カテコールポリエチレングリコール誘導体と蛋白質またはペプチドの接合体、及びこれの製造方法
本発明はカテコールを持つポリエチレングリコール誘導体を利用して、蛋白質またはペプチドの特定部位であるＮ末端にポリエチレングリコール誘導体を単一接合させた蛋白質またはペプチドとカテコールポリエチレングリコール誘導体の接合体及びこれの製造方法に関する。本発明によると、カテコール−ＰＥＧ誘導体が蛋白質またはペプチドの特定部位であるＮ末端アミングループに位置特異的かつ単一分子で結合して、均一なポリエチレングリコール蛋白質、またはペプチド接合体を高い収率で収得することができる。収得された接合体は、従来技術に比べて、蛋白質自体の化学的変形がないまま、蛋白質活性度阻害を最小化できて、接合体の薬学的効果が優れ、その均質性によって製造工程を単純化でき、また生体内での生物学的薬効性が均一に予測され、加水分解に強く、生体内の持続時間が長くなるため、蛋白質薬物の体内薬効及び安全性を増進させる効果がある。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カテコールを持つポリエチレングリコール誘導体を利用して、蛋白質またはペプチドの特定部位のＮ末端にポリエチレングリコール誘導体を単一接合させた蛋白質またはペプチド−カテコールポリエチレングリコール誘導体の接合体及びこれの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内では、私たちの体の成長及び分化に係る多様な種類の蛋白質またはペプチドが発現するようになる。このような蛋白質またはペプチドは、細胞壁に存在する受容体と結合して、多様な信号伝達物質（signaling molecules）の発現を誘導することによって生体恒常性（homeostasis）を維持する役割を果たす。しかし、このような蛋白質またはペプチドの量が生体内に適正水準を維持できない場合、生体内の信号伝達物質の不足現象や過発現現象によって、生体恒常性に問題が生じて、種々の問題点が現れるようになる。例えば、ヒト成長に係る成長ホルモンや傷の治癒に係る上皮成長因子等の濃度が低い場合、背が伸びないか、傷が癒えないことがある。
【０００３】
１９６２年カンフィールド（R. Canfield）、１９８５年エチ（F. Esch）、１９６２年コーヘン（S. Cohen）、１９８５年メトカーフ（D. Metcalf）等は、アミノ酸で構成された蛋白質因子のリゾチーム（Lysozyme）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）等を発見し、さらに各々のアミノ酸配列を確認した（R. Canfield, J. Biol. Chem. 238, 2698., 1963; F. Esch, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6507., 1985; S. Cohen, J. Biol. Chem. 237, 1555., 1962; D. Metcalf, Science 229, 16, 1985）。
【０００４】
このような蛋白質因子は、傷治療（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ／ｂＦＧＦ／ＥＧＦ）、白血球形成（Ｇ−ＣＳＦ）に影響を及ぼすと知られており、糖尿病患者に発生しやすい足部潰瘍治療剤や抗癌剤治療後の好中球減少症（Neutropenia）治療剤として常用される。
【０００５】
しかし、このような蛋白質の場合、血液及び組織内でその体内半減期（half-life）が非常に短いと知られており、治療用として蛋白質を投与する場合、生体内の薬効持続性と安全性が非常に低下する問題がある。
【０００６】
このような問題を解決するために、最近１０年間生体適合性高分子であるポリエチレングリコール（polyethyleneglycol；ＰＥＧ）を蛋白質またはペプチド物質に接合させようとする試みが続けられてきた（G. Pasut & F. M. Veronese Prog. Polym. Sci.32, 933, 2007; F. M. Veronese, Biomaterials22, 405.2001; P. Bailon, Pharm. Sci. Tech. Today 1, 352, 1998）。
【０００７】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、生体内で免疫反応を起こさない生体適合性が優れた高分子として米国食品医薬品局（ＦＤＡ）が承認した合成高分子中の一つである。この合成高分子を利用して、蛋白質接合体を製造することによって、増加した分子量を持った蛋白質ポリエチレングリコール接合体を得ることができ、これにより、腎臓におけるろ過（filtration）効果による蛋白質の透過を抑制することができる。さらに、ポリエチレングリコールのステルス作用（stealth effect）を介して生体内の蛋白質酵素による分解を抑制する効果を示すことによって究極的に生体内での半減期及び安全性を増加させるようになる。このような方法で薬効を増進させた蛋白質は、ヒト成長ホルモン、エリスロポエチン、インターフェロン、インシュリン、インターロイキン、カルシトニン等、多くの種類がある。
【０００８】
しかし、蛋白質薬物の体内安全性及び持続性向上のためにポリエチレングリコールを使う際に、ポリエチレングリコールが蛋白質薬物が持っている複数の結合部位と反応することによって、結果的に生成される産物が不均一な多重接合体混合物（a mixture of multi-PEGylated species）になる問題点があった。特に、不均一な多重接合体混合物の場合、薬物の持続効果と安全性を測定し難い問題がある。
【０００９】
一方、条件を厳しくして、一分子のポリエチレングリコールが結合した（mono-PEGylated）接合体を製造するとしても、その結合部位に応じて薬物の生物学的または体内活性度が顕著に影響を受けるという問題がある。これを解決するために、多くの治療用蛋白質（therapeutic proteins，ＥＰＯ，Ｇ−ＣＳＦ，成長ホルモンなど）は、活性部位（active site）がＮ末端（N-terminal）の隣接部位に位置していないため、蛋白質またはペプチドのＮ末端にＰＥＧを結合させようとする試みがなされてきた。なぜなら、Ｎ末端ペグ化反応は、ペグ化反応の最も大きい短所である蛋白質活性化低下を最小化できる技術である。
【００１０】
従って、上のようなＮ末端位置特異的単一ペグ化を実現するために、多くの方法を使って蛋白質またはペプチドのＮ末端アミン基の一級アミン（primary amine）に位置特異的（site-specific）に、ポリエチレングリコールを単一体で（mono-PEG）接合させようとする試みがなされてきた。
【００１１】
従来、このような試みに利用されたポリエチレングリコールは、一級アミンに特異的に反応する物質であるＮ−ヒドロキシスクシンイミド（N-hydroxysuccinimide）またはＮ−スクシニミジルプロピオネート（succinimidyl propionate）が片方末端についているメトキシポリエチレングリコール誘導体であった（T. H. Kim, Biomaterials, 23, 2311, 2002; H. Lee, Pharm. Res., 19, 845, 2002）。スクシンイミドポリエチレングリコール誘導体を使って、製造されたモノ−ペグ化（mono-PEGylated）接合体の場合、体内活性も変化度が非常に低いと知られているが、蛋白質またはペプチドと接合する反応途中Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドまたはＮ−スクシンイミジルプロピオネートの加水分解（hydrolysis）が早く起きて、蛋白質またはペプチド接合体を作る工程上に困難があって、接合体を獲得する収率が低い問題があった。
【００１２】
また、位置特異的タンパク質変異（Site-specific protein mutation）（single mutation）を利用した他の試みで、９５％以上のシステインを蛋白質（ペプチド）薬物のＮ末端に導入して、ペグ化（PEGylation）を行う技術が試みられてきた。ただ、前記技術によると、蛋白質薬物を化学的に変形させることであったため、変形による薬物の生活性減少等付随的問題を抱えていた。
【００１３】
さらに、アルデヒドＰＥＧを利用したＮ末端特異的ペグ化も試みられた。これはＡｍｇｅｎ社のＮｅｕｌａｓｔａ（商標）の生産に適用された方法である。しかし、前記技術の場合、その工程において反応条件が必ず酸性条件でなければならないという制約があり（ｐＨ４〜６、通常ｐＨ５．０〜５．５）、必ず還元剤であるＮａＢＨ４を共に使わなければならないため、このような制限された反応条件による制限性が問題となってきた。
【００１４】
そこで本発明者等は、カテコールを持つ化合物が結合されたＰＥＧ誘導体を利用して、蛋白質またはペプチドと前記ＰＥＧ誘導体の接合体を製造する場合、工程が簡単で、結果が加水分解に強く、特に、蛋白質またはペプチドのＮ末端の一級アミンに位置特異的で単一ＰＥＧ（mono-PEGylated）接合された接合体を高い収率で生成する可能性があることを確認して本発明を完成した。
【発明の概要】
【００１５】
本発明の目的は、蛋白質またはペプチドの特定部位のＮ末端アミン基にポリエチレングリコール誘導体を単一接合させた蛋白質またはペプチドとポリエチレングリコール誘導体の接合体及びこれの製造方法を提供することにある。
【００１６】
前記目的を達成するために、本発明はカテコールを持つ化合物が結合されたポリエチレングリコール誘導体、前記誘導体が蛋白質またはペプチドの特定部位のＮ末端に単一接合されている（mono-PEGylated）、蛋白質またはペプチドと前記ポリエチレングリコール誘導体の接合体及びこれの製造方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】メトキシポリエチレングリコールと３，４−ジヒドロキシ桂皮酸の反応模式図である。
【図２】ヒンジ−３ペプチドのアミノ酸配列である。
【図３】ｍＰＥＧ−ＣＴ及びヒンジ−３を混合した結果のＲＰ−ＨＰＬの結果である。
【図４】ｍＰＥＧ−ＣＴ及びヒンジ−３を混合した結果のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの結果である。
【図５】ヒンジ−３に存在するペグ化候補（candidate）を示した模式図である。
【図６】ＰＥＧ−ヒンジ−３のトリプシン分解後、切片に対するＲＰ−ＨＰＬの結果グラフで、黒線１３分のピークは、Ｔ１切片、赤線１３分のピークは希釈不足の結果、２３．５分のピークはペグ化された切片を示す。
【図７】ＰＥＧ−ヒンジ−３のトリプシン分解後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの結果のグラフで、ｍＰＥＧ（ＭＷ：５０００）またはｍＰＥＧとＴ１切片が加えられた値（ＭＷ：５８８３）にピークが現れた。
【図８】カテコールグループとスクシンイミジルコハク酸の結合形態に対する模式図である。
【図９】スクシンイミジルコハク酸−ＰＥＧ−リゾチーム（３列）及びカテコール−ＰＥＧ−リゾチーム（４列）のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果で、単一結合されたカテコール−ＰＥＧ−リゾチームは、一つのバンドだけを示すことが見られる。
【図１０】スクシンイミジルコハク酸−ＰＥＧ−ｂＦＧＦ（２列）及びカテコール−ＰＥＧ−ｂＦＧＦ（３列）のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（１０Ａ）、ｂＦＧＦのトリプシン分解のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの結果（ＭＷ：２４９５、１０Ｂ）及びカテコール−ＰＥＧ−ｂＦＧＦのトリプシン分解のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの結果（ＭＷ：７４６８、１０Ｃ）である。
【図１１】スクシンイミジルコハク酸−ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ（２列）及びカテコール−ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ（３列）のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（１１Ａ）、Ｇ−ＣＳＦのトリプシン分解のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの結果（ＭＷ：１７９２、１１Ｂ）及びカテコール−ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦのトリプシン分解のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの結果（ＭＷ：６７９２、１１Ｃ）である。
【図１２】リゾチーム蛋白質ペグ化反応時、ｐＨ６．０で、カテコールに対して０、０．５、１、１．５、２：１の割合でＮａｌＯ４を添加した結果のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル写真である。
【図１３】リゾチーム蛋白質ペグ化反応時、ｐＨ６．０でカテコールに対して０、０．５、１、１．５、２：１の割合でＮａｌＯ４を添加した場合のペグ化収率の相手値を示したグラフである。
【図１４】ｍＰＥＧ−ＣＴとＥＰＯ反応の結果の混合物（２列、二つのバンド）及びＦＰＬＣシステムを利用した精製されたｍＰＥＧ−ＣＴ−ＥＰＯ（ＰＥＧ−ＥＰＯ、３列、一つのバンド）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果である。
【図１５】ＲＰ−ＨＰＬの結果のグラフで、黒線ピークはｍＰＥＧ−ＣＴ−ＥＰＯ（９８分）、ＥＰＯ混合物（１４０分）を意味し、赤線ピークは各単一ＰＥＧ（１０５分）、二重ＰＥＧ（９８分）、多重−ＰＥＧ（８５分）を意味する。
【図１６】単一ＰＥＧ−ＥＰＯ、多重−ＰＥＧ−ＥＰＯ、ＥＰＯの生体内の半減期を示したグラフである。
【図１７】単一ＰＥＧ−ＥＰＯとＥＰＯの赤血球の相対的容積（hematocrit）を測定したグラフである。
【発明の詳細な説明】
【００１８】
本発明は、下記化学式１のカテコール（catechol）を持つ化合物が結合されたポリエチレングリコール誘導体と前記誘導体が蛋白質またはペプチドのＮ末端アミン基に単一体で選択的に接合されていることを特徴とする蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体を提供する。
【化１】
【００１９】
本発明の発明者等は、前記公示技術の問題点を解決するために研究中、蛋白質のＮ末端アミン基と特異的に結合する作用基を発見し、これはドーパ基（3,4-dihydroxy-L-phenylalanine group）として、ムール貝接着物質に多く含まれているアミノ酸（amino acid）として知られている。ドーパミンあるいはより広くはカテコールに対する研究としては、本発明の発明者によって発表された研究論文により、多様な表面にカテコール基が吸着できることを証明し、このような接着力を利用して、蛋白質を選択的に多様な表面にコーティングできることを証明した（H. Lee, PNAS, 103, 12999, 2006; H. Lee, Science, 318, 426, 2007; H. Lee, Adv. Mater. 21, 431, 2009）。
【００２０】
従って、本発明は、ポリエチレングリコールにカテコールを持つ化合物を結合させて、反応性を持つポリエチレングリコール誘導体を使う。前記のようなポリエチレングリコール誘導体は、蛋白質またはペプチド等のＮ末端アミン基に選択的に結合して、接合体を形成でき、この場合、ポリエチレングリコール誘導体は蛋白質またはペプチドの特定部位に単一分子で接合され（site-specific mono-PEGylation）、蛋白質またはペプチドの生理活性度が維持されると同時に、生体内で持続性と安全性が増加した蛋白質またはペプチド製剤を製造することができる。また、蛋白質／ペプチド等の誘導体を製造する際に発生する加水分解に非常に安定したカテコール基を利用することによって、反応効率が長時間維持できる長所がある。
【００２１】
本発明に使われた用語「ポリエチレングリコール」は、当業界で一般的にＰＥＧ、Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌと併用して使われる用語であり、また下記メトキシアルデヒドポリエチレングリコール等の誘導体の概念を含む。
【００２２】
本発明で使われるポリエチレングリコールは、メトキシアルデヒドポリエチレングリコール、スクシンイミドプロピオン酸ポリエチレングリコール、メトキシスクシンイミドブタン酸ポリエチレングリコール、メトキシスクシンイミジルコハク酸ポリエチレングリコール、メトキシベンゾトリアゾールカルボン酸ポリエチレングリコール、メトキシエポキシドポリエチレングリコール、メトキシカルボニルイミダゾールポリエチレングリコール、メトキシｐ−ニトロフェニルカルボン酸ポリエチレングリコール、メトキシイソシアン酸ポリエチレングリコール、一級アミンを含むメトキシアミンポリエチレングリコール、メトキシヒドラジドポリエチレングリコール及びカルボキシル基を含むメトキシカルボキシルポリエチレングリコールからなる群より選択される一つであることが好ましいか、これに限定されない。前記ポリエチレングリコールは、アミン基またはカルボキシル基と反応でき、カテコール基と結合して、誘導体を形成することができる。
