キャピラリー電気泳動法によるヘモグロビンの分析方法、キャピラリー電気泳動キット及び該方法における流れ阻害剤の使用
【課題】キャピラリー電気泳動法によりヘモグロビンを分離する方法、前記分離に使用されるバッファ組成物、並びにキャピラリー電気泳動法によりヘモグロビンを分析するためのキットの提供。
【解決手段】分析バッファーを含むキャピラリーに試料を流通させて、ヘモグロビンを含有する試料を分析するためのアルカリｐＨでの自由溶液キャピラリー電気泳動法であって、分析バッファーの溶液を含むキャピラリー管に試料を導入する少なくとも一の工程を具備する方法において、バッファーが双性イオン性タイプであり、それに少なくとも一の流れ阻害剤が併用されることを特徴とする方法に関する。 本発明は少なくとも一の双性イオン性バッファーとの併用でのＥＣ流れ阻害剤の使用と、キャピラリー電気泳動法によりヘモグロビンを分析するキットにも関する。
【解決手段】分析バッファーを含むキャピラリーに試料を流通させて、ヘモグロビンを含有する試料を分析するためのアルカリｐＨでの自由溶液キャピラリー電気泳動法であって、分析バッファーの溶液を含むキャピラリー管に試料を導入する少なくとも一の工程を具備する方法において、バッファーが双性イオン性タイプであり、それに少なくとも一の流れ阻害剤が併用されることを特徴とする方法に関する。 本発明は少なくとも一の双性イオン性バッファーとの併用でのＥＣ流れ阻害剤の使用と、キャピラリー電気泳動法によりヘモグロビンを分析するキットにも関する。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本発明は、キャピラリー電気泳動法によりヘモグロビンを分離する方法、上記分離に使用されるバッファー組成物、並びにキャピラリー電気泳動法によりヘモグロビンを分析するためのキットに関する。
【０００２】
分析目的、特に診断目的で特に血液のような生物学的液体中のヘモグロビンＡ２及びヘモグロビン変異体を分析し、よって電気泳動法によりヘモグロビン分離する場合、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）技術を用いることが知られている。「ヘモグロビン」という用語は任意の正常な又は異常なヘモグロビンと該ヘモグロビンの変異体を意味する。キャピラリー電気泳動法の一つの利点は、分析する生物学的液体の必要量が非常に僅かで済むことである。更に、分離中に試料を加熱しすぎないで高電圧を使用することができるならば、その方法による分離は非常に迅速なものとできる。
【０００３】
選択の技術はキャピラリー等電点電気泳動法（ＣＩＥＦ）による分析である。この方法は様々な形態のヘモグロビン（Ｈｅｍｐｅ）について高分解能を達成できる。しかしながら、自動化することは困難で、電気浸透流を防止するために被覆キャピラリーを使用しなければならないので、連続して実施される分析には適合させることができない。
【０００４】
「動的二重コーティング法(dynamic double coating)」として知られている更なる技術は、アナリス(Analis)から「アナリスＨｂＡ２-ＣＥキット」又は「ＣＥｏｆｉｘ ＨｂＡ２-ＣＥキット」として販売されている市販キットを用いて実施することができる。この方法は、４．７のｐＨのポリカチオンを含む溶液を用いてのキャピラリーの最初のリンスの後に、８．７のｐＨで、ポリアニオンを含む分析バッファーを用いた第二のリンスを含む。この「二重コーティング」法では、キャピラリーの内壁上に存在する負電荷量は裸のキャピラリーの場合よりも多いので、電気浸透流は更に多い。しかしながら、この動的二重コーティング法では、ＨｂＡ２、ＨｂＣ及びＨｂＥ画分を十分良好に分離することができず、ＨｂＣ又はＨｂＥ変異体の存在下でのＨｂＡ２画分の定量分析を不可能にする。更に、ＨｂＳ及びＨｂＤ画分は同じ電気泳動位置を有しているので、酸性媒質中での補完的分析が試料中に存在する変異体の型を決定するのに必要である。最後に、二重コーティングは各試料分析間で再度作製しなければならないため、この方法は費用が嵩み大量生産試験に用いることが困難である。
【０００５】
更に、自由溶液ヘモグロビン分離法が開示されているが、ＥＣヘモグロビン分析を合理化することができる程、精度、分解能又は迅速性について期待される基準を満たしていない。Ishoka（１）（１９９２）は、５０分のオーダー、つまりヘモグロビンの分析において現在予想される時間とは合わない移動時間で、ｐＨ９．９８のホウ酸塩バッファー（１００ｍＭ）を用いたヘモグロビンの分離を記載している。同様のｐＨ及び濃度条件の同じタイプのバッファー（Jenkins）（３）、（４）及び（５）では、ＨｂＡ、ＨｂＦ及びＨｂＳ画分について達成できる分解能は不十分なものである。Sahin（２）はより酸性のｐＨ条件を記載しているが、低濃度（２０ｍＭ）のホウ酸塩又はバルビタール（５０ｍＭ）をｐＨ８．５で用いた場合のＨｂＡ、ＨｂＦ、ＨｂＳ及びＨｂＡ２画分間の分解能については極めて印象的でない結果が得られ、ｐＨ８．０のトリスバッファー（１Ｍ）の場合もＨｂＡ、ＨｂＳ及びＨｂＡ２画分間の分解能については極めて印象的でない結果が得られている。更に、トリス／アルギニンの組み合わせ（Shihabi）（６）が用いられており、ＨｂＡ／ＨｂＳの分離を可能にしたが、ＨｂＣ／ＨｂＥ及びＨｂＡ２画分は分離されなかった。最後に、米国特許ＵＳ-Ａ-５２０２００６及びＵＳ-Ａ-５４３９８２５は、バルビタール又はエチルバルビタールの使用を記載しているが、主要なヘモグロビン、つまりＨｂＡ、ＨｂＦ、ＨｂＳ及びＨｂＣ間は低分解能を生じるに過ぎない。
【０００６】
しかして、二重コーティングを用いない単一工程の分析を可能にし、自動的にかつ連続して実施することができ、特にＨｂＡ２、ＨｂＣ、ＨｂＤ、ＨｂＥ、ＨｂＳ、ＨｂＦ及びＨｂＡ形態間の満足できる分解能を保証するヘモグロビン、特にヘモグロビンＡ２を分析する方法に対する必要性が存在している。
【０００７】
しかして、本出願人は、特に自由溶液ＥＣにおいて、流れ阻害剤と併用して双性イオン性分析バッファーを使用して、上述の画分の大幅に改善された分離を一工程で達成することができ、よって補完的分離を避け、二重コーティングを行うことなく、その実施を簡略にすることができることを実証した。好ましくは、自由溶液電気泳動法が実施される（ＦＳＣＥ）。
【０００８】
よって、本発明は、ヘモグロビンを含有した試料を、分析バッファーを含むキャピラリーに流通させて、キャピラリー電気泳動法によって生物学的試料中のヘモグロビンを分離する方法であって、少なくとも分析バッファーの溶液を含むキャピラリー管に試料を導入される少なくとも一の工程を具備し、バッファーが双性イオン性タイプであり、少なくとも一の流れ阻害剤が併用される方法に関する。上記工程には、一般に、ヘモグロビンの分離、様々な変異体の移動及び検出が続く。
【０００９】
本発明において使用される双性イオン性バッファーは、少なくとも一のアミン官能基と少なくとも一の酸官能基と該酸官能基と反対の位置に少なくとも一のヒドロキシル官能基を含む、８と１０の間のｐＨで緩衝する双性イオン性バッファーである。ここで使用する「酸性官能基」という用語はカルボン酸官能基又はスルホン酸官能基を意味する。上記双性イオン性バッファーは一又は二の分子から形成されうる：アミン官能基が酸官能基を持たない第一分子によって担持される場合、上記第一分子は酸基、特にカルボン酸又はスルホン酸官能基又はアミノ酸を担持する第二分子に会合させられる。挙げることができるアミノ酸の例はグリシンである。
【００１０】
本発明によれば、流れ阻害剤は脂肪族又は環状ジアミン又はポリアミンタイプである。これらは、例えば、脂肪族ジアミン、脂肪族ポリアミン及び／又は環状ジアミン又はポリアミンから選択される。脂肪族ジアミン又はポリアミンが好ましい。挙げることができる脂肪族ジアミンの例は、１,３-ジアミノプロパン、１,４-ジアミノブタン、１,５-ジアミノペンタン、１,６-ジアミノヘキサン、Ｎ,Ｎ'-ジメチル-１,６-ヘキサンジアミン、Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラメチル-１,４-ブタンジアミン及びそれらの許容可能な誘導体及び塩である。挙げることができる脂肪族ポリアミンの例は、ジエチレントリアミン、スペルミン、テトラエチレンペンタミン及びそれらの許容可能な誘導体及び塩である。流れ阻害剤は混合物として使用することができる。
【００１１】
