コレステロールセンサ
リポタンパク質を含有する試料中の、高密度リポタンパク質以外のリポタンパク質中のコレステロール量を決定するための方法であって、（a）試料中の高密度リポタンパク質に結合したコレステロールの量を電気化学的に決定すること、（b）試料中の総コレステロール量を電気化学的に決定すること、及び（b）の結果から（a）の結果を差し引くことを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リポタンパク質を含有する試料中の、高密度リポタンパク質以外のリポタンパク質に結合したコレステロール量を決定するための方法に関する。本発明はまた、そのような方法において用いるためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
血漿中のコレステロールは、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、中密度リポタンパク質（ＩＤＬ）、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）及びキロミクロン（ＣＭ）中に含有される。ＨＤＬコレステロール含量は、心疾患の危険性を低減することが示されているので、ＨＤＬ中のコレステロールは、しばしば「善玉」コレステロールと考えられる。他方、高ＬＤＬコレステロール含量は心疾患の危険性を増大することが示されているので、ＬＤＬ中のコレステロールは、しばしば「悪玉」コレステロールと考えられる。従って、米国コレステロール教育プログラム第３ガイドライン（National Cholesterol Education Program 3rd guidelines）により、心疾患の危険性の指標として、ＬＤＬコレステロールを測定することが推奨されている。
【０００３】
ＬＤＬコレステロールレベルを決定するために、過去においては、２つのタイプの技法を典型的に用いてきた。１つの技法においては、試料の総コレステロール、ＨＤＬコレステロール及びトリグリセリド含量を測定し、そしてＦｒｉｅｄｗａｌｄ式を、ＬＤＬコレステロール含量を算出するために用いる。しかしながら、このタイプの測定は、絶食時の試料に関してしか正確に実施できないトリグリセリドアッセイを伴う。そのような試料は、常に分析用に入手可能なわけではないので、この方法では、常に信頼できる結果を得られるわけではない。絶食時の試料が不要な技法が望ましい。
【０００４】
これに代わる技法では、ＬＤＬコレステロール含量の直接的測定を目的とする。研究技法から適合された、初期の検査室的方法は、例えば超遠心分離による、手作業の分離段階の後、各リポタンパク質画分中のコレステロール含量の、個別の分析を必要とするものであった。しかしながら、そのような技法は完全には自動化できず、且つ複雑な処理段階を実施する必要がある。より最近になって、様々なリポタンパク質画分の分離を事前に必要とせず、且つ処理の自動化を可能にする、いくつかの技法が提示されてきた。１つのアプローチにおいては、様々なリポタンパク質画分を異なる速度で分解する、ある種の界面活性剤を用いる。例えば、ある界面活性剤は、はじめはＨＤＬとより迅速に反応するかもしれず、そしてＬＤＬとの反応はより緩やかに起こるかもしれない。界面活性剤を加えた後、所定の時間にコレステロール含量を測定することによって、ＨＤＬコレステロール含量よりもＬＤＬコレステロール含量により大きく依存する測定を実施できることが分かってきた。
【０００５】
しかしながら、この後者のアプローチは、その結果に必要な精度及び信頼性を生じてきておらず、また、測定は、依然としてある程度の、ＨＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭ中のコレステロール含量への依存性を残していた。従って、簡単であるが信頼でき、且つ正確な心疾患の危険性の指標を提供する、異なるアプローチが必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明の要旨
本発明は、試料の総コレステロール及びＨＤＬコレステロール含量のみの測定を頼りにする、別のアプローチを用いる。従って、当該技法はトリグリセリド含量の測定を必要とせず、また、絶食時の試料を必要としない。本発明においては、非ＨＤＬコレステロール含量（即ち、ＨＤＬ以外のリポタンパク質、即ちＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭ中のコレステロール含量）は、総コレステロール含量から、ＨＤＬコレステロール含量を差し引くことによって決定される。この測定結果は、試料のＬＤＬ−コレステロール含量との良好な相関、従って心疾患の危険性との良好な相関も与えることが分かってきている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
従って、本発明は、リポタンパク質を含有する試料中の、高密度リポタンパク質以外のリポタンパク質中のコレステロール量を決定するための方法であって、（a）試料中の高密度リポタンパク質に結合したコレステロールの量を電気化学的に決定すること、（b）試料中の総コレステロール量を電気化学的に決定すること、及び（b）の結果から（a）の結果を差し引くことを含む、方法を提供する。
【０００８】
電気化学的分析を用いることによって、本発明は、非ＨＤＬコレステロール含量を分析するための、特別に簡単且つ迅速な方法を提供する。特に、決定（ａ）及び（ｂ）は、同時又は実質的に同時に実施でき、非ＨＤＬコレステロール含量の決定が、試料を試験装置に添加してからほんの１分又は数分で可能になる。更に、当該試験は未熟な技術者が実施でき、専門的な（specialist）設備も必要としない。１つの実施形態において、当該試験は、例えば、医師の外科手術、病室若しくは病棟といった医療環境における使用、又は患者自身による家庭での使用に適切な、携帯型装置で実施できる。
