キトサンの難溶性塩を含有する組成物
【課題】生活習慣病の予防並びに治療のため、伝統的に食品として摂取されてきた海洋性天然多糖類キトサンの高分子特性を利用した、安全性の高い機能性製剤・食品素材を提供すること。
【解決手段】キトサンと難溶性有機酸の塩を含有する飲食用組成物である。キトサンと難溶性有機酸の塩としては、キトサンと桂皮酸、クマル酸、バニリン酸、２−ヒドロキシ桂皮酸、３−ヒドロキシ桂皮酸、ローズマリー酸、フェルラ酸から選ばれるいずれかの酸との塩が好ましい。このキトサンと難溶性有機酸の塩を含有する飲食用組成物は血中コレステロールを低下させる作用、特に、胆汁酸吸着作用を有する。キトサン１重量部に対して難溶性有機酸を０．５重量部以上の比率で添加した塩が好ましい。
【解決手段】キトサンと難溶性有機酸の塩を含有する飲食用組成物である。キトサンと難溶性有機酸の塩としては、キトサンと桂皮酸、クマル酸、バニリン酸、２−ヒドロキシ桂皮酸、３−ヒドロキシ桂皮酸、ローズマリー酸、フェルラ酸から選ばれるいずれかの酸との塩が好ましい。このキトサンと難溶性有機酸の塩を含有する飲食用組成物は血中コレステロールを低下させる作用、特に、胆汁酸吸着作用を有する。キトサン１重量部に対して難溶性有機酸を０．５重量部以上の比率で添加した塩が好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、飲食用に適したキトサン含有組成物に関する。詳細には、キトサンの血中コレステロール低下作用、胆汁酸の吸着排泄作用を有する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
キトサンには血中コレステロールが低下する作用が知られている（例えば、特許文献１〜４）。その作用機序としては種々のメカニズムが報告されているが、そのひとつとして知られているのが胆汁酸の吸着作用である（非特許文献１、２）。胆汁酸吸着剤と分類される医薬品がある。コレステロールは胆汁酸に代謝されて小腸へ排泄される。しかし多くはもう一度吸収される。この小腸へ排泄された胆汁酸を吸着して、便としてコレステロールの排泄を増やすのが胆汁酸吸着剤である。これにより再吸収される胆汁酸が減り、コレステロールから胆汁酸への代謝が増加して、細胞のコレステロールが減り、コレステロールをとり込む反応が活発になり、血液中のコレステロールが下がるというものである。
キトサンの塩については、ニコチン酸塩（特許文献５）、オロチン酸塩（特許文献６）が報告されている。
【０００３】
【特許文献１】特開平５−３１６９９６号
【特許文献２】特開平６−５４６６５号
【特許文献３】特開平９−８７３０２号
【特許文献４】特開平１１−１４７８２８号
【特許文献５】特表２０００−５０４７２４号
【特許文献６】特開２００４−５１６１５号
【非特許文献１】Lipid, 18(10), p714-719, 1983
【非特許文献２】Brit. J. Nutri., 94, p331-337, 2005
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、生活習慣病の予防並びに治療のため、伝統的に食品として摂取されてきた海洋性天然多糖類の高分子特性を利用した、安全性の高い機能性製剤・食品素材の開発を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
従来、天然多糖類の消化管内機能が注目され、特にキトサン経口摂取による血中コレステロール低下は広く知られ、その有用性が認識されているものの民間療法という域を出ていない。すでに関連研究において、各種の弱酸塩に誘導化したキトサンが、胆汁酸の存在下、イオン交換反応に伴うコアセルベーションを起こすことを見いだしているが、これは消化管内での胆汁酸の吸着とそれに伴う血中脂質の低下をもたらすことを意味する。実際、高脂血症モデルラットに対するキトサン弱酸塩の経口投与による血中脂質の低下作用を観察している。
キトサンは、本来、フリーの状態では胆汁酸吸着は期待されず、胃内での塩形成によってはじめて胆汁酸との静電的複合体形成が可能になると考えられるため、あらかじめキトサン塩の形での摂取は、消化管内におけるその機能の確実な発揮をもたらすことになる。しかしながら、乳酸、酢酸、アスコルビン酸等の弱酸により作成したキトサン塩の分離・精製には、一般に高分子水溶液のコアセルベーションという煩雑な操作が必要となる。ここでは、比較的水溶性の小さい桂皮酸類を用いてキトサン懸濁液条件下での塩形成を行うことで、非常に簡便な操作によりキトサン塩を得ること、また、その塩は消化管内で胆汁酸を吸着すると同時に、生活習慣病に対して有用な生理作用を期待できる桂皮酸類を供給することを見いだした。
【０００６】
本発明は、キトサンと難溶性有機酸の塩を含有する飲食用組成物を要旨とする。キトサンと難溶性有機酸の塩としては、キトサンと桂皮酸、クマル酸、バニリン酸、２−ビドロキシクマル酸、３−ヒドロキシクマル酸、ローズマリー酸、フェルラ酸から選ばれるいずれかの酸との塩が好ましい。このキトサンと難溶性有機酸の塩を含有する飲食用組成物は血中コレステロールを低下させる作用、特に、胆汁酸吸着作用を有する。キトサン１重量部に対して難溶性有機酸を０．５重量部以上の比率で添加した塩が好ましい。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のキトサンと難溶性有機酸の塩は塩のまま腸に到達し、桂皮酸類と胆汁酸が交換されることにより胆汁酸の吸着を行い、効率よく胆汁酸を排泄する効果を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
