クロレラ・ブルガリスおよびこれを用いたバイオレメディエーション方法、ならびにバイオリアクタおよびこれを用いた有害物質除去方法。
【課題】有害化合物の除去処理において、被処理物の高温化という外乱に耐えうるクロレラ・ブルガリスおよびこれを用いたバイオレメディエーション方法、ならびにバイオリアクタおよびこれを用いた有害物質除去方法を提供する。
【解決手段】フェノール性水酸基を持つ有害化合物の除去能を有するクロレラ・ブルガリスであって、１５〜４２℃の温度範囲で生育可能なクロレラ・ブルガリスを、フェノール性水酸基を有する有害化合物を含む廃水や土壌に接触させることにより、廃水や土壌に含有されるフェノール性水酸基を有する有害化合物を除去する。
【解決手段】フェノール性水酸基を持つ有害化合物の除去能を有するクロレラ・ブルガリスであって、１５〜４２℃の温度範囲で生育可能なクロレラ・ブルガリスを、フェノール性水酸基を有する有害化合物を含む廃水や土壌に接触させることにより、廃水や土壌に含有されるフェノール性水酸基を有する有害化合物を除去する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フェノール性水酸基を持つ有害化合物の除去能を有するクロレラ・ブルガリスおよびこれを用いたバイオレメディエーション方法、ならびにバイオリアクタおよびこれを用いた有害物質除去方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
微細藻類を利用してフェノール性水酸基を持つ有害化合物の除去を行った例は、国内外の研究者によって既に報告されている。例えば、非特許文献１及び２には、微細藻類クロレラ・ファスカを利用した２，４−ジクロロフェノール及びビスフェノールＡの除去法についてそれぞれ報告がなされている。
【０００３】
また、一般的に微生物をバイオリアクタとして廃液処理などに使用することは、例えば、非特許文献３などで知られている。また、非特許文献４及び５では、固定化した微細藻類でリン酸やアンモニアの除去を行った結果が報告されている。
【０００４】
【非特許文献１】Ｎ．Ｔｓｕｊｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ２，４−ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌ ｂｙ Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｆｕｓｃａ ｖａｒ．ｖａｃｕｏｌａｔａ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．２５，ｐ．２４１−２４４．（２００３）．
【非特許文献２】Ｔ．Ｈｉｒｏｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｓｐｈｅｎｏｌ Ａ ａｎｄ ｄｉｓａｐｐｅａｒａｎｃｅ ｏｆ ｉｔｓ ｅｓｔｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ｔｈｅ ｇｒｅｅｎ ａｌｇａ Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｆｕｓｃａ ｖａｒ．ｖａｃｕｏｌａｔａ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２４，ｐ．１８９６−１９０１．（２００５）．
【非特許文献３】須藤隆一編，環境微生物実験法， １５４〜１８９頁（講談社刊１９８８年）。
【非特許文献４】Ｎ．Ｆ．Ｙ．Ｔａｍ ａｎｄ Ｙ．Ｓ．Ｗｏｎｇ，Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｍｉｃｒｏａｌｇａｌ ｂｅａｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｒｅｍｏｖａｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．１０７，ｐ．１４５−１５１（２０００）．
【非特許文献５】Ｌ．Ｅ．ｄｅ−Ｂａｓｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｒｏｍｏｖａｌ ｏｆ ａｍｍｏｎｉｕｍ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ｉｏｎｓ ｆｒｏｍ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ ｂｙ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ ｃｏｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｉｎ ａｌｇｉｎａｔｅ ｂｅａｄｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ ｇｒｏｗｔｈ−ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ａｚｏｓｐｉｒｅｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｅｎｃｅ．Ｗａｔｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．３６，ｐ．２９４１−２９４８（２００２）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
内分泌攪乱作用を示すクロロフェノール等のフェノール性水酸基を持つ有害化合物の除去において、これまで提案されている微生物を用いた場合、外乱により有害化合物を含有する被処理水が４０℃近くの高温状態となった際に、微生物は被処理水中でほぼ死滅状態となってしまうので、その後、被処理水が２５℃〜３５℃の適温状態に下がっても、微生物による有害化合物の除去を行うことができないという問題がある。
そこで、本発明は、有害化合物の除去処理において、被処理物の高温化という外乱に耐えうるクロレラ・ブルガリスおよびこれを用いたバイオレメディエーション方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、宮崎県および近隣の県の池、河川、水田、温泉等から採取した試水（すべて淡水）から分離して集積培養した微細藻類株（クロレラ・ブルガリス）の中に、クロロフェノール等のフェノール性水酸基を持つ有害化合物の除去能を有し、４２℃でも生育可能な光合成微生物を見出し、本発明に至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、フェノール性水酸基を持つ有害化合物の除去能を有するクロレラ・ブルガリスであって、１５〜４２℃の温度範囲で生育可能なクロレラ・ブルガリスであることを特徴とする。
【０００８】
また、本発明のクロレラ・ブルガリスは、５〜１５ｖ／ｖ％ＣＯ２通気下で生育可能であることを特徴とする。
このクロレラ・ブルガリスを用いれば、有害化合物の除去処理とともにＣＯ２の固定も可能であるので、有害化合物の除去処理とＣＯ２の削減とを同時に並行して実施することができる。
【０００９】
また、本発明者は、上記分離した微細藻類株について研究を進めた結果、とくに、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０９０６を有するクロレラ・ブルガリス、および受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０９６３を有するクロレラ・ブルガリスが、フェノール性水酸基を有する有害化合物の優れた除去能を有することがわかった。
【００１０】
また、本発明者は、フェノール性水酸基を有する有害化合物を含む水溶液中に、本発明のクロレラ・ブルガリスを添加して撹拌したり、フェノール性水酸基を有する有害化合物を含む土壌に本発明のクロレラ・ブルガリスを添加したりすると、その直後に、フェノール性水酸基を有する有害化合物が速やかに減少することを明らかにした。
【００１１】
すなわち、本発明のバイオレメディエーション方法は、フェノール性水酸基を有する有害化合物を含む廃水に、少なくとも本願の第１から第４のいずれかの発明におけるクロレラ・ブルガリスを接触させる工程を有することを特徴とする。
【００１２】
また、本発明のバイオレメディエーション方法は、フェノール性酸基を有する有害化合物を含む土壌に、少なくとも本願の第１から第４のいずれかの発明に記載のクロレラ・ブルガリスを接触させる工程を有することを特徴とする。
【００１３】
