キャリヤー、ターゲッティング部分、および造影剤を含んでいる医療用イメージングのための接合体
この発明は、体への薬剤の送達に関する。このような薬剤の１つの特定の種類は、医療用イメージング技術において有用な造影剤である。これらの薬剤は、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）を包む、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）または核イメージングにおける造影剤として、または放射線治療における治療薬として有用な金属であってもよい。これらの薬剤はあるいはまた、Ｘ線イメージングにおいて有用な造影剤であってもよい。本発明はまた、体への送達剤が、キャリヤーへ、および体内の特定の部位へ薬剤を向けるのに効果的なターゲティング部分へ連結されうる方法にも関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、体への薬剤の送達に関する。このような薬剤のある種類は、医薬用イメージング技術において有用な造影剤である。これらの薬剤は、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）を包含する、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、または核イメージングにおける造影剤として、または放射線治療における治療薬として有用な金属であってもよい。これらの薬剤は、あるいはまた、Ｘ線イメージングにおいて有用な造影剤であってもよい。本発明はまた、体へ送達される薬剤を、キャリヤーへ、および体内の特定の部位へ薬剤を向けるのに効果的なターゲッティング部分へ、結合する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
例えばＭＲＩまたはＸ線イメージングなどの技術によって得られる画像のコントラストを、適切な造影剤の先行投与によって向上させることは知られている。Ｘ線イメージングの場合、このような薬剤は典型的には、極めて放射線不透過性の材料であり、一方、ＭＲＩの場合、これらは典型的には、これらが導入される媒質の緩和時間に影響を与える常磁性種である。核イメージングにおいて、放射性種が位置する体内の部位を視覚化するのに用いられる信号を発生させるために、放射性種が用いられる。
【０００３】
改良された性能を示す造影剤を含有する新調合物を開発するために、多くの試みがなされてきた。このような改良は、体内での造影剤の滞留時間の増加、および薬剤が送達される特異性の改良、すなわち体内の特定の部位における薬剤の濃度を含みうる。
【０００４】
核イメージングにおいて、放射性金属イオンは、キレート部分、例えばジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）を用いて、モノクローナル抗体（Ｍａｂ）へ直接付着されてきた。しかしながらこの化学作用は、非特異的であることが発見されており、一般に、抗体結合活性の減少を生じ、この減少幅は、Ｍａｂへ連結される薬剤の増量とともに増加する。
【０００５】
例えばモノクローナル抗体が、ＤＴＰＡ無水物（ＤＴＰＡａ）で標識され、この錯体は、［153Ｓｍ］塩化物をキレートするために用いられた（Ｂｏｎｉｆａｃｅら、１９８９、Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ ３０：６８３−６９１）。この錯体は、２０の金属イオンが加えられた時、９０％超の抗体結合活性を保持した。しかしながら金属イオンの数が５０に増加した時、免疫反応性は、５０％以下に低下した。金属での抗体の標識は、抗体結合活性が悪影響を受ける前に結合されうるモル比の点で、明らかに制限されている。
【０００６】
ほかの研究者らは、２：１という低いＤＴＰＡ：Ｍａｂ比において、抗体結合活性の明確な損失が生じることを示している（Ｐａｉｋら、１９８７、Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ ２４：１１５８−１１６３）。
【０００７】
いくつかの商用抗体ベース製品を生成するために、抗体の直接標識が用いられてきた。例えばＣＥＡ−ｓｃａｎ（商標）およびＯｎｃｏ−Ｓｃｉｎｔ（商標）は、癌をイメージングするために用いることができる、商品として入手しうる薬剤である。これらの薬剤は、99mＴｃで直接標識された抗体からなり、静脈投与した時、これらは、癌細胞に結合する。
【０００８】
同様の手法が、ＭＲＩの分野においても取られ、この場合、初期の研究は、ＤＴＰＡａを用いて、ＤＴＰＡ−Ｇｄでモノクローナル抗体を標識することを調べた（Ｕｎｇｅｒら、１９８５、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｒａｄｉｏｌ ２０（７）：６９３−７００）。しかしながらＧｄ積載のレベルは、非常に低く（１抗体分子あたり１．５Ｇｄ3+イオン）、抗体−ＤＴＰＡ−Ｇｄによる画像の向上は、ｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて見ることができなかった。ＭＲＩによって検出されるのに十分大きな信号を生成するために、少なくとも１００Ｇｄ原子が各抗体分子へ結合される必要があるであろうと仮定された。
【０００９】
同様な線に沿ったほかの手法が、文献において報告されている（例えば、Ｓｈａｈｂａｚｉ−Ｇａｈｒｏｕｅｉら、２００２、Ａｕｓｔ Ｐｈｙｓ ａｎｄ Ｅｎｇ Ｓｃｉ ｉｎ Ｍｅｄ ２５（１）：３１−３８、Ｍａｔｓｕｍｕｒａら（１９９４）、Ａｃｔａ ｎｅｕｒｏｃｈｉｒｕｒｇｉｃａ ６０：３５６−３５８、Ｃｕｒｔｅｔら（１９８８）、Ｉｎｔｌ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ２：１２６−１３２）。
【００１０】
造影剤とターゲッティング部分、例えば抗体との直接接合に関わるすべての手法について共通の問題は、造影剤の添加は低レベルに維持されなければならないが、それは、さもなければ抗体の免疫反応性が悪影響を受けるからである。造影剤の積載量は、その結果として、さもなければ望ましい積載量よりも低くなることがあり、そのため所望のコントラスト作用よりも低くなることがある。同様に、治療薬がターゲッティング部分と接合される場合、この薬剤の有効性は、この薬剤の積載量を比較的低く維持する必要性によって弱められることがある。
【００１１】
血液プールにおける造影剤の滞留時間を増加させるために、造影剤用のキャリヤーとして、ポリマー分子が用いられてきた。初期の実験においては、ヒトアルブミンやポリリジンなどのキャリヤーがＤＴＰＡで標識され、ＭＲＩ造影金属を運ぶために用いられた（例えばポリリジンに結合されたＤＴＰＡ−Ｇｄ、Ｇｅｒｈａｒｄら（１９９４）、ＭＲＭ３２：６２２−６２８参照）。ほかの研究においては、ウシ血清アルブミンおよびウシ免疫グロブリンが、ＤＴＰＡおよびＧｄで標識され（Ｌａｕｆｆｅｒら（１９８５）、Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ ３（１）：１１−１６）、ポリ−Ｌ−リジン主鎖をベースとするポリペプチドが、ＤＴＰＡａと反応させられ、イメージングの目的で111Ｉｎをキレートするために用いられた（Ｐｉｍｍら（１９９２）、Ｅｕｒ Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ １９：４４９−４５２）。これらの研究において、キャリヤー結合造影剤は、血液プール中でより長い滞留時間を有することが発見された。
【００１２】
上に概略を示した２つの一般的な手法を組合わせるため、すなわちキャリヤー分子を利用して、造影剤の積載量を増加させ、ターゲッティング部分を用いて特異性を改良するための試みもなされてきた。
【００１３】
１つの研究において（Ｇｏｈｒ−Ｒｏｓｅｎｔｈａｌら（１９９３）、Ｉｎｖｅｓｔ Ｒａｄｉｏｌ ２８：７８９−７９５）、ＤＴＰＡ−Ｇｄで標識されたポリリジンが、ＭＲＩ造影剤として用いられた。平均して、１ポリマーあたり６５Ｇｄイオンという積載量が達成された。これは、モノクローナル抗体へ連結され、ヌードマウス上のヒト腫瘍を評価するために用いられた。過ヨウ素酸塩での抗体の活性化後、ポリマーの２００倍モル過剰を用い、還元性アミド化によってＭａｂがポリリジンＤＴＰＡへ連結された。ついでＧｄ3+が、１０倍モル過剰で添加された。抗体結合研究は、抗体結合活性が、遊離抗体と比較して６０〜７０％減少したことを示した。同様に、ポリリジン抗体接合体が免疫原性であり、主要器官、例えば肝臓および腎臓によって取り込まれることも注目された。
【００１４】
ＤＴＰＡ−Ｇｄを有するポリ（Ｌ−リジン）鎖とＭａｂとの接合のもう１つの例は、Ｍａｎａｂｅら（１９８６）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ａｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ ８８３（３）：４６０−４６７によって記載された。
【００１５】
同様な手法が、体への薬品の送達に関連して取られた。例えば、抗癌剤のメトトレキセート（ＭＴＸ）が、ヒト結成アルブミンへ連結された（Ｐｉｍｍら、１９８８、「抗癌剤の開発におけるヒト腫瘍異種移植（Ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｕｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ ｉｎ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」、ｐｐ９５−９８、ｐｕｂｌ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ）。３０までのＭＴＸ分子が、アルブミンへ化学的に連結され、その結果生じた接合体が、抗体へ化学的に連結された。しかしながら、抗体−アルブミン−ＭＴＸ接合体は、遊離抗体と比較して、血液プールの半減期がはるかに短かった。
【００１６】
ＭＴＸを用いた同様な研究が、Ｈａｒｔｕｎｇら（１９９９）、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５（４）：７５３−７５９によってなされた。この中で、はるかに低いレベルのＭＴＸが、ＨＳＡ分子へ積まれた。この減少された薬品負荷を用いた場合、この薬品の半減期は、３週間までであると評価された。
【００１７】
ＷＯ９４／１２２１８号および第ＵＳ４，７９４，１７０号は、慢性Ｂ型肝炎の治療のために、肝臓へ抗ウイルスヌクレオシド接合体を向けるための、ラクトースアミノ化ヒトアルブミンの使用について記載している。ＷＯ９０／０１９００号は、特異的細胞型へのＭＲＩ造影剤の標的送達のためのキャリヤー系について記載している。これは、常磁性材料のための錯化剤へ化学的に結合された細胞型用受容体特異的リガンドを含んでいる。ポリ（Ｌ−リジン）は、１ターゲッティング基あたりのキレート基の数を増加させるために、アシアログリコプロテイン標的剤へ連結される。しかしながらポリ（Ｌ−リジン）連結は、キレート基の付着の前に実施され、したがってこの錯体の結合活性に対する潜在的に有害な作用を有するポリ（Ｌ−リジン）キャリヤーおよびアシアログリコプロテイン標的剤の変性が、必然的に起こることになる。
【００１８】
体への薬剤の標的化送達のほかの手法は、典型的には１０μｍ未満の寸法を有する分子凝集体（例えばリポソーム）および粒子の使用を伴っていた。
【００１９】
リポソームを用いて行なわれた研究の例には、次のものが含まれる：
米国特許第５，９２９，０４４号は、標的剤を用いた、細胞への生物活性化合物の送達について記載している。この生物活性剤は、リポソームまたはウイルスのどちらかの中において運ばれる。
【００２０】
イメージング剤のキャリヤ−／標的キャリヤーとしてのリポソームの使用に関する多数の出版物が、Ｃａｒｉｄｅ（１９８５）の「治療薬キャリヤー系における批判的評論（Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、１（２）１２１−１５３、およびＴｉｌｃｏｃｋ（１９９９）Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖｉｅｗｓ３７：３３−５１によって記載されている。
【００２１】
ＤＴＰＡ−Ｇｄはステアリルアミンへ化学的に連結され、リポソーム膜の表面中に組み込まれてきた。これらの粒子は、ＤＴＰＡ−Ｇｄ単独と比較して、増加した緩和能（ｒｅｌａｘｉｖｉｔｙ）を有していた（Ｋｕｎｉｍａｓａら（１９９２）Ｃｈｅｍ ａｎｄ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ（Ｊａｐａｎ）４０（９）：２５６５−２５６７）。
【００２２】
多くの研究がなされているもう１つの分野は、造影剤を送達するためのナノ粒子の使用、および疾病部位へ薬剤を送達するためのこれらのナノ粒子の標的化である。
【００２３】
ナノ粒子を用いて実施された研究例には、次のものが含まれる：
フィブリン標的Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ビス−オレエートナノ粒子を用いた血栓のイメージング、およびフィブリンを用いたＧｄ−ＤＴＰＡ−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）ナノ粒子での同様な標的化が、Ｗｉｎｔｅｒら（２００３）「医学における磁気共鳴（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、５０（２）：４１１−４１６によって記載されている。
【００２４】
いくつかのグループが、標的化酸化鉄ナノ粒子の使用について記載している。例えばＳｕｗａら（１９９８）Ｉｎｔｌ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ７５（４）：６２６−６３４は、上皮成長因子に対して向けられた、Ｍａｂでコーティングされたスーパーパラマグネタイト（Ｔ２造影剤）のナノ粒子について記載した。同様な研究が、Ｍａｂ標識ポリエチレングリコールコーティングされた鉄ナノ粒子を用いたＳｕｚｕｋｉら（１９９６）の「脳腫瘍病理学（Ｂｒａｉｎ Ｔｕｍｏｕｒ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）」によって行なわれた。
【００２５】
別の手法において、Ａｒｔｅｍｏｖら（２００３）「医学における磁気共鳴」（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、４９（３）：４０３−４０８は、ビオチニル化されているＭａｂを用いてチロシンキナーゼＨｅｒ−２／ｎｅｕ受容体をまず標的化することについて記載した。ついでストレプトアビジン標識スーパーパラマグネタイトナノ粒子が、これらのビオチニル化癌細胞を標的とするために用いられた。これらのナノ粒子は、強いＴ２ＭＲＩコントラストを発生させた。
【００２６】
多数のＧｄ−ＤＴＰＡ錯体が外部表面上に組み込まれているフィブリン標的脂質カプセル化ペルフルオロカーボンナノ粒子からなるＴ１造影剤が、Ｙｕら（２０００）「医学における磁気共鳴」（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、４４（６）：８６７−８７２によって記載されている。これは、血塊へ強力に結合することが証明された。
【００２７】
もう１つのペルフルオロカーボンベースのナノ粒子が、Ａｎｄｅｒｓｏｎら（２０００）Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４４（３）：４３３−４３９によって記載された。この中で、Ｇｄ−ペルフルオロカーボンナノ粒子が、（特異的Ｍａｂを用いて）脈管形成性内皮上に存在するアルファ（ｖ）ベータ（３）インテグリンへ標的化された。
【００２８】
ヒト膀胱癌に対するＭａｂが、Ｓａｍｔｅｎ（１９９６）Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６：５４−５７によって、アドリアマイシン積載ヒトアルブミンナノ球へ連結された。
【００２９】
キャリヤー／標的キャリヤーとしての微小球の使用が、いくつかの論文に記載されている。例えば、Ｋｌｉｂａｎｏｖ（１９９９）Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖｉｅｗｓ ３７：１３９−１５７は、標識することができ、かつ標的造影剤として用いることができる、ガス充填された超微粒気泡について記載した。ＷＯ０３／０１５７５６号は、タンパク質材料の微小球の調製方法、および治療薬および造影剤のこれらの微小球中への組み込みについて記載している。
【００３０】
アルブミン微粒子へ連結された薬品の送達について記載している多くの出版物があった。例えば細胞傷害性薬品（ドキソルビシンおよびミトマイシンｃ）が、４０μｍヒトアルブミン微小球上に積載され、結腸直腸肝臓転移を有する患者の肝臓へ投与されている（Ｋｅｒｒら（１９９２）ＥＸＳ（スイス）６１、３３９−３４５）。
【００３１】
実施されてきた研究のボリュームにも関わらず、効果的な標的化のために、該薬剤を有する接合体の十分な積載、およびターゲッティング部分の結合活性の保持への相反する必要を満たす、体への送達剤の標的化接合体へのニーズが依然として存在する。
【００３２】
したがって、キャリヤーと薬剤との接合、およびこの接合体を意図された作用部位へ向けるターゲッティング部分との接合による、薬剤、特に造影剤の体への標的化送達のための手段であって、この接合体がターゲッティング部分の十分に高い結合活性を維持しつつこの薬剤の高い積載量を受け入れる手段を提供することが、本発明の１つの目的である。
【００３３】
本発明のもう１つの目的は、ターゲッティング部分との多数の共有結合の形成によって引き起こされることがあるターゲッティング部分の結合活性の破壊をともなわずに、多数の造影剤と１つまたはそれ以上のターゲッティング部分との結びつきを可能にすることである。
【００３４】
金属イオンの体内での局在化における高度の特異性を維持しつつ、多量の金属イオンの体への標的化送達のための手段を提供することが、本発明のさらにもう１つの目的である。
【００３５】
体への薬剤の送達用の標的化接合体の組立てのための方法であって、この接合体の標的化における高度の特異性を維持しつつ、これらの接合体が該薬剤の高い積載量を運ぶことを可能にする方法を提供することが、本発明のさらにもう１つの目的である。
【特許文献１】ＷＯ９４・１２２１８号
【特許文献２】ＷＯ９０／０１９００号
【特許文献３】米国特許４，７９４，１７０号
【特許文献４】米国特許５，９２９，０４４号
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００３６】
本発明の第一の態様によれば、医療用イメージングにおける使用のための接合体であって、タンパク質分子またはタンパク質分子から形成された粒子の形態のキャリヤーを含み、このキャリヤーが、造影剤またはその前駆体へ、および体内の特定の部位との親和性を有するターゲッティング部分へ結合されている接合体が提供される。
【００３７】
造影剤の「前駆体」とは、それ自体が造影剤として効果的でないが、使用前にいくつかのほかの種との反応または混合によって効果的にすることができる部分を意味する。このような前駆体の一例は、造影剤として機能する金属キレートを形成するように金属イオンとの結合を形成しうる金属キレート部分である。
【００３８】
「医療用イメージング」とは、診断、研究、または治療的処理の目的で、人体または動物の体の内部区域を可視化するために用いられるあらゆる技術を意味する。このような技術には、主としてＸ線イメージング、ＭＲＩ、および核イメージングが含まれ、ＰＥＴも含まれる。このような技術を向上するのに有用な薬剤は、体内の特定の部位、器官、または疾病部位の可視化を可能にし、および／またはイメージング技術によって発生された画像の品質における何らかの改良につながる材料であり、これらの画像の改良された、またはより容易な解釈を与える。このような薬剤は、本明細書において造影剤と呼ばれ、これらの使用は、画像の異なる区域間の「コントラスト」を高めることによって、この画像の異なる部分の区別を容易にする。したがって「造影剤」という用語は、（例えばＭＲＩの場合のように）このような薬剤の不存在下においても作られうる画像の品質を向上させるために用いられる薬剤、ならびに（例えば核イメージングの場合のように）画像の発生のための前提となっている薬剤を包含する。
【００３９】
この接合体は「造影剤」および「ターゲッティング部分」を含んでいるが、実際には実質的に多数の造影剤（またはこれらの前駆体）が各キャリヤーに結合され、１つより多いターゲッティング部分がキャリヤーへ結合されてもよいと理解されるであろう。一般に、キャリヤーがタンパク質分子の形態を有する場合、各キャリヤーへ結合された造影剤の数は、数十、例えば１０〜１００、より好ましくは２０〜６０、例えば２０〜５０であってもよい。同様な数の造影剤が、粒子の形態のキャリヤーを構成する各タンパク質分子へ結合されてもよい。しかしながら１つの粒子が一般に、非常に多数の個々のタンパク質分子（おそらく１０3〜１０11分子）から形成されるので、各粒子と結びついた造影剤の全体数は、それに対応して大きくなるであろう。キャリヤーがタンパク質分子の形態を有する場合、１キャリヤーあたりのターゲッティング部分の数は一般に５未満であり、たった１つであることもある。微粒子キャリヤーの場合、ターゲッティング部分の数はこれよりもかなり多くてもよく、一般にこれよりもかなり多いであろう。キャリヤーがタンパク質分子の形態にある場合、１つより多いキャリヤーが単一ターゲッティング部分へ連結されることも可能である。ただし、１ターゲッティング部分あたりのキャリヤーの数は一般に１０未満であろうし、普通は１、２、または３である。一般に、少数のキャリヤーのみがターゲッティング部分へ結合されるのが好ましいが、それは、ターゲッティング部分とキャリヤーとの間の過剰な数の結合はターゲッティング部分の結合活性に対して悪影響を有することがあるからである。
【００４０】
本発明による接合体は一般に、製薬的に許容しうる液体媒質を含んでいる調合物として体へ投与される。この媒質は一般に、水性媒質、最も普通には適切な賦形剤を含有する水溶液であろう。このような賦形剤は、１つまたはそれ以上の張性調節剤、防腐剤、界面活性剤、およびほかの従来の製薬賦形剤を含んでいてもよい。
【００４１】
本発明による接合体は、液体媒質中に可溶であってもよく、この場合この調合物は一般にこの接合体の溶液であろう。あるいはまたキャリヤーが粒子である場合、この粒子、したがってこの接合体は一般に不溶性であろうし、この調合物は液体溶媒中のこの接合体の懸濁液または分散液であろう。
【００４２】
したがって本発明の第二の態様によれば、本発明の第一の態様による接合体を、製薬的に許容しうる液体媒質と混合して含んでいる調合物が提供される。
【００４３】
本発明による接合体および調合物は、多くの点で有利である。第一に、これらは造影剤の血流中の滞留時間を延ばすことができる。さらには、特定の器官または疾病部位との親和性を有するターゲッティング部分の存在は、その位置への造影剤の送達を向上させ、例えば造影剤を特定の器官または疾病部位（例えば肝臓または腫瘍中）に蓄積させることによって、これらの薬剤の生体分布を改変し、その器官または疾病部位を標的とし視覚化することを可能にする。造影剤のための「キャリヤー」の使用は、体内の所望の部位へ送達される造影剤の量を増加させることができる。このことは、背景（非疾病）組織に対する信号／ノイズ比の増加によって検出を向上させうる。ターゲッティング部分の使用は、正常／健康な組織への薬剤の送達を避ける。さらには下で説明されているように、多量の造影剤が、ターゲッティング部分の結合能力を損傷することなく、キャリヤーへ接合されうる。
【００４４】
本発明において用いうるＭＲＩ造影剤には、金属イオン、特にガドリニウムが含まれる。このようなイオンは、キャリヤー材料へ共有結合されているキレート部分を介してキャリヤー材料へ連結されうる。
【００４５】
同様に、核イメージングにおいて有用な金属、例えば99mＴｃ、201Ｔｌ、および111Ｉｎもまた、直接または間接的（例えばキレート部分を介して）にキャリヤー材料へ連結されうる。
【００４６】
造影剤として効果的な金属が本発明の第一の態様による接合体の形態で体に送達されうる方法と同様にして、ほかの金属もほかの目的のために体へ送達されてもよい。例えばいくつかの金属は直接治療効果を有しうる。例えば放射線治療において有用な放射性金属である。このような放射性金属の１つは67Ｃｕであり、これはイメージング技術において用いられる金属と類似の方法においてキャリヤーへ結合されうる。その結果生じた接合体は、標的化された放射線治療に用いることができる。
【００４７】
したがって本発明のもう１つの態様において、体への金属の送達のための接合体であって、タンパク質分子またはタンパク質分子から形成された粒子の形態のキャリヤーを含み、このキャリヤーがキレート剤を介して前記金属へ連結され、かつ体内の特定の位置との親和性を有するターゲッティング部分と接合されている、接合体が提供される。
【００４８】
上記のように、この金属は例えばＭＲＩまたは核イメージングにおける造影剤として有用な金属であってもよく、またはこれは治療において有用な金属、例えば放射線治療において有用な放射性金属であってもよい。１つより多い種類の金属（例えば造影剤（例えばガドリニウム）と放射線治療薬（例えば67Ｃｕ）との混合物）を含有する接合体を調製することも可能である。同様に、１つより多い接合体（例えば造影剤を含んでいる第一接合体、および放射線治療薬を含んでいる第二接合体）を含む調合物を調製することも可能である。このような手段によって、従来のイメージング技術を用いて体内でのこの薬剤の正確な送達および位置を決定し、そうすることにおいて放射性同位元素の首尾良い送達を確認することが可能である。
【００４９】
放射性同位元素および／またはイメージング剤を運んでいてもよい、より大きいサイズ（例えば１０μｍ以上）の粒子を調製することも可能であろう。これらは腫瘍の微小循環中へ（例えばカテーテルによって）送達することができ、したがって毛管遮断によって血液供給を減少させることができる。さらには、放射性同位元素が粒子上に存在する場合、これは腫瘍中に送達され（その結果細胞死を生じる）、造影剤、例えばガドリニウムの存在は、従来のイメージング技術（例えばＭＲＩ）を用いて経時的に腫瘍をイメージングすることを可能にするであろう。
【００５０】
本発明の第一の態様による接合体は、ターゲッティング部分の不存在下において、キャリヤーと造影剤とを、またはこれの前駆体とを反応させ、その後ヘテロ二官能性架橋剤を用いてターゲッティング部分へキャリヤーを連結することによって調製することができる。この方法はより一般的に適用可能であり、多様なキャリヤーと体への送達剤との標的化された接合体の調製において有用である。したがって本発明のもう１つの態様によれば、体への送達剤とキャリヤーとの標的化された接合体の調製方法であって、
（ａ）体への送達剤またはこれの前駆体とキャリヤーとを反応させて中間接合体を形成すること、およびその後に
（ｂ）（ｉ）この中間接合体とヘテロ二官能性架橋剤とを反応させて中間接合体を活性化させ、ついでこの活性化された中間接合体とターゲッティング部分とを反応させること、または（ｉｉ）この中間接合体とヘテロ二官能性架橋剤との反応によって活性化されたターゲッティング部分とを反応させること、または（ｉｉｉ）この中間接合体、ヘテロ二官能性架橋剤、およびターゲッティング部分を、同時に互いに反応するようにさせること
を含む方法が提供される。
【００５１】
キャリヤーと体への送達剤（またはこれの前駆体）との反応、およびヘテロ二官能性架橋剤との反応は、キャリヤー上に存在する２つの異なる種類の官能基を介するものであることが特に好ましく、このヘテロ二官能性架橋剤とターゲッティング部分との反応がターゲッティング部分上に存在する第三の種類の官能基を介して起こり、３つの型の官能基が互いに異なることが特に好ましい。
【００５２】
本発明のこの態様による方法は、キャリヤーと体への送達剤（またはこれの前駆体）との反応、およびキャリヤーとターゲッティング部分との反応が、別々の工程において実施されるという点において有利である。したがってキャリヤーは、ターゲッティング部分と接合される前に体への送達剤と反応させられ、体への送達剤とターゲッティング部分との反応が避けられる。キャリヤー上、したがって最終接合体上の薬剤の高い積載量は、これによってターゲッティング部分の結合活性に対して最小限の悪影響しかともなわず、またはターゲッティング部分の結合活性に対する悪影響をまったくともなわずに達成することができる。この方法にしたがって調製された接合体は、したがって体への送達剤（またはこれの前駆体）のターゲッティング部分での不存在を特徴とするものであってもよい。言い方を変えると、この接合体は好ましくは体への送達剤（またはこれの前駆体）の少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％が、ターゲッティング部分へではなく、キャリヤーへ共有結合される。これによって結合活性の損失は最小限となり、本発明によって調製された接合体は、したがって接合体におけるターゲッティング部分の結合活性が、競合結合アッセイにおいて測定された場合、遊離ターゲッティング部分の結合活性の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、または少なくとも９０％であることを特徴としうる。
【００５３】
キャリヤーが粒子の形態を有する場合、本発明による方法は、粒子形成材料から粒子を形成する予備工程を含んでいてもよく、この粒子は、ついで体への送達剤（またはこれの前駆体）と、およびその後にターゲッティング部分と反応させられるキャリヤーを構成する。
【００５４】
この方法の変形例において、粒子の形成工程は、体への送達剤またはこれの前駆体が粒子形成材料と反応させられた後に行なわれてもよい。
【００５５】
キャリヤーが体へ送達されることになる薬剤の前駆体と反応させられる場合、この前駆体はその後薬剤へ転換される。このような転換は、この方法の工程（ｂ）の前、その後、または同時に行なわれてもよい。前駆体がキレート剤であり、転換がキレート剤と金属イオンとの間のキレートの形成を伴う場合、金属イオンの添加の間は反応混合物のｐＨが５．０〜６．５に維持されることが好ましい。
【００５６】
この方法は、キャリヤーがタンパク質性である接合体の調製へ特に適用可能である。
【００５７】
架橋剤が、キャリヤー上に存在しかつターゲッティング部分に存在しない基（例えばスルフヒドリル基）との反応に特異的な１つの官能性、およびターゲッティング部分上に存在しかつキャリヤーに存在しない基（例えばアルデヒド基）との反応に特異的な第二の官能性を有することが非常に好ましい。これは、キャリヤーおよび／またはターゲッティング部分の互いの連結を生じるであろう望まれない副反応の発生を減少または排除する。この方法はまた、体への送達剤がカルボキシル基またはその誘導体を有するか、またはカルボキシル基またはその誘導体を含有する中間化合物または部分を介してキャリヤーへ連結される、接合体の調製へも特に適用可能であり、この場合キャリヤーとの連結は、これらのカルボキシル基とキャリヤー中に存在するアミノ基との間に形成されたアミド結合によるものであってもよい。
【００５８】
ヘテロ二官能性架橋剤がキャリヤー上に存在するスルフヒドリル基と反応する場合、中間接合体上の遊離スルフヒドリル基がこの方法の工程（ａ）の間に可逆的にブロックされることが発見された。このような場合、この方法は好ましくは遊離スルフヒドリル基のアンブロッキングの中間工程を（工程（ａ）と（ｂ）との間に）含む。このようなアンブロッキングは好ましくは、２０〜５０℃の温度において１〜２４時間の間、中間接合体をインキュベーションすることによって実施される。
【００５９】
本発明のさらにもう１つの態様によれば、医療用イメージング技術によって得られた画像のコントラストの向上方法であって、画像が得られる前に本発明の第一の態様による接合体または本発明の第二の態様による調合物を、画像が得られることになるヒトまたは動物被験者へ投与することを含む方法が提供される。さらには、医療用イメージング技術によって得られることになる画像のコントラストを向上させるための調合物の製造における、本発明の第一の態様による接合体の使用も提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６０】
キャリヤー材料の性質
本発明の第一の態様による接合体は、造影剤およびターゲッティング部分用のキャリヤー材料としてタンパク質を含んでいる。
【００６１】
キャリヤー材料として用いることができるタンパク質には、球状タンパク質および繊維状または構造タンパク質、およびこれらの混合物が含まれる。
【００６２】
球状タンパク質の例には、合成または天然血清タンパク質、これらの天然または合成誘導体、塩、酵素的、化学的、またはほかの方法で変性されるか、切断されるか、短縮または架橋されるか、酸化されるか、または加水分解された、これらの誘導体またはサブユニットが含まれる。繊維状タンパク質または構造タンパク質の例には、合成または天然コラーゲン、エラスチン、ケラチン、フィブロイン、フィブリン、およびフィブロネクチン、これらの天然または合成誘導体、およびこれらの混合物が含まれる。血清タンパク質の例は、アルブミン、α−グロブリン、β−グロブリン、γ−グロブリン、トランスチレチン、フィブリノーゲン、トロンビン、およびトランスフェリンである。
【００６３】
このタンパク質は最も好ましくは、単一の完全なまたは実質的に完全なタンパク質分子である。しかしながらこのタンパク質分子は、完全なまたは実質的に完全な接合タンパク質分子のオリゴマーであってもよい。このようなオリゴマーは、タンパク質ダイマー、またはトリマー、または例えば２０以下の別々のタンパク質分子、より好ましくは１０以下、または５以下の別々のタンパク質分子を含んでいる、より長いオリゴマーであってもよい。
【００６４】
このタンパク質分子はあるいはまた完全タンパク質分子の断片であってもよく、これは天然由来のタンパク質分子中に見られるアミノ酸の配列に対応するが長さがより短いアミノ酸の配列を含んでいる分子を意味する。しかしながらこのような断片は好ましくは、天然由来タンパク質分子の長さの５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、または９０％超、最も好ましくは９５％超の長さを有し、かつ天然由来タンパク質分子の対応部分と、８０％超、９０％超、または最も好ましくは９５％超の相同性の程度を有するアミノ酸の配列を含んでいる。
【００６５】
トランスフェリンは、多くの潜在的連結部位を有し、本発明による接合体の血液脳関門を通る輸送を容易にすることができ、そしてこれは組換え生成物として調製されうるという点で、キャリヤー材料として特別な利点を有しうる（例えば、ＭａｃＧｉｌｌｉｖｒａｙら、２００２、「分子鉄および細胞鉄輸送（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｒｏｎ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）、Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ（Ｅｄ）、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．ｐ４１、およびＭａｓｏｎら、１９９３、「生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、３２：５４７２参照）。
【００６６】
特に好ましいキャリヤー材料は、下に詳細に記載された理由から、アルブミンである。
【００６７】
これらの接合体が人体への投与を意図している場合、このキャリヤー材料は好ましくはヒト起源である。すなわち実際にヒトに由来するか、または構造がヒト起源のタンパク質と同一である（または実質的に同一である）。したがって特に好ましいキャリヤー材料は、ヒト血清アルブミンである。
【００６８】
