グルコース検知における使用のための蛍光色素
ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡを含む新規クラスの化合物及びそれらを作製する方法が本明細書中で開示される。ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡを含む上記クラスの化合物は、検体検出用の蛍光色素として有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
検体検出における使用のための新規蛍光色素が開示される。
【０００２】
［関連出願］
本出願は、２００６年７月２５日に出願された米国仮出願第６０／８３３，０８１号（これは、その全体が参照により本明細書に援用される）の利益を主張する。
【背景技術】
【０００３】
８−ヒドロキシピレン−１，３，６−トリスルホン酸（ＨＰＴＳ）及びその誘導体を含む蛍光色素は既知であり、検体検出で使用されている。例えば、米国特許第６，６５３，１４１号、同第６，６２７，１７７号、同第５，５１２，２４６号、同第５，１３７，８３３号、同第６，８００，４５１号、同第６，７９４，１９５号、同第６，８０４，５４４号、同第６，００２，９５４号、同第６，３１９，５４０号、同第６，７６６，１８３号、同第５，５０３，７７０号及び同第５，７６３，２３８号、並びに同時係属米国特許出願第１０／４５６，８９５号及び同第１１／２９６，８９８号（これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される）を参照されたい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
以下の一般構造を有する蛍光色素が、本発明の実施の形態により開示される：
【０００５】
【化１】
【０００６】
（式中、
Ｒ２は、
【０００７】
【化２】
【０００８】
であり、
Ｒ３は、−（ＣＨ２）ｎ−Ａ−Ｍ＋
（式中、ｎは、１〜４であり、
Ａ−は、ＳＯ３−、ＨＰＯ３−、ＣＯ２−及び
【０００９】
【化３】
【００１０】
から成る群から選択される陰イオン基であり、
Ｍ＋は、Ｈ＋、アルカリ金属イオン、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋、Ｆｒ＋、オニウムイオン及びＮＲ４＋（式中、Ｒは、アルキル、アルキルアリール及び芳香族基から成る群から選択される）から成る群から選択される陽イオン基である）であり、
Ｒ４は、
【００１１】
【化４】
【００１２】
であり、
Ｒ５は、Ｙ−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ６及び
【００１３】
【化５】
【００１４】
（式中、ｎは、１〜１０に等しく、ｎ’は、２〜４に等しく、Ｙは、ＮＨ及びＯから成る群から選択される）から成る群から選択され、
Ｒ６は、ＮＨＲ７、ＯＲ７及びＣＯ２Ｈから成る群から選択され、
Ｒ７は、Ｈ、又はメタクリロイル、アクリロイル、スチリル、アクリルアミド及びメタクリルアミドから成る群から選択されるエチレン性不飽和基である）。
【００１５】
以下の一般構造を有する蛍光色素が、本発明の好ましい実施の形態により開示される：
【００１６】
【化６】
【００１７】
（式中、
Ｒ３は、−（ＣＨ２）ｎ−Ａ−Ｍ＋
（式中、ｎは、１〜４であり、
Ａ−は、ＳＯ３−、ＨＰＯ３−、ＣＯ２−及び
【００１８】
【化７】
【００１９】
から成る群から選択される陰イオン基であり、
Ｍ＋は、Ｈ＋、アルカリ金属イオン、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋、Ｆｒ＋、オニウムイオン及びＮＲ４＋（式中、Ｒは、アルキル、アルキルアリール及び芳香族基から成る群から選択される）から成る群から選択される陽イオン基である）であり、
Ｒ８は、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ９及び
【００２０】
【化８】
【００２１】
（式中、ｎは、１〜１０に等しく、ｎ’は、２〜４に等しい）から成る群から選択され、
Ｒ９は、ＮＨＲ１０、ＯＲ１０及びＣＯ２Ｈから成る群から選択され、
Ｒ１０は、Ｈ、又はメタクリロイル、アクリロイル、スチリル、アクリルアミド及びメタクリルアミドから成る群から選択されるエチレン性不飽和基である）。
【００２２】
以下の構造を有するＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡ（又はＨＰＴＳ−ＴｒｉＣｙｓ−ＭＡ）と称される蛍光色素が、本発明の好ましい実施の形態により開示される。
【００２３】
【化９】
【００２４】
本明細書中に開示される色素（例えば、ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡ）及び３，３’−ｏＢＢＶのようなボロン酸を含む消光剤を含むグルコースセンサが、本発明の別の実施の形態により開示される。
【００２５】
ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡが属する一般クラスの化合物を作製する第１の方法が、本発明の別の実施の形態により開示される。上記方法は下記工程を含む：
【００２６】
【化１０】
【００２７】
（式中、
Ｒ２は、
【００２８】
【化１１】
【００２９】
であり、
Ｒ３は、−（ＣＨ２）ｎ−Ａ−Ｍ＋
（式中、ｎは、１〜４であり、
Ａ−は、ＳＯ３−、ＨＰＯ３−、ＣＯ２−及び
【００３０】
【化１２】
【００３１】
から成る群から選択される陰イオン基であり、
Ｍ＋は、Ｈ＋、アルカリ金属イオン、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋、Ｆｒ＋、オニウムイオン及びＮＲ４＋（式中、Ｒは、アルキル、アルキルアリール及び芳香族基から成る群から選択される）から成る群から選択される陽イオン基である）であり、
Ｒ４は、
【００３２】
【化１３】
【００３３】
であり、
Ｒ５は、Ｙ−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ６及び
【００３４】
【化１４】
【００３５】
（式中、ｎは、１〜１０に等しく、ｎ’は、２〜４に等しく、Ｙは、ＮＨ及びＯから成る群から選択される）から成る群から選択され、
Ｒ６は、ＮＨＲ７、ＯＲ７及びＣＯ２Ｈから成る群から選択され、
Ｒ７は、Ｈ、又はメタクリロイル、アクリロイル、スチリル、アクリルアミド及びメタクリルアミドから成る群から選択されるエチレン性不飽和基であり、
Ｚは、フタルイミド、Ｂｏｃ及びＦｍｏｃから成る群から選択されるアミノ保護基である）。
【００３６】
ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡが属する一般クラスの化合物を作製する第２の方法が、本発明の別の実施の形態により開示される。上記方法は工程：
【００３７】
【化１５】
【００３８】
（式中、
Ｒ３は、−（ＣＨ２）ｎ−Ａ−Ｍ＋
（式中、ｎは、１〜４であり、
Ａ−は、ＳＯ３−、ＨＰＯ３−、ＣＯ２−及び
【００３９】
【化１６】
【００４０】
から成る群から選択される陰イオン基であり、
Ｍ＋は、Ｈ＋、アルカリ金属イオン、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋、Ｆｒ＋、オニウムイオン及びＮＲ４＋（式中、Ｒは、アルキル、アルキルアリール及び芳香族基から成る群から選択される）から成る群から選択される陽イオン基である）であり、
Ｒ８は、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ９及び
【００４１】
【化１７】
【００４２】
（式中、ｎは、１〜１０に等しく、ｎ’は、２〜４に等しい）から成る群から選択され、
Ｒ９は、ＮＨＲ１０、ＯＲ１０及びＣＯ２Ｈから成る群から選択され、
Ｒ１０は、Ｈ、又はメタクリロイル、アクリロイル、スチリル、アクリルアミド及びメタクリルアミドから成る群から選択されるエチレン性不飽和基である）
を含む。
【００４３】
ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡを作製する具体的な方法が、本発明の別の実施の形態により開示される。上記方法は、ＨＰＴＳ−ＣｙｓＯＨを作製する下記の工程：
【００４４】
【化１８】
【００４５】
及びＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡを作製する下記の工程：
【００４６】
【化１９】
【００４７】
を含む。
【００４８】
ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡを作製する別の具体的な方法が、本発明の別の実施の形態により開示される。上記方法は、
ａ）ＴＢＣｙｓを作製する下記の工程：
【００４９】
【化２０】
【００５０】
ｂ）Ｐｈｔｈ酸を作製する下記の工程：
【００５１】
【化２１】
【００５２】
ｃ）Ｐｈｔｈ ＭＡを作製する下記の工程：
【００５３】
【化２２】
【００５４】
ｄ）アミノＣｙｓＭＡを作製する下記の工程：
【００５５】
【化２３】
【００５６】
及びｅ）ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡを作製する下記の工程：
【００５７】
【化２４】
【００５８】
を含む。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】溶液中のＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡ／３，３’−ｏＢＢＶのＳｔｅｒｎ―Ｖｏｌｍｅｒ消光の図である。３，３’−ｏＢＢＶの添加時の相対発光変化（Ｓｔｅｒｎ―Ｖｏｌｍｅｒ曲線）を示し、３，３’−ｏＢＢＶによるＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡの消光を示す。
【図２】溶液中のＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡ／３，３’−ｏＢＢＶのグルコース応答の図である。ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡ及び３，３’−ｏＢＢＶへのグルコースの添加後に測定される蛍光発光を示す。
【図３】ヒドロゲル中のＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡの蛍光スペクトルの図である。ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡを含むポリマーヒドロゲルの蛍光励起スペクトル及び発光スペクトルを示す。
【図４】種々のｐＨでのヒドロゲル中のＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡの時間励振(Time Drive)（Ｅｍ＝５３２ｎｍ）の図である。種々のｐＨでのヒドロゲル中のＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡの時間励振を示す。
【図５】２つの異なる励起でのＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡのｐＨプロフィール（Ｅｍ＝５３２ｎｍ）の図である。２つの異なる励起波長でのＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡのｐＨプロフィールを示す。
【図６】ヒドロゲル中のＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡ／３，３’−ｏＢＢＶのグルコース応答の図である。ヒドロゲル中のＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡ／３，３’−ｏＢＢＶのグルコース応答を示す。
【図７】ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡ及びＨＰＴＳ−ＬｙｓＭＡの蛍光スペクトルの図である。ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡ及びＨＰＴＳ−ＬｙｓＭＡの蛍光スペクトルの比較を示す。（１×１０−５Ｍ）、Ｅｘスリット ８ｎｍ、Ｅｍスリット １２ｎｍ。
【図８】３，３’−ｏＢＢＶによるＨＰＴＳ−ＬｙｓＭＡ及びＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡを使用したＳｔｅｒｎ―Ｖｏｌｍｅｒ消光の比較（［色素］＝１×１０−５Ｍ）の図である。ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡ及びＨＰＴＳ−ＬｙｓＭＡを使用した３，３’−ｏＢＢＶのＳｔｅｒｎ―Ｖｏｌｍｅｒ消光研究の比較を示す。
【図９】３，３’−ｏＢＢＶによるＨＰＴＳ−ＬｙｓＭＡ及びＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡを使用したグルコース調節の比較（［色素］＝１×１０−５Ｍ、Ｑ／Ｄ＝１５０）の図である。３，３’−ｏＢＢＶによるＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡ及びＨＰＴＳ−ＬｙｓＭＡを使用したグルコース調節の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
蛍光色素