また、本発明のバイオリアクタは、酸性多糖類のゲルによって形成され、フェノール性水酸基を持つ有害化合物の除去能を有するクロレラ属の微細藻類を担持したビーズを充填したものであることを特徴とする。特に、クロレラ属の微細藻類を、本願の第１から第４のいずれかの発明に記載のクロレラ・ブルガリスとするとよい。
【００１４】
また、本発明の有害物質除去方法は、前記バイオリアクタを、フェノール性水酸基を有する有害化合物を含む水溶液中に浸漬し、当該水溶液から有害化合物を除去することを特徴とする。
【００１５】
クロレラ属の微細藻類が担持された担持体の形態としては、従来、シート状のもの、あるいはネット状のものなどが知られているが、このような形態の担持体は、長期間にわたって十分な機械的強度を維持することが難しいので、これらの担持体をバイオリアクタとして廃水中に含まれる有害化合物の除去に用いると担持体が崩壊しやすく、長期間にわたって、廃水中に含まれる有害化合物の除去を十分に行うことができないという問題がある。しかしながら、本発明によれば、シート状やネット状のものに担持されたクロレラ属の微細藻類を用いる場合と比べるとビーズ１つ１つの機械的強度が高いので、これらを充填したバイオリアクタを、フェノール性水酸基を有する有害化合物を含む水溶液中に浸漬しても、ビーズが崩壊することなくその形状が維持され、長期間にわたって廃水中に含まれる有害化合物の除去を行うことができる。
【００１６】
また、クロレラ属の微細藻類を担持したビーズは機械的強度が確保されるため、有害化合物の除去処理に使用した後の回収も容易であり、回収後にさらにこれを使用して繰り返し有害化合物の除去処理を行うこともできる。また、クロレラ属の微細藻類はビーズに担持されているので、除去処理を繰り返し行う際に、クロレラ属の微細藻類の回収に伴う遠心分離操作を必要としないので、作業が容易となる。
【００１７】
なお、シート状やネット状の担持体に十分な強度を持たせるために、廃水中に含まれる有害化合物の除去を行う際に十分な機械的強度を有する基材上に、シート状やネット状の担持体を形成することも考えられるが、そうなると、担持体の形成方法が煩雑である。しかしながら、本発明によれば、クロレラ属の微細藻類が担持されたビーズは、たとえば、クロレラ属の微細藻類を懸濁した酸性多糖類のゲルを所定の溶液中に滴下するだけで得ることができ、製造が容易である。さらに、ビーズ状にすることにより、シート状やネット状とする場合よりも、有害化合物を含む水溶液に接触する表面積を増加させることができ、有害化合物の処理能力の増大を図ることもできる。
【００１８】
なお、クロレラ属の微細藻類は、培養液から遠心分離により回収し、これをビーズの形状に調製して用いる。クロレラ属の微細藻類の担持方法としては、包括法、物理吸着法、マイクロカプセル法などを用いることができる。包括法を用いる場合、担体としては、アルギン酸カラギーナンなどの多糖類、硬化性樹脂、ポリアクリルアミド等のゲル化剤などを用いることができる。
【００１９】
なお、酸性多糖類としては、アルギン酸カルシウムを用いる方が望ましい。アルギン酸カルシウムは取り扱いが容易であり、また、ビーズの形成も容易である。
【００２０】
上記フェノール性水酸基を有する有害化合物としては、内分泌攪乱作用を示す有害化合物、たとえば、４−クロロフェノール（４ＣＰ）のようなクロロフェノール類、ビスフェノールＡなどが挙げられる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、フェノール性水酸基を持つ有害化合物の除去能を有し、微細藻類の培養や生育において比較的高温域とされる温度領域、すなわち３０〜４２℃程度の温度でも生育可能なクロレラ・ブルガリスであるので、このクロレラ・ブルガリスを用いれば、被処理物が外乱によって４０℃程度の高温となっても、死滅することなく生育することができ、有害化合物の除去処理を行うことができる。また、高温の燃焼ガスに含まれるＣＯ２の固定によって派生したクロレラ・ブルガリスを有効利用することができる。また、これを用いることにより、ＣＯ２の固定による排出削減とバイオレメディエーションを並行して実施することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明の実施の形態におけるクロレラ・ブルガリスを用いたフェノール性水酸基を有する有害化合物の除去法について詳細に説明する。本発明の実施の形態にかかるフェノール性水酸基を有する有害化合物の除去に用いるクロレラ・ブルガリスは、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０９０６を有するクロレラ・ブルガリス（以下、「クロレラ・ブルガリスＭＫＪ−３４」と称す。）、または本出願人が、独立法人産業総合研究所特許生物寄託センターに寄託して、平成１８年７月１８日に受領された受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０９６３を有するクロレラ・ブルガリス（以下、「クロレラ・ブルガリスＣ−１」と称す。）である。以下、このクロレラ・ブルガリスＭＫＪ−３４及びクロレラ・ブルガリスＣ−１の単離方法や形態解析の結果について説明する。また、これらを使用したバイオリアクタ、ならびにそれを用いた有害物質の除去方法についても詳細に説明する。
【実施例】
【００２３】
（実施例１）クロレラ・ブルガリスＭＫＪ−３４の単離方法
１−１：培地
熊本県菊池市の水田から採取した試水に含まれる微細藻類を、ＭＢＭ培地で集積培養した。ＭＢＭ培地は、ｘ１ ＭＢＭｍｅｄｉｕｍをオートクレーブ滅菌し、濾過滅菌したｘ１００ Ｆｅ ｍｉｘｔｕｒｅとｘ１００ Ａ５ ｍｅｔａｌ ｍｉｘｔｕｒｅをそれぞれ１００分の１量加えて使用した。それぞれの組成を以下に示す。
ｘｌ ＭＢＭ ｍｅｄｉｕｍ：
ＫＮＯ３ ２５ｍｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ７．５ｍｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ７．５ｍｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １７．５ｍｇ，ＮａＣｌ ２．５ｍｇ，ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ １ｍｇ，ＮａＨＣＯ３ ５０ｍｇ，Ｆｅ ｍｉｘｔｕｒｅ ０．１ｍｌ，Ａ５ ｍｅｔａｌ ｍｉｘｔｕｒｅ ０．１ｍｌ，
蒸留水９９．８ｍｌ，ｐＨ６．０
ｘ１００ Ｆｅ ｍｉｘｔｕｒｅ：ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １ｇ，蒸留水５００ｍｌ，Ｈ２ＳＯ４２滴
ｘ１００ Ａ５ ｍｅｔａｌ ｍｉｘｔｕｒｅ：Ｈ３ＢＯ３ ２８６ｍｇ，ＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２５０ｍｇ，ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２２．２ｍｇ，ＣｕＳＯ４・Ｈ２Ｏ ７．９ｍｇ，Ｎａ２ＭｏＯ４ ２．１ｍｇ，蒸留水１００ｍｌ
【００２４】
一方、微細藻類の高密度培養及び長期保存には、ＹＰＤ培地（グルコース２％、ポリペプトン（和光純薬製）２％、酵母エキス（和光純薬製）２％）を使用して、２日間回転振とう培養を行った。
【００２５】
１−２：単離方法
採取した試水を太陽光（間接光）照射下、４０℃で２週間静置集積培養を行った。集積培養液を１００培〜１０００倍に滅菌水で希釈して終濃度５０ｍｇ／ｌのアンピシリン及び２％の寒天を含むＭＢＭ平板培地に接種して３０℃、光照射下で２週間静置培養を行い、生じた緑色を呈するコロニーから微細藻類の分離を行った。そして、この緑色コロニーを再度ＭＢＭ平板培地に移し、シングルコロニーアイソレーションを繰り返し、単離微細藻類株とした。
【００２６】
単離した微細藻類株の１８Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を決定し、ホモロジーを検索すると、既知のクロレラ・ブルガリスの１８Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子と９９．９％の相同性を示した。単離微生物は、１８Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列及び形態的特徴並びにその生理学的性質からクロレラ・ブルガリスの新種と考えられ、この単離微生物をクロレラ・ブルガリスＭＫＪ−３４と命名した。
【００２７】
１−３：形態的特徴
単離したクロレラ・ブルガリスＭＫＪ−３４株の光学顕微鏡写真を図１に示す。単離微生物を光学顕微鏡で観察すると、図１に示すように、細胞形態は球形で、細胞膜は平滑、大きさは４−６μｍであり、自生胞子嚢中に、２−８個の娘細胞が観察され、クロレラ・ブルガリスの特徴を示していた。
