グリコシルトランスフェラーゼの核酸を発現する細胞を含有するバイオリアクター
本発明者等は、グリコシルトランスフェラーゼの核酸及びタンパク質、上記グリコシルトランスフェラーゼを発現するトランスジェニック細胞、並びに該トランスジェニック細胞を含むバイオリアクターについて記載する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明者等は、グリコシルトランスフェラーゼの核酸及びタンパク質、上記グリコシルトランスフェラーゼを発現するトランスジェニック細胞、並びに該トランスジェニック細胞を含むバイオリアクターについて記載する。
【背景技術】
【０００２】
グリコシルトランスフェラーゼ（ＧＴａｓｅ）は、グリコシル残基を活性化ヌクレオチド糖から、他の糖質、タンパク質、脂質及び他の有機基質等の単分子受容体及び高分子受容体へ翻訳後に転移させる酵素である。これらのグルコシル化分子は、多様な代謝経路及び代謝プロセスに関与する。グルコシル部分の転移により、細胞内及び植物の至る所で、受容体の生物活性、溶解性及び輸送特性が変わり得る。高等植物におけるＧＴａｓｅのうち、１ファミリーは、Ｃ末端コンセンサス配列が存在するのが特徴である。このファミリーのＧＴａｓｅは、植物細胞の細胞基質で働き、フェニルプロパノイド誘導体類、クマリン類、フラボノイド類、他の二次代謝産物及び植物ホルモン類として作用する既知の分子等の低分子量基質への、グルコースの転移を触媒する。入手可能な証拠から、インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）をグルコシル化するトウモロコシ（maize)及びアラビドプシス（シロイヌナズナ：Arabidopsis）ＧＴａｓｅ等、ＧＴａｓｅ酵素は高特異的であり得ることが示唆される。本発明者等はまた、アブシジン酸を修飾するＧＴａｓｅの１ファミリーを同定している（国際公開第０３／０２３０３５号パンフレットを参照されたい）。
【０００３】
グリコシルトランスフェラーゼのさらなる例は、本願に記載される。
【０００４】
サイトカイニン類は、アデニンに類似した構造を有する植物ホルモン類であり、細胞分裂の刺激を包含する各種機能を有する。サイトカイニン類は、ほとんどの高等植物で及びセン類、真菌類、細菌類で、並びに多くの真核生物及び原核生物の転移ＲＮＡで見い出される。２００を上回る種々のサイトカイニン化合物があり、分裂組織領域及び継続的成長部位、例えば根、若葉、発育果実（developing fruit)及び発育種子中に高濃度で見い出される。植物源から単離された最初のサイトカイニンは、ゼアチンと称された。細胞分裂を刺激するのに加え、サイトカイニン類は、細胞成長させることにより、組織培養、側芽の成長及び葉の伸長における形態形成をも刺激する。いくつかの種では、サイトカイニン類は、気孔開口の促進に関与し、クロロフィル合成を刺激することによりエチオプラストのクロロプラストへの変換を促進する。サイトカイニン類がグルコシル化により修飾され得ることは、既知である。
【０００５】
ＧＴａｓｅはまた、抗酸化物の改変に関して実用性がある。活性酸素種は、呼吸している間、全ての好気性生物で生産され、通常は生化学的抗酸化物と共に平衡状態で細胞中に存在する。汚染因子、オキシダント、毒物、重金属等による環境問題は、細胞の酸化還元の平衡をかき乱す活性酸素種が過剰となり、場合によっては広範囲にわたる病的状態を引き起こし得る。動物及びヒトでは、循環器病、癌、炎症性及び変性疾患は、酸化的損傷から起こる事象に関連される。これら疾患の現在の罹患率から、抗酸化物はかなりの関心が持たれ、食事で摂取されるか、又はＵＶ遮断剤等で局所的に塗布される。
【０００６】
野菜及び果物、茶、ハーブ類及び薬草から得られる抗酸化微量栄養素成分は、酸化的ストレスから引き起こされる健康問題に対して、有効な予防を提供するものと考えられる。植物組織からの既知の抗酸化物としては、例えばケルセチン、ルテオリン、並びにカテキン、エピカテキン及びシアニジン化合物群が挙げられる。コーヒー酸（３，４−ヒドロキシ桂皮酸）は、効果的な治療特性を有する抗酸化物のさらなる一例である。ある特定の植物種、器官及び組織は、抗酸化活性を有する１種類以上の化合物の比較的高い濃度を有することが知られている。それらの種における、これらの化合物のより多くの蓄積、食物及び飲料の生産で既に使用されている作物及び植物の一部における化合物のより広範囲の分布、並びに抗酸化物の向上した生体利用効率（吸収率、代謝変換率及び排泄率）は、極めて望まれる３つの考えられる特徴である。
【０００７】
バイオリアクター（例えば、発酵槽）は、細胞又は酵素を含む槽であり、通常は工業規模で分子の生産に使用される。上記分子は、上記槽に含有される細胞によって、又は反応槽中で完了した酸素反応を介して生成される、組み換えタンパク質（例えば、プロテアーゼ類、リパーゼ類、アミラーゼ類、ヌクレアーゼ類、抗体等の酵素）又は化合物であり得る。典型的には、細胞に基づいたバイオリアクターは、目的の細胞を含み、且つ反応を行うのに必要な栄養素成分及び／又は補因子の全てを包含する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、立体特異的方法で化合物（例えば、サイトカイニン類、ケルセチン）を修飾するＧＴａｓｅ（すなわち、高度に特異的に、有するサイトカイニン類又はケルセチンを標識できるＧＴａｓｅファミリー）を本願に開示する。さらに、本発明者等は、グルコシル部分をこれらの化合物に付加するのに、これらのグリコシルトランスフェラーゼを利用する、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞に基づいたバイオリアクターについても開示する。
【０００９】
本発明者等は、驚くべきことに、バイオリアクターがＵＤＰ−グルコース（これらの酵素群に対する基質）の外生的供給を必要としないことを見い出す。これは、植物のＧＴａｓｅにおいて一般的な原理であり、植物のＧＴａｓｅを用いて形質転換されたトランスジェニック細胞を含む任意の細胞に基づいたバイオリアクターに適用することができるということを、本発明者等は明らかにする。本発明者等の同時係属中の出願国際公開第０１／５９１４０号パンフレット、国際公開第０２／１０３０２２号パンフレット、国際公開第０３／０２３０３５号パンフレットにおいて、本発明者等は、一連の小分子に対する基質特異性を有するＧＴａｓｅ配列を開示し、これらの配列はバイオリアクターの実施の形態（embodiment)に関する最新の出願を具体的に参照して本明細書の一部とする。
【００１０】
本発明の一態様によれば、植物のグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸分子を用いて形質移入又は形質転換することにより遺伝的に改変された細胞を含む反応槽であって、該反応槽は上記細胞の増殖を維持する栄養培地を包含し、該栄養培地がＵＤＰ−グルコースの外生的供給を包含しないことを特徴とする、反応槽が提供される。
【００１１】
本発明の一態様によれば、遺伝的に改変された細胞を含む反応槽であって、
ｉ）図１ａ、図２ａ、図３ａ、図４ａ、図４ｂ、図５ａ、図５ｂ、図６ａ、図６ｂ、図７ａ、図７ｂ、図８ａ、図８ｂ、図９ａ、図９ｂ、図１０ａ、図１０ｂ、図１１ａ、図１２ａ及び図１２ｂに表されるような核酸配列を含む核酸分子、
ｉｉ）上記（ｉ）に表される核酸配列に対してハイブリダイズし、且つグリコシルトランスフェラーゼの活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子、及び
ｉｉｉ）上記（ｉ）及び（ｉｉ）で規定された核酸配列に対する遺伝子コードから、縮重する核酸配列を含む核酸分子
から成る群から選択される核酸分子を用いて、形質移入又は形質転換により改変される上記細胞、及び上記グリコシルトランスフェラーゼに対する基質である、少なくとも１つの外生的基質を包含し、上記細胞の増殖を維持する栄養培地を含み、
該栄養培地が、ＵＤＰ−グルコースの外生的供給を包含しないことを特徴とする、反応槽が提供される。
【００１２】
本発明の好ましい一実施形態において、上記反応槽がバイオリアクターである。
【００１３】
さらに本発明の好ましい一実施形態において、上記栄養培地がＵＤＰ−グルコースの外生的供給を包含しない。
【００１４】
さらに本発明の好ましい一実施形態において、上記核酸分子が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、図１ａ、図２ａ、図３ａ、図４ａ、図４ｂ、図５ａ、図５ｂ、図６ａ、図６ｂ、図７ａ、図７ｂ、図８ａ、図８ｂ、図９ａ、図９ｂ、図１０ａ、図１０ｂ、図１１ａ、図１２ａ及び図１２ｂに提示される核酸配列に対してハイブリダイズする。
【００１５】
厳密なハイブリダイゼーション／洗浄条件は、当該技術分野で既知のことである。例えば、０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中で６０℃で洗浄した後、核酸ハイブリッドは安定する。核酸の配列が既知であれば、最適なハイブリダイゼーション条件が算出され得ることは、当該技術分野で既知のことである。例えば、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションを受ける核酸のＧＣ含量により決定され得る。サムブルーク他（Sambrook et al.)著、(１９８９年）「分子クローニング（Molecular Cloning)；実験入門（A Laboratory Approach）」を参照されたい。特異的相同性を有する核酸分子間のハイブリダイゼーションを達成するのに必要とされる厳密な条件を算出する一般式は以下の通りである。
【００１６】
Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１［％Ｇ＋Ｃ］−０．６３（％ホルムアミド）
【００１７】
典型的には、ハイブリダイゼーション条件は、４×ＳＳＰＥ〜６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥは、１リットルに溶解された１７５．３ｇのＮａＣｌ、８８．２ｇのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ及び７．４ｇのＥＤＴＡを含有し、ｐＨは７．４に調整されている）、５×デンハート溶液〜１０×デンハート溶液（５０×デンハート溶液は、５ｇのフィコール（４００型、ファルマシア社）、５ｇのポリビニルピロリドン及び５ｇのウシ血清アルブミンを含有する）、１００μｇ〜１．０ｍｇ／ｍｌの超音波で破砕されたサケ／ニシンＤＮＡ、０．１〜１．０％のドデシル硫酸ナトリウム、任意に４０〜６０％の脱イオンホルムアミドを使用する。ハイブリダイゼーション温度は、標的核酸配列のＧＣ含量に依存して変わるが、通常は４２℃〜６５℃である。
【００１８】
さらに本発明の好ましい一実施形態において、上記細胞が、上記核酸分子を含むベクターを用いて形質移入又は形質転換される。
【００１９】
さらに好ましい本発明の１つの方法において、上記ベクターが、真核細胞又は原核細胞の遺伝子発現に従来適合している発現ベクターである。
【００２０】
典型的には、上記適合は、限定する意図はなく例として、細胞特異的発現を仲介する転写制御配列（プロモータ配列）の提供を包含する。これらのプロモータ配列は、細胞特異的であり得、誘導的又は構成的であり得る。
【００２１】
プロモータとは当該技術分野で認識されている用語であり、明快にするために、限定する意図はなく例としてのみ提供される以下の特徴を包含する。エンハンサー要素は、遺伝子の転写開始部位で５’側によく見られるシス作用性核酸配列である（エンハンサーはまた、遺伝子配列の３’側にも見られ得、又はイントロン配列内に位置することさえあるため、位置に依存しない）。エンハンサーは、エンハンサーが結合する遺伝子の転写の速度を増大するように機能する。エンハンサー活性は、エンハンサー要素への特異的な結合が見られるトランス作用性転写因子に応答する。転写因子（「真核生物の転写因子（Eukaryotic Transcription Factors)」、デイビッド・エス・ラックマン（David S Latchman)著、Academic Press Ltd（サンディエゴ所在）を参照されたい）の結合／活性は、限定する意図はなく例として、中間代謝産物（例えば、糖質）、環境エフェクター（例えば、光、熱）を含む多くの環境信号に応答する。
【００２２】
また、プロモータ要素は、転写開始の部位を選択するように機能する、いわゆるＴＡＴＡボックス及びＲＮＡポリメラーゼ開始選択（ＲＩＳ）配列を包含する。また、これらの配列は、とりわけＲＮＡポリメラーゼによる転写開始選択を促進するように機能するポリペプチド類を結合する。
【００２３】
適合はまた、真核細胞又は原核ホストのどちらかにおいて、選択可能なマーカー及び自律複製配列（これら両方が上記ベクターの維持を促進する）の提供を包含する。自律的に維持されるベクターは、エピソームベクターと称される。これらの分子が巨大ＤＮＡフラグメント（３０〜５０ｋｂのＤＮＡ）を組み込むことができるため、エピソームベクターが望ましい。この種のエピソームベクターは、国際公開第９８／０７８７６号パンフレットに記載される。
【００２４】
ベクターにコードされた遺伝子の発現を促進する適合は、転写終結／ポリアデニル化配列の提供を包含する。適合はまた、バイシストロン性発現カセット又は多シストロン性(multi-cistronic)発現カセットに配列されたベクターにコードされた遺伝子の発現を最大にするように機能する、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の提供を包含する。
【００２５】
また、発現制御配列は、いわゆる遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）を包含する。これは、マウスにおけるトランスジェニック構築物として分析される場合に、結合遺伝子に対する位置非依存的、コピー数依存的発現を与える調節要素である。ＬＣＲは、隣接するヘテロクロマチンのサイレンシング効果から導入遺伝子を遮蔽（insulate)する調節要素を包含する（グロスベルド他（Grosveld et al.)、Cell (１９８７年）、第５１巻：９７５〜９８５ページ）。
【００２６】
