コリンの定量方法
【課題】コリンの定量方法において、途中発生する定量を省略し、より少ない工程の定量を行うこと。
【解決手段】振動反応を利用したコリンの定量方法とする。また、その振動反応は、過酸化水素およびコリンを含む第一の溶液を、カタラーゼ及びコリンオキシダーゼを含む第二の溶液に、半透膜を介して浸透させることによって行う反応であることを特徴とするコリンの定量方法とする。
【解決手段】振動反応を利用したコリンの定量方法とする。また、その振動反応は、過酸化水素およびコリンを含む第一の溶液を、カタラーゼ及びコリンオキシダーゼを含む第二の溶液に、半透膜を介して浸透させることによって行う反応であることを特徴とするコリンの定量方法とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はコリンの定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コリンは体内でアミノ酸から合成される水溶性のビタミン様物質で、遊離または結合した状態（ホスファチジルコリン、アセチルコリン）で種々の動植物組織、特に脳、胆汁、卵黄、種子に含まれる。細胞膜の浸透圧の調節、ビタミンＢ複合体の１つとしての脂肪肝因子の作用、アセチルコリンとして血圧調節及び神経伝達に関与するなど種々の重要な生理作用に関係している。
【０００３】
従来のコリンの定量に関する技術としては、例えば、コリン脱水素酵素（コリンデヒドロゲナーゼ）を用いてアンペロメトリ型コリンセンサーによりするか、蛍光測定法に基づいて定量する方法が下記特許文献１に記載されている。またコリンオキシダーゼを用いてコリンを酸化した際に生成する過酸化水素を定量し、それに基づいて乳酸を定量する方法も行われている。
【０００４】
【特許文献１】特開平11-101776号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
コリンを酸化した際に生成する過酸化水素を定量し、それからコリンを定量するという２段階以上の操作が必要となる。また通常、酵素と基質である反応物を一緒の容器に入れ反応させると、生成物が時間とともに単調に増加し、最終的には平衡状態になる。従来はこの方法を用いて反応物に特異的に作用する酵素を使い生体物質の定量を行ってきた。これまでの酵素反応を利用したコリンの定量も例外ではなくこのような方法を利用している。
【０００６】
ところで、半透膜を用いて基質をゆっくりと酵素の溶液内に浸透させると、反応物や生成物の濃度が時間とともに周期的に増減する振動反応が起こる場合がある。例えば酵素としてカタラーゼを、基質として過酸化水素を用いると次の反応が起こって酸素が発生すると同時にこの逆反応も起ることがある。つまり溶存している酸素が振動する場合があるのである。但し、振動反応が起こるためには基質の適当な透過速度と生成物（この場合には酸素）の適度な排出が必要である。
【数１】
なお、この系にもう一つの酵素であるグルコースオキシダーゼとこの酵素の基質であるグルコースを添加しておくとグルコースの濃度とともに振動の周期が長くなり、ある濃度範囲ではグルコース濃度と振動の周期が直線関係で、グルコースの定量に利用できることがわかっている。しかし、もともと非線形現象である振動反応をコリンの定量にまで適用することについては記載がない。
【０００７】
以上、本発明は、上記を鑑みコリンの定量方法において、途中発生する定量を省略し、より少ない工程の定量を行うことを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、本発明に係るコリンの定量方法は、振動反応を利用する。これまでのコリンオキシダーゼを利用した方法では、生成した過酸化水素をカタラーゼで分解させ生成した酸素量を測定するなど最低２段階の操作を必要とした。しかし振動反応を利用したこの方法では酸素量の振動を測定するだけで直接コリンの定量化が可能となる。また少量の試料で測定が可能となる。
【０００９】
また本発明に係るコリンの定量方法において、振動反応は過酸化水素を含む第一の溶液を、カタラーゼ及びコリンオキシダーゼを含む第二の溶液に半透膜を介して浸透させることによって行う反応とすることも望ましい。また、半透膜は透析膜若しくはミリポアフィルターとすることも望ましい。
【００１０】
また本発明に係るの定量方法において、第二の溶液は、カタラーゼを０．０５〜１ｍｇ／ｍｌ、コリンオキシダーゼを５×１０−５〜１×１０−３ｍｇ／ｍｌの範囲で含有してなることも望ましい。この範囲にすることにより、もともと非線形現象である振動反応を判別可能な程度の傾きを有する直線関係に近似させ、明確に定量化することができるようになる。カタラーゼが０．０５ｍｇ／ｍｌより小さい場合は振動反応の周期が不規則になってしまい、直線関係に近似することが難しくなり、一方１ｍｇ／ｍｌより大きい場合は、振動反応の周期との濃度の関係が無関係で周期はほぼ一定であり、定量に適していない。また０．０５〜１ｍｇ／ｍｌの場合であっても、コリンオキシダーゼが５×１０−５〜ｍｇ／ｍｌより小さいときは、直線関係に現した場合その傾きが小さく定量には不適当となり、１×１０−３ｍｇ／ｍｌより大きいときにも振動反応の周期が不規則になってしまい、直線関係に近似することが難しくなる。