【００２８】
１−４：生理学的特徴
（１）フェノール除去能を持つ
（２）５〜１５ｖ／ｖ％ＣＯ２通気下で生育できる
（３）独立栄養条件下（光照射下）と従属栄養条件下の両方で生育できる
【００２９】
なお、クロレラ・ブルガリスＭＫＪ−３４株の長期保管は、ＹＰＤスラント培地上、３０℃下で培養し、コロニー形成を肉眼で確認（５−７日）の後、低温（例えば４℃）で保管するのが望ましい。コロニー形成を肉眼確認（約４日）の後、低温（例えば、４℃）で保管し保存菌株とする。この保存菌株は数ヶ月毎、標準的には６か月毎で新しいＹＰＤ寒天平板培地に植え替える。
【００３０】
（実施例２）クロレラ・ブルガリスＣ−１の単離方法
実施例１と同様の手順で、鹿児島県曽於郡大崎町の池から採取した試水から、上述したクロレラ・ブルガリスＭＫＪ−３４とは別の微細藻類株を単離した。
【００３１】
２−１：単離方法
より詳細には、まず、試水をＭＢＭ培地に接種して太陽光（間接光）照射下、２５℃で２週間、藻類の集積培養を行った。集積培養液は２５００倍〜１００００倍に希釈して再度２５℃で２週間集積培養を繰り返した。次に集積培養液を終濃度５０ｍｇ／ｌのアンピシリン及び２％の寒天を含むＭＢＭ平板培地に接種して３０℃、光照射下で２週間静置培養を行い、生じた緑色を呈するコロニーから微細藻類の分離を行った。この緑色コロニーを再度ＭＢＭ平板培地に移し、シングルコロニーアイソレーションを繰り返し、単離微細藻類株とした。
【００３２】
単離した微細藻類株の１８Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を決定し、ホモロジーを検索すると、既知のクロレラ・ブルガリスの１８Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子と９９％の相同性を示した。単離微生物は、１８Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列及び形態的特徴並びに生理学的性質からクロレラ・ブルガリスの新種と考えられ、この単離微生物をクロレラ・ブルガリスＣ−１と命名した。
【００３３】
２−２：形態的特徴
単離したクロレラ・ブルガリスＣ−１株の光学顕微鏡写真を図２に示す。単離微生物を光学顕微鏡で観察すると、図２に示すように、細胞形態は球形で、細胞膜は平滑、大きさは６−９μｍで、葉緑体は腕状であり、クロレラ・ブルガリスの特徴を示していた。
【００３４】
２−３：生理学的特徴
（１）フェノール除去能を持つ
（２）５〜１５ｖ／ｖ％ＣＯ２通気下で生育できる
（３）独立栄養条件下（光照射下）と従属栄養条件下の両方で生育できる
【００３５】
なお、クロレラ・ブルガリスＣ−１の長期保管は、実施例１の場合と同様に、ＹＰＤスラント培地上、３０℃下で培養した藻体を１５〜２０℃で保存するのが望ましい。なお、クロレラ・ブルガリスＣ−１は、４℃で２ヶ月以上放置すると増殖できなくなることがわかった。
【００３６】
（実施例３）クロレラ・ブルガリスＭＫＪ−３４のフェノール性水酸基を持つ有害化合物除去能の評価
【００３７】
３−１：フェノール類の定量方法
まず、反応液中の各種フェノール類の定量方法について以下に示す。
被試験液１ｍｌに試薬Ａ（０．３２％４−アミノアンチピリン水溶液、０．３２Ｎアンモニアを有する有害化合物の水溶液、蒸留水を１：３．２８：６．３３の比率で混合した水溶液）を７６４μｌ、および試薬Ｂ（０．３２％ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウム（フェリシアン化カリウム）水溶液）を２３６μｌ加え、室温下で５分間放置した後に４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。なお、クロレラ・ブルガリスを含まない緩衝液に有害化合物を添加したものを発色させて比較対照とし、これより有害化合物の消失率を算出した。本比色法で得られた結果は、高速液体クロマトグラフィーを用いた定量法によって得られた結果とよく相関していた。
【００３８】
３−２：クロレラ・ブルガリスＭＫＪ−３４の除去能の評価
実施例１で保管した保存菌株から白金耳を用いてコロニーをかきとり、ＹＰＤ液体培地に移植し、好ましくは３０℃で３日間振盪培養した。これを前培養藻体として、これを別のＹＰＤ培地に移植し、同様の培養条件で振盪培養した。この培養液を８０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離によって分離し、回収した藻体をフェノール性水酸基を持つ有害化合物除去に使用した。本実施例では、フェノール性水酸基を有する有害化合物の一つである４−クロロフェノール（４ＣＰ）を含む水溶液を用い、クロレラ・ブルガリスＭＫＪ−３４の４ＣＰの除去能を測定した。
【００３９】
３−２で示した方法で予め調製したクロレラ・ブルガリスＭＫＪ−３４の藻体を用いて、４ＣＰを含む水溶液から、４ＣＰの除去を試みた。評価に使用した水溶液中の４ＣＰ濃度を、３−１に示す方法に従って４−アミノアンチピリンによる発色後、比色定量法にて測定した。異なる量の藻体を３ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に懸濁し、これに、４ＣＰを０．１ｍＭ（１３ｐｐｍ）の終濃度になるように添加して、１６０ｒｐｍ、３０℃下で２４時間撹拌した。図３に示すように、４ＣＰの消失は藻体の濃度に依存しており、溶液中の藻体の含有量が４．０ｍｇ乾燥重／ｍｌ程度では、４ＣＰの消失率は最大で２０％以下と低い値であったが、藻体の濃度を高くすることによって消失率を５３％にまで上げることができた。
【００４０】
藻体を４ＣＰと２４時間インキュベートした後に藻体を回収して、繰り返し４ＣＰとインキュベートを行ったところ少なくとも７回までは除去率が著しく低下することなく、４ＣＰを除去することができた。
【００４１】
（実施例４）クロレラ・ブルガリスＣ−１のフェノール性水酸基を持つ有害化合物除去能の評価
クロレラ・ブルガリスＭＫＪ−３４と同様の方法で、クロレラ・ブルガリスＣ−１の藻体を調製して４ＣＰの除去について調べた。図４に示すように、藻体の濃度を高くすることによって１６時間後に０．１ｍＭ（１３ｐｐｍ）の４ＣＰを最高７６％消失させることができた。また、クロレラ・ブルガリスＣ−１を用いた場合、ＭＫＪ−３４株よりも低い藻体濃度、すなわち１５ｍｇ−ｄｒｙ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以下の藻体濃度で効率的に４ＣＰを消失させることが可能であることがわかった。
【００４２】
（実施例５）比較例
クロレラ・ブルガリスＭＫＪ−３４とクロレラ・ブルガリスＣ−１以外の公知のクロレラ属の微細藻類についても、実施例３または実施例４と同様の手順で４ＣＰ除去能を試験した。公知のクロレラ属の微細藻類は、東京大学分子細胞生物学研究所ＩＡＭカルチャーコレクションのタイプカルチャーから、以下の６藻類株をランダムに選択した。
【００４３】
クロレラ・ソロキニアナ ＩＡＭ Ｃ−２１２ （Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ ＩＡＭ Ｃ−２１２）
クロレラ・ケスレリ ＩＡＭ Ｃ−５３１ （Ｃ．ｋｅｓｓｌｅｒｉ ＩＡＭ Ｃ−５３１）
クロレラ・ブルガリス ＩＡＭ Ｃ−５３６ （Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ ＩＡＭ Ｃ−５３６）
クロレラ・ブルガリス ＩＡＭ Ｃ−５４７ （Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ ＩＡＭ Ｃ−５４７）
クロレラ・エスピー ＩＡＭ Ｃ−６２８ （Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ． ＩＡＭ Ｃ−６２８）
クロレラ・ブルガリス ＩＡＭ Ｃ−６２９ （Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ ＩＡＭ Ｃ−６２９）
試験の結果、上記６種類の藻類株は顕著な４ＣＰ除去能を示さないことがわかった。
【００４４】
（実施例６）クロレラ・ブルガリスＭＫＪ−３４及びクロレラ・ブルガリスＣ−１の高温下での生育特性
クロレラ・ブルガリスＭＫＪ−３４及びクロレラ・ブルガリスＣ−１の生育に対する３０〜４５℃の範囲の温度の影響を調べた。なお、両藻類株をＬ字型試験管内に調製した２０ｍｌのＭＢＭ液体培地中、蛍光灯での光照射下（５０００ｌｕｘ、１２時間暗、１２時間明のくり返し）で４日間振盪培養を行い、濁度（ＯＤ６６０）を測定することによって生育した藻体量を測定した。両藻類株は、少なくとも３０〜４２℃の範囲で生育可能であることが確認できた。３０〜４５℃の範囲での生育を図５に示す。