キチンはエビ、カニの甲羅をはじめとして、昆虫、貝、キノコにいたるまで、きわめて多くの生物に含まれている天然の素材であり、その構造はN-アセチル-D-グルコサミンが鎖状に長く（数百から数千）つながったアミノ多糖である。キチンをアルカリで処理するとアセチル基が除かれ、主としてD-グルコサミン単位からなるキトサンに変換されます。1回のアルカリ処理により、D-グルコサミン単位の割合は70-95%程度までになる。本発明におけるキトサンとはこのようなキトサンであり、その分子量、脱アセチル化度は問わない。通常、コレステロール低下作用を有するとされているキトサンであれば本発明のキトサンとして使用することができる。
【０００９】
本発明における難溶性有機酸とは以下のように定義する。溶解性については、例えば薬局方では２０±５℃で５分ごとに強く３０秒間振り混ぜるとき、３０分以内に溶ける度合と定義されており、溶質１ｇ又は１ｍｌを溶かすに要する溶媒量が１ｍｌ未満を「極めて解けやすい」、１ｍｌ以上１０ｍｌ未満を「溶けやすい」、１０ｍｌ以上３０ｍｌ未満を「やや溶けやすい」、３０ｍｌ以上１００ｍｌ未満を「やや溶けにくい」、１００ｍｌ以上１０００ｍｌ未満を「溶けにくい」、１０００ｍｌ以上１００００ｍｌ未満を「極めて溶けにくい」、１００００ｍｌ以上を「ほとんど溶けない」と規定している。本発明における難溶性の有機酸とは、この規定によれば溶質１ｇ又は１ｍｌを溶かすに要する溶媒量が１００ｍｌ以上の「溶けにくい」、好ましくは１０００ｍｌ以上の「極めて溶けにくい」に分類されるものである。例えば、桂皮酸は１ｇ溶解するのに２０００ｍｌの水が必要であり、バニリン酸は８６０ｍｌが必要である。フェルラ酸は温水であれば溶けるとされている。先行技術文献にキトサンのニコチン酸、オロチン酸塩が記載されているがニコチン酸は６０ｍｌ、オロチン酸は５８８ｍｌである。
【００１０】
酢酸、乳酸のように水溶性の高い有機酸を用いると、弱酸ではあっても塩調製時にキトサンを溶解させてしまうので、その後、塩の析出、精製が煩雑となる。難溶性の塩であることにより、胆汁酸との交換が容易になるばかりではなく、胆汁酸と結合した後、それを保持して排泄するのに有利である。
通常、キトサンの血中コレステロール低下効果を期待する場合、1日当たり約１〜２０ｇを摂取すると有効であるとされている。本発明のキトサン塩も同程度の使用量が適当である。フリーのキトサンを摂取した場合も胃酸によりイオン化されるので、小腸内では胆汁酸を吸着するが、塩素イオンは乖離しやすいのに対し、本発明の有機酸の塩は乖離しにくいため、より確実に胆汁酸を吸着することができる。
【００１１】
本発明の塩は難溶性であるため、飲料に溶かすわけにはいかないが、懸濁液として飲料に用いるほか、カプセル、タブレット等の健康食品、その他各種食品に添加して用いることができる。
本発明の有機酸は、胆汁酸と交換されることにより小腸内で遊離される。すなわち、例えば、桂皮酸、クマル酸、バニリン酸、２−ビドロキシクマル酸、３−ヒドロキシクマル酸、ローズマリー酸、フェルラ酸のキトサン塩を投与した場合、これらの有機酸が小腸に放出されることになるので、これらの成分の効果もあわせて期待することができる。
キトサンと難溶性有機酸の混合割合は、キトサン１重量部に対し難溶性有機酸を０．５重量部以上用いるのが好ましい。胆汁酸との交換は有機酸の存在量と相関するので、有機酸の割合が多いほど、多く胆汁酸と交換する。
難溶性有機酸は純度の低いものを使用することもできる。これら有機酸を含有する天然物の粗抽出物をキトサンと混合することにより塩としても差し支えない。例えば、フェルラ酸は米糠抽出物として市販されている。この米糠抽出物を使用することもできる。桂皮酸類もそれぞれ、各種植物の抽出液として用いることができる。
【００１２】
以下に本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００１３】
＜キトサン−フェルラ酸塩（CS-FA）の調製並びに精製＞
試薬
フェルラ酸（FA）は米糠より大量に精製されるようになり、食品添加物として安価で入手できる米糠FA（築野食品製）並びに試薬特級FA（ナカライテスク）を用いた。キトサン（CS）はキミカキトサン（F、微粉末、脱アセチル化度75-85％）等の各種市販CSを用いた。ペクチンはゲニューペクチン（三晶、LM-102AS）を用いた。 FA以外の桂皮酸類、アルギン酸ナトリウム、各種胆汁酸等は、それぞれ市販試薬を用いた。
【００１４】
CS-FA塩の調製
FA懸濁液（0.5g＋イオン交換水23.5g）にCS 1gを添加して１日攪拌後、遠心分離し、イオン交換水、続いてエタノールで洗浄、乾燥し淡黄色粉末（CS-FA）を得た。また、FAとCSの量比を変えた調製も行った。CS-FAは粉末X線回折（マックサイエンス）により解析した。さらに、他の桂皮酸を用いたCS塩も同様の方法により調製した。