ヒト血清アルブミンは血清由来であってもよく、例えば献血された血液から得られてもよい。しかしながら、血液由来物中に存在しうる潜在的汚染物質（例えばウイルスまたはほかの有害な薬剤）の感染のリスク、ならびに献血された血液から単離された材料と関連する供給の潜在的制約を排除または減少させるために、キャリヤー材料（例えばヒト血清アルブミン）が、キャリヤー材料を発現するために形質転換されるかまたはトランスフェクションされている微生物（細胞株を包含する）、遺伝子導入植物または動物、に由来する組換え生成物であるのが好ましい。
【００６９】
本発明における使用のために現在最も好ましいキャリヤー材料は、したがって、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）である。ｒＨＡの適切な形態は、英国ノッティンガムのデルタ・バイオテクノロジー社（Ｄｅｌｔａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ）から商品として入手することができる。
【００７０】
ｒＨＡの調製方法は一般に、当業者によく知られているであろうし、例えばＷＯ９６／３７５１５号およびＷＯ００／４４７７２号に記載されている。
【００７１】
ｒＨＡの調製の好ましい方法において、初期ｒＨＡ溶液は、発酵培地中でｒＨＡエンコードヌクレオチド配列で形質転換された菌類を培養することによって得られた菌培養培地に由来し、これによって前記菌類は、ｒＨＡを発現し、これをこの培地中に分泌する。この菌類は、糸状菌、例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種であってもよい。好ましくはこの菌類は酵母である。より好ましくは、この菌類は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属（例えばＫ．ｌａｃｔｉｓ）、またはＰｉｃｈｉａ属（例えばＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）のものである。
【００７２】
ｒＨＡは好ましくは、遊離−ＳＨ（スルフヒドリルまたはチオール）基を有する分子の実質的部分を含有する。これは、下記のように、ターゲッティング部分へのｒＨＡ分子の接合の特に有用な手段を提供する。
【００７３】
本発明による接合化学が非タンパク質キャリヤーへ適用される場合、多様なキャリヤー材料のどれでも用いることができる。このキャリヤー材料は生物適合性であるべきであり、キャリヤー材料とターゲッティング部分との接合体が、使用前、および生体内でのこれらの有効寿命の間一体性を維持するようなものであるべきである。このキャリヤー材料は２つの異なる種類の官能基を有し、体への送達剤（またはこれの前駆体）への連結、およびターゲッティング部分へのキャリヤー材料との連結のために異なる化学的方法を用いることができるようにすることが非常に好ましい。
【００７４】
キャリヤー材料として用いることができるほかの非タンパク質性材料には、多糖類、ならびに適切な合成ポリマーが含まれる。
【００７５】
しかしながらこのキャリヤー材料は、最も好ましくはタンパク質性である。キャリヤーが微粒子形態である場合、このキャリヤー材料（または粒子形成材料）は不溶性であってもよく、またはこの粒子は可溶性材料から形成されてついでその後の処理（例えば熱誘導架橋）によって不溶性にされてもよい。例えばこのキャリヤー材料は、コラーゲンまたはゼラチンであってもよい。
【００７６】
このキャリヤーが微粒子形態でない場合、このキャリヤー材料は好ましくは可溶性である。
【００７７】
アルブミンは、次の理由から可溶性接合体および微粒子接合体の両方にとって、現在のところ最も好ましいキャリヤー材料である：
ａ）アルブミンは、水性媒質中に可溶である；
ｂ）アルブミンの粒子は、容易に不溶性にすることができる；
ｃ）アルブミン分子中に存在する遊離スルフヒドリル基は、ターゲッティング部分への選択的連結のための手段を提供する；および
ｄ）アルブミンは、体への送達剤のための連結部位を供給するペンダントアミノ基（具体的にはリジン残基）を有する多くのアミノ酸残基を含有する。
【００７８】
粒子の形成
粒子形成材料の粒子はいかなる適切な技術によって生成されてもよく、多くのこのような技術は当業者によく知られているものであろう。
【００７９】
本発明による粒子の製造のために特に好ましい方法は次の工程を含む：
ｉ）粒子形成材料の懸濁液を形成する工程；および
ｉｉ）前記懸濁液をスプレー乾燥する工程。
【００８０】
工程（ｉ）、すなわち粒子形成材料の懸濁液の形成は好ましくは、まず粒子形成材料を溶媒中に溶解し、ついでこのように形成された溶液へ粒子形成材料用の非溶媒を添加し、粒子形成材料の沈殿をもたらすようにすることによって実施される。「非溶媒（ｎｏｎ−ｓｏｌｖｅｎｔ）」とは、粒子形成材料のその中での溶解性が、粒子形成材料の溶媒中での溶解性よりも実質的に小さいが、溶媒と混和しうる液体を意味する。
【００８１】
この非溶媒は好ましくは過剰に添加される。すなわち、溶媒へ添加された非溶媒の容積は好ましくは粒子形成材料の溶媒中溶液の容積よりも大きい。換言すれば、工程ｉｉ）においてスプレー乾燥される溶媒／非溶媒混合物は最も好ましくは、非溶媒を５０％ｖ／ｖより多く、より好ましくは６０％ｖ／ｖより多く、おそらくは７０％ｖ／ｖより多く含んでいる。
【００８２】
最も普通には、溶媒は水である。好ましい非溶媒はエタノールである。しかしながら一般に、非溶媒の添加が粒子形成材料の沈殿を引起こす所望の効果を有し、この溶媒と非溶媒とが用いられた割合で混和しうるならば、溶媒と非溶媒とのいかなる適切な組合わせを用いてもよい。
【００８３】
溶媒は最も普通には水であるが、これはあるいはまた例えば有機溶媒であってもよい。このような場合、非溶媒は水であってもよく、非溶媒の使用はその場合、おそらくは可燃性の有機溶媒を含有する懸濁液のその後のスプレー乾燥に関連したリスクの減少において有利になりうる。
【００８４】
この粒子形成材料がタンパク質性材料である場合（これが最も普通の場合であるが）、非溶媒の添加による沈殿は好ましくは、懸濁粒子の凝集を防ぐかまたは最小限にするように、およびスプレー乾燥後容易に分散しやすい親水性粒子を生成するために、等電点から離れたｐＨで実施される。このようにして、同じ目的を達成するために追加の界面活性剤を用いることを回避できる。
【００８５】
工程（ｉｉ）、すなわち工程ｉ）において形成された懸濁液のスプレー乾燥は、一般に従来の方法で、一般に従来の種類の装置を用いて実施することができる。概略的にはこのスプレー乾燥プロセスは、加熱ガス、最も普通には空気、を含有するチャンバー中に懸濁液をスプレーすることを伴う。このことにより、溶媒／非溶媒混合物は蒸発し、固体粒子を生成する。ガスはチャンバーから引き出され、ガス中で運ばれる粒子は例えばサイクロン分離機またはフィルター配列のなんらかの形態を用いて、ガスから分離される。ついでこれらの粒子は適切な容器中に回収される。
【００８６】
スプレー乾燥プロセスによって得られた粒子の性質はいくつかの要因に依存する。これらには、スプレー乾燥装置を通るガスの流量、懸濁液中の粒子形成材料の濃度、溶媒および非溶媒の種類、懸濁液がスプレー乾燥装置中に供給される速度、およびチャンバー中のガスの温度が含まれる。通常、小さいサイズ分布は、低い懸濁液供給速度、適切なノズル設計、高い微粒子化度、および高いガス流量の組合わせによって達成することができる。
【００８７】
工程ｉ）と工程ｉｉ）との間に、すなわち懸濁液の形成後であるがスプレー乾燥前に、懸濁液の（例えば機械的攪拌による）均質化を行うことが特に好ましい。この結果、懸濁液中の粒子のより均一なサイズ分布、およびこれに対応した工程ｉｉ）において形成される粒子のより小さくより均一なサイズ分布が生じる。
【００８８】
この懸濁液は好ましくは（特に粒子形成材料がアルブミンである時）、粒子形成材料０．１〜５０％ｗ／ｖ、より好ましくは１〜２０％ｗ／ｖ、最も好ましくは２〜１０％ｗ／ｖを含有する。粒子形成材料の混合物が用いられてもよい。この場合、上記の数字は粒子形成材料の総含量を表わす。
【００８９】
これらの粒子のスプレー乾燥後、これらの粒子が不溶性にされることが必要であるか、または望ましいことがある。これは、粒子形成材料の架橋によって達成されうる。これは、それ自体知られている多様な技術によってもたらされうる。好ましい方法において、これらの粒子は熱処理（例えば１５０℃より高い温度で、３０分間より長く、例えば１時間又は数時間）によって不溶性にされる。
【００９０】
上記のような粒子の好ましい調製方法は、このプロセスの２段階（懸濁液の形成およびスプレー乾燥）が、粒子の所望の形態およびサイズ分布を達成するために別々に最適化されうるという点において有利である。これは、これらの粒子の特性に対して高度の制御を与える。特に、このプロセスは特に小さいサイズおよび特に狭いサイズ分布の粒子の生産を可能にする。この方法によって生産された粒子は、例えば大部分が４μｍ未満の粒子サイズ、および１μｍ未満のモードピークを有する数サイズ（ｎｕｍｂｅｒ ｓｉｚｅ）、および２μｍ未満の平均サイズ（コールターカウンターを用いて測定された場合）を有しうる。このように小さいサイズの粒子は、これらが非常に小さい血管（毛管）に入ることができ、および／または肺の中に深く浸透しうるという点で有利である。より大きいサイズの粒子（例えば鼻腔投与用）を生成することも可能であろう。
【００９１】
これらの粒子は最も一般的には実質的に球形であるから、これらの粒子の「サイズ」への言及は通常、これらの粒子の「直径」を意味することが理解されるであろう。しかしながら、これらの粒子が球形でなくてもよいことも理解されるであろう。この場合、サイズは非球形粒子の質量に等しい質量を有する概念的球形粒子の直径として解釈されうる。
【００９２】
薬剤のキャリヤー材料への連結
体への送達剤のキャリヤー材料への連結は、とりわけ薬剤の種類およびキャリヤー材料の種類に応じて、多くの手段のいずれで実施してもよい。しかしながら一般に連結は、キャリヤー材料と薬剤との間の、またはキャリヤー材料と薬剤それ自体と化学的または物理的結合を形成しうる連結部分との間の共有結合の形成を伴う。
【００９３】
１つの好ましい連結方法、特に金属（例えばＭＲＩまたは核イメージングで用いられる金属）の連結、または放射線治療で用いられる放射性金属の連結に適した方法は、金属を結合しうるキレート剤とキャリヤー材料との接合を伴う。
【００９４】
１つの特に好ましい実施形態において、このキレート剤はキャリヤー材料（例えばアルブミン等のタンパク質性キャリヤー材料）中に存在するアミン基と反応してキレート剤をキャリヤー材料へ連結するアミド結合を形成するカルボキシル基またはその誘導体を含む。ついで金属の適切な塩の溶液が添加されてもよく、接合されたキレート剤による金属のキレートを生じる。
【００９５】
用いることができるキレート剤には、複数のアミン基を含有する化合物の酢酸誘導体が含まれる。例には、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、およびこれらの誘導体（例えばジエチレントリアミン五酢酸無水物）が含まれる。使用しうるキレート剤のほかの種類には大環状キレート剤が含まれる。大環状キレート剤の例は次のものである：
１，４，７−トリアザシクロノナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−三酢酸（ＮＯＴＡ）
１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）
１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＴＥＴＡ）。
【００９６】
キレート剤をキャリヤー材料へ連結するためのほかの方法は、当業者には明らかであろう。適切な化学作用は最も一般的には、キャリヤー材料および／またはキレート剤中に存在するアミン、チオール、カルボニル、カルボキシル、またはヒドロキシル基による連結の形成を伴う。
【００９７】
この薬剤が、金属キレートの形態でキャリヤーへ連結される場合、このキレートは製造プロセスの一部として形成されてもよく、あるいはまた金属はあとで（例えば使用の直前に）添加されてもよい。特にこの金属が放射性金属である場合、金属イオンを使用の直前に調合物へ添加することが望ましいことがある。
【００９８】
同様に有機剤（例えばＸ線造影剤として用いられる以下で言及されているヨウ素含有化合物）は、有機剤とキャリヤー材料との間の共有結合の形成によってキャリヤー材料へ直接連結されてもよい。有機剤をキャリヤー材料へ連結する方法もまた当業者には明白であり、キャリヤー材料および／または有機剤中に存在するアミン、チオール、カルボニル、カルボキシル、またはヒドロキシル基による連結の形成を包含してもよい。
【００９９】
一般に、有機剤またはキレート剤の１つ以上の分子がキャリヤーへ連結される。より好ましくはこのような分子が１０より多く、またはこのような分子が２０より多く連結される。タンパク質性キャリヤー材料の好ましい場合（例えばアルブミン）、１０〜１００、より好ましくは２０〜６０の有機剤またはキレート剤の分子を各タンパク質分子へ連結する（例えば１タンパク質分子あたりこのような薬剤の２０〜５０分子を連結する）ことも可能であろう。これは、放射線治療における使用のためのＭＲＩ造影剤または放射性金属についての従来の送達系と比較して、このような薬剤のかなり増加した密度を生じる。多くの例では、キャリヤー上の有機剤またはキレート剤の積載量ができるだけ高くなることが望ましいこともありうる。ほかの場合、積載量をより低いレベルに制限することも有利になりうる。
【０１００】
ターゲッティング部分の性質
キャリヤー材料は体内の特定の器官または疾病部位との親和性を有するターゲッティング部分と接合される。このようなターゲッティング部分には、抗体、ほかのタンパク質、およびペプチドが含まれる。好ましいターゲッティング部分は、抗体、特にモノクローナル抗体である。多くの適切なターゲッティング部分（例えば抗体）が、商品として入手しうる。
【０１０１】
本発明におけるターゲッティング部分として有用になりうる抗体の例には、次のものが含まれる：
腫瘍型 標的抗原 抗体
────────────────────────────────────────
結腸直腸癌 ＣＥＡ ｈＭＮ−１４
乳癌 ＭＵＣ１ ＨｕＢｒＥ３
膀胱癌 ＭＵＣ１ Ｃ５９５
前立腺癌 ＰＳＭＡ Ｊ５９１
腎細胞癌 糖タンパク質 ｃｈＧ２５０
【０１０２】
キャリヤー材料と接合されうる抗体のほかの例には、次のものが含まれる：
ａ）バイタクシン（Ｖｉｔａｘｉｎ）（登録商標） − 腫瘍中に新たに形成された血管上に発現されたアルファ−ｖベータ−３に結合するヒト化抗体；
ｂ）ヒト化ＣＤ２２抗体（通常、非ホジキンリンパ腫の治療のためにイットリウム−９０で標識されている）；および
ｃ）すべての造血細胞（特にリンパ球上）に発現されるチロシンホスファターゼＣＤ４５へのαＣＤ４５抗体。
【０１０３】
ターゲッティング部分のほかの形態の例には、次のものが含まれる：
ａ）血塊をイメージングするためのフィブリン；
ｂ）フィブリンへ結合する結合部分；
ｃ）親油性有機分子および両親媒性有機分子；
ｄ）受容体リガンド；
ｅ）ステロイド；
ｆ）脂質；
ｇ）ホルモン；
ｈ）肺癌上のソマトスタチン受容体へ結合する合成ペプチド（ダイアタイド（Ｄｉａｔｉｄｅ）から商品として入手しうる）；
ｉ）白血球抗原に対して誘導された抗体断片 − 感染病を検出するため；および
ｊ）細胞死の時に放出されるホスファチジルセリンを結合するアネクシン（Ａｎｎｅｘｉｎ）Ｖ − 心臓病をイメージングし、化学療法への応答を評価するためのマーカー。
【０１０４】
ターゲッティング部分の効果は、体内の所望の位置（例えば特定の器官または腫瘍等の疾病部位）に造影剤または治療薬が積載されている接合体を濃縮することである。
【０１０５】
ターゲッティング部分へのキャリヤーの連結
ターゲッティング部分のキャリヤー材料への連結方法はそれ自体公知であり、当業者にはよく知られているであろう。適切な化学作用は最も一般的には、キャリヤー材料および／またはターゲッティング部分中に存在するアミン、チオール、カルボニル、カルボキシル、またはヒドロキシル基による連結の形成を伴う。
【０１０６】
このキャリヤーは、ヘテロ二官能性架橋剤を用いてターゲッティング部分へ連結される。好ましくはこの架橋剤は、キャリヤー上に存在しかつターゲッティング部分には存在しない官能基に特異的な１つの反応性、およびターゲッティング部分上に存在しかつキャリヤーには存在しない官能基に特異的なもう１つの反応性を有する。既に記載されているように、このことは、望まれない副反応（例えばキャリヤー分子間または粒子間の連結、架橋剤の両方の官能性とキャリヤーまたはターゲッティング部分との反応等）の発生を排除する。
【０１０７】
架橋剤はまず中間接合体（すなわち体への送達剤またはその前駆体との反応後のキャリヤー）と反応させられ、これによって中間接合体を活性化し、ついでヘテロ二官能性架橋剤のもう一方の末端と反応するターゲッティング部分（例えば抗体）を添加してもよい。あるいはまた、この架橋剤をまずターゲッティング部分と反応させ、活性化されたターゲッティング部分をついで中間接合体と反応させてもよい。中間接合体、ターゲッティング部分、および架橋剤が、単一工程において互いに反応させられることも可能であろう。適切なヘテロ二官能性架橋剤は、商品として入手しうる。
【０１０８】
キャリヤー上の−ＳＨ（スルフヒドリルまたはチオール）基を介した反応に好ましい架橋剤は、スルフヒドリル基と特異的に反応する基を有する。このような基の１つの好ましい例は、マレイミド基である。ほかの例は、２−ピリジルジチオ、ハロアセテート、またはハロアセトアミド、特にヨード誘導体、アジリジン、アクリロイル／ビニル、４−ピリジルジチオ、および２−ニトロベンゾエート−５−ジチオである。
【０１０９】
遊離チオール基を含有しないキャリヤー材料の場合、このような基は（例えばジチオトレイトールでの還元によって）キャリヤー上で発生させることができ、またはチオレート化剤（例えばイミノチオランまたはＮ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ））を用いて導入することができる。
【０１１０】
特にターゲッティング部分が抗体またはほかのタンパク質である場合、架橋剤とターゲッティング部分とを反応させる好ましい方法は、ターゲッティング部分上の炭水化物部分を介する。穏やかな酸化条件下において、炭水化物中に見られるシス−ジオールはアルデヒド基へ転換することができ、これに対してはヒドラジド基が特異的な反応性を有する。
【０１１１】
本発明における使用のために特に好ましいヘテロ二官能性架橋剤には、したがって、ＳＨ−反応性官能基（例えばマレイミドまたは２−ピリジルジチオ）、およびアルデヒド反応性官能基（例えばヒドラジド）の両方が含まれる。
【０１１２】
本発明における使用のために好ましいヘテロ二官能性架橋剤は、したがって次のものである：
マレイミドカプロン酸ヒドラジド（通常、ＥＭＣＨと呼ばれる）
３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）
マレイミドプロピオン酸ヒドラジド（ＭＰＨ）
Ｎ−（κ−マレイミドウンデカン酸）ヒドラジド（ＫＭＵＨ）
４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）。
【０１１３】
ヒドラジド基を含む架橋剤は、これらの酸付加塩、特に塩酸塩の形態で利用されてもよい。
【０１１４】
上記のように、キャリヤー材料がｒＨＡである好ましい場合、ターゲッティング部分をｒＨＡ分子へ連結するのに特に有用な方法は、ｒＨＡ上に存在する遊離スルフヒドリル（チオール）基による連結による方法である。各ｒＨＡ分子上にわずか１つだけこのような遊離スルフヒドリル基があるので、１つのｒＨＡ分子は１つのみのターゲッティング部分へ連結するであろう。
【０１１５】
ｒＨＡは好ましくは、エルマン試薬である５，５’−ジチオビス−（２−ニトロベンゾエート）（ＤＴＮＢ）を用いて測定された時、少なくとも０．８５、０．８、０．７５、０．７、０．６５、または０．６０モルＳＨ／モルタンパク質の遊離チオール含量を有し、この試薬は遊離スルフヒドリル基（例えばｃｙｓ−ＳＨ（ｒＨＡの場合Ｃｙｓ−残基３４））を検出する特異的手段である。この反応は、４１２ｎｍに吸収極大を有する５−チオ−２−ニトロベンゾエートイオンＴＮＢ2-を放出する。４１２ｎｍにおける吸光度の増加を測定し、４１２ｎｍにおけるＴＮＢ2-イオンのモル吸収係数によって割ることによって、ｒＨＡの遊離スルフヒドリル含量を計算することができる。
【０１１６】
好ましくは抗体ターゲッティング部分は、抗体の可変領域の特異的結合活性を保持するために、抗体の定常部における連結部位を介してキャリヤー材料へ連結される。
【０１１７】
造影剤の性質
本発明による接合体および調合物は造影剤の送達のために有用である。造影剤が用いられるイメージング技術には、ＭＲＩ、Ｘ線イメージング技術、および核イメージングが含まれ、これにはＰＥＴが含まれる。
【０１１８】
本発明において用いることができるＸ線造影剤は、このような使用に適した性質を有する多様なヨウ素含有化合物が含まれる。このような化合物は一般に可溶性であり、イオン性または非イオン性であってもよい。このようなＸ線造影剤の１つの例は、イオパミドールとして知られているものである。ほかの公知のＸ線造影剤には、イオメプロール、イオプロミド、イオベルソール、イオジキサノール、およびイオヘキソールが含まれる。
【０１１９】
用いることができるＭＲＩ造影剤には、常磁性金属イオンを含む多様な化合物が含まれる。適切なこのようなイオンには、マンガン、および特にガドリニウムが含まれる。
【０１２０】
金属もまた、核イメージングに用いられる。この用途に適した金属は一般に、放射性γ−放射体である。例には、99mＴｃ、201Ｔｌ、および111Ｉｎが含まれる。
【０１２１】
金属に加えて、イメージングにおいて有用な非金属原子をキャリヤー材料へ連結すること（またはこのような原子を含有するか、またはこのような原子が導入されうる化合物を連結すること）も可能であろう。このような原子の例には、123Ｉおよび121Ｉが含まれる。
【０１２２】
放射線治療において有用な金属
本発明による接合体および調合物はまた、放射線治療において有用な放射性金属を送達するために用いられてもよい。このような金属は一般に、β−粒子の放射体であり、例には、67Ｃｕ、153Ｓｍ、90Ｙ、191Ｐｔ、193Ｐｔ、および195Ｐｔが含まれる。
【０１２３】
これらの調合物の投与
本発明による接合体および調合物は、多様な経路によって投与されてもよい。これらの調合物は、例えば静脈内投与されてもよい。これらの調合物はまた、経口または鼻腔吸入によって（例えば霧状にされた溶液として）投与されてもよい。適切な場合、これらの調合物はカテーテルを介して疾病部位へ直接送達されてもよい。
実施例
本発明はここで、次の実施例および添付図面を参照して、例証としてのみ、より詳細に記載される。実施例１〜１０は、可溶性ｒＨＡをベースとする接合体に関し、実施例１１〜１９は、不溶性ｒＨＡ粒子をベースとする接合体に関する。
【０１２４】
実施例１〜１０についての一般的方法
遊離チオールアッセイ
遊離チオール濃度は、放出された５−チオ−２−ニトロベンゾエートの１３６００Ｍ-1ｃｍ-1の吸光係数を用いて、ｐＨ８におけるＤＴＮＢとの反応そして４１２ｎｍにおける吸光度測定によって決定した。
【０１２５】
タンパク質アッセイ
ｒＨＡ濃度は、１ｇ．Ｌ-1吸光係数（０．５３）を用いて、２８０ｎｍ近くのピークにおける吸光度測定によって決定した。ＩｇＧ濃度は同様に決定したが、１ｇ．Ｌ-1吸光係数は１．４３を用いた。
【０１２６】
ＧＰＨＰＬＣ
ＧＰＨＰＬＣは、ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷＸＬ０．７８×３０ｃｍカラムおよびガード（トーソー・バイオセップ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｅｐ））を用いて実施し、ＰＢＳ中１ｍＬ．分-1で溶離された。
【０１２７】
材料
ＤＴＰＡａおよび塩化ガドリニウムは、シグマ（Ｓｉｇｍａ）から入手した。リコンブミン（Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ）（登録商標）−２５（２５％（ｗ／ｖ）ｒＨＡ）は、英国ノッティンガムのデルタ・バイオテクノロジー社から入手した。マグネビスト（Ｍａｇｎｅｖｉｓｔ）（商標）（０．５ＭのＧｄ−ＤＴＰＡキレート）は、商業的供給源から入手でき、対照として用いた。
【実施例１】
【０１２８】
ＭＲＩ造影剤（ガドリニウムキレート）で標識された可溶性ｒＨＡの調製
この方法は、ＤＴＰＡついでガドリニウム（Ｇｄ）で標識された可溶性ｒＨＡをベースとした、ＭＲＩ造影剤の開発について記載する。
【０１２９】
１．１ ＭＲＩ造影剤（ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄ）で標識されたｒＨＡの調製
ｒＨＡを、水中２０ｇ．Ｌ-1ｒＨＡへ希釈し、ＤＴＰＡａ（０．３ｇｒＨＡあたり１ｇ）を、約３０分間にわたって一定攪拌を行なってゆっくりと添加した。この間、５ＭのＮａＯＨを添加し、ｐＨを８．０のできるだけ近くに維持した。攪拌は、最終ＤＴＰＡａ添加後３０分間続行し、ついでｐＨを５ＭのＨＣｌで７．０に調節した。可溶性ｒＨＡ−ＤＴＰＡを約１２０容積の水に対して一晩透析し、過剰な遊離ＤＴＰＡを除去した。
【０１３０】
Ｇｄ標識は０．１ＭのＧｄＣｌ3での滴定によって実施した。結果として錯体形成およびアルブミンの沈殿を生じる、過剰なＧｄＣｌ3の添加を避けるように注意した。沈殿点は、利用可能なＤＴＰＡの尺度であると考えられた。Ｇｄ誘導の沈殿点から決定された、生じた結合ＤＴＰＡレベルは、４６モル．モル-1ｒＨＡであった。
【０１３１】
１．２ ＭＲＩ造影剤（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）で標識されたｒＨＡのイメージング特性
可溶性ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄは基本的に上記のようにして調製したが、次の修正をともなった：
ａ）ＤＴＰＡ標識のためのｒＨＡ濃度は、２５ｇ．Ｌ-1であった；
ｂ）ＤＴＰＡａ添加時間は、約２５分であった；
ｃ）透析は、約３５０容積の水に対して１８時間、ついで約１００容積に対して２時間実施した；
ｄ）Ｇｄ−誘導の沈殿点から決定された、生じた結合ＤＴＰＡレベルは、４５モル．モル-1ｒＨＡであった。
【０１３２】
その生じた材料を、０．２μｍで濾過し、限外濾過（ソーバール（Ｓｏｒｖａｌｌ）ＲＴ６０００Ｂ遠心分離機で、３，３００ｒｐｍでのビバスピン（Ｖｉｖａｓｐｉｎ）２０ １００００ＭＷＣＯ遠心濃縮器）によって約９０ｇ．Ｌ-1ｒＨＡ（初期ｒＨＡ基準）に濃縮し、５％（ｗ／ｖ）マンニトール中５０ｇ．Ｌ-1ｒＨＡへ調製した。その結果生じたＧｄ濃度は限外濾過の間に損失がないと仮定して計算された。調合された材料を、−３０℃浴中に静かな攪拌を行ないながら２ｍＬアリコートとして冷却し、必要とされるまで冷凍保存した（約−２０℃）。
【０１３３】
磁気共鳴イメージングを、可溶性ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄ、および水で約２ｍＬに希釈されたマグネビスト（商標）対照を、８ｍＬ０．５％アガロースと混合して規定のＧｄ濃度となったものを用いて実施した。緩和率（Ｒ１およびＲ２）は、各サンプルについて、ある範囲の反復時間（ＴＲ）およびエコー時間（ＴＥ）を用いて、このデータを次のどちらかへフィットさせることによって決定した：
Ｍ＝Ｍ∞（１−ｅ-R1.TR）またはＭ＝Ｍ0（ｅ-R2.TE）
（ここで、Ｍは、時間Ｔでの測定された信号であり、
Ｍ0は、Ｔ＝０における信号であり、かつ
Ｍ∞は、Ｔ＝∞における信号である）。
【０１３４】
この可溶性ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄのｉｎ ｖｉｔｒｏＭＲＩ特性を、Ｇｄ−ＤＴＰＡをベースとする商用ＭＲＩ造影剤であるマグネビスト（登録商標）の特性と比較した（図１）。Ｒ１およびＲ２緩和率の両方が、マグネビスト（登録商標）を用いて得られたものよりも有意に大きかった。このことは、可溶性ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄが、特にｒＨＡベースの材料について予想されたクリアランス率における顕著な減少から考えて、同じＧｄ濃度においてマグネビスト（登録商標）を用いて見られたものと同等またはこれよりも良好なｉｎ ｖｉｖｏ画像を生成することを示した。あるいはまたこれは、可溶性ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄが、マグネビスト（登録商標）よりも低いＧｄ用量で用いることができるであろうことを示唆した。
【実施例２】
【０１３５】
ＤＴＰＡで標識された可溶性ｒＨＡへの銅イオンの結合
（実施例１において調製された）ＤＴＰＡで標識された組換えヒトアルブミンは、放射性金属、例えば銅、インジウム、テクネチウム、およびほかのもののためのキャリヤーとして用いることができる。
【０１３６】
これを確認するために、（上記実施例１のように調製された）ＤＴＰＡ−標識されたアルブミンが、銅イオンへ結合することを証明することができる（この実施例にために、非放射性銅を用いた）。
【０１３７】
２．１ ｒＨＡ−ＤＴＰＡの調製
ｒＨＡ−ＤＴＰＡのサンプルは、実施例１．３において上記されているように調製したが、次の修正をともなった：
ａ）ＤＴＰＡａ添加時間は、約２０分であった；
ｂ）ＤＴＰＡａ添加後の攪拌時間は、約２０分であった；
ｃ）透析は、約３５０容積の水に対して４時間、ついで約３５０容積に対して１６時間、および約１００容積に対して３時間実施した；
ｄ）調製は、ＧｄＣｌ3滴定の前に停止した；
ｅ）ｒＨＡ−ＤＴＰＡの小さいサンプルでのＧｄ−誘導の沈殿点から測定された、生じた結合ＤＴＰＡレベルは、４６モル．モル-1ｒＨＡであった。
【０１３８】
２．２ 分光光度Ｃｕ2+滴定
ｒＨＡ−ＤＴＰＡの５ｍＬアリコートを、０．５ＭのＮａＯＨでｐＨ６に調節し、総容積を記録した。Ａ700測定のためにサンプルを採取し、ついでバルクに戻した。０．１ＭのＣｕＳＯ4の１２の５０μＬアリコートを、ｐＨ調節を行なって添加し、各回添加後に上記のようなＡ700測定を行なった。測定された吸光度値を５ｍＬの容積へ補正し、添加されたＣｕの量に対してプロットした。回帰線を滴定の２つの相へフィットさせ、これらの交差点を終点として考えた。
【０１３９】
図２に示されるように、銅結合の量（交差点として考えられたもの）は、ガドリニウム結合（上記実施例１に記載されているように、沈澱終点によって決定された）に対して得られた図にそっくりであった。
【実施例３】
【０１４０】
キャリヤー積載の最適化
最大の効果を得るために、このキャリヤーが、薬剤（例えばＭＲＩへの使用のためのＧｄ3+）または核イメージングまたは治療で使用される放射性金属の最大積載量を運ぶことが、多くの場合重要である。この方法は、ｒＨＡに対するＧｄ3+結合能力の最適化について記載する。
【０１４１】
３．１ ｒＨＡ−ＤＴＰＡの合成
ｒＨＡの４つの０．６ｇアリコートを、各々水中２４ｍＬに希釈した。２、１、０．５、または０．２ｇのＤＴＰＡａを、一定攪拌を行ないながらそれぞれ２５、２０、１２、および９分にわたって各々に添加し、ｐＨを５ＭのＮａＯＨの添加によってｐＨ８．０のできるだけ近くに維持した。これらの溶液を、最終添加後約３０分間攪拌し、３ＭのＨＣｌでｐＨ７に調節した。すべてのサンプルを、１１Ｌの水の４回交換に対して、全部で４４時間、共に透析した。
【０１４２】
３．２ Ｇｄ3+結合能力の測定
Ｇｄ3+結合能力を、ＸＯ指示薬での錯滴定によって決定した。この指示薬は約ｐＨ６において、遊離Ｇｄ3+の存在下で黄色から紫色に変わる。ＸＯ色はまたｐＨに依存し、大きなｐＨ変化が、非緩衝溶液中でｒＨＡ−ＤＴＰＡのＧｄＣｌ3滴定の間に発生することが見られたので、信頼しうる結果を得るためには滴定中の良好なｐＨ制御が必要とされた。
【０１４３】
各ｒＨＡ−ＤＴＰＡサンプル１ｍＬを、０．２ｍＬの０．２Ｍヘキサミン、および５μＬの０．１％（ｗ／ｖ）ＸＯ（出発ｐＨ５．９〜６．１）と混合し、０．１ＭのＧｄＣｌ3で最初の持続的色彩変化（最終ｐＨ５．４〜５．６）まで滴定した。これらの結果の有効性を確認するために、各サンプルを実施例２と同様に、ＣｕＳＯ4での分光光度滴定に付した。両方の滴定剤を、１０ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウム塩（フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ））の標準容積溶液に対して標準化した。
【０１４４】
これらの結果（表１および図３）は、これら２つの方法の間の優れた一致を示し、両方が利用可能なＤＴＰＡ基の信頼しうる尺度であることを示す。これらはまた、基本的に最大Ｇｄ3+結合能力を得るためにはＤＴＰＡａ添加の最高レベル（３．３３ｇのＤＴＰＡａ．ｇ-1ｒＨＡ；１０モルのＤＴＰＡａ．モル-1ｒＨＡ−ＮＨ2に等しい）が必要とされることも示した。
【０１４５】
【表１】
【実施例４】
【０１４６】
過剰反応物質の除去の最適化
キャリヤー分子の標識後、過剰な反応物質を除去することが望ましい。この目的のための透析の使用は、効率的な除去を達成するために、極端に長い時間および極端に大きい容積を必要とすることが発見された（例えば実施例３．１参照）。ゲル濾過の使用は、時間および容積の劇的な節約を与える。この方法は、ｒＨＡ−ＤＴＰＡからの過剰ＤＴＰＡの除去のためのゲル濾過の開発について記載する。
【０１４７】
４．１ ｒＨＡ−ＤＴＰＡの合成
０．３ｇのｒＨＡを水中１２ｍＬに希釈し、一定攪拌を行ないながらｐＨを５ＭのＮａＯＨの添加によってｐＨ８のできるだけ近くに維持しながら、１ｇのＤＴＰＡａを約３０分にわたって添加した。溶液を、最終添加後約６０分間攪拌し、３ＭのＨＣｌでｐＨ７に調節した。この材料の遊離チオールアッセイは、出発ｒＨＡについての０．６８モル．モル-1ｒＨＡの値と比較して、０．１０モル．モル-1ｒＨＡの値を生じた。
【０１４８】
４．２ セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ２５クロマトグラフィー
０．５ｍＬのｒＨＡ−ＤＴＰＡを、ＰＤ１０カラム（アマシャム・バイオサイエンシーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）からのセファデックスＧ２５媒質の予め充填された８．３ｍＬカラム）上へロードし、０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ中で平衡化した。このカラムを、０．５ｍＬアリコート０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌで溶出し、最初の４つは廃棄し、残りはアッセイのために回収した。ｒＨＡ−ＤＴＰＡの溶離プロフィールを決定するために、適切なフラクション０．１ｍＬを１ｍＬの水で希釈し、２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。過剰遊離ＤＴＰＡの溶離プロフィールを決定するために、適切なフラクション２０μＬを、２０ｍＭのヘキサミンｐＨ５中の１ｍＬの４ｍＭＣｕＳＯ4で希釈し、７００ｎｍにおける吸光度を測定した。これらの結果（図４ａ）は、過剰遊離ＤＴＰＡからのｒＨＡ−ＤＴＰＡのベースライン分離が、比較的低いカラムロード（６％カラム容積）にもかかわらず達成されないことを示した。
【０１４９】
４．３ セファデックスＧ２５クロマトグラフィー（小規模）
ＰＤ１０カラムを空にし、セファデックスＧ５０媒質（アマシャム・バイオサイエンシーズ）で、同じベッド容積に再充填した。このカラムを０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ中で平衡化し、０．５ｍＬのｒＨＡ−ＤＴＰＡをロードした。カラムを溶離し、これらのフラクションを上記のようのアッセイした。これらの結果（図４ｂ）は、たとえ自己充填されたカラムが商品として充填されたカラムよりも効率性が低く、その結果として有意により大きいピーク幅を生じるにしても、比較的高い多孔度マトリックスによる２つのピークの分離における顕著な改良を示した。
【０１５０】
４．４ 検出波長