【００４５】
（実施例７）クロレラ・ブルガリスＭＫＪ−３４及びクロレラ・ブルガリスＣ−１の高ＣＯ２濃度下での生育特性
クロレラ・ブルガリスＭＫＪ−３４及びクロレラ・ブルガリスＣ−１について、ＣＯ２を高濃度に含むガス通気下での生育について調べた。両藻類株を３００ｍｌ三角フラスコ内に調製した２８０ｍｌのＭＢＭ液体培地（ＮａＨＣＯ３無添加）中で、蛍光灯での光照射（５０００ｌｕｘ、１２時間暗、１２時間明のくり返し）、３５℃下の条件下で１００ｖ／ｖ％ＣＯ２と空気（０．０３８ｖ／ｖ％ＣＯ２）の混合ガスを通気しながら５日間培養を行い、濁度（ＯＤ６６０）を測定することによって生育した藻体量を測定した。図６に示すように、空気のみを通気した場合の両藻類株の生育は僅かであったが、５〜１０ｖ／ｖ％ＣＯ２通気下で良好に生育し、１５ｖ／ｖ％のＣＯ２の通気下でも生育が可能であることが確認された。
【００４６】
（実施例８）バイオレメディエーション方法
バイオレメディエーション方法としては、上記クロレラ・ブルガリスを、フェノール性水酸基を有する有害化合物を含む廃水、もしくは土壌に接触させることが挙げられるが、廃水に接触させる方法としては、包括法により、アルギン酸カルシウムのような酸性多糖類の塩に担持させて藻体ビーズとし、この藻体ビーズを充填したバイオリアクタを廃水中に浸漬する方が望ましい。以下に、本実施例におけるバイオリアクタならびに藻体ビーズの調製方法について説明する。
【００４７】
図７に示すように、バイオリアクタは、フェノール性水酸基を持つ有害化合物の除去能を有するクロレラ属の微細藻類を酸性多糖類の１つであるアルギン酸カルシウムゲルに担持させ、これを藻体ビーズ１として円筒型のカラム２に充填したものである。
【００４８】
円筒形のカラム２は、大きさが、直径３．８ｃｍ、内径１．８ｃｍ、高さ３２ｃｍであり、上部に、有害化合物を含む溶液（被処理水）を注入する注入口を、下部に、被処理水が排出される排出口を備えている。本実施例では、バイオリアクタに注入される被処理水を、温度を３０℃に保った状態で被分解基質である有害化合物の終濃度が０．１ｍＭ（１３ｐｐｍ）になるように調製し、流速約０．１ｍｌ／ｍｉｎで流し込むことにより、連続的に処理を行うことができる。なお、カラム２としては円筒形のものに限るものではなく、藻体ビーズ１を充填させることが可能なものであればどのような容器であってもよい。
【００４９】
微生物の担持法としては、包括法、物理吸着法、マイクロカプセル法などが知られているが、本実施例では、包括法で微細藻類の担持を行う。また、包括法の担体としては、アルギン酸カルシウムのような酸性多糖類の塩を用いる。酸性多糖類の塩を用いることにより、ビーズ状の形態を容易に付与することが出来る。
【００５０】
アルギン酸カルシウムを担体として用いる場合は、藻体ビーズ１を以下のような手順で調製することが出来る。例えば、本実施例では、２％アルギン酸ナトリウム溶液中に所定の濃度のクロレラ・ブルガリスＭＫＪ−３４を懸濁した液体を５％塩化カルシウム水溶液中に攪拌しながら滴下した。すると、球状の固形ゲルが得られ、これを蒸留水で洗浄することにより、藻体ビーズ１を得ることが出来た。
【００５１００５１】
上記方法で得られた藻体ビーズ３ｇを、０．１ｍＭのフェノール類をｐＨ７．０のリン酸緩衝液またはＭＯＰＳ緩衝液に懸濁した被分解基質（フェノール性水酸基を持つ有害化合物）含有水３ｍｌと共に温度３０℃の試験管内に入れ、往復振とうによる攪拌を加えると、藻体ビーズ１に担持されたクロレラ・ブルガリスＭＫＪ−３４が有害化合物を除去することができた。
【００５２】
なお、藻体ビーズ１を４ＣＰ含有水３ｍｌと共に２４時間振とうした後、ビーズの回収を繰り返し、その回数により４ＣＰ消失能力がどのように変化するかを調べた。図８に示すように、少なくとも７回までは除去率が著しく低下することなく、４ＣＰを除去することができた。この結果からも明らかなように、バイオリアクタに充填された藻体ビーズ１は、繰り返し使用することが可能である。なお、藻体ビーズ１を長期間使用すると、藻体ビーズ１と被処理水との平衡状態が崩れて膨潤する場合があるので、この場合、被処理水には、カルシウム塩等、藻体ビーズ１と被処理水との平衡状態を維持するための塩を適量混合させて用いる方がよい。これにより、藻体ビーズ１を長期間使用することが可能となる。
【００５３】
藻体ビーズ１を、円筒型のカラム２に充填してバイオリアクタとし、これを、４ＣＰを含有する被処理水に浸漬したところ、図９に示すように、７００ｍｌの被処理水に含まれる４ＣＰを、４０〜８０％の消失率で３日間連続的に除去することができた。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明は、フェノール性水酸基を持つ有害化合物に対する優れた除去能を有し、３０〜４２℃程度の温度でも生育可能であるので、被処理物の高温化という外乱に耐えうるクロレラ・ブルガリスとして用いることができる。また、このクロレラ・ブルガリスを例えばバイオリアクタに組み込むことで、パルプ工場、合成有機化学工場などから排出される廃液に含まれる有害化合物含有水の処理のような閉鎖系でのバイオレメディエーションや有害化合物を含有する土壌の浄化などの屋外で実施する開放系のバイオレメディエーションに利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】単離したクロレラ・ブルガリスＭＫＪ−３４の光学顕微鏡写真である。
【図２】単離したクロレラ・ブルガリスＣ−１の光学顕微鏡写真である。
【図３】異なる濃度のクロレラ・ブルガリスＭＫＪ−３４を添加した被処理水中の１３ｐｐｍのフェノール性水酸基を有する有害化合物の消失率（％）を示す図である。
【図４】異なる濃度のクロレラ・ブルガリスＣ−１を添加した被処理水中の１３ｐｐｍのフェノール性水酸基を有する有害化合物の消失率（％）を示す図である。
【図５】クロレラ・ブルガリスＭＫＪ−３４及びクロレラ・ブルガリスＣ−１の３０〜４５℃の範囲の温度下での生育状況を示す図である。
【図６】クロレラ・ブルガリスＭＫＪ−３４及びクロレラ・ブルガリスＣ−１のＣＯ２を高濃度に含むガス通気下での生育状況を示す図である。
【図７】本発明の実施の形態におけるバイオリアクタの正面図である。
【図８】藻体ビーズによる４ＣＰの繰り返し除去の過程を示した図である。
【図９】藻体ビーズを充填したバイオリアクタによる４ＣＰの連続的除去の結果を示した図である。
【符号の説明】
【００５６】
１ 藻体ビーズ
２ カラム
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フェノール性水酸基を持つ有害化合物の除去能を有するクロレラ・ブルガリスおよびこれを用いたバイオレメディエーション方法、ならびにバイオリアクタおよびこれを用いた有害物質除去方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
微細藻類を利用してフェノール性水酸基を持つ有害化合物の除去を行った例は、国内外の研究者によって既に報告されている。例えば、非特許文献１及び２には、微細藻類クロレラ・ファスカを利用した２，４−ジクロロフェノール及びビスフェノールＡの除去法についてそれぞれ報告がなされている。
【０００３】
また、一般的に微生物をバイオリアクタとして廃液処理などに使用することは、例えば、非特許文献３などで知られている。また、非特許文献４及び５では、固定化した微細藻類でリン酸やアンモニアの除去を行った結果が報告されている。
【０００４】
【非特許文献１】Ｎ．Ｔｓｕｊｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ２，４−ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌ ｂｙ Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｆｕｓｃａ ｖａｒ．ｖａｃｕｏｌａｔａ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．２５，ｐ．２４１−２４４．（２００３）．
【非特許文献２】Ｔ．Ｈｉｒｏｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｓｐｈｅｎｏｌ Ａ ａｎｄ ｄｉｓａｐｐｅａｒａｎｃｅ ｏｆ ｉｔｓ ｅｓｔｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ｔｈｅ ｇｒｅｅｎ ａｌｇａ Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｆｕｓｃａ ｖａｒ．ｖａｃｕｏｌａｔａ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２４，ｐ．１８９６−１９０１．（２００５）．