FA及びCS-FAの粉末X線回折の結果を図1に示す。米糠FAは試薬FAと同様の回折パターンが観察された。FAには結晶多形が存在することが知られているが、米糠FAと試薬FAにおいて明確なピークの差は観察されなかった。以後、すべての実験は米糠FAを用いて行った。
CS-FAについて、FA結晶の回折パターンは全く認められず、また、CS本来のブロードなピークは消失した。図1には示していないが、CSをイオン交換水中で撹拌、エタノール洗浄、乾燥の操作をしてもCSのピークの消失は観察されなかったことから、FA懸濁液中でのCSの変化（CS-FAの形成）が推察された。
【００１５】
CS-FAを固定化した天然多糖類ゲルビーズの調製
CSを分散（10%）した1％アルギン酸ナトリウム水溶液2ｇを0.1M CaCl2 10 mlに滴下し、瞬時に生じるAlg（アルギン酸）-Caを1時間静置後、FA酸懸濁液（0.1 g/ 10ml）中に移し、37℃で1日撹拌し、CS-FA固定化アルギン酸ゲルビーズ（Alg-Ca、ハイドロゲルビーズ）を調製した。また、必要時、乾燥してドライゲルビーズとした。なお、2％ペクチン水溶液を用いて、同様の方法によりCS-FA固定化ペクチンビーズを調製した。
【００１６】
＜胆汁酸吸着（取り込み）試験、FA放出試験＞
試料を37℃の各種胆汁酸水溶液中（溶液中に30μmolの胆汁酸を含有）で振とう、経時的に水溶液をサンプリングし、胆汁酸残存量をHPLCにて測定した。また、同時に放出されるFA量をHPLCにより測定した。
CS-FA（粉末）は速やかに胆汁酸を吸着し、2時間後の吸着量は0.366±0.006 mmolタウロコール酸/g CS-FA (n=3)であった。また、このときFAが放出され、その量は0.380±0.002 mmol FA /g CS-FA (n=3)であった。グリココール酸中においても同様に、胆汁酸吸着とFA放出が認められ、2時間の吸着量は0.388±0.000 mmolグリココール酸/gCS-FA (n=3)、FA放出量は0.380±0.002 mmol FA /g CS-FAであった。これより、CS-FAのFA放出に伴う胆汁酸吸着が示された。
Alg-Ca内部に固定化されたCSも、FA懸濁液中においてCS-FAに徐々に変化することが推測される。実際、調製したCS-FA固定化Alg-Ca（ハイドロゲルビーズ）はFAを放出しながら胆汁酸を取り込み、2時間後、系中に存在する胆汁酸の80%程度の取り込みが観察された。（図2、3）。さらに、ドライゲルビーズにおいても同様の現象が認められた。
CS-弱酸塩がそのままヒトに経口投与された場合、まず胃酸中でFAの放出が起こると考えられる。そこで、人工胃液中におけるCS-FAからのFA放出、その後の胆汁酸の吸着能について検討した。人工胃液中で0.71±0.051 mmol FA /g CS-FAの放出を示し、この間、CSは塩酸塩に変化したと考えられるが、その場合でも、胆汁酸の吸着が認められた（最初に添加したCS-FA 1g当たり0.32±0.022 mmol TCAの吸着）。
FA以外の桂皮酸類を用いて調製したCS塩に関しても、ほぼ同様の胆汁酸吸着あるいは取り込みと、同時に起こる各桂皮酸類の放出が確認された（図4、5）。
【００１７】
＜高血圧モデルラットによる血圧上昇抑制作用＞
桂皮酸類の経口投与等による血圧上昇抑制作用が報告されているが、その確立された系を利用してCS-FAの摂取による抗高血圧作用を検討した（A. Suzuki、 et al.、 Am. J. Hypertension、 15、351-357 (2002).、田頭 等、第14回日本循環薬理学会（2004年11月、静岡）等参照）。温度制御された飼育舎において、高血圧モデルラット SHR/Izm（雄性、4週齢、60-100 g、三協ラボ）を1匹ずつステンレスケージ内で1週間予備飼育した。その後、飲料水として0.003% L-NAME水溶液に切り替え、10%CS-FA等を含有した粉末飼料（*１）で飼育し（各群5匹）、自動血圧測定器（tail-cuff法、MUROMACHI KIKAI CO. MK-2000）により非麻酔下でのラット血圧を、5週間経時的に測定した。なお、この間の飼料摂取量は毎日、体重変化は1週間おきに計測した。なお、粉末飼料（SRF-1、オリエンタル飼料）、あるいは被検物質を含む粉末飼料は710μmのふるいを通過させて用いた。
（*１) 動物実験に使用したCS-FAは、1 g当り1.1 mmol (0.21g) のFAを含有していたので、10% CS-FA 含有飼料は1g当り0.11 mmol (21mg)のFAと約79 mgのCSを含むと考えられる。
いずれの飼料で飼育した群においても、飼料摂取量並びに体重の変化に大きな違いは観察されなかった。ここで、CS-FAを含有した飼料を与えた群では、摂取後2−5週において血圧上昇の抑制が認められた。その効果は、FAのみを添加した場合と同程度であった。すなわち、血圧上昇抑制効果はCS-FA由来のFAによるものと推察され、消化管内での確実なFA放出が期待できることが明らかとなった。なお、CSのみの添加においては、顕著な血圧上昇抑制効果はみられなかった。
【００１８】
