グリコペプチドの調製法
連結反応方法に補助された糖類を使用するグリコペプチドの合成方法であって、チオエステルの形態のＮ末端ペプチド部分が、チオール基を含む炭水化物部分を有する、Ｃ末端ペプチド部分とカップリングする方法を提供する。本発明の実施形態は、Ｃ末端カルボキシルチオエステルを含むペプチドと、側鎖グリコシルがチオール基を含有する遊離Ｎ末端アミノ基を持つ側鎖グリコシルペプチドとの間にペプチド結合を形成する方法であって、水性媒体中で２種類の試薬を接触させ、チオエステル交換反応の工程によって形成されたチオエステルから、アシル基の分子内ＳからＮへのシフトを介してカップリングされた生成物を形成することを含む方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の基金に関する声明
本発明は、アメリカ合衆国のＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって授与されたグラント番号ＧＭ４４１５４の下で、政府の支援によってなされた。米国合衆国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
先に出願された特許出願に対する優先権主張
本願は、２００６年３月２２日に出願された米国仮特許出願第６０／７４３，６６６号の、米国特許法第１１９（ｅ）条の下での利益を請求する。米国仮特許出願第６０／７４３，６６６号は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００３】
発明の分野
本発明は、ペプチドチオエステルと糖部分にチオール基を有するグリコペプチドとのカップリングによるペプチド結合の形成によって、ペプチド類およびグリコペプチド類を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
ペプチド類およびタンパク質の化学的合成は、広く研究されている分野であり、逐次カップリング反応を使用してそのような化合物を合成する方法、特にポリマーなどの固相への固定に関与する方法が開発されている。しかし、逐次合成方法は、より大きなペプチド類およびタンパク質の製造にはあまり適さない。このため、より小さなペプチド類を制御されたやり方で結合して大分子を製造するセグメントカップリング法が開発されてきている。
【０００５】
Ｄ．Ｓ．Ｋｅｍｐおよび共同研究者たちは、大ペプチドを製造する「チオール捕獲」法を開発した（（ａ）Ｋｅｍｐ，Ｄ．Ｓ．Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ１９８１，２０，１７９３−１８０４．（ｂ）Ｋｅｍｐ Ｄ．Ｓ．；Ｃａｒｅｙ，Ｒ．Ｉ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９３，５８，２２１６−２２２２）。これにより、追加のセグメントのカップリング法が導かれた。これらの中で、ネイティブケミカルライゲーション法は、タンパク質の化学的合成の有用なツールの代表である（Ｄａｗｓｏｎ，Ｐ．Ｅ．；Ｍｕｉｒ，Ｔ．Ｗ．；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ，Ｌ；Ｋｅｎｔ，Ｓ．Ｂ．Ｈ．Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９４，２６６，１１６−１１９）。このアプローチでは、Ｎ末端システイン残基が、ペプチドのシステインチオエステルとして、ペプチドチオエステルの捕獲に必要であり、これは次いで、自発的な分子内ＳからＮアシルへの転移により、連結反応部でアミド（ペプチド）結合を形成する。
【０００６】
連結反応部位でシステイン残基を必要とすることから生じる制限を克服するために、異なる方法が適用され、ペプチド結合技術のレパートリーが広がっている（（ａ）非特許文献１、（ｂ）非特許文献２、（ｃ）非特許文献３、（ｄ）非特許文献４）。除去可能なチオール系補助物質の使用は、システインのチオール側鎖と同じ機能を実現する魅力的なアプローチである。１−フェニル−２−メルカプトエチルおよび２−メルカプトベンジル基などの、システインの機能に類似した機能を発揮しうるＮα−結合補助物質を持つペプチド類が研究され、大ペプチド類の合成に成功裏に適用されている（（ａ）非特許文献５、（ｃ）非特許文献６、（ｄ）非特許文献７、（ｅ）非特許文献８、（ｆ）非特許文献９）。
【０００７】
簡単に入手しうる材料からのグリコペプチド類の合成は、構造的および機能的研究のための高分子量のペプチド類およびグリコペプチド類の製造の有利なアプローチの代表である。したがって、より大きなペプチド類およびタンパク質、グリコペプチド類および他のペプチド誘導体の改善された製造方法が依然として必要とされている。
【非特許文献１】Ｂｅｌｉｇｅｒｅ，Ｇ．Ｓ．；Ｄａｗｓｏｎ，Ｐ．Ｅ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９９，１２１，６３３２−６３３３
【非特許文献２】Ｙａｎ，Ｌ．Ｚ．；Ｄａｗｓｏｎ，Ｐ．Ｅ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００１，１２３，５２６−５３３
【非特許文献３】Ｓａｘｏｎ，Ｅ．；Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｊ．Ｌ；Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｃ．Ｒ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２０００，２，２１４１−２１４３
【非特許文献４】Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｂ．Ｌ．；Ｋｉｅｓｓｌｉｎｇ，Ｌ．Ｌ．；Ｒａｉｎｅｓ，Ｒ．Ｔ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２０００，２，１９３９−１９４１
【非特許文献５】Ｃａｎｎｅ，Ｌ．Ｅ．；Ｂａｒｋ，Ｓ．Ｊ．；Ｋｅｎｔ，Ｓ．Ｂ．Ｈ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９６，１１８，５８９１−５８９６
【非特許文献６】Ｌｏｗ，Ｄ．Ｗ．；Ｈｉｌｌ，Ｍ．Ｇ．；Ｃａｒｒａｓｃｏ，Ｍ．Ｒ．；Ｋｅｎｔ，Ｓ．Ｂ．Ｈ．；Ｂｏｔｔｉ，Ｐ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ Ｕ．Ｓ．Ａ．２００１，９８，６５５４−６５５９
【非特許文献７】Ｏｆｆｅｒ，Ｊ．；Ｂｏｄｄｙ，Ｃ；Ｄａｗｓｏｎ，Ｐ．Ｅ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００２，１２４，４６４２−４６４６
【非特許文献８】Ｍａｃｍｉｌｌａｎ，Ｄ．；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｗ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００４，６，４６５９−４６６２
【非特許文献９】Ｌｕ，Ｙ．−Ａ．；Ｔａｒｎ，Ｊ．Ｐ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００５，７，５００３−５００６
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の実施形態は、Ｃ末端カルボキシルチオエステルを含むペプチドと、側鎖グリコシルがチオール基を含有する遊離Ｎ末端アミノ基を持つ側鎖グリコシルペプチドとの間にペプチド結合を形成する方法であって、水性媒体中で２種類の試薬を接触させ、チオエステル交換反応の工程によって形成されたチオエステルから、アシル基の分子内ＳからＮへのシフトを介してカップリングされた生成物を形成することを含む方法に関する。
【０００９】
本発明の実施形態は、式（Ｉ）：
【００１０】
【化４】
（式中、
ｍは、０〜約１０であり；
ｎは、１〜約４であり；
ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して各部位で、Ｈまたはアルキルであり、またはＲａとＲｂとが一緒になって、オキソ（＝Ｏ）であり；
ｐは、１、２または３であり；
Ｘは、ＯまたはＣＨＲ３であり；
各Ｒ３は、独立して各部位で、水素、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、ヒドロキシまたはヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり、任意のヒドロキシまたはヒドロキシアルキルは、単糖類、二糖類、オリゴ糖またはヒドロキシ保護基でＯ置換されていてよく；ただし、１個のＲ３は、−ＯＣ（＝Ｏ）（ＣＨ（ＲＳ））ｎＳＨまたは−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ（Ｒｓ））ｎＳＨ（式中、Ｒｓは、独立して各部位で、水素または（Ｃ１−Ｃ６）アルキル（（Ｃ１−Ｃ６）アルキルの任意の炭素原子は、Ｊで置換されていてよい）であり、ｓは１〜約６である）を含み；
Ｙは、Ｃ（Ｒ４Ｒ５）、Ｏ、ＮＨまたはＳであり；
Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたはＪであり；
ＸおよびＹを有する炭素原子は、ＲまたはＳ配置であり；
各ＮＲは、独立して、ＮＨまたはＮ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり、またはＮＲは、ＮＲを有する炭素原子に結合するＲｃまたはＲｅと一緒になって、４〜７員環を形成することができ、または、
各Ｒｃ、Ｒｃ’、ＲｅおよびＲｅ’は、独立して各部位で、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキルまたはヘテロシクリル、あるいはブロックされていないまたは保護基でブロックされている可能性のある天然アミノ酸の側鎖であり；あるいはＲｃおよびＲｃ’またはＲｅおよびＲｅ’、あるいは両方が、これらが結合する炭素原子と一緒になって、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；任意のアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキルまたはヘテロシクリルは、０〜３個のＪで置換され；
Ｊは、ハロゲン、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、（Ｃ１−６）アルキル、（Ｃ１−６）アルコキシ、シクロアルキル、カルボキシ；アセタミド、ヒドロキシ、ヒドロキシ（Ｃ１−６）アルキル、トリフルオロメトキシ、スルファモイル、カルバモイル、スルホンアミド、アルキルスルホニルまたはアリールスルホニルであり；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ペプチド残基またはグリコペプチド残基である）の化合物、およびその任意の立体異性体、互変異性体、溶媒和物、水和物、塩類を製造する方法であって、
式（ＩＩ）：
【００１１】
【化５】
の化合物を、式（ＩＩＩ）：
【００１２】
【化６】
（式中、Ｒｄは、アルキル、アリール、アラルキル、カルボキシアルキルまたはカルボサアミドアルキルである）の化合物と接触させ、式（Ｉ）の化合物を得ることを含む方法に関する。
【００１３】
本発明の方法は、より大きなペプチド類、タンパク質およびそれらの誘導体の製造に大きな利点を提供する。化学的技術を使用しても、または生物学的技術を使用しても、製造することが困難な可能性のある大ペプチド類およびタンパク質は、医薬における治療用途および診断用途に非常に重大なものである。大ペプチド類およびタンパク質の合成のための生物学的技術は、一般的に、必須アミノ酸類に大きく限定され、特定の誘導体は、最終生成物の反応によって得ることが困難である。したがって、非天然アミノ酸類を含む、または側鎖に結合する非アミノ酸基を有するなどの大ペプチド類およびタンパク質の製造を可能にする化学的アプローチに汎用性を持たせることは、有利なことである。しかし、固相技術を使用する化学的合成は、まだ、非天然アミノ酸類および他の誘導体を含有しうる、より小さなペプチド類に大きく制限される。したがって、これらのより小さなペプチド類からより大きなペプチド類をアセンブリする効率的な技術が必要である。本発明は、効率的なセグメント連結反応アプローチによって、高収率および良好な純度で、より小さなペプチド類からより大きなものへのアセンブリを可能にする技術を提供する。さらに、ポリペプチド類の化学的合成で典型的に使用されるのは過酷な脱保護条件なので、適切な折りたたみおよび配座の達成において最終生成物を補助することができる、アミノ酸側鎖に保護基を有することを必要とせず、ペプチド類の使用を大いに可能にする本発明の方法は、最終生成物を変性する働きをすることができる。
【００１４】
本発明の方法は、連結反応部位でシステイン残基を必要としない、グリコペプチド類および糖タンパク質の合成において使用され、本発明の化学的合成方法の殆どはこれに頼る。これは、水溶液中で２種の保護されていないペプチド類の選択的連結反応を可能にし、より大きなグリコペプチドを与える。さらに、骨格をさらに複雑なグリコペプチド構造とし、その糖部分をさらに酵素方法により合成し、より複雑な糖タンパク質のグリコペプチドとすることもできる。
【００１５】
あるいは、変性糖部分を化学的方法または生物学的手段により除去し、脱グリコシル化されたペプチド類およびタンパク質を提供することもできる。
【００１６】
生成物のチオール基は除去され、グリコシルペプチドまたはアセタミドグリコシルペプチドを提供することができる。したがって、本発明の実施形態は、本発明の方法であって、さらに、式（Ｉ）（式中、Ｗは、ＯまたはＮＨである）の化合物を、触媒の存在下水素源と接触させることによって、式（Ｉ）の化合物を脱硫することを含む方法に関する。チオール基は還元除去され、アセタミドグリコシルペプチドを得る。
【００１７】
本発明の他の実施形態は、本発明の方法であって、さらに、式（Ｉ）（式中、ＷはＯである）の化合物を、ヒドラジンまたはアルカリ溶液と接触させることによって、該化合物を脱硫することを含む方法に関する。チオアセチルエステル基は、アルカリ条件によって切断され、先にチオアセテートを有している位置で、保護されていないヒドロキシル基を得、グリコシルペプチドを得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
定義
本発明のある請求項ならびに構造および式を伴って示される実施例について詳細に述べる。本発明を、列挙された請求項に関連して説明するが、本発明は、これらの請求項に限定されないことは理解すべきである。対して、本発明は、請求項によって定義された本発明の範囲内に含有されうる、全ての代替、修飾および等価物を包含するものである。
【００１９】
明細書中の「一実施形態」、「実施形態」、「好ましい実施形態」などについては、記載された実施形態が、ある特定の機能、構造、または特徴を有しうることを示すが、全ての実施形態において、その特定の機能、構造、または特徴を有する必要はない。さらに、該語句は、同じ実施形態に関する必要はない。また、ある特定の機能、構造または特徴が、実施形態に関連して記載されている場合、明記されている、いないに関係なく、他の実施形態に関連して、そのような機能、構造または特徴に影響を及ぼすことは、当業者の知識の範囲内であることは甘受される。
【００２０】
用語「アミノ酸」は、リボソームアミノ酸類（たとえば、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＶａｌ）を含む。ただし、これらはそれぞれ、ＤまたはＬ型であってよく、および非リボソームアミノ酸類以外の天然アミノ酸（たとえば、ホスホセリン、ホスホトレオニン、ホスホチロシン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシン、ガンマ−カルボキシグルタメート；馬尿酸、オクタヒドロインドール−２−カルボン酸、スタチン、１，２，３，４，−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、ペニシラミン、オルニチン、シトルリン、α−メチル−アラニン、パラ−ベンゾイルフェニルアラニン、フェニルグリシン、プロパルギルグリシン、サルコシンおよびｔｅｒｔ−ブチルグリシン）であってよい。さらに、該用語は、自然界では見られないα−アミノ酸、たとえば、フルオロ置換アミノ酸類およびアミノ基がカルボキシル基に関してα関係でないアミノ酸類、たとえば、β−、γ−およびδ−アミノ酸類も包含する。
【００２１】
また、用語「アミノ酸」は、常套のアミノ保護基（たとえば、アセチルまたはベンジルオキシカルボニル）を有する天然および非天然アミノ酸類、およびカルボキシ末端で保護された天然および非天然アミノ酸類（たとえば、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、フェニルまたはベンジルエステルまたはアミドとして；またはα−メチルベンジルアミドとして）、およびカルボキシル、カルボキサミド、アミノ、グアニド、チオ、ヒドロキシルおよび保護基を有する他の基などの側鎖を持つアミノ酸類も含む。これらのタイプの全ての追加の適切な保護基は、当業者に公知である（たとえば、Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．；Ｗｕｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｐｒｏｔｅｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ Ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第二編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）、およびこれらに列挙された参考例を参照）。
【００２２】
本明細書で使用される用語「アミノ酸側鎖」は、アミノ酸のカルボン酸（ＣＯＯＨ）基以外のアミノ酸の炭素原子に結合する１価のラジカルを言う。本発明の特定の実施形態では、用語「アミノ酸側鎖」は、リボソームα−アミノ酸の以下の構造に例示されるように、基Ｒを言うことができる。
【００２３】
【化７】
（式中、Ｒはメチル（Ａｌａ）；Ｒは３−グアニドプロピル（Ａｒｇ）；Ｒはカルボキサミドメチル（Ａｓｎ）；Ｒはカルボキシメチル（Ａｓｐ）；Ｒはチオールメチル（Ｃｙｓ）；Ｒはカルボキシエチル（Ｇｌｕ）；Ｒはカルボキサミドエチル（Ｇｌｎ）；Ｒは水素（Ｇｌｙ）；Ｒは（４−イミダゾリル）メチル（Ｈｉｓ）；Ｒはイソブチル（Ｉｌｅ）；Ｒはｓｅｃ−ブチル（Ｌｅｕ）；Ｒは４−アミノブチル（Ｌｙｓ）；Ｒは２−（メチルチオ）エチル（Ｍｅｔ）；Ｒはベンジル（Ｐｈｅ）；Ｒはヒドロキシメチル（Ｓｅｒ）；Ｒは１−ヒドロキシエチル（Ｔｈｒ）；Ｒは３−インドリルメチル（Ｔｒｐ）；Ｒはｐ−ヒドロキシベンジル（Ｔｙｒ）；およびＲはイソプロピル（Ｖａｌ）である）。追加の炭素原子が、アミノ酸のカルボキシル基とアミノ基との間に存在してもよく、Ｒ基は、それらの任意の炭素原子上の残基であってもよいことは理解される。α−アミノ酸において、構造は先に示したが、「アミノ酸側鎖」は、β−、γ−またはδ−アミノ酸のカルボキシル炭素以外の炭素原子上に配置されていてよい。
【００２４】
用語「ペプチド」は、アミノ酸類がアミド（ペプチド）結合によって順次結合した２個以上のアミノ酸類の配列（たとえば、先に記載したように）を言う。配列は、直線でも環状でもよい。配列が環状の場合、ペプチドは、さらに、アミノ酸に結合する他の結合タイプ、たとえば、エステル結合（デプシペプチド）またはジスルフィド結合を含んでよい。たとえば、環状ペプチドは、ある配列中の２個のシステイン残基の間にジスルフィド架橋を形成することによって製造することができ、またはその結果得られるものであってよい。本明細書で具体的に挙げるペプチド配列は、左側がアミノまたはＮ−末端、右側がカルボキシまたはＣ末端として記載されている。
【００２５】
「ペプチド残基」は、アミノ酸類の配列、すなわち、アミド結合によって結合しているアミノ酸類を言い、これは、Ｎ末端およびＣ末端は、必ずしも遊離した形態である必要はなく、さらに、追加のアミノ酸または他のラジカルに結合していてよい。したがって、単一のペプチドは、本明細書で定義する、大きな一組の可能性のあるペプチド残基を含有してよい。
【００２６】
本明細書で使用する用語「炭水化物」は、糖類として通常知られている化合物、および糖に化学的に関連のある化合物のクラスを含む。したがって、該用語は、単一の単糖類、二糖類および高分子物質を含む。該用語は、糖類、デンプン類、ガム類、セルロースおよびヘミセルロースを含む化合物群を包含する。さらに、該用語は、糖誘導体、たとえば、２−アミノ−２−デオキシグルコースのようなアミノ糖類、およびそれらのオリゴマーおよびポリマー、硫酸化糖類；およびヒドロキシル、アミノ、および保護基を有する他の基を持つ糖類も包含する。
【００２７】
本明細書で定義する炭水化物は、ベータ（β）またはアルファ（α）アノマー立体化学を持つ糖類または糖誘導体を含み；さらに該糖類は、（Ｒ）または（Ｓ）相対配置を有することができ、（＋）または（−）異性体として存在することができ、ＤまたはＬ配置で存在することができる。用語「アノマー」または「アノマーの」は、当該分野で周知のように、アセタール、ヘミアセタールまたはケタール炭素原子での立体化学的配置を言う。
【００２８】
用語「グリコペプチド」は、炭水化物に共有結合するペプチドを言う。典型的には、炭水化物は、ヒドロキシル、アミノ、アミド、またはカルボキシル基を含むアミノ酸側鎖を介して結合する。炭水化物は、アノマーヒドロキシル基を介して、他のヒドロキシル基を介して、アミノ基を介して、あるいは他の官能基を介して、炭水化物部分に結合してよい。
【００２９】
「アルキル」は、第一級、第二級、第三級または環状炭素原子を含有するＣ１〜約Ｃ１８炭化水素を言う。例示として、メチル（Ｍｅ，−ＣＨ３）、エチル（Ｅｔ，−ＣＨ２ＣＨ３）、１−プロピル（ｎ−Ｐｒ，ｎ−プロピル，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−プロピル（ｉ−Ｐｒ，ｉ−プロピル，−ＣＨ（ＣＨ３）２）、１−ブチル（ｎ−Ｂｕ，ｎ−ブチル，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−メチル−１−プロピル（ｉ−Ｂｕ，ｉ−ブチル，−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）、２−ブチル（ｓ−Ｂｕ，ｓ−ブチル，−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）、２−メチル−２−プロピル（ｔ−Ｂｕ，ｔ−ブチル，−Ｃ（ＣＨ３）３）などがある。アルキルは、先に記載し例示したように、単一ラジカルに結合することができる１価のラジカル、あるいは２個の異なる１価のラジカルまたは単一の２価のラジカルに結合することができる２価のラジカルであってよい。
【００３０】
アルキルは、場合によっては、１個以上のアルキル、アルケニル、アルキリデニル、アルケニリデニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、アセタミド、アセトキシ、アセチル、ベンズアミド、ベンゼンスルフィニル、ベンゼンスルホンアミド、ベンゼンスルホニル、ベンゼンスルホニルアミノ、ベンゾイル、ベンゾイルアミノ、ベンゾイルオキシ、ベンジル、ベンジルオキシ、ベンジルオキシカルボニル、ベンジルチオ、カルバモイル、カルバメート、イソシアナト、スルファモイル、スルフィナモイル、スルフィノ、スルホ、スルホアミノ、チオスルホ、ＮＲｘＲｙおよび／またはＣＯＯＲｘ（式中、ＲｘおよびＲｙは、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ環、シクロアルキルまたはヒドロキシである）で置換されうる。アルキルは、場合によっては、１個以上の非パーオキシドオキシ（−Ｏ−）、チオ（−Ｓ−）、イミノ（−Ｎ（Ｈ）−）、メチレンジオキシ（−ＯＣＨ２Ｏ−）、カルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）、カルボキシ（−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−）、カルボニルジオキシ（−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−）、カルボキシレート（−ＯＣ（＝Ｏ）−）、イミン（Ｃ＝ＮＨ）、スルフィニル（ＳＯ）またはスルホニル（ＳＯ２）で分断されうる。さらに、アルキルは、場合によっては、少なくとも部分的に不飽和で、それによってアルケニルを提供することができる。
【００３１】
用語「アリール」は、単環（たとえば、フェニル）または複数の縮合環を有する６〜約２０個の炭素原子の不飽和芳香族炭素環基であって、少なくとも１個の環は芳香族（たとえば、ナフチル、ジヒドロフェナントレニル、フルオレニルまたはアントリル）である基を言う。好ましいアリールとして、フェニル、ナフチルなどが挙げられる。
【００３２】
アリールは、場合によっては、１個以上のアルキル、アルケニル、アルキリデニル、アルケニリデニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、アセタミド、アセトキシ、アセチル、ベンズアミド、ベンゼンスルフィニル、ベンゼンスルホンアミド、ベンゼンスルホニル、ベンゼンスルホニルアミノ、ベンゾイル、ベンゾイルアミノ、ベンゾイルオキシ、ベンジル、ベンジルオキシ、ベンジルオキシカルボニル、ベンジルチオ、カルバモイル、カルバメート、イソシアナト、スルファモイル、スルフィナモイル、スルフィノ、スルホ、スルホアミノ、チオスルホ、ＮＲｘＲｙおよび／またはＣＯＯＲｘ（式中、ＲｘおよびＲｙは、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ環、シクロアルキルまたはヒドロキシである）で置換されうる。
【００３３】
用語「シクロアルキル」は、単一の環または複数の縮合環、たとえば、ビシクロ、トリシクロ、またはそれ以上のポリシクロ部分を有する３〜２０個の炭素原子の環状アルキル基を言う。そのようなシクロアルキル基として、たとえば、単環構造、たとえば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロオクチルなど、または複数の環構造、たとえば、アダマンタニル、ピナン類のようなビシクロ構造体などが挙げられる。
【００３４】
シクロアルキルは、場合によっては、１個以上のアルキル、アルケニル、アルキリデニル、アルケニリデニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、アセタミド、アセトキシ、アセチル、ベンズアミド、ベンゼンスルフィニル、ベンゼンスルホンアミド、ベンゼンスルホニル、ベンゼンスルホニルアミノ、ベンゾイル、ベンゾイルアミノ、ベンゾイルオキシ、ベンジル、ベンジルオキシ、ベンジルオキシカルボニル、ベンジルチオ、カルバモイル、カルバメート、イソシアナト、スルファモイル、スルフィナモイル、スルフィノ、スルホ、スルホアミノ、チオスルホ、ＮＲｘＲｙおよび／またはＣＯＯＲｘ（式中、ＲｘおよびＲｙは、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ環、シクロアルキルまたはヒドロキシである）で置換されうる。
【００３５】
シクロアルキルは、場合によっては、少なくとも部分的に不飽和で、それによりシクロアルケニルを提供しうる。
【００３６】
用語「ヘテロシクロアルキル」は、環炭素原子の１個以上が、ヘテロ原子、たとえば、酸素、窒素、リンまたはイオウによって置き換えられたシクロアルキル基を言う。該用語は、２個以上の炭素原子が置き換えられ、各原子が異なるタイプのヘテロ原子で置き換えられた構造も包含する。
【００３７】
用語「ヘテロアリール」は、本明細書では、１、２または３個の芳香族環を含み、芳香族環中に少なくとも１個の窒素、酸素またはイオウ原子を含む単環、二環または三環の環系であって、置換されていなくても置換されていてもよい環系と定義される。ヘテロアリール基の例として、２Ｈ−ピロリル、３Ｈ−インドリル、４Ｈ−キノリジニル、４ｎＨ−カルバゾリル、アクリジニル、ベンゾ［ｂ］チエニル、ベンゾチアゾリル、β−カルボリニル、カルバゾリル、クロメニル、シンナオリニル（ｃｉｎｎａｏｌｉｎｙｌ）、ジベンゾ［ｂ，ｄ］フラニル、フラザニル、フリル、イミダゾリル、イミジゾリル、インダゾリル、インドリシニル（ｉｎｄｏｌｉｓｉｎｙｌ）、インドリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、ナフチリジニル、ナフト［２，３−ｂ］、オキサゾリル、ペリミジニル、フェナンチリジニル、フェナントロリニル、フェナルサジニル（ｐｈｅｎａｒｓａｚｉｎｙｌ）、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサチイニル、フェノキサジニル、フタラジニル、プテリジニル、プリニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピリミジニル、ピロリル、キナゾリニル、キノリル、キノキサリニル、チアジアゾリル、チアントレニル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリルおよびキサンテニルが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、用語「ヘテロアリール」は、炭素、およびパーオキシドではない酸素、イオウおよびＮ（Ｚ）（式中、Ｚは存在しない、あるいはΗ、Ｏ、アルキル、フェニルまたはベンジルである）の群から独立して選択される１、２、３または４個のヘテロ原子を含む５または６個の環原子を含む単環芳香族環を示す。別の実施形態では、ヘテロアリールは、約８〜１０個の環原子のオルソ−縮合二環式ヘテロ環、特にベンズ誘導体またはプロピレンまたはテトラメチレンジラジカルをベンズ誘導体に縮合することによって誘導されるものを示す。
【００３８】
ヘテロアリールは、場合によっては、１個以上のアルキル、アルケニル、アルキリデニル、アルケニリデニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、アセタミド、アセトキシ、アセチル、ベンズアミド、ベンゼンスルフィニル、ベンゼンスルホンアミド、ベンゼンスルホニル、ベンゼンスルホニルアミノ、ベンゾイル、ベンゾイルアミノ、ベンゾイルオキシ、ベンジル、ベンジルオキシ、ベンジルオキシカルボニル、ベンジルチオ、カルバモイル、カルバメート、イソシアナト、スルファモイル、スルフィンアモイル、スルフィノ、スルホ、スルホアミノ、チオスルホ、ＮＲｘＲｙおよび／またはＣＯＯＲｘ（式中、ＲｘおよびＲｙは、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ環、シクロアルキルまたはヒドロキシである）で置換されうる。
【００３９】
本明細書で使用される「ラジカル」は、任意の原子組成の分子構造単位を言う。「１価のラジカル」は、１個の分子に１個の共有結合を形成しうる、１非充填原子価を持つ分子構造単位である。「２価のラジカル」は、２個の分子全体のそれぞれに１個の共有結合を形成しうる、または１個の分子全体に共有二重結合を形成する、２非充填原子価を持つ構造単位である。ラジカルは、１個の原子でもよく、非常に複雑な多原子構造であってよい。
【００４０】
用語「アミノ」は、−ＮＨ２を言い、用語「アルキルアミノ」は、−ＮＲ２（式中、少なくとも１個のＲはアルキルであり、第２のＲは、アルキルまたは水素である）を言う。用語「アシルアミノ」は、ＲＣ（＝Ｏ）Ｎ（式中、Ｒは、アルキルまたはアリールである）を言う。
【００４１】
用語「カルボキシ」または「カルボキシル」は、１価のラジカル：−ＣＯ２Ｈまたは−ＣＯ２Ｍ（式中、Ｍは、カチオンであり、−ＣＯ２部分は、負の電荷を帯びる）を言い、どちらの基も、置換基に対する単結合の形成により充填される１個の追加の原子価を持つ。Ｃ（＝Ｏ）ラジカルは、「カルボニル」と言われ、２個の別々の置換基への単結合によって、または１個の置換基に二重結合によって充填される、２原子価を持つ、２価のラジカルである。
【００４２】
用語「チオール」または「メルカプト」は、１価のラジカル：−ＳＨを言う。充填されていない１価に関して、１個の置換基に結合しうる。
【００４３】
本明細書で使用される用語「ヒドロキシル」または「ヒドロキシ」は、典型的には炭素原子に結合する１価の−ＯＨラジカルを言うが、該用語は、ヘテロ原子に結合する−ＯＨ基も包含する。「ヒドロキシル保護基」は、−ＯＨ基の水素原子を置き換え、ある条件下で、該基の反応性をより低く、あるいは反応性をなくすようにしうるような任意の基を言う。たとえば、Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．；Ｗｕｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ Ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）およびその引用文献を参照のこと。したがって、本明細書で使用される「ヒドロキシル保護基」は、アセテート類およびベンゾエート類などのエステル類、炭酸メチルなどの炭酸エステル類、ジメチルアミノカルバメートなどのウレタン類、テトラヒドロピラニルエーテルおよびメトキシメチルエーテルなどのアセタール類、ｐ−トルエンスルホニルエステルなどのスルホネートエステル類、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルエーテルなどのシリルエーテル類を包含する。
【００４４】
本明細書で使用される用語「オキソ」またはオキソ基」は、式：＝Ｏの２価のラジカルであって、１個の酸素原子は、共有二重結合を介して、他の原子と結合するラジカルを言う。オキソ基が炭素原子に結合する場合、該基は、カルボニルラジカルである。
【００４５】
本発明による、炭水化物補助グリコペプチド連結反応（「糖補助連結反応（ＳＡＬ）」）は、ペプチドのアミノ酸側鎖に共有結合し、該ペプチドと、Ｃ末端チオエステル基を有する他のペプチドとをカップリングさせるチオール含有炭水化物部分の使用を含む。本明細書で記載するように、アミノ酸残基に共有結合する糖部分は、メルカプトアセテートまたはメルカプトアセタミドなどのチオール含有部分を含有し、これは、ペプチドチオエステル試薬でチオエステルを形成し、内部チオエステルは、次いで、分子内ＳからＮへのアシル移動を起こす。好ましい実施形態では、カップリング反応は、水溶液中で行われ、多くの場合、アミノ酸側鎖保護基を使用することなく行われうる。また、炭水化物ヒドロキシル基は、保護されていない形態で存在してもよい。「ネイティブケミカルライゲーション（ＮＣＬ）」は、ペプチドチオエステルとＮ末端アミノ酸がシステインであるペプチドとの間で行うことができ、チオエステル結合は、最初、システインで形成され、次いで分子内ＳからＮへのアシル移動が行われる。
【００４６】
炭水化物チオール基の指向効果により得られる高カップリング収率は、本発明の特筆すべき機能である。これは、フラグメント連結反応方法を、既存の技術と関連させて使用する場合、高分子量ペプチド類の製造を簡単にする。
【００４７】
明らかに、本発明の数多くの修飾および変形が、前記技術に照らして可能である。したがって、本明細書での具体的な記載によりというより、添付の請求項の範囲内で、本発明を実施することができることが理解されよう。
【００４８】
以下に示す特定の範囲、値および実施形態は、説明目的のためだけに記載したものであり、請求項によって定義される本発明の範囲を限定するものではない。
【００４９】
特定の範囲、値および実施形態
本発明の実施形態は、式（Ｉ）：
【００５０】
【化８】
（式中、
ｍは、０〜約１０であり；
ｎは、１〜約４であり；
ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して各部位で、Ｈまたはアルキルであり、またはＲａとＲｂとが一緒になって、オキソ（＝Ｏ）であり；
ｐは、１、２または３であり；
Ｘは、ＯまたはＣＨＲ３であり；
各Ｒ３は、独立して各部位で、水素、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、ヒドロキシまたはヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり、任意のヒドロキシまたはヒドロキシアルキルは、単糖類、二糖類、オリゴ糖またはヒドロキシ保護基でＯ置換されていてよく；ただし、１個のＲ３は、−ＯＣ（＝Ｏ）（ＣＨ（ＲＳ））ｎＳＨまたは−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ（Ｒｓ））ｎＳＨ（式中、Ｒｓは、独立して各部位で、水素または（Ｃ１−Ｃ６）アルキル（（Ｃ１−Ｃ６）アルキルの任意の炭素原子は、Ｊで置換されてもよい）であり、ｓは１〜約６である）を含み；
Ｙは、Ｃ（Ｒ４Ｒ５）、Ｏ、ＮＨまたはＳであり；
Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたはＪであり；
ＸおよびＹを有する炭素原子は、ＲまたはＳ配置であり；
各ＮＲは、独立して、ＮＨまたはＮ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり、またはＮＲは、ＮＲを有する炭素原子に結合するＲｃまたはＲｅと一緒になって、４〜７員環を形成することができ、または、
各Ｒｃ、Ｒｃ’、ＲｅおよびＲｅ’は、独立して各部位で、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキルまたはヘテロシクリル、あるいはブロックされていないまたは保護基でブロックされている可能性のある天然アミノ酸の側鎖であり；あるいはＲｃおよびＲｃ’またはＲｅおよびＲｅ’、あるいは両方が、これらが結合する炭素原子と一緒になって、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；任意のアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキルまたはヘテロシクリルは、０〜３個のＪで置換され；
Ｊは、ハロゲン、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、（Ｃ１−６）アルキル、（Ｃ１−６）アルコキシ、シクロアルキル、カルボキシ；アセタミド、ヒドロキシ、ヒドロキシ（Ｃ１−６）アルキル、トリフルオロメトキシ、スルファモイル、カルバモイル、スルホンアミド、アルキルスルホニルまたはアリールスルホニルであり；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ペプチド残基またはグリコペプチド残基である）の化合物、およびその任意の立体異性体、互変異性体、溶媒和物、水和物、塩類を製造する方法であって、
式（ＩＩ）：
【００５１】
【化９】
の化合物を、式（ＩＩＩ）：
【００５２】
【化１０】
（式中、Ｒｄは、アルキル、アリール、アラルキル、カルボキシアルキルまたはカルボキサミドアルキルである）の化合物と接触させ、式（Ｉ）の化合物を得ることを含む方法に関する。
【００５３】
式（Ｉ）の化合物に関しては以下の通りである。
【００５４】
ｍの具体的な値は、１、２、３、４、５または６である。
【００５５】
ｎの具体的な値は、１、２または３である。
【００５６】
ｐの具体的な値は、１または２である。
【００５７】
Ｒａの具体的な値は、Ｈ、またはメチルである。
【００５８】
Ｒｂの具体的な値は、Ｈである。
【００５９】
各Ｒ３の具体的な値は、ＯＨである。
【００６０】
Ｗの具体的な値は、ＮＨまたはＯである。
【００６１】
Ｘの具体的な値は、Ｏである。
【００６２】
Ｙの具体的な値は、Ｏである。
【００６３】
Ｒｃの具体的な値は、アミノ酸側鎖である。Ｒｃの別の具体的な値は、Ｈ、メチルまたは（４−イミダゾリル）−メチルである。
【００６４】
Ｒｃの具体的な値は、アミノ酸側鎖である。別の具体的な値は、Ｈである。
【００６５】
各Ｒの具体的な値は、Ｈである。
【００６６】
ＲとＲｃとが一緒になった別の具体的な値は、ピロリジン環である。
【００６７】
Ｒ１の具体的な値は、Ｎ−アセチル−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号：１は、非修飾アミノ酸類に相当する）である。
【００６８】
Ｒ２の具体的な値は、フェニルアラニンアミドである。別の具体的な値は、Ｐ−Ｙ−Ｇ−Ｓ−ＮＨ２（配列番号：２は、非修飾アミノ酸類に相当する）である。
【００６９】
式（ＩＩ）の化合物に関しては以下の通りである。
【００７０】
ｍの具体的な値は、１、２、３、４、５または６である。
【００７１】
ｎの具体的な値は、１、２または３である。
【００７２】
ｐの具体的な値は、１または２である。
【００７３】
Ｒａの具体的な値は、Ｈまたはメチルである。
【００７４】
Ｒｂの具体的な値は、Ｈである。
【００７５】
各Ｒ３の具体的な値は、ＯＨである。
【００７６】
Ｗの具体的な値は、ＮＨまたはＯである。
【００７７】
Ｘの具体的な値の具体的な値は、Ｏである。
【００７８】
Ｙの具体的な値は、Ｏである。
【００７９】
Ｒｃの具体的な値は、アミノ酸側鎖である。Ｒｃの別の具体的な値は、Ｈ、メチルまたは（４−イミダゾリル）−メチルである。
【００８０】
Ｒｃの具体的な値は、アミノ酸側鎖である。別の具体的な値は、Ｈである。
【００８１】
各Ｒの具体的な値は、Ｈである。
【００８２】
ＲとＲｃとが一緒になった別の具体的な値は、ピロリジン環である。
【００８３】
Ｒ１の具体的な値は、Ｎ−アセチル−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号；１は、非修飾アミノ酸類に相当する）である。
【００８４】
Ｒ２の具体的な値は、フェニルアラニンアミドである。別の具体的な値は、Ｐ−Ｙ−Ｇ−Ｓ−ＮＨ２（配列番号：２は、非修飾アミノ酸類に相当する）である。
【００８５】
式（ＩＩＩ）の化合物に関しては、以下の通りである。
【００８６】
Ｒ１の具体的な値は、Ｎ−アセチル−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａである。
【００８７】
Ｒｄの具体的な値は、フェニルまたは−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ２である。
【００８８】
詳細な記載
図１を参照すると、本発明の実施形態による合成スキームが示されている。生成物のＮ末端セグメントを形成する「ペプチド１」と言うペプチドを、アミド（ペプチド）結合形成のためのセグメントを活性化する働きをするＣ末端カルボキシチオエステルで製造する。ペプチド１は、場合によっては、そのＮ末端を、たとえば、Ｎ−アセチル基で保護してもよく、あるいは遊離アミノ基を有してもよい。そうでなければ、システイン残基が配列中に存在する場合を除いて、側鎖部分をブロックまたは保護する必要はない。リシンの場合のように遊離アミノ基、チロシン、セリンおよびスレオニンの場合のように遊離ヒドロキシル基、アルギニンの場合のように遊離グアニド基、アスパルテートまたはグルタメートの場合のように遊離のカルボキシル基、ならびにアスパラギンおよびグルタミンの場合のように遊離カルボキサミド基を含む側鎖が、カップリング反応の間、保護されていない形態で存在してもよい。しかし、システイン残基は、たとえば、アセタミドメチルまたはｔｅｒｔ−ブチル誘導体として、カップリング反応中、ブロックすることができる。
【００８９】
本発明の方法において反応体として使用するためのペプチド１チオエステルを製造するために、Ｃ末端カルボキシル基を、任意の適切な方法を使用して、チオエステルの形態で得てもよい。Ｃ末端チオエステル基は、公知の固相ペプチド合成手法を使用して得るのが好ましく、該手法では、アンカーポリマーを、アセンブルされたペプチドを該ポリマーから最終除去する際、望ましいチオエステルが得られる基で誘導体化する。最終的にチオエステルが得られる基は、ペプチド１の固相合成の前に、前記ポリマーとカップリングさせる。たとえば、３−（トリチルチオ）プロピオネート残基を該ポリマーに結合することによって、β−メルカプトプロピオニル基を、ｐ−メチルベンズホドリルアミン−（ＭＢＨＡ）置換ポリスチレンなどのポリマーにプレロードし、次いで酸を持つＳ−トリチル基を除去することができる。３−（トリチルチオ）プロピオニル残基がプレロードされたＭＢＨＡ樹脂は、たとえば、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（登録商標）カタログ番号０１−６４−０４４９として、市販されている。次いで、ペプチドの残りを合成し、その後、側鎖の脱ブロックおよび所望の場合α−アミノ基の脱ブロックとなる条件で、該樹脂から切断し、β−メルカプトプロピオンアミドチオエステルとして、Ｃ末端カルボキシル基を持つペプチド１を得る。
【００９０】
図１において、「ペプチド２」として示されているペプチドセグメントは、カップリングされたグリコペプチドのＣ末端部分を形成する。ペプチド２は、炭水化物部分を共有結合する側鎖を有するアミノ酸を含む。ペプチド２は、本発明の方法によって、ペプチド１のカルボキシルチオエステルとカップリングするα−アミノ基を含む。好ましい実施形態では、炭水化物部分は、ペプチド２に共有結合する２−アミノ−２−デオキシグルコース基を含み、ここでは、糖類の２−アミノ基が、メルカプトアセテート基に共有結合している。結合チオール基を持つ炭水化物部分は、セリン側鎖のヒドロキシル基を持つグルコシド結合を介してペプチドに結合するのが好ましい。あるいは、本発明の原理を逸脱しなければ、炭水化物部分は、スレオニン側鎖のヒドロキシル基を介して、あるいは、たとえば、アスパラギン残基のように、アミノ基、カルボキシル基またはカルボキサミド基を含む側鎖を介して、ペプチド２に結合してもよい。同様に、炭水化物部分を、チオール基を用いて、２−アミノ−２−デオキシグルコースのメルカプトアセタミドの形成以外の方法で得てもよい。たとえば、チオール基を、糖ヒドロキシル基のメルカプトアセテートエステルとして、炭水化物部分に結合することができる。
【００９１】
炭水化物部分とアミノ酸側鎖との間の結合は、炭水化物部分のβ−アノマー配置の結合を含んでもよいことは理解される。しかし、アミノ酸側鎖と炭水化物部分との間の結合は、α−アノマー配置であってもよい。
【００９２】
図１に示すように、新しいペプチド結合を形成するカップリングが起こるメカニズムは、ペプチド１のカルボキシルチオエステルが交換され、ペプチド２の炭水化物部分を持つチオール基を有する、ペプチド１の新しいカルボキシルチオエステルが形成された中間体を介することが考えられる。図１の第２分子構造として示されているように、ペプチド１のβ−チオプロピオンアミド基は、炭水化物チオール基によって置き換えられ、結合チオエステル中間体を得る。このようなチオエステル中間体が存在するという証拠は、少なくともペプチド１のＣ末端残基がバリンである場合、実施例２８にて提供される。実施例２３に示すように、カップリング反応に関し、ペプチド１のＣ末端アミノ酸残基がバリンである場合の半減期は、Ｃ末端アミノ酸残基がグリシン、アラニンまたはヒスチジンである場合と比べて、実質的に大きい。実施例２８において、質量スペクトル分析は、バリンの場合、ペプチド１と炭水化物部分のチオール基との間にチオエステル結合が存在することを示し、一方、Ｃ末端アミノ酸がグリシン、アラニンまたはヒスチジンの場合、観察された生成物は、アミド結合が形成されたカップリングされたペプチド生成物を含むことを示す。したがって、このタイプの中間体が他のカップリング反応で存在する場合があり、そこでは、中間体チオエステルが、自発的に、該反応条件で、図１の第３構造体として示されるカップリング生成物に移行すると考えられる。しかし、本発明の原理を逸脱しない限り、反応のメカニズムは、本明細書で理論化しているものと異なってもよい。
【００９３】
図１で第３構造体として示される最終カップリング生成物は、本発明のカップリング反応によって得られた、ペプチド１とペプチド２との間で新しく形成されたアミド結合を示す。該カップリング反応は、弱アルカリ水溶液中で行うのが好ましく、ｐＨは約８．５が好ましいが、本発明の原理を逸脱しない限り、他のｐＨを使用してもよい。約０．２Ｍのリン酸緩衝液を、該水溶液を約ｐＨ８．５で緩衝処理するために使用するのが好ましい。追加の試薬は、水溶液に加えるのが好ましく、たとえば、グアニジンを約６Ｍの濃度で加えてもよい。また、反応体中のチオール基の酸化を最小限にするために、チオフェノール、ベンジルメルカプタンまたは２−メルカプトエタンスルホネートなどのチオール試薬を加えるのも好ましい。カップリング反応は、不活性雰囲気下、酸素の不存在下で行うのが好ましい。
【００９４】
カップリング反応は、約３７℃で行うのが好ましく、該温度で、半減期は、典型的には、数時間〜約１０時間の範囲である。反応の半減期は、ペプチド１のＣ末端アミノ酸残基の同一性に依存する。実施例２３に示すように、その位置に立体的により嵩高い側鎖を有するアミノ酸は、反応速度が遅く、したがってカップリング反応の半減期は延びる。
【００９５】
カップリング反応の進行は、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を使用して、簡単にモニタリングされる。例示が実施例２３および２５にて提供される。また、結合生成物は、分取スケールＨＰＬＣを使用することによって簡単に精製される。実施例２３では、反応は、３７℃で約１２時間後に止まり、収率７６％の精製されたカップリングされたグリコペプチドが、分取ＨＰＬＣにより単離された。ＨＰＬＣ後に得られた生成物の純度は、９０％を越えていた。
【００９６】