挙げることができる許容可能な塩は塩酸塩等である。挙げることができる誘導体の例は、脂肪族鎖の一又は複数の炭素原子が一又は複数のアルキル基で置換され、及び／又は遊離アミンの水素の一が一又は複数のアルキル基で置換されている上記化合物の誘導体である。
分析バッファー溶液はまた他の添加剤、特に様々なヘモグロビンの分離を改善するための他の添加剤を含有しうる。
更に、本発明は、少なくとも一の双性イオン性バッファーとの併用で、自由溶液ＥＣにおける、その電気泳動流れ阻害活性で知られている化合物の使用に関する。
【００１２】
次の実施例から明らかになるように、本発明の組み合わせを用いるとヘモグロビンとヘモグロビン変異体の分解能を大きく改善することができる。よって、それは既知の方法を使用して実施される分析と比較して、変異体の定性的及び定量的分析の精度と正確さを改善することができる。それはまたＨｂＣ又はＨｂＥの存在下でさえＨｂＡ２を定量することを可能にする。
本発明の双性イオン性バッファー−流れ阻害剤の組み合わせは、ＨｂＡ２、ＨｂＣ、ＨｂＤ、ＨｂＥ、ＨｂＳ、ＨｂＦ及び／又はＨｂＡタイプの正常な又は変異体ヘモグロビンが存在する試料を分析して、それらを検出し、及び／又は定量する際に特に使用される。
【００１３】
最後に、本発明は、双性イオン性タイプの少なくとも一の分析バッファー又は双性イオン性バッファーを含む少なくとも一の分析バッファーと少なくとも一の流れ阻害剤と、場合によってはｐＨ調節剤を含む、ＥＣによって生物学的試料中のヘモグロビンＡ２及びヘモグロビン変異体を分析するためのキットに関する。よって、キットは、少なくとも一の分析バッファーと本発明にかかる流れ阻害剤と、キャピラリーのリンスのための一又は複数の溶液及び／又は希釈セグメント及び／又は一（又は複数）の分析試料希釈剤を含む。キットはまた少なくとも一の溶血化溶液を含みうる。上記キットにおいて、バッファーと阻害剤と希釈剤又は他の添加剤は即時混合のために分離して保存されるか、又は混合物として保存されうる。このキットはまた場合によっては分析を実施するための指示書及び／又はソフトウェア支援情報を含む。
【００１４】
本発明の他の利点及び特徴は添付図面を参照しながら次の実施例の説明を読むと明らかになるであろう。
【００１５】
キャピラリー電気泳動を実施するための条件は当該分野で既知である。それは通常リンス溶液でキャピラリーをリンス洗浄し、分析バッファー溶液でリンス洗浄し、場合によっては試料を一又は複数回希釈し、試料を注入し、移動し検出することを含む。上記工程は自動化機械を使用して実施することができる。
キャピラリー電気泳動を実施するための試料の条件は自動キャピラリー装置（ＳＥＢＩＡ）を使用するのに適した条件である。
【００１６】
挙げることができる双性イオン性バッファーの例は、数個のヒドロキシル基を有する「トリス(Ｔris)」タイプのバッファーであり、その特定の例は次のバッファーである：トリス（２-アミノ-２-[ヒドロキシメチル]-１,３-プロパンジオール）、トリシン（Ｎ-トリス[ヒドロキシメチル]メチルグリシン）、ＴＡＰＳ（Ｎ-トリス[ヒドロキシメチル]メチル-３-アミノプロパンスルホン酸）、ＴＡＢＳ（Ｎ-トリス[ヒドロキシメチル]メチル-４-アミノブタンスルホン酸）、又はＡＭＰＤ（２-アミノ-２-メチル-１,３-プロパンジオール）又はビストリスプロパン（１,３-ビス[トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ]プロパン）で、最後の二つとトリスは場合によってはアミノ酸に結合している。
【００１７】
少数のヒドロキシル基を有する他の分子もまた好適な場合があり、例えば、特にＡＭＰＳＯ（３-[(１,１-ジメチル-２-ヒドロキシメチル)アミノ]-２-ヒドロキシ-プロパンスルホン酸）、ビシン（Ｎ,Ｎ-ビス[２-ヒドロキシメチル]グリシン）、ＨＥＰＢＳ（Ｎ-[２-ヒドロキシエチル]ピペラジン-Ｎ'-[４-ブタンスルホン]酸）である。
上に挙げたものの好適な双性イオン性バッファーはトリシンである。
これらのバッファーは既知であり商業的に入手できる。これらはまた混合物として使用することもできる。
【００１８】
上に挙げたものの中の好適な流れ阻害剤は１,４-ジアミノブタン（ＤＡＢ）、１,５-ジアミノペンタン、１,６-ジアミノヘキサン、ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）及びＮ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラメチル-１,４-ブタンジアミンである。阻害剤もまた混合物として使用することもできる。
１,４-ジアミノブタン塩酸塩が好適にトリシンと組み合わせられる。
【００１９】
「本発明の試料」という用語は分析する生物学的試料、つまり、健常な又は病気にかかった患者からの赤血球を含む任意の生物学的液体を意味する。ヒトの生物学的液体は、正常又は異常な、洗浄された血液、デカントされた血液、遠心された血液又は全血でありうる。更に、血液は溶血されうる。
ヒトの生物学的試料に加えて、動物由来の試料もまた分析することができる。試料はまた合成由来であり得、ついで本発明の方法は例えば生成をモニターすることを目的としうる。
試料は最初に例えば適当な希釈溶液、溶血化溶液又は分析バッファー溶液で希釈することができる。
【００２０】
本発明の双性イオン性バッファー／流れ阻害剤の組み合わせを用いるＥＣ方法はヒトの試料中の血液を分析しヘモグロビン及びその変異体を分離するのに特に使用される。
本発明によれば、分析バッファー溶液のｐＨは８〜１１の範囲、好ましくは８〜１０の範囲にある。
本発明の分析バッファー溶液は少なくとも一のｐＨ調節剤を更に含有してもよい。使用することができるｐＨ調節剤の例は、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ルビジウム、水酸化セシウム、水酸化フランシウム、又はアルキル部分が１〜８の炭素原子を含む水酸化モノ-、ジ-、トリ-又はテトラ-アルキルアンモニウムから選択される化合物である。
【００２１】
本発明によれば、バッファーは、通常の条件及び濃度で、つまり２０〜５００ｍＭのオーダー、好ましくは１００〜２５０ｍＭのオーダーで分析バッファー溶液に使用される。
流れ阻害剤は、約０．０１〜５０ｍＭの範囲、好ましくは０．１０〜２０ｍＭの範囲の濃度でバッファー溶液中に使用される。
更に、バッファー溶液はイオン強度を変更できる一又は複数の添加剤を含みうる。
挙げることができるそのような化合物の例は、塩、例えば硫酸塩、塩化物、及びその混合物である。
【００２２】
溶血化溶液はヘモグロビンＡ２及びヘモグロビン変異体を含む赤血球の溶血を実施することができる。それはまたＥＣ分析前に試料を希釈するためにも使用される。その組成に応じて、僅かな付加的な機械的移動（ボルテックス、撹拌、．．．）を用いて赤血球の溶血を完全にすることができる。
溶血化溶液は上述の分析バッファー（双性イオン性バッファー）、通常の細胞溶解添加剤、例えばトリトンＸ１００及び／又はサポニン及びある種の近いヘモグロビン間の分解能に正の効果を生じるための他の任意の添加剤を含む。挙げることができる一例はセビア（Sebia）の「イドラジェル(Hydragel)ヘモグロビン」溶血化溶液である。
溶血化溶液のｐＨは８〜１１の範囲、好ましくは８〜１０の範囲にある。
【００２３】
本発明のバッファー溶液は分析バッファー組成物の場合に通常の方法で調製される。つまり許容可能な担体に希釈のために液体形態又は固形形態の成分を添加することにより調製される。担体は通常は水であり、これは蒸留又は脱塩されていてもよい。
キャピラリーに用いられる材料はキャピラリー電気泳動法に通常使用されるものである。溶融石英キャピラリーを用いることができる。その内径は５〜２０００μｍでありうる。好ましくは、２００μｍ、好ましくは１００μｍ未満の内径のキャピラリーが用いられる。好ましくは、未処理の内表面のキャピラリーが使用される。当業者であればキャピラリーの種類とそのサイズを分析の用件に適合させることができる。
【００２４】
そのような裸のキャピラリーが本発明の利点を構成する。
ヘモグロビンは、洗浄され、デカントされ又は遠心された血液から得られた溶血血液について約２００ｎｍの波長で分析できる。しかし、血漿タンパク質との干渉を避けるために、それらは、洗浄され、デカントされ又は遠心された血液又は全血から得られた溶血血液を使用して、好ましくは約４１５ｎｍの波長で分析される。
