グリオキシル酸の生化学的製造方法
本発明は、工業的に有利なグリオキサールからのグリオキシル酸の生化学的製造方法を提供する。詳しくは、グリオキサールをグリオキシル酸へ変換する能力を有するオキシダーゼおよびデヒドロゲナーゼなどの酸化還元酵素をグリオキサールに作用させ、グリオキシル酸へ変換することを特徴とするグリオキシル酸の製造方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は微生物および／または微生物由来の酵素を用いることによるグリオキサールからグリオキシル酸を製造する方法に関する。グリオキシル酸はバニリン、エチルバニリンなどの合成原料として用いられ、農薬、さらには医薬品の合成の中間体としても有用な化合物である。
【背景技術】
従来よりグリオキシル酸の製造方法としては、グリオキサールの硝酸酸化などの化学的手法が知られており、また現在はグリオキシル酸のほとんどがこれら化学的手法により製造されている。しかしながら、グリオキサールの硝酸酸化などの化学的手法はグリオキシル酸以外の有機酸などの副生成物を生じやすく、製造されたグリオキシル酸の品質に好ましくない影響を与え、これらを除去するためには煩雑な工程を必要とする。また、大量に使用された硝酸などの中和工程で生成する大量の塩類廃棄物の処理が問題となる。
グリオキシル酸の生化学的製造方法としては、植物由来のグリコール酸オキシダーゼを用いグリコール酸をグリオキシル酸へ変換する方法（特許特表平７−５０２８９５号公報、特表平８−５０８１５９号公報を参照）や、微生物によるグリコール酸からのグリオキシル酸への変換方法などが知られている（特開平７−１６３３８０号公報、特開平８−３２２５８１号公報参照）。しかし、エチレングリコールやアセトアルデヒドより容易に合成され、安価に入手可能な化合物であり、グリオキシル酸の化学的な合成法における原料としても用いられているグリオキサールからグリオキシル酸への生化学的手法による合成方法は、報告されていない。
また、アルデヒド基を酸化するオキシダーゼが、おもに動物、植物などに存在することが確認されているが、それら酵素がグリオキサールに対し活性を示すとの報告はない。また、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍなどの白色腐朽菌の一部が、グリオキサールと反応し過酸化水素を生成する活性を有する酵素（グリオキサールオキシダーゼと呼ばれている）を菌体外に産生することが知られている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，（１９８７），１６９，２１９５−２２０１、Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９０），８７，２９３６−２９４０参照）。しかし、これら白色腐朽菌が産生する酵素によるグリオキサールの酸化反応時の生成物の同定はなされておらず、これら木材腐朽菌の酵素は、グリオキシル酸に対してもグリオキサールと同程度の酸化活性を有するため、これらの酵素によりグリオキサールをグリオキシル酸へと変換・蓄積させることは難しい。なお、これら木材腐朽菌の酵素以外の、グリオキサールを酸化する微生物由来のオキシダーゼは報告されていない。
したがって、本発明は、グリオキサールをグリオキシル酸へ変換する活性を有する微生物および／または当該活性を有する酵素、ならびにこれらを用いた効率的なグリオキシル酸の製造方法を提供することを目的とする。
【発明の開示】
本発明者らは、グリオキシル酸の効率的な製造方法を開発すべく鋭意検討を行なった結果、グリオキサールをグリオキシル酸へ変換する活性を有する微生物を見出し、それら微生物および／または該微生物から得た酵素液を用いたグリオキシル酸合成について詳細な検討を行なうことにより本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、グリオキサールをグリオキシル酸へ変換する能力を有する酸化還元酵素、または該酸化還元酵素の産生能を有する微生物の培養液、培養液上清、菌体および菌体処理物のいずれか１種もしくは２種以上のそれらの混合物をグリオキサールに作用させ、グリオキシル酸へ変換することを特徴とするグリオキシル酸の製造方法に関する。
前記酸化還元酵素は、オキシダーゼであることが好ましい。
前記酸化還元酵素は、ステノトロフォモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、セルロシミクロビウム（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）属からなる群から選ばれる少なくとも１つの微生物から得られた酵素であることが好ましい。
前記微生物は、ステノトロフォモナス・スピーシーズ（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＫＮＫ２３５（（寄託機関 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、あて名 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、寄託日 平成１４年９月６日、受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１９００２）、ストレプトミセス・スピーシーズ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＫＮＫ２６９（（寄託機関 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、あて名 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、寄託日 平成１４年９月６日、受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５６）、シュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＫＮＫ０５８（（寄託機関 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、あて名 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、寄託日 平成１４年１２月１３日、受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５５）、シュードモナス・スピーシーズＫＮＫ２５４（（寄託機関 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、あて名 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、寄託日 平成１４年９月６日、受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１９００３）、ミクロバクテリウム・スピーシーズ（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＫＮＫ０１１（（寄託機関 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、あて名 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、寄託日 平成１４年１２月１３日、受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５４）、アクロモバクター・スピーシーズ（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）ＩＦＯ １３４９５（寄託機関 独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部・生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）、あて名 〒２９２−０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ 鎌足２−５−８）、セルロモナス・スピーシーズ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＪＣＭ ２４７１（寄託機関 独立行政法人理化学研究所微生物系統保存施設（ＪＣＭ）、あて名 〒３５１−０１９８ 日本国埼玉県和光市広沢２−１）、セルロモナス・タバタ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｔｕｒｂａｔａ）ＩＦＯ １５０１２（寄託機関 独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部・生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）、あて名 〒２９２−０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ 鎌足２−５−８）、セルロモナス・タバタＩＦＯ １５０１４（寄託機関 独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部・生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）、あて名 〒２９２−０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ 鎌足２−５−８）、セルロモナス・タバタＩＦＯ １５０１５（寄託機関 独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部・生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）、あて名 〒２９２−０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ 鎌足２−５−８）、セルロシミクロビウム・セルランス（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ Ｃｅｌｌｕｌａｎｓ）ＩＦＯ １５０１３（寄託機関 独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部・生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）、あて名 〒２９２−０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ 鎌足２−５−８）、セルロシミクロビウム・セルランスＩＦＯ １５５１６（寄託機関 独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部・生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）、あて名 〒２９２−０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ 鎌足２−５−８）、セルロシミクロビウム・セルランスＪＣＭ ６２０１（寄託機関 独立行政法人理化学研究所微生物系統保存施設（ＪＣＭ）、あて名 〒３５１−０１９８ 日本国埼玉県和光市広沢２−１）、モルガネラ・モルガニイ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ）ＩＦＯ ３８４８（寄託機関 独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部・生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）、あて名 〒２９２−０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ 鎌足２−５−８）であることが好ましい。
前記グリオキシル酸の製造方法は、反応時にカタラーゼを共存させることが好ましい。
また、本発明は、グリオキサールに作用し、グリオキシル酸を生成する微生物由来のアルデヒドオキシダーゼに関する。
前記グリオキシル酸に対する活性は、グリオキサールに対する活性の１／１０倍以下の活性であることが好ましい。
前記アルデヒドオキシダーゼは、ステノトロフォモナス属、ストレプトミセス属、シュードモナス属、ミクロバクテリウム属、アクロモバクター属、セルロモナス属、セルロシミクロビウム属、モルガネラ属からなる群から選ばれる少なくとも１つの微生物が産生するものであることが好ましい。
前記微生物は、ステノトロフォモナス・スピーシーズＫＮＫ２３５（ＦＥＲＭ Ｐ−１９００２）、ストレプトミセス・スピーシーズＫＮＫ２６９（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５６）、シュードモナス・スピーシーズＫＮＫ０５８（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５５）、シュードモナス・スピーシーズＫＮＫ２５４（ＦＥＲＭ Ｐ−１９００３）、ミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５４）、アクロモバクター・スピーシーズＩＦＯ １３４９５、セルロモナス・スピーシーズＪＣＭ ２４７１、セルロモナス・タバタＩＦＯ １５０１２、セルロモナス・タバタＩＦＯ １５０１４、セルロモナス・タバタＩＦＯ １５０１５、セルロシミクロビウム・セルランスＩＦＯ １５０１３、セルロシミクロビウム・セルランスＩＦＯ １５５１６、セルロシミクロビウム・セルランスＪＣＭ ６２０１、モルガネラ・モルガニイＩＦＯ ３８４８であることが好ましい。
前記アルデヒドオキシダーゼは、以下（１）〜（３）の理化学的性質を有するストレプトミセス属微生物が産生するアルデヒドオキシダーゼであることが好ましい。
（１）至適ｐＨ：６〜９
（２）熱安定性：ｐＨ７．２で６０℃、２０分処理したのち、９０％以上の活性を保持している
（３）分子量：ゲル濾過分析において約１１万であり、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析において、約２．５万、約３．５万、約８万の３つのサブユニットタンパク質を有する
前記アルデヒドオキシダーゼは、以下（１）〜（３）の理化学的性質を有するシュードモナス属に属する微生物が産生するアルデヒドオキシダーゼであることが好ましい。
（１）分子量：ゲル濾過分析において約１５万
（２）反応至適温度：６０〜７０℃
（３）反応至適ｐＨ：５〜７
前記アルデヒドオキシダーゼは、以下の理化学的性質を有するミクロバクテリウム属微生物が菌体内および菌体外に産生するアルデヒドオキシダーゼであることが好ましい。
分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析において約１１万の単一タンパク質
前記アルデヒドオキシダーゼは、以下の理化学的性質を有するセルロシミクロビウム属微生物が菌体内および菌体外に産生するアルデヒドオキシダーゼであることが好ましい。
分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析において約９〜１０万の単一タンパク質
前記ストレプトミセス属に属する微生物は、ストレプトミセス・スピーシーズＫＮＫ２６９（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５６）であることが好ましい。
前記シュードモナス属に属する微生物は、シュードモナス・スピーシーズＫＮＫ０５８（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５５）であることが好ましい。
前記ミクロバクテリウム属に属する微生物は、ミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５４）であることが好ましい。
前記セルロシミクロビウム属に属する微生物は、セルロシミクロビウム・セルランスＩＦＯ １５５１６であることが好ましい。
前記アルデヒドオキシダーゼは、以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をサブユニットとして有するアルデヒドオキシダーゼであることが好ましい。
（ａ）配列番号１、２もしくは３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列のいずれか１つを含むタンパク質
前記アルデヒドオキシダーゼは、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質をサブユニットとして有するアルデヒドオキシダーゼであることが好ましい。
（ａ）配列番号４、５もしくは６の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡのいずれか１つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
前記アルデヒドオキシダーゼは、以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなるアルデヒドオキシダーゼであることが好ましい。
（ａ）配列番号７、８、１１もしくは１２で表されるアミノ酸配列
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列
前記アルデヒドオキシダーゼは、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡによってコードされるアルデヒドオキシダーゼであることが好ましい。
（ａ）配列番号９、１０、１３もしくは１４の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
さらに、本発明は、前記アルデヒドオキシダーゼをコードするＤＮＡにも関する。
詳しくは、前記ＤＮＡは、以下の（ａ）または（ｂ）のいずれかを含んでなる、前記アルデヒドオキシダーゼのサブユニットをコードするＤＮＡであることが好ましい。
（ａ）配列番号４、５もしくは６の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡのいずれか１つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
前記ＤＮＡは、以下の（ａ）または（ｂ）のいずれかを含んでなる、前記アルデヒドオキシダーゼをコードするＤＮＡであることが好ましい。
（ａ）配列番号９、１０、１３もしくは１４の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡのいずれか１つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
前記ＤＮＡは、配列番号１、２または３で表わされるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列のいずれかを含んでなる、前記アルデヒドオキシダーゼのサブユニットをコードするＤＮＡであることが好ましい。
前記ＤＮＡは、配列番号７、８、１１または１２で表わされるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列のいずれかを含んでなる、前記アルデヒドオキシダーゼをコードするＤＮＡであることが好ましい。
【図面の簡単な説明】
図１は、オキシダーゼ反応の活性測定法の原理を示す図である。図２は、本発明のＫＮＫ２６９株由来酵素の反応至適ｐＨを示す図である。緩衝液として、０．１Ｍ ＭａｃＩｌｖｉｎｅ緩衝液（●）、０．１Ｍ リン酸緩衝液（○）、０．１Ｍ Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液（△）、または０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ緩衝液（×）を使用した。図３は、本発明のＫＮＫ２６９株由来酵素の熱安定性を示す図である。図４は、本発明のＫＮＫ０５８株由来酵素の反応至適温度を示す図である。図５は、本発明のＫＮＫ０５８株由来酵素の反応至適ｐＨを示す図である。緩衝液として、０．１Ｍ ＭａｃＩｌｖｉｎｅ緩衝液（●）、０．１Ｍ リン酸緩衝液（○）、または０．１Ｍ Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液（×）を使用した。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明のグリオキサールのグリオキシル酸への変換反応を式１および式２に示す。
前記式１に示される反応は、オキシダーゼまたは該オキシダーゼを含有する微生物が介在する場合であり、前記式２に示される反応は、デヒドロゲナーゼまたは該デヒドロゲナーゼを含有する微生物が介在する場合である。本明細書において、グリオキサールからグリオキシル酸への変換は、前記式１および式２に示されるどちらの反応による変換をも包含しする。したがって、グリオキサールからグリオキシル酸へ変換する能力を有する酸化還元酵素とは、オキシダーゼまたはデヒドロゲナーゼを意味し、アルデヒドをカルボン酸に変換する酵素であればいずれでも良い。とくに、グリオキシル酸を蓄積するという点で、グリオキシル酸に対しては活性を有さないか、または低い活性しか有さない酵素が好ましい。
また、該酸化還元酵素の酸性能を有する微生物の培養液、培養上清、菌体および菌体処理物のいずれか１種または２種以上の混合物を用いて、グルオキサールからグリオキシル酸への変換することも可能である。反応がデヒドロゲナーゼにより触媒される場合（式２）、基質以外に補酵素、（たとえば、ＮＡＤ（ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチド）やＮＡＤＰ（ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドリン酸））が必要である。一方、反応がオキシダーゼにより触媒される場合は（式１）、基質であるグリオキサール以外に酸素があれば反応が進行するため、コスト的観点からオキシダーゼを用いることが有利である。
反応がオキシダーゼにより触媒される場合、グリオキシル酸以外に過酸化水素が生成され、この過酸化水素を検出することにより目的のオキシダーゼ活性は容易に検出できる。本発明における目的のオキシダーゼ活性の検出、定量は、図１に示すように、酸化反応により生成する過酸化水素を４−アミノアンチピリン（以下４−ＡＡ）とＮ−エチル−（２−ヒドロキシ−３−スルフォプロピル）−ｍ−トルイジン（以下ＴＯＯＳ）と反応させ、生成するキノンイミン色素を検出、定量することにより行なうことができる。
具体的には以下の組成を含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）０．９ｍｌに、菌体懸濁液または酵素液０．１ｍｌを添加し、３０℃での波長５５５ｎｍの吸光度の増加を測定することにより行なう。本発明において、１分間に１μｍｏｌのＨ２Ｏ２を生成する酵素活性を１ｕｎｉｔと定義する。
（組成）
グリオキサール ２０ｍＭ
４−ＡＡ ０．６７ｍＭ
ＴＯＯＳ １．０９ｍＭ
ワサビ由来ペルオキシダーゼ（以下ＰＯＤ） ２Ｕ／ｍＬ
また、グリオキサールおよびグリオキシル酸の定量は、高速液体クロマトグラフィーで行なうことができる。高速クロマトグラフィーによる分析は、たとえば、バイオラッド・アミネックスＨＰＸ−８７Ｈ（７．８ｍｍ×３００ｍｍ）カラムを用い、溶媒として５ｍＭのＨ２ＳＯ４水溶液を用い、流速０．４ｍｌ／分で行なうことができる。検出は２３０ｎｍの吸光度または示差屈折率を測定することにより行なう。本条件により、グリオキサールは１６分、グリオキシル酸は１５分に溶出される。
目的のオキシダーゼ活性を有する微生物は、たとえば、以下のようなスクリーニングにより取得することができる。炭素源として、グリオキサール、エチレングリコール、プロピレングリコールまたはグリコールアルデヒド１０ｇ、硝酸アンモニウム２ｇ、リン酸水素二カリウム１ｇ、リン酸水素−ナトリウム、酵母エキス０．１ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．２ｇ、塩化カルシウム二水和物０．１ｇ（いずれも１Ｌ当り）の組成からなる、高圧蒸気殺菌された（１２１℃、２０分間）のＳ培地（ｐＨ７）５ｍｌに、日本国内より採取した土壌サンプル各２ｇを１０ｍｌの生理食塩水に懸濁後の上清液０．２ｍｌを加えて、２８℃で３〜７日間集積培養を行なった。菌が生育した培養液を２％寒天を含むＳ培地プレートに０．１ｍｌずつ塗布し、２８℃で３〜７日間培養を行なった。そののち、生育したコロニーについて、再度２％寒天培地を含むＳ培地プレートにて静置培養を行ない、生育が確認された菌株を各炭素源に対する資化性菌とした。そののち、これら資化性菌について、グリオキサールのグリオキシル酸への変換活性を調べた。それぞれの菌体を試験管中Ｓ培地５ｍｌで２８℃、３〜５日間振とう培養後、菌体を遠心分離により集め、生理食塩水で洗浄したのち、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８）０．５ｍｌに懸濁した。その菌体懸濁液０．１ｍｌを５０ｍＭグリオキサールを含む１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８）０．２ｍｌに添加し、２８℃で６〜１２時間振とうさせた。そののち、反応液を遠心分離し、上澄液を高速液体クロマトグラフィーにより分析し、グリオキシル酸の生成の確認および定量を行なった。
また、グリオキサールの酸化が前記オキシダーゼにより触媒される場合、グリオキシル酸と同時に過酸化水素が生じるので、反応時に生成する過酸化水素を検出することによりオキシダーゼ保有菌を見出すこともできる。すなわち、前記Ｓ培地で培養して得られた菌体の菌体懸濁液０．１ｍｌを５０ｍＭグリオキサール、１．３４ｍＭ ４−ＡＡ、２．１８ｍＭ ＴＯＯＳ、４Ｕ／ｍｌペルオキシダーゼ含有する１００ｍＭリン酸緩衝液０．１ｍｌに添加し、２８℃で２時間振とうし、反応液が紫色になったもの、すなわちグリオキサールに対する反応により過酸化水素が生じた株を選別することにより、グリオキサールオキシダーゼ活性を保有する菌株を取得することが可能である。