カップリングされたグリコペプチド生成物を、好ましくは精製された形態で得ると、脱硫してもよいが、本発明の原理を逸脱しない限り、依然としてチオール基を含むカップリングされたグリコペプチド生成物を、他の方法で使用または転移させてもよい。図１に示す最終変換において示されているグリコペプチド生成物を脱硫するために、該生成物を、チオール基のイオウ原子が水素原子に置き換えられるような還元条件に曝す。好ましいメルカプトアセチル基は、図１の第４構造体に示されるように、アセチル基に還元的に変換される。脱硫反応を行う好ましい方法は、チオール含有グリコペプチドを、金属触媒の存在下で水素源に曝すことである。好ましい水素源は水素ガスである。別の好ましい水素源は、ホウ化水素ナトリウムなどのホウ化水素塩である。触媒は、水素化反応に使用される任意の適切な触媒、たとえば、パラジウム、白金またはロジウムなどの貴金属触媒、またはラネーニッケルなどのニッケル触媒であってよい。
【００９７】
脱硫反応は、任意の適切な溶媒中で行ってよいが、水性媒体を使用するのが好ましい。水性媒体は、そのｐＨで約０．１Ｍのリン酸緩衝液を用いて緩衝化された、ｐＨ約５．８の僅かな酸性が好ましい。パラジウムなどの貴金属触媒を用いる場合は、反応が実質的に完了するまで、典型的には数時間、反応混合物を大気圧程度で水素ガス下に保つ。再び、反応は、ＨＰＬＣを使用して簡単にモニタリングされる。実施例２４および２５には、典型的な脱硫反応の詳細が提供される。脱硫された生成物は、分取ＨＰＬＣによって精製されてもよい。あるいは、以下に記載するように、ヒドラジン分解またはアルカリケン化によって、脱硫反応を、糖基のメルカプトアセチルエステル上で行うこともできる。
【００９８】
実施例２９〜３７には、アミノ糖窒素原子上にメルカプトアセテート基を有する２−アミノグリコースを使用する別の合成に関する追加の実験の詳細が記載されている。
【００９９】
実施例３８〜４０には、以下のスキームに示される、チオール含有基として、グルコースの３−メルカプトアセテートエステルを使用する合成の実験の詳細が記載されている。
【０１００】
【化１１】
本発明では、発明者らによって、分子内ＳからＮへの再配置を受けるチオエステル中間体を形成し、最終生成物を与えるチオール含有基は、水素化を使用することなく簡単に除去できるように、異なるタイプの共有結合によって処理することができることが見出された。２−アミノグルコースのメルカプトアセタミドから、連結反応を触媒するチオ含有基を得る場合、該チオール基は、パラジウム触媒を使用する反応などの水素化によって除去する。しかし、実施例３８〜４０で代表されるシリーズでは、グルコース部分の３−ＯＨなどのヒドロキシル基のメルカプトアセチルエステルを使用して、連結反応を引き起こすことができる。そのようなエステル基のアルカリケン化に対する感受性のために、連結反応後、水素化より加水分解によってチオール基を除去することができる。エステル結合の開裂により、遊離グルコースヒドロキシル基が放出される。
【０１０１】
実施例４１〜４３には、アミノ酸残基であって、該残基のＮ末端が糖部分を有する残基が数多く存在する合成の実験の詳細が記載されている。以下のスキームは、ａ）ＳＡＬ（１４員環）およびｂ）６つのアミノ酸延長グリコシル化残基（２９員環）に対しＮ末端に関するＳＡＬ、Ｒ＝アミノ酸側鎖官能基、の提案される転移状態を示す。
【０１０２】
【化１２】
以下に詳細に記載するように、本発明の糖補助連結反応（ＳＡＬ）は、たとえ糖部分を有するペプチドのＮ末端が、グリコシル化アミノ酸から離れた数個のアミノ酸残基であっても、効果があることが発見された。０〜約１０個のアミノ酸残基チオール含有残基を持つ残基のＮ末端が存在しうることがここで本発明者らによって発見された。たとえば、約１〜６個のアミノ酸残基グリコシル化残基のＮ末端の存在が可能で、カップリング収率は比較的高く保たれる。先に説明したような大きな環状転移状態は、この効果から成ると考えられる。実施例４４は、糖が、アスパラギン側鎖のアミド窒素原子に結合するカップリング反応の例である。
【０１０３】
特許、特許文献または本明細書で開示された参考文献のいずれも、参照として、この発明に組み込まれ、本発明の一部を形成する。本発明を、以下の限定ではない例によって説明する。
【実施例】
【０１０４】
略語
Ｂｏｃ ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
ＤＣＭ ジクロロメタン
ＤＩＥＡ ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＥＡ 酢酸エチル
ＥＳＩ−ＴＯＦ エレクトロスプレーイオン化−飛しょう時間
Ｆｍｏｃ ９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＢＴＵ Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３，−テトラメチルウロニウムＰＦ６
Ｈｅｘ ヘキサン
ＨＯＢｔ Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＲＭＳ 高分解能質量スペクトル分析
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ 質量補助レーザー脱離イオン化−飛しょう時間
ＭＢＨＡ メチルベンズヒドリルアミン
ＭＳ 分子ふるい
ＮＭＡ Ｎ−メチルアニリン
ＮＭＭ Ｎ−メチルモルホリン
ＰＭＢ ｐ−メトキシベンジル
ＰｙＢＯＰ １−（７−アザベンズトリアゾリルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムＰＦ６
ｒｔ 室温
Ｔｆ トリフルオロメタンスルホネート
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ テトラヒドロフラン
ＴＭＳ トリメチルシリル
Ｔｒｔ トリチル。
【０１０５】
実施例１
グリコペプチド２の合成スキーム
【０１０６】
【化１３】
（ａ）ＦｍｏｃＳｅｒ−Ｏアリル、ＴＭＳＯＴｆ、ＣＨ２Ｃｌ２、分子ふるい、−７８℃；（ｂ）Ｚｎ、ＡｃＯＨ；（ｃ）ＴｒｔＳ−ＣＨ２−ＣＯＯＨ、ＨＢＴＵ、ＤＩＥＡ、ＤＭＦ；（ｄ）ＤＭＦ中２０％ピペリジン；（ｅ）Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、ＨＢＴＵ、ＨＯＢｔ、ＤＩＥＡ、ＤＭＦ；（ｆ）Ｐｄ（ＰＰｈ３）４、ＮＭＡ、ＴＨＦ；（ｇ）Ｈ−Ｐｈｅ−ＮＨ２、ＨＢＴＵ、ＨＯＢｔ、ＤＩＥＡ、ＤＭＦ；（ｈ）０．０５ＮのＮａＯＨ、ＭｅＯＨ、ｐＨ約１０；（ｉ）ＴＦＡ／Ｅｔ３ＳｉＨ／Ｈ２Ｏ（９／０．５／０．５）。
【０１０７】
実施例２
化合物５：化合物４（５．５４ｇ、８．９２ｍｍｏｌ）を、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）中のＦｍｏｃ−Ｓｅｒ−Ｏアリル（３．９２ｇ、１０．７０ｍｍｏｌ）およびＭＳ（ＡＷ−３００、５ｇ）に加えた。反応系を、アルゴン下、室温で１時間保った。次いで反応混合物を−７８℃とし、ＴＭＳＯＴｆ（１７４μＬ、０．８９ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。反応混合物を−７８℃で１．５時間攪拌し、ＤＩＥＡ（１５５．３μＬ、０．８９ｍｍｏｌ）を加えてクエンチした。反応混合物をろ過し、ろ液を２０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、水洗した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、フラッシュカラムクロマトグラフィ（ＥＡ／Ｈｅｘ、１：２）で濃縮した。その後、精製された生成物（６．２８ｇ、８５％）を、２０ｍＬのＡｃＯＨに懸濁し、次いでＺｎ微粉を加えた。反応混合物をｒｔで８時間攪拌した。ろ過後、溶媒を真空除去し、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ＥＡ／Ｈｅｘ、３：１）に供し、化合物５（４．３６ｇ、８８％）を得た。
【０１０８】
実施例３
化合物６：化合物５（１．０ｇ、１．４ｍｍｏｌ）を、予備活性化Ｓ−トリチル−２−メルカプト酢酸（９３２．４ｍｇ、２．８ｍｍｏｌ）に、乾燥ＤＭＦ（１０ｍＬ）中のＨＢＴＵ（１．０６ｇ、２．８ｍｍｏＬ）およびＤＩＥＡ（１ｍＬ、５．６ｍｍｏＬ）と共に加えた。反応混合物を、アルゴン下、ｒｔで２時間攪拌した。反応溶液を、８０ｍＬの酢酸エチルで希釈し、水次いで飽和食塩水で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、フラッシュカラムクロマトグラフィ（ＥＡ／Ｈｅｘ１：２）で濃縮した。化合物６（１．０ｇ、９０％）を、白色固体として得た。
【０１０９】
【化１４】
【０１１０】
【化１５】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ５４Ｈ５４Ｎ２Ｏ１３Ｓ［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算値：９９３．３２３９。測定値：９９３．３２４４。
【０１１１】
実施例４
化合物７：化合物６を、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンに溶解し、ｒｔで４５分攪拌する。全ての溶媒を真空除去した後、残基を、フラッシュカラムクロマトグラフィ（ＥＡ／Ｈｅｘ４：１、次いでＭｅＯＨ／ＣＨ３Ｃｌ１：９）に供した。精製した生成物（１．３０ｇ、１．７４ｍｍｏｌ）、ＢｏｃＧｌｙ−ＯＨ（９１３ｍｇ、５．２１ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（１．３２ｇ、３．４８ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ（５３３ｍｇ、３．４８ｍｍｏｌ）を、Ａｒ下ＤＭＦ（１５ｍＬ）に溶解し、次いでＤＩＥＡ（３．０３ｍＬ、１７．４ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物を、ｒｔで２時間攪拌した。全ての溶媒を除去した後、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ＥＡ／Ｈｅｘ１：１）に供し、化合物７（１．４２ｇ、９０％）を得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ４６Ｈ５５Ｎ３Ｏ１４Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋について計算値：９０６．３４７７。測定値：９０６．３４８０。
【０１１２】
実施例５
化合物８：化合物７（６６０ｍｇ、０．７３ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（１０ｍＬ）に懸濁し、Ｎ−メチルアニリン（７９２μＬ、７．３ｍｍｏｌ）および（ＰＰｈ３）４Ｐｄを引き続いて加えた。反応混合物をｒｔで４５分攪拌した。溶媒を除去した後、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ＥＡ／Ｈｅｘ４：１、次いでＭｅＯＨ／ＣＨ３Ｃｌ８：１）に供し、生成物（５４５ｍｇ、８６％）を得た。精製した生成物（５２０ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ）、ＮＨ２Ｐｈｅ−ＮＨ２（３６１ｍｇ、１．８ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（４５６ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ（１８４ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌ）を、アルゴン下で、ＤＭＦ（１５ｍＬ）に溶解し、次いでＤＩＥＡ（１．０４ｍＬ、６．０１ｍｍｏｌ）を注入した。反応混合物をｒｔで２時間攪拌した。全ての溶媒を除去した後、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ＥＡ／Ｈｅｘ４：１、次いでＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３１：９）に供し、化合物８（３９５ｍｇ、６５％）を得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ５２Ｈ６１Ｎ５Ｏ１４Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋について計算値：１０１２．４００８。測定値：１０１２．４００１。
【０１１３】
実施例６
化合物９：化合物８（２５０ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨに溶解し、０．０５ＮのＮａＯＨをｐＨが１０程度になるまで、滴下した。反応混合物を、ｒｔで１時間攪拌し続けた。反応系を酸性樹脂でｐＨ７の中性とし、次いで真空濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３１：９、次いで１：５）に供し、化合物９（１７８ｍｇ、８２％）を得た。
【０１１４】
【化１６】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ４６Ｈ５５Ｎ５Ｏ１１Ｓ［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算値：９０８．３５１１。測定値：９０８．３５０８。
【０１１５】
実施例７
化合物２：１０ｍＬのＴＦＡ／Ｅｔ３ＳｉＨ／ＣＨＣｌ３（９：０．５：０．５）を、Ａｒ下で化合物９に加えた。反応系をｒｔで４０分攪拌した。殆どのＴＦＡを除去した後、脱保護されたグリコペプチドを、冷Ｅｔ２Ｏを加えることによって、析出させた。白色析出物を集め、少量のＨ２Ｏに再懸濁させた。粗生成物を０．４５μｍシリンジフィルターでろ過し、次いで精製のためにＨＰＬＣに供した。凍結乾燥後、白色粉末としての純粋な化合物２を、次の連結反応工程のために用意した。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ２２Ｈ３３Ｎ５Ｏ９Ｓ［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算値：５６６．１８９１。測定値：５６６．１８７５。
【０１１６】
実施例８
グリコペプチド３の合成スキーム
【０１１７】
【化１７】
（ａ）ＦｍｏｃＳｅｒ−Ｏアリル、ＴＭＳＯＴｆ、ＣＨ２Ｃｌ２、分子ふるい、−７８℃；（ｂ）Ｚｎ、Ａｃ２Ｏ；（ｃ）ＤＭＦ中２０％ピペリジン；（ｄ）Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、ＨＢＴＵ、ＨＯＢｔ、ＤＩＥＡ、ＤＭＦ；（ｅ）Ｐｄ（ＰＰｈ３）４、ＮＭＡ、ＴＨＦ；（ｆ）Ｈ−Ｐｈｅ−ＮＨ２、ＨＢＴＵ、ＨＯＢｔ、ＤＩＥＡ、ＤＭＦ；（ｇ）０．０５ＮのＮａＯＨ、ＭｅＯＨ、ｐＨ約１０；（ｈ）Ｈ２Ｏ中９５％ＴＦＡ。
【０１１８】
実施例９
【０１１９】
【化１８】
化合物１１：ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ２７Ｈ４１Ｎ３Ｏ１４［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算値：６５４．２４８１。測定値：６５４．２４７３。
【０１２０】
実施例１０
【０１２１】
【化１９】
化合物１２：
【０１２２】
【化２０】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ３３Ｈ４７Ｎ５Ｏ１４［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算値：７３８．３１９２。測定値：７３８．３１８０。
【０１２３】
実施例１１
【０１２４】
【化２１】
化合物３：ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ２２Ｈ３３Ｎ５Ｏ９［Ｍ＋Ｈ］＋について計算値：５１２．２３５１。測定値：５１２．２３７３。
【０１２５】
実施例１２
グリコペプチド１の合成スキーム
【０１２６】
【化２２】
（ａ）Ｐｄ（ＰＰｈ３）４、ＮＭＡ、ＴＨＦ（ｂ）Ｈ−Ｐｈｅ−ＮＨ２、ＨＢＴＵ、ＨＯＢｔ、ＤＩＥＡ、ＤＭＦ；（ｃ）ＤＭＦ中２０％ピペリジン；（ｄ）０．０５ＮのＮａＯＨ、ＭｅＯＨ、ｐＨ約１０；（ｅ）ＴＦＡ／Ｅｔ３ＳｉＨ／Ｈ２Ｏ（９／０．５／０．５）。
【０１２７】
実施例１３
【０１２８】
【化２３】
化合物１３：ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ６０Ｈ６０Ｎ４Ｏ１３Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋について計算値：１０７７．３９５０。測定値：１０７７．３９３２。
【０１２９】
実施例１４
【０１３０】
【化２４】
化合物１４：ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ４５Ｈ５０Ｎ４Ｏ１１Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋について計算値：８５５．３２６９。測定値：８５５．３２６９。
【０１３１】
実施例１５
【０１３２】
【化２５】
化合物１：ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ２０Ｈ３０Ｎ４Ｏ８Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋について計算値：４８７．１８５７。測定値：４８７．１８５２。
【０１３３】
実施例１６
固相ペプチド合成
一般的方法。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を、ナトリウム／ベンゾフェノンで蒸留し、塩化メチレン（ＣＨ２Ｃｌ２）を塩化カルシウムで蒸留した。市販品質の試薬を購入し、さらに精製することなく使用した。グリコシル化実験を、反応前に高真空下で火炎乾燥した分子ふるい（ＡＷ３００）を使用して行った。薄層クロマトグラフ（ＴＬＣ）分析を、シリカゲル６０Ｆ２５４ガラスプレートを使用して行い、化合物スポットは、ＵＶ光（２５４ｎｍ）およびクエン酸モリブデン酸アンモニウム（ｃｉｔｒｉｃ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｍｏｌｙｂｄａｔｅ）で染色することによって視覚化した。フラッシュクロマトグラフィを、シリカゲル６０Ｇｅｄｕｒａｎ（登録商標）（３５〜７５μｍ、ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ）で行った。１Ｈ、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＭＸ−５００ＭＨｚスペクトロメータで記録した。カップリング定数（Ｊ）はヘルツで報告し、化学シフトはテトラメチルシラン（ＴＭＳ、０．０ｐｐｍ）に対する百万分率（ｐｐｍ）で報告する。
３−（トリチルチオ）プロパン酸のＭＢＨＡ−リンカーへのプレローディング：樹脂ローディングは、樹脂を過剰に加えることによって、約３００μｍｏｌ／ｇを目的とした。先ず、樹脂を洗浄（５×ＤＣＭ、５％ＤＩＥＡ／ＤＣＭで３分、５×ＤＣＭ、５×ＤＭＦ）した。３−（トリチルチオ）プロパン酸の予備活性化のため、ＰｙＢＯＰ（１当量）を、３−（トリチルチオ）プロパン酸の２当量のＮＭＭを含むＤＭＦ０．１Ｍ溶液に加えた。予備活性化の５分後、混合物を樹脂に加えた。２時間後、樹脂を洗浄（５×ＤＭＦ、５×ＤＣＭ、５％ＤＩＰＥＡ／ＤＣＭで３分、５×ＤＣＭ、５×ＤＭＦ）した。キャッピングのため、樹脂を無水酢酸／ピリジン（１：９）（２×１０分）で処理し、洗浄（５×ＤＭＦ、１０×ＤＣＭ）し、最後に真空乾燥した。
【０１３４】
固相化学実験を、Ｔｏｒｖｉｑから購入した、テフロン（登録商標）製のフィルターを備えるシリンジで行った。他に記載がない限り、全ての反応は室温で行った。分取ＨＰＬＣは、分取カラム（Ｖａｒｉａｎ Ｄｙｎａｍａｘ２５０×２１．４ｍｍ、Ｓ／Ｎ３０５９Ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ６０−８Ｃ１８）を使用するＨｉｔａｃｈｉ（Ｄ−７０００ＨＰＬＣシステム）装置を用い、流速８ｍＬ／分で行った。ＤＭＦは、バイオテク級のものを購入した。市販の試薬をさらに精製することなく使用した。樹脂、保護アミノ酸類およびＰｙＢＯＰは、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍから購入した。
【０１３５】
実施例１７
Ｂｏｃ法による固相合成：Ｂｏｃ切断：樹脂を５％のｍ−クレゾール／ＴＦＡ（２×４分、４ｍＬ）で処理した後、ＤＣＭ（８×４ｍＬ）およびＤＭＦ（５×４ｍＬ）で洗浄した。カップリング：４当量の保護アミノ酸（最終濃度：ＤＭＦ中０．１Ｍ）を、４当量のＰｙＢＯＰおよび８当量のＮＭＭを使用して５分間予備活性化した後、該溶液を樹脂に加えた。３０分後、樹脂をＤＭＦ（５×４ｍＬ）、ＤＣＭ（５×４ｍＬ）およびＤＭＦ（５×４ｍＬ）で洗浄した。キャッピング：無水酢酸／ピリジン（１：９、４ｍＬ）を樹脂に加えた。５分後、樹脂を、ＤＭＦ（５×４ｍＬ）およびＤＣＭ（５×４ｍＬ）で洗浄した。末端キャッピング：無水酢酸／ピリジン（１：９、４ｍＬ）を樹脂に加えた。１０分後、樹脂をＤＭＦ（５×４ｍＬ）およびＤＣＭ（８×４ｍＬ）で洗浄した。切断：ＴＦＭＳＡ／ＴＦＡ／チオアニソール（２：８：１）の混合物を樹脂に加えた。３時間後、樹脂をＴＦＡ（４×４ｍＬ）で洗浄した。検査：合わせた溶液を真空濃縮した。残渣を水に溶解し、分取ＨＰＬＣで精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（マトリックス：α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸）で分析した。
【０１３６】
実施例１８
Ａｃ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ２１５（配列番号：３は、非修飾アミノ酸類に相当する）。：３−（トリチルチオ）プロパン酸がプレロードされたＭＢＨＡ−樹脂、４００ｍｇ（１００μｍｏｌ）から出発し、線状アセンブリをＢｏｃ法に準じて行った。収量：５０．６ｍｇ（７１．５μｍｏｌ、７２％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：７０８．８（［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値７０８．８）；Ｃ３１Ｈ４９Ｎ９Ｏ８Ｓ（７０７．８４）。
【０１３７】
実施例１９
Ａｃ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ２１６（配列番号：４は非修飾アミノ酸類に相当する）。：３−（トリチルチオ）プロパン酸がプレロードされたＭＢＨＡ−樹脂、４００ｍｇ（１００μｍｏｌ）から出発し、線状アセンブリをＢｏｃ法に準じて行った。収量：３９ｍｇ（５４μｍｏｌ、５４％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：７２３．０（［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値：７２２．９）；Ｃ３２Ｈ５１Ｎ９Ｏ８Ｓ（７２１．８７）。
【０１３８】
実施例２０
Ａｃ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｓ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ２１７（配列番号：５は、非修飾アミノ酸類に相当する）。：３−（トリチルチオ）プロパン酸がプレロードされたＭＢＨＡ−樹脂、４００ｍｇ（１００μｍｏｌ）から出発し、線状アセンブリをＢｏｃ法に準じて行った。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：７５０．６（［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値：７５０．９）；Ｃ３４Ｈ５５Ｎ９Ｏ８Ｓ（７４９．９２）。
【０１３９】
実施例２１
Ａｃ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｓ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ２１８（配列番号：６は、非修飾アミノ酸類に相当する）。：３−（トリチルチオ）プロパン酸がプレロードされたＭＢＨＡ−樹脂、４００ｍｇ（１００μｍｏｌ）から出発し、線状アセンブリをＢｏｃ法に準じて行った。収量：３１ｍｇ（３９．３μｍｏｌ、３９％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：７８９．４（［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値：７８８．９）；Ｃ３５Ｈ５３Ｎ１１Ｏ８Ｓ（７８７．９３）。
【０１４０】
実施例２２
【０１４１】
【化２６】
実施例２３
化学連結反応
保護されていない合成ペプチドセグメントの連結反応を以下のように行った。使用する前に、６Ｍのグアニジンを含む０．２Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）を、アルゴンで１０分間脱ガスした。ペプチド類を最終濃度１０ｍＭで溶解し、次いで２％チオフェノールを添加した。連結反応を３７℃で、加熱ブロック中で行い、周期的にボルテックスし、チオール付加物を平衡化した。反応は、ＬＣＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ１１００単一四極子質量スペクトロメータに付随するＡｇｉｌｅｎｔ１１００ＬＣ、カラムはＡｇｉｌｅｎｔ ＳＢ Ｃ８ ５０×４．６ｍｍ）および／またはＨＰＬＣ｛分析カラム（ＸＴｅｒａＭＳ、Ｃｌ８ ３．５μｍ、４．６×ｌ００ｍｍを用いるＨｉｔａｃｈｉ Ｄ−７０００ＨＰＬＣシステク装置）を用い、流速１ｍＬ／分で｝を使用してモニタリングした。
【０１４２】
グリコペプチド連結反応および分取精製に関する代表的な例は、以下の通りである。２．８ｍｇのグリコペプチド２を、４．４ｍｇ（１．１当量）チオエステルペプチドＡｃ−ＬＹＲＡＧ−Ｃ（Ｏ）Ｓ−（ＣＨ２）２−ＣＯＮＨ２１５（配列番号：３は非修飾アミノ酸類に相当する）。の、６Ｍのグアニジンおよび１２μＬのチオフェノールを含む６００μＬの０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）溶液に加えた。連結反応を、３７℃で、加熱ブロック中で行い、周期的にボルテックスし、チオール付加物を平衡化した。１２時間後、ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）リン酸・塩酸塩；５０ｍＭ）を加え、ジスルフィド結合形成を減少させた。次いで、反応系を、逆相ＨＰＬＣ｛セミ分取カラムを使用するＨｉｔａｃｈｉ Ｄ−７０００ＨＰＬＣシステム装置、Ｖｙｄａｃ Ｃ−１８ １０μｍ、１０×２５０ｍｍ）を用い、流速５ｍＬ／分で行う｝を使用し生成した。水／０．１％ＴＦＡ中のアセトニトリルの線形勾配を、結合ペプチド類を溶出するために使用した。予期される質量を持つ画分を集め、凍結乾燥し、４．４ｍｇの純粋なグリコペプチド１９を得た。７６％の収率であった。
【０１４３】
異なるｐＨ（ｐＨ７〜９）での異なる連結反応条件、および２−メルカプトエタンスルホン酸塩（ＭＥＳ）、ベンジルメルカプタン、チオフェノールなどのチオール付加物を種々変え、およびチオールなしでテストを行った。驚くべきことに、反応はこれらの条件の殆どで良好に進行したが、６Ｍのグアニジンを含む２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）中の２％チオフェノールを使用した場合、ＨＰＬＣ分析によって最もクリーンな反応が得られることが見出された。ＭＥＳ（１ｍｇ／ｍｌ）の使用は、反応が５時間未満で完了したように、速度促進の点では優れていたが、ペプチドチオエステルの加水分解速度がより速いことが観察された。Ｃ末端にグリシンを持つペプチド−α−フェニルチオエステルも生成し、これを、他のチオール付加物なしで、連結反応混合物に直接使用した。このモデルペプチドでは、反応は４時間以内に完了した。
【０１４４】
連結反応速度におけるペプチドチオエステルのＣ末端アミノ酸の効果
【０１４５】
【化２７】
（ＬＹＲＡ−ＡＡは、配列番号：７に相当し、これは非修飾アミノ酸類を表わす）。
（ＬＹＲＡ−ＡＡ−ＧＳＦは、配列番号：８に相当し、これは非修飾アミノ酸類を表わす）。
ａ：ＥＳＩ−ＭＳによる特性決定。
【０１４６】
実施例２４
脱硫の一般的手順
【０１４７】
【化２８】
（Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｙは、配列番号：３に相当し、これは非修飾アミノ酸類を表わす）。
（Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅは、配列番号：７９に相当し、これは非修飾アミノ酸類を表わす）。
【０１４８】
脱硫反応は、ｐＨ５．８で６．０Ｍのグアニジン、１０ｍＭのＴＣＥＰを含む０．１Ｍのリン酸緩衝液中、室温で行った。緩衝液は、通常、各使用前に、１０分間アルゴンをバブリングすることによって脱ガスした。Ｐｄ／Ａｌ２Ｏ３を加え（ペプチドの重さの１０〜２０倍）、反応系を水素下に保った。脱硫反応は、分析ＨＰＬＣ｛分析カラム（ＸＴｅｒａＭＳ、Ｃ１８ ３．５μｍ、４．６×ｌ００ｍｍ）を使用するＨｉｔａｃｈｉ Ｄ−７０００ＨＰＬＣシステム装置を用い、流速１ｍＬ／分で行う｝に準じた。
【０１４９】
また、脱硫は、ラネーニッケルも使用して行い、これはペプチドの重量の１０倍用いた。ラネーニッケルは以下のようにして生成した。酢酸ニッケル（６００ｍｇ）を１５ｍＬのＨ２Ｏに溶解し、次いでホウ化水素ナトリウム（１００ｍｇ）を攪拌しながらゆっくり加えた。黒色アモルファスニッケル析出物をろ過し、蒸留水で中性になるまで洗浄した。次いでニッケルを閉鎖したボトルに移し、Ｈ２Ｏ中で保存した。ラネーニッケルの場合、反応に水素ガスを必要としないが、反応は、通常、Ｐｄ／Ａｌ２Ｏ３を用いる還元より遅かった（１２時間）。
【０１５０】
実施例２５
【０１５１】
【化２９】
Ａ）２の連結反応から精製された連結反応生成物１９およびチオエステルペプチド１５のＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析。生成物は、２１４ｎｍで、分析カラム（ＸＴｅｒａＭＳ、Ｃ１８ ３．５ｍｍ、４．６×１００ｍｍ）を使用するＨｉｔａｃｈｉ Ｄ−７０００ＨＰＬＣシステムを用い、流速１ｍＬ／分で行う）でモニタリングした。Ｂ）水素下Ｐｄ／Ａｌ２Ｏ３を使用した、２とチオエステルペプチド１５との間の連結反応生成物１９の脱硫粗反応生成物２０のＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析。反応は、２１４ｎｍで、分析カラム（ＸＴｅｒａＭＳ、Ｃ１８ ３．５ｍｍ、４．６×ｌ００ｍｍ）を使用するＨｉｔａｃｈｉ Ｄ−７０００ＨＰＬＣシステムを用い、流速１ｍＬ／分で行う）でモニタリングした。
【０１５２】
実施例２６
連結反応生成物１９の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（Ｄ２Ｏ、Ｂｒｕｋｅｒ ＭＡＸ−５００ＭＨＺ）。（Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙは、配列番号：９に相当し、これは非修飾アミノ酸類を表わす）。
【０１５３】
【化３０】
実施例２７
脱硫生成物２０の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（Ｄ２Ｏ、Ｂｒｕｋｅｒ ＭＡＸ−５００ＭＨＺ）。（Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙは、配列番号：９に相当し、これは非修飾アミノ酸類を表わす）。
【０１５４】
【化３１】
実施例２８
質量スペクトル分析によるチオエステル中間体および連結反応生成物の分析
ＬＣＭＳによる、異なる連結反応の分析の間、以下に示すように、断片化が起こるのが観察された。連結反応生成物が形成された場合は、断片化により、糖部のない全連結反応ペプチドが得られたであろう。しかし、連結反応中間体は形成されるが、ペプチド結合形成が起こらない場合は、断片化により、出発ペプチドチオエステル、およびメルカプトアセタミド−結合された糖が得られる。
【０１５５】
【化３２】
（Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅは、配列番号：８０に相当し、これは非修飾アミノ酸類を表わす）。
（Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｘは、配列番号：８１に相当し、これは非修飾アミノ酸類を表わす）。
【０１５６】
グリコペプチド類生成物および連結反応からの中間体の糖部上のアノマー中心での断片化。
【０１５７】
【化３３】
質量スペクトル分析により、連結反応生成物および異なるフラグメントの質量が認められた。エントリー１、２、３は、所望の連結反応生成物の形成に相当する。しかし、バリンチオエステル（エントリー４）の場合は、２４時間後、主生成物として連結反応中間体が観察された。この場合、連結反応混合物のｐＨが１１へ上昇したことにより、この中間体が消え、加水分解されたチオエステルが現れた。また、過剰のＭＥＳチオール付加物の添加により、チオエステル交換反応が起こり、ＭＥＳチオエステルペプチドを形成した。エントリー１、２、３の場合は、いずれもこれらの変化は起こらなかった。
【０１５８】
【化３４】
【０１５９】
【化３５】
【０１６０】
【化３６】
グリコペプチド生成物および連結反応中間体の糖部上のアノマー中心での観察された断片化。測定は、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００単一四極子質量スペクトロメータに付随するＡｇｉｌｅｎｔ１１００ＬＣを使用して行なった。カラムは、Ａｇｉｌｅｎｔ ＳＢ Ｃ８ ５０×４．６ｍｍである。Ａ：エントリー１に相当；Ｂ：エントリー２に相当；Ｃ：エントリー３に相当；Ｄ：エントリー４に相当；Ｅ：グリコペプチド２およびチオエステルペプチド１５からの脱硫生成物２０に相当。
【０１６１】
実施例２９
構造ブロック２４ａおよび２４ｂの合成
【０１６２】
【化３７】
試薬および条件：（ａ）Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ−Ｏアリル（２２ａに関し、Ｒ＝ＣＨ３）、またはＦｍｏｃ−Ｓｅｒ−Ｏアリル（２２ｂに関し、Ｒ＝Ｈ）、ＴＭＳＯＴｆ、分子ふるいＡＷ３００、ＣＨ２Ｃｌ２、−７０℃、７８〜８３％、α／β＝４／３；
（ｂ）Ｚｎ／ＡｃＯＨ；（ｃ）ＴｒｔＳ−ＣＨ２ＣＯＯＨ、ＨＢＴＵ、ＤＩＥＡ、ＤＭＦ、８４％（２工程）；（ｄ）Ｐｄ（ＰＰｈ３）４、ＮＭＡ、ＴＨＦ、９５％。
化合物２２ａα。反応前に、化合物２１（５．０ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）およびＦｍｏｃ−Ｔｈｒ−Ｏアリル（４．８３ｇ、１２．７ｍｍｏｌ）を混合し、高真空で一晩乾燥した。次いで混合物をＮ２下で無水ＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）に溶解し、３．０ｇの新しい、火炎乾燥した分子ふるいを加え、混合物を室温で１時間攪拌した。その後、−７８℃に冷却し、ＴＭＳＯＴｆ（２０３．９μＬ、１．０６６ｍｍｏｌ）を反応溶液にゆっくり加えた。次いで、混合物を−７８℃に保ち、４５分攪拌した。反応が落ちると、Ｅｔ３Ｎを加えてクエンチし、温度を室温まで上げた。分子ふるいをセライトによるろ過により除去し、ろ液を真空濃縮した。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ヘキサン中２０〜５０％ＥｔＯＡｃ）で生成し、純粋なα生成物（３．３１ｇ、４．７７ｍｍｏｌ、４５．４％）を得た。
【０１６３】
【化３８】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ３４Ｈ３８Ｎ４Ｏ１２［Ｍ＋Ｈ］＋について計算値：６９５．２５５９。測定値：６９５．２５５３。
【０１６４】
化合物２３ａ。化合物２２ａα（２．６８ｇ、３．８６ｍｍｏｌ）をＡｃＯＨ（２５ｍＬ）に溶解し、亜鉛（１５．０ｇ）を加えた。反応混合物を室温で４時間攪拌した。反応が成し遂げられると、亜鉛をセライトでろ取し、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄した。ろ液を真空濃縮した。次いで、濃縮残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ＥｔＯＡｃ中２０％ヘキサン）で生成し、純粋なアミン生成物（２．４０ｇ、３．６２ｍｍｏｌｅ、９４％）を得た。
【０１６５】
【化３９】
【０１６６】
【化４０】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ３４Ｈ４０Ｎ２Ｏ１２［Ｍ＋Ｈ］＋について計算値：６６９．２６５４。測定値：６６９．２６４１。該アミン（６５０ｍｇ、０．９７３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１５ｍＬ）に溶解した。ＴｒｔＳ−ＣＨ２ＣＯＯＨ（６５１ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（７４０ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（６７８μＬ、３．８９ｍｍｏｌ）を続けてアミンに加えた。反応系を室温で２時間攪拌した。反応が成し遂げられると、反応溶液を真空濃縮した。濃縮残渣を、フラッシュカラムクロマトグラフィ（ヘキサン中２０〜４０％ＥｔＯＡｃ）で精製し、純粋な化合物２３ａ（８７７．７ｍｇ、０．８９２ｍｍｏｌ、９１％）を得た。
【０１６７】
【化４１】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ５５Ｈ５６Ｎ２Ｏ１３Ｓ［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算値：１００７．３３９５。測定値：１００７．３３９０。
【０１６８】
化合物２４ａ。化合物２３ａ（７５０ｍｇ、０．７６２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２０ｍＬ）に溶解した。Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（８８．０ｍｇ、０．０７６ｍｍｏｌ）およびＮ−メチルアニリン（８２７μＬ、７．６２ｍｍｏｌ）を加え、次いで反応混合物を室温で４５分攪拌した。反応が成し遂げられると、溶液を真空濃縮した。粗生成物を、フラッシュカラムクロマトグラフィ（ヘキサン中５０％ＥｔＯＡｃ、次いでＣＨ２Ｃｌ２中１０％ＭｅＯＨ）で精製し、純粋な化合物２４ａ（６９０ｍｇ、０．７３１ｍｍｏｌ、９５％）を得た。
【０１６９】
【化４２】
【０１７０】
【化４３】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ５２Ｈ５２Ｎ２Ｏ１３Ｓ［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算値：９６７．３０８２。測定値：９６７．３０５９。
【０１７１】
化合物２２ｂα。反応前に、化合物２１（１．３３ｇ、２．８１ｍｍｏｌ）およびＦｍｏｃ−Ｓｅｒ−Ｏアリル（８５８．８ｍｇ、２．３４ｍｍｏｌ）を混合し、高真空で一晩乾燥した。次いで混合物をＮ２下無水ＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ）に溶解した。１．５ｇの新しい火炎乾燥した分子ふるいを加え、反応混合物を室温で１時間攪拌した。その後、反応混合物を−７８℃に冷却し、ＴＭＳＯＴｆ（５４．３μＬ、０．２８１ｍｍｏｌ）を反応溶液にゆっくり加えた。反応系を−７８℃に保ち、４５分攪拌した。反応が成し遂げられると、Ｅｔ３Ｎを加えてクエンチし、温度を室温に上げた。分子ふるいをセライトでろ取し、ろ液を真空濃縮した。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ヘキサン中２０〜５０％ＥｔＯＡｃ）で精製し、純粋なα生成物（８７２ｍｇ、１．２８ｍｍｏｌ、４５％）を得た。
【０１７２】
【化４４】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ３３Ｈ３６Ｎ４Ｏ１２［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算値：７０３．２２２２。測定値：７０３．２２０８。
【０１７３】
化合物２３ｂ。アミン（８２２ｍｇ、１．２６ｍｍｏｌ）［ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ３３Ｈ３８Ｎ２Ｏ１２［Ｍ＋Ｈ］＋について計算値：６５５．２４９７、測定値：６５５．２４９９］を、ＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解した。ＴｒｔＳ−ＣＨ２ＣＯＯＨ（８４０ｍｇ、２．５１ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（９５３ｍｇ、２．５１ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（８７５μＬ、５．０３ｍｍｏｌ）を、アミンに続けて加えた。反応系を室温で２時間攪拌した。反応が成し遂げられると、溶液を真空濃縮した。次いで、濃縮残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ヘキサン中２０〜４０％ＥｔＯＡｃ）で精製し、純粋な化合物２３ｂ（１．０３ｇ、１．０６ｍｍｏｌ、８４％）を得た。
【０１７４】
【化４５】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ５４Ｈ５４Ｎ２Ｏ１３Ｓ［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算値：９９３．３２３９。測定値：９９３．３２４０。
【０１７５】
化合物２４ｂ。化合物２３ｂ（４２０ｍｇ、０．４３３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１０ｍＬ）に、続けてＰｄ（ＰＰｈ３）４（５０．０ｍｇ、０．０４３ｍｍｏｌ）およびＮ−メチルアニリン（４７０μＬ、４．３３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で４５分攪拌した。反応が成し遂げられると、反応溶液を真空濃縮した。粗生成物を、フラッシュカラムクロマトグラフィ（ヘキサン中５０％ＥｔＯＡｃ、次いでＣＨ２Ｃｌ２中１０％ＭｅＯＨ）で精製し、純粋な化合物２４ｂ（３９０ｍｇ、０．４２０ｍｍｏｌ、９６％）を得た。
【０１７６】
【化４６】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ５１Ｈ５０Ｎ２Ｏ１３Ｓ［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算値：９５３．２９２６。測定値：９５３．２８９２。
【０１７７】
実施例３０
糖補助連結反応（ＳＡＬ）を使用するα−Ｏ−結合グリコペプチド類の合成
糖補助連結反応（ＳＡＬ）の連結反応効率を調べるため、４種のモデルα−Ｏ−結合グリコペプチド類２５ａ〜ｂおよび２６ａ〜ｂ、ならびにチオエステルペプチドＣｙｓ（Ａｃｍ）３７−Ｇｌｙ５２を、Ｇｌｙ−Ｖａｌ連結反応部を発現するジプテリシンの配列に基づいて生成した。ここで使用した連結反応条件は、我々の先の研究で使用した条件に類似するが、チオフェノールは省いた。
α−結合グリコペプチド類のＳＡＬ
【０１７８】
【化４７】
ａ：ｔ１／２は、反応体グリコペプチドが５０％消費されるために必要な反応時間を示す。ｂ：ＬＣＭＳにより特性決定。ｃ：各反応における反応体グリコペプチドの濃度は、６ｍＭである。
【０１７９】
先に示すように、α−Ｏ−結合グリコペプチド類は、β−Ｏ−結合およびＮ−結合グリコペプチド類（エントリー１〜４）と類似の効率で、ＳＡＬによって、順番に合成することができる。特に、ＧａｌＮＡｃ（ＳＨ）−Ｔｈｒを含むグリコペプチド類は、スレオニン（エントリー１〜４）のメチル基からの追加の立体因子にもかかわらず、ＧａｌＮＡｃ（ＳＨ）−Ｓｅｒを含むグリコペプチド類と類似の速度で到達した。予測どおり、Ｇｌｙ−Ｖａｌ接続部を持つ場合の連結反応速度は、チオフェノール（エントリー４および５）がない場合より、速かった。また、数種の条件をグリコペプチド２６ｂおよびチオエステルペプチドＣｙｓ（Ａｃｍ）３７−Ｇｌｙ５２を用いてスクリーニングし、ジプテリシンの合成のための連結反応条件を最適化した。ミクロ電極により反応ｐＨを測定すると、ＳＡＬのための理想的な反応ｐＨは７．２〜７．４である。前記表「α−結合グリコペプチド類のＳＡＬ」に示すように、より良好なｐＨ安定性を与える、より濃縮されたリン酸緩衝液を使用することによって、優れた連結反応効率を達成した（エントリー４および６）。このｐＨ範囲で、加水分解されたチオエステルは最小量でありながら、連結反応は最高効率を達成した。同じ条件下、この遅い連結反応において、加水分解されたチオエステルを相殺するために、２当量のペプチドチオエステルを加えると、最適連結反応結果を得た（エントリー４、７および８）。
【０１８０】
実施例３１
（Ａ）構造ブロック３０の合成。（Ｂ）側鎖アンカー法を使用するグリコペプチドチオエステルＡｓｐ１−Ａｓｎ３６。
【０１８１】
【化４８】
試薬および条件：（ａ）ＢＦ３−ＯＥｔ２、ＴｏｌＳＨ、ＣＨ２Ｃｌ２、０℃、次いでｒｔ；（ｂ）ＮａＯＭｅ、ＭｅＯＨ、ｐＨ約１１；（ｃ）ＰＭＢＣｌ、ＮａＨ、ＤＭＦ、０℃、次いでｒｔ、６８％（３工程）；（ｄ）Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ−Ｏアリル、ＮＴＳ、触媒ＴｆＯＨ、分子ふるいＡＷ３００、ＣＨ２Ｃｌ２、−１５℃、８３％、α／β＝３／２；（ｅ）ＡｃＳＨ、ピリジン、８６％；（ｆ）Ｐｄ（ＰＰｈ３）４、ＮＭＡ、ＴＨＦ、９５％。ＴｏｌＳＨ＝ｐ−チオクレゾール、ＮＩＳ＝Ｎ−ヨードスクシンイミド
化合物２８α。化合物２７（１０．２８ｇ、２７．５５ｍｍｏｌ）およびｐ−チオクレゾール（５．１ｇ、４１．３ｍｍｏｌ）を、Ｎ２（ガス）下でＣＨ２Ｃｌ２（４０ｍＬ）に溶解した。反応溶液を氷浴で０℃に冷却した。この溶液に、ＢＦ３ＯＥｔ２（６．９２ｍＬ、５５．１ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。その後、反応温度を徐々に室温まで上げた。８時間後、反応系に飽和ＮａＨＣＯ３をゆっくり加えることによりクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２で希釈した。生成物を、飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を集め、真空濃縮した。次いで、濃縮残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ヘキサン中２０〜４０％ＥｔＯＡｃ）で精製し、純粋な生成物（αおよびβ混合物、１０．３ｇ、２３．６ｍｍｏｌ、８５％）を得た。精製チオグリコシドをＭｅＯＨに溶解した。ＮａＯＭｅ（ＭｅＯＨ中２５重量％）を、ｐＨが１１〜１２程度になるまで、反応溶液に滴下した。反応混合物を室温で１時間攪拌し、酸性樹脂（Ｄｏｗｅｘ５０ＷＸ２−２００（Ｈ））で中性とした。次いで、樹脂をろ取し、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄した。ろ液を真空濃縮した。次いで、濃縮残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ＣＨ２Ｃｌ２中５〜１０％ＭｅＯＨ）で精製した。次いで、純粋なチオグリコシド（７．８３ｇ、２５．２ｍｍｏｌ）を６０ｍＬの乾燥ＤＭＦに０℃で溶解し、ＰＭＢＣｌ（２０．５ｍＬ、１５１ｍｍｏｌ）およびＮａＨ（３．６２ｇ、１５１ｍｍｏｌ）を加えることにより、ＰＭＢ基で完全に保護した。反応混合物を室温で２時間攪拌し、ＭｅＯＨでクエンチした。ＭｅＯＨを除去した後、真空濃縮した。次いで、生成物をＥｔＯＡｃで抽出し、Ｈ２Ｏで洗浄した。有機層を集め、飽和食塩水で再び洗浄した。有機層を真空濃縮した後、粗残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ヘキサン中１０〜４０％ＥｔＯＡｃ）で精製し、純粋なＰＭＢ保護チオグリコシド２８αおよび２８βをそれぞれ得た。［１５．５ｇ、２３．２ｍｍｏｌ（α＋β）、９２％］。
【０１８２】
【化４９】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ３７Ｈ４１Ｎ３Ｏ７Ｓ［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算値：６９４．２５５７。測定値：６９４．２５５６。
【０１８３】
化合物２８β
【０１８４】
【化５０】
【０１８５】
【化５１】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ３７Ｈ４１Ｎ３Ｏ７Ｓ［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算値：６９４．２５５７。測定値：６９４．２５５６。
【０１８６】
Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ−Ｏアリル。炭酸セシウム（２．２８ｇ、７．０ｍｍｏｌ）を、Ｎ２（ガス）下でＦｍｏｃ−Ｔｈｒ−ＯＨ（４．７５ｇ、１３．９ｍｍｏｌ）の乾燥ＭｅＯＨ（４０ｍＬ）懸濁液に加えた。反応混合物を室温で２時間攪拌し、次いで真空下、蒸発乾固した。濃縮残渣をさらに２時間高真空下で乾燥した。その後、乾燥混合物を、Ｎ２下で乾燥ＤＭＦ（４０ｍＬ）に再び溶解し、臭化アリル（１．４５ｍＬ、１６．７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で８時間攪拌した。白色析出物をセライトでろ取し、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄した。ろ液を真空濃縮し、次いでフラッシュカラムクロマトグラフィ（ヘキサン中２５〜５０％ＥｔＯＡｃ）で精製し、純粋な白色粉末（４．６４ｇ、１２．２ｍｍｏｌ、８７％）を得た。