【非特許文献３】須藤隆一編，環境微生物実験法， １５４〜１８９頁（講談社刊１９８８年）。
【非特許文献４】Ｎ．Ｆ．Ｙ．Ｔａｍ ａｎｄ Ｙ．Ｓ．Ｗｏｎｇ，Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｍｉｃｒｏａｌｇａｌ ｂｅａｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｒｅｍｏｖａｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．１０７，ｐ．１４５−１５１（２０００）．
【非特許文献５】Ｌ．Ｅ．ｄｅ−Ｂａｓｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｒｏｍｏｖａｌ ｏｆ ａｍｍｏｎｉｕｍ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ｉｏｎｓ ｆｒｏｍ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ ｂｙ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ ｃｏｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｉｎ ａｌｇｉｎａｔｅ ｂｅａｄｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ ｇｒｏｗｔｈ−ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ａｚｏｓｐｉｒｅｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｅｎｃｅ．Ｗａｔｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．３６，ｐ．２９４１−２９４８（２００２）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
内分泌攪乱作用を示すクロロフェノール等のフェノール性水酸基を持つ有害化合物の除去において、これまで提案されている微生物を用いた場合、外乱により有害化合物を含有する被処理水が４０℃近くの高温状態となった際に、微生物は被処理水中でほぼ死滅状態となってしまうので、その後、被処理水が２５℃〜３５℃の適温状態に下がっても、微生物による有害化合物の除去を行うことができないという問題がある。
そこで、本発明は、有害化合物の除去処理において、被処理物の高温化という外乱に耐えうるクロレラ・ブルガリスおよびこれを用いたバイオレメディエーション方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、宮崎県および近隣の県の池、河川、水田、温泉等から採取した試水（すべて淡水）から分離して集積培養した微細藻類株（クロレラ・ブルガリス）の中に、クロロフェノール等のフェノール性水酸基を持つ有害化合物の除去能を有し、４２℃でも生育可能な光合成微生物を見出し、本発明に至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、フェノール性水酸基を持つ有害化合物の除去能を有するクロレラ・ブルガリスであって、１５〜４２℃の温度範囲で生育可能なクロレラ・ブルガリスであることを特徴とする。
【０００８】
また、本発明のクロレラ・ブルガリスは、５〜１５ｖ／ｖ％ＣＯ２通気下で生育可能であることを特徴とする。
このクロレラ・ブルガリスを用いれば、有害化合物の除去処理とともにＣＯ２の固定も可能であるので、有害化合物の除去処理とＣＯ２の削減とを同時に並行して実施することができる。
【０００９】
また、本発明者は、上記分離した微細藻類株について研究を進めた結果、とくに、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０９０６を有するクロレラ・ブルガリス、および受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０９６３を有するクロレラ・ブルガリスが、フェノール性水酸基を有する有害化合物の優れた除去能を有することがわかった。
【００１０】
また、本発明者は、フェノール性水酸基を有する有害化合物を含む水溶液中に、本発明のクロレラ・ブルガリスを添加して撹拌したり、フェノール性水酸基を有する有害化合物を含む土壌に本発明のクロレラ・ブルガリスを添加したりすると、その直後に、フェノール性水酸基を有する有害化合物が速やかに減少することを明らかにした。
【００１１】
すなわち、本発明のバイオレメディエーション方法は、フェノール性水酸基を有する有害化合物を含む廃水に、少なくとも本願の第１から第４のいずれかの発明におけるクロレラ・ブルガリスを接触させる工程を有することを特徴とする。
【００１２】
また、本発明のバイオレメディエーション方法は、フェノール性酸基を有する有害化合物を含む土壌に、少なくとも本願の第１から第４のいずれかの発明に記載のクロレラ・ブルガリスを接触させる工程を有することを特徴とする。
【００１３】
また、本発明のバイオリアクタは、酸性多糖類のゲルによって形成され、フェノール性水酸基を持つ有害化合物の除去能を有するクロレラ属の微細藻類を担持したビーズを充填したものであることを特徴とする。特に、クロレラ属の微細藻類を、本願の第１から第４のいずれかの発明に記載のクロレラ・ブルガリスとするとよい。
【００１４】
また、本発明の有害物質除去方法は、前記バイオリアクタを、フェノール性水酸基を有する有害化合物を含む水溶液中に浸漬し、当該水溶液から有害化合物を除去することを特徴とする。
【００１５】
クロレラ属の微細藻類が担持された担持体の形態としては、従来、シート状のもの、あるいはネット状のものなどが知られているが、このような形態の担持体は、長期間にわたって十分な機械的強度を維持することが難しいので、これらの担持体をバイオリアクタとして廃水中に含まれる有害化合物の除去に用いると担持体が崩壊しやすく、長期間にわたって、廃水中に含まれる有害化合物の除去を十分に行うことができないという問題がある。しかしながら、本発明によれば、シート状やネット状のものに担持されたクロレラ属の微細藻類を用いる場合と比べるとビーズ１つ１つの機械的強度が高いので、これらを充填したバイオリアクタを、フェノール性水酸基を有する有害化合物を含む水溶液中に浸漬しても、ビーズが崩壊することなくその形状が維持され、長期間にわたって廃水中に含まれる有害化合物の除去を行うことができる。
【００１６】
また、クロレラ属の微細藻類を担持したビーズは機械的強度が確保されるため、有害化合物の除去処理に使用した後の回収も容易であり、回収後にさらにこれを使用して繰り返し有害化合物の除去処理を行うこともできる。また、クロレラ属の微細藻類はビーズに担持されているので、除去処理を繰り返し行う際に、クロレラ属の微細藻類の回収に伴う遠心分離操作を必要としないので、作業が容易となる。
【００１７】
なお、シート状やネット状の担持体に十分な強度を持たせるために、廃水中に含まれる有害化合物の除去を行う際に十分な機械的強度を有する基材上に、シート状やネット状の担持体を形成することも考えられるが、そうなると、担持体の形成方法が煩雑である。しかしながら、本発明によれば、クロレラ属の微細藻類が担持されたビーズは、たとえば、クロレラ属の微細藻類を懸濁した酸性多糖類のゲルを所定の溶液中に滴下するだけで得ることができ、製造が容易である。さらに、ビーズ状にすることにより、シート状やネット状とする場合よりも、有害化合物を含む水溶液に接触する表面積を増加させることができ、有害化合物の処理能力の増大を図ることもできる。
【００１８】
なお、クロレラ属の微細藻類は、培養液から遠心分離により回収し、これをビーズの形状に調製して用いる。クロレラ属の微細藻類の担持方法としては、包括法、物理吸着法、マイクロカプセル法などを用いることができる。包括法を用いる場合、担体としては、アルギン酸カラギーナンなどの多糖類、硬化性樹脂、ポリアクリルアミド等のゲル化剤などを用いることができる。
【００１９】
なお、酸性多糖類としては、アルギン酸カルシウムを用いる方が望ましい。アルギン酸カルシウムは取り扱いが容易であり、また、ビーズの形成も容易である。
【００２０】