本発明の蛍光色素は、８−ヒドロキシピレン−１，３，６−トリスルホネート（ＨＰＴＳ）の誘導体である。対イオンは、Ｈ＋又は任意の他の陽イオンであり得る。ＨＰＴＳは、およそ４０５ｎｍ及びおよそ４５０ｎｍで２つの励起波長を示し、これらはそれぞれ、酸及びその共役塩基の吸収波長に相当する。励起波長の変化は、ＨＰＴＳ上の水酸基のｐＨ依存的イオン化に起因する。ｐＨが増大するにつれ、ＨＰＴＳは、約４５０ｎｍでの吸光度の増加、及び約４２０ｎｍ以下での吸光度の減少を示す。吸収極大のｐＨ依存的シフトは、生理学的範囲における二重励起レシオメトリック検出を可能にする。色素は、３，３’−ｏＢＢＶのようなボロン酸を含む消光剤とともに使用され得る。
【００６１】
本発明の好ましい実施形態による色素の一般構造は：
【００６２】
【化２５】
【００６３】
（式中、
Ｒ２は、
【００６４】
【化２６】
【００６５】
であり、
Ｒ３は、−（ＣＨ２）ｎ−Ａ−Ｍ＋
（式中、ｎは、１〜４であり、
Ａ−は、ＳＯ３−、ＨＰＯ３−、ＣＯ２−及び
【００６６】
【化２７】
【００６７】
から成る群から選択される陰イオン基であり、
Ｍ＋は、Ｈ＋、アルカリ金属イオン、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋、Ｆｒ＋、オニウムイオン及びＮＲ４＋（式中、Ｒは、アルキル、アルキルアリール及び芳香族基から成る群から選択される）から成る群から選択される陽イオン基である）であり、
Ｒ４は、
【００６８】
【化２８】
【００６９】
であり、
Ｒ５は、Ｙ−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ６及び
【００７０】
【化２９】
【００７１】
（式中、ｎは、１〜１０に等しく、ｎ’は、２〜４に等しく、Ｙは、ＮＨ及びＯから成る群から選択される）から成る群から選択され、
Ｒ６は、ＮＨＲ７、ＯＲ７及びＣＯ２Ｈから成る群から選択され、
Ｒ７は、Ｈ、又はメタクリロイル、アクリロイル、スチリル、アクリルアミド及びメタクリルアミドから成る群から選択されるエチレン性不飽和基である）である。
【００７２】
本発明の好ましい実施形態による色素の一般構造は：
【００７３】
【化３０】
【００７４】
（式中、
Ｒ３は、−（ＣＨ２）ｎ−Ａ−Ｍ＋
（式中、ｎは、１〜４であり、
Ａ−は、ＳＯ３−、ＨＰＯ３−、ＣＯ２−及び
【００７５】
【化３１】
【００７６】
から成る群から選択される陰イオン基であり、
Ｍ＋は、Ｈ＋、アルカリ金属イオン、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋、Ｆｒ＋、オニウムイオン及びＮＲ４＋（式中、Ｒは、アルキル、アルキルアリール及び芳香族基から成る群から選択される）から成る群から選択される陽イオン基である）であり、
Ｒ４は、
【００７７】
【化３２】
【００７８】
であり、
Ｒ８は、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ９及び
【００７９】
【化３３】
【００８０】
（式中、ｎは、１〜１０に等しく、ｎ’は、２〜４に等しい）から成る群から選択され、
Ｒ９は、ＮＨＲ１０、ＯＲ１０及びＣＯ２Ｈから成る群から選択され、
Ｒ１０は、Ｈ、又はメタクリロイル、アクリロイル、スチリル、アクリルアミド及びメタクリルアミドから成る群から選択されるエチレン性不飽和基である）である。
【００８１】
ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡの構造は下記の通りである：
【００８２】
【化３４】
【００８３】
上記一般構造で示されるように、ＨＰＴＳコア上のＣｙｓ−ＭＡ以外の置換は、置換が負に帯電しており、且つ重合可能な基を有する限りは本発明の態様に調和する。例えば、システイン酸のＬ立体異性体又はＤ立体異性体のいずれかを使用してもよい。幾つかの実施形態では、スルホン酸のほんの１つ又は２つが置換されてもよい。同様に、上記で示されるＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡの変形において、ＮＢｕ４＋のほかに、正に帯電された金属（例えば、Ｎａ＋）を含む他の対イオンを使用してもよい。他の変形では、スルホン酸基が、例えばリン酸基、カルボン酸基等の官能基で置き換えられてもよい。
【００８４】
比較のために、ＨＰＴＳ−ＬｙｓＭＡの構造を下記の通りに以下で描写する：
【００８５】
【化３５】
【００８６】
ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡが属する一般クラスの化合物を作製する第１の方法
ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡが属する一般クラスの化合物を作製する第１の方法は、本発明の別の実施形態により開示される。上記方法は下記工程を含む：
【００８７】
【化３６】
【００８８】
（式中、
Ｒ２は、
【００８９】
【化３７】
【００９０】
であり、
Ｒ３は、−（ＣＨ２）ｎ−Ａ−Ｍ＋
（式中、ｎは、１〜４であり、
Ａ−は、ＳＯ３−、ＨＰＯ３−、ＣＯ２−及び
【００９１】
【化３８】
【００９２】
から成る群から選択される陰イオン基であり、
Ｍ＋は、Ｈ＋、アルカリ金属イオン、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋、Ｆｒ＋、オニウムイオン及びＮＲ４＋（式中、Ｒは、アルキル、アルキルアリール及び芳香族基から成る群から選択される）から成る群から選択される陽イオン基である）であり、
Ｒ４は、
【００９３】
【化３９】
【００９４】
であり、
Ｒ５は、Ｙ−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ６及び
【００９５】
【化４０】
【００９６】
（式中、ｎは、１〜１０に等しく、ｎ’は、２〜４に等しく、Ｙは、ＮＨ及びＯから成る群から選択される）から成る群から選択され、
Ｒ６は、ＮＨＲ７、ＯＲ７及びＣＯ２Ｈから成る群から選択され、
Ｒ７は、Ｈ、又はメタクリロイル、アクリロイル、スチリル、アクリルアミド及びメタクリルアミドから成る群から選択されるエチレン性不飽和基であり、
Ｚは、フタルイミド、Ｂｏｃ及びＦｍｏｃから成る群から選択されるアミノ保護基である）。
ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡが属する一般クラスの化合物を作製する第２の方法
ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡが属する一般クラスの化合物を作製する第２の方法は、本発明の別の実施形態により開示される。上記方法は工程：
【００９７】
【化４１】
【００９８】
（式中、
Ｒ３は、−（ＣＨ２）ｎ−Ａ−Ｍ＋
（式中、ｎは、１〜４であり、
Ａ−は、ＳＯ３−、ＨＰＯ３−、ＣＯ２−及び
【００９９】
【化４２】
【０１００】
から成る群から選択される陰イオン基であり、
Ｍ＋は、Ｈ＋、アルカリ金属イオン、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋、Ｆｒ＋、オニウムイオン及びＮＲ４＋（式中、Ｒは、アルキル、アルキルアリール及び芳香族基から成る群から選択される）から成る群から選択される陽イオン基である）であり、
Ｒ８は、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ９及び
【０１０１】
【化４３】
【０１０２】
（式中、ｎは、１〜１０に等しく、ｎ’は、２〜４に等しい）から成る群から選択され、
Ｒ９は、ＮＨＲ１０、ＯＲ１０及びＣＯ２Ｈから成る群から選択され、
Ｒ１０は、Ｈ、又はメタクリロイル、アクリロイル、スチリル、アクリルアミド及びメタクリルアミドから成る群から選択されるエチレン性不飽和基である）
を含む。
ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡを合成する第１の特定の方法
システイン酸１（０．５ｍｍｏｌ、９４ｍｇ、この合成ではＬ立体異性体を使用したが、Ｄ立体異性体もまた使用され得る）を、室温で水酸化テトラブチルアンモニウムの水溶液（０．５ｍｍｏｌ、０．１２５Ｍ溶液 ４ｍＬ）で処理した（スキーム１）。３０分間攪拌した後、溶液を凍結乾燥させて、２を得て、残渣をジクロロメタン（２ｍＬ）中に溶解させた。トリエチルアミン（０．６ｍｍｏｌ、６１ｍｇ）を添加した後、ジクロロメタン（２ｍＬ）中のＨＰＴＳ−Ｃｌ（０．１ｍｍｏｌ、５２ｍｇ）を滴下した。混合物を室温で１８時間攪拌し、続いて真空中で濃縮した。残渣を熱イソプロピルアルコール中に溶解させて、Ｂｉｏｔａｇｅ ＳＰ１ ２５Ｍシリカゲルカートリッジにかけて、ＮＨ４ＯＨ：イソプロピルアルコール（１：３）で溶出させて、黄色粉末としてＨＰＴＳ−ＣｙｓＯＨを得た（０．０２４ｍｍｏｌ、３９ｍｇ、２４％）。１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、５００ ＭＨｚ）d０．８５（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、３６Ｈ）、１．２０（ｓ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２４Ｈ）１．４４（ｍ、２４Ｈ）、２．９４（ｍ、２４Ｈ）、３．２４（ｍ、６Ｈ）、４．３１（ｍ、３Ｈ）、８．１９（ｄ、Ｊ＝１６．８Ｈｚ、２Ｈ）、８．３６（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．５０（ｄ、Ｊ＝９．３Ｈｚ、１Ｈ）、８．６４（ｄ、Ｊ＝９．３Ｈｚ、１Ｈ）、８．７１（ｄ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、１Ｈ）、８．９０（ｍ、４Ｈ）、９．１９（ｄ、Ｊ＝１２．０Ｈｚ、２Ｈ）。
スキーム１
【０１０３】
【化４４】
【０１０４】
ＨＰＴＳ−ＣｙｓＯＨ（０．０１８３ｍｍｏｌ、３０ｍｇ）のＤＭＦ（１ｍＬ）溶液に、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（０．０５５ｍｍｏｌ、１０．５ｍｇ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）（０．０５５ｍｍｏｌ、７．４ｍｇ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）（０．０５５ｍｍｏｌ、２１ｍｇ）及びＮ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（０．１８３ｍｍｏｌ、２４ｍｇ）を添加した。溶液を室温で２０分間攪拌した後、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩を添加して、混合物を４８時間攪拌した。反応混合物をアセトン：エーテル（５：１、１０ｍＬ）中で沈殿させて、油状残渣を得た。残渣をアセトン（１０ｍＬ）で粉砕して、３０分間超音波処理して、粗製混合物としてＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡを得た（橙色粉末 ３５ｍｇ）。
スキーム２
【０１０５】
【化４５】
【０１０６】
ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡを合成する第２の特定の方法
工程１：ＴＢＣｙｓの合成：
【０１０７】
【化４６】
【０１０８】
磁気攪拌棒を備えた５００ｍＬのビーカー中で、（Ｌ）−システイン酸（１２９．２４ｍｍｏｌ、２４．１９１３ｇ）をＨ２Ｏ（１００ｍＬ）中に溶解させて、水酸化テトラブチルアンモニウム（１２９．２４ｍｍｏｌ、１２９．２４ｍＬ、１．０Ｍ水溶液 １２８．５９ｇ）で処理した。混合物を室温で３０分間攪拌した後、低温（ドライアイス／２−プロパノール）浴を使用して凍結させた。固体を３日間かけて凍結乾燥させて、ガラス状物質を得て、これをＣＨ２Ｃｌ２（３００ｍＬ）中に再溶解させた。溶液を５００ｍＬのフラスコ中で乾固するまで蒸発させて、白色泡状物質としてＴＢＣｙｓを得た。収量：５３．３７５６ｇ、１２９ｍｍｏｌ、１００％。
【０１０９】
工程２：Ｐｈｔｈ酸の合成：
【０１１０】
【化４７】
【０１１１】
磁気攪拌棒を備えた５００ｍＬのフラスコ中で、ＴＢＣｙｓ（１２９ｍｍｏｌ、５３．１９３６ｇ）をＣＨＣｌ３（１２９ｍＬ）中に溶解させて、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン（６５ｍｍｏｌ、８．３８５ｇ、１１．３ｍＬ）を添加した後、無水フタル酸（１２９ｍｍｏｌ、１９．１０７４８ｇ）及び４オングストロームのモレキュラーシーブ（５０ｍＬ）を添加して、混合物を４８時間還流させた。混合物を６００ｍＬのガラス漏斗に通して濾過して、濾液を真空中で濃縮して、ジエチルエーテル（２×１００ｍＬ）で洗浄して、減圧下で乾燥させて、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミンと複合体形成したＰｈｔｈ酸を得た。収量：７０ｇ、１２９ｍｍｏｌ、１００％。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ）d０．９５（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、１２Ｈ）、１．３０（ｍ、８Ｈ）、１．３８（ｑ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、８Ｈ）、１．６１（ｍ、８Ｈ）、２．９６（ｑ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、１Ｈ）、３．２３（ｍ、８Ｈ）、３．５５（ｓｅｐｔ、Ｊ＝６．７、１Ｈ）、３．６２（ｍ、１Ｈ）、３．８６（ｄｄ、Ｊ１＝５Ｈｚ、Ｊ２＝９．４Ｈｚ、１Ｈ）、５．３１（ｄｄ、Ｊ１＝５．４Ｈｚ、Ｊ２＝１．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．６５（ｑ、Ｊ＝３Ｈｚ、２Ｈ）、７．５５（ｑ、Ｊ＝３Ｈｚ、２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１２５ＭＨｚ）d１２．０、１３．８、１８．１、１９．８、２４．０、４１．７、５０．４、５１．０、５３．１、５８．７、１２３．０、１３２．８、１３３．５２、１６７．９、１７０．７；ＨＰＬＣ ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣ−８−ＤＢ、５μｍ、１５０ｍｍ×４．６ｍｍ、λ＝２５４ｎｍ、ＭｅＯＨ／ＴＢＡＰを用いた勾配溶出（３０〜７０％ＭｅＯＨ）、Ｒｔ＝５．９分。