【００１１】
また本発明にかかるコリンの定量方法において、第一の溶液におけるコリン濃度は、４×１０−５〜５×１０−４ｍｏｌ／ｌの範囲内であることも望ましい。
【００１２】
また、本発明のコリンの定量方法は、過酸化水素及びコリンを含む第一の溶液を、カタラーゼ、コリンオキシダーゼを含む第二の溶液に半透膜を介して浸透させ、前記第二の溶液における溶存酸素の濃度変化に基づいて、前記第一の溶液に含まれるコリン濃度を算出するコリンの定量方法とする。なおこの場合において、半透膜は透析膜若しくはミリポアフィルターとすることも望ましい。
【００１３】
またこのコリンの定量方法においては、第二の溶液はカタラーゼを０．０５〜１ｍｇ／ｍｌ、コリンオキシダーゼを５×１０−５〜１×１０−３ｍｇ／ｍｌの範囲で含有してなることも望ましい。この範囲にすることにより、もともと非線形現象である振動反応の周期とコリン濃度の関係を直線関係に近似させ、明確に定量化することができるようになる。
【００１４】
またこのコリンの定量方法においては、第一の溶液のコリン濃度は４×１０−５〜５×１０−４ｍｏｌ／ｌの範囲内であることが望ましい。
【００１５】
また本発明に係るコリンの定量装置は、過酸化水素及びコリンを含有する第一の溶液を保持する第一の容器と、カタラーゼ、コリンオキシダーゼを含む第二の溶液を保持する第二の容器と、第一の容器と第二の容器との間に配置され、第一の溶液を第二の溶液に浸透させる半透膜と、第二の溶液に浸されるよう配置される酸素電極と、酸素電極に接続される溶存酸素計と、溶存酸素計に接続される情報処理装置と、を有することとする。
【発明の効果】
【００１６】
以上本発明は、振動反応を用いてその溶存酸素濃度を測ることにより簡単にコリンの定量を行うことができるため、その他途中発生する定量を省略し、より少ない工程の定量を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
まず、本発明が利用する原理について図１を用いて説明する。
半透膜を挟んだ２つの容器の一方に、カタラーゼ、コリンオキシダーゼを入れ、他方の容器に過酸化水素水溶液およびコリンの溶液を入れる。すると、過酸化水素水がゆっくりと半透膜を透過してカタラーゼと反応し、酸素を発生させる。一方、酸素が発生すると、コリンオキシダーゼがこの酸素を用いてコリンエステラーゼの作用によって半透膜を透過してきたコリンを酸化し、過酸化水素を発生させる。即ちこの一連の流れが循環過程となり、しかもその過酸化水素水の濃度が振動する振動反応となる。なおこの場合、酵素水溶液中に溶存している酸素の量を溶存酸素計で測定すると、溶存酸素の濃度は周期的に振動する。特にカタラーゼ等の諸条件が所定の濃度範囲にある場合は溶存酸素量の振動周期がコリンの濃度と直線関係になり、この関係を用いてコリンの定量に利用することができるようになる。即ちこれを利用してコリンが含まれている種々の状態に対しコリンの定量化が可能となる。なお、この場合においてカタラーゼの望ましい範囲としては、０．０５〜１ｍｇ／ｍｌ、コリンエステラーゼが５×１０−4〜１×１０−3ｍｇ／ｍｌの範囲であることであることが望ましい。この濃度範囲とすることにより、非線形な関係である振動反応の周期とコリンの濃度関係が直線関係になるためである。なお、過酸化水素水の濃度については、溶存酸素計の測定限度及び振動周期の規則性の観点から０．５〜１．０重量％の範囲であることが望ましい。なおこれより過酸化水素濃度が小さい場合、振動は不規則になるおそれがある。
【００１８】
以下本発明の実施例につき、図面を用いながら具体的に説明する。
【実施例１】
【００１９】
図２に本発明の実施例に係る装置（以下単に「本装置」という。）の図を示す。
図２に示すように本装置は、第一の容器１、第二の容器２、第一の容器と第二の容器とを繋ぐ接続管３、その接続管３の中に配置された半透膜４、第二の容器に挿入される酸素電極５、この酸素電極５に電気的に接続された溶存酸素計６、この溶存酸素計６に電気的に接続された情報処理装置７、を有して構成されている。
【００２０】
最初の状態において、第一の容器側には０．６％の過酸化水素水溶液２０ｍｌとコリン溶液０．１ｍｌが、第二の容器側にはカタラーゼ２．５ｍｇ、コリンオキシダーゼ０．０４５ｍｇを含む水溶液２５ｍｌが入れてある（カタラーゼ、コリンオキシダーゼを含む側の溶液を以下単に「酵素溶液」という。）。なお第一の容器１、第二の容器２のいずれもガラスにより構成されており、それぞれは上端が開いた円筒形状に形成され、内径は３ｃｍである。
【００２１】
接続管３は、第一の容器１、第二の容器２の間に配置され、これらの容器内を接続する。本実施例の接続管３も第一の容器１、第二の容器２と同様ガラスにより構成されており、第一及び第二の容器、接続管３は一体に構成されている。なお接続管の内径は１ｃｍである。