【０００９】
本発明はまた、リポタンパク質を含有する試料中の、高密度リポタンパク質以外のリポタンパク質中のコレステロール量を決定するためのキットであって、
− 作用電極、参照又は擬似参照電極及び任意に別個の対向電極を有する第一の電気化学セル；
− 当該第一の電気化学セルに使われる、試料のＨＤＬコレステロール含量を決定するための第一のシリーズの試薬；
− 作用電極、参照又は擬似参照電極及び任意に別個の対向電極を有する第二の電気化学セル；
− 当該第二の電気化学セルに使われる、試料の総コレステロール含量を決定するための第二のシリーズの試薬；
−各セルに電位を印加するための電源；
−結果生じる、各セルの電気化学的応答を測定するための測定機器；並びに
−高密度リポタンパク質以外のリポタンパク質中のコレステロール量を算出するための計算装置、
を含む、キットを提供する。
【００１０】
また、本発明のキットを使用する方法であって、
（i）試料を第一のシリーズの試薬と、結果生じる試料と第一のシリーズの試薬との混合物が第一の電気化学セルの作用電極に接触するように接触させること；
（ii）試料を第二のシリーズの試薬と、結果生じる試料と第二のシリーズの試薬との混合物が第二の電気化学セルの作用電極に接触するように接触させること；
（iii）各電気化学セルに電位を印加すること；
（iv）結果生じる、電気化学的応答を測定することによって、各セルにおいて形成した生成物量を電気化学的に検出すること；及び
（v）試料中の非ＨＤＬリポタンパク質に結合したコレステロール量を算出すること
を含む、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明による装置の電気化学セルを示す。
【図２】図２は、本発明による装置の、電気化学センサストリップを示す。
【図３】図３は、界面活性剤アンヒトール２０Ｎが、ＨＤＬを選択的に分解するかどうかを決定するための、試験プロトコルの結果を示す。
【図４】図４ａ及びｂは、ドナーの血漿試料を用いて実施した、総コレステロール試験の結果のプロットである。
【図５】図５ａ及びｂは、ドナーの血漿試料を用いて実施した、ＨＤＬコレステロール試験の結果のプロットである。
【図６】図６ａ及びｂは、本発明に従って測定した血漿試料の非ＨＤＬコレステロール含量と、Ｒａｎｄｏｘ ＳＰＡＣＥ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｅｒによって測定した、試料のＬＤＬコレステロール含量との相関のプロットである。
【図７】図７は、本発明に従って測定した血漿試料の非ＨＤＬコレステロール含量と、Ｆｒｉｅｄｗａｌｄ式を用いて決定した、試料のＬＤＬコレステロール含量との相関を示す。
【図８】図８（ａ）及び（ｂ）は、実施例３に従って製造したセンサについての、ＨＤＬ及びＴＣそれぞれについての、較正プロット（ＩＯＸ（ｎＡ）対濃度（ｍＭ））を示す。
【図９】図９は、参照の方法を用いて測定したＬＤＬ含量と、実施例３〜５のセンサを用いて行ったＴＣ及びＨＤＬ測定から決定したＬＤＬ含量との関係を示す。
【図１０】図１０は、参照の方法を用いて測定したＬＤＬ含量と、実施例３〜５のセンサを用いて行ったＴＣ及びＨＤＬ測定から決定したＬＤＬ含量との関係を示す。
【図１１】図１１は、参照の方法を用いて測定した通りのＬＤＬ含量と、実施例３〜５のセンサを用いて行ったＴＣ及びＨＤＬ測定から決定したＬＤＬ含量との関係を示す。
【図１２】図１２（ａ）及び（ｂ）は、実施例７のセンサについての、ＨＤＬ及びＴＣについての較正プロット（ＩＯＸ（ｎＡ）対濃度（ｍＭ））を示す。
【図１３】図１３は、Ｒａｎｄｏｘ ａｎａｌｙｓｅｒによって測定したＬＤＬ含量と、実施例７のセンサを用いて行ったＴＣ及びＨＤＬ測定を用いて本発明により算出したＬＤＬ含量との関係を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の方法は、試料のＨＤＬコレステロール含量及び試料の総コレステロール含量についての試験を実施すること、並びに簡単な減算により非ＨＤＬコレステロール含量を決定することを含む。この非常に簡単な技法で、試料のＬＤＬコレステロール含量、ひいては心疾患の危険性との良好な相関を持つことが分かった。
【００１３】
ＨＤＬコレステロール試験は、任意の電気化学的方法により実施し得る。電気化学的方法は、コレステロールの反応を、電極での電気化学的応答を測定することによって検出するものである。典型的には、選択的試薬を加え、測定の時間枠内では、確実にＨＤＬコレステロールしか反応し得ないようにする。次いで、試料をコレステロールエステル加水分解試薬及び、コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼのいずれかと反応させる。コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼと反応したコレステロールの量は、電極での電気化学的応答を測定することによって決定する。
【００１４】
選択的試薬は、ＨＤＬコレステロールをコレステロールエステル加水分解試薬及びコレステロールオキシダーゼ又はデヒドロゲナーゼと反応できるようにする、任意の物質であり得る。好適な選択的試薬としてはＨＤＬ以外のリポタンパク質と錯体を形成する錯化剤が挙げられる。錯化剤の例としては、多価陰イオン類、多価陰イオン類の２価の金属塩との組み合わせ、及びａｐｏＢ含有リポタンパク質に結合できる抗体が挙げられる。多価陰イオン類は、リンタングステン酸及びその塩、デキストラン硫酸及びその塩、ポリエチレングリコール並びにヘパリン及びその塩から選択できる。一度錯化された形態になると、ＨＤＬ以外のリポタンパク質は反応に利用できず、従ってコレステロール測定を妨げない。
