ケトンの製造方法、アルコールの製造方法および生体触媒
【課題】アルコールからケトンへの酸化及びケトンからアルコールへの還元を穏和な反応条件下で行なうことができ、且つ穏和な反応条件下でキラルなアルコールを生成することができるケトンの製造方法、アルコールの製造方法及び生体触媒を提供する。
【解決手段】アルコール（1-phenylethanol(rac.)）を生体触媒の存在下で酸化させてケトン（acetophenone）を得る際、生体触媒として植物（リンゴ）のカルスを用いた。リンゴのカルス（酵素）が触媒するのは1-phenylethanolからacetophenoneへの酸化反応である。ケトンを生体触媒の存在下で還元させてアルコール１−フェニルエタノール（1-phenylethanol）を得る際、生体触媒として灰色カビ病菌を用いた。灰色カビ病菌が触媒するのはacetophenoneから1-phenylethanolへの還元反応である。
【解決手段】アルコール（1-phenylethanol(rac.)）を生体触媒の存在下で酸化させてケトン（acetophenone）を得る際、生体触媒として植物（リンゴ）のカルスを用いた。リンゴのカルス（酵素）が触媒するのは1-phenylethanolからacetophenoneへの酸化反応である。ケトンを生体触媒の存在下で還元させてアルコール１−フェニルエタノール（1-phenylethanol）を得る際、生体触媒として灰色カビ病菌を用いた。灰色カビ病菌が触媒するのはacetophenoneから1-phenylethanolへの還元反応である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルコールを酸化させてケトンを得るケトンの製造方法、ケトンを還元させてアルコールを得るアルコールの製造方法およびそれらの製造方法に用いる生体触媒に関する。
【背景技術】
【０００２】
古くから、アルコールからケトンへの酸化およびケトンからアルコールへの還元が行なわれてきた。例えば、(二級)アルコールをケトンに酸化する方法として、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）−無水トリフルオロ酢酸を用いるSwern酸化があり、実用的な酸化法として広く利用されている。しかし、Swern酸化は低温条件で行わなければならない場合があり（−６０℃、−６０℃、−７８〜２５℃）、反応条件を厳しく設定しなければならなかった（各々、非特許文献１、２、３参照）。
【０００３】
一方、ケトンをアルコールに還元する方法はいくつかあるが、ラセミの二級アルコールを生成してしまうことになる（非特許文献４参照）。ここで、反応温度は８５℃以上である。キラルなアルコールを生成する反応もあるが、今度は反応条件が厳しくなり、−７８℃となる（非特許文献５参照）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上述したように、アルコールからケトンへの酸化およびケトンからアルコールへの還元は古くから行なわれてきたにもかかわらず、反応条件を厳しく設定しなければならないという問題があった。純有機合成化学においても不斉合成は、シャープレス教授により報告された不斉酸化反応（シャープレス酸化）、野依先生により発見された触媒還元系による不斉水素化（還元）反応（野依不斉水素化反応）など、ノーベル化学賞級の困難さがあるという問題があった。
【０００５】
そこで、本発明の目的は、上記問題を解決するためになされたものであり、アルコールからケトンへの酸化およびケトンからアルコールへの還元を穏和な反応条件下で行なうことができ、且つ穏和な反応条件下でキラルなアルコールを生成することができるケトンの製造方法、アルコールの製造方法および生体触媒を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
この発明のケトンの製造方法は、アルコールを生体触媒の存在下で酸化させ、ケトンを得ることを特徴とする。
【０００７】
ここで、この発明のケトンの製造方法において、前記生体触媒は植物のカルスとすることができる。
【０００８】
ここで、この発明のケトンの製造方法において、前記植物はリンゴ（Malus pumila）又はトウゴマとすることができる。
【０００９】
ここで、この発明のケトンの製造方法において、前記アルコールは１−フェニルエタノール（1-phenylethanol(rac.)）とし、前記ケトンはアセトフェノン（acetophenone）とすることができる。
【００１０】
この発明のアルコールの製造方法は、ケトンを生体触媒の存在下で還元させ、アルコールを得ることを特徴とする。
【００１１】
ここで、この発明のアルコールの製造方法において、前記生体触媒は灰色カビ病菌（Botrytis cinerea）とすることができる。
【００１２】
ここで、この発明のアルコールの製造方法において、前記ケトンはアセトフェノン（acetophenone）とし、前記アルコールは１−フェニルエタノール（1-phenylethanol）とすることができる。
【００１３】
この発明の生体触媒は、１−フェニルエタノール（1-phenylethanol(rac.)）を酸化してアセトフェノン（acetophenone）を得るための生体触媒であって、該生体触媒はリンゴ（Malus pumila）又はトウゴマのカルスであることを特徴とする。
【００１４】
ここで、この発明の生体触媒において、該生体触媒がリンゴ（Malus pumila）のカルスの場合、カルス化させるためのＭＳ（Murashige & Skoog）培地の成分に植物ホルモンとして２，４−ジクロロフェノキシ酢酸を１０μＭ及びカイネチンを１μＭ含むことができる。
【００１５】
この発明の生体触媒は、アセトフェノン（acetophenone）を還元して１−フェニルエタノール（1-phenylethanol）を得るための生体触媒であって、該生体触媒は灰色カビ病菌（Botrytis cinerea）であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のケトンの製造方法および生体触媒によれば、アルコールを生体触媒の存在下で酸化させ、ケトンを得ることができる。生体触媒としては植物のカルス、特にリンゴのカルスを用いる。植物のカルスとしてはトウゴマのカルスを用いてもよい。ここで、アルコールは1-phenylethanol(rac.)であり、ケトンはacetophenoneである。言い換えれば、上記リンゴのカルスは1-phenylethanol(rac.)を酸化してacetophenoneを得るための生体触媒であり、リンゴのカルス（酵素）が触媒するのは1-phenylethanol（基質）からacetophenone（生成物）への酸化反応となる。以上のように、化学反応の触媒となる生物自身が持つ酵素の働きを利用することにより、生物の細胞中で水を溶媒とし常温・常圧という温和（穏和）な条件下で、アルコールからケトンへの酸化を行なうことができるケトンの製造方法および生体触媒を提供することができるという効果がある。
【００１７】
本発明のアルコールの製造方法および生体触媒によれば、ケトンを生体触媒の存在下で還元させ、アルコールを得ることができる。生体触媒としては灰色カビ病菌（学名：Botrytis cinerea（B. cinerea））を用いる。ここで、ケトンはアセトフェノン（acetophenone）であり、アルコールは１−フェニルエタノール（1-phenylethanol）である。言い換えれば、上記灰色カビ病菌はacetophenoneを還元して1-phenylethanolを得るための生体触媒であり、灰色カビ病菌（酵素）が触媒するのはacetophenone（基質）から1-phenylethanol（生成物）への還元反応となる。以上のように、化学反応の触媒となる生物自身が持つ酵素の働きを利用することにより、生物の細胞中で水を溶媒とし常温・常圧という温和（穏和）な条件下で、ケトンからアルコールへの還元を行なうことができ、且つ穏和な反応条件下でキラルなアルコール（キラル化合物）を生成することができるアルコールの製造方法および生体触媒を提供することができるという効果がある。
【００１８】
さらに、細菌類（バクテリア）や真菌類（カビ）を用いることで安価なキラル化合物の製造につながり、反応の速度が速いことからキラル化合物の大量生産にもつながるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＭＳ固体培地上で培養したリンゴのカルスの写真を示す図である。
【図２】ＭＳ液体培地中で培養させたリンゴのカルスの写真を示す図である。
【図３】ＭＳ固体培地上で培養したトウゴマのカルスの写真を示す図である。
【図４】ＭＳ液体培地中で培養したトウゴマのカルスの写真を示す図である。
【図５】ＰＳＡ寒天培地上で培養させた灰色カビ病菌（B.cinerea）の写真を示す図である。
【図６】ＰＳ液体培地中で培養させた灰色カビ病菌の写真を示す図である。
【図７】acetophenoneの順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図８】acetophenoneのキラルカラムでの分析結果を示す図である。
【図９】1-phenylethanol(rac.)の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図１０】1-phenylethanol(rac.)のキラルカラムでの分析結果を示す図である。
【図１１】1-phenylethanolの（Ｒ）−体のキラルカラムでの分析結果を示す図である。
【図１２】1-phenylethanolの（Ｓ）−体のキラルカラムでの分析結果を示す図である。
【図１３】ＭＳ液体培地抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図１４】ＭＳ液体培地抽出物（1-phenylethanol添加）の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図１５】ＭＳ液体培地抽出物（acetophenone添加）のキラルカラムでの分析結果を示す図である。
【図１６】リンゴカルス抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図１７】リンゴカルス抽出物（1-phenylethanol(rac.)添加）の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図１８】リンゴカルスのみ抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図１９】リンゴカルスのみ抽出物（1-phenylethanol(rac.)添加）の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図２０】３日目のリンゴカルス抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図２１】３日目のリンゴカルス抽出物（1-phenylethano(rac.)添加）の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図２２】６日目のリンゴカルス抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図２３】６日目のリンゴカルス抽出物（1-phenylethano(rac.)添加）の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図２４】９日目のリンゴカルス抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図２５】９日目のリンゴカルス抽出物（1-phenylethano(rac.)添加）の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図２６】１２日目のリンゴカルス抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示図である。
【図２７】１２日目のリンゴカルス抽出物（1-phenylethano(rac.)添加）の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図２８】リンゴのカルスに1-phenylethanol(rac.)を添加して得られた経時変化の抽出物のＨＰＬＣの分析結果のプロットを示す図である。
【図２９】６日目のリンゴカルス抽出物（1-phenylethano(rac.)添加）と標品acetophenoneとを混ぜ、double injectionを行った結果の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図３０】菌なし液体培地抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図３１】菌なし液体培地抽出物（1-phenylethanol(rac.)添加）の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図３２】菌あり液体培地抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図３３】菌あり液体培地抽出物（1-phenylethanol(rac.)添加）の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図３４】菌ありＰＳ液体培地抽出物（acetophenone添加）のキラルカラムでのＨＰＬＣ分析結果を示す図である。
【図３５】菌体のみ抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図３６】菌体のみ抽出物（1-phenylethanol(rac.)添加）の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図３７】菌体のみ抽出物（acetophenone添加）のキラルカラムでのＨＰＬＣ分析結果を示す図である。
【図３８】０日目の灰色カビ病菌抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図３９】０日目の灰色カビ病菌抽出物（acetophenone添加）のキラルカラムでの分析結果を示す図である。
【図４０】１日目の灰色カビ病菌抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図４１】１日目の灰色カビ病菌抽出物（acetophenone添加）のキラルカラムでの分析結果を示す図である。
【図４２】２日目の灰色カビ病菌抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図４３】２日目の灰色カビ病菌抽出物（acetophenone添加）のキラルカラムでの分析結果を示す図である。
【図４４】灰色カビ病菌にacetophenoneを添加して得られた経時変化の抽出物のＨＰＬＣの分析結果のプロットを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、各実施例について図面を参照して詳細に説明する。
【実施例１】
【００２１】
１−１．発明の概要
本発明者等は、上述した従来のアルコールからケトンへの酸化およびケトンからアルコールへの還元における反応条件を厳しく設定しなければならないという課題を解決するべく鋭意研究を行なった。その結果、リンゴ（学名：Malus pumila、セイヨウリンゴ）およびトウゴマ（学名：Ricinus communis、ヒマ（蓖麻））の組織培養、またはワイン等に使用されているリンゴ灰色カビ病菌（学名：Botrytis cinerea（B. cinerea）、以下、「灰色カビ病菌」と略す。）等の生体触媒を利用して有機合成に応用できることを見出し、アセトフェノン（acetophenone）と１−フェニルエタノール（1-phenylethanol(rac.)）とを用いて酸化還元反応を試みた。本発明者等とは異なるアプローチを行なった関連する文献を非特許文献６〜９に示す。本実施例１では、まず酵素の特徴について概略を述べ、次にリンゴおよびトウゴマの組織培養、灰色カビ病菌の培養について説明する。酸化還元反応に関しては実施例２以降で説明する。
【００２２】
１−２．酵素の特徴
自然界には様々な生物が存在し、それらが生きていくために生物は自身の体内で様々な物質を生成する。これを“生合成”といい、一般の化学合成ではできにくい反応も、生物の細胞中で、水を溶媒として、常温・常圧という温和（穏和）な条件で必要なものだけを生成する化学反応である。このように効率的に化学反応を進めるためには、化学反応の触媒となる生物自身が持つ酵素の働きが不可欠である。
【００２３】
その酵素とは、生物の生体内反応における触媒として働く物質であり、様々な種類がある。１つの化合物が生合成されるには１つだけの酵素ではなく、酸化還元酵素、転移酵素、合成酵素、加水分解酵素等の数多くの酵素が関係し、多数の反応の段階を踏むことが一般的に知られている。