【００２２】
半透膜４は、溶液における成分の一部は通すが他の成分は通さない膜であって、本実施例では第一の容器１と第二の容器２との間に配置される流路３に設けられた透析膜を用いている（材質：αセルロース、分画分子量１２，０００〜１４，０００）。なお、半透膜４は、上記機能を奏する限りにおいて透析膜に限られることはなく、例えばミリポアフィルターなども好適に用いることができる。
【００２３】
酸素電極５は、第二の容器内、しかも第二の容器に保持される酵素溶液に浸されるよう配置されている。酸素電極５は酸素溶液中の溶存酸素がこの電極上で還元されて水になるときに生じる電子の量に応じ電位を発生させるものであって、一般に市販されている周知な酸素電極を用いることができる。
【００２４】
溶存酸素計６は、この酸素電極５の電位の発生を受け、この電位の値に基づいて溶存酸素の濃度を算出するものであって、これについても一般に市販されている周知な溶存酸素計を用いることができる。
【００２５】
情報処理装置７は、溶存酸素計７からの出力を受け、まずその出力から振動反応の周期を求める。具体的には、電位の値を経時的に取得し、時間に対する電位のデータを作成する。そしてこの経時的な電位のデータを解析することで振動反応の周期を計算する。そして更に、求めた周期と予め求めてある周期−コリン量の関係からコリンの定量を行う。
【００２６】
具体的に本実施例では、情報処理装置としてコンピュータを用いて上記処理を行う。より具体的に説明すると、本装置のコンピュータは、図３で示すように、溶存酸素計が測定する溶存酸素の濃度に対応するデータ（以下「溶存酸素濃度データ」という。）を受け付け、その溶存酸素濃度データをその濃度を示した時刻のデータ（以下「時刻データ」という。）とともに記録する溶存酸素データ取得手段７０１と、その時刻データと溶存酸素濃度データとの関係に基づいて振動反応の周期を判断する周期判断手段７０２と、コリンの濃度と振動反応の周期との関係を予め記憶してある周期−コリン関係記録手段７０３と、振動反応の周期と、コリンの濃度と振動反応の周期との関係に基づいてコリンの定量を行うコリン定量手段７０４と、を実施させるためのプログラムが、記録媒体であるハードディスクに格納され、実行されることでコリンの定量を行うことができる。またこの場合において、コリンの濃度と振動反応の周期は、カタラーゼやコリンオキシダーゼの濃度等によって直線の傾きや直線関係を示す範囲が異なるため、周期−コリン関係記録手段はその条件の入力を受付け、記録する機能をも有すること、更にはその入力に対応する条件に合致した振動の周期とコリンの濃度との関係を読み出すようにする（もちろん予め当該関係を記憶しておくことが必要である）ことがより望ましい。なおもちろん上記各手段は、記録媒体であればハードディスク以外の記録媒体であっても差し支えはなく、上記の機能を実行することができる限りにおいてプログラムでなくても良い。これは、種々操作の容易性の観点からプログラムが望ましい、という実施例を示したものである。
【００２７】
次に上記の構成をもとに測定を行った。以下説明する。
この測定において、コリンの量（濃度）をさまざまに変化させて６種類の試料を用意し、そのそれぞれに対して測定を行った。なおコリンの量（濃度）以外は上述の条件（カタラーゼ：０．１ｍｇ／ｍｌ、コリンオキシダーゼ：７．２×１０−５ｍｇ／ｍｌ）として固定した。表１に加えたコリンの濃度を示す。そしてその溶液中の０．１ｍｌにおける濃度を下記表１のように調整し、カタラーゼ等を混合した溶液に加え、全体として２５ｍｌの酵素溶液にした。表１に溶液に溶かしたコリンの量、濃度及び振動反応の周期を記載する。なお図４に表１における試料溶液番号２の場合の溶存酸素量の時間変化の例を示す。図４において横軸は時間（時間）を、縦軸は溶存酸素量（ｍｇ／ｌ）をそれぞれ示している。また本実施例における周期とは、振動反応が開始してから十分な時間が経過し、周期がほぼ一定になった場合における値を採用している。なおほぼ一定になるまでに要した十分な時間は反応を開始させてから概ね１〜２時間程度であった。
【表１】
【００２８】
表１の結果に対し、コリンの濃度に対する振動反応の周期を求めたものを図５に示す。横軸はコリンの濃度（Ｍ）を、縦軸は振動の周期（分）を示す。
【００２９】
この結果、振動の周期とコリンの濃度との関係は直線によって非常によく説明することができた。特に、本実施例ではコリンの濃度は２．０×１０−６〜３×１０−５Mの範囲で非常によく説明できており、この範囲であれば十分直線によって近似することができると考えられる。なお、コリンが２．０×１０−６Ｍより小さい場合、また１×１０−５Ｍより大きい場合は直線に載っておらず、コリンの範囲としても上記の範囲内であることが望ましいことが確認できた。
【００３０】