グリオキサールをグリオキシル酸へと変換する能力を有する微生物としては、ステノトロフォモナス属、ストレプトミセス属、シュードモナス属、ミクロバクテリウム属、アクロモバクター属、セルロモナス属、セルロシミクロビウム属、モルガネラ属等に属する微生物をあげることができる。それらのなかで代表的な微生物として、ステノトロフォモナス・スピーシーズＫＮＫ２３５（ＦＥＲＭ Ｐ−１９００２）、ストレプトミセス・スピーシーズＫＮＫ２６９（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５６）、シュードモナス・スピーシーズＫＮＫ０５８（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５５）、シュードモナス・スピーシーズＫＮＫ２５４（ＦＥＲＭ Ｐ−１９００３）、ミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５４）、アクロモバクター・スピーシーズＩＦＯ １３４９５、セルロモナス・スピーシーズＪＣＭ ２４７１、セルロモナス・タバタＩＦＯ １５０１２、セルロモナス・タバタＩＦＯ １５０１４、セルロモナス・タバタＩＦＯ １５０１５、セルロシミクロビウム・セルランスＩＦＯ １５０１３、セルロシミクロビウム・セルランスＩＦＯ １５５１６、セルロシミクロビウム・セルランスＪＣＭ ６２０１、モルガネラ・モルガニイＩＦＯ ３８４８などをあげることができる。これらの微生物のうちＩＦＯ １３４９５、ＩＦＯ １５０１２、ＩＦＯ １５０１４、ＩＦＯ １５０１５、ＩＦＯ １５０１３、ＩＦＯ １５５１６、ＩＦＯ ３８４８は公知であり、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部・生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）（〒２９２−０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ 鎌足２−５−８）から容易に入手することができる。ＪＣＭ ２４７１およびＪＣＭ ６２０１もまた公知であり、独立行政法人理化学研究所微生物系統保存施設（ＪＣＭ）（〒３５１−０１９８ 日本国埼玉県和光市広沢２−１）から容易に入手することができる。その他の微生物は本発明者により土壌から新たに分離・同定され、それぞれ前記寄託番号にて独立法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に寄託されている。前記ステノトロフォモナス・スピーシーズＫＮＫ２３５（以下、単にＫＮＫ２３５株という場合もある）、シュードモナス・スピーシーズＫＮＫ０５８（以下、単にＫＮＫ０５８株という場合もある）、シュードモナス・スピーシーズＫＮＫ２５４（以下、単にＫＮＫ２５４株という場合もある）およびミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１（以下、単にＫＮＫ０１１株という場合もある）の菌学的性質を表１に示す。
ストレプトミセス・スピーシーズＫＮＫ２６９株（以下、単にＫＮＫ２６９株という場合もある）の同定は以下の周知の方法にもとづき行なった。該菌株の１６ＳリボゾーマルＲＮＡ遺伝子（１６ＳｒＤＮＡ）のうち５‘末端側約５００ｂｐの領域をＰＣＲで増幅して、塩基配列を決定し、ＭｉｃｒｏＳｅｑ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ５００ｌｉｂｒａｒｙ ｖ．００２３（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、ＣＡ，ＵＳＡ）データベースを用いて相同性検索を行ない、分子系統樹を作製する方法で行なった。
前記アルデヒドオキシダーゼが、ストレプトミセス属微生物が産生するアルデヒドオキシダーゼの場合、以下（１）〜（３）の理化学的性質を有することが好ましい。
（１）至適ｐＨ：６〜９
（２）熱安定性：ｐＨ７．２で６０℃、２０分処理したのち、９０％以上の活性を保持している
（３）分子量：ゲル濾過分析において約１１万であり、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析において、約２．５万、約３．５万、約８万の３つのサブユニットタンパク質を有する
また、ストレプトミセス属微生物のなかでも、ストレプトミセス・スピーシーズＫＮＫ２６９（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５６）が好ましい。
前記アルデヒドオキシダーゼが、シュードモナス属に属する微生物が産生するアルデヒドオキシダーゼの場合、以下（１）〜（３）の理化学的性質を有することが好ましい。
（１）分子量：ゲル濾過分析において約１５万
（２）反応至適温度：６０〜７０℃
（３）反応至適ｐＨ：５〜７
また、シュードモナス属微生物のなかでも、シュードモナス・スピーシーズＫＮＫ０５８（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５５）が好ましい。
前記アルデヒドオキシダーゼが、ミクロバクテリウム属微生物が菌体内および菌体外に産生するアルデヒドオキシダーゼの場合、以下の理化学的性質を有することが好ましい。
分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析において約１１万の単一タンパク質
また、ミクロバクテリウム属微生物のなかでも、ミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５４）が好ましい。
前記アルデヒドオキシダーゼが、セルロシミクロビウム属微生物が菌体内および菌体外に産生するアルデヒドオキシダーゼの場合、以下の理化学的性質を有することが好ましい。
分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析において約９〜１０万の単一タンパク質
また、セルロシミクロビウム属微生物のなかでも、セルロシミクロビウム・セルランスＩＦＯ １５５１６が好ましい。
本発明において、グリオキサールをグリオキシル酸へ変換する能力を有する酸化還元酵素の産生能を有する微生物を培養するための培地は、その微生物が増殖し得るものであれば特に限定されない。たとえば、炭素源として、グルコースおよびシュークロースなどの糖質、エタノール、グリセロール、エチレングリコールおよびプロピレングリコールなどのアルコール類、グリオキサールなどのアルデヒド類、オレイン酸およびステアリン酸などの脂肪酸ならびにそのエステル類、菜種油および大豆油などの油類；窒素源として、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、ペプトン、ガザミノ酸、酵母エキス、肉エキスおよびコーンスチープリカーなど；無機塩類として、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸一水素カリウムおよびリン酸二水素カリウムなど；その他に、麦芽エキス、肉エキスなどを含有する通常の液体培地が使用され得る。
本発明によるグリコール酸の製造方法は、前記酸化還元酵素、または該酸化還元酵素の産生能を有する微生物の培養液、培養液から分離した微生物菌体、微生物菌体処理物、さらには微生物菌体外にも前記酸化酵素が産生される場合は培養液上清のいずれかをグリオキサールに作用させ、グリオキシル酸へと変換蓄積せしめることを特徴とする。
ここで、微生物菌体処理物とは、たとえば、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、それら菌体の破砕物、または粗酵素液などを意味する。用語「粗酵素液」には、たとえば、菌体のグラスビーズなどを用いる物理的破砕方法、酵素などを用いる生化学的方法などにより破砕または溶解した溶液、さらには遠心分離などにより該溶液中の固形物を除去して得た無細胞抽出液が含まれる。また、さらには、当業者が通常用いる方法、たとえば、透析、硫酸アンモニウム沈澱、クロマトグラフィーを単独でまたは組合わせて用い、前記無細胞抽出液を部分的に精製した酵素も「粗酵素液」に含まれる。また、微生物菌体処理物は、公知の手段で固定化して用いることもできる。固定化は当業者に周知の方法（たとえば、架橋法、物理的吸着法、包括法など）で行ない得る。
反応条件は使用する酵素、微生物またはその処理物により異なるが、最適な反応条件としては、温度は１０〜８０℃、好ましくは熱安定性の観点から２０〜４０℃の範囲、ｐＨはｐＨ４〜１２、好ましくはｐＨ安定性の観点からｐＨ６〜１０の範囲である。反応は振とう、撹拌条件下で実施するのが好ましい。
反応がオキシダーゼにより触媒される場合、反応系に過酸化水素が生成する。過酸化水素は酵素を失活させたり、グリオキシル酸をギ酸へと分解する場合もあるが、カタラーゼを添加することにより、反応により生じた過酸化水素を分解除去し、酵素の失活やグリオキシル酸の分解を防ぐことが可能である。
本発明の酵素としては、グリオキシル酸に対しては、低い活性しか示さないものが望ましい。とくに、本発明の酵素は、グリオキシル酸に対する活性が、グリオキサールに対する活性の１／１０倍以下であるものが好ましく、１／２０倍以下であることがより好ましく、１／１００倍以下であることがさらに好ましい。オキシダーゼのグリオキシル酸に対する活性が、グリオキサールに対する活性の１／１０倍をこえると、グリオキサールが酸化されて生成したグリオキシル酸がさらに酸化されるため、反応系にグリオキシル酸が蓄積されない、または蓄積量が低下する傾向がある。このように、本発明のオキシダーゼは、グリオキサールをグリオキシル酸へ変換することだけでなく、グリオキシル酸に対し活性が低いことが特徴である。グリオキサールに対し活性を示すことが知られている木材腐朽菌が産生するグリオキサールオキシダーゼは、グリオキシル酸に対しても高い活性を示す。表２に本発明酵素と木材腐朽菌が産生する酵素それぞれの、グリオキサールとグリオキシル酸に対する活性を示す。本発明酵素はグリオキサールに比べ、グリオキシル酸には非常に低い活性しか示さない。
さらに、本発明は、前記アルデヒドオキシダーゼを効果的に組換え生産するため使用することができる前記アルデヒドオキシダーゼをコードするＤＮＡに関する。詳しくは、本発明は、配列番号４、５または６の塩基配列からなるアルデヒドオキシダーゼのサブユニットをコードするＤＮＡに関し、さらには、該塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡのいずれか１つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡも、該ＤＮＡによってコードされるタンパク質をサブユニットとして有するタンパク質が、グリオキサールをグリオキシル酸へ変換する活性を有する限りにおいて、本発明のＤＮＡに含まれる。
また、本発明は、配列番号９、１０、１３または１４の塩基配列からなるアルデヒドオキシダーゼをコードするＤＮＡにも関し、さらには該塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡのいずれか１つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡも、該ＤＮＡによってコードされるタンパク質が、グリオキサールをグリオキシル酸へ変換する活性を有する限りにおいて、本発明のＤＮＡに含まれる。
また、配列番号１、２または３で表わされるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列のいずれかを含んでなるタンパク質をコードするＤＮＡも、該ＤＮＡによってコードされるタンパク質をサブユニットとして有するタンパク質が、グリオキサールをグリオキシル酸へ変換する活性を有する限りにおいて、本発明のＤＮＡに含まれる。
さらに、配列番号７、８、１１または１２で表わされるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列のいずれかを含んでなるタンパク質をコードするＤＮＡも、該ＤＮＡによってコードされるタンパク質が、グリオキサールをグリオキシル酸へ変換する活性を有する限りにおいて、本発明のＤＮＡに含まれる。
本発明は、配列番号４、５もしくは６の塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるタンパク質をサブユニットとして有するアルデヒドオキシダーゼ、または配列番号９、１０、１３もしくは１４の塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるアルデヒドオキシダーゼにも関する。さらには、配列番号４、５もしくは６の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡのいずれか１つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるタンパク質をサブユニットとして有するアルデヒドオキシダーゼ、配列番号９、１０、１３もしくは１４の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアルデヒドオキシダーゼも、グリオキサールをグリオキシル酸へ変換する活性を有する限りにおいて、本発明のオキシダーゼに含まれる。
ハイブリダイゼーションは、当業者に周知の操作により実施することができる。たとえば、具体的には、配列番号４、５、６、９、１０、１３、または１４に示した塩基配列の２本鎖ＤＮＡをニックトランスレーション法により３２Ｐで末端標識したＤＮＡをプローブＤＮＡとして用いたサザンハイブリダイゼーションにより実施できる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ 第３版２００１年（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ），Ｖｏｌ．１、チャプター６．５０〜５５参照）。任意の生物、微生物から調製した染色体ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、人工的に作製されたベクターＤＮＡ、またはこれらのＤＮＡを適当な制限酵素で消化したＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分離後、ニトロセルロースフィルターに固定し、前記プローブＤＮＡと結合するＤＮＡをオートラジオフラフィーで検出することで、本発明に使用しうるアルデヒドオキシダーゼの遺伝子を検出することができる。ハイブリダイゼーションにおけるストリンジェントな条件としては、ニトロセルロースフィルターに固定したＤＮＡと標識プローブＤＮＡを６×ＳＳＣ、５×デンハルト試薬、０．５％ ＳＤＳ、１μｇ／ｍ ｐｏｌｙ（Ａ）、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡからなる緩衝液中、６８℃でハイブリダイズし、２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳからなる緩衝液でリンスした後、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳからなる緩衝液を用い、３０℃で３０分の洗浄を２回行なう場合であり、さらにストリンジェントな条件としては１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳからなる緩衝液を用い、６５℃で３０分の洗浄を４回行なう場合である。１×ＳＳＣは０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムからなる水溶液で、１×デンハルト試薬は、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ ４００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％牛血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製、ＦｒａｃｔｉｏｎＶ）からなる。
また、本発明は、配列番号１、２もしくは３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をサブユニットとして有するアルデヒドオキシダーゼ、または配列番号７、８、１１もしくは１２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸配列からなるアルデヒドオキシダーゼにも関する。さらに、配列番号１、２または３で表されるアルデヒドオキシダーゼのサブユニットγ、βまたはαのアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列のいずれか１つを含むタンパク質も、該タンパク質をサブユニットとして有するタンパク質が、グリオキサールをグリオキシル酸へ変換する活性を有する限り、本発明のオキシダーゼに含まれる。また、配列番号７、８、１１または１２で表されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質も、グリオキサールをグリオキシル酸へ変換する活性を有する限り、本発明のオキシダーゼに含まれる。
特定のアミノ酸を欠失、置換または付加する方法としては、特定アミノ酸のコドンを欠失、または他のアミノ酸のコドンに置換、または他のアミノ酸のコドンを付加した塩基配列を含む合成ＤＮＡプライマーを使用したＰＣＲ、または化学的なＤＮＡ合成法などの公知の方法により作製した酵素の遺伝子を、遺伝子発現用のベクターに連結し、大腸菌などを宿主として組換え発現する方法などの従来公知の方法が用いられ、当業者であれば容易に実施し得る。
微生物の菌体外に分泌される酵素では、一般に遺伝子の開始コドンから数十アミノに相当する部分に分泌シグナル配列がコードされており、菌体内で合成された酵素タンパク質が菌体外に分泌される過程で分泌シグナル配列は切断されて成熟型の酵素となることが知られている。本発明に記載されている酵素のうちのいくつかでは菌体外にも活性な酵素が分泌されるが、これらの酵素の組換え生産においては、分泌シグナル配列を人為的に除去した遺伝子を用いることにより、酵素タンパク質を宿主となる微生物の菌体内に生産させて使用することができる。本発明はこの目的において使用できる分泌シグナル配列を除去した酵素遺伝子（配列番号１０および１４）も提供する。また、一方では、酵素の組換え発現において宿主微生物の菌体外に酵素を生産させる目的で、分泌シグナル配列を含んだ遺伝子（配列番号９および１３）を用いることもできる。さらには、本来の分泌シグナル配列を宿主微生物に適した分泌シグナル配列に置換したキメラ遺伝子を作製して使用することも当業者に公知の方法により可能である。
本発明に使用できる酵素の遺伝子は以下に述べる方法で得ることができる。すなわち、グリオキサールをグリオキシル酸に変換する酵素を生産する微生物の菌体または培養液から酵素タンパク質を精製し、酵素タンパク質をプロテアーゼ消化して得られるペプチドを用いて部分アミノ酸配列を決定する。次に、周知の方法により、これらの部分アミノ酸配列をもとに合成したプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行なうことによって酵素遺伝子の一部を増幅し、遺伝子内部の塩基配列を決定することができる。Ｎ−末端アミノ酸配列、またはＣ−末端近傍のアミノ酸配列から合成したＤＮＡプライマーを用いてインバースＰＣＲを行なうことでシグナル配列、Ｎ−末端アミノ酸配列およびＣ−末端アミノ酸配列などを決定することができる（Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９０、ｖｏｌ．６ Ｎｏ．５ ３７０−３７６）。塩基配列を決定したアルデヒドオキシダーゼの遺伝子はＰＣＲを用いて容易に取得できる。また、遺伝子の一部の配列を利用して公知の方法により微生物の染色体ＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから取得することが可能である。
本発明に用いる酵素は、天然酵素であってもよく、また組換え技術により得られた酵素であってもよい。組換え技術の方法としては、たとえば、酵素の遺伝子をプラスミドベクター、ファージベクターなどに挿入し、大腸菌などの細菌、酵母やカビなどの微生物、動物、植物、または動植物の細胞などの宿主を形質転換する方法などが有効である。
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例になんら限定されるものではない。
【実施例１】
エチレングリコール１０ｇ、酵母エキス１ｇ、ＮＵＴＲＩＥＮＴ ＢＲＯＴＨ（Ｄｉｆｃｏ社製）８ｇ、リン酸水素一カリウム３ｇ、リン酸水素二カリウム７ｇ（いずれも１Ｌ当り）の組成からなる液体培地（ＥＧ−ＮＢ培地（ｐＨ７））５ｍｌを大型試験管に分注し、１２１℃で２０分間高圧蒸気殺菌した。この培地に表３に示す微生物を無菌的に一白金耳植菌し、２８℃で２日間培養し、前培養液を得た。ついで、５００ｍｌ容坂口フラスコ中１００ｍｌの殺菌処理後のＥＧ−ＮＢ培地に、得られた前培養液を１ｍｌ植菌し、２８℃で３日間培養した。得られた培養液１００ｍｌより遠心分離により菌体を集め、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄後、同緩衝液（ｐＨ８．０）５ｍｌに懸濁した。本菌体懸濁液をミニビートビーター（ＢＩＯＳＰＥＣ社製）で破砕後、遠心分離により上澄液（無細胞抽出液）を得た。得られた無細胞抽出液０．８ｍｌに５００ｍＭグリオキサール水溶液０．１ｍｌ、５０，０００Ｕ／ｍｌのカタラーゼ溶液を０．１ｍｌ添加し、試験管中で、２８℃で４時間振とう反応を行ない、得られた反応液を高速液体クロマトグラフィーにより分析した。グリオキシル酸の生成量を表３にまとめた。
【実施例２】
実施例１で調製した表３記載の微生物の無細胞抽出液０．１ｍｌに、試験管中で４−ＡＡ１．３４ｍＭ、ＴＯＯＳ２．１９ｍＭ、ＰＯＤ６Ｕ／ｍｌを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）０．０５ｍｌを添加した。さらに１００ｍＭグリオキサール水溶液または水を０．０５ｍｌ添加し、２８℃、２分間振とうし、反応液の色の変化を観察した。その結果を表４に示す。いずれの微生物を用いた反応においても、グリオキサール水溶液を添加したものは反応液が濃い紫色に着色したが、グリオキサール水溶液の代わりに水を添加した場合、反応液は変色しなかった。グリオキサールの酸化反応時に過酸化水素が生成することがわかり、このことよりグリオキサールの酸化反応を触媒している酵素はオキシダーゼであることが判った。
【実施例３】
実施例１と同様な方法で調製したシュードモナス・スピーシーズＫＮＫ２５４株、ミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１株、セルロモナス・タバタＩＦＯ１５０１５株およびセルロモナス・スピーシーズＪＣＭ２４７１株の培養液１００ｍｌより遠心分離により菌体を集め、０．１ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）で洗浄後、同緩衝液５ｍｌに懸濁した。試験管中、本菌体懸濁液０．４５ｍｌに５００ｍＭグリオキサール水溶液０．０５ｍｌを添加し、４時間振とうして反応を行なった。反応後の上澄みをＨＰＬＣで分析し、生成したグリオキシル酸を算出した。その結果シュードモナス・スピーシーズＫＮＫ２５４株では２０ｍＭ、ミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１株では１４ｍＭ、セルロモナス・タバタＩＦＯ１５０１５株では３０ｍＭ、セルロモナス・スピーシーズＪＣＭ２４７１株では３３ｍＭのグリオキシル酸が生成していた。
【実施例４】
以下の方法に従って、ストレプトミセス・スピーシーズＫＮＫ２６９株より、グリオキサールをグリオキシル酸へ変換する活性を有するアルデヒドオキシダーゼの精製を行なった。
エチレングリコール１０ｇ、酵母エキス３ｇ、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ８ｇ、リン酸水素二カリウム３ｇ、リン酸水素二カリウム７ｇ（いずれも１Ｌあたり）の組成よりなる培地（ｐＨ７）５０ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコにいれて高圧蒸気殺菌後、ストレプトミセス・スピーシーズＫＮＫ２６９株を一白金耳植菌し、２８℃で３日間振とう培養し、前培養液を得た。ついで、１０リットルミニジャーに前記組成の培地６Ｌをいれて高圧蒸気殺菌後、前培養液５０ｍｌを植菌し、２８℃、通気０．５ｖｖｍ、撹拌３００ｒｐｍで２日間培養を行なった。本ミニジャー培養を繰り返し９５Ｌの培養液を取得し、ついで得られた培養液９５Ｌから遠心分離により菌体を集め、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）３Ｌに懸濁した。
得られた菌体懸濁液をダイノミル（Ｄｙｎｏ−Ｍｉｌｌ社製）で破砕後、遠心分離により菌体残渣を除き、無細胞抽出液２．５Ｌを得た。得られた無細胞抽出液２．５Ｌに氷冷下スターラーで撹拌しながら、所定量の硫酸アンモニウムを添加し、硫酸アンモニウム３０−５５％飽和で沈殿するタンパク質を遠心分離により集めた。