【０１８７】
【化５２】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ２２Ｈ２３ＮＯ５［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算値：４０４．１４６８。測定値：４０４．１４６８。
【０１８８】
化合物２９α。反応前に、化合物２８（９１７ｍｇ、１．３６６ｍｍｏｌ）およびＦｍｏｃ−Ｔｈｒ−Ｏアリル（６２４．７ｍｇ、１．６３９ｍｍｏｌ）を混合し、高真空で一晩乾燥した。次いで、反応混合物をＮ２下、ＣＨ２Ｃｌ２に溶解した。新しい火炎乾燥した分子ふるい（ＡＷ３００）（３ｇ）を反応混合物に加え、約２時間攪拌し、反応系を−２０℃に冷却し、次いでＮ−ヨードスクシンイミド（３３８．１ｍｇ、１．５０３ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物に、−２０℃で新しく製造したＴｆＯＨ（０．０５当量）をゆっくり加えた。反応系を−１５℃で１時間攪拌した。反応が成し遂げられると、飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３（水溶液）および飽和ＮａＨＣＯ３（水溶液）を加えることによりクエンチした。分子ふるいをセライトでろ取し、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄した。ろ液をＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３（水溶液）および飽和ＮａＨＣＯ３（水溶液）で洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した後、ろ液を真空下で蒸発乾固した。濃縮残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ヘキサン中２５〜５０％ＥｔＯＡｃ）で精製し、α生成物（５０６．７ｍｇ、０．５４６ｍｍｏｌ、４０％）を得た。
【０１８９】
【化５３】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ５２Ｈ５６Ｎ４Ｏ１２［Ｍ＋Ｈ］＋について計算値：９２９．３９６７。測定値：９２９．３９５４。
【０１９０】
化合物３０。化合物２９α（２００ｍｇ、０．２１５ｍｍｏｌ）を０℃でピリジン（１．２ｍＬ）に溶解し、次いでＡｃＳＨ（１．２ｍＬ）を加えた。次いで、反応系を室温まで上げた。反応混合物を４時間攪拌した。反応が成し遂げられると、混合物を真空下で蒸発乾固した。濃縮残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ヘキサン中２０％〜５０％ＥｔＯＡｃ、次いでＥｔＯＡｃ中３０％ヘキサン）で精製し、次のアリル除去工程用の純粋な生成物（１７４．７ｍｇ、０．１８５ｍｍｏｌ、８６％）を得た。
【０１９１】
【化５４】
【０１９２】
【化５５】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ５４Ｈ６０Ｎ２Ｏ１３［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算値：９６７．３９８７。測定値：９６７．３９８４。アリル除去工程では、前の工程の生成物（７２０ｍｇ、０．７６２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１０ｍＬ）に溶解し、次いでＰｄ（Ｐｈ３Ｐ）４（８８．１ｍｇ、０．０７６ｍｍｏｌ）およびＮ−メチルアニリン（８２７μＬ、７．６２ｍｍｏｌ）を継続して加えた。反応混合物を室温で４５分攪拌した。反応が成し遂げられると、反応溶液を真空下で蒸発乾固した。次いで、濃縮残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ヘキサン中５０％ＥｔＯＡｃ、次いでＣＨ２Ｃｌ２中１０％ＭｅＯＨ）で精製し、純粋な化合物１０（６５５ｍｇ、０．７２４ｍｍｏｌ、９５％）を得た。
【０１９３】
【化５６】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ５１Ｈ５６Ｎ２Ｏ１３［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算値：９２７．３６７４。測定値：９２７．３６８０。
【０１９４】
実施例３２
グリコペプチドＶａｌ５３−Ｐｈｅ８２の固相合成
Ｃ末端グリコペプチドセグメント（５３−８２）の合成は、Ｈ２Ｎ−Ｐｈｅ−２−ＣｌＴｒｔ−樹脂から始め、Ｆｍｏｃ法を使用して行った。グリコシル化アミノ酸を樹脂にカップリングするため、２当量の構造ブロック２４ａを使用し、反応系を２４時間振盪した。ＳＰＰＳが完了すると、糖上のアセテート基を、ヒドラジン／ＭｅＯＨ（１／６）で６時間処理することによって、固体支持体から除去した。このアセテート除去工程の後、樹脂をＭｅＯＨ、ＤＭＦおよびＣＨ２Ｃｌ２で洗浄した。得られたグリコペプチドを脱保護し、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／Ｅｔ３ＳｉＨ／チオアニソール（１７／１／１／１）を用いて室温で５０分処理することにより、樹脂から切断した。粗グリコペプチド溶液を蒸留し、切断混合物溶液を全て除去し、次いで、ＨＰＬＣ精製のために乾燥残渣をＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ（１／１）に再溶解した。精製されたグリコペプチドを凍結乾燥し、純粋なグリコペプチド（１８％の収率）を得た。ＥＳＩ−ＭＳ：３５２８Ｄａ。（ペプチド塊は、ペプチドの観察されたプロトン化状態の全てからの実験的質量／電荷（ｍ／ｚ）比から再構築した）。
【０１９５】
実施例３３
チオエステルペプチドＣｙｓ（Ａｃｍ）３７−Ｇｌｙ５２の合成
チオエステルペプチドの合成は、３−（トリチルチオ）プロパン酸をＭＢＨＡ−樹脂ＬＬへのプレローディングから始めた。プレローディング手順の詳細は、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ，Ｓｏｃ．２００６，１２８，５６２６−５６２７に見ることができ、該文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９６】
固相ペプチド合成は、Ｂｏｃ法を使用して行った。固体支持体への全配列が完了した後、Ｎ末端のＢｏｃ基を除去し、ＨＦ切断中の副反応を最小限に抑えた。次いで、１０％（ｖ／ｖ）のアニソールで最終切断を行う前に、樹脂を高真空下で４時間乾燥した。粗チオエステルペプチドをＨＰＬＣで精製し、純粋な生成物を４３％の収率で得た。ＥＳＩ−ＭＳ：１９８２Ｄａ。（ペプチド塊は、ペプチドの観察されたプロトン化状態の全てからの実験的質量／電荷（ｍ／ｚ）比から再構築された）。
【０１９７】
実施例３４
グリコペプチドチオエステルＡｓｐ１−Ａｓｎ３６の合成
合成は、Ｗａｎｇらによって、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ Ｒｅｓ．Ｔｈｅｒａｐ．２００５，１１，１１７−１２３に公表された手順に基づいて行った。該文献は参照により本明細書に組み込まれる。合成は、Ｒｉｎｋアミド樹脂から出発した。２０％ピペリジン（ＤＭＦ中）を用い２０分（×２）処理することによりＦｍｏｃ基を除去した後、ＨＢＴＵ（４当量）およびＤＩＥＡ（１０当量）のＤＭＦカップリング溶液と２時間混合することにより、樹脂をＦｍｏｃ−Ａｓｐ−Ｏアリル（４当量）でロードした。その後、樹脂をＤＭＦ（４ｍＬ×４）で洗浄し、次いでＡｃ２Ｏ／ＤＩＥＡ／ＤＭＦ（１：２：１７）を用いて樹脂上の遊離アミンのアセチル化を２０分行った。その後、樹脂を、ＤＭＦ（４ｍＬ×４）、ＤＣＭ（４ｍＬ×４）およびＤＭＦ（４ｍＬ×４）で洗浄した。Ｆｍｏｃ−ＳＰＰＳを、ＨＢＴＵ／ＤＩＥＡカップリング条件を用いて行った。グリコシル化アミノ酸をカップリングするために、２当量の構造ブロック１６を合成に使用し、カップリング時間を１日に延ばした。樹脂上にグリコペプチドの完全な配列が完了すると、ＤＣＭ中、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（２５ｍｇ／０．１ｍｍｏｌ樹脂）およびＰｈＳｉＨ３（１０当量）で３０分（×２）処理することにより、アリル基を除去した。ＤＣＭ（４ｍＬ×４）、ＤＭＦ（４ｍ×４）、次いでＤＣＭ（４ｍＬ×４）で洗浄した後、該樹脂を、エチル３−メルカプトプロピオネート（２４当量）、ＤＩＥＡ（３７．５当量）、無水ＨＯＢｔ（３０当量）、ＤＩＣ（３０当量）およびＤＣＭ／ＤＭＦ（１／４）を含む反応溶液と６時間（×２）混合することによって、遊離酸をチオエステルに変換した。その後、樹脂を、ＤＣＭ（４ｍＬ×４）、ＤＭＦ（４ｍ×４）、次いでＤＣＭ（４ｍＬ×４）で洗浄した。ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／チオアニソール／ＴＥＳ（１７／１／１／１）での処理により、完全脱保護とともに、グリコペプチドを樹脂から切断した。粗生成物をＨＰＬＣ精製に供し、純粋な生成物を９％の収量で得た。ＥＳＩ−ＭＳ：３９７７Ｄａ。（ペプチド塊は、ペプチドの観察されたプロトン化状態の全てからの実験的質量／電荷（ｍ／ｚ）比から再構築された）。
【０１９８】
実施例３５
糖補助連結反応（ＳＡＬ）の一般的手順
保護されていないペプチドセグメントの連結反応は、以下のようにして行った。反応の前、連結反応溶液（６ＭのＧｎ−ＨＣｌ、０．２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ８．５）を１０分間脱ガスした。続いて、グリコペプチドおよびチオエステルペプチドを、Ａｒ下で、連結反応溶液に溶解した。反応は３７℃で行い、周期的にボルテックスし、反応混合物を平衡化した。ＨＰＬＣまたはＬＣ／ＭＳ分析の前に、ＴＣＥＰ（６０ｍＭ）または１０％（ｖ／ｖ）の２−メルカプトエタノールを加え、形成されたジスルフィド結合を減らした。
【０１９９】
実施例３６
脱硫の一般的手順
脱硫反応は、室温で、１５ｍＭのＴＣＥＰを含む、６ＭのＧｎ−ＨＣｌ、０．２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ５．８の溶液中で行った。緩衝液は、使用する前、該溶液にＡｒを１０分バブリングすることにより脱ガスした。Ｐｄ／Ａｌ２Ｏ３（グリコペプチドの重さの１５倍）の添加の後、Ｈ２バルーンを使用して、反応混合物をＨ２下に保った。脱硫反応は、分析ＨＰＬＣクロマトグラフィおよびＬＣ／ＭＳによってモニタリングした。反応が完了すると、Ｐｄ／Ａｌ２Ｏ３を遠心分離によって沈降させ、上澄み液をＨＰＬＣ精製のために集めた。
【０２００】
実施例３７
ジプテリシングリコペプチドセグメントＣｙｓ（Ａｃｍ）３７−Ｐｈｅ８２からのＡｃｍ基の除去
Ｃｙｓ（Ａｃｍ）３７−Ｐｈｅ８２（３ｍｇ）を、３０当量のＨｇ（ＯＡｃ）２を含む１０％ＡｃＯＨ（ｐＨ４．０）、１ｍＬに溶解した。反応混合物をよく混合し、室温で１時間攪拌した。反応が成し遂げられると、１２０当量のＤＴＴを加え、混合物を１２時間反応させると、全てのＨｇ（ＯＡｃ）２が析出した。その後、黒色析出物を沈降させ、上澄み液をＨＰＬＣ精製のために集めた。
【０２０１】
実施例３８
ジプテリシングリコペプチドＣｙｓ３７−Ｐｈｅ８２およびジプテリシングルコペプチドチオエステルＡｓｐ１−Ａｓｎ３６のネイティブケミカルライゲーション（ＮＣＬ）
グリコペプチドセグメントＣｙｓ３７−Ｐｈｅ８２（２．９ｍＭ）およびグリコペプチドチオエステルセグメントＡｓｐ１−Ａｓｎ３６（４．４ｍＭ）の連結反応を、３７℃で、２％（ｖ／ｖ）のチオフェノールおよび２％（ｖ／ｖ）ベンジルメルカプタンを含む、６ＭのＧｎ・ΗＣｌ、２００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．９の溶液中で行った。１６時間後、連結反応が完了したことが観察され、連結反応生成物をＥＳＩ−ＭＳによって確認した。ＨＰＬＣ精製後、純粋な生成物が４７％で観察された。
【０２０２】
実施例３９
３−Ｏ−メルカプトアセチルセリン試薬３５の合成
【０２０３】
【化５７】
（Ｄ）−グルコサミンからの３−Ｏ−トリチルメルカプトアセチルセリン試薬３５の合成
ａ）Ａｃ２Ｏ、ＡｃＯＨ、Ｚｎ微粉、９１％；ｂ）Ｐｄ（ＰＰｈ３）４、ＮＭＡ、ＴＨＦ；ｃ）ＮａＯＭｅ、ＭｅＯＨ、ｐＨ９；ｄ）臭化アリル、ＤＩＥＡ、ＤＭＦ；ｅ）ベンズアルデヒドジメチルアセタール、ｐ−ＴｓＯＨ、ＭｅＣＮ、３２から、５１％；ｆ）ＴｒｔＳＣＨ２ＣＯＯＨ、ＤＩＣ、ＤＭＡＰ、ＣＨ２Ｃｌ２、０℃、９１％；ｇ）Ｐｄ（ＰＰｈ３）４、ＮＭＡ、ＴＨＦ、９１％。ＡｃＯＨ＝酢酸、ＮＭＡ＝Ｎ−メチルアニリン、ＤＩＥＡ＝Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、ｐ−ＴｓＯＨ＝ｐ−トルエン−４−スルホン酸、Ｔｒｏｃ＝２，２，２−トリクロロエチルカルバメート、Ｔｒｔ＝トリチル、ＤＩＣ＝Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、ＤＭＡＰ＝４−ジメチルアミノピリジン。
【０２０４】
（３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−６−（（Ｒ）−２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）−３−（アリルオキシ）−３−オキソプロポキシ）−５−アセタミド−２−（アセトキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３，４−ジイルジアセテート３２
【０２０５】
【化５８】
Ｔｒｏｃ保護グリコシルアミノ酸３１（１．０７ｇ、１．２９ｍｍｏｌ）を無水酢酸（１６ｍｌ）に溶解し、反応系を０℃に冷却した。予備活性化させたＺｎ微粉［５ｇ、１ＭのＨＣｌ（１００ｍｌ）、水（２×１００ｍｌ）、ジエチルエーテル（２×１００ｍｌ）で洗浄することにより活性化させる］、次いで酢酸（４．８ｍｌ）を加え、反応系をｒｔで９０分攪拌した。反応系をセライトのプラグでろ過し、ジクロロメタンで洗浄し、溶媒を真空除去した。カラムクロマトグラフィ（溶出液：３：１ｖ／ｖ酢酸エチル／ヘキサン）による精製により、所望の生成物３２を白色固体（０．８２ｇ、９１％）として得た。
Ｒｆ（３：１ｖ／ｖ酢酸エチル／ヘキサン）＝０．２３；１Ｈ−および１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルデータは、文献２３で報告されたデータと一致した。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ３５Ｈ４０Ｎ２Ｏ１３［Ｍ＋Ｈ］＋について計算値：６９７．２６０３。測定値：６９７．２６０２。
【０２０６】
（２Ｒ）−アリル２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）−３−（（６Ｒ，７Ｓ，８Ｒ，８ａＳ）−７−アセタミド−８−ヒドロキシ−２−フェニルヘキサヒドロピラノ［３，２−ｄ］［１，３］ジオキシン−６−イルオキシ）プロパノエート３３
【０２０７】
【化５９】
グリコシルアミノ酸３２（１．８３ｇ、２．６３ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（３７ｍｌ）に懸濁した。Ｎ−メチルアニリン（２．８６ｍｌ、２６．３ｍｍｏｌ）およびＰｄ（ＰＰｈ３）４（３０３ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を加え、反応系をｒｔで３０分攪拌した。溶媒を真空除去し、生成物をカラムクロマトグラフィ（溶出液：９：１ｖ／ｖジクロロメタン／メタノール＋１％ＡｃＯＨ）で精製し、酸をクリーム状固体［１．７ｇ、９５％、ＲＦ（９：１ｖ／ｖジクロロメタン／メタノール）＝０．０７］として得た。得られた酸を乾燥メタノール（５５ｍｌ）に溶解し、ナトリウムメトキシドのメタノール溶液（０．５Ｍ溶液）をｐＨが９．０になるまで加えた。反応系をｒｔで２時間攪拌し、その後、ダウエックス５０Ｈ＋樹脂の添加により中性とした。反応系をろ過し、溶媒を真空除去し、所望のトリオールを得た。これをさらに精製することなく使用した。該トリオールをＤＭＦ（１６ｍｌ）に溶解し、０℃に冷却した。ＤＩＥＡ（０．９０ｍｌ、５．１８ｍｍｏｌ）および臭化アリル（０．４５ｍｌ、５．１８ｍｍｏｌ）を滴下し、反応系をｒｔで６時間攪拌した。溶媒を真空除去し、生成物をカラムクロマトグラフィ（溶出液：９：１ｖ／ｖジクロロメタン／メタノール）で精製し、アリル保護化合物を白色固体（０．７７ｇ）として得た。得られたトリオール（０．７７ｇ、１．３５ｍｍｏｌ）をＭｅＣＮ（３３ｍｌ）に溶解した。ベンズアルデヒドジメチルアセタール（０．４１ｍｌ、２．７０ｍｍｏｌ）およびｐ−トルエンスルホン酸（２６ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を加え、反応系をｒｔで３時間攪拌した。溶媒を真空除去し、生成物をカラムクロマトグラフィ（溶出液：４：１ｖ／ｖ酢酸エチル／ヘキサン）で精製し、所望のアルコール３３を白色固体（０．８７ｇ、３２から、９８％および５１％）として得た。
【０２０８】
【化６０】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ３６Ｈ３８Ｎ２Ｏ１０［Ｍ＋Ｈ］＋について計算値：６５９．２５９９。測定値：６５９．２５９７。
【０２０９】
（２Ｒ）−アリル２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）−３−（（６Ｒ，７Ｓ，８Ｒ，８ａＳ）−７−アセタミド−２−フェニル−８−（２−（トリチルチオ）アセトキシ）ヘキサヒドロプラノ［３，２−ｄ］［１，３］ジオキシン−６−イルオキシ）プロパノエート３４
【０２１０】
【化６１】
アルコール３３（１４２ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を、乾燥ジクロロメタン（７．５ｍｌ）に溶解した。Ｓ−トリチル−メルカプト酢酸（１１０ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）を加え、反応系を０℃に冷却した。ＤＩＣ（５０μｌ、０．３２ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（１．３ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）を加え、反応系を０℃で１５分攪拌した。溶媒を真空除去し、生成物をカラムクロマトグラフィ（溶出液：２：１ヘキサン／酢酸エチル−１：１ｖ／ｖヘキサン／酢酸エチル）で精製し、３４を白色固体（１９０ｍｇ、９１％）として得た。
Ｒｆ（１：１ｖ／ｖヘキサン／酢酸エチル）＝０．５７；
【０２１１】
【化６２】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ５７Ｈ５４Ｎ２Ｏ１１Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋について計算値：９７５．３５２１。測定値：９３５．３５２６。
【０２１２】
（２Ｒ）−２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）−３−（（６Ｒ，７Ｓ，８Ｒ，８ａＳ）−７−アセタミド−２−フェニル−８−（２−（トリチルチオ）アセトキシ）ヘキサヒドロピラノ［３，２−ｄ］［１，３］ジオキシン−６−イルオキシ）プロパン酸３５
【０２１３】
【化６３】
アリル保護グリコシルアミノ酸３４（１３５ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（６ｍｌ）に懸濁した。Ｎ−メチルアニリン（０．１５ｍｌ、１．３８ｍｍｏｌ）およびＰｄ（ＰＰｈ３）４（１６ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）を加え、反応系をｒｔで２０分攪拌した。溶媒を真空除去し、生成物をカラムクロマトグラフィ（溶出液：９５：５ｖ／ｖジクロロメタン／メタノール−９：１ｖ／ｖジクロロメタン／メタノール）で精製し、所望の酸３５を淡黄色固体（１２３ｍｇ、９５％）として得た。
Ｒｆ（９５：５ｖ／ｖジクロロメタン／メタノール）＝０．２６；
【０２１４】
【化６４】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ５４Ｈ５０Ｎ２Ｏ１１Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋について計算値：９３５．３２０８。測定値：９３５．３２１１。
【０２１５】
実施例４０
３−Ｏ−メルカプトアセチル−２−アセタミドグルコシルペプチドフラグメントの固相ペプチド
【０２１６】
【化６５】
（Ｘ−Ｓｅｒ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒは、配列番号：８２に相当し、これは非修飾アミノ酸類を表わす）。
【０２１７】
一般的手順
分析ＨＰＬＣは、分析カラム（Ｇｒａｃｅ Ｖｙｄａｃ「タンパク質およびペプチドＣ１８」、１５０×４．６ｍｍ、粒径：１０μｍ、流速：１．５ｍｌ／分）を使用して、Ｈｉｔａｃｈｉ（Ｄ−７０００ＨＰＬＣシステム）装置で行った。セミ分取ＨＰＬＣは、セミ分取カラム（Ｇｒａｃｅ Ｖｙｄａｃ「タンパク質およびペプチドＣ１８」、２５０×１０ｍｍ、粒径：１０〜１５μｍ、流速：４ｍＬ／分）を使用して、Ｈｉｔａｃｈｉ（Ｄ−７０００ＨＰＬＣシステム）装置で行った。分取ＨＰＬＣは、分取カラム（Ｇｒａｃｅ Ｖｙｄａｃ「タンパク質およびペプチドＣ１８」、２５０×２２ｍｍ、粒径：１０〜１５μｍ、流速：８ｍＬ／分）を使用して、Ｈｉｔａｃｈｉ（Ｄ−７０００ＨＰＬＣシステム）装置で行った。シグナルの検出は、フォトダイオードアレイ検出器を用い、λ＝２８０ｎｍの波長で行った。溶出液Ａ（水中０．１％ＴＦＡ）およびＢ（アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ）を、５０℃の線形勾配において使用した。勾配：３０分で、Ａ：０％Ｂ→８０％Ｂ。
【０２１８】
材料
水は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ超純粋精製システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）から取った。ＤＭＦは、バイオテク級のものを購入した。市販の試薬は、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈまたはＡｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓから購入し、さらに精製することなく使用した。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）はナトリウム／ベンゾフェノンで蒸留し、ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）は塩化カルシウムで蒸留した。他の無水物級の溶媒は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、直接使用した。分子ふるい（ＡＷ３００）は、グリコシル化実験の前に、新しく粉砕し、直接火炎乾燥した。分析薄層クロマトグラフ（ＴＬＣ）は、シリカゲル６０Ｆ２５４ガラスプレートを使用して行った。化合物スポットは、酸性モリブデン酸セリウムアンモニウムで染色し、ＵＶ光（２５４ｎｍ）によって視覚化した。フラッシュクロマトグラフィは、シリカゲル６０Ｇｅｄｕｒａｎ（３５〜７５μｍ、ＥＭＤ Ｓｃｉｅｎｃｅ）で行った。樹脂、保護されたアミノ酸類およびＰｙＢＯＰは、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍから購入した。重水素化溶媒は、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から購入した。
【０２１９】
ＮＭＲスペクトル観測
１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲは、それぞれ、６００ＭＨｚおよび１５０ＭＨｚで操作し、ＣｒｙｏＰｒｏｂｅを備えるＢｒｕｋｅｒ ＤＲＸ−６００スペクトロメータを使用して記録した。カップリング定数（Ｊ）は、可能な場合は、ヘルツ（Ｈｚ）で報告し、化学シフトは、テトラメチルシラン（ＴＭＳ、０．００ｐｐｍ）に対する百万分率（ｐｐｍ）として報告する。
【０２２０】
質量スペクトル分析
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルは、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＶｏｙａｇｅｒ−ＤＥ Ｐｒｏ生体分光光度ワークステーションで測定した。０．１％ＴＦＡを含む１０ｍｇ／ｍｌのα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸溶液を、プローブ−マトリックス混合物を生成するために使用した。
【０２２１】
高分解能質量スペクトル分析は、Ｆｌｉｇｈｔ質量スペクトロメータのＡｇｉｌｅｎｔ６２１０Ｔｉｍｅで測定した。
ペプチド合成
Ｔｏｒｖｉｑから購入した、テフロン（登録商標）フィルターを備えたシリンジ中で、固相化学を行った。
【０２２２】
３−（トリチルチオ）プロパン酸のＭＢＨＡ−リンカーへのプレローディング：樹脂ローディングは、過剰の樹脂を加えることにより、約３００μｍｏｌ／ｇを目的とした。先ず、樹脂を洗浄（５×ＤＣＭ、３分で５％ＤＩＰＥＡ／ＤＣＭ、５×ＤＣＭ、５×ＤＭＦ）した。３−（トリチルチオ）プロパン酸の予備活性化のために、ＰｙＢＯＰ（１当量）を、２当量のＮＭＭを含む、３−（トリチルチオ）プロパン酸のＤＭＦ、０．１Ｍ溶液に加えた。予備活性化の５分後、混合物を樹脂に加えた。２時間後、樹脂を洗浄（５×ＤＭＦ、５×ＤＣＭ、３分で５％ＤＩＰＥＡ／ＤＣＭ、５×ＤＣＭ、５×ＤＭＦ）した。キャッピングのために、樹脂を無水酢酸／ピリジン（１：９）（２×１０分）で処理し、洗浄（５×ＤＭＦ、１０×ＤＣＭ）し、最後に真空乾燥した。
【０２２３】
Ｂｏｃ法による固相合成：Ｂｏｃ切断：樹脂を５％のｍ−クレゾール／ＴＦＡ（２×４分）で処理した後、ＤＣＭ（８×）およびＤＭＦ（５×）で洗浄した。カップリング：４当量のＰｙＢＯＰおよび８当量のＮＭＭを使用して、４当量の保護アミノ酸（最終濃度：ＤＭＦ中０．１Ｍ）を５分間予備活性化した後、該溶液を樹脂に加えた。３０分後、樹脂を、ＤＭＦ（５×）、ＤＣＭ（５×）およびＤＭＦ（８×）で洗浄した。キャッピング：無水酢酸／ピリジン（１：９）を樹脂に加えた。５分後、樹脂を、ＤＭＦ（５×）およびＤＣＭ（５×）で洗浄した。末端キャッピング：無水酢酸／ピリジン（１：９）を樹脂に加えた。１０分後、樹脂を、ＤＭＦ（５×）およびＤＣＭ（８×）で洗浄した。切断：ＴＦＭＳＡ／ＴＦＡ／チオアニソール（２：８：１）の混合物を、樹脂に加えた。２時間後、樹脂をＴＦＡ（４×）で洗浄した。検査：合わせた溶液を真空濃縮した。残渣を水に溶解し、分取ＨＰＬＣで精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（マトリックス：α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸）で分析した。
【０２２４】
Ｒｉｎｋアミド樹脂のプレローディング：先ず、樹脂を洗浄（５×ＤＣＭ、５×ＤＭＦ）し、次いで１０％ピペリジン／ＤＭＦ（２×５分）で処理することによりＦｍｏｃ基を除去し、さらに洗浄工程（５×ＤＭＦ、５×ＤＣＭ、５×ＤＭＦ）を行った。第１保護アミノ酸の予備活性化に関し、４当量のＰｙＢＯＰおよび８当量のＮＭＭを、構造ブロック（０．１Ｍ）のＤＭＦ溶液に加えた。予備活性化の５分後、混合物を樹脂に加えた。２時間後、樹脂を洗浄（５×ＤＭＦ、５×ＤＣＭ、５×ＤＭＦ）し、無水酢酸／ピリジン（１：９）（２×５分）でキャップし、洗浄（５×ＤＭＦ、５×ＤＣＭ、５×ＤＭＦ）した。
Ｆｍｏｃ法によるグリコペプチド固相合成：Ｆｍｏｃ切断：樹脂を１０％のピペリジン／ＤＭＦ（２×５分）で処理した後、洗浄（５×ＤＭＦ、５×ＤＣＭ、５×ＤＭＦ）した。カップリング：４当量のＰｙＢＯＰおよび８当量のＮＭＭを使用して、４当量の保護アミノ酸（最終濃度：ＤＭＦ中０．１Ｍ）を５分間予備活性化した後、該溶液を樹脂に加えた。３０分後、樹脂を、ＤＭＦ（５×）、ＤＣＭ（５×）およびＤＭＦ（５×）で洗浄した。キャッピング：無水酢酸／ピリジン（１：９）を樹脂に加えた。５分後、樹脂を、ＤＭＦ（５×）、ＤＣＭ（５×）およびＤＭＦ（５×）で洗浄した。糖含有モノマーのカップリング：１当量のＰｙＢＯＰおよび２当量のＮＭＭを使用して、１当量の構造ブロック（最終濃度：ＤＭＦ中０．１Ｍ）を５分間予備活性化した後、該溶液を樹脂に加えた。６時間後、樹脂を、ＤＭＦ（５×）、ＤＣＭ（５×）およびＤＭＦ（５×）で洗浄した。切断：ＴＦＡ、チオアニソール、トリイプロピルシランおよび水（１７：１：１：１）の混合物を加えた。２時間後、樹脂をＴＦＡ（４×４ｍＬ）で洗浄した。検査：合わせた溶液を、真空濃縮した。残渣を水に溶解し、分取ＨＰＬＣで精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（マトリックス：α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸）で分析した。
【０２２５】
固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により生成されたグリコペプチド類
【０２２６】
【化６６】
（配列番号：１２は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
【０２２７】
１００μｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｓｅｒ−Ｒｉｎｋアミド樹脂から出発し、線状アセンブリをＦｍｏｃ法に準じて行った。収量：３６ｍｇ（４３μｍｏｌ、４３％）。ＥＳＩ−ＴＯＦ ｈｉｇｈ−ａｃｃ．（ｍ／ｚ）：８４３．３１８１（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：８４３．３１８９）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：６．６分（勾配Ａ）；Ｃ３４Ｈ５０Ｎ８Ｏ１５Ｓ（８４２．３１１６）。
【０２２８】
【化６７】
（配列番号：１３は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
【０２２９】
１００μｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｓｅｒ−Ｒｉｎｋアミド樹脂から出発して、線状アセンブリをＦｍｏｃ法に準じて行った。収量：３５ｍｇ（４１μｍｏｌ、４１％）。ＥＳＩ−ＴＯＦ ｈｉｇｈ−ａｃｃ．（ｍ／ｚ）：８４９．２７３７（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：８４９．２７５３）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：５．６分（勾配Ａ）；Ｃ３２Ｈ４８Ｎ８Ｏ１５Ｓ２（８４８．２６８０）
【０２３０】
【化６８】
（配列番号：１４は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
【０２３１】
６６．５μｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｓｅｒ−Ｒｉｎｋアミド樹脂から出発して、線状アセンブリをＦｍｏｃ法に準じて行った。収量：２１．５ｍｇ（２４μｍｏｌ、３６％）。ＥＳＩ−ＴＯＦ ｈｉｇｈ−ａｃｃ．（ｍ／ｚ）：９０７．２７９６（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：９０７．２８０８）．ＨＰＬＣ：ｔＲ：５．７分（勾配Ａ）；Ｃ３４Ｈ５０Ｎ８Ｏ１７Ｓ２（９０６．２７３５）。
【０２３２】
【化６９】
（配列番号：１５は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
【０２３３】
６６．５μｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｓｅｒ−Ｒｉｎｋアミド樹脂から出発して、線状アセンブリをＦｍｏｃ法に準じて行った。収量：２５ｍｇ（２７μｍｏｌ、４１％）。ＥＳＩ−ＴＯＦ ｈｉｇｈ−ａｃｃ．（ｍ／ｚ）：９２９．３１２３（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：９２９．３１２８）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：５．９分（勾配Ａ）；Ｃ３６Ｈ５２Ｎ１０Ｏ１５Ｓ２（９２８．３０５５）。
【０２３４】
【化７０】
（配列番号：１６は、非修飾アミノ酸に相当する）。
【０２３５】
１００μｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｓｅｒ−Ｒｉｎｋアミド樹脂から出発して、線状アセンブリをＦｍｏｃ法に準じて行った。収量：２０ｍｇ（２１μｍｏｌ、２１％）。ＥＳＩ−ＴＯＦ ｈｉｇｈ−ａｃｃ．（ｍ／ｚ）：９４２．３８６０（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：９４２．３８７３）、ＨＰＬＣ：ｔＲ：６．７分（勾配Ａ）；Ｃ３９Ｈ５９Ｎ９Ｏ１６Ｓ（９４１．３８００）。
【０２３６】
【化７１】
（配列番号：１７は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
【０２３７】
６６．５μｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｓｅｒ−Ｒｉｎｋアミド樹脂から出発して、線状アセンブリをＦｍｏｃ法に準じて行った。収量：１１ｍｇ（１２μｍｏｌ、１８％）。ＥＳＩ−ＴＯＦ ｈｉｇｈ−ａｃｃ．（ｍ／ｚ）：９４８．３４２１（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：９４８．３４３７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ；６．６分（勾配Ａ）；Ｃ３７Ｈ５７Ｎ９Ｏ１６Ｓ２（９４７．３３６５）。
【０２３８】
【化７２】
（配列番号：１８は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
【０２３９】
６６．５μｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｓｅｒ−Ｒｉｎｋアミド樹脂から出発して、線状アセンブリをＦｍｏｃ法に準じて行った。収量：１２ｍｇ（１２μｍｏｌ、１８％）。ＥＳＩ−ＴＯＦ ｈｉｇｈ−ａｃｃ．（ｍ／ｚ）：１００６．３４８４（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１００６．３４９２）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：６．６分（勾配Ａ）；Ｃ３９Ｈ５９Ｎ９Ｏ１８Ｓ２（１００５．３４１９）。
【０２４０】
【化７３】
（配列番号：１９は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
【０２４１】
６６．５μｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｓｅｒ−Ｒｉｎｋアミド樹脂から出発して、線状アセンブリをＦｍｏｃ法に準じて行った。収量：１０ｍｇ（１０μｍｏｌ、１４％）。ＥＳＩ−ＴＯＦ ｈｉｇｈ−ａｃｃ．（ｍ／ｚ）：１０２８．３８０４（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１０２８．３８１２）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：６．５分（勾配Ａ）；Ｃ４１Ｈ６１Ｎ１１Ｏ１６Ｓ２（１０２７．３７３９）。
【０２４２】
【化７４】
（配列番号：２０は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
【０２４３】
６６．５μｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｓｅｒ−Ｒｉｎｋアミド樹脂から出発して、線状アセンブリをＦｍｏｃ法に準じて行った。収量：１２ｍｇ（１１μｍｏｌ、１７％）。ＥＳＩ−ＴＯＦ ｈｉｇｈ−ａｃｃ．（ｍ／ｚ）：１０６１．４２７１（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１０６１．４２７８）。ＨＰＬＣ：ｔｋ：９．０分（勾配Ａ）；Ｃ４３Ｈ６８Ｎ１０Ｏ１７Ｓ２（１０６０．４２０５）。
【０２４４】
【化７５】
（配列番号：２１は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
【０２４５】
６６．５μｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｓｅｒ−Ｒｉｎｋアミド樹脂から出発して、線状アセンブリをＦｍｏｃ法に準じて行った。収量：３ｍｇ（３μｍｏｌ、４％）。ＥＳＩ−ＴＯＦ ｈｉｇｈ−ａｃｃ．（ｍ／ｚ）：１１１８．４４８８（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１１１８．４４９３）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．８分（勾配Ａ）；Ｃ４５Ｈ７１Ｎ１１Ｏ１８Ｓ２（１１１７．４４２０）。
【０２４６】
【化７６−１】
（配列番号：２２は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
【０２４７】
６６．５μｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｓｅｒ−Ｒｉｎｋアミド樹脂から出発して、線状アセンブリをＦｍｏｃ法に準じて行った。収量：７ｍｇ（６μｍｏｌ、９％）。ＥＳＩ−ＴＯＦ ｈｉｇｈ−ａｃｃ．（ｍ／ｚ）：１１７５．４７０６（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１１７５．４７０７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．４分（勾配Ａ）；Ｃ４７Ｈ７４Ｎ１２Ｏ１９Ｓ２（１１７４．４６３４）。
ＳＰＰＳにより生成されるペプチドチオエステル類
【０２４８】
【化７６−２】
（配列番号：２３は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
【０２４９】
１００μｍｏｌの、３−（トリチルチオ）プロパン酸がプレロードされたＭＢＨＡ−樹脂から出発して、線状アセンブリをＢｏｃ法に準じて行った。収量：５０．６ｍｇ（７２μｍｏｌ、７２％）。ＥＳＩ−ＴＯＦ ｈｉｇｈ−ａｃｃ．（ｍ／ｚ）：７０８．３４９９（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：７０８．３４９７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．４分（勾配Ａ）；Ｃ３１Ｈ４９Ｎ９Ｏ８Ｓ（７０７．３４２５）。
【０２５０】
【化７６−３】
（配列番号：２４は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
【０２５１】
１００μｍｏｌの、３−（トリチルチオ）プロパン酸がプレロードされたＭＢＨＡ−樹脂から出発して、線状アセンブリをＢｏｃ法に準じて行った。収量：３９ｍｇ（５２μｍｏｌ、５２％）。ＥＳＩ−ＴＯＦ ｈｉｇｈ−ａｃｃ．（ｍ／ｚ）：７２２、３６４４（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：７２２．３６５４）。ＨＰＬＣ；ｔＲ：８．８分（勾配Ａ）；Ｃ３２Ｈ５１Ｎ９Ｏ８Ｓ（７２１．３５８１）。
【０２５２】
【化７６−４】
（配列番号：２５は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
【０２５３】
１００μｍｏｌの、３−（トリチルチオ）プロパン酸がプレロードされたＭＢＨＡ−樹脂から出発して、線状アセンブリをＢｏｃ法に準じて行った。収量：３３．３ｍｇ（４１μｍｏｌ、４１％）。ＥＳＩ−ＴＯＦ ｈｉｇｈ−ａｃｃ．（ｍ／ｚ）；８１４．３９０１（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：８１４．３９１６）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．３分（勾配Ａ）；Ｃ３８Ｈ５５Ｎ９Ｏ９Ｓ（８１３．３８４３）。
【０２５４】
【化７６−５】
（配列番号：２６は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
【０２５５】
１００μｍｏｌの、３−（トリチルチオ）プロパン酸がプレロードされたＭＢＨＡ−樹脂から出発して、線状アセンブリをＢｏｃ法に準じて行った。収量：３１ｍｇ（３９μｍｏｌ、３９％）。ＥＳＩ−ＴＯＦ ｈｉｇｈ−ａｃｃ．（ｍ／ｚ）：７８８．３８６３（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：７８８．３８７２）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．０分（勾配Ａ）；Ｃ３５Ｈ５３Ｎ１１Ｏ８Ｓ（７８７．３７９９）。
【０２５６】
【化７６−６】
（配列番号：２７は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
【０２５７】
１００μｍｏｌの、３−（トリチルチオ）プロパン酸がプレロードされたＭＢＨＡ−樹脂から出発して、線状アセンブリをＢｏｃ法に準じて行った。収量：８．７ｍｇ（１１μｍｏｌ、１１％）。ＥＳＩ−ＴＯＦ ｈｉｇｈ−ａｃｃ．（ｍ／ｚ）：７９８．３９６３（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：７９８．３９６７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．５分（勾配Ａ）；Ｃ３８Ｈ５５Ｎ９Ｏ８Ｓ（７９７．３８９４）。
【０２５８】
ペプチド連結反応
グリコペプチド類（１．５当量、約３μｍｏｌ）を、脱酸素化連結反応緩衝液（４：１ｖ／ｖＮ−メチル−２−ピロリジノン；６Ｍのグアニジン塩酸塩、１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ＝８．５）に溶解した。この溶液を、ペプチドチオエステル（約２μｍｏｌ）を含むエッペンドルフチューブに移した。チオフェノール（２体積％、３μｌ）を加え、反応系を緩やかに混合した。連結反応混合物を、ＬＣ−ＭＳが反応の完了を示すまで、１２時間毎に緩やかに混合しながら、３７℃で培養した。
連結反応生成物
【０２５９】
【化７７】
（配列番号：２８は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：６９％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１４４６．２（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１４４６．６）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．７分（勾配Ａ）；Ｃ６２Ｈ９２Ｎ１６Ｏ２２Ｓ（１４４５．６）。
【０２６０】
【化７８】
（配列番号：２８は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１３７１．８（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１３７２．５）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：７．８分（勾配Ａ）；Ｃ６０Ｈ９０Ｎ１６Ｏ２１（１３７１．５）。
【０２６１】
【化７９】
（配列番号：２９は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：８４％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１４５１．７（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１４５２．６）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．７分（勾配Ａ）；Ｃ６０Ｈ９０Ｎ１６Ｏ２２Ｓ２（１４５１．６）
【０２６２】
【化８０】
（配列番号：２９は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１３７８．３（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１３７８．５）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．１分（勾配Ａ）；Ｃ５８Ｈ８８Ｎ１６Ｏ２１Ｓ（１３７７．５）
【０２６３】
【化８１】
（配列番号：３０は、非修飾アミノ酸類に相当する）。．
収率：２８％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１５３３．１（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１５３２．７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．９分（勾配Ａ）；Ｃ６４Ｈ９４Ｎ１８Ｏ２２Ｓ２（１５３１．７）
【０２６４】
【化８２】
（配列番号：３０は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１４５８．０（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１４５８．６）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．３分（勾配Ａ）；Ｃ６２Ｈ９２Ｎ１８Ｏ２１Ｓ（１４５７．６）。
【０２６５】
【化８３】
（配列番号：３１は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：２７％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１６１２．４（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１６１２．８）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．１分（勾配Ａ）；Ｃ６８Ｈ９９Ｎ２０Ｏ２２Ｓ２（１６１１．８）。
【０２６６】
【化８４】
（配列番号：３１は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１５３８．０（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１５３８．７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：７．６分（勾配Ａ）；Ｃ６６Ｈ９６Ｎ２０Ｏ２１Ｓ（１５３７．７）。
【０２６７】
【化８５】
（配列番号：３２は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：３８％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１５０９．３（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１５１０．６）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．３分（勾配Ａ）；Ｃ６２Ｈ９２Ｎ１６Ｏ２４Ｓ２（１５０９．６）。
【０２６８】
【化８６】
（配列番号：３２は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１４３５．９（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１４３６．５）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．２分（勾配Ａ）；Ｃ６０Ｈ９０Ｎ１６０２３Ｓ（１４３５．５）。
【０２６９】
【化８７】
（配列番号：３３は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：２２％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１５９０．５（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１５９０．７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．３分（勾配Ａ）；Ｃ６６Ｈ９７Ｎ１８Ｏ２４Ｓ２（１５８９．７）。
【０２７０】
【化８８】