これらの適合は、当該技術分野に既知である。概して、発現ベクター構築技法及び組み換えＤＮＡ技法に関して、かなりの量の文献が公開されている。サムブルーク他（Sambrook et al.)著、(１９８９年）「分子クローニング（Molecular Cloning)；実験入門書（A Laboratory Approach）」、Cold Spring Harbour Laboratory、 Cold Spring Harbour（ニーヨーク所在）及びその中の参考文献であるマースト・エフ（Marson F)著、「ＤＮＡクローニング技法（DNA Cloning Techniques)：実践的なアプローチ（A Practical Approach)」、第３巻、IRL Press（オックスフォード、イギリス）；「ＤＮＡクローニング（DNA Cloning)」、エフ・エム・アウスベル他（F M Ausubel et al.)著、「分子生物における最新プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology)」、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ社（John Wiley & Sons)、INC.（１９９４年）を参照されたい。
【００２７】
本発明の好ましい一実施形態において、上記細胞が、図１ｂ、図２ｂ、図３ｂ、図４ｃ、図５ｃ、図６ｃ、図７ｃ、図８ｃ、図９ｃ、図１０ｃ、図１１ｂ若しくは図１２ｃに表されるアミノ酸配列により表されるようなポリペプチド、又は少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失若しくは置換により改変された変異ポリペプチドをコードする、核酸分子を用いて形質移入又は形質転換される。
【００２８】
変異ポリペプチドにおいて、任意の組み合わせで存在し得る１つ以上の置換、付加、欠失、切断（truncation)によりアミノ酸配列が異なり得る。好ましい変異体の中には、同類アミノ酸置換による参照ポリペプチドとは異なるものがある。このような置換は、同様の特性を有する別のアミノ酸により所定のアミノ酸を置換するものである。以下に、非限定的な同類置換（類似）であると考えられるアミノ酸を羅列する：ａ）アラニン、セリン及びスレオニン；ｂ）グルタミン酸及びアスパラギン酸；ｃ）アスパラギン及びグルタミン；ｄ）アルギニン及びリシン；ｅ）イソロイシン、ロイシン、メチオニン及びバリン；及びｆ）フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン。参照ポリペプチドと同じ生物学的機能及び活性を保有するか、又は促進する、参照ポリペプチドとは異なる変異体（例えばグリコシルトランスフェラーゼの活性を高めたポリペプチド）が極めて好ましい。機能的に等価なポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸残基が同類若しくは非同類アミノ酸残基で置換されたような、又は１つ以上のアミノ酸残基が１つの置換基を含むような変異体である。同類置換とは、１つを別のもので、脂肪族アミノ酸（Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅ）間での置換、ヒドロキシル残基（Ｓｅｒ及びＴｈｒ）の相互置換、酸性残基（Ａｓｐ及びＧｌｕ）の交換、アミド残基（Ａｓｎ及びＧｌｎ）間の置換、塩基性残基（Ｌｙｓ及びＡｒｇ）の交換、並びに芳香族残基（Ｐｈｅ及びＴｙｒ）間の置換である。
【００２９】
さらに、本発明は、本明細書中に開示されるようなポリペプチド配列、又はフラグメント及びその機能的に等価なポリペプチド類に対して、少なくとも７５％の同一性を有するポリペプチド配列を特徴とする。一実施の形態において、ポリペプチド類は、本明細書中に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８５％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性、なおさらより好ましくは少なくとも９７％の同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有し、且つポリペプチド類は増強したグリコシルトランスフェラーゼの活性を保有するか、又は有する。
【００３０】
本発明のさらなる態様によれば、核酸分子を用いて、形質移入又は形質転換されるトランスジェニック細胞であって、該トランスジェニック細胞は、
ｉ）図１ａ、図２ａ、図３ａ、図４ａ、図４ｂ、図５ａ、図５ｂ、図６ａ、図６ｂ、図７ａ、図７ｂ、図８ａ又は図８ｂに表されるような核酸配列から成る核酸分子、
ｉｉ）上記（ｉ）の核酸分子に対してハイブリダイズし、且つ抗酸化物をグルコシル化するグリコシルトランスフェラーゼの活性を有する核酸分子、及び
ｉｉｉ）上記（ｉ）及び（ｉｉ）に規定された核酸配列に対する遺伝子コードから、縮重する核酸配列から成る核酸分子
から成る群から選択される核酸配列を含む核酸分子を用いて、形質移入又は形質転換される、トランスジェニック細胞が提供される。
【００３１】
本発明の好ましい一実施形態において、上記核酸分子が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、図１ａ、図２ａ、図３ａ、図４ａ、図４ｂ、図５ａ、図５ｂ、図６ａ、図６ｂ、図７ａ、図７ｂ、図８ａ又は図８ｂに提示される核酸配列に対してハイブリダイズする。
【００３２】
本発明のさらに好ましい一実施形態において、上記抗酸化物がケルセチンである。
【００３３】
本発明の代替的な好ましい一実施形態において、上記抗酸化物がエスクレチンである。
【００３４】
本発明のまたさらなる一態様によれば、
ｉ）図１ａ、図２ａ、図３ａ、図４ａ、図４ｂ、図５ａ、図５ｂ、図６ａ、図６ｂ、図７ａ、図７ｂ、図８ａ又は図８ｂに表されるような核酸配列から成る核酸分子、
ｉｉ）上記（ｉ）の核酸分子に対してハイブリダイズし、且つ抗酸化物をグルコシル化するグリコシルトランスフェラーゼの活性を有する核酸分子、及び
ｉｉｉ）上記（ｉ）及び（ｉｉ）に規定された核酸配列に対する遺伝子コードから、縮重する核酸配列から成る核酸分子
から成る群から選択される核酸分子を含むベクターが提供される。
【００３５】
本発明のさらなる一態様によれば、核酸分子を用いて、形質移入又は形質転換されるトランスジェニック細胞であって、該トランスジェニック細胞は、
ｉ）図９ａ、図９ｂ、図１０ａ、図１０ｂ、図１１ａ、図１２ａ及び図１２ｂに表されるような核酸配列から成る核酸分子、
ｉｉ）上記（ｉ）の核酸分子に対してハイブリダイズし、且つサイトカイニンをグルコシル化するグリコシルトランスフェラーゼの活性を有する核酸分子、及び
ｉｉｉ）上記（ｉ）及び（ｉｉ）に規定された核酸配列に対する遺伝子コードから、縮重する核酸配列から成る核酸分子
から成る群から選択される核酸配列を含む核酸分子を用いて、形質移入又は形質転換される、トランスジェニック細胞が提供される。
【００３６】
本発明の好ましい一実施形態において、上記核酸分子が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、図９ａ、図９ｂ、図１０ａ，図１０ｂ、図１１ａ、図１２ａ及び図１２ｂに表される配列に対してハイブリダイズする。
【００３７】
本発明の好ましい一実施形態において、上記サイトカイニンが、トランス−ゼアチン、ジヒドロゼアチン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｎ６−ベンジルアデニン及びカイネチンから成る群から選択される。
【００３８】
本発明のまたさらなる一態様によれば、
ｉ）図９ａ、図９ｂ、図１０ａ、図１０ｂ、図１１ａ、図１２ａ及び図１２ｂに表されるような核酸配列から成る核酸分子、
ｉｉ）上記（ｉ）の核酸分子に対してハイブリダイズし、且つサイトカイニンをグルコシル化するグリコシルトランスフェラーゼの活性を有する核酸分子、及び
ｉｉｉ）上記（ｉ）及び（ｉｉ）に規定された核酸配列に対する遺伝子コードから、縮重する核酸配列から成る核酸分子
から成る群から選択される核酸分子を含むベクターが提供される。
【００３９】
本発明の好ましい一実施形態において、上記細胞が、真核細胞である。上記細胞が、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞又は植物細胞から成る群から選択されることが好ましい。
【００４０】
本発明の好ましい一実施形態において、上記細胞が植物細胞である。
【００４１】
本発明の好ましい一実施形態において、上記植物細胞は、トウモロコシ（Zea mays）、カノーラ（Brassica napus、Brassica rapa ssp.）、アルファルファ（Medicago Sativa）、コメ（Oryza sativa）、ライムギ（Secale cereale）、ソルガム（Sorghum bicolor、Sorghum vulgare)、ヒマワリ（Heliabthus annuas）、コムギ（Tritium aestivum）、ダイズ（Glycine max）、タバコ（Nicotiana tabacum）、ジャガイモ（Solanum tuberosum）、ラッカセイ（Arachis hypogaea）、ワタ（Gossypium hirsutum）、サツマイモ（Iopmoea batatus）、カッサバ（Manihot esculenta）、コーヒー（Coffea spp.）、ココナッツ（Cocos nucifera）、パイナップル（Anana comosus）、カンキツ樹（Citris tree)(Citrus spp.）、カカオ（Theobroma cacao）、チャ（Camellia sinensis）、バナナ（Musa spp.）、アボカド（Persea americana）、イチジク（Ficus carica）、グアバ（Psidium guajava）、マンゴー（Mangifer indica）、オリーブ（Olea europaea）、パパイヤ（Carica papaya）、カシューナッツ（Anacardium occidentale）、マカダミアナッツ（Macadamia integrifolia）、アーモンド（Prunus amygdalus）、テンサイ（Beta vulgaris）、オートムギ、オオムギ、野菜類及び観葉植物（ornamentals)から選択される。
【００４２】
本発明の植物細胞は、作物細胞（例えば、穀草類及び食用豆類、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモ類、タピオカ、コメ、ソルガム、キビ、カッサバ、オオムギ、エンドウ豆、並びに他の根、塊茎又は種子作物）であることが好ましい。重要な種子作物は、アブラナ、テンサイ、トウモロコシ、ヒマワリ、ダイズ及びソルガムである。本発明に適用し得る園芸植物としては、レタス、エンダイブ、並びにキャベツ、ブロッコリー及びカリフラワーを含むブラシカ属（Brassicas)の野菜、並びにカーネーション類及びゼラニウム類が挙げられる。本発明には、タバコ、ウリ科植物（cucurbits)、ニンジン、イチゴ、ヒマワリ、トマト、トウガラシ、キクが適用し得る。
【００４３】
目的の種子を提供する穀類植物としては、油料種子植物及びマメ科植物が挙げられる。目的の種子としては、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、コメ、ソルガム、ライムギ等の穀類の種が挙げられる。油料種子植物としては、ワタ、ダイズ、サフラワー、ヒマワリ、アブラナ属植物、トウモロコシ、アルファルファ、パーム、ココナッツ等が挙げられる。マメ科植物としては、豆類及びエンドウ類が挙げられる。豆類としては、グァー、イナゴマメ、コロハ、ダイズ、インゲンマメ、ササゲ、マングビーン、リママメ、ソラマメ、レンティル類、ヒヨコマメが挙げられる。
【００４４】
本発明の好ましい一実施形態において、上記細胞が原核細胞である。
【００４５】
本発明のさらに好ましい一態様によれば、本発明に記載の細胞を含む種子が提供される。
【００４６】
本発明のさらなる一態様によれば、抗酸化物をグルコシル化する方法であって、本発明に記載の細胞、及び本発明に記載の反応槽中で上記細胞の増殖を維持する栄養培地、並びに上記細胞の培養に関連する増殖条件の提供を含む、方法が提供される。
【００４７】
本発明の好ましい１つの方法において、上記栄養培地が、ＵＤＰ−グルコースの外生的供給を含まない。
【００４８】
本発明のさらに好ましい１つの方法において、上記抗酸化物が、ケルセチン又はエスクレチンである。
【００４９】
本発明のさらなる一態様によれば、サイトカイニンをグルコシル化する方法であって、本発明に記載の細胞、及び本発明による反応槽中で上記細胞の増殖を維持する栄養培地、並びに上記細胞の培養に関連する増殖条件の提供を含む、方法が提供される。
【００５０】
本発明の好ましい１つの方法において、上記培地がＵＤＰ−グルコースを含まない。
【００５１】
本発明のさらに好ましい１つの方法において、上記サイトカイニンが、トランス−ゼアチン、ジヒドロゼアチン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｎ６−ベンジルアデニン及びカイネチンから成る群から選択される。
【００５２】
次に、以下の図面を参照にして、本発明の一実施形態について、例によってのみ記載する。
【００５３】
【表１】
【００５４】
表１に、ケルセチンの修飾に関するＧＴａｓｅの位置選択性（部位修飾特異性）が記載される。ＧＴａｓｅは、本願又は国際公開第０１／５９１４０号パンフレットに記載された配列のいずれかであり、これらは参照されて本明細書の一部とする。表２には、ケルセチン及びそのグルコシド類のＮＭＲスペクトルデータを補足的に示す。
【００５５】
【表２】
【００５６】
【表３】
【００５７】
表３は、各種ＧＴａｓｅ核酸を用いて形質転換された細菌によるケルセチンの修飾をまとめたものである。ケルセチン−７，３’−ジ−Ｏ−グルコシド及びケルセチン−３’，７−ジ−Ｏ−グルコシドのＮＭＲスペクトルデータを補足的に表４に示す。
【００５８】
【表４】
【００５９】
【表５】
【００６０】
ケルセチンの全細胞生体触媒におけるグルコースの効果を示す。
【００６１】
材料及び方法
発酵槽システムにおける全細胞バイオリアクターアッセイ