得られたタンパク質を０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）で溶解し、同緩衝液により透析を行なったのち、これを同緩衝液で予め平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍ（東ソー株式会社製）カラム（１３０ｍｌ）にチャージし、素通り画分を除去後、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）で溶出し、活性画分を集めた。得られた酵素液に、硫酸アンモニウムを０．６Ｍになるように添加し、０．６Ｍ硫酸アンモニウムを含む０．０５Ｍリン酸緩衝液で予め平衡化したＰｈｅｎｙｌ−トヨパール６５０Ｍ（東ソー株式会社製）カラム（３００ｍｌ）にチャージし、０．６〜０．１Ｍの硫酸アンモニウム直線濃度勾配により溶出し、活性画分を集めた。得られた酵素液を０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）により透析を行ない、予め同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍカラム（１３０ｍｌ）にチャージし、０〜０．２５Ｍの塩化ナトリウム直線濃度勾配により溶出を行ない、活性画分を集めたのち、硫酸アンモニウムを６０％飽和になるまで添加し、遠心分離により、沈殿するタンパク質を集め、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）で溶解し、同緩衝液により透析を行なった。ついで、この透析後の酵素液を、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）で予め平衡化したＢｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）カラム（１０ｍｌ）にチャージし、０〜０．１Ｍの塩化ナトリウム直線濃度勾配により溶出を行ない、活性画分を集めた。本酵素液を限外濾過により濃縮して、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）で予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ＨＲ１６／６０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）カラム（１２０ｍｌ）にチャージし、同緩衝液で溶出を行なった。分子量１７万に相当する画分に、２８０ｎｍのタンパク質吸収と活性が一致する溶出ピークを得た。本活性画分を未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したところ、単一バンドを形成した。
また、本酵素をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したところ、分子量約２．５万、３．５万、８万に相当する３つのタンパク質バンドを形成した。これらのことより、本酵素は分子量約２．５万、３．５万、８万のサブユニット構造を有することがわかった。
【実施例５】
以下の方法に従って、ミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１株より、グリオキサールをグリオキシル酸へ変換する活性を有するアルデヒドオキシダーゼの精製を行なった。
酵母エキス５ｇ、硝酸アンモニウム２ｇ、リン酸水素二カリウム２ｇ、リン酸水素一ナトリウム二水和物１ｇ、硫酸マグネシウム・七水和物０．２ｇ、塩化カルシウム・二水和物０．１ｇ（いずれも１Ｌあたり）の組成よりなる培地（ｐＨ７）５０ｍｌを５００ｍｌにいれて高圧蒸気殺菌後、ミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１株を一白金耳植金し、２８℃で３日間振とう培養し、前培養液を得た。ついで、５リットルミニジャーに前記組成の培地３Ｌをいれて高圧蒸気殺菌後、前培養液３０ｍｌを植菌し、２８℃、通気０．５ｖｖｍ、撹拌４００ｒｐｍで２８時間培養を行なった。本ミニジャー培養を繰り返し６９Ｌの培養液を取得し、ついで得られた培養液６９Ｌから遠心分離により菌体を集め、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）に懸濁した。得られた菌体懸濁液をダイノミル（Ｄｙｎｏ−Ｍｉｌｌ社製）で破砕後、遠心分離により菌体残渣を除き、無細胞抽出液２Ｌを得た。得られた無細胞抽出液２Ｌに氷冷下、スターラーで撹拌しながら、所定量の硫酸アンモニウムを添加し、硫安アンモニウム２０−４０％飽和で沈殿するタンパク質を遠心分離により集めた。
得られたタンパク質を０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）で溶解し、同緩衝液により透析を行なったのち、これを同緩衝液で予め平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍカラム（３００ｍｌ）にチャージし、０〜０．６Ｍの塩化ナトリウム直線濃度勾配により溶出し、活性画分を集めた。この活性画分に硫酸アンモニウム濃度が０．７Ｍになるように所定量の硫酸アンモニウムを添加し、予め０．７Ｍ硫酸アンモニウムを含む０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）で平衡化したＰｈｅｎｙｌ−トヨパール６５０Ｍカラム（１６０ｍｌ）にチャージ後、０．７〜０Ｍの硫酸アンモニウム直線濃度勾配により溶出し、活性画分を集めた。得られた酵素液を０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）により透析を行なった。ついで、この透析後の酵素液を０．０５Ｍリン酸緩衝液で予め平衡化したＲｅｓｏｕｃｅ Ｑ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）カラム（６ｍｌ）にチャージし、０．１５〜０．４５Ｍの塩化ナトリウム直線濃度勾配により溶出を行ない、活性画分を集めた。得られた酵素液を限外濾過により濃縮を行ない、０．３Ｍ濃度になるように、硫酸アンモニウムを添加後、０．３Ｍ硫酸アンモニウムを含む０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）で予め平衡化したＲｅｓｏｕｃｅ Ｐｈｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）カラム（６ｍｌ）にチャージし、０．３〜０Ｍの硫酸アンモニウム直線濃度勾配により溶出し、活性画分を集めた。
得られた酵素液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したところ、分子量約１１万に相当する単一のタンパク質バンドを形成した。
【実施例６】
以下の方法に従って、シュードモナス・スピーシーズＫＮＫ０５８株より、グリオキサールをグリオキシル酸へ変換するアルデヒドオキシダーゼの精製を行なった。
エチレングリコール１０ｇ、ＮＵＴＲＩＥＮＴ ＢＲＯＴＨ８ｇ、リン酸水素二カリウム７ｇ、リン酸二水素カリウム３ｇ（いずれも１Ｌあたり）の組成よりなる培地（ｐＨ７）５ｍｌを大型試験管中で高圧蒸気殺菌後、シュードモナス・スピーシーズＫＮＫ０５８株を一白金耳植菌し、２８℃で２日間培養後、ついで、本培養液を滅菌済みの前記培地５００ｍｌを含んだ２Ｌ振盪フラスコに植菌し、２８℃、１８時間、振盪培養し、前培養液を得た。ついで、殺菌済みの前記培地６０Ｌを含んだジャーファメンターに植菌し、２８℃、通気１ｖｖｍ、撹拌２００ｒｐｍで４０時間培養を行なった。得られた培養液６０Ｌから遠心分離により菌体を集め、０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）に懸濁した。得られた菌体懸濁液をＩｎｃｏｎａｔｏｒ ２０１Ｍ超音波破砕装置（株式会社久保田製作所製）で６０分間破砕後、遠心分離により菌体残渣を除き、無細胞抽出液を得た。得られた無細胞抽出液を冷却下、スターラー撹拌しながら、所定量の硫酸アンモニウムを添加し、硫酸アンモニウム２０−６０％飽和で沈殿するタンパク質を遠心分離により集めた。
得られたタンパク質を０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）で溶解し、同緩衝液により透析を行なったのち、その酵素液に１．５ＬのＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ樹脂を添加し、４℃で１時間撹拌後、未吸着のタンパク質液を濾過により除いたのち、１Ｍ塩化ナトリウムで樹脂に吸着した酵素タンパク質の溶出を行なった。
得られた酵素液を０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）で透析後、０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）で平衡化したＨｉＰｒｅｐ １６／１０−Ｑ−ＸＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）カラム（１６ｍｌ）にチャージし、０〜１Ｍの塩化ナトリウムの直線濃度勾配法により溶出を行ない、活性画分を集めた。この活性画分に硫酸アンモニウム濃度が１．２Ｍになるように所定量の硫酸アンモニウムを添加し、予め、１．２Ｍの硫酸アンモニウムを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）で平衡化したＰｈｅｎｙｌ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ＨＲ １０／１０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）カラム（１０ｍｌ）にチャージし、１．２〜０Ｍの硫酸アンモニウムの直線濃度勾配法に溶出を行ない、活性画分を集めた。次に、得られた酵素液を０．０２Ｍリン酸緩衝液で透析後、同緩衝液で平衡化したＭｏｎｏＱ ＨＲ １０／１０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）カラム（１０ｍｌ）にチャージし、塩化ナトリウムの直線濃度勾配法により溶出を行ない、活性画分を集めた。さらに得られた酵素液を０．０２Ｍの塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液で平衡化したＨｉＰｒｅｐ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ １６／６０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）カラム（６０ｍｌ）にチャージし、同緩衝液で溶出を行なった。活性画分を集め、これを０．００５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）で透析後、同緩衝液で予め平衡化したＨｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ（生化学工業株式会社製）カラム（１０ｍｌ）にチャージし、０．００５〜０．５Ｍリン酸緩衝液の直線濃度勾配法により溶出を行なった。活性画分を集め、これを０．００５ｍＭリン酸緩衝液で透析後、同緩衝液で平衡化したＢｉｏ−Ｓｃａｌｅ ＣＨＴ５−Ｉ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）カラム（６．４ｍｌ）にチャージし、０．００５〜０．５Ｍリン酸緩衝液の直線濃度勾配法により溶出を行ない、活性画分を集めた。本活性画分を未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したところ、単一バンドを形成した。
【実施例７】
以下の方法に従って、セルロシミクロビウム・セルランスＩＦＯ１５５１６株の培養上清からグリオキサールをグリオキシル酸に変換するアルデヒドオキシダーゼの精製を行なった。
酵母エキス１０ｇ、硫酸アンモニウム２ｇ、リン酸水素２カリウム１ｇ、リン酸水素１ナトリウム１ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物０．２ｇ、塩化カルシウム・２水和物０．１ｇ（いずれも１リットル当り）の組成よりなる培地（ｐＨ７）６０ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに入れ高圧蒸気滅菌後、セルロシミクロビウム・セルランスＮＢＲＣ１５５１６株を１白金耳植菌し、２８℃で２日間振とう培養し、前培養液を得た。ついで、５Ｌミニジャーに前記組成の培地３Ｌを入れ、高圧蒸気滅菌後、前培養液６０ｍｌを植菌し、２８℃、通気０．５ｖｖｍ、撹拌４００ｒｐｍで２７時間培養を行なった。同様の培養を繰返して得た合計４５Ｌの培養液をｐＨ７に調整し、遠心分離により４５Ｌの培養上清を得た。得られた培養上清を撹拌型ウルトラホルダーＵＨＰ１５０（アドバンテック東洋株式会社製）を用いて２．４Ｌに濃縮後、氷冷下、撹拌しながら所定量の硫酸アンモニウムを添加し、硫酸アンモニウム０〜６０％飽和の範囲で沈澱するタンパク質を遠心分離により集めた。得られたタンパク質を２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）で溶解し、充分量の同緩衝液に対して透析を行なったのち、同緩衝液で予め平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍカラム（３００ｍｌ）にチャージし、塩化ナトリウム０〜０．５Ｍの濃度勾配で溶出し、活性画分を集めた。この活性画分に硫酸アンモニウムを終濃度１Ｍとなるよう添加し、予め１Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７で平衡化したＰｈｅｎｙｌ−トヨパール６５０Ｍ（６０ｍｌ）にチャージし、硫酸アンモニウム１〜０．５Ｍの直線濃度勾配で溶出し、活性画分を集めた。得られた酵素液を２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７に透析し、ついで、予め同緩衝液で平衡化したＲｅｓｏｕｒｃｅＱ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）カラム（６ｍｌ）にチャージし、塩化ナトリウム０．３５Ｍを含む同緩衝液で洗浄後、塩化ナトリウム０．３５〜０．５Ｍの直線濃度勾配で溶出し、活性画分を集めた。得られた酵素液を限外濾過濃縮し、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲカラム（２４ｍｌ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）にチャージし、同緩衝液で溶出した。得られた活性画分を用いてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行なった結果、分子量９〜１０万の単一バンドを形成した。
【実施例８】
実施例１記載の方法により得たＫＮＫ２３５株、ＫＮＫ０５８株の無細胞抽出液を０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）で予め平衡化したＲｅｓｏｕｃｅ Ｑカラム（６ｍｌ）にチャージし、０〜０．５Ｍの塩化ナトリウム直線濃度勾配により溶出を行ない、活性画分を集めた。これらＫＮＫ２３５株およびＫＮＫ０５８株の粗精製酵素液と実施例４、５および７で得たストレプトミセス・スピーシーズＫＮＫ２６９株、ミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１株およびセルロシミクロビウム・セルランスＩＦＯ１５５１６株から得られた精製酵素を用い、それらのグリオキサール、グリオキシル酸に対するオキシダーゼ活性を測定した。酵素活性測定は１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）中、グリオキサールまたはグリオキシル酸１０ｍＭ、４−ＡＡ０．６７ｍＭ、ＴＯＯＳ１．０９ｍＭ、ＰＯＤ２Ｕ／ｍｌ、およびＫＮＫ２３５株およびＫＮＫ０５８株の粗精製酵素または実施例４、５および７で取得したＫＮＫ２６９株、ＫＮＫ０１１株およびＩＦＯ１５５１６株からの精製酵素を含む１．０ｍｌの反応液を３０℃で反応させ、波長５５５ｎｍの吸光度の増加を測定することにより行なった。各酵素のグリオキサールとグリオキシル酸に対する活性の比較を表５に示す。
各酵素ともグリオキシル酸には、グリオキサールに比べ低い活性しか示さなかった。
【実施例９】
実施例４で得たストレプトミセス・スピーシーズＫＮＫ２６９株から得た酵素の理化学的性質について検討した。酵素活性の測定は、基本的には、実施例８記載の方法により行なった。
（至適ｐＨ）
ｐＨ５〜９の範囲で基質としてグリオキサールを用いて活性測定を行なった。その結果を図２に示す。至適ｐＨは６〜９であった。
（熱安定性）
０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中、３０〜７０℃の各温度で２０分間処理したのち、グリオキサールを基質にして本酵素の残存する活性測定を行なった。その結果を図３に示す。７０℃の処理で９０％以上の活性が残存していた。
【実施例１０】
実施例６で得たシュードモナス・スピーシーズＫＮＫ０５８株から得た酵素の理化学的性質について検討した。酵素活性の測定は、基本的には、実施例８記載の方法により行なった。
（分子量）
本酵素の分子量はＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷカラム（東ソー株式会社製）を用いて測定した場合、約１５万であった。
（至適温度）
基質としてグリオキサールを用いて、温度２５〜７５℃の範囲で活性測定を行なった。その結果を図４に示す。６０〜７０℃の範囲で高い活性を示した。
（至適ｐＨ）
緩衝液としてＭｃＩｌｖｉｎｅ緩衝液、リン酸緩衝液またはＴｒｉｃｉｎｅ緩衝液を用いてｐＨ４〜９の範囲で基質としてグリオキサールを用いて活性測定を行なった。その結果を図５に示す。ｐＨ５〜７の範囲で高い活性を示した。
【実施例１１】
実施例４、５、６および７で得たストレプトミセス・スピーシーズＫＮＫ２６９株由来酵素、ミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１株由来酵素、シュードモナス・スピーシーズＫＮＫ０５８株由来酵素、およびセルロシミクロビウム・セルランスＩＦＯ１５５１６株由来酵素を用い、グリオキサールを基質として反応を行なった。各株由来の酵素０．２Ｕ／ｍｌ、グリオキサール５０ｍＭ、カタラーゼ５０００Ｕ／ｍｌを含む１００ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液１ｍｌを試験管に加え、３０℃、３時間振とう反応を行なった。反応後、高速液体クロマトグラフィーで分析したところ、ＫＮＫ２６９株由来酵素では７．６ｍＭ、ＫＮＫ０１１株由来酵素では２５ｍＭ、ＫＮＫ０５８株由来酵素では５．７ｍＭ、ＩＦＯ１５５１６株由来酵素では２６ｍＭのグリオキシル酸が生成した。
【実施例１２】
以下の方法によりセルロモナス・タバタＩＦＯ１５０１２株、セルロモナス・タバタＩＦＯ１５０１４株、セルロシミクロビウム・セルランスＩＦＯ１５０１３株、セルロシミクロビウム・セルランスＩＦＯ１５５１６株、セルロシミクロビウム・セルランスＪＣＭ６２０１株、ミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１株の培養菌体のアルデヒドオキシダーゼ活性を測定した。
硝酸アンモニウム２ｇ、リン酸水素二カリウム１ｇ、リン酸水素一ナトリウム１．３ｇ、酵母エキス５ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．２ｇ、塩化カルシウム０．１ｇ（いずれも１Ｌあたり）ｐＨ７の組成からなる培地５ｍｌを大型試験管に分注し、高圧蒸気殺菌した。前記の菌株を白金耳植菌し、２８℃で２日間の前培養を行なった。ついで、５００ｍｌ容坂口フラスコ中６０ｍｌの同培地に、得られた前培養液を１ｍｌ植菌し、２８℃で２日間培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集め、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７で２回洗浄後、同緩衝液５．０ｍｌに懸濁した。本菌体懸濁液１．０ｍｌに１３３ｍＭグリオキサール水溶液０．４５ｍｌ、５０，０００Ｕ／ｍｌのカタラーゼ溶液を０．０５ｍｌ添加し、試験管中で、２８℃で４時間振とう反応を行ない、得られた反応液を高速液体クロマトグラフィーにより分析した。その結果、いずれの菌株でもグリオキサールからグリオキシル酸が生成していた。
また、菌体懸濁液０．１ｍｌを５０ｍＭグリオキサール、１．３４ｍＭ ４−ＡＡ，２．１８ｍＭＴＯＯＳ、４Ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼを含有する１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液０．１ｍｌに添加し、２８℃で２時間振とうし、反応液の発色を目視する方法でオキシダーゼ活性の判定を行なった。対照としてグリオキサール無添加の同一反応系を同時に行なった。その結果、いずれの菌株でもグリオキサールを添加した場合のみオキシダーゼ活性による発色が観察され、グリオキサールがオキシダーゼによって酸化されることが明らかになった。これらの結果を表６にまとめた。
【実施例１３】
実施例１２で調製したミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１株、セルロシミクロビウム・セルランスＩＦＯ１５５１６株の培養液上清を用いてアルデヒドオキシダーゼの菌体外への分泌を確認した。培養液を遠心し、菌体を除いた培養上清をアミコンＣｅｎｔｒｉｐｌｕｓ ＹＭ−１０（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いた限外濾過により濃縮、緩衝液を１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７に交換し、１２倍濃縮液を調製した。こうして得た培養上清濃縮液０．１ｍｌを用いて実施例１２と同様にグリオキサールを基質として発色によるオキシダーゼ活性の判定を行なった。その結果、表７に示した通り、培養上清も菌体懸濁液と同等の酵素活性を示した。
【実施例１４】
実施例４で精製したストレプトミセス・スピーシーズＫＮＫ２６９株のアルデヒドオキシダーゼのアミノ酸配列を以下の方法で決定した。酵素を構成する３種類のサブユニットを分離するために逆相ＨＰＬＣを用いた。カラムはＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰカラム（２５０×４．６ｍｍ）（ＹＭＣ社製）を使用し、移動相には０．１％トリフルオロ酢酸を用い、精製酵素３００μｇをチャージしたのち、アセロニトリル０〜５６％（流速１ｍｌ／分、１１０分）の直線濃度勾配で溶出する方法でサブユニットを分離した。保持時間約８５分で分子量２．５万（以下サブユニットγ）、約９０分で分子量３．５万（以下サブユニットβ）、約９２分で分子量８万（以下サブユニットα）が溶出された。分取した各サブユニットタンパク質の１／１０を使用して、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ ４９０ ｐｒｏｃｉｓｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いたエドマン分解法でＮ末端アミノ酸配列を決定した。次に、各サブユニットタンパク質の内部アミノ酸配列を決定した。各サブユニットタンパク質の残り全量を９Ｍ尿素で変性後、緩衝液を０．３Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ９．０に交換し、リジルエンドペプチダーゼで３０℃、１９時間消化した。分解物をＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰカラムを用いて逆相ＨＰＬＣ法により精製した。移動相に０．１％トリフルオロ酢酸を用い、アセロニトリル１０〜４８％までの直線濃度勾配でペプチドを溶出した。溶出した各ピークを分取し、同様の方法でサブユニット内部のアミノ酸配列を決定した。得られたアミノ酸配列のうち主なものを配列番号１５〜２０に示した。
【実施例１５】
決定した部分アミノ酸配列をもとにミックストＤＮＡプライマー（配列番号２１〜２６）を合成し、ストレプトミセス・スピーシーズＫＮＫ２６９株のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造株式会社製）を用い、ＧＣ緩衝液（宝酒造株式会社製）中でＰＣＲを行なった。得られた増幅ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてバンドを形成したＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡを用いて、直接シークエンシング、またはｐＴ７Ｂｌｕｅ−２（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にＴＡクローニングしたのち、プラスミドを用いてＤＮＡシークエンシングを行ない、塩基配列を決定した。配列番号２１〜２６に示したプライマー（１）と（２）、（３）と（４）および（５）と（６）の組合せでＰＣＲを行なって得られた増幅ＤＮＡの配列をアミノ酸に変換し、実施例１４で決定したアミノ酸配列と照合し、整列した結果、３種類のサブユニットをコードする遺伝子は、上流からγ、α、βの順にゲノム上に隣接、または一部重複して存在していた。ミックストプライマー部分の塩基配列決定には周辺の塩基配列をプライマーとして用いて同様の方法で決定した。こうしてサブユニットγ、α、βの全遺伝子をコードするゲノム領域のうちサブユニットγのＮ末端近傍とサブユニットαのＣ末端近傍を除いた全塩基配列を決定した。得られた塩基配列から導かれたアミノ酸配列は実施例１４で得られた各サブユニットの部分アミノ酸配列と完全に一致した。決定したサブユニットγ、α、βのアミノ酸配列を配列番号１〜３に、塩基配列を配列番号４〜６に示した。配列番号１および４は、それぞれ、サブユニットγの精製タンパク質のＮ末端以降のアミノ酸配列、およびＧｌｕ１２から終止コドンまでの塩基配列を示している。配列番号２および５は、それぞれ、サブユニットβの全アミノ酸配列、および開始コドンから終止コドンまでの全塩基配列を示している。配列番号３および６は、それぞれ、サブユニットαのＭｅｔ１からＴｈｒ６９３までのアミノ酸配列、および開始コドンからＡｒｇ６８５までの塩基配列を示している。配列番号１８に示す精製したＫＮＫ２６９株由来酵素のサブユニットαのＮ末端アミノ酸配列は、遺伝子配列から決定した配列番号３のアミノ酸配列のＡｌａ５から始まっていた。