【００２３】
また、前記ポリエチレングリコールとしては、直線型、分枝型、ブラシ型、またはスター型のような全種類のポリエチレングリコールが使える。
【００２４】
本発明で使われるカテコールを持つ化合物は、カルボキシル基とアミン基を含むジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン（3,4-dihydroxy-L-phenylalanine）、アミン基を含む３−ヒドロキシ−チラミン（3-hydroxy-tyramine）、カルボキシル基を含む３，４−ジヒドロキシヒドロけい皮酸（3,4-dihydroxy hydrocinnamic acid）、アルデヒド基を含む３，４−ジヒドロキシベンゾアルデヒド（3,4-dihydroxybenzaldehyde）及びノルエピネフリン（Norepinephrine）で形成された群から選択される一つであることが好ましいか、これに限定されるのではない。さらに、本発明で使われるカテコールを持つ化合物の分子量は、１，０００以下であることが好ましい。
【００２５】
本発明に係るポリエチレングリコール誘導体の分子量は、好ましくは５００〜１００，０００であり、最も好ましくは２，０００〜４０，０００である。分子量が１００，０００を超えるとポリエチレングリコール誘導体を確保し難く、製造上の問題が生じ、５００未満の場合ポリエチレングリコールが液状形態になって、物理的性質による問題が生じる等、反応効率性が落ちる問題がある。
【００２６】
ポリエチレングリコール誘導体が蛋白質に接合される場合、増加した分子量を持った蛋白質−ポリエチレングリコール誘導体の接合体を得られ、これによって腎臓でのろ過効果による蛋白質の透過を抑制できる長所がある。また、ポリエチレングリコールのステルス作用によって、生体内の蛋白質酵素による分解を抑制する効果が現れ、これは、生体内において半減期及び安全性を増加させる長所を意味する。
【００２７】
本発明に係る蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体は、前記の通り特定部位に単一分子で接合するため、不均一な接合体混合物が生成される問題を防止できる長所がある。これによって、薬物の持続効果と安全性を測定する場合、信頼すべきデータを得ることができ、所望の生物学的活性または体内活性を持つ薬物を容易に製造することができるようにする長所がある。またＮ末端という特定部位に接合するため、蛋白質薬物の化学的変形が全くないまま薬理学的効果を最大化できる長所がある。
【００２８】
本発明で使われる前記蛋白質はリゾチーム、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、ウリカーゼ（mammalian urate oxidase，uricase）、及びアルギニンデイミナーゼ（arginine deiminase，ＡＤＩ）からなる群より選択される一つであってもよいが、これに限定されることなく、この時使われるリゾチーム、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＧＣＳＦ等のような蛋白質は、遺伝子組み換え方法によって産生されるもので、ほ乳動物から抽出する方式と、遺伝子のＤＮＡベクターから複製した後、原核生物、または真核生物宿主の発明をとおして得られる。一方、前記使われる原核生物の宿主は大腸菌（Escherichia coli）を含み、真核生物の宿主はメチロトローフ酵母（Hansenula polymorpha）、サッカロマイセス、セレビシエを含むと共に、ほ乳動物は、ラット、犬、及び豚等から各蛋白質を得ることができる。
【００２９】
本発明で使われる前記ペプチドは、ヒンジ−７（Hinge-7）、ヒンジ−３（Hinge-3）、ブフォリン（buforin）、ヒストニン（histonin）、プロテグリン（protegrin）、インドリシジン（indolicidin）、ヒスタチン（histatin）、ＢＩＰ、マガイニン２（magainin 2）、グルカゴン類似ペプチド（glucagon-like peptide：ＧＬＰ−１）、ＧＮＲＨ／ＬＨＲＨアゴニスト（GNRH/LHRH agonist）、ソマトスタチン類似体（somatostatin analogue）、免疫調節ペプチドのグラチラマー（glatiramer）、サーモンカルシトニン（salmon calcitonin）、テスモプレシン（desmopressin）、血小板凝固抑制ペプチド、エプチフィバチド（eptifibatide）、及びＨＩＶ細胞流入抑制剤であるエンフュービルタイド（enfuvirtide）で形成された群から選択される一つであってもよいが、これに限定されない。
【００３０】
また、本発明は、
（ａ）反応槽内の極性有機溶媒にポリエチレングリコールを溶解させる工程；
（ｂ）他の反応槽内の極性有機溶媒に架橋剤及び化学式１のカテコールを持つ化合物を溶解させる工程；
（ｃ）前記工程（ｂ）で製造された溶液にＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（N,N-Diisopropylethylamine；ＤＩＰＥＡ）を添加して、反応させる工程；及び
（ｄ）前記工程（ａ）の溶液に前記工程（ｃ）の溶液を添加して、反応させる工程を含む。
【００３１】
前記化学式１のカテコールを持つ化合物が結合されたポリエチレングリコール誘導体の製造方法を提供する。前記製造方法によって製造されたポリエチレングリコール誘導体は、蛋白質またはペプチドのＮ末端アミン基に単一体で接合できることを特徴とする。
【００３２】
以下、本発明を各工程別に詳細に説明する。
本発明に係る工程（ａ）及び工程（ｂ）は、反応物質の溶液を各々製造する工程である。物質を溶解させる溶媒として、極性有機溶媒が使えるが、好ましくはアルコール、ＤＭＳＯ（Dimethyl sulfoxide）、ＤＭＦ（Dimethylformaldehyde）、アセトン（Acetone）及びＮＭＰ（N-Methylpyrrolidone）が利用でき、最も好ましくはＤＭＦが使える。ＤＭＦは、カテコール基の酸化を防止できる。
【００３３】
カテコールを持つ化合物の溶液に添加される架橋剤は、ベンゾトリアゾリルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（Benzotriazolyloxytris(dimethylamino)phosphonium Hexafluorophosphate；ＢＯＰ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（Hydroxybenzotriazole；ＨＯＢｔ）、エチル−（ジメチルアミノ）プロピルカルボイミドハイドロクロライド（ethyl-(N',N’-dimethylamino)propylcarboiimide hydrochloride；ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（Dicyclohexylcarbodiimide；ＤＣＣ）、Ｎ−ジヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）及びシアノヒドリドほう酸ナトリウム（Sodium Cyanoborohydride）で構成された群で選択された一つ以上である。アミン基とカルボキシル基の結合に利用される架橋剤の好ましい一例としては、ＨＯＢｔ及びＢＯＰ；ＥＤＣ及びＮＨＳ；またはＤＣＣ及びＮＨＳが挙げられる。アミン基とアルデヒド基の結合に利用される架橋剤の好ましい一例として、シアノヒドリドほう酸ナトリウムが挙げられる。
【００３４】
例えば、ＢＯＰ及びＨＯＢｔは、ゼロオーダー（zero order）架橋剤として添加される。最も好ましい様態としては、ＢＯＰ：ＨＯＢｔ：カテコールを持つ化合物のモル比は、１：１：１〜１０：１０：１の範囲であることが好ましい。これは、モル比が前記範囲を超える場合、反応性が落ちる問題があるためである。
【００３５】
本発明に係る工程（ｃ）は、工程（ｂ）で製造されたカテコールを持つ化合物溶液にＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を添加して、反応させる工程である。本工程で、ＤＩＰＥＡは、有機ベース（base）としてカテコールを持つ化合物溶液に添加されると共に、添加後約１０〜２０分間反応させることが好ましい。
【００３６】
本発明に係る工程（ｄ）は、前記工程（ａ）で製造された溶液に前記工程（ｃ）で製造された溶液を添加して反応させる工程である。本工程の反応は、常温で約１０〜１４時間行われることが好ましい。本発明の一実施例によると、本工程によってメトキシポリエチレングリコールとカテコールを持つ化合物が接合されて、ポリエチレングリコール誘導体が形成されることを確認した。
【００３７】
さらに、本発明に係る工程（ｄ）の溶液を透析する（ｅ）工程を含む。本発明に係る工程（ｅ）は、反応終了後、未反応物質を取り除くため透析する工程である。前記透析は、分子量除去量が２，０００〜１０，０００である透析膜を利用して、１０〜１４時間行われることが好ましい。この時使われる透析溶液は、ｐＨが１〜６である蒸留水を使用することが好ましい。透析過程でのｐＨが前記範囲を終える場合、カテコールが酸化される問題が生じ好ましくない。
【００３８】
さらにまた、本発明に係る工程（ｅ）で透析された溶液を凍結乾燥する（ｆ）工程を含める。本発明に係る工程（ｆ）は、白粉状のポリエチレングリコール誘導体を得るため、透析が完了した溶液を凍結乾燥する工程である。これは当業者に自明な凍結乾燥方法で行われ、これを介して、溶媒が昇華された後、白粉状のポリエチレングリコール誘導体が得られる。この時、溶媒の完全除去のため、加えて乾燥が行われる。
【００３９】
さらに本発明は、
（ａ）反応槽内に蛋白質またはペプチドを溶解させる工程；
（ｂ）他の反応槽内に前記ポリエチレングリコール誘導体を溶解させる工程；及び
（ｃ）前記工程（ａ）の溶液を工程（ｂ）の溶液に添加して反応させる工程を含む、
ポリエチレングリコール誘導体が蛋白質またはペプチドのＮ末端アミン基に単一体で接合された蛋白質またはペプチドとポリエチレングリコール誘導体の接合体の製造方法を提供する。
【００４０】
以下、各工程を詳細に説明する。
本発明に係る工程（ａ）は、Ｎ末端アミン基を持つ蛋白質またはペプチドを反応槽内に溶解させる工程である。好ましくは、緩衝溶液に溶解させられ、使われる緩衝溶液は、リン酸塩緩衝溶液、イミダゾール緩衝溶液、トリメチルアミン緩衝溶液、トリエタノールアミン緩衝溶液、ソジウムジエチルバルビツレート緩衝溶液、ビシン（bicine）緩衝溶液、アミノメチルプロパンジオール緩衝溶液中で選択されたいずれかひとつが使える。また、前記緩衝溶液のｐＨは、好ましくは５．５〜１０である。緩衝溶液のｐＨが５．５未満の場合、反応性が落ちる問題があり、１０を超える場合、蛋白質またはペプチド薬物の安定性が低下する問題がある。
【００４１】
本発明に係る工程（ｂ）は、本発明で提供するポリエチレングリコール誘導体を他の反応槽内に溶解させる工程である。好ましくは、前記工程（ａ）のような緩衝溶液に溶解させられる。
【００４２】
本発明に係る工程（ｃ）は、本発明に係る工程（ａ）の溶液を工程（ｂ）の溶液に添加して反応させる工程で、ペグ化反応を行う工程である。前記ペグ化反応は、２〜１００時間、４〜３５℃で行うことが好ましい。
【００４３】
また、ポリエチレングリコール誘導体の活性度を増加する酸化剤は、好ましくは、ＮａＩＯ４、ＭｎＣｌ２、ＦｅＣｌ２、ＦｅＣｌ３、ＫＭｎＯ４、Ｈ２Ｏ２、Ｎａ２Ｃｒ２Ｏ７、Ｎａ３ＶＯ４で構成された群で選択される一つ以上である。酸化剤は、ポリエチレングリコール誘導体の溶解時に添加して、反応を進められ、この時添加される酸化剤は、カテコール基と１：１〜１：１０のモル比を持つことが好ましい。最も好ましくは、ＮａＩＯ４を１．５：１のモル比で添加して、反応を進められる。反応時間が２時間未満であれば、ポリエチレングリコールの接合効率が低くなる問題があり、１００時間を越えると蛋白質またはペプチドの安定性が低下する問題がある。また、反応温度が４℃未満であると、反応速度が遅くなりすぎる問題があり、３５℃を超える場合、蛋白質またはペプチドが変形される問題がある。
【００４４】
また、本発明に係る工程（ｃ）以降、工程（ｃ）の溶液を透析した後、接合体を分離する工程（ｄ）をさらに実施することが好ましい。本発明に係る工程（ｄ）は、前記ペグ化反応終了後、未反応物質を取り除くため透析するか、または液状クロマトグラフィー（ＨＰＬＣまたはＦＰＬＣ）を利用して分離する工程である。前記工程は当業者に自明な透析方法、または液体クロマトグラフィー方法を利用して行う。
【実施例】
【００４５】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００４６】
実施例１：カテコール−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体の合成
カテコールを持つ化合物が結合されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体を合成するために、ＰＥＧの一例であるメトキシポリエチレングリコールを使って、カテコールを持つ化合物の一例である３，４−ジヒドロキシ桂皮酸を利用した。
【００４７】
アミン基を末端に持っているメトキシポリエチレングリコール（methoxy-polyethyleneglycol；ｍ−ＰＥＧ，ＭＷ：５ｋ）１０００ｍｇを反応槽内の１５ｍＬの極性有機溶媒であるＤＭＦ（dimethylformamide）溶液内で、３，４−ジヒドロキシけい皮酸（ＨＣＡ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、ベンゾトリアゾリルオキシトリスホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）と共にかき混ぜて７２０分間反応させた。使われた化合物の量は、各々３８ｍｇ、１１０ｍｇ及び４４μＬであった。一方、溶媒として使われたＤＭＦは、ＨＣＡのカテコール基の酸化を防止できるため好ましい。
【００４８】
図１に示したような反応が終了した後、残っている未反応物質を取り除くために、２４時間透析過程を経た後、凍結乾燥して、白粉状の３，４−ジヒドロキシ桂皮酸−ＰＥＧを収得して、カテコールを持っているＰＥＧ誘導体（以下、ｍＰＥＧ−ＣＴ）が合成されたことを確認した。
【００４９】
実施例２：ｍＰＥＧ−ＣＴを利用したＰＥＧ−ヒンジ−３接合体の製造及び製造形態確認
（１）ｍＰＥＧ−ＣＴを利用したＰＥＧ−ヒンジ−３接合体の製造
ポリエチレングリコール誘導体とペプチドを接合させるために実施例１の方法と同様にｍＰＥＧ−ＣＴを準備した（図１）。即ち、ｍＰＥＧ−ａｍｉｎｅ（ＭＷ：５ｋ）及びＨＣＡをＤＭＦ溶液内でＨＯＢｔ、ＢＯＰ、ＤＩＰＥＡと共に反応させて、ｍＰＥＧ−ＣＴを収得した。
その後、弱酸性条件で（ｐＨ６．５）、ｍＰＥＧ−ＣＴ及びヒンジ−３ペプチド（図２参照）を４度で混合して反応させた。その結果、ＰＥＧ−ヒンジ−３接合体が成功的に製造された。
（２）ＲＰ−ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを介した単一ペグ化の可否確認
前記実施例２−（１）で製造されたＰＥＧ−ヒンジ−３接合体の形態がヒンジ−３ペプチドにＰＥＧが単一体で接合した形態か否かを確認するために、ＲＰ−ＨＰＬＣ（Reverse phase-High performance liquid chromatography）及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight）分析を行った。
ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍは、Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ ｓｅｒｉｅｓを使って、カラムはｓｕｐｅｌｃｏ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（商標） ＢＩＯ Ｗｉｄｅ Ｐｏｒｅ Ｃ１８ ５ｃｍ×４．６ｍｍ，３μｍを使った。移動相は、水（０．１％ＴＦＡ）：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）＝９５：５から３０分まで水（０．１％ＴＦＡ）：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）＝５：９５で流し、３５分まで再び水９５％に合わせて流した。
【００５０】
その結果、図３に示したように、ＲＰ−ＨＰＬの結果、二つのピークだけが検出された。この二つのピークは、各々変形されないヒンジ−３（１６．２分）、単一ペグ化ヒンジ−３（１７分）を示しており、多重ペグ化は起きず単一ペグ化だけ起きたことを確認することができた。