ＵＧＴ全細胞生体触媒の大規模な分析に、６Ｌ容のガラス製の加圧滅菌が可能な発酵槽システム（アプリコン・バイオテクノロジー社（Applikon Biotechnology Ltd.)製）を用いた。ＵＧＴを発現しているＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１の一晩培養物（４０ｍｌ）を、事前に３０℃でｐＨ７．４に平衡化させた２ＬのＬＢ培地を含有する発酵槽システムへ移した。溶存Ｏ２濃度は、１時間は９５％に維持されたが、残りのプロセスでは６０％に減少された。培養物の吸光度が０．２に達したら、温度を２０℃に下げた。細菌培養物の吸光度が０．６に達した後、０．１ｍＭのイソプロプル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド及び２ｇのケルセチンを添加した。サンプルを周期的に採取し、菌体を遠心分離により除去した。得られた上清画分（培養液）をＨＰＬＣにて分析した。
【００６２】
個々のＵＧＴ全細胞生体触媒に関する最適条件
生体触媒の効率に影響し得る多様な条件がある。これらには、発酵槽の温度、培養液中の溶解酸素濃度及びｐＨ、加えられる基質の濃度、並びに基質の調製に使用される溶媒が挙げられる。
【００６３】
ＵＧＴ全細胞生体触媒を用いて試験された基質
１．ケルセチン
２．エスクレチン
３．トランス−ゼアチン
４．ジヒドロゼアチン
５．Ｎ６−イソペンテニルアデニン（ｉＰ）
６．Ｎ６−ベンジルアデニン
７．カイネチン
【００６４】
ケルセチンとのＵＧＴ酵素反応
アッセイ混合物（２００μｌ）に、２μｇの組み換えタンパク質、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、５ｍＭのＵＤＰ−グルコース、１．４ｍＭの２−メルカプトエタノール及び０．５ｍＭのケルセチンを含有させた。３０℃で１時間反応させ、急速冷凍し、−２０℃で保存後、逆相ＨＰＬＣ分析にかけた。
【００６５】
サイトカイニンとのＵＧＴ酵素反応
アッセイ混合物（２００μｌ）は、２μｇの組み換えタンパク質、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭのＵＤＰ−グルコース、０．５ｍＭのＡＴＰ、５０ｍＭのＭｇＣｌ２及び０．５ｍＭのサイトカイニンを含有した。３０℃で３時間反応させ、急速冷凍し、−２０℃で保存後、逆相ＨＰＬＣ分析にかけた。
【００６６】
反応ミックスのＨＰＬＣ分析
Ｃｏｌｕｍｂｕｓ５μＣ１８カラム（２５０×４．６０ｍｍ、フェノメネックス社（Phenomenex)製）を用いて、逆相ＨＰＬＣ（Ｓｐｅｃｔｒａ ＳＹＳＴＥＭ ＨＰＬＣシステム及びＵＶ６０００ＬＰフォトダイオード・アレイ検出器、サーモクエスト社（Thermo Quest）製）分析を行った。Ｈ２Ｏ中１０〜７５％のアセトニトリル（全ての溶液は、０．１％のトリフルオロ酢酸を含有した）の直線勾配により、２０分かけて１ｍｌ／分で、ケルセチングルコシド類をアグリコンから分離し、３７０ｎｍで調べた。Ｈ２Ｏ中１０〜１００％のメタノール（Ｎ６−イソペンテニルアデニン（ｉＰ）、Ｎ６−ベンジルアデニン及びカイネチンにおいて）又はＨ２Ｏ中１０〜６０％のメタノール（トランス−ゼアチン及びジヒドロゼアチンにおいて）の直線勾配により、２０分かけて１ｍｌ／分で、サイトカイニングルコシド類をそれらのアグリコンから分離した。全ての溶液は、０．２５％の酢酸、０．０４％のトリエチルアミン及びトリフルオロ酢酸を含有した。２０６ｎｍ及び２５２ｎｍで分離を調べた。生成物の同定は、基準グルコシド類と比較して確認された。
【００６７】
ＵＧＴにより形成されたサイトカイニン生成物
１．７−Ｎ−グルコシド（７６Ｃ１、７６Ｃ２）
２．９−Ｎ−グルコシド（７６Ｃ１、７６Ｃ２）
３．Ｏ−グルコシド（トランス−ゼアチン及びジヒドロゼアチンにのみ適用する）（トランス−ゼアチンに関しては８５Ａ１；ジヒドロゼアチンに関しては８５Ａ１及び７３Ｃ５）
【００６８】
大規模発酵
発酵を７リットル容の発酵槽（アプリコン・バイオコンソールＡＤＩ１０２５（Applicon Biotconsole ADI1025))で行った。処理を３日連続して行った。以下のパラメータ、すなわち温度、ｐＨ、Ｏ２飽和度の割合を連続的に観察し、制御した。系(system)の平衡化後、ＬＢ成長培地に１５ｍｌのスタータ・カルチャーを播種した。ＩＰＴＧで細胞が誘導される時に、基質を添加する。等間隔で一定分量を抜き取り、グリコシドの生成物をＨＰＬＣ分析で調べた。
【００６９】
誘導後、容器を約２０時間空にし、培養物をＳｏｒｖａｌ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ＲＣ、ＳＬＣ６０００ロータ内で遠沈させた。上清を凍結させた後、凍結乾燥した。
【００７０】
凍結乾燥した材料を、水で再溶解し、水に飽和したブタノール中に繰り返し抽出した。有機相を集め、溶媒をＢｕｃｈｉ Ｒ−１１４ ｒｏｔａｖａｐｏｒで蒸発させた。
【００７１】
抽出物を５０％のメタノールに溶解後、分離用ＨＰＬＣにて分離した。
カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ５μ Ｃ１８（２）、逆相２５０×１０分；容積およそ１９．６ｍｌ
使用システム：ＴＦにおけるＡＫＴＡ ＦＰＬＣシステム（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（株）社製）
【００７２】
５０％のメタノール中に溶解した抽出物を、さらに１０％のアセトニトリル及び０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で希釈し、最終濃度がおよそ５％のメタノールとなるようにした。１５％、３５％及び５０％のアセトニトリル及び０．１％のＴＦＡで、定組成工程溶離において、カラムから化合物を溶離した。ピーク画分を回収し、ＨＰＬＣ、ＬＣ−ＭＳ及び１Ｈ ＮＭＲにてアッセイした。
【００７３】
（実施例１）
植物ＵＧＴによるｉｎ ｖｉｔｒｏでのケルセチングルコシド類の合成
ケルセチンに対するアラビドプシス組み換えＵＧＴの活性を、以前に開発されたプラットフォームを用いて求めた１５。これらのデータセットにおいて、合計で４つの主要なモノグルコシド類しか見られず、逆相ＨＰＬＣを用いたそれらの分離を、図１３Ｂに示す。これらの生成物の構造は、１Ｈ ＮＭＲを用いて分析され、それらのスペクトルを公表されているデータと比較した１７。生成物は、ケラチンの３−Ｏ−、７−Ｏ−、３’−Ｏ−、及び４’−Ｏ−モノグルコシドとして確認された（表２を参照）。Ｃ５−ＯＨに対する有意な活性は、分析された組み換え酵素のいずれにも認められなかった。分析された９１個の組み換えＵＧＴのうち、２９個の酵素がケルセチンに対する有意な触媒活性を呈し、その詳細を表１に示す。表を要約すると、基質をグルコシル化するさらなる選択性があった。１４個の酵素が、ケルセチン上で一箇所の部位だけ認識し、そのうち１２個はＣ３−ＯＨをグルコシル化し、２個のＵＧＴがＣ７−ＯＨをグルコシル化した。１５個の酵素が、２箇所以上の部位をグルコシル化し、そのうち１１個は２箇所の部位のみ認識し、３個は３箇所の部位を認識することがわかった。１個のＵＧＴは４箇所の部位全てをグルコシル化できることがわかった。
【００７４】
いくつかのＵＧＴがケルセチン上で複数の部位を認識することを考えると、反応条件が適切である場合、モノグルコシド類のみが生成されるか、又は同じ分子上で複数のヒドロキシル基がグルコシル化されるかどうかを決定することが重要であった。４個のＵＧＴ（ＵＧＴ７１Ｃ１、ＵＧＴ７４Ｆ１、ＵＧＴ７６Ｅ１２及びＵＧＴ８９Ｂ１）を用いて、この可能性を調べた。要約するに、ジ−Ｏ−グルコシド形成は見られたものの、基質は低濃度においてのみであった。面白いことに、可能性のある４つのジ−Ｏ−グルコシド及び１つのトリ−Ｏ−グルコシドのうち、たった２つの生成物が見い出され、それらは３，７−ジ−Ｏ−グルコシド及び７，３’−ジ−Ｏ−グルコシドであった（図１３Ｃを参照）。７，３’−ジ−Ｏ−グルコシドは１Ｈ ＮＭＲにて確認され、一方３，７−ジ−Ｏ−グルコシドは、１Ｈ ＮＭＲ及びＬＣ−ＭＳにて確認された（表４及び補足図１４を参照）。これらのデータから、ＵＧＴ触媒作用の生成物は、異なる反応条件下で変わることが示唆される。このことから、さまざまな異なるグルコシド化合物を合成する潜在的（potential)手段が提供される。
【００７５】
生体触媒システムを構築するさらなる基盤として、時間のパラメータが、かなりの量のジ−Ｏ−グルコシド類を生成した２個のＵＧＴ（ＵＧＴ７１Ｃ１及びＵＧＴ７６Ｅ１２）に対して異なった。ＵＧＴ７１Ｃ１は、アグリコンを、モノグルコシドに速やかに変換し、そのモノグルコシドをその後さらに消費してジ−Ｏ−グルコシドを生成する。ＵＧＴ７６Ｅ１２反応ミックスでは、アグリコン量は使い果たされるものの、モノグルコシドは長時間一定濃度のまま残り続けた。これらのデータから、反応特性は使用されるＵＧＴに依存することが示唆される。
【００７６】
（実施例２）
全細胞生体触媒としての植物ＵＧＴ
先行の実施例で構築された基盤を用いて、本発明者等は、ケルセチンのグルコシドを合成する、全細胞生体触媒としての植物ＵＧＴを発現しているＥ．ｃｏｌｉの潜在能力を調べた。まず第１に、本発明者等は、７５ｍｌの標準培養液で増殖されたＥ．Ｃｏｌｉを用いた。ＵＧＴ７１Ｃ１を用いて形質転換された細胞を用いた実験予備セットの結果を、図１４に示す。面白いことに、４８時間の経時変化を通じて、大量のアグリコン及びグルコシド類が培養液中で回収され（図１４Ａ）、６時間以内におよそ５０％のアグリコンがグルコシド類に変換された（図１４Ｂ）。これらの研究から、いかなる補充ＵＤＰ−グルコースが存在せずとも、標準培養液中の細胞は、十分量の添加された基質をグルコシル化することができたことが示された。表３に、７個の異なるＵＧＴがＥ．ｃｏｌｉ中に発現され、且つ培養液中に回収された異なるグルコシド類の同定及び定量をＨＰＬＣにて分析した結果を記載する。ｉｎ ｖｉｖｏでのグルコシル化の位置選択性のパターンは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの各ＵＧＴにより発現されたものとかなり酷似したことを示唆した。細胞により合成された種々のグルコシド類の量はかなり異なり、これらの非最適化条件下にも関わらず、４つのモノグルコシド類及び２つのジ−Ｏ−グルコシド類が、それぞれ形成された。
【００７７】
細胞が休止状態でグルコシドを作ることができるかどうかを判断するのに、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞をリン酸緩衝液に移し、グルコースの存在下又は非存在下で培養した。結果を表５に示す。エネルギー源のない状態では、グルコシドへのごく僅かなケルセチンの変換が認められた。アグリコンが細胞ペレットから大量に回収されたことから、培養液からの取り込みが起こったことを示した。グルコースが存在する状態では、高濃度の化合物が培養液中に回収され、そのうち、大部分はケルセチンのグルコシドから成った。
【００７８】
添加されたＵＤＰ−グルコースの非存在下で、グルコシドの大規模製造に関する全細胞生体触媒の潜在能力を調べるため、形質移入された細菌性細胞を発酵槽中で培養した。この工程において、条件を生成サイクルを通じて厳密に制御し、且つ単純培養フラスコ及び最適化発酵槽システム内での全細胞ＵＧＴ生体触媒作用による転移効率の直接的な比較がなされるようにした。予備実験（表２）で、２４時間のインキュベーション後に８．９６μｇ／ｍｌ濃度で、単一生成物（３−Ｏ−グルコシド）の形成が見られたため、ＵＧＴ７３Ｂ３を分析用に選んだ。発酵槽システムを用いた２０時間の培養で、３−Ｏ−グルコシドの収率は、９９．３μｇ／ｍｌ、すなわち１０倍高くなることがわかった。図１５Ａに、これらのデータを示す。また、その図から、時間０（時間）において、グルコシドは、水溶性アグリコンよりもはるかに高い最終濃度であったことを示す。ケルセチンは、使用される緩衝条件下において、比較的不溶性であるため、上清を分析する前に、遠心分離工程で沈殿物として回収された。反応の進行に伴い、グルコシル化されたケルセチン量が増加することが、データから示唆される。
【００７９】
１過程抽出法により、水に飽和したブタノールで、ＵＧＴ７３Ｂ３全細胞生体触媒により生成されたグルコシドを培養液から容易に精製することができる。図１５Ｂに示されるように、ケルセチン−３−Ｏ−グルコシドを、有機相に完全に回収し、水相中に大量の不純物を残した。
【００８０】
この研究は、天然産物を位置選択的にグルコシル化する際に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおける生体触媒としての植物のグルコシルトランスフェラーゼの利用性について例示する。ｉｎ ｖｉｖｏで、Ｅ．Ｃｏｌｉ内で酵素を使用すると、効率的な基質の転移（convert)を達成するのに、ＵＤＰ−グルコースを培養液に補う必要がないことがわかった。したがって、形質転換された細胞は、全細胞及び安価な生体触媒システムとして使用することができ、特に生体内変換による生成物が培養液から回収され得る。グルコースが結合する潜在的部位としての５つのヒドロキシル基での、ケルセチンのグルコシル化が複雑であるため、本発明者等は、この研究にモデル医薬化合物としてケルセチンを使用した。ケルセチンに対する活性を得るのに、９１個の植物ＵＧＴをｉｎ ｖｉｔｒｏでスクリーニングした結果、１箇所又はそれ以上の部位のいずれかで、基質をグルコシル化したのは２９個であった。ＵＧＴにより認識されなかった唯一の部位は、Ｃ５−ＯＨであった。反応の動態及び生成物の回収は、素早い細胞内グルコシル化が分泌を促進したことを示した。位置選択性ＵＧＴを用いた使用におけるＥ．ｃｏｌｉの一般的な利用性は、培養液から基質を吸収し、より少ない程度に、生成物を分泌する細胞の能力に依存する。基質及び生成物両方の安定性もまた、達成には重要な因子である。
【００８１】
（実施例３）
発酵
ＵＧＴ７３Ｂ３及び１．５ｇのケルセチンを、ケルセチン−３−Ｏ−グルコシド（Ｑ−３−Ｇ）の生成に使用した。４リットルの発酵を行った後、粗上清のＨＰＬＣ分析を行い、Ｑ−３−Ｇの生成を確認した。ブタノール抽出、溶媒蒸発及び５０％のメタノール中での抽出物の再懸濁を経て、Ｑ−３−Ｇの精製を行った。
【００８２】
水で２ｍｌにした溶解抽出物のうち、およそ２００μｌ量を用いて、最適条件を決定するのに多くの分離を行った。いくつかの異なる勾配、並びに一連の溶離工程を調べた。以下の溶媒システムは、経験的に（実験的に：empirically)到達された。５０％のメタノール中の溶解抽出物を、さらに１０％のアセトニトリル及び０．１％ＴＦＡに希釈し、最終濃度がおよそ５％のメタノールになるようにした。定組成工程溶離において、１５％、３５％及び５０％のアセトニトリルで、化合物をカラムから溶離した。ピーク画分を回収した。
【００８３】