【００２４】
さらに酵素の特徴として反応特異性と基質特異性がある。通常酵素が触媒する反応は1つだけであり、異なった反応には別の酵素が必要である。また反応に関わる基質が酵素に応じて決まっており、異なった基質には別の酵素が用意される（非特許文献１０〜１４参照）。
【００２５】
以下、リンゴおよびトウゴマの組織培養、灰色カビ病菌の培養について順に説明する。
【００２６】
１−３−１．組織培養について
植物をカルス（callus）化させるめに、ＭＳ（Murashige＆Skoog）培地を作成してカルスの誘導、液体振とう培養に用いた。表1〜４に詳しいＭＳ培地の成分構成を示す（非特許文献１５参照）。表１、３でＭはモル濃度（１mol/L）である。
【００２７】
＜ MS培地の成分構成（１L中）＞
１．無機栄養素
【表１】
【００２８】
２．有機栄養素
【表２】
【００２９】
３．植物ホルモン
【表３】
【００３０】
４．支持材料
固体培地を作成するときに用いる。全量の０．８％（ｇ）を添加する。
【表４】
【００３１】
以上の成分が含まれている。ＭＳ培地を作製するときは、実験毎に各物質を秤量して培地を作る手間を省くため、あらかじめ上記の成分を数種類溶かした高濃度の貯蔵液、ＭＳ基本液（無機栄養素）、Ｆｅ−ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）液、Vitamine液（有機栄養素）の３種を調合し、それらを添加してＭＳ培地を作製する。作製方法を以下に示す。
【００３２】
ＭＳ培地の作製．
（１）ビーカーに蒸留水１００ｍｌを入れ、マグネチックスターラーで撹拌しながら、ＭＳ基本液２０ｍｌ、Ｆｅ−ＥＤＴＡ液１ｍｌ、Vitamine液０．２ｍｌ、植物ホルモンである２，４-ジクロロフェノキシ酢酸を１０μＭ、カイネチンを１μＭになるように添加する。
（２）ｐＨメーターで培地のｐＨをＮａＯＨ、ＨＣｌで５．７〜５．８に調整する。
（３）蒸留水で２００ｍｌに調整する。（固体培地では寒天を全体積量の０．８％加え、液体培地では加えずにそのまま用いる。)
（４）１００ｍｌ三角フラスコに２０ｍｌずつ入れて（分注）、キャップする。
（５）１００ｍｌ三角フラスコをオートクレーブ（圧力滅菌釜）にかけて滅菌し（好適には１２１℃、２気圧、１５〜２０分）、冷暗所（例えば冷蔵庫）に保存する。
【００３３】
１−３−２．リンゴのカルス化について．
図１は、ＭＳ固体培地上で培養したリンゴのカルスの写真を示す。図１において、符号１は１００ｍｌ三角フラスコ、５はＭＳ寒天培地（固体培地）、１０はリンゴの新芽である。エタノールおよび次亜塩素酸を用いて滅菌したリンゴの新芽１０を切り分け、それをＭＳ寒天培地５上にのせ、カルス誘導させた。
【００３４】
１−３−３．リンゴのカルスの液体培養について．
図２は、ＭＳ液体培地中で培養させたリンゴのカルスの写真を示す。図２で図１と同じ符号を付した箇所は同じ要素を示すため、説明は省略する。図２において、符号６はＭＳ液体培地である。ＭＳ固体培地５で培養させ、安定したリンゴのカルスを細かく刻み、ＭＳ液体培地６（２０ｍｌ）に入れて、２０℃で３日間振とう暗培養させた。
【００３５】
１−３−４．トウゴマのカルス化について
図３は、ＭＳ固体培地上で培養したトウゴマのカルスの写真を示す。図３で図１と同じ符号を付した箇所は同じ要素を示すため、説明は省略する。図３において、符号１１はトウゴマの根である。エタノールおよび次亜塩素酸を用いて滅菌したトウゴマの根１１を切り分け、それをＭＳ寒天培地５上にのせ、カルス誘導させた。
【００３６】
１−３−５．トウゴマのカルスの液体培養について
図４は、ＭＳ液体培地中で培養したトウゴマのカルスの写真を示す。図４で図２と同じ符号を付した箇所は同じ要素を示すため、説明は省略する。ＭＳ固体培地５上で培養させ、安定したトウゴマのカルスを細かく刻み、ＭＳ液体培地６（４０ｍｌ）に入れて、２０℃で３日間振とう暗培養（暗室の振とう器の上で暗培養）させた。
【００３７】
１−４−１．使用した植物病原菌について
＜灰色カビ病菌＞
灰色カビ病菌は不完全菌類という真菌類の一種である。体細胞分裂によって形成される無隔壁の分生胞子により増殖する。胞子から菌糸を伸ばして増えることから糸状菌としても分類されている。
【００３８】
１−４−２．灰色カビ病菌の培養について
植物病原菌を培養するのにＰＳＡ（Potate Scrose Agar）培地を用いた。以下にＰＳＡ（液体）培地の材料および作り方を示す。
【００３９】
ＰＳＡ培地の材料ａ〜ｄ
ａ．皮をむいたジャガイモ・・・４００g
ｂ．スクロース・・・・・・・・４０g
ｃ．寒天・・・・・・・・・・・４０g
ｄ．蒸留水・・・・・・・・・・２L
【００４０】
ＰＳＡ培地の作り方
（１）５Ｌの三角フラスコに２Ｌの蒸留水ｄと皮をむいたジャガイモａとを入れる。
（２）上記５Ｌの三角フラスコにアルミホイルで蓋をし、コッホ釜に入れて１時間蒸す。
（３）別の５Lの三角フラスコにスクロースｂを入れ、さらにガーゼでろ過した（２）を入れる。
（４）上記別の５Lの三角フラスコをよく攪拌し、スクロースｂを溶かす。
（５）（４）の溶液が熱いうちに寒天ｃを少しずつ加え、よく振り混ぜる。
（６）寒天ｃを溶かすために、上記別の５Ｌの三角フラスコをアルミホイルで蓋をし、コッホ釜に入れて３０分蒸す。
（７）（６）を５００ｍｌの三角フラスコに分け、アルミホイルで蓋をし、オートクレープにかけて滅菌する。
【００４１】
図５は、ＰＳＡ寒天培地上で培養させた灰色カビ病菌の写真を示す。図５において、符号２はシャーレ、７はＰＳＡ寒天培地、１２は灰色カビ病菌である。上記のように作製したＰＳＡ寒天培地７をクリーンベンチ（登録商標）内でシャーレ２に流し固め、そこに白金線を使って灰色カビ病菌１２の菌体をのせる。菌糸および胞子を十分に成長させるまで２０℃で明培養させた。
【００４２】
１−４−３．灰色カビ病菌の液体培養について
植物病原菌を培養するのにＰＳ（Potato Scrose）液体培地を用いた。以下にＰＳ液体培地の材料および作り方を示す。
【００４３】
ＰＳ液体培地の材料
ａ．皮をむいたジャガイモ・・・１００g
ｂ．スクロース・・・・・・・・１０g
ｄ．蒸留水・・・・・・・・・・５００ｍｌ
【００４４】
ＰＳ液体培地の作り方
（１）３Ｌの三角フラスコに５００ｍｌの蒸留水ｄと皮をむいたジャガイモａとを入れる。
（２）上記３Ｌの三角フラスコにアルミホイルで蓋をし、コッホ釜に入れて１時間蒸す。
（３）別の５００ｍｌの三角フラスコにスクロースｂを入れ、さらにガーゼでろ過した（２）を入れる。
（４）上記別の５００ｍｌの三角フラスコをよく攪拌し、スクロースｂを溶かす。
（５）（４）を１００ｍｌの三角フラスコに２０ｍｌずつ分け、アルミホイルで蓋をし、オートクレープにかけて滅菌する。
【００４５】
図６は、ＰＳ液体培地中で培養させた灰色カビ病菌の写真を示す。図６で図１および５と同じ符号を付した箇所は同じ要素を示すため、説明は省略する。図６において、符号８はＰＳ液体培地である。上記のように作製したＰＳ液体培地８に、クリーンベンチ（登録商標）内で白金線を使ってＰＳＡ寒天培地７で培養させた灰色カビ病菌１２をＰＳＡ寒天培地７から菌体および胞子をそぎ取り、ＰＳ液体培地８（２０ｍｌ）に入れて、２０℃で５日間振とう暗培養させた。
【００４６】
１−５．添加した基質について
以下の実施例２以降で説明する今回の実験で用いた基質はacetophenoneと１-phenylethanol(rac.)との２つであり、以下の式１および２に示す。式１に示されるようにacetophenoneのモル質量（ＭＷ）は１２０ｇ／ｍｏｌであり、式２に示されるように１-phenylethanol(rac.)のモル質量（ＭＷ）は１２２ｇ／ｍｏｌである。
【００４７】
【化１】
【００４８】
上記２つの基質を植物カルスまたは植物病原菌に添加するときは、液体培地６等中の基質の濃度が１.０×１０−４Mになるように添加した。
【００４９】
ＨＰＬＣ（High Performance Liquid Chromatography）において使用したカラムは、順相カラム（ＨＰＬＣ GL-PACK LiChlosorb（登録商標）Si 60、 粒径５μｍ、４．０×２５０ｍｍ）とキラルカラム（CHIRALPAK（登録商標）AD-H、０．４６ｃｍφ×２５ｃｍＬ）とを用いた。ＨＰＬＣにて分析する際に使用した展開溶媒（溶離液）は、順相カラムではhexane／2-propanol＝４０／１を用い、キラルカラムではhexane／ethanol＝９９／１を用いた。ＨＰＬＣシステムの他の構成装置（脱気装置、ポンプ、インジェクタ、カラム恒温槽、検出器、データ処理器等）については通常用いられる装置、例えば検出器なら紫外（Ultra Violet : ＵＶ）検出器等、を使用した。
【００５０】
次に、acetophenone、1-phenylethanol(rac.)および1-phenylethanolの２つのキラル化合物のＨＰＬＣの分析結果を図７〜図１２に示す。図７〜図１２で横軸は時間（分）、縦軸は電圧（ｍＶ）である（以下、ＨＰＬＣの分析結果を示す図において同様である）。
【００５１】
図７は、acetophenoneの順相カラムでの分析結果を示す。図７に示されるように、標品acetophenone（５μｌ）の順相カラムでの保持時間は約１１分であった。図８は、acetophenoneのキラルカラムでの分析結果を示す。図８に示されるように、標品acetophenone（５μｌ）のキラルカラムでの保持時間は約２３分であった。
【００５２】
図９は、1-phenylethanol(rac.)の順相カラムでの分析結果を示す。図９に示されるように、標品1-phenylethanol(rac.)（５μｌ）の順相カラムでの保持時間は約２３分であった。図１０は、1-phenylethanol(rac.)のキラルカラムでの分析結果を示す。図１０に示されるように、標品1-phenylethanol(rac.)（５μｌ）のキラルカラムでの保持時間は、初めのピークが約５０分であり、次のピークが約５５分であった。
【００５３】
図１１は、1-phenylethanolの（Ｒ）-体のキラルカラムでの分析結果を示す。図１１に示されるように、（Ｒ）-1-phenylethanol（５μｌ）のキラルカラムラムでの保持時間は約５０分であった。図１２は、1-phenylethanolの（Ｓ）−体のキラルカラムでの分析結果を示す。図１２に示されるように、（Ｓ）−1-phenylethanol（５μｌ）のキラルカラムでの保持時間は約５５分であった。
【００５４】
以上説明したように、本発明の実施例１では、まず酵素の特徴について概略を述べた。次に、リンゴおよびトウゴマの組織培養に関し、MＳ培地の成分構成（１L中）およびその作製について説明した。灰色カビ病菌の培養に関し、ＰＳ液体培地の材料および作製について説明した。今回の実験で用いた２つの基質、acetophenoneと１-phenylethanol(rac.)とについて示し、ＨＰＬＣにおいて使用した順相カラムおよびキラルカラムについて説明した。最後に、acetophenone、1-phenylethanol(rac.)および1-phenylethanolの２つのキラル化合物のＨＰＬＣの分析結果を図７〜図１２に示した。標品acetophenone（５μｌ）の順相カラムでの保持時間は約１１分、キラルカラムでの保持時間は約２３分であった。標品1-phenylethanol(rac.)（５μｌ）の順相カラムでの保持時間は約２３分、キラルカラムでの保持時間は、初めのピークが約５０分であり、次のピークが約５５分であった。（Ｒ）-1-phenylethanol（５μｌ）のキラルカラムでの保持時間は約５０分、（Ｓ）-1-phenylethanol（５μｌ）のキラルカラムでの保持時間は約５５分であった。
【実施例２】
【００５５】
実施例２では、アルコールを生体触媒の存在下で酸化させ、ケトンを得るケトンの製造方法について説明する。生体触媒としては植物のカルス、特にリンゴ（Malus pumila）のカルスを用いる。ここで、アルコールは１−フェニルエタノール（1-phenylethanol(rac.)）であり、ケトンはアセトフェノン（acetophenone）である。言い換えれば、上記リンゴのカルスは1-phenylethanol(rac.)を酸化してacetophenoneを得るための生体触媒であり、リンゴのカルス（酵素）が触媒するのは1-phenylethanol（基質）からacetophenone（生成物）への酸化反応となる。実施例１（表４）で説明したように、カルス化させるためのＭＳ培地の成分に植物ホルモンとして２，４−ジクロロフェノキシ酢酸を１０μＭおよびカイネチンを１μＭ含む。
【００５６】
２−１．基質の添加について
クリーンベンチ（登録商標）内で、３日間ＭＳ液体培地中で振とう暗培養させたリンゴのカルスに、基質と反応しやすくするため界面活性剤としてTriton（登録商標）X-100を２０μｌ添加する。次によく振り混ぜた後に、acetophenoneおよび1-phenylethanol(rac.)をそれぞれ別々のリンゴのカルスに２２μｌ添加した。添加後、２０℃で振とう暗培養させた。経時変化として、３日目、６日目、９日目、１２日目に１ｍｌ抽出した。総抽出は１４日目に行った。
【００５７】
対称として、リンゴのカルスを入れていないＭＳ液体培地にも界面活性剤および基質を添加し、２０℃で振とう暗培養させ、経時変化を取らずに総抽出のみ行った。
【００５８】
２−２．基質添加後の培養条件について
基質を添加した後、クリーンルーム内で、２０℃で振とう暗培養させた。
【００５９】
２−３．抽出について
３日目、６日目、９日目、１２日目の経時変化では１ｍｌだけフラスコから取り、ヘキサンを用いて抽出した。１４日目の培養後の総抽出ではエーテルを用いて抽出した。細胞部はホモジナイザーを用いて、エーテルで抽出した。以下に抽出の操作を示す。
【００６０】
＜１ｍｌ抽出の操作＞
（１）クリーンベンチ（登録商標）内で、液体培地をねじ口試験管にマイクロピペットで１ｍｌ取る。
（２）液体培地にエーテルを１ｍｌ加え、２００回ボルテックスにかける（ボルテックスミキサーで撹拌する。以下同様）。
（３）遠心機にかけて有機相、水相を分離させる。
（４）パスツールピペット（以下、「パスツール」と省略）で別なねじ口試験管に有機相を移す。
（５）（２）、（３）および（４）の操作を合計で４回行う。
（６）有機相が入ったねじ口試験管に蒸留水を１ｍｌ入れ、２０回ボルテックスにかける。
（７）パスツールで水相を取り除く。
（８）（６）および（７）の操作を合計で２回行う。
（９）有機相に無水硫酸マグネシウムを舞うまで入れ、２〜３時間脱水させる。
（１０）脱水させた後に、セライトろ過をする。
（１１）遠心エバポレーターで１ｍｌまで濃縮する。その後、ＨＰＬＣにて分析する。
【００６１】
＜総抽出の操作＞
（１）３００ｍｌの分液ロートにロートとメッシュを設置し、カルスが入らないように液体培地のみを入れる。
（２）液体培地にエーテルを３０ｍｌ入れ、１０、２０、２０、５０、１００、１００回と、分液ロートのコックを開けながら分液ロートを振る。
（３）分液ロートを４０分静置し、静置した後に水相（液体培地）を１００ｍｌの分液ロートに落とす。
（４）液体培地にエーテルを２０ｍｌ入れ、分液ロートを３００回振り、３０分静置する。
（５）分液ロートを静置した後に、水相を三角フラスコに落とし、有機相を３００ｍｌの分液ロートに入れる。
（６）水相を再び１００ｍｌの分液ロートに入れ、（３）、（４）および（５）の操作を合計で４回行う。
（７）有機相を溜めた３００ｍｌの分液ロートに飽和食塩水を３０ｍｌ入れ、３０回振り、４０分静置する。
（８）分液ロートを静置した後に、水相を落とし、有機相をスリ付きの三角フラスコに入れる。
（９）有機相を入れた三角フラスコに、無水硫酸マグネシウムを舞うまで入れ、一晩脱水させる。
（１０）脱水させた後に、セライトろ過をし、単蒸留で濃縮する。その後、ＨＰＬＣにて分析する。
【００６２】
＜細胞部の抽出操作＞
（１）総抽出で液体培地と分けたカルスをホモジナイザーに入れる。
（２）カルスにエーテルを５ｍｌ加えて、ホモジナイザーですり潰しながら抽出する。
（３）パスツールで溶液を１００ｍｌの分液ロートに移す。
（４）（２）、（３）の操作を合計で５回行う。
（５）溶液を溜めた分液ロートに、飽和食塩水を２０ｍｌ入れ、３０回振り、４０分静置する。
（６）分液ロートを静置した後に、水相を落とし、有機相をスリ付きの三角フラスコに入れる。
（７）有機相を入れた三角フラスコに、無水硫酸マグネシウムを舞うまで入れ、一晩脱水させる。
（８）脱水させた後に、セライトろ過をし、単蒸留で濃縮し、ＨＰＬＣにて分析する。
【００６３】
２−４．結果
１．総抽出した抽出物のＨＰＬＣの結果
（１）カルスを入れていないＭＳ液体培地に基質を添加した培地の抽出物（液体培地抽出物）のＨＰＬＣの結果