【００５１】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析のために、アセトニトリル（Acetonitrile）溶液（０．１％トリフルオロ酢酸（trifluoroacetic acid：ＴＦＡ））を水（０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））と１：１比となるよう混ぜた後、ジップチップ（zip tip）を使ってチップの先にある固定相に蛋白質を吸着させた後、水で洗浄して緩衝溶液に入っている塩を取り除き、１：１のアセトニトリル、水の混合液を使って純粋なＰＥＧ−ヒンジ−３のみを精製して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ用プレートに乗せて試料を準備した後、分析を行った。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析機器は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ社のＶｏｙａｇｅｒ ＤＥ−ＳＴＲ機器を使った。
【００５２】
その結果、図４に示したように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析結果もＰＥＧ（ＭＷ：５０００）及び単一ＰＥＧ−ヒンジ−３（ＭＷ：７２３８）だけが検出されたため、カテコール−ポリエチレングリコール誘導体を利用して、ペプチド−ポリエチレングリコール接合体を製造する場合、ポリエチレングリコールが単一体でペプチドに接合されたことを確認した。
【００５３】
（３）トリプシン分解を介した単一ペグ化位置確認
前記実施例２−（１）で製造されたＰＥＧ−ヒンジ−３接合体の形態が、ヒンジ−３ペプチドのＮ末端位置に特異的に接合された形態か否かを確認するために、ｔｒｙｐｔｉｃ分解方法後、ＲＰ−ＨＰＬ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を行った。ヒンジ−３と命名されたペプチドは、２０個のアミノ酸を持っている（図２参照）。一方、露出された一級アミン、潜在的ペグ化位置は、合わせて７個で、リシン（Ｋ）の６個のエプシロン−アミングループとＮ末端のアルファ−アミングループである。全てのアミンは、ペグ化位置の候補である（図５参照）。従って、これらの位置中、Ｎ末端のアルファ−アミングループにだけペグ化されたかを確認した。ヒンジ−３配列は、ただ一つのトリプトファンアミノ酸を含有するため（図２参照）、トリプシン分解でヒンジ−３蛋白質が分解される場合、Ｎ末端にだけＰＥＧが接合されたか否かをその切片の形態で確認することができた。
【００５４】
ヒンジ−３ペプチドはシステインを持っていないため、４Ｍウレア（Urea）に溶かした状態で少量の塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）の添加後、直ちにトリプシンの量を蛋白質の１／２０の割合で溶解させて、３７℃で１２時間トリプシン分解過程を実行した。その後、ＲＰ−ＨＰＬ分析を行った。
【００５５】
その結果、図６のようなグラフが観測された。２８０ｎｍＵＶで、トリプトファン残基だけが検出された。これが、分解されたヒンジ−３がＴ１切片（検定１３ｍｉｎ）で単一ピークだけが見られる理由である。仮に、カテコールがエプシロン−アミン（Ｋ１２、Ｋ１３、Ｋ１６、Ｋ１７、Ｋ２０）と反応したとすると、単一切片のピークは変わらない。しかし、図６に示された結果のように、単一切片のピークは確かに減少した（赤線）。即ち、カテコールグループによって、ピークの強度はＴ１切片が存在する時にだけ増加した。前ピーク（１３分、赤線）の存在は、十分な希釈過程を経なかったためである（ＭＷＣＯ：６０００で希釈）。
【００５６】
ＲＰ−ＨＰＬ分析後、ペグ化候補は、Ｋ９とＮ末端アミンだけが残るようになる。仮に、ｍＰＥＧ−ＣＴがＫ９と反応したとすると、トリプシンがペグ化されたリシン（Ｋ９）を認識できないため、ペグ化され消化された切片、即ちｍＰＥＧ−ＣＴとＴ１＋２切片が加わった分子量は６２５４．４９になる。従って、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を介して、ｍＰＥＧ−ＣＴがどの位置にペグ化されたかを分析した。分析方法は、前記実施例２−（２）で行われた方法と同様である。
【００５７】
その結果を図７に示した。図７によると、２個のピークだけが存在する：５０００、５８８３。この結果によると、５０００ピークは、ｍＰＥＧ−ＣＴで、５８８３ピークは、ｍＰＥＧ−ＣＴとヒンジ−３のＴ１切片（ＭＷ：８９９）が加わったことが確実で、ｍＰＥＧ−ＣＴとＴ１＋２切片が加わった分子量６２５４．４９は観測されなかったため、この５８８３ピークはＮ末端ペグ化の確実な証拠である。これにより、実施例２−（１）でｍＰＥＧ−ＣＴを利用して製造されたＰＥＧ−ヒンジ−３接合体は、ヒンジ−３ペプチドのＮ末端にＰＥＧが単一体の形態で接合された形態であることを確認した。
【００５８】
実施例３：ｍＰＥＧ−ＳＳ及びｍＰＥＧ−ＣＴを利用したＰＥＧ−リゾチーム接合体との比較
（１）ｍＰＥＧ−ＳＳを利用したＰＥＧ−リゾチーム接合体の製造
ペプチドだけでなく、蛋白質もＮ末端ペグ化できる。従来、アミンペグ化させる最も有用な方法は、表面露出された一級アミングループと共有結合を生成できるスクシンイミジルコハク酸（succinimidyl succinate）を使うことであった。しかし、このような方法は位置特異的でない問題があった。
カテコールグループとは異なって、スクシンイミジルコハク酸は、無作為的な一級アミン基と反応するためである（図８）。従って、蛋白質の例としてリゾチームを利用して、カテコールグループとスクシンイミジルコハク酸を比較するために、ｍＰＥＧ−ＳＳを利用してＰＥＧ−リゾチーム接合体を製造した。
一般に知らされた条件であるｐＨ８．５でｍＰＥＧ−ＳＳ２０ｍｇとリゾチーム５ｍｇを入れて、４℃で１２時間反応をさせてＰＥＧ−リゾチーム接合体を製造した。
その結果、ＰＥＧ−リゾチーム接合体が製造されたことを確認した。
【００５９】
（２）ｍＰＥＧ−ＣＴを利用したＰＥＧ−リゾチーム接合体の製造
実施例１のｍＰＥＧ−ＣＴを利用してＰＥＧ−リゾチーム接合体を製造するために、実施例２−（１）と同様に製造したが、蛋白質の特性を考慮してｐＨ８．５でｍＰＥＧ−ＣＴ（５ｋ）５ｍｇをリゾチーム５ｍｇと共に混ぜて４度で１２時間混合した。
その結果、ＰＥＧ−リゾチーム接合体が製造されたことを確認した。
【００６０】
（３）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｇｅｌ分析方法を利用した単一または多重ペグ化有無確認
前記実施例３−（１）及び３−（２）のＰＥＧ−リゾチーム接合体に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｇｅｌ分析を行って、前記接合体が単一ペグ化された形態であるか、多重ペグ化された形態であるかを確認した。
アクリルアミド（Acrylamide）分率が１５％のであるＤＳ ＰＡＧＥ Ｇｅｌを製造し電圧をかけて、リゾチーム及びＰＥＧ−リゾチーム接合体を大きさに応じて分離した。
【００６１】
その結果を図９に示した。図９の１列目はリゾチームだけを対照群としてかけたもので、２列目は実施例３−（１）のＰＥＧ−リゾチーム接合体、３列目は実施例３−（２）のＰＥＧ−リゾチーム接合体をローディングした結果である。その結果、２列目のメトキシ−ポリエチレングリコールスクシンイミジルコハク酸（ｍＰＥＧ−ＳＳ）を利用して製造した接合体は、３個のアミン基と反応した（バンドが３つ現れる）Ｋ３３、Ｋ９７、Ｋ１１６）。しかし、３列目で確認できるように、ｍＰＥＧ−ＣＴを利用して製造したＰＥＧ−リゾチーム接合体は、ただ一つのバンドだけが見られたため、ただ一つのアミン基と反応したことが分かった。これにより、スクシンイミジルコハク酸−ＰＥＧ誘導体とは異なって、カテコール−ＰＥＧ誘導体の場合、蛋白質と接合するに当たり、単一体の形態で接合されたことを確認した。
【００６２】
実施例４：ｍＰＥＧ−ＣＴを利用したＰＥＧ−ｂＦＧＦ接合体の製造及び製造形態確認
（１）ｍＰＥＧ−ＣＴまたはｍＰＥＧ−ＳＳを利用したＰＥＧ−ｂＦＧＦ接合体の製造
ｂＦＧＦ（ＭＷ：１７．１ｋＤａ）は、塩基性線維芽細胞成長因子（basic Fibroblast Growth Factor）であり、ＦＧＦの一種である。成体器官で、傷反応及び組織再生に対して機能する。前記実施例２−（１）で使った方法と同様にｍＰＥＧ−ＣＴを利用してＰＥＧ−ｂＦＧＦ接合体を製造して、その結果ＰＥＧ−ｂＦＧＦ接合体が製造されたことを確認した。
一方、実施例３−（１）と同様な方法でｍＰＥＧ−ＳＳを利用してＰＥＧ−ｂＦＧＦ接合体を製造した。
【００６３】
（２）ＳＤＳ ＰＡＧＥ Ｇｅｌ分析を介した単一ペグ化の可否確認
実施例２−（２）と同様な方法でＰＥＧ−ｂＦＧＦのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を介して、単一体にペグ化されたか否かに対して確認した。ただｐＨ値は異ならせて実験した。それは、Ｎ末端アミンの環境は異なるため、互いに異なったｐＫａ値を持つためである。ｂＦＧＦは、ｐＨ６．５でペグ化の可否を観察した。
【００６４】
その結果を図１０のＡに示した。
図１０のＡの２列目にローディングされた蛋白質は、ｍＰＥＧ−ＣＴを使ってｐＨ６．５でペグ化を行った結果であるが、既存ｂＦＧＦのバンドとモノペグ化されたＰＥＧ−ｂＦＧＦ接合体のバンド、二つのバンドを観察することができ、３列目にローディングされた蛋白質は、これをＦＰＬＣで分離して、精製したモノペグ化されたＰＥＧ−ｂＦＧＦ接合体である。これにより、カテコール−ポリエチレングリコール誘導体を利用して、蛋白質−ポリエチレングリコール接合体を製造する場合、ポリエチレングリコールが単一体で蛋白質に接合されることを確認した。
【００６５】
（３）トリプシン分解を介したペグ化位置確認
実施例２−（３）と同様な方法でＰＥＧ−ｂＦＧＦのトリプシン分解を介してペグ化位置を確認した。
その結果、図１０のＣに示したように、Ｔ１切片ピークは７４６８で観察された。変形されないｂＦＧＦのＴ１切片の分子量は２４９５であるため（図１０のＢ）、７４６８ピークはｍＰＥＧ−ＣＴ（ＭＷ：５０００）とｂＦＧＦのＴ１切片（ＭＷ：２４９５）が加わったことが確実になったため、この７４６８ピークはＮ末端ペグ化の確実な証拠である。これにより、ｍＰＥＧ−ＣＴを利用して製造されたＰＥＧ−ｂＦＧＦ接合体は、ｂＦＧＦ蛋白質のＮ末端にＰＥＧが単一体の形態で接合された形態であることを確認した。
【００６６】
実施例５：ｍＰＥＧ−ＣＴを利用したＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ接合体の製造及び製造形態確認
（１）ｍＰＥＧ−ＣＴまたはｍＰＥＧ−ＳＳを利用したＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ接合体の製造
Ｇ−ＣＳＦ（Granulocyte Colony-Stimulating Factor；ＭＷ：１８．８ｋＤａ）もヒト血液システムの最も重要な蛋白質であり、骨髄を刺激して、血流に放出されるようにする役割を果たす。前記実施例２−（１）と同様な方法でＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ接合体を製造し、その結果ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ接合体が製造されたことを確認した。
一方、実施例３−（１）と同様な方法でｍＰＥＧ−ＳＳを利用してＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ接合体を製造した。
（２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｇｅｌ分析を介したペグ化の可否確認
実施例２−（２）と同様な方法でＰＥＧ−ｂＦＧＦのＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｇｅｌ分析及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を介して、単一体にペグ化されたか否かに対して確認した。
【００６７】
その結果を図１１に示した。
図１１のＡに示したように、ｍＰＥＧ−ＣＴを使ってペグ化させた結果、ペグ化される前のＧ−ＣＳＦとモノペグ化されたＧ−ＣＳＦバンドだけを観察することができ（２列目）、これをＦＰＬＣで精製した結果、モノペグ化されたＧ−ＣＳＦだけを分離することができた（３列目）。これにより、Ｇ−ＣＳＦ蛋白質に対し単一体にペグ化されたことを確認した。
【００６８】
（３）トリプシン分解を介したＮ末端に単一ペグ化されたか否かの確認
実施例４−（３）と同様な方法で、Ｇ−ＣＳＦ及びＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦのトリプシン分解を介してペグ化位置を確認した。
その結果、図１１のＢに示したように、Ｇ−ＣＳＦのトリプシン分解のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの結果、Ｔ１切片の分子量は１７９２であった。一方、図１１のＣに示したように、カテコール−ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦのトリプシン分解のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの結果、Ｔ１の分子量は６７９２であった。従って、前記結果はＴ１切片とＰＥＧ（ＭＷ：５０００）が加わった結果と考えられるため、このことからスクシンイミジルコハク酸−ＰＥＧ誘導体とは異なって、カテコール−ＰＥＧ誘導体の場合、蛋白質と接合されるに当たり、単一体の形態で接合されたことを確認した。
【００６９】
前記実施例１〜５から、成功的にカテコールを持つ化合物が結合されたポリエチレン誘導体（ＰＥＧ−ＣＴ）を合成し、ＰＥＧ−ＣＴを蛋白質またはペプチドに接合させる場合、単一体の形態でＮ末端特異的に結合が可能であることを確認した。
【００７０】
実施例６：過ヨウ素酸ナトリウム（Sodium Periodate）を利用したペグ化効率増進
ペグ化効率を増進させるために、酸化剤である過ヨウ素酸ナトリウムを使った。低ｐＨ条件でアルファアミン（Ｎ末端アミン）はエプシロンアミン（リシン残基アミン）に比べてＮＨ３＋陽イオン形態で存在する比が高い。このため、Ｎ末端アミンだけが過ヨウ素酸塩によって酸化されたキノンと反応することができる。従って、それぞれ違異なる過ヨウ素酸ナトリウム比率条件下でペグ化を行った。
ｐＨ６．０のバッファー溶液に５ｍｇのリゾチーム、５ｍｇのｍＰＥＧ−ＣＴを溶かして４℃で７２０分間反応させた。この時、過ヨウ素酸ナトリウムは、ｍＰＥＧ−ＣＴと各々０、０．５、１、２：１の割合で添加した。
対照群実験は実施例３−（２）と共に実験した。
【００７１】
その結果を図１２、１３にｐＨ６．０以下で互いに異なる過ヨウ素酸塩比率でペグ化効率を比較して示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｇｅｌの最後のカラム及びグラフのｐＨ８．５のペグ化収率の値は、化学反応のないまま形成された対照群である。実験結果、最も収率が高いのは、過ヨウ素酸塩：カテコールが１．５：１である時に５７．９４％と示された。
【００７２】
実施例７：ＰＥＧ−ＥＰＯ接合体の生体内の持続時間確認（ｉｎ ｖｉｖｏ）
（１）ｍＰＥＧ−ＣＴまたはｍＰＥＧ−ＳＳを利用したＰＥＧ−ＥＰＯ接合体の製造及び確認
エリスロポエチン（ＭＷ：３０ｋＤａ）は、腎臓で生成されるホルモンで、骨髄で赤血球の生成を促進する。最も重要な機能は、赤血球の分化と発生を促進することである。本実験では、ｍＰＥＧ−ＣＴ（ＭＷ：３０ｋＤａ）を使っているが、その理由は少なくとも２０ｋＤａのＰＥＧを付着するペグ化がｉｎ ｖｉｖｏ環境で効果があるためである。
【００７３】
実施例２−（１）及び３−（１）に記載された方法で製造する際に、ｍＰＥＧ−ＣＴとＥＰＯを反応させる時、過ヨウ素酸ナトリウムを１．５：１の割合で添加しており、ｐＨ環境は７．５であった。ｐＫａ値が蛋白質毎に異なるため、リゾチームに比べて多少高いｐＨ条件を使った。反応終了後、ＰＥＧ接合されたＥＰＯをＦＰＬＣシステム（Ｓｈｅｐｈａｃｒｙｌ ＴＭ Ｈｉｐｒｅｐ ２６／６０ Ｓ−２００−ＨＲ ３２０ｍＬ）を利用して精製した。
【００７４】
その結果を図１４及び図１５に示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｇｅｌの結果から分かるように、ＦＰＬＣ過程後、ＥＰＯ混合物（図１５において、黒線、１４０分）及びｍＰＥＧ−ＣＴ−ＥＰＯ（ＰＥＧ−ＥＰＯ、図１４において、２番目のｌｉｎｅまたは図１５において、黒線、９８分）が完璧に精製された（図１４において３番目のｌｉｎｅ）。ペグ化収得率は７７％であった。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの結果から単一ペグ化ＥＰＯを確認することができた（ｄａｔａ ｎｏｔ ｓｈｏｗｎ）。
【００７５】
ｍＰＥＧ−ＳＳ（ＭＷ：２０ｋＤａ）を蛋白質多重−ペグ化対照群として使った。単一ペグ化ＥＰＯは１０５分で、２重ペグ化ＥＰＯ（di-PEGylated）は９５分で検出され、ＦＰＬＣで精製した（図１５、赤線）。ピークは、８５分で検出され、これは接合された蛋白質及び多重−ペグ化蛋白質を示すものである。ペグ化は、ｍＰＥＧ−ＣＴに比べてｍＰＥＧ−ＳＳがずっと低い収率で形成されたが、比較の便宜のために図面では高さを調整して示した。