【実施例１６】
実施例５で精製したミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１株アルデヒドオキシダーゼのアミノ酸配列を決定した。限外濾過膜を用いて脱塩した精製酵素１０μｇを使用し、実施例１４で用いたのと同様の方法でＮ末端アミノ酸配列を決定した。次に、タンパク質内部のアミノ酸配列を決定するため、精製酵素のプロテアーゼ消化ペプチドのアミノ酸配列決定を行なった。精製酵素１００μｇを９Ｍ尿素で変性後、緩衝液を０．２Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ９．０に交換し、リジルエンドペプチダーゼで３０℃、１６時間消化した。こうして得た消化ペプチド混合物をＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰカラム（２５０×４．６ｍｍ）を用いた逆相ＨＰＬＣにより実施例１４と同様の方法で分離した。溶出した各ピークを分取し、同様の方法でアミノ酸配列を決定し、酵素タンパク質の内部部分アミノ酸配列を決定した。得られたアミノ酸の主なものを配列番号２７〜２９に示した。
【実施例１７】
決定した部分アミノ酸配列をもとにミックストＤＮＡプライマー（配列番号３０〜３３）を合成し、ミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１株のゲノムＤＮＡを鋳型として実施例１５と同様の方法でＰＣＲを行なった。増幅ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてバンドを形成したＤＮＡを抽出し、直接、またはｐＴ７Ｂｌｕｅ−２にＴＡクローニングしたのち、ＤＮＡシークエンシングを行なって塩基配列を決定した。配列番号３０〜３３のプライマー（１）と（２）、（３）と（４）の組合せのＰＣＲから得られた塩基配列とアミノ酸配列を照合し、実施例１５と同様の方法によって精製酵素のＮ末端とＣ末端周辺を除く約２．８ｋｂの塩基配列を決定した。精製酵素Ｎ末端とＣ末端周辺の塩基配列決定は、インバースＰＣＲ法によって行なった（Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９０、Ｖｏｌ．６ Ｎｏ．５ ３７０−３７６参照）。ゲノムＤＮＡを各種の制限酵素で処理したのち、終濃度２．５ｎｇ／ｍｌでセルフライゲーションし、各末端近傍の塩基配列から合成したプライマーを用いてＰＣＲを行なった。得られた増幅ＤＮＡをｐＴ７Ｂｌｕｅ−２にライゲーションしたのち、同様に塩基配列を決定した。ゲノムＤＮＡのＰｖｕＩ消化物を用いたインバースＰＣＲで得られた約６５０塩基の増幅バンドから開始コドン上流から精製酵素のＮ末端下流の配列、ＡｐａＩ消化物を用いたインバースＰＣＲで得られた約１．９ｋ塩基の増幅バンドから終止コドン周辺の塩基配列を決定した。こうして決定した開始コドンから終止コドンまでの遺伝子全長は３３４８塩基、アミノ酸配列にして１１１５残基であった。この塩基配列から導かれたアミノ酸は精製酵素のアミノ酸配列分析で得られたアミノ酸配列と完全に一致していた。一方、菌体から精製した酵素のＮ末端は、開始コドンＭｅｔ１から数えて４７番目のＶａｌであった。ミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１株は培養液上清にも同一の酵素を産生していることから、Ｍｅｔ１からＡｌａ４６間は分泌シグナル配列として分泌過程で切断されることが明らかになった。決定した酵素タンパク質、酵素遺伝子の全アミノ酸配列、全塩基配列を配列番号７、９に示した。分泌後の成熟型酵素の全アミノ酸配列とこれをコードする塩基配列を配列番号８、１０に示した。
【実施例１８】
実施例１７で遺伝子配列を決定したミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１株のアルデヒドオキシダーゼの遺伝子を発現用ベクターにクローニングし、発現実験を行なった。Ａｌａ４６のコドンを開始コドンａｔｇに置換し、制限酵素ＮｄｅＩ認識配列を付加した合成プライマー（配列番号３４）と終止コドン下流６３〜６８塩基に制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列を付加した相補配列の合成プライマー（配列番号３５）を用い、ミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１株のゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲを行ない、約３．７ｋｂの増幅バンドを得た。このバンドを形成したＤＮＡをアガロースゲル電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて抽出し、ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。消化ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動して同様に抽出し、ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩ消化した発現ベクターｐＵＣＮＴ（特開２００３−１１６５５２）にライゲーションし、Ｅ．コリＤＨ５αに形質転換した。得られた形質転換株をアンピシリン１００μｇを含むＬＢ培地で一晩培養後、新しい同培地に継植して培養し、２時間後に１ｍＭのＩＰＴＧを添加して５時間培養後、培養菌体をＳＤＳ処理して全タンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行なった結果、約１１ｋＤａの位置に酵素タンパク質のバンドが確認できた。
【実施例１９】
実施例７で得られたセルロシミクロビウム・セルランスＩＦＯ１５５１６株のアルデヒドオキシダーゼを用いてアミノ酸配列の決定を行なった。限外濾過膜を用いて脱塩した精製酵素１０μｇを使用し、プロテインシークエンシングシステム モデル４９０プロサイズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてアミノ酸配列を決定した。次に、精製酵素１００μｇを９Ｍ尿素で変性後、緩衝液を０．２Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ９．０に交換し、リジルエンドペプチダーゼで３０℃、１６時間消化した。分解物をＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰカラム（ＹＭＣ社製）を用いて逆相ＨＰＬＣ法により精製した。移動相に０．１％トリフルオロ酢酸を用い、アセロニトリル１０〜５５％までの直線濃度勾配でペプチドを溶出した。溶出した各ピークを分取し、同様にタンパク質内部のアミノ酸配列を決定した。得られたアミノ酸配列の主なものを配列番号３６〜３８に示した。
【実施例２０】
実施例１９で決定した部分アミノ酸配列をもとに合成したミックストＤＮＡプライマー（配列番号３９〜４１）、およびミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１株のアルデヒドオキシダーゼの遺伝子の２５２１〜２５４５塩基の相補鎖ＤＮＡのミックストＤＮＡプライマー（配列番号４２）を用いて、セルロシミクロビウム・セルランスＩＦＯ１５５１６株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行なった。配列番号３９〜４２のプライマー（１）と（２）、（３）と（４）の組合せのＰＣＲで得られた増幅ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてバンドを形成したＤＮＡを抽出した。これらのＤＮＡを、直接、またはｐＴ７Ｂｌｕｅ−２にＴＡクローニングしたのち、ＤＮＡシークエンシングを行なって塩基配列を決定した。得られた塩基配列を、アミノ酸配列と照合し、実施例１５と同様の方法によって精製酵素のＮ末端とＣ末端周辺を除く約２．５ｋｂの塩基配列を決定した。精製酵素Ｎ末端とＣ末端周辺の塩基配列決定は実施例１７と同様にインバースＰＣＲ法によって行なった。ゲノムＤＮＡを各種の制限酵素で処理したのち、終濃度２．５ｎｇ／ｍｌでセルフライゲーションし、各末端近傍の塩基配列から合成したプライマーを用いてＰＣＲを行なった。得られた増幅ＤＮＡをｐＴ７Ｂｌｕｅ−２にライゲーションしたのち、同様に塩基配列を決定した。ゲノムＤＮＡのＮａｅＩ消化物を用いたインバースＰＣＲで得られた約１ｋｂの増幅バンドから開始コドン上流から精製酵素のＮ末端下流の配列、ＮｃｏＩ消化物を用いたインバースＰＣＲで得られた約１．１ｋｂの増幅バンドから終止コドン周辺の塩基配列を決定した。こうして決定した開始コドンから終止コドンまでの遺伝子全長は３３２４塩基、アミノ酸配列にして１１０７残基であった。この塩基配列から導かれたアミノ酸は精製酵素のアミノ酸配列分析で得られたアミノ酸配列と完全に一致していた。菌体から精製した酵素のＮ末端は、開始コドンＭｅｔ１から数えて３９番目のＡｓｐであった。培地中に分泌された酵素ではＭｅｔ１からＡｌａ３８は分泌シグナル配列として分泌過程で切断されていた。決定した酵素タンパク質、酵素遺伝子の全アミノ酸配列、全塩基配列を配列番号１１、１３に示した。分泌後の成熟型酵素の全アミノ酸配列とこれをコードする塩基配列を配列番号１２、１４に示した。
【産業上の利用可能性】
本発明による微生物、酵素を用いたグリオキサールからのグリオキシル酸の製造方法によれば、温和な条件でグリオキシル酸を製造することが可能であり、従来の硝酸酸化法などの化学的合成方法で問題点であった大量の塩類の生成などなくグリオキシル酸を製造できる。
【配列表フリーテキスト】
配列番号１：アルデヒドオキシダーゼのサブユニットγのアミノ酸配列
配列番号２：アルデヒドオキシダーゼのサブユニットβのアミノ酸配列
配列番号３：アルデヒドオキシダーゼのサブユニットαのアミノ酸配列
配列番号４：アルデヒドオキシダーゼのサブユニットγのＤＮＡ配列
配列番号５：アルデヒドオキシダーゼのサブユニットβのＤＮＡ配列
配列番号６：アルデヒドオキシダーゼのサブユニットαのＤＮＡ配列
配列番号７：シグナルペプチドを含むアルデヒドオキシダーゼのアミノ酸配列
配列番号８：アルデヒドオキシダーゼのアミノ酸配列
配列番号９：シグナルペプチドを含むアルデヒドオキシダーゼのＤＮＡ配列
配列番号１０：アルデヒドオキシダーゼのＤＮＡ配列
配列番号１１：シグナルペプチドを含むアルデヒドオキシダーゼのアミノ酸配列
配列番号１２：アルデヒドオキシダーゼのアミノ酸配列
配列番号１３：シグナルペプチドを含むアルデヒドオキシダーゼのＤＮＡ配列
配列番号１４：アルデヒドオキシダーゼのＤＮＡ配列
配列番号１５：アルデヒドオキシダーゼのサブユニットγのＮ末端アミノ酸配列
配列番号１６：アルデヒドオキシダーゼのサブユニットβのＮ末端アミノ酸配列
配列番号１７：アルデヒドオキシダーゼのサブユニットβのアミノ酸配列（Ａｌａ２３１〜Ａｌａ２６６）
配列番号１８：アルデヒドオキシダーゼのサブユニットαのＮ末端アミノ酸配列
配列番号１９：アルデヒドオキシダーゼのサブユニットαのアミノ酸配列（Ｌｅｕ２６１〜Ｇｌｕ２９８）
配列番号２０：アルデヒドオキシダーゼのサブユニットαのアミノ酸配列（Ｇｌｙ６５９〜Ｔｈｒ６９３）
配列番号２１：ストレプトミセス・スピーシーズＫＮＫ２６９株のアルデヒドオキシダーゼのサブユニットγのＮ末端アミノ酸配列に対応するミックストＤＮＡプライマー（１）
配列番号２２：ストレプトミセス・スピーシーズＫＮＫ２６９株のアルデヒドオキシダーゼのサブユニットβのアミノ酸配列（Ａｓｐ２５１〜Ａｌａ２５８）に対応する相補的なミックストＤＮＡプライマー（２）
配列番号２３：ストレプトミセス・スピーシーズＫＮＫ２６９株のアルデヒドオキシダーゼのサブユニットβのアミノ酸配列（Ａｓｐ２５１〜Ａｌａ２５８）に対応するミックストＤＮＡプライマー（３）
配列番号２４：ストレプトミセス・スピーシーズＫＮＫ２６９株のアルデヒドオキシダーゼのサブユニットαのアミノ酸配列（Ｌｅｕ２７４〜Ｇｌｕ２８１）に対応する相補的なミックストＤＮＡプライマー（４）
配列番号２５：ストレプトミセス・スピーシーズＫＮＫ２６９株のアルデヒドオキシダーゼのサブユニットαのアミノ酸配列（Ｌｅｕ２７４〜Ｇｌｕ２８１）に対応するミックストＤＮＡプライマー（５）
配列番号２６：ストレプトミセス・スピーシーズＫＮＫ２６９株のアルデヒドオキシダーゼのサブユニットαのアミノ酸配列（Ｌｅｕ６８６〜Ｇｌｕ６９３）に対応する相補的なミックストＤＮＡプライマー（６）
配列番号２７：アルデヒドオキシダーゼのＮ末端アミノ酸配列
配列番号２８：アルデヒドオキシダーゼの内部アミノ酸配列
配列番号２９：アルデヒドオキシダーゼの内部アミノ酸配列
配列番号３０：ミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１株由来のアルデヒドオキシダーゼのＮ末端アミノ酸配列に対応するミックストＤＮＡプライマー（１）
配列番号３１：ミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１株由来のアルデヒドオキシダーゼのアミノ酸配列（Ａｓｐ５１３〜Ｐｈｅ５２１）に対応する相補的なミックストＤＮＡプライマー（２）
配列番号３２：ミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１株由来のアルデヒドオキシダーゼのアミノ酸配列（Ａｓｐ５１３〜Ｐｈｅ５２１）に対応するミックストＤＮＡプライマー（３）
配列番号３３：ミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１株由来のアルデヒドオキシダーゼのアミノ酸配列（Ｐｈｅ９５９〜Ｔｈｒ９６９）に対応する相補的なミックストＤＮＡプライマー（４）
配列番号３４：ミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１株由来のアルデヒドオキシダーゼの、クローニングのためのＮｄｅＩ制限部位を含むＤＮＡプライマー
配列番号３５：ミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１株由来のアルデヒドオキシダーゼの、クローニングのためのＥｃｏＲＩ制限部位を含むＤＮＡプライマー
配列番号３６：アルデヒドオキシダーゼのＮ末端アミノ酸配列
配列番号３７：アルデヒドオキシダーゼの内部アミノ酸配列
配列番号３８：アルデヒドオキシダーゼの内部アミノ酸配列
配列番号３９：セルロシミクロビウム・セルランスＩＦＯ１５５１６株由来のアルデヒドオキシダーゼのＮ末端アミノ酸配列に対応するミックストＤＮＡプライマー（１）
配列番号４０：セルロシミクロビウム・セルランスＩＦＯ１５５１６株由来のアルデヒドオキシダーゼのアミノ酸配列（Ｉｌｅ３５０〜Ｖａｌ３５８）に対応する相補的なミックストＤＮＡプライマー（２）
配列番号４１：セルロシミクロビウム・セルランスＩＦＯ１５５１６株由来のアルデヒドオキシダーゼのアミノ酸配列（Ｔｈｒ１７６〜Ｔｈｒ１８３）に対応するミックストＤＮＡプライマー（３）
配列番号４２：ミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１由来のアルデヒドオキシダーゼのＤＮＡ配列（２５２１〜２５４５）に対応する相補的なミックストＤＮＡプライマー（４）
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【技術分野】
本発明は微生物および／または微生物由来の酵素を用いることによるグリオキサールからグリオキシル酸を製造する方法に関する。グリオキシル酸はバニリン、エチルバニリンなどの合成原料として用いられ、農薬、さらには医薬品の合成の中間体としても有用な化合物である。
【背景技術】
従来よりグリオキシル酸の製造方法としては、グリオキサールの硝酸酸化などの化学的手法が知られており、また現在はグリオキシル酸のほとんどがこれら化学的手法により製造されている。しかしながら、グリオキサールの硝酸酸化などの化学的手法はグリオキシル酸以外の有機酸などの副生成物を生じやすく、製造されたグリオキシル酸の品質に好ましくない影響を与え、これらを除去するためには煩雑な工程を必要とする。また、大量に使用された硝酸などの中和工程で生成する大量の塩類廃棄物の処理が問題となる。
グリオキシル酸の生化学的製造方法としては、植物由来のグリコール酸オキシダーゼを用いグリコール酸をグリオキシル酸へ変換する方法（特許特表平７−５０２８９５号公報、特表平８−５０８１５９号公報を参照）や、微生物によるグリコール酸からのグリオキシル酸への変換方法などが知られている（特開平７−１６３３８０号公報、特開平８−３２２５８１号公報参照）。しかし、エチレングリコールやアセトアルデヒドより容易に合成され、安価に入手可能な化合物であり、グリオキシル酸の化学的な合成法における原料としても用いられているグリオキサールからグリオキシル酸への生化学的手法による合成方法は、報告されていない。
また、アルデヒド基を酸化するオキシダーゼが、おもに動物、植物などに存在することが確認されているが、それら酵素がグリオキサールに対し活性を示すとの報告はない。また、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍなどの白色腐朽菌の一部が、グリオキサールと反応し過酸化水素を生成する活性を有する酵素（グリオキサールオキシダーゼと呼ばれている）を菌体外に産生することが知られている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，（１９８７），１６９，２１９５−２２０１、Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９０），８７，２９３６−２９４０参照）。しかし、これら白色腐朽菌が産生する酵素によるグリオキサールの酸化反応時の生成物の同定はなされておらず、これら木材腐朽菌の酵素は、グリオキシル酸に対してもグリオキサールと同程度の酸化活性を有するため、これらの酵素によりグリオキサールをグリオキシル酸へと変換・蓄積させることは難しい。なお、これら木材腐朽菌の酵素以外の、グリオキサールを酸化する微生物由来のオキシダーゼは報告されていない。
したがって、本発明は、グリオキサールをグリオキシル酸へ変換する活性を有する微生物および／または当該活性を有する酵素、ならびにこれらを用いた効率的なグリオキシル酸の製造方法を提供することを目的とする。
【発明の開示】
本発明者らは、グリオキシル酸の効率的な製造方法を開発すべく鋭意検討を行なった結果、グリオキサールをグリオキシル酸へ変換する活性を有する微生物を見出し、それら微生物および／または該微生物から得た酵素液を用いたグリオキシル酸合成について詳細な検討を行なうことにより本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、グリオキサールをグリオキシル酸へ変換する能力を有する酸化還元酵素、または該酸化還元酵素の産生能を有する微生物の培養液、培養液上清、菌体および菌体処理物のいずれか１種もしくは２種以上のそれらの混合物をグリオキサールに作用させ、グリオキシル酸へ変換することを特徴とするグリオキシル酸の製造方法に関する。
前記酸化還元酵素は、オキシダーゼであることが好ましい。
前記酸化還元酵素は、ステノトロフォモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、セルロシミクロビウム（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）属からなる群から選ばれる少なくとも１つの微生物から得られた酵素であることが好ましい。
前記微生物は、ステノトロフォモナス・スピーシーズ（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＫＮＫ２３５（（寄託機関 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、あて名 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、寄託日 平成１４年９月６日、受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１９００２）、ストレプトミセス・スピーシーズ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＫＮＫ２６９（（寄託機関 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、あて名 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、寄託日 平成１４年９月６日、受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５６）、シュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＫＮＫ０５８（（寄託機関 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、あて名 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、寄託日 平成１４年１２月１３日、受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５５）、シュードモナス・スピーシーズＫＮＫ２５４（（寄託機関 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、あて名 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、寄託日 平成１４年９月６日、受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１９００３）、ミクロバクテリウム・スピーシーズ（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＫＮＫ０１１（（寄託機関 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、あて名 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、寄託日 平成１４年１２月１３日、受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５４）、アクロモバクター・スピーシーズ（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）ＩＦＯ １３４９５（寄託機関 独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部・生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）、あて名 〒２９２−０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ 鎌足２−５−８）、セルロモナス・スピーシーズ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＪＣＭ ２４７１（寄託機関 独立行政法人理化学研究所微生物系統保存施設（ＪＣＭ）、あて名 〒３５１−０１９８ 日本国埼玉県和光市広沢２−１）、セルロモナス・タバタ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｔｕｒｂａｔａ）ＩＦＯ １５０１２（寄託機関 独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部・生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）、あて名 〒２９２−０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ 鎌足２−５−８）、セルロモナス・タバタＩＦＯ １５０１４（寄託機関 独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部・生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）、あて名 〒２９２−０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ 鎌足２−５−８）、セルロモナス・タバタＩＦＯ １５０１５（寄託機関 独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部・生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）、あて名 〒２９２−０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ 鎌足２−５−８）、セルロシミクロビウム・セルランス（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ Ｃｅｌｌｕｌａｎｓ）ＩＦＯ １５０１３（寄託機関 独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部・生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）、あて名 〒２９２−０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ 鎌足２−５−８）、セルロシミクロビウム・セルランスＩＦＯ １５５１６（寄託機関 独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部・生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）、あて名 〒２９２−０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ 鎌足２−５−８）、セルロシミクロビウム・セルランスＪＣＭ ６２０１（寄託機関 独立行政法人理化学研究所微生物系統保存施設（ＪＣＭ）、あて名 〒３５１−０１９８ 日本国埼玉県和光市広沢２−１）、モルガネラ・モルガニイ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ）ＩＦＯ ３８４８（寄託機関 独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部・生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）、あて名 〒２９２−０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ 鎌足２−５−８）であることが好ましい。