０．１８ＭのＤＴＰＡ ｐＨ７の吸光度スペクトル（ｒＨＡ／ＤＴＰＡａ反応の終了時のおよその濃度およびｐＨ）は、２７０ｎｍ以上で無視しうる吸光度を示し、有意な吸光度は２６０ｎｍ以下で現れた。したがってｒＨＡ−ＤＴＰＡおよび遊離ＤＴＰＡの両方の検出を可能にするため、カラム流出物の監視のために、２５４ｎｍの検出波長が選ばれた。
【０１５１】
４．５ セファデックスＧ５０クロマトグラフィー（大規模）
ＸＫ１６／４０カラム（アマシャム・バイオサイエンシーズ）を、０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ中セファデックスＧ５０媒質で３７ｃｍのベッド高さに充填し、２５４ｎｍおよび２ＡＵフルスケールに設定された２ｍｍフローセル（アマシャム・バイオサイエンシーズ）を有するＵＶ−１モニターへ連結した。ｒＨＡ−ＤＴＰＡの新鮮なサンプルを上記のように調製するが、最終添加とｐＨ７への調節との間の攪拌時間は約３０分に減少させた。この材料をカラム上にロードし、２．８５ｍＬ．分-1で０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌで溶離した。結果（図４ｃ）は、高いカラムロード（２０％カラム容積）でさえ、過剰遊離ＤＴＰＡからのｒＨＡ−ＤＴＰＡのベースライン分離が容易に達成され、精製ｒＨＡ−ＤＴＰＡはカラム溶離の開始から１０分以内に生成されることを示した。
【実施例５】
【０１５２】
可溶性ｒＨＡ誘導体中の遊離チオール回復のための条件の開発
以前の結果（実施例４参照）は、ｒＨＡ遊離チオールがＤＴＰＡａとの反応によって大幅にブロックされることを示した。このチオールが架橋剤付着部位として用いられることになるならば、架橋剤との効率的な反応のためにｒＨＡ遊離チオールの回復が必要とされた。この方法は、ｒＨＡとＤＴＰＡａとの反応（ｒＨＡ−ＤＴＰＡ）、またはｒＨＡ−ＤＴＰＡへのＧｄ3+の結合（ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄ）後に、この目的を達成するための条件の開発について記載する。
【０１５３】
５．１ ｒＨＡ−ＤＴＰＡ遊離チオールに対する保存の効果
実施例４からのｒＨＡ−ＤＴＰＡの遊離チオール含量を、６週間の冷蔵保存後に再アッセイし、０．１０から０．２９モル．モル-1ｒＨＡへと上昇していることが分かった。このことは、遊離チオールの回復が、適切な条件下に可能であろうことを示唆した。
【０１５４】
５．２ ｒＨＡ−ＤＴＰＡの合成
ｒＨＡ−ＤＴＰＡの合成を、実施例４のセファデックスＧ５０クロマトグラフィー（大規模）と同様にして行い、ｒＨＡ−ＤＴＰＡピークが、溶離の開始の２〜９分後に収集された。出発ｒＨＡ中の遊離チオールレベルは、０．７０モル．モル-1ｒＨＡであった。
【０１５５】
５．３ ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄの合成
９．８ｍＬのｒＨＡ−ＤＴＰＡを３０μＬの０．１％（ｗ／ｖ）ＸＯと混合し、ｐＨを１ＭのＮａＯＨでｐＨ５．５〜ｐＨ６．０に終点（黄色から紫色への最初の変化によって示される；４８モルＧｄ3+．モル-1ｒＨＡ）まで維持し、０．１ＭのＧｄＣｌ3で滴定した。
【０１５６】
余剰Ｇｄ3+を結合するためにさらに０．１ｍＬのｒＨＡ−ＤＴＰＡを添加すると、色彩は黄色に戻り、溶液は１ＭのＮａＯＨでｐＨ７に調節された。
【０１５７】
５．４ 遊離チオールの回復
ｒＨＡ−ＤＴＰＡおよびｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄの両方の６つの１ｍＬアリコートを採取した。各々の型の３つを、必要に応じてＨＣｌまたはＮａＯＨで、ｐＨ５、ｐＨ６、またはｐＨ８に調節し、残りの３つをｐＨ７に放置した。すべてのサンプルを、水で１．１ｍＬとした。各々の型の２つのｐＨ７サンプルを、３５℃または４５℃でインキュベーションし、残りのサンプルをすべて２５℃でインキュベーションした。遊離チオールアッセイを、出発ｒＨＡ−ＤＴＰＡおよびｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄに対して実施し、ついで指定された時間にインキュベーションの各々に対して実施した。結果（図５）は、両方のサンプル中の遊離チオールを、簡易なインキュベーションによって回復することができることを示した。ただし、回復率は、ｒＨＡ−ＤＴＰＡの場合よりも、ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄの場合の方がはるかに高かった。両方の反応はなんらかのｐＨ依存性を示した。ただし温度の増加は、反応速度を増加させる上でより効果的であった。最大回復（約８０％の出発遊離チオールに等しい）は、４５℃で、ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄについて約２時間後、ｒＨＡ−ＤＴＰＡについて２０時間後に達成された。
【実施例６】
【０１５８】
可溶性ｒＨＡ誘導体との架橋剤反応
本発明による方法において、ターゲッティング部分およびキャリヤー分子は各々、明確な生成物を生成する選択的架橋剤反応のために、別個の化学基を含有する。抗体ターゲッティング部分およびｒＨＡキャリヤー分子という特定の場合においては、これらの基は好ましくは、それぞれ炭水化物および遊離チオールである。この方法は、ｒＨＡ−ＤＴＰＡおよびｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄと、これらの基との使用に適した２つの架橋剤、すなわちＰＤＰＨおよびＥＭＣＨとの反応について記載する。
【０１５９】
６．１ ｒＨＡ−ＤＴＰＡの合成
０．３ｇのｒＨＡ（遊離チオールレベル０．６７モル．モル-1ｒＨＡ）を水中１２ｍＬに希釈し、ｐＨを５ＭのＮａＯＨの添加によってｐＨ８のできるだけ近くに維持しながら、１ｇのＤＴＰＡａを一定攪拌を行ないながら約３０分にわたって添加した。溶液を、最終添加後約３０分間攪拌し、３ＭのＨＣｌでｐＨ７に調節し、０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ中で平衡化したセファデックスＧ５０媒質カラム（１．６×３７ｃｍ）へ適用した。溶離は、２５４ｎｍにおける検出をしながら２．８４ｍＬ．分-1で実施した。ｒＨＡ−ＤＴＰＡピークが溶離の開始の２〜９分後に収集され、これは、０．０７モル．モル-1ｒＨＡの遊離チオールレベルを示した。ｒＨＡ−ＤＴＰＡを４５℃で２０時間インキュベーションしチオールをアンブロックすると、０．５７モル．モル-1ｒＨＡの遊離チオールレベルを生じた。
【０１６０】
６．２ ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄの合成
ａ）ＤＴＰＡａを約３５分間にわたって添加し；ｂ）セファデックスＧ５０カラムを２．７ｍＬ．分-1で溶離し；ｃ）ｒＨＡ−ＤＴＰＡピークは、溶離開始の２〜１０分後に収集され、０．１４モル．モル-1ｒＨＡの遊離チオールレベルを示したこと、以外は上記と同様にして０．３ｇのｒＨＡ（遊離チオールレベル０．７０モル．モル-1ｒＨＡ）をｒＨＡ−ＤＴＰＡへ転換した。１ｍＬのｒＨＡ−ＤＴＰＡを除去し、６０μＬの０．１％（ｗ／ｖ）ＸＯを残りに添加した。終点（４８モルＧｄ3+．モル-1ｒＨＡ）までｐＨを１ＭのＮａＯＨでｐＨ５．５とｐＨ６．０の間に維持しながら、ＤＴＰＡ基を０．１ＭのＧｄＣｌ3で滴定した。０．３ｍＬの保管されたｒＨＡ−ＤＴＰＡを余剰Ｇｄ3+を結合するために添加し、溶液を１ＭのＮａＯＨでｐＨ７に調節し、ついで４５℃で２時間インキュベーションしてチオールをアンブロックすると、０．５１モル．モル-1ｒＨＡの遊離チオールレベルを生じた。
【０１６１】
６．３ ＰＤＰＨとの反応
２ｍＬのｒＨＡ−ＤＴＰＡを、０．１５ｍＬの０．２Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4および０．０５ｍＬの０．２Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4と混合した。１ｍＬサンプルを採取し、３４３ｎｍにおけるその吸光度を、０．１ｍＬの１０ｍＭ ＰＤＰＨ（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ））の添加の直前に測定し、その後２０分間２分毎に測定した。測定はＰＤＰＨ自体の吸光度について補正し、反応の程度は放出された２−チオピリジンについて８０８０Ｍ-1．ｃｍ-1の吸光係数を用いて計算した。実験は、ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄを用いて繰り返した。結果は、ＰＤＰＨとの反応が、どちらの場合にも迅速かつ効率的であり、最初の２分の時点で９６〜９８％完了し、反応の最終程度は、遊離チオールアッセイによって測定された程度の約９０％であることを示した。
【０１６２】
６．４ ＥＭＣＨとの反応
４ｍＬのｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄを、０．３ｍＬの０．２Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4および０．１ｍＬの０．２Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4と混合し、０．４４ｍＬの１０ｍＭ ＥＭＣＨ（ピアス）を添加した。１ｍＬサンプルを、添加の１５、３０、６０、および１２０分後に採取し、５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７中で平衡化されたＰＤ１０カラムへ直ちに適用し、過剰ＥＭＣＨを除去した。高分子量フラクションを、溶離開始後１．５〜３．５ｍＬから収集した。溶離物を、直接的に、およびまた（ＥＭＣＨ除去を評価するため）一定量のＤＴＴでスパイクして、遊離チオールアッセイに付し、（ｒＨＡ回収を評価するため）タンパク質アッセイに付した。測定された回収率は、ＤＴＴについては９８〜１０４％、ｒＨＡについては１０２〜１０４％の範囲内にあり、このことは、ＥＭＣＨの完全な排除およびｒＨＡの回収を確認した。直接遊離チオールアッセイについての結果は、ＥＭＣＨとの反応が、迅速かつ同時に効率的であり、遊離チオールレベルが最初の１５分の時点で０．０２モル．モル-1ｒＨＡへ減少することを示した。
【実施例７】
【０１６３】
抗体との架橋剤反応
この実施例は、２つの抗体αＣＤ４５およびＣ５９５と架橋剤ＰＤＰＨとの反応について記載する。
【０１６４】
７．１ ＰＤＰＨとのαＣＤ４５反応
１ｍＬのαＣＤ４５（セロテック（Ｓｅｒｏｔｅｃ）ＭＣＡ４３Ｇ；ＩｇＧ濃度１．０ｍｇ．ｍＬ-1）を、２．３ｍｇのＫｌＯ4へ添加し、室温において暗所で３０分間混合した。溶液をＰＢＳで平衡化されたＰＤ１０カラムへ適用し、高分子量フラクションを、溶離開始後１．５〜３．５ｍＬから収集した。溶離物を、ＰＢＳで予め洗浄されたナノセップ（Ｎａｎｏｓｅｐ）１０Ｋオメガ（Ｏｍｅｇａ）遠心濃縮器（ポール（Ｐａｌｌ））を用いて１ｍＬの最終容積に濃縮し、１．０ｍｇのＰＤＰＨへ添加し、室温で２１時間混合した。αＣＤ４５−ＰＤＰＨをＰＤ１０カラムを用いて精製し、この溶離物を上記のように１ｍＬに再濃縮すると９０％の全体でのＩｇＧ回収率が得られた。反応の程度を、１０μＬの１０ｍＭ ＤＴＴの添加の直前、およびその後１５分間１分毎に、３４３ｎｍにおける吸光度測定によって８０８０Ｍ-1．ｃｍ-1の吸光係数を用いて、結合ＰＤＰＨの還元の時に放出された２−チオピリジンから決定した。結果（図６）は、ＰＤＰＨがαＣＤ４５と首尾良く反応し、２．３モルＰＤＰＨ．モル-1ＩｇＧの化学量論を生じたことを示した。分析ＧＰＨＰＬＣ（２８０ｎｍの検出波長での５０μＬ注入）は、生じたαＣＤ４５−ＰＤＰＨが高いモノマー純度を保持し、約８．４分のピーク溶離時間をともなうことを示した。
【０１６５】
７．２ ＰＤＰＨとのＣ５９５反応
０．３５ｍＬのＣ５９５（ノッティンガム大学から入手；ＩｇＧ濃度３．２ｍｇ．ｍＬ-1）を０．６５ｍＬ ＰＢＳで希釈し、２．４ｍｇのＫｌＯ4へ添加し、室温において暗所で３０分間混合した。溶液をＰＢＳで平衡化されたＰＤ１０カラムへ適用し、高分子量フラクションを溶離の開始後１．５〜３．５ｍＬから収集した。溶離物を、ＰＢＳで予め洗浄されたナノセップ１０Ｋオメガ遠心濃縮器を用いて１ｍＬの最終容積に濃縮し、１．０ｍｇのＰＤＰＨへ添加し、室温で１９時間混合した。Ｃ５９５−ＰＤＰＨをＰＤ１０カラムを用いて精製し、溶離物を上記のように１ｍＬに再濃縮すると、８５％の全体でのＩｇＧ回収率が得られた。反応の程度を、１０μＬの１０ｍＭ ＤＴＴの添加の直前、およびその後１５分間１分毎に、３４３ｎｍにおける吸光度測定によって８０８０Ｍ-1．ｃｍ-1の吸光係数を用いて、結合ＰＤＰＨの還元の時に放出された２−チオピリジンから決定した。結果（図７）は、ＰＤＰＨがＣ５９５と首尾良く反応し、２．５モルＰＤＰＨ．モル-1ＩｇＧの化学量論を生じたことを示した。分析ＧＰＨＰＬＣ（２８０ｎｍの検出波長での５０μＬ注入）は、結果として生じたＣ５９５−ＰＤＰＨが高いモノマー純度を保持し、ピーク溶離時間が約８．５分であることを示した。
【実施例８】
【０１６６】
ｒＨＡ−ＤＴＰＡ／ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄの精製
ターゲッティング部分とキャリヤー分子との接合体は個々の成分のどちらよりも明らかに大きく、したがって未反応の個々の成分のどれからの接合体の精製もゲル透過クロマトグラフィーによって達成可能であるはずである。ｒＨＡキャリヤー分子の特定の場合、ヒトアルブミンがダイマーおよびより長いオリゴマーを形成する傾向は、非標的キャリヤー分子からの標的接合体の首尾良い精製を危うくすることがあるであろう。この方法は、この接合体のその後の精製を単純化するために、ターゲッティング部分との反応の前にモノマーｒＨＡ−ＤＴＰＡおよびｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄを精製することについて記載する。
【０１６７】
８．１ 分取ＧＰＨＰＬＣ
ｒＨＡ誘導体の精製は、高い生産性を生じるために大きい注入容積（２００μＬ）、および高いｒＨＡ濃度におけるピーク吸光度を減少させるために準最適検出波長（２５４ｎｍ）を用いた。
【０１６８】
８．２ ｒＨＡ−ＤＴＰＡの精製
ｒＨＡ−ＤＴＰＡの分取ＧＰＨＰＬＣは、約６．６分におけるダイマーピーク、および約７．６分におけるモノマーピークを特徴としていた。モノマーｒＨＡ−ＤＴＰＡの精製のために、７．２〜９．０分で溶離する材料を収集した。収集された材料の分析ＧＰＨＰＬＣ（２８０ｎｍの検出波長での５０μＬ注入）は、高度のモノマー純度がこの方法によって達成されたことを確認した。
【０１６９】
８．３ ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄの精製
ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄの分取ＧＰＨＰＬＣは、約６．９分におけるダイマーピーク、および約８．１分におけるモノマーピークを特徴としていた。モノマーｒＨＡ−ＤＴＰＡの精製のために、７．７〜９．０分で溶離する材料を収集した。収集された材料の分析ＧＰＨＰＬＣ（２５４ｎｍの検出波長での１００μＬ注入）は、高度のモノマー純度がこの方法によって達成されたことを確認した。
【実施例９】
【０１７０】
αＣＤ４５−ＰＤＰＨ−ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄの調製
合成における個々の工程の以前の開発に基づいて（実施例１〜８）、この方法は標的化薬剤の完全調製について記載する。この方法において、キャリヤー分子（ｒＨＡ）をＤＴＰＡついでＧｄで高いレベル標識し、標的化ＭＲＩ造影剤としての使用に適するようにする。
【０１７１】
９．１ ｒＨＡ−ＤＴＰＡの合成
０．３ｇのｒＨＡ（遊離チオールレベル０．７０モル．モル-1ｒＨＡ）を水中１２ｍＬに希釈し、ｐＨを５ＭのＮａＯＨの添加によってｐＨ８のできるだけ近くに維持しながら、１ｇのＤＴＰＡａを一定攪拌を行ないながら約３５分にわたって添加した。溶液を最終添加後３０分間攪拌し、３ＭのＨＣｌでｐＨ７に調節し、０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌで平衡化されたセファデックスＧ５０媒質カラム（１．６×３７ｃｍ）へ適用した。溶離は、２５４ｎｍでの検出をしながら２．７ｍＬ．分-1で実施した。ｒＨＡ−ＤＴＰＡピークは、溶離開始の２〜１０分後に収集され、これは０．１４モル．モル-1ｒＨＡの遊離チオールレベルを示した。
【０１７２】
９．２ ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄの合成
１ｍＬのｒＨＡ−ＤＴＰＡを除去し、６０μＬの０．１％（ｗ／ｖ）ＸＯを残りに添加した。ｐＨを１ＭのＮａＯＨでｐＨ５．５〜ｐＨ６．０に終点（黄色から紫色への最初の変化によって示された；４８モルＧｄ3+．モル-1ｒＨＡ）まで維持しながら、ＤＴＰＡ基を０．１ＭのＧｄＣｌ3で滴定した。０．３ｍＬの保管されたｒＨＡ−ＤＴＰＡを、余剰Ｇｄ3+を結合するために添加し、色彩は黄色に戻り、溶液を１ＭのＮａＯＨでｐＨ７に調節し、ついで４５℃で２時間インキュベーションしてチオールをアンブロックすると、０．５１モル．モル-1ｒＨＡの遊離チオールレベルを生じた。
【０１７３】
９．３ αＣＤ４５−ＰＤＰＨの合成
１ｍＬのαＣＤ４５を２．３ｍｇのＫｌＯ4へ添加し、室温において暗所で３０分間混合した。溶液をＰＢＳで平衡化されたＰＤ１０カラムへ適用し、高分子量フラクションを、溶離開始後、１．５〜３．５ｍＬから収集した。溶離物をＰＢＳで予め洗浄されたナノセップ１０Ｋオメガ遠心濃縮器を用いて１ｍＬの最終容積まで濃縮し、１．１ｍｇのＰＤＰＨへ添加し、室温で５時間混合した。αＣＤ４５−ＰＤＰＨを、上記のように用いられているＰＤ１０カラムを用いて精製した。
【０１７４】
９．４ ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄの精製
モノマーｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄを、２５４ｎｍにおける検出をしながら２００μＬの注入を用いて分取ＧＰＨＰＬＣによって精製した。クロマトグラフィーは８サイクル実施し、注入の７．７〜９．０分後に生成物を収集した。この生成物のｒＨＡ濃度は、１．１ｇ．Ｌ-1であった。この生成物の高いモノマー純度が、２８０ｎｍにおける検出とともに５０μＬ注入を用いて分析ＧＰＨＰＬＣによって確認された。
【０１７５】
９．５ αＣＤ４５−ＰＤＰＨ−ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄの合成
精製されたｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄを、約１０モルｒＨＡ．モル-1ＩｇＧでαＣＤ４５−ＰＤＰＨへ添加し、溶液を、ＰＢＳで予め洗浄されたビバスピン（Ｖｉｖａｓｐｉｎ）２０ １０Ｋ遠心濃縮器（サートリウス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ））を用いて１ｍＬに濃縮し、室温で２４時間混合した。αＣＤ４５−ＰＤＰＨ−ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄの形成は、２８０ｎｍでの検出をしながら２０μＬ注入を用いた分析ＧＰＨＰＬＣ上の新たな高分子量ピークの出現によって確認された。２．３の想定ｒＨＡ：αＣＤ４５化学量論（ＰＤＰＨ：αＣＤ４５について実施例７で測定されたように）は、Ｇｄ3+：ｒＨＡ化学量論の測定値４８ともに、この錯体についての予測Ｇｄレベルとして約１１０モルＧｄ3+．モル-1ＩｇＧを与える。
【０１７６】
９．６ αＣＤ４５−ＰＤＰＨ−ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄの精製
αＣＤ４５−ＰＤＰＨ−ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄを、上記のように分取ＧＰＨＰＬＣによって精製したが、約９５μＬの１０回注入、２８０ｎｍにおける検出、６．０〜７．２分からの生成物収集を用いた。この生成物は、２つのナノセップ１０Ｋオメガ遠心濃縮器を用いて１ｍＬに濃縮し、純度は、２８０ｎｍにおける検出をしながら５０μＬの注入を用いた分析ＧＰＨＰＬＣによって確認された。最後にこの生成物を、−３０℃浴中に約１５０μＬアリコートとして冷凍し、−２０℃で保存した。
【０１７７】
９．７ 抗体結合活性
αＣＤ４５−ＰＤＰＨ−ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄの抗体活性は、発蛍光団標識されたαＣＤ４５に対する競合結合アッセイにおいて、白血球共通抗原ＣＤ４５を発現するラットの脾臓細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ）を用いて測定した。これらの細胞の蛍光強度は、一定の０．２μｇ蛍光抗体を用いαＣＤ４５−ＰＤＰＨ−ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄの量を増やしながら、フローサイトメトリーによって測定した。非標識αＣＤ４５は、正の対照として同様にアッセイした。結果（図８）は、αＣＤ４５−ＰＤＰＨ−ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄが、非標識αＣＤ４５と同様に蛍光抗体を置換させることができることを示し、このことは、接合体が抗体結合活性を保持したことを証明した。
【０１７８】
９．８ 磁気共鳴特性
αＣＤ４５−ＰＤＰＨ−ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄは、２テスラにおけるＴ１およびＴ２の緩和時間として、それぞれ９２および９５ｍｓを与えた。これは、同時に測定された時に１９３および１７７ｍｓの値を生じる０．５ｍＭのオムニスキャン（Ｏｍｎｉｓｃａｎ）（商標）（アマシャムからの非標的化ガドリニウムベースのＭＲＩ造影剤）よりも約２倍良好であった。このことは、この接合体についての優れた緩和の向上を示している。
【実施例１０】
【０１７９】
Ｃ５９５−ＰＤＰＨ−ｒＨＡ−ＤＴＰＡの調製
この方法は、標的化された薬剤の調製であって、キャリヤー分子（ｒＨＡ）が高レベルでＤＴＰＡで標識されるが、金属イオンを用いず、これを標的化核イメージングまたは治療薬としての使用のために適した放射性金属の積載に適したものにする調製について記載する。
【０１８０】
１０．１ ｒＨＡ−ＤＴＰＡの合成
０．３ｇのｒＨＡ（遊離チオールレベル０．６７モル．モル-1ｒＨＡ）を水中１２ｍＬに希釈し、ｐＨを５ＭのＮａＯＨの添加によってできるだけｐＨ８の近くに維持しながら、１ｇのＤＴＰＡａを一定攪拌を行ないながら約３０分にわたって添加した。溶液を、最終添加後約３０分間攪拌し、３ＭのＨＣｌでｐＨ７に調節し、０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌで平衡化したセファデックスＧ５０媒質カラム（１．６×３７ｃｍ）へ適用した。溶離は、２５４ｎｍにおける検出とともに２．８４ｍＬ．分-1で実施した。ｒＨＡ−ＤＴＰＡピークが、溶離の開始の２〜９分後に収集され、これは、０．０７モル．モル-1ｒＨＡの遊離チオールレベルを示した。ｒＨＡ−ＤＴＰＡを４５℃で２０時間インキュベーションしてチオールをアンブロックすると、０．５７モル．モル-1ｒＨＡの遊離チオールレベルを生じた。上記のようなＧｄＣｌ3での錯滴定によってこの材料の４ｍＬアリコートに対して測定されたＤＴＰＡレベルは、４４モル．モル-1ｒＨＡであった。
【０１８１】
１０．２ Ｃ５９５−ＰＤＰＨの合成
Ｃ５９５（ノッティンガム大学から入手；ＩｇＧ濃度３．２ｍｇ．ｍＬ-1）をＰＢＳ中１．０ｍｇ．ｍＬ-1ＩｇＧに希釈し、１ｍＬを２．３ｍｇのＫｌＯ4へ添加し、室温において暗所で３０分間混合した。この溶液をＰＢＳで平衡化されたＰＤ１０カラムへ適用し、高分子量フラクションを、溶離の開始後１．５〜３．５ｍＬから収集した。溶離物を、ＰＢＳで予め洗浄されたナノセップ１０Ｋオメガ遠心濃縮器を用いて１ｍＬの最終容積に濃縮し、１．１ｍｇのＰＤＰＨへ添加し、室温で５時間混合した。Ｃ５９５−ＰＤＰＨを、上記のように用いられているＰＤ１０カラムを用いて精製した。
【０１８２】
１０．３ ｒＨＡ−ＤＴＰＡの精製
モノマーｒＨＡ−ＤＴＰＡを、ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷＸＬ０．７８×３０ｃｍカラムおよびガード上の２００μＬ注入を用いて、分取ＧＰＨＰＬＣによって精製し、２５４ｎｍにおける検出とともにＰＢＳ中１ｍＬ．分-1で溶離した。クロマトグラフィーの６サイクルを実施し、注入の７．２〜９．０分後に生成物を収集した。この生成物のｒＨＡ濃度は、１．０ｇ．Ｌ-1であった。この生成物の高いモノマー純度は、上記の分取ＧＰＨＰＬＣと同様であるが、２８０ｎｍにおける検出をしながら５０μＬ注入を用いた分析ＧＰＨＰＬＣによって確認された。
【０１８３】
１０．４ Ｃ５９５−ＰＤＰＨ−ｒＨＡ−ＤＴＰＡの合成
精製されたｒＨＡ−ＤＴＰＡを、約１０モルｒＨＡ．モル-1ＩｇＧでＣ５９５−ＰＤＰＨへ添加し、この溶液をＰＢＳで予め洗浄されたビバスピン２０ １０Ｋ遠心濃縮器を用いて１ｍＬに濃縮し、室温で１８時間混合した。Ｃ５９５−ＰＤＰＨ−ｒＨＡ−ＤＴＰＡの形成は、２８０ｎｍにおける検出とともに２０μＬ注入を用いた分析ＧＰＨＰＬＣでの新たな高分子量ピークの出現によって確認された。２．５の想定ｒＨＡ：Ｃ５９５化学量論（ＰＤＰＨ：Ｃ５９５について実施例７において測定されたように）は、測定Ｇｄ3+：ｒＨＡ化学量論である４４とともに、この錯体について予測されたＧｄレベルとして約１１０モルＧｄ3+．モル-1ＩｇＧを与える。
【０１８４】
１０．５ Ｃ５９５−ＰＤＰＨ−ｒＨＡ−ＤＴＰＡの精製
Ｃ５９５−ＰＤＰＨ−ｒＨＡ−ＤＴＰＡを、上記のような分取ＧＰＨＰＬＣによって精製したが、約９５μＬの１０回注入、２８０ｎｍにおける検出、５．７〜６．６分からの生成物収集を用いた。この生成物を２つのナノセップ１０Ｋオメガ遠心濃縮器を用いて１ｍＬに濃縮し、純度は２８０ｎｍにおける検出とともに５０μＬの注入を用いて分析ＧＰＨＰＬＣによって確認された。最後に生成物を、−３０℃浴中に約１１５μＬアリコートとして冷凍し、−２０℃で保存した。
【実施例１１】
【０１８５】
ＭＲＩ造影剤（ガドリニウムキレート）で標識されたｒＨＡ粒子の調製
１１．１ 方法
１１．１．１ ｒＨＡ粒子の調製
次のようにして、ｒＨＡ粒子の１バッチをｒＨＡ懸濁液のスプレー乾燥によって生成した：
２００ｍＬの２５％（ｗ／ｖ）ｒＨＡを、５Ｌのピロゲンフリー精製水に対して室温で一晩透析して過剰な塩化ナトリウムを除去し、３２０ｍＬの最終容積を生じた。５２ｍＬの透析タンパク質を１ＭのＮａＯＨでｐＨ８．０に調節し、磁気攪拌機での一定混合を行ないながらエタノールをゆっくりと乳状懸濁液が形成されるまで添加した（８０ｍＬエタノール）。連続的に攪拌された懸濁液を、次の条件下、シュリック（Ｓｃｈｌｉｃｋ）２−流体噴霧ノズル（モデル９７０／０）が取り付けられたブキ・ミニスプレードライヤー（Ｂｕｃｈｉ Ｍｉｎｉ Ｓｐｒａｙ Ｄｒｙｅｒ）（モデルＢ−１９１）を用いてスプレー乾燥した：
入口温度 １００℃
出口温度 ６７℃
供給率 ３ｍＬ．分-1
噴霧圧力 ゲージ圧６バール（６ｂａｒｇ）
結果として生じた微粒子（４．０ｇ）をサイクロン収集ジャーから回収し、１７６℃で５５分間熱固定して不溶性にし（３．５ｇを生じる）、７．０ｇのマンニトールと混合し、５ｂａｒｇの流入圧力および３ｂａｒｇのミル圧力を有するアトライター６ｉｎ流体エネルギーミルを用いて解凝集した。
【０１８６】
１１．１．２ ＤＴＰＡａとの接合
調合された粒子をエタノールで湿潤させ、遠心分離（ソルヴァル（Ｓｏｒｖａｌｌ）ＲＴ６０００）によって水で完全に洗浄し、賦形剤のマンニトールを除去した。洗浄後、アリコートを乾燥重量測定のために採取し、（この測定を基準にして）ｒＨＡ粒子を水中２０ｇ．Ｌ-1に希釈した。ＤＴＰＡａ（０．３ｇの粒子につき１ｇ）を、約２５分間にわたって一定攪拌を行ないながらゆっくりと添加した。この間に、５ＭのＮａＯＨを添加し、ｐＨをできるだけ８．０の近くに維持した。攪拌は、最終ＤＴＰＡａ添加後３０分間続行し、ついでｐＨを５ＭのＨＣｌで７．０に調節した。ｒＨＡ−ＤＴＰＡ粒子を、遠心分離と８ｇ．Ｌ-1（当初乾燥重量を基準にして）への再懸濁によって、０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌで２回、水で２回洗浄し、最後に６０ｇ．Ｌ-1に再懸濁した。
【０１８７】
１１．１．３ Ｇｄでの標識
ｒＨＡ−ＤＴＰＡ粒子懸濁液の乾燥重量を測定し、ＤＴＰＡ標識による質量増加を決定すると、３２．４モル．モル-1ｒＨＡの値が得られた。Ｇｄ標識のために、この懸濁液のもう１つのアリコートを水で希釈し、０．１ＭのＧｄＣｌ3を一定攪拌を行ないながら添加して全体として２．５倍の希釈となり、乾燥重量測定によって決定されたＤＴＰＡレベルに等しい最終Ｇｄ濃度を生じた。混合を１０分間続行し、懸濁液を水でさらに１．５倍希釈し、ｒＨＡ−Ｇｄ粒子を遠心分離によって沈降させ、ペレットを水中に６０ｇ．Ｌ-1（当初乾燥重量を基準にして）に再懸濁した。その結果生じた懸濁液を、５０ｇ．Ｌ-1、５％（ｗ／ｖ）マンニトールへ調合し、凍結乾燥した。
【０１８８】
１１．２ 粒子の性質決定
１１．２．１ これらの粒子の磁気共鳴特性
磁気共鳴イメージングを、Ｇｄ−ＤＴＰＡ標識粒子に対して実施した。これらの粒子およびマグネビスト（登録商標）対照を、水で約２ｍＬに希釈し、ついで８ｍＬの０．５％アガロースと混合して、規定のＧｄ濃度を生じた。各サンプルについての緩和率（Ｒ１およびＲ２）を、実施例１に記載されているように決定した。
【０１８９】
ｒＨＡ−Ｇｄ粒子のｉｎ ｖｉｔｒｏＭＲＩ特性を、Ｇｄ−ＤＴＰＡをベースとする商用ＭＲＩ造影剤であるマグネビスト（登録商標）の特性と比較した。微粒子ｒＨＡ−Ｇｄでの緩和率（図９）は、マグネビスト（登録商標）を用いて得られたものと同等である（Ｒ１について）か、またはこれよりも有意に大きかった（Ｒ２について）。このことは、ｒＨＡ−Ｇｄ粒子が、特に微粒子材料に対して予測されたクリアランス率の顕著な減少から考えて、同じＧｄ濃度においてマグネビスト（登録商標）を用いて見られたものと同等であるか、これよりも良好なｉｎ ｖｉｖｏ画像を生成するはずであることを示した。あるいはまたこれは、これらの粒子を、マグネビスト（登録商標）よりも低いＧｄ用量で用いることができることを示唆した。
【０１９０】
１１．２．２ サイズ分布分析
この標識方法が、有意な凝集レベルを生じたかどうかを決定するために、クールターサイズ分析を行なった。図１０に示されている結果は、このサイズ分布（Ｇｄ−ＤＴＰＡ標識後）が有意に変わってはいなかったことを確認する。
【０１９１】
１１．２．３ 再懸濁特性
光学顕微鏡法（図１１）は、Ｇｄ−ＤＴＰＡ標識粒子が非凝集であり、再懸濁されて適切な懸濁液を生じることを確認した。
【実施例１２】
【０１９２】
ＭＲＩ造影剤での可溶性ｒＨＡの標識、ついで粒子の製造
この実施例は、粒子が予めＧｄ−キレートで標識されている可溶性ｒＨＡ分子から形成される、本発明の方法の変形例を例証する。
【０１９３】
１２．１ 方法
ｒＨＡの１．５ｇアリコートを、水中２０ｇ．Ｌ-1に希釈し、５ｇのＤＴＰＡａで処理し、約４０分間にわたって一定攪拌を行ないながら、ゆっくりと添加した。この間、５ＭのＮａＯＨを添加してｐＨを８．０のできるだけ近くに維持した。攪拌は、最終ＤＴＰＡａ添加後３０分間続行し、ついでｐＨを、５ＭのＨＣｌで７．０に調節した。
【０１９４】
標識された（＋ＤＴＰＡ）サンプルを１０．５Ｌの水に対して透析して、５時間後に交換して、全部で２１時間透析した。必要とされるＧｄ添加を評価するために、＋ＤＴＰＡサンプルの５ｍＬアリコートを、最初の持続的曇りに至るまで１ＭのＧｄＣｌ3で滴定した。これに基づいて、可溶性ｒＨＡで得られたＤＴＰＡレベルは、４７モル．モル-1であった。＋ＤＴＰＡサンプルのもう１つの５ｍＬアリコートを除去し、残りのサンプルを最初の持続的曇りに至るまで１ＭのＧｄＣｌ3で滴定し、未滴定アリコートを、あらゆる過剰Ｇｄを結合するために戻した。
【０１９５】
ついでＧｄ標識サンプルを０．２μｍで濾過して、あらゆる残留不溶性材料を除去した。これらのサンプルを、シュリック２流体ノズルを有するブキ・スプレードライヤーを用いて、入口温度１１０℃、噴霧圧力０．５バール、および供給率３．５ｍＬ．分-1でスプレー乾燥し、約７９℃の出口温度を生じた。収集されたサンプルの重さを測って、回収率を計算し、ついで１７５℃で全部で５時間半、熱固定した。
【０１９６】
ＤＴＰＡ標識の不存在下、ｒＨＡ粒子は１７５℃５５分の後で不溶である。しかしながらこれは、Ｇｄ標識サンプルの場合には当てはまらず、材料の不溶性を達成するために、追加の固定が必要とされた。
【実施例１３】
【０１９７】
微粒子ｒＨＡの遊離チオール含量
標的化された薬剤としての使用のために、これらの粒子が、ターゲッティング部分の化学的連結に適した反応性基を含有することが重要である。粒子形成材料としてのｒＨＡの場合、ｃｙｓ３４における遊離チオールはこの目的に非常に適した基である。この方法は、これらの粒子を不溶にするために用いられる高温熱固定にもかかわらず、これが反応のために依然として利用可能であることを確認するために、ｒＨＡ粒子の遊離チオール含量の測定について記載する。
【０１９８】
１３．１ ｒＨＡ粒子の調製
１００ｍＬの２５％（ｗ／ｖ）ｒＨＡを、２０Ｌの水に対して室温で一晩透析し、その結果生じたタンパク質濃度を、１ｇ．Ｌ-1吸光係数である０．５３を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度測定によって決定した。この透析されたタンパク質（２４．４ｇ）を、水で１２．５％（ｗ／ｖ）に希釈し、ＮａＯＨでｐＨ８．０に調節した。２７５ｍＬのエタノールを添加し、その結果生じた懸濁液を、入口温度１００℃、出口温度７２℃、流量３ｍＬ．分-1、および噴霧圧力６ｂａｒｇでスプレー乾燥した。生じた微粒子（１３．４ｇ）を１７５℃で１時間熱固定し（１１．１ｇを生じる）、２２．２ｇのマンニトールと混合し、入口圧力５ｂａｒｇおよびミル圧力３ｂａｒｇを有する流体エネルギーミルを２回通した。
【０１９９】
１３．２ 遊離チオールアッセイ
遊離チオール濃度は、放出された５−チオール−２−ニトロベンゾエートの吸光係数である１３６００Ｍ-1．ｃｍ-1を用いて、ｐＨ７でのＤＴＮＢとの反応、および４１２ｎｍにおける吸光度測定によって決定した。反応を室温で１時間実施し、これらの粒子は上澄み液への吸光度測定の前に遠心分離によって沈降させた。ＤＴＮＢの吸光度、および未沈降粒子からの残留濁度の両方について補正を行なった。測定された遊離チオールレベルは、０．３６モル．モル-1ｒＨＡであり、このことは、遊離チオールが熱固定工程によって完全には破壊されず、ターゲッティング部分の連結に適したレベルにおいて存在することを確認した。
【実施例１４】
【０２００】
粒子積載の最適化
最大の効果を得るために、この粒子が、薬剤（例えばＭＲＩへの使用のためのＧｄ3+）または核イメージングまたは治療における使用のための放射性金属の最大積載量を運ぶことが多くの場合重要である。この方法はｒＨＡ粒子に対するＧｄ3+結合能力の最適化について記載する。
【０２０１】
１４．１ ＤＴＰＡ−標識ｒＨＡ粒子の合成
ｒＨＡ粒子のアリコートを水中に懸濁し、ｐＨを５ＭのＮａＯＨの添加によってｐＨ８のできるだけ近くに維持しながら、様々な量のＤＴＰＡａ（約０．５〜５ｇ．ｇ-1ｒＨＡの範囲をカバーする）を、一定攪拌を行ないながらそれぞれ約１０〜４０分にわたって添加した。これらの懸濁液を、最終添加後約３０分間攪拌し、３ＭのＨＣｌでｐＨ７に調節した。すべてのサンプルを、遠心分離および再懸濁によって完全に洗浄し、未結合ＤＴＰＡを除去した。
【０２０２】
１４．２ Ｇｄ3+結合能力の測定
Ｇｄ3+結合能力はＸＯ指示薬を用いた錯滴定によって決定する。ｐＨを、適切な緩衝液（例えばヘキサミン）の使用によって、または適切なアルカリ（例えばＮａＯＨ）での調節によって、滴定の間ｐＨ５．０〜６．５の範囲内に制御する。ＸＯを、既知量のＤＴＰＡ標識ｒＨＡ粒子を含有する懸濁液へ添加し、滴定を、標準化ＧｄＣｌ3溶液を用いて最初の持続的色彩変化に至るまで実施する。