上記フェノール性水酸基を有する有害化合物としては、内分泌攪乱作用を示す有害化合物、たとえば、４−クロロフェノール（４ＣＰ）のようなクロロフェノール類、ビスフェノールＡなどが挙げられる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、フェノール性水酸基を持つ有害化合物の除去能を有し、微細藻類の培養や生育において比較的高温域とされる温度領域、すなわち３０〜４２℃程度の温度でも生育可能なクロレラ・ブルガリスであるので、このクロレラ・ブルガリスを用いれば、被処理物が外乱によって４０℃程度の高温となっても、死滅することなく生育することができ、有害化合物の除去処理を行うことができる。また、高温の燃焼ガスに含まれるＣＯ２の固定によって派生したクロレラ・ブルガリスを有効利用することができる。また、これを用いることにより、ＣＯ２の固定による排出削減とバイオレメディエーションを並行して実施することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明の実施の形態におけるクロレラ・ブルガリスを用いたフェノール性水酸基を有する有害化合物の除去法について詳細に説明する。本発明の実施の形態にかかるフェノール性水酸基を有する有害化合物の除去に用いるクロレラ・ブルガリスは、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０９０６を有するクロレラ・ブルガリス（以下、「クロレラ・ブルガリスＭＫＪ−３４」と称す。）、または本出願人が、独立法人産業総合研究所特許生物寄託センターに寄託して、平成１８年７月１８日に受領された受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０９６３を有するクロレラ・ブルガリス（以下、「クロレラ・ブルガリスＣ−１」と称す。）である。以下、このクロレラ・ブルガリスＭＫＪ−３４及びクロレラ・ブルガリスＣ−１の単離方法や形態解析の結果について説明する。また、これらを使用したバイオリアクタ、ならびにそれを用いた有害物質の除去方法についても詳細に説明する。
【実施例】
【００２３】
（実施例１）クロレラ・ブルガリスＭＫＪ−３４の単離方法
１−１：培地
熊本県菊池市の水田から採取した試水に含まれる微細藻類を、ＭＢＭ培地で集積培養した。ＭＢＭ培地は、ｘ１ ＭＢＭｍｅｄｉｕｍをオートクレーブ滅菌し、濾過滅菌したｘ１００ Ｆｅ ｍｉｘｔｕｒｅとｘ１００ Ａ５ ｍｅｔａｌ ｍｉｘｔｕｒｅをそれぞれ１００分の１量加えて使用した。それぞれの組成を以下に示す。
ｘｌ ＭＢＭ ｍｅｄｉｕｍ：
ＫＮＯ３ ２５ｍｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ７．５ｍｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ７．５ｍｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １７．５ｍｇ，ＮａＣｌ ２．５ｍｇ，ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ １ｍｇ，ＮａＨＣＯ３ ５０ｍｇ，Ｆｅ ｍｉｘｔｕｒｅ ０．１ｍｌ，Ａ５ ｍｅｔａｌ ｍｉｘｔｕｒｅ ０．１ｍｌ，
蒸留水９９．８ｍｌ，ｐＨ６．０
ｘ１００ Ｆｅ ｍｉｘｔｕｒｅ：ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １ｇ，蒸留水５００ｍｌ，Ｈ２ＳＯ４２滴
ｘ１００ Ａ５ ｍｅｔａｌ ｍｉｘｔｕｒｅ：Ｈ３ＢＯ３ ２８６ｍｇ，ＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２５０ｍｇ，ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２２．２ｍｇ，ＣｕＳＯ４・Ｈ２Ｏ ７．９ｍｇ，Ｎａ２ＭｏＯ４ ２．１ｍｇ，蒸留水１００ｍｌ
【００２４】
一方、微細藻類の高密度培養及び長期保存には、ＹＰＤ培地（グルコース２％、ポリペプトン（和光純薬製）２％、酵母エキス（和光純薬製）２％）を使用して、２日間回転振とう培養を行った。
【００２５】
１−２：単離方法
採取した試水を太陽光（間接光）照射下、４０℃で２週間静置集積培養を行った。集積培養液を１００培〜１０００倍に滅菌水で希釈して終濃度５０ｍｇ／ｌのアンピシリン及び２％の寒天を含むＭＢＭ平板培地に接種して３０℃、光照射下で２週間静置培養を行い、生じた緑色を呈するコロニーから微細藻類の分離を行った。そして、この緑色コロニーを再度ＭＢＭ平板培地に移し、シングルコロニーアイソレーションを繰り返し、単離微細藻類株とした。
【００２６】
単離した微細藻類株の１８Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を決定し、ホモロジーを検索すると、既知のクロレラ・ブルガリスの１８Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子と９９．９％の相同性を示した。単離微生物は、１８Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列及び形態的特徴並びにその生理学的性質からクロレラ・ブルガリスの新種と考えられ、この単離微生物をクロレラ・ブルガリスＭＫＪ−３４と命名した。
【００２７】
１−３：形態的特徴
単離したクロレラ・ブルガリスＭＫＪ−３４株の光学顕微鏡写真を図１に示す。単離微生物を光学顕微鏡で観察すると、図１に示すように、細胞形態は球形で、細胞膜は平滑、大きさは４−６μｍであり、自生胞子嚢中に、２−８個の娘細胞が観察され、クロレラ・ブルガリスの特徴を示していた。
【００２８】
１−４：生理学的特徴
（１）フェノール除去能を持つ
（２）５〜１５ｖ／ｖ％ＣＯ２通気下で生育できる
（３）独立栄養条件下（光照射下）と従属栄養条件下の両方で生育できる
【００２９】
なお、クロレラ・ブルガリスＭＫＪ−３４株の長期保管は、ＹＰＤスラント培地上、３０℃下で培養し、コロニー形成を肉眼で確認（５−７日）の後、低温（例えば４℃）で保管するのが望ましい。コロニー形成を肉眼確認（約４日）の後、低温（例えば、４℃）で保管し保存菌株とする。この保存菌株は数ヶ月毎、標準的には６か月毎で新しいＹＰＤ寒天平板培地に植え替える。
【００３０】
（実施例２）クロレラ・ブルガリスＣ−１の単離方法
実施例１と同様の手順で、鹿児島県曽於郡大崎町の池から採取した試水から、上述したクロレラ・ブルガリスＭＫＪ−３４とは別の微細藻類株を単離した。
【００３１】
２−１：単離方法
より詳細には、まず、試水をＭＢＭ培地に接種して太陽光（間接光）照射下、２５℃で２週間、藻類の集積培養を行った。集積培養液は２５００倍〜１００００倍に希釈して再度２５℃で２週間集積培養を繰り返した。次に集積培養液を終濃度５０ｍｇ／ｌのアンピシリン及び２％の寒天を含むＭＢＭ平板培地に接種して３０℃、光照射下で２週間静置培養を行い、生じた緑色を呈するコロニーから微細藻類の分離を行った。この緑色コロニーを再度ＭＢＭ平板培地に移し、シングルコロニーアイソレーションを繰り返し、単離微細藻類株とした。
【００３２】
単離した微細藻類株の１８Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を決定し、ホモロジーを検索すると、既知のクロレラ・ブルガリスの１８Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子と９９％の相同性を示した。単離微生物は、１８Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列及び形態的特徴並びに生理学的性質からクロレラ・ブルガリスの新種と考えられ、この単離微生物をクロレラ・ブルガリスＣ−１と命名した。
【００３３】
２−２：形態的特徴
単離したクロレラ・ブルガリスＣ−１株の光学顕微鏡写真を図２に示す。単離微生物を光学顕微鏡で観察すると、図２に示すように、細胞形態は球形で、細胞膜は平滑、大きさは６−９μｍで、葉緑体は腕状であり、クロレラ・ブルガリスの特徴を示していた。
【００３４】
２−３：生理学的特徴
（１）フェノール除去能を持つ
（２）５〜１５ｖ／ｖ％ＣＯ２通気下で生育できる
（３）独立栄養条件下（光照射下）と従属栄養条件下の両方で生育できる
【００３５】
なお、クロレラ・ブルガリスＣ−１の長期保管は、実施例１の場合と同様に、ＹＰＤスラント培地上、３０℃下で培養した藻体を１５〜２０℃で保存するのが望ましい。なお、クロレラ・ブルガリスＣ−１は、４℃で２ヶ月以上放置すると増殖できなくなることがわかった。
【００３６】
（実施例３）クロレラ・ブルガリスＭＫＪ−３４のフェノール性水酸基を持つ有害化合物除去能の評価
【００３７】
３−１：フェノール類の定量方法
まず、反応液中の各種フェノール類の定量方法について以下に示す。