【実施例】
【００２５】
材料と方法
Ａ）キャピラリー電気泳動
臨床試料のキャピラリー電気泳動を、２５ミクロンの内径の溶融石英キャピラリーを装備したＥＣ装置で実施した。
検出は約４１５ｎｍの最適化された条件下で実施した。
試料をキャピラリー装置（ＳＥＢＩＡ）中に配し、水力学的注入によって自動的に注入した。約５５０Ｖ／ｃｍの電場を印加することによって試料を８分以内で分離した。キャピラリーを各分析前に０．２５Ｍの水酸化ナトリウムと次に分析バッファー溶液を用いてリンス洗浄した。
【００２６】
分析バッファー：
使用した化学製品は分析用グレードの製品とした。
・２００ｍＭのトリシン−１５ｍＭの１,４-ジアミノブタン（Ａ）バッファーを、約９００ｍｌの脱塩水に３５．８４ｇのトリシンを溶解させた後、２．３２ｇの１,４-ジアミノブタン塩酸塩（ＤＡＢ）を加えることにより調製した。約３８．３ｍｌの５ＭのＮａＯＨを用いてｐＨを２２℃で９．３７に調節し、バッファー溶液の容積を脱塩水で１ｌに調節した。
・２００ｍＭのトリシン−１５ｍＭの１,５-ジアミノペンタン（Ｂ）バッファーを、約９００ｍｌの脱塩水に３５．８４ｇのトリシンを溶解させた後、２．６２ｇの１,５-ジアミノペンタン塩酸塩（ＤＡＢ）を加えることにより調製した。約３８．４ｍｌの５ＭのＮａＯＨを用いてｐＨを２２℃で９．４０に調節し、バッファー溶液の容積を脱塩水で１ｌに調節した。
【００２７】
・２００ｍＭのトリシン−８ｍＭのジエチレントリアミン（Ｃ）バッファーを、約９００ｍｌの脱塩水に３５．８４ｇのトリシンを溶解させた後、２．０６ｇのジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）を加えることにより調製した。約３２．４ｍｌの５ＭのＮａＯＨを用いてｐＨを２２℃で９．４０に調節し、バッファー溶液の容積を脱塩水で１ｌに調節した。
・２００ｍＭのトリシン−２０ｍＭのＮ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラメチル-１,４-ブタンジアミン（Ｄ）バッファーを、約９００ｍｌの脱塩水に３５．８４ｇのトリシンを溶解させた後、１．１５ｇのＮ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラメチル-１,４-ブタンジアミンを加えることにより調製した。約３４．７ｍｌの５ＭのＮａＯＨを用いてｐＨを２２℃で９．１９に調節し、バッファー溶液の容積を脱塩水で１ｌに調節した。
【００２８】
Ｂ）臨床試料
ＥＣに対して、デカント又は遠心したヒト血液を溶血化溶液で１／６に希釈した。これは、約９００ｍｌの脱塩水に１．００ｇのトリトンＸ１００、２．５０ｇのサポニン、３．６３ｇのトリスを溶解させることによって調製した。ｐＨは２２．０℃で８．７０に調節し、溶液の容積を脱塩水で１ｌに調節した。用いた化学製品は分析用グレードのものとした。
【００２９】
実施例１〜５
トリシン／ＤＡＢ．２ＨＣｌ分析バッファー溶液を上述のようにして調製した。
上記方法を使用して、ヒト血液に対して電気泳動を実施した。
実施例１：主要ピークとしてＨｂＡを、より小さい画分としてＨｂＡ２を含む正常なヒト血液の分析（図１）。
実施例２：小さいＨｂＡ画分、増強ＨｂＦ画分、強いＨｂＳ画分及び正常なＨｂＡ２画分を示す疾患のあるヒト血液の分析（図１）。ヘテロ接合性ＨｂＳは鎌形赤血球サイトーシス（鎌状赤血球性貧血）由来であった（図２）。
実施例３：Ａ／Ｃヘテロ接合性を提示する疾患のあるヒト血液の分析。ＨｂＣ画分は、それから良好に分離するＨｂＡ２画分の丁度前に分離する。この良好な分離はＡ２の定量を保証し、β-サラセミアの症例に、つまり増強されたＨｂＡ２画分に向けることができることを意味する（図３）。
実施例４：Ａ／Ｅヘテロ接合性を提示するヒト血液の分析。ＨｂＥ画分は、それから完全に分離するＨｂＡ２画分の直ぐ後に分離する。よって、ＨｂＥの存在下でＨｂＡ２を定量するのに問題はない（図４）。
実施例５：Ａ／Ｓヘテロ接合性を提示する血液とＡ／Ｄロサンゼルス接合性を提示する血液の混合物の分析。ＨｂＳ及びＨｂＤ画分は部分的に分離し、これは、それらが補完的分析を必要とすることなく互いに区別できることを意味している（図５）。
実施例６：β-サラセミアのヒト血液、つまり増強した割合のＨｂＡ２画分と少ないＨｂＦ画分を有する血液の分析。
【００３０】
４種の分析バッファー溶液Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤを上記の様にして調製した。
電気泳動を上述の方法を使用して実施した。
図６ａはバッファーＡ（トリシン／ＤＡＢ．２ＨＣｌ）での結果を示す。図６ｂはバッファーＢ（トリシン／１,５-ジアミノペンタン．２ＨＣｌ）での結果を示す。図６ｃはバッファーＣ（トリシン／ＤＥＴＡ）での結果を示す。図６ｄはバッファーＤ（トリシン／Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラメチル-１,４-ブタンジアミン）での結果を示す。
これらの４図を比較すると、全ての場合で、画分の各々の分離は良好であり、少量のＨｂＦ及びＨｂＡ２画分がよく焦点化されている。
【００３１】
実施例７：鎌形赤血球（鎌状赤血球細胞）ヘテロ接合性（ＨｂＳ／ＨｂＡ）を提示するヒト血液の分析
４種の分析バッファー溶液（Ａ：トリシン／ＤＡＢ．２ＨＣｌ；Ｂ：トリシン／１,５-ジアミノペンタン．２ＨＣｌ；Ｃ：トリシン／ＤＥＴＡ；Ｄ：トリシン／Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラメチル-１,４-ブタンジアミン）を上の様にして調製した（図７）。
電気泳動を上述の方法を使用して実施した。
図の順序は上述のバッファーに対応する。ここでもまた、使用されるバッファーにかかわらず、匹敵する特性が観察された。
【００３２】
文献
１． Noriaki Ishioka等, Biomedical Chromatography, vol 6, 224-226 (1992)。
２． Ahmet Sahin等, Journal of Chromatography A, 709 (1995) 121-125。
３． Margaret A Jenkins, Michael D Guerin, Journal of Chromatography B, 682 (1996), 23-24。
４． Margaret A Jenkins, Jean Hendy, Ian L Smith, J CAP ELEC. 004: 3 (1997), 137-143。
５． Margaret A Jenkins, Sujiva Ratnaike, Clinica Chimica Acta 289 (1999) 121-132。
６． Zak K Shihabi等, Electrophoresis, 21 (2000), 749-752。
７． James M Hempe, Randall D Craver, Electrophoresis, 21 (2000) 743-748。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明のバッファー溶液を使用してキャピラリー電気泳動によって分析した正常なヒト血液（ＨｂＡ、ＨｂＡ２）の電気泳動図を示す。
【図２】同じバッファー溶液を使用してキャピラリー電気泳動によって分析した血液の電気泳動図を示す。血液は次の変異体を含む：図２＝ＨｂＦ及びＨｂＳ。
【図３】同じバッファー溶液を使用してキャピラリー電気泳動によって分析した血液の電気泳動図を示す。血液は次の変異体を含む：図３＝ＨｂＣ。
【図４】同じバッファー溶液を使用してキャピラリー電気泳動によって分析した血液の電気泳動図を示す。血液は次の変異体を含む：図４＝ＨｂＥ。
【図５】同じバッファー溶液を使用してキャピラリー電気泳動によって分析した血液の電気泳動図を示す。血液は次の変異体を含む：図５＝ＨｂＳ及びＨｂＤ-Los Angels。
【図６Ａ】異なった流れ阻害剤をベースとして異なったバッファー溶液を使用してキャピラリー電気泳動によって分析したβ-サラセミア血液の電気泳動図を示す。
【図６Ｂ】異なった流れ阻害剤をベースとして異なったバッファー溶液を使用してキャピラリー電気泳動によって分析したβ-サラセミア血液の電気泳動図を示す。