（配列番号：３３は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１５１４．６（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１５１６．６）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．３分（勾配Ａ）；Ｃ６４Ｈ９４Ｎ１８Ｏ２３Ｓ（１５１５．６）。
【０２７１】
【化８９】
（配列番号：３４は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：４０％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１６１６．４（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１６１６．７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．９分（勾配Ａ）；Ｃ６９Ｈ９８Ｎ１６Ｏ２５Ｓ２（１６１５．７）。
【０２７２】
【化９０】
（配列番号：３４は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１５４１．８（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１５４２．６）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．８分（勾配Ａ）；Ｃ６７Ｈ９６Ｎ１６Ｏ２４Ｓ（１５４１．６）。
【０２７３】
【化９１】
（配列番号：３５は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：２８％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１４６６．２（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１４６６．６）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．８分（勾配Ａ）；Ｃ６１Ｈ９２Ｎ１６Ｏ２２Ｓ２（１４６５．６）。
【０２７４】
【化９２】
（配列番号：３５は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１３９２．５（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１３９２．５）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．６分（勾配Ａ）；Ｃ５９Ｈ９０Ｎ１６Ｏ２１Ｓ（１３９１．５）。
【０２７５】
【化９３】
（配列番号：３６は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：３２％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１６３７．５（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１６３８．８）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．６分（勾配Ａ）；Ｃ７１Ｈ１００Ｎ１８０２３Ｓ２（１６３７．８）。
【０２７６】
【化９４】
（配列番号：３６は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１５６４．６（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１５６４．７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．４分（勾配Ａ）；Ｃ６９Ｈ９８Ｎ１８Ｏ２２Ｓ（１５６３．７）。
【０２７７】
【化９５】
（配列番号：３７は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：４０％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１５４８．２（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１５４６．７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．６分（勾配Ａ）；Ｃ６５Ｈ９６Ｎ１８Ｏ２２Ｓ２（１５４５．７）。
【０２７８】
【化９６】
（配列番号：３７は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１４７２．６（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１４７２．６）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．２分（勾配Ａ）；Ｃ６３Ｈ９４Ｎ１８Ｏ２１Ｓ（１４７１．６）。
【０２７９】
【化９７】
（配列番号：３８は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：５９％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１５２４．８（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１５２４．７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．８分（勾配Ａ）；Ｃ６３Ｈ９４Ｎ１６Ｏ２４Ｓ２（１５２３．６）。
【０２８０】
【化９８】
（配列番号：３８は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１４５０．８（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１４５０．５）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．２分（勾配Ａ）；Ｃ６１Ｈ９２Ｎ１６Ｏ２３Ｓ（１４４９．５）。
【０２８１】
【化９９】
（配列番号：３９は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：６２％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１５３１．３（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１５３２．７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．２分（勾配Ａ）；Ｃ６４Ｈ９４Ｎ１８Ｏ２２Ｓ２（１５３１．７）。
【０２８２】
【化１００】
（配列番号：３９は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１４５９．７（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１４５８．６）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：７．８分（勾配Ａ）；Ｃ６２Ｈ９２Ｎ１８Ｏ２１Ｓ（１４５７．６）。
【０２８３】
【化１０１】
（配列番号：４０は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：６５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１５５９．６（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１５５９．７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．８分（勾配Ａ）；Ｃ６８Ｈ１０３Ｎ１７Ｏ２３Ｓ（１５５８．７）。
【０２８４】
【化１０２】
（配列番号：４０は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１４８５．２（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１４８５．６）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．９分（勾配Ａ）；Ｃ６６Ｈ１０１Ｎ１７Ｏ２２（１４８４．６）。
【０２８５】
【化１０３】
（配列番号：４１は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：５８％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１６２５．７（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１６２５．８）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．３分（勾配Ａ）；Ｃ７１Ｈ１０５Ｎ１９Ｏ２３Ｓ（１６２４．８）。
【０２８６】
【化１０４】
（配列番号：４１は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１５５１．７（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１５５１．７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．２分（勾配Ａ）；Ｃ６９Ｈ１０４Ｎ１９Ｏ２２（１５５０．７）。
【０２８７】
【化１０５】
（配列番号：４２は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：４８％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１５６５．４（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１５６５．７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：１０．０分（勾配Ａ）；Ｃ６６Ｈ１０１Ｎ１７Ｏ２３Ｓ２（１５６４．７）。
【０２８８】
【化１０６】
（配列番号：４２は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１４９１．７（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１４９１．６）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．０分（勾配Ａ）；Ｃ６４Ｈ９９Ｎ１７Ｏ２２Ｓ（１４９０．６）。
【０２８９】
【化１０７】
（配列番号：４３は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：６６％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１５５０．８（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１５５１．７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．４分（勾配Ａ）；Ｃ５５Ｈ９９Ｎ１７Ｏ２３Ｓ２（１５５０．７）。
【０２９０】
【化１０８】
（配列番号：４３は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１４７７．３（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１４７７．６）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．４分（勾配Ａ）；Ｃ６３Ｈ９７Ｎ１７Ｏ２２Ｓ（１４７６．６）。
【０２９１】
【化１０９】
（配列番号：４４は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：６８％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１５４５．５（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１５４５．７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．９分（勾配Ａ）；Ｃ５７Ｈ１０１Ｎ１７Ｏ２３Ｓ（１５４４．７）。
【０２９２】
【化１１０】
（配列番号：４４は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１４７１．７（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１４７１．６）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．５分（勾配Ａ）；Ｃ６５Ｈ９５Ｎ１７Ｏ２２（１４７０．６）。
【０２９３】
【化１１１】
（配列番号：４５は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：６０％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１６３２．２（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１６３１．８）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．３分（勾配Ａ）；Ｃ６９Ｈ１０３Ｎ１９Ｏ２３Ｓ２（１６３０．８）。
【０２９４】
【化１１２】
（配列番号：４５は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１５５７．９（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１５５７．７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．３分（勾配Ａ）；Ｃ６７Ｈ１０１Ｎ１９Ｏ２２Ｓ（１５５６．７）。
【０２９５】
【化１１３】
（配列番号：４６は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：４５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１６５７．５（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１６５７．８）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：１０．６分（勾配Ａ）；Ｃ７２Ｈ１０５Ｎ１７Ｏ２４Ｓ２（１６５６．８）。
【０２９６】
【化１１４】
（配列番号：４６は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１５８３．１（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１５８３．７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．６分（勾配Ａ）；Ｃ７０Ｈ１０３Ｎ１７Ｏ２３Ｓ（１５８２．７）。
【０２９７】
【化１１５】
（配列番号：４７は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：５５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１６３０．３（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１６３１．８）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．０分（勾配Ａ）；Ｃ６９Ｈ１０３Ｎ１９Ｏ２３Ｓ２（１６３０．８）。
【０２９８】
【化１１６】
（配列番号：４７は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１５５８．３（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１５５７．７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．２分（勾配Ａ）；Ｃ６７Ｈ１０１Ｎ１９Ｏ２２Ｓ（１５５６．７）。
【０２９９】
【化１１７】
（配列番号：４８は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：２３％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１６４７．３（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１６４５．８）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：１０．２分（勾配Ａ）；Ｃ７０Ｈ１０５Ｎ１９Ｏ２３Ｓ２（１６４４．８）。
【０３００】
【化１１８】
（配列番号：４８は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１５７１．０（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１５７１．７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．５分（勾配Ａ）；Ｃ６８Ｈ１０３Ｎ１９Ｏ２２Ｓ（１５７０．７）。
【０３０１】
【化１１９】
（配列番号：４９は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：４０％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１７１２．４（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１７１１．９）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．５分（勾配Ａ）；Ｃ７３Ｈ１０７Ｎ２１Ｏ２３Ｓ２（１７１０．９）。
【０３０２】
【化１２０】
（配列番号：４９は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１６３８．６（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１６３７．８）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．６分（勾配Ａ）；Ｃ７１Ｈ１０５Ｎ２１Ｏ２２Ｓ（１６３６．８）。
【０３０３】
【化１２１】
（配列番号：５０は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：３９％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１７３７．５（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１７３７．９）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：１０．４分（勾配Ａ）；Ｃ７６Ｈ１０９Ｎ１９Ｏ２４Ｓ２（１７３６．９）。
【０３０４】
【化１２２】
（配列番号：５０は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１６６３．４（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１６６３．８）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．５分（勾配Ａ）；Ｃ７４Ｈ１０７Ｎ１９Ｏ２３Ｓ（１６６２．８）。
【０３０５】
【化１２３】
（配列番号：５１は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：８１％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１６０８．５（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１６０９．８）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．８分（勾配Ａ）；Ｃ６７Ｈ１０１Ｎ１７Ｏ２５Ｓ２（１６０８．７）。
【０３０６】
【化１２４】
（配列番号：５１は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１５３５．２（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１５３５．７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．０分（勾配Ａ）；Ｃ６５Ｈ９９Ｎ１７Ｏ２４Ｓ（１５３４．６）。
【０３０７】
【化１２５】
（配列番号：５２は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：５０％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１６２３．３（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１６２３．８）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：１０．２分（勾配Ａ）；Ｃ６８Ｈ１０３Ｎ１７Ｏ２５Ｓ２（１６２２、８）。
【０３０８】
【化１２６】
（配列番号：５２は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１５４８．８（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１５４９．７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．３分（勾配Ａ）；Ｃ６６Ｈ１０１Ｎ１７０２４Ｓ（１５４８．７）。
【０３０９】
【化１２７】
（配列番号：５３は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：６０％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１６８７．８（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１６８９．８）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．４分（勾配Ａ）；Ｃ７１Ｈ１０５Ｎ１９Ｏ２５Ｓ２（１６８８．８）。
【０３１０】
【化１２８】
（配列番号：５３は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１６１６．０（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１６１５．７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．６分（勾配Ａ）；Ｃ６９Ｈ１０３Ｎ１９Ｏ２４Ｓ（１６１４．７）。
【０３１１】
【化１２９】
（配列番号：５４は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：３７％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１７１４．９（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１７１５．９）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：１０．６分（勾配Ａ）；Ｃ７４Ｈ１０７Ｎ１７Ｏ２６Ｓ２（１７１４．９）。
【０３１２】
【化１３０】
（配列番号：５４は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１６４０．８（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１６４１．８）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．９分（勾配Ａ）；Ｃ７２Ｈ１０５Ｎ１７Ｏ２５Ｓ（１６４０．８）。
【０３１３】
【化１３１】
（配列番号：５５は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：６２％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１６６４．０（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１６６４．９）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：１１．３分（勾配Ａ）；Ｃ７１Ｈ１１０Ｎ１８Ｏ２４Ｓ２（１６６３．９）。
【０３１４】
【化１３２】
（配列番号：５５は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１５８８．７（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１５９０．８）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：１１．０分（勾配Ａ）；Ｃ６９Ｈ１０８Ｎ１８Ｏ２３Ｓ（１５８９．８）。
【０３１５】
【化１３３】
（配列番号：５６は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：８１％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１７４５．２（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１７４５．０）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：１０．８分（勾配Ａ）；Ｃ７５Ｈ１１４Ｎ２０Ｏ２４Ｓ２（１７４４．０）。
【０３１６】
【化１３４】
（配列番号：５６は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１６７０．０（［Ｍ＋Ｈ］＋３、理論値：１６７０．９）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．５分（勾配Ａ）；Ｃ７３Ｈ１１２Ｎ２０Ｏ２３Ｓ（１６６９．９）。
【０３１７】
【化１３５】
（配列番号：５７は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：５６％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１７２２．０（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１７２１．９）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：１１．４分（勾配Ａ）；Ｃ７３Ｈ１１３Ｎ１９Ｏ２５Ｓ２（１７２０．９）。
【０３１８】
【化１３６】
（配列番号：５７は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１６４７．５（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１６４７．８）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：１０．０分（勾配Ａ）；Ｃ７１Ｈ１１１Ｎ１９Ｏ２４Ｓ（１６４６．８）。
【０３１９】
【化１３７】
（配列番号：５８は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：６２％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１７７８．８（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１７７９．０）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：１０．８分（勾配Ａ）；Ｃ７５Ｈ１１６Ｎ２０Ｏ２６Ｓ２（１７７８）。
【０３２０】
【化１３８】
（配列番号：５８は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１７０４．９（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１７０４．９）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：１０．４分（勾配Ａ）；Ｃ７３Ｈ１１４Ｎ２０Ｏ２５Ｓ（１７０３．９）。
【０３２１】
実施例４１
Ｎ末端延長グリコペプチド試薬の合成
【０３２２】
【化１３９】
グリコペプチド類の固相ペプチド合成
Ｎ末端延長グリコペプチド類４４〜４８の合成は、Ｆｍｏｃ−保護Ｒｉｎｋアミド樹脂から出発して、Ｆｍｏｃ法に準じて固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により行った。不必要なモノマーの消費を避けるため、１当量だけを使用し、反応時間を６時間に増やした。３０２ｎｍでのＦｍｏｃ／ピペリジン付加物のＵＶ吸収により、これらの条件が許容しうるカップリング収率を提供することを示唆した。立体障害方側鎖を持つアミノ酸類は、Ｎ末端をグリコシル化アミノ酸に導入し、糖タンパク質配列を負荷する方法の適応性を実証した。たとえば、グリコペプチド４８は、Ｎ末端グリシンの導入前、配列：Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ（配列番号：６３）を含む。所望のアミノ酸配列をカップリングした後、先ずヒドラジンを使用してアセテート基を除去し、そして樹脂をトリフルオロ酢酸／チオアニソール／トリイソプロピルシラン／水（８５：５：５：５）で処理し、トリチル保護基、側鎖保護基を切断し、固体支持体からオリゴマーを放出させた。ＨＰＬＣによる精製後、グリコペプチド類４４〜４８を４６％と５２％との間の収率で得た。
【０３２３】
実施例４２
延長糖補助連結反応
アミノ酸類グリシン、ヒスチジン、アラニンおよびチロシンをＣ末端に持つチオエステル類を、Ｂｏｃ法によるＳＰＰＳを使用して合成した。
【０３２４】
Ｎ末端延長グリコペプチドおよびＣ末端グリシン残基を持つチオエステルの初期連結反応を、標準的な連結反応条件（６ＭのＧｎ．ＨＣｌ、１００ｍＭのリン酸二水素カリウム、２％ＰｈＳＨ、３７℃）で行った。ここで、これらの条件では、有意量の加水分解されたチオエステルをもたらし、連結反応収率は減少した。この問題を解決するため、様々な混合溶媒の連結反応条件を分析した。最も効果的な溶媒系は、Ｎ−メチルピロリジノンおよびＨＥＰＥＳ緩衝液（４：１ｖ／ｖＮＭＰ：６ＭのＧｎ．ＨＣｌ、１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．５、２％ＰｈＳＨ、３７℃）の混合物であり、これは、加水分解により最小損失のチオエステルにカップリングする容易な連結反応を可能にし、これらの条件下での全ての延長グリコペプチド類（４４〜４８）およびチオエステル（４９）の反応は、高収率で単離された連結反応生成物をもたらした。用語「延長ＳＡＬ」（ｅｘＳＡＬ）、「二倍」（ｄｅｘＳＡＬ）、「三倍」（ｔｅｘＳＡＬ）、「四倍」（ｑｅｘＳＡＬ）および「５倍延長」ＳＡＬ（ｐｅｘＳＡＬ）は、糖基を有する残基と遊離Ｎ末端アミノ基を持つ残基との間のアミノ酸残基の数を言う。ＳＡＬにおいては、糖を有するアミノ酸、たとえばセリンに結合するＧｌｙが存在する。ｅｘＳＡＬでは、１個の追加の介在アミノ酸残基が存在し、ｄｅｘＳＡＬでは、２個の追加の介在アミノ酸残基が存在し、その他同様である。延長ＳＡＬ（ｅｘＳＡＬ）により８６％の単離収率がもたらされ、それぞれ、７０％および６０％の収率である、２倍延長ＳＡＬ（ｄｅｘＳＡＬ）および３倍延長ＳＡＬ（ｔｅｘＳＡＬ）より有意に高かった。４倍延長および５倍延長ＳＡＬ（ｑｅｘＳＡＬおよびｐｅｘＳＡＬ）反応は、さらに低い収率（それぞれ３８％および４９％）で進んだ。
（配列番号：６４は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
【０３２５】
【化１４０】
グリコペプチド類４４〜４８およびＣ末端グリシンチオエステル４９の延長された糖補助連結反応の単離収率；条件：４：１ｖ／ｖＮＭＰ：６ＭのＧｎ．ＨＣｌ、１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．５、２％のＰｈＳＨ、３７℃、＊この連結反応のＨＰＬＣ収率は、ｔｅｘＳＡＬに類似していた。ＨＰＬＣによる単離が難しい生成物は、単離収率が減少した。
反応速度研究
これらの研究から、アミノ酸類をグリコペプチド類のＮ末端に付加させると、連結反応収率に、有意な減少があることが明らかになる。得られる単離収率にいくらかの光明を投じることを期待して、研究の次の段階は、反応の速度論を分析することに関する。この目的のために、延長ＳＡＬ方法の速度を、先に報告されたＳＡＬ方法と比較した。生成物形成の速度を、ＨＰＬＣにより、最初の１１時間は２時間ごとにモニタリングし、終点は２４時間後とした。ＳＡＬ反応の半減期は９時間であり、１２時間の半減期を示したｅｘＳＡＬ反応より僅かに速かった。連結反応速度は、追加のアミノ酸類がＮ末端に付加されると、より遅くなり始めた。興味深いことに、ｄｅｘＳＡＬ、ｔｅｘＳＡＬおよびｑｅｘＳＡＬ反応は、１９時間の半減期を持つ連結反応と類似する速度を示した。ｐｅｘＳＡＬにおける第６番目のアミノ酸残基の付加により、連結反応速度が大きく落ちる結果となり、そのため、反応は、２４時間後に４２％しか進まなかった。これらの反応速度研究により、ＳＡＬは、その延長された相当物より容易であるが、これらの速度は、大きさの順番によって異ならず、このように、これら延長方法の全て（ｅｘＳＡＬ、ｄｅｘＳＡＬ、ｔｅｘＳＡＬ、ｑｅｘＳＡＬおよびｐｅｘＳＡＬ）は、合成的に有用であることが示される。
【０３２６】
実施例４３
ｅｘＳＡＬの範囲
ｅｘＳＡＬ中の連結反応部にある他のアミノ酸残基の効果を研究するために、以下に示すグリコペプチド−ペプチドチオエステル対を調べた。Ｎ末端ヒスチジンを含有するグリコペプチド類と、アスパラギン酸残基とを、ＳＰＰＳ（Ｆｍｏｃ法）により合成した。これらを、Ｃ末端グリシン、ヒスチジンおよびアラニン残基を含むペプチドチオエステル類と、混合溶媒系で反応させた。グリコペプチド４４と、Ｃ末端グリシンを有するペプチドチオエステル４９との間の連結反応では、８６％の単離収率を得た。（上記エントリー１）。Ｃ末端ヒスチジン残基を含有するペプチドチオエステルは、先に報告したＳＡＬ法に従って、良好な収率（７０％、以下のエントリー２）で連結反応させた。チオエステル成分のＣ末端アミノ酸の立体的嵩高さの増加によって、連結反応効率は実質的に減少した（Ａｌａ−Ｇｌｙが４４％、以下のエントリー３）。Ｎ末端アスパラギン酸残基を有するグリコペプチド類は、注目に値する連結反応効率を達成した。このグリコペプチドを利用した単離連結反応収率は、グリシングリコペプチド４４の単離連結反応収率（６４〜９１％の収率、以下のエントリー７〜９）を超えていた。驚くべきことに、立体的に困難な連結反応部、たとえばＨｉｓ−Ｈｉｓ（７３％、以下のエントリー５）、Ａｌａ−Ｈｉｓ（７７％、以下のエントリー６）およびＨｉｓ−Ａｓｐ（９１％、以下のエントリー８）でさえ、優れた収率を示した。
【０３２７】
延長糖補助連結反応（ｅｘＳＡＬ）の範囲；条件：４：１ｖ／ｖＮＭＰ：６ＭのＧｎ．ＨＣｌ、１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．５、２％ＰｈＳＨ、３７℃。
（配列番号：７０は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
【０３２８】
【化１４１】
連結反応生成物の後続脱硫により、２位に未変性Ｎ−アセチル官能基を含有するグリコペプチド類を得た。これは、アルミナ上のパラジウムを使用する水素化条件によって行った。生成物を定量的収率（以下を参照）で、普通に単離（ＨＰＬＣ生成後）した。
【０３２９】
【化１４２】
ｄｅｘＳＡＬの範囲
ｄｅｘＳＡＬ方法を、種々のアミノ酸類に連結反応部で適用することにより、さらなる延長の範囲を試験した（以下を参照）。グリコペプチド類は、ＳＰＰＳ（Ｆｍｏｃ法）により合成した。これらのグリコペプチド類を、先に記載した混合溶媒系を使用して、Ｃ末端グリシン、アラニン、ヒスチジンおよびチロシン残基を有するペプチドチオエステル類と反応させた。グリシングリコペプチド類を使用する反応により、連結反応生成物を良好な収率（４４〜７０％）で得た。対照的に、Ｎ末端ヒスチジン残基を含有するグリコペプチド類は、延長ＳＡＬ法（２４〜４８％）と比べると、著しく低い収率で連結反応した。Ｇｌｙ−ＨｉｓおよびＨｉｓ−Ｈｉｓ連結反応は、十分な収率で単離したが、立体的に妨害されたアラニンおよびチロシンペプチドチオエステル類の導入により、収率が著しく低下する（それぞれ２８％および２４％）結果となった。アスパラギン酸塩で延長されたグリコペプチド類は、全てのケースにおいて、高収率（４９〜７６％）で連結反応させた。
（配列番号：７０は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
【０３３０】
【化１４３】
連結反応部で種々のアミノ酸類を用いた、ｅｘＳＡＬ法およびｄｅｘＳＡＬ法の観察された可撓性は、それぞれ、ｔｅｘＳＡＬ、ｑｅｘＳＡＬおよびｐｅｘＳＡＬによるグリコペプチド類４６〜４８を持つ立体障害ペプチドチオエステル類の連結反応にまで拡大された。これらのグリコペプチド類は、このチオエステルと満足のいく収率で連結反応させた（ｔｅｘＳＡＬ、ｑｅｘＳＡＬおよびｐｅｘＳＡＬに関し、それぞれ、４９、４８および３１％）。
（配列番号：７０は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
【０３３１】
【化１４４】
実施例４４
Ａｓｎ−結合糖部分を持つ連結反応
【０３３２】
【化１４５】
（配列番号：７８は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
Ａ）構造ブロック５６の合成：試薬および条件：ａ）プロパンジチオール、ＤＩＥＡ、ＭｅＯＨ、４時間、ｒｔ；ｂ）Ｆｍｏｃ−（Ａｓｐ）−ＯＡｌｌ、ＨＢＴＵ、ＤＩＥＡ、ＤＭＦ、１２時間、９０％；ｃ）Ｚｎ、ＡｃＯＨ、ｒｔ、１２時間、８５％；ｄ）ＴｒｔＳ−ＣＨ２−ＣＯＯＨ、ＨＢＴＵ、ＤＩＥＡ、ＤＭＦ、４時間、ｒｔ、７８％；ｅ）Ｐｄ（ＰＰｈ３）４、ＮＭＡ、ＴＨＦ、１時間、ｒｔ、９０％。
Ｂ）Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミドポリスチレン樹脂上のグリコペプチドのＳＰＰＳ合成
【図面の簡単な説明】
【０３３３】
【図１】本発明に従ってグリコペプチドを製造するための合成スキームを示す。
【技術分野】
【０００１】
政府の基金に関する声明
本発明は、アメリカ合衆国のＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって授与されたグラント番号ＧＭ４４１５４の下で、政府の支援によってなされた。米国合衆国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
先に出願された特許出願に対する優先権主張
本願は、２００６年３月２２日に出願された米国仮特許出願第６０／７４３，６６６号の、米国特許法第１１９（ｅ）条の下での利益を請求する。米国仮特許出願第６０／７４３，６６６号は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００３】
発明の分野
本発明は、ペプチドチオエステルと糖部分にチオール基を有するグリコペプチドとのカップリングによるペプチド結合の形成によって、ペプチド類およびグリコペプチド類を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
ペプチド類およびタンパク質の化学的合成は、広く研究されている分野であり、逐次カップリング反応を使用してそのような化合物を合成する方法、特にポリマーなどの固相への固定に関与する方法が開発されている。しかし、逐次合成方法は、より大きなペプチド類およびタンパク質の製造にはあまり適さない。このため、より小さなペプチド類を制御されたやり方で結合して大分子を製造するセグメントカップリング法が開発されてきている。
【０００５】
Ｄ．Ｓ．Ｋｅｍｐおよび共同研究者たちは、大ペプチドを製造する「チオール捕獲」法を開発した（（ａ）Ｋｅｍｐ，Ｄ．Ｓ．Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ１９８１，２０，１７９３−１８０４．（ｂ）Ｋｅｍｐ Ｄ．Ｓ．；Ｃａｒｅｙ，Ｒ．Ｉ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９３，５８，２２１６−２２２２）。これにより、追加のセグメントのカップリング法が導かれた。これらの中で、ネイティブケミカルライゲーション法は、タンパク質の化学的合成の有用なツールの代表である（Ｄａｗｓｏｎ，Ｐ．Ｅ．；Ｍｕｉｒ，Ｔ．Ｗ．；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ，Ｌ；Ｋｅｎｔ，Ｓ．Ｂ．Ｈ．Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９４，２６６，１１６−１１９）。このアプローチでは、Ｎ末端システイン残基が、ペプチドのシステインチオエステルとして、ペプチドチオエステルの捕獲に必要であり、これは次いで、自発的な分子内ＳからＮアシルへの転移により、連結反応部でアミド（ペプチド）結合を形成する。
【０００６】
連結反応部位でシステイン残基を必要とすることから生じる制限を克服するために、異なる方法が適用され、ペプチド結合技術のレパートリーが広がっている（（ａ）非特許文献１、（ｂ）非特許文献２、（ｃ）非特許文献３、（ｄ）非特許文献４）。除去可能なチオール系補助物質の使用は、システインのチオール側鎖と同じ機能を実現する魅力的なアプローチである。１−フェニル−２−メルカプトエチルおよび２−メルカプトベンジル基などの、システインの機能に類似した機能を発揮しうるＮα−結合補助物質を持つペプチド類が研究され、大ペプチド類の合成に成功裏に適用されている（（ａ）非特許文献５、（ｃ）非特許文献６、（ｄ）非特許文献７、（ｅ）非特許文献８、（ｆ）非特許文献９）。
【０００７】
簡単に入手しうる材料からのグリコペプチド類の合成は、構造的および機能的研究のための高分子量のペプチド類およびグリコペプチド類の製造の有利なアプローチの代表である。したがって、より大きなペプチド類およびタンパク質、グリコペプチド類および他のペプチド誘導体の改善された製造方法が依然として必要とされている。
【非特許文献１】Ｂｅｌｉｇｅｒｅ，Ｇ．Ｓ．；Ｄａｗｓｏｎ，Ｐ．Ｅ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９９，１２１，６３３２−６３３３
【非特許文献２】Ｙａｎ，Ｌ．Ｚ．；Ｄａｗｓｏｎ，Ｐ．Ｅ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００１，１２３，５２６−５３３
【非特許文献３】Ｓａｘｏｎ，Ｅ．；Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｊ．Ｌ；Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｃ．Ｒ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２０００，２，２１４１−２１４３
【非特許文献４】Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｂ．Ｌ．；Ｋｉｅｓｓｌｉｎｇ，Ｌ．Ｌ．；Ｒａｉｎｅｓ，Ｒ．Ｔ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２０００，２，１９３９−１９４１
【非特許文献５】Ｃａｎｎｅ，Ｌ．Ｅ．；Ｂａｒｋ，Ｓ．Ｊ．；Ｋｅｎｔ，Ｓ．Ｂ．Ｈ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９６，１１８，５８９１−５８９６
【非特許文献６】Ｌｏｗ，Ｄ．Ｗ．；Ｈｉｌｌ，Ｍ．Ｇ．；Ｃａｒｒａｓｃｏ，Ｍ．Ｒ．；Ｋｅｎｔ，Ｓ．Ｂ．Ｈ．；Ｂｏｔｔｉ，Ｐ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ Ｕ．Ｓ．Ａ．２００１，９８，６５５４−６５５９
【非特許文献７】Ｏｆｆｅｒ，Ｊ．；Ｂｏｄｄｙ，Ｃ；Ｄａｗｓｏｎ，Ｐ．Ｅ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００２，１２４，４６４２−４６４６
【非特許文献８】Ｍａｃｍｉｌｌａｎ，Ｄ．；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｗ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００４，６，４６５９−４６６２
【非特許文献９】Ｌｕ，Ｙ．−Ａ．；Ｔａｒｎ，Ｊ．Ｐ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００５，７，５００３−５００６
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の実施形態は、Ｃ末端カルボキシルチオエステルを含むペプチドと、側鎖グリコシルがチオール基を含有する遊離Ｎ末端アミノ基を持つ側鎖グリコシルペプチドとの間にペプチド結合を形成する方法であって、水性媒体中で２種類の試薬を接触させ、チオエステル交換反応の工程によって形成されたチオエステルから、アシル基の分子内ＳからＮへのシフトを介してカップリングされた生成物を形成することを含む方法に関する。
【０００９】
本発明の実施形態は、式（Ｉ）：
【００１０】
【化４】
（式中、
ｍは、０〜約１０であり；
ｎは、１〜約４であり；
ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して各部位で、Ｈまたはアルキルであり、またはＲａとＲｂとが一緒になって、オキソ（＝Ｏ）であり；
ｐは、１、２または３であり；
Ｘは、ＯまたはＣＨＲ３であり；
各Ｒ３は、独立して各部位で、水素、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、ヒドロキシまたはヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり、任意のヒドロキシまたはヒドロキシアルキルは、単糖類、二糖類、オリゴ糖またはヒドロキシ保護基でＯ置換されていてよく；ただし、１個のＲ３は、−ＯＣ（＝Ｏ）（ＣＨ（ＲＳ））ｎＳＨまたは−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ（Ｒｓ））ｎＳＨ（式中、Ｒｓは、独立して各部位で、水素または（Ｃ１−Ｃ６）アルキル（（Ｃ１−Ｃ６）アルキルの任意の炭素原子は、Ｊで置換されていてよい）であり、ｓは１〜約６である）を含み；
Ｙは、Ｃ（Ｒ４Ｒ５）、Ｏ、ＮＨまたはＳであり；
Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたはＪであり；
ＸおよびＹを有する炭素原子は、ＲまたはＳ配置であり；
各ＮＲは、独立して、ＮＨまたはＮ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり、またはＮＲは、ＮＲを有する炭素原子に結合するＲｃまたはＲｅと一緒になって、４〜７員環を形成することができ、または、
各Ｒｃ、Ｒｃ’、ＲｅおよびＲｅ’は、独立して各部位で、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキルまたはヘテロシクリル、あるいはブロックされていないまたは保護基でブロックされている可能性のある天然アミノ酸の側鎖であり；あるいはＲｃおよびＲｃ’またはＲｅおよびＲｅ’、あるいは両方が、これらが結合する炭素原子と一緒になって、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；任意のアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキルまたはヘテロシクリルは、０〜３個のＪで置換され；
Ｊは、ハロゲン、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、（Ｃ１−６）アルキル、（Ｃ１−６）アルコキシ、シクロアルキル、カルボキシ；アセタミド、ヒドロキシ、ヒドロキシ（Ｃ１−６）アルキル、トリフルオロメトキシ、スルファモイル、カルバモイル、スルホンアミド、アルキルスルホニルまたはアリールスルホニルであり；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ペプチド残基またはグリコペプチド残基である）の化合物、およびその任意の立体異性体、互変異性体、溶媒和物、水和物、塩類を製造する方法であって、
式（ＩＩ）：
【００１１】
【化５】
の化合物を、式（ＩＩＩ）：
【００１２】
【化６】
（式中、Ｒｄは、アルキル、アリール、アラルキル、カルボキシアルキルまたはカルボサアミドアルキルである）の化合物と接触させ、式（Ｉ）の化合物を得ることを含む方法に関する。
【００１３】