【０１１２】
工程３：Ｐｈｔｈ ＭＡの合成：
【０１１３】
【化４８】
【０１１４】
磁気攪拌棒を備えた２５０ｍＬの丸底フラスコ中で、Ｐｈｔｈ酸（２４．９ｍｍｏｌ、１３．４６ｇ）を０℃でＣＨ２Ｃｌ２（８５ｍＬ）中に溶解させて、ＥＤＣ（２７ｍｍｏｌ、５．１５７ｇ）、ＨＯＢＴ（２７ｍｍｏｌ、３．６４５ｇ）及びトリエチルアミン（５４ｍｍｏｌ、５．４ｇ、７．５ｍＬ）を順次添加して、混合物を窒素下で２０分間攪拌した。Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（２７ｍｍｏｌ、４．８０６ｇ）を添加して、混合物を２時間かけて室温に到達させた後、室温でさらに１４時間攪拌した。溶液を飽和ＮａＨＣＯ３（１００ｍＬ）で処理して、ＣＨ２Ｃｌ２（３×２０ｍＬ）で抽出した。ＣＨ２Ｃｌ２層をＭｇＳＯ４で乾燥させて、真空中で濃縮して、橙色油状物質を得て、これをＢｉｏｔａｇｅ ＫＰ−ｓｉｌ ４０Ｍカートリッジにかけた。この物質は、５％〜１５％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を用いた勾配溶出によって精製した。生成物は白色泡状物質として単離された（収率７２％）。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ）d０．９９（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、１２Ｈ）、１．４４（ｓｅｘｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、８Ｈ）、１．６６（ｍ、１０Ｈ）、１．８９（ｓ、３Ｈ）、３．２８（ｍ、１１Ｈ）、３．３８（ｓｅｘｔ、２Ｈ）、３．９６（ｄｄ、Ｊ１＝９Ｈｚ、Ｊ２＝５．９Ｈｚ、１Ｈ）、５．２２（ｔ、Ｊ＝１．４Ｈｚ、１Ｈ）、５．４４（ｄｄ、Ｊ１＝１．９Ｈｚ、Ｊ２＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）、５．６９（ｓ、１Ｈ）、５．９１（ｔ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．７０（ｍ、２Ｈ）、７．８２（ｍ、２Ｈ）、９．０９（ｔ、Ｊ＝５．８Ｈｚ、１Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１２５ＭＨｚ）d１３．８、１８．７、１９．８、２４．１、２９．１、３６．０、３６．４、５０．５、５３．２、５８．９、１１９．６、１２３．４、１３２．３、１３４．０、１４０．０、１６７．９、１６８．５、１６９．３；ＨＰＬＣ ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣ−８−ＤＢ、５μｍ、１５０ｍｍ×４．６ｍｍ、λ＝２５４ｎｍ、ＭｅＯＨ／ＴＢＡＰを用いた勾配溶出（３０〜７０％ＭｅＯＨ）、Ｒｔ＝６．６分。
【０１１５】
工程４：アミノＣｙｓＭＡの合成：
【０１１６】
【化４９】
【０１１７】
磁気攪拌棒を備えた１００ｍＬの丸底フラスコ中で、Ｐｈｔｈ ＭＡ（２．５９ｍｍｏｌ、１．７２２５ｇ）をエタノール（２０ｍＬ）中に溶解させて、ヒドラジン一水和物（２．５９ｍｍｏｌ、０．１３０ｇ、０．１２６ｍＬ）を添加して、混合物を８０℃で２時間加熱した。溶液を室温に冷却して、ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）を添加した。形成された沈殿物を、ガラス漏斗を使用して濾過して、さらにＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）で洗浄して、濾液を真空中で濃縮した。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）中に溶解させて、Ｂｉｏｔａｇｅ ＫＰ−ＮＨ ４０Ｍカートリッジにかけて、１％〜１５％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２で溶出させた。分画を収集して、真空中で濃縮して、無色油状物質としてアミノＣｙｓＭＡを得た。収率：６０％。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、５００ＭＨｚ）d１．０３（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、１２Ｈ）、１．４２（ｓｅｘｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、８Ｈ）、１．６６（ｍ、８Ｈ）、１．９５（ｓ、３Ｈ）、２．８７（ｑ、Ｊ１＝９．４Ｈｚ、Ｊ２＝４．４Ｈｚ、１Ｈ）、３．２３（ｍ、１０Ｈ）、３．８１（ｄｄ、Ｊ１＝３．３Ｈｚ、Ｊ２＝６．０Ｈｚ、１Ｈ）、５．３７（ｓ、１Ｈ）、５．７３（ｓ、１Ｈ）；ＨＰＬＣ ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣ−８−ＤＢ、５μｍ、１５０ｍｍ×４．６ｍｍ、λ＝２５４ｎｍ、ＭｅＯＨ／ＴＢＡＰを用いた勾配溶出（３０〜７０％ＭｅＯＨ）、Ｒｔ＝３．５分。
【０１１８】
工程５：ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡの合成：
【０１１９】
【化５０】
【０１２０】
５０ｍＬの丸底フラスコ中で、アミノＣｙｓＭＡ（１．０９ｍｍｏｌ、０．５８２７ｇ）をＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）中に溶解させて、ＨＰＴＳ−Ｃｌ（０．２９ｍｍｏｌ、０．１６３ｇ）を添加した。トリエチルアミン（１．１ｍｍｏｌ、０．１５３ｍＬ）を添加して、混合物を室温で１６時間攪拌した。赤色溶液を１Ｍ ＮａＯＨ（１０ｍＬ）で処理して、３０分間攪拌して、２層を分液漏斗で分離させた。橙色水層をＤｏｗｅｘ ５０Ｗ樹脂（Ｈ＋形態）のカラムに通して、ｐＨ紙で測定される場合にｐＨ＝４を有する黄色／緑色溶液を得た。次に、水溶液をＤｏｗｅｘ ５０Ｗ（Ｎａ＋形態）のカラムに通して、ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡの粗製ナトリウム塩を得た。溶液をポリスチレン−ジビニルベンゼン樹脂（２５０ｇ）上へ吸着させて、Ｈ２Ｏ（５×５００ｍＬ）で洗浄した。洗液を保存して、吸着された材料を、ＭｅＯＨ（１Ｌ）を用いて樹脂から取り出した。新鮮なＭｅＯＨ（４×５００ｍＬ）による多重同時蒸発後に、ＭｅＯＨ／水抽出物を乾固するまで蒸発させて、残渣をＭｅＯＨ（０．５ｍＬ）中に再溶解させた。アセトン（１５ｍＬ）を添加して、沈殿物を遠心分離により収集して、アルゴン気流下で乾燥させて、橙色／黄色固体としてＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡを得た。さらなる生成物を、同じＭｅＯＨ抽出手順を使用して洗液から単離した。収率：４０％。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ、ｐｐｍ）：１．１８−１．０９（ｍ、６Ｈ）、１．７６−１．５３（ｍ、９Ｈ）、２．７３−２．２３（ｍ、１２Ｈ）；ＨＰＬＣ ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣ−８−ＤＢ、５μｍ、１５０ｍｍ×４．６ｍｍ、ＦＬＤ検出器、ＭｅＯＨ／ＴＢＡＰを用いた勾配溶出（３０〜７０％ＭｅＯＨ）、Ｒｔ＝１１．６分；Ｃ４６Ｈ５８Ｎ９Ｎａ３Ｏ２２Ｓ６に関するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ［ＭＨ］＋：１３５０、［ＭＨ−Ｎａ＋Ｈ］＋：１３２８、［ＭＨ−２Ｎａ＋２Ｈ］＋：１３０６、［ＭＨ−３Ｎａ＋３Ｈ］＋：１２８４（ｍａｊｏｒ）。
消光剤
本明細書中で使用する場合、「消光剤」という用語は、その存在時に、蛍光色素（例えば、ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡ）の発光を低減する化合物を指す。
【０１２１】
幾つかの実施形態では、消光剤部分は、グルコース認識を提供する。かかる部分は好ましくは、芳香族ボロン酸を含む。より具体的には、ボロン酸は、共役窒素含有複素環式芳香族ビスオニウム構造（例えば、ビオロゲン）に共有結合され、ここでボロン酸は、水性媒体、有機媒体又は組合せ媒体中でグルコースと可逆的に或いは不可逆的に反応して、ボロン酸エステルを形成する。反応の程度は、媒体中のグルコース濃度に関連する。
【０１２２】
ビスオニウム塩は、共役複素環式芳香族二窒素化合物から調製される。共役複素環式芳香族二窒素は、例えばジピリジル、ジピリジルエチレン、ジピリジルフェニレン、フェナントロリン及びジアザフルオレンである。両方の窒素が置換され得る上記共役複素環式芳香族二窒素化合物の全ての異性体が、本発明で有用である。ボロン酸置換されたビオロゲン及びボロン酸置換されたポリビオロゲンは、同時係属米国出願第１１／６７１，８８０号（その全体が参照により本明細書に援用される）に詳述されている。
【０１２３】
他の実施形態では、ピリジニウムボロン酸消光剤は、本発明の色素と組み合わせて使用される。ピリジニウムボロン酸消光剤は、米国仮出願第６０／９１５，３７２号（その全体が参照により本明細書に援用される）に詳述されている。
【０１２４】
１つの好ましい実施形態では、３，３’−ｏＢＢＶは、消光剤部分として使用され得る。３，３’−ｏＢＢＶの構造は：
【０１２５】
【化５１】
【０１２６】
である。
色素の機能分析
ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡを、蛍光光度計を使用して溶液中で試験して、ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡをＨＰＴＳ−ＬｙｓＭＡと比較する方法を確定した。Ｓｔｅｒｎ―Ｖｏｌｍｅｒ研究及びグルコース応答研究を同一条件下で連続して実施して、直接的な比較を保証した。
溶液研究
ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡの溶液（ｐＨ ７．４ ＰＢＳ中に１×１０−５Ｍ）に、増加量の３，３’−ｏＢＢＶ（ＭｅＯＨ中に３０ｍＭ）を添加して、各添加後に蛍光発光を測定した。図１は、３，３’−ｏＢＢＶの添加時の相対発光変化（Ｓｔｅｒｎ―Ｖｏｌｍｅｒ曲線）を付与し、３，３’−ｏＢＢＶによるＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡの消光を示す。蛍光光度計設定は下記の通りであった：１％減衰、ｅｘスリット ８ｎｍ、ｅｍスリット １２ｎｍ、４８６ｎｍ ｅｘ λ、５３７ｎｍ ｅｍ λ。
【０１２７】
ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡ（１×１０−５Ｍ）及び３，３’−ｏＢＢＶ（３×１０−３Ｍ）を、ｐＨ ７．４ ＰＢＳ中のグルコースの原液（３１２５０ｍｇ／ｄＬ）で滴定して、グルコースの各添加後に蛍光発光を測定した。グルコースの添加時の相対変化は図２に付与される。
ポリマー研究
ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡ（１ｍｇ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミド（４００ｍｇ）、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（８ｍｇ）、ＨＣｌ（１Ｍ溶液 １０μＬ）及びＶＡ−０４４（１ｍｇ）を水中に溶解させて、メスフラスコ中で１ｍＬに希釈した。溶液を凍結−吸引−解凍させて(freeze-pump-thaw)（３回）、０．００５”ポリイミドスペーサーを含有する型へ注入して、５５℃で１６時間重合させた。得られたフィルムをｐＨ ７．４リン酸緩衝液中に置いて、その蛍光励起スペクトル及び発光スペクトルを得た（図３）。
【０１２８】
フィルムはフローセル構成において２つの異なる励起波長（４１８ｎｍ及び４８６ｎｍ）で様々なｐＨ（最初はｐＨ５．１にて、ｐＨ ５．７５、６．２６、６．５、６．９、７．４、８．０２に変化させて、続いてｐＨ ７．４に戻す）で試験して、１つの発光波長（５３２ｎｍ）で経時的にモニタリングした（図４）。蛍光光度計設定は下記の通りであった：ｅｘスリット ５ｎｍ、ｅｍスリット ３．５ｎｍ、５１５ｎｍ カットオフフィルタ、４１８ｎｍ ｅｘ λ、４８６ｎｍ ｅｘ λ、５３２ｎｍ ｅｍ λ。ｐＨプロフィールは図５に要約される。