【００７６】
（２）Ｉｎ ｖｉｖｏ持続時間確認
Ｉｎ ｖｉｖｏ薬物動態学（pharmacokinetic）実験のために、陽性対照群として多重−ペグ化ＥＰＯ、即ち、前記実施例７−（１）で製造したｍＰＥＧ−ＳＳを利用して製造した多重ＰＥＧ−ＥＰＯを使った。
マウスに対して１００μｇ蛋白質／ｋｇ（マウス体重）の量を静脈注射でＥＰＯを投入後、Ｉｎ ｖｉｖｏを循環する時間を測定した。各蛋白質に対し、５匹のマウスを使って、各マウスに〜２．５μｇの蛋白質を注入した。これは、転化因子が２．５６×１０４ｍＩＵだと仮定した時、６．４×１０４ｍＩＵのＥＰＯに該当する量である。プラズマの蛋白質はＥＬＩＳＡで定量し、定量値は各蛋白質サンプル、即ちＰＥＧ−ＥＰＯ、多重ＰＥＧ−ＥＰＯとＥＰＯの各々異なるＥＬＩＳＡ抗体の親和度に応じて調整した。
【００７７】
その結果を図１６に示した。図１６に示したように、全ての蛋白質サンプルの半減期は、約４〜９６時間と測定された。初期（０．２５〜４時間）において類似する傾向を示したものの、正確な半減期を測定するには多少不正確な結果と考えられる。中期（４〜４８時間）において、ＥＰＯは循環しており、６時間の半減期を持つ。また、注射後７２時間、血漿（plasma）から検出されなかった。多重ＰＥＧ−ＥＰＯはさらに半減期が長かった（３０時間）。ただ、後期（４８〜９６時間）において、より速い半減期を持った（１５時間）。一方、単一ＰＥＧ−ＥＰＯは、最も長い半減期（３０時間）を持っており、最も長い時間（９６時間）観察された。この結果から、多重ＰＥＧ−ＥＰＯと単一ＰＥＧ−ＥＰＯは、長い半減期によって通常のＥＰＯより優れた効能を示し、単一ＰＥＧ−ＥＰＯが多重ＰＥＧ−ＥＰＯより優れた半減期を持つことを確認し、生体内で持続時間が長く、蛋白質薬物の体内薬効及び安全性を極大化する可能性があることが予測された。
【００７８】
（３）生物学的活性測定
生物学的活性を測定するために、血サンプルにある血液の容積に対する赤血球の相対的容積比率（hematocrit）を測定した。
マウスから抽出した血にＥＤＴＡを混ぜて凝固を防いだ後、ＶｅｔＳｃａｎ ＨＭ５（Ａｂａｘｉｓ社）を使って、赤血球の相対的容積比率を測定した。
【００７９】
その結果、図１７に示したように、注射後０日から３日間、ＥＰＯとＰＥＧ−ＥＰＯは類似する活性を持っており、７〜１０日後にも同様であった。ただ、ＥＰＯはｉｎ ｖｉｖｏ活性を１４日目に多くが喪失したのに対して、ＰＥＧ−ＥＰＯの場合、そのまま効果が維持された。この結果から、蛋白質薬物の化学的変形がない本発明によると、蛋白質薬物の体内薬効が優れたものになると予測される。
【００８０】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明によると、カテコール−ＰＥＧ誘導体が蛋白質またはペプチドの特定部位であるＮ末端アミングループに位置特異的かつ単一分子で結合して、均一なポリエチレングリコール蛋白質、またはペプチド接合体を高い収率で収得することができる。収得された接合体は、従来技術に比べて、蛋白質自体の化学的変形がないまま、蛋白質活性度阻害を最小化できて、接合体の薬学的効果が優れ、その均質性によって製造工程を単純化でき、また生体内での生物学的薬効性が均一に予測され、加水分解に強く、生体内の持続時間が長くなるため、蛋白質薬物の体内薬効及び安全性を増進させる効果がある。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カテコールを持つポリエチレングリコール誘導体を利用して、蛋白質またはペプチドの特定部位のＮ末端にポリエチレングリコール誘導体を単一接合させた蛋白質またはペプチド−カテコールポリエチレングリコール誘導体の接合体及びこれの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内では、私たちの体の成長及び分化に係る多様な種類の蛋白質またはペプチドが発現するようになる。このような蛋白質またはペプチドは、細胞壁に存在する受容体と結合して、多様な信号伝達物質（signaling molecules）の発現を誘導することによって生体恒常性（homeostasis）を維持する役割を果たす。しかし、このような蛋白質またはペプチドの量が生体内に適正水準を維持できない場合、生体内の信号伝達物質の不足現象や過発現現象によって、生体恒常性に問題が生じて、種々の問題点が現れるようになる。例えば、ヒト成長に係る成長ホルモンや傷の治癒に係る上皮成長因子等の濃度が低い場合、背が伸びないか、傷が癒えないことがある。
【０００３】
１９６２年カンフィールド（R. Canfield）、１９８５年エチ（F. Esch）、１９６２年コーヘン（S. Cohen）、１９８５年メトカーフ（D. Metcalf）等は、アミノ酸で構成された蛋白質因子のリゾチーム（Lysozyme）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）等を発見し、さらに各々のアミノ酸配列を確認した（R. Canfield, J. Biol. Chem. 238, 2698., 1963; F. Esch, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6507., 1985; S. Cohen, J. Biol. Chem. 237, 1555., 1962; D. Metcalf, Science 229, 16, 1985）。
【０００４】
このような蛋白質因子は、傷治療（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ／ｂＦＧＦ／ＥＧＦ）、白血球形成（Ｇ−ＣＳＦ）に影響を及ぼすと知られており、糖尿病患者に発生しやすい足部潰瘍治療剤や抗癌剤治療後の好中球減少症（Neutropenia）治療剤として常用される。
【０００５】
しかし、このような蛋白質の場合、血液及び組織内でその体内半減期（half-life）が非常に短いと知られており、治療用として蛋白質を投与する場合、生体内の薬効持続性と安全性が非常に低下する問題がある。
【０００６】
このような問題を解決するために、最近１０年間生体適合性高分子であるポリエチレングリコール（polyethyleneglycol；ＰＥＧ）を蛋白質またはペプチド物質に接合させようとする試みが続けられてきた（G. Pasut & F. M. Veronese Prog. Polym. Sci.32, 933, 2007; F. M. Veronese, Biomaterials22, 405.2001; P. Bailon, Pharm. Sci. Tech. Today 1, 352, 1998）。
【０００７】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、生体内で免疫反応を起こさない生体適合性が優れた高分子として米国食品医薬品局（ＦＤＡ）が承認した合成高分子中の一つである。この合成高分子を利用して、蛋白質接合体を製造することによって、増加した分子量を持った蛋白質ポリエチレングリコール接合体を得ることができ、これにより、腎臓におけるろ過（filtration）効果による蛋白質の透過を抑制することができる。さらに、ポリエチレングリコールのステルス作用（stealth effect）を介して生体内の蛋白質酵素による分解を抑制する効果を示すことによって究極的に生体内での半減期及び安全性を増加させるようになる。このような方法で薬効を増進させた蛋白質は、ヒト成長ホルモン、エリスロポエチン、インターフェロン、インシュリン、インターロイキン、カルシトニン等、多くの種類がある。
【０００８】
しかし、蛋白質薬物の体内安全性及び持続性向上のためにポリエチレングリコールを使う際に、ポリエチレングリコールが蛋白質薬物が持っている複数の結合部位と反応することによって、結果的に生成される産物が不均一な多重接合体混合物（a mixture of multi-PEGylated species）になる問題点があった。特に、不均一な多重接合体混合物の場合、薬物の持続効果と安全性を測定し難い問題がある。
【０００９】
一方、条件を厳しくして、一分子のポリエチレングリコールが結合した（mono-PEGylated）接合体を製造するとしても、その結合部位に応じて薬物の生物学的または体内活性度が顕著に影響を受けるという問題がある。これを解決するために、多くの治療用蛋白質（therapeutic proteins，ＥＰＯ，Ｇ−ＣＳＦ，成長ホルモンなど）は、活性部位（active site）がＮ末端（N-terminal）の隣接部位に位置していないため、蛋白質またはペプチドのＮ末端にＰＥＧを結合させようとする試みがなされてきた。なぜなら、Ｎ末端ペグ化反応は、ペグ化反応の最も大きい短所である蛋白質活性化低下を最小化できる技術である。
【００１０】
従って、上のようなＮ末端位置特異的単一ペグ化を実現するために、多くの方法を使って蛋白質またはペプチドのＮ末端アミン基の一級アミン（primary amine）に位置特異的（site-specific）に、ポリエチレングリコールを単一体で（mono-PEG）接合させようとする試みがなされてきた。
【００１１】
従来、このような試みに利用されたポリエチレングリコールは、一級アミンに特異的に反応する物質であるＮ−ヒドロキシスクシンイミド（N-hydroxysuccinimide）またはＮ−スクシニミジルプロピオネート（succinimidyl propionate）が片方末端についているメトキシポリエチレングリコール誘導体であった（T. H. Kim, Biomaterials, 23, 2311, 2002; H. Lee, Pharm. Res., 19, 845, 2002）。スクシンイミドポリエチレングリコール誘導体を使って、製造されたモノ−ペグ化（mono-PEGylated）接合体の場合、体内活性も変化度が非常に低いと知られているが、蛋白質またはペプチドと接合する反応途中Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドまたはＮ−スクシンイミジルプロピオネートの加水分解（hydrolysis）が早く起きて、蛋白質またはペプチド接合体を作る工程上に困難があって、接合体を獲得する収率が低い問題があった。
【００１２】
また、位置特異的タンパク質変異（Site-specific protein mutation）（single mutation）を利用した他の試みで、９５％以上のシステインを蛋白質（ペプチド）薬物のＮ末端に導入して、ペグ化（PEGylation）を行う技術が試みられてきた。ただ、前記技術によると、蛋白質薬物を化学的に変形させることであったため、変形による薬物の生活性減少等付随的問題を抱えていた。
【００１３】
さらに、アルデヒドＰＥＧを利用したＮ末端特異的ペグ化も試みられた。これはＡｍｇｅｎ社のＮｅｕｌａｓｔａ（商標）の生産に適用された方法である。しかし、前記技術の場合、その工程において反応条件が必ず酸性条件でなければならないという制約があり（ｐＨ４〜６、通常ｐＨ５．０〜５．５）、必ず還元剤であるＮａＢＨ４を共に使わなければならないため、このような制限された反応条件による制限性が問題となってきた。
【００１４】
そこで本発明者等は、カテコールを持つ化合物が結合されたＰＥＧ誘導体を利用して、蛋白質またはペプチドと前記ＰＥＧ誘導体の接合体を製造する場合、工程が簡単で、結果が加水分解に強く、特に、蛋白質またはペプチドのＮ末端の一級アミンに位置特異的で単一ＰＥＧ（mono-PEGylated）接合された接合体を高い収率で生成する可能性があることを確認して本発明を完成した。
【発明の概要】
【００１５】
本発明の目的は、蛋白質またはペプチドの特定部位のＮ末端アミン基にポリエチレングリコール誘導体を単一接合させた蛋白質またはペプチドとポリエチレングリコール誘導体の接合体及びこれの製造方法を提供することにある。
【００１６】
前記目的を達成するために、本発明はカテコールを持つ化合物が結合されたポリエチレングリコール誘導体、前記誘導体が蛋白質またはペプチドの特定部位のＮ末端に単一接合されている（mono-PEGylated）、蛋白質またはペプチドと前記ポリエチレングリコール誘導体の接合体及びこれの製造方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】メトキシポリエチレングリコールと３，４−ジヒドロキシ桂皮酸の反応模式図である。
【図２】ヒンジ−３ペプチドのアミノ酸配列である。
【図３】ｍＰＥＧ−ＣＴ及びヒンジ−３を混合した結果のＲＰ−ＨＰＬの結果である。
【図４】ｍＰＥＧ−ＣＴ及びヒンジ−３を混合した結果のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの結果である。
【図５】ヒンジ−３に存在するペグ化候補（candidate）を示した模式図である。
【図６】ＰＥＧ−ヒンジ−３のトリプシン分解後、切片に対するＲＰ−ＨＰＬの結果グラフで、黒線１３分のピークは、Ｔ１切片、赤線１３分のピークは希釈不足の結果、２３．５分のピークはペグ化された切片を示す。
【図７】ＰＥＧ−ヒンジ−３のトリプシン分解後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの結果のグラフで、ｍＰＥＧ（ＭＷ：５０００）またはｍＰＥＧとＴ１切片が加えられた値（ＭＷ：５８８３）にピークが現れた。
【図８】カテコールグループとスクシンイミジルコハク酸の結合形態に対する模式図である。
【図９】スクシンイミジルコハク酸−ＰＥＧ−リゾチーム（３列）及びカテコール−ＰＥＧ−リゾチーム（４列）のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果で、単一結合されたカテコール−ＰＥＧ−リゾチームは、一つのバンドだけを示すことが見られる。
【図１０】スクシンイミジルコハク酸−ＰＥＧ−ｂＦＧＦ（２列）及びカテコール−ＰＥＧ−ｂＦＧＦ（３列）のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（１０Ａ）、ｂＦＧＦのトリプシン分解のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの結果（ＭＷ：２４９５、１０Ｂ）及びカテコール−ＰＥＧ−ｂＦＧＦのトリプシン分解のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの結果（ＭＷ：７４６８、１０Ｃ）である。
【図１１】スクシンイミジルコハク酸−ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ（２列）及びカテコール−ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ（３列）のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（１１Ａ）、Ｇ−ＣＳＦのトリプシン分解のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの結果（ＭＷ：１７９２、１１Ｂ）及びカテコール−ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦのトリプシン分解のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの結果（ＭＷ：６７９２、１１Ｃ）である。
【図１２】リゾチーム蛋白質ペグ化反応時、ｐＨ６．０で、カテコールに対して０、０．５、１、１．５、２：１の割合でＮａｌＯ４を添加した結果のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル写真である。
【図１３】リゾチーム蛋白質ペグ化反応時、ｐＨ６．０でカテコールに対して０、０．５、１、１．５、２：１の割合でＮａｌＯ４を添加した場合のペグ化収率の相手値を示したグラフである。
【図１４】ｍＰＥＧ−ＣＴとＥＰＯ反応の結果の混合物（２列、二つのバンド）及びＦＰＬＣシステムを利用した精製されたｍＰＥＧ−ＣＴ−ＥＰＯ（ＰＥＧ−ＥＰＯ、３列、一つのバンド）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果である。
【図１５】ＲＰ−ＨＰＬの結果のグラフで、黒線ピークはｍＰＥＧ−ＣＴ−ＥＰＯ（９８分）、ＥＰＯ混合物（１４０分）を意味し、赤線ピークは各単一ＰＥＧ（１０５分）、二重ＰＥＧ（９８分）、多重−ＰＥＧ（８５分）を意味する。
【図１６】単一ＰＥＧ−ＥＰＯ、多重−ＰＥＧ−ＥＰＯ、ＥＰＯの生体内の半減期を示したグラフである。
【図１７】単一ＰＥＧ−ＥＰＯとＥＰＯの赤血球の相対的容積（hematocrit）を測定したグラフである。
【発明の詳細な説明】
【００１８】
本発明は、下記化学式１のカテコール（catechol）を持つ化合物が結合されたポリエチレングリコール誘導体と前記誘導体が蛋白質またはペプチドのＮ末端アミン基に単一体で選択的に接合されていることを特徴とする蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体を提供する。
【化１】
【００１９】