【００１５】
好ましい実施形態において、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭよりも、ＨＤＬに対して高度に選択的な特異的界面活性剤と、試料を反応させることによって選択性を実現する。従って、当該界面活性剤は、ＨＤＬに結合するコレステロール及びコレステロールエステル類についての測定を可能にするが、一方でＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭに結合するものはリポタンパク質構造に結合したままであり、後のコレステロール含量の測定において実質的に反応しない。
【００１６】
この実施形態において用いる界面活性剤は、試料中の高密度リポタンパク質を選択的に分解すると考えられるものである。しかしながら本発明は、この作用様式に限られない。従って、当該界面活性剤は、コレステロールアッセイにおいて、ＨＤＬコレステロールの反応を選択的に可能にするものであるが、一方でＬＤＬコレステロールは実質的に反応できない。これは、当該界面活性剤は、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭと比較して、ＨＤＬと選択的に反応することを意味する。本発明の文脈では、ＨＤＬを選択的に分解する界面活性剤、即ち、コレステロールアッセイにおいてＨＤＬコレステロールが反応することを選択的に可能にする界面活性剤は、典型的には、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は最も好ましくは少なくとも９０％の、ＨＤＬとＬＤＬとの間のディファレンシエーション（differentiation）を有する、界面活性剤である。
【００１７】
ＨＤＬとＬＤＬとの間のディファレンシエーションは、式（ｉ）：
【００１８】
【数１】
【００１９】
（式中、ＧｘはＸに対する、測定された応答のグラジエント（例、既知の濃度のＸに対する、測定された電流）である）に従って決定できる。測定される応答は、リポタンパク質濃度に関係する（又は対応する）任意のパラメータであり得る（例、それは、当該濃度に比例するパラメータであり得る）。
【００２０】
従って、当業者は、（ＬＤＬを含有しない、）ＨＤＬコレステロール含量が既知の試料の、ＨＤＬコレステロール含量を測定するために、選択した界面活性剤を用いることによって、そして対応して同じ手順を用いて、（ＨＤＬを含有しない、）ＬＤＬコレステロール含量が既知の試料の、ＬＤＬコレステロール含量を測定することによって、任意の所与の界面活性剤がＨＤＬを選択的に分解するものかどうかを、容易に決定できる。結果からディファレンシエーションの値が計算できる。界面活性剤アンヒトール２０Ｎを用いた、コレステロール含量の測定についての手順の例を、実施例１において示す。
【００２１】
本発明において、ＨＤＬ濃度は典型的には、コレステロールのコレステノンへの電気化学的変換に際して、電極で生じる電流を決定することによって電気化学的に測定される。従って、典型的には、測定電流値を、グラジエントを決定するために用いる。
【００２２】
好ましい実施形態においては、本発明の選択的界面活性剤は、実質的にＬＤＬを分解しない。従って、ＨＤＬとＬＤＬとの間のディファレンシエーションは、経時的に一定である。しかしながら、それでもいくつかの界面活性剤は、依然として非常に緩やかではあるがＬＤＬを分解し得る。この場合、ＨＤＬとＬＤＬとの間のディファレンシエーションは、時間と共に変動し得る。ディファレンシエーションは、ＨＤＬコレステロール試験の間に用いる経過時間と同じの、試料への試薬の添加と、コレステロール含量の測定との間の経過時間を用いて測定しなくてはならない。そのような経過時間は、典型的には、３分以下、好ましくは１２０秒以下、９０秒以下又は６０秒以下のオーダーである。本発明の文脈では、選択的界面活性剤は、実施例１に記載する手順及び試料への試薬の添加と測定との間の、６２秒の経過時間を用いてコレステロール含量を測定した場合、典型的には、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０%、少なくとも７０%、少なくとも８０%又は最も好ましくは少なくとも９０%の、ＨＤＬとＬＤＬとの間のディファレンシエーションを有する界面活性剤である。
【００２３】
ＨＤＬと選択的に反応する界面活性剤の例としては、ポリオキシアルキレン誘導体類、ペルフルオロアルカン類又はペルフルオロアルキル基含有化合物類、スクロースエステル類、テトラメチルデシンジオール及びエトキシ化テトラメチルデシンジオール類、任意にポリアルキレンオキシドと結合される、ポリアルキレンオキシド修飾ポリジメチルシロキサン、イソノニルフェノキシポリ（グリシドール）、ヒドロキシエチルグルカミド誘導体類、Ｎ−メチル−Ｎ−アシルグルカミド誘導体類、マルトシド類及びチオマルトシド類等の非イオン性界面活性剤並びにアルキルベタイン誘導体類、アルキルアミンオキシド類及びアンモニオアルキルスルホン酸塩類等の両性界面活性剤が挙げられる。
【００２４】
本発明の１つの実施形態において、当該界面活性剤は、ポリオキシアルキレン誘導体類、ペルフルオロアルカン類又はペルフルオロアルキル基含有化合物、スクロースエステル類、テトラメチルデシンジオール及びエトキシ化テトラメチルデシンジオール類、任意にポリアルキレンオキシドと結合される、ポリアルキレンオキシド修飾ポリジメチルシロキサン、イソノニルフェノキシポリ（グリシドール）及びヒドロキシエチルグルカミド誘導体類等の非イオン性界面活性剤、並びにアルキルベタイン誘導体類、アルキルアミンオキシド類及びアンモニオアルキルスルホン酸塩類等の両性界面活性剤から選択される。
【００２５】