以上の実験から、CS-FAは粉末として容易に作製可能であり、粉末時のみならずゲルマトリクス内に固定化された場合においても、胆汁酸吸着とFA放出という2つの機能が発揮されることが明らかとなった。また、実際にモデルラットにおいてその摂取における効果も確認された。生活習慣病（高脂血症、高血圧、糖尿病等）は複合的に起こる疾患でもあり、その予防の目的でCS-FA等のCS−桂皮酸類塩摂取の有用性が示された。
【実施例２】
【００１９】
＜キトサン(CS)とフェルラ酸(FA)による塩調製条件の検討＞
FA量を少なくしたCS-FA調製を試み、その胆汁酸吸着能について検討した。
胆汁酸吸着能はCSの脱アセチル化度と関連していることを報告しているが、ここでCSとしては市販品で利用しやすい種類を用いた。
材料
CS：(株)共和テクノス製、フローナックH-100Mあるいは60M
FA：築野食品工業(株)製（M.W. 194.18、 pKa 4.56 文献値）
胆汁酸：タウロコール酸（TCA）、グリココール酸（GCA）
【００２０】
方法
CS-FA調製法：CS並びにFAをイオン交換水に添加して１日攪拌後、遠心分離し、イオン交換水、続いてエタノールで洗浄、乾燥し粉末（CS-FA）を得た。反応系中に含まれるCSとFAの重量比はCS（フローナックH-100M）：FA＝５：１、１０：１、２０：１、４０：１とした。また、フローナック60Mを用いて、CS-FA（10：1）を調製した。
胆汁酸吸着量：試料50 mgを37℃の各種胆汁酸水溶液中（溶液中に30μmolの胆汁酸を含有）で振とう、経時的に水溶液をサンプリングし、胆汁酸残存量をHPLCにて測定した。すべての実験は3回行なった。
【００２１】
結果
（1）胆汁酸吸着の時間変化
調製したCS-FAは、いずれも瞬時にTCAを吸着した（図７）。ただし、FAの量を少なくして調製したCS-FAでは、時間とともに吸着量が若干減少する傾向がみられた。また、GCAの吸着に関しても同様であった（図８）。
【００２２】
（2）胆汁酸吸着量
CS量に対してFA量を減らしたとき、それに伴うTCA吸着量の低下が認められた（図９）。30分後のデータにより比較すると、CS-FA(40:1)ではCS-FA(5:1)の1/3以下の胆汁酸吸着量となった。これは、CSを構成するグルコサミン（1ユニットの分子量を161.16として）のアミノ基を塩にするに、量的に不十分なためである。GCAについても全く同様の傾向が認められた（図１０）。
【００２３】
（3）異なるCSによる調製
他のCSを用いて調製した場合（フローナック60M（CS-FA＝10：1））でも、例えば30分後TCA取り込み量は0.20±0.01 (mmol/g CS-FA) となり、フローナックH-100Mの場合とほぼ同量の吸着が認められた。
以上、FA添加量とCS-FAの胆汁酸吸着能は相関することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００２４】
本発明によりフリーのキトサンと比べ、安定して胆汁酸を吸着し体外へ排泄する効果を有する飲食用に適した組成物を提供することができるので、健康食品、特別保健用食品等として提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】粉末X線回折結果を示した図である。
【図２】CS-FA含有Alg-Caのタウロコール酸(TCA)取り込みとFA放出を示す図である。
【図３】CS-FA含有Alg-Caのグリココール酸(GCA)取り込みとFA放出を示す図である。
【図４】CS−桂皮酸類塩によるTCAの吸着（白のカラム）と桂皮酸類の放出（黒のカラム）、（全て2時間後のデータ）を示す図である。
【図５】CS−桂皮酸類塩を固定化したペクチンビーズによるTCAの吸着（白のカラム）と桂皮酸類の放出（黒のカラム）、（全て2時間後のデータ）を示す図である。
【図６】血圧上昇への影響（開始時と比較した収縮期血圧の上昇値）を示す図である（分散分析Tukey’s test、 各群n=5、（注）□、△ではいずれも●（CS-FA）に含有されている量に相当するCSあるいはFAが添加されている）。
【図７】CS-FAによるTCAの吸着を示す図である（データは全てmean±SD (n=3)であるが、SDは非常に小さい）。
【図８】CS-FAによるGCAの吸着を示す図である（（注）データは全てmean±SD (n=3)であるが、SDは非常に小さい）。
【図９】調製時のCS:FAの量比によるTCA吸着への影響を示す図である（30分後のデータ）。
【図１０】調製時のCS:FAの量比によるGCA吸着への影響を示す図である（30分後のデータ）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、飲食用に適したキトサン含有組成物に関する。詳細には、キトサンの血中コレステロール低下作用、胆汁酸の吸着排泄作用を有する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
キトサンには血中コレステロールが低下する作用が知られている（例えば、特許文献１〜４）。その作用機序としては種々のメカニズムが報告されているが、そのひとつとして知られているのが胆汁酸の吸着作用である（非特許文献１、２）。胆汁酸吸着剤と分類される医薬品がある。コレステロールは胆汁酸に代謝されて小腸へ排泄される。しかし多くはもう一度吸収される。この小腸へ排泄された胆汁酸を吸着して、便としてコレステロールの排泄を増やすのが胆汁酸吸着剤である。これにより再吸収される胆汁酸が減り、コレステロールから胆汁酸への代謝が増加して、細胞のコレステロールが減り、コレステロールをとり込む反応が活発になり、血液中のコレステロールが下がるというものである。