本発明の発明者等は、前記公示技術の問題点を解決するために研究中、蛋白質のＮ末端アミン基と特異的に結合する作用基を発見し、これはドーパ基（3,4-dihydroxy-L-phenylalanine group）として、ムール貝接着物質に多く含まれているアミノ酸（amino acid）として知られている。ドーパミンあるいはより広くはカテコールに対する研究としては、本発明の発明者によって発表された研究論文により、多様な表面にカテコール基が吸着できることを証明し、このような接着力を利用して、蛋白質を選択的に多様な表面にコーティングできることを証明した（H. Lee, PNAS, 103, 12999, 2006; H. Lee, Science, 318, 426, 2007; H. Lee, Adv. Mater. 21, 431, 2009）。
【００２０】
従って、本発明は、ポリエチレングリコールにカテコールを持つ化合物を結合させて、反応性を持つポリエチレングリコール誘導体を使う。前記のようなポリエチレングリコール誘導体は、蛋白質またはペプチド等のＮ末端アミン基に選択的に結合して、接合体を形成でき、この場合、ポリエチレングリコール誘導体は蛋白質またはペプチドの特定部位に単一分子で接合され（site-specific mono-PEGylation）、蛋白質またはペプチドの生理活性度が維持されると同時に、生体内で持続性と安全性が増加した蛋白質またはペプチド製剤を製造することができる。また、蛋白質／ペプチド等の誘導体を製造する際に発生する加水分解に非常に安定したカテコール基を利用することによって、反応効率が長時間維持できる長所がある。
【００２１】
本発明に使われた用語「ポリエチレングリコール」は、当業界で一般的にＰＥＧ、Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌと併用して使われる用語であり、また下記メトキシアルデヒドポリエチレングリコール等の誘導体の概念を含む。
【００２２】
本発明で使われるポリエチレングリコールは、メトキシアルデヒドポリエチレングリコール、スクシンイミドプロピオン酸ポリエチレングリコール、メトキシスクシンイミドブタン酸ポリエチレングリコール、メトキシスクシンイミジルコハク酸ポリエチレングリコール、メトキシベンゾトリアゾールカルボン酸ポリエチレングリコール、メトキシエポキシドポリエチレングリコール、メトキシカルボニルイミダゾールポリエチレングリコール、メトキシｐ−ニトロフェニルカルボン酸ポリエチレングリコール、メトキシイソシアン酸ポリエチレングリコール、一級アミンを含むメトキシアミンポリエチレングリコール、メトキシヒドラジドポリエチレングリコール及びカルボキシル基を含むメトキシカルボキシルポリエチレングリコールからなる群より選択される一つであることが好ましいか、これに限定されない。前記ポリエチレングリコールは、アミン基またはカルボキシル基と反応でき、カテコール基と結合して、誘導体を形成することができる。
【００２３】
また、前記ポリエチレングリコールとしては、直線型、分枝型、ブラシ型、またはスター型のような全種類のポリエチレングリコールが使える。
【００２４】
本発明で使われるカテコールを持つ化合物は、カルボキシル基とアミン基を含むジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン（3,4-dihydroxy-L-phenylalanine）、アミン基を含む３−ヒドロキシ−チラミン（3-hydroxy-tyramine）、カルボキシル基を含む３，４−ジヒドロキシヒドロけい皮酸（3,4-dihydroxy hydrocinnamic acid）、アルデヒド基を含む３，４−ジヒドロキシベンゾアルデヒド（3,4-dihydroxybenzaldehyde）及びノルエピネフリン（Norepinephrine）で形成された群から選択される一つであることが好ましいか、これに限定されるのではない。さらに、本発明で使われるカテコールを持つ化合物の分子量は、１，０００以下であることが好ましい。
【００２５】
本発明に係るポリエチレングリコール誘導体の分子量は、好ましくは５００〜１００，０００であり、最も好ましくは２，０００〜４０，０００である。分子量が１００，０００を超えるとポリエチレングリコール誘導体を確保し難く、製造上の問題が生じ、５００未満の場合ポリエチレングリコールが液状形態になって、物理的性質による問題が生じる等、反応効率性が落ちる問題がある。
【００２６】
ポリエチレングリコール誘導体が蛋白質に接合される場合、増加した分子量を持った蛋白質−ポリエチレングリコール誘導体の接合体を得られ、これによって腎臓でのろ過効果による蛋白質の透過を抑制できる長所がある。また、ポリエチレングリコールのステルス作用によって、生体内の蛋白質酵素による分解を抑制する効果が現れ、これは、生体内において半減期及び安全性を増加させる長所を意味する。
【００２７】
本発明に係る蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体は、前記の通り特定部位に単一分子で接合するため、不均一な接合体混合物が生成される問題を防止できる長所がある。これによって、薬物の持続効果と安全性を測定する場合、信頼すべきデータを得ることができ、所望の生物学的活性または体内活性を持つ薬物を容易に製造することができるようにする長所がある。またＮ末端という特定部位に接合するため、蛋白質薬物の化学的変形が全くないまま薬理学的効果を最大化できる長所がある。
【００２８】
本発明で使われる前記蛋白質はリゾチーム、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、ウリカーゼ（mammalian urate oxidase，uricase）、及びアルギニンデイミナーゼ（arginine deiminase，ＡＤＩ）からなる群より選択される一つであってもよいが、これに限定されることなく、この時使われるリゾチーム、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＧＣＳＦ等のような蛋白質は、遺伝子組み換え方法によって産生されるもので、ほ乳動物から抽出する方式と、遺伝子のＤＮＡベクターから複製した後、原核生物、または真核生物宿主の発明をとおして得られる。一方、前記使われる原核生物の宿主は大腸菌（Escherichia coli）を含み、真核生物の宿主はメチロトローフ酵母（Hansenula polymorpha）、サッカロマイセス、セレビシエを含むと共に、ほ乳動物は、ラット、犬、及び豚等から各蛋白質を得ることができる。
【００２９】
本発明で使われる前記ペプチドは、ヒンジ−７（Hinge-7）、ヒンジ−３（Hinge-3）、ブフォリン（buforin）、ヒストニン（histonin）、プロテグリン（protegrin）、インドリシジン（indolicidin）、ヒスタチン（histatin）、ＢＩＰ、マガイニン２（magainin 2）、グルカゴン類似ペプチド（glucagon-like peptide：ＧＬＰ−１）、ＧＮＲＨ／ＬＨＲＨアゴニスト（GNRH/LHRH agonist）、ソマトスタチン類似体（somatostatin analogue）、免疫調節ペプチドのグラチラマー（glatiramer）、サーモンカルシトニン（salmon calcitonin）、テスモプレシン（desmopressin）、血小板凝固抑制ペプチド、エプチフィバチド（eptifibatide）、及びＨＩＶ細胞流入抑制剤であるエンフュービルタイド（enfuvirtide）で形成された群から選択される一つであってもよいが、これに限定されない。
【００３０】
また、本発明は、
（ａ）反応槽内の極性有機溶媒にポリエチレングリコールを溶解させる工程；
（ｂ）他の反応槽内の極性有機溶媒に架橋剤及び化学式１のカテコールを持つ化合物を溶解させる工程；
（ｃ）前記工程（ｂ）で製造された溶液にＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（N,N-Diisopropylethylamine；ＤＩＰＥＡ）を添加して、反応させる工程；及び
（ｄ）前記工程（ａ）の溶液に前記工程（ｃ）の溶液を添加して、反応させる工程を含む。
【００３１】
前記化学式１のカテコールを持つ化合物が結合されたポリエチレングリコール誘導体の製造方法を提供する。前記製造方法によって製造されたポリエチレングリコール誘導体は、蛋白質またはペプチドのＮ末端アミン基に単一体で接合できることを特徴とする。
【００３２】
以下、本発明を各工程別に詳細に説明する。
本発明に係る工程（ａ）及び工程（ｂ）は、反応物質の溶液を各々製造する工程である。物質を溶解させる溶媒として、極性有機溶媒が使えるが、好ましくはアルコール、ＤＭＳＯ（Dimethyl sulfoxide）、ＤＭＦ（Dimethylformaldehyde）、アセトン（Acetone）及びＮＭＰ（N-Methylpyrrolidone）が利用でき、最も好ましくはＤＭＦが使える。ＤＭＦは、カテコール基の酸化を防止できる。
【００３３】
カテコールを持つ化合物の溶液に添加される架橋剤は、ベンゾトリアゾリルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（Benzotriazolyloxytris(dimethylamino)phosphonium Hexafluorophosphate；ＢＯＰ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（Hydroxybenzotriazole；ＨＯＢｔ）、エチル−（ジメチルアミノ）プロピルカルボイミドハイドロクロライド（ethyl-(N',N’-dimethylamino)propylcarboiimide hydrochloride；ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（Dicyclohexylcarbodiimide；ＤＣＣ）、Ｎ−ジヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）及びシアノヒドリドほう酸ナトリウム（Sodium Cyanoborohydride）で構成された群で選択された一つ以上である。アミン基とカルボキシル基の結合に利用される架橋剤の好ましい一例としては、ＨＯＢｔ及びＢＯＰ；ＥＤＣ及びＮＨＳ；またはＤＣＣ及びＮＨＳが挙げられる。アミン基とアルデヒド基の結合に利用される架橋剤の好ましい一例として、シアノヒドリドほう酸ナトリウムが挙げられる。
【００３４】
例えば、ＢＯＰ及びＨＯＢｔは、ゼロオーダー（zero order）架橋剤として添加される。最も好ましい様態としては、ＢＯＰ：ＨＯＢｔ：カテコールを持つ化合物のモル比は、１：１：１〜１０：１０：１の範囲であることが好ましい。これは、モル比が前記範囲を超える場合、反応性が落ちる問題があるためである。
【００３５】
本発明に係る工程（ｃ）は、工程（ｂ）で製造されたカテコールを持つ化合物溶液にＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を添加して、反応させる工程である。本工程で、ＤＩＰＥＡは、有機ベース（base）としてカテコールを持つ化合物溶液に添加されると共に、添加後約１０〜２０分間反応させることが好ましい。
【００３６】
本発明に係る工程（ｄ）は、前記工程（ａ）で製造された溶液に前記工程（ｃ）で製造された溶液を添加して反応させる工程である。本工程の反応は、常温で約１０〜１４時間行われることが好ましい。本発明の一実施例によると、本工程によってメトキシポリエチレングリコールとカテコールを持つ化合物が接合されて、ポリエチレングリコール誘導体が形成されることを確認した。
【００３７】
さらに、本発明に係る工程（ｄ）の溶液を透析する（ｅ）工程を含む。本発明に係る工程（ｅ）は、反応終了後、未反応物質を取り除くため透析する工程である。前記透析は、分子量除去量が２，０００〜１０，０００である透析膜を利用して、１０〜１４時間行われることが好ましい。この時使われる透析溶液は、ｐＨが１〜６である蒸留水を使用することが好ましい。透析過程でのｐＨが前記範囲を終える場合、カテコールが酸化される問題が生じ好ましくない。
【００３８】
さらにまた、本発明に係る工程（ｅ）で透析された溶液を凍結乾燥する（ｆ）工程を含める。本発明に係る工程（ｆ）は、白粉状のポリエチレングリコール誘導体を得るため、透析が完了した溶液を凍結乾燥する工程である。これは当業者に自明な凍結乾燥方法で行われ、これを介して、溶媒が昇華された後、白粉状のポリエチレングリコール誘導体が得られる。この時、溶媒の完全除去のため、加えて乾燥が行われる。
【００３９】
さらに本発明は、
（ａ）反応槽内に蛋白質またはペプチドを溶解させる工程；
（ｂ）他の反応槽内に前記ポリエチレングリコール誘導体を溶解させる工程；及び
（ｃ）前記工程（ａ）の溶液を工程（ｂ）の溶液に添加して反応させる工程を含む、
ポリエチレングリコール誘導体が蛋白質またはペプチドのＮ末端アミン基に単一体で接合された蛋白質またはペプチドとポリエチレングリコール誘導体の接合体の製造方法を提供する。
【００４０】
以下、各工程を詳細に説明する。
本発明に係る工程（ａ）は、Ｎ末端アミン基を持つ蛋白質またはペプチドを反応槽内に溶解させる工程である。好ましくは、緩衝溶液に溶解させられ、使われる緩衝溶液は、リン酸塩緩衝溶液、イミダゾール緩衝溶液、トリメチルアミン緩衝溶液、トリエタノールアミン緩衝溶液、ソジウムジエチルバルビツレート緩衝溶液、ビシン（bicine）緩衝溶液、アミノメチルプロパンジオール緩衝溶液中で選択されたいずれかひとつが使える。また、前記緩衝溶液のｐＨは、好ましくは５．５〜１０である。緩衝溶液のｐＨが５．５未満の場合、反応性が落ちる問題があり、１０を超える場合、蛋白質またはペプチド薬物の安定性が低下する問題がある。
【００４１】
本発明に係る工程（ｂ）は、本発明で提供するポリエチレングリコール誘導体を他の反応槽内に溶解させる工程である。好ましくは、前記工程（ａ）のような緩衝溶液に溶解させられる。
【００４２】
本発明に係る工程（ｃ）は、本発明に係る工程（ａ）の溶液を工程（ｂ）の溶液に添加して反応させる工程で、ペグ化反応を行う工程である。前記ペグ化反応は、２〜１００時間、４〜３５℃で行うことが好ましい。
【００４３】
また、ポリエチレングリコール誘導体の活性度を増加する酸化剤は、好ましくは、ＮａＩＯ４、ＭｎＣｌ２、ＦｅＣｌ２、ＦｅＣｌ３、ＫＭｎＯ４、Ｈ２Ｏ２、Ｎａ２Ｃｒ２Ｏ７、Ｎａ３ＶＯ４で構成された群で選択される一つ以上である。酸化剤は、ポリエチレングリコール誘導体の溶解時に添加して、反応を進められ、この時添加される酸化剤は、カテコール基と１：１〜１：１０のモル比を持つことが好ましい。最も好ましくは、ＮａＩＯ４を１．５：１のモル比で添加して、反応を進められる。反応時間が２時間未満であれば、ポリエチレングリコールの接合効率が低くなる問題があり、１００時間を越えると蛋白質またはペプチドの安定性が低下する問題がある。また、反応温度が４℃未満であると、反応速度が遅くなりすぎる問題があり、３５℃を超える場合、蛋白質またはペプチドが変形される問題がある。
【００４４】
また、本発明に係る工程（ｃ）以降、工程（ｃ）の溶液を透析した後、接合体を分離する工程（ｄ）をさらに実施することが好ましい。本発明に係る工程（ｄ）は、前記ペグ化反応終了後、未反応物質を取り除くため透析するか、または液状クロマトグラフィー（ＨＰＬＣまたはＦＰＬＣ）を利用して分離する工程である。前記工程は当業者に自明な透析方法、または液体クロマトグラフィー方法を利用して行う。
【実施例】
【００４５】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００４６】
実施例１：カテコール−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体の合成
カテコールを持つ化合物が結合されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体を合成するために、ＰＥＧの一例であるメトキシポリエチレングリコールを使って、カテコールを持つ化合物の一例である３，４−ジヒドロキシ桂皮酸を利用した。
【００４７】
アミン基を末端に持っているメトキシポリエチレングリコール（methoxy-polyethyleneglycol；ｍ−ＰＥＧ，ＭＷ：５ｋ）１０００ｍｇを反応槽内の１５ｍＬの極性有機溶媒であるＤＭＦ（dimethylformamide）溶液内で、３，４−ジヒドロキシけい皮酸（ＨＣＡ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、ベンゾトリアゾリルオキシトリスホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）と共にかき混ぜて７２０分間反応させた。使われた化合物の量は、各々３８ｍｇ、１１０ｍｇ及び４４μＬであった。一方、溶媒として使われたＤＭＦは、ＨＣＡのカテコール基の酸化を防止できるため好ましい。
【００４８】
図１に示したような反応が終了した後、残っている未反応物質を取り除くために、２４時間透析過程を経た後、凍結乾燥して、白粉状の３，４−ジヒドロキシ桂皮酸−ＰＥＧを収得して、カテコールを持っているＰＥＧ誘導体（以下、ｍＰＥＧ−ＣＴ）が合成されたことを確認した。
【００４９】
実施例２：ｍＰＥＧ−ＣＴを利用したＰＥＧ−ヒンジ−３接合体の製造及び製造形態確認
（１）ｍＰＥＧ−ＣＴを利用したＰＥＧ−ヒンジ−３接合体の製造