被試験液１ｍｌに試薬Ａ（０．３２％４−アミノアンチピリン水溶液、０．３２Ｎアンモニアを有する有害化合物の水溶液、蒸留水を１：３．２８：６．３３の比率で混合した水溶液）を７６４μｌ、および試薬Ｂ（０．３２％ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウム（フェリシアン化カリウム）水溶液）を２３６μｌ加え、室温下で５分間放置した後に４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。なお、クロレラ・ブルガリスを含まない緩衝液に有害化合物を添加したものを発色させて比較対照とし、これより有害化合物の消失率を算出した。本比色法で得られた結果は、高速液体クロマトグラフィーを用いた定量法によって得られた結果とよく相関していた。
【００３８】
３−２：クロレラ・ブルガリスＭＫＪ−３４の除去能の評価
実施例１で保管した保存菌株から白金耳を用いてコロニーをかきとり、ＹＰＤ液体培地に移植し、好ましくは３０℃で３日間振盪培養した。これを前培養藻体として、これを別のＹＰＤ培地に移植し、同様の培養条件で振盪培養した。この培養液を８０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離によって分離し、回収した藻体をフェノール性水酸基を持つ有害化合物除去に使用した。本実施例では、フェノール性水酸基を有する有害化合物の一つである４−クロロフェノール（４ＣＰ）を含む水溶液を用い、クロレラ・ブルガリスＭＫＪ−３４の４ＣＰの除去能を測定した。
【００３９】
３−２で示した方法で予め調製したクロレラ・ブルガリスＭＫＪ−３４の藻体を用いて、４ＣＰを含む水溶液から、４ＣＰの除去を試みた。評価に使用した水溶液中の４ＣＰ濃度を、３−１に示す方法に従って４−アミノアンチピリンによる発色後、比色定量法にて測定した。異なる量の藻体を３ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に懸濁し、これに、４ＣＰを０．１ｍＭ（１３ｐｐｍ）の終濃度になるように添加して、１６０ｒｐｍ、３０℃下で２４時間撹拌した。図３に示すように、４ＣＰの消失は藻体の濃度に依存しており、溶液中の藻体の含有量が４．０ｍｇ乾燥重／ｍｌ程度では、４ＣＰの消失率は最大で２０％以下と低い値であったが、藻体の濃度を高くすることによって消失率を５３％にまで上げることができた。
【００４０】
藻体を４ＣＰと２４時間インキュベートした後に藻体を回収して、繰り返し４ＣＰとインキュベートを行ったところ少なくとも７回までは除去率が著しく低下することなく、４ＣＰを除去することができた。
【００４１】
（実施例４）クロレラ・ブルガリスＣ−１のフェノール性水酸基を持つ有害化合物除去能の評価
クロレラ・ブルガリスＭＫＪ−３４と同様の方法で、クロレラ・ブルガリスＣ−１の藻体を調製して４ＣＰの除去について調べた。図４に示すように、藻体の濃度を高くすることによって１６時間後に０．１ｍＭ（１３ｐｐｍ）の４ＣＰを最高７６％消失させることができた。また、クロレラ・ブルガリスＣ−１を用いた場合、ＭＫＪ−３４株よりも低い藻体濃度、すなわち１５ｍｇ−ｄｒｙ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以下の藻体濃度で効率的に４ＣＰを消失させることが可能であることがわかった。
【００４２】
（実施例５）比較例
クロレラ・ブルガリスＭＫＪ−３４とクロレラ・ブルガリスＣ−１以外の公知のクロレラ属の微細藻類についても、実施例３または実施例４と同様の手順で４ＣＰ除去能を試験した。公知のクロレラ属の微細藻類は、東京大学分子細胞生物学研究所ＩＡＭカルチャーコレクションのタイプカルチャーから、以下の６藻類株をランダムに選択した。
【００４３】
クロレラ・ソロキニアナ ＩＡＭ Ｃ−２１２ （Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ ＩＡＭ Ｃ−２１２）
クロレラ・ケスレリ ＩＡＭ Ｃ−５３１ （Ｃ．ｋｅｓｓｌｅｒｉ ＩＡＭ Ｃ−５３１）
クロレラ・ブルガリス ＩＡＭ Ｃ−５３６ （Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ ＩＡＭ Ｃ−５３６）
クロレラ・ブルガリス ＩＡＭ Ｃ−５４７ （Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ ＩＡＭ Ｃ−５４７）
クロレラ・エスピー ＩＡＭ Ｃ−６２８ （Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ． ＩＡＭ Ｃ−６２８）
クロレラ・ブルガリス ＩＡＭ Ｃ−６２９ （Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ ＩＡＭ Ｃ−６２９）
試験の結果、上記６種類の藻類株は顕著な４ＣＰ除去能を示さないことがわかった。
【００４４】
（実施例６）クロレラ・ブルガリスＭＫＪ−３４及びクロレラ・ブルガリスＣ−１の高温下での生育特性
クロレラ・ブルガリスＭＫＪ−３４及びクロレラ・ブルガリスＣ−１の生育に対する３０〜４５℃の範囲の温度の影響を調べた。なお、両藻類株をＬ字型試験管内に調製した２０ｍｌのＭＢＭ液体培地中、蛍光灯での光照射下（５０００ｌｕｘ、１２時間暗、１２時間明のくり返し）で４日間振盪培養を行い、濁度（ＯＤ６６０）を測定することによって生育した藻体量を測定した。両藻類株は、少なくとも３０〜４２℃の範囲で生育可能であることが確認できた。３０〜４５℃の範囲での生育を図５に示す。
【００４５】
（実施例７）クロレラ・ブルガリスＭＫＪ−３４及びクロレラ・ブルガリスＣ−１の高ＣＯ２濃度下での生育特性
クロレラ・ブルガリスＭＫＪ−３４及びクロレラ・ブルガリスＣ−１について、ＣＯ２を高濃度に含むガス通気下での生育について調べた。両藻類株を３００ｍｌ三角フラスコ内に調製した２８０ｍｌのＭＢＭ液体培地（ＮａＨＣＯ３無添加）中で、蛍光灯での光照射（５０００ｌｕｘ、１２時間暗、１２時間明のくり返し）、３５℃下の条件下で１００ｖ／ｖ％ＣＯ２と空気（０．０３８ｖ／ｖ％ＣＯ２）の混合ガスを通気しながら５日間培養を行い、濁度（ＯＤ６６０）を測定することによって生育した藻体量を測定した。図６に示すように、空気のみを通気した場合の両藻類株の生育は僅かであったが、５〜１０ｖ／ｖ％ＣＯ２通気下で良好に生育し、１５ｖ／ｖ％のＣＯ２の通気下でも生育が可能であることが確認された。
【００４６】
（実施例８）バイオレメディエーション方法
バイオレメディエーション方法としては、上記クロレラ・ブルガリスを、フェノール性水酸基を有する有害化合物を含む廃水、もしくは土壌に接触させることが挙げられるが、廃水に接触させる方法としては、包括法により、アルギン酸カルシウムのような酸性多糖類の塩に担持させて藻体ビーズとし、この藻体ビーズを充填したバイオリアクタを廃水中に浸漬する方が望ましい。以下に、本実施例におけるバイオリアクタならびに藻体ビーズの調製方法について説明する。
【００４７】
図７に示すように、バイオリアクタは、フェノール性水酸基を持つ有害化合物の除去能を有するクロレラ属の微細藻類を酸性多糖類の１つであるアルギン酸カルシウムゲルに担持させ、これを藻体ビーズ１として円筒型のカラム２に充填したものである。
【００４８】
円筒形のカラム２は、大きさが、直径３．８ｃｍ、内径１．８ｃｍ、高さ３２ｃｍであり、上部に、有害化合物を含む溶液（被処理水）を注入する注入口を、下部に、被処理水が排出される排出口を備えている。本実施例では、バイオリアクタに注入される被処理水を、温度を３０℃に保った状態で被分解基質である有害化合物の終濃度が０．１ｍＭ（１３ｐｐｍ）になるように調製し、流速約０．１ｍｌ／ｍｉｎで流し込むことにより、連続的に処理を行うことができる。なお、カラム２としては円筒形のものに限るものではなく、藻体ビーズ１を充填させることが可能なものであればどのような容器であってもよい。
【００４９】
微生物の担持法としては、包括法、物理吸着法、マイクロカプセル法などが知られているが、本実施例では、包括法で微細藻類の担持を行う。また、包括法の担体としては、アルギン酸カルシウムのような酸性多糖類の塩を用いる。酸性多糖類の塩を用いることにより、ビーズ状の形態を容易に付与することが出来る。
【００５０】
アルギン酸カルシウムを担体として用いる場合は、藻体ビーズ１を以下のような手順で調製することが出来る。例えば、本実施例では、２％アルギン酸ナトリウム溶液中に所定の濃度のクロレラ・ブルガリスＭＫＪ−３４を懸濁した液体を５％塩化カルシウム水溶液中に攪拌しながら滴下した。すると、球状の固形ゲルが得られ、これを蒸留水で洗浄することにより、藻体ビーズ１を得ることが出来た。
【００５１００５１】