図１３は、ＭＳ液体培地抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す。図１３に示されるように、保持時間約１１分のピーク（図７に示される順相カラムでの保持時間約１１分のacetophenoneのピーク）はほとんど出現せず、保持時間約２３分のピーク（図９に示される順相カラムでの保持時間約２３分の1-phenylethanolのピーク）が出現した。これはコンタミネーションし、カビによって1-phenylethanolが生成したと考えられる。図１４は、ＭＳ液体培地抽出物（1-phenylethanol添加）の順相カラムでの分析結果を示す。図１４に示されるように、順相カラムでの保持時間約２３分の1-phenylethanolのピークが出現した。発明者らは、更に（Ｒ）-体、（Ｓ）-体の両者を生成していたことをキラルカラムで確認した。図１５は、ＭＳ液体培地抽出物（acetophenone添加）のキラルカラムでの分析結果を示す。図１５に示されるように、（Ｒ）-体（保持時間約５０分の最初のピーク）の方が（Ｓ）-体（保持時間約５５分の２つ目のピーク）より大きいことがわかる。発明者らは、ＭＳ液体培地にacetophenoneを添加する実験を再度行い、ＭＳ液体培地とacetophenoneが反応しないこと、つまりコンタミネーションを起こさなければ図１３に示されるようにはならないことを確認した。
【００６４】
（２）リンゴのカルスを入れたＭＳ液体培地に基質を添加した培地の抽出物（リンゴカルス抽出物）のＨＰＬＣの結果
図１６は、リンゴカルス抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す。図１６に示されるように、順相カラムでの保持時間約１１分のacetophenoneのピークが出現した。保持時間約２３分の小さいピークに関しては、おそらくリンゴのカルスでは酸化反応のみが起こり、acetophenoneを添加しても反応しない筈であるため、コンタミネーションしたと思われる。図１７は、リンゴカルス抽出物（1-phenylethanol(rac.)添加）の順相カラムでの分析結果を示す。図１７に示されるように、順相カラムでの保持時間約１１分の小さいacetophenoneのピークが見られ、順調に酸化反応が起こったことがわかる。しかし、経時変化の結果より９日目から１２日目ぐらいにコンタミネーションしたため、acetophenoneが1-phenylethanolに戻ったことが、経時変化で得た抽出物の分析結果よりわかった。
【００６５】
（３）基質を添加したリンゴのカルスの細胞部を磨り潰し抽出した抽出物（リンゴカルスのみ抽出物）のＨＰＬＣの結果
図１８は、リンゴカルスのみ抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す。図１８に示されるように、順相カラムでの保持時間約２３分の1-phenylethanolのピークが見られなかった。この結果より、リンゴのカルスとacetophenoneとが反応しないことがわかった。図１９は、リンゴカルスのみ抽出物（1-phenylethano(rac.)添加）の順相カラムでの分析結果を示す。図１９に示されるように順相カラムでの保持時間約１１分の小さいacetophenoneのピークが見られるため、ＭＳ液体培地の場合（図１７）と同様に、細胞部でもacetophenoneの生成があるということがわかった。
【００６６】
２．経時変化
（１）３日目の抽出物のＨＰＬＣの結果
図２０は、３日目のリンゴカルス抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す。図２０に示されるように、順相カラムでの保持時間約１１分のacetophenoneのピークが出現している。図２１は、３日目のリンゴカルス抽出物（1-phenylethano(rac.)添加）の順相カラムでの分析結果を示す。図２１に示されるように、保持時間約２５分に順相カラムでの1-phenylethanolのピークが出現しており、順相カラムでの保持時間約１１分のacetophenoneの小さいピーク（丸印Ａで示す。）が出現しているため、acetophenoneが少し生成されていることがわかる。
【００６７】
（２）６日目の抽出物のＨＰＬＣの結果
図２２は、６日目のリンゴカルス抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す。図２２に示されるように、順相カラムでの保持時間約１１分のacetophenoneのピークが出現している。図２３は、６日目のリンゴカルス抽出物（1-phenylethano(rac.)添加）の順相カラムでの分析結果を示す。図２３に示されるように、順相カラムでの保持時間約２３（〜２４）分の1-phenylethanolのピークが出現している。図２３と図２１（３日目）とを比較すると、順相カラムでの保持時間約１１分のacetophenoneのピーク（丸印Ａで示す。）が大きくなっていることがわかる。
【００６８】
（３）９日目の抽出物のＨＰＬＣの結果
図２４は、９日目のリンゴカルス抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す。図２４に示されるように、順相カラムでの保持時間約１１分のacetophenoneのピークが出現している。図２５は、９日目のリンゴカルス抽出物（1-phenylethano(rac.)添加）の順相カラムでの分析結果を示す。図２５に示されるように、順相カラムでの保持時間約２３（〜２４）分の1-phenylethanolのピークが小さくなり、図２５と図２３（６日目）とを比較すると、順相カラムでの保持時間約１１分のacetophenoneのピークがかなり大きくなっていることがわかる。以上より、1-phenylethanol(rac.)がacetophenoneに変換されたということがわかる。
【００６９】
（４）１２日目の抽出物のＨＰＬＣの結果
図２６は、１２日目のリンゴカルス抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す。図２６に示されるように、順相カラムでの保持時間約１１分のacetophenoneのピークが出現している。順相カラムでの保持時間約２３分の1-phenylethanolのピークと思われるピークが少し見られるが、これはおそらくコンタミネーションが原因だと思われる。図２７は、１２日目のリンゴカルス抽出物（1-phenylethano(rac.)添加）の順相カラムでの分析結果を示す。図２７と図２５（９日目）とを比較すると（scaleの相違は除く）、コンタミネーションしたため順相カラムでの保持時間約１１分のacetophenoneのピークが小さくなり、順相カラムでの保持時間約２３分の1-phenylethanolのピークが大きくなった。
【００７０】
図２８は、以上のＨＰＬＣの結果より、リンゴのカルスに1-phenylethanol(rac.)を添加して得られた経時変化の抽出物のＨＰＬＣの分析結果のプロットを示す。図２８で横軸は経過時間（日）であり、縦軸はリンゴのカルスが入っていないＭＳ液体培地に1-phenylethanol(rac.)を添加して抽出したＭＳ液体培地抽出物のＨＰＬＣの分析結果に示される1-phenylethanolのピーク（図１４参照）面積を１００％として考えた場合における、各経過日のリンゴのカルスが入ったＭＳ液体培地抽出物のＨＰＬＣの分析結果に示されるacetopheone および1-phenylethanolのピーク（図２１、２３、２５、２７等参照）面積比（％）である。表５は、図２８に示されるリンゴのカルスに1-phenylethanol(rac.)を添加して得られた経時変化の抽出物のＨＰＬＣの分析結果を数値で示す。
【００７１】
【表５】
【００７２】
図２８に示されるように、1-phenylethanolのピーク（図１４参照）面積（１００％）に対し、acetopheoneのピーク面積の比（％）は四角印で表し、1-phenylethanolのピーク面積の比（％）は三角印で表して、３日目から１４日目までのリンゴのカルスが入ったＭＳ液体培地抽出物のＨＰＬＣの各分析結果に基づきプロットした。図２８のプロットした結果に示されるように、９日目までは順調にリンゴのカルスによって1-phenylethanol
(rac.) が酸化されてacetopheoneを生成していた。しかし９日目から１２日目の間にコンタミネーションしたことで、acetophenoneの生成から1-phenylethanolの生成へと変化したことがわかった。
【００７３】
３．1-phenylethanol(rac.)を添加した６日目の抽出物と標品のdouble injectionのＨＰＬＣの結果
経時変化として得た６日目のリンゴカルス抽出物（1-phenylethano(rac.)添加）(図１７参照)と標品acetophenone（図７参照）とを混ぜ、double injectionを行った。図２９は、６日目のリンゴカルス抽出物（1-phenylethano(rac.)添加）と標品acetophenoneとを混ぜ、double injectionを行った結果の順相カラムでの分析結果を示す。図２９に示されるように、順相カラムでの保持時間約１１分のacetophenoneのピークが大きくなった。標品acetophenoneを添加してピークがずれないことから、混ぜる前のピークがacetophenoneであることがわかった。double injectionによる同定である。この結果より、リンゴのカルスに1-phenylethanol(rac.)を添加するとacetophenoneが生成するということがわかった。
【００７４】
２−５．考察
以上の結果より、リンゴのカルスは酸化反応を起こすということがわかった。そして、コンタミネーションの原因であるカビが還元反応を起こすということもわかった。リンゴのカルスによって起きた反応を以下の式３に示す。式３で「Jonagold」はりんごの品種である。
【００７５】
【化２】
【００７６】
上記式２の反応はおそらくリンゴのカルスの細胞の中で起こっていると考えられる。経時変化ではＭＳ液体培地をできるだけリンゴのカルスを吸わないようにしてマイクロピペットで取った。ＭＳ液体培地中では常に添加した基質の濃度が一定となるはずだが、経時変化における添加した基質のピークの高さを見ると、ピークの高さが一定ではないことが見てわかる。ゆえに、リンゴのカルスは一度添加した基質を取り込み、細胞内で酸化反応を起こし、ＭＳ液体培地中に生成物をリリースしたということが言える。
【００７７】
以上のように、本発明の実施例２によれば、アルコールを生体触媒の存在下で酸化させ、ケトンを得ることができる。生体触媒としては植物のカルス、特にリンゴのカルスを用いる。ここで、アルコールは1-phenylethanol(rac.)であり、ケトンはacetophenoneである。言い換えれば、上記リンゴのカルスは1-phenylethanol(rac.)を酸化してacetophenoneを得るための生体触媒であり、リンゴのカルス（酵素）が触媒するのは1-phenylethanol（基質）からacetophenone（生成物）への酸化反応となる。以上のように、化学反応の触媒となる生物自身が持つ酵素の働きを利用することにより、生物の細胞中で水を溶媒とし常温・常圧という温和（穏和）な条件下で、アルコールからケトンへの酸化を行なうことができるケトンの製造方法および生体触媒を提供することができる。
【実施例３】
【００７８】
実施例３では、アルコールを生体触媒の存在下で酸化させ、ケトンを得る別のケトンの製造方法について説明する。生体触媒としては植物のカルス、特にトウゴマのカルスを用いる。ここで、アルコールは１−フェニルエタノール（1-phenylethanol(rac.)）であり、ケトンはアセトフェノン（acetophenone）である。言い換えれば、上記トウゴマのカルスは1-phenylethanol(rac.)を酸化してacetophenoneを得るための生体触媒であり、トウゴマのカルス（酵素）が触媒するのは1-phenylethanol（基質）からacetophenone（生成物）への酸化反応となる。
【００７９】
３−１．基質の添加について
クリーンベンチ（登録商標）内で、３日間適切な量のＭＳ液体培地中で振とう暗培養させたトウゴマのカルスに、基質と反応しやすくするため界面活性剤としてTriton（登録商標）X-100を２０μｌ添加する。次によく振り混ぜた後に、1-phenylethanol(rac.)をトウゴマのカルスに２２μｌ添加した。添加後、２０℃で振とう暗培養させた。経時変化として、７日目、１４日目に１ｍｌ抽出した。総抽出は２１日目に行った。
【００８０】
３−２．基質添加後の培養条件について
基質を添加した後、クリーンルーム内で、２０℃で振とう暗培養させた。
【００８１】
３−３．抽出について
７日目、１４日目の経時変化では１ｍｌだけフラスコから取り、エーテルを用いて抽出した。２１日目の培養後の総抽出でもエーテルを用いて抽出した。細胞部はホモジナイザーを用いて、エーテルで抽出した。以下、実施例２のリンゴのカルスと同様であるが、抽出の操作を示す。
【００８２】
＜１ｍｌ抽出の操作＞
（１）クリーンベンチ（登録商標）内で、液体培地をねじ口試験管にマイクロピペットで１ｍｌ取る。
（２）液体培地にエーテルを１ｍｌ加え、２００回ボルテックスにかける。
（３）遠心機にかけて有機相、水相を分離させる。
（４）パスツールで別なねじ口試験管に有機相を移す。
（５）（２）、（３）および（４）の操作を合計で４回行う。
（６）有機相が入ったねじ口試験管に蒸留水を１ｍｌ入れ、２０回ボルテックスにかける。
（７）パスツールで水相を取り除く。
（８）（６）および（７）の操作を合計で２回行う。
（９）有機相に無水硫酸マグネシウムを舞うまで入れ、２〜３時間脱水させる。
（１０）脱水させた後に、セライトろ過をする。
（１１）遠心エバポレーターで１ｍｌまで濃縮する。その後、ＨＰＬＣにて分析する。
【００８３】
＜総抽出の操作＞
（１）３００ｍｌの分液ロートにロートとメッシュを設置し、カルスが入らないように液体培地のみを入れる。
（２）液体培地にエーテルを３０ｍｌ入れ、１０、２０、２０、５０、１００、１００回と、分液ロートのコックを開けながら分液ロートを振る。
（３）分液ロートを４０分静置し、静置した後に水相（液体培地）を１００ｍｌの分液ロートに落とす。
（４）液体培地にエーテルを２０ｍｌ入れ、分液ロートを３００回振り、３０分静置する。
（５）分液ロートを静置した後に、水相を三角フラスコに落とし、有機相を３００ｍｌの分液ロートに入れる。
（６）水相を再び１００ｍｌの分液ロートに入れ、（３）、（４）および（５）の操作を合計で４回行う。
（７）有機相を溜めた３００ｍｌの分液ロートに飽和食塩水を３０ｍｌ入れ、３０回振り、４０分静置する。
（８）分液ロートを静置した後に、水相を落とし、有機相をスリ付きの三角フラスコに入れる。
（９）有機相を入れた三角フラスコに、無水硫酸マグネシウムを舞うまで入れ、一晩脱水させる。
（１０）脱水させた後に、セライトろ過をし、単蒸留で濃縮する。その後、ＨＰＬＣにて分析する。
【００８４】
＜細胞部の抽出操作＞
（１）総抽出で液体培地と分けたカルスをホモジナイザーに入れる。
（２）カルスにエーテルを５ｍｌ加えて、ホモジナイザーですり潰しながら抽出する。
（３）パスツールで溶液を１００ｍｌの分液ロートに移す。
（４）（２）、（３）の操作を合計で５回行う。
（５）溶液を溜めた分液ロートに、飽和食塩水を２０ｍｌ入れ、３０回振り、４０分静置する。
（６）分液ロートを静置した後に、水相を落とし、有機相をスリ付きの三角フラスコに入れる。
（７）有機相を入れた三角フラスコに、無水硫酸マグネシウムを舞うまで入れ、一晩脱水させる。
（８）脱水させた後に、セライトろ過をし、単蒸留で濃縮し、ＨＰＬＣにて分析する。
【００８５】
３−４．結果
総抽出した抽出物のＨＰＬＣの結果、トウゴマのカルスで行った基質転換での経時変化で得た抽出物のＨＰＬＣの結果については省略する。
【００８６】
３−５．考察
トウゴマのカルスを使った基質転換の実験でわかったことは、液体培地の量に対して適切な量のトウゴマのカルスを用いると、トウゴマのカルスと基質とが反応しやすくなるということである。これは、基質とトウゴマのカルスの衝突率を低くしないために必要であると考えられる。
【００８７】
以上のように、本発明の実施例３によれば、アルコールを生体触媒の存在下で酸化させ、ケトンを得ることができる。生体触媒としては植物のカルス、特にトウゴマのカルスを用いる。ここで、アルコールは1-phenylethanol(rac.)であり、ケトンはacetophenoneである。言い換えれば、上記トウゴマのカルスは1-phenylethanol(rac.)を酸化してacetophenoneを得るための生体触媒であり、トウゴマのカルス（酵素）が触媒するのは1-phenylethanol（基質）からacetophenone（生成物）への酸化反応となる。以上のように、化学反応の触媒となる生物自身が持つ酵素の働きを利用することにより、生物の細胞中で水を溶媒とし常温・常圧という温和（穏和）な条件下で、アルコールからケトンへの酸化を行なうことができる別のケトンの製造方法および生体触媒を提供することができる。
【実施例４】
【００８８】
実施例４では、ケトンを生体触媒の存在下で還元させ、アルコールを得るアルコールの製造方法について説明する。生体触媒としては灰色カビ病菌（学名：Botrytis cinerea（B.