【図６Ｃ】異なった流れ阻害剤をベースとして異なったバッファー溶液を使用してキャピラリー電気泳動によって分析したβ-サラセミア血液の電気泳動図を示す。
【図６Ｄ】異なった流れ阻害剤をベースとして異なったバッファー溶液を使用してキャピラリー電気泳動によって分析したβ-サラセミア血液の電気泳動図を示す。
【図７Ａ】異なった流れ阻害剤をベースとして異なったバッファー溶液を使用してキャピラリー電気泳動によって分析したＨｂＦ及びＨｂＳを含む血液の電気泳動図を示す。
【図７Ｂ】異なった流れ阻害剤をベースとして異なったバッファー溶液を使用してキャピラリー電気泳動によって分析したＨｂＦ及びＨｂＳを含む血液の電気泳動図を示す。
【図７Ｃ】異なった流れ阻害剤をベースとして異なったバッファー溶液を使用してキャピラリー電気泳動によって分析したＨｂＦ及びＨｂＳを含む血液の電気泳動図を示す。
【図７Ｄ】異なった流れ阻害剤をベースとして異なったバッファー溶液を使用してキャピラリー電気泳動によって分析したＨｂＦ及びＨｂＳを含む血液の電気泳動図を示す。
【発明の開示】
【０００１】
本発明は、キャピラリー電気泳動法によりヘモグロビンを分離する方法、上記分離に使用されるバッファー組成物、並びにキャピラリー電気泳動法によりヘモグロビンを分析するためのキットに関する。
【０００２】
分析目的、特に診断目的で特に血液のような生物学的液体中のヘモグロビンＡ２及びヘモグロビン変異体を分析し、よって電気泳動法によりヘモグロビン分離する場合、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）技術を用いることが知られている。「ヘモグロビン」という用語は任意の正常な又は異常なヘモグロビンと該ヘモグロビンの変異体を意味する。キャピラリー電気泳動法の一つの利点は、分析する生物学的液体の必要量が非常に僅かで済むことである。更に、分離中に試料を加熱しすぎないで高電圧を使用することができるならば、その方法による分離は非常に迅速なものとできる。
【０００３】
選択の技術はキャピラリー等電点電気泳動法（ＣＩＥＦ）による分析である。この方法は様々な形態のヘモグロビン（Ｈｅｍｐｅ）について高分解能を達成できる。しかしながら、自動化することは困難で、電気浸透流を防止するために被覆キャピラリーを使用しなければならないので、連続して実施される分析には適合させることができない。
【０００４】
「動的二重コーティング法(dynamic double coating)」として知られている更なる技術は、アナリス(Analis)から「アナリスＨｂＡ２-ＣＥキット」又は「ＣＥｏｆｉｘ ＨｂＡ２-ＣＥキット」として販売されている市販キットを用いて実施することができる。この方法は、４．７のｐＨのポリカチオンを含む溶液を用いてのキャピラリーの最初のリンスの後に、８．７のｐＨで、ポリアニオンを含む分析バッファーを用いた第二のリンスを含む。この「二重コーティング」法では、キャピラリーの内壁上に存在する負電荷量は裸のキャピラリーの場合よりも多いので、電気浸透流は更に多い。しかしながら、この動的二重コーティング法では、ＨｂＡ２、ＨｂＣ及びＨｂＥ画分を十分良好に分離することができず、ＨｂＣ又はＨｂＥ変異体の存在下でのＨｂＡ２画分の定量分析を不可能にする。更に、ＨｂＳ及びＨｂＤ画分は同じ電気泳動位置を有しているので、酸性媒質中での補完的分析が試料中に存在する変異体の型を決定するのに必要である。最後に、二重コーティングは各試料分析間で再度作製しなければならないため、この方法は費用が嵩み大量生産試験に用いることが困難である。
【０００５】
更に、自由溶液ヘモグロビン分離法が開示されているが、ＥＣヘモグロビン分析を合理化することができる程、精度、分解能又は迅速性について期待される基準を満たしていない。Ishoka（１）（１９９２）は、５０分のオーダー、つまりヘモグロビンの分析において現在予想される時間とは合わない移動時間で、ｐＨ９．９８のホウ酸塩バッファー（１００ｍＭ）を用いたヘモグロビンの分離を記載している。同様のｐＨ及び濃度条件の同じタイプのバッファー（Jenkins）（３）、（４）及び（５）では、ＨｂＡ、ＨｂＦ及びＨｂＳ画分について達成できる分解能は不十分なものである。Sahin（２）はより酸性のｐＨ条件を記載しているが、低濃度（２０ｍＭ）のホウ酸塩又はバルビタール（５０ｍＭ）をｐＨ８．５で用いた場合のＨｂＡ、ＨｂＦ、ＨｂＳ及びＨｂＡ２画分間の分解能については極めて印象的でない結果が得られ、ｐＨ８．０のトリスバッファー（１Ｍ）の場合もＨｂＡ、ＨｂＳ及びＨｂＡ２画分間の分解能については極めて印象的でない結果が得られている。更に、トリス／アルギニンの組み合わせ（Shihabi）（６）が用いられており、ＨｂＡ／ＨｂＳの分離を可能にしたが、ＨｂＣ／ＨｂＥ及びＨｂＡ２画分は分離されなかった。最後に、米国特許ＵＳ-Ａ-５２０２００６及びＵＳ-Ａ-５４３９８２５は、バルビタール又はエチルバルビタールの使用を記載しているが、主要なヘモグロビン、つまりＨｂＡ、ＨｂＦ、ＨｂＳ及びＨｂＣ間は低分解能を生じるに過ぎない。
【０００６】
しかして、二重コーティングを用いない単一工程の分析を可能にし、自動的にかつ連続して実施することができ、特にＨｂＡ２、ＨｂＣ、ＨｂＤ、ＨｂＥ、ＨｂＳ、ＨｂＦ及びＨｂＡ形態間の満足できる分解能を保証するヘモグロビン、特にヘモグロビンＡ２を分析する方法に対する必要性が存在している。
【０００７】
しかして、本出願人は、特に自由溶液ＥＣにおいて、流れ阻害剤と併用して双性イオン性分析バッファーを使用して、上述の画分の大幅に改善された分離を一工程で達成することができ、よって補完的分離を避け、二重コーティングを行うことなく、その実施を簡略にすることができることを実証した。好ましくは、自由溶液電気泳動法が実施される（ＦＳＣＥ）。
【０００８】
よって、本発明は、ヘモグロビンを含有した試料を、分析バッファーを含むキャピラリーに流通させて、キャピラリー電気泳動法によって生物学的試料中のヘモグロビンを分離する方法であって、少なくとも分析バッファーの溶液を含むキャピラリー管に試料を導入される少なくとも一の工程を具備し、バッファーが双性イオン性タイプであり、少なくとも一の流れ阻害剤が併用される方法に関する。上記工程には、一般に、ヘモグロビンの分離、様々な変異体の移動及び検出が続く。
【０００９】
本発明において使用される双性イオン性バッファーは、少なくとも一のアミン官能基と少なくとも一の酸官能基と該酸官能基と反対の位置に少なくとも一のヒドロキシル官能基を含む、８と１０の間のｐＨで緩衝する双性イオン性バッファーである。ここで使用する「酸性官能基」という用語はカルボン酸官能基又はスルホン酸官能基を意味する。上記双性イオン性バッファーは一又は二の分子から形成されうる：アミン官能基が酸官能基を持たない第一分子によって担持される場合、上記第一分子は酸基、特にカルボン酸又はスルホン酸官能基又はアミノ酸を担持する第二分子に会合させられる。挙げることができるアミノ酸の例はグリシンである。
【００１０】
本発明によれば、流れ阻害剤は脂肪族又は環状ジアミン又はポリアミンタイプである。これらは、例えば、脂肪族ジアミン、脂肪族ポリアミン及び／又は環状ジアミン又はポリアミンから選択される。脂肪族ジアミン又はポリアミンが好ましい。挙げることができる脂肪族ジアミンの例は、１,３-ジアミノプロパン、１,４-ジアミノブタン、１,５-ジアミノペンタン、１,６-ジアミノヘキサン、Ｎ,Ｎ'-ジメチル-１,６-ヘキサンジアミン、Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラメチル-１,４-ブタンジアミン及びそれらの許容可能な誘導体及び塩である。挙げることができる脂肪族ポリアミンの例は、ジエチレントリアミン、スペルミン、テトラエチレンペンタミン及びそれらの許容可能な誘導体及び塩である。流れ阻害剤は混合物として使用することができる。
【００１１】
挙げることができる許容可能な塩は塩酸塩等である。挙げることができる誘導体の例は、脂肪族鎖の一又は複数の炭素原子が一又は複数のアルキル基で置換され、及び／又は遊離アミンの水素の一が一又は複数のアルキル基で置換されている上記化合物の誘導体である。
分析バッファー溶液はまた他の添加剤、特に様々なヘモグロビンの分離を改善するための他の添加剤を含有しうる。
更に、本発明は、少なくとも一の双性イオン性バッファーとの併用で、自由溶液ＥＣにおける、その電気泳動流れ阻害活性で知られている化合物の使用に関する。
【００１２】