前記グリオキシル酸の製造方法は、反応時にカタラーゼを共存させることが好ましい。
また、本発明は、グリオキサールに作用し、グリオキシル酸を生成する微生物由来のアルデヒドオキシダーゼに関する。
前記グリオキシル酸に対する活性は、グリオキサールに対する活性の１／１０倍以下の活性であることが好ましい。
前記アルデヒドオキシダーゼは、ステノトロフォモナス属、ストレプトミセス属、シュードモナス属、ミクロバクテリウム属、アクロモバクター属、セルロモナス属、セルロシミクロビウム属、モルガネラ属からなる群から選ばれる少なくとも１つの微生物が産生するものであることが好ましい。
前記微生物は、ステノトロフォモナス・スピーシーズＫＮＫ２３５（ＦＥＲＭ Ｐ−１９００２）、ストレプトミセス・スピーシーズＫＮＫ２６９（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５６）、シュードモナス・スピーシーズＫＮＫ０５８（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５５）、シュードモナス・スピーシーズＫＮＫ２５４（ＦＥＲＭ Ｐ−１９００３）、ミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５４）、アクロモバクター・スピーシーズＩＦＯ １３４９５、セルロモナス・スピーシーズＪＣＭ ２４７１、セルロモナス・タバタＩＦＯ １５０１２、セルロモナス・タバタＩＦＯ １５０１４、セルロモナス・タバタＩＦＯ １５０１５、セルロシミクロビウム・セルランスＩＦＯ １５０１３、セルロシミクロビウム・セルランスＩＦＯ １５５１６、セルロシミクロビウム・セルランスＪＣＭ ６２０１、モルガネラ・モルガニイＩＦＯ ３８４８であることが好ましい。
前記アルデヒドオキシダーゼは、以下（１）〜（３）の理化学的性質を有するストレプトミセス属微生物が産生するアルデヒドオキシダーゼであることが好ましい。
（１）至適ｐＨ：６〜９
（２）熱安定性：ｐＨ７．２で６０℃、２０分処理したのち、９０％以上の活性を保持している
（３）分子量：ゲル濾過分析において約１１万であり、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析において、約２．５万、約３．５万、約８万の３つのサブユニットタンパク質を有する
前記アルデヒドオキシダーゼは、以下（１）〜（３）の理化学的性質を有するシュードモナス属に属する微生物が産生するアルデヒドオキシダーゼであることが好ましい。
（１）分子量：ゲル濾過分析において約１５万
（２）反応至適温度：６０〜７０℃
（３）反応至適ｐＨ：５〜７
前記アルデヒドオキシダーゼは、以下の理化学的性質を有するミクロバクテリウム属微生物が菌体内および菌体外に産生するアルデヒドオキシダーゼであることが好ましい。
分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析において約１１万の単一タンパク質
前記アルデヒドオキシダーゼは、以下の理化学的性質を有するセルロシミクロビウム属微生物が菌体内および菌体外に産生するアルデヒドオキシダーゼであることが好ましい。
分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析において約９〜１０万の単一タンパク質
前記ストレプトミセス属に属する微生物は、ストレプトミセス・スピーシーズＫＮＫ２６９（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５６）であることが好ましい。
前記シュードモナス属に属する微生物は、シュードモナス・スピーシーズＫＮＫ０５８（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５５）であることが好ましい。
前記ミクロバクテリウム属に属する微生物は、ミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５４）であることが好ましい。
前記セルロシミクロビウム属に属する微生物は、セルロシミクロビウム・セルランスＩＦＯ １５５１６であることが好ましい。
前記アルデヒドオキシダーゼは、以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をサブユニットとして有するアルデヒドオキシダーゼであることが好ましい。
（ａ）配列番号１、２もしくは３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列のいずれか１つを含むタンパク質
前記アルデヒドオキシダーゼは、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質をサブユニットとして有するアルデヒドオキシダーゼであることが好ましい。
（ａ）配列番号４、５もしくは６の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡのいずれか１つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
前記アルデヒドオキシダーゼは、以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなるアルデヒドオキシダーゼであることが好ましい。
（ａ）配列番号７、８、１１もしくは１２で表されるアミノ酸配列
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列
前記アルデヒドオキシダーゼは、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡによってコードされるアルデヒドオキシダーゼであることが好ましい。
（ａ）配列番号９、１０、１３もしくは１４の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
さらに、本発明は、前記アルデヒドオキシダーゼをコードするＤＮＡにも関する。
詳しくは、前記ＤＮＡは、以下の（ａ）または（ｂ）のいずれかを含んでなる、前記アルデヒドオキシダーゼのサブユニットをコードするＤＮＡであることが好ましい。
（ａ）配列番号４、５もしくは６の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡのいずれか１つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
前記ＤＮＡは、以下の（ａ）または（ｂ）のいずれかを含んでなる、前記アルデヒドオキシダーゼをコードするＤＮＡであることが好ましい。
（ａ）配列番号９、１０、１３もしくは１４の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡのいずれか１つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
前記ＤＮＡは、配列番号１、２または３で表わされるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列のいずれかを含んでなる、前記アルデヒドオキシダーゼのサブユニットをコードするＤＮＡであることが好ましい。
前記ＤＮＡは、配列番号７、８、１１または１２で表わされるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列のいずれかを含んでなる、前記アルデヒドオキシダーゼをコードするＤＮＡであることが好ましい。
【図面の簡単な説明】
図１は、オキシダーゼ反応の活性測定法の原理を示す図である。図２は、本発明のＫＮＫ２６９株由来酵素の反応至適ｐＨを示す図である。緩衝液として、０．１Ｍ ＭａｃＩｌｖｉｎｅ緩衝液（●）、０．１Ｍ リン酸緩衝液（○）、０．１Ｍ Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液（△）、または０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ緩衝液（×）を使用した。図３は、本発明のＫＮＫ２６９株由来酵素の熱安定性を示す図である。図４は、本発明のＫＮＫ０５８株由来酵素の反応至適温度を示す図である。図５は、本発明のＫＮＫ０５８株由来酵素の反応至適ｐＨを示す図である。緩衝液として、０．１Ｍ ＭａｃＩｌｖｉｎｅ緩衝液（●）、０．１Ｍ リン酸緩衝液（○）、または０．１Ｍ Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液（×）を使用した。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明のグリオキサールのグリオキシル酸への変換反応を式１および式２に示す。
前記式１に示される反応は、オキシダーゼまたは該オキシダーゼを含有する微生物が介在する場合であり、前記式２に示される反応は、デヒドロゲナーゼまたは該デヒドロゲナーゼを含有する微生物が介在する場合である。本明細書において、グリオキサールからグリオキシル酸への変換は、前記式１および式２に示されるどちらの反応による変換をも包含しする。したがって、グリオキサールからグリオキシル酸へ変換する能力を有する酸化還元酵素とは、オキシダーゼまたはデヒドロゲナーゼを意味し、アルデヒドをカルボン酸に変換する酵素であればいずれでも良い。とくに、グリオキシル酸を蓄積するという点で、グリオキシル酸に対しては活性を有さないか、または低い活性しか有さない酵素が好ましい。
また、該酸化還元酵素の酸性能を有する微生物の培養液、培養上清、菌体および菌体処理物のいずれか１種または２種以上の混合物を用いて、グルオキサールからグリオキシル酸への変換することも可能である。反応がデヒドロゲナーゼにより触媒される場合（式２）、基質以外に補酵素、（たとえば、ＮＡＤ（ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチド）やＮＡＤＰ（ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドリン酸））が必要である。一方、反応がオキシダーゼにより触媒される場合は（式１）、基質であるグリオキサール以外に酸素があれば反応が進行するため、コスト的観点からオキシダーゼを用いることが有利である。
反応がオキシダーゼにより触媒される場合、グリオキシル酸以外に過酸化水素が生成され、この過酸化水素を検出することにより目的のオキシダーゼ活性は容易に検出できる。本発明における目的のオキシダーゼ活性の検出、定量は、図１に示すように、酸化反応により生成する過酸化水素を４−アミノアンチピリン（以下４−ＡＡ）とＮ−エチル−（２−ヒドロキシ−３−スルフォプロピル）−ｍ−トルイジン（以下ＴＯＯＳ）と反応させ、生成するキノンイミン色素を検出、定量することにより行なうことができる。
具体的には以下の組成を含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）０．９ｍｌに、菌体懸濁液または酵素液０．１ｍｌを添加し、３０℃での波長５５５ｎｍの吸光度の増加を測定することにより行なう。本発明において、１分間に１μｍｏｌのＨ２Ｏ２を生成する酵素活性を１ｕｎｉｔと定義する。
（組成）
グリオキサール ２０ｍＭ
４−ＡＡ ０．６７ｍＭ
ＴＯＯＳ １．０９ｍＭ
ワサビ由来ペルオキシダーゼ（以下ＰＯＤ） ２Ｕ／ｍＬ
また、グリオキサールおよびグリオキシル酸の定量は、高速液体クロマトグラフィーで行なうことができる。高速クロマトグラフィーによる分析は、たとえば、バイオラッド・アミネックスＨＰＸ−８７Ｈ（７．８ｍｍ×３００ｍｍ）カラムを用い、溶媒として５ｍＭのＨ２ＳＯ４水溶液を用い、流速０．４ｍｌ／分で行なうことができる。検出は２３０ｎｍの吸光度または示差屈折率を測定することにより行なう。本条件により、グリオキサールは１６分、グリオキシル酸は１５分に溶出される。
目的のオキシダーゼ活性を有する微生物は、たとえば、以下のようなスクリーニングにより取得することができる。炭素源として、グリオキサール、エチレングリコール、プロピレングリコールまたはグリコールアルデヒド１０ｇ、硝酸アンモニウム２ｇ、リン酸水素二カリウム１ｇ、リン酸水素−ナトリウム、酵母エキス０．１ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．２ｇ、塩化カルシウム二水和物０．１ｇ（いずれも１Ｌ当り）の組成からなる、高圧蒸気殺菌された（１２１℃、２０分間）のＳ培地（ｐＨ７）５ｍｌに、日本国内より採取した土壌サンプル各２ｇを１０ｍｌの生理食塩水に懸濁後の上清液０．２ｍｌを加えて、２８℃で３〜７日間集積培養を行なった。菌が生育した培養液を２％寒天を含むＳ培地プレートに０．１ｍｌずつ塗布し、２８℃で３〜７日間培養を行なった。そののち、生育したコロニーについて、再度２％寒天培地を含むＳ培地プレートにて静置培養を行ない、生育が確認された菌株を各炭素源に対する資化性菌とした。そののち、これら資化性菌について、グリオキサールのグリオキシル酸への変換活性を調べた。それぞれの菌体を試験管中Ｓ培地５ｍｌで２８℃、３〜５日間振とう培養後、菌体を遠心分離により集め、生理食塩水で洗浄したのち、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８）０．５ｍｌに懸濁した。その菌体懸濁液０．１ｍｌを５０ｍＭグリオキサールを含む１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８）０．２ｍｌに添加し、２８℃で６〜１２時間振とうさせた。そののち、反応液を遠心分離し、上澄液を高速液体クロマトグラフィーにより分析し、グリオキシル酸の生成の確認および定量を行なった。
また、グリオキサールの酸化が前記オキシダーゼにより触媒される場合、グリオキシル酸と同時に過酸化水素が生じるので、反応時に生成する過酸化水素を検出することによりオキシダーゼ保有菌を見出すこともできる。すなわち、前記Ｓ培地で培養して得られた菌体の菌体懸濁液０．１ｍｌを５０ｍＭグリオキサール、１．３４ｍＭ ４−ＡＡ、２．１８ｍＭ ＴＯＯＳ、４Ｕ／ｍｌペルオキシダーゼ含有する１００ｍＭリン酸緩衝液０．１ｍｌに添加し、２８℃で２時間振とうし、反応液が紫色になったもの、すなわちグリオキサールに対する反応により過酸化水素が生じた株を選別することにより、グリオキサールオキシダーゼ活性を保有する菌株を取得することが可能である。
グリオキサールをグリオキシル酸へと変換する能力を有する微生物としては、ステノトロフォモナス属、ストレプトミセス属、シュードモナス属、ミクロバクテリウム属、アクロモバクター属、セルロモナス属、セルロシミクロビウム属、モルガネラ属等に属する微生物をあげることができる。それらのなかで代表的な微生物として、ステノトロフォモナス・スピーシーズＫＮＫ２３５（ＦＥＲＭ Ｐ−１９００２）、ストレプトミセス・スピーシーズＫＮＫ２６９（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５６）、シュードモナス・スピーシーズＫＮＫ０５８（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５５）、シュードモナス・スピーシーズＫＮＫ２５４（ＦＥＲＭ Ｐ−１９００３）、ミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５４）、アクロモバクター・スピーシーズＩＦＯ １３４９５、セルロモナス・スピーシーズＪＣＭ ２４７１、セルロモナス・タバタＩＦＯ １５０１２、セルロモナス・タバタＩＦＯ １５０１４、セルロモナス・タバタＩＦＯ １５０１５、セルロシミクロビウム・セルランスＩＦＯ １５０１３、セルロシミクロビウム・セルランスＩＦＯ １５５１６、セルロシミクロビウム・セルランスＪＣＭ ６２０１、モルガネラ・モルガニイＩＦＯ ３８４８などをあげることができる。これらの微生物のうちＩＦＯ １３４９５、ＩＦＯ １５０１２、ＩＦＯ １５０１４、ＩＦＯ １５０１５、ＩＦＯ １５０１３、ＩＦＯ １５５１６、ＩＦＯ ３８４８は公知であり、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部・生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）（〒２９２−０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ 鎌足２−５−８）から容易に入手することができる。ＪＣＭ ２４７１およびＪＣＭ ６２０１もまた公知であり、独立行政法人理化学研究所微生物系統保存施設（ＪＣＭ）（〒３５１−０１９８ 日本国埼玉県和光市広沢２−１）から容易に入手することができる。その他の微生物は本発明者により土壌から新たに分離・同定され、それぞれ前記寄託番号にて独立法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に寄託されている。前記ステノトロフォモナス・スピーシーズＫＮＫ２３５（以下、単にＫＮＫ２３５株という場合もある）、シュードモナス・スピーシーズＫＮＫ０５８（以下、単にＫＮＫ０５８株という場合もある）、シュードモナス・スピーシーズＫＮＫ２５４（以下、単にＫＮＫ２５４株という場合もある）およびミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１（以下、単にＫＮＫ０１１株という場合もある）の菌学的性質を表１に示す。
ストレプトミセス・スピーシーズＫＮＫ２６９株（以下、単にＫＮＫ２６９株という場合もある）の同定は以下の周知の方法にもとづき行なった。該菌株の１６ＳリボゾーマルＲＮＡ遺伝子（１６ＳｒＤＮＡ）のうち５‘末端側約５００ｂｐの領域をＰＣＲで増幅して、塩基配列を決定し、ＭｉｃｒｏＳｅｑ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ５００ｌｉｂｒａｒｙ ｖ．００２３（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、ＣＡ，ＵＳＡ）データベースを用いて相同性検索を行ない、分子系統樹を作製する方法で行なった。
前記アルデヒドオキシダーゼが、ストレプトミセス属微生物が産生するアルデヒドオキシダーゼの場合、以下（１）〜（３）の理化学的性質を有することが好ましい。
（１）至適ｐＨ：６〜９
（２）熱安定性：ｐＨ７．２で６０℃、２０分処理したのち、９０％以上の活性を保持している
（３）分子量：ゲル濾過分析において約１１万であり、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析において、約２．５万、約３．５万、約８万の３つのサブユニットタンパク質を有する
また、ストレプトミセス属微生物のなかでも、ストレプトミセス・スピーシーズＫＮＫ２６９（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５６）が好ましい。
前記アルデヒドオキシダーゼが、シュードモナス属に属する微生物が産生するアルデヒドオキシダーゼの場合、以下（１）〜（３）の理化学的性質を有することが好ましい。
（１）分子量：ゲル濾過分析において約１５万
（２）反応至適温度：６０〜７０℃
（３）反応至適ｐＨ：５〜７
また、シュードモナス属微生物のなかでも、シュードモナス・スピーシーズＫＮＫ０５８（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５５）が好ましい。
前記アルデヒドオキシダーゼが、ミクロバクテリウム属微生物が菌体内および菌体外に産生するアルデヒドオキシダーゼの場合、以下の理化学的性質を有することが好ましい。
分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析において約１１万の単一タンパク質
また、ミクロバクテリウム属微生物のなかでも、ミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５４）が好ましい。
前記アルデヒドオキシダーゼが、セルロシミクロビウム属微生物が菌体内および菌体外に産生するアルデヒドオキシダーゼの場合、以下の理化学的性質を有することが好ましい。
分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析において約９〜１０万の単一タンパク質
また、セルロシミクロビウム属微生物のなかでも、セルロシミクロビウム・セルランスＩＦＯ １５５１６が好ましい。
本発明において、グリオキサールをグリオキシル酸へ変換する能力を有する酸化還元酵素の産生能を有する微生物を培養するための培地は、その微生物が増殖し得るものであれば特に限定されない。たとえば、炭素源として、グルコースおよびシュークロースなどの糖質、エタノール、グリセロール、エチレングリコールおよびプロピレングリコールなどのアルコール類、グリオキサールなどのアルデヒド類、オレイン酸およびステアリン酸などの脂肪酸ならびにそのエステル類、菜種油および大豆油などの油類；窒素源として、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、ペプトン、ガザミノ酸、酵母エキス、肉エキスおよびコーンスチープリカーなど；無機塩類として、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸一水素カリウムおよびリン酸二水素カリウムなど；その他に、麦芽エキス、肉エキスなどを含有する通常の液体培地が使用され得る。
本発明によるグリコール酸の製造方法は、前記酸化還元酵素、または該酸化還元酵素の産生能を有する微生物の培養液、培養液から分離した微生物菌体、微生物菌体処理物、さらには微生物菌体外にも前記酸化酵素が産生される場合は培養液上清のいずれかをグリオキサールに作用させ、グリオキシル酸へと変換蓄積せしめることを特徴とする。
ここで、微生物菌体処理物とは、たとえば、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、それら菌体の破砕物、または粗酵素液などを意味する。用語「粗酵素液」には、たとえば、菌体のグラスビーズなどを用いる物理的破砕方法、酵素などを用いる生化学的方法などにより破砕または溶解した溶液、さらには遠心分離などにより該溶液中の固形物を除去して得た無細胞抽出液が含まれる。また、さらには、当業者が通常用いる方法、たとえば、透析、硫酸アンモニウム沈澱、クロマトグラフィーを単独でまたは組合わせて用い、前記無細胞抽出液を部分的に精製した酵素も「粗酵素液」に含まれる。また、微生物菌体処理物は、公知の手段で固定化して用いることもできる。固定化は当業者に周知の方法（たとえば、架橋法、物理的吸着法、包括法など）で行ない得る。
反応条件は使用する酵素、微生物またはその処理物により異なるが、最適な反応条件としては、温度は１０〜８０℃、好ましくは熱安定性の観点から２０〜４０℃の範囲、ｐＨはｐＨ４〜１２、好ましくはｐＨ安定性の観点からｐＨ６〜１０の範囲である。反応は振とう、撹拌条件下で実施するのが好ましい。
反応がオキシダーゼにより触媒される場合、反応系に過酸化水素が生成する。過酸化水素は酵素を失活させたり、グリオキシル酸をギ酸へと分解する場合もあるが、カタラーゼを添加することにより、反応により生じた過酸化水素を分解除去し、酵素の失活やグリオキシル酸の分解を防ぐことが可能である。
本発明の酵素としては、グリオキシル酸に対しては、低い活性しか示さないものが望ましい。とくに、本発明の酵素は、グリオキシル酸に対する活性が、グリオキサールに対する活性の１／１０倍以下であるものが好ましく、１／２０倍以下であることがより好ましく、１／１００倍以下であることがさらに好ましい。オキシダーゼのグリオキシル酸に対する活性が、グリオキサールに対する活性の１／１０倍をこえると、グリオキサールが酸化されて生成したグリオキシル酸がさらに酸化されるため、反応系にグリオキシル酸が蓄積されない、または蓄積量が低下する傾向がある。このように、本発明のオキシダーゼは、グリオキサールをグリオキシル酸へ変換することだけでなく、グリオキシル酸に対し活性が低いことが特徴である。グリオキサールに対し活性を示すことが知られている木材腐朽菌が産生するグリオキサールオキシダーゼは、グリオキシル酸に対しても高い活性を示す。表２に本発明酵素と木材腐朽菌が産生する酵素それぞれの、グリオキサールとグリオキシル酸に対する活性を示す。本発明酵素はグリオキサールに比べ、グリオキシル酸には非常に低い活性しか示さない。
さらに、本発明は、前記アルデヒドオキシダーゼを効果的に組換え生産するため使用することができる前記アルデヒドオキシダーゼをコードするＤＮＡに関する。詳しくは、本発明は、配列番号４、５または６の塩基配列からなるアルデヒドオキシダーゼのサブユニットをコードするＤＮＡに関し、さらには、該塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡのいずれか１つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡも、該ＤＮＡによってコードされるタンパク質をサブユニットとして有するタンパク質が、グリオキサールをグリオキシル酸へ変換する活性を有する限りにおいて、本発明のＤＮＡに含まれる。