【実施例１５】
【０２０３】
微粒子ｒＨＡ誘導体における遊離チオール回収のための条件の開発
可溶性ｒＨＡでの結果（実施例４参照）は、ｒＨＡ遊離チオールがＤＴＰＡａとの反応によって大幅にブロックされることを示している。このチオールが架橋剤付着部位として用いられることになるならば、ｒＨＡ遊離チオールの回収が架橋剤との効率的な反応のために必要とされる。この方法は、ｒＨＡ粒子とＤＴＰＡａ（ＤＴＰＡ標識されたｒＨＡ粒子）との反応後、またはＧｄ3+（Ｇｄ標識されたｒＨＡ粒子）の結合後に、この目的を達成するための条件の開発について記載する。
【０２０４】
１５．１ 標識されたｒＨＡ粒子の合成
ＤＴＰＡ標識されたｒＨＡ粒子を、基本的に実施例１１に記載されているように作製する。Ｇｄ標識されたｒＨＡ粒子は、基本的には実施例１１に記載されているようにＤＴＰＡ標識されたｒＨＡ粒子から生成されてもよい。あるいはまたこれらは、実施例１４に記載されているように、ＸＯの存在下、ＧｄＣｌ3での錯滴定を用いて生成されてもよく、余剰Ｇｄ3+を結合するために滴定の最後にＤＴＰＡ標識されたｒＨＡ粒子のさらなる少量の添加をともなう。
【０２０５】
１５．２ 遊離チオールの回収
ＤＴＰＡ標識されたｒＨＡ粒子およびＧｄ標識されたｒＨＡ粒子の両方のアリコートをある範囲のｐＨ値および／またはある範囲の温度においてインキュベーションし、インキュベーションの開始時およびその後周期的にサンプルを採取した。これらを遊離チオールアッセイに付し、各粒子型での遊離チオールの回収のための最適条件を決定する。
【実施例１６】
【０２０６】
微粒子ｒＨＡ誘導体との架橋剤反応
本発明による方法において、ターゲッティング部分および粒子は各々、明確な生成物を生成するために、架橋剤反応のための独自の化学基を含有する。抗体ターゲッティング部分およびｒＨＡ粒子という特定の場合、これらの基はそれぞれ、炭水化物および遊離チオールである。この方法は、ＤＴＰＡ標識されたｒＨＡ粒子およびＧｄ標識されたｒＨＡ粒子と、これらの基との併用に適した２つの架橋剤（ＰＤＰＨおよびＥＭＣＨ）との反応について記載する。
【０２０７】
１６．１ 標識されたｒＨＡ粒子の合成
ＤＴＰＡ標識されたｒＨＡ粒子およびＧｄ標識されたｒＨＡ粒子の両方を、基本的に実施例１５に記載されているように合成し、遊離チオールを実施例１５において決定された最適条件を用いてアンブロックする。
【０２０８】
１６．２ ＰＤＰＨとの反応
標識ｒＨＡ粒子の両方の型のアリコートを、リン酸塩緩衝液の添加によってｐＨ約７で緩衝させる。サンプルを、ＰＤＰＨの添加の直前およびその後周期的に、利用可能な遊離チオール基よりも有意なモル過剰で採取する。これらのサンプルを直ちに遠心分離し、３４３ｎｍにおける上澄み液吸光度を測定する。測定値は、ＰＤＰＨそれ自体の吸光度および非沈降粒子からの残留濁度の両方について補正し、反応の程度を、放出された２−チオピリジンについての吸光係数である８０８０Ｍ-1．ｃｍ-1を用いて計算する。これらのデータは、ＰＤＰＨを各々の粒子型へ連結するための最適反応条件を決定するために用いる。
【０２０９】
１６．３ ＥＭＣＨとの反応
標識されたｒＨＡ粒子の両方の型のアリコートを、リン酸塩緩衝液の添加によって約ｐＨ７で緩衝させる。サンプルを、ＥＭＣＨの添加の直前およびその後周期的に、利用可能な遊離チオール基よりも有意なモル過剰で採取する。これらのサンプルを直ちに遠心分離し、ペレットを完全に洗浄して、遊離チオールアッセイの前に過剰ＥＭＣＨを除去する。これらのデータは、ＥＭＣＨを各々の粒子型へ連結するための最適反応条件を決定するために用いる。
【実施例１７】
【０２１０】
抗体／Ｇｄ標識されたｒＨＡ粒子の調製
合成における個々の工程の以前の開発に基づいて（実施例１１〜１６）、この方法は、標的された薬剤の調製であって、粒子（ｒＨＡ）を、ＤＴＰＡついでＧｄで高レベルに標識し、ついで抗体へ連結し、これを標的化されたＭＲＩ造影剤としての使用に適したものにする調製について記載する。
【０２１１】
１７．１ 架橋剤を用いた、および用いない、Ｇｄ標識されたｒＨＡ粒子の合成
Ｇｄ標識されたｒＨＡ粒子およびＧｄ標識されたｒＨＡ粒子＋架橋剤（ＰＤＰＨまたはＥＭＣＨ）を基本的に実施例１６に記載されているように合成する。ついでこれらの粒子を遠心分離および再懸濁によって完全に洗浄し、過剰な反応体を除去する。
【０２１２】
１７．２ 架橋剤を用いた、および用いない、過ヨウ素酸塩酸化された抗体の合成
過ヨウ素酸塩酸化された抗体を、基本的に実施例７に記載されているように、ＫｌＯ4での抗体のインキュベーション、ＰＤ１０クロマトグラフィー、および遠心濃縮によって合成する。ＰＤＰＨ架橋剤の過ヨウ素酸塩酸化された抗体への連結、およびその後のＰＤ１０クロマトグラフィー、および遠心濃縮もまた、基本的に実施例７に記載されているように実施する。ＥＭＣＨ架橋剤の連結も同様に実施することができる。
【０２１３】
１７．３ 抗体／Ｇｄ標識されたｒＨＡ粒子の合成
抗体／Ｇｄ標識されたｒＨＡ粒子は、反応体の次の３つの組合わせのいずれかをインキュベーションすることによって作製することができる。
【０２１４】
１．（Ｇｄ標識されたｒＨＡ粒子＋架橋剤）＋（過ヨウ素酸塩酸化された抗体）
２．（Ｇｄ標識されたｒＨＡ粒子）＋（過ヨウ素酸塩酸化された抗体＋架橋剤）
３．（Ｇｄ標識されたｒＨＡ粒子）＋（過ヨウ素酸塩酸化された抗体）＋（架橋剤）
どの合成経路が用いられても、結果として生じる粒子を遠心分離および再懸濁によって完全に洗浄し、過剰な反応体を除去する。
【実施例１８】
【０２１５】
抗体／ＤＴＰＡ標識されたｒＨＡ粒子の調製
この方法は、標的化された薬剤の調製であって、金属イオンを用いずに粒子（ｒＨＡ）を高レベルでＤＴＰＡで標識し、ついで抗体へ連結し、これを標的化された核イメージングまたは治療薬としての使用に適した放射性金属の積載に適したものにする調製について記載する。
【０２１６】
１８．１ 架橋剤を用いた、および用いない、ＤＴＰＡ標識されたｒＨＡ粒子の合成
ＤＴＰＡ標識されたｒＨＡ粒子およびＤＴＰＡ標識されたｒＨＡ粒子＋架橋剤（ＰＤＰＨまたはＥＭＣＨ）を、基本的に実施例１６に記載されているように合成する。ついでこれらの粒子を遠心分離および再懸濁によって完全に洗浄し、過剰な反応体を除去する。
【０２１７】
１８．２ 架橋剤を用いた、および用いない、過ヨウ素酸塩酸化された抗体の合成
過ヨウ素酸塩酸化された抗体を、基本的に実施例７に記載されているように、ＫｌＯ4での抗体のインキュベーション、ＰＤ１０クロマトグラフィー、および遠心濃縮によって合成する。ＰＤＰＨ架橋剤の過ヨウ素酸塩酸化された抗体への連結、およびその後のＰＤ１０クロマトグラフィーおよび遠心濃縮もまた、基本的に実施例７に記載されているように実施する。ＥＭＣＨ架橋剤の連結も同様に実施することができる。
【０２１８】
１８．３ 抗体／Ｇｄ標識されたｒＨＡ粒子の合成
抗体／ＤＴＰＡ標識されたｒＨＡ粒子は、反応体の次の３つの組合わせのいずれかをインキュベーションすることによって作製することができる。
【０２１９】
１．（ＤＴＰＡ標識されたｒＨＡ粒子＋架橋剤）＋（過ヨウ素酸塩酸化された抗体）
２．（ＤＴＰＡ標識されたｒＨＡ粒子）＋（過ヨウ素酸塩酸化された抗体＋架橋剤）
３．（ＤＴＰＡ標識されたｒＨＡ粒子）＋（過ヨウ素酸塩酸化された抗体）＋（架橋剤）
どの合成経路が用いられても、生じる粒子を遠心分離および再懸濁によって完全に洗浄し、過剰な反応体を除去する。
【図面の簡単な説明】
【０２２０】
【図１】ガドリニウム−ジエチレントリアミン五酢酸（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）で標識されたｒＨＡのｉｎ ｖｉｔｒｏでのＭＲＩ特性を示している。
【図２】ＤＴＰＡ標識されたアルブミンへの銅イオンの結合を示している。
【図３】反応において用いられているＤＴＰＡａの量の関数としての、ｒＨＡ−ＤＴＰＡ接合体のＧｄ3+−結合能を示している。
【図４】異なるクロマトグラフィー方法による、過剰ＤＴＰＡからのｒＨＡ−ＤＴＰＡの分離の実行可能性を示している。
【図５】ｒＨＡ−ＤＴＰＡおよびｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄのサンプル中の遊離チオールの回収を示している。
【図６】放出された２−チオピリジンの測定によって示されている、抗体とＰＤＰＨとの反応の程度を示している。
【図７】異なる抗体についての図６と同様なプロットである。
【図８】本発明による接合体についての結合活性の保持を示している。
【図９】Ｇｄ−ＤＴＰＡで標識されたｒＨＡ粒子のｉｎ ｖｉｔｒｏＭＲＩ特性を示している。
【図１０ａ】Ｇｄ−ＤＴＰＡでの標識の前のｒＨＡ粒子の粒子サイズ分布を示している。
【図１０ｂ】Ｇｄ−ＤＴＰＡでの標識の後のｒＨＡ粒子の粒子サイズ分布を示している。
【図１１】水中への再懸濁後にＧｄ−ＤＴＰＡで標識されたｒＨＡ粒子の顕微鏡写真である。
【０２２１】
省略形
αＣＤ４５ マウス抗ラットＣＤ４５
Ｃ５９５ ＭＵＣ１抗原に特異的なモノクローナル抗体
ＤＴＮＢ エルマン試薬（５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸））
ＤＴＰＡ ジエチレントリアミンペンタアセテート
ＤＴＰＡａ ジエチレントリアミン五酢酸無水物
ＤＴＴ ジチオトレイトール
ＥＭＣＨ Ｎ−（ε−マレイミドカプロン酸）ヒドラジド
ＧＰＨＰＬＣ ゲル浸透高速液体クロマトグラフィー
ＩｇＧ 免疫グロブリンＧ
Ｍａｂ モノクローナル抗体
ＭＲＩ 磁気共鳴イメージング
ＰＢＳ リン酸緩衝生理食塩水（０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、１５ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、５ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4）
ＰＤＰＨ ３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオニルヒドラジド
ｒＨＡ 組換えヒトアルブミン
ＸＯ キシレノールオレンジ
【図１−１】
【図１−２】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、体への薬剤の送達に関する。このような薬剤のある種類は、医薬用イメージング技術において有用な造影剤である。これらの薬剤は、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）を包含する、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、または核イメージングにおける造影剤として、または放射線治療における治療薬として有用な金属であってもよい。これらの薬剤は、あるいはまた、Ｘ線イメージングにおいて有用な造影剤であってもよい。本発明はまた、体へ送達される薬剤を、キャリヤーへ、および体内の特定の部位へ薬剤を向けるのに効果的なターゲッティング部分へ、結合する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
例えばＭＲＩまたはＸ線イメージングなどの技術によって得られる画像のコントラストを、適切な造影剤の先行投与によって向上させることは知られている。Ｘ線イメージングの場合、このような薬剤は典型的には、極めて放射線不透過性の材料であり、一方、ＭＲＩの場合、これらは典型的には、これらが導入される媒質の緩和時間に影響を与える常磁性種である。核イメージングにおいて、放射性種が位置する体内の部位を視覚化するのに用いられる信号を発生させるために、放射性種が用いられる。
【０００３】
改良された性能を示す造影剤を含有する新調合物を開発するために、多くの試みがなされてきた。このような改良は、体内での造影剤の滞留時間の増加、および薬剤が送達される特異性の改良、すなわち体内の特定の部位における薬剤の濃度を含みうる。
【０００４】
核イメージングにおいて、放射性金属イオンは、キレート部分、例えばジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）を用いて、モノクローナル抗体（Ｍａｂ）へ直接付着されてきた。しかしながらこの化学作用は、非特異的であることが発見されており、一般に、抗体結合活性の減少を生じ、この減少幅は、Ｍａｂへ連結される薬剤の増量とともに増加する。
【０００５】
例えばモノクローナル抗体が、ＤＴＰＡ無水物（ＤＴＰＡａ）で標識され、この錯体は、［153Ｓｍ］塩化物をキレートするために用いられた（Ｂｏｎｉｆａｃｅら、１９８９、Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ ３０：６８３−６９１）。この錯体は、２０の金属イオンが加えられた時、９０％超の抗体結合活性を保持した。しかしながら金属イオンの数が５０に増加した時、免疫反応性は、５０％以下に低下した。金属での抗体の標識は、抗体結合活性が悪影響を受ける前に結合されうるモル比の点で、明らかに制限されている。
【０００６】
ほかの研究者らは、２：１という低いＤＴＰＡ：Ｍａｂ比において、抗体結合活性の明確な損失が生じることを示している（Ｐａｉｋら、１９８７、Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ ２４：１１５８−１１６３）。
【０００７】
いくつかの商用抗体ベース製品を生成するために、抗体の直接標識が用いられてきた。例えばＣＥＡ−ｓｃａｎ（商標）およびＯｎｃｏ−Ｓｃｉｎｔ（商標）は、癌をイメージングするために用いることができる、商品として入手しうる薬剤である。これらの薬剤は、99mＴｃで直接標識された抗体からなり、静脈投与した時、これらは、癌細胞に結合する。
【０００８】
同様の手法が、ＭＲＩの分野においても取られ、この場合、初期の研究は、ＤＴＰＡａを用いて、ＤＴＰＡ−Ｇｄでモノクローナル抗体を標識することを調べた（Ｕｎｇｅｒら、１９８５、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｒａｄｉｏｌ ２０（７）：６９３−７００）。しかしながらＧｄ積載のレベルは、非常に低く（１抗体分子あたり１．５Ｇｄ3+イオン）、抗体−ＤＴＰＡ−Ｇｄによる画像の向上は、ｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて見ることができなかった。ＭＲＩによって検出されるのに十分大きな信号を生成するために、少なくとも１００Ｇｄ原子が各抗体分子へ結合される必要があるであろうと仮定された。
【０００９】
同様な線に沿ったほかの手法が、文献において報告されている（例えば、Ｓｈａｈｂａｚｉ−Ｇａｈｒｏｕｅｉら、２００２、Ａｕｓｔ Ｐｈｙｓ ａｎｄ Ｅｎｇ Ｓｃｉ ｉｎ Ｍｅｄ ２５（１）：３１−３８、Ｍａｔｓｕｍｕｒａら（１９９４）、Ａｃｔａ ｎｅｕｒｏｃｈｉｒｕｒｇｉｃａ ６０：３５６−３５８、Ｃｕｒｔｅｔら（１９８８）、Ｉｎｔｌ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ２：１２６−１３２）。
【００１０】
造影剤とターゲッティング部分、例えば抗体との直接接合に関わるすべての手法について共通の問題は、造影剤の添加は低レベルに維持されなければならないが、それは、さもなければ抗体の免疫反応性が悪影響を受けるからである。造影剤の積載量は、その結果として、さもなければ望ましい積載量よりも低くなることがあり、そのため所望のコントラスト作用よりも低くなることがある。同様に、治療薬がターゲッティング部分と接合される場合、この薬剤の有効性は、この薬剤の積載量を比較的低く維持する必要性によって弱められることがある。
【００１１】
血液プールにおける造影剤の滞留時間を増加させるために、造影剤用のキャリヤーとして、ポリマー分子が用いられてきた。初期の実験においては、ヒトアルブミンやポリリジンなどのキャリヤーがＤＴＰＡで標識され、ＭＲＩ造影金属を運ぶために用いられた（例えばポリリジンに結合されたＤＴＰＡ−Ｇｄ、Ｇｅｒｈａｒｄら（１９９４）、ＭＲＭ３２：６２２−６２８参照）。ほかの研究においては、ウシ血清アルブミンおよびウシ免疫グロブリンが、ＤＴＰＡおよびＧｄで標識され（Ｌａｕｆｆｅｒら（１９８５）、Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ ３（１）：１１−１６）、ポリ−Ｌ−リジン主鎖をベースとするポリペプチドが、ＤＴＰＡａと反応させられ、イメージングの目的で111Ｉｎをキレートするために用いられた（Ｐｉｍｍら（１９９２）、Ｅｕｒ Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ １９：４４９−４５２）。これらの研究において、キャリヤー結合造影剤は、血液プール中でより長い滞留時間を有することが発見された。
【００１２】
上に概略を示した２つの一般的な手法を組合わせるため、すなわちキャリヤー分子を利用して、造影剤の積載量を増加させ、ターゲッティング部分を用いて特異性を改良するための試みもなされてきた。
【００１３】
１つの研究において（Ｇｏｈｒ−Ｒｏｓｅｎｔｈａｌら（１９９３）、Ｉｎｖｅｓｔ Ｒａｄｉｏｌ ２８：７８９−７９５）、ＤＴＰＡ−Ｇｄで標識されたポリリジンが、ＭＲＩ造影剤として用いられた。平均して、１ポリマーあたり６５Ｇｄイオンという積載量が達成された。これは、モノクローナル抗体へ連結され、ヌードマウス上のヒト腫瘍を評価するために用いられた。過ヨウ素酸塩での抗体の活性化後、ポリマーの２００倍モル過剰を用い、還元性アミド化によってＭａｂがポリリジンＤＴＰＡへ連結された。ついでＧｄ3+が、１０倍モル過剰で添加された。抗体結合研究は、抗体結合活性が、遊離抗体と比較して６０〜７０％減少したことを示した。同様に、ポリリジン抗体接合体が免疫原性であり、主要器官、例えば肝臓および腎臓によって取り込まれることも注目された。
【００１４】
ＤＴＰＡ−Ｇｄを有するポリ（Ｌ−リジン）鎖とＭａｂとの接合のもう１つの例は、Ｍａｎａｂｅら（１９８６）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ａｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ ８８３（３）：４６０−４６７によって記載された。
【００１５】
同様な手法が、体への薬品の送達に関連して取られた。例えば、抗癌剤のメトトレキセート（ＭＴＸ）が、ヒト結成アルブミンへ連結された（Ｐｉｍｍら、１９８８、「抗癌剤の開発におけるヒト腫瘍異種移植（Ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｕｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ ｉｎ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」、ｐｐ９５−９８、ｐｕｂｌ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ）。３０までのＭＴＸ分子が、アルブミンへ化学的に連結され、その結果生じた接合体が、抗体へ化学的に連結された。しかしながら、抗体−アルブミン−ＭＴＸ接合体は、遊離抗体と比較して、血液プールの半減期がはるかに短かった。
【００１６】
ＭＴＸを用いた同様な研究が、Ｈａｒｔｕｎｇら（１９９９）、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５（４）：７５３−７５９によってなされた。この中で、はるかに低いレベルのＭＴＸが、ＨＳＡ分子へ積まれた。この減少された薬品負荷を用いた場合、この薬品の半減期は、３週間までであると評価された。
【００１７】
ＷＯ９４／１２２１８号および第ＵＳ４，７９４，１７０号は、慢性Ｂ型肝炎の治療のために、肝臓へ抗ウイルスヌクレオシド接合体を向けるための、ラクトースアミノ化ヒトアルブミンの使用について記載している。ＷＯ９０／０１９００号は、特異的細胞型へのＭＲＩ造影剤の標的送達のためのキャリヤー系について記載している。これは、常磁性材料のための錯化剤へ化学的に結合された細胞型用受容体特異的リガンドを含んでいる。ポリ（Ｌ−リジン）は、１ターゲッティング基あたりのキレート基の数を増加させるために、アシアログリコプロテイン標的剤へ連結される。しかしながらポリ（Ｌ−リジン）連結は、キレート基の付着の前に実施され、したがってこの錯体の結合活性に対する潜在的に有害な作用を有するポリ（Ｌ−リジン）キャリヤーおよびアシアログリコプロテイン標的剤の変性が、必然的に起こることになる。
【００１８】
体への薬剤の標的化送達のほかの手法は、典型的には１０μｍ未満の寸法を有する分子凝集体（例えばリポソーム）および粒子の使用を伴っていた。
【００１９】
リポソームを用いて行なわれた研究の例には、次のものが含まれる：
米国特許第５，９２９，０４４号は、標的剤を用いた、細胞への生物活性化合物の送達について記載している。この生物活性剤は、リポソームまたはウイルスのどちらかの中において運ばれる。
【００２０】
イメージング剤のキャリヤ−／標的キャリヤーとしてのリポソームの使用に関する多数の出版物が、Ｃａｒｉｄｅ（１９８５）の「治療薬キャリヤー系における批判的評論（Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、１（２）１２１−１５３、およびＴｉｌｃｏｃｋ（１９９９）Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖｉｅｗｓ３７：３３−５１によって記載されている。
【００２１】
ＤＴＰＡ−Ｇｄはステアリルアミンへ化学的に連結され、リポソーム膜の表面中に組み込まれてきた。これらの粒子は、ＤＴＰＡ−Ｇｄ単独と比較して、増加した緩和能（ｒｅｌａｘｉｖｉｔｙ）を有していた（Ｋｕｎｉｍａｓａら（１９９２）Ｃｈｅｍ ａｎｄ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ（Ｊａｐａｎ）４０（９）：２５６５−２５６７）。
【００２２】
多くの研究がなされているもう１つの分野は、造影剤を送達するためのナノ粒子の使用、および疾病部位へ薬剤を送達するためのこれらのナノ粒子の標的化である。
【００２３】
ナノ粒子を用いて実施された研究例には、次のものが含まれる：
フィブリン標的Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ビス−オレエートナノ粒子を用いた血栓のイメージング、およびフィブリンを用いたＧｄ−ＤＴＰＡ−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）ナノ粒子での同様な標的化が、Ｗｉｎｔｅｒら（２００３）「医学における磁気共鳴（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、５０（２）：４１１−４１６によって記載されている。
【００２４】
いくつかのグループが、標的化酸化鉄ナノ粒子の使用について記載している。例えばＳｕｗａら（１９９８）Ｉｎｔｌ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ７５（４）：６２６−６３４は、上皮成長因子に対して向けられた、Ｍａｂでコーティングされたスーパーパラマグネタイト（Ｔ２造影剤）のナノ粒子について記載した。同様な研究が、Ｍａｂ標識ポリエチレングリコールコーティングされた鉄ナノ粒子を用いたＳｕｚｕｋｉら（１９９６）の「脳腫瘍病理学（Ｂｒａｉｎ Ｔｕｍｏｕｒ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）」によって行なわれた。
【００２５】
別の手法において、Ａｒｔｅｍｏｖら（２００３）「医学における磁気共鳴」（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、４９（３）：４０３−４０８は、ビオチニル化されているＭａｂを用いてチロシンキナーゼＨｅｒ−２／ｎｅｕ受容体をまず標的化することについて記載した。ついでストレプトアビジン標識スーパーパラマグネタイトナノ粒子が、これらのビオチニル化癌細胞を標的とするために用いられた。これらのナノ粒子は、強いＴ２ＭＲＩコントラストを発生させた。
【００２６】
多数のＧｄ−ＤＴＰＡ錯体が外部表面上に組み込まれているフィブリン標的脂質カプセル化ペルフルオロカーボンナノ粒子からなるＴ１造影剤が、Ｙｕら（２０００）「医学における磁気共鳴」（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、４４（６）：８６７−８７２によって記載されている。これは、血塊へ強力に結合することが証明された。
【００２７】
もう１つのペルフルオロカーボンベースのナノ粒子が、Ａｎｄｅｒｓｏｎら（２０００）Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４４（３）：４３３−４３９によって記載された。この中で、Ｇｄ−ペルフルオロカーボンナノ粒子が、（特異的Ｍａｂを用いて）脈管形成性内皮上に存在するアルファ（ｖ）ベータ（３）インテグリンへ標的化された。
【００２８】
ヒト膀胱癌に対するＭａｂが、Ｓａｍｔｅｎ（１９９６）Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６：５４−５７によって、アドリアマイシン積載ヒトアルブミンナノ球へ連結された。
【００２９】
キャリヤー／標的キャリヤーとしての微小球の使用が、いくつかの論文に記載されている。例えば、Ｋｌｉｂａｎｏｖ（１９９９）Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖｉｅｗｓ ３７：１３９−１５７は、標識することができ、かつ標的造影剤として用いることができる、ガス充填された超微粒気泡について記載した。ＷＯ０３／０１５７５６号は、タンパク質材料の微小球の調製方法、および治療薬および造影剤のこれらの微小球中への組み込みについて記載している。
【００３０】
アルブミン微粒子へ連結された薬品の送達について記載している多くの出版物があった。例えば細胞傷害性薬品（ドキソルビシンおよびミトマイシンｃ）が、４０μｍヒトアルブミン微小球上に積載され、結腸直腸肝臓転移を有する患者の肝臓へ投与されている（Ｋｅｒｒら（１９９２）ＥＸＳ（スイス）６１、３３９−３４５）。
【００３１】
実施されてきた研究のボリュームにも関わらず、効果的な標的化のために、該薬剤を有する接合体の十分な積載、およびターゲッティング部分の結合活性の保持への相反する必要を満たす、体への送達剤の標的化接合体へのニーズが依然として存在する。
【００３２】
したがって、キャリヤーと薬剤との接合、およびこの接合体を意図された作用部位へ向けるターゲッティング部分との接合による、薬剤、特に造影剤の体への標的化送達のための手段であって、この接合体がターゲッティング部分の十分に高い結合活性を維持しつつこの薬剤の高い積載量を受け入れる手段を提供することが、本発明の１つの目的である。
【００３３】
本発明のもう１つの目的は、ターゲッティング部分との多数の共有結合の形成によって引き起こされることがあるターゲッティング部分の結合活性の破壊をともなわずに、多数の造影剤と１つまたはそれ以上のターゲッティング部分との結びつきを可能にすることである。
【００３４】
金属イオンの体内での局在化における高度の特異性を維持しつつ、多量の金属イオンの体への標的化送達のための手段を提供することが、本発明のさらにもう１つの目的である。
【００３５】
体への薬剤の送達用の標的化接合体の組立てのための方法であって、この接合体の標的化における高度の特異性を維持しつつ、これらの接合体が該薬剤の高い積載量を運ぶことを可能にする方法を提供することが、本発明のさらにもう１つの目的である。
【特許文献１】ＷＯ９４・１２２１８号
【特許文献２】ＷＯ９０／０１９００号
【特許文献３】米国特許４，７９４，１７０号
【特許文献４】米国特許５，９２９，０４４号
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００３６】
本発明の第一の態様によれば、医療用イメージングにおける使用のための接合体であって、タンパク質分子またはタンパク質分子から形成された粒子の形態のキャリヤーを含み、このキャリヤーが、造影剤またはその前駆体へ、および体内の特定の部位との親和性を有するターゲッティング部分へ結合されている接合体が提供される。
【００３７】
造影剤の「前駆体」とは、それ自体が造影剤として効果的でないが、使用前にいくつかのほかの種との反応または混合によって効果的にすることができる部分を意味する。このような前駆体の一例は、造影剤として機能する金属キレートを形成するように金属イオンとの結合を形成しうる金属キレート部分である。
【００３８】
「医療用イメージング」とは、診断、研究、または治療的処理の目的で、人体または動物の体の内部区域を可視化するために用いられるあらゆる技術を意味する。このような技術には、主としてＸ線イメージング、ＭＲＩ、および核イメージングが含まれ、ＰＥＴも含まれる。このような技術を向上するのに有用な薬剤は、体内の特定の部位、器官、または疾病部位の可視化を可能にし、および／またはイメージング技術によって発生された画像の品質における何らかの改良につながる材料であり、これらの画像の改良された、またはより容易な解釈を与える。このような薬剤は、本明細書において造影剤と呼ばれ、これらの使用は、画像の異なる区域間の「コントラスト」を高めることによって、この画像の異なる部分の区別を容易にする。したがって「造影剤」という用語は、（例えばＭＲＩの場合のように）このような薬剤の不存在下においても作られうる画像の品質を向上させるために用いられる薬剤、ならびに（例えば核イメージングの場合のように）画像の発生のための前提となっている薬剤を包含する。
【００３９】
この接合体は「造影剤」および「ターゲッティング部分」を含んでいるが、実際には実質的に多数の造影剤（またはこれらの前駆体）が各キャリヤーに結合され、１つより多いターゲッティング部分がキャリヤーへ結合されてもよいと理解されるであろう。一般に、キャリヤーがタンパク質分子の形態を有する場合、各キャリヤーへ結合された造影剤の数は、数十、例えば１０〜１００、より好ましくは２０〜６０、例えば２０〜５０であってもよい。同様な数の造影剤が、粒子の形態のキャリヤーを構成する各タンパク質分子へ結合されてもよい。しかしながら１つの粒子が一般に、非常に多数の個々のタンパク質分子（おそらく１０3〜１０11分子）から形成されるので、各粒子と結びついた造影剤の全体数は、それに対応して大きくなるであろう。キャリヤーがタンパク質分子の形態を有する場合、１キャリヤーあたりのターゲッティング部分の数は一般に５未満であり、たった１つであることもある。微粒子キャリヤーの場合、ターゲッティング部分の数はこれよりもかなり多くてもよく、一般にこれよりもかなり多いであろう。キャリヤーがタンパク質分子の形態にある場合、１つより多いキャリヤーが単一ターゲッティング部分へ連結されることも可能である。ただし、１ターゲッティング部分あたりのキャリヤーの数は一般に１０未満であろうし、普通は１、２、または３である。一般に、少数のキャリヤーのみがターゲッティング部分へ結合されるのが好ましいが、それは、ターゲッティング部分とキャリヤーとの間の過剰な数の結合はターゲッティング部分の結合活性に対して悪影響を有することがあるからである。
【００４０】
本発明による接合体は一般に、製薬的に許容しうる液体媒質を含んでいる調合物として体へ投与される。この媒質は一般に、水性媒質、最も普通には適切な賦形剤を含有する水溶液であろう。このような賦形剤は、１つまたはそれ以上の張性調節剤、防腐剤、界面活性剤、およびほかの従来の製薬賦形剤を含んでいてもよい。
【００４１】
本発明による接合体は、液体媒質中に可溶であってもよく、この場合この調合物は一般にこの接合体の溶液であろう。あるいはまたキャリヤーが粒子である場合、この粒子、したがってこの接合体は一般に不溶性であろうし、この調合物は液体溶媒中のこの接合体の懸濁液または分散液であろう。
【００４２】
したがって本発明の第二の態様によれば、本発明の第一の態様による接合体を、製薬的に許容しうる液体媒質と混合して含んでいる調合物が提供される。
【００４３】
本発明による接合体および調合物は、多くの点で有利である。第一に、これらは造影剤の血流中の滞留時間を延ばすことができる。さらには、特定の器官または疾病部位との親和性を有するターゲッティング部分の存在は、その位置への造影剤の送達を向上させ、例えば造影剤を特定の器官または疾病部位（例えば肝臓または腫瘍中）に蓄積させることによって、これらの薬剤の生体分布を改変し、その器官または疾病部位を標的とし視覚化することを可能にする。造影剤のための「キャリヤー」の使用は、体内の所望の部位へ送達される造影剤の量を増加させることができる。このことは、背景（非疾病）組織に対する信号／ノイズ比の増加によって検出を向上させうる。ターゲッティング部分の使用は、正常／健康な組織への薬剤の送達を避ける。さらには下で説明されているように、多量の造影剤が、ターゲッティング部分の結合能力を損傷することなく、キャリヤーへ接合されうる。
【００４４】
本発明において用いうるＭＲＩ造影剤には、金属イオン、特にガドリニウムが含まれる。このようなイオンは、キャリヤー材料へ共有結合されているキレート部分を介してキャリヤー材料へ連結されうる。
【００４５】
同様に、核イメージングにおいて有用な金属、例えば99mＴｃ、201Ｔｌ、および111Ｉｎもまた、直接または間接的（例えばキレート部分を介して）にキャリヤー材料へ連結されうる。
【００４６】
造影剤として効果的な金属が本発明の第一の態様による接合体の形態で体に送達されうる方法と同様にして、ほかの金属もほかの目的のために体へ送達されてもよい。例えばいくつかの金属は直接治療効果を有しうる。例えば放射線治療において有用な放射性金属である。このような放射性金属の１つは67Ｃｕであり、これはイメージング技術において用いられる金属と類似の方法においてキャリヤーへ結合されうる。その結果生じた接合体は、標的化された放射線治療に用いることができる。
【００４７】
したがって本発明のもう１つの態様において、体への金属の送達のための接合体であって、タンパク質分子またはタンパク質分子から形成された粒子の形態のキャリヤーを含み、このキャリヤーがキレート剤を介して前記金属へ連結され、かつ体内の特定の位置との親和性を有するターゲッティング部分と接合されている、接合体が提供される。
【００４８】
上記のように、この金属は例えばＭＲＩまたは核イメージングにおける造影剤として有用な金属であってもよく、またはこれは治療において有用な金属、例えば放射線治療において有用な放射性金属であってもよい。１つより多い種類の金属（例えば造影剤（例えばガドリニウム）と放射線治療薬（例えば67Ｃｕ）との混合物）を含有する接合体を調製することも可能である。同様に、１つより多い接合体（例えば造影剤を含んでいる第一接合体、および放射線治療薬を含んでいる第二接合体）を含む調合物を調製することも可能である。このような手段によって、従来のイメージング技術を用いて体内でのこの薬剤の正確な送達および位置を決定し、そうすることにおいて放射性同位元素の首尾良い送達を確認することが可能である。
【００４９】
放射性同位元素および／またはイメージング剤を運んでいてもよい、より大きいサイズ（例えば１０μｍ以上）の粒子を調製することも可能であろう。これらは腫瘍の微小循環中へ（例えばカテーテルによって）送達することができ、したがって毛管遮断によって血液供給を減少させることができる。さらには、放射性同位元素が粒子上に存在する場合、これは腫瘍中に送達され（その結果細胞死を生じる）、造影剤、例えばガドリニウムの存在は、従来のイメージング技術（例えばＭＲＩ）を用いて経時的に腫瘍をイメージングすることを可能にするであろう。
【００５０】
本発明の第一の態様による接合体は、ターゲッティング部分の不存在下において、キャリヤーと造影剤とを、またはこれの前駆体とを反応させ、その後ヘテロ二官能性架橋剤を用いてターゲッティング部分へキャリヤーを連結することによって調製することができる。この方法はより一般的に適用可能であり、多様なキャリヤーと体への送達剤との標的化された接合体の調製において有用である。したがって本発明のもう１つの態様によれば、体への送達剤とキャリヤーとの標的化された接合体の調製方法であって、
（ａ）体への送達剤またはこれの前駆体とキャリヤーとを反応させて中間接合体を形成すること、およびその後に