以上、カタラーゼ、コリンオキシダーゼを用いて振動反応を利用することで、コリンの濃度を定量することができる。特に、カタラーゼ及びコリンオキシダーゼを所定の濃度範囲にすることで規則的な振動反応を起こし、その周期を求めることでコリンの濃度を定量することができる。
【００３１】
また、本実施例では、第一の容器１と第二の容器２、そしてその容器の間を繋げる流路３とを用いて構成されているが、容器形状はこれに限られず、例えば図６で示されるように、一つの容器を仕切板で仕切り、窓を開けて半透膜を配置する構成ももちろん可能である。
【００３２】
（比較例１）
一方、上記実施例において、コリンオキシダーゼの濃度が大きい場合において、実施例１における範囲の適性を調べた。以下説明する。
【００３３】
溶液として、コリンオキシダーゼが７．２×１０−４ｍｇ／ｍｌの濃度のものを用いた。また第一の溶液に過酸化水素、コリンを加えておく。
この結果を表２及び図７に示す。
【表２】
【００３４】
コリンオキシダーゼ濃度を１０倍にすると、直線の得られる範囲が１．０×１０−６〜５×１０−６Mとなり、より低いコリン濃度を定量するときに適当であることがわかる。
【００３５】
（比較例２）
一方、上記実施例において、アセチルコリンが共存するとき、実施例１における範囲の適性を調べた。以下説明する。
【００３６】
溶液として、コリンオキシダーゼが７．２×１０−５ｍｇ／ｍｌの濃度のものを用いた。また第一の溶液に過酸化水素、コリンの他に一定量のアセチルコリン（０．００００１Ｍ）を加えておく。
この結果を表３及び図８に示す。
【表３】
【００３７】
０．００００１Ｍのアセチルコリンが共存するときには直線の得られる範囲がコリン濃度３．０×１０−４〜１×１０−４Mとなり、高い濃度領域で直線がえられることがわかる。またこの直線が得られる範囲では、コリン濃度の増加とともに周期が短くなることがわかる。共存するアセチルコリンの濃度に対応するコリンの検量線を作成する必要がある。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】振動反応の反応機構を示す図。
【図２】実施例１におけるコリンの定量装置の概略図。
【図３】実施例１における情報処理装置７の機能ブロックを示す図。
【図４】実施例１における振動反応における溶存酸素量の時間変化を示す図。
【図５】実施例１におけるコリン濃度と周期との関係を示す図。
【図６】コリンの定量装置における他の容器例を示す図。
【図７】比較例１におけるコリン濃度と周期との関係を示す図。
【図８】比較例２におけるコリン濃度と周期との関係を示す図。
【符号の説明】
【００３９】
１…第一の容器、２…第二の容器、３…連絡管、４…半透膜、５…酸素電極、６…溶存酸素計、７…情報処理装置
【技術分野】
【０００１】
本発明はコリンの定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コリンは体内でアミノ酸から合成される水溶性のビタミン様物質で、遊離または結合した状態（ホスファチジルコリン、アセチルコリン）で種々の動植物組織、特に脳、胆汁、卵黄、種子に含まれる。細胞膜の浸透圧の調節、ビタミンＢ複合体の１つとしての脂肪肝因子の作用、アセチルコリンとして血圧調節及び神経伝達に関与するなど種々の重要な生理作用に関係している。
【０００３】
従来のコリンの定量に関する技術としては、例えば、コリン脱水素酵素（コリンデヒドロゲナーゼ）を用いてアンペロメトリ型コリンセンサーによりするか、蛍光測定法に基づいて定量する方法が下記特許文献１に記載されている。またコリンオキシダーゼを用いてコリンを酸化した際に生成する過酸化水素を定量し、それに基づいて乳酸を定量する方法も行われている。
【０００４】
【特許文献１】特開平11-101776号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
コリンを酸化した際に生成する過酸化水素を定量し、それからコリンを定量するという２段階以上の操作が必要となる。また通常、酵素と基質である反応物を一緒の容器に入れ反応させると、生成物が時間とともに単調に増加し、最終的には平衡状態になる。従来はこの方法を用いて反応物に特異的に作用する酵素を使い生体物質の定量を行ってきた。これまでの酵素反応を利用したコリンの定量も例外ではなくこのような方法を利用している。
【０００６】
ところで、半透膜を用いて基質をゆっくりと酵素の溶液内に浸透させると、反応物や生成物の濃度が時間とともに周期的に増減する振動反応が起こる場合がある。例えば酵素としてカタラーゼを、基質として過酸化水素を用いると次の反応が起こって酸素が発生すると同時にこの逆反応も起ることがある。つまり溶存している酸素が振動する場合があるのである。但し、振動反応が起こるためには基質の適当な透過速度と生成物（この場合には酸素）の適度な排出が必要である。
【数１】