【０１２９】
ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡ（２ｍｇ）、３，３’−ｏＢＢＶ（１５ｍｇ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミド（４００ｍｇ）、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（８ｍｇ）、ＨＣｌ（１Ｍ溶液 １０μＬ）及びＶＡ−０４４（１ｍｇ）を水中に溶解させて、メスフラスコ中で１ｍＬに希釈した。溶液を凍結−吸引−解凍させて（３回）、０．００５”ポリイミドスペーサーを含有する型へ注入して、５５℃で１６時間重合させた。得られたフィルムをｐＨ ７．４リン酸緩衝液中に置いて、フローセル構成において増加量のグルコース（０、５０、１００、２００、４００ｍｇ／ｄＬ）を用いて試験した。グルコースの添加時の相対蛍光変化は図６に付与される。蛍光光度計設定は下記の通りであった：ｅｘスリット ８ｎｍ、ｅｍスリット ３．５ｎｍ、５１５ｎｍ カットオフフィルタ、４８６ｎｍ ｅｘ λ、５３２ｎｍ ｅｍ λ。
比較研究
溶液中のＣｙｓＭＡ色素及びＬｙｓＭＡ色素の蛍光スペクトルの比較は図７に示される。ＣｙｓＭＡ色素は、ＬｙｓＭＡ色素に対して青色側へシフトする。
【０１３０】
溶液中のＣｙｓＭＡ及びＬｙｓＭＡに関するＳｔｅｒｎ―Ｖｏｌｍｅｒ消光研究の比較は図８に付与され、グルコース応答は図９に付与される。
【０１３１】
ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡは、ＨＰＴＳ−ＬｙｓＭＡよりも効果的に３，３’−ｏＢＢＶにより消光される。ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡは、スルホン酸のために、カルボン酸を有するＨＰＴＳ−ＬｙｓＭＡよりも強力な複合体を形成し、よりしっかりとした複合体がより大きなグルコース応答を導く。このため、スルホネート基で置換された色素が好ましい。
グルコースセンサ
１つの好ましい実施形態では、血中グルコース濃度を確定するための装置が開示される。装置は、血管内で展開用に寸法を取った光ファイバを含むセンサを備える。センサは、不水溶性ポリマーマトリックス（ここでポリマーマトリックスは、グルコースにとって透過性である）、ポリマーマトリックスに結合された本明細書中で開示されるような蛍光色素、血中グルコース濃度に関連する量のグルコースを可逆的に結合するように適応された本明細書中に開示されるような消光剤（ここで、消光剤もまた、ポリマーマトリックスに結合されて、蛍光色素と操作可能にカップリングされ、また消光剤は、結合されたグルコースの量に関連する蛍光色素により発光される光を調節するように設計される）、少なくとも１つの励起光源及び発光検出器をさらに含む。
【０１３２】
血中グルコース濃度を測定する方法もまた開示される。上記方法は、上述の装置を準備する工程、血管へセンサを挿入する工程、励起波長でセンサを照射する工程、発光波長でセンサの蛍光発光を検出する工程、及び血中グルコース濃度を測定する工程を含む。
【０１３３】
幾つかの実施形態では、移動している流れを包含しないｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用に関して、検知構成成分は、個々の（別個の）構成成分として使用される。色素及び消光剤は液体溶液中で一緒に混合されて、検体が添加されて、蛍光強度の変化が測定され、構成成分は廃棄される。浸出を防止するために検知構成成分を捕捉するのに使用することができる高分子マトリックスは存在する必要がない。任意に、検知構成成分は固定化されて、それらの使用が、移動している流れにおいて検体を測定するのを可能にする。
【０１３４】
ｉｎ ｖｉｖｏ用途に関しては、センサは、１つ又は複数のポリヒドロキシル有機化合物を含有するか、或いは上記化合物を含有する筋肉のような組織中に植え込まれている生理液、好ましくは血液の移動している流れにおいて使用される。したがって、検知部分はいずれもセンサ組立品から抜け出ないことが好ましい。したがって、ｉｎ ｖｉｖｏでの使用に関して、検知構成成分は好ましくは、有機ポリマー検知組立品の一部である。可溶性色素及び消光剤は、検体の通過を可能にするが、検知部分の通過を阻止する半透膜により閉じ込められ得る。このことは、検体分子よりも実質的に大きい可溶性検知部分（検体の分子量の少なくとも２倍、又は１０００より大きい、好ましくは５０００より大きい分子量）を使用すること、及び検知部分が定量的に保持されるように２つの間で特定の分子量カットオフを有する選択的半透膜（例えば、透析又は限外濾過膜）を用いることにより実現することができる。
【０１３５】
好ましくは、検知部分は、グルコースにとって自由に透過性である不溶性ポリマーマトリックスに固定化される。ポリマーマトリックスは、有機ポリマー、無機ポリマー又はそれらのポリマーの組合せで構成される。マトリックスは、生体適合性材料で構成されてもよい。あるいは、マトリックスは、第２の生体適合性ポリマー、及び／又は所定の検体にとって透過性である半透膜でコーティングされる。
【０１３６】
ポリマーマトリックスの機能は、検体との接触を可能とし、且つ検体をボロン酸に結合させると同時に、蛍光色素及び消光剤部分を一緒に保持及び固定化することである。この効果を達成するには、マトリックスは、媒体中では不溶性でなくてはならず、マトリックスと検体溶液との間で高表面積界面を確立することにより検体と密接に結び付かなくてはならない。例えば、超薄フィルム又は微孔質支持体マトリックスが使用される。あるいは、マトリックスは、検体溶液中で膨潤性であり、例えばヒドロゲルマトリックスが水系で使用される。場合によっては、検知ポリマーは、光導管の表面のような表面に結合されるか、或いは微孔質膜中に含浸される。全ての場合において、マトリックスは、結合部位への検体の輸送を妨害してはならず、その結果、２相間で平衡が確立され得る。超薄フィルム、微孔質ポリマー、微孔質ゾルゲル及びヒドロゲルを調製するための技法は当該技術分野で確立されている。有用なマトリックスは全て、検体透過性であるとして規定される。
【０１３７】
明瞭性及び理解の目的で本発明を幾らか詳細に記載してきたが、本発明の真の範囲を逸脱することなく、形態及び詳細において様々な変更が成され得ることは当業者に理解されよう。図、表及び付録並びに上記で参照した特許、出願及び刊行物は全て、参照により本明細書に援用される。
【技術分野】
【０００１】
検体検出における使用のための新規蛍光色素が開示される。
【０００２】
［関連出願］
本出願は、２００６年７月２５日に出願された米国仮出願第６０／８３３，０８１号（これは、その全体が参照により本明細書に援用される）の利益を主張する。
【背景技術】
【０００３】
８−ヒドロキシピレン−１，３，６−トリスルホン酸（ＨＰＴＳ）及びその誘導体を含む蛍光色素は既知であり、検体検出で使用されている。例えば、米国特許第６，６５３，１４１号、同第６，６２７，１７７号、同第５，５１２，２４６号、同第５，１３７，８３３号、同第６，８００，４５１号、同第６，７９４，１９５号、同第６，８０４，５４４号、同第６，００２，９５４号、同第６，３１９，５４０号、同第６，７６６，１８３号、同第５，５０３，７７０号及び同第５，７６３，２３８号、並びに同時係属米国特許出願第１０／４５６，８９５号及び同第１１／２９６，８９８号（これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される）を参照されたい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
以下の一般構造を有する蛍光色素が、本発明の実施の形態により開示される：
【０００５】
【化１】
【０００６】
（式中、
Ｒ２は、
【０００７】
【化２】
【０００８】
であり、
Ｒ３は、−（ＣＨ２）ｎ−Ａ−Ｍ＋
（式中、ｎは、１〜４であり、
Ａ−は、ＳＯ３−、ＨＰＯ３−、ＣＯ２−及び
【０００９】
【化３】
【００１０】
から成る群から選択される陰イオン基であり、
Ｍ＋は、Ｈ＋、アルカリ金属イオン、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋、Ｆｒ＋、オニウムイオン及びＮＲ４＋（式中、Ｒは、アルキル、アルキルアリール及び芳香族基から成る群から選択される）から成る群から選択される陽イオン基である）であり、
Ｒ４は、
【００１１】
【化４】
【００１２】
であり、
Ｒ５は、Ｙ−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ６及び
【００１３】
【化５】
【００１４】
（式中、ｎは、１〜１０に等しく、ｎ’は、２〜４に等しく、Ｙは、ＮＨ及びＯから成る群から選択される）から成る群から選択され、
Ｒ６は、ＮＨＲ７、ＯＲ７及びＣＯ２Ｈから成る群から選択され、
Ｒ７は、Ｈ、又はメタクリロイル、アクリロイル、スチリル、アクリルアミド及びメタクリルアミドから成る群から選択されるエチレン性不飽和基である）。
【００１５】
以下の一般構造を有する蛍光色素が、本発明の好ましい実施の形態により開示される：
【００１６】
【化６】
【００１７】
（式中、
Ｒ３は、−（ＣＨ２）ｎ−Ａ−Ｍ＋
（式中、ｎは、１〜４であり、
Ａ−は、ＳＯ３−、ＨＰＯ３−、ＣＯ２−及び
【００１８】
【化７】
【００１９】
から成る群から選択される陰イオン基であり、
Ｍ＋は、Ｈ＋、アルカリ金属イオン、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋、Ｆｒ＋、オニウムイオン及びＮＲ４＋（式中、Ｒは、アルキル、アルキルアリール及び芳香族基から成る群から選択される）から成る群から選択される陽イオン基である）であり、
Ｒ８は、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ９及び
【００２０】
【化８】
【００２１】
（式中、ｎは、１〜１０に等しく、ｎ’は、２〜４に等しい）から成る群から選択され、
Ｒ９は、ＮＨＲ１０、ＯＲ１０及びＣＯ２Ｈから成る群から選択され、
Ｒ１０は、Ｈ、又はメタクリロイル、アクリロイル、スチリル、アクリルアミド及びメタクリルアミドから成る群から選択されるエチレン性不飽和基である）。
【００２２】
以下の構造を有するＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡ（又はＨＰＴＳ−ＴｒｉＣｙｓ−ＭＡ）と称される蛍光色素が、本発明の好ましい実施の形態により開示される。
【００２３】
【化９】
【００２４】
本明細書中に開示される色素（例えば、ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡ）及び３，３’−ｏＢＢＶのようなボロン酸を含む消光剤を含むグルコースセンサが、本発明の別の実施の形態により開示される。
【００２５】
ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡが属する一般クラスの化合物を作製する第１の方法が、本発明の別の実施の形態により開示される。上記方法は下記工程を含む：
【００２６】
【化１０】
【００２７】
（式中、
Ｒ２は、
【００２８】
【化１１】
【００２９】
であり、
Ｒ３は、−（ＣＨ２）ｎ−Ａ−Ｍ＋
（式中、ｎは、１〜４であり、
Ａ−は、ＳＯ３−、ＨＰＯ３−、ＣＯ２−及び
【００３０】
【化１２】
【００３１】
から成る群から選択される陰イオン基であり、
Ｍ＋は、Ｈ＋、アルカリ金属イオン、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋、Ｆｒ＋、オニウムイオン及びＮＲ４＋（式中、Ｒは、アルキル、アルキルアリール及び芳香族基から成る群から選択される）から成る群から選択される陽イオン基である）であり、
Ｒ４は、
【００３２】
【化１３】
【００３３】
であり、
Ｒ５は、Ｙ−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ６及び
【００３４】
【化１４】
【００３５】
（式中、ｎは、１〜１０に等しく、ｎ’は、２〜４に等しく、Ｙは、ＮＨ及びＯから成る群から選択される）から成る群から選択され、
Ｒ６は、ＮＨＲ７、ＯＲ７及びＣＯ２Ｈから成る群から選択され、
Ｒ７は、Ｈ、又はメタクリロイル、アクリロイル、スチリル、アクリルアミド及びメタクリルアミドから成る群から選択されるエチレン性不飽和基であり、
Ｚは、フタルイミド、Ｂｏｃ及びＦｍｏｃから成る群から選択されるアミノ保護基である）。
【００３６】
ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡが属する一般クラスの化合物を作製する第２の方法が、本発明の別の実施の形態により開示される。上記方法は工程：
【００３７】
【化１５】
【００３８】
（式中、
Ｒ３は、−（ＣＨ２）ｎ−Ａ−Ｍ＋
（式中、ｎは、１〜４であり、
Ａ−は、ＳＯ３−、ＨＰＯ３−、ＣＯ２−及び
【００３９】
【化１６】
【００４０】
から成る群から選択される陰イオン基であり、
Ｍ＋は、Ｈ＋、アルカリ金属イオン、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋、Ｆｒ＋、オニウムイオン及びＮＲ４＋（式中、Ｒは、アルキル、アルキルアリール及び芳香族基から成る群から選択される）から成る群から選択される陽イオン基である）であり、
Ｒ８は、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ９及び