本発明の方法は、より大きなペプチド類、タンパク質およびそれらの誘導体の製造に大きな利点を提供する。化学的技術を使用しても、または生物学的技術を使用しても、製造することが困難な可能性のある大ペプチド類およびタンパク質は、医薬における治療用途および診断用途に非常に重大なものである。大ペプチド類およびタンパク質の合成のための生物学的技術は、一般的に、必須アミノ酸類に大きく限定され、特定の誘導体は、最終生成物の反応によって得ることが困難である。したがって、非天然アミノ酸類を含む、または側鎖に結合する非アミノ酸基を有するなどの大ペプチド類およびタンパク質の製造を可能にする化学的アプローチに汎用性を持たせることは、有利なことである。しかし、固相技術を使用する化学的合成は、まだ、非天然アミノ酸類および他の誘導体を含有しうる、より小さなペプチド類に大きく制限される。したがって、これらのより小さなペプチド類からより大きなペプチド類をアセンブリする効率的な技術が必要である。本発明は、効率的なセグメント連結反応アプローチによって、高収率および良好な純度で、より小さなペプチド類からより大きなものへのアセンブリを可能にする技術を提供する。さらに、ポリペプチド類の化学的合成で典型的に使用されるのは過酷な脱保護条件なので、適切な折りたたみおよび配座の達成において最終生成物を補助することができる、アミノ酸側鎖に保護基を有することを必要とせず、ペプチド類の使用を大いに可能にする本発明の方法は、最終生成物を変性する働きをすることができる。
【００１４】
本発明の方法は、連結反応部位でシステイン残基を必要としない、グリコペプチド類および糖タンパク質の合成において使用され、本発明の化学的合成方法の殆どはこれに頼る。これは、水溶液中で２種の保護されていないペプチド類の選択的連結反応を可能にし、より大きなグリコペプチドを与える。さらに、骨格をさらに複雑なグリコペプチド構造とし、その糖部分をさらに酵素方法により合成し、より複雑な糖タンパク質のグリコペプチドとすることもできる。
【００１５】
あるいは、変性糖部分を化学的方法または生物学的手段により除去し、脱グリコシル化されたペプチド類およびタンパク質を提供することもできる。
【００１６】
生成物のチオール基は除去され、グリコシルペプチドまたはアセタミドグリコシルペプチドを提供することができる。したがって、本発明の実施形態は、本発明の方法であって、さらに、式（Ｉ）（式中、Ｗは、ＯまたはＮＨである）の化合物を、触媒の存在下水素源と接触させることによって、式（Ｉ）の化合物を脱硫することを含む方法に関する。チオール基は還元除去され、アセタミドグリコシルペプチドを得る。
【００１７】
本発明の他の実施形態は、本発明の方法であって、さらに、式（Ｉ）（式中、ＷはＯである）の化合物を、ヒドラジンまたはアルカリ溶液と接触させることによって、該化合物を脱硫することを含む方法に関する。チオアセチルエステル基は、アルカリ条件によって切断され、先にチオアセテートを有している位置で、保護されていないヒドロキシル基を得、グリコシルペプチドを得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
定義
本発明のある請求項ならびに構造および式を伴って示される実施例について詳細に述べる。本発明を、列挙された請求項に関連して説明するが、本発明は、これらの請求項に限定されないことは理解すべきである。対して、本発明は、請求項によって定義された本発明の範囲内に含有されうる、全ての代替、修飾および等価物を包含するものである。
【００１９】
明細書中の「一実施形態」、「実施形態」、「好ましい実施形態」などについては、記載された実施形態が、ある特定の機能、構造、または特徴を有しうることを示すが、全ての実施形態において、その特定の機能、構造、または特徴を有する必要はない。さらに、該語句は、同じ実施形態に関する必要はない。また、ある特定の機能、構造または特徴が、実施形態に関連して記載されている場合、明記されている、いないに関係なく、他の実施形態に関連して、そのような機能、構造または特徴に影響を及ぼすことは、当業者の知識の範囲内であることは甘受される。
【００２０】
用語「アミノ酸」は、リボソームアミノ酸類（たとえば、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＶａｌ）を含む。ただし、これらはそれぞれ、ＤまたはＬ型であってよく、および非リボソームアミノ酸類以外の天然アミノ酸（たとえば、ホスホセリン、ホスホトレオニン、ホスホチロシン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシン、ガンマ−カルボキシグルタメート；馬尿酸、オクタヒドロインドール−２−カルボン酸、スタチン、１，２，３，４，−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、ペニシラミン、オルニチン、シトルリン、α−メチル−アラニン、パラ−ベンゾイルフェニルアラニン、フェニルグリシン、プロパルギルグリシン、サルコシンおよびｔｅｒｔ−ブチルグリシン）であってよい。さらに、該用語は、自然界では見られないα−アミノ酸、たとえば、フルオロ置換アミノ酸類およびアミノ基がカルボキシル基に関してα関係でないアミノ酸類、たとえば、β−、γ−およびδ−アミノ酸類も包含する。
【００２１】
また、用語「アミノ酸」は、常套のアミノ保護基（たとえば、アセチルまたはベンジルオキシカルボニル）を有する天然および非天然アミノ酸類、およびカルボキシ末端で保護された天然および非天然アミノ酸類（たとえば、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、フェニルまたはベンジルエステルまたはアミドとして；またはα−メチルベンジルアミドとして）、およびカルボキシル、カルボキサミド、アミノ、グアニド、チオ、ヒドロキシルおよび保護基を有する他の基などの側鎖を持つアミノ酸類も含む。これらのタイプの全ての追加の適切な保護基は、当業者に公知である（たとえば、Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．；Ｗｕｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｐｒｏｔｅｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ Ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第二編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）、およびこれらに列挙された参考例を参照）。
【００２２】
本明細書で使用される用語「アミノ酸側鎖」は、アミノ酸のカルボン酸（ＣＯＯＨ）基以外のアミノ酸の炭素原子に結合する１価のラジカルを言う。本発明の特定の実施形態では、用語「アミノ酸側鎖」は、リボソームα−アミノ酸の以下の構造に例示されるように、基Ｒを言うことができる。
【００２３】
【化７】
（式中、Ｒはメチル（Ａｌａ）；Ｒは３−グアニドプロピル（Ａｒｇ）；Ｒはカルボキサミドメチル（Ａｓｎ）；Ｒはカルボキシメチル（Ａｓｐ）；Ｒはチオールメチル（Ｃｙｓ）；Ｒはカルボキシエチル（Ｇｌｕ）；Ｒはカルボキサミドエチル（Ｇｌｎ）；Ｒは水素（Ｇｌｙ）；Ｒは（４−イミダゾリル）メチル（Ｈｉｓ）；Ｒはイソブチル（Ｉｌｅ）；Ｒはｓｅｃ−ブチル（Ｌｅｕ）；Ｒは４−アミノブチル（Ｌｙｓ）；Ｒは２−（メチルチオ）エチル（Ｍｅｔ）；Ｒはベンジル（Ｐｈｅ）；Ｒはヒドロキシメチル（Ｓｅｒ）；Ｒは１−ヒドロキシエチル（Ｔｈｒ）；Ｒは３−インドリルメチル（Ｔｒｐ）；Ｒはｐ−ヒドロキシベンジル（Ｔｙｒ）；およびＲはイソプロピル（Ｖａｌ）である）。追加の炭素原子が、アミノ酸のカルボキシル基とアミノ基との間に存在してもよく、Ｒ基は、それらの任意の炭素原子上の残基であってもよいことは理解される。α−アミノ酸において、構造は先に示したが、「アミノ酸側鎖」は、β−、γ−またはδ−アミノ酸のカルボキシル炭素以外の炭素原子上に配置されていてよい。
【００２４】
用語「ペプチド」は、アミノ酸類がアミド（ペプチド）結合によって順次結合した２個以上のアミノ酸類の配列（たとえば、先に記載したように）を言う。配列は、直線でも環状でもよい。配列が環状の場合、ペプチドは、さらに、アミノ酸に結合する他の結合タイプ、たとえば、エステル結合（デプシペプチド）またはジスルフィド結合を含んでよい。たとえば、環状ペプチドは、ある配列中の２個のシステイン残基の間にジスルフィド架橋を形成することによって製造することができ、またはその結果得られるものであってよい。本明細書で具体的に挙げるペプチド配列は、左側がアミノまたはＮ−末端、右側がカルボキシまたはＣ末端として記載されている。
【００２５】
「ペプチド残基」は、アミノ酸類の配列、すなわち、アミド結合によって結合しているアミノ酸類を言い、これは、Ｎ末端およびＣ末端は、必ずしも遊離した形態である必要はなく、さらに、追加のアミノ酸または他のラジカルに結合していてよい。したがって、単一のペプチドは、本明細書で定義する、大きな一組の可能性のあるペプチド残基を含有してよい。
【００２６】
本明細書で使用する用語「炭水化物」は、糖類として通常知られている化合物、および糖に化学的に関連のある化合物のクラスを含む。したがって、該用語は、単一の単糖類、二糖類および高分子物質を含む。該用語は、糖類、デンプン類、ガム類、セルロースおよびヘミセルロースを含む化合物群を包含する。さらに、該用語は、糖誘導体、たとえば、２−アミノ−２−デオキシグルコースのようなアミノ糖類、およびそれらのオリゴマーおよびポリマー、硫酸化糖類；およびヒドロキシル、アミノ、および保護基を有する他の基を持つ糖類も包含する。
【００２７】
本明細書で定義する炭水化物は、ベータ（β）またはアルファ（α）アノマー立体化学を持つ糖類または糖誘導体を含み；さらに該糖類は、（Ｒ）または（Ｓ）相対配置を有することができ、（＋）または（−）異性体として存在することができ、ＤまたはＬ配置で存在することができる。用語「アノマー」または「アノマーの」は、当該分野で周知のように、アセタール、ヘミアセタールまたはケタール炭素原子での立体化学的配置を言う。
【００２８】
用語「グリコペプチド」は、炭水化物に共有結合するペプチドを言う。典型的には、炭水化物は、ヒドロキシル、アミノ、アミド、またはカルボキシル基を含むアミノ酸側鎖を介して結合する。炭水化物は、アノマーヒドロキシル基を介して、他のヒドロキシル基を介して、アミノ基を介して、あるいは他の官能基を介して、炭水化物部分に結合してよい。
【００２９】
「アルキル」は、第一級、第二級、第三級または環状炭素原子を含有するＣ１〜約Ｃ１８炭化水素を言う。例示として、メチル（Ｍｅ，−ＣＨ３）、エチル（Ｅｔ，−ＣＨ２ＣＨ３）、１−プロピル（ｎ−Ｐｒ，ｎ−プロピル，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−プロピル（ｉ−Ｐｒ，ｉ−プロピル，−ＣＨ（ＣＨ３）２）、１−ブチル（ｎ−Ｂｕ，ｎ−ブチル，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−メチル−１−プロピル（ｉ−Ｂｕ，ｉ−ブチル，−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）、２−ブチル（ｓ−Ｂｕ，ｓ−ブチル，−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）、２−メチル−２−プロピル（ｔ−Ｂｕ，ｔ−ブチル，−Ｃ（ＣＨ３）３）などがある。アルキルは、先に記載し例示したように、単一ラジカルに結合することができる１価のラジカル、あるいは２個の異なる１価のラジカルまたは単一の２価のラジカルに結合することができる２価のラジカルであってよい。
【００３０】
アルキルは、場合によっては、１個以上のアルキル、アルケニル、アルキリデニル、アルケニリデニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、アセタミド、アセトキシ、アセチル、ベンズアミド、ベンゼンスルフィニル、ベンゼンスルホンアミド、ベンゼンスルホニル、ベンゼンスルホニルアミノ、ベンゾイル、ベンゾイルアミノ、ベンゾイルオキシ、ベンジル、ベンジルオキシ、ベンジルオキシカルボニル、ベンジルチオ、カルバモイル、カルバメート、イソシアナト、スルファモイル、スルフィナモイル、スルフィノ、スルホ、スルホアミノ、チオスルホ、ＮＲｘＲｙおよび／またはＣＯＯＲｘ（式中、ＲｘおよびＲｙは、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ環、シクロアルキルまたはヒドロキシである）で置換されうる。アルキルは、場合によっては、１個以上の非パーオキシドオキシ（−Ｏ−）、チオ（−Ｓ−）、イミノ（−Ｎ（Ｈ）−）、メチレンジオキシ（−ＯＣＨ２Ｏ−）、カルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）、カルボキシ（−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−）、カルボニルジオキシ（−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−）、カルボキシレート（−ＯＣ（＝Ｏ）−）、イミン（Ｃ＝ＮＨ）、スルフィニル（ＳＯ）またはスルホニル（ＳＯ２）で分断されうる。さらに、アルキルは、場合によっては、少なくとも部分的に不飽和で、それによってアルケニルを提供することができる。
【００３１】
用語「アリール」は、単環（たとえば、フェニル）または複数の縮合環を有する６〜約２０個の炭素原子の不飽和芳香族炭素環基であって、少なくとも１個の環は芳香族（たとえば、ナフチル、ジヒドロフェナントレニル、フルオレニルまたはアントリル）である基を言う。好ましいアリールとして、フェニル、ナフチルなどが挙げられる。
【００３２】
アリールは、場合によっては、１個以上のアルキル、アルケニル、アルキリデニル、アルケニリデニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、アセタミド、アセトキシ、アセチル、ベンズアミド、ベンゼンスルフィニル、ベンゼンスルホンアミド、ベンゼンスルホニル、ベンゼンスルホニルアミノ、ベンゾイル、ベンゾイルアミノ、ベンゾイルオキシ、ベンジル、ベンジルオキシ、ベンジルオキシカルボニル、ベンジルチオ、カルバモイル、カルバメート、イソシアナト、スルファモイル、スルフィナモイル、スルフィノ、スルホ、スルホアミノ、チオスルホ、ＮＲｘＲｙおよび／またはＣＯＯＲｘ（式中、ＲｘおよびＲｙは、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ環、シクロアルキルまたはヒドロキシである）で置換されうる。
【００３３】
用語「シクロアルキル」は、単一の環または複数の縮合環、たとえば、ビシクロ、トリシクロ、またはそれ以上のポリシクロ部分を有する３〜２０個の炭素原子の環状アルキル基を言う。そのようなシクロアルキル基として、たとえば、単環構造、たとえば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロオクチルなど、または複数の環構造、たとえば、アダマンタニル、ピナン類のようなビシクロ構造体などが挙げられる。
【００３４】
シクロアルキルは、場合によっては、１個以上のアルキル、アルケニル、アルキリデニル、アルケニリデニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、アセタミド、アセトキシ、アセチル、ベンズアミド、ベンゼンスルフィニル、ベンゼンスルホンアミド、ベンゼンスルホニル、ベンゼンスルホニルアミノ、ベンゾイル、ベンゾイルアミノ、ベンゾイルオキシ、ベンジル、ベンジルオキシ、ベンジルオキシカルボニル、ベンジルチオ、カルバモイル、カルバメート、イソシアナト、スルファモイル、スルフィナモイル、スルフィノ、スルホ、スルホアミノ、チオスルホ、ＮＲｘＲｙおよび／またはＣＯＯＲｘ（式中、ＲｘおよびＲｙは、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ環、シクロアルキルまたはヒドロキシである）で置換されうる。
【００３５】
シクロアルキルは、場合によっては、少なくとも部分的に不飽和で、それによりシクロアルケニルを提供しうる。
【００３６】
用語「ヘテロシクロアルキル」は、環炭素原子の１個以上が、ヘテロ原子、たとえば、酸素、窒素、リンまたはイオウによって置き換えられたシクロアルキル基を言う。該用語は、２個以上の炭素原子が置き換えられ、各原子が異なるタイプのヘテロ原子で置き換えられた構造も包含する。
【００３７】
用語「ヘテロアリール」は、本明細書では、１、２または３個の芳香族環を含み、芳香族環中に少なくとも１個の窒素、酸素またはイオウ原子を含む単環、二環または三環の環系であって、置換されていなくても置換されていてもよい環系と定義される。ヘテロアリール基の例として、２Ｈ−ピロリル、３Ｈ−インドリル、４Ｈ−キノリジニル、４ｎＨ−カルバゾリル、アクリジニル、ベンゾ［ｂ］チエニル、ベンゾチアゾリル、β−カルボリニル、カルバゾリル、クロメニル、シンナオリニル（ｃｉｎｎａｏｌｉｎｙｌ）、ジベンゾ［ｂ，ｄ］フラニル、フラザニル、フリル、イミダゾリル、イミジゾリル、インダゾリル、インドリシニル（ｉｎｄｏｌｉｓｉｎｙｌ）、インドリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、ナフチリジニル、ナフト［２，３−ｂ］、オキサゾリル、ペリミジニル、フェナンチリジニル、フェナントロリニル、フェナルサジニル（ｐｈｅｎａｒｓａｚｉｎｙｌ）、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサチイニル、フェノキサジニル、フタラジニル、プテリジニル、プリニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピリミジニル、ピロリル、キナゾリニル、キノリル、キノキサリニル、チアジアゾリル、チアントレニル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリルおよびキサンテニルが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、用語「ヘテロアリール」は、炭素、およびパーオキシドではない酸素、イオウおよびＮ（Ｚ）（式中、Ｚは存在しない、あるいはΗ、Ｏ、アルキル、フェニルまたはベンジルである）の群から独立して選択される１、２、３または４個のヘテロ原子を含む５または６個の環原子を含む単環芳香族環を示す。別の実施形態では、ヘテロアリールは、約８〜１０個の環原子のオルソ−縮合二環式ヘテロ環、特にベンズ誘導体またはプロピレンまたはテトラメチレンジラジカルをベンズ誘導体に縮合することによって誘導されるものを示す。
【００３８】
ヘテロアリールは、場合によっては、１個以上のアルキル、アルケニル、アルキリデニル、アルケニリデニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、アセタミド、アセトキシ、アセチル、ベンズアミド、ベンゼンスルフィニル、ベンゼンスルホンアミド、ベンゼンスルホニル、ベンゼンスルホニルアミノ、ベンゾイル、ベンゾイルアミノ、ベンゾイルオキシ、ベンジル、ベンジルオキシ、ベンジルオキシカルボニル、ベンジルチオ、カルバモイル、カルバメート、イソシアナト、スルファモイル、スルフィンアモイル、スルフィノ、スルホ、スルホアミノ、チオスルホ、ＮＲｘＲｙおよび／またはＣＯＯＲｘ（式中、ＲｘおよびＲｙは、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ環、シクロアルキルまたはヒドロキシである）で置換されうる。
【００３９】
本明細書で使用される「ラジカル」は、任意の原子組成の分子構造単位を言う。「１価のラジカル」は、１個の分子に１個の共有結合を形成しうる、１非充填原子価を持つ分子構造単位である。「２価のラジカル」は、２個の分子全体のそれぞれに１個の共有結合を形成しうる、または１個の分子全体に共有二重結合を形成する、２非充填原子価を持つ構造単位である。ラジカルは、１個の原子でもよく、非常に複雑な多原子構造であってよい。
【００４０】
用語「アミノ」は、−ＮＨ２を言い、用語「アルキルアミノ」は、−ＮＲ２（式中、少なくとも１個のＲはアルキルであり、第２のＲは、アルキルまたは水素である）を言う。用語「アシルアミノ」は、ＲＣ（＝Ｏ）Ｎ（式中、Ｒは、アルキルまたはアリールである）を言う。
【００４１】
用語「カルボキシ」または「カルボキシル」は、１価のラジカル：−ＣＯ２Ｈまたは−ＣＯ２Ｍ（式中、Ｍは、カチオンであり、−ＣＯ２部分は、負の電荷を帯びる）を言い、どちらの基も、置換基に対する単結合の形成により充填される１個の追加の原子価を持つ。Ｃ（＝Ｏ）ラジカルは、「カルボニル」と言われ、２個の別々の置換基への単結合によって、または１個の置換基に二重結合によって充填される、２原子価を持つ、２価のラジカルである。
【００４２】
用語「チオール」または「メルカプト」は、１価のラジカル：−ＳＨを言う。充填されていない１価に関して、１個の置換基に結合しうる。
【００４３】
本明細書で使用される用語「ヒドロキシル」または「ヒドロキシ」は、典型的には炭素原子に結合する１価の−ＯＨラジカルを言うが、該用語は、ヘテロ原子に結合する−ＯＨ基も包含する。「ヒドロキシル保護基」は、−ＯＨ基の水素原子を置き換え、ある条件下で、該基の反応性をより低く、あるいは反応性をなくすようにしうるような任意の基を言う。たとえば、Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．；Ｗｕｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ Ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）およびその引用文献を参照のこと。したがって、本明細書で使用される「ヒドロキシル保護基」は、アセテート類およびベンゾエート類などのエステル類、炭酸メチルなどの炭酸エステル類、ジメチルアミノカルバメートなどのウレタン類、テトラヒドロピラニルエーテルおよびメトキシメチルエーテルなどのアセタール類、ｐ−トルエンスルホニルエステルなどのスルホネートエステル類、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルエーテルなどのシリルエーテル類を包含する。
【００４４】
本明細書で使用される用語「オキソ」またはオキソ基」は、式：＝Ｏの２価のラジカルであって、１個の酸素原子は、共有二重結合を介して、他の原子と結合するラジカルを言う。オキソ基が炭素原子に結合する場合、該基は、カルボニルラジカルである。
【００４５】
本発明による、炭水化物補助グリコペプチド連結反応（「糖補助連結反応（ＳＡＬ）」）は、ペプチドのアミノ酸側鎖に共有結合し、該ペプチドと、Ｃ末端チオエステル基を有する他のペプチドとをカップリングさせるチオール含有炭水化物部分の使用を含む。本明細書で記載するように、アミノ酸残基に共有結合する糖部分は、メルカプトアセテートまたはメルカプトアセタミドなどのチオール含有部分を含有し、これは、ペプチドチオエステル試薬でチオエステルを形成し、内部チオエステルは、次いで、分子内ＳからＮへのアシル移動を起こす。好ましい実施形態では、カップリング反応は、水溶液中で行われ、多くの場合、アミノ酸側鎖保護基を使用することなく行われうる。また、炭水化物ヒドロキシル基は、保護されていない形態で存在してもよい。「ネイティブケミカルライゲーション（ＮＣＬ）」は、ペプチドチオエステルとＮ末端アミノ酸がシステインであるペプチドとの間で行うことができ、チオエステル結合は、最初、システインで形成され、次いで分子内ＳからＮへのアシル移動が行われる。
【００４６】
炭水化物チオール基の指向効果により得られる高カップリング収率は、本発明の特筆すべき機能である。これは、フラグメント連結反応方法を、既存の技術と関連させて使用する場合、高分子量ペプチド類の製造を簡単にする。
【００４７】
明らかに、本発明の数多くの修飾および変形が、前記技術に照らして可能である。したがって、本明細書での具体的な記載によりというより、添付の請求項の範囲内で、本発明を実施することができることが理解されよう。
【００４８】
以下に示す特定の範囲、値および実施形態は、説明目的のためだけに記載したものであり、請求項によって定義される本発明の範囲を限定するものではない。
【００４９】
特定の範囲、値および実施形態
本発明の実施形態は、式（Ｉ）：
【００５０】
【化８】
（式中、
ｍは、０〜約１０であり；
ｎは、１〜約４であり；
ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して各部位で、Ｈまたはアルキルであり、またはＲａとＲｂとが一緒になって、オキソ（＝Ｏ）であり；
ｐは、１、２または３であり；
Ｘは、ＯまたはＣＨＲ３であり；
各Ｒ３は、独立して各部位で、水素、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、ヒドロキシまたはヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり、任意のヒドロキシまたはヒドロキシアルキルは、単糖類、二糖類、オリゴ糖またはヒドロキシ保護基でＯ置換されていてよく；ただし、１個のＲ３は、−ＯＣ（＝Ｏ）（ＣＨ（ＲＳ））ｎＳＨまたは−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ（Ｒｓ））ｎＳＨ（式中、Ｒｓは、独立して各部位で、水素または（Ｃ１−Ｃ６）アルキル（（Ｃ１−Ｃ６）アルキルの任意の炭素原子は、Ｊで置換されてもよい）であり、ｓは１〜約６である）を含み；
Ｙは、Ｃ（Ｒ４Ｒ５）、Ｏ、ＮＨまたはＳであり；
Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたはＪであり；
ＸおよびＹを有する炭素原子は、ＲまたはＳ配置であり；
各ＮＲは、独立して、ＮＨまたはＮ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり、またはＮＲは、ＮＲを有する炭素原子に結合するＲｃまたはＲｅと一緒になって、４〜７員環を形成することができ、または、
各Ｒｃ、Ｒｃ’、ＲｅおよびＲｅ’は、独立して各部位で、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキルまたはヘテロシクリル、あるいはブロックされていないまたは保護基でブロックされている可能性のある天然アミノ酸の側鎖であり；あるいはＲｃおよびＲｃ’またはＲｅおよびＲｅ’、あるいは両方が、これらが結合する炭素原子と一緒になって、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；任意のアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキルまたはヘテロシクリルは、０〜３個のＪで置換され；
Ｊは、ハロゲン、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、（Ｃ１−６）アルキル、（Ｃ１−６）アルコキシ、シクロアルキル、カルボキシ；アセタミド、ヒドロキシ、ヒドロキシ（Ｃ１−６）アルキル、トリフルオロメトキシ、スルファモイル、カルバモイル、スルホンアミド、アルキルスルホニルまたはアリールスルホニルであり；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ペプチド残基またはグリコペプチド残基である）の化合物、およびその任意の立体異性体、互変異性体、溶媒和物、水和物、塩類を製造する方法であって、
式（ＩＩ）：
【００５１】
【化９】
の化合物を、式（ＩＩＩ）：
【００５２】
【化１０】
（式中、Ｒｄは、アルキル、アリール、アラルキル、カルボキシアルキルまたはカルボキサミドアルキルである）の化合物と接触させ、式（Ｉ）の化合物を得ることを含む方法に関する。
【００５３】
式（Ｉ）の化合物に関しては以下の通りである。
【００５４】
ｍの具体的な値は、１、２、３、４、５または６である。
【００５５】
ｎの具体的な値は、１、２または３である。
【００５６】
ｐの具体的な値は、１または２である。
【００５７】
Ｒａの具体的な値は、Ｈ、またはメチルである。
【００５８】
Ｒｂの具体的な値は、Ｈである。
【００５９】
各Ｒ３の具体的な値は、ＯＨである。
【００６０】
Ｗの具体的な値は、ＮＨまたはＯである。
【００６１】
Ｘの具体的な値は、Ｏである。
【００６２】
Ｙの具体的な値は、Ｏである。
【００６３】
Ｒｃの具体的な値は、アミノ酸側鎖である。Ｒｃの別の具体的な値は、Ｈ、メチルまたは（４−イミダゾリル）−メチルである。
【００６４】
Ｒｃの具体的な値は、アミノ酸側鎖である。別の具体的な値は、Ｈである。
【００６５】
各Ｒの具体的な値は、Ｈである。
【００６６】
ＲとＲｃとが一緒になった別の具体的な値は、ピロリジン環である。
【００６７】
Ｒ１の具体的な値は、Ｎ−アセチル−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号：１は、非修飾アミノ酸類に相当する）である。
【００６８】
Ｒ２の具体的な値は、フェニルアラニンアミドである。別の具体的な値は、Ｐ−Ｙ−Ｇ−Ｓ−ＮＨ２（配列番号：２は、非修飾アミノ酸類に相当する）である。
【００６９】
式（ＩＩ）の化合物に関しては以下の通りである。
【００７０】
ｍの具体的な値は、１、２、３、４、５または６である。
【００７１】
ｎの具体的な値は、１、２または３である。
【００７２】
ｐの具体的な値は、１または２である。
【００７３】
Ｒａの具体的な値は、Ｈまたはメチルである。
【００７４】
Ｒｂの具体的な値は、Ｈである。
【００７５】
各Ｒ３の具体的な値は、ＯＨである。
【００７６】
Ｗの具体的な値は、ＮＨまたはＯである。
【００７７】
Ｘの具体的な値の具体的な値は、Ｏである。
【００７８】
Ｙの具体的な値は、Ｏである。
【００７９】
Ｒｃの具体的な値は、アミノ酸側鎖である。Ｒｃの別の具体的な値は、Ｈ、メチルまたは（４−イミダゾリル）−メチルである。
【００８０】
Ｒｃの具体的な値は、アミノ酸側鎖である。別の具体的な値は、Ｈである。
【００８１】
各Ｒの具体的な値は、Ｈである。
【００８２】
ＲとＲｃとが一緒になった別の具体的な値は、ピロリジン環である。
【００８３】
Ｒ１の具体的な値は、Ｎ−アセチル−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号；１は、非修飾アミノ酸類に相当する）である。
【００８４】
Ｒ２の具体的な値は、フェニルアラニンアミドである。別の具体的な値は、Ｐ−Ｙ−Ｇ−Ｓ−ＮＨ２（配列番号：２は、非修飾アミノ酸類に相当する）である。
【００８５】
式（ＩＩＩ）の化合物に関しては、以下の通りである。
【００８６】
Ｒ１の具体的な値は、Ｎ−アセチル−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａである。
【００８７】
Ｒｄの具体的な値は、フェニルまたは−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ２である。
【００８８】
詳細な記載
図１を参照すると、本発明の実施形態による合成スキームが示されている。生成物のＮ末端セグメントを形成する「ペプチド１」と言うペプチドを、アミド（ペプチド）結合形成のためのセグメントを活性化する働きをするＣ末端カルボキシチオエステルで製造する。ペプチド１は、場合によっては、そのＮ末端を、たとえば、Ｎ−アセチル基で保護してもよく、あるいは遊離アミノ基を有してもよい。そうでなければ、システイン残基が配列中に存在する場合を除いて、側鎖部分をブロックまたは保護する必要はない。リシンの場合のように遊離アミノ基、チロシン、セリンおよびスレオニンの場合のように遊離ヒドロキシル基、アルギニンの場合のように遊離グアニド基、アスパルテートまたはグルタメートの場合のように遊離のカルボキシル基、ならびにアスパラギンおよびグルタミンの場合のように遊離カルボキサミド基を含む側鎖が、カップリング反応の間、保護されていない形態で存在してもよい。しかし、システイン残基は、たとえば、アセタミドメチルまたはｔｅｒｔ−ブチル誘導体として、カップリング反応中、ブロックすることができる。
【００８９】
本発明の方法において反応体として使用するためのペプチド１チオエステルを製造するために、Ｃ末端カルボキシル基を、任意の適切な方法を使用して、チオエステルの形態で得てもよい。Ｃ末端チオエステル基は、公知の固相ペプチド合成手法を使用して得るのが好ましく、該手法では、アンカーポリマーを、アセンブルされたペプチドを該ポリマーから最終除去する際、望ましいチオエステルが得られる基で誘導体化する。最終的にチオエステルが得られる基は、ペプチド１の固相合成の前に、前記ポリマーとカップリングさせる。たとえば、３−（トリチルチオ）プロピオネート残基を該ポリマーに結合することによって、β−メルカプトプロピオニル基を、ｐ−メチルベンズホドリルアミン−（ＭＢＨＡ）置換ポリスチレンなどのポリマーにプレロードし、次いで酸を持つＳ−トリチル基を除去することができる。３−（トリチルチオ）プロピオニル残基がプレロードされたＭＢＨＡ樹脂は、たとえば、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（登録商標）カタログ番号０１−６４−０４４９として、市販されている。次いで、ペプチドの残りを合成し、その後、側鎖の脱ブロックおよび所望の場合α−アミノ基の脱ブロックとなる条件で、該樹脂から切断し、β−メルカプトプロピオンアミドチオエステルとして、Ｃ末端カルボキシル基を持つペプチド１を得る。
【００９０】
図１において、「ペプチド２」として示されているペプチドセグメントは、カップリングされたグリコペプチドのＣ末端部分を形成する。ペプチド２は、炭水化物部分を共有結合する側鎖を有するアミノ酸を含む。ペプチド２は、本発明の方法によって、ペプチド１のカルボキシルチオエステルとカップリングするα−アミノ基を含む。好ましい実施形態では、炭水化物部分は、ペプチド２に共有結合する２−アミノ−２−デオキシグルコース基を含み、ここでは、糖類の２−アミノ基が、メルカプトアセテート基に共有結合している。結合チオール基を持つ炭水化物部分は、セリン側鎖のヒドロキシル基を持つグルコシド結合を介してペプチドに結合するのが好ましい。あるいは、本発明の原理を逸脱しなければ、炭水化物部分は、スレオニン側鎖のヒドロキシル基を介して、あるいは、たとえば、アスパラギン残基のように、アミノ基、カルボキシル基またはカルボキサミド基を含む側鎖を介して、ペプチド２に結合してもよい。同様に、炭水化物部分を、チオール基を用いて、２−アミノ−２−デオキシグルコースのメルカプトアセタミドの形成以外の方法で得てもよい。たとえば、チオール基を、糖ヒドロキシル基のメルカプトアセテートエステルとして、炭水化物部分に結合することができる。
【００９１】
炭水化物部分とアミノ酸側鎖との間の結合は、炭水化物部分のβ−アノマー配置の結合を含んでもよいことは理解される。しかし、アミノ酸側鎖と炭水化物部分との間の結合は、α−アノマー配置であってもよい。
【００９２】
図１に示すように、新しいペプチド結合を形成するカップリングが起こるメカニズムは、ペプチド１のカルボキシルチオエステルが交換され、ペプチド２の炭水化物部分を持つチオール基を有する、ペプチド１の新しいカルボキシルチオエステルが形成された中間体を介することが考えられる。図１の第２分子構造として示されているように、ペプチド１のβ−チオプロピオンアミド基は、炭水化物チオール基によって置き換えられ、結合チオエステル中間体を得る。このようなチオエステル中間体が存在するという証拠は、少なくともペプチド１のＣ末端残基がバリンである場合、実施例２８にて提供される。実施例２３に示すように、カップリング反応に関し、ペプチド１のＣ末端アミノ酸残基がバリンである場合の半減期は、Ｃ末端アミノ酸残基がグリシン、アラニンまたはヒスチジンである場合と比べて、実質的に大きい。実施例２８において、質量スペクトル分析は、バリンの場合、ペプチド１と炭水化物部分のチオール基との間にチオエステル結合が存在することを示し、一方、Ｃ末端アミノ酸がグリシン、アラニンまたはヒスチジンの場合、観察された生成物は、アミド結合が形成されたカップリングされたペプチド生成物を含むことを示す。したがって、このタイプの中間体が他のカップリング反応で存在する場合があり、そこでは、中間体チオエステルが、自発的に、該反応条件で、図１の第３構造体として示されるカップリング生成物に移行すると考えられる。しかし、本発明の原理を逸脱しない限り、反応のメカニズムは、本明細書で理論化しているものと異なってもよい。
【００９３】
図１で第３構造体として示される最終カップリング生成物は、本発明のカップリング反応によって得られた、ペプチド１とペプチド２との間で新しく形成されたアミド結合を示す。該カップリング反応は、弱アルカリ水溶液中で行うのが好ましく、ｐＨは約８．５が好ましいが、本発明の原理を逸脱しない限り、他のｐＨを使用してもよい。約０．２Ｍのリン酸緩衝液を、該水溶液を約ｐＨ８．５で緩衝処理するために使用するのが好ましい。追加の試薬は、水溶液に加えるのが好ましく、たとえば、グアニジンを約６Ｍの濃度で加えてもよい。また、反応体中のチオール基の酸化を最小限にするために、チオフェノール、ベンジルメルカプタンまたは２−メルカプトエタンスルホネートなどのチオール試薬を加えるのも好ましい。カップリング反応は、不活性雰囲気下、酸素の不存在下で行うのが好ましい。
【００９４】
カップリング反応は、約３７℃で行うのが好ましく、該温度で、半減期は、典型的には、数時間〜約１０時間の範囲である。反応の半減期は、ペプチド１のＣ末端アミノ酸残基の同一性に依存する。実施例２３に示すように、その位置に立体的により嵩高い側鎖を有するアミノ酸は、反応速度が遅く、したがってカップリング反応の半減期は延びる。
【００９５】
カップリング反応の進行は、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を使用して、簡単にモニタリングされる。例示が実施例２３および２５にて提供される。また、結合生成物は、分取スケールＨＰＬＣを使用することによって簡単に精製される。実施例２３では、反応は、３７℃で約１２時間後に止まり、収率７６％の精製されたカップリングされたグリコペプチドが、分取ＨＰＬＣにより単離された。ＨＰＬＣ後に得られた生成物の純度は、９０％を越えていた。
【００９６】
カップリングされたグリコペプチド生成物を、好ましくは精製された形態で得ると、脱硫してもよいが、本発明の原理を逸脱しない限り、依然としてチオール基を含むカップリングされたグリコペプチド生成物を、他の方法で使用または転移させてもよい。図１に示す最終変換において示されているグリコペプチド生成物を脱硫するために、該生成物を、チオール基のイオウ原子が水素原子に置き換えられるような還元条件に曝す。好ましいメルカプトアセチル基は、図１の第４構造体に示されるように、アセチル基に還元的に変換される。脱硫反応を行う好ましい方法は、チオール含有グリコペプチドを、金属触媒の存在下で水素源に曝すことである。好ましい水素源は水素ガスである。別の好ましい水素源は、ホウ化水素ナトリウムなどのホウ化水素塩である。触媒は、水素化反応に使用される任意の適切な触媒、たとえば、パラジウム、白金またはロジウムなどの貴金属触媒、またはラネーニッケルなどのニッケル触媒であってよい。
【００９７】
脱硫反応は、任意の適切な溶媒中で行ってよいが、水性媒体を使用するのが好ましい。水性媒体は、そのｐＨで約０．１Ｍのリン酸緩衝液を用いて緩衝化された、ｐＨ約５．８の僅かな酸性が好ましい。パラジウムなどの貴金属触媒を用いる場合は、反応が実質的に完了するまで、典型的には数時間、反応混合物を大気圧程度で水素ガス下に保つ。再び、反応は、ＨＰＬＣを使用して簡単にモニタリングされる。実施例２４および２５には、典型的な脱硫反応の詳細が提供される。脱硫された生成物は、分取ＨＰＬＣによって精製されてもよい。あるいは、以下に記載するように、ヒドラジン分解またはアルカリケン化によって、脱硫反応を、糖基のメルカプトアセチルエステル上で行うこともできる。
【００９８】
実施例２９〜３７には、アミノ糖窒素原子上にメルカプトアセテート基を有する２−アミノグリコースを使用する別の合成に関する追加の実験の詳細が記載されている。
【００９９】
実施例３８〜４０には、以下のスキームに示される、チオール含有基として、グルコースの３−メルカプトアセテートエステルを使用する合成の実験の詳細が記載されている。
【０１００】
【化１１】
本発明では、発明者らによって、分子内ＳからＮへの再配置を受けるチオエステル中間体を形成し、最終生成物を与えるチオール含有基は、水素化を使用することなく簡単に除去できるように、異なるタイプの共有結合によって処理することができることが見出された。２−アミノグルコースのメルカプトアセタミドから、連結反応を触媒するチオ含有基を得る場合、該チオール基は、パラジウム触媒を使用する反応などの水素化によって除去する。しかし、実施例３８〜４０で代表されるシリーズでは、グルコース部分の３−ＯＨなどのヒドロキシル基のメルカプトアセチルエステルを使用して、連結反応を引き起こすことができる。そのようなエステル基のアルカリケン化に対する感受性のために、連結反応後、水素化より加水分解によってチオール基を除去することができる。エステル結合の開裂により、遊離グルコースヒドロキシル基が放出される。
【０１０１】
実施例４１〜４３には、アミノ酸残基であって、該残基のＮ末端が糖部分を有する残基が数多く存在する合成の実験の詳細が記載されている。以下のスキームは、ａ）ＳＡＬ（１４員環）およびｂ）６つのアミノ酸延長グリコシル化残基（２９員環）に対しＮ末端に関するＳＡＬ、Ｒ＝アミノ酸側鎖官能基、の提案される転移状態を示す。
【０１０２】
【化１２】
以下に詳細に記載するように、本発明の糖補助連結反応（ＳＡＬ）は、たとえ糖部分を有するペプチドのＮ末端が、グリコシル化アミノ酸から離れた数個のアミノ酸残基であっても、効果があることが発見された。０〜約１０個のアミノ酸残基チオール含有残基を持つ残基のＮ末端が存在しうることがここで本発明者らによって発見された。たとえば、約１〜６個のアミノ酸残基グリコシル化残基のＮ末端の存在が可能で、カップリング収率は比較的高く保たれる。先に説明したような大きな環状転移状態は、この効果から成ると考えられる。実施例４４は、糖が、アスパラギン側鎖のアミド窒素原子に結合するカップリング反応の例である。
【０１０３】
特許、特許文献または本明細書で開示された参考文献のいずれも、参照として、この発明に組み込まれ、本発明の一部を形成する。本発明を、以下の限定ではない例によって説明する。
【実施例】
【０１０４】
略語
Ｂｏｃ ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
ＤＣＭ ジクロロメタン
ＤＩＥＡ ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＥＡ 酢酸エチル
ＥＳＩ−ＴＯＦ エレクトロスプレーイオン化−飛しょう時間
Ｆｍｏｃ ９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＢＴＵ Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３，−テトラメチルウロニウムＰＦ６
Ｈｅｘ ヘキサン
ＨＯＢｔ Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＲＭＳ 高分解能質量スペクトル分析
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ 質量補助レーザー脱離イオン化−飛しょう時間
ＭＢＨＡ メチルベンズヒドリルアミン
ＭＳ 分子ふるい
ＮＭＡ Ｎ−メチルアニリン
ＮＭＭ Ｎ−メチルモルホリン
ＰＭＢ ｐ−メトキシベンジル
ＰｙＢＯＰ １−（７−アザベンズトリアゾリルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムＰＦ６
ｒｔ 室温
Ｔｆ トリフルオロメタンスルホネート
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ テトラヒドロフラン
ＴＭＳ トリメチルシリル
Ｔｒｔ トリチル。
【０１０５】
実施例１
グリコペプチド２の合成スキーム
【０１０６】
【化１３】
（ａ）ＦｍｏｃＳｅｒ−Ｏアリル、ＴＭＳＯＴｆ、ＣＨ２Ｃｌ２、分子ふるい、−７８℃；（ｂ）Ｚｎ、ＡｃＯＨ；（ｃ）ＴｒｔＳ−ＣＨ２−ＣＯＯＨ、ＨＢＴＵ、ＤＩＥＡ、ＤＭＦ；（ｄ）ＤＭＦ中２０％ピペリジン；（ｅ）Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、ＨＢＴＵ、ＨＯＢｔ、ＤＩＥＡ、ＤＭＦ；（ｆ）Ｐｄ（ＰＰｈ３）４、ＮＭＡ、ＴＨＦ；（ｇ）Ｈ−Ｐｈｅ−ＮＨ２、ＨＢＴＵ、ＨＯＢｔ、ＤＩＥＡ、ＤＭＦ；（ｈ）０．０５ＮのＮａＯＨ、ＭｅＯＨ、ｐＨ約１０；（ｉ）ＴＦＡ／Ｅｔ３ＳｉＨ／Ｈ２Ｏ（９／０．５／０．５）。
【０１０７】
実施例２
化合物５：化合物４（５．５４ｇ、８．９２ｍｍｏｌ）を、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）中のＦｍｏｃ−Ｓｅｒ−Ｏアリル（３．９２ｇ、１０．７０ｍｍｏｌ）およびＭＳ（ＡＷ−３００、５ｇ）に加えた。反応系を、アルゴン下、室温で１時間保った。次いで反応混合物を−７８℃とし、ＴＭＳＯＴｆ（１７４μＬ、０．８９ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。反応混合物を−７８℃で１．５時間攪拌し、ＤＩＥＡ（１５５．３μＬ、０．８９ｍｍｏｌ）を加えてクエンチした。反応混合物をろ過し、ろ液を２０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、水洗した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、フラッシュカラムクロマトグラフィ（ＥＡ／Ｈｅｘ、１：２）で濃縮した。その後、精製された生成物（６．２８ｇ、８５％）を、２０ｍＬのＡｃＯＨに懸濁し、次いでＺｎ微粉を加えた。反応混合物をｒｔで８時間攪拌した。ろ過後、溶媒を真空除去し、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ＥＡ／Ｈｅｘ、３：１）に供し、化合物５（４．３６ｇ、８８％）を得た。
【０１０８】
実施例３
化合物６：化合物５（１．０ｇ、１．４ｍｍｏｌ）を、予備活性化Ｓ−トリチル−２−メルカプト酢酸（９３２．４ｍｇ、２．８ｍｍｏｌ）に、乾燥ＤＭＦ（１０ｍＬ）中のＨＢＴＵ（１．０６ｇ、２．８ｍｍｏＬ）およびＤＩＥＡ（１ｍＬ、５．６ｍｍｏＬ）と共に加えた。反応混合物を、アルゴン下、ｒｔで２時間攪拌した。反応溶液を、８０ｍＬの酢酸エチルで希釈し、水次いで飽和食塩水で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、フラッシュカラムクロマトグラフィ（ＥＡ／Ｈｅｘ１：２）で濃縮した。化合物６（１．０ｇ、９０％）を、白色固体として得た。
【０１０９】
【化１４】
【０１１０】
【化１５】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ５４Ｈ５４Ｎ２Ｏ１３Ｓ［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算値：９９３．３２３９。測定値：９９３．３２４４。
【０１１１】
実施例４
化合物７：化合物６を、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンに溶解し、ｒｔで４５分攪拌する。全ての溶媒を真空除去した後、残基を、フラッシュカラムクロマトグラフィ（ＥＡ／Ｈｅｘ４：１、次いでＭｅＯＨ／ＣＨ３Ｃｌ１：９）に供した。精製した生成物（１．３０ｇ、１．７４ｍｍｏｌ）、ＢｏｃＧｌｙ−ＯＨ（９１３ｍｇ、５．２１ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（１．３２ｇ、３．４８ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ（５３３ｍｇ、３．４８ｍｍｏｌ）を、Ａｒ下ＤＭＦ（１５ｍＬ）に溶解し、次いでＤＩＥＡ（３．０３ｍＬ、１７．４ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物を、ｒｔで２時間攪拌した。全ての溶媒を除去した後、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ＥＡ／Ｈｅｘ１：１）に供し、化合物７（１．４２ｇ、９０％）を得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ４６Ｈ５５Ｎ３Ｏ１４Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋について計算値：９０６．３４７７。測定値：９０６．３４８０。
【０１１２】
実施例５
化合物８：化合物７（６６０ｍｇ、０．７３ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（１０ｍＬ）に懸濁し、Ｎ−メチルアニリン（７９２μＬ、７．３ｍｍｏｌ）および（ＰＰｈ３）４Ｐｄを引き続いて加えた。反応混合物をｒｔで４５分攪拌した。溶媒を除去した後、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ＥＡ／Ｈｅｘ４：１、次いでＭｅＯＨ／ＣＨ３Ｃｌ８：１）に供し、生成物（５４５ｍｇ、８６％）を得た。精製した生成物（５２０ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ）、ＮＨ２Ｐｈｅ−ＮＨ２（３６１ｍｇ、１．８ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（４５６ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ（１８４ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌ）を、アルゴン下で、ＤＭＦ（１５ｍＬ）に溶解し、次いでＤＩＥＡ（１．０４ｍＬ、６．０１ｍｍｏｌ）を注入した。反応混合物をｒｔで２時間攪拌した。全ての溶媒を除去した後、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ＥＡ／Ｈｅｘ４：１、次いでＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３１：９）に供し、化合物８（３９５ｍｇ、６５％）を得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ５２Ｈ６１Ｎ５Ｏ１４Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋について計算値：１０１２．４００８。測定値：１０１２．４００１。