ポリエチレングリコール誘導体とペプチドを接合させるために実施例１の方法と同様にｍＰＥＧ−ＣＴを準備した（図１）。即ち、ｍＰＥＧ−ａｍｉｎｅ（ＭＷ：５ｋ）及びＨＣＡをＤＭＦ溶液内でＨＯＢｔ、ＢＯＰ、ＤＩＰＥＡと共に反応させて、ｍＰＥＧ−ＣＴを収得した。
その後、弱酸性条件で（ｐＨ６．５）、ｍＰＥＧ−ＣＴ及びヒンジ−３ペプチド（図２参照）を４度で混合して反応させた。その結果、ＰＥＧ−ヒンジ−３接合体が成功的に製造された。
（２）ＲＰ−ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを介した単一ペグ化の可否確認
前記実施例２−（１）で製造されたＰＥＧ−ヒンジ−３接合体の形態がヒンジ−３ペプチドにＰＥＧが単一体で接合した形態か否かを確認するために、ＲＰ−ＨＰＬＣ（Reverse phase-High performance liquid chromatography）及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight）分析を行った。
ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍは、Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ ｓｅｒｉｅｓを使って、カラムはｓｕｐｅｌｃｏ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（商標） ＢＩＯ Ｗｉｄｅ Ｐｏｒｅ Ｃ１８ ５ｃｍ×４．６ｍｍ，３μｍを使った。移動相は、水（０．１％ＴＦＡ）：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）＝９５：５から３０分まで水（０．１％ＴＦＡ）：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）＝５：９５で流し、３５分まで再び水９５％に合わせて流した。
【００５０】
その結果、図３に示したように、ＲＰ−ＨＰＬの結果、二つのピークだけが検出された。この二つのピークは、各々変形されないヒンジ−３（１６．２分）、単一ペグ化ヒンジ−３（１７分）を示しており、多重ペグ化は起きず単一ペグ化だけ起きたことを確認することができた。
【００５１】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析のために、アセトニトリル（Acetonitrile）溶液（０．１％トリフルオロ酢酸（trifluoroacetic acid：ＴＦＡ））を水（０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））と１：１比となるよう混ぜた後、ジップチップ（zip tip）を使ってチップの先にある固定相に蛋白質を吸着させた後、水で洗浄して緩衝溶液に入っている塩を取り除き、１：１のアセトニトリル、水の混合液を使って純粋なＰＥＧ−ヒンジ−３のみを精製して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ用プレートに乗せて試料を準備した後、分析を行った。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析機器は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ社のＶｏｙａｇｅｒ ＤＥ−ＳＴＲ機器を使った。
【００５２】
その結果、図４に示したように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析結果もＰＥＧ（ＭＷ：５０００）及び単一ＰＥＧ−ヒンジ−３（ＭＷ：７２３８）だけが検出されたため、カテコール−ポリエチレングリコール誘導体を利用して、ペプチド−ポリエチレングリコール接合体を製造する場合、ポリエチレングリコールが単一体でペプチドに接合されたことを確認した。
【００５３】
（３）トリプシン分解を介した単一ペグ化位置確認
前記実施例２−（１）で製造されたＰＥＧ−ヒンジ−３接合体の形態が、ヒンジ−３ペプチドのＮ末端位置に特異的に接合された形態か否かを確認するために、ｔｒｙｐｔｉｃ分解方法後、ＲＰ−ＨＰＬ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を行った。ヒンジ−３と命名されたペプチドは、２０個のアミノ酸を持っている（図２参照）。一方、露出された一級アミン、潜在的ペグ化位置は、合わせて７個で、リシン（Ｋ）の６個のエプシロン−アミングループとＮ末端のアルファ−アミングループである。全てのアミンは、ペグ化位置の候補である（図５参照）。従って、これらの位置中、Ｎ末端のアルファ−アミングループにだけペグ化されたかを確認した。ヒンジ−３配列は、ただ一つのトリプトファンアミノ酸を含有するため（図２参照）、トリプシン分解でヒンジ−３蛋白質が分解される場合、Ｎ末端にだけＰＥＧが接合されたか否かをその切片の形態で確認することができた。
【００５４】
ヒンジ−３ペプチドはシステインを持っていないため、４Ｍウレア（Urea）に溶かした状態で少量の塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）の添加後、直ちにトリプシンの量を蛋白質の１／２０の割合で溶解させて、３７℃で１２時間トリプシン分解過程を実行した。その後、ＲＰ−ＨＰＬ分析を行った。
【００５５】
その結果、図６のようなグラフが観測された。２８０ｎｍＵＶで、トリプトファン残基だけが検出された。これが、分解されたヒンジ−３がＴ１切片（検定１３ｍｉｎ）で単一ピークだけが見られる理由である。仮に、カテコールがエプシロン−アミン（Ｋ１２、Ｋ１３、Ｋ１６、Ｋ１７、Ｋ２０）と反応したとすると、単一切片のピークは変わらない。しかし、図６に示された結果のように、単一切片のピークは確かに減少した（赤線）。即ち、カテコールグループによって、ピークの強度はＴ１切片が存在する時にだけ増加した。前ピーク（１３分、赤線）の存在は、十分な希釈過程を経なかったためである（ＭＷＣＯ：６０００で希釈）。
【００５６】
ＲＰ−ＨＰＬ分析後、ペグ化候補は、Ｋ９とＮ末端アミンだけが残るようになる。仮に、ｍＰＥＧ−ＣＴがＫ９と反応したとすると、トリプシンがペグ化されたリシン（Ｋ９）を認識できないため、ペグ化され消化された切片、即ちｍＰＥＧ−ＣＴとＴ１＋２切片が加わった分子量は６２５４．４９になる。従って、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を介して、ｍＰＥＧ−ＣＴがどの位置にペグ化されたかを分析した。分析方法は、前記実施例２−（２）で行われた方法と同様である。
【００５７】
その結果を図７に示した。図７によると、２個のピークだけが存在する：５０００、５８８３。この結果によると、５０００ピークは、ｍＰＥＧ−ＣＴで、５８８３ピークは、ｍＰＥＧ−ＣＴとヒンジ−３のＴ１切片（ＭＷ：８９９）が加わったことが確実で、ｍＰＥＧ−ＣＴとＴ１＋２切片が加わった分子量６２５４．４９は観測されなかったため、この５８８３ピークはＮ末端ペグ化の確実な証拠である。これにより、実施例２−（１）でｍＰＥＧ−ＣＴを利用して製造されたＰＥＧ−ヒンジ−３接合体は、ヒンジ−３ペプチドのＮ末端にＰＥＧが単一体の形態で接合された形態であることを確認した。
【００５８】
実施例３：ｍＰＥＧ−ＳＳ及びｍＰＥＧ−ＣＴを利用したＰＥＧ−リゾチーム接合体との比較
（１）ｍＰＥＧ−ＳＳを利用したＰＥＧ−リゾチーム接合体の製造
ペプチドだけでなく、蛋白質もＮ末端ペグ化できる。従来、アミンペグ化させる最も有用な方法は、表面露出された一級アミングループと共有結合を生成できるスクシンイミジルコハク酸（succinimidyl succinate）を使うことであった。しかし、このような方法は位置特異的でない問題があった。
カテコールグループとは異なって、スクシンイミジルコハク酸は、無作為的な一級アミン基と反応するためである（図８）。従って、蛋白質の例としてリゾチームを利用して、カテコールグループとスクシンイミジルコハク酸を比較するために、ｍＰＥＧ−ＳＳを利用してＰＥＧ−リゾチーム接合体を製造した。
一般に知らされた条件であるｐＨ８．５でｍＰＥＧ−ＳＳ２０ｍｇとリゾチーム５ｍｇを入れて、４℃で１２時間反応をさせてＰＥＧ−リゾチーム接合体を製造した。
その結果、ＰＥＧ−リゾチーム接合体が製造されたことを確認した。
【００５９】
（２）ｍＰＥＧ−ＣＴを利用したＰＥＧ−リゾチーム接合体の製造
実施例１のｍＰＥＧ−ＣＴを利用してＰＥＧ−リゾチーム接合体を製造するために、実施例２−（１）と同様に製造したが、蛋白質の特性を考慮してｐＨ８．５でｍＰＥＧ−ＣＴ（５ｋ）５ｍｇをリゾチーム５ｍｇと共に混ぜて４度で１２時間混合した。
その結果、ＰＥＧ−リゾチーム接合体が製造されたことを確認した。
【００６０】
（３）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｇｅｌ分析方法を利用した単一または多重ペグ化有無確認
前記実施例３−（１）及び３−（２）のＰＥＧ−リゾチーム接合体に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｇｅｌ分析を行って、前記接合体が単一ペグ化された形態であるか、多重ペグ化された形態であるかを確認した。
アクリルアミド（Acrylamide）分率が１５％のであるＤＳ ＰＡＧＥ Ｇｅｌを製造し電圧をかけて、リゾチーム及びＰＥＧ−リゾチーム接合体を大きさに応じて分離した。
【００６１】
その結果を図９に示した。図９の１列目はリゾチームだけを対照群としてかけたもので、２列目は実施例３−（１）のＰＥＧ−リゾチーム接合体、３列目は実施例３−（２）のＰＥＧ−リゾチーム接合体をローディングした結果である。その結果、２列目のメトキシ−ポリエチレングリコールスクシンイミジルコハク酸（ｍＰＥＧ−ＳＳ）を利用して製造した接合体は、３個のアミン基と反応した（バンドが３つ現れる）Ｋ３３、Ｋ９７、Ｋ１１６）。しかし、３列目で確認できるように、ｍＰＥＧ−ＣＴを利用して製造したＰＥＧ−リゾチーム接合体は、ただ一つのバンドだけが見られたため、ただ一つのアミン基と反応したことが分かった。これにより、スクシンイミジルコハク酸−ＰＥＧ誘導体とは異なって、カテコール−ＰＥＧ誘導体の場合、蛋白質と接合するに当たり、単一体の形態で接合されたことを確認した。
【００６２】
実施例４：ｍＰＥＧ−ＣＴを利用したＰＥＧ−ｂＦＧＦ接合体の製造及び製造形態確認
（１）ｍＰＥＧ−ＣＴまたはｍＰＥＧ−ＳＳを利用したＰＥＧ−ｂＦＧＦ接合体の製造
ｂＦＧＦ（ＭＷ：１７．１ｋＤａ）は、塩基性線維芽細胞成長因子（basic Fibroblast Growth Factor）であり、ＦＧＦの一種である。成体器官で、傷反応及び組織再生に対して機能する。前記実施例２−（１）で使った方法と同様にｍＰＥＧ−ＣＴを利用してＰＥＧ−ｂＦＧＦ接合体を製造して、その結果ＰＥＧ−ｂＦＧＦ接合体が製造されたことを確認した。
一方、実施例３−（１）と同様な方法でｍＰＥＧ−ＳＳを利用してＰＥＧ−ｂＦＧＦ接合体を製造した。
【００６３】
（２）ＳＤＳ ＰＡＧＥ Ｇｅｌ分析を介した単一ペグ化の可否確認
実施例２−（２）と同様な方法でＰＥＧ−ｂＦＧＦのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を介して、単一体にペグ化されたか否かに対して確認した。ただｐＨ値は異ならせて実験した。それは、Ｎ末端アミンの環境は異なるため、互いに異なったｐＫａ値を持つためである。ｂＦＧＦは、ｐＨ６．５でペグ化の可否を観察した。
【００６４】
その結果を図１０のＡに示した。
図１０のＡの２列目にローディングされた蛋白質は、ｍＰＥＧ−ＣＴを使ってｐＨ６．５でペグ化を行った結果であるが、既存ｂＦＧＦのバンドとモノペグ化されたＰＥＧ−ｂＦＧＦ接合体のバンド、二つのバンドを観察することができ、３列目にローディングされた蛋白質は、これをＦＰＬＣで分離して、精製したモノペグ化されたＰＥＧ−ｂＦＧＦ接合体である。これにより、カテコール−ポリエチレングリコール誘導体を利用して、蛋白質−ポリエチレングリコール接合体を製造する場合、ポリエチレングリコールが単一体で蛋白質に接合されることを確認した。
【００６５】
（３）トリプシン分解を介したペグ化位置確認
実施例２−（３）と同様な方法でＰＥＧ−ｂＦＧＦのトリプシン分解を介してペグ化位置を確認した。
その結果、図１０のＣに示したように、Ｔ１切片ピークは７４６８で観察された。変形されないｂＦＧＦのＴ１切片の分子量は２４９５であるため（図１０のＢ）、７４６８ピークはｍＰＥＧ−ＣＴ（ＭＷ：５０００）とｂＦＧＦのＴ１切片（ＭＷ：２４９５）が加わったことが確実になったため、この７４６８ピークはＮ末端ペグ化の確実な証拠である。これにより、ｍＰＥＧ−ＣＴを利用して製造されたＰＥＧ−ｂＦＧＦ接合体は、ｂＦＧＦ蛋白質のＮ末端にＰＥＧが単一体の形態で接合された形態であることを確認した。
【００６６】
実施例５：ｍＰＥＧ−ＣＴを利用したＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ接合体の製造及び製造形態確認
（１）ｍＰＥＧ−ＣＴまたはｍＰＥＧ−ＳＳを利用したＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ接合体の製造
Ｇ−ＣＳＦ（Granulocyte Colony-Stimulating Factor；ＭＷ：１８．８ｋＤａ）もヒト血液システムの最も重要な蛋白質であり、骨髄を刺激して、血流に放出されるようにする役割を果たす。前記実施例２−（１）と同様な方法でＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ接合体を製造し、その結果ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ接合体が製造されたことを確認した。
一方、実施例３−（１）と同様な方法でｍＰＥＧ−ＳＳを利用してＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ接合体を製造した。
（２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｇｅｌ分析を介したペグ化の可否確認
実施例２−（２）と同様な方法でＰＥＧ−ｂＦＧＦのＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｇｅｌ分析及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を介して、単一体にペグ化されたか否かに対して確認した。
【００６７】
その結果を図１１に示した。
図１１のＡに示したように、ｍＰＥＧ−ＣＴを使ってペグ化させた結果、ペグ化される前のＧ−ＣＳＦとモノペグ化されたＧ−ＣＳＦバンドだけを観察することができ（２列目）、これをＦＰＬＣで精製した結果、モノペグ化されたＧ−ＣＳＦだけを分離することができた（３列目）。これにより、Ｇ−ＣＳＦ蛋白質に対し単一体にペグ化されたことを確認した。
【００６８】
（３）トリプシン分解を介したＮ末端に単一ペグ化されたか否かの確認
実施例４−（３）と同様な方法で、Ｇ−ＣＳＦ及びＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦのトリプシン分解を介してペグ化位置を確認した。
その結果、図１１のＢに示したように、Ｇ−ＣＳＦのトリプシン分解のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの結果、Ｔ１切片の分子量は１７９２であった。一方、図１１のＣに示したように、カテコール−ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦのトリプシン分解のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの結果、Ｔ１の分子量は６７９２であった。従って、前記結果はＴ１切片とＰＥＧ（ＭＷ：５０００）が加わった結果と考えられるため、このことからスクシンイミジルコハク酸−ＰＥＧ誘導体とは異なって、カテコール−ＰＥＧ誘導体の場合、蛋白質と接合されるに当たり、単一体の形態で接合されたことを確認した。
【００６９】
前記実施例１〜５から、成功的にカテコールを持つ化合物が結合されたポリエチレン誘導体（ＰＥＧ−ＣＴ）を合成し、ＰＥＧ−ＣＴを蛋白質またはペプチドに接合させる場合、単一体の形態でＮ末端特異的に結合が可能であることを確認した。
【００７０】
実施例６：過ヨウ素酸ナトリウム（Sodium Periodate）を利用したペグ化効率増進
ペグ化効率を増進させるために、酸化剤である過ヨウ素酸ナトリウムを使った。低ｐＨ条件でアルファアミン（Ｎ末端アミン）はエプシロンアミン（リシン残基アミン）に比べてＮＨ３＋陽イオン形態で存在する比が高い。このため、Ｎ末端アミンだけが過ヨウ素酸塩によって酸化されたキノンと反応することができる。従って、それぞれ違異なる過ヨウ素酸ナトリウム比率条件下でペグ化を行った。
ｐＨ６．０のバッファー溶液に５ｍｇのリゾチーム、５ｍｇのｍＰＥＧ−ＣＴを溶かして４℃で７２０分間反応させた。この時、過ヨウ素酸ナトリウムは、ｍＰＥＧ−ＣＴと各々０、０．５、１、２：１の割合で添加した。
対照群実験は実施例３−（２）と共に実験した。
【００７１】