【００４１】
【化１７】
【００４２】
（式中、ｎは、１〜１０に等しく、ｎ’は、２〜４に等しい）から成る群から選択され、
Ｒ９は、ＮＨＲ１０、ＯＲ１０及びＣＯ２Ｈから成る群から選択され、
Ｒ１０は、Ｈ、又はメタクリロイル、アクリロイル、スチリル、アクリルアミド及びメタクリルアミドから成る群から選択されるエチレン性不飽和基である）
を含む。
【００４３】
ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡを作製する具体的な方法が、本発明の別の実施の形態により開示される。上記方法は、ＨＰＴＳ−ＣｙｓＯＨを作製する下記の工程：
【００４４】
【化１８】
【００４５】
及びＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡを作製する下記の工程：
【００４６】
【化１９】
【００４７】
を含む。
【００４８】
ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡを作製する別の具体的な方法が、本発明の別の実施の形態により開示される。上記方法は、
ａ）ＴＢＣｙｓを作製する下記の工程：
【００４９】
【化２０】
【００５０】
ｂ）Ｐｈｔｈ酸を作製する下記の工程：
【００５１】
【化２１】
【００５２】
ｃ）Ｐｈｔｈ ＭＡを作製する下記の工程：
【００５３】
【化２２】
【００５４】
ｄ）アミノＣｙｓＭＡを作製する下記の工程：
【００５５】
【化２３】
【００５６】
及びｅ）ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡを作製する下記の工程：
【００５７】
【化２４】
【００５８】
を含む。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】溶液中のＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡ／３，３’−ｏＢＢＶのＳｔｅｒｎ―Ｖｏｌｍｅｒ消光の図である。３，３’−ｏＢＢＶの添加時の相対発光変化（Ｓｔｅｒｎ―Ｖｏｌｍｅｒ曲線）を示し、３，３’−ｏＢＢＶによるＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡの消光を示す。
【図２】溶液中のＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡ／３，３’−ｏＢＢＶのグルコース応答の図である。ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡ及び３，３’−ｏＢＢＶへのグルコースの添加後に測定される蛍光発光を示す。
【図３】ヒドロゲル中のＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡの蛍光スペクトルの図である。ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡを含むポリマーヒドロゲルの蛍光励起スペクトル及び発光スペクトルを示す。
【図４】種々のｐＨでのヒドロゲル中のＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡの時間励振(Time Drive)（Ｅｍ＝５３２ｎｍ）の図である。種々のｐＨでのヒドロゲル中のＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡの時間励振を示す。
【図５】２つの異なる励起でのＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡのｐＨプロフィール（Ｅｍ＝５３２ｎｍ）の図である。２つの異なる励起波長でのＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡのｐＨプロフィールを示す。
【図６】ヒドロゲル中のＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡ／３，３’−ｏＢＢＶのグルコース応答の図である。ヒドロゲル中のＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡ／３，３’−ｏＢＢＶのグルコース応答を示す。
【図７】ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡ及びＨＰＴＳ−ＬｙｓＭＡの蛍光スペクトルの図である。ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡ及びＨＰＴＳ−ＬｙｓＭＡの蛍光スペクトルの比較を示す。（１×１０−５Ｍ）、Ｅｘスリット ８ｎｍ、Ｅｍスリット １２ｎｍ。
【図８】３，３’−ｏＢＢＶによるＨＰＴＳ−ＬｙｓＭＡ及びＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡを使用したＳｔｅｒｎ―Ｖｏｌｍｅｒ消光の比較（［色素］＝１×１０−５Ｍ）の図である。ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡ及びＨＰＴＳ−ＬｙｓＭＡを使用した３，３’−ｏＢＢＶのＳｔｅｒｎ―Ｖｏｌｍｅｒ消光研究の比較を示す。
【図９】３，３’−ｏＢＢＶによるＨＰＴＳ−ＬｙｓＭＡ及びＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡを使用したグルコース調節の比較（［色素］＝１×１０−５Ｍ、Ｑ／Ｄ＝１５０）の図である。３，３’−ｏＢＢＶによるＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡ及びＨＰＴＳ−ＬｙｓＭＡを使用したグルコース調節の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
蛍光色素
本発明の蛍光色素は、８−ヒドロキシピレン−１，３，６−トリスルホネート（ＨＰＴＳ）の誘導体である。対イオンは、Ｈ＋又は任意の他の陽イオンであり得る。ＨＰＴＳは、およそ４０５ｎｍ及びおよそ４５０ｎｍで２つの励起波長を示し、これらはそれぞれ、酸及びその共役塩基の吸収波長に相当する。励起波長の変化は、ＨＰＴＳ上の水酸基のｐＨ依存的イオン化に起因する。ｐＨが増大するにつれ、ＨＰＴＳは、約４５０ｎｍでの吸光度の増加、及び約４２０ｎｍ以下での吸光度の減少を示す。吸収極大のｐＨ依存的シフトは、生理学的範囲における二重励起レシオメトリック検出を可能にする。色素は、３，３’−ｏＢＢＶのようなボロン酸を含む消光剤とともに使用され得る。
【００６１】
本発明の好ましい実施形態による色素の一般構造は：
【００６２】
【化２５】
【００６３】
（式中、
Ｒ２は、
【００６４】
【化２６】
【００６５】
であり、
Ｒ３は、−（ＣＨ２）ｎ−Ａ−Ｍ＋
（式中、ｎは、１〜４であり、
Ａ−は、ＳＯ３−、ＨＰＯ３−、ＣＯ２−及び
【００６６】
【化２７】
【００６７】
から成る群から選択される陰イオン基であり、
Ｍ＋は、Ｈ＋、アルカリ金属イオン、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋、Ｆｒ＋、オニウムイオン及びＮＲ４＋（式中、Ｒは、アルキル、アルキルアリール及び芳香族基から成る群から選択される）から成る群から選択される陽イオン基である）であり、
Ｒ４は、
【００６８】
【化２８】
【００６９】
であり、
Ｒ５は、Ｙ−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ６及び
【００７０】
【化２９】
【００７１】
（式中、ｎは、１〜１０に等しく、ｎ’は、２〜４に等しく、Ｙは、ＮＨ及びＯから成る群から選択される）から成る群から選択され、
Ｒ６は、ＮＨＲ７、ＯＲ７及びＣＯ２Ｈから成る群から選択され、
Ｒ７は、Ｈ、又はメタクリロイル、アクリロイル、スチリル、アクリルアミド及びメタクリルアミドから成る群から選択されるエチレン性不飽和基である）である。
【００７２】
本発明の好ましい実施形態による色素の一般構造は：
【００７３】
【化３０】
【００７４】
（式中、
Ｒ３は、−（ＣＨ２）ｎ−Ａ−Ｍ＋
（式中、ｎは、１〜４であり、
Ａ−は、ＳＯ３−、ＨＰＯ３−、ＣＯ２−及び
【００７５】
【化３１】
【００７６】
から成る群から選択される陰イオン基であり、
Ｍ＋は、Ｈ＋、アルカリ金属イオン、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋、Ｆｒ＋、オニウムイオン及びＮＲ４＋（式中、Ｒは、アルキル、アルキルアリール及び芳香族基から成る群から選択される）から成る群から選択される陽イオン基である）であり、
Ｒ４は、
【００７７】
【化３２】
【００７８】
であり、
Ｒ８は、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ９及び
【００７９】
【化３３】
【００８０】
（式中、ｎは、１〜１０に等しく、ｎ’は、２〜４に等しい）から成る群から選択され、
Ｒ９は、ＮＨＲ１０、ＯＲ１０及びＣＯ２Ｈから成る群から選択され、
Ｒ１０は、Ｈ、又はメタクリロイル、アクリロイル、スチリル、アクリルアミド及びメタクリルアミドから成る群から選択されるエチレン性不飽和基である）である。
【００８１】
ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡの構造は下記の通りである：
【００８２】
【化３４】
【００８３】
上記一般構造で示されるように、ＨＰＴＳコア上のＣｙｓ−ＭＡ以外の置換は、置換が負に帯電しており、且つ重合可能な基を有する限りは本発明の態様に調和する。例えば、システイン酸のＬ立体異性体又はＤ立体異性体のいずれかを使用してもよい。幾つかの実施形態では、スルホン酸のほんの１つ又は２つが置換されてもよい。同様に、上記で示されるＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡの変形において、ＮＢｕ４＋のほかに、正に帯電された金属（例えば、Ｎａ＋）を含む他の対イオンを使用してもよい。他の変形では、スルホン酸基が、例えばリン酸基、カルボン酸基等の官能基で置き換えられてもよい。
【００８４】
比較のために、ＨＰＴＳ−ＬｙｓＭＡの構造を下記の通りに以下で描写する：
【００８５】
【化３５】
【００８６】
ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡが属する一般クラスの化合物を作製する第１の方法
ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡが属する一般クラスの化合物を作製する第１の方法は、本発明の別の実施形態により開示される。上記方法は下記工程を含む：
【００８７】
【化３６】
【００８８】
（式中、
Ｒ２は、
【００８９】
【化３７】
【００９０】
であり、
Ｒ３は、−（ＣＨ２）ｎ−Ａ−Ｍ＋
（式中、ｎは、１〜４であり、
Ａ−は、ＳＯ３−、ＨＰＯ３−、ＣＯ２−及び
【００９１】
【化３８】
【００９２】
から成る群から選択される陰イオン基であり、
Ｍ＋は、Ｈ＋、アルカリ金属イオン、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋、Ｆｒ＋、オニウムイオン及びＮＲ４＋（式中、Ｒは、アルキル、アルキルアリール及び芳香族基から成る群から選択される）から成る群から選択される陽イオン基である）であり、
Ｒ４は、
【００９３】
【化３９】
【００９４】
であり、
Ｒ５は、Ｙ−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ６及び
【００９５】
【化４０】
【００９６】
（式中、ｎは、１〜１０に等しく、ｎ’は、２〜４に等しく、Ｙは、ＮＨ及びＯから成る群から選択される）から成る群から選択され、
Ｒ６は、ＮＨＲ７、ＯＲ７及びＣＯ２Ｈから成る群から選択され、
Ｒ７は、Ｈ、又はメタクリロイル、アクリロイル、スチリル、アクリルアミド及びメタクリルアミドから成る群から選択されるエチレン性不飽和基であり、
Ｚは、フタルイミド、Ｂｏｃ及びＦｍｏｃから成る群から選択されるアミノ保護基である）。
ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡが属する一般クラスの化合物を作製する第２の方法
ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡが属する一般クラスの化合物を作製する第２の方法は、本発明の別の実施形態により開示される。上記方法は工程：
【００９７】
【化４１】
【００９８】
（式中、
Ｒ３は、−（ＣＨ２）ｎ−Ａ−Ｍ＋
（式中、ｎは、１〜４であり、
Ａ−は、ＳＯ３−、ＨＰＯ３−、ＣＯ２−及び
【００９９】
【化４２】
【０１００】
から成る群から選択される陰イオン基であり、
Ｍ＋は、Ｈ＋、アルカリ金属イオン、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋、Ｆｒ＋、オニウムイオン及びＮＲ４＋（式中、Ｒは、アルキル、アルキルアリール及び芳香族基から成る群から選択される）から成る群から選択される陽イオン基である）であり、
Ｒ８は、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ９及び
【０１０１】
【化４３】
【０１０２】
（式中、ｎは、１〜１０に等しく、ｎ’は、２〜４に等しい）から成る群から選択され、
Ｒ９は、ＮＨＲ１０、ＯＲ１０及びＣＯ２Ｈから成る群から選択され、