【０１１３】
実施例６
化合物９：化合物８（２５０ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨに溶解し、０．０５ＮのＮａＯＨをｐＨが１０程度になるまで、滴下した。反応混合物を、ｒｔで１時間攪拌し続けた。反応系を酸性樹脂でｐＨ７の中性とし、次いで真空濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３１：９、次いで１：５）に供し、化合物９（１７８ｍｇ、８２％）を得た。
【０１１４】
【化１６】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ４６Ｈ５５Ｎ５Ｏ１１Ｓ［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算値：９０８．３５１１。測定値：９０８．３５０８。
【０１１５】
実施例７
化合物２：１０ｍＬのＴＦＡ／Ｅｔ３ＳｉＨ／ＣＨＣｌ３（９：０．５：０．５）を、Ａｒ下で化合物９に加えた。反応系をｒｔで４０分攪拌した。殆どのＴＦＡを除去した後、脱保護されたグリコペプチドを、冷Ｅｔ２Ｏを加えることによって、析出させた。白色析出物を集め、少量のＨ２Ｏに再懸濁させた。粗生成物を０．４５μｍシリンジフィルターでろ過し、次いで精製のためにＨＰＬＣに供した。凍結乾燥後、白色粉末としての純粋な化合物２を、次の連結反応工程のために用意した。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ２２Ｈ３３Ｎ５Ｏ９Ｓ［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算値：５６６．１８９１。測定値：５６６．１８７５。
【０１１６】
実施例８
グリコペプチド３の合成スキーム
【０１１７】
【化１７】
（ａ）ＦｍｏｃＳｅｒ−Ｏアリル、ＴＭＳＯＴｆ、ＣＨ２Ｃｌ２、分子ふるい、−７８℃；（ｂ）Ｚｎ、Ａｃ２Ｏ；（ｃ）ＤＭＦ中２０％ピペリジン；（ｄ）Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、ＨＢＴＵ、ＨＯＢｔ、ＤＩＥＡ、ＤＭＦ；（ｅ）Ｐｄ（ＰＰｈ３）４、ＮＭＡ、ＴＨＦ；（ｆ）Ｈ−Ｐｈｅ−ＮＨ２、ＨＢＴＵ、ＨＯＢｔ、ＤＩＥＡ、ＤＭＦ；（ｇ）０．０５ＮのＮａＯＨ、ＭｅＯＨ、ｐＨ約１０；（ｈ）Ｈ２Ｏ中９５％ＴＦＡ。
【０１１８】
実施例９
【０１１９】
【化１８】
化合物１１：ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ２７Ｈ４１Ｎ３Ｏ１４［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算値：６５４．２４８１。測定値：６５４．２４７３。
【０１２０】
実施例１０
【０１２１】
【化１９】
化合物１２：
【０１２２】
【化２０】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ３３Ｈ４７Ｎ５Ｏ１４［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算値：７３８．３１９２。測定値：７３８．３１８０。
【０１２３】
実施例１１
【０１２４】
【化２１】
化合物３：ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ２２Ｈ３３Ｎ５Ｏ９［Ｍ＋Ｈ］＋について計算値：５１２．２３５１。測定値：５１２．２３７３。
【０１２５】
実施例１２
グリコペプチド１の合成スキーム
【０１２６】
【化２２】
（ａ）Ｐｄ（ＰＰｈ３）４、ＮＭＡ、ＴＨＦ（ｂ）Ｈ−Ｐｈｅ−ＮＨ２、ＨＢＴＵ、ＨＯＢｔ、ＤＩＥＡ、ＤＭＦ；（ｃ）ＤＭＦ中２０％ピペリジン；（ｄ）０．０５ＮのＮａＯＨ、ＭｅＯＨ、ｐＨ約１０；（ｅ）ＴＦＡ／Ｅｔ３ＳｉＨ／Ｈ２Ｏ（９／０．５／０．５）。
【０１２７】
実施例１３
【０１２８】
【化２３】
化合物１３：ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ６０Ｈ６０Ｎ４Ｏ１３Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋について計算値：１０７７．３９５０。測定値：１０７７．３９３２。
【０１２９】
実施例１４
【０１３０】
【化２４】
化合物１４：ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ４５Ｈ５０Ｎ４Ｏ１１Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋について計算値：８５５．３２６９。測定値：８５５．３２６９。
【０１３１】
実施例１５
【０１３２】
【化２５】
化合物１：ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ２０Ｈ３０Ｎ４Ｏ８Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋について計算値：４８７．１８５７。測定値：４８７．１８５２。
【０１３３】
実施例１６
固相ペプチド合成
一般的方法。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を、ナトリウム／ベンゾフェノンで蒸留し、塩化メチレン（ＣＨ２Ｃｌ２）を塩化カルシウムで蒸留した。市販品質の試薬を購入し、さらに精製することなく使用した。グリコシル化実験を、反応前に高真空下で火炎乾燥した分子ふるい（ＡＷ３００）を使用して行った。薄層クロマトグラフ（ＴＬＣ）分析を、シリカゲル６０Ｆ２５４ガラスプレートを使用して行い、化合物スポットは、ＵＶ光（２５４ｎｍ）およびクエン酸モリブデン酸アンモニウム（ｃｉｔｒｉｃ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｍｏｌｙｂｄａｔｅ）で染色することによって視覚化した。フラッシュクロマトグラフィを、シリカゲル６０Ｇｅｄｕｒａｎ（登録商標）（３５〜７５μｍ、ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ）で行った。１Ｈ、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＭＸ−５００ＭＨｚスペクトロメータで記録した。カップリング定数（Ｊ）はヘルツで報告し、化学シフトはテトラメチルシラン（ＴＭＳ、０．０ｐｐｍ）に対する百万分率（ｐｐｍ）で報告する。
３−（トリチルチオ）プロパン酸のＭＢＨＡ−リンカーへのプレローディング：樹脂ローディングは、樹脂を過剰に加えることによって、約３００μｍｏｌ／ｇを目的とした。先ず、樹脂を洗浄（５×ＤＣＭ、５％ＤＩＥＡ／ＤＣＭで３分、５×ＤＣＭ、５×ＤＭＦ）した。３−（トリチルチオ）プロパン酸の予備活性化のため、ＰｙＢＯＰ（１当量）を、３−（トリチルチオ）プロパン酸の２当量のＮＭＭを含むＤＭＦ０．１Ｍ溶液に加えた。予備活性化の５分後、混合物を樹脂に加えた。２時間後、樹脂を洗浄（５×ＤＭＦ、５×ＤＣＭ、５％ＤＩＰＥＡ／ＤＣＭで３分、５×ＤＣＭ、５×ＤＭＦ）した。キャッピングのため、樹脂を無水酢酸／ピリジン（１：９）（２×１０分）で処理し、洗浄（５×ＤＭＦ、１０×ＤＣＭ）し、最後に真空乾燥した。
【０１３４】
固相化学実験を、Ｔｏｒｖｉｑから購入した、テフロン（登録商標）製のフィルターを備えるシリンジで行った。他に記載がない限り、全ての反応は室温で行った。分取ＨＰＬＣは、分取カラム（Ｖａｒｉａｎ Ｄｙｎａｍａｘ２５０×２１．４ｍｍ、Ｓ／Ｎ３０５９Ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ６０−８Ｃ１８）を使用するＨｉｔａｃｈｉ（Ｄ−７０００ＨＰＬＣシステム）装置を用い、流速８ｍＬ／分で行った。ＤＭＦは、バイオテク級のものを購入した。市販の試薬をさらに精製することなく使用した。樹脂、保護アミノ酸類およびＰｙＢＯＰは、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍから購入した。
【０１３５】
実施例１７
Ｂｏｃ法による固相合成：Ｂｏｃ切断：樹脂を５％のｍ−クレゾール／ＴＦＡ（２×４分、４ｍＬ）で処理した後、ＤＣＭ（８×４ｍＬ）およびＤＭＦ（５×４ｍＬ）で洗浄した。カップリング：４当量の保護アミノ酸（最終濃度：ＤＭＦ中０．１Ｍ）を、４当量のＰｙＢＯＰおよび８当量のＮＭＭを使用して５分間予備活性化した後、該溶液を樹脂に加えた。３０分後、樹脂をＤＭＦ（５×４ｍＬ）、ＤＣＭ（５×４ｍＬ）およびＤＭＦ（５×４ｍＬ）で洗浄した。キャッピング：無水酢酸／ピリジン（１：９、４ｍＬ）を樹脂に加えた。５分後、樹脂を、ＤＭＦ（５×４ｍＬ）およびＤＣＭ（５×４ｍＬ）で洗浄した。末端キャッピング：無水酢酸／ピリジン（１：９、４ｍＬ）を樹脂に加えた。１０分後、樹脂をＤＭＦ（５×４ｍＬ）およびＤＣＭ（８×４ｍＬ）で洗浄した。切断：ＴＦＭＳＡ／ＴＦＡ／チオアニソール（２：８：１）の混合物を樹脂に加えた。３時間後、樹脂をＴＦＡ（４×４ｍＬ）で洗浄した。検査：合わせた溶液を真空濃縮した。残渣を水に溶解し、分取ＨＰＬＣで精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（マトリックス：α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸）で分析した。
【０１３６】
実施例１８
Ａｃ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ２１５（配列番号：３は、非修飾アミノ酸類に相当する）。：３−（トリチルチオ）プロパン酸がプレロードされたＭＢＨＡ−樹脂、４００ｍｇ（１００μｍｏｌ）から出発し、線状アセンブリをＢｏｃ法に準じて行った。収量：５０．６ｍｇ（７１．５μｍｏｌ、７２％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：７０８．８（［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値７０８．８）；Ｃ３１Ｈ４９Ｎ９Ｏ８Ｓ（７０７．８４）。
【０１３７】
実施例１９
Ａｃ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ２１６（配列番号：４は非修飾アミノ酸類に相当する）。：３−（トリチルチオ）プロパン酸がプレロードされたＭＢＨＡ−樹脂、４００ｍｇ（１００μｍｏｌ）から出発し、線状アセンブリをＢｏｃ法に準じて行った。収量：３９ｍｇ（５４μｍｏｌ、５４％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：７２３．０（［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値：７２２．９）；Ｃ３２Ｈ５１Ｎ９Ｏ８Ｓ（７２１．８７）。
【０１３８】
実施例２０
Ａｃ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｓ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ２１７（配列番号：５は、非修飾アミノ酸類に相当する）。：３−（トリチルチオ）プロパン酸がプレロードされたＭＢＨＡ−樹脂、４００ｍｇ（１００μｍｏｌ）から出発し、線状アセンブリをＢｏｃ法に準じて行った。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：７５０．６（［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値：７５０．９）；Ｃ３４Ｈ５５Ｎ９Ｏ８Ｓ（７４９．９２）。
【０１３９】
実施例２１
Ａｃ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｓ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ２１８（配列番号：６は、非修飾アミノ酸類に相当する）。：３−（トリチルチオ）プロパン酸がプレロードされたＭＢＨＡ−樹脂、４００ｍｇ（１００μｍｏｌ）から出発し、線状アセンブリをＢｏｃ法に準じて行った。収量：３１ｍｇ（３９．３μｍｏｌ、３９％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：７８９．４（［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値：７８８．９）；Ｃ３５Ｈ５３Ｎ１１Ｏ８Ｓ（７８７．９３）。
【０１４０】
実施例２２
【０１４１】
【化２６】
実施例２３
化学連結反応
保護されていない合成ペプチドセグメントの連結反応を以下のように行った。使用する前に、６Ｍのグアニジンを含む０．２Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）を、アルゴンで１０分間脱ガスした。ペプチド類を最終濃度１０ｍＭで溶解し、次いで２％チオフェノールを添加した。連結反応を３７℃で、加熱ブロック中で行い、周期的にボルテックスし、チオール付加物を平衡化した。反応は、ＬＣＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ１１００単一四極子質量スペクトロメータに付随するＡｇｉｌｅｎｔ１１００ＬＣ、カラムはＡｇｉｌｅｎｔ ＳＢ Ｃ８ ５０×４．６ｍｍ）および／またはＨＰＬＣ｛分析カラム（ＸＴｅｒａＭＳ、Ｃｌ８ ３．５μｍ、４．６×ｌ００ｍｍを用いるＨｉｔａｃｈｉ Ｄ−７０００ＨＰＬＣシステク装置）を用い、流速１ｍＬ／分で｝を使用してモニタリングした。
【０１４２】
グリコペプチド連結反応および分取精製に関する代表的な例は、以下の通りである。２．８ｍｇのグリコペプチド２を、４．４ｍｇ（１．１当量）チオエステルペプチドＡｃ−ＬＹＲＡＧ−Ｃ（Ｏ）Ｓ−（ＣＨ２）２−ＣＯＮＨ２１５（配列番号：３は非修飾アミノ酸類に相当する）。の、６Ｍのグアニジンおよび１２μＬのチオフェノールを含む６００μＬの０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）溶液に加えた。連結反応を、３７℃で、加熱ブロック中で行い、周期的にボルテックスし、チオール付加物を平衡化した。１２時間後、ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）リン酸・塩酸塩；５０ｍＭ）を加え、ジスルフィド結合形成を減少させた。次いで、反応系を、逆相ＨＰＬＣ｛セミ分取カラムを使用するＨｉｔａｃｈｉ Ｄ−７０００ＨＰＬＣシステム装置、Ｖｙｄａｃ Ｃ−１８ １０μｍ、１０×２５０ｍｍ）を用い、流速５ｍＬ／分で行う｝を使用し生成した。水／０．１％ＴＦＡ中のアセトニトリルの線形勾配を、結合ペプチド類を溶出するために使用した。予期される質量を持つ画分を集め、凍結乾燥し、４．４ｍｇの純粋なグリコペプチド１９を得た。７６％の収率であった。
【０１４３】
異なるｐＨ（ｐＨ７〜９）での異なる連結反応条件、および２−メルカプトエタンスルホン酸塩（ＭＥＳ）、ベンジルメルカプタン、チオフェノールなどのチオール付加物を種々変え、およびチオールなしでテストを行った。驚くべきことに、反応はこれらの条件の殆どで良好に進行したが、６Ｍのグアニジンを含む２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）中の２％チオフェノールを使用した場合、ＨＰＬＣ分析によって最もクリーンな反応が得られることが見出された。ＭＥＳ（１ｍｇ／ｍｌ）の使用は、反応が５時間未満で完了したように、速度促進の点では優れていたが、ペプチドチオエステルの加水分解速度がより速いことが観察された。Ｃ末端にグリシンを持つペプチド−α−フェニルチオエステルも生成し、これを、他のチオール付加物なしで、連結反応混合物に直接使用した。このモデルペプチドでは、反応は４時間以内に完了した。
【０１４４】
連結反応速度におけるペプチドチオエステルのＣ末端アミノ酸の効果
【０１４５】
【化２７】
（ＬＹＲＡ−ＡＡは、配列番号：７に相当し、これは非修飾アミノ酸類を表わす）。
（ＬＹＲＡ−ＡＡ−ＧＳＦは、配列番号：８に相当し、これは非修飾アミノ酸類を表わす）。
ａ：ＥＳＩ−ＭＳによる特性決定。
【０１４６】
実施例２４
脱硫の一般的手順
【０１４７】
【化２８】
（Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｙは、配列番号：３に相当し、これは非修飾アミノ酸類を表わす）。
（Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅは、配列番号：７９に相当し、これは非修飾アミノ酸類を表わす）。
【０１４８】
脱硫反応は、ｐＨ５．８で６．０Ｍのグアニジン、１０ｍＭのＴＣＥＰを含む０．１Ｍのリン酸緩衝液中、室温で行った。緩衝液は、通常、各使用前に、１０分間アルゴンをバブリングすることによって脱ガスした。Ｐｄ／Ａｌ２Ｏ３を加え（ペプチドの重さの１０〜２０倍）、反応系を水素下に保った。脱硫反応は、分析ＨＰＬＣ｛分析カラム（ＸＴｅｒａＭＳ、Ｃ１８ ３．５μｍ、４．６×ｌ００ｍｍ）を使用するＨｉｔａｃｈｉ Ｄ−７０００ＨＰＬＣシステム装置を用い、流速１ｍＬ／分で行う｝に準じた。
【０１４９】
また、脱硫は、ラネーニッケルも使用して行い、これはペプチドの重量の１０倍用いた。ラネーニッケルは以下のようにして生成した。酢酸ニッケル（６００ｍｇ）を１５ｍＬのＨ２Ｏに溶解し、次いでホウ化水素ナトリウム（１００ｍｇ）を攪拌しながらゆっくり加えた。黒色アモルファスニッケル析出物をろ過し、蒸留水で中性になるまで洗浄した。次いでニッケルを閉鎖したボトルに移し、Ｈ２Ｏ中で保存した。ラネーニッケルの場合、反応に水素ガスを必要としないが、反応は、通常、Ｐｄ／Ａｌ２Ｏ３を用いる還元より遅かった（１２時間）。
【０１５０】
実施例２５
【０１５１】
【化２９】
Ａ）２の連結反応から精製された連結反応生成物１９およびチオエステルペプチド１５のＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析。生成物は、２１４ｎｍで、分析カラム（ＸＴｅｒａＭＳ、Ｃ１８ ３．５ｍｍ、４．６×１００ｍｍ）を使用するＨｉｔａｃｈｉ Ｄ−７０００ＨＰＬＣシステムを用い、流速１ｍＬ／分で行う）でモニタリングした。Ｂ）水素下Ｐｄ／Ａｌ２Ｏ３を使用した、２とチオエステルペプチド１５との間の連結反応生成物１９の脱硫粗反応生成物２０のＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析。反応は、２１４ｎｍで、分析カラム（ＸＴｅｒａＭＳ、Ｃ１８ ３．５ｍｍ、４．６×ｌ００ｍｍ）を使用するＨｉｔａｃｈｉ Ｄ−７０００ＨＰＬＣシステムを用い、流速１ｍＬ／分で行う）でモニタリングした。
【０１５２】
実施例２６
連結反応生成物１９の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（Ｄ２Ｏ、Ｂｒｕｋｅｒ ＭＡＸ−５００ＭＨＺ）。（Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙは、配列番号：９に相当し、これは非修飾アミノ酸類を表わす）。
【０１５３】
【化３０】
実施例２７
脱硫生成物２０の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（Ｄ２Ｏ、Ｂｒｕｋｅｒ ＭＡＸ−５００ＭＨＺ）。（Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙは、配列番号：９に相当し、これは非修飾アミノ酸類を表わす）。
【０１５４】
【化３１】
実施例２８
質量スペクトル分析によるチオエステル中間体および連結反応生成物の分析
ＬＣＭＳによる、異なる連結反応の分析の間、以下に示すように、断片化が起こるのが観察された。連結反応生成物が形成された場合は、断片化により、糖部のない全連結反応ペプチドが得られたであろう。しかし、連結反応中間体は形成されるが、ペプチド結合形成が起こらない場合は、断片化により、出発ペプチドチオエステル、およびメルカプトアセタミド−結合された糖が得られる。
【０１５５】
【化３２】
（Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅは、配列番号：８０に相当し、これは非修飾アミノ酸類を表わす）。
（Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｘは、配列番号：８１に相当し、これは非修飾アミノ酸類を表わす）。
【０１５６】
グリコペプチド類生成物および連結反応からの中間体の糖部上のアノマー中心での断片化。
【０１５７】
【化３３】
質量スペクトル分析により、連結反応生成物および異なるフラグメントの質量が認められた。エントリー１、２、３は、所望の連結反応生成物の形成に相当する。しかし、バリンチオエステル（エントリー４）の場合は、２４時間後、主生成物として連結反応中間体が観察された。この場合、連結反応混合物のｐＨが１１へ上昇したことにより、この中間体が消え、加水分解されたチオエステルが現れた。また、過剰のＭＥＳチオール付加物の添加により、チオエステル交換反応が起こり、ＭＥＳチオエステルペプチドを形成した。エントリー１、２、３の場合は、いずれもこれらの変化は起こらなかった。
【０１５８】
【化３４】
【０１５９】
【化３５】
【０１６０】
【化３６】
グリコペプチド生成物および連結反応中間体の糖部上のアノマー中心での観察された断片化。測定は、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００単一四極子質量スペクトロメータに付随するＡｇｉｌｅｎｔ１１００ＬＣを使用して行なった。カラムは、Ａｇｉｌｅｎｔ ＳＢ Ｃ８ ５０×４．６ｍｍである。Ａ：エントリー１に相当；Ｂ：エントリー２に相当；Ｃ：エントリー３に相当；Ｄ：エントリー４に相当；Ｅ：グリコペプチド２およびチオエステルペプチド１５からの脱硫生成物２０に相当。
【０１６１】
実施例２９
構造ブロック２４ａおよび２４ｂの合成
【０１６２】
【化３７】
試薬および条件：（ａ）Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ−Ｏアリル（２２ａに関し、Ｒ＝ＣＨ３）、またはＦｍｏｃ−Ｓｅｒ−Ｏアリル（２２ｂに関し、Ｒ＝Ｈ）、ＴＭＳＯＴｆ、分子ふるいＡＷ３００、ＣＨ２Ｃｌ２、−７０℃、７８〜８３％、α／β＝４／３；
（ｂ）Ｚｎ／ＡｃＯＨ；（ｃ）ＴｒｔＳ−ＣＨ２ＣＯＯＨ、ＨＢＴＵ、ＤＩＥＡ、ＤＭＦ、８４％（２工程）；（ｄ）Ｐｄ（ＰＰｈ３）４、ＮＭＡ、ＴＨＦ、９５％。
化合物２２ａα。反応前に、化合物２１（５．０ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）およびＦｍｏｃ−Ｔｈｒ−Ｏアリル（４．８３ｇ、１２．７ｍｍｏｌ）を混合し、高真空で一晩乾燥した。次いで混合物をＮ２下で無水ＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）に溶解し、３．０ｇの新しい、火炎乾燥した分子ふるいを加え、混合物を室温で１時間攪拌した。その後、−７８℃に冷却し、ＴＭＳＯＴｆ（２０３．９μＬ、１．０６６ｍｍｏｌ）を反応溶液にゆっくり加えた。次いで、混合物を−７８℃に保ち、４５分攪拌した。反応が落ちると、Ｅｔ３Ｎを加えてクエンチし、温度を室温まで上げた。分子ふるいをセライトによるろ過により除去し、ろ液を真空濃縮した。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ヘキサン中２０〜５０％ＥｔＯＡｃ）で生成し、純粋なα生成物（３．３１ｇ、４．７７ｍｍｏｌ、４５．４％）を得た。
【０１６３】
【化３８】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ３４Ｈ３８Ｎ４Ｏ１２［Ｍ＋Ｈ］＋について計算値：６９５．２５５９。測定値：６９５．２５５３。
【０１６４】
化合物２３ａ。化合物２２ａα（２．６８ｇ、３．８６ｍｍｏｌ）をＡｃＯＨ（２５ｍＬ）に溶解し、亜鉛（１５．０ｇ）を加えた。反応混合物を室温で４時間攪拌した。反応が成し遂げられると、亜鉛をセライトでろ取し、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄した。ろ液を真空濃縮した。次いで、濃縮残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ＥｔＯＡｃ中２０％ヘキサン）で生成し、純粋なアミン生成物（２．４０ｇ、３．６２ｍｍｏｌｅ、９４％）を得た。
【０１６５】
【化３９】
【０１６６】
【化４０】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ３４Ｈ４０Ｎ２Ｏ１２［Ｍ＋Ｈ］＋について計算値：６６９．２６５４。測定値：６６９．２６４１。該アミン（６５０ｍｇ、０．９７３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１５ｍＬ）に溶解した。ＴｒｔＳ−ＣＨ２ＣＯＯＨ（６５１ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（７４０ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（６７８μＬ、３．８９ｍｍｏｌ）を続けてアミンに加えた。反応系を室温で２時間攪拌した。反応が成し遂げられると、反応溶液を真空濃縮した。濃縮残渣を、フラッシュカラムクロマトグラフィ（ヘキサン中２０〜４０％ＥｔＯＡｃ）で精製し、純粋な化合物２３ａ（８７７．７ｍｇ、０．８９２ｍｍｏｌ、９１％）を得た。
【０１６７】
【化４１】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ５５Ｈ５６Ｎ２Ｏ１３Ｓ［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算値：１００７．３３９５。測定値：１００７．３３９０。
【０１６８】
化合物２４ａ。化合物２３ａ（７５０ｍｇ、０．７６２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２０ｍＬ）に溶解した。Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（８８．０ｍｇ、０．０７６ｍｍｏｌ）およびＮ−メチルアニリン（８２７μＬ、７．６２ｍｍｏｌ）を加え、次いで反応混合物を室温で４５分攪拌した。反応が成し遂げられると、溶液を真空濃縮した。粗生成物を、フラッシュカラムクロマトグラフィ（ヘキサン中５０％ＥｔＯＡｃ、次いでＣＨ２Ｃｌ２中１０％ＭｅＯＨ）で精製し、純粋な化合物２４ａ（６９０ｍｇ、０．７３１ｍｍｏｌ、９５％）を得た。
【０１６９】
【化４２】
【０１７０】
【化４３】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ５２Ｈ５２Ｎ２Ｏ１３Ｓ［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算値：９６７．３０８２。測定値：９６７．３０５９。
【０１７１】
化合物２２ｂα。反応前に、化合物２１（１．３３ｇ、２．８１ｍｍｏｌ）およびＦｍｏｃ−Ｓｅｒ−Ｏアリル（８５８．８ｍｇ、２．３４ｍｍｏｌ）を混合し、高真空で一晩乾燥した。次いで混合物をＮ２下無水ＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ）に溶解した。１．５ｇの新しい火炎乾燥した分子ふるいを加え、反応混合物を室温で１時間攪拌した。その後、反応混合物を−７８℃に冷却し、ＴＭＳＯＴｆ（５４．３μＬ、０．２８１ｍｍｏｌ）を反応溶液にゆっくり加えた。反応系を−７８℃に保ち、４５分攪拌した。反応が成し遂げられると、Ｅｔ３Ｎを加えてクエンチし、温度を室温に上げた。分子ふるいをセライトでろ取し、ろ液を真空濃縮した。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ヘキサン中２０〜５０％ＥｔＯＡｃ）で精製し、純粋なα生成物（８７２ｍｇ、１．２８ｍｍｏｌ、４５％）を得た。
【０１７２】
【化４４】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ３３Ｈ３６Ｎ４Ｏ１２［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算値：７０３．２２２２。測定値：７０３．２２０８。
【０１７３】
化合物２３ｂ。アミン（８２２ｍｇ、１．２６ｍｍｏｌ）［ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ３３Ｈ３８Ｎ２Ｏ１２［Ｍ＋Ｈ］＋について計算値：６５５．２４９７、測定値：６５５．２４９９］を、ＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解した。ＴｒｔＳ−ＣＨ２ＣＯＯＨ（８４０ｍｇ、２．５１ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（９５３ｍｇ、２．５１ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（８７５μＬ、５．０３ｍｍｏｌ）を、アミンに続けて加えた。反応系を室温で２時間攪拌した。反応が成し遂げられると、溶液を真空濃縮した。次いで、濃縮残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ヘキサン中２０〜４０％ＥｔＯＡｃ）で精製し、純粋な化合物２３ｂ（１．０３ｇ、１．０６ｍｍｏｌ、８４％）を得た。
【０１７４】
【化４５】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ５４Ｈ５４Ｎ２Ｏ１３Ｓ［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算値：９９３．３２３９。測定値：９９３．３２４０。
【０１７５】
化合物２４ｂ。化合物２３ｂ（４２０ｍｇ、０．４３３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１０ｍＬ）に、続けてＰｄ（ＰＰｈ３）４（５０．０ｍｇ、０．０４３ｍｍｏｌ）およびＮ−メチルアニリン（４７０μＬ、４．３３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で４５分攪拌した。反応が成し遂げられると、反応溶液を真空濃縮した。粗生成物を、フラッシュカラムクロマトグラフィ（ヘキサン中５０％ＥｔＯＡｃ、次いでＣＨ２Ｃｌ２中１０％ＭｅＯＨ）で精製し、純粋な化合物２４ｂ（３９０ｍｇ、０．４２０ｍｍｏｌ、９６％）を得た。
【０１７６】
【化４６】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ５１Ｈ５０Ｎ２Ｏ１３Ｓ［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算値：９５３．２９２６。測定値：９５３．２８９２。
【０１７７】
実施例３０
糖補助連結反応（ＳＡＬ）を使用するα−Ｏ−結合グリコペプチド類の合成
糖補助連結反応（ＳＡＬ）の連結反応効率を調べるため、４種のモデルα−Ｏ−結合グリコペプチド類２５ａ〜ｂおよび２６ａ〜ｂ、ならびにチオエステルペプチドＣｙｓ（Ａｃｍ）３７−Ｇｌｙ５２を、Ｇｌｙ−Ｖａｌ連結反応部を発現するジプテリシンの配列に基づいて生成した。ここで使用した連結反応条件は、我々の先の研究で使用した条件に類似するが、チオフェノールは省いた。
α−結合グリコペプチド類のＳＡＬ
【０１７８】
【化４７】
ａ：ｔ１／２は、反応体グリコペプチドが５０％消費されるために必要な反応時間を示す。ｂ：ＬＣＭＳにより特性決定。ｃ：各反応における反応体グリコペプチドの濃度は、６ｍＭである。
【０１７９】
先に示すように、α−Ｏ−結合グリコペプチド類は、β−Ｏ−結合およびＮ−結合グリコペプチド類（エントリー１〜４）と類似の効率で、ＳＡＬによって、順番に合成することができる。特に、ＧａｌＮＡｃ（ＳＨ）−Ｔｈｒを含むグリコペプチド類は、スレオニン（エントリー１〜４）のメチル基からの追加の立体因子にもかかわらず、ＧａｌＮＡｃ（ＳＨ）−Ｓｅｒを含むグリコペプチド類と類似の速度で到達した。予測どおり、Ｇｌｙ−Ｖａｌ接続部を持つ場合の連結反応速度は、チオフェノール（エントリー４および５）がない場合より、速かった。また、数種の条件をグリコペプチド２６ｂおよびチオエステルペプチドＣｙｓ（Ａｃｍ）３７−Ｇｌｙ５２を用いてスクリーニングし、ジプテリシンの合成のための連結反応条件を最適化した。ミクロ電極により反応ｐＨを測定すると、ＳＡＬのための理想的な反応ｐＨは７．２〜７．４である。前記表「α−結合グリコペプチド類のＳＡＬ」に示すように、より良好なｐＨ安定性を与える、より濃縮されたリン酸緩衝液を使用することによって、優れた連結反応効率を達成した（エントリー４および６）。このｐＨ範囲で、加水分解されたチオエステルは最小量でありながら、連結反応は最高効率を達成した。同じ条件下、この遅い連結反応において、加水分解されたチオエステルを相殺するために、２当量のペプチドチオエステルを加えると、最適連結反応結果を得た（エントリー４、７および８）。
【０１８０】
実施例３１
（Ａ）構造ブロック３０の合成。（Ｂ）側鎖アンカー法を使用するグリコペプチドチオエステルＡｓｐ１−Ａｓｎ３６。
【０１８１】
【化４８】
試薬および条件：（ａ）ＢＦ３−ＯＥｔ２、ＴｏｌＳＨ、ＣＨ２Ｃｌ２、０℃、次いでｒｔ；（ｂ）ＮａＯＭｅ、ＭｅＯＨ、ｐＨ約１１；（ｃ）ＰＭＢＣｌ、ＮａＨ、ＤＭＦ、０℃、次いでｒｔ、６８％（３工程）；（ｄ）Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ−Ｏアリル、ＮＴＳ、触媒ＴｆＯＨ、分子ふるいＡＷ３００、ＣＨ２Ｃｌ２、−１５℃、８３％、α／β＝３／２；（ｅ）ＡｃＳＨ、ピリジン、８６％；（ｆ）Ｐｄ（ＰＰｈ３）４、ＮＭＡ、ＴＨＦ、９５％。ＴｏｌＳＨ＝ｐ−チオクレゾール、ＮＩＳ＝Ｎ−ヨードスクシンイミド
化合物２８α。化合物２７（１０．２８ｇ、２７．５５ｍｍｏｌ）およびｐ−チオクレゾール（５．１ｇ、４１．３ｍｍｏｌ）を、Ｎ２（ガス）下でＣＨ２Ｃｌ２（４０ｍＬ）に溶解した。反応溶液を氷浴で０℃に冷却した。この溶液に、ＢＦ３ＯＥｔ２（６．９２ｍＬ、５５．１ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。その後、反応温度を徐々に室温まで上げた。８時間後、反応系に飽和ＮａＨＣＯ３をゆっくり加えることによりクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２で希釈した。生成物を、飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を集め、真空濃縮した。次いで、濃縮残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ヘキサン中２０〜４０％ＥｔＯＡｃ）で精製し、純粋な生成物（αおよびβ混合物、１０．３ｇ、２３．６ｍｍｏｌ、８５％）を得た。精製チオグリコシドをＭｅＯＨに溶解した。ＮａＯＭｅ（ＭｅＯＨ中２５重量％）を、ｐＨが１１〜１２程度になるまで、反応溶液に滴下した。反応混合物を室温で１時間攪拌し、酸性樹脂（Ｄｏｗｅｘ５０ＷＸ２−２００（Ｈ））で中性とした。次いで、樹脂をろ取し、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄した。ろ液を真空濃縮した。次いで、濃縮残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ＣＨ２Ｃｌ２中５〜１０％ＭｅＯＨ）で精製した。次いで、純粋なチオグリコシド（７．８３ｇ、２５．２ｍｍｏｌ）を６０ｍＬの乾燥ＤＭＦに０℃で溶解し、ＰＭＢＣｌ（２０．５ｍＬ、１５１ｍｍｏｌ）およびＮａＨ（３．６２ｇ、１５１ｍｍｏｌ）を加えることにより、ＰＭＢ基で完全に保護した。反応混合物を室温で２時間攪拌し、ＭｅＯＨでクエンチした。ＭｅＯＨを除去した後、真空濃縮した。次いで、生成物をＥｔＯＡｃで抽出し、Ｈ２Ｏで洗浄した。有機層を集め、飽和食塩水で再び洗浄した。有機層を真空濃縮した後、粗残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ヘキサン中１０〜４０％ＥｔＯＡｃ）で精製し、純粋なＰＭＢ保護チオグリコシド２８αおよび２８βをそれぞれ得た。［１５．５ｇ、２３．２ｍｍｏｌ（α＋β）、９２％］。
【０１８２】
【化４９】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ３７Ｈ４１Ｎ３Ｏ７Ｓ［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算値：６９４．２５５７。測定値：６９４．２５５６。
【０１８３】
化合物２８β
【０１８４】
【化５０】
【０１８５】
【化５１】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ３７Ｈ４１Ｎ３Ｏ７Ｓ［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算値：６９４．２５５７。測定値：６９４．２５５６。
【０１８６】
Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ−Ｏアリル。炭酸セシウム（２．２８ｇ、７．０ｍｍｏｌ）を、Ｎ２（ガス）下でＦｍｏｃ−Ｔｈｒ−ＯＨ（４．７５ｇ、１３．９ｍｍｏｌ）の乾燥ＭｅＯＨ（４０ｍＬ）懸濁液に加えた。反応混合物を室温で２時間攪拌し、次いで真空下、蒸発乾固した。濃縮残渣をさらに２時間高真空下で乾燥した。その後、乾燥混合物を、Ｎ２下で乾燥ＤＭＦ（４０ｍＬ）に再び溶解し、臭化アリル（１．４５ｍＬ、１６．７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で８時間攪拌した。白色析出物をセライトでろ取し、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄した。ろ液を真空濃縮し、次いでフラッシュカラムクロマトグラフィ（ヘキサン中２５〜５０％ＥｔＯＡｃ）で精製し、純粋な白色粉末（４．６４ｇ、１２．２ｍｍｏｌ、８７％）を得た。
【０１８７】
【化５２】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ２２Ｈ２３ＮＯ５［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算値：４０４．１４６８。測定値：４０４．１４６８。
【０１８８】
化合物２９α。反応前に、化合物２８（９１７ｍｇ、１．３６６ｍｍｏｌ）およびＦｍｏｃ−Ｔｈｒ−Ｏアリル（６２４．７ｍｇ、１．６３９ｍｍｏｌ）を混合し、高真空で一晩乾燥した。次いで、反応混合物をＮ２下、ＣＨ２Ｃｌ２に溶解した。新しい火炎乾燥した分子ふるい（ＡＷ３００）（３ｇ）を反応混合物に加え、約２時間攪拌し、反応系を−２０℃に冷却し、次いでＮ−ヨードスクシンイミド（３３８．１ｍｇ、１．５０３ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物に、−２０℃で新しく製造したＴｆＯＨ（０．０５当量）をゆっくり加えた。反応系を−１５℃で１時間攪拌した。反応が成し遂げられると、飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３（水溶液）および飽和ＮａＨＣＯ３（水溶液）を加えることによりクエンチした。分子ふるいをセライトでろ取し、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄した。ろ液をＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３（水溶液）および飽和ＮａＨＣＯ３（水溶液）で洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した後、ろ液を真空下で蒸発乾固した。濃縮残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ヘキサン中２５〜５０％ＥｔＯＡｃ）で精製し、α生成物（５０６．７ｍｇ、０．５４６ｍｍｏｌ、４０％）を得た。
【０１８９】
【化５３】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ５２Ｈ５６Ｎ４Ｏ１２［Ｍ＋Ｈ］＋について計算値：９２９．３９６７。測定値：９２９．３９５４。
【０１９０】
化合物３０。化合物２９α（２００ｍｇ、０．２１５ｍｍｏｌ）を０℃でピリジン（１．２ｍＬ）に溶解し、次いでＡｃＳＨ（１．２ｍＬ）を加えた。次いで、反応系を室温まで上げた。反応混合物を４時間攪拌した。反応が成し遂げられると、混合物を真空下で蒸発乾固した。濃縮残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ヘキサン中２０％〜５０％ＥｔＯＡｃ、次いでＥｔＯＡｃ中３０％ヘキサン）で精製し、次のアリル除去工程用の純粋な生成物（１７４．７ｍｇ、０．１８５ｍｍｏｌ、８６％）を得た。
【０１９１】
【化５４】
【０１９２】
【化５５】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ５４Ｈ６０Ｎ２Ｏ１３［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算値：９６７．３９８７。測定値：９６７．３９８４。アリル除去工程では、前の工程の生成物（７２０ｍｇ、０．７６２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１０ｍＬ）に溶解し、次いでＰｄ（Ｐｈ３Ｐ）４（８８．１ｍｇ、０．０７６ｍｍｏｌ）およびＮ−メチルアニリン（８２７μＬ、７．６２ｍｍｏｌ）を継続して加えた。反応混合物を室温で４５分攪拌した。反応が成し遂げられると、反応溶液を真空下で蒸発乾固した。次いで、濃縮残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ヘキサン中５０％ＥｔＯＡｃ、次いでＣＨ２Ｃｌ２中１０％ＭｅＯＨ）で精製し、純粋な化合物１０（６５５ｍｇ、０．７２４ｍｍｏｌ、９５％）を得た。
【０１９３】
【化５６】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ５１Ｈ５６Ｎ２Ｏ１３［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算値：９２７．３６７４。測定値：９２７．３６８０。
【０１９４】
実施例３２
グリコペプチドＶａｌ５３−Ｐｈｅ８２の固相合成
Ｃ末端グリコペプチドセグメント（５３−８２）の合成は、Ｈ２Ｎ−Ｐｈｅ−２−ＣｌＴｒｔ−樹脂から始め、Ｆｍｏｃ法を使用して行った。グリコシル化アミノ酸を樹脂にカップリングするため、２当量の構造ブロック２４ａを使用し、反応系を２４時間振盪した。ＳＰＰＳが完了すると、糖上のアセテート基を、ヒドラジン／ＭｅＯＨ（１／６）で６時間処理することによって、固体支持体から除去した。このアセテート除去工程の後、樹脂をＭｅＯＨ、ＤＭＦおよびＣＨ２Ｃｌ２で洗浄した。得られたグリコペプチドを脱保護し、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／Ｅｔ３ＳｉＨ／チオアニソール（１７／１／１／１）を用いて室温で５０分処理することにより、樹脂から切断した。粗グリコペプチド溶液を蒸留し、切断混合物溶液を全て除去し、次いで、ＨＰＬＣ精製のために乾燥残渣をＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ（１／１）に再溶解した。精製されたグリコペプチドを凍結乾燥し、純粋なグリコペプチド（１８％の収率）を得た。ＥＳＩ−ＭＳ：３５２８Ｄａ。（ペプチド塊は、ペプチドの観察されたプロトン化状態の全てからの実験的質量／電荷（ｍ／ｚ）比から再構築した）。
【０１９５】
実施例３３
チオエステルペプチドＣｙｓ（Ａｃｍ）３７−Ｇｌｙ５２の合成
チオエステルペプチドの合成は、３−（トリチルチオ）プロパン酸をＭＢＨＡ−樹脂ＬＬへのプレローディングから始めた。プレローディング手順の詳細は、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ，Ｓｏｃ．２００６，１２８，５６２６−５６２７に見ることができ、該文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９６】
固相ペプチド合成は、Ｂｏｃ法を使用して行った。固体支持体への全配列が完了した後、Ｎ末端のＢｏｃ基を除去し、ＨＦ切断中の副反応を最小限に抑えた。次いで、１０％（ｖ／ｖ）のアニソールで最終切断を行う前に、樹脂を高真空下で４時間乾燥した。粗チオエステルペプチドをＨＰＬＣで精製し、純粋な生成物を４３％の収率で得た。ＥＳＩ−ＭＳ：１９８２Ｄａ。（ペプチド塊は、ペプチドの観察されたプロトン化状態の全てからの実験的質量／電荷（ｍ／ｚ）比から再構築された）。
【０１９７】
実施例３４
グリコペプチドチオエステルＡｓｐ１−Ａｓｎ３６の合成
合成は、Ｗａｎｇらによって、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ Ｒｅｓ．Ｔｈｅｒａｐ．２００５，１１，１１７−１２３に公表された手順に基づいて行った。該文献は参照により本明細書に組み込まれる。合成は、Ｒｉｎｋアミド樹脂から出発した。２０％ピペリジン（ＤＭＦ中）を用い２０分（×２）処理することによりＦｍｏｃ基を除去した後、ＨＢＴＵ（４当量）およびＤＩＥＡ（１０当量）のＤＭＦカップリング溶液と２時間混合することにより、樹脂をＦｍｏｃ−Ａｓｐ−Ｏアリル（４当量）でロードした。その後、樹脂をＤＭＦ（４ｍＬ×４）で洗浄し、次いでＡｃ２Ｏ／ＤＩＥＡ／ＤＭＦ（１：２：１７）を用いて樹脂上の遊離アミンのアセチル化を２０分行った。その後、樹脂を、ＤＭＦ（４ｍＬ×４）、ＤＣＭ（４ｍＬ×４）およびＤＭＦ（４ｍＬ×４）で洗浄した。Ｆｍｏｃ−ＳＰＰＳを、ＨＢＴＵ／ＤＩＥＡカップリング条件を用いて行った。グリコシル化アミノ酸をカップリングするために、２当量の構造ブロック１６を合成に使用し、カップリング時間を１日に延ばした。樹脂上にグリコペプチドの完全な配列が完了すると、ＤＣＭ中、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（２５ｍｇ／０．１ｍｍｏｌ樹脂）およびＰｈＳｉＨ３（１０当量）で３０分（×２）処理することにより、アリル基を除去した。ＤＣＭ（４ｍＬ×４）、ＤＭＦ（４ｍ×４）、次いでＤＣＭ（４ｍＬ×４）で洗浄した後、該樹脂を、エチル３−メルカプトプロピオネート（２４当量）、ＤＩＥＡ（３７．５当量）、無水ＨＯＢｔ（３０当量）、ＤＩＣ（３０当量）およびＤＣＭ／ＤＭＦ（１／４）を含む反応溶液と６時間（×２）混合することによって、遊離酸をチオエステルに変換した。その後、樹脂を、ＤＣＭ（４ｍＬ×４）、ＤＭＦ（４ｍ×４）、次いでＤＣＭ（４ｍＬ×４）で洗浄した。ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／チオアニソール／ＴＥＳ（１７／１／１／１）での処理により、完全脱保護とともに、グリコペプチドを樹脂から切断した。粗生成物をＨＰＬＣ精製に供し、純粋な生成物を９％の収量で得た。ＥＳＩ−ＭＳ：３９７７Ｄａ。（ペプチド塊は、ペプチドの観察されたプロトン化状態の全てからの実験的質量／電荷（ｍ／ｚ）比から再構築された）。
【０１９８】
実施例３５
糖補助連結反応（ＳＡＬ）の一般的手順
保護されていないペプチドセグメントの連結反応は、以下のようにして行った。反応の前、連結反応溶液（６ＭのＧｎ−ＨＣｌ、０．２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ８．５）を１０分間脱ガスした。続いて、グリコペプチドおよびチオエステルペプチドを、Ａｒ下で、連結反応溶液に溶解した。反応は３７℃で行い、周期的にボルテックスし、反応混合物を平衡化した。ＨＰＬＣまたはＬＣ／ＭＳ分析の前に、ＴＣＥＰ（６０ｍＭ）または１０％（ｖ／ｖ）の２−メルカプトエタノールを加え、形成されたジスルフィド結合を減らした。
【０１９９】
実施例３６
脱硫の一般的手順
脱硫反応は、室温で、１５ｍＭのＴＣＥＰを含む、６ＭのＧｎ−ＨＣｌ、０．２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ５．８の溶液中で行った。緩衝液は、使用する前、該溶液にＡｒを１０分バブリングすることにより脱ガスした。Ｐｄ／Ａｌ２Ｏ３（グリコペプチドの重さの１５倍）の添加の後、Ｈ２バルーンを使用して、反応混合物をＨ２下に保った。脱硫反応は、分析ＨＰＬＣクロマトグラフィおよびＬＣ／ＭＳによってモニタリングした。反応が完了すると、Ｐｄ／Ａｌ２Ｏ３を遠心分離によって沈降させ、上澄み液をＨＰＬＣ精製のために集めた。
【０２００】
実施例３７
ジプテリシングリコペプチドセグメントＣｙｓ（Ａｃｍ）３７−Ｐｈｅ８２からのＡｃｍ基の除去
Ｃｙｓ（Ａｃｍ）３７−Ｐｈｅ８２（３ｍｇ）を、３０当量のＨｇ（ＯＡｃ）２を含む１０％ＡｃＯＨ（ｐＨ４．０）、１ｍＬに溶解した。反応混合物をよく混合し、室温で１時間攪拌した。反応が成し遂げられると、１２０当量のＤＴＴを加え、混合物を１２時間反応させると、全てのＨｇ（ＯＡｃ）２が析出した。その後、黒色析出物を沈降させ、上澄み液をＨＰＬＣ精製のために集めた。
【０２０１】
実施例３８
ジプテリシングリコペプチドＣｙｓ３７−Ｐｈｅ８２およびジプテリシングルコペプチドチオエステルＡｓｐ１−Ａｓｎ３６のネイティブケミカルライゲーション（ＮＣＬ）