本発明のＨＤＬアッセイにおいて用いるための、好ましい界面活性剤としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、エマルゲン１０９Ｐ（花王株式会社）、エマルゲン１１３５Ｓ−７０（花王株式会社）、ポリオキシアルキレンジスチレン化フェニルエーテル（エマルゲンＡ−９０、花王株式会社）、ポリオキシアルキレンアリルフェニルエーテル（ニューカルゲンＦＳ１２、竹本油脂株式会社）、ｐ−イソノニルフェノキシポリ（グリシドール）（Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ １０Ｇ、Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｔｏｏｌ Ｋｉｔ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）、シルウェットＬ−７６００（Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｔｏｏｌ Ｋｉｔ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）、ＰＥＧ−３０テトラメチルデシンジオール（スルフィノール ４８５、Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｔｏｏｌ Ｋｉｔ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）、スクロースモノカプレート（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ． Ｌｔｄ）、ペルフルオロＣ６−Ｃ１６アルカン類（ゾニール ＦＳＮ１００、Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｔｏｏｌ Ｋｉｔ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）、ＨＥＧＡ−８、ＨＥＧＡ−９、ＨＥＧＡ−１０、Ｃ−ＨＥＧＡ−９、Ｃ−ＨＥＧＡ−１０、ｎ−オクチル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸塩（ツヴィッタージェント３−０８、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ラウリルジメチルアミンオキシド（アンヒトール２０Ｎ、花王株式会社）、コカミドプロピルベタイン（ソフタゾリン ＣＰＢ、川研ファインケミカル株式会社）及びラウラミドプロピルベタイン（ソフタゾリン ＬＰＢ−Ｒ、川研ファインケミカル株式会社）が挙げられる。
【００２６】
本発明の１つの実施形態において、ＨＤＬアッセイで用いられる好ましい界面活性剤、エマルゲン１１３５Ｓ−７０（花王株式会社）、ポリオキシアルキレンアリルフェニルエーテル（ニューカルゲンＦＳ１２、竹本油脂株式会社）、ｐ−イソノニルフェノキシポリ（グリシドール）（Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ １０Ｇ、Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｔｏｏｌ Ｋｉｔ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）、シルウェットＬ−７６００（Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｔｏｏｌ Ｋｉｔ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）、ＰＥＧ−３０テトラメチルデシンジオール（スルフィノール ４８５、Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｔｏｏｌ Ｋｉｔ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）、スクロースモノカプレート（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ． Ｌｔｄ）、ペルフルロ（perfluro）Ｃ６−Ｃ１６アルカン類（ゾニール ＦＳＮ１００、Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｔｏｏｌ Ｋｉｔ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）、ＨＥＧＡ−８、ＨＥＧＡ−９、ＨＥＧＡ−１０、Ｃ−ＨＥＧＡ−９、Ｃ−ＨＥＧＡ−１０、ｎ−オクチル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸塩（ツヴィッタージェント３−０８、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ラウリルジメチルアミンオキシド（アンヒトール２０Ｎ、花王株式会社）、コカミドプロピルベタイン（ソフタゾリン ＣＰＢ、川研ファインケミカル株式会社）及びラウラミドプロピルベタイン（ソフタゾリン ＬＰＢ−Ｒ、川研ファインケミカル株式会社）。
【００２７】