cinerea））を用いる。ここで、ケトンはアセトフェノン（acetophenone）であり、アルコールは１−フェニルエタノール（1-phenylethanol）である。言い換えれば、上記灰色カビ病菌はacetophenoneを還元して1-phenylethanolを得るための生体触媒であり、灰色カビ病菌（酵素）が触媒するのはacetophenone（基質）から1-phenylethanol（生成物）への還元反応となる。
【００８９】
４−１．基質の添加について
ＰＳ寒天培地上で培養した灰色カビ病菌をＰＳ液体培地に移し５日間培養させた灰色カビ病菌に、基質と反応しやすくするため界面活性剤としてTriton（登録商標）X-100を２０μｌ添加する。次によく振り混ぜた後に、基質としてacetophenoneを２２μｌ添加した。基質添加後、２０℃で７日間振とう暗培養させ、抽出した。
【００９０】
対称として、灰色カビ病菌を入れていないＰＳ液体培地にも同様に界面活性剤および基質を添加し、２０℃で７日間振とう暗培養させ、抽出した。
【００９１】
７日間経時変化を取らずに行った実験結果より、同様に灰色カビ病菌にacetophenoneを添加する実験を再度行い、１日毎に経時変化を取った。０日目、１日目、２日目に１ｍｌ抽出し、２日目の経時変化の結果より、３日目に総抽出した。
【００９２】
４−２．基質添加後の培養条件について
基質を添加した後、クリーンルーム内で、２０℃で振とう暗培養させた。
【００９３】
４−３．抽出について
経時変化では１ｍｌだけフラスコから取り、エーテルを用いて抽出した。培養後の総抽出ではエーテルを用いて抽出した。菌体はホモジナイザーを用いて、エーテルで抽出した。以下に抽出の操作を示す。
【００９４】
＜１ｍｌ抽出の操作＞
（１）クリーンベンチ（登録商標）内で、液体培地をねじ口試験管にマイクロピペットで１ｍｌ取る。
（２）液体培地にエーテルを１ｍｌ加え、２００回ボルテックスにかける。
（３）遠心機にかけて有機相、水相を分離させる。
（４）パスツールで別なねじ口試験管に有機相を移す。
（５）（２）、（３）および（４）の操作を合計で４回行う。
（６）有機相が入ったねじ口試験管に蒸留水を１ｍｌ入れ、２０回ボルテックスにかける。
（７）パスツールで水相を取り除く。
（８）（６）および（７）の操作を合計で２回行う。
（９）有機相に無水硫酸マグネシウムを舞うまで入れ、２〜３時間脱水させる。
（１０）脱水させた後に、セライトろ過をする。
（１１）遠心エバポレーターで１ｍｌまで濃縮する。その後、ＨＰＬＣにて分析する。
【００９５】
＜総抽出の操作＞
（１）３００ｍｌの分液ロートにロートとメッシュを設置し、菌体が入らないように液体培地のみを入れる。
（２）液体培地にエーテルを３０ｍｌ入れ、１０、２０、２０、５０、１００、１００回と、分液ロートのコックを開けながら分液ロートを振る。
（３）分液ロートを４０分静置し、静置した後に水相（液体培地）を１００ｍｌの分液ロートに落とす。
（４）液体培地にエーテルを２０ｍｌ入れ、分液ロートを３００回振り、３０分静置する。
（５）分液ロートを静置した後に、水相を三角フラスコに落とし、有機相を３００ｍｌの分液ロートに入れる。
（６）水相を再び１００ｍｌの分液ロートに入れ、（３）、（４）および（５）の操作を合計で４回行う。
（７）有機相を溜めた３００ｍｌの分液ロートに飽和食塩水を３０ｍｌ入れ、３０回振り、４０分静置する。
（８）分液ロートを静置した後に、水相を落とし、有機相をスリ付きの三角フラスコに入れる。
（９）有機相を入れた三角フラスコに、無水硫酸マグネシウムを舞うまで入れ、一晩脱水させる。
（１０）脱水させた後に、セライトろ過をし、単蒸留で濃縮する。その後、ＨＰＬＣにて分析する。
【００９６】
＜菌体の抽出操作＞
（１）総抽出で液体培地と分けた菌体をホモジナイザーに入れる。
（２）菌体にエーテルを５ｍｌ加えて、ホモジナイザーですり潰しながら抽出する。
（３）パスツールで溶液を１００ｍｌの分液ロートに移す。
（４）（２）、（３）の操作を合計で５回行う。
（５）溶液を溜めた分液ロートに、飽和食塩水を２０ｍｌ入れ、３０回振り、４０分静置する。
（６）分液ロートを静置した後に、水相を落とし、有機相をスリ付きの三角フラスコに入れる。
（７）有機相を入れた三角フラスコに、無水硫酸マグネシウムを舞うまで入れ、一晩脱水させる。
（８）脱水させた後に、セライトろ過をし、単蒸留で濃縮し、ＨＰＬＣにて分析する。
【００９７】
４−４．結果
１．総抽出で得た抽出物のＨＰＬＣの結果
（１）基質を添加した菌を入れていないＰＳ液体培地（菌なし液体培地抽出物）のＨＰＬＣの結果
図３０は、菌なし液体培地抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す。図３０に示されるように、順相カラムでの保持時間約１１分のacetophenoneのピークが出現した。図３０では、多少保持時間２０分台に小さなピークが見られるが、これはおそらくコンタミネーションが原因だと考えられる。図３１は、菌なし液体培地抽出物（1-phenylethanol(rac.)添加）の順相カラムでの分析結果を示す。図３１に示されるように、順相カラムでの保持時間約２３分の1-phenylethanolのピークが出現した。
【００９８】
（２）基質を添加した菌入りのＰＳ液体培地（菌あり液体培地抽出物）のＨＰＬＣの結果
図３２は、菌あり液体培地抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す。図３２に示されるように、順相カラムでの保持時間約１１分のacetophenoneのピークがほとんど見られず、順相カラムでの保持時間約２３分の1-phenylethanol のピークが見られた。これは、1-phenylethanolが生成したものと考えられる。図３３は、菌あり液体培地抽出物（1-phenylethanol(rac.)添加）の順相カラムでの分析結果を示す。図３３に示されるように、順相カラムでの保持時間約２３分の1-phenylethanolのピークが出現した。図３４は、菌ありＰＳ液体培地抽出物（acetophenone添加）のキラルカラムでのＨＰＬＣ分析結果を示す。図３４に示されるように、先に出ている（保持時間約９分の）小さなピークが（Ｒ）-1-phenylethanolであり、２つ目の（保持時間約５６分の）大きなピークが（Ｓ）-1-phenylethanolのピークである。（Ｒ）-体と（Ｓ）-体とのピーク面積の比率はおよそ７：９３であった。
【００９９】
（３）基質を添加し、菌体を磨り潰して抽出した抽出物（菌体のみ抽出物）のＨＰＬＣの結果
図３５は、菌体のみ抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す。図３５に示されるように、順相カラムでの保持時間約２３分の1-phenylethanol のピークが見られた。図３６は、菌体のみ抽出物（1-phenylethanol(rac.)添加）の順相カラムでの分析結果を示す。図３６に示されるように、順相カラムでの保持時間約２３分の1-phenylethanolのピークが出現した。以上のように、菌体のみ抽出物の場合も菌あり液体培地の場合と同様なピークが見られた。図３５および３６に示される保持時間約７分の辺りのピークは、抽出に用いたエーテル、ＰＳ液体培地に入っている微量成分が無保持のまま出てきたものである。図３７は、菌体のみ抽出物（acetophenone添加）のキラルカラムでのＨＰＬＣ分析結果を示す。図３７に示されるように、先に出ている（保持時間約９分の）ピークが（Ｒ）-1-phenylethanolであり、２つ目の（保持時間約５６分の）ピークが(S)-1-phenylethanolのピークである。菌ありＰＳ液体培地抽出物の場合（図３４）と同様に、菌体のみ抽出物で生成した1-phenylethanolの（Ｒ）-体、(S)-体の比率もおよそ７：９３であった。
【０１００】
２．経時変化で得た抽出物のＨＰＬＣの結果
（１）０日目の抽出物のＨＰＬＣの結果およびキラルカラムでのＨＰＬＣの分析結果
基質を添加した直後にＰＳ液体培地を１ｍｌ取り、抽出した抽出物のＨＰＬＣの結果を示す。図３８は、０日目の灰色カビ病菌抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す。図３８に示されるように、順相カラムでの保持時間約１１分のacetophenoneのピークが出現している。図３９は、０日目の灰色カビ病菌抽出物（acetophenone添加）のキラルカラムでの分析結果を示す。図３９に示されるように、保持時間約２５分にキラルカラムでのacetophenoneのピーク（図８参照）が出現している。図３８および３９に示されるように、acetopheoneのピークのみが見られ、acetophenoneは灰色カビ病菌と反応していないことがわかった。
【０１０１】
（２）１日目の抽出物のＨＰＬＣの結果およびキラルカラムでのＨＰＬＣの分析結果
図４０は、１日目の灰色カビ病菌抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す。図４０に示されるように、保持時間約２３分に順相カラムでの小さい1-phenylethanolのピークが出現している。図４１は、１日目の灰色カビ病菌抽出物（acetophenone添加）のキラルカラムでの分析結果を示す。図４１に示されるように、保持時間約５０分および５５分にキラルカラムでの小さい1-phenylethanolのピーク（図１０参照）が出現している。図４０および４１に示されるように、１日目で1-phenylethanolが生成していることがわかった。生成した1-phenylethanolの（Ｒ）-体、（Ｓ）-体の比率は３：２０であった。
【０１０２】
（３）２日目の抽出物のＨＰＬＣの結果およびキラルカラムでのＨＰＬＣの分析結果
図４２は、２日目の灰色カビ病菌抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す。図４２に示されるように、順相カラムでの保持時間約１１分のacetopheoneのピークはほとんど見られず、順相カラムでの保持時間約２３分の1-phenylethanolのピークのみが出現している。図４３は、２日目の灰色カビ病菌抽出物（acetophenone添加）のキラルカラムでの分析結果を示す。図４３に示されるように、キラルカラムでのacetopheoneのピーク（保持時間約２３分）はほとんど見られず、保持時間約５０分および５５分にキラルカラムでの1-phenylethanolのピーク（図１０参照）が出現している。図４２および４３に示されるように、２日目でacetophenoneがほとんど全て反応したことがわかった。生成した1-phenylethanolの（Ｒ）-体、（Ｓ）-体の比率は３：９７であった。式４、５に生成した1-phenylethanolの（Ｒ）-体、（Ｓ）-体を各々示す。
【０１０３】
【化３】
【０１０４】
多少ではあるが、キラルカラムでのacetophenoneのピークが残っていたので、３日目にて抽出作業を行った。
【０１０５】
図４４は、以上のＨＰＬＣの結果より、灰色カビ病菌にacetophenoneを添加して得られた経時変化の抽出物のＨＰＬＣの分析結果のプロットを示す。図４４で横軸は経過時間（日）であり、縦軸は基質を添加した菌を入れていないＰＳ液体培地にacetopheoneを添加して抽出した菌なし液体培地抽出物のＨＰＬＣの分析結果に示されるacetopheone のピーク（図３０参照）面積を１００％として考えた場合における、各経過日の灰色カビ病菌が入った灰色カビ病菌抽出物のＨＰＬＣの分析結果に示されるacetopheone および1-phenylethanolのピーク（図３８、４０、４２等参照）面積比（％）である。表６は、図４４に示される灰色カビ病菌にacetophenoneを添加して得られた経時変化の抽出物のＨＰＬＣの分析結果を数値で示す。
【０１０６】
【表６】
【０１０７】
図４４に示されるように、acetopheone のピーク（図３０参照）面積（１００％）に対し、acetopheoneのピーク面積の比（％）は四角印で表し、1-phenylethanolのピーク面積の比（％）は三角印で表して、０日目から３日目までの灰色カビ病菌が入った灰色カビ病菌抽出物のＨＰＬＣの各分析結果に基づきプロットした。図４４のプロットした経時変化の結果に示されるように、灰色カビ病菌によってacetophenoneが３日でほぼ１００％1-phenylethanolに還元されるということがわかった。
【０１０８】
さらに、1-phenylethanolの（Ｒ）-体、（Ｓ）-体の比率は、１日目では（Ｒ）：（Ｓ）＝１３：８７、２日目では（Ｒ）：（Ｓ）＝２．７：９７．３、３日目では（Ｒ）：（Ｓ）＝２．６：９７．４であり、最終的に（Ｓ）-体を９４％eeで生成したことがわかった。
【０１０９】
４−５．考察
上記の結果より、灰色カビ病菌を用いた基質転換ではacetophenoneが還元されて1-phenylethanolを生成することがわかった。さらに光学活性体を生成することがわかり、（Ｒ）-体よりも（Ｓ）-体を多く生成したことがわかった。（Ｒ）-体と（Ｓ）-体との比率は７：９３であった。
【０１１０】
経時変化の結果より、灰色カビ病菌を用いた基質転換で起こった還元反応は、３日で原料であるacetophenoneがほぼ１００％還元され、1-phenylethanolを生成したということがわかった。さらに、（Ｒ）-体、（Ｓ）-体が３：９７の比率で生成するということもわかった。灰色カビ病菌によって起きた反応を以下のスキーム（式６）に示す。
【０１１１】
【化４】
【０１１２】
以上のように、本発明の実施例４によれば、ケトンを生体触媒の存在下で還元させ、アルコールを得ることができる。生体触媒としては灰色カビ病菌（学名：Botrytis cinerea（B. cinerea））を用いる。ここで、ケトンはアセトフェノン（acetophenone）であり、アルコールは１−フェニルエタノール（1-phenylethanol）である。言い換えれば、上記灰色カビ病菌はacetophenoneを還元して1-phenylethanolを得るための生体触媒であり、灰色カビ病菌（酵素）が触媒するのはacetophenone（基質）から1-phenylethanol（生成物）への還元反応となる。以上のように、化学反応の触媒となる生物自身が持つ酵素の働きを利用することにより、生物の細胞中で水を溶媒とし常温・常圧という温和（穏和）な条件下で、ケトンからアルコールへの還元を行なうことができ、且つ穏和な反応条件下でキラルなアルコール（キラル化合物）を生成することができるアルコールの製造方法および生体触媒を提供することができる。
【０１１３】
総括．
リンゴの組織培養およびトウゴマの組織培養を用いた場合、1-phenylethanolからacetophenoneを生成するという酸化反応を起こすことがわかった。液体培地の量に対して適切な量のトウゴマのカルスを用いると、トウゴマのカルスと基質とが反応しやすくなるということも判明した。
【０１１４】
さらに、光学活性体である1-phenylethanolの（Ｒ）-体、（Ｓ）-体のどちらも、カルスによって酸化されてacetophenoneを生成した。（Ｒ）-体、（Ｓ）-体の反応率はほぼ１：１であった。
【０１１５】
灰色カビ病菌を用いた場合、acetophenoneが還元されて1-phenylethanolを生成することがわかった。さらに光学活性体を生成し、（Ｒ）-体、（Ｓ）-体の比率を見ると（Ｒ）-体よりも（Ｓ）-体を多く生成したことがわかった。その鏡像体過剰率は９４％eeであった。式７、８に生成した1-phenylethanolの（Ｒ）-体、（Ｓ）-体を各々示す。
【０１１６】
【化５】
【０１１７】
リンゴのカルスを用いた実験で、カルスを入れていないMS液体培地がコンタミネーションして1-phenylethanolを生成したが（図１３参照）、それらでは（Ｓ）-体よりも（Ｒ）-体のほうが多く生成されていた（図１５参照）。MS液体培地の方では、おそらくバクテリア（細菌類）が生えたのではないかと見た目から判断した。これらの結果より、真菌類（カビ）は（Ｓ）-体を多く生成することがわかり、細菌類（バクテリア）は（Ｒ）-体を多く生成するのではないかと考えられる。
【０１１８】
今後の展望として、細菌類（バクテリア）や真菌類（カビ）を用いることで安価なキラル化合物の製造につながること、実験結果より反応の速度が速いことからキラル化合物の大量生産にもつながること等が考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１１９】
本発明の活用例として、アルコールからケトンへの酸化およびケトンからアルコールへの還元を穏和な反応条件下で行ない、且つ穏和な反応条件下でキラルなアルコールを生成するケトンの製造方法、アルコールの製造方法に適用することができる。特に、細菌類（バクテリア）や真菌類（カビ）を用いることによる安価なキラル化合物の製造、反応の速度が速いことによるキラル化合物の大量生産に適用することができる。
【符号の説明】
【０１２０】
１ １００ｍｌ三角フラスコ、 ２ シャーレ、 ５ ＭＳ寒天培地（固体培地）、 ６ ＭＳ液体培地、 ７ ＰＳＡ寒天培地、 ８ ＰＳ液体培地、 １０ リンゴの新芽、 １１ トウゴマの根、 １２ 灰色カビ病菌
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０１２１】
【非特許文献１】A. K. Sharma and D. Swern, TetrahedronLett., 1503, (1974) .
【非特許文献２】A. J. Mancuso and D. Swern, Synthesis,70, (1971).
【非特許文献３】S. Takano, T. Yamane, M. Takahashi and K. Ogasawara, Synlett., 410, (1992).
【非特許文献４】J. G. de Vries and R. M.Kellogg, J. Org. Chem., 45, 4126, (1980).
【非特許文献５】E. L. Eliel, J. E. Lynch, F.Kume and S. V. Frye, Org. Synth VIII, 302,(1993).
【非特許文献６】Kaoru Nakamura , Mikio Fujii and Yoshiteru Ida,Stereoinversion of arylethanols by Geotrichum candidum Tetrahedron : Asymmetry 12 (2001) 3147-3157.
【非特許文献７】Kaoru Nakamura , Masato HIGAKI , Kazutoshi USHIO, Shinzaburo OKA and Atsuyoshi OHNO, STEREOCHEMICAL CONTROL OF MICROBIAL REDUCTION. Tetrahedron Letters , Vol. 26, No. 35 ,pp 4213-4216,1985.
【非特許文献８】Kaoru Nakamura , Mikio Fujii and Yoshiteru Ida, Asymmetric reduction of ketones by Geotrichum candidum inthe presence of Amberlite XAD,a solid organic solvent J. Chem. Soc.,Perkin Trans. 1 , 2000 , 3205-3211.
【非特許文献９】Mikio Fujii , Hiroyuki Akita , Yoshiteru Ida ,Toshiya Nakagawa and Kaoru Nakamura, Control ofchemoselectivity of microbial reaction with resin adsorbent : enhancement of Baeyer-Villiger oxidation over reduction Appl Microbial Biotechnol (2007) 77 : 45-51.
【非特許文献１０】K. Ogura , T. Koyama,in : K. Ogura , U. Sankawa(Eds.) , Dynamic Aspects of Natural Products Chemistry, Molecular Approaches ,Kondansha , Tokyo , 1997.
【非特許文献１１】T. Koyama , K. Ogura , Comprehensive Natural Product Chemistry , vol. 2 ,Pergamon , Oxford , 1999,p69.
【非特許文献１２】K. Ogura , T. Koyama , Chem. Rev. 98 (1998) 1263.
【非特許文献１３】M. Nagaki , M. Nakada , T. Musashi , J. Kawakami, N. Ohya , M. Kurihara , Y. Maki , T. Nishino, T. Koyama , Biosci.Biotechnol. Biochem. 71 (2007) 1657.
【非特許文献１４】M. Nagaki , H. Yamamoto , A. Takahashi , Y. Maki, J. Ishibashi , T. Nishino , T. Koyama , J. Mol. Catal. B : Enzym. 17 (2002) 81.
【非特許文献１５】Second Revised Edition PLANT TISSUE CULTURE METHODS National Research Council of Canada, Prairie Resional Laboratory.