（ｂ）（ｉ）この中間接合体とヘテロ二官能性架橋剤とを反応させて中間接合体を活性化させ、ついでこの活性化された中間接合体とターゲッティング部分とを反応させること、または（ｉｉ）この中間接合体とヘテロ二官能性架橋剤との反応によって活性化されたターゲッティング部分とを反応させること、または（ｉｉｉ）この中間接合体、ヘテロ二官能性架橋剤、およびターゲッティング部分を、同時に互いに反応するようにさせること
を含む方法が提供される。
【００５１】
キャリヤーと体への送達剤（またはこれの前駆体）との反応、およびヘテロ二官能性架橋剤との反応は、キャリヤー上に存在する２つの異なる種類の官能基を介するものであることが特に好ましく、このヘテロ二官能性架橋剤とターゲッティング部分との反応がターゲッティング部分上に存在する第三の種類の官能基を介して起こり、３つの型の官能基が互いに異なることが特に好ましい。
【００５２】
本発明のこの態様による方法は、キャリヤーと体への送達剤（またはこれの前駆体）との反応、およびキャリヤーとターゲッティング部分との反応が、別々の工程において実施されるという点において有利である。したがってキャリヤーは、ターゲッティング部分と接合される前に体への送達剤と反応させられ、体への送達剤とターゲッティング部分との反応が避けられる。キャリヤー上、したがって最終接合体上の薬剤の高い積載量は、これによってターゲッティング部分の結合活性に対して最小限の悪影響しかともなわず、またはターゲッティング部分の結合活性に対する悪影響をまったくともなわずに達成することができる。この方法にしたがって調製された接合体は、したがって体への送達剤（またはこれの前駆体）のターゲッティング部分での不存在を特徴とするものであってもよい。言い方を変えると、この接合体は好ましくは体への送達剤（またはこれの前駆体）の少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％が、ターゲッティング部分へではなく、キャリヤーへ共有結合される。これによって結合活性の損失は最小限となり、本発明によって調製された接合体は、したがって接合体におけるターゲッティング部分の結合活性が、競合結合アッセイにおいて測定された場合、遊離ターゲッティング部分の結合活性の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、または少なくとも９０％であることを特徴としうる。
【００５３】
キャリヤーが粒子の形態を有する場合、本発明による方法は、粒子形成材料から粒子を形成する予備工程を含んでいてもよく、この粒子は、ついで体への送達剤（またはこれの前駆体）と、およびその後にターゲッティング部分と反応させられるキャリヤーを構成する。
【００５４】
この方法の変形例において、粒子の形成工程は、体への送達剤またはこれの前駆体が粒子形成材料と反応させられた後に行なわれてもよい。
【００５５】
キャリヤーが体へ送達されることになる薬剤の前駆体と反応させられる場合、この前駆体はその後薬剤へ転換される。このような転換は、この方法の工程（ｂ）の前、その後、または同時に行なわれてもよい。前駆体がキレート剤であり、転換がキレート剤と金属イオンとの間のキレートの形成を伴う場合、金属イオンの添加の間は反応混合物のｐＨが５．０〜６．５に維持されることが好ましい。
【００５６】
この方法は、キャリヤーがタンパク質性である接合体の調製へ特に適用可能である。
【００５７】
架橋剤が、キャリヤー上に存在しかつターゲッティング部分に存在しない基（例えばスルフヒドリル基）との反応に特異的な１つの官能性、およびターゲッティング部分上に存在しかつキャリヤーに存在しない基（例えばアルデヒド基）との反応に特異的な第二の官能性を有することが非常に好ましい。これは、キャリヤーおよび／またはターゲッティング部分の互いの連結を生じるであろう望まれない副反応の発生を減少または排除する。この方法はまた、体への送達剤がカルボキシル基またはその誘導体を有するか、またはカルボキシル基またはその誘導体を含有する中間化合物または部分を介してキャリヤーへ連結される、接合体の調製へも特に適用可能であり、この場合キャリヤーとの連結は、これらのカルボキシル基とキャリヤー中に存在するアミノ基との間に形成されたアミド結合によるものであってもよい。
【００５８】
ヘテロ二官能性架橋剤がキャリヤー上に存在するスルフヒドリル基と反応する場合、中間接合体上の遊離スルフヒドリル基がこの方法の工程（ａ）の間に可逆的にブロックされることが発見された。このような場合、この方法は好ましくは遊離スルフヒドリル基のアンブロッキングの中間工程を（工程（ａ）と（ｂ）との間に）含む。このようなアンブロッキングは好ましくは、２０〜５０℃の温度において１〜２４時間の間、中間接合体をインキュベーションすることによって実施される。
【００５９】
本発明のさらにもう１つの態様によれば、医療用イメージング技術によって得られた画像のコントラストの向上方法であって、画像が得られる前に本発明の第一の態様による接合体または本発明の第二の態様による調合物を、画像が得られることになるヒトまたは動物被験者へ投与することを含む方法が提供される。さらには、医療用イメージング技術によって得られることになる画像のコントラストを向上させるための調合物の製造における、本発明の第一の態様による接合体の使用も提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６０】
キャリヤー材料の性質
本発明の第一の態様による接合体は、造影剤およびターゲッティング部分用のキャリヤー材料としてタンパク質を含んでいる。
【００６１】
キャリヤー材料として用いることができるタンパク質には、球状タンパク質および繊維状または構造タンパク質、およびこれらの混合物が含まれる。
【００６２】
球状タンパク質の例には、合成または天然血清タンパク質、これらの天然または合成誘導体、塩、酵素的、化学的、またはほかの方法で変性されるか、切断されるか、短縮または架橋されるか、酸化されるか、または加水分解された、これらの誘導体またはサブユニットが含まれる。繊維状タンパク質または構造タンパク質の例には、合成または天然コラーゲン、エラスチン、ケラチン、フィブロイン、フィブリン、およびフィブロネクチン、これらの天然または合成誘導体、およびこれらの混合物が含まれる。血清タンパク質の例は、アルブミン、α−グロブリン、β−グロブリン、γ−グロブリン、トランスチレチン、フィブリノーゲン、トロンビン、およびトランスフェリンである。
【００６３】
このタンパク質は最も好ましくは、単一の完全なまたは実質的に完全なタンパク質分子である。しかしながらこのタンパク質分子は、完全なまたは実質的に完全な接合タンパク質分子のオリゴマーであってもよい。このようなオリゴマーは、タンパク質ダイマー、またはトリマー、または例えば２０以下の別々のタンパク質分子、より好ましくは１０以下、または５以下の別々のタンパク質分子を含んでいる、より長いオリゴマーであってもよい。
【００６４】
このタンパク質分子はあるいはまた完全タンパク質分子の断片であってもよく、これは天然由来のタンパク質分子中に見られるアミノ酸の配列に対応するが長さがより短いアミノ酸の配列を含んでいる分子を意味する。しかしながらこのような断片は好ましくは、天然由来タンパク質分子の長さの５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、または９０％超、最も好ましくは９５％超の長さを有し、かつ天然由来タンパク質分子の対応部分と、８０％超、９０％超、または最も好ましくは９５％超の相同性の程度を有するアミノ酸の配列を含んでいる。
【００６５】
トランスフェリンは、多くの潜在的連結部位を有し、本発明による接合体の血液脳関門を通る輸送を容易にすることができ、そしてこれは組換え生成物として調製されうるという点で、キャリヤー材料として特別な利点を有しうる（例えば、ＭａｃＧｉｌｌｉｖｒａｙら、２００２、「分子鉄および細胞鉄輸送（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｒｏｎ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）、Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ（Ｅｄ）、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．ｐ４１、およびＭａｓｏｎら、１９９３、「生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、３２：５４７２参照）。
【００６６】
特に好ましいキャリヤー材料は、下に詳細に記載された理由から、アルブミンである。
【００６７】
これらの接合体が人体への投与を意図している場合、このキャリヤー材料は好ましくはヒト起源である。すなわち実際にヒトに由来するか、または構造がヒト起源のタンパク質と同一である（または実質的に同一である）。したがって特に好ましいキャリヤー材料は、ヒト血清アルブミンである。
【００６８】
ヒト血清アルブミンは血清由来であってもよく、例えば献血された血液から得られてもよい。しかしながら、血液由来物中に存在しうる潜在的汚染物質（例えばウイルスまたはほかの有害な薬剤）の感染のリスク、ならびに献血された血液から単離された材料と関連する供給の潜在的制約を排除または減少させるために、キャリヤー材料（例えばヒト血清アルブミン）が、キャリヤー材料を発現するために形質転換されるかまたはトランスフェクションされている微生物（細胞株を包含する）、遺伝子導入植物または動物、に由来する組換え生成物であるのが好ましい。
【００６９】
本発明における使用のために現在最も好ましいキャリヤー材料は、したがって、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）である。ｒＨＡの適切な形態は、英国ノッティンガムのデルタ・バイオテクノロジー社（Ｄｅｌｔａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ）から商品として入手することができる。
【００７０】
ｒＨＡの調製方法は一般に、当業者によく知られているであろうし、例えばＷＯ９６／３７５１５号およびＷＯ００／４４７７２号に記載されている。
【００７１】
ｒＨＡの調製の好ましい方法において、初期ｒＨＡ溶液は、発酵培地中でｒＨＡエンコードヌクレオチド配列で形質転換された菌類を培養することによって得られた菌培養培地に由来し、これによって前記菌類は、ｒＨＡを発現し、これをこの培地中に分泌する。この菌類は、糸状菌、例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種であってもよい。好ましくはこの菌類は酵母である。より好ましくは、この菌類は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属（例えばＫ．ｌａｃｔｉｓ）、またはＰｉｃｈｉａ属（例えばＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）のものである。
【００７２】
ｒＨＡは好ましくは、遊離−ＳＨ（スルフヒドリルまたはチオール）基を有する分子の実質的部分を含有する。これは、下記のように、ターゲッティング部分へのｒＨＡ分子の接合の特に有用な手段を提供する。
【００７３】
本発明による接合化学が非タンパク質キャリヤーへ適用される場合、多様なキャリヤー材料のどれでも用いることができる。このキャリヤー材料は生物適合性であるべきであり、キャリヤー材料とターゲッティング部分との接合体が、使用前、および生体内でのこれらの有効寿命の間一体性を維持するようなものであるべきである。このキャリヤー材料は２つの異なる種類の官能基を有し、体への送達剤（またはこれの前駆体）への連結、およびターゲッティング部分へのキャリヤー材料との連結のために異なる化学的方法を用いることができるようにすることが非常に好ましい。
【００７４】
キャリヤー材料として用いることができるほかの非タンパク質性材料には、多糖類、ならびに適切な合成ポリマーが含まれる。
【００７５】
しかしながらこのキャリヤー材料は、最も好ましくはタンパク質性である。キャリヤーが微粒子形態である場合、このキャリヤー材料（または粒子形成材料）は不溶性であってもよく、またはこの粒子は可溶性材料から形成されてついでその後の処理（例えば熱誘導架橋）によって不溶性にされてもよい。例えばこのキャリヤー材料は、コラーゲンまたはゼラチンであってもよい。
【００７６】
このキャリヤーが微粒子形態でない場合、このキャリヤー材料は好ましくは可溶性である。
【００７７】
アルブミンは、次の理由から可溶性接合体および微粒子接合体の両方にとって、現在のところ最も好ましいキャリヤー材料である：
ａ）アルブミンは、水性媒質中に可溶である；
ｂ）アルブミンの粒子は、容易に不溶性にすることができる；
ｃ）アルブミン分子中に存在する遊離スルフヒドリル基は、ターゲッティング部分への選択的連結のための手段を提供する；および
ｄ）アルブミンは、体への送達剤のための連結部位を供給するペンダントアミノ基（具体的にはリジン残基）を有する多くのアミノ酸残基を含有する。
【００７８】
粒子の形成
粒子形成材料の粒子はいかなる適切な技術によって生成されてもよく、多くのこのような技術は当業者によく知られているものであろう。
【００７９】
本発明による粒子の製造のために特に好ましい方法は次の工程を含む：
ｉ）粒子形成材料の懸濁液を形成する工程；および
ｉｉ）前記懸濁液をスプレー乾燥する工程。
【００８０】
工程（ｉ）、すなわち粒子形成材料の懸濁液の形成は好ましくは、まず粒子形成材料を溶媒中に溶解し、ついでこのように形成された溶液へ粒子形成材料用の非溶媒を添加し、粒子形成材料の沈殿をもたらすようにすることによって実施される。「非溶媒（ｎｏｎ−ｓｏｌｖｅｎｔ）」とは、粒子形成材料のその中での溶解性が、粒子形成材料の溶媒中での溶解性よりも実質的に小さいが、溶媒と混和しうる液体を意味する。
【００８１】
この非溶媒は好ましくは過剰に添加される。すなわち、溶媒へ添加された非溶媒の容積は好ましくは粒子形成材料の溶媒中溶液の容積よりも大きい。換言すれば、工程ｉｉ）においてスプレー乾燥される溶媒／非溶媒混合物は最も好ましくは、非溶媒を５０％ｖ／ｖより多く、より好ましくは６０％ｖ／ｖより多く、おそらくは７０％ｖ／ｖより多く含んでいる。
【００８２】
最も普通には、溶媒は水である。好ましい非溶媒はエタノールである。しかしながら一般に、非溶媒の添加が粒子形成材料の沈殿を引起こす所望の効果を有し、この溶媒と非溶媒とが用いられた割合で混和しうるならば、溶媒と非溶媒とのいかなる適切な組合わせを用いてもよい。
【００８３】
溶媒は最も普通には水であるが、これはあるいはまた例えば有機溶媒であってもよい。このような場合、非溶媒は水であってもよく、非溶媒の使用はその場合、おそらくは可燃性の有機溶媒を含有する懸濁液のその後のスプレー乾燥に関連したリスクの減少において有利になりうる。
【００８４】
この粒子形成材料がタンパク質性材料である場合（これが最も普通の場合であるが）、非溶媒の添加による沈殿は好ましくは、懸濁粒子の凝集を防ぐかまたは最小限にするように、およびスプレー乾燥後容易に分散しやすい親水性粒子を生成するために、等電点から離れたｐＨで実施される。このようにして、同じ目的を達成するために追加の界面活性剤を用いることを回避できる。
【００８５】
工程（ｉｉ）、すなわち工程ｉ）において形成された懸濁液のスプレー乾燥は、一般に従来の方法で、一般に従来の種類の装置を用いて実施することができる。概略的にはこのスプレー乾燥プロセスは、加熱ガス、最も普通には空気、を含有するチャンバー中に懸濁液をスプレーすることを伴う。このことにより、溶媒／非溶媒混合物は蒸発し、固体粒子を生成する。ガスはチャンバーから引き出され、ガス中で運ばれる粒子は例えばサイクロン分離機またはフィルター配列のなんらかの形態を用いて、ガスから分離される。ついでこれらの粒子は適切な容器中に回収される。
【００８６】
スプレー乾燥プロセスによって得られた粒子の性質はいくつかの要因に依存する。これらには、スプレー乾燥装置を通るガスの流量、懸濁液中の粒子形成材料の濃度、溶媒および非溶媒の種類、懸濁液がスプレー乾燥装置中に供給される速度、およびチャンバー中のガスの温度が含まれる。通常、小さいサイズ分布は、低い懸濁液供給速度、適切なノズル設計、高い微粒子化度、および高いガス流量の組合わせによって達成することができる。
【００８７】
工程ｉ）と工程ｉｉ）との間に、すなわち懸濁液の形成後であるがスプレー乾燥前に、懸濁液の（例えば機械的攪拌による）均質化を行うことが特に好ましい。この結果、懸濁液中の粒子のより均一なサイズ分布、およびこれに対応した工程ｉｉ）において形成される粒子のより小さくより均一なサイズ分布が生じる。
【００８８】
この懸濁液は好ましくは（特に粒子形成材料がアルブミンである時）、粒子形成材料０．１〜５０％ｗ／ｖ、より好ましくは１〜２０％ｗ／ｖ、最も好ましくは２〜１０％ｗ／ｖを含有する。粒子形成材料の混合物が用いられてもよい。この場合、上記の数字は粒子形成材料の総含量を表わす。
【００８９】
これらの粒子のスプレー乾燥後、これらの粒子が不溶性にされることが必要であるか、または望ましいことがある。これは、粒子形成材料の架橋によって達成されうる。これは、それ自体知られている多様な技術によってもたらされうる。好ましい方法において、これらの粒子は熱処理（例えば１５０℃より高い温度で、３０分間より長く、例えば１時間又は数時間）によって不溶性にされる。
【００９０】
上記のような粒子の好ましい調製方法は、このプロセスの２段階（懸濁液の形成およびスプレー乾燥）が、粒子の所望の形態およびサイズ分布を達成するために別々に最適化されうるという点において有利である。これは、これらの粒子の特性に対して高度の制御を与える。特に、このプロセスは特に小さいサイズおよび特に狭いサイズ分布の粒子の生産を可能にする。この方法によって生産された粒子は、例えば大部分が４μｍ未満の粒子サイズ、および１μｍ未満のモードピークを有する数サイズ（ｎｕｍｂｅｒ ｓｉｚｅ）、および２μｍ未満の平均サイズ（コールターカウンターを用いて測定された場合）を有しうる。このように小さいサイズの粒子は、これらが非常に小さい血管（毛管）に入ることができ、および／または肺の中に深く浸透しうるという点で有利である。より大きいサイズの粒子（例えば鼻腔投与用）を生成することも可能であろう。
【００９１】
これらの粒子は最も一般的には実質的に球形であるから、これらの粒子の「サイズ」への言及は通常、これらの粒子の「直径」を意味することが理解されるであろう。しかしながら、これらの粒子が球形でなくてもよいことも理解されるであろう。この場合、サイズは非球形粒子の質量に等しい質量を有する概念的球形粒子の直径として解釈されうる。
【００９２】
薬剤のキャリヤー材料への連結
体への送達剤のキャリヤー材料への連結は、とりわけ薬剤の種類およびキャリヤー材料の種類に応じて、多くの手段のいずれで実施してもよい。しかしながら一般に連結は、キャリヤー材料と薬剤との間の、またはキャリヤー材料と薬剤それ自体と化学的または物理的結合を形成しうる連結部分との間の共有結合の形成を伴う。
【００９３】
１つの好ましい連結方法、特に金属（例えばＭＲＩまたは核イメージングで用いられる金属）の連結、または放射線治療で用いられる放射性金属の連結に適した方法は、金属を結合しうるキレート剤とキャリヤー材料との接合を伴う。
【００９４】
１つの特に好ましい実施形態において、このキレート剤はキャリヤー材料（例えばアルブミン等のタンパク質性キャリヤー材料）中に存在するアミン基と反応してキレート剤をキャリヤー材料へ連結するアミド結合を形成するカルボキシル基またはその誘導体を含む。ついで金属の適切な塩の溶液が添加されてもよく、接合されたキレート剤による金属のキレートを生じる。
【００９５】
用いることができるキレート剤には、複数のアミン基を含有する化合物の酢酸誘導体が含まれる。例には、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、およびこれらの誘導体（例えばジエチレントリアミン五酢酸無水物）が含まれる。使用しうるキレート剤のほかの種類には大環状キレート剤が含まれる。大環状キレート剤の例は次のものである：
１，４，７−トリアザシクロノナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−三酢酸（ＮＯＴＡ）
１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）
１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＴＥＴＡ）。
【００９６】
キレート剤をキャリヤー材料へ連結するためのほかの方法は、当業者には明らかであろう。適切な化学作用は最も一般的には、キャリヤー材料および／またはキレート剤中に存在するアミン、チオール、カルボニル、カルボキシル、またはヒドロキシル基による連結の形成を伴う。
【００９７】
この薬剤が、金属キレートの形態でキャリヤーへ連結される場合、このキレートは製造プロセスの一部として形成されてもよく、あるいはまた金属はあとで（例えば使用の直前に）添加されてもよい。特にこの金属が放射性金属である場合、金属イオンを使用の直前に調合物へ添加することが望ましいことがある。
【００９８】
同様に有機剤（例えばＸ線造影剤として用いられる以下で言及されているヨウ素含有化合物）は、有機剤とキャリヤー材料との間の共有結合の形成によってキャリヤー材料へ直接連結されてもよい。有機剤をキャリヤー材料へ連結する方法もまた当業者には明白であり、キャリヤー材料および／または有機剤中に存在するアミン、チオール、カルボニル、カルボキシル、またはヒドロキシル基による連結の形成を包含してもよい。
【００９９】
一般に、有機剤またはキレート剤の１つ以上の分子がキャリヤーへ連結される。より好ましくはこのような分子が１０より多く、またはこのような分子が２０より多く連結される。タンパク質性キャリヤー材料の好ましい場合（例えばアルブミン）、１０〜１００、より好ましくは２０〜６０の有機剤またはキレート剤の分子を各タンパク質分子へ連結する（例えば１タンパク質分子あたりこのような薬剤の２０〜５０分子を連結する）ことも可能であろう。これは、放射線治療における使用のためのＭＲＩ造影剤または放射性金属についての従来の送達系と比較して、このような薬剤のかなり増加した密度を生じる。多くの例では、キャリヤー上の有機剤またはキレート剤の積載量ができるだけ高くなることが望ましいこともありうる。ほかの場合、積載量をより低いレベルに制限することも有利になりうる。
【０１００】
ターゲッティング部分の性質
キャリヤー材料は体内の特定の器官または疾病部位との親和性を有するターゲッティング部分と接合される。このようなターゲッティング部分には、抗体、ほかのタンパク質、およびペプチドが含まれる。好ましいターゲッティング部分は、抗体、特にモノクローナル抗体である。多くの適切なターゲッティング部分（例えば抗体）が、商品として入手しうる。
【０１０１】
本発明におけるターゲッティング部分として有用になりうる抗体の例には、次のものが含まれる：
腫瘍型 標的抗原 抗体
────────────────────────────────────────
結腸直腸癌 ＣＥＡ ｈＭＮ−１４
乳癌 ＭＵＣ１ ＨｕＢｒＥ３
膀胱癌 ＭＵＣ１ Ｃ５９５
前立腺癌 ＰＳＭＡ Ｊ５９１
腎細胞癌 糖タンパク質 ｃｈＧ２５０
【０１０２】
キャリヤー材料と接合されうる抗体のほかの例には、次のものが含まれる：
ａ）バイタクシン（Ｖｉｔａｘｉｎ）（登録商標） − 腫瘍中に新たに形成された血管上に発現されたアルファ−ｖベータ−３に結合するヒト化抗体；
ｂ）ヒト化ＣＤ２２抗体（通常、非ホジキンリンパ腫の治療のためにイットリウム−９０で標識されている）；および
ｃ）すべての造血細胞（特にリンパ球上）に発現されるチロシンホスファターゼＣＤ４５へのαＣＤ４５抗体。
【０１０３】
ターゲッティング部分のほかの形態の例には、次のものが含まれる：
ａ）血塊をイメージングするためのフィブリン；
ｂ）フィブリンへ結合する結合部分；
ｃ）親油性有機分子および両親媒性有機分子；
ｄ）受容体リガンド；
ｅ）ステロイド；
ｆ）脂質；
ｇ）ホルモン；
ｈ）肺癌上のソマトスタチン受容体へ結合する合成ペプチド（ダイアタイド（Ｄｉａｔｉｄｅ）から商品として入手しうる）；
ｉ）白血球抗原に対して誘導された抗体断片 − 感染病を検出するため；および
ｊ）細胞死の時に放出されるホスファチジルセリンを結合するアネクシン（Ａｎｎｅｘｉｎ）Ｖ − 心臓病をイメージングし、化学療法への応答を評価するためのマーカー。
【０１０４】
ターゲッティング部分の効果は、体内の所望の位置（例えば特定の器官または腫瘍等の疾病部位）に造影剤または治療薬が積載されている接合体を濃縮することである。
【０１０５】
ターゲッティング部分へのキャリヤーの連結
ターゲッティング部分のキャリヤー材料への連結方法はそれ自体公知であり、当業者にはよく知られているであろう。適切な化学作用は最も一般的には、キャリヤー材料および／またはターゲッティング部分中に存在するアミン、チオール、カルボニル、カルボキシル、またはヒドロキシル基による連結の形成を伴う。
【０１０６】
このキャリヤーは、ヘテロ二官能性架橋剤を用いてターゲッティング部分へ連結される。好ましくはこの架橋剤は、キャリヤー上に存在しかつターゲッティング部分には存在しない官能基に特異的な１つの反応性、およびターゲッティング部分上に存在しかつキャリヤーには存在しない官能基に特異的なもう１つの反応性を有する。既に記載されているように、このことは、望まれない副反応（例えばキャリヤー分子間または粒子間の連結、架橋剤の両方の官能性とキャリヤーまたはターゲッティング部分との反応等）の発生を排除する。
【０１０７】
架橋剤はまず中間接合体（すなわち体への送達剤またはその前駆体との反応後のキャリヤー）と反応させられ、これによって中間接合体を活性化し、ついでヘテロ二官能性架橋剤のもう一方の末端と反応するターゲッティング部分（例えば抗体）を添加してもよい。あるいはまた、この架橋剤をまずターゲッティング部分と反応させ、活性化されたターゲッティング部分をついで中間接合体と反応させてもよい。中間接合体、ターゲッティング部分、および架橋剤が、単一工程において互いに反応させられることも可能であろう。適切なヘテロ二官能性架橋剤は、商品として入手しうる。
【０１０８】
キャリヤー上の−ＳＨ（スルフヒドリルまたはチオール）基を介した反応に好ましい架橋剤は、スルフヒドリル基と特異的に反応する基を有する。このような基の１つの好ましい例は、マレイミド基である。ほかの例は、２−ピリジルジチオ、ハロアセテート、またはハロアセトアミド、特にヨード誘導体、アジリジン、アクリロイル／ビニル、４−ピリジルジチオ、および２−ニトロベンゾエート−５−ジチオである。
【０１０９】
遊離チオール基を含有しないキャリヤー材料の場合、このような基は（例えばジチオトレイトールでの還元によって）キャリヤー上で発生させることができ、またはチオレート化剤（例えばイミノチオランまたはＮ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ））を用いて導入することができる。
【０１１０】
特にターゲッティング部分が抗体またはほかのタンパク質である場合、架橋剤とターゲッティング部分とを反応させる好ましい方法は、ターゲッティング部分上の炭水化物部分を介する。穏やかな酸化条件下において、炭水化物中に見られるシス−ジオールはアルデヒド基へ転換することができ、これに対してはヒドラジド基が特異的な反応性を有する。
【０１１１】
本発明における使用のために特に好ましいヘテロ二官能性架橋剤には、したがって、ＳＨ−反応性官能基（例えばマレイミドまたは２−ピリジルジチオ）、およびアルデヒド反応性官能基（例えばヒドラジド）の両方が含まれる。
【０１１２】
本発明における使用のために好ましいヘテロ二官能性架橋剤は、したがって次のものである：
マレイミドカプロン酸ヒドラジド（通常、ＥＭＣＨと呼ばれる）
３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）
マレイミドプロピオン酸ヒドラジド（ＭＰＨ）
Ｎ−（κ−マレイミドウンデカン酸）ヒドラジド（ＫＭＵＨ）
４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）。
【０１１３】
ヒドラジド基を含む架橋剤は、これらの酸付加塩、特に塩酸塩の形態で利用されてもよい。
【０１１４】
上記のように、キャリヤー材料がｒＨＡである好ましい場合、ターゲッティング部分をｒＨＡ分子へ連結するのに特に有用な方法は、ｒＨＡ上に存在する遊離スルフヒドリル（チオール）基による連結による方法である。各ｒＨＡ分子上にわずか１つだけこのような遊離スルフヒドリル基があるので、１つのｒＨＡ分子は１つのみのターゲッティング部分へ連結するであろう。
【０１１５】
ｒＨＡは好ましくは、エルマン試薬である５，５’−ジチオビス−（２−ニトロベンゾエート）（ＤＴＮＢ）を用いて測定された時、少なくとも０．８５、０．８、０．７５、０．７、０．６５、または０．６０モルＳＨ／モルタンパク質の遊離チオール含量を有し、この試薬は遊離スルフヒドリル基（例えばｃｙｓ−ＳＨ（ｒＨＡの場合Ｃｙｓ−残基３４））を検出する特異的手段である。この反応は、４１２ｎｍに吸収極大を有する５−チオ−２−ニトロベンゾエートイオンＴＮＢ2-を放出する。４１２ｎｍにおける吸光度の増加を測定し、４１２ｎｍにおけるＴＮＢ2-イオンのモル吸収係数によって割ることによって、ｒＨＡの遊離スルフヒドリル含量を計算することができる。
【０１１６】
好ましくは抗体ターゲッティング部分は、抗体の可変領域の特異的結合活性を保持するために、抗体の定常部における連結部位を介してキャリヤー材料へ連結される。
【０１１７】
造影剤の性質
本発明による接合体および調合物は造影剤の送達のために有用である。造影剤が用いられるイメージング技術には、ＭＲＩ、Ｘ線イメージング技術、および核イメージングが含まれ、これにはＰＥＴが含まれる。
【０１１８】
本発明において用いることができるＸ線造影剤は、このような使用に適した性質を有する多様なヨウ素含有化合物が含まれる。このような化合物は一般に可溶性であり、イオン性または非イオン性であってもよい。このようなＸ線造影剤の１つの例は、イオパミドールとして知られているものである。ほかの公知のＸ線造影剤には、イオメプロール、イオプロミド、イオベルソール、イオジキサノール、およびイオヘキソールが含まれる。
【０１１９】
用いることができるＭＲＩ造影剤には、常磁性金属イオンを含む多様な化合物が含まれる。適切なこのようなイオンには、マンガン、および特にガドリニウムが含まれる。
【０１２０】
金属もまた、核イメージングに用いられる。この用途に適した金属は一般に、放射性γ−放射体である。例には、99mＴｃ、201Ｔｌ、および111Ｉｎが含まれる。
【０１２１】
金属に加えて、イメージングにおいて有用な非金属原子をキャリヤー材料へ連結すること（またはこのような原子を含有するか、またはこのような原子が導入されうる化合物を連結すること）も可能であろう。このような原子の例には、123Ｉおよび121Ｉが含まれる。
【０１２２】
放射線治療において有用な金属
本発明による接合体および調合物はまた、放射線治療において有用な放射性金属を送達するために用いられてもよい。このような金属は一般に、β−粒子の放射体であり、例には、67Ｃｕ、153Ｓｍ、90Ｙ、191Ｐｔ、193Ｐｔ、および195Ｐｔが含まれる。
【０１２３】
これらの調合物の投与
本発明による接合体および調合物は、多様な経路によって投与されてもよい。これらの調合物は、例えば静脈内投与されてもよい。これらの調合物はまた、経口または鼻腔吸入によって（例えば霧状にされた溶液として）投与されてもよい。適切な場合、これらの調合物はカテーテルを介して疾病部位へ直接送達されてもよい。
実施例
本発明はここで、次の実施例および添付図面を参照して、例証としてのみ、より詳細に記載される。実施例１〜１０は、可溶性ｒＨＡをベースとする接合体に関し、実施例１１〜１９は、不溶性ｒＨＡ粒子をベースとする接合体に関する。
【０１２４】
実施例１〜１０についての一般的方法
遊離チオールアッセイ
遊離チオール濃度は、放出された５−チオ−２−ニトロベンゾエートの１３６００Ｍ-1ｃｍ-1の吸光係数を用いて、ｐＨ８におけるＤＴＮＢとの反応そして４１２ｎｍにおける吸光度測定によって決定した。
【０１２５】
タンパク質アッセイ
ｒＨＡ濃度は、１ｇ．Ｌ-1吸光係数（０．５３）を用いて、２８０ｎｍ近くのピークにおける吸光度測定によって決定した。ＩｇＧ濃度は同様に決定したが、１ｇ．Ｌ-1吸光係数は１．４３を用いた。
【０１２６】
ＧＰＨＰＬＣ
ＧＰＨＰＬＣは、ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷＸＬ０．７８×３０ｃｍカラムおよびガード（トーソー・バイオセップ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｅｐ））を用いて実施し、ＰＢＳ中１ｍＬ．分-1で溶離された。
【０１２７】
材料
ＤＴＰＡａおよび塩化ガドリニウムは、シグマ（Ｓｉｇｍａ）から入手した。リコンブミン（Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ）（登録商標）−２５（２５％（ｗ／ｖ）ｒＨＡ）は、英国ノッティンガムのデルタ・バイオテクノロジー社から入手した。マグネビスト（Ｍａｇｎｅｖｉｓｔ）（商標）（０．５ＭのＧｄ−ＤＴＰＡキレート）は、商業的供給源から入手でき、対照として用いた。
【実施例１】
【０１２８】
ＭＲＩ造影剤（ガドリニウムキレート）で標識された可溶性ｒＨＡの調製
この方法は、ＤＴＰＡついでガドリニウム（Ｇｄ）で標識された可溶性ｒＨＡをベースとした、ＭＲＩ造影剤の開発について記載する。
【０１２９】
１．１ ＭＲＩ造影剤（ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄ）で標識されたｒＨＡの調製
ｒＨＡを、水中２０ｇ．Ｌ-1ｒＨＡへ希釈し、ＤＴＰＡａ（０．３ｇｒＨＡあたり１ｇ）を、約３０分間にわたって一定攪拌を行なってゆっくりと添加した。この間、５ＭのＮａＯＨを添加し、ｐＨを８．０のできるだけ近くに維持した。攪拌は、最終ＤＴＰＡａ添加後３０分間続行し、ついでｐＨを５ＭのＨＣｌで７．０に調節した。可溶性ｒＨＡ−ＤＴＰＡを約１２０容積の水に対して一晩透析し、過剰な遊離ＤＴＰＡを除去した。
【０１３０】
Ｇｄ標識は０．１ＭのＧｄＣｌ3での滴定によって実施した。結果として錯体形成およびアルブミンの沈殿を生じる、過剰なＧｄＣｌ3の添加を避けるように注意した。沈殿点は、利用可能なＤＴＰＡの尺度であると考えられた。Ｇｄ誘導の沈殿点から決定された、生じた結合ＤＴＰＡレベルは、４６モル．モル-1ｒＨＡであった。
【０１３１】
１．２ ＭＲＩ造影剤（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）で標識されたｒＨＡのイメージング特性
可溶性ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄは基本的に上記のようにして調製したが、次の修正をともなった：
ａ）ＤＴＰＡ標識のためのｒＨＡ濃度は、２５ｇ．Ｌ-1であった；
ｂ）ＤＴＰＡａ添加時間は、約２５分であった；
ｃ）透析は、約３５０容積の水に対して１８時間、ついで約１００容積に対して２時間実施した；
ｄ）Ｇｄ−誘導の沈殿点から決定された、生じた結合ＤＴＰＡレベルは、４５モル．モル-1ｒＨＡであった。
【０１３２】
その生じた材料を、０．２μｍで濾過し、限外濾過（ソーバール（Ｓｏｒｖａｌｌ）ＲＴ６０００Ｂ遠心分離機で、３，３００ｒｐｍでのビバスピン（Ｖｉｖａｓｐｉｎ）２０ １００００ＭＷＣＯ遠心濃縮器）によって約９０ｇ．Ｌ-1ｒＨＡ（初期ｒＨＡ基準）に濃縮し、５％（ｗ／ｖ）マンニトール中５０ｇ．Ｌ-1ｒＨＡへ調製した。その結果生じたＧｄ濃度は限外濾過の間に損失がないと仮定して計算された。調合された材料を、−３０℃浴中に静かな攪拌を行ないながら２ｍＬアリコートとして冷却し、必要とされるまで冷凍保存した（約−２０℃）。
【０１３３】