更なる実施形態において、ＨＤＬアッセイで用いられる、好ましい界面活性剤としては、エマルゲン１１３５Ｓ−７０（花王株式会社）、ｐ−イソノニルフェノキシポリ（グリシドール）（Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ １０Ｇ、Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｔｏｏｌ Ｋｉｔ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）、シルウェットＬ−７６００（Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｔｏｏｌ Ｋｉｔ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）、ＰＥＧ−３０テトラメチルデシンジオール（スルフィノール ４８５、Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｔｏｏｌ Ｋｉｔ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）、スクロースモノカプレート、ペルフルロ（perfluro）Ｃ６−Ｃ１６アルカン類（ゾニール ＦＳＮ１００、Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｔｏｏｌ Ｋｉｔ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）、ＨＥＧＡ−８、ＨＥＧＡ−９、ＨＥＧＡ−１０、Ｃ−ＨＥＧＡ−９、Ｃ−ＨＥＧＡ−１０、ｎ−オクチル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸塩（ツヴィッタージェント３−０８、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ラウリルジメチルアミンオキシド（アンヒトール２０Ｎ、花王株式会社）、コカミドプロピルベタイン（ソフタゾリン ＣＰＢ、川研ファインケミカル株式会社）及びラウラミドプロピルベタイン（ソフタゾリン ＬＰＢ−Ｒ、川研ファインケミカル株式会社）が挙げられる。エマルゲン１１３５Ｓ−７０（花王株式会社）及びHEGA-8、HEGA-10、C-HEGA-9、C-HEGA-10を含むヒドロキシエチルグルカミド誘導体類が特に好ましい。スクロースモノカプレートも好ましい。
【００２８】
本発明の１つの実施形態においては、好ましい界面活性剤は、スクロースエステル類、マルトシド類である。特に好ましい界面活性剤は、スクロースモノカプレート、スクロースモノデカノエート、ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトシド Ｃｙｍａｌ−４及びＣｙｍａｌ−５である。
【００２９】
代替の実施形態においては、好ましい界面活性剤は、ヒドロキシエチルグルカミド誘導体類及びＮ−アシル−Ｎ−メチルグルカミン誘導体類である。ＨＥＧＡ−８、ＨＥＧＡ−１０、ＨＥＧＡ−９、Ｃ−ＨＥＧＡ−９、Ｃ−ＨＥＧＡ−１０及びＭＥＧＡ−８が特に好ましい界面活性剤である。
【００３０】
界面活性剤は個々に用いてもよく、又は２以上の異なる界面活性剤を組み合わせて用いてもよい。典型的には、使用する界面活性剤の総量は、試験試料１ｍｌ当たり最大２００ｍｇ、好ましくは最大１００ｍｇ／ｍｌ、例えば最大約５０ｍｇ／ｍｌである。
【００３１】
選択的界面活性剤又は他の選択的試薬に加えて、典型的には、試料を、コレステロールエステル加水分解試薬及びコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼと反応させる。ＨＤＬリポタンパク質中に含有されるコレステロールは、遊離コレステロール又はコレステロールエステル類の形態であり得る。従って、コレステロールエステル加水分解試薬が、任意のコレステロールエステル類を遊離コレステロールに分解するために用いられる。コレステロールエステル類をコレステロールに加水分解できる任意の試薬が用いられ得る。試薬は、コレステロールとコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼとの反応、及び、アッセイにおけるその後の任意の段階を、妨げないものでなくてはならない。好ましいコレステロールエステル加水分解試薬は、酵素、例えば、コレステロールエステラーゼ及びリパーゼである。好適なリパーゼは、例えば、シュードモナス（pseudomonas）又はクロモバクテリウム・ビスコスム（chromobacterium viscosum）種由来のリパーゼである。任意に安定化剤又は保存剤等の添加剤を含有する市販の酵素（例、東洋紡又はアマノから入手可能なもの）を用い得る。コレステロールエステル加水分解試薬は、試料１ｍｌあたり０．１〜２０ｍｇ、好ましくは１ｍｌあたり０．５〜１５ｍｇの量で用いられ得る。
【００３２】
市販されている任意の形態のコレステロールオキシダーゼ及びコレステロールデヒドロゲナーゼを用いることができる。例えば、コレステロールデヒドロゲナーゼは、例えばノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）種由来である。コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼは、試薬混合物１ｍｌあたり０．０１〜１００ｍｇの量で用いてよい。１つの実施形態においては、コレステロールオキシダーゼ又はデヒドロゲナーゼは、試料１ｍｌあたり０．１〜８０ｍｇ、好ましくは１ｍｌあたり０．５〜３０ｍｇの量で用いてもよい。
【００３３】
各酵素は、安定化剤又は保存剤等の添加剤を含有し得る。更に、各酵素は、化学的に修飾され得る。
【００３４】
当該界面活性剤又は他の選択的試薬は、試料に対して、他の試薬を加える前に加えてもよく、又は他の試薬を加えるのと同時に加えてもよい。好ましい実施形態においては、コレステロールエステル加水分解試薬、コレステロールオキシダーゼ又はデヒドロゲナーゼ及び選択的界面活性剤は、単一の段階で試料と混合される単一の試薬混合物の状態で存在する。特に好ましい実施形態において、当該方法は、試料を試薬と接触させる単一の段階を含み、そのため単一の試薬混合物のみ提供される必要がある。本発明の試薬混合物は、典型的には、コレステロールエステル加水分解試薬を試料１ｍｌ当たり０．１〜２５ｍｇ（例、０．１〜２０ｍｇ）、好ましくは０．５〜１０ｍｇの量で含み、且つコレステロールデヒドロゲナーゼを試料１ｍｌ当たり０．１〜８０ｍｇ、好ましくは０．５〜２５ｍｇの量で含む。選択的試薬も存在し、典型的には選択的界面活性剤は、試料１ｍｌ当たり最大５０ｍｇ、好ましくは最大２０ｍｇ、例えば約５ｍｇの量である。