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルコールを酸化させてケトンを得るケトンの製造方法、ケトンを還元させてアルコールを得るアルコールの製造方法およびそれらの製造方法に用いる生体触媒に関する。
【背景技術】
【０００２】
古くから、アルコールからケトンへの酸化およびケトンからアルコールへの還元が行なわれてきた。例えば、(二級)アルコールをケトンに酸化する方法として、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）−無水トリフルオロ酢酸を用いるSwern酸化があり、実用的な酸化法として広く利用されている。しかし、Swern酸化は低温条件で行わなければならない場合があり（−６０℃、−６０℃、−７８〜２５℃）、反応条件を厳しく設定しなければならなかった（各々、非特許文献１、２、３参照）。
【０００３】
一方、ケトンをアルコールに還元する方法はいくつかあるが、ラセミの二級アルコールを生成してしまうことになる（非特許文献４参照）。ここで、反応温度は８５℃以上である。キラルなアルコールを生成する反応もあるが、今度は反応条件が厳しくなり、−７８℃となる（非特許文献５参照）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上述したように、アルコールからケトンへの酸化およびケトンからアルコールへの還元は古くから行なわれてきたにもかかわらず、反応条件を厳しく設定しなければならないという問題があった。純有機合成化学においても不斉合成は、シャープレス教授により報告された不斉酸化反応（シャープレス酸化）、野依先生により発見された触媒還元系による不斉水素化（還元）反応（野依不斉水素化反応）など、ノーベル化学賞級の困難さがあるという問題があった。
【０００５】
そこで、本発明の目的は、上記問題を解決するためになされたものであり、アルコールからケトンへの酸化およびケトンからアルコールへの還元を穏和な反応条件下で行なうことができ、且つ穏和な反応条件下でキラルなアルコールを生成することができるケトンの製造方法、アルコールの製造方法および生体触媒を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
この発明のケトンの製造方法は、アルコールを生体触媒の存在下で酸化させ、ケトンを得ることを特徴とする。
【０００７】
ここで、この発明のケトンの製造方法において、前記生体触媒は植物のカルスとすることができる。
【０００８】
ここで、この発明のケトンの製造方法において、前記植物はリンゴ（Malus pumila）又はトウゴマとすることができる。
【０００９】
ここで、この発明のケトンの製造方法において、前記アルコールは１−フェニルエタノール（1-phenylethanol(rac.)）とし、前記ケトンはアセトフェノン（acetophenone）とすることができる。
【００１０】
この発明のアルコールの製造方法は、ケトンを生体触媒の存在下で還元させ、アルコールを得ることを特徴とする。
【００１１】
ここで、この発明のアルコールの製造方法において、前記生体触媒は灰色カビ病菌（Botrytis cinerea）とすることができる。
【００１２】
ここで、この発明のアルコールの製造方法において、前記ケトンはアセトフェノン（acetophenone）とし、前記アルコールは１−フェニルエタノール（1-phenylethanol）とすることができる。
【００１３】
この発明の生体触媒は、１−フェニルエタノール（1-phenylethanol(rac.)）を酸化してアセトフェノン（acetophenone）を得るための生体触媒であって、該生体触媒はリンゴ（Malus pumila）又はトウゴマのカルスであることを特徴とする。
【００１４】
ここで、この発明の生体触媒において、該生体触媒がリンゴ（Malus pumila）のカルスの場合、カルス化させるためのＭＳ（Murashige & Skoog）培地の成分に植物ホルモンとして２，４−ジクロロフェノキシ酢酸を１０μＭ及びカイネチンを１μＭ含むことができる。
【００１５】
この発明の生体触媒は、アセトフェノン（acetophenone）を還元して１−フェニルエタノール（1-phenylethanol）を得るための生体触媒であって、該生体触媒は灰色カビ病菌（Botrytis cinerea）であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のケトンの製造方法および生体触媒によれば、アルコールを生体触媒の存在下で酸化させ、ケトンを得ることができる。生体触媒としては植物のカルス、特にリンゴのカルスを用いる。植物のカルスとしてはトウゴマのカルスを用いてもよい。ここで、アルコールは1-phenylethanol(rac.)であり、ケトンはacetophenoneである。言い換えれば、上記リンゴのカルスは1-phenylethanol(rac.)を酸化してacetophenoneを得るための生体触媒であり、リンゴのカルス（酵素）が触媒するのは1-phenylethanol（基質）からacetophenone（生成物）への酸化反応となる。以上のように、化学反応の触媒となる生物自身が持つ酵素の働きを利用することにより、生物の細胞中で水を溶媒とし常温・常圧という温和（穏和）な条件下で、アルコールからケトンへの酸化を行なうことができるケトンの製造方法および生体触媒を提供することができるという効果がある。
【００１７】
本発明のアルコールの製造方法および生体触媒によれば、ケトンを生体触媒の存在下で還元させ、アルコールを得ることができる。生体触媒としては灰色カビ病菌（学名：Botrytis cinerea（B. cinerea））を用いる。ここで、ケトンはアセトフェノン（acetophenone）であり、アルコールは１−フェニルエタノール（1-phenylethanol）である。言い換えれば、上記灰色カビ病菌はacetophenoneを還元して1-phenylethanolを得るための生体触媒であり、灰色カビ病菌（酵素）が触媒するのはacetophenone（基質）から1-phenylethanol（生成物）への還元反応となる。以上のように、化学反応の触媒となる生物自身が持つ酵素の働きを利用することにより、生物の細胞中で水を溶媒とし常温・常圧という温和（穏和）な条件下で、ケトンからアルコールへの還元を行なうことができ、且つ穏和な反応条件下でキラルなアルコール（キラル化合物）を生成することができるアルコールの製造方法および生体触媒を提供することができるという効果がある。
【００１８】
さらに、細菌類（バクテリア）や真菌類（カビ）を用いることで安価なキラル化合物の製造につながり、反応の速度が速いことからキラル化合物の大量生産にもつながるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＭＳ固体培地上で培養したリンゴのカルスの写真を示す図である。
【図２】ＭＳ液体培地中で培養させたリンゴのカルスの写真を示す図である。
【図３】ＭＳ固体培地上で培養したトウゴマのカルスの写真を示す図である。
【図４】ＭＳ液体培地中で培養したトウゴマのカルスの写真を示す図である。
【図５】ＰＳＡ寒天培地上で培養させた灰色カビ病菌（B.cinerea）の写真を示す図である。
【図６】ＰＳ液体培地中で培養させた灰色カビ病菌の写真を示す図である。
【図７】acetophenoneの順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図８】acetophenoneのキラルカラムでの分析結果を示す図である。
【図９】1-phenylethanol(rac.)の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図１０】1-phenylethanol(rac.)のキラルカラムでの分析結果を示す図である。
【図１１】1-phenylethanolの（Ｒ）−体のキラルカラムでの分析結果を示す図である。
【図１２】1-phenylethanolの（Ｓ）−体のキラルカラムでの分析結果を示す図である。
【図１３】ＭＳ液体培地抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図１４】ＭＳ液体培地抽出物（1-phenylethanol添加）の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図１５】ＭＳ液体培地抽出物（acetophenone添加）のキラルカラムでの分析結果を示す図である。
【図１６】リンゴカルス抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図１７】リンゴカルス抽出物（1-phenylethanol(rac.)添加）の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図１８】リンゴカルスのみ抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図１９】リンゴカルスのみ抽出物（1-phenylethanol(rac.)添加）の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図２０】３日目のリンゴカルス抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図２１】３日目のリンゴカルス抽出物（1-phenylethano(rac.)添加）の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図２２】６日目のリンゴカルス抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図２３】６日目のリンゴカルス抽出物（1-phenylethano(rac.)添加）の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図２４】９日目のリンゴカルス抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図２５】９日目のリンゴカルス抽出物（1-phenylethano(rac.)添加）の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図２６】１２日目のリンゴカルス抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示図である。
【図２７】１２日目のリンゴカルス抽出物（1-phenylethano(rac.)添加）の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図２８】リンゴのカルスに1-phenylethanol(rac.)を添加して得られた経時変化の抽出物のＨＰＬＣの分析結果のプロットを示す図である。
【図２９】６日目のリンゴカルス抽出物（1-phenylethano(rac.)添加）と標品acetophenoneとを混ぜ、double injectionを行った結果の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図３０】菌なし液体培地抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図３１】菌なし液体培地抽出物（1-phenylethanol(rac.)添加）の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図３２】菌あり液体培地抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図３３】菌あり液体培地抽出物（1-phenylethanol(rac.)添加）の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図３４】菌ありＰＳ液体培地抽出物（acetophenone添加）のキラルカラムでのＨＰＬＣ分析結果を示す図である。
【図３５】菌体のみ抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図３６】菌体のみ抽出物（1-phenylethanol(rac.)添加）の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図３７】菌体のみ抽出物（acetophenone添加）のキラルカラムでのＨＰＬＣ分析結果を示す図である。
【図３８】０日目の灰色カビ病菌抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図３９】０日目の灰色カビ病菌抽出物（acetophenone添加）のキラルカラムでの分析結果を示す図である。
【図４０】１日目の灰色カビ病菌抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図４１】１日目の灰色カビ病菌抽出物（acetophenone添加）のキラルカラムでの分析結果を示す図である。
【図４２】２日目の灰色カビ病菌抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す図である。
【図４３】２日目の灰色カビ病菌抽出物（acetophenone添加）のキラルカラムでの分析結果を示す図である。
【図４４】灰色カビ病菌にacetophenoneを添加して得られた経時変化の抽出物のＨＰＬＣの分析結果のプロットを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、各実施例について図面を参照して詳細に説明する。
【実施例１】
【００２１】
１−１．発明の概要
本発明者等は、上述した従来のアルコールからケトンへの酸化およびケトンからアルコールへの還元における反応条件を厳しく設定しなければならないという課題を解決するべく鋭意研究を行なった。その結果、リンゴ（学名：Malus pumila、セイヨウリンゴ）およびトウゴマ（学名：Ricinus communis、ヒマ（蓖麻））の組織培養、またはワイン等に使用されているリンゴ灰色カビ病菌（学名：Botrytis cinerea（B. cinerea）、以下、「灰色カビ病菌」と略す。）等の生体触媒を利用して有機合成に応用できることを見出し、アセトフェノン（acetophenone）と１−フェニルエタノール（1-phenylethanol(rac.)）とを用いて酸化還元反応を試みた。本発明者等とは異なるアプローチを行なった関連する文献を非特許文献６〜９に示す。本実施例１では、まず酵素の特徴について概略を述べ、次にリンゴおよびトウゴマの組織培養、灰色カビ病菌の培養について説明する。酸化還元反応に関しては実施例２以降で説明する。
【００２２】
１−２．酵素の特徴
自然界には様々な生物が存在し、それらが生きていくために生物は自身の体内で様々な物質を生成する。これを“生合成”といい、一般の化学合成ではできにくい反応も、生物の細胞中で、水を溶媒として、常温・常圧という温和（穏和）な条件で必要なものだけを生成する化学反応である。このように効率的に化学反応を進めるためには、化学反応の触媒となる生物自身が持つ酵素の働きが不可欠である。
【００２３】
その酵素とは、生物の生体内反応における触媒として働く物質であり、様々な種類がある。１つの化合物が生合成されるには１つだけの酵素ではなく、酸化還元酵素、転移酵素、合成酵素、加水分解酵素等の数多くの酵素が関係し、多数の反応の段階を踏むことが一般的に知られている。
【００２４】
さらに酵素の特徴として反応特異性と基質特異性がある。通常酵素が触媒する反応は1つだけであり、異なった反応には別の酵素が必要である。また反応に関わる基質が酵素に応じて決まっており、異なった基質には別の酵素が用意される（非特許文献１０〜１４参照）。
【００２５】
以下、リンゴおよびトウゴマの組織培養、灰色カビ病菌の培養について順に説明する。
【００２６】
１−３−１．組織培養について
植物をカルス（callus）化させるめに、ＭＳ（Murashige＆Skoog）培地を作成してカルスの誘導、液体振とう培養に用いた。表1〜４に詳しいＭＳ培地の成分構成を示す（非特許文献１５参照）。表１、３でＭはモル濃度（１mol/L）である。
【００２７】
＜ MS培地の成分構成（１L中）＞
１．無機栄養素
【表１】
【００２８】
２．有機栄養素
【表２】
【００２９】
３．植物ホルモン
【表３】
【００３０】
４．支持材料
固体培地を作成するときに用いる。全量の０．８％（ｇ）を添加する。
【表４】
【００３１】
以上の成分が含まれている。ＭＳ培地を作製するときは、実験毎に各物質を秤量して培地を作る手間を省くため、あらかじめ上記の成分を数種類溶かした高濃度の貯蔵液、ＭＳ基本液（無機栄養素）、Ｆｅ−ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）液、Vitamine液（有機栄養素）の３種を調合し、それらを添加してＭＳ培地を作製する。作製方法を以下に示す。
【００３２】
ＭＳ培地の作製．
（１）ビーカーに蒸留水１００ｍｌを入れ、マグネチックスターラーで撹拌しながら、ＭＳ基本液２０ｍｌ、Ｆｅ−ＥＤＴＡ液１ｍｌ、Vitamine液０．２ｍｌ、植物ホルモンである２，４-ジクロロフェノキシ酢酸を１０μＭ、カイネチンを１μＭになるように添加する。
（２）ｐＨメーターで培地のｐＨをＮａＯＨ、ＨＣｌで５．７〜５．８に調整する。
（３）蒸留水で２００ｍｌに調整する。（固体培地では寒天を全体積量の０．８％加え、液体培地では加えずにそのまま用いる。)
（４）１００ｍｌ三角フラスコに２０ｍｌずつ入れて（分注）、キャップする。
（５）１００ｍｌ三角フラスコをオートクレーブ（圧力滅菌釜）にかけて滅菌し（好適には１２１℃、２気圧、１５〜２０分）、冷暗所（例えば冷蔵庫）に保存する。
【００３３】
１−３−２．リンゴのカルス化について．
図１は、ＭＳ固体培地上で培養したリンゴのカルスの写真を示す。図１において、符号１は１００ｍｌ三角フラスコ、５はＭＳ寒天培地（固体培地）、１０はリンゴの新芽である。エタノールおよび次亜塩素酸を用いて滅菌したリンゴの新芽１０を切り分け、それをＭＳ寒天培地５上にのせ、カルス誘導させた。
【００３４】
１−３−３．リンゴのカルスの液体培養について．
図２は、ＭＳ液体培地中で培養させたリンゴのカルスの写真を示す。図２で図１と同じ符号を付した箇所は同じ要素を示すため、説明は省略する。図２において、符号６はＭＳ液体培地である。ＭＳ固体培地５で培養させ、安定したリンゴのカルスを細かく刻み、ＭＳ液体培地６（２０ｍｌ）に入れて、２０℃で３日間振とう暗培養させた。
【００３５】
１−３−４．トウゴマのカルス化について
図３は、ＭＳ固体培地上で培養したトウゴマのカルスの写真を示す。図３で図１と同じ符号を付した箇所は同じ要素を示すため、説明は省略する。図３において、符号１１はトウゴマの根である。エタノールおよび次亜塩素酸を用いて滅菌したトウゴマの根１１を切り分け、それをＭＳ寒天培地５上にのせ、カルス誘導させた。
【００３６】
１−３−５．トウゴマのカルスの液体培養について
図４は、ＭＳ液体培地中で培養したトウゴマのカルスの写真を示す。図４で図２と同じ符号を付した箇所は同じ要素を示すため、説明は省略する。ＭＳ固体培地５上で培養させ、安定したトウゴマのカルスを細かく刻み、ＭＳ液体培地６（４０ｍｌ）に入れて、２０℃で３日間振とう暗培養（暗室の振とう器の上で暗培養）させた。
