５Ｃ）。しかしながら、ＩＬ−６の発現量は、ＰＢＳを投与したｏｂ／ｏｂマウスとＯＳＭを投与したｏｂ／ｏｂマウスの間で有意差は認められなかった（図５Ｄ）。Ｍ１マクロファージとは異なり、Ｍ２マクロファージは抗炎症性サイトカインであるＩＬ−１０を産生するが、ＩＬ−１０の発現は、ｏｂ／ｏｂマウスの脂肪組織において、ＯＳＭにより増強された（図５Ｅ）。血清中のアディポネクチンのレベルは、ＰＢＳ投与ｏｂ／ｏｂマウスとＯＳＭ投与ｏｂ／ｏｂマウスとの間で差は認められなかった（図５Ｆ）。
【００５５】
２−５．ＮＤを与えたＯＳＭＲβ−／−マウスの解析
ＯＳＭとメタボリック症候群との関連性をさらに検討するために、ＮＤを与えたＯＳＭＲβ−／−マウスを用いて解析を行った。ＮＤを与えたＯＳＭＲβ＋／＋マウスとＯＳＭＲβ−／−マウスとの間において、１６週齢に至るまでの間、体重及び組織重量における有意差は認められなかった（図６Ａ及びＣ）また、摂食量の差も認められなかった（図６Ｂ）。
【００５６】
２−６．ＮＤを与えたＯＳＭＲβ−／−マウスにおけるグルコース代謝
ＮＤを与えたＯＳＭＲβ＋／＋マウスとＯＳＭＲβ−／−マウスのグルコース代謝を調べるために、８週間にわたり週に１度血中グルコースと血清中のインスリンレベルを測定した。ＯＳＭＲβ＋／＋マウスとＯＳＭＲβ−／−マウスにおいて、血中グルコースレベルに有意差は認められなかったが（図６Ｄ）、血清中のインスリンレベルは、ＯＳＭＲβ−／−マウスの方が高かった（図６Ｅ）。次に、グルコース耐性とインスリン抵抗性について、調べた。グルコースを腹腔内に投与した後、ＯＳＭＲβ−／−マウスの血中グルコースレベルは、ＯＳＭＲβ＋／＋マウスよりも高かった（図６Ｆ）。さらに、ＮＤを与えた状態において、インスリンを腹腔内に投与すると、ＯＳＭＲβ−／−マウスの血中グルコースレベルは、ＯＳＭＲβ＋／＋マウスよりも高かった（図６Ｇ）。これらの結果より、ＯＳＭＲβ−／−マウスは、ＮＤを与えた状態では、インスリン抵抗性を示すことが示唆された。
【００５７】
２−７．ＮＤを与えたＯＳＭＲβ−／−マウスの脂肪組織炎症
ＯＳＭＲβ−／−マウスの脂肪組織中のマクロファージの表現型を検討するために、Ｍ１及びＭ２マクロファージの発現型マーカーをウエスタンブロッティングで調べた。ＯＳＭＲβ−／−マウスの脂肪組織中のｉＮＯＳの発現量は、ＯＳＭＲβ＋／＋マウスの発現量より増加していた（図７Ａ及びＢ）。これに対し、ＣＤ２０６及びＣＤ６３は、ＯＳＭＲβ−／−マウスにおいて減少していた（図７Ａ及びＢ）。次に、ＯＳＭＲβ−／−マウスのＡＴＭｓの表現型についてフローサイトメトリを用いて解析した。Ｆ４／８０陽性マクロファージの数は、ＯＳＭＲβ＋／＋マウスと比較して、ＮＤを与えたＯＳＭＲβ−／−マウスの脂肪組織において増加していた（図７Ｃ−Ｆ）。ＮＤを与えたＯＳＭＲβ−／−マウスの全ＡＴＭｓ中のＣＤ１１ｃ陽性Ｍ１マクロファージの割合は、ＯＳＭＲβ＋／＋マウスよりも高かったが（図７Ｇ）、ＣＤ２０６陽性Ｍ２マクロファージの割合は、ＯＳＭＲβ＋／＋マウスよりも低かった（図７Ｈ）。これらの変動により、ＮＤを与えたＯＳＭＲβ−／−マウスにおいては、Ｍ２ＡＴＭｓに対するＭ１の割合は、ＯＳＭＲβ＋／＋マウスに比べて増大した（図７Ｉ）。
ＯＳＭＲβ−／−マウスの脂肪組織の炎症について検討するために、炎症性サイトカインであるＴＮＦ−α及びＩＬ−６の発現量について調べた。ＴＮＦ−αの発現は、ＯＳＭＲβ＋／＋マウスと比較すると、ＮＤを与えたＯＳＭＲβ−／−マウスの脂肪組織において増大していた（図８Ａ）。これに対し、ＩＬ−６の発現量は、ＯＳＭＲβ＋／＋マウスとＯＳＭＲβ−／−マウスとの間で差は認められなかった（図８Ｂ）。抗炎症性サイトカインであるＩＬ−１０については、ＮＤを与えた状態において、ＯＳＭＲβ−／−マウスの脂肪組織中での発現が低かった（図８Ｃ）。血清中のアディポネクチンのレベルは、ＯＳＭＲβ＋／＋マウスとＯＳＭＲβ−／−マウスとの間で差は認められなかった（図８Ｄ）。
【００５８】
２−８．マクロファージにおけるＯＳＭの役割