キトサンの塩については、ニコチン酸塩（特許文献５）、オロチン酸塩（特許文献６）が報告されている。
【０００３】
【特許文献１】特開平５−３１６９９６号
【特許文献２】特開平６−５４６６５号
【特許文献３】特開平９−８７３０２号
【特許文献４】特開平１１−１４７８２８号
【特許文献５】特表２０００−５０４７２４号
【特許文献６】特開２００４−５１６１５号
【非特許文献１】Lipid, 18(10), p714-719, 1983
【非特許文献２】Brit. J. Nutri., 94, p331-337, 2005
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、生活習慣病の予防並びに治療のため、伝統的に食品として摂取されてきた海洋性天然多糖類の高分子特性を利用した、安全性の高い機能性製剤・食品素材の開発を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
従来、天然多糖類の消化管内機能が注目され、特にキトサン経口摂取による血中コレステロール低下は広く知られ、その有用性が認識されているものの民間療法という域を出ていない。すでに関連研究において、各種の弱酸塩に誘導化したキトサンが、胆汁酸の存在下、イオン交換反応に伴うコアセルベーションを起こすことを見いだしているが、これは消化管内での胆汁酸の吸着とそれに伴う血中脂質の低下をもたらすことを意味する。実際、高脂血症モデルラットに対するキトサン弱酸塩の経口投与による血中脂質の低下作用を観察している。
キトサンは、本来、フリーの状態では胆汁酸吸着は期待されず、胃内での塩形成によってはじめて胆汁酸との静電的複合体形成が可能になると考えられるため、あらかじめキトサン塩の形での摂取は、消化管内におけるその機能の確実な発揮をもたらすことになる。しかしながら、乳酸、酢酸、アスコルビン酸等の弱酸により作成したキトサン塩の分離・精製には、一般に高分子水溶液のコアセルベーションという煩雑な操作が必要となる。ここでは、比較的水溶性の小さい桂皮酸類を用いてキトサン懸濁液条件下での塩形成を行うことで、非常に簡便な操作によりキトサン塩を得ること、また、その塩は消化管内で胆汁酸を吸着すると同時に、生活習慣病に対して有用な生理作用を期待できる桂皮酸類を供給することを見いだした。
【０００６】
本発明は、キトサンと難溶性有機酸の塩を含有する飲食用組成物を要旨とする。キトサンと難溶性有機酸の塩としては、キトサンと桂皮酸、クマル酸、バニリン酸、２−ビドロキシクマル酸、３−ヒドロキシクマル酸、ローズマリー酸、フェルラ酸から選ばれるいずれかの酸との塩が好ましい。このキトサンと難溶性有機酸の塩を含有する飲食用組成物は血中コレステロールを低下させる作用、特に、胆汁酸吸着作用を有する。キトサン１重量部に対して難溶性有機酸を０．５重量部以上の比率で添加した塩が好ましい。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のキトサンと難溶性有機酸の塩は塩のまま腸に到達し、桂皮酸類と胆汁酸が交換されることにより胆汁酸の吸着を行い、効率よく胆汁酸を排泄する効果を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
キチンはエビ、カニの甲羅をはじめとして、昆虫、貝、キノコにいたるまで、きわめて多くの生物に含まれている天然の素材であり、その構造はN-アセチル-D-グルコサミンが鎖状に長く（数百から数千）つながったアミノ多糖である。キチンをアルカリで処理するとアセチル基が除かれ、主としてD-グルコサミン単位からなるキトサンに変換されます。1回のアルカリ処理により、D-グルコサミン単位の割合は70-95%程度までになる。本発明におけるキトサンとはこのようなキトサンであり、その分子量、脱アセチル化度は問わない。通常、コレステロール低下作用を有するとされているキトサンであれば本発明のキトサンとして使用することができる。
【０００９】
本発明における難溶性有機酸とは以下のように定義する。溶解性については、例えば薬局方では２０±５℃で５分ごとに強く３０秒間振り混ぜるとき、３０分以内に溶ける度合と定義されており、溶質１ｇ又は１ｍｌを溶かすに要する溶媒量が１ｍｌ未満を「極めて解けやすい」、１ｍｌ以上１０ｍｌ未満を「溶けやすい」、１０ｍｌ以上３０ｍｌ未満を「やや溶けやすい」、３０ｍｌ以上１００ｍｌ未満を「やや溶けにくい」、１００ｍｌ以上１０００ｍｌ未満を「溶けにくい」、１０００ｍｌ以上１００００ｍｌ未満を「極めて溶けにくい」、１００００ｍｌ以上を「ほとんど溶けない」と規定している。本発明における難溶性の有機酸とは、この規定によれば溶質１ｇ又は１ｍｌを溶かすに要する溶媒量が１００ｍｌ以上の「溶けにくい」、好ましくは１０００ｍｌ以上の「極めて溶けにくい」に分類されるものである。例えば、桂皮酸は１ｇ溶解するのに２０００ｍｌの水が必要であり、バニリン酸は８６０ｍｌが必要である。フェルラ酸は温水であれば溶けるとされている。先行技術文献にキトサンのニコチン酸、オロチン酸塩が記載されているがニコチン酸は６０ｍｌ、オロチン酸は５８８ｍｌである。