なお、この系にもう一つの酵素であるグルコースオキシダーゼとこの酵素の基質であるグルコースを添加しておくとグルコースの濃度とともに振動の周期が長くなり、ある濃度範囲ではグルコース濃度と振動の周期が直線関係で、グルコースの定量に利用できることがわかっている。しかし、もともと非線形現象である振動反応をコリンの定量にまで適用することについては記載がない。
【０００７】
以上、本発明は、上記を鑑みコリンの定量方法において、途中発生する定量を省略し、より少ない工程の定量を行うことを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、本発明に係るコリンの定量方法は、振動反応を利用する。これまでのコリンオキシダーゼを利用した方法では、生成した過酸化水素をカタラーゼで分解させ生成した酸素量を測定するなど最低２段階の操作を必要とした。しかし振動反応を利用したこの方法では酸素量の振動を測定するだけで直接コリンの定量化が可能となる。また少量の試料で測定が可能となる。
【０００９】
また本発明に係るコリンの定量方法において、振動反応は過酸化水素を含む第一の溶液を、カタラーゼ及びコリンオキシダーゼを含む第二の溶液に半透膜を介して浸透させることによって行う反応とすることも望ましい。また、半透膜は透析膜若しくはミリポアフィルターとすることも望ましい。
【００１０】
また本発明に係るの定量方法において、第二の溶液は、カタラーゼを０．０５〜１ｍｇ／ｍｌ、コリンオキシダーゼを５×１０−５〜１×１０−３ｍｇ／ｍｌの範囲で含有してなることも望ましい。この範囲にすることにより、もともと非線形現象である振動反応を判別可能な程度の傾きを有する直線関係に近似させ、明確に定量化することができるようになる。カタラーゼが０．０５ｍｇ／ｍｌより小さい場合は振動反応の周期が不規則になってしまい、直線関係に近似することが難しくなり、一方１ｍｇ／ｍｌより大きい場合は、振動反応の周期との濃度の関係が無関係で周期はほぼ一定であり、定量に適していない。また０．０５〜１ｍｇ／ｍｌの場合であっても、コリンオキシダーゼが５×１０−５〜ｍｇ／ｍｌより小さいときは、直線関係に現した場合その傾きが小さく定量には不適当となり、１×１０−３ｍｇ／ｍｌより大きいときにも振動反応の周期が不規則になってしまい、直線関係に近似することが難しくなる。
【００１１】
また本発明にかかるコリンの定量方法において、第一の溶液におけるコリン濃度は、４×１０−５〜５×１０−４ｍｏｌ／ｌの範囲内であることも望ましい。
【００１２】
また、本発明のコリンの定量方法は、過酸化水素及びコリンを含む第一の溶液を、カタラーゼ、コリンオキシダーゼを含む第二の溶液に半透膜を介して浸透させ、前記第二の溶液における溶存酸素の濃度変化に基づいて、前記第一の溶液に含まれるコリン濃度を算出するコリンの定量方法とする。なおこの場合において、半透膜は透析膜若しくはミリポアフィルターとすることも望ましい。
【００１３】
またこのコリンの定量方法においては、第二の溶液はカタラーゼを０．０５〜１ｍｇ／ｍｌ、コリンオキシダーゼを５×１０−５〜１×１０−３ｍｇ／ｍｌの範囲で含有してなることも望ましい。この範囲にすることにより、もともと非線形現象である振動反応の周期とコリン濃度の関係を直線関係に近似させ、明確に定量化することができるようになる。
【００１４】
またこのコリンの定量方法においては、第一の溶液のコリン濃度は４×１０−５〜５×１０−４ｍｏｌ／ｌの範囲内であることが望ましい。
【００１５】
また本発明に係るコリンの定量装置は、過酸化水素及びコリンを含有する第一の溶液を保持する第一の容器と、カタラーゼ、コリンオキシダーゼを含む第二の溶液を保持する第二の容器と、第一の容器と第二の容器との間に配置され、第一の溶液を第二の溶液に浸透させる半透膜と、第二の溶液に浸されるよう配置される酸素電極と、酸素電極に接続される溶存酸素計と、溶存酸素計に接続される情報処理装置と、を有することとする。
【発明の効果】
【００１６】
以上本発明は、振動反応を用いてその溶存酸素濃度を測ることにより簡単にコリンの定量を行うことができるため、その他途中発生する定量を省略し、より少ない工程の定量を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
まず、本発明が利用する原理について図１を用いて説明する。
半透膜を挟んだ２つの容器の一方に、カタラーゼ、コリンオキシダーゼを入れ、他方の容器に過酸化水素水溶液およびコリンの溶液を入れる。すると、過酸化水素水がゆっくりと半透膜を透過してカタラーゼと反応し、酸素を発生させる。一方、酸素が発生すると、コリンオキシダーゼがこの酸素を用いてコリンエステラーゼの作用によって半透膜を透過してきたコリンを酸化し、過酸化水素を発生させる。即ちこの一連の流れが循環過程となり、しかもその過酸化水素水の濃度が振動する振動反応となる。なおこの場合、酵素水溶液中に溶存している酸素の量を溶存酸素計で測定すると、溶存酸素の濃度は周期的に振動する。特にカタラーゼ等の諸条件が所定の濃度範囲にある場合は溶存酸素量の振動周期がコリンの濃度と直線関係になり、この関係を用いてコリンの定量に利用することができるようになる。即ちこれを利用してコリンが含まれている種々の状態に対しコリンの定量化が可能となる。なお、この場合においてカタラーゼの望ましい範囲としては、０．０５〜１ｍｇ／ｍｌ、コリンエステラーゼが５×１０−4〜１×１０−3ｍｇ／ｍｌの範囲であることであることが望ましい。この濃度範囲とすることにより、非線形な関係である振動反応の周期とコリンの濃度関係が直線関係になるためである。なお、過酸化水素水の濃度については、溶存酸素計の測定限度及び振動周期の規則性の観点から０．５〜１．０重量％の範囲であることが望ましい。なおこれより過酸化水素濃度が小さい場合、振動は不規則になるおそれがある。