ＯＳＭのマクロファージに対する直接的な影響を検討するために、マウスの腹腔内滲出マクロファージ（ＰＥＭｓ；peritoneal exudate macrophages）及びＲＡＷ２６４．７細胞を使用した。図９Ａに示すように、ＯＳＭはｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質（CREB）とSTAT3を活性化した。また、ＯＳＭＲβ＋／＋マウス由来のＰＥＭｓにおいてＩＬ−４がＩＬ−１０の発現を誘導した（図９Ｂ）。しかしながら、ＯＳＭＲβ−／−マウス由来のＰＥＭｓにおけるＩＬ−４によるＩＬ−１０の発現の増加は、ＯＳＭＲβ＋／＋マウス由来のＰＥＭｓと比べると、弱くなっていた（図９Ｂ）。ＩＬ−４の効果と同様に、ＯＳＭＲβ＋／＋マウス由来のＰＥＭｓにおいては、ＩＬ−１０の発現は、ＯＳＭ処理１時間後から認められ、２時間後にピークを迎え、４時間後まで高いレベルが維持されていた（図９Ｂ）。他方、ＯＳＭＲβ−／−マウス由来のＰＥＭｓ中のＩＬ−１０の発現については、ＯＳＭの効果は認められなかった（図９Ｂ）。これらの結果は、ＯＳＭは、ＰＥＭｓ中のＩＬ−１０の発現を直接誘導することを示す。さらに、ＯＳＭは、ＯＳＭＲβ＋／＋マウス由来のＰＥＭｓ中で、Ｍ２マーカー（アルギナーゼ１及びＣＤ２０６）の発現を誘導するが、ＩＬ−４と同様に、ＯＳＭＲβ−／−マウス由来のＰＥＭｓ中では誘導しなかった（図９Ｃ及びＤ）。ｉＮＯＳの発現は、ＯＳＭ及びＩＬ−４いずれの処理によっても観察されなかった（図９Ｃ）。
【００５９】
２−９．ＨＦＤを与えたＯＳＭＲβ−／−マウスにおけるグルコース代謝
図１０Ａは、ＯＳＭＲβ−／−マウスの血中グルコースレベルがＨＦＤを与えてから６週間後に増加し始めたことを示す。ＯＳＭＲβ−／−マウスの血清インスリンレベルは、ＨＦＤを与えてから１週間後に増加し始め、８週間増加し続けた（図１０Ｂ）。腹腔内へのグルコースの投与の後、ＨＦＤを与えたＯＳＭＲβ−／−マウスの血中グルコースレベルは、ＯＳＭＲβ＋／＋マウスのレベルよりも非常に高かった（図１０Ｃ）。さらに、ＨＦＤを与えた状態で腹腔内へインスリンを投与した後、ＯＳＭＲβ−／−マウスの血中グルコースレベルは、ＯＳＭＲβ＋／＋マウスのレベルよりも高かった（図１０Ｄ）。これらの結果は、ＯＳＭＲβ−／−マウスは、ＨＦＤを与えた状態において、重篤なインスリン抵抗性を示すことを示唆する。
【００６０】
２−１０．ＨＦＤを与えたＯＳＭＲβ−／−マウスの脂肪組織炎症
ＨＦＤを与えた場合、ｉＮＯＳの発現は、ＯＳＭＲβ＋／＋マウスと比較して、ＯＳＭＲβ−／−マウスの脂肪組織中において増加していた（図１１Ａ及びＢ）。これに対し、ＣＤ２０６及びＣＤ１６３は、ＯＳＭＲβ−／−マウスにおいて減少していた（図１１Ａ及びＢ）。Ｆ４／８０陽性マクロファージの数は、ＨＦＤを与えた状態において、ＯＳＭＲβ＋／＋マウスと比較して、ＯＳＭＲβ−／−マウスの脂肪組織中において増加していた（図１１Ｃ−Ｆ）。さらに、ＯＳＭＲβ−／−マウスのＣＤ１１ｃ陽性Ｍ１マクロファージ及びＣＤ２０６陽性Ｍ２マクロファージの％は、ＨＦＤを与えた状態において、ＯＳＭＲβ＋／＋マウスの割合よりも高かった（図１１Ｇ及びＨ）。さらに、Ｍ２ＡＴＭｓに対するＭ１ＡＴＭｓの割合は、ＯＳＭＲβ＋／＋マウスよりもＨＦＤを与えたＯＳＭＲβ−／−マウスにおいて増大していた（図１１Ｉ）
ＴＮＦ−αの発現は、ＯＳＭＲβ＋／＋マウスと比較して、ＯＳＭＲβ−／−マウスの脂肪組織中において増加した（図１２Ａ）。これに対し、ＩＬ−６の発現量は、ＯＳＭＲβ＋／＋マウスとＨＦＤを与えたＯＳＭＲβ−／−マウスとの間で有意な差は認められなかった（図１２Ｂ）。ＯＳＭＲβ＋／＋マウスとＯＳＭＲβ−／−マウスとの間で、血清アディポネクチンレベルも有意な差は認められなかった（図１２Ｃ）。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明は、インスリン抵抗性及び／又は脂肪組織の炎症に起因する疾患の治療又は予防の用途に適用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オンコスタチンＭ受容体に対するアゴニストを含んでなる、インスリン抵抗性の改善薬。
【請求項２】
オンコスタチンＭ受容体に対するアゴニストを含んでなる、脂肪組織の抗炎症薬。
【請求項３】
前記オンコスタチンＭ受容体アゴニストが、以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるポリペプチドである請求項１乃至２のいずれかに記載の医薬。
（ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、かつ、オンコスタチンＭ受容体への活性作用を有するポリペプチド
【請求項４】
前記オンコスタチンＭ受容体アゴニストが、以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるポリペプチドを有効成分とする請求項１乃至２のいずれかに記載の医薬。
（ａ）配列番号４から７のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号４から７のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、かつ、オンコスタチンＭ受容体への活性作用を有するポリペプチド
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれかに記載の医薬のスクリーニング方法であって、オンコスタチンＭ受容体への結合を指標とすることを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項６】
請求項１乃至４のいずれかに記載の医薬のスクリーニング方法であって、オンコスタチンＭ受容体に対する活性作用を指標とすることを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項１】
オンコスタチンＭ受容体に対するアゴニストを含んでなる、インスリン抵抗性の改善薬。
【請求項２】
オンコスタチンＭ受容体に対するアゴニストを含んでなる、脂肪組織の抗炎症薬。
【請求項３】
前記オンコスタチンＭ受容体アゴニストが、以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるポリペプチドである請求項１乃至２のいずれかに記載の医薬。
（ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、かつ、オンコスタチンＭ受容体への活性作用を有するポリペプチド
【請求項４】
前記オンコスタチンＭ受容体アゴニストが、以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるポリペプチドを有効成分とする請求項１乃至２のいずれかに記載の医薬。
（ａ）配列番号４から７のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号４から７のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、かつ、オンコスタチンＭ受容体への活性作用を有するポリペプチド
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれかに記載の医薬のスクリーニング方法であって、オンコスタチンＭ受容体への結合を指標とすることを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項６】
請求項１乃至４のいずれかに記載の医薬のスクリーニング方法であって、オンコスタチンＭ受容体に対する活性作用を指標とすることを特徴とするスクリーニング方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２０１３−６７５９３（Ｐ２０１３−６７５９３Ａ）
【公開日】平成２５年４月１８日（２０１３．４．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２０８３５４（Ｐ２０１１−２０８３５４）
【出願日】平成２３年９月２６日（２０１１．９．２６）
【出願人】（３０８０３８６１３）公立大学法人和歌山県立医科大学 (4)
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年４月１８日（２０１３．４．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年９月２６日（２０１１．９．２６）
【出願人】（３０８０３８６１３）公立大学法人和歌山県立医科大学 (4)
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
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