【００１０】
酢酸、乳酸のように水溶性の高い有機酸を用いると、弱酸ではあっても塩調製時にキトサンを溶解させてしまうので、その後、塩の析出、精製が煩雑となる。難溶性の塩であることにより、胆汁酸との交換が容易になるばかりではなく、胆汁酸と結合した後、それを保持して排泄するのに有利である。
通常、キトサンの血中コレステロール低下効果を期待する場合、1日当たり約１〜２０ｇを摂取すると有効であるとされている。本発明のキトサン塩も同程度の使用量が適当である。フリーのキトサンを摂取した場合も胃酸によりイオン化されるので、小腸内では胆汁酸を吸着するが、塩素イオンは乖離しやすいのに対し、本発明の有機酸の塩は乖離しにくいため、より確実に胆汁酸を吸着することができる。
【００１１】
本発明の塩は難溶性であるため、飲料に溶かすわけにはいかないが、懸濁液として飲料に用いるほか、カプセル、タブレット等の健康食品、その他各種食品に添加して用いることができる。
本発明の有機酸は、胆汁酸と交換されることにより小腸内で遊離される。すなわち、例えば、桂皮酸、クマル酸、バニリン酸、２−ビドロキシクマル酸、３−ヒドロキシクマル酸、ローズマリー酸、フェルラ酸のキトサン塩を投与した場合、これらの有機酸が小腸に放出されることになるので、これらの成分の効果もあわせて期待することができる。
キトサンと難溶性有機酸の混合割合は、キトサン１重量部に対し難溶性有機酸を０．５重量部以上用いるのが好ましい。胆汁酸との交換は有機酸の存在量と相関するので、有機酸の割合が多いほど、多く胆汁酸と交換する。
難溶性有機酸は純度の低いものを使用することもできる。これら有機酸を含有する天然物の粗抽出物をキトサンと混合することにより塩としても差し支えない。例えば、フェルラ酸は米糠抽出物として市販されている。この米糠抽出物を使用することもできる。桂皮酸類もそれぞれ、各種植物の抽出液として用いることができる。
【００１２】
以下に本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００１３】
＜キトサン−フェルラ酸塩（CS-FA）の調製並びに精製＞
試薬
フェルラ酸（FA）は米糠より大量に精製されるようになり、食品添加物として安価で入手できる米糠FA（築野食品製）並びに試薬特級FA（ナカライテスク）を用いた。キトサン（CS）はキミカキトサン（F、微粉末、脱アセチル化度75-85％）等の各種市販CSを用いた。ペクチンはゲニューペクチン（三晶、LM-102AS）を用いた。 FA以外の桂皮酸類、アルギン酸ナトリウム、各種胆汁酸等は、それぞれ市販試薬を用いた。
【００１４】
CS-FA塩の調製
FA懸濁液（0.5g＋イオン交換水23.5g）にCS 1gを添加して１日攪拌後、遠心分離し、イオン交換水、続いてエタノールで洗浄、乾燥し淡黄色粉末（CS-FA）を得た。また、FAとCSの量比を変えた調製も行った。CS-FAは粉末X線回折（マックサイエンス）により解析した。さらに、他の桂皮酸を用いたCS塩も同様の方法により調製した。
FA及びCS-FAの粉末X線回折の結果を図1に示す。米糠FAは試薬FAと同様の回折パターンが観察された。FAには結晶多形が存在することが知られているが、米糠FAと試薬FAにおいて明確なピークの差は観察されなかった。以後、すべての実験は米糠FAを用いて行った。
CS-FAについて、FA結晶の回折パターンは全く認められず、また、CS本来のブロードなピークは消失した。図1には示していないが、CSをイオン交換水中で撹拌、エタノール洗浄、乾燥の操作をしてもCSのピークの消失は観察されなかったことから、FA懸濁液中でのCSの変化（CS-FAの形成）が推察された。
【００１５】
CS-FAを固定化した天然多糖類ゲルビーズの調製
CSを分散（10%）した1％アルギン酸ナトリウム水溶液2ｇを0.1M CaCl2 10 mlに滴下し、瞬時に生じるAlg（アルギン酸）-Caを1時間静置後、FA酸懸濁液（0.1 g/ 10ml）中に移し、37℃で1日撹拌し、CS-FA固定化アルギン酸ゲルビーズ（Alg-Ca、ハイドロゲルビーズ）を調製した。また、必要時、乾燥してドライゲルビーズとした。なお、2％ペクチン水溶液を用いて、同様の方法によりCS-FA固定化ペクチンビーズを調製した。
【００１６】
＜胆汁酸吸着（取り込み）試験、FA放出試験＞
試料を37℃の各種胆汁酸水溶液中（溶液中に30μmolの胆汁酸を含有）で振とう、経時的に水溶液をサンプリングし、胆汁酸残存量をHPLCにて測定した。また、同時に放出されるFA量をHPLCにより測定した。
CS-FA（粉末）は速やかに胆汁酸を吸着し、2時間後の吸着量は0.366±0.006 mmolタウロコール酸/g CS-FA (n=3)であった。また、このときFAが放出され、その量は0.380±0.002 mmol FA /g CS-FA (n=3)であった。グリココール酸中においても同様に、胆汁酸吸着とFA放出が認められ、2時間の吸着量は0.388±0.000 mmolグリココール酸/gCS-FA (n=3)、FA放出量は0.380±0.002 mmol FA /g CS-FAであった。これより、CS-FAのFA放出に伴う胆汁酸吸着が示された。