【００１８】
以下本発明の実施例につき、図面を用いながら具体的に説明する。
【実施例１】
【００１９】
図２に本発明の実施例に係る装置（以下単に「本装置」という。）の図を示す。
図２に示すように本装置は、第一の容器１、第二の容器２、第一の容器と第二の容器とを繋ぐ接続管３、その接続管３の中に配置された半透膜４、第二の容器に挿入される酸素電極５、この酸素電極５に電気的に接続された溶存酸素計６、この溶存酸素計６に電気的に接続された情報処理装置７、を有して構成されている。
【００２０】
最初の状態において、第一の容器側には０．６％の過酸化水素水溶液２０ｍｌとコリン溶液０．１ｍｌが、第二の容器側にはカタラーゼ２．５ｍｇ、コリンオキシダーゼ０．０４５ｍｇを含む水溶液２５ｍｌが入れてある（カタラーゼ、コリンオキシダーゼを含む側の溶液を以下単に「酵素溶液」という。）。なお第一の容器１、第二の容器２のいずれもガラスにより構成されており、それぞれは上端が開いた円筒形状に形成され、内径は３ｃｍである。
【００２１】
接続管３は、第一の容器１、第二の容器２の間に配置され、これらの容器内を接続する。本実施例の接続管３も第一の容器１、第二の容器２と同様ガラスにより構成されており、第一及び第二の容器、接続管３は一体に構成されている。なお接続管の内径は１ｃｍである。
【００２２】
半透膜４は、溶液における成分の一部は通すが他の成分は通さない膜であって、本実施例では第一の容器１と第二の容器２との間に配置される流路３に設けられた透析膜を用いている（材質：αセルロース、分画分子量１２，０００〜１４，０００）。なお、半透膜４は、上記機能を奏する限りにおいて透析膜に限られることはなく、例えばミリポアフィルターなども好適に用いることができる。
【００２３】
酸素電極５は、第二の容器内、しかも第二の容器に保持される酵素溶液に浸されるよう配置されている。酸素電極５は酸素溶液中の溶存酸素がこの電極上で還元されて水になるときに生じる電子の量に応じ電位を発生させるものであって、一般に市販されている周知な酸素電極を用いることができる。
【００２４】
溶存酸素計６は、この酸素電極５の電位の発生を受け、この電位の値に基づいて溶存酸素の濃度を算出するものであって、これについても一般に市販されている周知な溶存酸素計を用いることができる。
【００２５】
情報処理装置７は、溶存酸素計７からの出力を受け、まずその出力から振動反応の周期を求める。具体的には、電位の値を経時的に取得し、時間に対する電位のデータを作成する。そしてこの経時的な電位のデータを解析することで振動反応の周期を計算する。そして更に、求めた周期と予め求めてある周期−コリン量の関係からコリンの定量を行う。
【００２６】
具体的に本実施例では、情報処理装置としてコンピュータを用いて上記処理を行う。より具体的に説明すると、本装置のコンピュータは、図３で示すように、溶存酸素計が測定する溶存酸素の濃度に対応するデータ（以下「溶存酸素濃度データ」という。）を受け付け、その溶存酸素濃度データをその濃度を示した時刻のデータ（以下「時刻データ」という。）とともに記録する溶存酸素データ取得手段７０１と、その時刻データと溶存酸素濃度データとの関係に基づいて振動反応の周期を判断する周期判断手段７０２と、コリンの濃度と振動反応の周期との関係を予め記憶してある周期−コリン関係記録手段７０３と、振動反応の周期と、コリンの濃度と振動反応の周期との関係に基づいてコリンの定量を行うコリン定量手段７０４と、を実施させるためのプログラムが、記録媒体であるハードディスクに格納され、実行されることでコリンの定量を行うことができる。またこの場合において、コリンの濃度と振動反応の周期は、カタラーゼやコリンオキシダーゼの濃度等によって直線の傾きや直線関係を示す範囲が異なるため、周期−コリン関係記録手段はその条件の入力を受付け、記録する機能をも有すること、更にはその入力に対応する条件に合致した振動の周期とコリンの濃度との関係を読み出すようにする（もちろん予め当該関係を記憶しておくことが必要である）ことがより望ましい。なおもちろん上記各手段は、記録媒体であればハードディスク以外の記録媒体であっても差し支えはなく、上記の機能を実行することができる限りにおいてプログラムでなくても良い。これは、種々操作の容易性の観点からプログラムが望ましい、という実施例を示したものである。