また、本発明は、配列番号９、１０、１３または１４の塩基配列からなるアルデヒドオキシダーゼをコードするＤＮＡにも関し、さらには該塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡのいずれか１つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡも、該ＤＮＡによってコードされるタンパク質が、グリオキサールをグリオキシル酸へ変換する活性を有する限りにおいて、本発明のＤＮＡに含まれる。
また、配列番号１、２または３で表わされるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列のいずれかを含んでなるタンパク質をコードするＤＮＡも、該ＤＮＡによってコードされるタンパク質をサブユニットとして有するタンパク質が、グリオキサールをグリオキシル酸へ変換する活性を有する限りにおいて、本発明のＤＮＡに含まれる。
さらに、配列番号７、８、１１または１２で表わされるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列のいずれかを含んでなるタンパク質をコードするＤＮＡも、該ＤＮＡによってコードされるタンパク質が、グリオキサールをグリオキシル酸へ変換する活性を有する限りにおいて、本発明のＤＮＡに含まれる。
本発明は、配列番号４、５もしくは６の塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるタンパク質をサブユニットとして有するアルデヒドオキシダーゼ、または配列番号９、１０、１３もしくは１４の塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるアルデヒドオキシダーゼにも関する。さらには、配列番号４、５もしくは６の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡのいずれか１つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるタンパク質をサブユニットとして有するアルデヒドオキシダーゼ、配列番号９、１０、１３もしくは１４の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアルデヒドオキシダーゼも、グリオキサールをグリオキシル酸へ変換する活性を有する限りにおいて、本発明のオキシダーゼに含まれる。
ハイブリダイゼーションは、当業者に周知の操作により実施することができる。たとえば、具体的には、配列番号４、５、６、９、１０、１３、または１４に示した塩基配列の２本鎖ＤＮＡをニックトランスレーション法により３２Ｐで末端標識したＤＮＡをプローブＤＮＡとして用いたサザンハイブリダイゼーションにより実施できる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ 第３版２００１年（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ），Ｖｏｌ．１、チャプター６．５０〜５５参照）。任意の生物、微生物から調製した染色体ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、人工的に作製されたベクターＤＮＡ、またはこれらのＤＮＡを適当な制限酵素で消化したＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分離後、ニトロセルロースフィルターに固定し、前記プローブＤＮＡと結合するＤＮＡをオートラジオフラフィーで検出することで、本発明に使用しうるアルデヒドオキシダーゼの遺伝子を検出することができる。ハイブリダイゼーションにおけるストリンジェントな条件としては、ニトロセルロースフィルターに固定したＤＮＡと標識プローブＤＮＡを６×ＳＳＣ、５×デンハルト試薬、０．５％ ＳＤＳ、１μｇ／ｍ ｐｏｌｙ（Ａ）、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡからなる緩衝液中、６８℃でハイブリダイズし、２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳからなる緩衝液でリンスした後、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳからなる緩衝液を用い、３０℃で３０分の洗浄を２回行なう場合であり、さらにストリンジェントな条件としては１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳからなる緩衝液を用い、６５℃で３０分の洗浄を４回行なう場合である。１×ＳＳＣは０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムからなる水溶液で、１×デンハルト試薬は、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ ４００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％牛血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製、ＦｒａｃｔｉｏｎＶ）からなる。
また、本発明は、配列番号１、２もしくは３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をサブユニットとして有するアルデヒドオキシダーゼ、または配列番号７、８、１１もしくは１２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸配列からなるアルデヒドオキシダーゼにも関する。さらに、配列番号１、２または３で表されるアルデヒドオキシダーゼのサブユニットγ、βまたはαのアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列のいずれか１つを含むタンパク質も、該タンパク質をサブユニットとして有するタンパク質が、グリオキサールをグリオキシル酸へ変換する活性を有する限り、本発明のオキシダーゼに含まれる。また、配列番号７、８、１１または１２で表されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質も、グリオキサールをグリオキシル酸へ変換する活性を有する限り、本発明のオキシダーゼに含まれる。
特定のアミノ酸を欠失、置換または付加する方法としては、特定アミノ酸のコドンを欠失、または他のアミノ酸のコドンに置換、または他のアミノ酸のコドンを付加した塩基配列を含む合成ＤＮＡプライマーを使用したＰＣＲ、または化学的なＤＮＡ合成法などの公知の方法により作製した酵素の遺伝子を、遺伝子発現用のベクターに連結し、大腸菌などを宿主として組換え発現する方法などの従来公知の方法が用いられ、当業者であれば容易に実施し得る。
微生物の菌体外に分泌される酵素では、一般に遺伝子の開始コドンから数十アミノに相当する部分に分泌シグナル配列がコードされており、菌体内で合成された酵素タンパク質が菌体外に分泌される過程で分泌シグナル配列は切断されて成熟型の酵素となることが知られている。本発明に記載されている酵素のうちのいくつかでは菌体外にも活性な酵素が分泌されるが、これらの酵素の組換え生産においては、分泌シグナル配列を人為的に除去した遺伝子を用いることにより、酵素タンパク質を宿主となる微生物の菌体内に生産させて使用することができる。本発明はこの目的において使用できる分泌シグナル配列を除去した酵素遺伝子（配列番号１０および１４）も提供する。また、一方では、酵素の組換え発現において宿主微生物の菌体外に酵素を生産させる目的で、分泌シグナル配列を含んだ遺伝子（配列番号９および１３）を用いることもできる。さらには、本来の分泌シグナル配列を宿主微生物に適した分泌シグナル配列に置換したキメラ遺伝子を作製して使用することも当業者に公知の方法により可能である。
本発明に使用できる酵素の遺伝子は以下に述べる方法で得ることができる。すなわち、グリオキサールをグリオキシル酸に変換する酵素を生産する微生物の菌体または培養液から酵素タンパク質を精製し、酵素タンパク質をプロテアーゼ消化して得られるペプチドを用いて部分アミノ酸配列を決定する。次に、周知の方法により、これらの部分アミノ酸配列をもとに合成したプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行なうことによって酵素遺伝子の一部を増幅し、遺伝子内部の塩基配列を決定することができる。Ｎ−末端アミノ酸配列、またはＣ−末端近傍のアミノ酸配列から合成したＤＮＡプライマーを用いてインバースＰＣＲを行なうことでシグナル配列、Ｎ−末端アミノ酸配列およびＣ−末端アミノ酸配列などを決定することができる（Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９０、ｖｏｌ．６ Ｎｏ．５ ３７０−３７６）。塩基配列を決定したアルデヒドオキシダーゼの遺伝子はＰＣＲを用いて容易に取得できる。また、遺伝子の一部の配列を利用して公知の方法により微生物の染色体ＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから取得することが可能である。
本発明に用いる酵素は、天然酵素であってもよく、また組換え技術により得られた酵素であってもよい。組換え技術の方法としては、たとえば、酵素の遺伝子をプラスミドベクター、ファージベクターなどに挿入し、大腸菌などの細菌、酵母やカビなどの微生物、動物、植物、または動植物の細胞などの宿主を形質転換する方法などが有効である。
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例になんら限定されるものではない。
【実施例１】
エチレングリコール１０ｇ、酵母エキス１ｇ、ＮＵＴＲＩＥＮＴ ＢＲＯＴＨ（Ｄｉｆｃｏ社製）８ｇ、リン酸水素一カリウム３ｇ、リン酸水素二カリウム７ｇ（いずれも１Ｌ当り）の組成からなる液体培地（ＥＧ−ＮＢ培地（ｐＨ７））５ｍｌを大型試験管に分注し、１２１℃で２０分間高圧蒸気殺菌した。この培地に表３に示す微生物を無菌的に一白金耳植菌し、２８℃で２日間培養し、前培養液を得た。ついで、５００ｍｌ容坂口フラスコ中１００ｍｌの殺菌処理後のＥＧ−ＮＢ培地に、得られた前培養液を１ｍｌ植菌し、２８℃で３日間培養した。得られた培養液１００ｍｌより遠心分離により菌体を集め、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄後、同緩衝液（ｐＨ８．０）５ｍｌに懸濁した。本菌体懸濁液をミニビートビーター（ＢＩＯＳＰＥＣ社製）で破砕後、遠心分離により上澄液（無細胞抽出液）を得た。得られた無細胞抽出液０．８ｍｌに５００ｍＭグリオキサール水溶液０．１ｍｌ、５０，０００Ｕ／ｍｌのカタラーゼ溶液を０．１ｍｌ添加し、試験管中で、２８℃で４時間振とう反応を行ない、得られた反応液を高速液体クロマトグラフィーにより分析した。グリオキシル酸の生成量を表３にまとめた。
【実施例２】
実施例１で調製した表３記載の微生物の無細胞抽出液０．１ｍｌに、試験管中で４−ＡＡ１．３４ｍＭ、ＴＯＯＳ２．１９ｍＭ、ＰＯＤ６Ｕ／ｍｌを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）０．０５ｍｌを添加した。さらに１００ｍＭグリオキサール水溶液または水を０．０５ｍｌ添加し、２８℃、２分間振とうし、反応液の色の変化を観察した。その結果を表４に示す。いずれの微生物を用いた反応においても、グリオキサール水溶液を添加したものは反応液が濃い紫色に着色したが、グリオキサール水溶液の代わりに水を添加した場合、反応液は変色しなかった。グリオキサールの酸化反応時に過酸化水素が生成することがわかり、このことよりグリオキサールの酸化反応を触媒している酵素はオキシダーゼであることが判った。
【実施例３】
実施例１と同様な方法で調製したシュードモナス・スピーシーズＫＮＫ２５４株、ミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１株、セルロモナス・タバタＩＦＯ１５０１５株およびセルロモナス・スピーシーズＪＣＭ２４７１株の培養液１００ｍｌより遠心分離により菌体を集め、０．１ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）で洗浄後、同緩衝液５ｍｌに懸濁した。試験管中、本菌体懸濁液０．４５ｍｌに５００ｍＭグリオキサール水溶液０．０５ｍｌを添加し、４時間振とうして反応を行なった。反応後の上澄みをＨＰＬＣで分析し、生成したグリオキシル酸を算出した。その結果シュードモナス・スピーシーズＫＮＫ２５４株では２０ｍＭ、ミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１株では１４ｍＭ、セルロモナス・タバタＩＦＯ１５０１５株では３０ｍＭ、セルロモナス・スピーシーズＪＣＭ２４７１株では３３ｍＭのグリオキシル酸が生成していた。
【実施例４】
以下の方法に従って、ストレプトミセス・スピーシーズＫＮＫ２６９株より、グリオキサールをグリオキシル酸へ変換する活性を有するアルデヒドオキシダーゼの精製を行なった。
エチレングリコール１０ｇ、酵母エキス３ｇ、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ８ｇ、リン酸水素二カリウム３ｇ、リン酸水素二カリウム７ｇ（いずれも１Ｌあたり）の組成よりなる培地（ｐＨ７）５０ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコにいれて高圧蒸気殺菌後、ストレプトミセス・スピーシーズＫＮＫ２６９株を一白金耳植菌し、２８℃で３日間振とう培養し、前培養液を得た。ついで、１０リットルミニジャーに前記組成の培地６Ｌをいれて高圧蒸気殺菌後、前培養液５０ｍｌを植菌し、２８℃、通気０．５ｖｖｍ、撹拌３００ｒｐｍで２日間培養を行なった。本ミニジャー培養を繰り返し９５Ｌの培養液を取得し、ついで得られた培養液９５Ｌから遠心分離により菌体を集め、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）３Ｌに懸濁した。
得られた菌体懸濁液をダイノミル（Ｄｙｎｏ−Ｍｉｌｌ社製）で破砕後、遠心分離により菌体残渣を除き、無細胞抽出液２．５Ｌを得た。得られた無細胞抽出液２．５Ｌに氷冷下スターラーで撹拌しながら、所定量の硫酸アンモニウムを添加し、硫酸アンモニウム３０−５５％飽和で沈殿するタンパク質を遠心分離により集めた。
得られたタンパク質を０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）で溶解し、同緩衝液により透析を行なったのち、これを同緩衝液で予め平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍ（東ソー株式会社製）カラム（１３０ｍｌ）にチャージし、素通り画分を除去後、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）で溶出し、活性画分を集めた。得られた酵素液に、硫酸アンモニウムを０．６Ｍになるように添加し、０．６Ｍ硫酸アンモニウムを含む０．０５Ｍリン酸緩衝液で予め平衡化したＰｈｅｎｙｌ−トヨパール６５０Ｍ（東ソー株式会社製）カラム（３００ｍｌ）にチャージし、０．６〜０．１Ｍの硫酸アンモニウム直線濃度勾配により溶出し、活性画分を集めた。得られた酵素液を０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）により透析を行ない、予め同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍカラム（１３０ｍｌ）にチャージし、０〜０．２５Ｍの塩化ナトリウム直線濃度勾配により溶出を行ない、活性画分を集めたのち、硫酸アンモニウムを６０％飽和になるまで添加し、遠心分離により、沈殿するタンパク質を集め、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）で溶解し、同緩衝液により透析を行なった。ついで、この透析後の酵素液を、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）で予め平衡化したＢｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）カラム（１０ｍｌ）にチャージし、０〜０．１Ｍの塩化ナトリウム直線濃度勾配により溶出を行ない、活性画分を集めた。本酵素液を限外濾過により濃縮して、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）で予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ＨＲ１６／６０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）カラム（１２０ｍｌ）にチャージし、同緩衝液で溶出を行なった。分子量１７万に相当する画分に、２８０ｎｍのタンパク質吸収と活性が一致する溶出ピークを得た。本活性画分を未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したところ、単一バンドを形成した。
また、本酵素をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したところ、分子量約２．５万、３．５万、８万に相当する３つのタンパク質バンドを形成した。これらのことより、本酵素は分子量約２．５万、３．５万、８万のサブユニット構造を有することがわかった。
【実施例５】
以下の方法に従って、ミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１株より、グリオキサールをグリオキシル酸へ変換する活性を有するアルデヒドオキシダーゼの精製を行なった。
酵母エキス５ｇ、硝酸アンモニウム２ｇ、リン酸水素二カリウム２ｇ、リン酸水素一ナトリウム二水和物１ｇ、硫酸マグネシウム・七水和物０．２ｇ、塩化カルシウム・二水和物０．１ｇ（いずれも１Ｌあたり）の組成よりなる培地（ｐＨ７）５０ｍｌを５００ｍｌにいれて高圧蒸気殺菌後、ミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１株を一白金耳植金し、２８℃で３日間振とう培養し、前培養液を得た。ついで、５リットルミニジャーに前記組成の培地３Ｌをいれて高圧蒸気殺菌後、前培養液３０ｍｌを植菌し、２８℃、通気０．５ｖｖｍ、撹拌４００ｒｐｍで２８時間培養を行なった。本ミニジャー培養を繰り返し６９Ｌの培養液を取得し、ついで得られた培養液６９Ｌから遠心分離により菌体を集め、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）に懸濁した。得られた菌体懸濁液をダイノミル（Ｄｙｎｏ−Ｍｉｌｌ社製）で破砕後、遠心分離により菌体残渣を除き、無細胞抽出液２Ｌを得た。得られた無細胞抽出液２Ｌに氷冷下、スターラーで撹拌しながら、所定量の硫酸アンモニウムを添加し、硫安アンモニウム２０−４０％飽和で沈殿するタンパク質を遠心分離により集めた。
得られたタンパク質を０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）で溶解し、同緩衝液により透析を行なったのち、これを同緩衝液で予め平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍカラム（３００ｍｌ）にチャージし、０〜０．６Ｍの塩化ナトリウム直線濃度勾配により溶出し、活性画分を集めた。この活性画分に硫酸アンモニウム濃度が０．７Ｍになるように所定量の硫酸アンモニウムを添加し、予め０．７Ｍ硫酸アンモニウムを含む０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）で平衡化したＰｈｅｎｙｌ−トヨパール６５０Ｍカラム（１６０ｍｌ）にチャージ後、０．７〜０Ｍの硫酸アンモニウム直線濃度勾配により溶出し、活性画分を集めた。得られた酵素液を０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）により透析を行なった。ついで、この透析後の酵素液を０．０５Ｍリン酸緩衝液で予め平衡化したＲｅｓｏｕｃｅ Ｑ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）カラム（６ｍｌ）にチャージし、０．１５〜０．４５Ｍの塩化ナトリウム直線濃度勾配により溶出を行ない、活性画分を集めた。得られた酵素液を限外濾過により濃縮を行ない、０．３Ｍ濃度になるように、硫酸アンモニウムを添加後、０．３Ｍ硫酸アンモニウムを含む０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）で予め平衡化したＲｅｓｏｕｃｅ Ｐｈｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）カラム（６ｍｌ）にチャージし、０．３〜０Ｍの硫酸アンモニウム直線濃度勾配により溶出し、活性画分を集めた。
得られた酵素液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したところ、分子量約１１万に相当する単一のタンパク質バンドを形成した。
【実施例６】
以下の方法に従って、シュードモナス・スピーシーズＫＮＫ０５８株より、グリオキサールをグリオキシル酸へ変換するアルデヒドオキシダーゼの精製を行なった。
エチレングリコール１０ｇ、ＮＵＴＲＩＥＮＴ ＢＲＯＴＨ８ｇ、リン酸水素二カリウム７ｇ、リン酸二水素カリウム３ｇ（いずれも１Ｌあたり）の組成よりなる培地（ｐＨ７）５ｍｌを大型試験管中で高圧蒸気殺菌後、シュードモナス・スピーシーズＫＮＫ０５８株を一白金耳植菌し、２８℃で２日間培養後、ついで、本培養液を滅菌済みの前記培地５００ｍｌを含んだ２Ｌ振盪フラスコに植菌し、２８℃、１８時間、振盪培養し、前培養液を得た。ついで、殺菌済みの前記培地６０Ｌを含んだジャーファメンターに植菌し、２８℃、通気１ｖｖｍ、撹拌２００ｒｐｍで４０時間培養を行なった。得られた培養液６０Ｌから遠心分離により菌体を集め、０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）に懸濁した。得られた菌体懸濁液をＩｎｃｏｎａｔｏｒ ２０１Ｍ超音波破砕装置（株式会社久保田製作所製）で６０分間破砕後、遠心分離により菌体残渣を除き、無細胞抽出液を得た。得られた無細胞抽出液を冷却下、スターラー撹拌しながら、所定量の硫酸アンモニウムを添加し、硫酸アンモニウム２０−６０％飽和で沈殿するタンパク質を遠心分離により集めた。
得られたタンパク質を０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）で溶解し、同緩衝液により透析を行なったのち、その酵素液に１．５ＬのＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ樹脂を添加し、４℃で１時間撹拌後、未吸着のタンパク質液を濾過により除いたのち、１Ｍ塩化ナトリウムで樹脂に吸着した酵素タンパク質の溶出を行なった。
得られた酵素液を０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）で透析後、０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）で平衡化したＨｉＰｒｅｐ １６／１０−Ｑ−ＸＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）カラム（１６ｍｌ）にチャージし、０〜１Ｍの塩化ナトリウムの直線濃度勾配法により溶出を行ない、活性画分を集めた。この活性画分に硫酸アンモニウム濃度が１．２Ｍになるように所定量の硫酸アンモニウムを添加し、予め、１．２Ｍの硫酸アンモニウムを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）で平衡化したＰｈｅｎｙｌ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ＨＲ １０／１０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）カラム（１０ｍｌ）にチャージし、１．２〜０Ｍの硫酸アンモニウムの直線濃度勾配法に溶出を行ない、活性画分を集めた。次に、得られた酵素液を０．０２Ｍリン酸緩衝液で透析後、同緩衝液で平衡化したＭｏｎｏＱ ＨＲ １０／１０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）カラム（１０ｍｌ）にチャージし、塩化ナトリウムの直線濃度勾配法により溶出を行ない、活性画分を集めた。さらに得られた酵素液を０．０２Ｍの塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液で平衡化したＨｉＰｒｅｐ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ １６／６０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）カラム（６０ｍｌ）にチャージし、同緩衝液で溶出を行なった。活性画分を集め、これを０．００５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）で透析後、同緩衝液で予め平衡化したＨｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ（生化学工業株式会社製）カラム（１０ｍｌ）にチャージし、０．００５〜０．５Ｍリン酸緩衝液の直線濃度勾配法により溶出を行なった。活性画分を集め、これを０．００５ｍＭリン酸緩衝液で透析後、同緩衝液で平衡化したＢｉｏ−Ｓｃａｌｅ ＣＨＴ５−Ｉ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）カラム（６．４ｍｌ）にチャージし、０．００５〜０．５Ｍリン酸緩衝液の直線濃度勾配法により溶出を行ない、活性画分を集めた。本活性画分を未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したところ、単一バンドを形成した。