Ｒ１０は、Ｈ、又はメタクリロイル、アクリロイル、スチリル、アクリルアミド及びメタクリルアミドから成る群から選択されるエチレン性不飽和基である）
を含む。
ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡを合成する第１の特定の方法
システイン酸１（０．５ｍｍｏｌ、９４ｍｇ、この合成ではＬ立体異性体を使用したが、Ｄ立体異性体もまた使用され得る）を、室温で水酸化テトラブチルアンモニウムの水溶液（０．５ｍｍｏｌ、０．１２５Ｍ溶液 ４ｍＬ）で処理した（スキーム１）。３０分間攪拌した後、溶液を凍結乾燥させて、２を得て、残渣をジクロロメタン（２ｍＬ）中に溶解させた。トリエチルアミン（０．６ｍｍｏｌ、６１ｍｇ）を添加した後、ジクロロメタン（２ｍＬ）中のＨＰＴＳ−Ｃｌ（０．１ｍｍｏｌ、５２ｍｇ）を滴下した。混合物を室温で１８時間攪拌し、続いて真空中で濃縮した。残渣を熱イソプロピルアルコール中に溶解させて、Ｂｉｏｔａｇｅ ＳＰ１ ２５Ｍシリカゲルカートリッジにかけて、ＮＨ４ＯＨ：イソプロピルアルコール（１：３）で溶出させて、黄色粉末としてＨＰＴＳ−ＣｙｓＯＨを得た（０．０２４ｍｍｏｌ、３９ｍｇ、２４％）。１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、５００ ＭＨｚ）d０．８５（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、３６Ｈ）、１．２０（ｓ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２４Ｈ）１．４４（ｍ、２４Ｈ）、２．９４（ｍ、２４Ｈ）、３．２４（ｍ、６Ｈ）、４．３１（ｍ、３Ｈ）、８．１９（ｄ、Ｊ＝１６．８Ｈｚ、２Ｈ）、８．３６（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．５０（ｄ、Ｊ＝９．３Ｈｚ、１Ｈ）、８．６４（ｄ、Ｊ＝９．３Ｈｚ、１Ｈ）、８．７１（ｄ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、１Ｈ）、８．９０（ｍ、４Ｈ）、９．１９（ｄ、Ｊ＝１２．０Ｈｚ、２Ｈ）。
スキーム１
【０１０３】
【化４４】
【０１０４】
ＨＰＴＳ−ＣｙｓＯＨ（０．０１８３ｍｍｏｌ、３０ｍｇ）のＤＭＦ（１ｍＬ）溶液に、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（０．０５５ｍｍｏｌ、１０．５ｍｇ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）（０．０５５ｍｍｏｌ、７．４ｍｇ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）（０．０５５ｍｍｏｌ、２１ｍｇ）及びＮ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（０．１８３ｍｍｏｌ、２４ｍｇ）を添加した。溶液を室温で２０分間攪拌した後、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩を添加して、混合物を４８時間攪拌した。反応混合物をアセトン：エーテル（５：１、１０ｍＬ）中で沈殿させて、油状残渣を得た。残渣をアセトン（１０ｍＬ）で粉砕して、３０分間超音波処理して、粗製混合物としてＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡを得た（橙色粉末 ３５ｍｇ）。
スキーム２
【０１０５】
【化４５】
【０１０６】
ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡを合成する第２の特定の方法
工程１：ＴＢＣｙｓの合成：
【０１０７】
【化４６】
【０１０８】
磁気攪拌棒を備えた５００ｍＬのビーカー中で、（Ｌ）−システイン酸（１２９．２４ｍｍｏｌ、２４．１９１３ｇ）をＨ２Ｏ（１００ｍＬ）中に溶解させて、水酸化テトラブチルアンモニウム（１２９．２４ｍｍｏｌ、１２９．２４ｍＬ、１．０Ｍ水溶液 １２８．５９ｇ）で処理した。混合物を室温で３０分間攪拌した後、低温（ドライアイス／２−プロパノール）浴を使用して凍結させた。固体を３日間かけて凍結乾燥させて、ガラス状物質を得て、これをＣＨ２Ｃｌ２（３００ｍＬ）中に再溶解させた。溶液を５００ｍＬのフラスコ中で乾固するまで蒸発させて、白色泡状物質としてＴＢＣｙｓを得た。収量：５３．３７５６ｇ、１２９ｍｍｏｌ、１００％。
【０１０９】
工程２：Ｐｈｔｈ酸の合成：
【０１１０】
【化４７】
【０１１１】
磁気攪拌棒を備えた５００ｍＬのフラスコ中で、ＴＢＣｙｓ（１２９ｍｍｏｌ、５３．１９３６ｇ）をＣＨＣｌ３（１２９ｍＬ）中に溶解させて、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン（６５ｍｍｏｌ、８．３８５ｇ、１１．３ｍＬ）を添加した後、無水フタル酸（１２９ｍｍｏｌ、１９．１０７４８ｇ）及び４オングストロームのモレキュラーシーブ（５０ｍＬ）を添加して、混合物を４８時間還流させた。混合物を６００ｍＬのガラス漏斗に通して濾過して、濾液を真空中で濃縮して、ジエチルエーテル（２×１００ｍＬ）で洗浄して、減圧下で乾燥させて、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミンと複合体形成したＰｈｔｈ酸を得た。収量：７０ｇ、１２９ｍｍｏｌ、１００％。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ）d０．９５（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、１２Ｈ）、１．３０（ｍ、８Ｈ）、１．３８（ｑ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、８Ｈ）、１．６１（ｍ、８Ｈ）、２．９６（ｑ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、１Ｈ）、３．２３（ｍ、８Ｈ）、３．５５（ｓｅｐｔ、Ｊ＝６．７、１Ｈ）、３．６２（ｍ、１Ｈ）、３．８６（ｄｄ、Ｊ１＝５Ｈｚ、Ｊ２＝９．４Ｈｚ、１Ｈ）、５．３１（ｄｄ、Ｊ１＝５．４Ｈｚ、Ｊ２＝１．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．６５（ｑ、Ｊ＝３Ｈｚ、２Ｈ）、７．５５（ｑ、Ｊ＝３Ｈｚ、２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１２５ＭＨｚ）d１２．０、１３．８、１８．１、１９．８、２４．０、４１．７、５０．４、５１．０、５３．１、５８．７、１２３．０、１３２．８、１３３．５２、１６７．９、１７０．７；ＨＰＬＣ ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣ−８−ＤＢ、５μｍ、１５０ｍｍ×４．６ｍｍ、λ＝２５４ｎｍ、ＭｅＯＨ／ＴＢＡＰを用いた勾配溶出（３０〜７０％ＭｅＯＨ）、Ｒｔ＝５．９分。
【０１１２】
工程３：Ｐｈｔｈ ＭＡの合成：
【０１１３】
【化４８】
【０１１４】
磁気攪拌棒を備えた２５０ｍＬの丸底フラスコ中で、Ｐｈｔｈ酸（２４．９ｍｍｏｌ、１３．４６ｇ）を０℃でＣＨ２Ｃｌ２（８５ｍＬ）中に溶解させて、ＥＤＣ（２７ｍｍｏｌ、５．１５７ｇ）、ＨＯＢＴ（２７ｍｍｏｌ、３．６４５ｇ）及びトリエチルアミン（５４ｍｍｏｌ、５．４ｇ、７．５ｍＬ）を順次添加して、混合物を窒素下で２０分間攪拌した。Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（２７ｍｍｏｌ、４．８０６ｇ）を添加して、混合物を２時間かけて室温に到達させた後、室温でさらに１４時間攪拌した。溶液を飽和ＮａＨＣＯ３（１００ｍＬ）で処理して、ＣＨ２Ｃｌ２（３×２０ｍＬ）で抽出した。ＣＨ２Ｃｌ２層をＭｇＳＯ４で乾燥させて、真空中で濃縮して、橙色油状物質を得て、これをＢｉｏｔａｇｅ ＫＰ−ｓｉｌ ４０Ｍカートリッジにかけた。この物質は、５％〜１５％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を用いた勾配溶出によって精製した。生成物は白色泡状物質として単離された（収率７２％）。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ）d０．９９（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、１２Ｈ）、１．４４（ｓｅｘｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、８Ｈ）、１．６６（ｍ、１０Ｈ）、１．８９（ｓ、３Ｈ）、３．２８（ｍ、１１Ｈ）、３．３８（ｓｅｘｔ、２Ｈ）、３．９６（ｄｄ、Ｊ１＝９Ｈｚ、Ｊ２＝５．９Ｈｚ、１Ｈ）、５．２２（ｔ、Ｊ＝１．４Ｈｚ、１Ｈ）、５．４４（ｄｄ、Ｊ１＝１．９Ｈｚ、Ｊ２＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）、５．６９（ｓ、１Ｈ）、５．９１（ｔ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．７０（ｍ、２Ｈ）、７．８２（ｍ、２Ｈ）、９．０９（ｔ、Ｊ＝５．８Ｈｚ、１Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１２５ＭＨｚ）d１３．８、１８．７、１９．８、２４．１、２９．１、３６．０、３６．４、５０．５、５３．２、５８．９、１１９．６、１２３．４、１３２．３、１３４．０、１４０．０、１６７．９、１６８．５、１６９．３；ＨＰＬＣ ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣ−８−ＤＢ、５μｍ、１５０ｍｍ×４．６ｍｍ、λ＝２５４ｎｍ、ＭｅＯＨ／ＴＢＡＰを用いた勾配溶出（３０〜７０％ＭｅＯＨ）、Ｒｔ＝６．６分。
【０１１５】
工程４：アミノＣｙｓＭＡの合成：
【０１１６】
【化４９】
【０１１７】
磁気攪拌棒を備えた１００ｍＬの丸底フラスコ中で、Ｐｈｔｈ ＭＡ（２．５９ｍｍｏｌ、１．７２２５ｇ）をエタノール（２０ｍＬ）中に溶解させて、ヒドラジン一水和物（２．５９ｍｍｏｌ、０．１３０ｇ、０．１２６ｍＬ）を添加して、混合物を８０℃で２時間加熱した。溶液を室温に冷却して、ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）を添加した。形成された沈殿物を、ガラス漏斗を使用して濾過して、さらにＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）で洗浄して、濾液を真空中で濃縮した。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）中に溶解させて、Ｂｉｏｔａｇｅ ＫＰ−ＮＨ ４０Ｍカートリッジにかけて、１％〜１５％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２で溶出させた。分画を収集して、真空中で濃縮して、無色油状物質としてアミノＣｙｓＭＡを得た。収率：６０％。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、５００ＭＨｚ）d１．０３（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、１２Ｈ）、１．４２（ｓｅｘｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、８Ｈ）、１．６６（ｍ、８Ｈ）、１．９５（ｓ、３Ｈ）、２．８７（ｑ、Ｊ１＝９．４Ｈｚ、Ｊ２＝４．４Ｈｚ、１Ｈ）、３．２３（ｍ、１０Ｈ）、３．８１（ｄｄ、Ｊ１＝３．３Ｈｚ、Ｊ２＝６．０Ｈｚ、１Ｈ）、５．３７（ｓ、１Ｈ）、５．７３（ｓ、１Ｈ）；ＨＰＬＣ ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣ−８−ＤＢ、５μｍ、１５０ｍｍ×４．６ｍｍ、λ＝２５４ｎｍ、ＭｅＯＨ／ＴＢＡＰを用いた勾配溶出（３０〜７０％ＭｅＯＨ）、Ｒｔ＝３．５分。
【０１１８】
工程５：ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡの合成：
【０１１９】
【化５０】
【０１２０】
５０ｍＬの丸底フラスコ中で、アミノＣｙｓＭＡ（１．０９ｍｍｏｌ、０．５８２７ｇ）をＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）中に溶解させて、ＨＰＴＳ−Ｃｌ（０．２９ｍｍｏｌ、０．１６３ｇ）を添加した。トリエチルアミン（１．１ｍｍｏｌ、０．１５３ｍＬ）を添加して、混合物を室温で１６時間攪拌した。赤色溶液を１Ｍ ＮａＯＨ（１０ｍＬ）で処理して、３０分間攪拌して、２層を分液漏斗で分離させた。橙色水層をＤｏｗｅｘ ５０Ｗ樹脂（Ｈ＋形態）のカラムに通して、ｐＨ紙で測定される場合にｐＨ＝４を有する黄色／緑色溶液を得た。次に、水溶液をＤｏｗｅｘ ５０Ｗ（Ｎａ＋形態）のカラムに通して、ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡの粗製ナトリウム塩を得た。溶液をポリスチレン−ジビニルベンゼン樹脂（２５０ｇ）上へ吸着させて、Ｈ２Ｏ（５×５００ｍＬ）で洗浄した。洗液を保存して、吸着された材料を、ＭｅＯＨ（１Ｌ）を用いて樹脂から取り出した。新鮮なＭｅＯＨ（４×５００ｍＬ）による多重同時蒸発後に、ＭｅＯＨ／水抽出物を乾固するまで蒸発させて、残渣をＭｅＯＨ（０．５ｍＬ）中に再溶解させた。アセトン（１５ｍＬ）を添加して、沈殿物を遠心分離により収集して、アルゴン気流下で乾燥させて、橙色／黄色固体としてＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡを得た。さらなる生成物を、同じＭｅＯＨ抽出手順を使用して洗液から単離した。収率：４０％。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ、ｐｐｍ）：１．１８−１．０９（ｍ、６Ｈ）、１．７６−１．５３（ｍ、９Ｈ）、２．７３−２．２３（ｍ、１２Ｈ）；ＨＰＬＣ ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣ−８−ＤＢ、５μｍ、１５０ｍｍ×４．６ｍｍ、ＦＬＤ検出器、ＭｅＯＨ／ＴＢＡＰを用いた勾配溶出（３０〜７０％ＭｅＯＨ）、Ｒｔ＝１１．６分；Ｃ４６Ｈ５８Ｎ９Ｎａ３Ｏ２２Ｓ６に関するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ［ＭＨ］＋：１３５０、［ＭＨ−Ｎａ＋Ｈ］＋：１３２８、［ＭＨ−２Ｎａ＋２Ｈ］＋：１３０６、［ＭＨ−３Ｎａ＋３Ｈ］＋：１２８４（ｍａｊｏｒ）。