上記方法で得られた藻体ビーズ３ｇを、０．１ｍＭのフェノール類をｐＨ７．０のリン酸緩衝液またはＭＯＰＳ緩衝液に懸濁した被分解基質（フェノール性水酸基を持つ有害化合物）含有水３ｍｌと共に温度３０℃の試験管内に入れ、往復振とうによる攪拌を加えると、藻体ビーズ１に担持されたクロレラ・ブルガリスＭＫＪ−３４が有害化合物を除去することができた。
【００５２】
なお、藻体ビーズ１を４ＣＰ含有水３ｍｌと共に２４時間振とうした後、ビーズの回収を繰り返し、その回数により４ＣＰ消失能力がどのように変化するかを調べた。図８に示すように、少なくとも７回までは除去率が著しく低下することなく、４ＣＰを除去することができた。この結果からも明らかなように、バイオリアクタに充填された藻体ビーズ１は、繰り返し使用することが可能である。なお、藻体ビーズ１を長期間使用すると、藻体ビーズ１と被処理水との平衡状態が崩れて膨潤する場合があるので、この場合、被処理水には、カルシウム塩等、藻体ビーズ１と被処理水との平衡状態を維持するための塩を適量混合させて用いる方がよい。これにより、藻体ビーズ１を長期間使用することが可能となる。
【００５３】
藻体ビーズ１を、円筒型のカラム２に充填してバイオリアクタとし、これを、４ＣＰを含有する被処理水に浸漬したところ、図９に示すように、７００ｍｌの被処理水に含まれる４ＣＰを、４０〜８０％の消失率で３日間連続的に除去することができた。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明は、フェノール性水酸基を持つ有害化合物に対する優れた除去能を有し、３０〜４２℃程度の温度でも生育可能であるので、被処理物の高温化という外乱に耐えうるクロレラ・ブルガリスとして用いることができる。また、このクロレラ・ブルガリスを例えばバイオリアクタに組み込むことで、パルプ工場、合成有機化学工場などから排出される廃液に含まれる有害化合物含有水の処理のような閉鎖系でのバイオレメディエーションや有害化合物を含有する土壌の浄化などの屋外で実施する開放系のバイオレメディエーションに利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】単離したクロレラ・ブルガリスＭＫＪ−３４の光学顕微鏡写真である。
【図２】単離したクロレラ・ブルガリスＣ−１の光学顕微鏡写真である。
【図３】異なる濃度のクロレラ・ブルガリスＭＫＪ−３４を添加した被処理水中の１３ｐｐｍのフェノール性水酸基を有する有害化合物の消失率（％）を示す図である。
【図４】異なる濃度のクロレラ・ブルガリスＣ−１を添加した被処理水中の１３ｐｐｍのフェノール性水酸基を有する有害化合物の消失率（％）を示す図である。
【図５】クロレラ・ブルガリスＭＫＪ−３４及びクロレラ・ブルガリスＣ−１の３０〜４５℃の範囲の温度下での生育状況を示す図である。
【図６】クロレラ・ブルガリスＭＫＪ−３４及びクロレラ・ブルガリスＣ−１のＣＯ２を高濃度に含むガス通気下での生育状況を示す図である。
【図７】本発明の実施の形態におけるバイオリアクタの正面図である。
【図８】藻体ビーズによる４ＣＰの繰り返し除去の過程を示した図である。
【図９】藻体ビーズを充填したバイオリアクタによる４ＣＰの連続的除去の結果を示した図である。
【符号の説明】
【００５６】
１ 藻体ビーズ
２ カラム
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェノール性水酸基を持つ有害化合物の除去能を有するクロレラ・ブルガリスであって、１５〜４２℃の温度範囲で生育可能なクロレラ・ブルガリス。
【請求項２】
５〜１５ｖ／ｖ％ＣＯ２通気下で生育可能な請求項１記載のクロレラ・ブルガリス。
【請求項３】
寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０９０６を有する請求項１または２に記載のクロレラ・ブルガリス。
【請求項４】
受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０９６３を有する請求項１または２に記載のクロレラ・ブルガリス。
【請求項５】
フェノール性水酸基を有する有害化合物を含む廃水に、少なくとも請求項１から４のいずれかの項に記載のクロレラ・ブルガリスを接触させる工程を有することを特徴とするバイオレメディエーション方法。
【請求項６】
フェノール性水酸基を有する有害化合物を含む土壌に、少なくとも請求項１から４のいずれかの項に記載のクロレラ・ブルガリスを接触させる工程を有することを特徴とするバイオレメディエーション方法。
【請求項７】
酸性多糖類のゲルによって形成され、フェノール性水酸基を持つ有害化合物の除去能を有するクロレラ属の微細藻類を担持したビーズを充填したバイオリアクタ。
【請求項８】
前記クロレラ属の微細藻類は、請求項１から４のいずれかの項に記載のクロレラ・ブルガリスである請求項７記載のバイオリアクタ。
【請求項９】
請求項７または８に記載のバイオリアクタを、フェノール性水酸基を有する有害化合物を含む水溶液中に浸漬し、当該水溶液から前記有害化合物を除去する有害物質除去方法。
【請求項１０】
前記酸性多糖類は、アルギン酸カルシウムであることを特徴とする請求項９記載の有害物質除去方法。
【請求項１１】
前記フェノール性水酸基を有する有害化合物が、内分泌攪乱作用を示す有害化合物であることを特徴とする請求項９または１０に記載の有害物質除去方法。
【請求項１】
フェノール性水酸基を持つ有害化合物の除去能を有するクロレラ・ブルガリスであって、１５〜４２℃の温度範囲で生育可能なクロレラ・ブルガリス。
【請求項２】
５〜１５ｖ／ｖ％ＣＯ２通気下で生育可能な請求項１記載のクロレラ・ブルガリス。
【請求項３】
寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０９０６を有する請求項１または２に記載のクロレラ・ブルガリス。
【請求項４】
受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０９６３を有する請求項１または２に記載のクロレラ・ブルガリス。
【請求項５】
フェノール性水酸基を有する有害化合物を含む廃水に、少なくとも請求項１から４のいずれかの項に記載のクロレラ・ブルガリスを接触させる工程を有することを特徴とするバイオレメディエーション方法。
【請求項６】
フェノール性水酸基を有する有害化合物を含む土壌に、少なくとも請求項１から４のいずれかの項に記載のクロレラ・ブルガリスを接触させる工程を有することを特徴とするバイオレメディエーション方法。
【請求項７】
酸性多糖類のゲルによって形成され、フェノール性水酸基を持つ有害化合物の除去能を有するクロレラ属の微細藻類を担持したビーズを充填したバイオリアクタ。
【請求項８】
前記クロレラ属の微細藻類は、請求項１から４のいずれかの項に記載のクロレラ・ブルガリスである請求項７記載のバイオリアクタ。
【請求項９】
請求項７または８に記載のバイオリアクタを、フェノール性水酸基を有する有害化合物を含む水溶液中に浸漬し、当該水溶液から前記有害化合物を除去する有害物質除去方法。
【請求項１０】
前記酸性多糖類は、アルギン酸カルシウムであることを特徴とする請求項９記載の有害物質除去方法。
【請求項１１】
前記フェノール性水酸基を有する有害化合物が、内分泌攪乱作用を示す有害化合物であることを特徴とする請求項９または１０に記載の有害物質除去方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００８−４３３２１（Ｐ２００８−４３３２１Ａ）
【公開日】平成２０年２月２８日（２００８．２．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２５０００５（Ｐ２００６−２５０００５）
【出願日】平成１８年８月１８日（２００６．８．１８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１８年２月２３日 国立大学法人 宮崎大学主催の「平成１７年度工学部物質環境化学科卒業論文発表会」において文書をもって発表
【出願人】（８０３００００７８）株式会社みやざきＴＬＯ (20)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年２月２８日（２００８．２．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年８月１８日（２００６．８．１８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１８年２月２３日 国立大学法人 宮崎大学主催の「平成１７年度工学部物質環境化学科卒業論文発表会」において文書をもって発表
【出願人】（８０３００００７８）株式会社みやざきＴＬＯ (20)
【Ｆターム（参考）】
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