Alg-Ca内部に固定化されたCSも、FA懸濁液中においてCS-FAに徐々に変化することが推測される。実際、調製したCS-FA固定化Alg-Ca（ハイドロゲルビーズ）はFAを放出しながら胆汁酸を取り込み、2時間後、系中に存在する胆汁酸の80%程度の取り込みが観察された。（図2、3）。さらに、ドライゲルビーズにおいても同様の現象が認められた。
CS-弱酸塩がそのままヒトに経口投与された場合、まず胃酸中でFAの放出が起こると考えられる。そこで、人工胃液中におけるCS-FAからのFA放出、その後の胆汁酸の吸着能について検討した。人工胃液中で0.71±0.051 mmol FA /g CS-FAの放出を示し、この間、CSは塩酸塩に変化したと考えられるが、その場合でも、胆汁酸の吸着が認められた（最初に添加したCS-FA 1g当たり0.32±0.022 mmol TCAの吸着）。
FA以外の桂皮酸類を用いて調製したCS塩に関しても、ほぼ同様の胆汁酸吸着あるいは取り込みと、同時に起こる各桂皮酸類の放出が確認された（図4、5）。
【００１７】
＜高血圧モデルラットによる血圧上昇抑制作用＞
桂皮酸類の経口投与等による血圧上昇抑制作用が報告されているが、その確立された系を利用してCS-FAの摂取による抗高血圧作用を検討した（A. Suzuki、 et al.、 Am. J. Hypertension、 15、351-357 (2002).、田頭 等、第14回日本循環薬理学会（2004年11月、静岡）等参照）。温度制御された飼育舎において、高血圧モデルラット SHR/Izm（雄性、4週齢、60-100 g、三協ラボ）を1匹ずつステンレスケージ内で1週間予備飼育した。その後、飲料水として0.003% L-NAME水溶液に切り替え、10%CS-FA等を含有した粉末飼料（*１）で飼育し（各群5匹）、自動血圧測定器（tail-cuff法、MUROMACHI KIKAI CO. MK-2000）により非麻酔下でのラット血圧を、5週間経時的に測定した。なお、この間の飼料摂取量は毎日、体重変化は1週間おきに計測した。なお、粉末飼料（SRF-1、オリエンタル飼料）、あるいは被検物質を含む粉末飼料は710μmのふるいを通過させて用いた。
（*１) 動物実験に使用したCS-FAは、1 g当り1.1 mmol (0.21g) のFAを含有していたので、10% CS-FA 含有飼料は1g当り0.11 mmol (21mg)のFAと約79 mgのCSを含むと考えられる。
いずれの飼料で飼育した群においても、飼料摂取量並びに体重の変化に大きな違いは観察されなかった。ここで、CS-FAを含有した飼料を与えた群では、摂取後2−5週において血圧上昇の抑制が認められた。その効果は、FAのみを添加した場合と同程度であった。すなわち、血圧上昇抑制効果はCS-FA由来のFAによるものと推察され、消化管内での確実なFA放出が期待できることが明らかとなった。なお、CSのみの添加においては、顕著な血圧上昇抑制効果はみられなかった。
【００１８】
以上の実験から、CS-FAは粉末として容易に作製可能であり、粉末時のみならずゲルマトリクス内に固定化された場合においても、胆汁酸吸着とFA放出という2つの機能が発揮されることが明らかとなった。また、実際にモデルラットにおいてその摂取における効果も確認された。生活習慣病（高脂血症、高血圧、糖尿病等）は複合的に起こる疾患でもあり、その予防の目的でCS-FA等のCS−桂皮酸類塩摂取の有用性が示された。
【実施例２】
【００１９】
＜キトサン(CS)とフェルラ酸(FA)による塩調製条件の検討＞
FA量を少なくしたCS-FA調製を試み、その胆汁酸吸着能について検討した。
胆汁酸吸着能はCSの脱アセチル化度と関連していることを報告しているが、ここでCSとしては市販品で利用しやすい種類を用いた。
材料
CS：(株)共和テクノス製、フローナックH-100Mあるいは60M
FA：築野食品工業(株)製（M.W. 194.18、 pKa 4.56 文献値）
胆汁酸：タウロコール酸（TCA）、グリココール酸（GCA）
【００２０】
方法
CS-FA調製法：CS並びにFAをイオン交換水に添加して１日攪拌後、遠心分離し、イオン交換水、続いてエタノールで洗浄、乾燥し粉末（CS-FA）を得た。反応系中に含まれるCSとFAの重量比はCS（フローナックH-100M）：FA＝５：１、１０：１、２０：１、４０：１とした。また、フローナック60Mを用いて、CS-FA（10：1）を調製した。
胆汁酸吸着量：試料50 mgを37℃の各種胆汁酸水溶液中（溶液中に30μmolの胆汁酸を含有）で振とう、経時的に水溶液をサンプリングし、胆汁酸残存量をHPLCにて測定した。すべての実験は3回行なった。
【００２１】
結果
（1）胆汁酸吸着の時間変化
調製したCS-FAは、いずれも瞬時にTCAを吸着した（図７）。ただし、FAの量を少なくして調製したCS-FAでは、時間とともに吸着量が若干減少する傾向がみられた。また、GCAの吸着に関しても同様であった（図８）。
【００２２】
（2）胆汁酸吸着量