半量（すなわち、２リットルの発酵物のうちの当量物）をブタノール中に抽出し、さらに上述のように精製した。ピーク画分を充填中の全流量と共に回収した。
【００８４】
ＨＰＬＣ分析に基づいた計算値及び既知の市販の標準液（アピン（Ａpin））との比較から、純度及び収率は、９５％を上回る（>95%）純度で５５ｍｇのケルセチン−３−Ｏ−グルコシドであることが見込まれた。
【００８５】
Ｑ−３−Ｇの同定及び純度を１Ｈ ＮＭＲ及びＬＣ−ＭＳにて確認した。
【００８６】
（実施例４）
ＵＧＴ８４Ｂ１及び０．５ｇのケルセチンを、ケルセチン−７−Ｏ−グルコシド（Ｑ−７−Ｇ）の生成に使用した。２リットルの発酵を行った後、粗上清のＨＰＬＣ分析を行い、Ｑ−７−Ｇが生成されたことを確認した。上述したＱ−３−Ｇの時のように、ブタノール抽出、溶媒蒸発及び５０％のメタノール中での抽出物の再懸濁を経て、Ｑ−７−Ｇの精製を行った。ピーク画分を、充填中の全流量と共に回収した。
【００８７】
ＨＰＬＣ分析に基づいた計算値及び既知の市販の標準液（アピン）との比較から、純度及び収率は、９０％を上回る（>90%）純度で８ｍｇのケルセチン−７−Ｏ−グルコシドであることが見込まれた。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１ａ】ＵＧＴ７１Ｂ８核酸配列を示す。
【図１ｂ】ＵＧＴ７１Ｂ８アミノ酸配列を示す。
【図２ａ】ＵＧＴ７１Ｃ３核酸配列を示す。
【図２ｂ】ＵＧＴ７１Ｃ３アミノ酸配列を示す。
【図３ａ】ＵＧＴ７１Ｃ４核酸配列を示す。
【図３ｂ】ＵＧＴ７１Ｃ４アミノ酸配列を示す。
【図４ａ】ＵＧＴ８８Ａ１ゲノム核酸配列を示す。
【図４ｂ】ＵＧＴ８８Ａ１ｃＤＮＡ配列を示す。
【図４ｃ】ＵＧＴ８８Ａ１アミノ酸配列を示す。
【図５ａ】ＵＧＴ７８Ｄ２ゲノム配列を示す。
【図５ｂ】ＵＧＴ７８Ｄ２ｃＤＮＡ配列を示す。
【図５ｃ】ＵＧＴ７８Ｄ２アミノ酸配列を示す。
【図６ａ】ＵＧＴ７８Ｄ３ゲノム配列を示す。
【図６ｂ】ＵＧＴ７８Ｄ３ｃＤＮＡ配列を示す。
【図６ｃ】ＵＧＴ７８Ｄ３アミノ酸配列を示す。
【図７ａ】ＵＧＴ７６Ｄ１ゲノム配列を示す。
【図７ｂ】ＵＧＴ７６Ｄ１ｃＤＮＡ配列を示す。
【図７ｃ】ＵＧＴ７６Ｄ１アミノ酸配列を示す。
【図８ａ】ＵＧＴ７６Ｅ２ゲノム配列を示す。
【図８ｂ】ＵＧＴ７６Ｅ２ｃＤＮＡ配列を示す。
【図８ｃ】ＵＧＴ７６Ｅ２アミノ酸配列を示す。
【図９ａ】ＵＧＴ７６Ｃ１ゲノム配列を示す。
【図９ｂ】ＵＧＴ７６Ｃ１ｃＤＮＡ配列を示す。
【図９ｃ】ＵＧＴ７６Ｃ１アミノ酸配列を示す。
【図１０ａ】ＵＧＴ７６Ｃ２ゲノム配列を示す。
【図１０ｂ】ＵＧＴ７６Ｃ２ｃＤＮＡ配列を示す。
【図１０ｃ】ＵＧＴ７６Ｃ２アミノ酸配列を示す。
【図１１ａ】ＵＧＴ７３Ｃ５ゲノム配列を示す。
【図１１ｂ】ＵＧＴ７３Ｃ５アミノ酸配列を示す。
【図１２ａ】ＵＧＴ８５Ａ１ゲノム配列を示す。
【図１２ｂ】ＵＧＴ８５Ａ１ｃＤＮＡ配列を示す。
【図１２ｃ】ＵＧＴ８５Ａ１アミノ酸配列を示す。
【図１３Ａ】ケルセチン及びそのモノグルコシド類。ケルセチンの化学構造を示す。
【図１３Ｂ】ケルセチン及びそのモノグルコシド類。３７０ｎｍの吸収波長を用いて、実験プロトコルに記載されるようなＨＰＬＣにより分離された、ケルセチン及びそのモノグルコシド類を示す。ＮＭＲを用いて確認されたモノグルコシド類の同定から、（１）はケルセチン−７−Ｏ−グルコシド、（２）はケルセチン−３−Ｏ−グルコシド、（３）はケルセチン−４’−Ｏ−グルコシド、（４）はケルセチン−３’−Ｏ−グルコシドである。（１）〜（３）は、組み換え酵素ＵＧＴ８９Ｂ１を用いて調製され、（４）は組み換え酵素ＵＧＴ７１Ｃ１を用いて調製された。
【図１３Ｃ】ケルセチン及びそのモノグルコシド類。ケルセチンの複数のヒドロキシル基をグルコシル化し得る４ＵＧＴの詳細な分析を示す。
【図１４Ａ】ＵＧＴ７１Ｃ１を用いた全細胞生体触媒アッセイ。組み換え体を発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞を、生体触媒アッセイに使用した。０．１ｍＭのケルセチン及び０．１ｍＭのＩＰＴＧを用いてインキュベーションした後、細胞を遠心分離で回収し、８０％のメタノールで抽出し、細胞抽出物（ペレット）及び培養液（上清）の両方について、ＨＰＬＣを用いて分析した。０〜４８時間の経時変化を追ったアグリコン／グルコシドの併用量変化を示す。
【図１４Ｂ】ＵＧＴ７１Ｃ１を用いた全細胞生体触媒アッセイ。組み換え体を発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞を、生体触媒アッセイに使用した。０．１ｍＭのケルセチン及び０．１ｍＭのＩＰＴＧを用いてインキュベーションした後、細胞を遠心分離で回収し、８０％のメタノールで抽出し、細胞抽出物（ペレット）及び培養液（上清）の両方について、ＨＰＬＣを用いて分析した。同経時変化を追った培養液中の種々のグルコシド類及びアグリコンの濃度変化を示す。
【図１５Ａ】全細胞生体触媒としてＵＧＴ７３Ｂ３を用いたケルセチン−３−Ｏ−グルコシドの発酵規模生産。０〜２０時間の経時変化を追った培養液中のケルセチン−３−Ｏ−グルコシド及びアグリコンの濃度変化を示す。
【図１５Ｂ】全細胞生体触媒としてＵＧＴ７３Ｂ３を用いたケルセチン−３−Ｏ−グルコシドの発酵規模生産。２０時間での培養液のＨＰＬＣ分析：パネル１はさらなる抽出前；パネル２は水に飽和したブタノールを用いた抽出後の水相；パネル３は上記の抽出後の有機相を示す。分析には、２３４ｎｍの吸収波長を用いた。
【技術分野】
【０００１】
本発明者等は、グリコシルトランスフェラーゼの核酸及びタンパク質、上記グリコシルトランスフェラーゼを発現するトランスジェニック細胞、並びに該トランスジェニック細胞を含むバイオリアクターについて記載する。
【背景技術】
【０００２】
グリコシルトランスフェラーゼ（ＧＴａｓｅ）は、グリコシル残基を活性化ヌクレオチド糖から、他の糖質、タンパク質、脂質及び他の有機基質等の単分子受容体及び高分子受容体へ翻訳後に転移させる酵素である。これらのグルコシル化分子は、多様な代謝経路及び代謝プロセスに関与する。グルコシル部分の転移により、細胞内及び植物の至る所で、受容体の生物活性、溶解性及び輸送特性が変わり得る。高等植物におけるＧＴａｓｅのうち、１ファミリーは、Ｃ末端コンセンサス配列が存在するのが特徴である。このファミリーのＧＴａｓｅは、植物細胞の細胞基質で働き、フェニルプロパノイド誘導体類、クマリン類、フラボノイド類、他の二次代謝産物及び植物ホルモン類として作用する既知の分子等の低分子量基質への、グルコースの転移を触媒する。入手可能な証拠から、インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）をグルコシル化するトウモロコシ（maize)及びアラビドプシス（シロイヌナズナ：Arabidopsis）ＧＴａｓｅ等、ＧＴａｓｅ酵素は高特異的であり得ることが示唆される。本発明者等はまた、アブシジン酸を修飾するＧＴａｓｅの１ファミリーを同定している（国際公開第０３／０２３０３５号パンフレットを参照されたい）。
【０００３】
グリコシルトランスフェラーゼのさらなる例は、本願に記載される。
【０００４】
サイトカイニン類は、アデニンに類似した構造を有する植物ホルモン類であり、細胞分裂の刺激を包含する各種機能を有する。サイトカイニン類は、ほとんどの高等植物で及びセン類、真菌類、細菌類で、並びに多くの真核生物及び原核生物の転移ＲＮＡで見い出される。２００を上回る種々のサイトカイニン化合物があり、分裂組織領域及び継続的成長部位、例えば根、若葉、発育果実（developing fruit)及び発育種子中に高濃度で見い出される。植物源から単離された最初のサイトカイニンは、ゼアチンと称された。細胞分裂を刺激するのに加え、サイトカイニン類は、細胞成長させることにより、組織培養、側芽の成長及び葉の伸長における形態形成をも刺激する。いくつかの種では、サイトカイニン類は、気孔開口の促進に関与し、クロロフィル合成を刺激することによりエチオプラストのクロロプラストへの変換を促進する。サイトカイニン類がグルコシル化により修飾され得ることは、既知である。
【０００５】
ＧＴａｓｅはまた、抗酸化物の改変に関して実用性がある。活性酸素種は、呼吸している間、全ての好気性生物で生産され、通常は生化学的抗酸化物と共に平衡状態で細胞中に存在する。汚染因子、オキシダント、毒物、重金属等による環境問題は、細胞の酸化還元の平衡をかき乱す活性酸素種が過剰となり、場合によっては広範囲にわたる病的状態を引き起こし得る。動物及びヒトでは、循環器病、癌、炎症性及び変性疾患は、酸化的損傷から起こる事象に関連される。これら疾患の現在の罹患率から、抗酸化物はかなりの関心が持たれ、食事で摂取されるか、又はＵＶ遮断剤等で局所的に塗布される。
【０００６】
野菜及び果物、茶、ハーブ類及び薬草から得られる抗酸化微量栄養素成分は、酸化的ストレスから引き起こされる健康問題に対して、有効な予防を提供するものと考えられる。植物組織からの既知の抗酸化物としては、例えばケルセチン、ルテオリン、並びにカテキン、エピカテキン及びシアニジン化合物群が挙げられる。コーヒー酸（３，４−ヒドロキシ桂皮酸）は、効果的な治療特性を有する抗酸化物のさらなる一例である。ある特定の植物種、器官及び組織は、抗酸化活性を有する１種類以上の化合物の比較的高い濃度を有することが知られている。それらの種における、これらの化合物のより多くの蓄積、食物及び飲料の生産で既に使用されている作物及び植物の一部における化合物のより広範囲の分布、並びに抗酸化物の向上した生体利用効率（吸収率、代謝変換率及び排泄率）は、極めて望まれる３つの考えられる特徴である。
【０００７】
バイオリアクター（例えば、発酵槽）は、細胞又は酵素を含む槽であり、通常は工業規模で分子の生産に使用される。上記分子は、上記槽に含有される細胞によって、又は反応槽中で完了した酸素反応を介して生成される、組み換えタンパク質（例えば、プロテアーゼ類、リパーゼ類、アミラーゼ類、ヌクレアーゼ類、抗体等の酵素）又は化合物であり得る。典型的には、細胞に基づいたバイオリアクターは、目的の細胞を含み、且つ反応を行うのに必要な栄養素成分及び／又は補因子の全てを包含する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、立体特異的方法で化合物（例えば、サイトカイニン類、ケルセチン）を修飾するＧＴａｓｅ（すなわち、高度に特異的に、有するサイトカイニン類又はケルセチンを標識できるＧＴａｓｅファミリー）を本願に開示する。さらに、本発明者等は、グルコシル部分をこれらの化合物に付加するのに、これらのグリコシルトランスフェラーゼを利用する、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞に基づいたバイオリアクターについても開示する。
【０００９】
本発明者等は、驚くべきことに、バイオリアクターがＵＤＰ−グルコース（これらの酵素群に対する基質）の外生的供給を必要としないことを見い出す。これは、植物のＧＴａｓｅにおいて一般的な原理であり、植物のＧＴａｓｅを用いて形質転換されたトランスジェニック細胞を含む任意の細胞に基づいたバイオリアクターに適用することができるということを、本発明者等は明らかにする。本発明者等の同時係属中の出願国際公開第０１／５９１４０号パンフレット、国際公開第０２／１０３０２２号パンフレット、国際公開第０３／０２３０３５号パンフレットにおいて、本発明者等は、一連の小分子に対する基質特異性を有するＧＴａｓｅ配列を開示し、これらの配列はバイオリアクターの実施の形態（embodiment)に関する最新の出願を具体的に参照して本明細書の一部とする。
【００１０】
本発明の一態様によれば、植物のグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸分子を用いて形質移入又は形質転換することにより遺伝的に改変された細胞を含む反応槽であって、該反応槽は上記細胞の増殖を維持する栄養培地を包含し、該栄養培地がＵＤＰ−グルコースの外生的供給を包含しないことを特徴とする、反応槽が提供される。
【００１１】
本発明の一態様によれば、遺伝的に改変された細胞を含む反応槽であって、
ｉ）図１ａ、図２ａ、図３ａ、図４ａ、図４ｂ、図５ａ、図５ｂ、図６ａ、図６ｂ、図７ａ、図７ｂ、図８ａ、図８ｂ、図９ａ、図９ｂ、図１０ａ、図１０ｂ、図１１ａ、図１２ａ及び図１２ｂに表されるような核酸配列を含む核酸分子、
ｉｉ）上記（ｉ）に表される核酸配列に対してハイブリダイズし、且つグリコシルトランスフェラーゼの活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子、及び
ｉｉｉ）上記（ｉ）及び（ｉｉ）で規定された核酸配列に対する遺伝子コードから、縮重する核酸配列を含む核酸分子
から成る群から選択される核酸分子を用いて、形質移入又は形質転換により改変される上記細胞、及び上記グリコシルトランスフェラーゼに対する基質である、少なくとも１つの外生的基質を包含し、上記細胞の増殖を維持する栄養培地を含み、
該栄養培地が、ＵＤＰ−グルコースの外生的供給を包含しないことを特徴とする、反応槽が提供される。
【００１２】
本発明の好ましい一実施形態において、上記反応槽がバイオリアクターである。
【００１３】
さらに本発明の好ましい一実施形態において、上記栄養培地がＵＤＰ−グルコースの外生的供給を包含しない。
【００１４】
さらに本発明の好ましい一実施形態において、上記核酸分子が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、図１ａ、図２ａ、図３ａ、図４ａ、図４ｂ、図５ａ、図５ｂ、図６ａ、図６ｂ、図７ａ、図７ｂ、図８ａ、図８ｂ、図９ａ、図９ｂ、図１０ａ、図１０ｂ、図１１ａ、図１２ａ及び図１２ｂに提示される核酸配列に対してハイブリダイズする。
【００１５】
厳密なハイブリダイゼーション／洗浄条件は、当該技術分野で既知のことである。例えば、０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中で６０℃で洗浄した後、核酸ハイブリッドは安定する。核酸の配列が既知であれば、最適なハイブリダイゼーション条件が算出され得ることは、当該技術分野で既知のことである。例えば、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションを受ける核酸のＧＣ含量により決定され得る。サムブルーク他（Sambrook et al.)著、(１９８９年）「分子クローニング（Molecular Cloning)；実験入門（A Laboratory Approach）」を参照されたい。特異的相同性を有する核酸分子間のハイブリダイゼーションを達成するのに必要とされる厳密な条件を算出する一般式は以下の通りである。