磁気共鳴イメージングを、可溶性ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄ、および水で約２ｍＬに希釈されたマグネビスト（商標）対照を、８ｍＬ０．５％アガロースと混合して規定のＧｄ濃度となったものを用いて実施した。緩和率（Ｒ１およびＲ２）は、各サンプルについて、ある範囲の反復時間（ＴＲ）およびエコー時間（ＴＥ）を用いて、このデータを次のどちらかへフィットさせることによって決定した：
Ｍ＝Ｍ∞（１−ｅ-R1.TR）またはＭ＝Ｍ0（ｅ-R2.TE）
（ここで、Ｍは、時間Ｔでの測定された信号であり、
Ｍ0は、Ｔ＝０における信号であり、かつ
Ｍ∞は、Ｔ＝∞における信号である）。
【０１３４】
この可溶性ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄのｉｎ ｖｉｔｒｏＭＲＩ特性を、Ｇｄ−ＤＴＰＡをベースとする商用ＭＲＩ造影剤であるマグネビスト（登録商標）の特性と比較した（図１）。Ｒ１およびＲ２緩和率の両方が、マグネビスト（登録商標）を用いて得られたものよりも有意に大きかった。このことは、可溶性ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄが、特にｒＨＡベースの材料について予想されたクリアランス率における顕著な減少から考えて、同じＧｄ濃度においてマグネビスト（登録商標）を用いて見られたものと同等またはこれよりも良好なｉｎ ｖｉｖｏ画像を生成することを示した。あるいはまたこれは、可溶性ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄが、マグネビスト（登録商標）よりも低いＧｄ用量で用いることができるであろうことを示唆した。
【実施例２】
【０１３５】
ＤＴＰＡで標識された可溶性ｒＨＡへの銅イオンの結合
（実施例１において調製された）ＤＴＰＡで標識された組換えヒトアルブミンは、放射性金属、例えば銅、インジウム、テクネチウム、およびほかのもののためのキャリヤーとして用いることができる。
【０１３６】
これを確認するために、（上記実施例１のように調製された）ＤＴＰＡ−標識されたアルブミンが、銅イオンへ結合することを証明することができる（この実施例にために、非放射性銅を用いた）。
【０１３７】
２．１ ｒＨＡ−ＤＴＰＡの調製
ｒＨＡ−ＤＴＰＡのサンプルは、実施例１．３において上記されているように調製したが、次の修正をともなった：
ａ）ＤＴＰＡａ添加時間は、約２０分であった；
ｂ）ＤＴＰＡａ添加後の攪拌時間は、約２０分であった；
ｃ）透析は、約３５０容積の水に対して４時間、ついで約３５０容積に対して１６時間、および約１００容積に対して３時間実施した；
ｄ）調製は、ＧｄＣｌ3滴定の前に停止した；
ｅ）ｒＨＡ−ＤＴＰＡの小さいサンプルでのＧｄ−誘導の沈殿点から測定された、生じた結合ＤＴＰＡレベルは、４６モル．モル-1ｒＨＡであった。
【０１３８】
２．２ 分光光度Ｃｕ2+滴定
ｒＨＡ−ＤＴＰＡの５ｍＬアリコートを、０．５ＭのＮａＯＨでｐＨ６に調節し、総容積を記録した。Ａ700測定のためにサンプルを採取し、ついでバルクに戻した。０．１ＭのＣｕＳＯ4の１２の５０μＬアリコートを、ｐＨ調節を行なって添加し、各回添加後に上記のようなＡ700測定を行なった。測定された吸光度値を５ｍＬの容積へ補正し、添加されたＣｕの量に対してプロットした。回帰線を滴定の２つの相へフィットさせ、これらの交差点を終点として考えた。
【０１３９】
図２に示されるように、銅結合の量（交差点として考えられたもの）は、ガドリニウム結合（上記実施例１に記載されているように、沈澱終点によって決定された）に対して得られた図にそっくりであった。
【実施例３】
【０１４０】
キャリヤー積載の最適化
最大の効果を得るために、このキャリヤーが、薬剤（例えばＭＲＩへの使用のためのＧｄ3+）または核イメージングまたは治療で使用される放射性金属の最大積載量を運ぶことが、多くの場合重要である。この方法は、ｒＨＡに対するＧｄ3+結合能力の最適化について記載する。
【０１４１】
３．１ ｒＨＡ−ＤＴＰＡの合成
ｒＨＡの４つの０．６ｇアリコートを、各々水中２４ｍＬに希釈した。２、１、０．５、または０．２ｇのＤＴＰＡａを、一定攪拌を行ないながらそれぞれ２５、２０、１２、および９分にわたって各々に添加し、ｐＨを５ＭのＮａＯＨの添加によってｐＨ８．０のできるだけ近くに維持した。これらの溶液を、最終添加後約３０分間攪拌し、３ＭのＨＣｌでｐＨ７に調節した。すべてのサンプルを、１１Ｌの水の４回交換に対して、全部で４４時間、共に透析した。
【０１４２】
３．２ Ｇｄ3+結合能力の測定
Ｇｄ3+結合能力を、ＸＯ指示薬での錯滴定によって決定した。この指示薬は約ｐＨ６において、遊離Ｇｄ3+の存在下で黄色から紫色に変わる。ＸＯ色はまたｐＨに依存し、大きなｐＨ変化が、非緩衝溶液中でｒＨＡ−ＤＴＰＡのＧｄＣｌ3滴定の間に発生することが見られたので、信頼しうる結果を得るためには滴定中の良好なｐＨ制御が必要とされた。
【０１４３】
各ｒＨＡ−ＤＴＰＡサンプル１ｍＬを、０．２ｍＬの０．２Ｍヘキサミン、および５μＬの０．１％（ｗ／ｖ）ＸＯ（出発ｐＨ５．９〜６．１）と混合し、０．１ＭのＧｄＣｌ3で最初の持続的色彩変化（最終ｐＨ５．４〜５．６）まで滴定した。これらの結果の有効性を確認するために、各サンプルを実施例２と同様に、ＣｕＳＯ4での分光光度滴定に付した。両方の滴定剤を、１０ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウム塩（フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ））の標準容積溶液に対して標準化した。
【０１４４】
これらの結果（表１および図３）は、これら２つの方法の間の優れた一致を示し、両方が利用可能なＤＴＰＡ基の信頼しうる尺度であることを示す。これらはまた、基本的に最大Ｇｄ3+結合能力を得るためにはＤＴＰＡａ添加の最高レベル（３．３３ｇのＤＴＰＡａ．ｇ-1ｒＨＡ；１０モルのＤＴＰＡａ．モル-1ｒＨＡ−ＮＨ2に等しい）が必要とされることも示した。
【０１４５】
【表１】
【実施例４】
【０１４６】
過剰反応物質の除去の最適化
キャリヤー分子の標識後、過剰な反応物質を除去することが望ましい。この目的のための透析の使用は、効率的な除去を達成するために、極端に長い時間および極端に大きい容積を必要とすることが発見された（例えば実施例３．１参照）。ゲル濾過の使用は、時間および容積の劇的な節約を与える。この方法は、ｒＨＡ−ＤＴＰＡからの過剰ＤＴＰＡの除去のためのゲル濾過の開発について記載する。
【０１４７】
４．１ ｒＨＡ−ＤＴＰＡの合成
０．３ｇのｒＨＡを水中１２ｍＬに希釈し、一定攪拌を行ないながらｐＨを５ＭのＮａＯＨの添加によってｐＨ８のできるだけ近くに維持しながら、１ｇのＤＴＰＡａを約３０分にわたって添加した。溶液を、最終添加後約６０分間攪拌し、３ＭのＨＣｌでｐＨ７に調節した。この材料の遊離チオールアッセイは、出発ｒＨＡについての０．６８モル．モル-1ｒＨＡの値と比較して、０．１０モル．モル-1ｒＨＡの値を生じた。
【０１４８】
４．２ セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ２５クロマトグラフィー
０．５ｍＬのｒＨＡ−ＤＴＰＡを、ＰＤ１０カラム（アマシャム・バイオサイエンシーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）からのセファデックスＧ２５媒質の予め充填された８．３ｍＬカラム）上へロードし、０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ中で平衡化した。このカラムを、０．５ｍＬアリコート０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌで溶出し、最初の４つは廃棄し、残りはアッセイのために回収した。ｒＨＡ−ＤＴＰＡの溶離プロフィールを決定するために、適切なフラクション０．１ｍＬを１ｍＬの水で希釈し、２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。過剰遊離ＤＴＰＡの溶離プロフィールを決定するために、適切なフラクション２０μＬを、２０ｍＭのヘキサミンｐＨ５中の１ｍＬの４ｍＭＣｕＳＯ4で希釈し、７００ｎｍにおける吸光度を測定した。これらの結果（図４ａ）は、過剰遊離ＤＴＰＡからのｒＨＡ−ＤＴＰＡのベースライン分離が、比較的低いカラムロード（６％カラム容積）にもかかわらず達成されないことを示した。
【０１４９】
４．３ セファデックスＧ２５クロマトグラフィー（小規模）
ＰＤ１０カラムを空にし、セファデックスＧ５０媒質（アマシャム・バイオサイエンシーズ）で、同じベッド容積に再充填した。このカラムを０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ中で平衡化し、０．５ｍＬのｒＨＡ−ＤＴＰＡをロードした。カラムを溶離し、これらのフラクションを上記のようのアッセイした。これらの結果（図４ｂ）は、たとえ自己充填されたカラムが商品として充填されたカラムよりも効率性が低く、その結果として有意により大きいピーク幅を生じるにしても、比較的高い多孔度マトリックスによる２つのピークの分離における顕著な改良を示した。
【０１５０】
４．４ 検出波長
０．１８ＭのＤＴＰＡ ｐＨ７の吸光度スペクトル（ｒＨＡ／ＤＴＰＡａ反応の終了時のおよその濃度およびｐＨ）は、２７０ｎｍ以上で無視しうる吸光度を示し、有意な吸光度は２６０ｎｍ以下で現れた。したがってｒＨＡ−ＤＴＰＡおよび遊離ＤＴＰＡの両方の検出を可能にするため、カラム流出物の監視のために、２５４ｎｍの検出波長が選ばれた。
【０１５１】
４．５ セファデックスＧ５０クロマトグラフィー（大規模）
ＸＫ１６／４０カラム（アマシャム・バイオサイエンシーズ）を、０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ中セファデックスＧ５０媒質で３７ｃｍのベッド高さに充填し、２５４ｎｍおよび２ＡＵフルスケールに設定された２ｍｍフローセル（アマシャム・バイオサイエンシーズ）を有するＵＶ−１モニターへ連結した。ｒＨＡ−ＤＴＰＡの新鮮なサンプルを上記のように調製するが、最終添加とｐＨ７への調節との間の攪拌時間は約３０分に減少させた。この材料をカラム上にロードし、２．８５ｍＬ．分-1で０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌで溶離した。結果（図４ｃ）は、高いカラムロード（２０％カラム容積）でさえ、過剰遊離ＤＴＰＡからのｒＨＡ−ＤＴＰＡのベースライン分離が容易に達成され、精製ｒＨＡ−ＤＴＰＡはカラム溶離の開始から１０分以内に生成されることを示した。
【実施例５】
【０１５２】
可溶性ｒＨＡ誘導体中の遊離チオール回復のための条件の開発
以前の結果（実施例４参照）は、ｒＨＡ遊離チオールがＤＴＰＡａとの反応によって大幅にブロックされることを示した。このチオールが架橋剤付着部位として用いられることになるならば、架橋剤との効率的な反応のためにｒＨＡ遊離チオールの回復が必要とされた。この方法は、ｒＨＡとＤＴＰＡａとの反応（ｒＨＡ−ＤＴＰＡ）、またはｒＨＡ−ＤＴＰＡへのＧｄ3+の結合（ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄ）後に、この目的を達成するための条件の開発について記載する。
【０１５３】
５．１ ｒＨＡ−ＤＴＰＡ遊離チオールに対する保存の効果
実施例４からのｒＨＡ−ＤＴＰＡの遊離チオール含量を、６週間の冷蔵保存後に再アッセイし、０．１０から０．２９モル．モル-1ｒＨＡへと上昇していることが分かった。このことは、遊離チオールの回復が、適切な条件下に可能であろうことを示唆した。
【０１５４】
５．２ ｒＨＡ−ＤＴＰＡの合成
ｒＨＡ−ＤＴＰＡの合成を、実施例４のセファデックスＧ５０クロマトグラフィー（大規模）と同様にして行い、ｒＨＡ−ＤＴＰＡピークが、溶離の開始の２〜９分後に収集された。出発ｒＨＡ中の遊離チオールレベルは、０．７０モル．モル-1ｒＨＡであった。
【０１５５】
５．３ ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄの合成
９．８ｍＬのｒＨＡ−ＤＴＰＡを３０μＬの０．１％（ｗ／ｖ）ＸＯと混合し、ｐＨを１ＭのＮａＯＨでｐＨ５．５〜ｐＨ６．０に終点（黄色から紫色への最初の変化によって示される；４８モルＧｄ3+．モル-1ｒＨＡ）まで維持し、０．１ＭのＧｄＣｌ3で滴定した。
【０１５６】
余剰Ｇｄ3+を結合するためにさらに０．１ｍＬのｒＨＡ−ＤＴＰＡを添加すると、色彩は黄色に戻り、溶液は１ＭのＮａＯＨでｐＨ７に調節された。
【０１５７】
５．４ 遊離チオールの回復
ｒＨＡ−ＤＴＰＡおよびｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄの両方の６つの１ｍＬアリコートを採取した。各々の型の３つを、必要に応じてＨＣｌまたはＮａＯＨで、ｐＨ５、ｐＨ６、またはｐＨ８に調節し、残りの３つをｐＨ７に放置した。すべてのサンプルを、水で１．１ｍＬとした。各々の型の２つのｐＨ７サンプルを、３５℃または４５℃でインキュベーションし、残りのサンプルをすべて２５℃でインキュベーションした。遊離チオールアッセイを、出発ｒＨＡ−ＤＴＰＡおよびｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄに対して実施し、ついで指定された時間にインキュベーションの各々に対して実施した。結果（図５）は、両方のサンプル中の遊離チオールを、簡易なインキュベーションによって回復することができることを示した。ただし、回復率は、ｒＨＡ−ＤＴＰＡの場合よりも、ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄの場合の方がはるかに高かった。両方の反応はなんらかのｐＨ依存性を示した。ただし温度の増加は、反応速度を増加させる上でより効果的であった。最大回復（約８０％の出発遊離チオールに等しい）は、４５℃で、ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄについて約２時間後、ｒＨＡ−ＤＴＰＡについて２０時間後に達成された。
【実施例６】
【０１５８】
可溶性ｒＨＡ誘導体との架橋剤反応
本発明による方法において、ターゲッティング部分およびキャリヤー分子は各々、明確な生成物を生成する選択的架橋剤反応のために、別個の化学基を含有する。抗体ターゲッティング部分およびｒＨＡキャリヤー分子という特定の場合においては、これらの基は好ましくは、それぞれ炭水化物および遊離チオールである。この方法は、ｒＨＡ−ＤＴＰＡおよびｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄと、これらの基との使用に適した２つの架橋剤、すなわちＰＤＰＨおよびＥＭＣＨとの反応について記載する。
【０１５９】
６．１ ｒＨＡ−ＤＴＰＡの合成
０．３ｇのｒＨＡ（遊離チオールレベル０．６７モル．モル-1ｒＨＡ）を水中１２ｍＬに希釈し、ｐＨを５ＭのＮａＯＨの添加によってｐＨ８のできるだけ近くに維持しながら、１ｇのＤＴＰＡａを一定攪拌を行ないながら約３０分にわたって添加した。溶液を、最終添加後約３０分間攪拌し、３ＭのＨＣｌでｐＨ７に調節し、０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ中で平衡化したセファデックスＧ５０媒質カラム（１．６×３７ｃｍ）へ適用した。溶離は、２５４ｎｍにおける検出をしながら２．８４ｍＬ．分-1で実施した。ｒＨＡ−ＤＴＰＡピークが溶離の開始の２〜９分後に収集され、これは、０．０７モル．モル-1ｒＨＡの遊離チオールレベルを示した。ｒＨＡ−ＤＴＰＡを４５℃で２０時間インキュベーションしチオールをアンブロックすると、０．５７モル．モル-1ｒＨＡの遊離チオールレベルを生じた。
【０１６０】
６．２ ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄの合成
ａ）ＤＴＰＡａを約３５分間にわたって添加し；ｂ）セファデックスＧ５０カラムを２．７ｍＬ．分-1で溶離し；ｃ）ｒＨＡ−ＤＴＰＡピークは、溶離開始の２〜１０分後に収集され、０．１４モル．モル-1ｒＨＡの遊離チオールレベルを示したこと、以外は上記と同様にして０．３ｇのｒＨＡ（遊離チオールレベル０．７０モル．モル-1ｒＨＡ）をｒＨＡ−ＤＴＰＡへ転換した。１ｍＬのｒＨＡ−ＤＴＰＡを除去し、６０μＬの０．１％（ｗ／ｖ）ＸＯを残りに添加した。終点（４８モルＧｄ3+．モル-1ｒＨＡ）までｐＨを１ＭのＮａＯＨでｐＨ５．５とｐＨ６．０の間に維持しながら、ＤＴＰＡ基を０．１ＭのＧｄＣｌ3で滴定した。０．３ｍＬの保管されたｒＨＡ−ＤＴＰＡを余剰Ｇｄ3+を結合するために添加し、溶液を１ＭのＮａＯＨでｐＨ７に調節し、ついで４５℃で２時間インキュベーションしてチオールをアンブロックすると、０．５１モル．モル-1ｒＨＡの遊離チオールレベルを生じた。
【０１６１】
６．３ ＰＤＰＨとの反応
２ｍＬのｒＨＡ−ＤＴＰＡを、０．１５ｍＬの０．２Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4および０．０５ｍＬの０．２Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4と混合した。１ｍＬサンプルを採取し、３４３ｎｍにおけるその吸光度を、０．１ｍＬの１０ｍＭ ＰＤＰＨ（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ））の添加の直前に測定し、その後２０分間２分毎に測定した。測定はＰＤＰＨ自体の吸光度について補正し、反応の程度は放出された２−チオピリジンについて８０８０Ｍ-1．ｃｍ-1の吸光係数を用いて計算した。実験は、ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄを用いて繰り返した。結果は、ＰＤＰＨとの反応が、どちらの場合にも迅速かつ効率的であり、最初の２分の時点で９６〜９８％完了し、反応の最終程度は、遊離チオールアッセイによって測定された程度の約９０％であることを示した。
【０１６２】
６．４ ＥＭＣＨとの反応
４ｍＬのｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄを、０．３ｍＬの０．２Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4および０．１ｍＬの０．２Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4と混合し、０．４４ｍＬの１０ｍＭ ＥＭＣＨ（ピアス）を添加した。１ｍＬサンプルを、添加の１５、３０、６０、および１２０分後に採取し、５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７中で平衡化されたＰＤ１０カラムへ直ちに適用し、過剰ＥＭＣＨを除去した。高分子量フラクションを、溶離開始後１．５〜３．５ｍＬから収集した。溶離物を、直接的に、およびまた（ＥＭＣＨ除去を評価するため）一定量のＤＴＴでスパイクして、遊離チオールアッセイに付し、（ｒＨＡ回収を評価するため）タンパク質アッセイに付した。測定された回収率は、ＤＴＴについては９８〜１０４％、ｒＨＡについては１０２〜１０４％の範囲内にあり、このことは、ＥＭＣＨの完全な排除およびｒＨＡの回収を確認した。直接遊離チオールアッセイについての結果は、ＥＭＣＨとの反応が、迅速かつ同時に効率的であり、遊離チオールレベルが最初の１５分の時点で０．０２モル．モル-1ｒＨＡへ減少することを示した。
【実施例７】
【０１６３】
抗体との架橋剤反応
この実施例は、２つの抗体αＣＤ４５およびＣ５９５と架橋剤ＰＤＰＨとの反応について記載する。
【０１６４】
７．１ ＰＤＰＨとのαＣＤ４５反応
１ｍＬのαＣＤ４５（セロテック（Ｓｅｒｏｔｅｃ）ＭＣＡ４３Ｇ；ＩｇＧ濃度１．０ｍｇ．ｍＬ-1）を、２．３ｍｇのＫｌＯ4へ添加し、室温において暗所で３０分間混合した。溶液をＰＢＳで平衡化されたＰＤ１０カラムへ適用し、高分子量フラクションを、溶離開始後１．５〜３．５ｍＬから収集した。溶離物を、ＰＢＳで予め洗浄されたナノセップ（Ｎａｎｏｓｅｐ）１０Ｋオメガ（Ｏｍｅｇａ）遠心濃縮器（ポール（Ｐａｌｌ））を用いて１ｍＬの最終容積に濃縮し、１．０ｍｇのＰＤＰＨへ添加し、室温で２１時間混合した。αＣＤ４５−ＰＤＰＨをＰＤ１０カラムを用いて精製し、この溶離物を上記のように１ｍＬに再濃縮すると９０％の全体でのＩｇＧ回収率が得られた。反応の程度を、１０μＬの１０ｍＭ ＤＴＴの添加の直前、およびその後１５分間１分毎に、３４３ｎｍにおける吸光度測定によって８０８０Ｍ-1．ｃｍ-1の吸光係数を用いて、結合ＰＤＰＨの還元の時に放出された２−チオピリジンから決定した。結果（図６）は、ＰＤＰＨがαＣＤ４５と首尾良く反応し、２．３モルＰＤＰＨ．モル-1ＩｇＧの化学量論を生じたことを示した。分析ＧＰＨＰＬＣ（２８０ｎｍの検出波長での５０μＬ注入）は、生じたαＣＤ４５−ＰＤＰＨが高いモノマー純度を保持し、約８．４分のピーク溶離時間をともなうことを示した。
【０１６５】
７．２ ＰＤＰＨとのＣ５９５反応
０．３５ｍＬのＣ５９５（ノッティンガム大学から入手；ＩｇＧ濃度３．２ｍｇ．ｍＬ-1）を０．６５ｍＬ ＰＢＳで希釈し、２．４ｍｇのＫｌＯ4へ添加し、室温において暗所で３０分間混合した。溶液をＰＢＳで平衡化されたＰＤ１０カラムへ適用し、高分子量フラクションを溶離の開始後１．５〜３．５ｍＬから収集した。溶離物を、ＰＢＳで予め洗浄されたナノセップ１０Ｋオメガ遠心濃縮器を用いて１ｍＬの最終容積に濃縮し、１．０ｍｇのＰＤＰＨへ添加し、室温で１９時間混合した。Ｃ５９５−ＰＤＰＨをＰＤ１０カラムを用いて精製し、溶離物を上記のように１ｍＬに再濃縮すると、８５％の全体でのＩｇＧ回収率が得られた。反応の程度を、１０μＬの１０ｍＭ ＤＴＴの添加の直前、およびその後１５分間１分毎に、３４３ｎｍにおける吸光度測定によって８０８０Ｍ-1．ｃｍ-1の吸光係数を用いて、結合ＰＤＰＨの還元の時に放出された２−チオピリジンから決定した。結果（図７）は、ＰＤＰＨがＣ５９５と首尾良く反応し、２．５モルＰＤＰＨ．モル-1ＩｇＧの化学量論を生じたことを示した。分析ＧＰＨＰＬＣ（２８０ｎｍの検出波長での５０μＬ注入）は、結果として生じたＣ５９５−ＰＤＰＨが高いモノマー純度を保持し、ピーク溶離時間が約８．５分であることを示した。
【実施例８】
【０１６６】
ｒＨＡ−ＤＴＰＡ／ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄの精製
ターゲッティング部分とキャリヤー分子との接合体は個々の成分のどちらよりも明らかに大きく、したがって未反応の個々の成分のどれからの接合体の精製もゲル透過クロマトグラフィーによって達成可能であるはずである。ｒＨＡキャリヤー分子の特定の場合、ヒトアルブミンがダイマーおよびより長いオリゴマーを形成する傾向は、非標的キャリヤー分子からの標的接合体の首尾良い精製を危うくすることがあるであろう。この方法は、この接合体のその後の精製を単純化するために、ターゲッティング部分との反応の前にモノマーｒＨＡ−ＤＴＰＡおよびｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄを精製することについて記載する。
【０１６７】
８．１ 分取ＧＰＨＰＬＣ
ｒＨＡ誘導体の精製は、高い生産性を生じるために大きい注入容積（２００μＬ）、および高いｒＨＡ濃度におけるピーク吸光度を減少させるために準最適検出波長（２５４ｎｍ）を用いた。
【０１６８】
８．２ ｒＨＡ−ＤＴＰＡの精製
ｒＨＡ−ＤＴＰＡの分取ＧＰＨＰＬＣは、約６．６分におけるダイマーピーク、および約７．６分におけるモノマーピークを特徴としていた。モノマーｒＨＡ−ＤＴＰＡの精製のために、７．２〜９．０分で溶離する材料を収集した。収集された材料の分析ＧＰＨＰＬＣ（２８０ｎｍの検出波長での５０μＬ注入）は、高度のモノマー純度がこの方法によって達成されたことを確認した。
【０１６９】
８．３ ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄの精製
ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄの分取ＧＰＨＰＬＣは、約６．９分におけるダイマーピーク、および約８．１分におけるモノマーピークを特徴としていた。モノマーｒＨＡ−ＤＴＰＡの精製のために、７．７〜９．０分で溶離する材料を収集した。収集された材料の分析ＧＰＨＰＬＣ（２５４ｎｍの検出波長での１００μＬ注入）は、高度のモノマー純度がこの方法によって達成されたことを確認した。
【実施例９】
【０１７０】
αＣＤ４５−ＰＤＰＨ−ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄの調製
合成における個々の工程の以前の開発に基づいて（実施例１〜８）、この方法は標的化薬剤の完全調製について記載する。この方法において、キャリヤー分子（ｒＨＡ）をＤＴＰＡついでＧｄで高いレベル標識し、標的化ＭＲＩ造影剤としての使用に適するようにする。
【０１７１】
９．１ ｒＨＡ−ＤＴＰＡの合成
０．３ｇのｒＨＡ（遊離チオールレベル０．７０モル．モル-1ｒＨＡ）を水中１２ｍＬに希釈し、ｐＨを５ＭのＮａＯＨの添加によってｐＨ８のできるだけ近くに維持しながら、１ｇのＤＴＰＡａを一定攪拌を行ないながら約３５分にわたって添加した。溶液を最終添加後３０分間攪拌し、３ＭのＨＣｌでｐＨ７に調節し、０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌで平衡化されたセファデックスＧ５０媒質カラム（１．６×３７ｃｍ）へ適用した。溶離は、２５４ｎｍでの検出をしながら２．７ｍＬ．分-1で実施した。ｒＨＡ−ＤＴＰＡピークは、溶離開始の２〜１０分後に収集され、これは０．１４モル．モル-1ｒＨＡの遊離チオールレベルを示した。
【０１７２】
９．２ ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄの合成
１ｍＬのｒＨＡ−ＤＴＰＡを除去し、６０μＬの０．１％（ｗ／ｖ）ＸＯを残りに添加した。ｐＨを１ＭのＮａＯＨでｐＨ５．５〜ｐＨ６．０に終点（黄色から紫色への最初の変化によって示された；４８モルＧｄ3+．モル-1ｒＨＡ）まで維持しながら、ＤＴＰＡ基を０．１ＭのＧｄＣｌ3で滴定した。０．３ｍＬの保管されたｒＨＡ−ＤＴＰＡを、余剰Ｇｄ3+を結合するために添加し、色彩は黄色に戻り、溶液を１ＭのＮａＯＨでｐＨ７に調節し、ついで４５℃で２時間インキュベーションしてチオールをアンブロックすると、０．５１モル．モル-1ｒＨＡの遊離チオールレベルを生じた。
【０１７３】
９．３ αＣＤ４５−ＰＤＰＨの合成
１ｍＬのαＣＤ４５を２．３ｍｇのＫｌＯ4へ添加し、室温において暗所で３０分間混合した。溶液をＰＢＳで平衡化されたＰＤ１０カラムへ適用し、高分子量フラクションを、溶離開始後、１．５〜３．５ｍＬから収集した。溶離物をＰＢＳで予め洗浄されたナノセップ１０Ｋオメガ遠心濃縮器を用いて１ｍＬの最終容積まで濃縮し、１．１ｍｇのＰＤＰＨへ添加し、室温で５時間混合した。αＣＤ４５−ＰＤＰＨを、上記のように用いられているＰＤ１０カラムを用いて精製した。
【０１７４】
９．４ ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄの精製
モノマーｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄを、２５４ｎｍにおける検出をしながら２００μＬの注入を用いて分取ＧＰＨＰＬＣによって精製した。クロマトグラフィーは８サイクル実施し、注入の７．７〜９．０分後に生成物を収集した。この生成物のｒＨＡ濃度は、１．１ｇ．Ｌ-1であった。この生成物の高いモノマー純度が、２８０ｎｍにおける検出とともに５０μＬ注入を用いて分析ＧＰＨＰＬＣによって確認された。
【０１７５】
９．５ αＣＤ４５−ＰＤＰＨ−ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄの合成
精製されたｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄを、約１０モルｒＨＡ．モル-1ＩｇＧでαＣＤ４５−ＰＤＰＨへ添加し、溶液を、ＰＢＳで予め洗浄されたビバスピン（Ｖｉｖａｓｐｉｎ）２０ １０Ｋ遠心濃縮器（サートリウス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ））を用いて１ｍＬに濃縮し、室温で２４時間混合した。αＣＤ４５−ＰＤＰＨ−ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄの形成は、２８０ｎｍでの検出をしながら２０μＬ注入を用いた分析ＧＰＨＰＬＣ上の新たな高分子量ピークの出現によって確認された。２．３の想定ｒＨＡ：αＣＤ４５化学量論（ＰＤＰＨ：αＣＤ４５について実施例７で測定されたように）は、Ｇｄ3+：ｒＨＡ化学量論の測定値４８ともに、この錯体についての予測Ｇｄレベルとして約１１０モルＧｄ3+．モル-1ＩｇＧを与える。
【０１７６】
９．６ αＣＤ４５−ＰＤＰＨ−ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄの精製
αＣＤ４５−ＰＤＰＨ−ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄを、上記のように分取ＧＰＨＰＬＣによって精製したが、約９５μＬの１０回注入、２８０ｎｍにおける検出、６．０〜７．２分からの生成物収集を用いた。この生成物は、２つのナノセップ１０Ｋオメガ遠心濃縮器を用いて１ｍＬに濃縮し、純度は、２８０ｎｍにおける検出をしながら５０μＬの注入を用いた分析ＧＰＨＰＬＣによって確認された。最後にこの生成物を、−３０℃浴中に約１５０μＬアリコートとして冷凍し、−２０℃で保存した。
【０１７７】
９．７ 抗体結合活性
αＣＤ４５−ＰＤＰＨ−ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄの抗体活性は、発蛍光団標識されたαＣＤ４５に対する競合結合アッセイにおいて、白血球共通抗原ＣＤ４５を発現するラットの脾臓細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ）を用いて測定した。これらの細胞の蛍光強度は、一定の０．２μｇ蛍光抗体を用いαＣＤ４５−ＰＤＰＨ−ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄの量を増やしながら、フローサイトメトリーによって測定した。非標識αＣＤ４５は、正の対照として同様にアッセイした。結果（図８）は、αＣＤ４５−ＰＤＰＨ−ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄが、非標識αＣＤ４５と同様に蛍光抗体を置換させることができることを示し、このことは、接合体が抗体結合活性を保持したことを証明した。
【０１７８】
９．８ 磁気共鳴特性
αＣＤ４５−ＰＤＰＨ−ｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄは、２テスラにおけるＴ１およびＴ２の緩和時間として、それぞれ９２および９５ｍｓを与えた。これは、同時に測定された時に１９３および１７７ｍｓの値を生じる０．５ｍＭのオムニスキャン（Ｏｍｎｉｓｃａｎ）（商標）（アマシャムからの非標的化ガドリニウムベースのＭＲＩ造影剤）よりも約２倍良好であった。このことは、この接合体についての優れた緩和の向上を示している。
【実施例１０】
【０１７９】
Ｃ５９５−ＰＤＰＨ−ｒＨＡ−ＤＴＰＡの調製
この方法は、標的化された薬剤の調製であって、キャリヤー分子（ｒＨＡ）が高レベルでＤＴＰＡで標識されるが、金属イオンを用いず、これを標的化核イメージングまたは治療薬としての使用のために適した放射性金属の積載に適したものにする調製について記載する。
【０１８０】
１０．１ ｒＨＡ−ＤＴＰＡの合成
０．３ｇのｒＨＡ（遊離チオールレベル０．６７モル．モル-1ｒＨＡ）を水中１２ｍＬに希釈し、ｐＨを５ＭのＮａＯＨの添加によってできるだけｐＨ８の近くに維持しながら、１ｇのＤＴＰＡａを一定攪拌を行ないながら約３０分にわたって添加した。溶液を、最終添加後約３０分間攪拌し、３ＭのＨＣｌでｐＨ７に調節し、０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌで平衡化したセファデックスＧ５０媒質カラム（１．６×３７ｃｍ）へ適用した。溶離は、２５４ｎｍにおける検出とともに２．８４ｍＬ．分-1で実施した。ｒＨＡ−ＤＴＰＡピークが、溶離の開始の２〜９分後に収集され、これは、０．０７モル．モル-1ｒＨＡの遊離チオールレベルを示した。ｒＨＡ−ＤＴＰＡを４５℃で２０時間インキュベーションしてチオールをアンブロックすると、０．５７モル．モル-1ｒＨＡの遊離チオールレベルを生じた。上記のようなＧｄＣｌ3での錯滴定によってこの材料の４ｍＬアリコートに対して測定されたＤＴＰＡレベルは、４４モル．モル-1ｒＨＡであった。
【０１８１】
１０．２ Ｃ５９５−ＰＤＰＨの合成
Ｃ５９５（ノッティンガム大学から入手；ＩｇＧ濃度３．２ｍｇ．ｍＬ-1）をＰＢＳ中１．０ｍｇ．ｍＬ-1ＩｇＧに希釈し、１ｍＬを２．３ｍｇのＫｌＯ4へ添加し、室温において暗所で３０分間混合した。この溶液をＰＢＳで平衡化されたＰＤ１０カラムへ適用し、高分子量フラクションを、溶離の開始後１．５〜３．５ｍＬから収集した。溶離物を、ＰＢＳで予め洗浄されたナノセップ１０Ｋオメガ遠心濃縮器を用いて１ｍＬの最終容積に濃縮し、１．１ｍｇのＰＤＰＨへ添加し、室温で５時間混合した。Ｃ５９５−ＰＤＰＨを、上記のように用いられているＰＤ１０カラムを用いて精製した。
【０１８２】
１０．３ ｒＨＡ−ＤＴＰＡの精製
モノマーｒＨＡ−ＤＴＰＡを、ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷＸＬ０．７８×３０ｃｍカラムおよびガード上の２００μＬ注入を用いて、分取ＧＰＨＰＬＣによって精製し、２５４ｎｍにおける検出とともにＰＢＳ中１ｍＬ．分-1で溶離した。クロマトグラフィーの６サイクルを実施し、注入の７．２〜９．０分後に生成物を収集した。この生成物のｒＨＡ濃度は、１．０ｇ．Ｌ-1であった。この生成物の高いモノマー純度は、上記の分取ＧＰＨＰＬＣと同様であるが、２８０ｎｍにおける検出をしながら５０μＬ注入を用いた分析ＧＰＨＰＬＣによって確認された。
【０１８３】
１０．４ Ｃ５９５−ＰＤＰＨ−ｒＨＡ−ＤＴＰＡの合成
精製されたｒＨＡ−ＤＴＰＡを、約１０モルｒＨＡ．モル-1ＩｇＧでＣ５９５−ＰＤＰＨへ添加し、この溶液をＰＢＳで予め洗浄されたビバスピン２０ １０Ｋ遠心濃縮器を用いて１ｍＬに濃縮し、室温で１８時間混合した。Ｃ５９５−ＰＤＰＨ−ｒＨＡ−ＤＴＰＡの形成は、２８０ｎｍにおける検出とともに２０μＬ注入を用いた分析ＧＰＨＰＬＣでの新たな高分子量ピークの出現によって確認された。２．５の想定ｒＨＡ：Ｃ５９５化学量論（ＰＤＰＨ：Ｃ５９５について実施例７において測定されたように）は、測定Ｇｄ3+：ｒＨＡ化学量論である４４とともに、この錯体について予測されたＧｄレベルとして約１１０モルＧｄ3+．モル-1ＩｇＧを与える。
【０１８４】
１０．５ Ｃ５９５−ＰＤＰＨ−ｒＨＡ−ＤＴＰＡの精製
Ｃ５９５−ＰＤＰＨ−ｒＨＡ−ＤＴＰＡを、上記のような分取ＧＰＨＰＬＣによって精製したが、約９５μＬの１０回注入、２８０ｎｍにおける検出、５．７〜６．６分からの生成物収集を用いた。この生成物を２つのナノセップ１０Ｋオメガ遠心濃縮器を用いて１ｍＬに濃縮し、純度は２８０ｎｍにおける検出とともに５０μＬの注入を用いて分析ＧＰＨＰＬＣによって確認された。最後に生成物を、−３０℃浴中に約１１５μＬアリコートとして冷凍し、−２０℃で保存した。
【実施例１１】
【０１８５】
ＭＲＩ造影剤（ガドリニウムキレート）で標識されたｒＨＡ粒子の調製
１１．１ 方法
１１．１．１ ｒＨＡ粒子の調製
次のようにして、ｒＨＡ粒子の１バッチをｒＨＡ懸濁液のスプレー乾燥によって生成した：
２００ｍＬの２５％（ｗ／ｖ）ｒＨＡを、５Ｌのピロゲンフリー精製水に対して室温で一晩透析して過剰な塩化ナトリウムを除去し、３２０ｍＬの最終容積を生じた。５２ｍＬの透析タンパク質を１ＭのＮａＯＨでｐＨ８．０に調節し、磁気攪拌機での一定混合を行ないながらエタノールをゆっくりと乳状懸濁液が形成されるまで添加した（８０ｍＬエタノール）。連続的に攪拌された懸濁液を、次の条件下、シュリック（Ｓｃｈｌｉｃｋ）２−流体噴霧ノズル（モデル９７０／０）が取り付けられたブキ・ミニスプレードライヤー（Ｂｕｃｈｉ Ｍｉｎｉ Ｓｐｒａｙ Ｄｒｙｅｒ）（モデルＢ−１９１）を用いてスプレー乾燥した：