【００３７】
１−４−１．使用した植物病原菌について
＜灰色カビ病菌＞
灰色カビ病菌は不完全菌類という真菌類の一種である。体細胞分裂によって形成される無隔壁の分生胞子により増殖する。胞子から菌糸を伸ばして増えることから糸状菌としても分類されている。
【００３８】
１−４−２．灰色カビ病菌の培養について
植物病原菌を培養するのにＰＳＡ（Potate Scrose Agar）培地を用いた。以下にＰＳＡ（液体）培地の材料および作り方を示す。
【００３９】
ＰＳＡ培地の材料ａ〜ｄ
ａ．皮をむいたジャガイモ・・・４００g
ｂ．スクロース・・・・・・・・４０g
ｃ．寒天・・・・・・・・・・・４０g
ｄ．蒸留水・・・・・・・・・・２L
【００４０】
ＰＳＡ培地の作り方
（１）５Ｌの三角フラスコに２Ｌの蒸留水ｄと皮をむいたジャガイモａとを入れる。
（２）上記５Ｌの三角フラスコにアルミホイルで蓋をし、コッホ釜に入れて１時間蒸す。
（３）別の５Lの三角フラスコにスクロースｂを入れ、さらにガーゼでろ過した（２）を入れる。
（４）上記別の５Lの三角フラスコをよく攪拌し、スクロースｂを溶かす。
（５）（４）の溶液が熱いうちに寒天ｃを少しずつ加え、よく振り混ぜる。
（６）寒天ｃを溶かすために、上記別の５Ｌの三角フラスコをアルミホイルで蓋をし、コッホ釜に入れて３０分蒸す。
（７）（６）を５００ｍｌの三角フラスコに分け、アルミホイルで蓋をし、オートクレープにかけて滅菌する。
【００４１】
図５は、ＰＳＡ寒天培地上で培養させた灰色カビ病菌の写真を示す。図５において、符号２はシャーレ、７はＰＳＡ寒天培地、１２は灰色カビ病菌である。上記のように作製したＰＳＡ寒天培地７をクリーンベンチ（登録商標）内でシャーレ２に流し固め、そこに白金線を使って灰色カビ病菌１２の菌体をのせる。菌糸および胞子を十分に成長させるまで２０℃で明培養させた。
【００４２】
１−４−３．灰色カビ病菌の液体培養について
植物病原菌を培養するのにＰＳ（Potato Scrose）液体培地を用いた。以下にＰＳ液体培地の材料および作り方を示す。
【００４３】
ＰＳ液体培地の材料
ａ．皮をむいたジャガイモ・・・１００g
ｂ．スクロース・・・・・・・・１０g
ｄ．蒸留水・・・・・・・・・・５００ｍｌ
【００４４】
ＰＳ液体培地の作り方
（１）３Ｌの三角フラスコに５００ｍｌの蒸留水ｄと皮をむいたジャガイモａとを入れる。
（２）上記３Ｌの三角フラスコにアルミホイルで蓋をし、コッホ釜に入れて１時間蒸す。
（３）別の５００ｍｌの三角フラスコにスクロースｂを入れ、さらにガーゼでろ過した（２）を入れる。
（４）上記別の５００ｍｌの三角フラスコをよく攪拌し、スクロースｂを溶かす。
（５）（４）を１００ｍｌの三角フラスコに２０ｍｌずつ分け、アルミホイルで蓋をし、オートクレープにかけて滅菌する。
【００４５】
図６は、ＰＳ液体培地中で培養させた灰色カビ病菌の写真を示す。図６で図１および５と同じ符号を付した箇所は同じ要素を示すため、説明は省略する。図６において、符号８はＰＳ液体培地である。上記のように作製したＰＳ液体培地８に、クリーンベンチ（登録商標）内で白金線を使ってＰＳＡ寒天培地７で培養させた灰色カビ病菌１２をＰＳＡ寒天培地７から菌体および胞子をそぎ取り、ＰＳ液体培地８（２０ｍｌ）に入れて、２０℃で５日間振とう暗培養させた。
【００４６】
１−５．添加した基質について
以下の実施例２以降で説明する今回の実験で用いた基質はacetophenoneと１-phenylethanol(rac.)との２つであり、以下の式１および２に示す。式１に示されるようにacetophenoneのモル質量（ＭＷ）は１２０ｇ／ｍｏｌであり、式２に示されるように１-phenylethanol(rac.)のモル質量（ＭＷ）は１２２ｇ／ｍｏｌである。
【００４７】
【化１】
【００４８】
上記２つの基質を植物カルスまたは植物病原菌に添加するときは、液体培地６等中の基質の濃度が１.０×１０−４Mになるように添加した。
【００４９】
ＨＰＬＣ（High Performance Liquid Chromatography）において使用したカラムは、順相カラム（ＨＰＬＣ GL-PACK LiChlosorb（登録商標）Si 60、 粒径５μｍ、４．０×２５０ｍｍ）とキラルカラム（CHIRALPAK（登録商標）AD-H、０．４６ｃｍφ×２５ｃｍＬ）とを用いた。ＨＰＬＣにて分析する際に使用した展開溶媒（溶離液）は、順相カラムではhexane／2-propanol＝４０／１を用い、キラルカラムではhexane／ethanol＝９９／１を用いた。ＨＰＬＣシステムの他の構成装置（脱気装置、ポンプ、インジェクタ、カラム恒温槽、検出器、データ処理器等）については通常用いられる装置、例えば検出器なら紫外（Ultra Violet : ＵＶ）検出器等、を使用した。
【００５０】
次に、acetophenone、1-phenylethanol(rac.)および1-phenylethanolの２つのキラル化合物のＨＰＬＣの分析結果を図７〜図１２に示す。図７〜図１２で横軸は時間（分）、縦軸は電圧（ｍＶ）である（以下、ＨＰＬＣの分析結果を示す図において同様である）。
【００５１】
図７は、acetophenoneの順相カラムでの分析結果を示す。図７に示されるように、標品acetophenone（５μｌ）の順相カラムでの保持時間は約１１分であった。図８は、acetophenoneのキラルカラムでの分析結果を示す。図８に示されるように、標品acetophenone（５μｌ）のキラルカラムでの保持時間は約２３分であった。
【００５２】
図９は、1-phenylethanol(rac.)の順相カラムでの分析結果を示す。図９に示されるように、標品1-phenylethanol(rac.)（５μｌ）の順相カラムでの保持時間は約２３分であった。図１０は、1-phenylethanol(rac.)のキラルカラムでの分析結果を示す。図１０に示されるように、標品1-phenylethanol(rac.)（５μｌ）のキラルカラムでの保持時間は、初めのピークが約５０分であり、次のピークが約５５分であった。
【００５３】
図１１は、1-phenylethanolの（Ｒ）-体のキラルカラムでの分析結果を示す。図１１に示されるように、（Ｒ）-1-phenylethanol（５μｌ）のキラルカラムラムでの保持時間は約５０分であった。図１２は、1-phenylethanolの（Ｓ）−体のキラルカラムでの分析結果を示す。図１２に示されるように、（Ｓ）−1-phenylethanol（５μｌ）のキラルカラムでの保持時間は約５５分であった。
【００５４】
以上説明したように、本発明の実施例１では、まず酵素の特徴について概略を述べた。次に、リンゴおよびトウゴマの組織培養に関し、MＳ培地の成分構成（１L中）およびその作製について説明した。灰色カビ病菌の培養に関し、ＰＳ液体培地の材料および作製について説明した。今回の実験で用いた２つの基質、acetophenoneと１-phenylethanol(rac.)とについて示し、ＨＰＬＣにおいて使用した順相カラムおよびキラルカラムについて説明した。最後に、acetophenone、1-phenylethanol(rac.)および1-phenylethanolの２つのキラル化合物のＨＰＬＣの分析結果を図７〜図１２に示した。標品acetophenone（５μｌ）の順相カラムでの保持時間は約１１分、キラルカラムでの保持時間は約２３分であった。標品1-phenylethanol(rac.)（５μｌ）の順相カラムでの保持時間は約２３分、キラルカラムでの保持時間は、初めのピークが約５０分であり、次のピークが約５５分であった。（Ｒ）-1-phenylethanol（５μｌ）のキラルカラムでの保持時間は約５０分、（Ｓ）-1-phenylethanol（５μｌ）のキラルカラムでの保持時間は約５５分であった。
【実施例２】
【００５５】
実施例２では、アルコールを生体触媒の存在下で酸化させ、ケトンを得るケトンの製造方法について説明する。生体触媒としては植物のカルス、特にリンゴ（Malus pumila）のカルスを用いる。ここで、アルコールは１−フェニルエタノール（1-phenylethanol(rac.)）であり、ケトンはアセトフェノン（acetophenone）である。言い換えれば、上記リンゴのカルスは1-phenylethanol(rac.)を酸化してacetophenoneを得るための生体触媒であり、リンゴのカルス（酵素）が触媒するのは1-phenylethanol（基質）からacetophenone（生成物）への酸化反応となる。実施例１（表４）で説明したように、カルス化させるためのＭＳ培地の成分に植物ホルモンとして２，４−ジクロロフェノキシ酢酸を１０μＭおよびカイネチンを１μＭ含む。
【００５６】
２−１．基質の添加について
クリーンベンチ（登録商標）内で、３日間ＭＳ液体培地中で振とう暗培養させたリンゴのカルスに、基質と反応しやすくするため界面活性剤としてTriton（登録商標）X-100を２０μｌ添加する。次によく振り混ぜた後に、acetophenoneおよび1-phenylethanol(rac.)をそれぞれ別々のリンゴのカルスに２２μｌ添加した。添加後、２０℃で振とう暗培養させた。経時変化として、３日目、６日目、９日目、１２日目に１ｍｌ抽出した。総抽出は１４日目に行った。
【００５７】
対称として、リンゴのカルスを入れていないＭＳ液体培地にも界面活性剤および基質を添加し、２０℃で振とう暗培養させ、経時変化を取らずに総抽出のみ行った。
【００５８】
２−２．基質添加後の培養条件について
基質を添加した後、クリーンルーム内で、２０℃で振とう暗培養させた。
【００５９】
２−３．抽出について
３日目、６日目、９日目、１２日目の経時変化では１ｍｌだけフラスコから取り、ヘキサンを用いて抽出した。１４日目の培養後の総抽出ではエーテルを用いて抽出した。細胞部はホモジナイザーを用いて、エーテルで抽出した。以下に抽出の操作を示す。
【００６０】
＜１ｍｌ抽出の操作＞
（１）クリーンベンチ（登録商標）内で、液体培地をねじ口試験管にマイクロピペットで１ｍｌ取る。
（２）液体培地にエーテルを１ｍｌ加え、２００回ボルテックスにかける（ボルテックスミキサーで撹拌する。以下同様）。
（３）遠心機にかけて有機相、水相を分離させる。
（４）パスツールピペット（以下、「パスツール」と省略）で別なねじ口試験管に有機相を移す。
（５）（２）、（３）および（４）の操作を合計で４回行う。
（６）有機相が入ったねじ口試験管に蒸留水を１ｍｌ入れ、２０回ボルテックスにかける。
（７）パスツールで水相を取り除く。
（８）（６）および（７）の操作を合計で２回行う。
（９）有機相に無水硫酸マグネシウムを舞うまで入れ、２〜３時間脱水させる。
（１０）脱水させた後に、セライトろ過をする。
（１１）遠心エバポレーターで１ｍｌまで濃縮する。その後、ＨＰＬＣにて分析する。
【００６１】
＜総抽出の操作＞
（１）３００ｍｌの分液ロートにロートとメッシュを設置し、カルスが入らないように液体培地のみを入れる。
（２）液体培地にエーテルを３０ｍｌ入れ、１０、２０、２０、５０、１００、１００回と、分液ロートのコックを開けながら分液ロートを振る。
（３）分液ロートを４０分静置し、静置した後に水相（液体培地）を１００ｍｌの分液ロートに落とす。
（４）液体培地にエーテルを２０ｍｌ入れ、分液ロートを３００回振り、３０分静置する。
（５）分液ロートを静置した後に、水相を三角フラスコに落とし、有機相を３００ｍｌの分液ロートに入れる。
（６）水相を再び１００ｍｌの分液ロートに入れ、（３）、（４）および（５）の操作を合計で４回行う。
（７）有機相を溜めた３００ｍｌの分液ロートに飽和食塩水を３０ｍｌ入れ、３０回振り、４０分静置する。
（８）分液ロートを静置した後に、水相を落とし、有機相をスリ付きの三角フラスコに入れる。
（９）有機相を入れた三角フラスコに、無水硫酸マグネシウムを舞うまで入れ、一晩脱水させる。
（１０）脱水させた後に、セライトろ過をし、単蒸留で濃縮する。その後、ＨＰＬＣにて分析する。
【００６２】
＜細胞部の抽出操作＞
（１）総抽出で液体培地と分けたカルスをホモジナイザーに入れる。
（２）カルスにエーテルを５ｍｌ加えて、ホモジナイザーですり潰しながら抽出する。
（３）パスツールで溶液を１００ｍｌの分液ロートに移す。
（４）（２）、（３）の操作を合計で５回行う。
（５）溶液を溜めた分液ロートに、飽和食塩水を２０ｍｌ入れ、３０回振り、４０分静置する。
（６）分液ロートを静置した後に、水相を落とし、有機相をスリ付きの三角フラスコに入れる。
（７）有機相を入れた三角フラスコに、無水硫酸マグネシウムを舞うまで入れ、一晩脱水させる。
（８）脱水させた後に、セライトろ過をし、単蒸留で濃縮し、ＨＰＬＣにて分析する。
【００６３】
２−４．結果
１．総抽出した抽出物のＨＰＬＣの結果
（１）カルスを入れていないＭＳ液体培地に基質を添加した培地の抽出物（液体培地抽出物）のＨＰＬＣの結果
図１３は、ＭＳ液体培地抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す。図１３に示されるように、保持時間約１１分のピーク（図７に示される順相カラムでの保持時間約１１分のacetophenoneのピーク）はほとんど出現せず、保持時間約２３分のピーク（図９に示される順相カラムでの保持時間約２３分の1-phenylethanolのピーク）が出現した。これはコンタミネーションし、カビによって1-phenylethanolが生成したと考えられる。図１４は、ＭＳ液体培地抽出物（1-phenylethanol添加）の順相カラムでの分析結果を示す。図１４に示されるように、順相カラムでの保持時間約２３分の1-phenylethanolのピークが出現した。発明者らは、更に（Ｒ）-体、（Ｓ）-体の両者を生成していたことをキラルカラムで確認した。図１５は、ＭＳ液体培地抽出物（acetophenone添加）のキラルカラムでの分析結果を示す。図１５に示されるように、（Ｒ）-体（保持時間約５０分の最初のピーク）の方が（Ｓ）-体（保持時間約５５分の２つ目のピーク）より大きいことがわかる。発明者らは、ＭＳ液体培地にacetophenoneを添加する実験を再度行い、ＭＳ液体培地とacetophenoneが反応しないこと、つまりコンタミネーションを起こさなければ図１３に示されるようにはならないことを確認した。
【００６４】
（２）リンゴのカルスを入れたＭＳ液体培地に基質を添加した培地の抽出物（リンゴカルス抽出物）のＨＰＬＣの結果
図１６は、リンゴカルス抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す。図１６に示されるように、順相カラムでの保持時間約１１分のacetophenoneのピークが出現した。保持時間約２３分の小さいピークに関しては、おそらくリンゴのカルスでは酸化反応のみが起こり、acetophenoneを添加しても反応しない筈であるため、コンタミネーションしたと思われる。図１７は、リンゴカルス抽出物（1-phenylethanol(rac.)添加）の順相カラムでの分析結果を示す。図１７に示されるように、順相カラムでの保持時間約１１分の小さいacetophenoneのピークが見られ、順調に酸化反応が起こったことがわかる。しかし、経時変化の結果より９日目から１２日目ぐらいにコンタミネーションしたため、acetophenoneが1-phenylethanolに戻ったことが、経時変化で得た抽出物の分析結果よりわかった。
【００６５】
（３）基質を添加したリンゴのカルスの細胞部を磨り潰し抽出した抽出物（リンゴカルスのみ抽出物）のＨＰＬＣの結果
図１８は、リンゴカルスのみ抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す。図１８に示されるように、順相カラムでの保持時間約２３分の1-phenylethanolのピークが見られなかった。この結果より、リンゴのカルスとacetophenoneとが反応しないことがわかった。図１９は、リンゴカルスのみ抽出物（1-phenylethano(rac.)添加）の順相カラムでの分析結果を示す。図１９に示されるように順相カラムでの保持時間約１１分の小さいacetophenoneのピークが見られるため、ＭＳ液体培地の場合（図１７）と同様に、細胞部でもacetophenoneの生成があるということがわかった。
【００６６】
２．経時変化
（１）３日目の抽出物のＨＰＬＣの結果
図２０は、３日目のリンゴカルス抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す。図２０に示されるように、順相カラムでの保持時間約１１分のacetophenoneのピークが出現している。図２１は、３日目のリンゴカルス抽出物（1-phenylethano(rac.)添加）の順相カラムでの分析結果を示す。図２１に示されるように、保持時間約２５分に順相カラムでの1-phenylethanolのピークが出現しており、順相カラムでの保持時間約１１分のacetophenoneの小さいピーク（丸印Ａで示す。）が出現しているため、acetophenoneが少し生成されていることがわかる。
【００６７】
（２）６日目の抽出物のＨＰＬＣの結果
図２２は、６日目のリンゴカルス抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す。図２２に示されるように、順相カラムでの保持時間約１１分のacetophenoneのピークが出現している。図２３は、６日目のリンゴカルス抽出物（1-phenylethano(rac.)添加）の順相カラムでの分析結果を示す。図２３に示されるように、順相カラムでの保持時間約２３（〜２４）分の1-phenylethanolのピークが出現している。図２３と図２１（３日目）とを比較すると、順相カラムでの保持時間約１１分のacetophenoneのピーク（丸印Ａで示す。）が大きくなっていることがわかる。
【００６８】
（３）９日目の抽出物のＨＰＬＣの結果
図２４は、９日目のリンゴカルス抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す。図２４に示されるように、順相カラムでの保持時間約１１分のacetophenoneのピークが出現している。図２５は、９日目のリンゴカルス抽出物（1-phenylethano(rac.)添加）の順相カラムでの分析結果を示す。図２５に示されるように、順相カラムでの保持時間約２３（〜２４）分の1-phenylethanolのピークが小さくなり、図２５と図２３（６日目）とを比較すると、順相カラムでの保持時間約１１分のacetophenoneのピークがかなり大きくなっていることがわかる。以上より、1-phenylethanol(rac.)がacetophenoneに変換されたということがわかる。
【００６９】
（４）１２日目の抽出物のＨＰＬＣの結果
図２６は、１２日目のリンゴカルス抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す。図２６に示されるように、順相カラムでの保持時間約１１分のacetophenoneのピークが出現している。順相カラムでの保持時間約２３分の1-phenylethanolのピークと思われるピークが少し見られるが、これはおそらくコンタミネーションが原因だと思われる。図２７は、１２日目のリンゴカルス抽出物（1-phenylethano(rac.)添加）の順相カラムでの分析結果を示す。図２７と図２５（９日目）とを比較すると（scaleの相違は除く）、コンタミネーションしたため順相カラムでの保持時間約１１分のacetophenoneのピークが小さくなり、順相カラムでの保持時間約２３分の1-phenylethanolのピークが大きくなった。