【００１６】
Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１［％Ｇ＋Ｃ］−０．６３（％ホルムアミド）
【００１７】
典型的には、ハイブリダイゼーション条件は、４×ＳＳＰＥ〜６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥは、１リットルに溶解された１７５．３ｇのＮａＣｌ、８８．２ｇのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ及び７．４ｇのＥＤＴＡを含有し、ｐＨは７．４に調整されている）、５×デンハート溶液〜１０×デンハート溶液（５０×デンハート溶液は、５ｇのフィコール（４００型、ファルマシア社）、５ｇのポリビニルピロリドン及び５ｇのウシ血清アルブミンを含有する）、１００μｇ〜１．０ｍｇ／ｍｌの超音波で破砕されたサケ／ニシンＤＮＡ、０．１〜１．０％のドデシル硫酸ナトリウム、任意に４０〜６０％の脱イオンホルムアミドを使用する。ハイブリダイゼーション温度は、標的核酸配列のＧＣ含量に依存して変わるが、通常は４２℃〜６５℃である。
【００１８】
さらに本発明の好ましい一実施形態において、上記細胞が、上記核酸分子を含むベクターを用いて形質移入又は形質転換される。
【００１９】
さらに好ましい本発明の１つの方法において、上記ベクターが、真核細胞又は原核細胞の遺伝子発現に従来適合している発現ベクターである。
【００２０】
典型的には、上記適合は、限定する意図はなく例として、細胞特異的発現を仲介する転写制御配列（プロモータ配列）の提供を包含する。これらのプロモータ配列は、細胞特異的であり得、誘導的又は構成的であり得る。
【００２１】
プロモータとは当該技術分野で認識されている用語であり、明快にするために、限定する意図はなく例としてのみ提供される以下の特徴を包含する。エンハンサー要素は、遺伝子の転写開始部位で５’側によく見られるシス作用性核酸配列である（エンハンサーはまた、遺伝子配列の３’側にも見られ得、又はイントロン配列内に位置することさえあるため、位置に依存しない）。エンハンサーは、エンハンサーが結合する遺伝子の転写の速度を増大するように機能する。エンハンサー活性は、エンハンサー要素への特異的な結合が見られるトランス作用性転写因子に応答する。転写因子（「真核生物の転写因子（Eukaryotic Transcription Factors)」、デイビッド・エス・ラックマン（David S Latchman)著、Academic Press Ltd（サンディエゴ所在）を参照されたい）の結合／活性は、限定する意図はなく例として、中間代謝産物（例えば、糖質）、環境エフェクター（例えば、光、熱）を含む多くの環境信号に応答する。
【００２２】
また、プロモータ要素は、転写開始の部位を選択するように機能する、いわゆるＴＡＴＡボックス及びＲＮＡポリメラーゼ開始選択（ＲＩＳ）配列を包含する。また、これらの配列は、とりわけＲＮＡポリメラーゼによる転写開始選択を促進するように機能するポリペプチド類を結合する。
【００２３】
適合はまた、真核細胞又は原核ホストのどちらかにおいて、選択可能なマーカー及び自律複製配列（これら両方が上記ベクターの維持を促進する）の提供を包含する。自律的に維持されるベクターは、エピソームベクターと称される。これらの分子が巨大ＤＮＡフラグメント（３０〜５０ｋｂのＤＮＡ）を組み込むことができるため、エピソームベクターが望ましい。この種のエピソームベクターは、国際公開第９８／０７８７６号パンフレットに記載される。
【００２４】
ベクターにコードされた遺伝子の発現を促進する適合は、転写終結／ポリアデニル化配列の提供を包含する。適合はまた、バイシストロン性発現カセット又は多シストロン性(multi-cistronic)発現カセットに配列されたベクターにコードされた遺伝子の発現を最大にするように機能する、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の提供を包含する。
【００２５】
また、発現制御配列は、いわゆる遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）を包含する。これは、マウスにおけるトランスジェニック構築物として分析される場合に、結合遺伝子に対する位置非依存的、コピー数依存的発現を与える調節要素である。ＬＣＲは、隣接するヘテロクロマチンのサイレンシング効果から導入遺伝子を遮蔽（insulate)する調節要素を包含する（グロスベルド他（Grosveld et al.)、Cell (１９８７年）、第５１巻：９７５〜９８５ページ）。
【００２６】
これらの適合は、当該技術分野に既知である。概して、発現ベクター構築技法及び組み換えＤＮＡ技法に関して、かなりの量の文献が公開されている。サムブルーク他（Sambrook et al.)著、(１９８９年）「分子クローニング（Molecular Cloning)；実験入門書（A Laboratory Approach）」、Cold Spring Harbour Laboratory、 Cold Spring Harbour（ニーヨーク所在）及びその中の参考文献であるマースト・エフ（Marson F)著、「ＤＮＡクローニング技法（DNA Cloning Techniques)：実践的なアプローチ（A Practical Approach)」、第３巻、IRL Press（オックスフォード、イギリス）；「ＤＮＡクローニング（DNA Cloning)」、エフ・エム・アウスベル他（F M Ausubel et al.)著、「分子生物における最新プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology)」、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ社（John Wiley & Sons)、INC.（１９９４年）を参照されたい。
【００２７】
本発明の好ましい一実施形態において、上記細胞が、図１ｂ、図２ｂ、図３ｂ、図４ｃ、図５ｃ、図６ｃ、図７ｃ、図８ｃ、図９ｃ、図１０ｃ、図１１ｂ若しくは図１２ｃに表されるアミノ酸配列により表されるようなポリペプチド、又は少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失若しくは置換により改変された変異ポリペプチドをコードする、核酸分子を用いて形質移入又は形質転換される。
【００２８】
変異ポリペプチドにおいて、任意の組み合わせで存在し得る１つ以上の置換、付加、欠失、切断（truncation)によりアミノ酸配列が異なり得る。好ましい変異体の中には、同類アミノ酸置換による参照ポリペプチドとは異なるものがある。このような置換は、同様の特性を有する別のアミノ酸により所定のアミノ酸を置換するものである。以下に、非限定的な同類置換（類似）であると考えられるアミノ酸を羅列する：ａ）アラニン、セリン及びスレオニン；ｂ）グルタミン酸及びアスパラギン酸；ｃ）アスパラギン及びグルタミン；ｄ）アルギニン及びリシン；ｅ）イソロイシン、ロイシン、メチオニン及びバリン；及びｆ）フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン。参照ポリペプチドと同じ生物学的機能及び活性を保有するか、又は促進する、参照ポリペプチドとは異なる変異体（例えばグリコシルトランスフェラーゼの活性を高めたポリペプチド）が極めて好ましい。機能的に等価なポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸残基が同類若しくは非同類アミノ酸残基で置換されたような、又は１つ以上のアミノ酸残基が１つの置換基を含むような変異体である。同類置換とは、１つを別のもので、脂肪族アミノ酸（Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅ）間での置換、ヒドロキシル残基（Ｓｅｒ及びＴｈｒ）の相互置換、酸性残基（Ａｓｐ及びＧｌｕ）の交換、アミド残基（Ａｓｎ及びＧｌｎ）間の置換、塩基性残基（Ｌｙｓ及びＡｒｇ）の交換、並びに芳香族残基（Ｐｈｅ及びＴｙｒ）間の置換である。
【００２９】
さらに、本発明は、本明細書中に開示されるようなポリペプチド配列、又はフラグメント及びその機能的に等価なポリペプチド類に対して、少なくとも７５％の同一性を有するポリペプチド配列を特徴とする。一実施の形態において、ポリペプチド類は、本明細書中に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８５％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性、なおさらより好ましくは少なくとも９７％の同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有し、且つポリペプチド類は増強したグリコシルトランスフェラーゼの活性を保有するか、又は有する。
【００３０】
本発明のさらなる態様によれば、核酸分子を用いて、形質移入又は形質転換されるトランスジェニック細胞であって、該トランスジェニック細胞は、
ｉ）図１ａ、図２ａ、図３ａ、図４ａ、図４ｂ、図５ａ、図５ｂ、図６ａ、図６ｂ、図７ａ、図７ｂ、図８ａ又は図８ｂに表されるような核酸配列から成る核酸分子、
ｉｉ）上記（ｉ）の核酸分子に対してハイブリダイズし、且つ抗酸化物をグルコシル化するグリコシルトランスフェラーゼの活性を有する核酸分子、及び
ｉｉｉ）上記（ｉ）及び（ｉｉ）に規定された核酸配列に対する遺伝子コードから、縮重する核酸配列から成る核酸分子
から成る群から選択される核酸配列を含む核酸分子を用いて、形質移入又は形質転換される、トランスジェニック細胞が提供される。
【００３１】
本発明の好ましい一実施形態において、上記核酸分子が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、図１ａ、図２ａ、図３ａ、図４ａ、図４ｂ、図５ａ、図５ｂ、図６ａ、図６ｂ、図７ａ、図７ｂ、図８ａ又は図８ｂに提示される核酸配列に対してハイブリダイズする。
【００３２】
本発明のさらに好ましい一実施形態において、上記抗酸化物がケルセチンである。
【００３３】
本発明の代替的な好ましい一実施形態において、上記抗酸化物がエスクレチンである。
【００３４】
本発明のまたさらなる一態様によれば、
ｉ）図１ａ、図２ａ、図３ａ、図４ａ、図４ｂ、図５ａ、図５ｂ、図６ａ、図６ｂ、図７ａ、図７ｂ、図８ａ又は図８ｂに表されるような核酸配列から成る核酸分子、
ｉｉ）上記（ｉ）の核酸分子に対してハイブリダイズし、且つ抗酸化物をグルコシル化するグリコシルトランスフェラーゼの活性を有する核酸分子、及び
ｉｉｉ）上記（ｉ）及び（ｉｉ）に規定された核酸配列に対する遺伝子コードから、縮重する核酸配列から成る核酸分子
から成る群から選択される核酸分子を含むベクターが提供される。
【００３５】
本発明のさらなる一態様によれば、核酸分子を用いて、形質移入又は形質転換されるトランスジェニック細胞であって、該トランスジェニック細胞は、
ｉ）図９ａ、図９ｂ、図１０ａ、図１０ｂ、図１１ａ、図１２ａ及び図１２ｂに表されるような核酸配列から成る核酸分子、
ｉｉ）上記（ｉ）の核酸分子に対してハイブリダイズし、且つサイトカイニンをグルコシル化するグリコシルトランスフェラーゼの活性を有する核酸分子、及び
ｉｉｉ）上記（ｉ）及び（ｉｉ）に規定された核酸配列に対する遺伝子コードから、縮重する核酸配列から成る核酸分子
から成る群から選択される核酸配列を含む核酸分子を用いて、形質移入又は形質転換される、トランスジェニック細胞が提供される。
【００３６】
本発明の好ましい一実施形態において、上記核酸分子が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、図９ａ、図９ｂ、図１０ａ，図１０ｂ、図１１ａ、図１２ａ及び図１２ｂに表される配列に対してハイブリダイズする。
【００３７】
本発明の好ましい一実施形態において、上記サイトカイニンが、トランス−ゼアチン、ジヒドロゼアチン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｎ６−ベンジルアデニン及びカイネチンから成る群から選択される。
【００３８】
本発明のまたさらなる一態様によれば、
ｉ）図９ａ、図９ｂ、図１０ａ、図１０ｂ、図１１ａ、図１２ａ及び図１２ｂに表されるような核酸配列から成る核酸分子、
ｉｉ）上記（ｉ）の核酸分子に対してハイブリダイズし、且つサイトカイニンをグルコシル化するグリコシルトランスフェラーゼの活性を有する核酸分子、及び
ｉｉｉ）上記（ｉ）及び（ｉｉ）に規定された核酸配列に対する遺伝子コードから、縮重する核酸配列から成る核酸分子
から成る群から選択される核酸分子を含むベクターが提供される。
【００３９】
本発明の好ましい一実施形態において、上記細胞が、真核細胞である。上記細胞が、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞又は植物細胞から成る群から選択されることが好ましい。
【００４０】
本発明の好ましい一実施形態において、上記細胞が植物細胞である。
【００４１】
本発明の好ましい一実施形態において、上記植物細胞は、トウモロコシ（Zea mays）、カノーラ（Brassica napus、Brassica rapa ssp.）、アルファルファ（Medicago Sativa）、コメ（Oryza sativa）、ライムギ（Secale cereale）、ソルガム（Sorghum bicolor、Sorghum vulgare)、ヒマワリ（Heliabthus annuas）、コムギ（Tritium aestivum）、ダイズ（Glycine max）、タバコ（Nicotiana tabacum）、ジャガイモ（Solanum tuberosum）、ラッカセイ（Arachis hypogaea）、ワタ（Gossypium hirsutum）、サツマイモ（Iopmoea batatus）、カッサバ（Manihot esculenta）、コーヒー（Coffea spp.）、ココナッツ（Cocos nucifera）、パイナップル（Anana comosus）、カンキツ樹（Citris tree)(Citrus spp.）、カカオ（Theobroma cacao）、チャ（Camellia sinensis）、バナナ（Musa spp.）、アボカド（Persea americana）、イチジク（Ficus carica）、グアバ（Psidium guajava）、マンゴー（Mangifer indica）、オリーブ（Olea europaea）、パパイヤ（Carica papaya）、カシューナッツ（Anacardium occidentale）、マカダミアナッツ（Macadamia integrifolia）、アーモンド（Prunus amygdalus）、テンサイ（Beta vulgaris）、オートムギ、オオムギ、野菜類及び観葉植物（ornamentals)から選択される。