消光剤
本明細書中で使用する場合、「消光剤」という用語は、その存在時に、蛍光色素（例えば、ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡ）の発光を低減する化合物を指す。
【０１２１】
幾つかの実施形態では、消光剤部分は、グルコース認識を提供する。かかる部分は好ましくは、芳香族ボロン酸を含む。より具体的には、ボロン酸は、共役窒素含有複素環式芳香族ビスオニウム構造（例えば、ビオロゲン）に共有結合され、ここでボロン酸は、水性媒体、有機媒体又は組合せ媒体中でグルコースと可逆的に或いは不可逆的に反応して、ボロン酸エステルを形成する。反応の程度は、媒体中のグルコース濃度に関連する。
【０１２２】
ビスオニウム塩は、共役複素環式芳香族二窒素化合物から調製される。共役複素環式芳香族二窒素は、例えばジピリジル、ジピリジルエチレン、ジピリジルフェニレン、フェナントロリン及びジアザフルオレンである。両方の窒素が置換され得る上記共役複素環式芳香族二窒素化合物の全ての異性体が、本発明で有用である。ボロン酸置換されたビオロゲン及びボロン酸置換されたポリビオロゲンは、同時係属米国出願第１１／６７１，８８０号（その全体が参照により本明細書に援用される）に詳述されている。
【０１２３】
他の実施形態では、ピリジニウムボロン酸消光剤は、本発明の色素と組み合わせて使用される。ピリジニウムボロン酸消光剤は、米国仮出願第６０／９１５，３７２号（その全体が参照により本明細書に援用される）に詳述されている。
【０１２４】
１つの好ましい実施形態では、３，３’−ｏＢＢＶは、消光剤部分として使用され得る。３，３’−ｏＢＢＶの構造は：
【０１２５】
【化５１】
【０１２６】
である。
色素の機能分析
ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡを、蛍光光度計を使用して溶液中で試験して、ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡをＨＰＴＳ−ＬｙｓＭＡと比較する方法を確定した。Ｓｔｅｒｎ―Ｖｏｌｍｅｒ研究及びグルコース応答研究を同一条件下で連続して実施して、直接的な比較を保証した。
溶液研究
ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡの溶液（ｐＨ ７．４ ＰＢＳ中に１×１０−５Ｍ）に、増加量の３，３’−ｏＢＢＶ（ＭｅＯＨ中に３０ｍＭ）を添加して、各添加後に蛍光発光を測定した。図１は、３，３’−ｏＢＢＶの添加時の相対発光変化（Ｓｔｅｒｎ―Ｖｏｌｍｅｒ曲線）を付与し、３，３’−ｏＢＢＶによるＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡの消光を示す。蛍光光度計設定は下記の通りであった：１％減衰、ｅｘスリット ８ｎｍ、ｅｍスリット １２ｎｍ、４８６ｎｍ ｅｘ λ、５３７ｎｍ ｅｍ λ。
【０１２７】
ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡ（１×１０−５Ｍ）及び３，３’−ｏＢＢＶ（３×１０−３Ｍ）を、ｐＨ ７．４ ＰＢＳ中のグルコースの原液（３１２５０ｍｇ／ｄＬ）で滴定して、グルコースの各添加後に蛍光発光を測定した。グルコースの添加時の相対変化は図２に付与される。
ポリマー研究
ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡ（１ｍｇ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミド（４００ｍｇ）、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（８ｍｇ）、ＨＣｌ（１Ｍ溶液 １０μＬ）及びＶＡ−０４４（１ｍｇ）を水中に溶解させて、メスフラスコ中で１ｍＬに希釈した。溶液を凍結−吸引−解凍させて(freeze-pump-thaw)（３回）、０．００５”ポリイミドスペーサーを含有する型へ注入して、５５℃で１６時間重合させた。得られたフィルムをｐＨ ７．４リン酸緩衝液中に置いて、その蛍光励起スペクトル及び発光スペクトルを得た（図３）。
【０１２８】
フィルムはフローセル構成において２つの異なる励起波長（４１８ｎｍ及び４８６ｎｍ）で様々なｐＨ（最初はｐＨ５．１にて、ｐＨ ５．７５、６．２６、６．５、６．９、７．４、８．０２に変化させて、続いてｐＨ ７．４に戻す）で試験して、１つの発光波長（５３２ｎｍ）で経時的にモニタリングした（図４）。蛍光光度計設定は下記の通りであった：ｅｘスリット ５ｎｍ、ｅｍスリット ３．５ｎｍ、５１５ｎｍ カットオフフィルタ、４１８ｎｍ ｅｘ λ、４８６ｎｍ ｅｘ λ、５３２ｎｍ ｅｍ λ。ｐＨプロフィールは図５に要約される。
【０１２９】
ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡ（２ｍｇ）、３，３’−ｏＢＢＶ（１５ｍｇ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミド（４００ｍｇ）、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（８ｍｇ）、ＨＣｌ（１Ｍ溶液 １０μＬ）及びＶＡ−０４４（１ｍｇ）を水中に溶解させて、メスフラスコ中で１ｍＬに希釈した。溶液を凍結−吸引−解凍させて（３回）、０．００５”ポリイミドスペーサーを含有する型へ注入して、５５℃で１６時間重合させた。得られたフィルムをｐＨ ７．４リン酸緩衝液中に置いて、フローセル構成において増加量のグルコース（０、５０、１００、２００、４００ｍｇ／ｄＬ）を用いて試験した。グルコースの添加時の相対蛍光変化は図６に付与される。蛍光光度計設定は下記の通りであった：ｅｘスリット ８ｎｍ、ｅｍスリット ３．５ｎｍ、５１５ｎｍ カットオフフィルタ、４８６ｎｍ ｅｘ λ、５３２ｎｍ ｅｍ λ。
比較研究
溶液中のＣｙｓＭＡ色素及びＬｙｓＭＡ色素の蛍光スペクトルの比較は図７に示される。ＣｙｓＭＡ色素は、ＬｙｓＭＡ色素に対して青色側へシフトする。
【０１３０】
溶液中のＣｙｓＭＡ及びＬｙｓＭＡに関するＳｔｅｒｎ―Ｖｏｌｍｅｒ消光研究の比較は図８に付与され、グルコース応答は図９に付与される。
【０１３１】
ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡは、ＨＰＴＳ−ＬｙｓＭＡよりも効果的に３，３’−ｏＢＢＶにより消光される。ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡは、スルホン酸のために、カルボン酸を有するＨＰＴＳ−ＬｙｓＭＡよりも強力な複合体を形成し、よりしっかりとした複合体がより大きなグルコース応答を導く。このため、スルホネート基で置換された色素が好ましい。
グルコースセンサ
１つの好ましい実施形態では、血中グルコース濃度を確定するための装置が開示される。装置は、血管内で展開用に寸法を取った光ファイバを含むセンサを備える。センサは、不水溶性ポリマーマトリックス（ここでポリマーマトリックスは、グルコースにとって透過性である）、ポリマーマトリックスに結合された本明細書中で開示されるような蛍光色素、血中グルコース濃度に関連する量のグルコースを可逆的に結合するように適応された本明細書中に開示されるような消光剤（ここで、消光剤もまた、ポリマーマトリックスに結合されて、蛍光色素と操作可能にカップリングされ、また消光剤は、結合されたグルコースの量に関連する蛍光色素により発光される光を調節するように設計される）、少なくとも１つの励起光源及び発光検出器をさらに含む。
【０１３２】
血中グルコース濃度を測定する方法もまた開示される。上記方法は、上述の装置を準備する工程、血管へセンサを挿入する工程、励起波長でセンサを照射する工程、発光波長でセンサの蛍光発光を検出する工程、及び血中グルコース濃度を測定する工程を含む。
【０１３３】
幾つかの実施形態では、移動している流れを包含しないｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用に関して、検知構成成分は、個々の（別個の）構成成分として使用される。色素及び消光剤は液体溶液中で一緒に混合されて、検体が添加されて、蛍光強度の変化が測定され、構成成分は廃棄される。浸出を防止するために検知構成成分を捕捉するのに使用することができる高分子マトリックスは存在する必要がない。任意に、検知構成成分は固定化されて、それらの使用が、移動している流れにおいて検体を測定するのを可能にする。
【０１３４】
ｉｎ ｖｉｖｏ用途に関しては、センサは、１つ又は複数のポリヒドロキシル有機化合物を含有するか、或いは上記化合物を含有する筋肉のような組織中に植え込まれている生理液、好ましくは血液の移動している流れにおいて使用される。したがって、検知部分はいずれもセンサ組立品から抜け出ないことが好ましい。したがって、ｉｎ ｖｉｖｏでの使用に関して、検知構成成分は好ましくは、有機ポリマー検知組立品の一部である。可溶性色素及び消光剤は、検体の通過を可能にするが、検知部分の通過を阻止する半透膜により閉じ込められ得る。このことは、検体分子よりも実質的に大きい可溶性検知部分（検体の分子量の少なくとも２倍、又は１０００より大きい、好ましくは５０００より大きい分子量）を使用すること、及び検知部分が定量的に保持されるように２つの間で特定の分子量カットオフを有する選択的半透膜（例えば、透析又は限外濾過膜）を用いることにより実現することができる。
【０１３５】
好ましくは、検知部分は、グルコースにとって自由に透過性である不溶性ポリマーマトリックスに固定化される。ポリマーマトリックスは、有機ポリマー、無機ポリマー又はそれらのポリマーの組合せで構成される。マトリックスは、生体適合性材料で構成されてもよい。あるいは、マトリックスは、第２の生体適合性ポリマー、及び／又は所定の検体にとって透過性である半透膜でコーティングされる。
【０１３６】
ポリマーマトリックスの機能は、検体との接触を可能とし、且つ検体をボロン酸に結合させると同時に、蛍光色素及び消光剤部分を一緒に保持及び固定化することである。この効果を達成するには、マトリックスは、媒体中では不溶性でなくてはならず、マトリックスと検体溶液との間で高表面積界面を確立することにより検体と密接に結び付かなくてはならない。例えば、超薄フィルム又は微孔質支持体マトリックスが使用される。あるいは、マトリックスは、検体溶液中で膨潤性であり、例えばヒドロゲルマトリックスが水系で使用される。場合によっては、検知ポリマーは、光導管の表面のような表面に結合されるか、或いは微孔質膜中に含浸される。全ての場合において、マトリックスは、結合部位への検体の輸送を妨害してはならず、その結果、２相間で平衡が確立され得る。超薄フィルム、微孔質ポリマー、微孔質ゾルゲル及びヒドロゲルを調製するための技法は当該技術分野で確立されている。有用なマトリックスは全て、検体透過性であるとして規定される。
【０１３７】
明瞭性及び理解の目的で本発明を幾らか詳細に記載してきたが、本発明の真の範囲を逸脱することなく、形態及び詳細において様々な変更が成され得ることは当業者に理解されよう。図、表及び付録並びに上記で参照した特許、出願及び刊行物は全て、参照により本明細書に援用される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物：
【化１】
（式中、
Ｒ２は、
【化２】
であり、
Ｒ３は、−（ＣＨ２）ｎ−Ａ−Ｍ＋
（式中、ｎは、１〜４であり、
Ａ−は、ＳＯ３−、ＨＰＯ３−、ＣＯ２−及び
【化３】
から成る群から選択される陰イオン基であり、
Ｍ＋は、Ｈ＋、アルカリ金属イオン、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋、Ｆｒ＋、オニウムイオン及びＮＲ４＋（式中、Ｒは、アルキル、アルキルアリール及び芳香族基から成る群から選択される）から成る群から選択される陽イオン基である）であり、
Ｒ４は、
【化４】
であり、
Ｒ５は、Ｙ−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ６及び
【化５】
（式中、ｎは、１〜１０に等しく、ｎ’は、２〜４に等しく、Ｙは、ＮＨ及びＯから成る群から選択される）から成る群から選択され、
Ｒ６は、ＮＨＲ７、ＯＲ７及びＣＯ２Ｈから成る群から選択され、
Ｒ７は、Ｈ、又はメタクリロイル、アクリロイル、スチリル、アクリルアミド及びメタクリルアミドから成る群から選択されるエチレン性不飽和基である）。