【００３５】
電極でコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼの反応を検出するために、典型的には試料をまた、コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼと相互作用できる補酵素、及び酸化又は還元されて電極で電気化学的に検出できる生成物を形成することができる酸化還元試薬と反応させる。試料と試薬との混合物は、生じる酸化還元反応が検出できるように、電気化学セルの作用電極と接触させる。セルに電位を印加し、結果生じる電気化学的応答、典型的には電流を測定する。
【００３６】
この好ましい実施形態においては、ＨＤＬ−コレステロール量は、以下のアッセイ：
【００３７】
【化１】
【００３８】
（式中、ＣｈＤはコレステロールデヒドロゲナーゼである）に従って測定する。このアッセイにおいて、所望により、コレステロールデヒドロゲナーゼは、コレステロールオキシダーゼと置き換えることができる。当該アッセイによって生成した、還元された酸化還元試薬量を電気化学的に測定する。しかるべき場合には、更なる試薬もまた、このアッセイに含めてもよい。
【００３９】
典型的には、補酵素はＮＡＤ＋又はそのアナログである。ＮＡＤ＋のアナログは、ＮＡＤ＋と共通する構造的特徴を有し、且つコレステロールデヒドロゲナーゼの補酵素としても働く化合物である。ＮＡＤ＋のアナログの例としては、ＡＰＡＤ（アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド）；ＴＮＡＤ（チオＮＡＤ）；ＡＨＤ（アセチルピリジンヒポキサンチンジヌクレオチド）；ＮａＡＤ（ニコチン酸アデニンジヌクレオチド）；ＮＨＤ（ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド）；及びＮＧＤ（ニコチンアミドグアニンジヌクレオチド）が挙げられる。補酵素は、典型的には、１〜２０ｍＭ、例えば３〜１５ｍＭ、好ましくは５〜１０ｍＭの量で、試薬混合物中に存在する。
【００４０】
典型的には、酸化還元剤は、上に示したアッセイに従って還元できるものでなくてはならない。この場合、酸化還元剤は補酵素から（又は後述のようなレダクターゼから）電子を受容でき、且つ電子を電極に伝達できるものでなくてはならない。酸化還元剤は分子又はイオン錯体であり得る。タンパク質等の、天然に存在する電子受容体であってもよく、又は合成分子であってもよい。酸化還元剤は、典型的には、少なくとも２つの酸化状態を有するであろう。
【００４１】
好ましくは、酸化還元剤は無機錯体である。当該剤は金属イオンを含んでいてもよく、少なくとも２価を有することが好ましいであろう。特に、当該剤は、遷移金属イオンを含んでいてもよく、好ましい遷移金属イオンとしては、コバルト、銅、鉄、クロム、マンガン、ニッケル、オスミウム又はルテニウムのイオン、例えば、コバルト、銅、鉄、クロム、マンガン、ニッケル、又はルテニウムのイオンが挙げられる。酸化還元剤は帯電していてもよく、例えば、カチオン性又はその代わりにアニオン性であり得る。好適なカチオン性の剤の例は、Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋等のルテニウム錯体であり、好適なアニオン性の剤の例は、Ｆｅ（ＣＮ）６３−等のフェリシアン化錯体である。用いられ得る錯体の例としては、Ｃｕ（ＥＤＴＡ）２−、Ｆｅ（ＣＮ）６３−、Ｆｅ（ＣＮ）５（Ｏ２ＣＲ）３−、Ｆｅ（ＣＮ）４（シュウ酸塩）３−、Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋、Ｒｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２）（エチレンジアミン等の）それらのキレートアミンリガンド誘導体類、Ｒｕ（ＮＨ３）５（ｐｙ）３＋、フェロセニウム、及び、−ＮＨ２、−ＮＨＲ、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、及びＣＯ２Ｈ等の１以上の基が、２つのシクロペンタジエニル環の一方又は両方へと置換されたその誘導体類が挙げられる。無機錯体は、好ましくはＦｅ（ＣＮ）６３−、Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋、又はフェロセニウムモノカルボン酸（ＦＭＣＡ）である。Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋及びＲｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２）が好ましい。
【００４２】
酸化還元剤は、典型的には、１０〜２００ｍＭ、例えば２０〜１５０ｍＭ、好ましくは３０〜１００ｍＭ又は最大８０ｍＭの量で試薬混合物中に存在する。
【００４３】
好ましい実施形態においては、電気化学的アッセイにおいて用いる試薬混合物は、レダクターゼを更に含む。レダクターゼは、典型的には、還元型ＮＡＤから２個の電子を伝達され、酸化還元剤へ２個の電子を伝達する。従って、レダクターゼの使用により、素早い電子の伝達がもたらされる。
【００４４】