次の実施例から明らかになるように、本発明の組み合わせを用いるとヘモグロビンとヘモグロビン変異体の分解能を大きく改善することができる。よって、それは既知の方法を使用して実施される分析と比較して、変異体の定性的及び定量的分析の精度と正確さを改善することができる。それはまたＨｂＣ又はＨｂＥの存在下でさえＨｂＡ２を定量することを可能にする。
本発明の双性イオン性バッファー−流れ阻害剤の組み合わせは、ＨｂＡ２、ＨｂＣ、ＨｂＤ、ＨｂＥ、ＨｂＳ、ＨｂＦ及び／又はＨｂＡタイプの正常な又は変異体ヘモグロビンが存在する試料を分析して、それらを検出し、及び／又は定量する際に特に使用される。
【００１３】
最後に、本発明は、双性イオン性タイプの少なくとも一の分析バッファー又は双性イオン性バッファーを含む少なくとも一の分析バッファーと少なくとも一の流れ阻害剤と、場合によってはｐＨ調節剤を含む、ＥＣによって生物学的試料中のヘモグロビンＡ２及びヘモグロビン変異体を分析するためのキットに関する。よって、キットは、少なくとも一の分析バッファーと本発明にかかる流れ阻害剤と、キャピラリーのリンスのための一又は複数の溶液及び／又は希釈セグメント及び／又は一（又は複数）の分析試料希釈剤を含む。キットはまた少なくとも一の溶血化溶液を含みうる。上記キットにおいて、バッファーと阻害剤と希釈剤又は他の添加剤は即時混合のために分離して保存されるか、又は混合物として保存されうる。このキットはまた場合によっては分析を実施するための指示書及び／又はソフトウェア支援情報を含む。
【００１４】
本発明の他の利点及び特徴は添付図面を参照しながら次の実施例の説明を読むと明らかになるであろう。
【００１５】
キャピラリー電気泳動を実施するための条件は当該分野で既知である。それは通常リンス溶液でキャピラリーをリンス洗浄し、分析バッファー溶液でリンス洗浄し、場合によっては試料を一又は複数回希釈し、試料を注入し、移動し検出することを含む。上記工程は自動化機械を使用して実施することができる。
キャピラリー電気泳動を実施するための試料の条件は自動キャピラリー装置（ＳＥＢＩＡ）を使用するのに適した条件である。
【００１６】
挙げることができる双性イオン性バッファーの例は、数個のヒドロキシル基を有する「トリス(Ｔris)」タイプのバッファーであり、その特定の例は次のバッファーである：トリス（２-アミノ-２-[ヒドロキシメチル]-１,３-プロパンジオール）、トリシン（Ｎ-トリス[ヒドロキシメチル]メチルグリシン）、ＴＡＰＳ（Ｎ-トリス[ヒドロキシメチル]メチル-３-アミノプロパンスルホン酸）、ＴＡＢＳ（Ｎ-トリス[ヒドロキシメチル]メチル-４-アミノブタンスルホン酸）、又はＡＭＰＤ（２-アミノ-２-メチル-１,３-プロパンジオール）又はビストリスプロパン（１,３-ビス[トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ]プロパン）で、最後の二つとトリスは場合によってはアミノ酸に結合している。
【００１７】
少数のヒドロキシル基を有する他の分子もまた好適な場合があり、例えば、特にＡＭＰＳＯ（３-[(１,１-ジメチル-２-ヒドロキシメチル)アミノ]-２-ヒドロキシ-プロパンスルホン酸）、ビシン（Ｎ,Ｎ-ビス[２-ヒドロキシメチル]グリシン）、ＨＥＰＢＳ（Ｎ-[２-ヒドロキシエチル]ピペラジン-Ｎ'-[４-ブタンスルホン]酸）である。
上に挙げたものの好適な双性イオン性バッファーはトリシンである。
これらのバッファーは既知であり商業的に入手できる。これらはまた混合物として使用することもできる。
【００１８】
上に挙げたものの中の好適な流れ阻害剤は１,４-ジアミノブタン（ＤＡＢ）、１,５-ジアミノペンタン、１,６-ジアミノヘキサン、ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）及びＮ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラメチル-１,４-ブタンジアミンである。阻害剤もまた混合物として使用することもできる。
１,４-ジアミノブタン塩酸塩が好適にトリシンと組み合わせられる。
【００１９】
「本発明の試料」という用語は分析する生物学的試料、つまり、健常な又は病気にかかった患者からの赤血球を含む任意の生物学的液体を意味する。ヒトの生物学的液体は、正常又は異常な、洗浄された血液、デカントされた血液、遠心された血液又は全血でありうる。更に、血液は溶血されうる。
ヒトの生物学的試料に加えて、動物由来の試料もまた分析することができる。試料はまた合成由来であり得、ついで本発明の方法は例えば生成をモニターすることを目的としうる。
試料は最初に例えば適当な希釈溶液、溶血化溶液又は分析バッファー溶液で希釈することができる。
【００２０】
本発明の双性イオン性バッファー／流れ阻害剤の組み合わせを用いるＥＣ方法はヒトの試料中の血液を分析しヘモグロビン及びその変異体を分離するのに特に使用される。
本発明によれば、分析バッファー溶液のｐＨは８〜１１の範囲、好ましくは８〜１０の範囲にある。
本発明の分析バッファー溶液は少なくとも一のｐＨ調節剤を更に含有してもよい。使用することができるｐＨ調節剤の例は、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ルビジウム、水酸化セシウム、水酸化フランシウム、又はアルキル部分が１〜８の炭素原子を含む水酸化モノ-、ジ-、トリ-又はテトラ-アルキルアンモニウムから選択される化合物である。
【００２１】
本発明によれば、バッファーは、通常の条件及び濃度で、つまり２０〜５００ｍＭのオーダー、好ましくは１００〜２５０ｍＭのオーダーで分析バッファー溶液に使用される。
流れ阻害剤は、約０．０１〜５０ｍＭの範囲、好ましくは０．１０〜２０ｍＭの範囲の濃度でバッファー溶液中に使用される。
更に、バッファー溶液はイオン強度を変更できる一又は複数の添加剤を含みうる。
挙げることができるそのような化合物の例は、塩、例えば硫酸塩、塩化物、及びその混合物である。
【００２２】
溶血化溶液はヘモグロビンＡ２及びヘモグロビン変異体を含む赤血球の溶血を実施することができる。それはまたＥＣ分析前に試料を希釈するためにも使用される。その組成に応じて、僅かな付加的な機械的移動（ボルテックス、撹拌、．．．）を用いて赤血球の溶血を完全にすることができる。
溶血化溶液は上述の分析バッファー（双性イオン性バッファー）、通常の細胞溶解添加剤、例えばトリトンＸ１００及び／又はサポニン及びある種の近いヘモグロビン間の分解能に正の効果を生じるための他の任意の添加剤を含む。挙げることができる一例はセビア（Sebia）の「イドラジェル(Hydragel)ヘモグロビン」溶血化溶液である。
溶血化溶液のｐＨは８〜１１の範囲、好ましくは８〜１０の範囲にある。
【００２３】
本発明のバッファー溶液は分析バッファー組成物の場合に通常の方法で調製される。つまり許容可能な担体に希釈のために液体形態又は固形形態の成分を添加することにより調製される。担体は通常は水であり、これは蒸留又は脱塩されていてもよい。
キャピラリーに用いられる材料はキャピラリー電気泳動法に通常使用されるものである。溶融石英キャピラリーを用いることができる。その内径は５〜２０００μｍでありうる。好ましくは、２００μｍ、好ましくは１００μｍ未満の内径のキャピラリーが用いられる。好ましくは、未処理の内表面のキャピラリーが使用される。当業者であればキャピラリーの種類とそのサイズを分析の用件に適合させることができる。
【００２４】
そのような裸のキャピラリーが本発明の利点を構成する。
ヘモグロビンは、洗浄され、デカントされ又は遠心された血液から得られた溶血血液について約２００ｎｍの波長で分析できる。しかし、血漿タンパク質との干渉を避けるために、それらは、洗浄され、デカントされ又は遠心された血液又は全血から得られた溶血血液を使用して、好ましくは約４１５ｎｍの波長で分析される。
【実施例】
【００２５】
材料と方法
Ａ）キャピラリー電気泳動
臨床試料のキャピラリー電気泳動を、２５ミクロンの内径の溶融石英キャピラリーを装備したＥＣ装置で実施した。
検出は約４１５ｎｍの最適化された条件下で実施した。
試料をキャピラリー装置（ＳＥＢＩＡ）中に配し、水力学的注入によって自動的に注入した。約５５０Ｖ／ｃｍの電場を印加することによって試料を８分以内で分離した。キャピラリーを各分析前に０．２５Ｍの水酸化ナトリウムと次に分析バッファー溶液を用いてリンス洗浄した。
【００２６】
分析バッファー：