CS量に対してFA量を減らしたとき、それに伴うTCA吸着量の低下が認められた（図９）。30分後のデータにより比較すると、CS-FA(40:1)ではCS-FA(5:1)の1/3以下の胆汁酸吸着量となった。これは、CSを構成するグルコサミン（1ユニットの分子量を161.16として）のアミノ基を塩にするに、量的に不十分なためである。GCAについても全く同様の傾向が認められた（図１０）。
【００２３】
（3）異なるCSによる調製
他のCSを用いて調製した場合（フローナック60M（CS-FA＝10：1））でも、例えば30分後TCA取り込み量は0.20±0.01 (mmol/g CS-FA) となり、フローナックH-100Mの場合とほぼ同量の吸着が認められた。
以上、FA添加量とCS-FAの胆汁酸吸着能は相関することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００２４】
本発明によりフリーのキトサンと比べ、安定して胆汁酸を吸着し体外へ排泄する効果を有する飲食用に適した組成物を提供することができるので、健康食品、特別保健用食品等として提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】粉末X線回折結果を示した図である。
【図２】CS-FA含有Alg-Caのタウロコール酸(TCA)取り込みとFA放出を示す図である。
【図３】CS-FA含有Alg-Caのグリココール酸(GCA)取り込みとFA放出を示す図である。
【図４】CS−桂皮酸類塩によるTCAの吸着（白のカラム）と桂皮酸類の放出（黒のカラム）、（全て2時間後のデータ）を示す図である。
【図５】CS−桂皮酸類塩を固定化したペクチンビーズによるTCAの吸着（白のカラム）と桂皮酸類の放出（黒のカラム）、（全て2時間後のデータ）を示す図である。
【図６】血圧上昇への影響（開始時と比較した収縮期血圧の上昇値）を示す図である（分散分析Tukey’s test、 各群n=5、（注）□、△ではいずれも●（CS-FA）に含有されている量に相当するCSあるいはFAが添加されている）。
【図７】CS-FAによるTCAの吸着を示す図である（データは全てmean±SD (n=3)であるが、SDは非常に小さい）。
【図８】CS-FAによるGCAの吸着を示す図である（（注）データは全てmean±SD (n=3)であるが、SDは非常に小さい）。
【図９】調製時のCS:FAの量比によるTCA吸着への影響を示す図である（30分後のデータ）。
【図１０】調製時のCS:FAの量比によるGCA吸着への影響を示す図である（30分後のデータ）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キトサンと難溶性有機酸の塩を含有する飲食用組成物。
【請求項２】
難溶性有機酸が、桂皮酸、クマル酸、バニリン酸、２−ビドロキシクマル酸、３−ヒドロキシクマル酸、ローズマリー酸、フェルラ酸から選ばれるいずれかの酸との塩である、請求項１の飲食用組成物。
【請求項３】
血中コレステロールを低下させる作用を有する請求項１又は２の飲食用組成物。
【請求項４】
胆汁酸吸着作用を有する請求項１、２又は３の飲食用組成物。
【請求項５】
キトサン１重量部に対して難溶性有機酸を０．５重量部以上の比率で添加した塩である請求項１ないし４いずれかの飲食用組成物。
【請求項１】
キトサンと難溶性有機酸の塩を含有する飲食用組成物。
【請求項２】
難溶性有機酸が、桂皮酸、クマル酸、バニリン酸、２−ビドロキシクマル酸、３−ヒドロキシクマル酸、ローズマリー酸、フェルラ酸から選ばれるいずれかの酸との塩である、請求項１の飲食用組成物。
【請求項３】
血中コレステロールを低下させる作用を有する請求項１又は２の飲食用組成物。
【請求項４】
胆汁酸吸着作用を有する請求項１、２又は３の飲食用組成物。
【請求項５】
キトサン１重量部に対して難溶性有機酸を０．５重量部以上の比率で添加した塩である請求項１ないし４いずれかの飲食用組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２００７−２３６２２２（Ｐ２００７−２３６２２２Ａ）
【公開日】平成１９年９月２０日（２００７．９．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５９６１２（Ｐ２００６−５９６１２）
【出願日】平成１８年３月６日（２００６．３．６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００６年２月２４日 日本薬剤学会発行の「日本薬剤学会第２１年会講演要旨集」に発表
【出願人】（０００００４１８９）日本水産株式会社 (119)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年９月２０日（２００７．９．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月６日（２００６．３．６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００６年２月２４日 日本薬剤学会発行の「日本薬剤学会第２１年会講演要旨集」に発表
【出願人】（０００００４１８９）日本水産株式会社 (119)
【Ｆターム（参考）】
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