その結果を図１２、１３にｐＨ６．０以下で互いに異なる過ヨウ素酸塩比率でペグ化効率を比較して示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｇｅｌの最後のカラム及びグラフのｐＨ８．５のペグ化収率の値は、化学反応のないまま形成された対照群である。実験結果、最も収率が高いのは、過ヨウ素酸塩：カテコールが１．５：１である時に５７．９４％と示された。
【００７２】
実施例７：ＰＥＧ−ＥＰＯ接合体の生体内の持続時間確認（ｉｎ ｖｉｖｏ）
（１）ｍＰＥＧ−ＣＴまたはｍＰＥＧ−ＳＳを利用したＰＥＧ−ＥＰＯ接合体の製造及び確認
エリスロポエチン（ＭＷ：３０ｋＤａ）は、腎臓で生成されるホルモンで、骨髄で赤血球の生成を促進する。最も重要な機能は、赤血球の分化と発生を促進することである。本実験では、ｍＰＥＧ−ＣＴ（ＭＷ：３０ｋＤａ）を使っているが、その理由は少なくとも２０ｋＤａのＰＥＧを付着するペグ化がｉｎ ｖｉｖｏ環境で効果があるためである。
【００７３】
実施例２−（１）及び３−（１）に記載された方法で製造する際に、ｍＰＥＧ−ＣＴとＥＰＯを反応させる時、過ヨウ素酸ナトリウムを１．５：１の割合で添加しており、ｐＨ環境は７．５であった。ｐＫａ値が蛋白質毎に異なるため、リゾチームに比べて多少高いｐＨ条件を使った。反応終了後、ＰＥＧ接合されたＥＰＯをＦＰＬＣシステム（Ｓｈｅｐｈａｃｒｙｌ ＴＭ Ｈｉｐｒｅｐ ２６／６０ Ｓ−２００−ＨＲ ３２０ｍＬ）を利用して精製した。
【００７４】
その結果を図１４及び図１５に示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｇｅｌの結果から分かるように、ＦＰＬＣ過程後、ＥＰＯ混合物（図１５において、黒線、１４０分）及びｍＰＥＧ−ＣＴ−ＥＰＯ（ＰＥＧ−ＥＰＯ、図１４において、２番目のｌｉｎｅまたは図１５において、黒線、９８分）が完璧に精製された（図１４において３番目のｌｉｎｅ）。ペグ化収得率は７７％であった。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの結果から単一ペグ化ＥＰＯを確認することができた（ｄａｔａ ｎｏｔ ｓｈｏｗｎ）。
【００７５】
ｍＰＥＧ−ＳＳ（ＭＷ：２０ｋＤａ）を蛋白質多重−ペグ化対照群として使った。単一ペグ化ＥＰＯは１０５分で、２重ペグ化ＥＰＯ（di-PEGylated）は９５分で検出され、ＦＰＬＣで精製した（図１５、赤線）。ピークは、８５分で検出され、これは接合された蛋白質及び多重−ペグ化蛋白質を示すものである。ペグ化は、ｍＰＥＧ−ＣＴに比べてｍＰＥＧ−ＳＳがずっと低い収率で形成されたが、比較の便宜のために図面では高さを調整して示した。
【００７６】
（２）Ｉｎ ｖｉｖｏ持続時間確認
Ｉｎ ｖｉｖｏ薬物動態学（pharmacokinetic）実験のために、陽性対照群として多重−ペグ化ＥＰＯ、即ち、前記実施例７−（１）で製造したｍＰＥＧ−ＳＳを利用して製造した多重ＰＥＧ−ＥＰＯを使った。
マウスに対して１００μｇ蛋白質／ｋｇ（マウス体重）の量を静脈注射でＥＰＯを投入後、Ｉｎ ｖｉｖｏを循環する時間を測定した。各蛋白質に対し、５匹のマウスを使って、各マウスに〜２．５μｇの蛋白質を注入した。これは、転化因子が２．５６×１０４ｍＩＵだと仮定した時、６．４×１０４ｍＩＵのＥＰＯに該当する量である。プラズマの蛋白質はＥＬＩＳＡで定量し、定量値は各蛋白質サンプル、即ちＰＥＧ−ＥＰＯ、多重ＰＥＧ−ＥＰＯとＥＰＯの各々異なるＥＬＩＳＡ抗体の親和度に応じて調整した。
【００７７】
その結果を図１６に示した。図１６に示したように、全ての蛋白質サンプルの半減期は、約４〜９６時間と測定された。初期（０．２５〜４時間）において類似する傾向を示したものの、正確な半減期を測定するには多少不正確な結果と考えられる。中期（４〜４８時間）において、ＥＰＯは循環しており、６時間の半減期を持つ。また、注射後７２時間、血漿（plasma）から検出されなかった。多重ＰＥＧ−ＥＰＯはさらに半減期が長かった（３０時間）。ただ、後期（４８〜９６時間）において、より速い半減期を持った（１５時間）。一方、単一ＰＥＧ−ＥＰＯは、最も長い半減期（３０時間）を持っており、最も長い時間（９６時間）観察された。この結果から、多重ＰＥＧ−ＥＰＯと単一ＰＥＧ−ＥＰＯは、長い半減期によって通常のＥＰＯより優れた効能を示し、単一ＰＥＧ−ＥＰＯが多重ＰＥＧ−ＥＰＯより優れた半減期を持つことを確認し、生体内で持続時間が長く、蛋白質薬物の体内薬効及び安全性を極大化する可能性があることが予測された。
【００７８】
（３）生物学的活性測定
生物学的活性を測定するために、血サンプルにある血液の容積に対する赤血球の相対的容積比率（hematocrit）を測定した。
マウスから抽出した血にＥＤＴＡを混ぜて凝固を防いだ後、ＶｅｔＳｃａｎ ＨＭ５（Ａｂａｘｉｓ社）を使って、赤血球の相対的容積比率を測定した。
【００７９】
その結果、図１７に示したように、注射後０日から３日間、ＥＰＯとＰＥＧ−ＥＰＯは類似する活性を持っており、７〜１０日後にも同様であった。ただ、ＥＰＯはｉｎ ｖｉｖｏ活性を１４日目に多くが喪失したのに対して、ＰＥＧ−ＥＰＯの場合、そのまま効果が維持された。この結果から、蛋白質薬物の化学的変形がない本発明によると、蛋白質薬物の体内薬効が優れたものになると予測される。
【００８０】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明によると、カテコール−ＰＥＧ誘導体が蛋白質またはペプチドの特定部位であるＮ末端アミングループに位置特異的かつ単一分子で結合して、均一なポリエチレングリコール蛋白質、またはペプチド接合体を高い収率で収得することができる。収得された接合体は、従来技術に比べて、蛋白質自体の化学的変形がないまま、蛋白質活性度阻害を最小化できて、接合体の薬学的効果が優れ、その均質性によって製造工程を単純化でき、また生体内での生物学的薬効性が均一に予測され、加水分解に強く、生体内の持続時間が長くなるため、蛋白質薬物の体内薬効及び安全性を増進させる効果がある。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式１のカテコールを持つ化合物が結合されているポリエチレングリコール誘導体：
【化１】
【請求項２】
前記誘導体は蛋白質またはペプチドのＮ末端アミン基に単一体で接合できることを特徴とする請求項１に記載のポリエチレングリコール誘導体。
【請求項３】
前記ポリエチレングリコールは、メトキシアルデヒドポリエチレングリコール、スクシンイミドプロピオン酸ポリエチレングリコール、メトキシスクシンイミドブタン酸ポリエチレングリコール、メトキシスクシンイミジルコハク酸ポリエチレングリコール、メトキシベンゾトリアゾールカルボン酸ポリエチレングリコール、メトキシエポキシドポリエチレングリコール、メトキシカルボニルイミダゾールポリエチレングリコール、メトキシｐ−ニトロフェニルカルボン酸ポリエチレングリコール、メトキシイソシアン酸ポリエチレングリコール、一級アミンを含むメトキシアミンポリエチレングリコール、メトキシヒドラジドポリエチレングリコール及びカルボキシル基を含むメトキシカルボキシルポリエチレングリコールからなる群より選択される一つであることを特徴とする請求項１に記載のポリエチレングリコール誘導体。
【請求項４】
前記ポリエチレングリコールとしては、直線型、分枝型、ブラシ型、及びスター型からなる群より選択される一つであることを特徴とする請求項１に記載のポリエチレングリコール誘導体。
【請求項５】
前記カテコールを持つ化合物は、カルボキシル基とアミン基を含むジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン、アミン基を含む３−ヒドロキシ−チラミン、カルボキシル基を含む３，４−ジヒドロキシヒドロけい皮酸、アルデヒド基を含む３，４−ジヒドロキシベンゾアルデヒド及びノルエピネフリンからなる群より選択される一つであることを特徴とする請求項１に記載のポリエチレングリコール誘導体。
【請求項６】
前記カテコールを持つ化合物の分子量は、１，０００以下であることを特徴とする請求項１に記載のポリエチレングリコール誘導体。
【請求項７】
前記誘導体の分子量は、５００〜１００，０００Ｄａであることを特徴とする請求項１に記載のポリエチレングリコール誘導体。
【請求項８】
下記化学式１のカテコールを持つ化合物が結合されているポリエチレングリコール誘導体が蛋白質またはペプチドのＮ末端アミン基に単一体で接合されていることを特徴とする蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体：
【化２】
【請求項９】
前記ポリエチレングリコールは、メトキシアルデヒドポリエチレングリコール、スクシンイミドプロピオン酸ポリエチレングリコール、メトキシスクシンイミドブタン酸ポリエチレングリコール、メトキシスクシンイミジルコハク酸ポリエチレングリコール、メトキシベンゾトリアゾールカルボン酸ポリエチレングリコール、メトキシエポキシドポリエチレングリコール、メトキシカルボニルイミダゾールポリエチレングリコール、メトキシｐ−ニトロフェニルカルボン酸ポリエチレングリコール、メトキシイソシアン酸ポリエチレングリコール、一級アミンを含むメトキシアミンポリエチレングリコール、メトキシヒドラジドポリエチレングリコール及びカルボキシル基を含むメトキシカルボキシルポリエチレングリコールからなる群より選択される一つであることを特徴とする請求項８に記載の蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体。
【請求項１０】
前記ポリエチレングリコールとしては、直線型、分枝型、ブラシ型、及びスター型からなる群より選択される一つであることを特徴とする請求項８に記載の蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体。
【請求項１１】
前記カテコールを持つ化合物は、カルボキシル基とアミン基を含むジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン、アミン基を含む３−ヒドロキシ−チラミン、カルボキシル基を含む３，４−ジヒドロキシヒドロけい皮酸、アルデヒド基を含む３，４−ジヒドロキシベンゾアルデヒド及びノルエピネフリンからなる群より選択される一つであることを特徴とする請求項１０に記載の蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体。
【請求項１２】
前記カテコールを持つ化合物の分子量は、１，０００以下であることを特徴とする請求項８に記載の蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体。
【請求項１３】
前記ポリエチレングリコール誘導体の分子量は、５００〜１００，０００Ｄａであることを特徴とする請求項８に記載の蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体。
【請求項１４】
前記蛋白質はリゾチーム、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、黄体化ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、ウリカーゼ（uricase）、及びアルギニンデイミナーゼ（ＡＤＩ）からなる群より選択される一つであることを特徴とする請求項８に記載の蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体。
【請求項１５】
前記ペプチドは、ヒンジ−７、ヒンジ−３、ブフォリン、ヒストニン、プロテグリン、インドリシジン、ヒスタチン、ＢＩＰ、マガイニン２、グルカゴン類似ペプチド（ＧＬＰ−１）、ＧＮＲＨ／ＬＨＲＨアゴニスト、ソマトスタチン類似体、免疫調節ペプチドのグラチラマー、サーモンカルシトニン、テスモプレシン、血小板凝固抑制ペプチド、エプチフィバチド、及びＨＩＶ細胞流入抑制剤のエンフュービルタイドからなる群より選択される一つであることを特徴とする請求項８に記載の蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体。
【請求項１６】
次の工程を含む、下記化学式１のカテコールを持つ化合物が結合されているポリエチレングリコール誘導体の製造方法：
【化３】
（ａ）反応槽内の極性有機溶媒にポリエチレングリコールを溶解させる工程；
（ｂ）他の反応槽内の極性有機溶媒に架橋剤及び化学式１のカテコールを持つ化合物を溶解させる工程；
（ｃ）上記工程（ｂ）で製造された溶液にＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を添加して、反応させる工程；及び
（ｄ）上記工程（ａ）の溶液に上記工程（ｃ）の溶液を添加して、反応させる工程。
【請求項１７】
前記極性有機溶媒はアルコール、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、アセトン及びＮＭＰからなる群より選択される一つ以上であることを特徴とする請求項１６に記載の化学式１のカテコールを持つ化合物が結合されているポリエチレングリコール誘導体の製造方法。
【請求項１８】
前記ポリエチレングリコールは、メトキシアルデヒドポリエチレングリコール、スクシンイミドプロピオン酸ポリエチレングリコール、メトキシスクシンイミドブタン酸ポリエチレングリコール、メトキシスクシンイミジルコハク酸ポリエチレングリコール、メトキシベンゾトリアゾールカルボン酸ポリエチレングリコール、メトキシエポキシドポリエチレングリコール、メトキシカルボニルイミダゾールポリエチレングリコール、メトキシｐ−ニトロフェニルカルボン酸ポリエチレングリコール、メトキシイソシアン酸ポリエチレングリコール、一級アミンを含むメトキシアミンポリエチレングリコール、メトキシヒドラジドポリエチレングリコール及びカルボキシル基を含むメトキシカルボキシルポリエチレングリコールからなる群より選択される一つであることを特徴とする請求項１６に記載の化学式１のカテコールを持つ化合物が結合されているポリエチレングリコール誘導体の製造方法。
【請求項１９】
前記架橋剤は、ベンゾトリアゾリルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、エチル−（ジメチルアミノ）プロピルカルボイミドハイドロクロライド（ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ−ジヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）及びシアノヒドリドほう酸ナトリウムからなる群より選択された一つ以上であることを特徴とする請求項１６に記載の化学式１のカテコールを持つ化合物が結合されているポリエチレングリコール誘導体の製造方法。
【請求項２０】
前記カテコールを持つ化合物は、カルボキシル基とアミン基を含むジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン、アミン基を含む３−ヒドロキシ−チラミン、カルボキシル基を含む３，４−ジヒドロキシヒドロけい皮酸、アルデヒド基を含む３，４−ジヒドロキシベンゾアルデヒド及びノルエピネフリンからなる群より選択される一つであることを特徴とする請求項１６に記載の化学式１のカテコールを持つ化合物が結合されているポリエチレングリコール誘導体の製造方法。
【請求項２１】
（ｅ）前記工程（ｄ）の溶液を透析する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１６に記載の化学式１のカテコールを持つ化合物が結合されているポリエチレングリコール誘導体の製造方法。
【請求項２２】
（ｆ）前記工程（ｅ）で透析された溶液を凍結乾燥する工程をさらに含むことを特徴とする請求項２１に記載の化学式１のカテコールを持つ化合物が結合されているポリエチレングリコール誘導体の製造方法。
【請求項２３】
次の工程を含む、請求項１〜６のいずれか一項のポリエチレングリコール誘導体が蛋白質またはペプチドのＮ末端アミン基に単一体で接合されていることを特徴とする蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体の製造方法：
（ａ）反応槽内の蛋白質またはペプチドを溶解させる工程；
（ｂ）他の反応槽内の前記ポリエチレングリコール誘導体を溶解させる工程；及び
（ｃ）前記工程（ａ）の溶液に前記工程（ｂ）の溶液を添加して、反応させる工程。
【請求項２４】
前記ポリエチレングリコールは、メトキシアルデヒドポリエチレングリコール、スクシンイミドプロピオン酸ポリエチレングリコール、メトキシスクシンイミドブタン酸ポリエチレングリコール、メトキシスクシンイミジルコハク酸ポリエチレングリコール、メトキシベンゾトリアゾールカルボン酸ポリエチレングリコール、メトキシエポキシドポリエチレングリコール、メトキシカルボニルイミダゾールポリエチレングリコール、メトキシｐ−ニトロフェニルカルボン酸ポリエチレングリコール、メトキシイソシアン酸ポリエチレングリコール、一級アミンを含むメトキシアミンポリエチレングリコール、メトキシヒドラジドポリエチレングリコール及びカルボキシル基を含むメトキシカルボキシルポリエチレングリコールからなる群より選択される一つであることを特徴とする請求項２３に記載の蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体の製造方法。
【請求項２５】