入口温度 １００℃
出口温度 ６７℃
供給率 ３ｍＬ．分-1
噴霧圧力 ゲージ圧６バール（６ｂａｒｇ）
結果として生じた微粒子（４．０ｇ）をサイクロン収集ジャーから回収し、１７６℃で５５分間熱固定して不溶性にし（３．５ｇを生じる）、７．０ｇのマンニトールと混合し、５ｂａｒｇの流入圧力および３ｂａｒｇのミル圧力を有するアトライター６ｉｎ流体エネルギーミルを用いて解凝集した。
【０１８６】
１１．１．２ ＤＴＰＡａとの接合
調合された粒子をエタノールで湿潤させ、遠心分離（ソルヴァル（Ｓｏｒｖａｌｌ）ＲＴ６０００）によって水で完全に洗浄し、賦形剤のマンニトールを除去した。洗浄後、アリコートを乾燥重量測定のために採取し、（この測定を基準にして）ｒＨＡ粒子を水中２０ｇ．Ｌ-1に希釈した。ＤＴＰＡａ（０．３ｇの粒子につき１ｇ）を、約２５分間にわたって一定攪拌を行ないながらゆっくりと添加した。この間に、５ＭのＮａＯＨを添加し、ｐＨをできるだけ８．０の近くに維持した。攪拌は、最終ＤＴＰＡａ添加後３０分間続行し、ついでｐＨを５ＭのＨＣｌで７．０に調節した。ｒＨＡ−ＤＴＰＡ粒子を、遠心分離と８ｇ．Ｌ-1（当初乾燥重量を基準にして）への再懸濁によって、０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌで２回、水で２回洗浄し、最後に６０ｇ．Ｌ-1に再懸濁した。
【０１８７】
１１．１．３ Ｇｄでの標識
ｒＨＡ−ＤＴＰＡ粒子懸濁液の乾燥重量を測定し、ＤＴＰＡ標識による質量増加を決定すると、３２．４モル．モル-1ｒＨＡの値が得られた。Ｇｄ標識のために、この懸濁液のもう１つのアリコートを水で希釈し、０．１ＭのＧｄＣｌ3を一定攪拌を行ないながら添加して全体として２．５倍の希釈となり、乾燥重量測定によって決定されたＤＴＰＡレベルに等しい最終Ｇｄ濃度を生じた。混合を１０分間続行し、懸濁液を水でさらに１．５倍希釈し、ｒＨＡ−Ｇｄ粒子を遠心分離によって沈降させ、ペレットを水中に６０ｇ．Ｌ-1（当初乾燥重量を基準にして）に再懸濁した。その結果生じた懸濁液を、５０ｇ．Ｌ-1、５％（ｗ／ｖ）マンニトールへ調合し、凍結乾燥した。
【０１８８】
１１．２ 粒子の性質決定
１１．２．１ これらの粒子の磁気共鳴特性
磁気共鳴イメージングを、Ｇｄ−ＤＴＰＡ標識粒子に対して実施した。これらの粒子およびマグネビスト（登録商標）対照を、水で約２ｍＬに希釈し、ついで８ｍＬの０．５％アガロースと混合して、規定のＧｄ濃度を生じた。各サンプルについての緩和率（Ｒ１およびＲ２）を、実施例１に記載されているように決定した。
【０１８９】
ｒＨＡ−Ｇｄ粒子のｉｎ ｖｉｔｒｏＭＲＩ特性を、Ｇｄ−ＤＴＰＡをベースとする商用ＭＲＩ造影剤であるマグネビスト（登録商標）の特性と比較した。微粒子ｒＨＡ−Ｇｄでの緩和率（図９）は、マグネビスト（登録商標）を用いて得られたものと同等である（Ｒ１について）か、またはこれよりも有意に大きかった（Ｒ２について）。このことは、ｒＨＡ−Ｇｄ粒子が、特に微粒子材料に対して予測されたクリアランス率の顕著な減少から考えて、同じＧｄ濃度においてマグネビスト（登録商標）を用いて見られたものと同等であるか、これよりも良好なｉｎ ｖｉｖｏ画像を生成するはずであることを示した。あるいはまたこれは、これらの粒子を、マグネビスト（登録商標）よりも低いＧｄ用量で用いることができることを示唆した。
【０１９０】
１１．２．２ サイズ分布分析
この標識方法が、有意な凝集レベルを生じたかどうかを決定するために、クールターサイズ分析を行なった。図１０に示されている結果は、このサイズ分布（Ｇｄ−ＤＴＰＡ標識後）が有意に変わってはいなかったことを確認する。
【０１９１】
１１．２．３ 再懸濁特性
光学顕微鏡法（図１１）は、Ｇｄ−ＤＴＰＡ標識粒子が非凝集であり、再懸濁されて適切な懸濁液を生じることを確認した。
【実施例１２】
【０１９２】
ＭＲＩ造影剤での可溶性ｒＨＡの標識、ついで粒子の製造
この実施例は、粒子が予めＧｄ−キレートで標識されている可溶性ｒＨＡ分子から形成される、本発明の方法の変形例を例証する。
【０１９３】
１２．１ 方法
ｒＨＡの１．５ｇアリコートを、水中２０ｇ．Ｌ-1に希釈し、５ｇのＤＴＰＡａで処理し、約４０分間にわたって一定攪拌を行ないながら、ゆっくりと添加した。この間、５ＭのＮａＯＨを添加してｐＨを８．０のできるだけ近くに維持した。攪拌は、最終ＤＴＰＡａ添加後３０分間続行し、ついでｐＨを、５ＭのＨＣｌで７．０に調節した。
【０１９４】
標識された（＋ＤＴＰＡ）サンプルを１０．５Ｌの水に対して透析して、５時間後に交換して、全部で２１時間透析した。必要とされるＧｄ添加を評価するために、＋ＤＴＰＡサンプルの５ｍＬアリコートを、最初の持続的曇りに至るまで１ＭのＧｄＣｌ3で滴定した。これに基づいて、可溶性ｒＨＡで得られたＤＴＰＡレベルは、４７モル．モル-1であった。＋ＤＴＰＡサンプルのもう１つの５ｍＬアリコートを除去し、残りのサンプルを最初の持続的曇りに至るまで１ＭのＧｄＣｌ3で滴定し、未滴定アリコートを、あらゆる過剰Ｇｄを結合するために戻した。
【０１９５】
ついでＧｄ標識サンプルを０．２μｍで濾過して、あらゆる残留不溶性材料を除去した。これらのサンプルを、シュリック２流体ノズルを有するブキ・スプレードライヤーを用いて、入口温度１１０℃、噴霧圧力０．５バール、および供給率３．５ｍＬ．分-1でスプレー乾燥し、約７９℃の出口温度を生じた。収集されたサンプルの重さを測って、回収率を計算し、ついで１７５℃で全部で５時間半、熱固定した。
【０１９６】
ＤＴＰＡ標識の不存在下、ｒＨＡ粒子は１７５℃５５分の後で不溶である。しかしながらこれは、Ｇｄ標識サンプルの場合には当てはまらず、材料の不溶性を達成するために、追加の固定が必要とされた。
【実施例１３】
【０１９７】
微粒子ｒＨＡの遊離チオール含量
標的化された薬剤としての使用のために、これらの粒子が、ターゲッティング部分の化学的連結に適した反応性基を含有することが重要である。粒子形成材料としてのｒＨＡの場合、ｃｙｓ３４における遊離チオールはこの目的に非常に適した基である。この方法は、これらの粒子を不溶にするために用いられる高温熱固定にもかかわらず、これが反応のために依然として利用可能であることを確認するために、ｒＨＡ粒子の遊離チオール含量の測定について記載する。
【０１９８】
１３．１ ｒＨＡ粒子の調製
１００ｍＬの２５％（ｗ／ｖ）ｒＨＡを、２０Ｌの水に対して室温で一晩透析し、その結果生じたタンパク質濃度を、１ｇ．Ｌ-1吸光係数である０．５３を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度測定によって決定した。この透析されたタンパク質（２４．４ｇ）を、水で１２．５％（ｗ／ｖ）に希釈し、ＮａＯＨでｐＨ８．０に調節した。２７５ｍＬのエタノールを添加し、その結果生じた懸濁液を、入口温度１００℃、出口温度７２℃、流量３ｍＬ．分-1、および噴霧圧力６ｂａｒｇでスプレー乾燥した。生じた微粒子（１３．４ｇ）を１７５℃で１時間熱固定し（１１．１ｇを生じる）、２２．２ｇのマンニトールと混合し、入口圧力５ｂａｒｇおよびミル圧力３ｂａｒｇを有する流体エネルギーミルを２回通した。
【０１９９】
１３．２ 遊離チオールアッセイ
遊離チオール濃度は、放出された５−チオール−２−ニトロベンゾエートの吸光係数である１３６００Ｍ-1．ｃｍ-1を用いて、ｐＨ７でのＤＴＮＢとの反応、および４１２ｎｍにおける吸光度測定によって決定した。反応を室温で１時間実施し、これらの粒子は上澄み液への吸光度測定の前に遠心分離によって沈降させた。ＤＴＮＢの吸光度、および未沈降粒子からの残留濁度の両方について補正を行なった。測定された遊離チオールレベルは、０．３６モル．モル-1ｒＨＡであり、このことは、遊離チオールが熱固定工程によって完全には破壊されず、ターゲッティング部分の連結に適したレベルにおいて存在することを確認した。
【実施例１４】
【０２００】
粒子積載の最適化
最大の効果を得るために、この粒子が、薬剤（例えばＭＲＩへの使用のためのＧｄ3+）または核イメージングまたは治療における使用のための放射性金属の最大積載量を運ぶことが多くの場合重要である。この方法はｒＨＡ粒子に対するＧｄ3+結合能力の最適化について記載する。
【０２０１】
１４．１ ＤＴＰＡ−標識ｒＨＡ粒子の合成
ｒＨＡ粒子のアリコートを水中に懸濁し、ｐＨを５ＭのＮａＯＨの添加によってｐＨ８のできるだけ近くに維持しながら、様々な量のＤＴＰＡａ（約０．５〜５ｇ．ｇ-1ｒＨＡの範囲をカバーする）を、一定攪拌を行ないながらそれぞれ約１０〜４０分にわたって添加した。これらの懸濁液を、最終添加後約３０分間攪拌し、３ＭのＨＣｌでｐＨ７に調節した。すべてのサンプルを、遠心分離および再懸濁によって完全に洗浄し、未結合ＤＴＰＡを除去した。
【０２０２】
１４．２ Ｇｄ3+結合能力の測定
Ｇｄ3+結合能力はＸＯ指示薬を用いた錯滴定によって決定する。ｐＨを、適切な緩衝液（例えばヘキサミン）の使用によって、または適切なアルカリ（例えばＮａＯＨ）での調節によって、滴定の間ｐＨ５．０〜６．５の範囲内に制御する。ＸＯを、既知量のＤＴＰＡ標識ｒＨＡ粒子を含有する懸濁液へ添加し、滴定を、標準化ＧｄＣｌ3溶液を用いて最初の持続的色彩変化に至るまで実施する。
【実施例１５】
【０２０３】
微粒子ｒＨＡ誘導体における遊離チオール回収のための条件の開発
可溶性ｒＨＡでの結果（実施例４参照）は、ｒＨＡ遊離チオールがＤＴＰＡａとの反応によって大幅にブロックされることを示している。このチオールが架橋剤付着部位として用いられることになるならば、ｒＨＡ遊離チオールの回収が架橋剤との効率的な反応のために必要とされる。この方法は、ｒＨＡ粒子とＤＴＰＡａ（ＤＴＰＡ標識されたｒＨＡ粒子）との反応後、またはＧｄ3+（Ｇｄ標識されたｒＨＡ粒子）の結合後に、この目的を達成するための条件の開発について記載する。
【０２０４】
１５．１ 標識されたｒＨＡ粒子の合成
ＤＴＰＡ標識されたｒＨＡ粒子を、基本的に実施例１１に記載されているように作製する。Ｇｄ標識されたｒＨＡ粒子は、基本的には実施例１１に記載されているようにＤＴＰＡ標識されたｒＨＡ粒子から生成されてもよい。あるいはまたこれらは、実施例１４に記載されているように、ＸＯの存在下、ＧｄＣｌ3での錯滴定を用いて生成されてもよく、余剰Ｇｄ3+を結合するために滴定の最後にＤＴＰＡ標識されたｒＨＡ粒子のさらなる少量の添加をともなう。
【０２０５】
１５．２ 遊離チオールの回収
ＤＴＰＡ標識されたｒＨＡ粒子およびＧｄ標識されたｒＨＡ粒子の両方のアリコートをある範囲のｐＨ値および／またはある範囲の温度においてインキュベーションし、インキュベーションの開始時およびその後周期的にサンプルを採取した。これらを遊離チオールアッセイに付し、各粒子型での遊離チオールの回収のための最適条件を決定する。
【実施例１６】
【０２０６】
微粒子ｒＨＡ誘導体との架橋剤反応
本発明による方法において、ターゲッティング部分および粒子は各々、明確な生成物を生成するために、架橋剤反応のための独自の化学基を含有する。抗体ターゲッティング部分およびｒＨＡ粒子という特定の場合、これらの基はそれぞれ、炭水化物および遊離チオールである。この方法は、ＤＴＰＡ標識されたｒＨＡ粒子およびＧｄ標識されたｒＨＡ粒子と、これらの基との併用に適した２つの架橋剤（ＰＤＰＨおよびＥＭＣＨ）との反応について記載する。
【０２０７】
１６．１ 標識されたｒＨＡ粒子の合成
ＤＴＰＡ標識されたｒＨＡ粒子およびＧｄ標識されたｒＨＡ粒子の両方を、基本的に実施例１５に記載されているように合成し、遊離チオールを実施例１５において決定された最適条件を用いてアンブロックする。
【０２０８】
１６．２ ＰＤＰＨとの反応
標識ｒＨＡ粒子の両方の型のアリコートを、リン酸塩緩衝液の添加によってｐＨ約７で緩衝させる。サンプルを、ＰＤＰＨの添加の直前およびその後周期的に、利用可能な遊離チオール基よりも有意なモル過剰で採取する。これらのサンプルを直ちに遠心分離し、３４３ｎｍにおける上澄み液吸光度を測定する。測定値は、ＰＤＰＨそれ自体の吸光度および非沈降粒子からの残留濁度の両方について補正し、反応の程度を、放出された２−チオピリジンについての吸光係数である８０８０Ｍ-1．ｃｍ-1を用いて計算する。これらのデータは、ＰＤＰＨを各々の粒子型へ連結するための最適反応条件を決定するために用いる。
【０２０９】
１６．３ ＥＭＣＨとの反応
標識されたｒＨＡ粒子の両方の型のアリコートを、リン酸塩緩衝液の添加によって約ｐＨ７で緩衝させる。サンプルを、ＥＭＣＨの添加の直前およびその後周期的に、利用可能な遊離チオール基よりも有意なモル過剰で採取する。これらのサンプルを直ちに遠心分離し、ペレットを完全に洗浄して、遊離チオールアッセイの前に過剰ＥＭＣＨを除去する。これらのデータは、ＥＭＣＨを各々の粒子型へ連結するための最適反応条件を決定するために用いる。
【実施例１７】
【０２１０】
抗体／Ｇｄ標識されたｒＨＡ粒子の調製
合成における個々の工程の以前の開発に基づいて（実施例１１〜１６）、この方法は、標的された薬剤の調製であって、粒子（ｒＨＡ）を、ＤＴＰＡついでＧｄで高レベルに標識し、ついで抗体へ連結し、これを標的化されたＭＲＩ造影剤としての使用に適したものにする調製について記載する。
【０２１１】
１７．１ 架橋剤を用いた、および用いない、Ｇｄ標識されたｒＨＡ粒子の合成
Ｇｄ標識されたｒＨＡ粒子およびＧｄ標識されたｒＨＡ粒子＋架橋剤（ＰＤＰＨまたはＥＭＣＨ）を基本的に実施例１６に記載されているように合成する。ついでこれらの粒子を遠心分離および再懸濁によって完全に洗浄し、過剰な反応体を除去する。
【０２１２】
１７．２ 架橋剤を用いた、および用いない、過ヨウ素酸塩酸化された抗体の合成
過ヨウ素酸塩酸化された抗体を、基本的に実施例７に記載されているように、ＫｌＯ4での抗体のインキュベーション、ＰＤ１０クロマトグラフィー、および遠心濃縮によって合成する。ＰＤＰＨ架橋剤の過ヨウ素酸塩酸化された抗体への連結、およびその後のＰＤ１０クロマトグラフィー、および遠心濃縮もまた、基本的に実施例７に記載されているように実施する。ＥＭＣＨ架橋剤の連結も同様に実施することができる。
【０２１３】
１７．３ 抗体／Ｇｄ標識されたｒＨＡ粒子の合成
抗体／Ｇｄ標識されたｒＨＡ粒子は、反応体の次の３つの組合わせのいずれかをインキュベーションすることによって作製することができる。
【０２１４】
１．（Ｇｄ標識されたｒＨＡ粒子＋架橋剤）＋（過ヨウ素酸塩酸化された抗体）
２．（Ｇｄ標識されたｒＨＡ粒子）＋（過ヨウ素酸塩酸化された抗体＋架橋剤）
３．（Ｇｄ標識されたｒＨＡ粒子）＋（過ヨウ素酸塩酸化された抗体）＋（架橋剤）
どの合成経路が用いられても、結果として生じる粒子を遠心分離および再懸濁によって完全に洗浄し、過剰な反応体を除去する。
【実施例１８】
【０２１５】
抗体／ＤＴＰＡ標識されたｒＨＡ粒子の調製
この方法は、標的化された薬剤の調製であって、金属イオンを用いずに粒子（ｒＨＡ）を高レベルでＤＴＰＡで標識し、ついで抗体へ連結し、これを標的化された核イメージングまたは治療薬としての使用に適した放射性金属の積載に適したものにする調製について記載する。
【０２１６】
１８．１ 架橋剤を用いた、および用いない、ＤＴＰＡ標識されたｒＨＡ粒子の合成
ＤＴＰＡ標識されたｒＨＡ粒子およびＤＴＰＡ標識されたｒＨＡ粒子＋架橋剤（ＰＤＰＨまたはＥＭＣＨ）を、基本的に実施例１６に記載されているように合成する。ついでこれらの粒子を遠心分離および再懸濁によって完全に洗浄し、過剰な反応体を除去する。
【０２１７】
１８．２ 架橋剤を用いた、および用いない、過ヨウ素酸塩酸化された抗体の合成
過ヨウ素酸塩酸化された抗体を、基本的に実施例７に記載されているように、ＫｌＯ4での抗体のインキュベーション、ＰＤ１０クロマトグラフィー、および遠心濃縮によって合成する。ＰＤＰＨ架橋剤の過ヨウ素酸塩酸化された抗体への連結、およびその後のＰＤ１０クロマトグラフィーおよび遠心濃縮もまた、基本的に実施例７に記載されているように実施する。ＥＭＣＨ架橋剤の連結も同様に実施することができる。
【０２１８】
１８．３ 抗体／Ｇｄ標識されたｒＨＡ粒子の合成
抗体／ＤＴＰＡ標識されたｒＨＡ粒子は、反応体の次の３つの組合わせのいずれかをインキュベーションすることによって作製することができる。
【０２１９】
１．（ＤＴＰＡ標識されたｒＨＡ粒子＋架橋剤）＋（過ヨウ素酸塩酸化された抗体）
２．（ＤＴＰＡ標識されたｒＨＡ粒子）＋（過ヨウ素酸塩酸化された抗体＋架橋剤）
３．（ＤＴＰＡ標識されたｒＨＡ粒子）＋（過ヨウ素酸塩酸化された抗体）＋（架橋剤）
どの合成経路が用いられても、生じる粒子を遠心分離および再懸濁によって完全に洗浄し、過剰な反応体を除去する。
【図面の簡単な説明】
【０２２０】
【図１】ガドリニウム−ジエチレントリアミン五酢酸（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）で標識されたｒＨＡのｉｎ ｖｉｔｒｏでのＭＲＩ特性を示している。
【図２】ＤＴＰＡ標識されたアルブミンへの銅イオンの結合を示している。
【図３】反応において用いられているＤＴＰＡａの量の関数としての、ｒＨＡ−ＤＴＰＡ接合体のＧｄ3+−結合能を示している。
【図４】異なるクロマトグラフィー方法による、過剰ＤＴＰＡからのｒＨＡ−ＤＴＰＡの分離の実行可能性を示している。
【図５】ｒＨＡ−ＤＴＰＡおよびｒＨＡ−ＤＴＰＡ−Ｇｄのサンプル中の遊離チオールの回収を示している。
【図６】放出された２−チオピリジンの測定によって示されている、抗体とＰＤＰＨとの反応の程度を示している。
【図７】異なる抗体についての図６と同様なプロットである。
【図８】本発明による接合体についての結合活性の保持を示している。
【図９】Ｇｄ−ＤＴＰＡで標識されたｒＨＡ粒子のｉｎ ｖｉｔｒｏＭＲＩ特性を示している。
【図１０ａ】Ｇｄ−ＤＴＰＡでの標識の前のｒＨＡ粒子の粒子サイズ分布を示している。
【図１０ｂ】Ｇｄ−ＤＴＰＡでの標識の後のｒＨＡ粒子の粒子サイズ分布を示している。
【図１１】水中への再懸濁後にＧｄ−ＤＴＰＡで標識されたｒＨＡ粒子の顕微鏡写真である。
【０２２１】
省略形
αＣＤ４５ マウス抗ラットＣＤ４５
Ｃ５９５ ＭＵＣ１抗原に特異的なモノクローナル抗体
ＤＴＮＢ エルマン試薬（５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸））
ＤＴＰＡ ジエチレントリアミンペンタアセテート
ＤＴＰＡａ ジエチレントリアミン五酢酸無水物
ＤＴＴ ジチオトレイトール
ＥＭＣＨ Ｎ−（ε−マレイミドカプロン酸）ヒドラジド
ＧＰＨＰＬＣ ゲル浸透高速液体クロマトグラフィー
ＩｇＧ 免疫グロブリンＧ
Ｍａｂ モノクローナル抗体
ＭＲＩ 磁気共鳴イメージング
ＰＢＳ リン酸緩衝生理食塩水（０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、１５ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、５ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4）
ＰＤＰＨ ３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオニルヒドラジド
ｒＨＡ 組換えヒトアルブミン
ＸＯ キシレノールオレンジ
【図１−１】
【図１−２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
医療用イメージングにおける使用のための接合体であって、タンパク質分子またはタンパク質分子から形成された粒子の形態のキャリヤーを含み、前記キャリヤーが、造影剤またはその前駆体、および体内の特定の部位との親和性を有するターゲッティング部分へ結合されている接合体。
【請求項２】
磁気共鳴イメージングにおける使用のための、請求項１に記載の接合体。
【請求項３】
前記造影剤が常磁性金属イオンを含んでいる、請求項２に記載の接合体。
【請求項４】
前記金属イオンがＧｄ3+イオンを含んでいる、請求項３に記載の接合体。
【請求項５】
前記金属イオンが、キャリヤーに共有結合されているキレート部分を介してキャリヤーへ連結されている、請求項３または４に記載の接合体。
【請求項６】
核イメージングにおける使用のための、請求項１に記載の接合体。
【請求項７】
前記造影剤が、放射性金属イオンを含んでいる、請求項６に記載の接合体。
【請求項８】
前記放射性金属が、99mＴｃ、201Ｔｌ、および111Ｉｎからなる群から選択される、請求項７に記載の接合体。
【請求項９】
前記金属が、キャリヤーへ共有結合されているキレート部分を介してキャリヤーへ連結されている、請求項７または８に記載の接合体。
【請求項１０】
前記キレート部分が、キャリヤー中のアミン基と反応してアミド結合を形成するカルボキシル基またはその誘導体を含んでいる、請求項５または９に記載の接合体。
【請求項１１】
前記キレート部分が、複数のアミン基を含んでいる化合物の酢酸誘導体である、請求項１０に記載の接合体。
【請求項１２】
前記キレート部分が、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、およびこれらの誘導体からなる群から選択される、請求項１１に記載の接合体。
【請求項１３】
体への金属の送達のための接合体であって、
タンパク質分子またはタンパク質分子から形成された粒子の形態のキャリヤーを含み、
前記キャリヤーが、キレート剤を介して前記金属へ連結され、体内の特定の部位への親和性を有するターゲッティング部分へ接合されている、
接合体。
【請求項１４】
１０乃至１００個のキレート部分が各タンパク質分子へ連結されている、請求項５または請求項９乃至１３のいずれか１項に記載の接合体。
【請求項１５】
２０乃至６０個のキレート部分が各タンパク質分子へ連結されている、請求項１４に記載の接合体。
【請求項１６】
Ｘ線イメージングにおける使用のための、請求項１に記載の接合体。
【請求項１７】
前記造影剤がヨウ素化合物である、請求項１６に記載の接合体。
【請求項１８】
前記タンパク質分子が、完全または実質的に完全な単一のタンパク質分子である、前記いずれかの請求項に記載の接合体。
【請求項１９】
前記タンパク質分子が、接合された完全または実質的に完全なタンパク質分子のオリゴマーである、請求項１乃至１７のいずれか１項に記載の接合体。
【請求項２０】
前記オリゴマーが、２乃至２０の離散タンパク質分子、より好ましくは１０まで、または５までの離散タンパク質分子を含んでいる、請求項１９に記載の接合体。
【請求項２１】
前記タンパク質が、ヒトに由来するか、または構造がヒト起源のタンパク質と同一であるかまたは実質的に同一である、前記いずれかの請求項に記載の接合体。
【請求項２２】
前記タンパク質がアルブミンである、前記いずれかの請求項に記載の接合体。
【請求項２３】
前記アルブミンがヒト血清アルブミンである、請求項２２に記載の接合体。
【請求項２４】
前記アルブミンが組換えヒト血清アルブミンである、請求項２３に記載の接合体。
【請求項２５】
可溶性であり、前記キャリヤーがタンパク質分子を含んでいる、前記いずれかの請求項に記載の接合体。
【請求項２６】
前記キャリヤーが、タンパク質分子から形成された粒子の形態にある、請求項１乃至２４のいずれか１項に記載の接合体。
【請求項２７】
ターゲッティング部分が、抗体、ほかのタンパク質、およびペプチドからなる群から選択される、前記いずれかの請求項に記載の接合体。
【請求項２８】
前記ターゲッティング部分が抗体である、請求項２７に記載の接合体。
【請求項２９】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２８に記載の接合体。
【請求項３０】
前記キャリヤー分子が、ヘテロ二官能性架橋剤によってターゲッティング部分へ連結されている、前記いずれかの請求項に記載の接合体。
【請求項３１】
前記架橋剤が、キャリヤー上に存在しかつターゲッティング部分に存在しない官能基に特異的な１つの反応性、およびターゲッティング部分上に存在しかつキャリヤーに存在しない官能基に特異的なもう１つの反応性を有する、請求項３０に記載の接合体。
【請求項３２】
前記架橋剤が、キャリヤー上の−ＳＨ基へ反応性がある基を含んでいる、請求項３１に記載の接合体。
【請求項３３】
前記架橋剤が、マレイミド、２−ピリジルジチオ、ハロアセテート、ハロアセトアミド、アジリジン、アクリロイル／ビニル、４−ピリジルジチオ、および２−ニトロベンゾエート−５−ジチオからなる群から選択された基を含んでいる、請求項３２に記載の接合体。
【請求項３４】
前記架橋剤が、ターゲッティング部分上に存在する炭水化物部分またはその誘導体へ反応性がある基を含んでいる、請求項３１に記載の接合体。
【請求項３５】
前記架橋剤がヒドラジド基を含んでいる、請求項３４に記載の接合体。
【請求項３６】
前記架橋剤が、
マレイミドカプロン酸ヒドラジド；
３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオニルヒドラジド；
マレイミドプロピオン酸ヒドラジド；
Ｎ−（κ−マレイミドウンデカン酸）ヒドラジド；および
４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド
からなる群から選択される、請求項３０乃至３５のいずれか１項に記載の接合体。
【請求項３７】
１つより多いキャリヤーがターゲッティング部分へ連結されている、請求項２５に記載の接合体。
【請求項３８】
１つのターゲッティング部分につき２乃至１０個のキャリヤーを含んでいる、請求項３７に記載の接合体。
【請求項３９】
１つのターゲッティング部分につき２乃至５個のキャリヤーを含んでいる、請求項３８に記載の接合体。
【請求項４０】
前記ターゲッティング部分が抗体であり、抗体の定常部における連結部位を介してキャリヤーへ連結されている、前記いずれかの請求項に記載の接合体。
【請求項４１】
接合体中に存在する体への送達剤（またはその前駆体）の少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％が、キャリヤーへ共有結合されている、前記いずれかの請求項に記載の接合体。
【請求項４２】
競合結合アッセイにおいて測定された場合、遊離ターゲッティング部分の結合活性の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、または少なくとも９０％の、接合体中のターゲッティング部分の結合活性を有する、前記いずれかの請求項に記載の接合体。
【請求項４３】
前記いずれかの請求項に記載の接合体を、製薬的に許容しうる液体媒質と混合して含んでいる調合物。
【請求項４４】
前記液体媒質が水性である、請求項４３に記載の調合物。
【請求項４５】
キャリヤーを有する体への送達剤の標的化された接合体の調製方法であって、
（ａ）体への送達剤またはその前駆体とキャリヤーとを反応させて中間接合体を形成すること、およびその後
（ｂ）（ｉ）前記中間接合体とヘテロ二官能性架橋剤とを反応させて前記中間接合体を活性化させ、ついで前記活性化中間接合体とターゲッティング部分とを反応させること、または（ｉｉ）前記中間接合体と、ヘテロ二官能性架橋剤との反応によって活性化されているターゲッティング部分とを反応させること、または（ｉｉｉ）前記中間接合体、ヘテロ二官能性架橋剤、およびターゲッティング部分を、同時に互いに反応するようにさせること
を含む方法。
【請求項４６】
前記キャリヤー材料がタンパク質性である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記キャリヤー材料がアルブミンである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記アルブミンがヒト血清アルブミンである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記アルブミンが組換えヒト血清アルブミンである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記ターゲッティング部分が抗体である、請求項４５乃至４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記架橋剤が、キャリヤー上に存在しかつターゲッティング部分に存在しない基との反応に特異的な１つの官能性、およびターゲッティング部分上に存在しかつキャリヤーに存在しない基との反応に特異的な第二の官能性を有する、請求項４５乃至５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記架橋剤が、スルフヒドリル基と反応性がある基を含んでいる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記架橋剤が、マレイミド、２−ピリジルジチオ、ハロアセテート、ハロアセトアミド、アジリジン、アクリロイル／ビニル、４−ピリジルジチオ、および２−ニトロベンゾエート−５−ジチオからなる群から選択された基を含んでいる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記架橋剤が、炭水化物部分またはその誘導体と反応性がある基を含んでいる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記架橋剤がヒドラジド基を含んでいる、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
体への送達剤が、カルボキシル基を有するか、またはカルボキシル基を含有する中間体化合物または部分を介してキャリヤーへ連結されている、請求項４５乃至５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
工程（ｂ）の前に、キャリヤー上に存在するスルフヒドリル基のアンブロッキングが行なわれる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５８】
工程（ａ）がキャリヤーとキレート剤との反応を伴う、請求項４５乃至５７のいずれか１項に記載の方法であって、さらに、キャリヤー材料へ結合されたキレート剤と、反応混合物へ添加された金属イオンとの間のキレートの形成も含み、該反応混合物のｐＨが、前記金属イオンの添加の間、５．０乃至６．５に維持される方法。
【請求項５９】
前記キャリヤーが可溶性タンパク質分子を含んでいる、請求項４５乃至５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記キャリヤーが粒子である、請求項４５乃至５８のいずれか１項に記載の方法であって、粒子形成材料から粒子を形成する予備工程を含む方法。
【請求項６１】
前記粒子が、
ｉ）粒子形成材料の懸濁液を形成する工程；および
ｉｉ）前記懸濁液をスプレー乾燥する工程
を含む方法によって形成される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
粒子形成材料の懸濁液が、溶媒中に前記粒子形成材料を溶解し、ついで粒子形成材料のための非溶媒を添加して、粒子形成材料の沈殿をもたらすことによって形成される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
請求項１乃至４２のいずれか１項に記載の接合体の調製のための、請求項４５乃至６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
請求項４５乃至６３のいずれか１項に記載の方法によって調製された接合体。
【請求項６５】
医療用イメージング技術によって得られた画像のコントラストを向上させる方法であって、画像が得られる前に、請求項１乃至４２のいずれか１項または請求項６４に記載の接合体、または請求項４３乃至４４のいずれか１項に記載の調合物を、画像が得られることになるヒトまたは動物被験者へ投与することを含む方法。
【請求項６６】
医療用イメージング技術によって得られる画像のコントラストを向上させるための調合物の製造における、請求項１乃至４２のいずれか１項または請求項６４に記載の接合体の使用。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
医療用イメージングにおける使用のための接合体であって、
タンパク質分子またはタンパク質分子から形成された粒子の形態のキャリヤーを含み、
前記キャリヤーが、造影剤またはその前駆体、および体内の特定の部位との親和性を有するターゲッティング部分へ結合されており、
前記キャリヤー分子が、キャリヤー上に存在しかつターゲッティング部分上に存在しない官能基に特異的な１つの反応性、およびターゲッティング部分上に存在しかつキャリヤーに存在しない官能基に特異的なもう１つの反応性を有するヘテロ二官能性架橋剤によって、ターゲッティング部分へ連結される
接合体。
【請求項２】
磁気共鳴イメージングにおける使用のための、請求項１に記載の接合体。
【請求項３】
前記造影剤が常磁性金属イオンを含んでいる、請求項２に記載の接合体。
【請求項４】
前記金属イオンがＧｄ3+イオンを含んでいる、請求項３に記載の接合体。
【請求項５】
前記金属イオンが、キャリヤーに共有結合されているキレート部分を介してキャリヤーへ連結されている、請求項３または４に記載の接合体。
【請求項６】
核イメージングにおける使用のための、請求項１に記載の接合体。
【請求項７】
前記造影剤が、放射性金属イオンを含んでいる、請求項６に記載の接合体。
【請求項８】
前記放射性金属が、99mＴｃ、201Ｔｌ、および111Ｉｎからなる群から選択される、請求項７に記載の接合体。
【請求項９】
前記金属が、キャリヤーへ共有結合されているキレート部分を介してキャリヤーへ連結されている、請求項７または８に記載の接合体。
【請求項１０】
前記キレート部分が、キャリヤー中のアミン基と反応してアミド結合を形成するカルボキシル基またはその誘導体を含んでいる、請求項５または９に記載の接合体。
【請求項１１】
前記キレート部分が、複数のアミン基を含んでいる化合物の酢酸誘導体である、請求項１０に記載の接合体。
【請求項１２】
前記キレート部分が、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、およびこれらの誘導体からなる群から選択される、請求項１１に記載の接合体。
【請求項１３】
体への金属の送達のための接合体であって、
タンパク質分子またはタンパク質分子から形成された粒子の形態のキャリヤーを含み、
前記キャリヤーが、キレート剤を介して前記金属へ連結され、体内の特定の部位への親和性を有するターゲッティング部分へ接合されている、
接合体。
【請求項１４】
１０乃至１００個のキレート部分が各タンパク質分子へ連結されている、請求項５または請求項９乃至１３のいずれか１項に記載の接合体。
【請求項１５】
２０乃至６０個のキレート部分が各タンパク質分子へ連結されている、請求項１４に記載の接合体。
【請求項１６】
Ｘ線イメージングにおける使用のための、請求項１に記載の接合体。
【請求項１７】
前記造影剤がヨウ素化合物である、請求項１６に記載の接合体。
【請求項１８】
前記タンパク質分子が、完全または実質的に完全な単一のタンパク質分子である、前記いずれかの請求項に記載の接合体。
【請求項１９】
前記タンパク質分子が、接合された完全または実質的に完全なタンパク質分子のオリゴマーである、請求項１乃至１７のいずれか１項に記載の接合体。
【請求項２０】
前記オリゴマーが、２乃至２０の離散タンパク質分子、より好ましくは１０まで、または５までの離散タンパク質分子を含んでいる、請求項１９に記載の接合体。
【請求項２１】
前記タンパク質が、ヒトに由来するか、または構造がヒト起源のタンパク質と同一であるかまたは実質的に同一である、前記いずれかの請求項に記載の接合体。
【請求項２２】
前記タンパク質がアルブミンである、前記いずれかの請求項に記載の接合体。
【請求項２３】
前記アルブミンがヒト血清アルブミンである、請求項２２に記載の接合体。
【請求項２４】
前記アルブミンが組換えヒト血清アルブミンである、請求項２３に記載の接合体。
【請求項２５】
可溶性であり、前記キャリヤーがタンパク質分子を含んでいる、前記いずれかの請求項に記載の接合体。
【請求項２６】
前記キャリヤーが、タンパク質分子から形成された粒子の形態にある、請求項１乃至２４のいずれか１項に記載の接合体。
【請求項２７】
ターゲッティング部分が、抗体、ほかのタンパク質、およびペプチドからなる群から選択される、前記いずれかの請求項に記載の接合体。
【請求項２８】