用いられ得るレダクターゼの例としては、ジアホラーゼ並びにチトクロームＰ４５０レダクターゼ、特に、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）由来のチトクロームＰ４５０ｃａｍ酵素系のプチダレドキシンレダクターゼ、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のＰ４５０ＢＭ−３酵素のフラビン（ＦＡＤ／ＦＭＮ）ドメイン、ホウレンソウフェレドキシン（ferrodoxin）レダクターゼ、アドレノドキシンレダクターゼ、硝酸還元酵素、チトクロームｂ５レダクターゼ、トウモロコシ硝酸還元酵素、テルプレドキシンレダクターゼ及び酵母、ラット、ウサギ及びヒトＮＡＤＰＨチトクロームＰ４５０レダクターゼが挙げられる。本発明で用いるための好ましいレダクターゼとしては、ジアホラーゼ及びプチダレドキシンレダクターゼが挙げられる。
【００４５】
レダクターゼは組み換えタンパク質、又は精製若しくは単離した天然に存在するタンパク質であってもよい。レダクターゼは、電子の伝達を行う速度又は基質特異性を最適化する等、その性能を向上するために変異されていてもよい。
【００４６】
レダクターゼは、典型的には、０．５〜１００ｍｇ／ｍｌ、例えば１〜５０ｍｇ／ｍｌ、１〜３０ｍｇ／ｍｌ又は２〜２０ｍｇ／ｍｌの量で試薬混合物中に存在する。
【００４７】
本発明の好ましい実施形態においては、電気化学的アッセイの大まかなスキームは、以下：
【００４８】
【化２】
【００４９】
（式中、
ＰｄＲはプチダレドキシンレダクターゼであり
Ｄｉａはジアホラーゼであり
ＣｈＤはコレステロールデヒドロゲナーゼである）
の通りである。
【００５０】
試薬混合物は、任意に、１以上の更なる成分、例えば、賦形剤及び／又は緩衝剤及び／又は安定化剤を含有する。混合物を安定化するため、並びに任意で、試薬混合物を本発明の装置上で乾燥する場合に当該乾燥混合物に多孔性を提供するために、当該試薬混合物に賦形剤を含めることが好ましい。好適な賦形剤の例としては、マンニトール、イノシトール及びラクトース等の糖類、並びにＰＥＧが挙げられる。グリシンもまた、賦形剤として用いることができる。至適酵素活性のために必要なｐＨを提供するために、緩衝剤も含めてもよい。例えば、トリス緩衝剤（ｐＨ９）を用いてもよい。例えば酵素の安定性を高めるために、安定化剤を加えてもよい。好適な安定化剤の例は、アミノ酸（例、グリシン及びエクトイン）である。
【００５１】
典型的には、試料は単一の段階で全ての試薬と接触する。従って、アッセイを実施するために、必要な試薬を全て含有し、且つ試料と容易に接触できる試薬混合物を提供する。好ましい実施形態においては、本発明のＨＤＬコレステロールアッセイのための試薬混合物は、高密度リポタンパク質を選択的に分解する界面活性剤；コレステロールエステラーゼ又はリパーゼ；コレステロールデヒドロゲナーゼ；ＮＡＤ＋又はそのアナログ；レダクターゼ；及び酸化還元剤を含む。より好ましい実施形態においては、ＨＤＬコレステロールアッセイのための試薬混合物は、高密度リポタンパク質を選択的に分解する界面活性剤、コレステロールエステラーゼ又はリパーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ＋又はそのアナログ、ジアホラーゼ又はプチダレドキシンレダクターゼ及びＲｕ（ＮＨ３）６３＋を含む。
【００５２】
本発明はまた、試料の総コレステロール含量のためのアッセイを包含する。総コレステロール含量を電気化学的に検出する、任意の方法を用いてもよい。好ましい方法においては、全てのリポタンパク質を分解する界面活性剤を試料に添加し、全てのリポタンパク質に結合するコレステロール及びコレステロールエステル類を、反応のために利用可能にする。次いで、当該試料をコレステロールエステル加水分解試薬及びコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼ、並びに典型的には補酵素及び酸化還元試薬並びに任意にレダクターゼと反応させる。コレステロールエステル加水分解試薬、コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼ及び任意の他の成分を用いるコレステロールの測定は、典型的には、ＨＤＬコレステロール試験についての上述したのと同様の方法で実施する。
【００５３】
本発明の１つの実施形態において、総コレステロール試験は、ＨＤＬコレステロール試験とは別個のシリーズの試薬を用いて実施する。この実施形態においては、試料に、ＨＤＬコレステロール試験を実施するために第一のシリーズの試薬を添加し、そして分けた、試料の一部に、総コレステロール試験を実施するために第二のシリーズの試薬を添加する。総コレステロールアッセイにおいて用いる界面活性剤は、典型的には、胆汁酸誘導体類又はその塩であるが、それはこれらが全てのタイプのリポタンパク質を効率的に分解することが分かってきたからである。好適な胆汁酸誘導体類の例としては、コール酸、タウロコール酸、グリココール酸、リトコール酸、デオキシコール酸、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コールアミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］プロパン）、ＣＨＡＰＳＯ、ＢＩＧＣＨＡＰ及びデオキシＢＩＧＣＨＡＰが挙げられる。２以上の胆汁酸誘導体類又はその塩の組み合わせも用い得る。例えば、ＣＨＡＰＳ単独での使用では、時折、酵素の沈殿を生じることが分かってきている。従って、ＣＨＡＰＳと、この効果を有しない、異なる界面活性剤（例、デオキシＢＩＧＣＨＡＰ）との組み合わせが、よいことが分かってきている。好ましい実施形態において、ＣＨＡＰＳとデオキシＢＩＧＣＨＡＰは、１：１の比率で用いられる。グルコピラノシド類もまた、界面活性剤として用いられ得る（例、ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド）。