【００２７】
次に上記の構成をもとに測定を行った。以下説明する。
この測定において、コリンの量（濃度）をさまざまに変化させて６種類の試料を用意し、そのそれぞれに対して測定を行った。なおコリンの量（濃度）以外は上述の条件（カタラーゼ：０．１ｍｇ／ｍｌ、コリンオキシダーゼ：７．２×１０−５ｍｇ／ｍｌ）として固定した。表１に加えたコリンの濃度を示す。そしてその溶液中の０．１ｍｌにおける濃度を下記表１のように調整し、カタラーゼ等を混合した溶液に加え、全体として２５ｍｌの酵素溶液にした。表１に溶液に溶かしたコリンの量、濃度及び振動反応の周期を記載する。なお図４に表１における試料溶液番号２の場合の溶存酸素量の時間変化の例を示す。図４において横軸は時間（時間）を、縦軸は溶存酸素量（ｍｇ／ｌ）をそれぞれ示している。また本実施例における周期とは、振動反応が開始してから十分な時間が経過し、周期がほぼ一定になった場合における値を採用している。なおほぼ一定になるまでに要した十分な時間は反応を開始させてから概ね１〜２時間程度であった。
【表１】
【００２８】
表１の結果に対し、コリンの濃度に対する振動反応の周期を求めたものを図５に示す。横軸はコリンの濃度（Ｍ）を、縦軸は振動の周期（分）を示す。
【００２９】
この結果、振動の周期とコリンの濃度との関係は直線によって非常によく説明することができた。特に、本実施例ではコリンの濃度は２．０×１０−６〜３×１０−５Mの範囲で非常によく説明できており、この範囲であれば十分直線によって近似することができると考えられる。なお、コリンが２．０×１０−６Ｍより小さい場合、また１×１０−５Ｍより大きい場合は直線に載っておらず、コリンの範囲としても上記の範囲内であることが望ましいことが確認できた。
【００３０】
以上、カタラーゼ、コリンオキシダーゼを用いて振動反応を利用することで、コリンの濃度を定量することができる。特に、カタラーゼ及びコリンオキシダーゼを所定の濃度範囲にすることで規則的な振動反応を起こし、その周期を求めることでコリンの濃度を定量することができる。
【００３１】
また、本実施例では、第一の容器１と第二の容器２、そしてその容器の間を繋げる流路３とを用いて構成されているが、容器形状はこれに限られず、例えば図６で示されるように、一つの容器を仕切板で仕切り、窓を開けて半透膜を配置する構成ももちろん可能である。
【００３２】
（比較例１）
一方、上記実施例において、コリンオキシダーゼの濃度が大きい場合において、実施例１における範囲の適性を調べた。以下説明する。
【００３３】
溶液として、コリンオキシダーゼが７．２×１０−４ｍｇ／ｍｌの濃度のものを用いた。また第一の溶液に過酸化水素、コリンを加えておく。
この結果を表２及び図７に示す。
【表２】
【００３４】
コリンオキシダーゼ濃度を１０倍にすると、直線の得られる範囲が１．０×１０−６〜５×１０−６Mとなり、より低いコリン濃度を定量するときに適当であることがわかる。
【００３５】
（比較例２）
一方、上記実施例において、アセチルコリンが共存するとき、実施例１における範囲の適性を調べた。以下説明する。
【００３６】
溶液として、コリンオキシダーゼが７．２×１０−５ｍｇ／ｍｌの濃度のものを用いた。また第一の溶液に過酸化水素、コリンの他に一定量のアセチルコリン（０．００００１Ｍ）を加えておく。
この結果を表３及び図８に示す。
【表３】
【００３７】
０．００００１Ｍのアセチルコリンが共存するときには直線の得られる範囲がコリン濃度３．０×１０−４〜１×１０−４Mとなり、高い濃度領域で直線がえられることがわかる。またこの直線が得られる範囲では、コリン濃度の増加とともに周期が短くなることがわかる。共存するアセチルコリンの濃度に対応するコリンの検量線を作成する必要がある。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】振動反応の反応機構を示す図。
【図２】実施例１におけるコリンの定量装置の概略図。
【図３】実施例１における情報処理装置７の機能ブロックを示す図。
【図４】実施例１における振動反応における溶存酸素量の時間変化を示す図。
【図５】実施例１におけるコリン濃度と周期との関係を示す図。
【図６】コリンの定量装置における他の容器例を示す図。
【図７】比較例１におけるコリン濃度と周期との関係を示す図。
【図８】比較例２におけるコリン濃度と周期との関係を示す図。
【符号の説明】
【００３９】
１…第一の容器、２…第二の容器、３…連絡管、４…半透膜、５…酸素電極、６…溶存酸素計、７…情報処理装置
【特許請求の範囲】
【請求項１】
振動反応を利用したコリンの定量方法。
【請求項２】
前記振動反応は、過酸化水素およびコリンを含む第一の溶液を、カタラーゼ及びコリンオキシダーゼを含む第二の溶液に、半透膜を介して浸透させることによって行う反応であることを特徴とする請求項１記載のコリンの定量方法。
【請求項３】
前記半透膜は、透析膜若しくはミリポアフィルターであることを特徴とする請求項２記載のコリンの定量方法。