使用した化学製品は分析用グレードの製品とした。
・２００ｍＭのトリシン−１５ｍＭの１,４-ジアミノブタン（Ａ）バッファーを、約９００ｍｌの脱塩水に３５．８４ｇのトリシンを溶解させた後、２．３２ｇの１,４-ジアミノブタン塩酸塩（ＤＡＢ）を加えることにより調製した。約３８．３ｍｌの５ＭのＮａＯＨを用いてｐＨを２２℃で９．３７に調節し、バッファー溶液の容積を脱塩水で１ｌに調節した。
・２００ｍＭのトリシン−１５ｍＭの１,５-ジアミノペンタン（Ｂ）バッファーを、約９００ｍｌの脱塩水に３５．８４ｇのトリシンを溶解させた後、２．６２ｇの１,５-ジアミノペンタン塩酸塩（ＤＡＢ）を加えることにより調製した。約３８．４ｍｌの５ＭのＮａＯＨを用いてｐＨを２２℃で９．４０に調節し、バッファー溶液の容積を脱塩水で１ｌに調節した。
【００２７】
・２００ｍＭのトリシン−８ｍＭのジエチレントリアミン（Ｃ）バッファーを、約９００ｍｌの脱塩水に３５．８４ｇのトリシンを溶解させた後、２．０６ｇのジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）を加えることにより調製した。約３２．４ｍｌの５ＭのＮａＯＨを用いてｐＨを２２℃で９．４０に調節し、バッファー溶液の容積を脱塩水で１ｌに調節した。
・２００ｍＭのトリシン−２０ｍＭのＮ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラメチル-１,４-ブタンジアミン（Ｄ）バッファーを、約９００ｍｌの脱塩水に３５．８４ｇのトリシンを溶解させた後、１．１５ｇのＮ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラメチル-１,４-ブタンジアミンを加えることにより調製した。約３４．７ｍｌの５ＭのＮａＯＨを用いてｐＨを２２℃で９．１９に調節し、バッファー溶液の容積を脱塩水で１ｌに調節した。
【００２８】
Ｂ）臨床試料
ＥＣに対して、デカント又は遠心したヒト血液を溶血化溶液で１／６に希釈した。これは、約９００ｍｌの脱塩水に１．００ｇのトリトンＸ１００、２．５０ｇのサポニン、３．６３ｇのトリスを溶解させることによって調製した。ｐＨは２２．０℃で８．７０に調節し、溶液の容積を脱塩水で１ｌに調節した。用いた化学製品は分析用グレードのものとした。
【００２９】
実施例１〜５
トリシン／ＤＡＢ．２ＨＣｌ分析バッファー溶液を上述のようにして調製した。
上記方法を使用して、ヒト血液に対して電気泳動を実施した。
実施例１：主要ピークとしてＨｂＡを、より小さい画分としてＨｂＡ２を含む正常なヒト血液の分析（図１）。
実施例２：小さいＨｂＡ画分、増強ＨｂＦ画分、強いＨｂＳ画分及び正常なＨｂＡ２画分を示す疾患のあるヒト血液の分析（図１）。ヘテロ接合性ＨｂＳは鎌形赤血球サイトーシス（鎌状赤血球性貧血）由来であった（図２）。
実施例３：Ａ／Ｃヘテロ接合性を提示する疾患のあるヒト血液の分析。ＨｂＣ画分は、それから良好に分離するＨｂＡ２画分の丁度前に分離する。この良好な分離はＡ２の定量を保証し、β-サラセミアの症例に、つまり増強されたＨｂＡ２画分に向けることができることを意味する（図３）。
実施例４：Ａ／Ｅヘテロ接合性を提示するヒト血液の分析。ＨｂＥ画分は、それから完全に分離するＨｂＡ２画分の直ぐ後に分離する。よって、ＨｂＥの存在下でＨｂＡ２を定量するのに問題はない（図４）。
実施例５：Ａ／Ｓヘテロ接合性を提示する血液とＡ／Ｄロサンゼルス接合性を提示する血液の混合物の分析。ＨｂＳ及びＨｂＤ画分は部分的に分離し、これは、それらが補完的分析を必要とすることなく互いに区別できることを意味している（図５）。
実施例６：β-サラセミアのヒト血液、つまり増強した割合のＨｂＡ２画分と少ないＨｂＦ画分を有する血液の分析。
【００３０】
４種の分析バッファー溶液Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤを上記の様にして調製した。
電気泳動を上述の方法を使用して実施した。
図６ａはバッファーＡ（トリシン／ＤＡＢ．２ＨＣｌ）での結果を示す。図６ｂはバッファーＢ（トリシン／１,５-ジアミノペンタン．２ＨＣｌ）での結果を示す。図６ｃはバッファーＣ（トリシン／ＤＥＴＡ）での結果を示す。図６ｄはバッファーＤ（トリシン／Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラメチル-１,４-ブタンジアミン）での結果を示す。
これらの４図を比較すると、全ての場合で、画分の各々の分離は良好であり、少量のＨｂＦ及びＨｂＡ２画分がよく焦点化されている。
【００３１】
実施例７：鎌形赤血球（鎌状赤血球細胞）ヘテロ接合性（ＨｂＳ／ＨｂＡ）を提示するヒト血液の分析
４種の分析バッファー溶液（Ａ：トリシン／ＤＡＢ．２ＨＣｌ；Ｂ：トリシン／１,５-ジアミノペンタン．２ＨＣｌ；Ｃ：トリシン／ＤＥＴＡ；Ｄ：トリシン／Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラメチル-１,４-ブタンジアミン）を上の様にして調製した（図７）。
電気泳動を上述の方法を使用して実施した。
図の順序は上述のバッファーに対応する。ここでもまた、使用されるバッファーにかかわらず、匹敵する特性が観察された。
【００３２】
文献
１． Noriaki Ishioka等, Biomedical Chromatography, vol 6, 224-226 (1992)。
２． Ahmet Sahin等, Journal of Chromatography A, 709 (1995) 121-125。
３． Margaret A Jenkins, Michael D Guerin, Journal of Chromatography B, 682 (1996), 23-24。
４． Margaret A Jenkins, Jean Hendy, Ian L Smith, J CAP ELEC. 004: 3 (1997), 137-143。
５． Margaret A Jenkins, Sujiva Ratnaike, Clinica Chimica Acta 289 (1999) 121-132。
６． Zak K Shihabi等, Electrophoresis, 21 (2000), 749-752。
７． James M Hempe, Randall D Craver, Electrophoresis, 21 (2000) 743-748。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明のバッファー溶液を使用してキャピラリー電気泳動によって分析した正常なヒト血液（ＨｂＡ、ＨｂＡ２）の電気泳動図を示す。
【図２】同じバッファー溶液を使用してキャピラリー電気泳動によって分析した血液の電気泳動図を示す。血液は次の変異体を含む：図２＝ＨｂＦ及びＨｂＳ。
【図３】同じバッファー溶液を使用してキャピラリー電気泳動によって分析した血液の電気泳動図を示す。血液は次の変異体を含む：図３＝ＨｂＣ。
【図４】同じバッファー溶液を使用してキャピラリー電気泳動によって分析した血液の電気泳動図を示す。血液は次の変異体を含む：図４＝ＨｂＥ。
【図５】同じバッファー溶液を使用してキャピラリー電気泳動によって分析した血液の電気泳動図を示す。血液は次の変異体を含む：図５＝ＨｂＳ及びＨｂＤ-Los Angels。
【図６Ａ】異なった流れ阻害剤をベースとして異なったバッファー溶液を使用してキャピラリー電気泳動によって分析したβ-サラセミア血液の電気泳動図を示す。
【図６Ｂ】異なった流れ阻害剤をベースとして異なったバッファー溶液を使用してキャピラリー電気泳動によって分析したβ-サラセミア血液の電気泳動図を示す。
【図６Ｃ】異なった流れ阻害剤をベースとして異なったバッファー溶液を使用してキャピラリー電気泳動によって分析したβ-サラセミア血液の電気泳動図を示す。
【図６Ｄ】異なった流れ阻害剤をベースとして異なったバッファー溶液を使用してキャピラリー電気泳動によって分析したβ-サラセミア血液の電気泳動図を示す。
【図７Ａ】異なった流れ阻害剤をベースとして異なったバッファー溶液を使用してキャピラリー電気泳動によって分析したＨｂＦ及びＨｂＳを含む血液の電気泳動図を示す。
【図７Ｂ】異なった流れ阻害剤をベースとして異なったバッファー溶液を使用してキャピラリー電気泳動によって分析したＨｂＦ及びＨｂＳを含む血液の電気泳動図を示す。