【００７０】
図２８は、以上のＨＰＬＣの結果より、リンゴのカルスに1-phenylethanol(rac.)を添加して得られた経時変化の抽出物のＨＰＬＣの分析結果のプロットを示す。図２８で横軸は経過時間（日）であり、縦軸はリンゴのカルスが入っていないＭＳ液体培地に1-phenylethanol(rac.)を添加して抽出したＭＳ液体培地抽出物のＨＰＬＣの分析結果に示される1-phenylethanolのピーク（図１４参照）面積を１００％として考えた場合における、各経過日のリンゴのカルスが入ったＭＳ液体培地抽出物のＨＰＬＣの分析結果に示されるacetopheone および1-phenylethanolのピーク（図２１、２３、２５、２７等参照）面積比（％）である。表５は、図２８に示されるリンゴのカルスに1-phenylethanol(rac.)を添加して得られた経時変化の抽出物のＨＰＬＣの分析結果を数値で示す。
【００７１】
【表５】
【００７２】
図２８に示されるように、1-phenylethanolのピーク（図１４参照）面積（１００％）に対し、acetopheoneのピーク面積の比（％）は四角印で表し、1-phenylethanolのピーク面積の比（％）は三角印で表して、３日目から１４日目までのリンゴのカルスが入ったＭＳ液体培地抽出物のＨＰＬＣの各分析結果に基づきプロットした。図２８のプロットした結果に示されるように、９日目までは順調にリンゴのカルスによって1-phenylethanol
(rac.) が酸化されてacetopheoneを生成していた。しかし９日目から１２日目の間にコンタミネーションしたことで、acetophenoneの生成から1-phenylethanolの生成へと変化したことがわかった。
【００７３】
３．1-phenylethanol(rac.)を添加した６日目の抽出物と標品のdouble injectionのＨＰＬＣの結果
経時変化として得た６日目のリンゴカルス抽出物（1-phenylethano(rac.)添加）(図１７参照)と標品acetophenone（図７参照）とを混ぜ、double injectionを行った。図２９は、６日目のリンゴカルス抽出物（1-phenylethano(rac.)添加）と標品acetophenoneとを混ぜ、double injectionを行った結果の順相カラムでの分析結果を示す。図２９に示されるように、順相カラムでの保持時間約１１分のacetophenoneのピークが大きくなった。標品acetophenoneを添加してピークがずれないことから、混ぜる前のピークがacetophenoneであることがわかった。double injectionによる同定である。この結果より、リンゴのカルスに1-phenylethanol(rac.)を添加するとacetophenoneが生成するということがわかった。
【００７４】
２−５．考察
以上の結果より、リンゴのカルスは酸化反応を起こすということがわかった。そして、コンタミネーションの原因であるカビが還元反応を起こすということもわかった。リンゴのカルスによって起きた反応を以下の式３に示す。式３で「Jonagold」はりんごの品種である。
【００７５】
【化２】
【００７６】
上記式２の反応はおそらくリンゴのカルスの細胞の中で起こっていると考えられる。経時変化ではＭＳ液体培地をできるだけリンゴのカルスを吸わないようにしてマイクロピペットで取った。ＭＳ液体培地中では常に添加した基質の濃度が一定となるはずだが、経時変化における添加した基質のピークの高さを見ると、ピークの高さが一定ではないことが見てわかる。ゆえに、リンゴのカルスは一度添加した基質を取り込み、細胞内で酸化反応を起こし、ＭＳ液体培地中に生成物をリリースしたということが言える。
【００７７】
以上のように、本発明の実施例２によれば、アルコールを生体触媒の存在下で酸化させ、ケトンを得ることができる。生体触媒としては植物のカルス、特にリンゴのカルスを用いる。ここで、アルコールは1-phenylethanol(rac.)であり、ケトンはacetophenoneである。言い換えれば、上記リンゴのカルスは1-phenylethanol(rac.)を酸化してacetophenoneを得るための生体触媒であり、リンゴのカルス（酵素）が触媒するのは1-phenylethanol（基質）からacetophenone（生成物）への酸化反応となる。以上のように、化学反応の触媒となる生物自身が持つ酵素の働きを利用することにより、生物の細胞中で水を溶媒とし常温・常圧という温和（穏和）な条件下で、アルコールからケトンへの酸化を行なうことができるケトンの製造方法および生体触媒を提供することができる。
【実施例３】
【００７８】
実施例３では、アルコールを生体触媒の存在下で酸化させ、ケトンを得る別のケトンの製造方法について説明する。生体触媒としては植物のカルス、特にトウゴマのカルスを用いる。ここで、アルコールは１−フェニルエタノール（1-phenylethanol(rac.)）であり、ケトンはアセトフェノン（acetophenone）である。言い換えれば、上記トウゴマのカルスは1-phenylethanol(rac.)を酸化してacetophenoneを得るための生体触媒であり、トウゴマのカルス（酵素）が触媒するのは1-phenylethanol（基質）からacetophenone（生成物）への酸化反応となる。
【００７９】
３−１．基質の添加について
クリーンベンチ（登録商標）内で、３日間適切な量のＭＳ液体培地中で振とう暗培養させたトウゴマのカルスに、基質と反応しやすくするため界面活性剤としてTriton（登録商標）X-100を２０μｌ添加する。次によく振り混ぜた後に、1-phenylethanol(rac.)をトウゴマのカルスに２２μｌ添加した。添加後、２０℃で振とう暗培養させた。経時変化として、７日目、１４日目に１ｍｌ抽出した。総抽出は２１日目に行った。
【００８０】
３−２．基質添加後の培養条件について
基質を添加した後、クリーンルーム内で、２０℃で振とう暗培養させた。
【００８１】
３−３．抽出について
７日目、１４日目の経時変化では１ｍｌだけフラスコから取り、エーテルを用いて抽出した。２１日目の培養後の総抽出でもエーテルを用いて抽出した。細胞部はホモジナイザーを用いて、エーテルで抽出した。以下、実施例２のリンゴのカルスと同様であるが、抽出の操作を示す。
【００８２】
＜１ｍｌ抽出の操作＞
（１）クリーンベンチ（登録商標）内で、液体培地をねじ口試験管にマイクロピペットで１ｍｌ取る。
（２）液体培地にエーテルを１ｍｌ加え、２００回ボルテックスにかける。
（３）遠心機にかけて有機相、水相を分離させる。
（４）パスツールで別なねじ口試験管に有機相を移す。
（５）（２）、（３）および（４）の操作を合計で４回行う。
（６）有機相が入ったねじ口試験管に蒸留水を１ｍｌ入れ、２０回ボルテックスにかける。
（７）パスツールで水相を取り除く。
（８）（６）および（７）の操作を合計で２回行う。
（９）有機相に無水硫酸マグネシウムを舞うまで入れ、２〜３時間脱水させる。
（１０）脱水させた後に、セライトろ過をする。
（１１）遠心エバポレーターで１ｍｌまで濃縮する。その後、ＨＰＬＣにて分析する。
【００８３】
＜総抽出の操作＞
（１）３００ｍｌの分液ロートにロートとメッシュを設置し、カルスが入らないように液体培地のみを入れる。
（２）液体培地にエーテルを３０ｍｌ入れ、１０、２０、２０、５０、１００、１００回と、分液ロートのコックを開けながら分液ロートを振る。
（３）分液ロートを４０分静置し、静置した後に水相（液体培地）を１００ｍｌの分液ロートに落とす。
（４）液体培地にエーテルを２０ｍｌ入れ、分液ロートを３００回振り、３０分静置する。
（５）分液ロートを静置した後に、水相を三角フラスコに落とし、有機相を３００ｍｌの分液ロートに入れる。
（６）水相を再び１００ｍｌの分液ロートに入れ、（３）、（４）および（５）の操作を合計で４回行う。
（７）有機相を溜めた３００ｍｌの分液ロートに飽和食塩水を３０ｍｌ入れ、３０回振り、４０分静置する。
（８）分液ロートを静置した後に、水相を落とし、有機相をスリ付きの三角フラスコに入れる。
（９）有機相を入れた三角フラスコに、無水硫酸マグネシウムを舞うまで入れ、一晩脱水させる。
（１０）脱水させた後に、セライトろ過をし、単蒸留で濃縮する。その後、ＨＰＬＣにて分析する。
【００８４】
＜細胞部の抽出操作＞
（１）総抽出で液体培地と分けたカルスをホモジナイザーに入れる。
（２）カルスにエーテルを５ｍｌ加えて、ホモジナイザーですり潰しながら抽出する。
（３）パスツールで溶液を１００ｍｌの分液ロートに移す。
（４）（２）、（３）の操作を合計で５回行う。
（５）溶液を溜めた分液ロートに、飽和食塩水を２０ｍｌ入れ、３０回振り、４０分静置する。
（６）分液ロートを静置した後に、水相を落とし、有機相をスリ付きの三角フラスコに入れる。
（７）有機相を入れた三角フラスコに、無水硫酸マグネシウムを舞うまで入れ、一晩脱水させる。
（８）脱水させた後に、セライトろ過をし、単蒸留で濃縮し、ＨＰＬＣにて分析する。
【００８５】
３−４．結果
総抽出した抽出物のＨＰＬＣの結果、トウゴマのカルスで行った基質転換での経時変化で得た抽出物のＨＰＬＣの結果については省略する。
【００８６】
３−５．考察
トウゴマのカルスを使った基質転換の実験でわかったことは、液体培地の量に対して適切な量のトウゴマのカルスを用いると、トウゴマのカルスと基質とが反応しやすくなるということである。これは、基質とトウゴマのカルスの衝突率を低くしないために必要であると考えられる。
【００８７】
以上のように、本発明の実施例３によれば、アルコールを生体触媒の存在下で酸化させ、ケトンを得ることができる。生体触媒としては植物のカルス、特にトウゴマのカルスを用いる。ここで、アルコールは1-phenylethanol(rac.)であり、ケトンはacetophenoneである。言い換えれば、上記トウゴマのカルスは1-phenylethanol(rac.)を酸化してacetophenoneを得るための生体触媒であり、トウゴマのカルス（酵素）が触媒するのは1-phenylethanol（基質）からacetophenone（生成物）への酸化反応となる。以上のように、化学反応の触媒となる生物自身が持つ酵素の働きを利用することにより、生物の細胞中で水を溶媒とし常温・常圧という温和（穏和）な条件下で、アルコールからケトンへの酸化を行なうことができる別のケトンの製造方法および生体触媒を提供することができる。
【実施例４】
【００８８】
実施例４では、ケトンを生体触媒の存在下で還元させ、アルコールを得るアルコールの製造方法について説明する。生体触媒としては灰色カビ病菌（学名：Botrytis cinerea（B.
cinerea））を用いる。ここで、ケトンはアセトフェノン（acetophenone）であり、アルコールは１−フェニルエタノール（1-phenylethanol）である。言い換えれば、上記灰色カビ病菌はacetophenoneを還元して1-phenylethanolを得るための生体触媒であり、灰色カビ病菌（酵素）が触媒するのはacetophenone（基質）から1-phenylethanol（生成物）への還元反応となる。
【００８９】
４−１．基質の添加について
ＰＳ寒天培地上で培養した灰色カビ病菌をＰＳ液体培地に移し５日間培養させた灰色カビ病菌に、基質と反応しやすくするため界面活性剤としてTriton（登録商標）X-100を２０μｌ添加する。次によく振り混ぜた後に、基質としてacetophenoneを２２μｌ添加した。基質添加後、２０℃で７日間振とう暗培養させ、抽出した。
【００９０】
対称として、灰色カビ病菌を入れていないＰＳ液体培地にも同様に界面活性剤および基質を添加し、２０℃で７日間振とう暗培養させ、抽出した。
【００９１】
７日間経時変化を取らずに行った実験結果より、同様に灰色カビ病菌にacetophenoneを添加する実験を再度行い、１日毎に経時変化を取った。０日目、１日目、２日目に１ｍｌ抽出し、２日目の経時変化の結果より、３日目に総抽出した。
【００９２】
４−２．基質添加後の培養条件について
基質を添加した後、クリーンルーム内で、２０℃で振とう暗培養させた。
【００９３】
４−３．抽出について
経時変化では１ｍｌだけフラスコから取り、エーテルを用いて抽出した。培養後の総抽出ではエーテルを用いて抽出した。菌体はホモジナイザーを用いて、エーテルで抽出した。以下に抽出の操作を示す。
【００９４】
＜１ｍｌ抽出の操作＞
（１）クリーンベンチ（登録商標）内で、液体培地をねじ口試験管にマイクロピペットで１ｍｌ取る。
（２）液体培地にエーテルを１ｍｌ加え、２００回ボルテックスにかける。
（３）遠心機にかけて有機相、水相を分離させる。
（４）パスツールで別なねじ口試験管に有機相を移す。
（５）（２）、（３）および（４）の操作を合計で４回行う。
（６）有機相が入ったねじ口試験管に蒸留水を１ｍｌ入れ、２０回ボルテックスにかける。
（７）パスツールで水相を取り除く。
（８）（６）および（７）の操作を合計で２回行う。
（９）有機相に無水硫酸マグネシウムを舞うまで入れ、２〜３時間脱水させる。
（１０）脱水させた後に、セライトろ過をする。
（１１）遠心エバポレーターで１ｍｌまで濃縮する。その後、ＨＰＬＣにて分析する。
【００９５】
＜総抽出の操作＞
（１）３００ｍｌの分液ロートにロートとメッシュを設置し、菌体が入らないように液体培地のみを入れる。
（２）液体培地にエーテルを３０ｍｌ入れ、１０、２０、２０、５０、１００、１００回と、分液ロートのコックを開けながら分液ロートを振る。
（３）分液ロートを４０分静置し、静置した後に水相（液体培地）を１００ｍｌの分液ロートに落とす。
（４）液体培地にエーテルを２０ｍｌ入れ、分液ロートを３００回振り、３０分静置する。
（５）分液ロートを静置した後に、水相を三角フラスコに落とし、有機相を３００ｍｌの分液ロートに入れる。
（６）水相を再び１００ｍｌの分液ロートに入れ、（３）、（４）および（５）の操作を合計で４回行う。
（７）有機相を溜めた３００ｍｌの分液ロートに飽和食塩水を３０ｍｌ入れ、３０回振り、４０分静置する。
（８）分液ロートを静置した後に、水相を落とし、有機相をスリ付きの三角フラスコに入れる。
（９）有機相を入れた三角フラスコに、無水硫酸マグネシウムを舞うまで入れ、一晩脱水させる。
（１０）脱水させた後に、セライトろ過をし、単蒸留で濃縮する。その後、ＨＰＬＣにて分析する。
【００９６】
＜菌体の抽出操作＞
（１）総抽出で液体培地と分けた菌体をホモジナイザーに入れる。
（２）菌体にエーテルを５ｍｌ加えて、ホモジナイザーですり潰しながら抽出する。
（３）パスツールで溶液を１００ｍｌの分液ロートに移す。
（４）（２）、（３）の操作を合計で５回行う。
（５）溶液を溜めた分液ロートに、飽和食塩水を２０ｍｌ入れ、３０回振り、４０分静置する。
（６）分液ロートを静置した後に、水相を落とし、有機相をスリ付きの三角フラスコに入れる。
（７）有機相を入れた三角フラスコに、無水硫酸マグネシウムを舞うまで入れ、一晩脱水させる。
（８）脱水させた後に、セライトろ過をし、単蒸留で濃縮し、ＨＰＬＣにて分析する。
【００９７】
４−４．結果
１．総抽出で得た抽出物のＨＰＬＣの結果
（１）基質を添加した菌を入れていないＰＳ液体培地（菌なし液体培地抽出物）のＨＰＬＣの結果
図３０は、菌なし液体培地抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す。図３０に示されるように、順相カラムでの保持時間約１１分のacetophenoneのピークが出現した。図３０では、多少保持時間２０分台に小さなピークが見られるが、これはおそらくコンタミネーションが原因だと考えられる。図３１は、菌なし液体培地抽出物（1-phenylethanol(rac.)添加）の順相カラムでの分析結果を示す。図３１に示されるように、順相カラムでの保持時間約２３分の1-phenylethanolのピークが出現した。
【００９８】
（２）基質を添加した菌入りのＰＳ液体培地（菌あり液体培地抽出物）のＨＰＬＣの結果
図３２は、菌あり液体培地抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す。図３２に示されるように、順相カラムでの保持時間約１１分のacetophenoneのピークがほとんど見られず、順相カラムでの保持時間約２３分の1-phenylethanol のピークが見られた。これは、1-phenylethanolが生成したものと考えられる。図３３は、菌あり液体培地抽出物（1-phenylethanol(rac.)添加）の順相カラムでの分析結果を示す。図３３に示されるように、順相カラムでの保持時間約２３分の1-phenylethanolのピークが出現した。図３４は、菌ありＰＳ液体培地抽出物（acetophenone添加）のキラルカラムでのＨＰＬＣ分析結果を示す。図３４に示されるように、先に出ている（保持時間約９分の）小さなピークが（Ｒ）-1-phenylethanolであり、２つ目の（保持時間約５６分の）大きなピークが（Ｓ）-1-phenylethanolのピークである。（Ｒ）-体と（Ｓ）-体とのピーク面積の比率はおよそ７：９３であった。
【００９９】
（３）基質を添加し、菌体を磨り潰して抽出した抽出物（菌体のみ抽出物）のＨＰＬＣの結果
図３５は、菌体のみ抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す。図３５に示されるように、順相カラムでの保持時間約２３分の1-phenylethanol のピークが見られた。図３６は、菌体のみ抽出物（1-phenylethanol(rac.)添加）の順相カラムでの分析結果を示す。図３６に示されるように、順相カラムでの保持時間約２３分の1-phenylethanolのピークが出現した。以上のように、菌体のみ抽出物の場合も菌あり液体培地の場合と同様なピークが見られた。図３５および３６に示される保持時間約７分の辺りのピークは、抽出に用いたエーテル、ＰＳ液体培地に入っている微量成分が無保持のまま出てきたものである。図３７は、菌体のみ抽出物（acetophenone添加）のキラルカラムでのＨＰＬＣ分析結果を示す。図３７に示されるように、先に出ている（保持時間約９分の）ピークが（Ｒ）-1-phenylethanolであり、２つ目の（保持時間約５６分の）ピークが(S)-1-phenylethanolのピークである。菌ありＰＳ液体培地抽出物の場合（図３４）と同様に、菌体のみ抽出物で生成した1-phenylethanolの（Ｒ）-体、(S)-体の比率もおよそ７：９３であった。
【０１００】
２．経時変化で得た抽出物のＨＰＬＣの結果
（１）０日目の抽出物のＨＰＬＣの結果およびキラルカラムでのＨＰＬＣの分析結果
基質を添加した直後にＰＳ液体培地を１ｍｌ取り、抽出した抽出物のＨＰＬＣの結果を示す。図３８は、０日目の灰色カビ病菌抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す。図３８に示されるように、順相カラムでの保持時間約１１分のacetophenoneのピークが出現している。図３９は、０日目の灰色カビ病菌抽出物（acetophenone添加）のキラルカラムでの分析結果を示す。図３９に示されるように、保持時間約２５分にキラルカラムでのacetophenoneのピーク（図８参照）が出現している。図３８および３９に示されるように、acetopheoneのピークのみが見られ、acetophenoneは灰色カビ病菌と反応していないことがわかった。