【実施例７】
以下の方法に従って、セルロシミクロビウム・セルランスＩＦＯ１５５１６株の培養上清からグリオキサールをグリオキシル酸に変換するアルデヒドオキシダーゼの精製を行なった。
酵母エキス１０ｇ、硫酸アンモニウム２ｇ、リン酸水素２カリウム１ｇ、リン酸水素１ナトリウム１ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物０．２ｇ、塩化カルシウム・２水和物０．１ｇ（いずれも１リットル当り）の組成よりなる培地（ｐＨ７）６０ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに入れ高圧蒸気滅菌後、セルロシミクロビウム・セルランスＮＢＲＣ１５５１６株を１白金耳植菌し、２８℃で２日間振とう培養し、前培養液を得た。ついで、５Ｌミニジャーに前記組成の培地３Ｌを入れ、高圧蒸気滅菌後、前培養液６０ｍｌを植菌し、２８℃、通気０．５ｖｖｍ、撹拌４００ｒｐｍで２７時間培養を行なった。同様の培養を繰返して得た合計４５Ｌの培養液をｐＨ７に調整し、遠心分離により４５Ｌの培養上清を得た。得られた培養上清を撹拌型ウルトラホルダーＵＨＰ１５０（アドバンテック東洋株式会社製）を用いて２．４Ｌに濃縮後、氷冷下、撹拌しながら所定量の硫酸アンモニウムを添加し、硫酸アンモニウム０〜６０％飽和の範囲で沈澱するタンパク質を遠心分離により集めた。得られたタンパク質を２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）で溶解し、充分量の同緩衝液に対して透析を行なったのち、同緩衝液で予め平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍカラム（３００ｍｌ）にチャージし、塩化ナトリウム０〜０．５Ｍの濃度勾配で溶出し、活性画分を集めた。この活性画分に硫酸アンモニウムを終濃度１Ｍとなるよう添加し、予め１Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７で平衡化したＰｈｅｎｙｌ−トヨパール６５０Ｍ（６０ｍｌ）にチャージし、硫酸アンモニウム１〜０．５Ｍの直線濃度勾配で溶出し、活性画分を集めた。得られた酵素液を２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７に透析し、ついで、予め同緩衝液で平衡化したＲｅｓｏｕｒｃｅＱ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）カラム（６ｍｌ）にチャージし、塩化ナトリウム０．３５Ｍを含む同緩衝液で洗浄後、塩化ナトリウム０．３５〜０．５Ｍの直線濃度勾配で溶出し、活性画分を集めた。得られた酵素液を限外濾過濃縮し、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲカラム（２４ｍｌ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）にチャージし、同緩衝液で溶出した。得られた活性画分を用いてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行なった結果、分子量９〜１０万の単一バンドを形成した。
【実施例８】
実施例１記載の方法により得たＫＮＫ２３５株、ＫＮＫ０５８株の無細胞抽出液を０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）で予め平衡化したＲｅｓｏｕｃｅ Ｑカラム（６ｍｌ）にチャージし、０〜０．５Ｍの塩化ナトリウム直線濃度勾配により溶出を行ない、活性画分を集めた。これらＫＮＫ２３５株およびＫＮＫ０５８株の粗精製酵素液と実施例４、５および７で得たストレプトミセス・スピーシーズＫＮＫ２６９株、ミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１株およびセルロシミクロビウム・セルランスＩＦＯ１５５１６株から得られた精製酵素を用い、それらのグリオキサール、グリオキシル酸に対するオキシダーゼ活性を測定した。酵素活性測定は１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）中、グリオキサールまたはグリオキシル酸１０ｍＭ、４−ＡＡ０．６７ｍＭ、ＴＯＯＳ１．０９ｍＭ、ＰＯＤ２Ｕ／ｍｌ、およびＫＮＫ２３５株およびＫＮＫ０５８株の粗精製酵素または実施例４、５および７で取得したＫＮＫ２６９株、ＫＮＫ０１１株およびＩＦＯ１５５１６株からの精製酵素を含む１．０ｍｌの反応液を３０℃で反応させ、波長５５５ｎｍの吸光度の増加を測定することにより行なった。各酵素のグリオキサールとグリオキシル酸に対する活性の比較を表５に示す。
各酵素ともグリオキシル酸には、グリオキサールに比べ低い活性しか示さなかった。
【実施例９】
実施例４で得たストレプトミセス・スピーシーズＫＮＫ２６９株から得た酵素の理化学的性質について検討した。酵素活性の測定は、基本的には、実施例８記載の方法により行なった。
（至適ｐＨ）
ｐＨ５〜９の範囲で基質としてグリオキサールを用いて活性測定を行なった。その結果を図２に示す。至適ｐＨは６〜９であった。
（熱安定性）
０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中、３０〜７０℃の各温度で２０分間処理したのち、グリオキサールを基質にして本酵素の残存する活性測定を行なった。その結果を図３に示す。７０℃の処理で９０％以上の活性が残存していた。
【実施例１０】
実施例６で得たシュードモナス・スピーシーズＫＮＫ０５８株から得た酵素の理化学的性質について検討した。酵素活性の測定は、基本的には、実施例８記載の方法により行なった。
（分子量）
本酵素の分子量はＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷカラム（東ソー株式会社製）を用いて測定した場合、約１５万であった。
（至適温度）
基質としてグリオキサールを用いて、温度２５〜７５℃の範囲で活性測定を行なった。その結果を図４に示す。６０〜７０℃の範囲で高い活性を示した。
（至適ｐＨ）
緩衝液としてＭｃＩｌｖｉｎｅ緩衝液、リン酸緩衝液またはＴｒｉｃｉｎｅ緩衝液を用いてｐＨ４〜９の範囲で基質としてグリオキサールを用いて活性測定を行なった。その結果を図５に示す。ｐＨ５〜７の範囲で高い活性を示した。
【実施例１１】
実施例４、５、６および７で得たストレプトミセス・スピーシーズＫＮＫ２６９株由来酵素、ミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１株由来酵素、シュードモナス・スピーシーズＫＮＫ０５８株由来酵素、およびセルロシミクロビウム・セルランスＩＦＯ１５５１６株由来酵素を用い、グリオキサールを基質として反応を行なった。各株由来の酵素０．２Ｕ／ｍｌ、グリオキサール５０ｍＭ、カタラーゼ５０００Ｕ／ｍｌを含む１００ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液１ｍｌを試験管に加え、３０℃、３時間振とう反応を行なった。反応後、高速液体クロマトグラフィーで分析したところ、ＫＮＫ２６９株由来酵素では７．６ｍＭ、ＫＮＫ０１１株由来酵素では２５ｍＭ、ＫＮＫ０５８株由来酵素では５．７ｍＭ、ＩＦＯ１５５１６株由来酵素では２６ｍＭのグリオキシル酸が生成した。
【実施例１２】
以下の方法によりセルロモナス・タバタＩＦＯ１５０１２株、セルロモナス・タバタＩＦＯ１５０１４株、セルロシミクロビウム・セルランスＩＦＯ１５０１３株、セルロシミクロビウム・セルランスＩＦＯ１５５１６株、セルロシミクロビウム・セルランスＪＣＭ６２０１株、ミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１株の培養菌体のアルデヒドオキシダーゼ活性を測定した。
硝酸アンモニウム２ｇ、リン酸水素二カリウム１ｇ、リン酸水素一ナトリウム１．３ｇ、酵母エキス５ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．２ｇ、塩化カルシウム０．１ｇ（いずれも１Ｌあたり）ｐＨ７の組成からなる培地５ｍｌを大型試験管に分注し、高圧蒸気殺菌した。前記の菌株を白金耳植菌し、２８℃で２日間の前培養を行なった。ついで、５００ｍｌ容坂口フラスコ中６０ｍｌの同培地に、得られた前培養液を１ｍｌ植菌し、２８℃で２日間培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集め、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７で２回洗浄後、同緩衝液５．０ｍｌに懸濁した。本菌体懸濁液１．０ｍｌに１３３ｍＭグリオキサール水溶液０．４５ｍｌ、５０，０００Ｕ／ｍｌのカタラーゼ溶液を０．０５ｍｌ添加し、試験管中で、２８℃で４時間振とう反応を行ない、得られた反応液を高速液体クロマトグラフィーにより分析した。その結果、いずれの菌株でもグリオキサールからグリオキシル酸が生成していた。
また、菌体懸濁液０．１ｍｌを５０ｍＭグリオキサール、１．３４ｍＭ ４−ＡＡ，２．１８ｍＭＴＯＯＳ、４Ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼを含有する１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液０．１ｍｌに添加し、２８℃で２時間振とうし、反応液の発色を目視する方法でオキシダーゼ活性の判定を行なった。対照としてグリオキサール無添加の同一反応系を同時に行なった。その結果、いずれの菌株でもグリオキサールを添加した場合のみオキシダーゼ活性による発色が観察され、グリオキサールがオキシダーゼによって酸化されることが明らかになった。これらの結果を表６にまとめた。
【実施例１３】
実施例１２で調製したミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１株、セルロシミクロビウム・セルランスＩＦＯ１５５１６株の培養液上清を用いてアルデヒドオキシダーゼの菌体外への分泌を確認した。培養液を遠心し、菌体を除いた培養上清をアミコンＣｅｎｔｒｉｐｌｕｓ ＹＭ−１０（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いた限外濾過により濃縮、緩衝液を１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７に交換し、１２倍濃縮液を調製した。こうして得た培養上清濃縮液０．１ｍｌを用いて実施例１２と同様にグリオキサールを基質として発色によるオキシダーゼ活性の判定を行なった。その結果、表７に示した通り、培養上清も菌体懸濁液と同等の酵素活性を示した。
【実施例１４】
実施例４で精製したストレプトミセス・スピーシーズＫＮＫ２６９株のアルデヒドオキシダーゼのアミノ酸配列を以下の方法で決定した。酵素を構成する３種類のサブユニットを分離するために逆相ＨＰＬＣを用いた。カラムはＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰカラム（２５０×４．６ｍｍ）（ＹＭＣ社製）を使用し、移動相には０．１％トリフルオロ酢酸を用い、精製酵素３００μｇをチャージしたのち、アセロニトリル０〜５６％（流速１ｍｌ／分、１１０分）の直線濃度勾配で溶出する方法でサブユニットを分離した。保持時間約８５分で分子量２．５万（以下サブユニットγ）、約９０分で分子量３．５万（以下サブユニットβ）、約９２分で分子量８万（以下サブユニットα）が溶出された。分取した各サブユニットタンパク質の１／１０を使用して、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ ４９０ ｐｒｏｃｉｓｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いたエドマン分解法でＮ末端アミノ酸配列を決定した。次に、各サブユニットタンパク質の内部アミノ酸配列を決定した。各サブユニットタンパク質の残り全量を９Ｍ尿素で変性後、緩衝液を０．３Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ９．０に交換し、リジルエンドペプチダーゼで３０℃、１９時間消化した。分解物をＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰカラムを用いて逆相ＨＰＬＣ法により精製した。移動相に０．１％トリフルオロ酢酸を用い、アセロニトリル１０〜４８％までの直線濃度勾配でペプチドを溶出した。溶出した各ピークを分取し、同様の方法でサブユニット内部のアミノ酸配列を決定した。得られたアミノ酸配列のうち主なものを配列番号１５〜２０に示した。
【実施例１５】
決定した部分アミノ酸配列をもとにミックストＤＮＡプライマー（配列番号２１〜２６）を合成し、ストレプトミセス・スピーシーズＫＮＫ２６９株のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造株式会社製）を用い、ＧＣ緩衝液（宝酒造株式会社製）中でＰＣＲを行なった。得られた増幅ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてバンドを形成したＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡを用いて、直接シークエンシング、またはｐＴ７Ｂｌｕｅ−２（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にＴＡクローニングしたのち、プラスミドを用いてＤＮＡシークエンシングを行ない、塩基配列を決定した。配列番号２１〜２６に示したプライマー（１）と（２）、（３）と（４）および（５）と（６）の組合せでＰＣＲを行なって得られた増幅ＤＮＡの配列をアミノ酸に変換し、実施例１４で決定したアミノ酸配列と照合し、整列した結果、３種類のサブユニットをコードする遺伝子は、上流からγ、α、βの順にゲノム上に隣接、または一部重複して存在していた。ミックストプライマー部分の塩基配列決定には周辺の塩基配列をプライマーとして用いて同様の方法で決定した。こうしてサブユニットγ、α、βの全遺伝子をコードするゲノム領域のうちサブユニットγのＮ末端近傍とサブユニットαのＣ末端近傍を除いた全塩基配列を決定した。得られた塩基配列から導かれたアミノ酸配列は実施例１４で得られた各サブユニットの部分アミノ酸配列と完全に一致した。決定したサブユニットγ、α、βのアミノ酸配列を配列番号１〜３に、塩基配列を配列番号４〜６に示した。配列番号１および４は、それぞれ、サブユニットγの精製タンパク質のＮ末端以降のアミノ酸配列、およびＧｌｕ１２から終止コドンまでの塩基配列を示している。配列番号２および５は、それぞれ、サブユニットβの全アミノ酸配列、および開始コドンから終止コドンまでの全塩基配列を示している。配列番号３および６は、それぞれ、サブユニットαのＭｅｔ１からＴｈｒ６９３までのアミノ酸配列、および開始コドンからＡｒｇ６８５までの塩基配列を示している。配列番号１８に示す精製したＫＮＫ２６９株由来酵素のサブユニットαのＮ末端アミノ酸配列は、遺伝子配列から決定した配列番号３のアミノ酸配列のＡｌａ５から始まっていた。
【実施例１６】
実施例５で精製したミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１株アルデヒドオキシダーゼのアミノ酸配列を決定した。限外濾過膜を用いて脱塩した精製酵素１０μｇを使用し、実施例１４で用いたのと同様の方法でＮ末端アミノ酸配列を決定した。次に、タンパク質内部のアミノ酸配列を決定するため、精製酵素のプロテアーゼ消化ペプチドのアミノ酸配列決定を行なった。精製酵素１００μｇを９Ｍ尿素で変性後、緩衝液を０．２Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ９．０に交換し、リジルエンドペプチダーゼで３０℃、１６時間消化した。こうして得た消化ペプチド混合物をＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰカラム（２５０×４．６ｍｍ）を用いた逆相ＨＰＬＣにより実施例１４と同様の方法で分離した。溶出した各ピークを分取し、同様の方法でアミノ酸配列を決定し、酵素タンパク質の内部部分アミノ酸配列を決定した。得られたアミノ酸の主なものを配列番号２７〜２９に示した。
【実施例１７】
決定した部分アミノ酸配列をもとにミックストＤＮＡプライマー（配列番号３０〜３３）を合成し、ミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１株のゲノムＤＮＡを鋳型として実施例１５と同様の方法でＰＣＲを行なった。増幅ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてバンドを形成したＤＮＡを抽出し、直接、またはｐＴ７Ｂｌｕｅ−２にＴＡクローニングしたのち、ＤＮＡシークエンシングを行なって塩基配列を決定した。配列番号３０〜３３のプライマー（１）と（２）、（３）と（４）の組合せのＰＣＲから得られた塩基配列とアミノ酸配列を照合し、実施例１５と同様の方法によって精製酵素のＮ末端とＣ末端周辺を除く約２．８ｋｂの塩基配列を決定した。精製酵素Ｎ末端とＣ末端周辺の塩基配列決定は、インバースＰＣＲ法によって行なった（Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９０、Ｖｏｌ．６ Ｎｏ．５ ３７０−３７６参照）。ゲノムＤＮＡを各種の制限酵素で処理したのち、終濃度２．５ｎｇ／ｍｌでセルフライゲーションし、各末端近傍の塩基配列から合成したプライマーを用いてＰＣＲを行なった。得られた増幅ＤＮＡをｐＴ７Ｂｌｕｅ−２にライゲーションしたのち、同様に塩基配列を決定した。ゲノムＤＮＡのＰｖｕＩ消化物を用いたインバースＰＣＲで得られた約６５０塩基の増幅バンドから開始コドン上流から精製酵素のＮ末端下流の配列、ＡｐａＩ消化物を用いたインバースＰＣＲで得られた約１．９ｋ塩基の増幅バンドから終止コドン周辺の塩基配列を決定した。こうして決定した開始コドンから終止コドンまでの遺伝子全長は３３４８塩基、アミノ酸配列にして１１１５残基であった。この塩基配列から導かれたアミノ酸は精製酵素のアミノ酸配列分析で得られたアミノ酸配列と完全に一致していた。一方、菌体から精製した酵素のＮ末端は、開始コドンＭｅｔ１から数えて４７番目のＶａｌであった。ミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１株は培養液上清にも同一の酵素を産生していることから、Ｍｅｔ１からＡｌａ４６間は分泌シグナル配列として分泌過程で切断されることが明らかになった。決定した酵素タンパク質、酵素遺伝子の全アミノ酸配列、全塩基配列を配列番号７、９に示した。分泌後の成熟型酵素の全アミノ酸配列とこれをコードする塩基配列を配列番号８、１０に示した。
【実施例１８】
実施例１７で遺伝子配列を決定したミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１株のアルデヒドオキシダーゼの遺伝子を発現用ベクターにクローニングし、発現実験を行なった。Ａｌａ４６のコドンを開始コドンａｔｇに置換し、制限酵素ＮｄｅＩ認識配列を付加した合成プライマー（配列番号３４）と終止コドン下流６３〜６８塩基に制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列を付加した相補配列の合成プライマー（配列番号３５）を用い、ミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１株のゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲを行ない、約３．７ｋｂの増幅バンドを得た。このバンドを形成したＤＮＡをアガロースゲル電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて抽出し、ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。消化ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動して同様に抽出し、ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩ消化した発現ベクターｐＵＣＮＴ（特開２００３−１１６５５２）にライゲーションし、Ｅ．コリＤＨ５αに形質転換した。得られた形質転換株をアンピシリン１００μｇを含むＬＢ培地で一晩培養後、新しい同培地に継植して培養し、２時間後に１ｍＭのＩＰＴＧを添加して５時間培養後、培養菌体をＳＤＳ処理して全タンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行なった結果、約１１ｋＤａの位置に酵素タンパク質のバンドが確認できた。
【実施例１９】
実施例７で得られたセルロシミクロビウム・セルランスＩＦＯ１５５１６株のアルデヒドオキシダーゼを用いてアミノ酸配列の決定を行なった。限外濾過膜を用いて脱塩した精製酵素１０μｇを使用し、プロテインシークエンシングシステム モデル４９０プロサイズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてアミノ酸配列を決定した。次に、精製酵素１００μｇを９Ｍ尿素で変性後、緩衝液を０．２Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ９．０に交換し、リジルエンドペプチダーゼで３０℃、１６時間消化した。分解物をＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰカラム（ＹＭＣ社製）を用いて逆相ＨＰＬＣ法により精製した。移動相に０．１％トリフルオロ酢酸を用い、アセロニトリル１０〜５５％までの直線濃度勾配でペプチドを溶出した。溶出した各ピークを分取し、同様にタンパク質内部のアミノ酸配列を決定した。得られたアミノ酸配列の主なものを配列番号３６〜３８に示した。
【実施例２０】
実施例１９で決定した部分アミノ酸配列をもとに合成したミックストＤＮＡプライマー（配列番号３９〜４１）、およびミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１株のアルデヒドオキシダーゼの遺伝子の２５２１〜２５４５塩基の相補鎖ＤＮＡのミックストＤＮＡプライマー（配列番号４２）を用いて、セルロシミクロビウム・セルランスＩＦＯ１５５１６株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行なった。配列番号３９〜４２のプライマー（１）と（２）、（３）と（４）の組合せのＰＣＲで得られた増幅ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてバンドを形成したＤＮＡを抽出した。これらのＤＮＡを、直接、またはｐＴ７Ｂｌｕｅ−２にＴＡクローニングしたのち、ＤＮＡシークエンシングを行なって塩基配列を決定した。得られた塩基配列を、アミノ酸配列と照合し、実施例１５と同様の方法によって精製酵素のＮ末端とＣ末端周辺を除く約２．５ｋｂの塩基配列を決定した。精製酵素Ｎ末端とＣ末端周辺の塩基配列決定は実施例１７と同様にインバースＰＣＲ法によって行なった。ゲノムＤＮＡを各種の制限酵素で処理したのち、終濃度２．５ｎｇ／ｍｌでセルフライゲーションし、各末端近傍の塩基配列から合成したプライマーを用いてＰＣＲを行なった。得られた増幅ＤＮＡをｐＴ７Ｂｌｕｅ−２にライゲーションしたのち、同様に塩基配列を決定した。ゲノムＤＮＡのＮａｅＩ消化物を用いたインバースＰＣＲで得られた約１ｋｂの増幅バンドから開始コドン上流から精製酵素のＮ末端下流の配列、ＮｃｏＩ消化物を用いたインバースＰＣＲで得られた約１．１ｋｂの増幅バンドから終止コドン周辺の塩基配列を決定した。こうして決定した開始コドンから終止コドンまでの遺伝子全長は３３２４塩基、アミノ酸配列にして１１０７残基であった。この塩基配列から導かれたアミノ酸は精製酵素のアミノ酸配列分析で得られたアミノ酸配列と完全に一致していた。菌体から精製した酵素のＮ末端は、開始コドンＭｅｔ１から数えて３９番目のＡｓｐであった。培地中に分泌された酵素ではＭｅｔ１からＡｌａ３８は分泌シグナル配列として分泌過程で切断されていた。決定した酵素タンパク質、酵素遺伝子の全アミノ酸配列、全塩基配列を配列番号１１、１３に示した。分泌後の成熟型酵素の全アミノ酸配列とこれをコードする塩基配列を配列番号１２、１４に示した。
【産業上の利用可能性】
本発明による微生物、酵素を用いたグリオキサールからのグリオキシル酸の製造方法によれば、温和な条件でグリオキシル酸を製造することが可能であり、従来の硝酸酸化法などの化学的合成方法で問題点であった大量の塩類の生成などなくグリオキシル酸を製造できる。
【配列表フリーテキスト】
配列番号１：アルデヒドオキシダーゼのサブユニットγのアミノ酸配列
配列番号２：アルデヒドオキシダーゼのサブユニットβのアミノ酸配列
配列番号３：アルデヒドオキシダーゼのサブユニットαのアミノ酸配列
配列番号４：アルデヒドオキシダーゼのサブユニットγのＤＮＡ配列
配列番号５：アルデヒドオキシダーゼのサブユニットβのＤＮＡ配列
配列番号６：アルデヒドオキシダーゼのサブユニットαのＤＮＡ配列
配列番号７：シグナルペプチドを含むアルデヒドオキシダーゼのアミノ酸配列
配列番号８：アルデヒドオキシダーゼのアミノ酸配列