【請求項２】
化合物：
【化６】
（式中、
Ｒ３は、−（ＣＨ２）ｎ−Ａ−Ｍ＋
（式中、ｎは、１〜４であり、
Ａ−は、ＳＯ３−、ＨＰＯ３−、ＣＯ２−及び
【化７】
から成る群から選択される陰イオン基であり、
Ｍ＋は、Ｈ＋、アルカリ金属イオン、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋、Ｆｒ＋、オニウムイオン及びＮＲ４＋（式中、Ｒは、アルキル、アルキルアリール及び芳香族基から成る群から選択される）から成る群から選択される陽イオン基である）であり、
Ｒ４は、
【化８】
であり、
Ｒ８は、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ９及び
【化９】
（式中、ｎは、１〜１０に等しく、ｎ’は、２〜４に等しい）から成る群から選択され、
Ｒ９は、ＮＨＲ１０、ＯＲ１０及びＣＯ２Ｈから成る群から選択され、
Ｒ１０は、Ｈ、又はメタクリロイル、アクリロイル、スチリル、アクリルアミド及びメタクリルアミドから成る群から選択されるエチレン性不飽和基である）。
【請求項３】
化合物：
【化１０】
【請求項４】
ＮＢｕ４が任意の他の対イオンである、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
システインのＬ立体異性体、Ｄ立体異性体又はＬ及びＤ立体異性体を含む、請求項３に記載の化合物。
【請求項６】
請求項１に記載の化合物を含むグルコースセンサ。
【請求項７】
消光剤部分(quencher moiety)をさらに含む、請求項６に記載のグルコースセンサ。
【請求項８】
前記消光剤部分は、ボロン酸を含む、請求項７に記載のグルコースセンサ。
【請求項９】
前記ボロン酸消光剤は、３，３’−ｏＢＢＶである、請求項８に記載のグルコースセンサ。
【請求項１０】
請求項１に記載の化合物を作製する方法であって、
【化１１】
（式中、
Ｒ２は、
【化１２】
であり、
Ｒ３は、−（ＣＨ２）ｎ−Ａ−Ｍ＋
（式中、ｎは、１〜４であり、
Ａ−は、ＳＯ３−、ＨＰＯ３−、ＣＯ２−及び
【化１３】
から成る群から選択される陰イオン基であり、
Ｍ＋は、Ｈ＋、アルカリ金属イオン、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋、Ｆｒ＋、オニウムイオン及びＮＲ４＋（式中、Ｒは、アルキル、アルキルアリール及び芳香族基から成る群から選択される）から成る群から選択される陽イオン基である）であり、
Ｒ４は、
【化１４】
であり、
Ｒ５は、Ｙ−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ６及び
【化１５】
（式中、ｎは、１〜１０に等しく、ｎ’は、２〜４に等しく、Ｙは、ＮＨ及びＯから成る群から選択される）から成る群から選択され、
Ｒ６は、ＮＨＲ７、ＯＲ７及びＣＯ２Ｈから成る群から選択され、
Ｒ７は、Ｈ、又はメタクリロイル、アクリロイル、スチリル、アクリルアミド及びメタクリルアミドから成る群から選択されるエチレン性不飽和基であり、
Ｚは、フタルイミド、Ｂｏｃ及びＦｍｏｃから成る群から選択されるアミノ保護基である）
の工程を含む、方法。
【請求項１１】
請求項２に記載の化合物を作製する方法であって、
【化１６】
（式中、
Ｒ３は、−（ＣＨ２）ｎ−Ａ−Ｍ＋
（式中、ｎは、１〜４であり、
Ａ−は、ＳＯ３−、ＨＰＯ３−、ＣＯ２−及び
【化１７】
から成る群から選択される陰イオン基であり、
Ｍ＋は、Ｈ＋、アルカリ金属イオン、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋、Ｆｒ＋、オニウムイオン及びＮＲ４＋（式中、Ｒは、アルキル、アルキルアリール及び芳香族基から成る群から選択される）から成る群から選択される陽イオン基である）であり、
Ｒ８は、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ９及び
【化１８】
（式中、ｎは、１〜１０に等しく、ｎ’は、２〜４に等しい）から成る群から選択され、
Ｒ９は、ＮＨＲ１０、ＯＲ１０及びＣＯ２Ｈから成る群から選択され、
Ｒ１０は、Ｈ、又はメタクリロイル、アクリロイル、スチリル、アクリルアミド及びメタクリルアミドから成る群から選択されるエチレン性不飽和基である）
の工程を含む、方法。
【請求項１２】
請求項３に記載の化合物を作製する方法であって、ＨＰＴＳ−ＣｙｓＯＨを作製する下記の工程：
【化１９】
及びＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡを作製する下記の工程：
【化２０】
を含む、方法。
【請求項１３】
請求項３に記載の化合物を作製する方法であって、ＴＢＣｙｓを作製する下記の工程：
【化２１】
、Ｐｈｔｈ酸を作製する下記の工程：
【化２２】
、Ｐｈｔｈ ＭＡを作製する下記の工程：
【化２３】
、アミノＣｙｓＭＡを作製する下記の工程：
【化２４】
及びＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡを作製する下記の工程
【化２５】
を含む、方法。
【請求項１】
化合物：
【化１】
（式中、
Ｒ２は、
【化２】
であり、
Ｒ３は、−（ＣＨ２）ｎ−Ａ−Ｍ＋
（式中、ｎは、１〜４であり、
Ａ−は、ＳＯ３−、ＨＰＯ３−、ＣＯ２−及び
【化３】
から成る群から選択される陰イオン基であり、
Ｍ＋は、Ｈ＋、アルカリ金属イオン、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋、Ｆｒ＋、オニウムイオン及びＮＲ４＋（式中、Ｒは、アルキル、アルキルアリール及び芳香族基から成る群から選択される）から成る群から選択される陽イオン基である）であり、
Ｒ４は、
【化４】
であり、
Ｒ５は、Ｙ−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ６及び
【化５】
（式中、ｎは、１〜１０に等しく、ｎ’は、２〜４に等しく、Ｙは、ＮＨ及びＯから成る群から選択される）から成る群から選択され、
Ｒ６は、ＮＨＲ７、ＯＲ７及びＣＯ２Ｈから成る群から選択され、
Ｒ７は、Ｈ、又はメタクリロイル、アクリロイル、スチリル、アクリルアミド及びメタクリルアミドから成る群から選択されるエチレン性不飽和基である）。
【請求項２】
化合物：
【化６】
（式中、
Ｒ３は、−（ＣＨ２）ｎ−Ａ−Ｍ＋
（式中、ｎは、１〜４であり、
Ａ−は、ＳＯ３−、ＨＰＯ３−、ＣＯ２−及び
【化７】
から成る群から選択される陰イオン基であり、
Ｍ＋は、Ｈ＋、アルカリ金属イオン、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋、Ｆｒ＋、オニウムイオン及びＮＲ４＋（式中、Ｒは、アルキル、アルキルアリール及び芳香族基から成る群から選択される）から成る群から選択される陽イオン基である）であり、
Ｒ４は、
【化８】
であり、
Ｒ８は、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ９及び
【化９】
（式中、ｎは、１〜１０に等しく、ｎ’は、２〜４に等しい）から成る群から選択され、
Ｒ９は、ＮＨＲ１０、ＯＲ１０及びＣＯ２Ｈから成る群から選択され、
Ｒ１０は、Ｈ、又はメタクリロイル、アクリロイル、スチリル、アクリルアミド及びメタクリルアミドから成る群から選択されるエチレン性不飽和基である）。
【請求項３】
化合物：
【化１０】
【請求項４】
ＮＢｕ４が任意の他の対イオンである、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
システインのＬ立体異性体、Ｄ立体異性体又はＬ及びＤ立体異性体を含む、請求項３に記載の化合物。
【請求項６】
請求項１に記載の化合物を含むグルコースセンサ。
【請求項７】
消光剤部分(quencher moiety)をさらに含む、請求項６に記載のグルコースセンサ。
【請求項８】
前記消光剤部分は、ボロン酸を含む、請求項７に記載のグルコースセンサ。
【請求項９】
前記ボロン酸消光剤は、３，３’−ｏＢＢＶである、請求項８に記載のグルコースセンサ。
【請求項１０】
請求項１に記載の化合物を作製する方法であって、
【化１１】
（式中、
Ｒ２は、
【化１２】
であり、
Ｒ３は、−（ＣＨ２）ｎ−Ａ−Ｍ＋
（式中、ｎは、１〜４であり、
Ａ−は、ＳＯ３−、ＨＰＯ３−、ＣＯ２−及び
【化１３】
から成る群から選択される陰イオン基であり、
Ｍ＋は、Ｈ＋、アルカリ金属イオン、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋、Ｆｒ＋、オニウムイオン及びＮＲ４＋（式中、Ｒは、アルキル、アルキルアリール及び芳香族基から成る群から選択される）から成る群から選択される陽イオン基である）であり、
Ｒ４は、
【化１４】
であり、
Ｒ５は、Ｙ−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ６及び
【化１５】
（式中、ｎは、１〜１０に等しく、ｎ’は、２〜４に等しく、Ｙは、ＮＨ及びＯから成る群から選択される）から成る群から選択され、
Ｒ６は、ＮＨＲ７、ＯＲ７及びＣＯ２Ｈから成る群から選択され、
Ｒ７は、Ｈ、又はメタクリロイル、アクリロイル、スチリル、アクリルアミド及びメタクリルアミドから成る群から選択されるエチレン性不飽和基であり、
Ｚは、フタルイミド、Ｂｏｃ及びＦｍｏｃから成る群から選択されるアミノ保護基である）
の工程を含む、方法。
【請求項１１】
請求項２に記載の化合物を作製する方法であって、
【化１６】
（式中、
Ｒ３は、−（ＣＨ２）ｎ−Ａ−Ｍ＋
（式中、ｎは、１〜４であり、
Ａ−は、ＳＯ３−、ＨＰＯ３−、ＣＯ２−及び
【化１７】
から成る群から選択される陰イオン基であり、
Ｍ＋は、Ｈ＋、アルカリ金属イオン、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋、Ｆｒ＋、オニウムイオン及びＮＲ４＋（式中、Ｒは、アルキル、アルキルアリール及び芳香族基から成る群から選択される）から成る群から選択される陽イオン基である）であり、
Ｒ８は、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ９及び
【化１８】
（式中、ｎは、１〜１０に等しく、ｎ’は、２〜４に等しい）から成る群から選択され、
Ｒ９は、ＮＨＲ１０、ＯＲ１０及びＣＯ２Ｈから成る群から選択され、
Ｒ１０は、Ｈ、又はメタクリロイル、アクリロイル、スチリル、アクリルアミド及びメタクリルアミドから成る群から選択されるエチレン性不飽和基である）
の工程を含む、方法。
【請求項１２】
請求項３に記載の化合物を作製する方法であって、ＨＰＴＳ−ＣｙｓＯＨを作製する下記の工程：
【化１９】
及びＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡを作製する下記の工程：
【化２０】
を含む、方法。
【請求項１３】
請求項３に記載の化合物を作製する方法であって、ＴＢＣｙｓを作製する下記の工程：
【化２１】
、Ｐｈｔｈ酸を作製する下記の工程：
【化２２】
、Ｐｈｔｈ ＭＡを作製する下記の工程：
【化２３】
、アミノＣｙｓＭＡを作製する下記の工程：
【化２４】
及びＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡを作製する下記の工程
【化２５】
を含む、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２００９−５４４７２９（Ｐ２００９−５４４７２９Ａ）
【公表日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２１９６２（Ｐ２００９−５２１９６２）
【出願日】平成１９年７月２４日（２００７．７．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７４２５５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０１４２８０
【国際公開日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【出願人】（５０７２６２６９３）グルメトリックス，インコーポレイテッド (2)
【氏名又は名称原語表記】ＧｌｕＭｅｔｒｉｃｓ，Ｉｎｃ．
【住所又は居所原語表記】１５３７５ Ｂａｒｒａｎｃａ Ｐａｒｋｗａｙ， Ｓｔｅ Ｉ−１０８，Ｉｒｖｉｎｅ， ＣＡ ９２６１８ Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年７月２４日（２００７．７．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７４２５５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０１４２８０
【国際公開日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【出願人】（５０７２６２６９３）グルメトリックス，インコーポレイテッド (2)
【氏名又は名称原語表記】ＧｌｕＭｅｔｒｉｃｓ，Ｉｎｃ．
【住所又は居所原語表記】１５３７５ Ｂａｒｒａｎｃａ Ｐａｒｋｗａｙ， Ｓｔｅ Ｉ−１０８，Ｉｒｖｉｎｅ， ＣＡ ９２６１８ Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
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