グリコペプチドセグメントＣｙｓ３７−Ｐｈｅ８２（２．９ｍＭ）およびグリコペプチドチオエステルセグメントＡｓｐ１−Ａｓｎ３６（４．４ｍＭ）の連結反応を、３７℃で、２％（ｖ／ｖ）のチオフェノールおよび２％（ｖ／ｖ）ベンジルメルカプタンを含む、６ＭのＧｎ・ΗＣｌ、２００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．９の溶液中で行った。１６時間後、連結反応が完了したことが観察され、連結反応生成物をＥＳＩ−ＭＳによって確認した。ＨＰＬＣ精製後、純粋な生成物が４７％で観察された。
【０２０２】
実施例３９
３−Ｏ−メルカプトアセチルセリン試薬３５の合成
【０２０３】
【化５７】
（Ｄ）−グルコサミンからの３−Ｏ−トリチルメルカプトアセチルセリン試薬３５の合成
ａ）Ａｃ２Ｏ、ＡｃＯＨ、Ｚｎ微粉、９１％；ｂ）Ｐｄ（ＰＰｈ３）４、ＮＭＡ、ＴＨＦ；ｃ）ＮａＯＭｅ、ＭｅＯＨ、ｐＨ９；ｄ）臭化アリル、ＤＩＥＡ、ＤＭＦ；ｅ）ベンズアルデヒドジメチルアセタール、ｐ−ＴｓＯＨ、ＭｅＣＮ、３２から、５１％；ｆ）ＴｒｔＳＣＨ２ＣＯＯＨ、ＤＩＣ、ＤＭＡＰ、ＣＨ２Ｃｌ２、０℃、９１％；ｇ）Ｐｄ（ＰＰｈ３）４、ＮＭＡ、ＴＨＦ、９１％。ＡｃＯＨ＝酢酸、ＮＭＡ＝Ｎ−メチルアニリン、ＤＩＥＡ＝Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、ｐ−ＴｓＯＨ＝ｐ−トルエン−４−スルホン酸、Ｔｒｏｃ＝２，２，２−トリクロロエチルカルバメート、Ｔｒｔ＝トリチル、ＤＩＣ＝Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、ＤＭＡＰ＝４−ジメチルアミノピリジン。
【０２０４】
（３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−６−（（Ｒ）−２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）−３−（アリルオキシ）−３−オキソプロポキシ）−５−アセタミド−２−（アセトキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３，４−ジイルジアセテート３２
【０２０５】
【化５８】
Ｔｒｏｃ保護グリコシルアミノ酸３１（１．０７ｇ、１．２９ｍｍｏｌ）を無水酢酸（１６ｍｌ）に溶解し、反応系を０℃に冷却した。予備活性化させたＺｎ微粉［５ｇ、１ＭのＨＣｌ（１００ｍｌ）、水（２×１００ｍｌ）、ジエチルエーテル（２×１００ｍｌ）で洗浄することにより活性化させる］、次いで酢酸（４．８ｍｌ）を加え、反応系をｒｔで９０分攪拌した。反応系をセライトのプラグでろ過し、ジクロロメタンで洗浄し、溶媒を真空除去した。カラムクロマトグラフィ（溶出液：３：１ｖ／ｖ酢酸エチル／ヘキサン）による精製により、所望の生成物３２を白色固体（０．８２ｇ、９１％）として得た。
Ｒｆ（３：１ｖ／ｖ酢酸エチル／ヘキサン）＝０．２３；１Ｈ−および１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルデータは、文献２３で報告されたデータと一致した。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ３５Ｈ４０Ｎ２Ｏ１３［Ｍ＋Ｈ］＋について計算値：６９７．２６０３。測定値：６９７．２６０２。
【０２０６】
（２Ｒ）−アリル２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）−３−（（６Ｒ，７Ｓ，８Ｒ，８ａＳ）−７−アセタミド−８−ヒドロキシ−２−フェニルヘキサヒドロピラノ［３，２−ｄ］［１，３］ジオキシン−６−イルオキシ）プロパノエート３３
【０２０７】
【化５９】
グリコシルアミノ酸３２（１．８３ｇ、２．６３ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（３７ｍｌ）に懸濁した。Ｎ−メチルアニリン（２．８６ｍｌ、２６．３ｍｍｏｌ）およびＰｄ（ＰＰｈ３）４（３０３ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を加え、反応系をｒｔで３０分攪拌した。溶媒を真空除去し、生成物をカラムクロマトグラフィ（溶出液：９：１ｖ／ｖジクロロメタン／メタノール＋１％ＡｃＯＨ）で精製し、酸をクリーム状固体［１．７ｇ、９５％、ＲＦ（９：１ｖ／ｖジクロロメタン／メタノール）＝０．０７］として得た。得られた酸を乾燥メタノール（５５ｍｌ）に溶解し、ナトリウムメトキシドのメタノール溶液（０．５Ｍ溶液）をｐＨが９．０になるまで加えた。反応系をｒｔで２時間攪拌し、その後、ダウエックス５０Ｈ＋樹脂の添加により中性とした。反応系をろ過し、溶媒を真空除去し、所望のトリオールを得た。これをさらに精製することなく使用した。該トリオールをＤＭＦ（１６ｍｌ）に溶解し、０℃に冷却した。ＤＩＥＡ（０．９０ｍｌ、５．１８ｍｍｏｌ）および臭化アリル（０．４５ｍｌ、５．１８ｍｍｏｌ）を滴下し、反応系をｒｔで６時間攪拌した。溶媒を真空除去し、生成物をカラムクロマトグラフィ（溶出液：９：１ｖ／ｖジクロロメタン／メタノール）で精製し、アリル保護化合物を白色固体（０．７７ｇ）として得た。得られたトリオール（０．７７ｇ、１．３５ｍｍｏｌ）をＭｅＣＮ（３３ｍｌ）に溶解した。ベンズアルデヒドジメチルアセタール（０．４１ｍｌ、２．７０ｍｍｏｌ）およびｐ−トルエンスルホン酸（２６ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を加え、反応系をｒｔで３時間攪拌した。溶媒を真空除去し、生成物をカラムクロマトグラフィ（溶出液：４：１ｖ／ｖ酢酸エチル／ヘキサン）で精製し、所望のアルコール３３を白色固体（０．８７ｇ、３２から、９８％および５１％）として得た。
【０２０８】
【化６０】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ３６Ｈ３８Ｎ２Ｏ１０［Ｍ＋Ｈ］＋について計算値：６５９．２５９９。測定値：６５９．２５９７。
【０２０９】
（２Ｒ）−アリル２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）−３−（（６Ｒ，７Ｓ，８Ｒ，８ａＳ）−７−アセタミド−２−フェニル−８−（２−（トリチルチオ）アセトキシ）ヘキサヒドロプラノ［３，２−ｄ］［１，３］ジオキシン−６−イルオキシ）プロパノエート３４
【０２１０】
【化６１】
アルコール３３（１４２ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を、乾燥ジクロロメタン（７．５ｍｌ）に溶解した。Ｓ−トリチル−メルカプト酢酸（１１０ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）を加え、反応系を０℃に冷却した。ＤＩＣ（５０μｌ、０．３２ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（１．３ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）を加え、反応系を０℃で１５分攪拌した。溶媒を真空除去し、生成物をカラムクロマトグラフィ（溶出液：２：１ヘキサン／酢酸エチル−１：１ｖ／ｖヘキサン／酢酸エチル）で精製し、３４を白色固体（１９０ｍｇ、９１％）として得た。
Ｒｆ（１：１ｖ／ｖヘキサン／酢酸エチル）＝０．５７；
【０２１１】
【化６２】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ５７Ｈ５４Ｎ２Ｏ１１Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋について計算値：９７５．３５２１。測定値：９３５．３５２６。
【０２１２】
（２Ｒ）−２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）−３−（（６Ｒ，７Ｓ，８Ｒ，８ａＳ）−７−アセタミド−２−フェニル−８−（２−（トリチルチオ）アセトキシ）ヘキサヒドロピラノ［３，２−ｄ］［１，３］ジオキシン−６−イルオキシ）プロパン酸３５
【０２１３】
【化６３】
アリル保護グリコシルアミノ酸３４（１３５ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（６ｍｌ）に懸濁した。Ｎ−メチルアニリン（０．１５ｍｌ、１．３８ｍｍｏｌ）およびＰｄ（ＰＰｈ３）４（１６ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）を加え、反応系をｒｔで２０分攪拌した。溶媒を真空除去し、生成物をカラムクロマトグラフィ（溶出液：９５：５ｖ／ｖジクロロメタン／メタノール−９：１ｖ／ｖジクロロメタン／メタノール）で精製し、所望の酸３５を淡黄色固体（１２３ｍｇ、９５％）として得た。
Ｒｆ（９５：５ｖ／ｖジクロロメタン／メタノール）＝０．２６；
【０２１４】
【化６４】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）Ｃ５４Ｈ５０Ｎ２Ｏ１１Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋について計算値：９３５．３２０８。測定値：９３５．３２１１。
【０２１５】
実施例４０
３−Ｏ−メルカプトアセチル−２−アセタミドグルコシルペプチドフラグメントの固相ペプチド
【０２１６】
【化６５】
（Ｘ−Ｓｅｒ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒは、配列番号：８２に相当し、これは非修飾アミノ酸類を表わす）。
【０２１７】
一般的手順
分析ＨＰＬＣは、分析カラム（Ｇｒａｃｅ Ｖｙｄａｃ「タンパク質およびペプチドＣ１８」、１５０×４．６ｍｍ、粒径：１０μｍ、流速：１．５ｍｌ／分）を使用して、Ｈｉｔａｃｈｉ（Ｄ−７０００ＨＰＬＣシステム）装置で行った。セミ分取ＨＰＬＣは、セミ分取カラム（Ｇｒａｃｅ Ｖｙｄａｃ「タンパク質およびペプチドＣ１８」、２５０×１０ｍｍ、粒径：１０〜１５μｍ、流速：４ｍＬ／分）を使用して、Ｈｉｔａｃｈｉ（Ｄ−７０００ＨＰＬＣシステム）装置で行った。分取ＨＰＬＣは、分取カラム（Ｇｒａｃｅ Ｖｙｄａｃ「タンパク質およびペプチドＣ１８」、２５０×２２ｍｍ、粒径：１０〜１５μｍ、流速：８ｍＬ／分）を使用して、Ｈｉｔａｃｈｉ（Ｄ−７０００ＨＰＬＣシステム）装置で行った。シグナルの検出は、フォトダイオードアレイ検出器を用い、λ＝２８０ｎｍの波長で行った。溶出液Ａ（水中０．１％ＴＦＡ）およびＢ（アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ）を、５０℃の線形勾配において使用した。勾配：３０分で、Ａ：０％Ｂ→８０％Ｂ。
【０２１８】
材料
水は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ超純粋精製システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）から取った。ＤＭＦは、バイオテク級のものを購入した。市販の試薬は、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈまたはＡｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓから購入し、さらに精製することなく使用した。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）はナトリウム／ベンゾフェノンで蒸留し、ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）は塩化カルシウムで蒸留した。他の無水物級の溶媒は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、直接使用した。分子ふるい（ＡＷ３００）は、グリコシル化実験の前に、新しく粉砕し、直接火炎乾燥した。分析薄層クロマトグラフ（ＴＬＣ）は、シリカゲル６０Ｆ２５４ガラスプレートを使用して行った。化合物スポットは、酸性モリブデン酸セリウムアンモニウムで染色し、ＵＶ光（２５４ｎｍ）によって視覚化した。フラッシュクロマトグラフィは、シリカゲル６０Ｇｅｄｕｒａｎ（３５〜７５μｍ、ＥＭＤ Ｓｃｉｅｎｃｅ）で行った。樹脂、保護されたアミノ酸類およびＰｙＢＯＰは、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍから購入した。重水素化溶媒は、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から購入した。
【０２１９】
ＮＭＲスペクトル観測
１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲは、それぞれ、６００ＭＨｚおよび１５０ＭＨｚで操作し、ＣｒｙｏＰｒｏｂｅを備えるＢｒｕｋｅｒ ＤＲＸ−６００スペクトロメータを使用して記録した。カップリング定数（Ｊ）は、可能な場合は、ヘルツ（Ｈｚ）で報告し、化学シフトは、テトラメチルシラン（ＴＭＳ、０．００ｐｐｍ）に対する百万分率（ｐｐｍ）として報告する。
【０２２０】
質量スペクトル分析
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルは、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＶｏｙａｇｅｒ−ＤＥ Ｐｒｏ生体分光光度ワークステーションで測定した。０．１％ＴＦＡを含む１０ｍｇ／ｍｌのα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸溶液を、プローブ−マトリックス混合物を生成するために使用した。
【０２２１】
高分解能質量スペクトル分析は、Ｆｌｉｇｈｔ質量スペクトロメータのＡｇｉｌｅｎｔ６２１０Ｔｉｍｅで測定した。
ペプチド合成
Ｔｏｒｖｉｑから購入した、テフロン（登録商標）フィルターを備えたシリンジ中で、固相化学を行った。
【０２２２】
３−（トリチルチオ）プロパン酸のＭＢＨＡ−リンカーへのプレローディング：樹脂ローディングは、過剰の樹脂を加えることにより、約３００μｍｏｌ／ｇを目的とした。先ず、樹脂を洗浄（５×ＤＣＭ、３分で５％ＤＩＰＥＡ／ＤＣＭ、５×ＤＣＭ、５×ＤＭＦ）した。３−（トリチルチオ）プロパン酸の予備活性化のために、ＰｙＢＯＰ（１当量）を、２当量のＮＭＭを含む、３−（トリチルチオ）プロパン酸のＤＭＦ、０．１Ｍ溶液に加えた。予備活性化の５分後、混合物を樹脂に加えた。２時間後、樹脂を洗浄（５×ＤＭＦ、５×ＤＣＭ、３分で５％ＤＩＰＥＡ／ＤＣＭ、５×ＤＣＭ、５×ＤＭＦ）した。キャッピングのために、樹脂を無水酢酸／ピリジン（１：９）（２×１０分）で処理し、洗浄（５×ＤＭＦ、１０×ＤＣＭ）し、最後に真空乾燥した。
【０２２３】
Ｂｏｃ法による固相合成：Ｂｏｃ切断：樹脂を５％のｍ−クレゾール／ＴＦＡ（２×４分）で処理した後、ＤＣＭ（８×）およびＤＭＦ（５×）で洗浄した。カップリング：４当量のＰｙＢＯＰおよび８当量のＮＭＭを使用して、４当量の保護アミノ酸（最終濃度：ＤＭＦ中０．１Ｍ）を５分間予備活性化した後、該溶液を樹脂に加えた。３０分後、樹脂を、ＤＭＦ（５×）、ＤＣＭ（５×）およびＤＭＦ（８×）で洗浄した。キャッピング：無水酢酸／ピリジン（１：９）を樹脂に加えた。５分後、樹脂を、ＤＭＦ（５×）およびＤＣＭ（５×）で洗浄した。末端キャッピング：無水酢酸／ピリジン（１：９）を樹脂に加えた。１０分後、樹脂を、ＤＭＦ（５×）およびＤＣＭ（８×）で洗浄した。切断：ＴＦＭＳＡ／ＴＦＡ／チオアニソール（２：８：１）の混合物を、樹脂に加えた。２時間後、樹脂をＴＦＡ（４×）で洗浄した。検査：合わせた溶液を真空濃縮した。残渣を水に溶解し、分取ＨＰＬＣで精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（マトリックス：α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸）で分析した。
【０２２４】
Ｒｉｎｋアミド樹脂のプレローディング：先ず、樹脂を洗浄（５×ＤＣＭ、５×ＤＭＦ）し、次いで１０％ピペリジン／ＤＭＦ（２×５分）で処理することによりＦｍｏｃ基を除去し、さらに洗浄工程（５×ＤＭＦ、５×ＤＣＭ、５×ＤＭＦ）を行った。第１保護アミノ酸の予備活性化に関し、４当量のＰｙＢＯＰおよび８当量のＮＭＭを、構造ブロック（０．１Ｍ）のＤＭＦ溶液に加えた。予備活性化の５分後、混合物を樹脂に加えた。２時間後、樹脂を洗浄（５×ＤＭＦ、５×ＤＣＭ、５×ＤＭＦ）し、無水酢酸／ピリジン（１：９）（２×５分）でキャップし、洗浄（５×ＤＭＦ、５×ＤＣＭ、５×ＤＭＦ）した。
Ｆｍｏｃ法によるグリコペプチド固相合成：Ｆｍｏｃ切断：樹脂を１０％のピペリジン／ＤＭＦ（２×５分）で処理した後、洗浄（５×ＤＭＦ、５×ＤＣＭ、５×ＤＭＦ）した。カップリング：４当量のＰｙＢＯＰおよび８当量のＮＭＭを使用して、４当量の保護アミノ酸（最終濃度：ＤＭＦ中０．１Ｍ）を５分間予備活性化した後、該溶液を樹脂に加えた。３０分後、樹脂を、ＤＭＦ（５×）、ＤＣＭ（５×）およびＤＭＦ（５×）で洗浄した。キャッピング：無水酢酸／ピリジン（１：９）を樹脂に加えた。５分後、樹脂を、ＤＭＦ（５×）、ＤＣＭ（５×）およびＤＭＦ（５×）で洗浄した。糖含有モノマーのカップリング：１当量のＰｙＢＯＰおよび２当量のＮＭＭを使用して、１当量の構造ブロック（最終濃度：ＤＭＦ中０．１Ｍ）を５分間予備活性化した後、該溶液を樹脂に加えた。６時間後、樹脂を、ＤＭＦ（５×）、ＤＣＭ（５×）およびＤＭＦ（５×）で洗浄した。切断：ＴＦＡ、チオアニソール、トリイプロピルシランおよび水（１７：１：１：１）の混合物を加えた。２時間後、樹脂をＴＦＡ（４×４ｍＬ）で洗浄した。検査：合わせた溶液を、真空濃縮した。残渣を水に溶解し、分取ＨＰＬＣで精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（マトリックス：α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸）で分析した。
【０２２５】
固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により生成されたグリコペプチド類
【０２２６】
【化６６】
（配列番号：１２は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
【０２２７】
１００μｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｓｅｒ−Ｒｉｎｋアミド樹脂から出発し、線状アセンブリをＦｍｏｃ法に準じて行った。収量：３６ｍｇ（４３μｍｏｌ、４３％）。ＥＳＩ−ＴＯＦ ｈｉｇｈ−ａｃｃ．（ｍ／ｚ）：８４３．３１８１（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：８４３．３１８９）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：６．６分（勾配Ａ）；Ｃ３４Ｈ５０Ｎ８Ｏ１５Ｓ（８４２．３１１６）。
【０２２８】
【化６７】
（配列番号：１３は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
【０２２９】
１００μｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｓｅｒ−Ｒｉｎｋアミド樹脂から出発して、線状アセンブリをＦｍｏｃ法に準じて行った。収量：３５ｍｇ（４１μｍｏｌ、４１％）。ＥＳＩ−ＴＯＦ ｈｉｇｈ−ａｃｃ．（ｍ／ｚ）：８４９．２７３７（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：８４９．２７５３）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：５．６分（勾配Ａ）；Ｃ３２Ｈ４８Ｎ８Ｏ１５Ｓ２（８４８．２６８０）
【０２３０】
【化６８】
（配列番号：１４は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
【０２３１】
６６．５μｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｓｅｒ−Ｒｉｎｋアミド樹脂から出発して、線状アセンブリをＦｍｏｃ法に準じて行った。収量：２１．５ｍｇ（２４μｍｏｌ、３６％）。ＥＳＩ−ＴＯＦ ｈｉｇｈ−ａｃｃ．（ｍ／ｚ）：９０７．２７９６（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：９０７．２８０８）．ＨＰＬＣ：ｔＲ：５．７分（勾配Ａ）；Ｃ３４Ｈ５０Ｎ８Ｏ１７Ｓ２（９０６．２７３５）。
【０２３２】
【化６９】
（配列番号：１５は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
【０２３３】
６６．５μｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｓｅｒ−Ｒｉｎｋアミド樹脂から出発して、線状アセンブリをＦｍｏｃ法に準じて行った。収量：２５ｍｇ（２７μｍｏｌ、４１％）。ＥＳＩ−ＴＯＦ ｈｉｇｈ−ａｃｃ．（ｍ／ｚ）：９２９．３１２３（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：９２９．３１２８）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：５．９分（勾配Ａ）；Ｃ３６Ｈ５２Ｎ１０Ｏ１５Ｓ２（９２８．３０５５）。
【０２３４】
【化７０】
（配列番号：１６は、非修飾アミノ酸に相当する）。
【０２３５】
１００μｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｓｅｒ−Ｒｉｎｋアミド樹脂から出発して、線状アセンブリをＦｍｏｃ法に準じて行った。収量：２０ｍｇ（２１μｍｏｌ、２１％）。ＥＳＩ−ＴＯＦ ｈｉｇｈ−ａｃｃ．（ｍ／ｚ）：９４２．３８６０（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：９４２．３８７３）、ＨＰＬＣ：ｔＲ：６．７分（勾配Ａ）；Ｃ３９Ｈ５９Ｎ９Ｏ１６Ｓ（９４１．３８００）。
【０２３６】
【化７１】
（配列番号：１７は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
【０２３７】
６６．５μｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｓｅｒ−Ｒｉｎｋアミド樹脂から出発して、線状アセンブリをＦｍｏｃ法に準じて行った。収量：１１ｍｇ（１２μｍｏｌ、１８％）。ＥＳＩ−ＴＯＦ ｈｉｇｈ−ａｃｃ．（ｍ／ｚ）：９４８．３４２１（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：９４８．３４３７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ；６．６分（勾配Ａ）；Ｃ３７Ｈ５７Ｎ９Ｏ１６Ｓ２（９４７．３３６５）。
【０２３８】
【化７２】
（配列番号：１８は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
【０２３９】
６６．５μｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｓｅｒ−Ｒｉｎｋアミド樹脂から出発して、線状アセンブリをＦｍｏｃ法に準じて行った。収量：１２ｍｇ（１２μｍｏｌ、１８％）。ＥＳＩ−ＴＯＦ ｈｉｇｈ−ａｃｃ．（ｍ／ｚ）：１００６．３４８４（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１００６．３４９２）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：６．６分（勾配Ａ）；Ｃ３９Ｈ５９Ｎ９Ｏ１８Ｓ２（１００５．３４１９）。
【０２４０】
【化７３】
（配列番号：１９は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
【０２４１】
６６．５μｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｓｅｒ−Ｒｉｎｋアミド樹脂から出発して、線状アセンブリをＦｍｏｃ法に準じて行った。収量：１０ｍｇ（１０μｍｏｌ、１４％）。ＥＳＩ−ＴＯＦ ｈｉｇｈ−ａｃｃ．（ｍ／ｚ）：１０２８．３８０４（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１０２８．３８１２）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：６．５分（勾配Ａ）；Ｃ４１Ｈ６１Ｎ１１Ｏ１６Ｓ２（１０２７．３７３９）。
【０２４２】
【化７４】
（配列番号：２０は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
【０２４３】
６６．５μｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｓｅｒ−Ｒｉｎｋアミド樹脂から出発して、線状アセンブリをＦｍｏｃ法に準じて行った。収量：１２ｍｇ（１１μｍｏｌ、１７％）。ＥＳＩ−ＴＯＦ ｈｉｇｈ−ａｃｃ．（ｍ／ｚ）：１０６１．４２７１（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１０６１．４２７８）。ＨＰＬＣ：ｔｋ：９．０分（勾配Ａ）；Ｃ４３Ｈ６８Ｎ１０Ｏ１７Ｓ２（１０６０．４２０５）。
【０２４４】
【化７５】
（配列番号：２１は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
【０２４５】
６６．５μｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｓｅｒ−Ｒｉｎｋアミド樹脂から出発して、線状アセンブリをＦｍｏｃ法に準じて行った。収量：３ｍｇ（３μｍｏｌ、４％）。ＥＳＩ−ＴＯＦ ｈｉｇｈ−ａｃｃ．（ｍ／ｚ）：１１１８．４４８８（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１１１８．４４９３）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．８分（勾配Ａ）；Ｃ４５Ｈ７１Ｎ１１Ｏ１８Ｓ２（１１１７．４４２０）。
【０２４６】
【化７６−１】
（配列番号：２２は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
【０２４７】
６６．５μｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｓｅｒ−Ｒｉｎｋアミド樹脂から出発して、線状アセンブリをＦｍｏｃ法に準じて行った。収量：７ｍｇ（６μｍｏｌ、９％）。ＥＳＩ−ＴＯＦ ｈｉｇｈ−ａｃｃ．（ｍ／ｚ）：１１７５．４７０６（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１１７５．４７０７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．４分（勾配Ａ）；Ｃ４７Ｈ７４Ｎ１２Ｏ１９Ｓ２（１１７４．４６３４）。
ＳＰＰＳにより生成されるペプチドチオエステル類
【０２４８】
【化７６−２】
（配列番号：２３は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
【０２４９】
１００μｍｏｌの、３−（トリチルチオ）プロパン酸がプレロードされたＭＢＨＡ−樹脂から出発して、線状アセンブリをＢｏｃ法に準じて行った。収量：５０．６ｍｇ（７２μｍｏｌ、７２％）。ＥＳＩ−ＴＯＦ ｈｉｇｈ−ａｃｃ．（ｍ／ｚ）：７０８．３４９９（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：７０８．３４９７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．４分（勾配Ａ）；Ｃ３１Ｈ４９Ｎ９Ｏ８Ｓ（７０７．３４２５）。
【０２５０】
【化７６−３】
（配列番号：２４は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
【０２５１】
１００μｍｏｌの、３−（トリチルチオ）プロパン酸がプレロードされたＭＢＨＡ−樹脂から出発して、線状アセンブリをＢｏｃ法に準じて行った。収量：３９ｍｇ（５２μｍｏｌ、５２％）。ＥＳＩ−ＴＯＦ ｈｉｇｈ−ａｃｃ．（ｍ／ｚ）：７２２、３６４４（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：７２２．３６５４）。ＨＰＬＣ；ｔＲ：８．８分（勾配Ａ）；Ｃ３２Ｈ５１Ｎ９Ｏ８Ｓ（７２１．３５８１）。
【０２５２】
【化７６−４】
（配列番号：２５は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
【０２５３】
１００μｍｏｌの、３−（トリチルチオ）プロパン酸がプレロードされたＭＢＨＡ−樹脂から出発して、線状アセンブリをＢｏｃ法に準じて行った。収量：３３．３ｍｇ（４１μｍｏｌ、４１％）。ＥＳＩ−ＴＯＦ ｈｉｇｈ−ａｃｃ．（ｍ／ｚ）；８１４．３９０１（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：８１４．３９１６）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．３分（勾配Ａ）；Ｃ３８Ｈ５５Ｎ９Ｏ９Ｓ（８１３．３８４３）。
【０２５４】
【化７６−５】
（配列番号：２６は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
【０２５５】
１００μｍｏｌの、３−（トリチルチオ）プロパン酸がプレロードされたＭＢＨＡ−樹脂から出発して、線状アセンブリをＢｏｃ法に準じて行った。収量：３１ｍｇ（３９μｍｏｌ、３９％）。ＥＳＩ−ＴＯＦ ｈｉｇｈ−ａｃｃ．（ｍ／ｚ）：７８８．３８６３（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：７８８．３８７２）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．０分（勾配Ａ）；Ｃ３５Ｈ５３Ｎ１１Ｏ８Ｓ（７８７．３７９９）。
【０２５６】
【化７６−６】
（配列番号：２７は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
【０２５７】
１００μｍｏｌの、３−（トリチルチオ）プロパン酸がプレロードされたＭＢＨＡ−樹脂から出発して、線状アセンブリをＢｏｃ法に準じて行った。収量：８．７ｍｇ（１１μｍｏｌ、１１％）。ＥＳＩ−ＴＯＦ ｈｉｇｈ−ａｃｃ．（ｍ／ｚ）：７９８．３９６３（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：７９８．３９６７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．５分（勾配Ａ）；Ｃ３８Ｈ５５Ｎ９Ｏ８Ｓ（７９７．３８９４）。
【０２５８】
ペプチド連結反応
グリコペプチド類（１．５当量、約３μｍｏｌ）を、脱酸素化連結反応緩衝液（４：１ｖ／ｖＮ−メチル−２−ピロリジノン；６Ｍのグアニジン塩酸塩、１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ＝８．５）に溶解した。この溶液を、ペプチドチオエステル（約２μｍｏｌ）を含むエッペンドルフチューブに移した。チオフェノール（２体積％、３μｌ）を加え、反応系を緩やかに混合した。連結反応混合物を、ＬＣ−ＭＳが反応の完了を示すまで、１２時間毎に緩やかに混合しながら、３７℃で培養した。
連結反応生成物
【０２５９】
【化７７】
（配列番号：２８は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：６９％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１４４６．２（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１４４６．６）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．７分（勾配Ａ）；Ｃ６２Ｈ９２Ｎ１６Ｏ２２Ｓ（１４４５．６）。
【０２６０】
【化７８】
（配列番号：２８は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１３７１．８（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１３７２．５）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：７．８分（勾配Ａ）；Ｃ６０Ｈ９０Ｎ１６Ｏ２１（１３７１．５）。
【０２６１】
【化７９】
（配列番号：２９は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：８４％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１４５１．７（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１４５２．６）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．７分（勾配Ａ）；Ｃ６０Ｈ９０Ｎ１６Ｏ２２Ｓ２（１４５１．６）
【０２６２】
【化８０】
（配列番号：２９は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１３７８．３（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１３７８．５）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．１分（勾配Ａ）；Ｃ５８Ｈ８８Ｎ１６Ｏ２１Ｓ（１３７７．５）
【０２６３】
【化８１】
（配列番号：３０は、非修飾アミノ酸類に相当する）。．
収率：２８％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１５３３．１（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１５３２．７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．９分（勾配Ａ）；Ｃ６４Ｈ９４Ｎ１８Ｏ２２Ｓ２（１５３１．７）
【０２６４】
【化８２】
（配列番号：３０は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１４５８．０（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１４５８．６）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．３分（勾配Ａ）；Ｃ６２Ｈ９２Ｎ１８Ｏ２１Ｓ（１４５７．６）。
【０２６５】
【化８３】
（配列番号：３１は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：２７％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１６１２．４（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１６１２．８）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．１分（勾配Ａ）；Ｃ６８Ｈ９９Ｎ２０Ｏ２２Ｓ２（１６１１．８）。
【０２６６】
【化８４】
（配列番号：３１は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１５３８．０（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１５３８．７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：７．６分（勾配Ａ）；Ｃ６６Ｈ９６Ｎ２０Ｏ２１Ｓ（１５３７．７）。
【０２６７】
【化８５】
（配列番号：３２は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：３８％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１５０９．３（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１５１０．６）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．３分（勾配Ａ）；Ｃ６２Ｈ９２Ｎ１６Ｏ２４Ｓ２（１５０９．６）。
【０２６８】
【化８６】
（配列番号：３２は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１４３５．９（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１４３６．５）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．２分（勾配Ａ）；Ｃ６０Ｈ９０Ｎ１６０２３Ｓ（１４３５．５）。
【０２６９】
【化８７】
（配列番号：３３は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：２２％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１５９０．５（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１５９０．７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．３分（勾配Ａ）；Ｃ６６Ｈ９７Ｎ１８Ｏ２４Ｓ２（１５８９．７）。
【０２７０】
【化８８】
（配列番号：３３は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１５１４．６（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１５１６．６）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．３分（勾配Ａ）；Ｃ６４Ｈ９４Ｎ１８Ｏ２３Ｓ（１５１５．６）。
【０２７１】
【化８９】
（配列番号：３４は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：４０％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１６１６．４（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１６１６．７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．９分（勾配Ａ）；Ｃ６９Ｈ９８Ｎ１６Ｏ２５Ｓ２（１６１５．７）。
【０２７２】
【化９０】
（配列番号：３４は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１５４１．８（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１５４２．６）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．８分（勾配Ａ）；Ｃ６７Ｈ９６Ｎ１６Ｏ２４Ｓ（１５４１．６）。
【０２７３】
【化９１】
（配列番号：３５は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：２８％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１４６６．２（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１４６６．６）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．８分（勾配Ａ）；Ｃ６１Ｈ９２Ｎ１６Ｏ２２Ｓ２（１４６５．６）。
【０２７４】
【化９２】
（配列番号：３５は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１３９２．５（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１３９２．５）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．６分（勾配Ａ）；Ｃ５９Ｈ９０Ｎ１６Ｏ２１Ｓ（１３９１．５）。
【０２７５】
【化９３】
（配列番号：３６は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：３２％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１６３７．５（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１６３８．８）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．６分（勾配Ａ）；Ｃ７１Ｈ１００Ｎ１８０２３Ｓ２（１６３７．８）。
【０２７６】
【化９４】
（配列番号：３６は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１５６４．６（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１５６４．７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．４分（勾配Ａ）；Ｃ６９Ｈ９８Ｎ１８Ｏ２２Ｓ（１５６３．７）。
【０２７７】
【化９５】
（配列番号：３７は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：４０％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１５４８．２（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１５４６．７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．６分（勾配Ａ）；Ｃ６５Ｈ９６Ｎ１８Ｏ２２Ｓ２（１５４５．７）。
【０２７８】
【化９６】
（配列番号：３７は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１４７２．６（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１４７２．６）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．２分（勾配Ａ）；Ｃ６３Ｈ９４Ｎ１８Ｏ２１Ｓ（１４７１．６）。
【０２７９】
【化９７】
（配列番号：３８は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：５９％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１５２４．８（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１５２４．７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．８分（勾配Ａ）；Ｃ６３Ｈ９４Ｎ１６Ｏ２４Ｓ２（１５２３．６）。
【０２８０】
【化９８】
（配列番号：３８は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１４５０．８（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１４５０．５）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．２分（勾配Ａ）；Ｃ６１Ｈ９２Ｎ１６Ｏ２３Ｓ（１４４９．５）。
【０２８１】
【化９９】
（配列番号：３９は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：６２％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１５３１．３（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１５３２．７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．２分（勾配Ａ）；Ｃ６４Ｈ９４Ｎ１８Ｏ２２Ｓ２（１５３１．７）。
【０２８２】
【化１００】
（配列番号：３９は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１４５９．７（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１４５８．６）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：７．８分（勾配Ａ）；Ｃ６２Ｈ９２Ｎ１８Ｏ２１Ｓ（１４５７．６）。
【０２８３】
【化１０１】
（配列番号：４０は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：６５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１５５９．６（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１５５９．７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．８分（勾配Ａ）；Ｃ６８Ｈ１０３Ｎ１７Ｏ２３Ｓ（１５５８．７）。
【０２８４】
【化１０２】
（配列番号：４０は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１４８５．２（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１４８５．６）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．９分（勾配Ａ）；Ｃ６６Ｈ１０１Ｎ１７Ｏ２２（１４８４．６）。
【０２８５】
【化１０３】
（配列番号：４１は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：５８％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１６２５．７（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１６２５．８）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．３分（勾配Ａ）；Ｃ７１Ｈ１０５Ｎ１９Ｏ２３Ｓ（１６２４．８）。
【０２８６】
【化１０４】
（配列番号：４１は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１５５１．７（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１５５１．７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．２分（勾配Ａ）；Ｃ６９Ｈ１０４Ｎ１９Ｏ２２（１５５０．７）。
【０２８７】
【化１０５】
（配列番号：４２は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：４８％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１５６５．４（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１５６５．７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：１０．０分（勾配Ａ）；Ｃ６６Ｈ１０１Ｎ１７Ｏ２３Ｓ２（１５６４．７）。
【０２８８】
【化１０６】
（配列番号：４２は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１４９１．７（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１４９１．６）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．０分（勾配Ａ）；Ｃ６４Ｈ９９Ｎ１７Ｏ２２Ｓ（１４９０．６）。
【０２８９】
【化１０７】
（配列番号：４３は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：６６％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１５５０．８（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１５５１．７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．４分（勾配Ａ）；Ｃ５５Ｈ９９Ｎ１７Ｏ２３Ｓ２（１５５０．７）。
【０２９０】
【化１０８】
（配列番号：４３は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１４７７．３（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１４７７．６）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．４分（勾配Ａ）；Ｃ６３Ｈ９７Ｎ１７Ｏ２２Ｓ（１４７６．６）。