【請求項４】
前記第二の溶液は、前記カタラーゼを０．０５〜１ｍｇ／ｍｌ、コリンオキシダーゼを５×１０−５〜１×１０−３ｍｇ／ｍｌの範囲で含有してなることを特徴とする請求項２記載のコリンの定量方法。
【請求項５】
前記第一の溶液は、前記コリン濃度を２．５×１０−６〜１．５×１０−４ｍｏｌ／ｌの範囲内で含有してなることを特徴とする請求項４記載のコリンの定量方法。
【請求項６】
過酸化水素およびコリンを含む第一の溶液を、カタラーゼおよびコリンオキシダーゼを含む第二の溶液に、半透膜を介して浸透させ、前記第二の溶液における溶存酸素の濃度変化に基づいて、前記第二の溶液に含まれるコリン濃度を算出するコリンの定量方法。
【請求項７】
前記半透膜は、透析膜若しくはミリポアフィルターであることを特徴とする請求項６記載のコリンの定量方法。
【請求項８】
前記第二の溶液は、前記カタラーゼを０．０５〜１ｍｇ／ｍｌ、コリンオキシダーゼを５×１０−５〜１×１０−３ｍｇ／ｍｌの範囲で含有してなることを特徴とする請求項６記載のコリンの定量方法。
【請求項９】
前記第二の溶液において、前記コリンオキシダーゼ濃度を５×１０−５〜１×１０−３ｍｇ／ｍｌの範囲内で含有してなることを特徴とする請求項６記載のコリンの定量方法。
【請求項１０】
過酸化水素及びコリンを含有する第一の溶液を保持する第一の容器と、カタラーゼ、コリンオキシダーゼを含む第二の溶液を保持すると第二の容器と、前記第一の容器と第二の容器との間に配置され、前記第一の溶液を前記第二の溶液に浸透させる半透膜と、前記第二の溶液に浸されるよう配置される酸素電極と、前記酸素電極に接続される溶存酸素計と、前記溶存酸素計に接続される情報処理装置と、を有するコリンの定量装置。
【請求項１】
振動反応を利用したコリンの定量方法。
【請求項２】
前記振動反応は、過酸化水素およびコリンを含む第一の溶液を、カタラーゼ及びコリンオキシダーゼを含む第二の溶液に、半透膜を介して浸透させることによって行う反応であることを特徴とする請求項１記載のコリンの定量方法。
【請求項３】
前記半透膜は、透析膜若しくはミリポアフィルターであることを特徴とする請求項２記載のコリンの定量方法。
【請求項４】
前記第二の溶液は、前記カタラーゼを０．０５〜１ｍｇ／ｍｌ、コリンオキシダーゼを５×１０−５〜１×１０−３ｍｇ／ｍｌの範囲で含有してなることを特徴とする請求項２記載のコリンの定量方法。
【請求項５】
前記第一の溶液は、前記コリン濃度を２．５×１０−６〜１．５×１０−４ｍｏｌ／ｌの範囲内で含有してなることを特徴とする請求項４記載のコリンの定量方法。
【請求項６】
過酸化水素およびコリンを含む第一の溶液を、カタラーゼおよびコリンオキシダーゼを含む第二の溶液に、半透膜を介して浸透させ、前記第二の溶液における溶存酸素の濃度変化に基づいて、前記第二の溶液に含まれるコリン濃度を算出するコリンの定量方法。
【請求項７】
前記半透膜は、透析膜若しくはミリポアフィルターであることを特徴とする請求項６記載のコリンの定量方法。
【請求項８】
前記第二の溶液は、前記カタラーゼを０．０５〜１ｍｇ／ｍｌ、コリンオキシダーゼを５×１０−５〜１×１０−３ｍｇ／ｍｌの範囲で含有してなることを特徴とする請求項６記載のコリンの定量方法。
【請求項９】
前記第二の溶液において、前記コリンオキシダーゼ濃度を５×１０−５〜１×１０−３ｍｇ／ｍｌの範囲内で含有してなることを特徴とする請求項６記載のコリンの定量方法。
【請求項１０】
過酸化水素及びコリンを含有する第一の溶液を保持する第一の容器と、カタラーゼ、コリンオキシダーゼを含む第二の溶液を保持すると第二の容器と、前記第一の容器と第二の容器との間に配置され、前記第一の溶液を前記第二の溶液に浸透させる半透膜と、前記第二の溶液に浸されるよう配置される酸素電極と、前記酸素電極に接続される溶存酸素計と、前記溶存酸素計に接続される情報処理装置と、を有するコリンの定量装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００７−１３９５７４（Ｐ２００７−１３９５７４Ａ）
【公開日】平成１９年６月７日（２００７．６．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３３３５４９（Ｐ２００５−３３３５４９）
【出願日】平成１７年１１月１８日（２００５．１１．１８）
【出願人】（３０４０２１８３１）国立大学法人 千葉大学 (601)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年６月７日（２００７．６．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１１月１８日（２００５．１１．１８）
【出願人】（３０４０２１８３１）国立大学法人 千葉大学 (601)
【Ｆターム（参考）】
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