配列番号９：シグナルペプチドを含むアルデヒドオキシダーゼのＤＮＡ配列
配列番号１０：アルデヒドオキシダーゼのＤＮＡ配列
配列番号１１：シグナルペプチドを含むアルデヒドオキシダーゼのアミノ酸配列
配列番号１２：アルデヒドオキシダーゼのアミノ酸配列
配列番号１３：シグナルペプチドを含むアルデヒドオキシダーゼのＤＮＡ配列
配列番号１４：アルデヒドオキシダーゼのＤＮＡ配列
配列番号１５：アルデヒドオキシダーゼのサブユニットγのＮ末端アミノ酸配列
配列番号１６：アルデヒドオキシダーゼのサブユニットβのＮ末端アミノ酸配列
配列番号１７：アルデヒドオキシダーゼのサブユニットβのアミノ酸配列（Ａｌａ２３１〜Ａｌａ２６６）
配列番号１８：アルデヒドオキシダーゼのサブユニットαのＮ末端アミノ酸配列
配列番号１９：アルデヒドオキシダーゼのサブユニットαのアミノ酸配列（Ｌｅｕ２６１〜Ｇｌｕ２９８）
配列番号２０：アルデヒドオキシダーゼのサブユニットαのアミノ酸配列（Ｇｌｙ６５９〜Ｔｈｒ６９３）
配列番号２１：ストレプトミセス・スピーシーズＫＮＫ２６９株のアルデヒドオキシダーゼのサブユニットγのＮ末端アミノ酸配列に対応するミックストＤＮＡプライマー（１）
配列番号２２：ストレプトミセス・スピーシーズＫＮＫ２６９株のアルデヒドオキシダーゼのサブユニットβのアミノ酸配列（Ａｓｐ２５１〜Ａｌａ２５８）に対応する相補的なミックストＤＮＡプライマー（２）
配列番号２３：ストレプトミセス・スピーシーズＫＮＫ２６９株のアルデヒドオキシダーゼのサブユニットβのアミノ酸配列（Ａｓｐ２５１〜Ａｌａ２５８）に対応するミックストＤＮＡプライマー（３）
配列番号２４：ストレプトミセス・スピーシーズＫＮＫ２６９株のアルデヒドオキシダーゼのサブユニットαのアミノ酸配列（Ｌｅｕ２７４〜Ｇｌｕ２８１）に対応する相補的なミックストＤＮＡプライマー（４）
配列番号２５：ストレプトミセス・スピーシーズＫＮＫ２６９株のアルデヒドオキシダーゼのサブユニットαのアミノ酸配列（Ｌｅｕ２７４〜Ｇｌｕ２８１）に対応するミックストＤＮＡプライマー（５）
配列番号２６：ストレプトミセス・スピーシーズＫＮＫ２６９株のアルデヒドオキシダーゼのサブユニットαのアミノ酸配列（Ｌｅｕ６８６〜Ｇｌｕ６９３）に対応する相補的なミックストＤＮＡプライマー（６）
配列番号２７：アルデヒドオキシダーゼのＮ末端アミノ酸配列
配列番号２８：アルデヒドオキシダーゼの内部アミノ酸配列
配列番号２９：アルデヒドオキシダーゼの内部アミノ酸配列
配列番号３０：ミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１株由来のアルデヒドオキシダーゼのＮ末端アミノ酸配列に対応するミックストＤＮＡプライマー（１）
配列番号３１：ミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１株由来のアルデヒドオキシダーゼのアミノ酸配列（Ａｓｐ５１３〜Ｐｈｅ５２１）に対応する相補的なミックストＤＮＡプライマー（２）
配列番号３２：ミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１株由来のアルデヒドオキシダーゼのアミノ酸配列（Ａｓｐ５１３〜Ｐｈｅ５２１）に対応するミックストＤＮＡプライマー（３）
配列番号３３：ミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１株由来のアルデヒドオキシダーゼのアミノ酸配列（Ｐｈｅ９５９〜Ｔｈｒ９６９）に対応する相補的なミックストＤＮＡプライマー（４）
配列番号３４：ミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１株由来のアルデヒドオキシダーゼの、クローニングのためのＮｄｅＩ制限部位を含むＤＮＡプライマー
配列番号３５：ミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１株由来のアルデヒドオキシダーゼの、クローニングのためのＥｃｏＲＩ制限部位を含むＤＮＡプライマー
配列番号３６：アルデヒドオキシダーゼのＮ末端アミノ酸配列
配列番号３７：アルデヒドオキシダーゼの内部アミノ酸配列
配列番号３８：アルデヒドオキシダーゼの内部アミノ酸配列
配列番号３９：セルロシミクロビウム・セルランスＩＦＯ１５５１６株由来のアルデヒドオキシダーゼのＮ末端アミノ酸配列に対応するミックストＤＮＡプライマー（１）
配列番号４０：セルロシミクロビウム・セルランスＩＦＯ１５５１６株由来のアルデヒドオキシダーゼのアミノ酸配列（Ｉｌｅ３５０〜Ｖａｌ３５８）に対応する相補的なミックストＤＮＡプライマー（２）
配列番号４１：セルロシミクロビウム・セルランスＩＦＯ１５５１６株由来のアルデヒドオキシダーゼのアミノ酸配列（Ｔｈｒ１７６〜Ｔｈｒ１８３）に対応するミックストＤＮＡプライマー（３）
配列番号４２：ミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１由来のアルデヒドオキシダーゼのＤＮＡ配列（２５２１〜２５４５）に対応する相補的なミックストＤＮＡプライマー（４）
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリオキサールをグリオキシル酸へ変換する能力を有する酸化還元酵素、または該酸化還元酵素の産生能を有する微生物の培養液、培養液上清、菌体および菌体処理物のいずれか１種もしくは２種以上のそれらの混合物をグリオキサールに作用させ、グリオキシル酸へ変換することを特徴とするグリオキシル酸の製造方法。
【請求項２】
前記酸化還元酵素がオキシダーゼである請求の範囲第１項記載のグリオキシル酸の製造方法。
【請求項３】
前記酸化還元酵素がステノトロフォモナス属、ストレプトミセス属、シュードモナス属、ミクロバクテリウム属、アクロモバクター属、セルロモナス属、セルロシミクロビウム属、モルガネラ属からなる群から選ばれる少なくとも１つの微生物から得られた酵素である請求の範囲第１項または第２項記載のグリオキシル酸の製造方法。
【請求項４】
前記微生物が、ステノトロフォモナス・スピーシーズＫＮＫ２３５（ＦＥＲＭ Ｐ−１９００２）、ストレプトミセス・スピーシーズＫＮＫ２６９（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５６）、シュードモナス・スピーシーズＫＮＫ０５８（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５５）、シュードモナス・スピーシーズＫＮＫ２５４（ＦＥＲＭ Ｐ−１９００３）、ミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５４）、アクロモバクター・スピーシーズＩＦＯ １３４９５、セルロモナス・スピーシーズＪＣＭ ２４７１、セルロモナス・タバタＩＦＯ １５０１２、セルロモナス・タバタＩＦＯ １５０１４、セルロモナス・タバタＩＦＯ １５０１５、セルロシミクロビウム・セルランスＩＦＯ １５０１３、セルロシミクロビウム・セルランスＩＦＯ １５５１６、セルロシミクロビウム・セルランスＪＣＭ ６２０１、モルガネラ・モルガニイＩＦＯ ３８４８である請求の範囲第３項記載のグリオキシル酸の製造方法。
【請求項５】
反応時にカタラーゼを共存させる請求の範囲第１項記載のグリオキシル酸の製造方法。
【請求項６】
グリオキサールに作用し、グリオキシル酸を生成する微生物由来アルデヒドオキシダーゼ。
【請求項７】
グリオキシル酸に対する活性が、グリオキサールに対する活性の１／１０倍以下の活性である請求の範囲第６項記載のアルデヒドオキシダーゼ。
【請求項８】
前記アルデヒドオキシダーゼが、ステノトロフォモナス属、ストレプトミセス属、シュードモナス属、ミクロバクテリウム属、アクロモバクター属、セルロモナス属、セルロシミクロビウム属、モルガネラ属からなる群から選ばれる少なくとも１つの微生物が産生する請求の範囲第６項または第７項記載のアルデヒドオキシダーゼ。
【請求項９】
前記微生物が、ステノトロフォモナス・スピーシーズＫＮＫ２３５（ＦＥＲＭ Ｐ−１９００２）、ストレプトミセス・スピーシーズＫＮＫ２６９（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５６）、シュードモナス・スピーシーズＫＮＫ０５８（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５５）、シュードモナス・スピーシーズＫＮＫ２５４（ＦＥＲＭ Ｐ−１９００３）、ミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５４）、アクロモバクター・スピーシーズＩＦＯ １３４９５、セルロモナス・スピーシーズＪＣＭ ２４７１、セルロモナス・タバタＩＦＯ １５０１２、セルロモナス・タバタＩＦＯ １５０１４、セルロモナス・タバタＩＦＯ １５０１５、セルロシミクロビウム・セルランスＩＦＯ １５０１３、セルロシミクロビウム・セルランスＩＦＯ １５５１６、セルロシミクロビウム・セルランスＪＣＭ ６２０１、モルガネラ・モルガニイＩＦＯ ３８４８である請求の範囲第８項記載のアルデヒドオキシダーゼ。
【請求項１０】
以下（１）〜（３）の理化学的性質を有するストレプトミセス属微生物が産生する請求の範囲第８項記載のアルデヒドオキシダーゼ。
（１）至適ｐＨ：６〜９
（２）熱安定性：ｐＨ７．２で６０℃、２０分処理したのち、９０％以上の活性を保持している
（３）分子量：ゲル濾過分析において約１１万であり、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析において、約２．５万、約３．５万、約８万の３つのサブユニットタンパク質を有する
【請求項１１】
以下（１）〜（３）の理化学的性質を有するシュードモナス属に属する微生物が産生する請求の範囲第８項記載のアルデヒドオキシダーゼ。
（１）分子量：ゲル濾過分析において約１５万
（２）反応至適温度：６０〜７０℃
（３）反応至適ｐＨ：５〜７
【請求項１２】
以下の理化学的性質を有するミクロバクテリウム属微生物が菌体内および菌体外に産生する請求の範囲第８項記載のアルデヒドオキシダーゼ。
分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析において約１１万の単一タンパク質
【請求項１３】
以下の理化学的性質を有するセルロシミクロビウム属微生物が菌体内および菌体外に産生する請求の範囲第８項記載のアルデヒドオキシダーゼ。
分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析において約９〜１０万の単一タンパク質
【請求項１４】
ストレプトミセス属に属する微生物がストレプトミセス・スピーシーズＫＮＫ２６９（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５６）である請求の範囲第１０項記載のアルデヒドオキシダーゼ。
【請求項１５】
シュードモナス属に属する微生物がシュードモナス・スピーシーズＫＮＫ０５８（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５５）である請求の範囲第１１項記載のアルデヒドオキシダーゼ。
【請求項１６】
ミクロバクテリウム属に属する微生物がミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５４）である請求の範囲第１２項記載のアルデヒドオキシダーゼ。
【請求項１７】
セルロシミクロビウム属に属する微生物がセルロシミクロビウム・セルランスＩＦＯ １５５１６である請求の範囲第１３項記載のアルデヒドオキシダーゼ。
【請求項１８】
以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をサブユニットとして有する請求の範囲第６項記載のアルデヒドオキシダーゼ。
（ａ）配列番号１、２もしくは３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列のいずれか１つを含むタンパク質
【請求項１９】
以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質をサブユニットとして有する請求の範囲第６項記載のアルデヒドオキシダーゼ。
（ａ）配列番号４、５もしくは６の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡのいずれか１つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
【請求項２０】
以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなる請求の範囲第６項記載のアルデヒドオキシダーゼ。
（ａ）配列番号７、８、１１もしくは１２で表されるアミノ酸配列
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
【請求項２１】
以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡによってコードされる請求の範囲第６項記載のアルデヒドオキシダーゼ。
（ａ）配列番号９、１０、１３もしくは１４の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
【請求項２２】
以下の（ａ）または（ｂ）のいずれかを含んでなる、請求の範囲第６項記載のアルデヒドオキシダーゼのサブユニットをコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号４、５もしくは６の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡのいずれか１つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
【請求項２３】
以下の（ａ）または（ｂ）のいずれかを含んでなる、請求の範囲第６項記載のアルデヒドオキシダーゼをコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号９、１０、１３もしくは１４の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡのいずれか１つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
【請求項２４】
配列番号１、２または３で表わされるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列のいずれかを含んでなる、請求の範囲第６項記載のアルデヒドオキシダーゼのサブユニットをコードするＤＮＡ。
【請求項２５】
配列番号７、８、１１または１２で表わされるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列のいずれかを含んでなる、請求の範囲第６項記載のアルデヒドオキシダーゼをコードするＤＮＡ。
【請求項１】
グリオキサールをグリオキシル酸へ変換する能力を有する酸化還元酵素、または該酸化還元酵素の産生能を有する微生物の培養液、培養液上清、菌体および菌体処理物のいずれか１種もしくは２種以上のそれらの混合物をグリオキサールに作用させ、グリオキシル酸へ変換することを特徴とするグリオキシル酸の製造方法。
【請求項２】
前記酸化還元酵素がオキシダーゼである請求の範囲第１項記載のグリオキシル酸の製造方法。
【請求項３】
前記酸化還元酵素がステノトロフォモナス属、ストレプトミセス属、シュードモナス属、ミクロバクテリウム属、アクロモバクター属、セルロモナス属、セルロシミクロビウム属、モルガネラ属からなる群から選ばれる少なくとも１つの微生物から得られた酵素である請求の範囲第１項または第２項記載のグリオキシル酸の製造方法。
【請求項４】
前記微生物が、ステノトロフォモナス・スピーシーズＫＮＫ２３５（ＦＥＲＭ Ｐ−１９００２）、ストレプトミセス・スピーシーズＫＮＫ２６９（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５６）、シュードモナス・スピーシーズＫＮＫ０５８（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５５）、シュードモナス・スピーシーズＫＮＫ２５４（ＦＥＲＭ Ｐ−１９００３）、ミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５４）、アクロモバクター・スピーシーズＩＦＯ １３４９５、セルロモナス・スピーシーズＪＣＭ ２４７１、セルロモナス・タバタＩＦＯ １５０１２、セルロモナス・タバタＩＦＯ １５０１４、セルロモナス・タバタＩＦＯ １５０１５、セルロシミクロビウム・セルランスＩＦＯ １５０１３、セルロシミクロビウム・セルランスＩＦＯ １５５１６、セルロシミクロビウム・セルランスＪＣＭ ６２０１、モルガネラ・モルガニイＩＦＯ ３８４８である請求の範囲第３項記載のグリオキシル酸の製造方法。
【請求項５】
反応時にカタラーゼを共存させる請求の範囲第１項記載のグリオキシル酸の製造方法。
【請求項６】
グリオキサールに作用し、グリオキシル酸を生成する微生物由来アルデヒドオキシダーゼ。
【請求項７】
グリオキシル酸に対する活性が、グリオキサールに対する活性の１／１０倍以下の活性である請求の範囲第６項記載のアルデヒドオキシダーゼ。
【請求項８】
前記アルデヒドオキシダーゼが、ステノトロフォモナス属、ストレプトミセス属、シュードモナス属、ミクロバクテリウム属、アクロモバクター属、セルロモナス属、セルロシミクロビウム属、モルガネラ属からなる群から選ばれる少なくとも１つの微生物が産生する請求の範囲第６項または第７項記載のアルデヒドオキシダーゼ。
【請求項９】
前記微生物が、ステノトロフォモナス・スピーシーズＫＮＫ２３５（ＦＥＲＭ Ｐ−１９００２）、ストレプトミセス・スピーシーズＫＮＫ２６９（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５６）、シュードモナス・スピーシーズＫＮＫ０５８（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５５）、シュードモナス・スピーシーズＫＮＫ２５４（ＦＥＲＭ Ｐ−１９００３）、ミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５４）、アクロモバクター・スピーシーズＩＦＯ １３４９５、セルロモナス・スピーシーズＪＣＭ ２４７１、セルロモナス・タバタＩＦＯ １５０１２、セルロモナス・タバタＩＦＯ １５０１４、セルロモナス・タバタＩＦＯ １５０１５、セルロシミクロビウム・セルランスＩＦＯ １５０１３、セルロシミクロビウム・セルランスＩＦＯ １５５１６、セルロシミクロビウム・セルランスＪＣＭ ６２０１、モルガネラ・モルガニイＩＦＯ ３８４８である請求の範囲第８項記載のアルデヒドオキシダーゼ。
【請求項１０】
以下（１）〜（３）の理化学的性質を有するストレプトミセス属微生物が産生する請求の範囲第８項記載のアルデヒドオキシダーゼ。
（１）至適ｐＨ：６〜９
（２）熱安定性：ｐＨ７．２で６０℃、２０分処理したのち、９０％以上の活性を保持している
（３）分子量：ゲル濾過分析において約１１万であり、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析において、約２．５万、約３．５万、約８万の３つのサブユニットタンパク質を有する
【請求項１１】
以下（１）〜（３）の理化学的性質を有するシュードモナス属に属する微生物が産生する請求の範囲第８項記載のアルデヒドオキシダーゼ。
（１）分子量：ゲル濾過分析において約１５万
（２）反応至適温度：６０〜７０℃
（３）反応至適ｐＨ：５〜７
【請求項１２】
以下の理化学的性質を有するミクロバクテリウム属微生物が菌体内および菌体外に産生する請求の範囲第８項記載のアルデヒドオキシダーゼ。
分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析において約１１万の単一タンパク質
【請求項１３】
以下の理化学的性質を有するセルロシミクロビウム属微生物が菌体内および菌体外に産生する請求の範囲第８項記載のアルデヒドオキシダーゼ。
分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析において約９〜１０万の単一タンパク質
【請求項１４】
ストレプトミセス属に属する微生物がストレプトミセス・スピーシーズＫＮＫ２６９（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５６）である請求の範囲第１０項記載のアルデヒドオキシダーゼ。
【請求項１５】
シュードモナス属に属する微生物がシュードモナス・スピーシーズＫＮＫ０５８（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５５）である請求の範囲第１１項記載のアルデヒドオキシダーゼ。
【請求項１６】
ミクロバクテリウム属に属する微生物がミクロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ０１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５５４）である請求の範囲第１２項記載のアルデヒドオキシダーゼ。
【請求項１７】
セルロシミクロビウム属に属する微生物がセルロシミクロビウム・セルランスＩＦＯ １５５１６である請求の範囲第１３項記載のアルデヒドオキシダーゼ。
【請求項１８】
以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をサブユニットとして有する請求の範囲第６項記載のアルデヒドオキシダーゼ。
（ａ）配列番号１、２もしくは３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列のいずれか１つを含むタンパク質
【請求項１９】
以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質をサブユニットとして有する請求の範囲第６項記載のアルデヒドオキシダーゼ。
（ａ）配列番号４、５もしくは６の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡのいずれか１つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
【請求項２０】
以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなる請求の範囲第６項記載のアルデヒドオキシダーゼ。
（ａ）配列番号７、８、１１もしくは１２で表されるアミノ酸配列
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
【請求項２１】
以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡによってコードされる請求の範囲第６項記載のアルデヒドオキシダーゼ。
（ａ）配列番号９、１０、１３もしくは１４の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
【請求項２２】
以下の（ａ）または（ｂ）のいずれかを含んでなる、請求の範囲第６項記載のアルデヒドオキシダーゼのサブユニットをコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号４、５もしくは６の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡのいずれか１つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
【請求項２３】
以下の（ａ）または（ｂ）のいずれかを含んでなる、請求の範囲第６項記載のアルデヒドオキシダーゼをコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号９、１０、１３もしくは１４の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡのいずれか１つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
【請求項２４】
配列番号１、２または３で表わされるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列のいずれかを含んでなる、請求の範囲第６項記載のアルデヒドオキシダーゼのサブユニットをコードするＤＮＡ。
【請求項２５】
配列番号７、８、１１または１２で表わされるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列のいずれかを含んでなる、請求の範囲第６項記載のアルデヒドオキシダーゼをコードするＤＮＡ。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７２２８１
【国際公開日】平成１６年８月２６日（２００４．８．２６）
【発行日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０５００９（Ｐ２００５−５０５００９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００１５７７
【国際出願日】平成１６年２月１３日（２００４．２．１３）
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年８月２６日（２００４．８．２６）
【発行日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００１５７７
【国際出願日】平成１６年２月１３日（２００４．２．１３）
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【Ｆターム（参考）】
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