【００４２】
本発明の植物細胞は、作物細胞（例えば、穀草類及び食用豆類、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモ類、タピオカ、コメ、ソルガム、キビ、カッサバ、オオムギ、エンドウ豆、並びに他の根、塊茎又は種子作物）であることが好ましい。重要な種子作物は、アブラナ、テンサイ、トウモロコシ、ヒマワリ、ダイズ及びソルガムである。本発明に適用し得る園芸植物としては、レタス、エンダイブ、並びにキャベツ、ブロッコリー及びカリフラワーを含むブラシカ属（Brassicas)の野菜、並びにカーネーション類及びゼラニウム類が挙げられる。本発明には、タバコ、ウリ科植物（cucurbits)、ニンジン、イチゴ、ヒマワリ、トマト、トウガラシ、キクが適用し得る。
【００４３】
目的の種子を提供する穀類植物としては、油料種子植物及びマメ科植物が挙げられる。目的の種子としては、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、コメ、ソルガム、ライムギ等の穀類の種が挙げられる。油料種子植物としては、ワタ、ダイズ、サフラワー、ヒマワリ、アブラナ属植物、トウモロコシ、アルファルファ、パーム、ココナッツ等が挙げられる。マメ科植物としては、豆類及びエンドウ類が挙げられる。豆類としては、グァー、イナゴマメ、コロハ、ダイズ、インゲンマメ、ササゲ、マングビーン、リママメ、ソラマメ、レンティル類、ヒヨコマメが挙げられる。
【００４４】
本発明の好ましい一実施形態において、上記細胞が原核細胞である。
【００４５】
本発明のさらに好ましい一態様によれば、本発明に記載の細胞を含む種子が提供される。
【００４６】
本発明のさらなる一態様によれば、抗酸化物をグルコシル化する方法であって、本発明に記載の細胞、及び本発明に記載の反応槽中で上記細胞の増殖を維持する栄養培地、並びに上記細胞の培養に関連する増殖条件の提供を含む、方法が提供される。
【００４７】
本発明の好ましい１つの方法において、上記栄養培地が、ＵＤＰ−グルコースの外生的供給を含まない。
【００４８】
本発明のさらに好ましい１つの方法において、上記抗酸化物が、ケルセチン又はエスクレチンである。
【００４９】
本発明のさらなる一態様によれば、サイトカイニンをグルコシル化する方法であって、本発明に記載の細胞、及び本発明による反応槽中で上記細胞の増殖を維持する栄養培地、並びに上記細胞の培養に関連する増殖条件の提供を含む、方法が提供される。
【００５０】
本発明の好ましい１つの方法において、上記培地がＵＤＰ−グルコースを含まない。
【００５１】
本発明のさらに好ましい１つの方法において、上記サイトカイニンが、トランス−ゼアチン、ジヒドロゼアチン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｎ６−ベンジルアデニン及びカイネチンから成る群から選択される。
【００５２】
次に、以下の図面を参照にして、本発明の一実施形態について、例によってのみ記載する。
【００５３】
【表１】
【００５４】
表１に、ケルセチンの修飾に関するＧＴａｓｅの位置選択性（部位修飾特異性）が記載される。ＧＴａｓｅは、本願又は国際公開第０１／５９１４０号パンフレットに記載された配列のいずれかであり、これらは参照されて本明細書の一部とする。表２には、ケルセチン及びそのグルコシド類のＮＭＲスペクトルデータを補足的に示す。
【００５５】
【表２】
【００５６】
【表３】
【００５７】
表３は、各種ＧＴａｓｅ核酸を用いて形質転換された細菌によるケルセチンの修飾をまとめたものである。ケルセチン−７，３’−ジ−Ｏ−グルコシド及びケルセチン−３’，７−ジ−Ｏ−グルコシドのＮＭＲスペクトルデータを補足的に表４に示す。
【００５８】
【表４】
【００５９】
【表５】
【００６０】
ケルセチンの全細胞生体触媒におけるグルコースの効果を示す。
【００６１】
材料及び方法
発酵槽システムにおける全細胞バイオリアクターアッセイ
ＵＧＴ全細胞生体触媒の大規模な分析に、６Ｌ容のガラス製の加圧滅菌が可能な発酵槽システム（アプリコン・バイオテクノロジー社（Applikon Biotechnology Ltd.)製）を用いた。ＵＧＴを発現しているＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１の一晩培養物（４０ｍｌ）を、事前に３０℃でｐＨ７．４に平衡化させた２ＬのＬＢ培地を含有する発酵槽システムへ移した。溶存Ｏ２濃度は、１時間は９５％に維持されたが、残りのプロセスでは６０％に減少された。培養物の吸光度が０．２に達したら、温度を２０℃に下げた。細菌培養物の吸光度が０．６に達した後、０．１ｍＭのイソプロプル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド及び２ｇのケルセチンを添加した。サンプルを周期的に採取し、菌体を遠心分離により除去した。得られた上清画分（培養液）をＨＰＬＣにて分析した。
【００６２】
個々のＵＧＴ全細胞生体触媒に関する最適条件
生体触媒の効率に影響し得る多様な条件がある。これらには、発酵槽の温度、培養液中の溶解酸素濃度及びｐＨ、加えられる基質の濃度、並びに基質の調製に使用される溶媒が挙げられる。
【００６３】
ＵＧＴ全細胞生体触媒を用いて試験された基質
１．ケルセチン
２．エスクレチン
３．トランス−ゼアチン
４．ジヒドロゼアチン
５．Ｎ６−イソペンテニルアデニン（ｉＰ）
６．Ｎ６−ベンジルアデニン
７．カイネチン
【００６４】
ケルセチンとのＵＧＴ酵素反応
アッセイ混合物（２００μｌ）に、２μｇの組み換えタンパク質、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、５ｍＭのＵＤＰ−グルコース、１．４ｍＭの２−メルカプトエタノール及び０．５ｍＭのケルセチンを含有させた。３０℃で１時間反応させ、急速冷凍し、−２０℃で保存後、逆相ＨＰＬＣ分析にかけた。
【００６５】
サイトカイニンとのＵＧＴ酵素反応
アッセイ混合物（２００μｌ）は、２μｇの組み換えタンパク質、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭのＵＤＰ−グルコース、０．５ｍＭのＡＴＰ、５０ｍＭのＭｇＣｌ２及び０．５ｍＭのサイトカイニンを含有した。３０℃で３時間反応させ、急速冷凍し、−２０℃で保存後、逆相ＨＰＬＣ分析にかけた。
【００６６】
反応ミックスのＨＰＬＣ分析
Ｃｏｌｕｍｂｕｓ５μＣ１８カラム（２５０×４．６０ｍｍ、フェノメネックス社（Phenomenex)製）を用いて、逆相ＨＰＬＣ（Ｓｐｅｃｔｒａ ＳＹＳＴＥＭ ＨＰＬＣシステム及びＵＶ６０００ＬＰフォトダイオード・アレイ検出器、サーモクエスト社（Thermo Quest）製）分析を行った。Ｈ２Ｏ中１０〜７５％のアセトニトリル（全ての溶液は、０．１％のトリフルオロ酢酸を含有した）の直線勾配により、２０分かけて１ｍｌ／分で、ケルセチングルコシド類をアグリコンから分離し、３７０ｎｍで調べた。Ｈ２Ｏ中１０〜１００％のメタノール（Ｎ６−イソペンテニルアデニン（ｉＰ）、Ｎ６−ベンジルアデニン及びカイネチンにおいて）又はＨ２Ｏ中１０〜６０％のメタノール（トランス−ゼアチン及びジヒドロゼアチンにおいて）の直線勾配により、２０分かけて１ｍｌ／分で、サイトカイニングルコシド類をそれらのアグリコンから分離した。全ての溶液は、０．２５％の酢酸、０．０４％のトリエチルアミン及びトリフルオロ酢酸を含有した。２０６ｎｍ及び２５２ｎｍで分離を調べた。生成物の同定は、基準グルコシド類と比較して確認された。
【００６７】
ＵＧＴにより形成されたサイトカイニン生成物
１．７−Ｎ−グルコシド（７６Ｃ１、７６Ｃ２）
２．９−Ｎ−グルコシド（７６Ｃ１、７６Ｃ２）
３．Ｏ−グルコシド（トランス−ゼアチン及びジヒドロゼアチンにのみ適用する）（トランス−ゼアチンに関しては８５Ａ１；ジヒドロゼアチンに関しては８５Ａ１及び７３Ｃ５）
【００６８】
大規模発酵
発酵を７リットル容の発酵槽（アプリコン・バイオコンソールＡＤＩ１０２５（Applicon Biotconsole ADI1025))で行った。処理を３日連続して行った。以下のパラメータ、すなわち温度、ｐＨ、Ｏ２飽和度の割合を連続的に観察し、制御した。系(system)の平衡化後、ＬＢ成長培地に１５ｍｌのスタータ・カルチャーを播種した。ＩＰＴＧで細胞が誘導される時に、基質を添加する。等間隔で一定分量を抜き取り、グリコシドの生成物をＨＰＬＣ分析で調べた。
【００６９】
誘導後、容器を約２０時間空にし、培養物をＳｏｒｖａｌ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ＲＣ、ＳＬＣ６０００ロータ内で遠沈させた。上清を凍結させた後、凍結乾燥した。
【００７０】
凍結乾燥した材料を、水で再溶解し、水に飽和したブタノール中に繰り返し抽出した。有機相を集め、溶媒をＢｕｃｈｉ Ｒ−１１４ ｒｏｔａｖａｐｏｒで蒸発させた。
【００７１】
抽出物を５０％のメタノールに溶解後、分離用ＨＰＬＣにて分離した。
カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ５μ Ｃ１８（２）、逆相２５０×１０分；容積およそ１９．６ｍｌ
使用システム：ＴＦにおけるＡＫＴＡ ＦＰＬＣシステム（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（株）社製）
【００７２】
５０％のメタノール中に溶解した抽出物を、さらに１０％のアセトニトリル及び０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で希釈し、最終濃度がおよそ５％のメタノールとなるようにした。１５％、３５％及び５０％のアセトニトリル及び０．１％のＴＦＡで、定組成工程溶離において、カラムから化合物を溶離した。ピーク画分を回収し、ＨＰＬＣ、ＬＣ−ＭＳ及び１Ｈ ＮＭＲにてアッセイした。
【００７３】
（実施例１）
植物ＵＧＴによるｉｎ ｖｉｔｒｏでのケルセチングルコシド類の合成
ケルセチンに対するアラビドプシス組み換えＵＧＴの活性を、以前に開発されたプラットフォームを用いて求めた１５。これらのデータセットにおいて、合計で４つの主要なモノグルコシド類しか見られず、逆相ＨＰＬＣを用いたそれらの分離を、図１３Ｂに示す。これらの生成物の構造は、１Ｈ ＮＭＲを用いて分析され、それらのスペクトルを公表されているデータと比較した１７。生成物は、ケラチンの３−Ｏ−、７−Ｏ−、３’−Ｏ−、及び４’−Ｏ−モノグルコシドとして確認された（表２を参照）。Ｃ５−ＯＨに対する有意な活性は、分析された組み換え酵素のいずれにも認められなかった。分析された９１個の組み換えＵＧＴのうち、２９個の酵素がケルセチンに対する有意な触媒活性を呈し、その詳細を表１に示す。表を要約すると、基質をグルコシル化するさらなる選択性があった。１４個の酵素が、ケルセチン上で一箇所の部位だけ認識し、そのうち１２個はＣ３−ＯＨをグルコシル化し、２個のＵＧＴがＣ７−ＯＨをグルコシル化した。１５個の酵素が、２箇所以上の部位をグルコシル化し、そのうち１１個は２箇所の部位のみ認識し、３個は３箇所の部位を認識することがわかった。１個のＵＧＴは４箇所の部位全てをグルコシル化できることがわかった。
【００７４】
いくつかのＵＧＴがケルセチン上で複数の部位を認識することを考えると、反応条件が適切である場合、モノグルコシド類のみが生成されるか、又は同じ分子上で複数のヒドロキシル基がグルコシル化されるかどうかを決定することが重要であった。４個のＵＧＴ（ＵＧＴ７１Ｃ１、ＵＧＴ７４Ｆ１、ＵＧＴ７６Ｅ１２及びＵＧＴ８９Ｂ１）を用いて、この可能性を調べた。要約するに、ジ−Ｏ−グルコシド形成は見られたものの、基質は低濃度においてのみであった。面白いことに、可能性のある４つのジ−Ｏ−グルコシド及び１つのトリ−Ｏ−グルコシドのうち、たった２つの生成物が見い出され、それらは３，７−ジ−Ｏ−グルコシド及び７，３’−ジ−Ｏ−グルコシドであった（図１３Ｃを参照）。７，３’−ジ−Ｏ−グルコシドは１Ｈ ＮＭＲにて確認され、一方３，７−ジ−Ｏ−グルコシドは、１Ｈ ＮＭＲ及びＬＣ−ＭＳにて確認された（表４及び補足図１４を参照）。これらのデータから、ＵＧＴ触媒作用の生成物は、異なる反応条件下で変わることが示唆される。このことから、さまざまな異なるグルコシド化合物を合成する潜在的（potential)手段が提供される。
【００７５】
生体触媒システムを構築するさらなる基盤として、時間のパラメータが、かなりの量のジ−Ｏ−グルコシド類を生成した２個のＵＧＴ（ＵＧＴ７１Ｃ１及びＵＧＴ７６Ｅ１２）に対して異なった。ＵＧＴ７１Ｃ１は、アグリコンを、モノグルコシドに速やかに変換し、そのモノグルコシドをその後さらに消費してジ−Ｏ−グルコシドを生成する。ＵＧＴ７６Ｅ１２反応ミックスでは、アグリコン量は使い果たされるものの、モノグルコシドは長時間一定濃度のまま残り続けた。これらのデータから、反応特性は使用されるＵＧＴに依存することが示唆される。
【００７６】
（実施例２）
全細胞生体触媒としての植物ＵＧＴ
先行の実施例で構築された基盤を用いて、本発明者等は、ケルセチンのグルコシドを合成する、全細胞生体触媒としての植物ＵＧＴを発現しているＥ．ｃｏｌｉの潜在能力を調べた。まず第１に、本発明者等は、７５ｍｌの標準培養液で増殖されたＥ．Ｃｏｌｉを用いた。ＵＧＴ７１Ｃ１を用いて形質転換された細胞を用いた実験予備セットの結果を、図１４に示す。面白いことに、４８時間の経時変化を通じて、大量のアグリコン及びグルコシド類が培養液中で回収され（図１４Ａ）、６時間以内におよそ５０％のアグリコンがグルコシド類に変換された（図１４Ｂ）。これらの研究から、いかなる補充ＵＤＰ−グルコースが存在せずとも、標準培養液中の細胞は、十分量の添加された基質をグルコシル化することができたことが示された。表３に、７個の異なるＵＧＴがＥ．ｃｏｌｉ中に発現され、且つ培養液中に回収された異なるグルコシド類の同定及び定量をＨＰＬＣにて分析した結果を記載する。ｉｎ ｖｉｖｏでのグルコシル化の位置選択性のパターンは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの各ＵＧＴにより発現されたものとかなり酷似したことを示唆した。細胞により合成された種々のグルコシド類の量はかなり異なり、これらの非最適化条件下にも関わらず、４つのモノグルコシド類及び２つのジ−Ｏ−グルコシド類が、それぞれ形成された。