【図７Ｃ】異なった流れ阻害剤をベースとして異なったバッファー溶液を使用してキャピラリー電気泳動によって分析したＨｂＦ及びＨｂＳを含む血液の電気泳動図を示す。
【図７Ｄ】異なった流れ阻害剤をベースとして異なったバッファー溶液を使用してキャピラリー電気泳動によって分析したＨｂＦ及びＨｂＳを含む血液の電気泳動図を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘモグロビンを含有した試料を、分析バッファーを含むキャピラリーに流通させて、キャピラリー電気泳動法によって生物学的試料中のヘモグロビンを分離する方法であって、少なくとも分析バッファーの溶液を含むキャピラリー管に試料を導入する少なくとも一の工程を具備する方法において、バッファーが双性イオン性タイプであり、少なくとも一の流れ阻害剤が併用されることを特徴とする方法。
【請求項２】
ヘモグロビンを移動によって分離し上記ヘモグロビンを検出することを更に含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試料が、正常又は異常な、洗浄された血液か、デカントされた血液か、遠心された血液か又は全血である血液試料であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
試料が、溶血された血液試料であることを特徴とする請求項１ないし３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
ヘモグロビンがヘモグロビンＡ２及びＣ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｆ及び／又はＡヘモグロビンであることを特徴とする請求項１ないし４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
双性イオン性バッファーが一又は二の分子から形成され、少なくとも一のアミン官能基と少なくとも一の酸官能基と該酸官能基と反対の位置に少なくとも一のヒドロキシル官能基を含むことを特徴とする、請求項１ないし５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
バッファーはトリシン、ＴＡＰＳ、ＴＡＢＳ、ＡＭＰＳＯ、ビシン又はＨＥＰＢＳ、又はアミノ酸とトリス、ＡＭＰＤ又はビストリスプロパンの組み合わせから選択されることを特徴とする、請求項１ないし６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
バッファーがトリシンであることを特徴とする請求項１ないし７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
流れ阻害剤が脂肪族又は環状ジアミン又はポリアミンタイプであることを特徴とする、請求項１ないし８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
上記流れ阻害剤が、脂肪族ジアミン、脂肪族ポリアミン及びそれらの許容可能な誘導体及び塩、並びにそれらの混合物から選択されることを特徴とする請求項１ないし９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
上記流れ阻害剤が、１,３-ジアミノプロパン、１,４-ジアミノブタン、１,５-ジアミノペンタン、１,６-ジアミノヘキサン、ジエチレントリアミン、スペルミン、Ｎ,Ｎ'-ジメチル-１,６-ヘキサンジアミン、テトラエチレンペンタミン、Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラメチル-１,４-ブタンジアミン及びそれらの許容可能な誘導体及び塩、並びにそれらの混合物から選択されることを特徴とする請求項１ないし１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
上記流れ阻害剤が、１,４-ジアミノブタン、１,５-ジアミノペンタン、１,６-ジアミノヘキサン、ジエチレントリアミン及びＮ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラメチル-１,４-ブタンジアミン及びそれらの許容可能な誘導体及び塩、並びにそれらの混合物から選択されることを特徴とする請求項１ないし１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
流れ阻害剤が、１,４-ジアミノブタンであることを特徴とする請求項１ないし１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
流れ阻害剤が、塩酸塩形態の１,４-ジアミノブタンであることを特徴とする請求項１ないし１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
バッファー溶液中のバッファー濃度が２０ｍＭから５００ｍＭの範囲にあることを特徴とする請求項１ないし１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
バッファー溶液中のバッファー濃度が１００ｍＭから２５０ｍＭの範囲にあることを特徴とする請求項１ないし１５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】
バッファー溶液中の流れ阻害剤濃度が０．０１ｍＭから５０ｍＭの範囲にあることを特徴とする請求項１ないし１６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８】
バッファー溶液中の流れ阻害剤濃度が０．１０ｍＭから２０ｍＭの範囲にあることを特徴とする請求項１ないし１７の何れか一項に記載の方法。
【請求項１９】
バッファー溶液がｐＨ調節剤を更に含有することを特徴とする請求項１ないし１８の何れか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ｐＨ調節剤が、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ルビジウム、水酸化セシウム、水酸化フランシウム、及びアルキル部分が１〜８の炭素原子を含む水酸化モノ-、ジ-、トリ-又はテトラ-アルキルアンモニウムから選択されることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
キャピラリーが裸であることを特徴とする請求項１ないし２０の何れか一項に記載の方法。
【請求項２２】
キャピラリーが溶融石英から形成されていることを特徴とする請求項１ないし２１の何れか一項に記載の方法。
【請求項２３】
分析バッファー溶液のｐＨが８〜１０の範囲にあることを特徴とする請求項１ないし２２の何れか一項に記載の方法。
【請求項２４】
電気泳動法が自由溶液キャピラリー電気泳動タイプであることを特徴とする請求項１ないし２３の何れか一項に記載の方法。
【請求項２５】
バッファー溶液中の少なくとも一の双性イオン性バッファーとの併用で、ヘモグロビンのキャピラリー電気泳動法における、脂肪族及び環状ジアミン及びポリアミンから選択される流れ阻害剤の使用。
【請求項２６】
流れ阻害剤が、脂肪族アミン、脂肪族ポリアミン及びそれらの許容可能な誘導体及び塩、並びにそれらの混合物から選択される請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
双性イオン性バッファーが約２０〜５００ｍＭの濃度で存在し、阻害剤が約０．０１〜５０ｍＭの濃度で存在する請求項２５又は２６に記載の使用。
【請求項２８】
自由溶液キャピラリー電気泳動法における請求項２５ないし２７の何れか一項に記載の使用。
【請求項２９】
双性イオン性タイプの少なくとも一の分析バッファー又は双性イオン性バッファーを含む少なくとも一の分析バッファーと少なくとも一の流れ阻害剤と、場合によってはｐＨ調節剤を含むキャピラリー電気泳動ヘモグロビン分析キット。
【請求項３０】
溶血化溶液を更に含むことを特徴とする請求項２９に記載の分析キット。
【請求項１】
ヘモグロビンを含有した試料を、分析バッファーを含むキャピラリーに流通させて、キャピラリー電気泳動法によって生物学的試料中のヘモグロビンを分離する方法であって、少なくとも分析バッファーの溶液を含むキャピラリー管に試料を導入する少なくとも一の工程を具備する方法において、バッファーが双性イオン性タイプであり、少なくとも一の流れ阻害剤が併用されることを特徴とする方法。