前記カテコールを持つ化合物は、カルボキシル基とアミン基を含むジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン、アミン基を含む３−ヒドロキシ−チラミン、カルボキシル基を含む３，４−ジヒドロキシヒドロけい皮酸、アルデヒド基を含む３，４−ジヒドロキシベンゾアルデヒド及びノルエピネフリンからなる群より選択される一つであることを特徴とする請求項２３に記載の蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体の製造方法。
【請求項２６】
（ｄ）前記工程（ｃ）の溶液を透析したあと接合体を分離する工程をさらに含むことを特徴とする請求項２３に記載の蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体の製造方法。
【請求項２７】
前記工程（ｄ）で接合体を分離する方法は液状クロマトグラフィーを利用することを特徴とする請求項２３に記載の蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体の製造方法。
【請求項２８】
前記工程（ｄ）はポリエチレングリコール誘導体と酸化剤を１：１〜１：１０のモルとして反応槽内で溶解させることを特徴とする請求項２３に記載の蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体の製造方法。
【請求項２９】
前記酸化剤は、ＮａＩＯ４、ＭｎＣｌ２、ＦｅＣｌ２、ＦｅＣｌ３、ＫＭｎＯ４、Ｈ２Ｏ２、Ｎａ２Ｃｒ２Ｏ７及びＮａ３ＶＯ４からなる群より選択される一つ以上であることを特徴とする請求項２８に記載の蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体の製造方法。
【請求項３０】
前記工程（ｂ）の反応は２〜１００時間の間４〜２５℃の温度で行われることを特徴とする請求項２３に記載の蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体の製造方法。
【請求項１】
下記化学式１のカテコールを持つ化合物が結合されているポリエチレングリコール誘導体：
【化１】
【請求項２】
前記誘導体は蛋白質またはペプチドのＮ末端アミン基に単一体で接合できることを特徴とする請求項１に記載のポリエチレングリコール誘導体。
【請求項３】
前記ポリエチレングリコールは、メトキシアルデヒドポリエチレングリコール、スクシンイミドプロピオン酸ポリエチレングリコール、メトキシスクシンイミドブタン酸ポリエチレングリコール、メトキシスクシンイミジルコハク酸ポリエチレングリコール、メトキシベンゾトリアゾールカルボン酸ポリエチレングリコール、メトキシエポキシドポリエチレングリコール、メトキシカルボニルイミダゾールポリエチレングリコール、メトキシｐ−ニトロフェニルカルボン酸ポリエチレングリコール、メトキシイソシアン酸ポリエチレングリコール、一級アミンを含むメトキシアミンポリエチレングリコール、メトキシヒドラジドポリエチレングリコール及びカルボキシル基を含むメトキシカルボキシルポリエチレングリコールからなる群より選択される一つであることを特徴とする請求項１に記載のポリエチレングリコール誘導体。
【請求項４】
前記ポリエチレングリコールとしては、直線型、分枝型、ブラシ型、及びスター型からなる群より選択される一つであることを特徴とする請求項１に記載のポリエチレングリコール誘導体。
【請求項５】
前記カテコールを持つ化合物は、カルボキシル基とアミン基を含むジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン、アミン基を含む３−ヒドロキシ−チラミン、カルボキシル基を含む３，４−ジヒドロキシヒドロけい皮酸、アルデヒド基を含む３，４−ジヒドロキシベンゾアルデヒド及びノルエピネフリンからなる群より選択される一つであることを特徴とする請求項１に記載のポリエチレングリコール誘導体。
【請求項６】
前記カテコールを持つ化合物の分子量は、１，０００以下であることを特徴とする請求項１に記載のポリエチレングリコール誘導体。
【請求項７】
前記誘導体の分子量は、５００〜１００，０００Ｄａであることを特徴とする請求項１に記載のポリエチレングリコール誘導体。
【請求項８】
下記化学式１のカテコールを持つ化合物が結合されているポリエチレングリコール誘導体が蛋白質またはペプチドのＮ末端アミン基に単一体で接合されていることを特徴とする蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体：
【化２】
【請求項９】
前記ポリエチレングリコールは、メトキシアルデヒドポリエチレングリコール、スクシンイミドプロピオン酸ポリエチレングリコール、メトキシスクシンイミドブタン酸ポリエチレングリコール、メトキシスクシンイミジルコハク酸ポリエチレングリコール、メトキシベンゾトリアゾールカルボン酸ポリエチレングリコール、メトキシエポキシドポリエチレングリコール、メトキシカルボニルイミダゾールポリエチレングリコール、メトキシｐ−ニトロフェニルカルボン酸ポリエチレングリコール、メトキシイソシアン酸ポリエチレングリコール、一級アミンを含むメトキシアミンポリエチレングリコール、メトキシヒドラジドポリエチレングリコール及びカルボキシル基を含むメトキシカルボキシルポリエチレングリコールからなる群より選択される一つであることを特徴とする請求項８に記載の蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体。
【請求項１０】
前記ポリエチレングリコールとしては、直線型、分枝型、ブラシ型、及びスター型からなる群より選択される一つであることを特徴とする請求項８に記載の蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体。
【請求項１１】
前記カテコールを持つ化合物は、カルボキシル基とアミン基を含むジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン、アミン基を含む３−ヒドロキシ−チラミン、カルボキシル基を含む３，４−ジヒドロキシヒドロけい皮酸、アルデヒド基を含む３，４−ジヒドロキシベンゾアルデヒド及びノルエピネフリンからなる群より選択される一つであることを特徴とする請求項１０に記載の蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体。
【請求項１２】
前記カテコールを持つ化合物の分子量は、１，０００以下であることを特徴とする請求項８に記載の蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体。
【請求項１３】
前記ポリエチレングリコール誘導体の分子量は、５００〜１００，０００Ｄａであることを特徴とする請求項８に記載の蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体。
【請求項１４】
前記蛋白質はリゾチーム、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、黄体化ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、ウリカーゼ（uricase）、及びアルギニンデイミナーゼ（ＡＤＩ）からなる群より選択される一つであることを特徴とする請求項８に記載の蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体。
【請求項１５】
前記ペプチドは、ヒンジ−７、ヒンジ−３、ブフォリン、ヒストニン、プロテグリン、インドリシジン、ヒスタチン、ＢＩＰ、マガイニン２、グルカゴン類似ペプチド（ＧＬＰ−１）、ＧＮＲＨ／ＬＨＲＨアゴニスト、ソマトスタチン類似体、免疫調節ペプチドのグラチラマー、サーモンカルシトニン、テスモプレシン、血小板凝固抑制ペプチド、エプチフィバチド、及びＨＩＶ細胞流入抑制剤のエンフュービルタイドからなる群より選択される一つであることを特徴とする請求項８に記載の蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体。
【請求項１６】
次の工程を含む、下記化学式１のカテコールを持つ化合物が結合されているポリエチレングリコール誘導体の製造方法：
【化３】
（ａ）反応槽内の極性有機溶媒にポリエチレングリコールを溶解させる工程；
（ｂ）他の反応槽内の極性有機溶媒に架橋剤及び化学式１のカテコールを持つ化合物を溶解させる工程；
（ｃ）上記工程（ｂ）で製造された溶液にＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を添加して、反応させる工程；及び
（ｄ）上記工程（ａ）の溶液に上記工程（ｃ）の溶液を添加して、反応させる工程。
【請求項１７】
前記極性有機溶媒はアルコール、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、アセトン及びＮＭＰからなる群より選択される一つ以上であることを特徴とする請求項１６に記載の化学式１のカテコールを持つ化合物が結合されているポリエチレングリコール誘導体の製造方法。
【請求項１８】
前記ポリエチレングリコールは、メトキシアルデヒドポリエチレングリコール、スクシンイミドプロピオン酸ポリエチレングリコール、メトキシスクシンイミドブタン酸ポリエチレングリコール、メトキシスクシンイミジルコハク酸ポリエチレングリコール、メトキシベンゾトリアゾールカルボン酸ポリエチレングリコール、メトキシエポキシドポリエチレングリコール、メトキシカルボニルイミダゾールポリエチレングリコール、メトキシｐ−ニトロフェニルカルボン酸ポリエチレングリコール、メトキシイソシアン酸ポリエチレングリコール、一級アミンを含むメトキシアミンポリエチレングリコール、メトキシヒドラジドポリエチレングリコール及びカルボキシル基を含むメトキシカルボキシルポリエチレングリコールからなる群より選択される一つであることを特徴とする請求項１６に記載の化学式１のカテコールを持つ化合物が結合されているポリエチレングリコール誘導体の製造方法。
【請求項１９】
前記架橋剤は、ベンゾトリアゾリルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、エチル−（ジメチルアミノ）プロピルカルボイミドハイドロクロライド（ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ−ジヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）及びシアノヒドリドほう酸ナトリウムからなる群より選択された一つ以上であることを特徴とする請求項１６に記載の化学式１のカテコールを持つ化合物が結合されているポリエチレングリコール誘導体の製造方法。
【請求項２０】
前記カテコールを持つ化合物は、カルボキシル基とアミン基を含むジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン、アミン基を含む３−ヒドロキシ−チラミン、カルボキシル基を含む３，４−ジヒドロキシヒドロけい皮酸、アルデヒド基を含む３，４−ジヒドロキシベンゾアルデヒド及びノルエピネフリンからなる群より選択される一つであることを特徴とする請求項１６に記載の化学式１のカテコールを持つ化合物が結合されているポリエチレングリコール誘導体の製造方法。
【請求項２１】
（ｅ）前記工程（ｄ）の溶液を透析する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１６に記載の化学式１のカテコールを持つ化合物が結合されているポリエチレングリコール誘導体の製造方法。
【請求項２２】
（ｆ）前記工程（ｅ）で透析された溶液を凍結乾燥する工程をさらに含むことを特徴とする請求項２１に記載の化学式１のカテコールを持つ化合物が結合されているポリエチレングリコール誘導体の製造方法。
【請求項２３】
次の工程を含む、請求項１〜６のいずれか一項のポリエチレングリコール誘導体が蛋白質またはペプチドのＮ末端アミン基に単一体で接合されていることを特徴とする蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体の製造方法：
（ａ）反応槽内の蛋白質またはペプチドを溶解させる工程；
（ｂ）他の反応槽内の前記ポリエチレングリコール誘導体を溶解させる工程；及び
（ｃ）前記工程（ａ）の溶液に前記工程（ｂ）の溶液を添加して、反応させる工程。
【請求項２４】
前記ポリエチレングリコールは、メトキシアルデヒドポリエチレングリコール、スクシンイミドプロピオン酸ポリエチレングリコール、メトキシスクシンイミドブタン酸ポリエチレングリコール、メトキシスクシンイミジルコハク酸ポリエチレングリコール、メトキシベンゾトリアゾールカルボン酸ポリエチレングリコール、メトキシエポキシドポリエチレングリコール、メトキシカルボニルイミダゾールポリエチレングリコール、メトキシｐ−ニトロフェニルカルボン酸ポリエチレングリコール、メトキシイソシアン酸ポリエチレングリコール、一級アミンを含むメトキシアミンポリエチレングリコール、メトキシヒドラジドポリエチレングリコール及びカルボキシル基を含むメトキシカルボキシルポリエチレングリコールからなる群より選択される一つであることを特徴とする請求項２３に記載の蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体の製造方法。
【請求項２５】
前記カテコールを持つ化合物は、カルボキシル基とアミン基を含むジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン、アミン基を含む３−ヒドロキシ−チラミン、カルボキシル基を含む３，４−ジヒドロキシヒドロけい皮酸、アルデヒド基を含む３，４−ジヒドロキシベンゾアルデヒド及びノルエピネフリンからなる群より選択される一つであることを特徴とする請求項２３に記載の蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体の製造方法。
【請求項２６】
（ｄ）前記工程（ｃ）の溶液を透析したあと接合体を分離する工程をさらに含むことを特徴とする請求項２３に記載の蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体の製造方法。
【請求項２７】
前記工程（ｄ）で接合体を分離する方法は液状クロマトグラフィーを利用することを特徴とする請求項２３に記載の蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体の製造方法。
【請求項２８】
前記工程（ｄ）はポリエチレングリコール誘導体と酸化剤を１：１〜１：１０のモルとして反応槽内で溶解させることを特徴とする請求項２３に記載の蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体の製造方法。
【請求項２９】
前記酸化剤は、ＮａＩＯ４、ＭｎＣｌ２、ＦｅＣｌ２、ＦｅＣｌ３、ＫＭｎＯ４、Ｈ２Ｏ２、Ｎａ２Ｃｒ２Ｏ７及びＮａ３ＶＯ４からなる群より選択される一つ以上であることを特徴とする請求項２８に記載の蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体の製造方法。
【請求項３０】
前記工程（ｂ）の反応は２〜１００時間の間４〜２５℃の温度で行われることを特徴とする請求項２３に記載の蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公表番号】特表２０１３−５０９４０２（Ｐ２０１３−５０９４０２Ａ）
【公表日】平成２５年３月１４日（２０１３．３．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３６６９６（Ｐ２０１２−５３６６９６）
【出願日】平成２２年１０月２９日（２０１０．１０．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２０１０／００７５６７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０５３０６５
【国際公開日】平成２３年５月５日（２０１１．５．５）
【出願人】（５０２３１８４７８）コリア アドバンスド インスティチュート オブ サイエンス アンド テクノロジィ (27)
【出願人】（５１２１１４７５２）イノ セラピー インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年３月１４日（２０１３．３．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月２９日（２０１０．１０．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２０１０／００７５６７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０５３０６５
【国際公開日】平成２３年５月５日（２０１１．５．５）
【出願人】（５０２３１８４７８）コリア アドバンスド インスティチュート オブ サイエンス アンド テクノロジィ (27)
【出願人】（５１２１１４７５２）イノ セラピー インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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