【００７７】
細胞が休止状態でグルコシドを作ることができるかどうかを判断するのに、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞をリン酸緩衝液に移し、グルコースの存在下又は非存在下で培養した。結果を表５に示す。エネルギー源のない状態では、グルコシドへのごく僅かなケルセチンの変換が認められた。アグリコンが細胞ペレットから大量に回収されたことから、培養液からの取り込みが起こったことを示した。グルコースが存在する状態では、高濃度の化合物が培養液中に回収され、そのうち、大部分はケルセチンのグルコシドから成った。
【００７８】
添加されたＵＤＰ−グルコースの非存在下で、グルコシドの大規模製造に関する全細胞生体触媒の潜在能力を調べるため、形質移入された細菌性細胞を発酵槽中で培養した。この工程において、条件を生成サイクルを通じて厳密に制御し、且つ単純培養フラスコ及び最適化発酵槽システム内での全細胞ＵＧＴ生体触媒作用による転移効率の直接的な比較がなされるようにした。予備実験（表２）で、２４時間のインキュベーション後に８．９６μｇ／ｍｌ濃度で、単一生成物（３−Ｏ−グルコシド）の形成が見られたため、ＵＧＴ７３Ｂ３を分析用に選んだ。発酵槽システムを用いた２０時間の培養で、３−Ｏ−グルコシドの収率は、９９．３μｇ／ｍｌ、すなわち１０倍高くなることがわかった。図１５Ａに、これらのデータを示す。また、その図から、時間０（時間）において、グルコシドは、水溶性アグリコンよりもはるかに高い最終濃度であったことを示す。ケルセチンは、使用される緩衝条件下において、比較的不溶性であるため、上清を分析する前に、遠心分離工程で沈殿物として回収された。反応の進行に伴い、グルコシル化されたケルセチン量が増加することが、データから示唆される。
【００７９】
１過程抽出法により、水に飽和したブタノールで、ＵＧＴ７３Ｂ３全細胞生体触媒により生成されたグルコシドを培養液から容易に精製することができる。図１５Ｂに示されるように、ケルセチン−３−Ｏ−グルコシドを、有機相に完全に回収し、水相中に大量の不純物を残した。
【００８０】
この研究は、天然産物を位置選択的にグルコシル化する際に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおける生体触媒としての植物のグルコシルトランスフェラーゼの利用性について例示する。ｉｎ ｖｉｖｏで、Ｅ．Ｃｏｌｉ内で酵素を使用すると、効率的な基質の転移（convert)を達成するのに、ＵＤＰ−グルコースを培養液に補う必要がないことがわかった。したがって、形質転換された細胞は、全細胞及び安価な生体触媒システムとして使用することができ、特に生体内変換による生成物が培養液から回収され得る。グルコースが結合する潜在的部位としての５つのヒドロキシル基での、ケルセチンのグルコシル化が複雑であるため、本発明者等は、この研究にモデル医薬化合物としてケルセチンを使用した。ケルセチンに対する活性を得るのに、９１個の植物ＵＧＴをｉｎ ｖｉｔｒｏでスクリーニングした結果、１箇所又はそれ以上の部位のいずれかで、基質をグルコシル化したのは２９個であった。ＵＧＴにより認識されなかった唯一の部位は、Ｃ５−ＯＨであった。反応の動態及び生成物の回収は、素早い細胞内グルコシル化が分泌を促進したことを示した。位置選択性ＵＧＴを用いた使用におけるＥ．ｃｏｌｉの一般的な利用性は、培養液から基質を吸収し、より少ない程度に、生成物を分泌する細胞の能力に依存する。基質及び生成物両方の安定性もまた、達成には重要な因子である。
【００８１】
（実施例３）
発酵
ＵＧＴ７３Ｂ３及び１．５ｇのケルセチンを、ケルセチン−３−Ｏ−グルコシド（Ｑ−３−Ｇ）の生成に使用した。４リットルの発酵を行った後、粗上清のＨＰＬＣ分析を行い、Ｑ−３−Ｇの生成を確認した。ブタノール抽出、溶媒蒸発及び５０％のメタノール中での抽出物の再懸濁を経て、Ｑ−３−Ｇの精製を行った。
【００８２】
水で２ｍｌにした溶解抽出物のうち、およそ２００μｌ量を用いて、最適条件を決定するのに多くの分離を行った。いくつかの異なる勾配、並びに一連の溶離工程を調べた。以下の溶媒システムは、経験的に（実験的に：empirically)到達された。５０％のメタノール中の溶解抽出物を、さらに１０％のアセトニトリル及び０．１％ＴＦＡに希釈し、最終濃度がおよそ５％のメタノールになるようにした。定組成工程溶離において、１５％、３５％及び５０％のアセトニトリルで、化合物をカラムから溶離した。ピーク画分を回収した。
【００８３】
半量（すなわち、２リットルの発酵物のうちの当量物）をブタノール中に抽出し、さらに上述のように精製した。ピーク画分を充填中の全流量と共に回収した。
【００８４】
ＨＰＬＣ分析に基づいた計算値及び既知の市販の標準液（アピン（Ａpin））との比較から、純度及び収率は、９５％を上回る（>95%）純度で５５ｍｇのケルセチン−３−Ｏ−グルコシドであることが見込まれた。
【００８５】
Ｑ−３−Ｇの同定及び純度を１Ｈ ＮＭＲ及びＬＣ−ＭＳにて確認した。
【００８６】
（実施例４）
ＵＧＴ８４Ｂ１及び０．５ｇのケルセチンを、ケルセチン−７−Ｏ−グルコシド（Ｑ−７−Ｇ）の生成に使用した。２リットルの発酵を行った後、粗上清のＨＰＬＣ分析を行い、Ｑ−７−Ｇが生成されたことを確認した。上述したＱ−３−Ｇの時のように、ブタノール抽出、溶媒蒸発及び５０％のメタノール中での抽出物の再懸濁を経て、Ｑ−７−Ｇの精製を行った。ピーク画分を、充填中の全流量と共に回収した。
【００８７】
ＨＰＬＣ分析に基づいた計算値及び既知の市販の標準液（アピン）との比較から、純度及び収率は、９０％を上回る（>90%）純度で８ｍｇのケルセチン−７−Ｏ−グルコシドであることが見込まれた。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１ａ】ＵＧＴ７１Ｂ８核酸配列を示す。
【図１ｂ】ＵＧＴ７１Ｂ８アミノ酸配列を示す。
【図２ａ】ＵＧＴ７１Ｃ３核酸配列を示す。
【図２ｂ】ＵＧＴ７１Ｃ３アミノ酸配列を示す。
【図３ａ】ＵＧＴ７１Ｃ４核酸配列を示す。
【図３ｂ】ＵＧＴ７１Ｃ４アミノ酸配列を示す。
【図４ａ】ＵＧＴ８８Ａ１ゲノム核酸配列を示す。
【図４ｂ】ＵＧＴ８８Ａ１ｃＤＮＡ配列を示す。
【図４ｃ】ＵＧＴ８８Ａ１アミノ酸配列を示す。
【図５ａ】ＵＧＴ７８Ｄ２ゲノム配列を示す。
【図５ｂ】ＵＧＴ７８Ｄ２ｃＤＮＡ配列を示す。
【図５ｃ】ＵＧＴ７８Ｄ２アミノ酸配列を示す。
【図６ａ】ＵＧＴ７８Ｄ３ゲノム配列を示す。
【図６ｂ】ＵＧＴ７８Ｄ３ｃＤＮＡ配列を示す。
【図６ｃ】ＵＧＴ７８Ｄ３アミノ酸配列を示す。
【図７ａ】ＵＧＴ７６Ｄ１ゲノム配列を示す。
【図７ｂ】ＵＧＴ７６Ｄ１ｃＤＮＡ配列を示す。
【図７ｃ】ＵＧＴ７６Ｄ１アミノ酸配列を示す。
【図８ａ】ＵＧＴ７６Ｅ２ゲノム配列を示す。
【図８ｂ】ＵＧＴ７６Ｅ２ｃＤＮＡ配列を示す。
【図８ｃ】ＵＧＴ７６Ｅ２アミノ酸配列を示す。
【図９ａ】ＵＧＴ７６Ｃ１ゲノム配列を示す。
【図９ｂ】ＵＧＴ７６Ｃ１ｃＤＮＡ配列を示す。
【図９ｃ】ＵＧＴ７６Ｃ１アミノ酸配列を示す。
【図１０ａ】ＵＧＴ７６Ｃ２ゲノム配列を示す。
【図１０ｂ】ＵＧＴ７６Ｃ２ｃＤＮＡ配列を示す。
【図１０ｃ】ＵＧＴ７６Ｃ２アミノ酸配列を示す。
【図１１ａ】ＵＧＴ７３Ｃ５ゲノム配列を示す。
【図１１ｂ】ＵＧＴ７３Ｃ５アミノ酸配列を示す。
【図１２ａ】ＵＧＴ８５Ａ１ゲノム配列を示す。
【図１２ｂ】ＵＧＴ８５Ａ１ｃＤＮＡ配列を示す。
【図１２ｃ】ＵＧＴ８５Ａ１アミノ酸配列を示す。
【図１３Ａ】ケルセチン及びそのモノグルコシド類。ケルセチンの化学構造を示す。
【図１３Ｂ】ケルセチン及びそのモノグルコシド類。３７０ｎｍの吸収波長を用いて、実験プロトコルに記載されるようなＨＰＬＣにより分離された、ケルセチン及びそのモノグルコシド類を示す。ＮＭＲを用いて確認されたモノグルコシド類の同定から、（１）はケルセチン−７−Ｏ−グルコシド、（２）はケルセチン−３−Ｏ−グルコシド、（３）はケルセチン−４’−Ｏ−グルコシド、（４）はケルセチン−３’−Ｏ−グルコシドである。（１）〜（３）は、組み換え酵素ＵＧＴ８９Ｂ１を用いて調製され、（４）は組み換え酵素ＵＧＴ７１Ｃ１を用いて調製された。
【図１３Ｃ】ケルセチン及びそのモノグルコシド類。ケルセチンの複数のヒドロキシル基をグルコシル化し得る４ＵＧＴの詳細な分析を示す。
【図１４Ａ】ＵＧＴ７１Ｃ１を用いた全細胞生体触媒アッセイ。組み換え体を発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞を、生体触媒アッセイに使用した。０．１ｍＭのケルセチン及び０．１ｍＭのＩＰＴＧを用いてインキュベーションした後、細胞を遠心分離で回収し、８０％のメタノールで抽出し、細胞抽出物（ペレット）及び培養液（上清）の両方について、ＨＰＬＣを用いて分析した。０〜４８時間の経時変化を追ったアグリコン／グルコシドの併用量変化を示す。
【図１４Ｂ】ＵＧＴ７１Ｃ１を用いた全細胞生体触媒アッセイ。組み換え体を発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞を、生体触媒アッセイに使用した。０．１ｍＭのケルセチン及び０．１ｍＭのＩＰＴＧを用いてインキュベーションした後、細胞を遠心分離で回収し、８０％のメタノールで抽出し、細胞抽出物（ペレット）及び培養液（上清）の両方について、ＨＰＬＣを用いて分析した。同経時変化を追った培養液中の種々のグルコシド類及びアグリコンの濃度変化を示す。
【図１５Ａ】全細胞生体触媒としてＵＧＴ７３Ｂ３を用いたケルセチン−３−Ｏ−グルコシドの発酵規模生産。０〜２０時間の経時変化を追った培養液中のケルセチン−３−Ｏ−グルコシド及びアグリコンの濃度変化を示す。
【図１５Ｂ】全細胞生体触媒としてＵＧＴ７３Ｂ３を用いたケルセチン−３−Ｏ−グルコシドの発酵規模生産。２０時間での培養液のＨＰＬＣ分析：パネル１はさらなる抽出前；パネル２は水に飽和したブタノールを用いた抽出後の水相；パネル３は上記の抽出後の有機相を示す。分析には、２３４ｎｍの吸収波長を用いた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝的に改変された細胞を含む反応槽であって、
ｉ）図１ａ、図２ａ、図３ａ、図４ａ、図４ｂ、図５ａ、図５ｂ、図６ａ、図６ｂ、図７ａ、図７ｂ、図８ａ、図８ｂ、図９ａ、図９ｂ、図１０ａ、図１０ｂ、図１１ａ、図１２ａ及び図１２ｂに表されるような核酸配列を含む核酸分子、
ｉｉ）前記（ｉ）に表される核酸配列に対してハイブリダイズし、且つグリコシルトランスフェラーゼの活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子、及び
ｉｉｉ）前記（ｉ）及び（ｉｉ）で規定された核酸配列に対する遺伝子コードから、縮重する核酸配列を含む核酸分子
から成る群から選択される核酸分子を用いて、形質移入又は形質転換により改変される前記細胞、及び前記グリコシルトランスフェラーゼに対する基質である、少なくとも１つの外生的基質を含む、前記細胞の増殖を維持する栄養培地を包含し、
該栄養培地が、ＵＤＰ−グルコースの外生的供給を包含しないことを特徴とする、反応槽。
【請求項２】
前記反応槽がバイオリアクターである、請求項１に記載の反応槽。
【請求項３】
前記反応槽が発酵槽である、請求項１又は２に記載の反応槽。
【請求項４】
前記核酸分子が、厳密なハイブリダイゼーション条件下で、図１ａ、図２ａ、図３ａ、図４ａ、図４ｂ、図５ａ、図５ｂ、図６ａ、図６ｂ、図７ａ、図７ｂ、図８ａ、図８ｂ、図９ａ、図９ｂ、図１０ａ、図１０ｂ、図１１ａ、図１２ａ及び図１２ｂに提示される核酸配列に対してハイブリダイズする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の反応槽。
【請求項５】
前記細胞が、前記核酸分子を含むベクターを用いて形質移入又は形質転換される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の反応槽。
【請求項６】
前記細胞が、図１ｂ、図２ｂ、図３ｂ、図４ｃ、図５ｃ、図６ｃ、図７ｃ、図８ｃ、図９ｃ、図１０ｃ、図１１ｂ又は図１２ｃに表されるアミノ酸配列により表されるようなポリペプチド、又は少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失又は置換により改変された変異ポリペプチドをコードする、核酸分子を用いて形質移入又は形質転換される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の反応槽。
【請求項７】
核酸分子を用いて、形質移入又は形質転換されるトランスジェニック細胞であって、該細胞は、
ｉ）図１ａ、図２ａ、図３ａ、図４ａ、図４ｂ、図５ａ、図５ｂ、図６ａ、図６ｂ、図７ａ、図７ｂ、図８ａ又は図８ｂに表されるような核酸配列から成る核酸分子、
ｉｉ）前記（ｉ）の核酸分子に対してハイブリダイズし、且つ抗酸化物をグルコシル化するグリコシルトランスフェラーゼの活性を有する核酸分子、及び
ｉｉｉ）前記（ｉ）及び（ｉｉ）に規定された核酸配列に対する遺伝子コードから、縮重する核酸配列から成る核酸分子
から成る群から選択される核酸配列を含む核酸分子を用いて、形質移入又は形質転換される、トランスジェニック細胞。
【請求項８】
前記核酸分子が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、図１ａ、図２ａ、図３ａ、図４ａ、図４ｂ、図５ａ、図５ｂ、図６ａ、図６ｂ、図７ａ、図７ｂ、図８ａ又は図８ｂに提示される核酸配列に対してハイブリダイズする、請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
前記抗酸化物がケルセチンである、請求項７又は８に記載の細胞。
【請求項１０】
前記抗酸化物がエスクレチンである、請求項７又は８に記載の細胞。
【請求項１１】
核酸分子を用いて、形質移入又は形質転換されるトランスジェニック細胞であって、該細胞は、
ｉ）図９ａ、図９ｂ、図１０ａ、図１０ｂ、図１１ａ、図１２ａ及び図１２ｂに表されるような核酸配列から成る核酸分子、