【請求項２】
ヘモグロビンを移動によって分離し上記ヘモグロビンを検出することを更に含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試料が、正常又は異常な、洗浄された血液か、デカントされた血液か、遠心された血液か又は全血である血液試料であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
試料が、溶血された血液試料であることを特徴とする請求項１ないし３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
ヘモグロビンがヘモグロビンＡ２及びＣ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｆ及び／又はＡヘモグロビンであることを特徴とする請求項１ないし４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
双性イオン性バッファーが一又は二の分子から形成され、少なくとも一のアミン官能基と少なくとも一の酸官能基と該酸官能基と反対の位置に少なくとも一のヒドロキシル官能基を含むことを特徴とする、請求項１ないし５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
バッファーはトリシン、ＴＡＰＳ、ＴＡＢＳ、ＡＭＰＳＯ、ビシン又はＨＥＰＢＳ、又はアミノ酸とトリス、ＡＭＰＤ又はビストリスプロパンの組み合わせから選択されることを特徴とする、請求項１ないし６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
バッファーがトリシンであることを特徴とする請求項１ないし７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
流れ阻害剤が脂肪族又は環状ジアミン又はポリアミンタイプであることを特徴とする、請求項１ないし８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
上記流れ阻害剤が、脂肪族ジアミン、脂肪族ポリアミン及びそれらの許容可能な誘導体及び塩、並びにそれらの混合物から選択されることを特徴とする請求項１ないし９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
上記流れ阻害剤が、１,３-ジアミノプロパン、１,４-ジアミノブタン、１,５-ジアミノペンタン、１,６-ジアミノヘキサン、ジエチレントリアミン、スペルミン、Ｎ,Ｎ'-ジメチル-１,６-ヘキサンジアミン、テトラエチレンペンタミン、Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラメチル-１,４-ブタンジアミン及びそれらの許容可能な誘導体及び塩、並びにそれらの混合物から選択されることを特徴とする請求項１ないし１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
上記流れ阻害剤が、１,４-ジアミノブタン、１,５-ジアミノペンタン、１,６-ジアミノヘキサン、ジエチレントリアミン及びＮ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラメチル-１,４-ブタンジアミン及びそれらの許容可能な誘導体及び塩、並びにそれらの混合物から選択されることを特徴とする請求項１ないし１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
流れ阻害剤が、１,４-ジアミノブタンであることを特徴とする請求項１ないし１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
流れ阻害剤が、塩酸塩形態の１,４-ジアミノブタンであることを特徴とする請求項１ないし１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
バッファー溶液中のバッファー濃度が２０ｍＭから５００ｍＭの範囲にあることを特徴とする請求項１ないし１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
バッファー溶液中のバッファー濃度が１００ｍＭから２５０ｍＭの範囲にあることを特徴とする請求項１ないし１５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】
バッファー溶液中の流れ阻害剤濃度が０．０１ｍＭから５０ｍＭの範囲にあることを特徴とする請求項１ないし１６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８】
バッファー溶液中の流れ阻害剤濃度が０．１０ｍＭから２０ｍＭの範囲にあることを特徴とする請求項１ないし１７の何れか一項に記載の方法。
【請求項１９】
バッファー溶液がｐＨ調節剤を更に含有することを特徴とする請求項１ないし１８の何れか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ｐＨ調節剤が、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ルビジウム、水酸化セシウム、水酸化フランシウム、及びアルキル部分が１〜８の炭素原子を含む水酸化モノ-、ジ-、トリ-又はテトラ-アルキルアンモニウムから選択されることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
キャピラリーが裸であることを特徴とする請求項１ないし２０の何れか一項に記載の方法。
【請求項２２】
キャピラリーが溶融石英から形成されていることを特徴とする請求項１ないし２１の何れか一項に記載の方法。
【請求項２３】
分析バッファー溶液のｐＨが８〜１０の範囲にあることを特徴とする請求項１ないし２２の何れか一項に記載の方法。
【請求項２４】
電気泳動法が自由溶液キャピラリー電気泳動タイプであることを特徴とする請求項１ないし２３の何れか一項に記載の方法。
【請求項２５】
バッファー溶液中の少なくとも一の双性イオン性バッファーとの併用で、ヘモグロビンのキャピラリー電気泳動法における、脂肪族及び環状ジアミン及びポリアミンから選択される流れ阻害剤の使用。
【請求項２６】
流れ阻害剤が、脂肪族アミン、脂肪族ポリアミン及びそれらの許容可能な誘導体及び塩、並びにそれらの混合物から選択される請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
双性イオン性バッファーが約２０〜５００ｍＭの濃度で存在し、阻害剤が約０．０１〜５０ｍＭの濃度で存在する請求項２５又は２６に記載の使用。
【請求項２８】
自由溶液キャピラリー電気泳動法における請求項２５ないし２７の何れか一項に記載の使用。
【請求項２９】
双性イオン性タイプの少なくとも一の分析バッファー又は双性イオン性バッファーを含む少なくとも一の分析バッファーと少なくとも一の流れ阻害剤と、場合によってはｐＨ調節剤を含むキャピラリー電気泳動ヘモグロビン分析キット。
【請求項３０】
溶血化溶液を更に含むことを特徴とする請求項２９に記載の分析キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【公開番号】特開２００６−１４５５３７（Ｐ２００６−１４５５３７Ａ）
【公開日】平成１８年６月８日（２００６．６．８）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２００５−３３４５０４（Ｐ２００５−３３４５０４）
【出願日】平成１７年１１月１８日（２００５．１１．１８）
【出願人】（５０４４１９５０８）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年６月８日（２００６．６．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３３４５０４（Ｐ２００５−３３４５０４）
【出願日】平成１７年１１月１８日（２００５．１１．１８）
【出願人】（５０４４１９５０８）
【Ｆターム（参考）】
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