前記ターゲッティング部分が抗体である、請求項２７に記載の接合体。
【請求項２９】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２８に記載の接合体。
【請求項３０】
前記架橋剤が、キャリヤー上の−ＳＨ基へ反応性がある基を含んでいる、前記いずれかの請求項に記載の接合体。
【請求項３１】
前記架橋剤が、マレイミド、２−ピリジルジチオ、ハロアセテート、ハロアセトアミド、アジリジン、アクリロイル／ビニル、４−ピリジルジチオ、および２−ニトロベンゾエート−５−ジチオからなる群から選択された基を含んでいる、請求項３０に記載の接合体。
【請求項３２】
前記架橋剤が、ターゲッティング部分上に存在する炭水化物部分またはその誘導体への反応性を有する基を含んでいる、前記いずれかの請求項に記載の接合体。
【請求項３３】
前記架橋剤がヒドラジド基を含んでいる、請求項３２に記載の接合体。
【請求項３４】
前記架橋剤が、
マレイミドカプロン酸ヒドラジド；
３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオニルヒドラジド；
マレイミドプロピオン酸ヒドラジド；
Ｎ−（κ−マレイミドウンデカン酸）ヒドラジド；および
４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド
からなる群から選択される、請求項３０乃至３３のいずれか１項に記載の接合体。
【請求項３５】
１つより多いキャリヤーがターゲッティング部分へ連結されている、請求項２５に記載の接合体。
【請求項３６】
１つのターゲッティング部分につき２乃至１０個のキャリヤーを含んでいる、請求項３５に記載の接合体。
【請求項３７】
１つのターゲッティング部分につき２乃至５個のキャリヤーを含んでいる、請求項３６に記載の接合体。
【請求項３８】
前記ターゲッティング部分が抗体であり、抗体の定常部中の連結部位を介してキャリヤーへ連結されている、前記いずれかの請求項に記載の接合体。
【請求項３９】
接合体中に存在する体への送達剤（またはその前駆体）の少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％が、キャリヤーへ共有結合されている、前記いずれかの請求項に記載の接合体。
【請求項４０】
競合結合アッセイにおいて測定された場合、遊離ターゲッティング部分の結合活性の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、または少なくとも９０％の、接合体中のターゲッティング部分の結合活性を有する、前記いずれかの請求項に記載の接合体。
【請求項４１】
前記いずれかの請求項に記載の接合体を、製薬的に許容しうる液体媒質と混合して含んでいる調合物。
【請求項４２】
前記液体媒質が水性である、請求項４１に記載の調合物。
【請求項４３】
キャリヤーを有する体への送達剤の標的化された接合体の調製方法であって、
（ａ）体への送達剤またはその前駆体とキャリヤーとを反応させて中間接合体を形成すること、およびその後
（ｂ）（ｉ）前記中間接合体とヘテロ二官能性架橋剤とを反応させて前記中間接合体を活性化させ、ついで前記活性化中間接合体とターゲッティング部分とを反応させること、または（ｉｉ）前記中間接合体と、ヘテロ二官能性架橋剤との反応によって活性化されているターゲッティング部分とを反応させること、または（ｉｉｉ）前記中間接合体、ヘテロ二官能性架橋剤、およびターゲッティング部分を、同時に互いに反応するようにさせることを含み、
前記架橋剤が、キャリヤー上に存在しかつターゲッティング部分に存在しない基との反応に特異的な１つの官能性、およびターゲッティング部分上に存在しかつキャリヤーに存在しない基との反応に特異的な第二の官能性を有する
キャリヤーを有する体への送達剤の標的化された接合体の調製方法。
【請求項４４】
前記キャリヤー材料がタンパク質性である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記キャリヤー材料がアルブミンである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記アルブミンがヒト血清アルブミンである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記アルブミンが組換えヒト血清アルブミンである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ターゲッティング部分が抗体である、請求項４３乃至４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記架橋剤が、スルフヒドリル基との反応性を有する基を含んでいる、請求項４３乃至４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記架橋剤が、マレイミド、２−ピリジルジチオ、ハロアセテート、ハロアセトアミド、アジリジン、アクリロイル／ビニル、４−ピリジルジチオ、および２−ニトロベンゾエート−５−ジチオからなる群から選択された基を含んでいる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記架橋剤が、炭水化物部分またはその誘導体と反応性がある基を含んでいる、請求項４３乃至４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記架橋剤が、ヒドラジド基を含んでいる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
体への送達剤が、カルボキシル基を有するか、またはカルボキシル基を含有する中間体化合物または部分を介してキャリヤーと連結されている、請求項４３乃至５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
工程（ｂ）の前に、キャリヤー上に存在するスルフヒドリル基のアンブロッキングが行なわれる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
工程（ａ）が、キャリヤーとキレート剤との反応を伴う、請求項４３乃至５４のいずれか１項に記載の方法であって、
さらに、キャリヤー材料へ結合されたキレート剤と、反応混合物へ添加された金属イオンとの間のキレートを形成することも含み、
該反応混合物のｐＨが、前記金属イオンの添加の間、５．０乃至６．５に維持される
請求項４３乃至５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記キャリヤーが可溶性タンパク質分子を含んでいる、請求項４３乃至５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記キャリヤーが粒子である、請求項４３乃至５５のいずれか１項に記載の方法であって、粒子形成材料から粒子を形成する予備工程を含む、請求項４３乃至５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記粒子が、
ｉ）粒子形成材料の懸濁液を形成する工程；および
ｉｉ）前記懸濁液をスプレー乾燥する工程
を含む方法によって形成される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
粒子形成材料の懸濁液が、溶媒中に粒子形成材料を溶解し、ついで粒子形成材料のための非溶媒を添加して、粒子形成材料の沈殿をもたらすことによって形成される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
請求項１乃至４０のいずれか１項に記載の接合体の調製のための、請求項４３乃至５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
請求項４３乃至６０のいずれか１項に記載の方法によって調製される接合体。
【請求項６２】
医療用イメージング技術によって得られた画像のコントラストを向上させる方法であって、画像が得られる前に、請求項１乃至４０のいずれか１項または請求項６１に記載の接合体、または請求項４１乃至４２のいずれか１項に記載の調合物を、画像が得られることになるヒトまたは動物被験者へ投与することを含む、医療用イメージング技術によって得られた画像のコントラストを向上させる方法。
【請求項６３】
医療用イメージング技術によって得られることになる画像のコントラストを向上させるための調合物の製造における、請求項１乃至４０のいずれか１項または請求項６１に記載の接合体の使用。
【請求項１】
医療用イメージングにおける使用のための接合体であって、タンパク質分子またはタンパク質分子から形成された粒子の形態のキャリヤーを含み、前記キャリヤーが、造影剤またはその前駆体、および体内の特定の部位との親和性を有するターゲッティング部分へ結合されている接合体。
【請求項２】
磁気共鳴イメージングにおける使用のための、請求項１に記載の接合体。
【請求項３】
前記造影剤が常磁性金属イオンを含んでいる、請求項２に記載の接合体。
【請求項４】
前記金属イオンがＧｄ3+イオンを含んでいる、請求項３に記載の接合体。
【請求項５】
前記金属イオンが、キャリヤーに共有結合されているキレート部分を介してキャリヤーへ連結されている、請求項３または４に記載の接合体。
【請求項６】
核イメージングにおける使用のための、請求項１に記載の接合体。
【請求項７】
前記造影剤が、放射性金属イオンを含んでいる、請求項６に記載の接合体。
【請求項８】
前記放射性金属が、99mＴｃ、201Ｔｌ、および111Ｉｎからなる群から選択される、請求項７に記載の接合体。
【請求項９】
前記金属が、キャリヤーへ共有結合されているキレート部分を介してキャリヤーへ連結されている、請求項７または８に記載の接合体。
【請求項１０】
前記キレート部分が、キャリヤー中のアミン基と反応してアミド結合を形成するカルボキシル基またはその誘導体を含んでいる、請求項５または９に記載の接合体。
【請求項１１】
前記キレート部分が、複数のアミン基を含んでいる化合物の酢酸誘導体である、請求項１０に記載の接合体。
【請求項１２】
前記キレート部分が、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、およびこれらの誘導体からなる群から選択される、請求項１１に記載の接合体。
【請求項１３】
体への金属の送達のための接合体であって、
タンパク質分子またはタンパク質分子から形成された粒子の形態のキャリヤーを含み、
前記キャリヤーが、キレート剤を介して前記金属へ連結され、体内の特定の部位への親和性を有するターゲッティング部分へ接合されている、
接合体。
【請求項１４】
１０乃至１００個のキレート部分が各タンパク質分子へ連結されている、請求項５または請求項９乃至１３のいずれか１項に記載の接合体。
【請求項１５】
２０乃至６０個のキレート部分が各タンパク質分子へ連結されている、請求項１４に記載の接合体。
【請求項１６】
Ｘ線イメージングにおける使用のための、請求項１に記載の接合体。
【請求項１７】
前記造影剤がヨウ素化合物である、請求項１６に記載の接合体。
【請求項１８】
前記タンパク質分子が、完全または実質的に完全な単一のタンパク質分子である、前記いずれかの請求項に記載の接合体。
【請求項１９】
前記タンパク質分子が、接合された完全または実質的に完全なタンパク質分子のオリゴマーである、請求項１乃至１７のいずれか１項に記載の接合体。
【請求項２０】
前記オリゴマーが、２乃至２０の離散タンパク質分子、より好ましくは１０まで、または５までの離散タンパク質分子を含んでいる、請求項１９に記載の接合体。
【請求項２１】
前記タンパク質が、ヒトに由来するか、または構造がヒト起源のタンパク質と同一であるかまたは実質的に同一である、前記いずれかの請求項に記載の接合体。
【請求項２２】
前記タンパク質がアルブミンである、前記いずれかの請求項に記載の接合体。
【請求項２３】
前記アルブミンがヒト血清アルブミンである、請求項２２に記載の接合体。
【請求項２４】
前記アルブミンが組換えヒト血清アルブミンである、請求項２３に記載の接合体。
【請求項２５】
可溶性であり、前記キャリヤーがタンパク質分子を含んでいる、前記いずれかの請求項に記載の接合体。
【請求項２６】
前記キャリヤーが、タンパク質分子から形成された粒子の形態にある、請求項１乃至２４のいずれか１項に記載の接合体。
【請求項２７】
ターゲッティング部分が、抗体、ほかのタンパク質、およびペプチドからなる群から選択される、前記いずれかの請求項に記載の接合体。
【請求項２８】
前記ターゲッティング部分が抗体である、請求項２７に記載の接合体。
【請求項２９】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２８に記載の接合体。
【請求項３０】
前記キャリヤー分子が、ヘテロ二官能性架橋剤によってターゲッティング部分へ連結されている、前記いずれかの請求項に記載の接合体。
【請求項３１】
前記架橋剤が、キャリヤー上に存在しかつターゲッティング部分に存在しない官能基に特異的な１つの反応性、およびターゲッティング部分上に存在しかつキャリヤーに存在しない官能基に特異的なもう１つの反応性を有する、請求項３０に記載の接合体。
【請求項３２】
前記架橋剤が、キャリヤー上の−ＳＨ基へ反応性がある基を含んでいる、請求項３１に記載の接合体。
【請求項３３】
前記架橋剤が、マレイミド、２−ピリジルジチオ、ハロアセテート、ハロアセトアミド、アジリジン、アクリロイル／ビニル、４−ピリジルジチオ、および２−ニトロベンゾエート−５−ジチオからなる群から選択された基を含んでいる、請求項３２に記載の接合体。
【請求項３４】
前記架橋剤が、ターゲッティング部分上に存在する炭水化物部分またはその誘導体へ反応性がある基を含んでいる、請求項３１に記載の接合体。
【請求項３５】
前記架橋剤がヒドラジド基を含んでいる、請求項３４に記載の接合体。
【請求項３６】
前記架橋剤が、
マレイミドカプロン酸ヒドラジド；
３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオニルヒドラジド；
マレイミドプロピオン酸ヒドラジド；
Ｎ−（κ−マレイミドウンデカン酸）ヒドラジド；および
４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド
からなる群から選択される、請求項３０乃至３５のいずれか１項に記載の接合体。
【請求項３７】
１つより多いキャリヤーがターゲッティング部分へ連結されている、請求項２５に記載の接合体。
【請求項３８】
１つのターゲッティング部分につき２乃至１０個のキャリヤーを含んでいる、請求項３７に記載の接合体。
【請求項３９】
１つのターゲッティング部分につき２乃至５個のキャリヤーを含んでいる、請求項３８に記載の接合体。
【請求項４０】
前記ターゲッティング部分が抗体であり、抗体の定常部における連結部位を介してキャリヤーへ連結されている、前記いずれかの請求項に記載の接合体。
【請求項４１】
接合体中に存在する体への送達剤（またはその前駆体）の少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％が、キャリヤーへ共有結合されている、前記いずれかの請求項に記載の接合体。
【請求項４２】
競合結合アッセイにおいて測定された場合、遊離ターゲッティング部分の結合活性の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、または少なくとも９０％の、接合体中のターゲッティング部分の結合活性を有する、前記いずれかの請求項に記載の接合体。
【請求項４３】
前記いずれかの請求項に記載の接合体を、製薬的に許容しうる液体媒質と混合して含んでいる調合物。
【請求項４４】
前記液体媒質が水性である、請求項４３に記載の調合物。
【請求項４５】
キャリヤーを有する体への送達剤の標的化された接合体の調製方法であって、
（ａ）体への送達剤またはその前駆体とキャリヤーとを反応させて中間接合体を形成すること、およびその後
（ｂ）（ｉ）前記中間接合体とヘテロ二官能性架橋剤とを反応させて前記中間接合体を活性化させ、ついで前記活性化中間接合体とターゲッティング部分とを反応させること、または（ｉｉ）前記中間接合体と、ヘテロ二官能性架橋剤との反応によって活性化されているターゲッティング部分とを反応させること、または（ｉｉｉ）前記中間接合体、ヘテロ二官能性架橋剤、およびターゲッティング部分を、同時に互いに反応するようにさせること
を含む方法。
【請求項４６】
前記キャリヤー材料がタンパク質性である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記キャリヤー材料がアルブミンである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記アルブミンがヒト血清アルブミンである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記アルブミンが組換えヒト血清アルブミンである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記ターゲッティング部分が抗体である、請求項４５乃至４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記架橋剤が、キャリヤー上に存在しかつターゲッティング部分に存在しない基との反応に特異的な１つの官能性、およびターゲッティング部分上に存在しかつキャリヤーに存在しない基との反応に特異的な第二の官能性を有する、請求項４５乃至５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記架橋剤が、スルフヒドリル基と反応性がある基を含んでいる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記架橋剤が、マレイミド、２−ピリジルジチオ、ハロアセテート、ハロアセトアミド、アジリジン、アクリロイル／ビニル、４−ピリジルジチオ、および２−ニトロベンゾエート−５−ジチオからなる群から選択された基を含んでいる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記架橋剤が、炭水化物部分またはその誘導体と反応性がある基を含んでいる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記架橋剤がヒドラジド基を含んでいる、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
体への送達剤が、カルボキシル基を有するか、またはカルボキシル基を含有する中間体化合物または部分を介してキャリヤーへ連結されている、請求項４５乃至５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
工程（ｂ）の前に、キャリヤー上に存在するスルフヒドリル基のアンブロッキングが行なわれる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５８】
工程（ａ）がキャリヤーとキレート剤との反応を伴う、請求項４５乃至５７のいずれか１項に記載の方法であって、さらに、キャリヤー材料へ結合されたキレート剤と、反応混合物へ添加された金属イオンとの間のキレートの形成も含み、該反応混合物のｐＨが、前記金属イオンの添加の間、５．０乃至６．５に維持される方法。
【請求項５９】
前記キャリヤーが可溶性タンパク質分子を含んでいる、請求項４５乃至５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記キャリヤーが粒子である、請求項４５乃至５８のいずれか１項に記載の方法であって、粒子形成材料から粒子を形成する予備工程を含む方法。
【請求項６１】
前記粒子が、
ｉ）粒子形成材料の懸濁液を形成する工程；および
ｉｉ）前記懸濁液をスプレー乾燥する工程
を含む方法によって形成される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
粒子形成材料の懸濁液が、溶媒中に前記粒子形成材料を溶解し、ついで粒子形成材料のための非溶媒を添加して、粒子形成材料の沈殿をもたらすことによって形成される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
請求項１乃至４２のいずれか１項に記載の接合体の調製のための、請求項４５乃至６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
請求項４５乃至６３のいずれか１項に記載の方法によって調製された接合体。
【請求項６５】
医療用イメージング技術によって得られた画像のコントラストを向上させる方法であって、画像が得られる前に、請求項１乃至４２のいずれか１項または請求項６４に記載の接合体、または請求項４３乃至４４のいずれか１項に記載の調合物を、画像が得られることになるヒトまたは動物被験者へ投与することを含む方法。
【請求項６６】
医療用イメージング技術によって得られる画像のコントラストを向上させるための調合物の製造における、請求項１乃至４２のいずれか１項または請求項６４に記載の接合体の使用。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
医療用イメージングにおける使用のための接合体であって、
タンパク質分子またはタンパク質分子から形成された粒子の形態のキャリヤーを含み、
前記キャリヤーが、造影剤またはその前駆体、および体内の特定の部位との親和性を有するターゲッティング部分へ結合されており、
前記キャリヤー分子が、キャリヤー上に存在しかつターゲッティング部分上に存在しない官能基に特異的な１つの反応性、およびターゲッティング部分上に存在しかつキャリヤーに存在しない官能基に特異的なもう１つの反応性を有するヘテロ二官能性架橋剤によって、ターゲッティング部分へ連結される
接合体。
【請求項２】
磁気共鳴イメージングにおける使用のための、請求項１に記載の接合体。
【請求項３】
前記造影剤が常磁性金属イオンを含んでいる、請求項２に記載の接合体。
【請求項４】
前記金属イオンがＧｄ3+イオンを含んでいる、請求項３に記載の接合体。
【請求項５】
前記金属イオンが、キャリヤーに共有結合されているキレート部分を介してキャリヤーへ連結されている、請求項３または４に記載の接合体。
【請求項６】
核イメージングにおける使用のための、請求項１に記載の接合体。
【請求項７】
前記造影剤が、放射性金属イオンを含んでいる、請求項６に記載の接合体。
【請求項８】
前記放射性金属が、99mＴｃ、201Ｔｌ、および111Ｉｎからなる群から選択される、請求項７に記載の接合体。
【請求項９】
前記金属が、キャリヤーへ共有結合されているキレート部分を介してキャリヤーへ連結されている、請求項７または８に記載の接合体。
【請求項１０】
前記キレート部分が、キャリヤー中のアミン基と反応してアミド結合を形成するカルボキシル基またはその誘導体を含んでいる、請求項５または９に記載の接合体。
【請求項１１】
前記キレート部分が、複数のアミン基を含んでいる化合物の酢酸誘導体である、請求項１０に記載の接合体。
【請求項１２】
前記キレート部分が、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、およびこれらの誘導体からなる群から選択される、請求項１１に記載の接合体。
【請求項１３】
体への金属の送達のための接合体であって、
タンパク質分子またはタンパク質分子から形成された粒子の形態のキャリヤーを含み、
前記キャリヤーが、キレート剤を介して前記金属へ連結され、体内の特定の部位への親和性を有するターゲッティング部分へ接合されている、
接合体。
【請求項１４】
１０乃至１００個のキレート部分が各タンパク質分子へ連結されている、請求項５または請求項９乃至１３のいずれか１項に記載の接合体。
【請求項１５】
２０乃至６０個のキレート部分が各タンパク質分子へ連結されている、請求項１４に記載の接合体。
【請求項１６】
Ｘ線イメージングにおける使用のための、請求項１に記載の接合体。
【請求項１７】
前記造影剤がヨウ素化合物である、請求項１６に記載の接合体。
【請求項１８】
前記タンパク質分子が、完全または実質的に完全な単一のタンパク質分子である、前記いずれかの請求項に記載の接合体。
【請求項１９】
前記タンパク質分子が、接合された完全または実質的に完全なタンパク質分子のオリゴマーである、請求項１乃至１７のいずれか１項に記載の接合体。
【請求項２０】
前記オリゴマーが、２乃至２０の離散タンパク質分子、より好ましくは１０まで、または５までの離散タンパク質分子を含んでいる、請求項１９に記載の接合体。
【請求項２１】
前記タンパク質が、ヒトに由来するか、または構造がヒト起源のタンパク質と同一であるかまたは実質的に同一である、前記いずれかの請求項に記載の接合体。
【請求項２２】
前記タンパク質がアルブミンである、前記いずれかの請求項に記載の接合体。
【請求項２３】
前記アルブミンがヒト血清アルブミンである、請求項２２に記載の接合体。
【請求項２４】
前記アルブミンが組換えヒト血清アルブミンである、請求項２３に記載の接合体。
【請求項２５】
可溶性であり、前記キャリヤーがタンパク質分子を含んでいる、前記いずれかの請求項に記載の接合体。
【請求項２６】
前記キャリヤーが、タンパク質分子から形成された粒子の形態にある、請求項１乃至２４のいずれか１項に記載の接合体。
【請求項２７】
ターゲッティング部分が、抗体、ほかのタンパク質、およびペプチドからなる群から選択される、前記いずれかの請求項に記載の接合体。
【請求項２８】
前記ターゲッティング部分が抗体である、請求項２７に記載の接合体。
【請求項２９】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２８に記載の接合体。
【請求項３０】
前記架橋剤が、キャリヤー上の−ＳＨ基へ反応性がある基を含んでいる、前記いずれかの請求項に記載の接合体。
【請求項３１】
前記架橋剤が、マレイミド、２−ピリジルジチオ、ハロアセテート、ハロアセトアミド、アジリジン、アクリロイル／ビニル、４−ピリジルジチオ、および２−ニトロベンゾエート−５−ジチオからなる群から選択された基を含んでいる、請求項３０に記載の接合体。
【請求項３２】
前記架橋剤が、ターゲッティング部分上に存在する炭水化物部分またはその誘導体への反応性を有する基を含んでいる、前記いずれかの請求項に記載の接合体。
【請求項３３】
前記架橋剤がヒドラジド基を含んでいる、請求項３２に記載の接合体。
【請求項３４】
前記架橋剤が、
マレイミドカプロン酸ヒドラジド；
３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオニルヒドラジド；
マレイミドプロピオン酸ヒドラジド；
Ｎ−（κ−マレイミドウンデカン酸）ヒドラジド；および
４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド
からなる群から選択される、請求項３０乃至３３のいずれか１項に記載の接合体。
【請求項３５】
１つより多いキャリヤーがターゲッティング部分へ連結されている、請求項２５に記載の接合体。
【請求項３６】
１つのターゲッティング部分につき２乃至１０個のキャリヤーを含んでいる、請求項３５に記載の接合体。
【請求項３７】
１つのターゲッティング部分につき２乃至５個のキャリヤーを含んでいる、請求項３６に記載の接合体。
【請求項３８】
前記ターゲッティング部分が抗体であり、抗体の定常部中の連結部位を介してキャリヤーへ連結されている、前記いずれかの請求項に記載の接合体。
【請求項３９】
接合体中に存在する体への送達剤（またはその前駆体）の少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％が、キャリヤーへ共有結合されている、前記いずれかの請求項に記載の接合体。
【請求項４０】
競合結合アッセイにおいて測定された場合、遊離ターゲッティング部分の結合活性の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、または少なくとも９０％の、接合体中のターゲッティング部分の結合活性を有する、前記いずれかの請求項に記載の接合体。
【請求項４１】
前記いずれかの請求項に記載の接合体を、製薬的に許容しうる液体媒質と混合して含んでいる調合物。
【請求項４２】
前記液体媒質が水性である、請求項４１に記載の調合物。
【請求項４３】
キャリヤーを有する体への送達剤の標的化された接合体の調製方法であって、
（ａ）体への送達剤またはその前駆体とキャリヤーとを反応させて中間接合体を形成すること、およびその後
（ｂ）（ｉ）前記中間接合体とヘテロ二官能性架橋剤とを反応させて前記中間接合体を活性化させ、ついで前記活性化中間接合体とターゲッティング部分とを反応させること、または（ｉｉ）前記中間接合体と、ヘテロ二官能性架橋剤との反応によって活性化されているターゲッティング部分とを反応させること、または（ｉｉｉ）前記中間接合体、ヘテロ二官能性架橋剤、およびターゲッティング部分を、同時に互いに反応するようにさせることを含み、
前記架橋剤が、キャリヤー上に存在しかつターゲッティング部分に存在しない基との反応に特異的な１つの官能性、およびターゲッティング部分上に存在しかつキャリヤーに存在しない基との反応に特異的な第二の官能性を有する
キャリヤーを有する体への送達剤の標的化された接合体の調製方法。
【請求項４４】
前記キャリヤー材料がタンパク質性である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記キャリヤー材料がアルブミンである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記アルブミンがヒト血清アルブミンである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記アルブミンが組換えヒト血清アルブミンである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ターゲッティング部分が抗体である、請求項４３乃至４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記架橋剤が、スルフヒドリル基との反応性を有する基を含んでいる、請求項４３乃至４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記架橋剤が、マレイミド、２−ピリジルジチオ、ハロアセテート、ハロアセトアミド、アジリジン、アクリロイル／ビニル、４−ピリジルジチオ、および２−ニトロベンゾエート−５−ジチオからなる群から選択された基を含んでいる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記架橋剤が、炭水化物部分またはその誘導体と反応性がある基を含んでいる、請求項４３乃至４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記架橋剤が、ヒドラジド基を含んでいる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
体への送達剤が、カルボキシル基を有するか、またはカルボキシル基を含有する中間体化合物または部分を介してキャリヤーと連結されている、請求項４３乃至５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
工程（ｂ）の前に、キャリヤー上に存在するスルフヒドリル基のアンブロッキングが行なわれる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
工程（ａ）が、キャリヤーとキレート剤との反応を伴う、請求項４３乃至５４のいずれか１項に記載の方法であって、
さらに、キャリヤー材料へ結合されたキレート剤と、反応混合物へ添加された金属イオンとの間のキレートを形成することも含み、
該反応混合物のｐＨが、前記金属イオンの添加の間、５．０乃至６．５に維持される
請求項４３乃至５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記キャリヤーが可溶性タンパク質分子を含んでいる、請求項４３乃至５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記キャリヤーが粒子である、請求項４３乃至５５のいずれか１項に記載の方法であって、粒子形成材料から粒子を形成する予備工程を含む、請求項４３乃至５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記粒子が、
ｉ）粒子形成材料の懸濁液を形成する工程；および
ｉｉ）前記懸濁液をスプレー乾燥する工程
を含む方法によって形成される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
粒子形成材料の懸濁液が、溶媒中に粒子形成材料を溶解し、ついで粒子形成材料のための非溶媒を添加して、粒子形成材料の沈殿をもたらすことによって形成される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
請求項１乃至４０のいずれか１項に記載の接合体の調製のための、請求項４３乃至５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
請求項４３乃至６０のいずれか１項に記載の方法によって調製される接合体。
【請求項６２】
医療用イメージング技術によって得られた画像のコントラストを向上させる方法であって、画像が得られる前に、請求項１乃至４０のいずれか１項または請求項６１に記載の接合体、または請求項４１乃至４２のいずれか１項に記載の調合物を、画像が得られることになるヒトまたは動物被験者へ投与することを含む、医療用イメージング技術によって得られた画像のコントラストを向上させる方法。
【請求項６３】
医療用イメージング技術によって得られることになる画像のコントラストを向上させるための調合物の製造における、請求項１乃至４０のいずれか１項または請求項６１に記載の接合体の使用。
【図２】
【図３】
【図４−１】
【図４−２】
【図４−３】
【図５−１】
【図５−２】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９−１】
【図９−２】
【図１０ａ】
【図１０ｂ】
【図１１】
【図３】
【図４−１】
【図４−２】
【図４−３】
【図５−１】
【図５−２】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９−１】
【図９−２】
【図１０ａ】
【図１０ｂ】
【図１１】
【公表番号】特表２００６−５１８７２７（Ｐ２００６−５１８７２７Ａ）
【公表日】平成１８年８月１７日（２００６．８．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０２２７５（Ｐ２００６−５０２２７５）
【出願日】平成１６年２月１７日（２００４．２．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００４／０００５８２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７１５３６
【国際公開日】平成１６年８月２６日（２００４．８．２６）
【出願人】（５０４０６０８３８）アッパートン リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年８月１７日（２００６．８．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年２月１７日（２００４．２．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００４／０００５８２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７１５３６
【国際公開日】平成１６年８月２６日（２００４．８．２６）
【出願人】（５０４０６０８３８）アッパートン リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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