ｉｉ）前記（ｉ）の核酸分子に対してハイブリダイズし、且つサイトカイニンのグルコシル化であるグリコシルトランスフェラーゼの活性を有する核酸分子、及び
ｉｉｉ）前記（ｉ）及び（ｉｉ）に規定された配列に対する遺伝子コードから、縮重する核酸配列から成る核酸分子
から成る群から選択される核酸配列を含む核酸分子を用いて、形質移入又は形質転換される、トランスジェニック細胞。
【請求項１２】
前記核酸分子が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、図９ａ、図９ｂ、図１０ａ，図１０ｂ、図１１ａ、図１２ａ及び図１２ｂに表される核酸配列に対してハイブリダイズする、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
前記サイトカイニンが、トランス−ゼアチン、ジヒドロゼアチン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｎ６−ベンジルアデニン及びカイネチンから成る群から選択される、請求項１１又は１２に記載の細胞。
【請求項１４】
前記細胞が真核細胞である、請求項７〜１３のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１５】
前記細胞が、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞又は植物細胞から成る群から選択される、請求項１４に記載の細胞。
【請求項１６】
前記細胞が植物細胞である、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
前記細胞が原核細胞である、請求項７〜１３のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１８】
請求項１６に記載の細胞を含む種子。
【請求項１９】
抗酸化物をグルコシル化する方法であって、請求項７〜１０又は請求項１４〜１７のいずれか１項に記載のトランスジェニック細胞、請求項１〜６のいずれか１項に記載の反応槽中で前記トランスジェニック細胞の増殖を維持する栄養培地、及び前記トランスジェニック細胞の培養に関連する増殖条件の提供を含み、前記栄養培地がＵＰＤ−グルコースの外生的供給を包含しない、該方法。
【請求項２０】
前記抗酸化物が、ケルセチン又はエスクレチンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
サイトカイニンをグルコシル化する方法であって、請求項１１〜１３又は請求項１４〜１７のいずれか１項に記載のトランスジェニック細胞、本発明による反応槽中で前記トランスジェニック細胞の増殖を維持する栄養培地、及び前記トランスジェニック細胞の培養に関連する増殖条件の提供を含み、前記栄養培地がＵＰＤ−グルコースの外生的供給を含まない、該方法。
【請求項２２】
前記サイトカイニンが、トランス−ゼアチン、ジヒドロゼアチン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｎ６−ベンジルアデニン及びカイネチンから成る群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項１】
遺伝的に改変された細胞を含む反応槽であって、
ｉ）図１ａ、図２ａ、図３ａ、図４ａ、図４ｂ、図５ａ、図５ｂ、図６ａ、図６ｂ、図７ａ、図７ｂ、図８ａ、図８ｂ、図９ａ、図９ｂ、図１０ａ、図１０ｂ、図１１ａ、図１２ａ及び図１２ｂに表されるような核酸配列を含む核酸分子、
ｉｉ）前記（ｉ）に表される核酸配列に対してハイブリダイズし、且つグリコシルトランスフェラーゼの活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子、及び
ｉｉｉ）前記（ｉ）及び（ｉｉ）で規定された核酸配列に対する遺伝子コードから、縮重する核酸配列を含む核酸分子
から成る群から選択される核酸分子を用いて、形質移入又は形質転換により改変される前記細胞、及び前記グリコシルトランスフェラーゼに対する基質である、少なくとも１つの外生的基質を含む、前記細胞の増殖を維持する栄養培地を包含し、
該栄養培地が、ＵＤＰ−グルコースの外生的供給を包含しないことを特徴とする、反応槽。
【請求項２】
前記反応槽がバイオリアクターである、請求項１に記載の反応槽。
【請求項３】
前記反応槽が発酵槽である、請求項１又は２に記載の反応槽。
【請求項４】
前記核酸分子が、厳密なハイブリダイゼーション条件下で、図１ａ、図２ａ、図３ａ、図４ａ、図４ｂ、図５ａ、図５ｂ、図６ａ、図６ｂ、図７ａ、図７ｂ、図８ａ、図８ｂ、図９ａ、図９ｂ、図１０ａ、図１０ｂ、図１１ａ、図１２ａ及び図１２ｂに提示される核酸配列に対してハイブリダイズする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の反応槽。
【請求項５】
前記細胞が、前記核酸分子を含むベクターを用いて形質移入又は形質転換される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の反応槽。
【請求項６】
前記細胞が、図１ｂ、図２ｂ、図３ｂ、図４ｃ、図５ｃ、図６ｃ、図７ｃ、図８ｃ、図９ｃ、図１０ｃ、図１１ｂ又は図１２ｃに表されるアミノ酸配列により表されるようなポリペプチド、又は少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失又は置換により改変された変異ポリペプチドをコードする、核酸分子を用いて形質移入又は形質転換される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の反応槽。
【請求項７】
核酸分子を用いて、形質移入又は形質転換されるトランスジェニック細胞であって、該細胞は、
ｉ）図１ａ、図２ａ、図３ａ、図４ａ、図４ｂ、図５ａ、図５ｂ、図６ａ、図６ｂ、図７ａ、図７ｂ、図８ａ又は図８ｂに表されるような核酸配列から成る核酸分子、
ｉｉ）前記（ｉ）の核酸分子に対してハイブリダイズし、且つ抗酸化物をグルコシル化するグリコシルトランスフェラーゼの活性を有する核酸分子、及び
ｉｉｉ）前記（ｉ）及び（ｉｉ）に規定された核酸配列に対する遺伝子コードから、縮重する核酸配列から成る核酸分子
から成る群から選択される核酸配列を含む核酸分子を用いて、形質移入又は形質転換される、トランスジェニック細胞。
【請求項８】
前記核酸分子が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、図１ａ、図２ａ、図３ａ、図４ａ、図４ｂ、図５ａ、図５ｂ、図６ａ、図６ｂ、図７ａ、図７ｂ、図８ａ又は図８ｂに提示される核酸配列に対してハイブリダイズする、請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
前記抗酸化物がケルセチンである、請求項７又は８に記載の細胞。
【請求項１０】
前記抗酸化物がエスクレチンである、請求項７又は８に記載の細胞。
【請求項１１】
核酸分子を用いて、形質移入又は形質転換されるトランスジェニック細胞であって、該細胞は、
ｉ）図９ａ、図９ｂ、図１０ａ、図１０ｂ、図１１ａ、図１２ａ及び図１２ｂに表されるような核酸配列から成る核酸分子、
ｉｉ）前記（ｉ）の核酸分子に対してハイブリダイズし、且つサイトカイニンのグルコシル化であるグリコシルトランスフェラーゼの活性を有する核酸分子、及び
ｉｉｉ）前記（ｉ）及び（ｉｉ）に規定された配列に対する遺伝子コードから、縮重する核酸配列から成る核酸分子
から成る群から選択される核酸配列を含む核酸分子を用いて、形質移入又は形質転換される、トランスジェニック細胞。
【請求項１２】
前記核酸分子が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、図９ａ、図９ｂ、図１０ａ，図１０ｂ、図１１ａ、図１２ａ及び図１２ｂに表される核酸配列に対してハイブリダイズする、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
前記サイトカイニンが、トランス−ゼアチン、ジヒドロゼアチン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｎ６−ベンジルアデニン及びカイネチンから成る群から選択される、請求項１１又は１２に記載の細胞。
【請求項１４】
前記細胞が真核細胞である、請求項７〜１３のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１５】
前記細胞が、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞又は植物細胞から成る群から選択される、請求項１４に記載の細胞。
【請求項１６】
前記細胞が植物細胞である、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
前記細胞が原核細胞である、請求項７〜１３のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１８】
請求項１６に記載の細胞を含む種子。
【請求項１９】
抗酸化物をグルコシル化する方法であって、請求項７〜１０又は請求項１４〜１７のいずれか１項に記載のトランスジェニック細胞、請求項１〜６のいずれか１項に記載の反応槽中で前記トランスジェニック細胞の増殖を維持する栄養培地、及び前記トランスジェニック細胞の培養に関連する増殖条件の提供を含み、前記栄養培地がＵＰＤ−グルコースの外生的供給を包含しない、該方法。
【請求項２０】
前記抗酸化物が、ケルセチン又はエスクレチンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
サイトカイニンをグルコシル化する方法であって、請求項１１〜１３又は請求項１４〜１７のいずれか１項に記載のトランスジェニック細胞、本発明による反応槽中で前記トランスジェニック細胞の増殖を維持する栄養培地、及び前記トランスジェニック細胞の培養に関連する増殖条件の提供を含み、前記栄養培地がＵＰＤ−グルコースの外生的供給を含まない、該方法。
【請求項２２】
前記サイトカイニンが、トランス−ゼアチン、ジヒドロゼアチン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｎ６−ベンジルアデニン及びカイネチンから成る群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図４ｃ】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図５ｃ】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図６ｃ】
【図７ａ】
【図７ｂ】
【図７ｃ】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【図８ｃ】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【図９ｃ】
【図１０ａ】
【図１０ｂ】
【図１０ｃ】
【図１１ａ】
【図１１ｂ】
【図１２ａ】
【図１２ａ】
【図１２ｂ】
【図１２ｃ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１ｂ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図４ｃ】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図５ｃ】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図６ｃ】
【図７ａ】
【図７ｂ】
【図７ｃ】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【図８ｃ】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【図９ｃ】
【図１０ａ】
【図１０ｂ】
【図１０ｃ】
【図１１ａ】
【図１１ｂ】
【図１２ａ】
【図１２ａ】
【図１２ｂ】
【図１２ｃ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【公表番号】特表２００７−５０４８３６（Ｐ２００７−５０４８３６Ａ）
【公表日】平成１９年３月８日（２００７．３．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３０５３７（Ｐ２００６−５３０５３７）
【出願日】平成１６年５月２４日（２００４．５．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００２２３７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０６５０８
【国際公開日】平成１６年１２月９日（２００４．１２．９）
【出願人】（５０５４３９８２０）ザ・ユニヴァーシティ・オブ・ヨーク (2)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＹＯＲＫ
【住所又は居所原語表記】Ｈｅｓｌｉｎｇｔｏｎ， Ｙｏｒｋ ＹＯ１０ ５ＤＤ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年３月８日（２００７．３．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年５月２４日（２００４．５．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００２２３７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０６５０８
【国際公開日】平成１６年１２月９日（２００４．１２．９）
【出願人】（５０５４３９８２０）ザ・ユニヴァーシティ・オブ・ヨーク (2)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＹＯＲＫ
【住所又は居所原語表記】Ｈｅｓｌｉｎｇｔｏｎ， Ｙｏｒｋ ＹＯ１０ ５ＤＤ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ
【Ｆターム（参考）】
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