【０２９１】
【化１０９】
（配列番号：４４は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：６８％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１５４５．５（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１５４５．７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．９分（勾配Ａ）；Ｃ５７Ｈ１０１Ｎ１７Ｏ２３Ｓ（１５４４．７）。
【０２９２】
【化１１０】
（配列番号：４４は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１４７１．７（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１４７１．６）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．５分（勾配Ａ）；Ｃ６５Ｈ９５Ｎ１７Ｏ２２（１４７０．６）。
【０２９３】
【化１１１】
（配列番号：４５は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：６０％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１６３２．２（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１６３１．８）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．３分（勾配Ａ）；Ｃ６９Ｈ１０３Ｎ１９Ｏ２３Ｓ２（１６３０．８）。
【０２９４】
【化１１２】
（配列番号：４５は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１５５７．９（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１５５７．７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．３分（勾配Ａ）；Ｃ６７Ｈ１０１Ｎ１９Ｏ２２Ｓ（１５５６．７）。
【０２９５】
【化１１３】
（配列番号：４６は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：４５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１６５７．５（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１６５７．８）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：１０．６分（勾配Ａ）；Ｃ７２Ｈ１０５Ｎ１７Ｏ２４Ｓ２（１６５６．８）。
【０２９６】
【化１１４】
（配列番号：４６は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１５８３．１（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１５８３．７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．６分（勾配Ａ）；Ｃ７０Ｈ１０３Ｎ１７Ｏ２３Ｓ（１５８２．７）。
【０２９７】
【化１１５】
（配列番号：４７は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：５５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１６３０．３（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１６３１．８）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．０分（勾配Ａ）；Ｃ６９Ｈ１０３Ｎ１９Ｏ２３Ｓ２（１６３０．８）。
【０２９８】
【化１１６】
（配列番号：４７は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１５５８．３（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１５５７．７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．２分（勾配Ａ）；Ｃ６７Ｈ１０１Ｎ１９Ｏ２２Ｓ（１５５６．７）。
【０２９９】
【化１１７】
（配列番号：４８は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：２３％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１６４７．３（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１６４５．８）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：１０．２分（勾配Ａ）；Ｃ７０Ｈ１０５Ｎ１９Ｏ２３Ｓ２（１６４４．８）。
【０３００】
【化１１８】
（配列番号：４８は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１５７１．０（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１５７１．７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．５分（勾配Ａ）；Ｃ６８Ｈ１０３Ｎ１９Ｏ２２Ｓ（１５７０．７）。
【０３０１】
【化１１９】
（配列番号：４９は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：４０％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１７１２．４（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１７１１．９）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．５分（勾配Ａ）；Ｃ７３Ｈ１０７Ｎ２１Ｏ２３Ｓ２（１７１０．９）。
【０３０２】
【化１２０】
（配列番号：４９は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１６３８．６（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１６３７．８）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．６分（勾配Ａ）；Ｃ７１Ｈ１０５Ｎ２１Ｏ２２Ｓ（１６３６．８）。
【０３０３】
【化１２１】
（配列番号：５０は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：３９％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１７３７．５（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１７３７．９）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：１０．４分（勾配Ａ）；Ｃ７６Ｈ１０９Ｎ１９Ｏ２４Ｓ２（１７３６．９）。
【０３０４】
【化１２２】
（配列番号：５０は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１６６３．４（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１６６３．８）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．５分（勾配Ａ）；Ｃ７４Ｈ１０７Ｎ１９Ｏ２３Ｓ（１６６２．８）。
【０３０５】
【化１２３】
（配列番号：５１は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：８１％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１６０８．５（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１６０９．８）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．８分（勾配Ａ）；Ｃ６７Ｈ１０１Ｎ１７Ｏ２５Ｓ２（１６０８．７）。
【０３０６】
【化１２４】
（配列番号：５１は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１５３５．２（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１５３５．７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．０分（勾配Ａ）；Ｃ６５Ｈ９９Ｎ１７Ｏ２４Ｓ（１５３４．６）。
【０３０７】
【化１２５】
（配列番号：５２は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：５０％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１６２３．３（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１６２３．８）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：１０．２分（勾配Ａ）；Ｃ６８Ｈ１０３Ｎ１７Ｏ２５Ｓ２（１６２２、８）。
【０３０８】
【化１２６】
（配列番号：５２は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１５４８．８（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１５４９．７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．３分（勾配Ａ）；Ｃ６６Ｈ１０１Ｎ１７０２４Ｓ（１５４８．７）。
【０３０９】
【化１２７】
（配列番号：５３は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：６０％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１６８７．８（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１６８９．８）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．４分（勾配Ａ）；Ｃ７１Ｈ１０５Ｎ１９Ｏ２５Ｓ２（１６８８．８）。
【０３１０】
【化１２８】
（配列番号：５３は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１６１６．０（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１６１５．７）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：８．６分（勾配Ａ）；Ｃ６９Ｈ１０３Ｎ１９Ｏ２４Ｓ（１６１４．７）。
【０３１１】
【化１２９】
（配列番号：５４は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：３７％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１７１４．９（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１７１５．９）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：１０．６分（勾配Ａ）；Ｃ７４Ｈ１０７Ｎ１７Ｏ２６Ｓ２（１７１４．９）。
【０３１２】
【化１３０】
（配列番号：５４は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１６４０．８（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１６４１．８）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．９分（勾配Ａ）；Ｃ７２Ｈ１０５Ｎ１７Ｏ２５Ｓ（１６４０．８）。
【０３１３】
【化１３１】
（配列番号：５５は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：６２％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１６６４．０（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１６６４．９）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：１１．３分（勾配Ａ）；Ｃ７１Ｈ１１０Ｎ１８Ｏ２４Ｓ２（１６６３．９）。
【０３１４】
【化１３２】
（配列番号：５５は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１５８８．７（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１５９０．８）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：１１．０分（勾配Ａ）；Ｃ６９Ｈ１０８Ｎ１８Ｏ２３Ｓ（１５８９．８）。
【０３１５】
【化１３３】
（配列番号：５６は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：８１％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１７４５．２（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１７４５．０）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：１０．８分（勾配Ａ）；Ｃ７５Ｈ１１４Ｎ２０Ｏ２４Ｓ２（１７４４．０）。
【０３１６】
【化１３４】
（配列番号：５６は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１６７０．０（［Ｍ＋Ｈ］＋３、理論値：１６７０．９）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：９．５分（勾配Ａ）；Ｃ７３Ｈ１１２Ｎ２０Ｏ２３Ｓ（１６６９．９）。
【０３１７】
【化１３５】
（配列番号：５７は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：５６％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１７２２．０（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１７２１．９）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：１１．４分（勾配Ａ）；Ｃ７３Ｈ１１３Ｎ１９Ｏ２５Ｓ２（１７２０．９）。
【０３１８】
【化１３６】
（配列番号：５７は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１６４７．５（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１６４７．８）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：１０．０分（勾配Ａ）；Ｃ７１Ｈ１１１Ｎ１９Ｏ２４Ｓ（１６４６．８）。
【０３１９】
【化１３７】
（配列番号：５８は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：６２％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１７７８．８（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１７７９．０）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：１０．８分（勾配Ａ）；Ｃ７５Ｈ１１６Ｎ２０Ｏ２６Ｓ２（１７７８）。
【０３２０】
【化１３８】
（配列番号：５８は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
収率：＞９５％。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：１７０４．９（［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１７０４．９）。ＨＰＬＣ：ｔＲ：１０．４分（勾配Ａ）；Ｃ７３Ｈ１１４Ｎ２０Ｏ２５Ｓ（１７０３．９）。
【０３２１】
実施例４１
Ｎ末端延長グリコペプチド試薬の合成
【０３２２】
【化１３９】
グリコペプチド類の固相ペプチド合成
Ｎ末端延長グリコペプチド類４４〜４８の合成は、Ｆｍｏｃ−保護Ｒｉｎｋアミド樹脂から出発して、Ｆｍｏｃ法に準じて固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により行った。不必要なモノマーの消費を避けるため、１当量だけを使用し、反応時間を６時間に増やした。３０２ｎｍでのＦｍｏｃ／ピペリジン付加物のＵＶ吸収により、これらの条件が許容しうるカップリング収率を提供することを示唆した。立体障害方側鎖を持つアミノ酸類は、Ｎ末端をグリコシル化アミノ酸に導入し、糖タンパク質配列を負荷する方法の適応性を実証した。たとえば、グリコペプチド４８は、Ｎ末端グリシンの導入前、配列：Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ（配列番号：６３）を含む。所望のアミノ酸配列をカップリングした後、先ずヒドラジンを使用してアセテート基を除去し、そして樹脂をトリフルオロ酢酸／チオアニソール／トリイソプロピルシラン／水（８５：５：５：５）で処理し、トリチル保護基、側鎖保護基を切断し、固体支持体からオリゴマーを放出させた。ＨＰＬＣによる精製後、グリコペプチド類４４〜４８を４６％と５２％との間の収率で得た。
【０３２３】
実施例４２
延長糖補助連結反応
アミノ酸類グリシン、ヒスチジン、アラニンおよびチロシンをＣ末端に持つチオエステル類を、Ｂｏｃ法によるＳＰＰＳを使用して合成した。
【０３２４】
Ｎ末端延長グリコペプチドおよびＣ末端グリシン残基を持つチオエステルの初期連結反応を、標準的な連結反応条件（６ＭのＧｎ．ＨＣｌ、１００ｍＭのリン酸二水素カリウム、２％ＰｈＳＨ、３７℃）で行った。ここで、これらの条件では、有意量の加水分解されたチオエステルをもたらし、連結反応収率は減少した。この問題を解決するため、様々な混合溶媒の連結反応条件を分析した。最も効果的な溶媒系は、Ｎ−メチルピロリジノンおよびＨＥＰＥＳ緩衝液（４：１ｖ／ｖＮＭＰ：６ＭのＧｎ．ＨＣｌ、１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．５、２％ＰｈＳＨ、３７℃）の混合物であり、これは、加水分解により最小損失のチオエステルにカップリングする容易な連結反応を可能にし、これらの条件下での全ての延長グリコペプチド類（４４〜４８）およびチオエステル（４９）の反応は、高収率で単離された連結反応生成物をもたらした。用語「延長ＳＡＬ」（ｅｘＳＡＬ）、「二倍」（ｄｅｘＳＡＬ）、「三倍」（ｔｅｘＳＡＬ）、「四倍」（ｑｅｘＳＡＬ）および「５倍延長」ＳＡＬ（ｐｅｘＳＡＬ）は、糖基を有する残基と遊離Ｎ末端アミノ基を持つ残基との間のアミノ酸残基の数を言う。ＳＡＬにおいては、糖を有するアミノ酸、たとえばセリンに結合するＧｌｙが存在する。ｅｘＳＡＬでは、１個の追加の介在アミノ酸残基が存在し、ｄｅｘＳＡＬでは、２個の追加の介在アミノ酸残基が存在し、その他同様である。延長ＳＡＬ（ｅｘＳＡＬ）により８６％の単離収率がもたらされ、それぞれ、７０％および６０％の収率である、２倍延長ＳＡＬ（ｄｅｘＳＡＬ）および３倍延長ＳＡＬ（ｔｅｘＳＡＬ）より有意に高かった。４倍延長および５倍延長ＳＡＬ（ｑｅｘＳＡＬおよびｐｅｘＳＡＬ）反応は、さらに低い収率（それぞれ３８％および４９％）で進んだ。
（配列番号：６４は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
【０３２５】
【化１４０】
グリコペプチド類４４〜４８およびＣ末端グリシンチオエステル４９の延長された糖補助連結反応の単離収率；条件：４：１ｖ／ｖＮＭＰ：６ＭのＧｎ．ＨＣｌ、１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．５、２％のＰｈＳＨ、３７℃、＊この連結反応のＨＰＬＣ収率は、ｔｅｘＳＡＬに類似していた。ＨＰＬＣによる単離が難しい生成物は、単離収率が減少した。
反応速度研究
これらの研究から、アミノ酸類をグリコペプチド類のＮ末端に付加させると、連結反応収率に、有意な減少があることが明らかになる。得られる単離収率にいくらかの光明を投じることを期待して、研究の次の段階は、反応の速度論を分析することに関する。この目的のために、延長ＳＡＬ方法の速度を、先に報告されたＳＡＬ方法と比較した。生成物形成の速度を、ＨＰＬＣにより、最初の１１時間は２時間ごとにモニタリングし、終点は２４時間後とした。ＳＡＬ反応の半減期は９時間であり、１２時間の半減期を示したｅｘＳＡＬ反応より僅かに速かった。連結反応速度は、追加のアミノ酸類がＮ末端に付加されると、より遅くなり始めた。興味深いことに、ｄｅｘＳＡＬ、ｔｅｘＳＡＬおよびｑｅｘＳＡＬ反応は、１９時間の半減期を持つ連結反応と類似する速度を示した。ｐｅｘＳＡＬにおける第６番目のアミノ酸残基の付加により、連結反応速度が大きく落ちる結果となり、そのため、反応は、２４時間後に４２％しか進まなかった。これらの反応速度研究により、ＳＡＬは、その延長された相当物より容易であるが、これらの速度は、大きさの順番によって異ならず、このように、これら延長方法の全て（ｅｘＳＡＬ、ｄｅｘＳＡＬ、ｔｅｘＳＡＬ、ｑｅｘＳＡＬおよびｐｅｘＳＡＬ）は、合成的に有用であることが示される。
【０３２６】
実施例４３
ｅｘＳＡＬの範囲
ｅｘＳＡＬ中の連結反応部にある他のアミノ酸残基の効果を研究するために、以下に示すグリコペプチド−ペプチドチオエステル対を調べた。Ｎ末端ヒスチジンを含有するグリコペプチド類と、アスパラギン酸残基とを、ＳＰＰＳ（Ｆｍｏｃ法）により合成した。これらを、Ｃ末端グリシン、ヒスチジンおよびアラニン残基を含むペプチドチオエステル類と、混合溶媒系で反応させた。グリコペプチド４４と、Ｃ末端グリシンを有するペプチドチオエステル４９との間の連結反応では、８６％の単離収率を得た。（上記エントリー１）。Ｃ末端ヒスチジン残基を含有するペプチドチオエステルは、先に報告したＳＡＬ法に従って、良好な収率（７０％、以下のエントリー２）で連結反応させた。チオエステル成分のＣ末端アミノ酸の立体的嵩高さの増加によって、連結反応効率は実質的に減少した（Ａｌａ−Ｇｌｙが４４％、以下のエントリー３）。Ｎ末端アスパラギン酸残基を有するグリコペプチド類は、注目に値する連結反応効率を達成した。このグリコペプチドを利用した単離連結反応収率は、グリシングリコペプチド４４の単離連結反応収率（６４〜９１％の収率、以下のエントリー７〜９）を超えていた。驚くべきことに、立体的に困難な連結反応部、たとえばＨｉｓ−Ｈｉｓ（７３％、以下のエントリー５）、Ａｌａ−Ｈｉｓ（７７％、以下のエントリー６）およびＨｉｓ−Ａｓｐ（９１％、以下のエントリー８）でさえ、優れた収率を示した。
【０３２７】
延長糖補助連結反応（ｅｘＳＡＬ）の範囲；条件：４：１ｖ／ｖＮＭＰ：６ＭのＧｎ．ＨＣｌ、１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．５、２％ＰｈＳＨ、３７℃。
（配列番号：７０は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
【０３２８】
【化１４１】
連結反応生成物の後続脱硫により、２位に未変性Ｎ−アセチル官能基を含有するグリコペプチド類を得た。これは、アルミナ上のパラジウムを使用する水素化条件によって行った。生成物を定量的収率（以下を参照）で、普通に単離（ＨＰＬＣ生成後）した。
【０３２９】
【化１４２】
ｄｅｘＳＡＬの範囲
ｄｅｘＳＡＬ方法を、種々のアミノ酸類に連結反応部で適用することにより、さらなる延長の範囲を試験した（以下を参照）。グリコペプチド類は、ＳＰＰＳ（Ｆｍｏｃ法）により合成した。これらのグリコペプチド類を、先に記載した混合溶媒系を使用して、Ｃ末端グリシン、アラニン、ヒスチジンおよびチロシン残基を有するペプチドチオエステル類と反応させた。グリシングリコペプチド類を使用する反応により、連結反応生成物を良好な収率（４４〜７０％）で得た。対照的に、Ｎ末端ヒスチジン残基を含有するグリコペプチド類は、延長ＳＡＬ法（２４〜４８％）と比べると、著しく低い収率で連結反応した。Ｇｌｙ−ＨｉｓおよびＨｉｓ−Ｈｉｓ連結反応は、十分な収率で単離したが、立体的に妨害されたアラニンおよびチロシンペプチドチオエステル類の導入により、収率が著しく低下する（それぞれ２８％および２４％）結果となった。アスパラギン酸塩で延長されたグリコペプチド類は、全てのケースにおいて、高収率（４９〜７６％）で連結反応させた。
（配列番号：７０は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
【０３３０】
【化１４３】
連結反応部で種々のアミノ酸類を用いた、ｅｘＳＡＬ法およびｄｅｘＳＡＬ法の観察された可撓性は、それぞれ、ｔｅｘＳＡＬ、ｑｅｘＳＡＬおよびｐｅｘＳＡＬによるグリコペプチド類４６〜４８を持つ立体障害ペプチドチオエステル類の連結反応にまで拡大された。これらのグリコペプチド類は、このチオエステルと満足のいく収率で連結反応させた（ｔｅｘＳＡＬ、ｑｅｘＳＡＬおよびｐｅｘＳＡＬに関し、それぞれ、４９、４８および３１％）。
（配列番号：７０は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
【０３３１】
【化１４４】
実施例４４
Ａｓｎ−結合糖部分を持つ連結反応
【０３３２】
【化１４５】
（配列番号：７８は、非修飾アミノ酸類に相当する）。
Ａ）構造ブロック５６の合成：試薬および条件：ａ）プロパンジチオール、ＤＩＥＡ、ＭｅＯＨ、４時間、ｒｔ；ｂ）Ｆｍｏｃ−（Ａｓｐ）−ＯＡｌｌ、ＨＢＴＵ、ＤＩＥＡ、ＤＭＦ、１２時間、９０％；ｃ）Ｚｎ、ＡｃＯＨ、ｒｔ、１２時間、８５％；ｄ）ＴｒｔＳ−ＣＨ２−ＣＯＯＨ、ＨＢＴＵ、ＤＩＥＡ、ＤＭＦ、４時間、ｒｔ、７８％；ｅ）Ｐｄ（ＰＰｈ３）４、ＮＭＡ、ＴＨＦ、１時間、ｒｔ、９０％。
Ｂ）Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミドポリスチレン樹脂上のグリコペプチドのＳＰＰＳ合成
【図面の簡単な説明】
【０３３３】
【図１】本発明に従ってグリコペプチドを製造するための合成スキームを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
（式中、
ｍは、０〜約１０であり；
ｎは、１〜約４であり；
ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して各部位で、Ｈまたはアルキルであり、またはＲａとＲｂとが一緒になって、オキソ（＝Ｏ）であり；
ｐは、１、２または３であり；
Ｘは、ＯまたはＣＨＲ３であり；
各Ｒ３は、独立して各部位で、水素、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、ヒドロキシまたはヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり、任意のヒドロキシまたはヒドロキシアルキルは、単糖類、二糖類、オリゴ糖またはヒドロキシ保護基でＯ置換されていてよく；ただし、１個のＲ３は、−ＯＣ（＝Ｏ）（ＣＨ（ＲＳ））ｎＳＨまたは−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ（Ｒｓ））ｎＳＨ（式中、Ｒｓは、独立して各部位で、水素または（Ｃ１−Ｃ６）アルキル（（Ｃ１−Ｃ６）アルキルの任意の炭素原子は、Ｊで置換されていてよい）であり、ｓは１〜約６である）を含み；
Ｙは、Ｃ（Ｒ４Ｒ５）、Ｏ、ＮＨまたはＳであり；
Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたはＪであり；
ＸおよびＹを有する炭素原子は、ＲまたはＳ配置であり；
各ＮＲは、独立して、ＮＨまたはＮ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり、またはＮＲは、ＮＲを有する炭素原子に結合するＲｃまたはＲｅと一緒になって、４〜７員環を形成することができ、または、
各Ｒｃ、Ｒｃ’、ＲｅおよびＲｅ’は、独立して各部位で、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキルまたはヘテロシクリル、あるいはブロックされていなくても保護基でブロックされていてもよい天然のアミノ酸の側鎖であり；あるいはＲｃおよびＲｃ’またはＲｅおよびＲｅ’、あるいは両方が、これらが結合する炭素原子と一緒になって、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；任意のアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキルまたはヘテロシクリルは、０〜３個のＪで置換され；
Ｊは、ハロゲン、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、（Ｃ１−６）アルキル、（Ｃ１−６）アルコキシ、シクロアルキル、カルボキシ；アセタミド、ヒドロキシ、ヒドロキシ（Ｃ１−６）アルキル、トリフルオロメトキシ、スルファモイル、カルバモイル、スルホンアミド、アルキルスルホニルまたはアリールスルホニルであり；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ペプチド残基またはグリコペプチド残基である）の化合物、およびその任意の立体異性体、互変異性体、溶媒和物、水和物、または塩を製造する方法であって、
式（ＩＩ）：
【化２】
の化合物を、式（ＩＩＩ）：
【化３】
（式中、Ｒｄは、アルキル、アリール、アラルキル、カルボキシアルキルまたはカルボサアミドアルキルである）の化合物と接触させ、式（Ｉ）の化合物を得ることを含む方法。
【請求項２】
ＲｓはＨであり、ｓは１である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｐは、１または２であり、ＷはＯである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ｐは、１または２であり、ＷはＮＨである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ｎは１であり、ＹはＯであり、ＲａはＨまたはメチルであり、ＲｂはＨである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＹはＮＨであり、（ＣＲａＲｂ）ｎは、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−または−（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）−である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
Ｒｄは、メチル、フェニルまたは−（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ｍは、１、２、３、４、５または６である請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ＸおよびＹを有する炭素原子が、Ｒ配置である請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＸおよびＹを有する炭素原子が、Ｓ配置である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
Ｒ２は、フェニルアラニンアミドである請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
Ｒ１は、Ｎ−アセチル−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号：１）である請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
式（ＩＩ）の化合物のＮ末端アミノ酸残基のＲｅおよびＲｅ’が、両方Ｈである請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ＸがＯである請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ＸがＣＨＯＨである請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記接触が、水溶液中で接触することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記接触が、アルカリ水溶液中で接触することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記接触が、グアニジンを含むアルカリ水溶液中で接触することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記接触が、チオールを含むアルカリ水溶液中で接触することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記接触が、チオフェノールを含むアルカリ水溶液中で接触することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記接触を、約３５℃〜約４０℃で行う請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
式（ＩＩＩ）の化合物の濃度が、約５ｍＭ〜約２０ｍＭである請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
式（ＩＩＩ）の化合物の濃度が、約７．５ｍＭ〜約１５ｍＭである請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
式（ＩＩ）の化合物および式（ＩＩＩ）の化合物を、約０．８〜約１．２のモル比で使用する請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
式（Ｉ）の化合物を、少なくとも約７０モル％の収率で得る請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
式（Ｉ）の化合物を、約９０％を超える純度で得る請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記接触を、約６時間〜約２４時間の間で行う請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記接触を、約６時間〜約１８時間の間で行う請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
さらに、式（Ｉ）の化合物をＨＰＬＣにより精製することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
さらに、式（Ｉ）（式中、Ｗは、ＯまたはＮＨである）の化合物を、触媒の存在下、水素源と接触させることによって、該化合物を脱硫することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記水素源が水素ガスである請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記触媒が、パラジウム族の金属である請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記触媒が、パラジウム金属である請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記水素源が、ホウ化水素塩である請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記水素源が、ホウ化水素ナトリウムである請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記触媒が、ラネーニッケルである請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
前記接触が、水溶液中で接触させることを含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
前記接触が、グアニジンを含む水溶液中で接触させることを含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３９】
さらに、式（Ｉ）（式中、ＷはＯである）の化合物を、ヒドラジンまたはアルカリ溶液と接触させることによって、該化合物を脱硫させることを含む請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
請求項１の方法で製造された式（Ｉ）の化合物。
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
（式中、
ｍは、０〜約１０であり；
ｎは、１〜約４であり；
ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して各部位で、Ｈまたはアルキルであり、またはＲａとＲｂとが一緒になって、オキソ（＝Ｏ）であり；
ｐは、１、２または３であり；
Ｘは、ＯまたはＣＨＲ３であり；
各Ｒ３は、独立して各部位で、水素、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、ヒドロキシまたはヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり、任意のヒドロキシまたはヒドロキシアルキルは、単糖類、二糖類、オリゴ糖またはヒドロキシ保護基でＯ置換されていてよく；ただし、１個のＲ３は、−ＯＣ（＝Ｏ）（ＣＨ（ＲＳ））ｎＳＨまたは−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ（Ｒｓ））ｎＳＨ（式中、Ｒｓは、独立して各部位で、水素または（Ｃ１−Ｃ６）アルキル（（Ｃ１−Ｃ６）アルキルの任意の炭素原子は、Ｊで置換されていてよい）であり、ｓは１〜約６である）を含み；
Ｙは、Ｃ（Ｒ４Ｒ５）、Ｏ、ＮＨまたはＳであり；
Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたはＪであり；
ＸおよびＹを有する炭素原子は、ＲまたはＳ配置であり；
各ＮＲは、独立して、ＮＨまたはＮ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり、またはＮＲは、ＮＲを有する炭素原子に結合するＲｃまたはＲｅと一緒になって、４〜７員環を形成することができ、または、
各Ｒｃ、Ｒｃ’、ＲｅおよびＲｅ’は、独立して各部位で、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキルまたはヘテロシクリル、あるいはブロックされていなくても保護基でブロックされていてもよい天然のアミノ酸の側鎖であり；あるいはＲｃおよびＲｃ’またはＲｅおよびＲｅ’、あるいは両方が、これらが結合する炭素原子と一緒になって、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；任意のアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキルまたはヘテロシクリルは、０〜３個のＪで置換され；
Ｊは、ハロゲン、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、（Ｃ１−６）アルキル、（Ｃ１−６）アルコキシ、シクロアルキル、カルボキシ；アセタミド、ヒドロキシ、ヒドロキシ（Ｃ１−６）アルキル、トリフルオロメトキシ、スルファモイル、カルバモイル、スルホンアミド、アルキルスルホニルまたはアリールスルホニルであり；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ペプチド残基またはグリコペプチド残基である）の化合物、およびその任意の立体異性体、互変異性体、溶媒和物、水和物、または塩を製造する方法であって、
式（ＩＩ）：
【化２】
の化合物を、式（ＩＩＩ）：
【化３】
（式中、Ｒｄは、アルキル、アリール、アラルキル、カルボキシアルキルまたはカルボサアミドアルキルである）の化合物と接触させ、式（Ｉ）の化合物を得ることを含む方法。
【請求項２】
ＲｓはＨであり、ｓは１である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｐは、１または２であり、ＷはＯである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ｐは、１または２であり、ＷはＮＨである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ｎは１であり、ＹはＯであり、ＲａはＨまたはメチルであり、ＲｂはＨである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＹはＮＨであり、（ＣＲａＲｂ）ｎは、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−または−（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）−である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
Ｒｄは、メチル、フェニルまたは−（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ｍは、１、２、３、４、５または６である請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ＸおよびＹを有する炭素原子が、Ｒ配置である請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＸおよびＹを有する炭素原子が、Ｓ配置である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
Ｒ２は、フェニルアラニンアミドである請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
Ｒ１は、Ｎ−アセチル−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号：１）である請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
式（ＩＩ）の化合物のＮ末端アミノ酸残基のＲｅおよびＲｅ’が、両方Ｈである請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ＸがＯである請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ＸがＣＨＯＨである請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記接触が、水溶液中で接触することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記接触が、アルカリ水溶液中で接触することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記接触が、グアニジンを含むアルカリ水溶液中で接触することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記接触が、チオールを含むアルカリ水溶液中で接触することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記接触が、チオフェノールを含むアルカリ水溶液中で接触することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記接触を、約３５℃〜約４０℃で行う請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
式（ＩＩＩ）の化合物の濃度が、約５ｍＭ〜約２０ｍＭである請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
式（ＩＩＩ）の化合物の濃度が、約７．５ｍＭ〜約１５ｍＭである請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
式（ＩＩ）の化合物および式（ＩＩＩ）の化合物を、約０．８〜約１．２のモル比で使用する請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
式（Ｉ）の化合物を、少なくとも約７０モル％の収率で得る請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
式（Ｉ）の化合物を、約９０％を超える純度で得る請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記接触を、約６時間〜約２４時間の間で行う請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記接触を、約６時間〜約１８時間の間で行う請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
さらに、式（Ｉ）の化合物をＨＰＬＣにより精製することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
さらに、式（Ｉ）（式中、Ｗは、ＯまたはＮＨである）の化合物を、触媒の存在下、水素源と接触させることによって、該化合物を脱硫することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記水素源が水素ガスである請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記触媒が、パラジウム族の金属である請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記触媒が、パラジウム金属である請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記水素源が、ホウ化水素塩である請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記水素源が、ホウ化水素ナトリウムである請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記触媒が、ラネーニッケルである請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
前記接触が、水溶液中で接触させることを含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
前記接触が、グアニジンを含む水溶液中で接触させることを含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３９】
さらに、式（Ｉ）（式中、ＷはＯである）の化合物を、ヒドラジンまたはアルカリ溶液と接触させることによって、該化合物を脱硫させることを含む請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
請求項１の方法で製造された式（Ｉ）の化合物。
【図１】
【公表番号】特表２００９−５３３３２８（Ｐ２００９−５３３３２８Ａ）
【公表日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５０１５６１（Ｐ２００９−５０１５６１）
【出願日】平成１９年３月２２日（２００７．３．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００７１４２
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１１１９５２
【国際公開日】平成１９年１０月４日（２００７．１０．４）
【出願人】（５９３０５２７８５）ザ スクリップス リサーチ インスティテュート (91)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月２２日（２００７．３．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００７１４２
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１１１９５２
【国際公開日】平成１９年１０月４日（２００７．１０．４）
【出願人】（５９３０５２７８５）ザ スクリップス リサーチ インスティテュート (91)
【Ｆターム（参考）】
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