【０１０１】
（２）１日目の抽出物のＨＰＬＣの結果およびキラルカラムでのＨＰＬＣの分析結果
図４０は、１日目の灰色カビ病菌抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す。図４０に示されるように、保持時間約２３分に順相カラムでの小さい1-phenylethanolのピークが出現している。図４１は、１日目の灰色カビ病菌抽出物（acetophenone添加）のキラルカラムでの分析結果を示す。図４１に示されるように、保持時間約５０分および５５分にキラルカラムでの小さい1-phenylethanolのピーク（図１０参照）が出現している。図４０および４１に示されるように、１日目で1-phenylethanolが生成していることがわかった。生成した1-phenylethanolの（Ｒ）-体、（Ｓ）-体の比率は３：２０であった。
【０１０２】
（３）２日目の抽出物のＨＰＬＣの結果およびキラルカラムでのＨＰＬＣの分析結果
図４２は、２日目の灰色カビ病菌抽出物（acetophenone添加）の順相カラムでの分析結果を示す。図４２に示されるように、順相カラムでの保持時間約１１分のacetopheoneのピークはほとんど見られず、順相カラムでの保持時間約２３分の1-phenylethanolのピークのみが出現している。図４３は、２日目の灰色カビ病菌抽出物（acetophenone添加）のキラルカラムでの分析結果を示す。図４３に示されるように、キラルカラムでのacetopheoneのピーク（保持時間約２３分）はほとんど見られず、保持時間約５０分および５５分にキラルカラムでの1-phenylethanolのピーク（図１０参照）が出現している。図４２および４３に示されるように、２日目でacetophenoneがほとんど全て反応したことがわかった。生成した1-phenylethanolの（Ｒ）-体、（Ｓ）-体の比率は３：９７であった。式４、５に生成した1-phenylethanolの（Ｒ）-体、（Ｓ）-体を各々示す。
【０１０３】
【化３】
【０１０４】
多少ではあるが、キラルカラムでのacetophenoneのピークが残っていたので、３日目にて抽出作業を行った。
【０１０５】
図４４は、以上のＨＰＬＣの結果より、灰色カビ病菌にacetophenoneを添加して得られた経時変化の抽出物のＨＰＬＣの分析結果のプロットを示す。図４４で横軸は経過時間（日）であり、縦軸は基質を添加した菌を入れていないＰＳ液体培地にacetopheoneを添加して抽出した菌なし液体培地抽出物のＨＰＬＣの分析結果に示されるacetopheone のピーク（図３０参照）面積を１００％として考えた場合における、各経過日の灰色カビ病菌が入った灰色カビ病菌抽出物のＨＰＬＣの分析結果に示されるacetopheone および1-phenylethanolのピーク（図３８、４０、４２等参照）面積比（％）である。表６は、図４４に示される灰色カビ病菌にacetophenoneを添加して得られた経時変化の抽出物のＨＰＬＣの分析結果を数値で示す。
【０１０６】
【表６】
【０１０７】
図４４に示されるように、acetopheone のピーク（図３０参照）面積（１００％）に対し、acetopheoneのピーク面積の比（％）は四角印で表し、1-phenylethanolのピーク面積の比（％）は三角印で表して、０日目から３日目までの灰色カビ病菌が入った灰色カビ病菌抽出物のＨＰＬＣの各分析結果に基づきプロットした。図４４のプロットした経時変化の結果に示されるように、灰色カビ病菌によってacetophenoneが３日でほぼ１００％1-phenylethanolに還元されるということがわかった。
【０１０８】
さらに、1-phenylethanolの（Ｒ）-体、（Ｓ）-体の比率は、１日目では（Ｒ）：（Ｓ）＝１３：８７、２日目では（Ｒ）：（Ｓ）＝２．７：９７．３、３日目では（Ｒ）：（Ｓ）＝２．６：９７．４であり、最終的に（Ｓ）-体を９４％eeで生成したことがわかった。
【０１０９】
４−５．考察
上記の結果より、灰色カビ病菌を用いた基質転換ではacetophenoneが還元されて1-phenylethanolを生成することがわかった。さらに光学活性体を生成することがわかり、（Ｒ）-体よりも（Ｓ）-体を多く生成したことがわかった。（Ｒ）-体と（Ｓ）-体との比率は７：９３であった。
【０１１０】
経時変化の結果より、灰色カビ病菌を用いた基質転換で起こった還元反応は、３日で原料であるacetophenoneがほぼ１００％還元され、1-phenylethanolを生成したということがわかった。さらに、（Ｒ）-体、（Ｓ）-体が３：９７の比率で生成するということもわかった。灰色カビ病菌によって起きた反応を以下のスキーム（式６）に示す。
【０１１１】
【化４】
【０１１２】
以上のように、本発明の実施例４によれば、ケトンを生体触媒の存在下で還元させ、アルコールを得ることができる。生体触媒としては灰色カビ病菌（学名：Botrytis cinerea（B. cinerea））を用いる。ここで、ケトンはアセトフェノン（acetophenone）であり、アルコールは１−フェニルエタノール（1-phenylethanol）である。言い換えれば、上記灰色カビ病菌はacetophenoneを還元して1-phenylethanolを得るための生体触媒であり、灰色カビ病菌（酵素）が触媒するのはacetophenone（基質）から1-phenylethanol（生成物）への還元反応となる。以上のように、化学反応の触媒となる生物自身が持つ酵素の働きを利用することにより、生物の細胞中で水を溶媒とし常温・常圧という温和（穏和）な条件下で、ケトンからアルコールへの還元を行なうことができ、且つ穏和な反応条件下でキラルなアルコール（キラル化合物）を生成することができるアルコールの製造方法および生体触媒を提供することができる。
【０１１３】
総括．
リンゴの組織培養およびトウゴマの組織培養を用いた場合、1-phenylethanolからacetophenoneを生成するという酸化反応を起こすことがわかった。液体培地の量に対して適切な量のトウゴマのカルスを用いると、トウゴマのカルスと基質とが反応しやすくなるということも判明した。
【０１１４】
さらに、光学活性体である1-phenylethanolの（Ｒ）-体、（Ｓ）-体のどちらも、カルスによって酸化されてacetophenoneを生成した。（Ｒ）-体、（Ｓ）-体の反応率はほぼ１：１であった。
【０１１５】
灰色カビ病菌を用いた場合、acetophenoneが還元されて1-phenylethanolを生成することがわかった。さらに光学活性体を生成し、（Ｒ）-体、（Ｓ）-体の比率を見ると（Ｒ）-体よりも（Ｓ）-体を多く生成したことがわかった。その鏡像体過剰率は９４％eeであった。式７、８に生成した1-phenylethanolの（Ｒ）-体、（Ｓ）-体を各々示す。
【０１１６】
【化５】
【０１１７】
リンゴのカルスを用いた実験で、カルスを入れていないMS液体培地がコンタミネーションして1-phenylethanolを生成したが（図１３参照）、それらでは（Ｓ）-体よりも（Ｒ）-体のほうが多く生成されていた（図１５参照）。MS液体培地の方では、おそらくバクテリア（細菌類）が生えたのではないかと見た目から判断した。これらの結果より、真菌類（カビ）は（Ｓ）-体を多く生成することがわかり、細菌類（バクテリア）は（Ｒ）-体を多く生成するのではないかと考えられる。
【０１１８】
今後の展望として、細菌類（バクテリア）や真菌類（カビ）を用いることで安価なキラル化合物の製造につながること、実験結果より反応の速度が速いことからキラル化合物の大量生産にもつながること等が考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１１９】
本発明の活用例として、アルコールからケトンへの酸化およびケトンからアルコールへの還元を穏和な反応条件下で行ない、且つ穏和な反応条件下でキラルなアルコールを生成するケトンの製造方法、アルコールの製造方法に適用することができる。特に、細菌類（バクテリア）や真菌類（カビ）を用いることによる安価なキラル化合物の製造、反応の速度が速いことによるキラル化合物の大量生産に適用することができる。
【符号の説明】
【０１２０】
１ １００ｍｌ三角フラスコ、 ２ シャーレ、 ５ ＭＳ寒天培地（固体培地）、 ６ ＭＳ液体培地、 ７ ＰＳＡ寒天培地、 ８ ＰＳ液体培地、 １０ リンゴの新芽、 １１ トウゴマの根、 １２ 灰色カビ病菌
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０１２１】
【非特許文献１】A. K. Sharma and D. Swern, TetrahedronLett., 1503, (1974) .
【非特許文献２】A. J. Mancuso and D. Swern, Synthesis,70, (1971).
【非特許文献３】S. Takano, T. Yamane, M. Takahashi and K. Ogasawara, Synlett., 410, (1992).
【非特許文献４】J. G. de Vries and R. M.Kellogg, J. Org. Chem., 45, 4126, (1980).
【非特許文献５】E. L. Eliel, J. E. Lynch, F.Kume and S. V. Frye, Org. Synth VIII, 302,(1993).
【非特許文献６】Kaoru Nakamura , Mikio Fujii and Yoshiteru Ida,Stereoinversion of arylethanols by Geotrichum candidum Tetrahedron : Asymmetry 12 (2001) 3147-3157.
【非特許文献７】Kaoru Nakamura , Masato HIGAKI , Kazutoshi USHIO, Shinzaburo OKA and Atsuyoshi OHNO, STEREOCHEMICAL CONTROL OF MICROBIAL REDUCTION. Tetrahedron Letters , Vol. 26, No. 35 ,pp 4213-4216,1985.
【非特許文献８】Kaoru Nakamura , Mikio Fujii and Yoshiteru Ida, Asymmetric reduction of ketones by Geotrichum candidum inthe presence of Amberlite XAD,a solid organic solvent J. Chem. Soc.,Perkin Trans. 1 , 2000 , 3205-3211.
【非特許文献９】Mikio Fujii , Hiroyuki Akita , Yoshiteru Ida ,Toshiya Nakagawa and Kaoru Nakamura, Control ofchemoselectivity of microbial reaction with resin adsorbent : enhancement of Baeyer-Villiger oxidation over reduction Appl Microbial Biotechnol (2007) 77 : 45-51.
【非特許文献１０】K. Ogura , T. Koyama,in : K. Ogura , U. Sankawa(Eds.) , Dynamic Aspects of Natural Products Chemistry, Molecular Approaches ,Kondansha , Tokyo , 1997.
【非特許文献１１】T. Koyama , K. Ogura , Comprehensive Natural Product Chemistry , vol. 2 ,Pergamon , Oxford , 1999,p69.
【非特許文献１２】K. Ogura , T. Koyama , Chem. Rev. 98 (1998) 1263.
【非特許文献１３】M. Nagaki , M. Nakada , T. Musashi , J. Kawakami, N. Ohya , M. Kurihara , Y. Maki , T. Nishino, T. Koyama , Biosci.Biotechnol. Biochem. 71 (2007) 1657.
【非特許文献１４】M. Nagaki , H. Yamamoto , A. Takahashi , Y. Maki, J. Ishibashi , T. Nishino , T. Koyama , J. Mol. Catal. B : Enzym. 17 (2002) 81.
【非特許文献１５】Second Revised Edition PLANT TISSUE CULTURE METHODS National Research Council of Canada, Prairie Resional Laboratory.
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルコールを生体触媒の存在下で酸化させ、ケトンを得ることを特徴とするケトンの製造方法。
【請求項２】
請求項１記載のケトンの製造方法において、前記生体触媒は植物のカルスであることを特徴とするケトンの製造方法。
【請求項３】
請求項２記載のケトンの製造方法において、前記植物はリンゴ（Malus pumila）又はトウゴマであることを特徴とするケトンの製造方法。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれかに記載のケトンの製造方法において、前記アルコールは１−フェニルエタノール（1-phenylethanol(rac.)）であり、前記ケトンはアセトフェノン（acetophenone）あることを特徴とするケトンの製造方法。
【請求項５】
ケトンを生体触媒の存在下で還元させ、アルコールを得ることを特徴とするアルコールの製造方法。
【請求項６】
請求項５記載のアルコールの製造方法において、前記生体触媒は灰色カビ病菌（Botrytis cinerea）であることを特徴とするアルコールの製造方法。
【請求項７】
請求項５又は６記載のアルコールの製造方法において、前記ケトンはアセトフェノン（acetophenone）であり、前記アルコールは１−フェニルエタノール（1-phenylethanol）であることを特徴とするアルコールの製造方法。
【請求項８】
１−フェニルエタノール（1-phenylethanol(rac.)）を酸化してアセトフェノン（acetophenone）を得るための生体触媒であって、該生体触媒はリンゴ（Malus pumila）又はトウゴマのカルスであることを特徴とする生体触媒。
【請求項９】
請求項８記載の生体触媒において、該生体触媒がリンゴ（Malus pumila）のカルスの場合、カルス化させるためのＭＳ（Murashige & Skoog）培地の成分に植物ホルモンとして２，４−ジクロロフェノキシ酢酸を１０μＭ及びカイネチンを１μＭ含むことを特徴とする生体触媒。
【請求項１０】
アセトフェノン（acetophenone）を還元して１−フェニルエタノール（1-phenylethanol）を得るための生体触媒であって、該生体触媒は灰色カビ病菌（Botrytis cinerea）であることを特徴とする生体触媒。
【請求項１】
アルコールを生体触媒の存在下で酸化させ、ケトンを得ることを特徴とするケトンの製造方法。
【請求項２】
請求項１記載のケトンの製造方法において、前記生体触媒は植物のカルスであることを特徴とするケトンの製造方法。
【請求項３】
請求項２記載のケトンの製造方法において、前記植物はリンゴ（Malus pumila）又はトウゴマであることを特徴とするケトンの製造方法。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれかに記載のケトンの製造方法において、前記アルコールは１−フェニルエタノール（1-phenylethanol(rac.)）であり、前記ケトンはアセトフェノン（acetophenone）あることを特徴とするケトンの製造方法。
【請求項５】
ケトンを生体触媒の存在下で還元させ、アルコールを得ることを特徴とするアルコールの製造方法。
【請求項６】
請求項５記載のアルコールの製造方法において、前記生体触媒は灰色カビ病菌（Botrytis cinerea）であることを特徴とするアルコールの製造方法。
【請求項７】
請求項５又は６記載のアルコールの製造方法において、前記ケトンはアセトフェノン（acetophenone）であり、前記アルコールは１−フェニルエタノール（1-phenylethanol）であることを特徴とするアルコールの製造方法。
【請求項８】
１−フェニルエタノール（1-phenylethanol(rac.)）を酸化してアセトフェノン（acetophenone）を得るための生体触媒であって、該生体触媒はリンゴ（Malus pumila）又はトウゴマのカルスであることを特徴とする生体触媒。
【請求項９】
請求項８記載の生体触媒において、該生体触媒がリンゴ（Malus pumila）のカルスの場合、カルス化させるためのＭＳ（Murashige & Skoog）培地の成分に植物ホルモンとして２，４−ジクロロフェノキシ酢酸を１０μＭ及びカイネチンを１μＭ含むことを特徴とする生体触媒。
【請求項１０】
アセトフェノン（acetophenone）を還元して１−フェニルエタノール（1-phenylethanol）を得るための生体触媒であって、該生体触媒は灰色カビ病菌（Botrytis cinerea）であることを特徴とする生体触媒。
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１１−１０９９９２（Ｐ２０１１−１０９９９２Ａ）
【公開日】平成２３年６月９日（２０１１．６．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２７０８８７（Ｐ２００９−２７０８８７）
【出願日】平成２１年１１月２８日（２００９．１１．２８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２１年９月１９日 日本化学会東北支部発行の「平成２１年度化学系学協会東北大会プログラムおよび講演予稿集」に発表
【出願人】（５０４２２９２８４）国立大学法人弘前大学 (162)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年６月９日（２０１１．６．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月２８日（２００９．１１．２８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２１年９月１９日 日本化学会東北支部発行の「平成２１年度化学系学協会東北大会プログラムおよび講演予稿集」に発表
【出願人】（５０４２２９２８４）国立大学法人弘前大学 (162)
【Ｆターム（参考）】
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