【００５４】
存在する界面活性剤の総量は、コレステロールデヒドロゲナーゼ酵素の重量に対して、典型的には６０〜８５重量％、好ましくは７０〜８０重量％である。
【００５５】
総コレステロール試験において用いる試薬は、典型的には、単一の試薬混合物の形態で提供され、単一の段階で試料と反応させることができる。試薬混合物には、好ましくは、胆汁酸誘導体類又はその塩；コレステロールエステラーゼ又はリパーゼ；コレステロールデヒドロゲナーゼ；ＮＡＤ＋又はそのアナログ；レダクターゼ；及び酸化還元試薬が含まれる。より好ましい実施形態においては、総コレステロールアッセイのための試薬混合物には、ＣＨＡＰＳ、デオキシＢＩＧＣＨＡＰ、コレステロールエステラーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、ＴＮＡＤ＋、プチダレドキシンレダクターゼ及びＲｕ（ＮＨ３）６３＋が含まれる。
【００５６】
本発明の別の実施形態においては、ＨＤＬコレステロール試験及び総コレステロール試験を実施するために、同一の試薬を用いる。この実施形態においては、上記した通りの選択的試薬（例、選択的界面活性剤）を、試料のＨＤＬコレステロール含量の測定を提供するために用いる。しかしながら、用いる選択的試薬は、他のリポタンパク質との反応を完全に抑制するものではなく、ＨＤＬと選択的に反応するものである。このように、ＨＤＬコレステロール試験は、まず、ＨＤＬが選択的に反応する時間に試料／試薬混合物の電気化学的応答を測定することによって実施される。次いで、反応を継続させ、そして全てのリポタンパク質が反応する時間に、第二の電気化学的測定を行う。このように、単一の電気化学セル中の単一の試薬混合物を、試料のＨＤＬ含量に対応する第一の測定結果を提供するために用い、そして試料の総コレステロール含量に対応する第二の測定結果のために用い得る。
【００５７】
ＨＤＬ及び総コレステロール含量に対応する２回の測定を行い得る時間は、用いる特定の選択的試薬の反応速度に依存するであろう。当業者は、任意の特定の選択的試薬についての測定のための、しかるべき時点を、決定することができるであろう。多くの場合において、ＨＤＬコレステロール試験は、試料を試薬混合物に添加して約１分以内（例、３０秒以内）に完了するであろうし、且つ総コレステロール試験は、試料を試薬混合物に添加してから約２分後に完了するであろう。
【００５８】
各ＨＤＬコレステロールアッセイのための試薬混合物及び、総コレステロールアッセイのための試薬混合物を用いる場合、それらは、典型的には、固形形態（例えば、乾燥形態）又はゲルとして提供される。任意に、当該試薬を凍結乾燥してもよい。代替的にはそれらは、溶液又は懸濁液の形態であり得る。試薬混合物中に存在する各成分の量は、上ではモル濃度又はｗ／ｖで表しているが、当業者は、存在する各成分の相対量が同じままであるようにして、これらの量を乾燥混合物又はゲルに好適な単位に適合させることができるであろう。
【００５９】
本発明の好ましい実施形態においては、試料の一部をＨＤＬコレステロールアッセイのための試薬と反応させ、且つ同時又は実質的に同時（例、３０秒以内又は１５秒以内）に、試料の更に一部を総コレステロールアッセイのための試薬と反応させる。これで、決定すべき試料の非ＨＤＬコレステロール含量の算出が、非常に短時間で可能になる。好ましい実施形態において、ＨＤＬコレステロール及び総コレステロールアッセイは、試料を試薬に添加してから５分以内、好ましくは３分、２分、９０秒又は６０秒以内に完了する。
【００６０】
電気化学的測定が全血で実施される場合、得られる測定結果はヘマトクリット値に依存し得る。従って、測定結果は理想的には、少なくとも部分的に、この要因を説明するために調整するべきである。或いは、アッセイを実施する前に、試料を濾過することによって赤血球を除去できる。
【００６１】
本発明のキットは、各セルが、作用電極、参照電極又は擬似参照電極及び任意に別個の対向電極を有する電気化学セルを、少なくとも１つ、例えば少なくとも２つ有する装置を含む。当該セルが所望の電気化学的試験を提供するために、シリーズの試薬が当該セル又は各セルに使われる。当該試薬が電気化学セルに使われるということによって意味されるのは、一度試料が試薬と接触すると、試薬と試料の混合物が電気化学セルの作用電極に接触することになるように、試薬は位置するということである。当該キットはまた、各セルに電位を印加するための電源及び結果生じる、各セルの電気化学的応答を測定するための測定機器を含む。
【００６２】
本発明の装置は、ＨＤＬコレステロールアッセイを実施するための上記の第一のシリーズの試薬が使われる、少なくとも１つの電気化学セルを有する。１つの実施形態において、この単一セルは、ＨＤＬコレステロール試験及び総コレステロール試験を実施するために用いる。代替の実施形態において、当該装置は、総コレステロールアッセイを実施するための、上記の第二のシリーズの試薬が使われる、少なくとも１つの第二の電気化学セルを含む。当該キットはまた、総コレステロールの結果からＨＤＬコレステロールの結果を差し引くことによって、試料の非ＨＤＬコレステロール含量を決定するための、算出手段、典型的には、コンピュータプログラムを含む。
【００６３】
典型的には、各シリーズの試薬は、単一の試薬混合物の形態（即ち、各シリーズの試薬について、１つの試薬混合物が提供される）で装置中に与えられる。試薬混合物は、液体又は固体のいずれかの形態で存在し得るが、固体形態が好ましい。典型的には、試薬混合物は、好適な液体（例、水）中に懸濁／溶解させて装置中に挿入するか又は装置上に置き、次いで所定の位置で乾燥させる。装置中／上で物質を乾燥させる段階は、当該物質を望ましい場所に保持するのに役立ち、且つ試薬が、装置の一方の電気化学セルからもう一方へと移動するのを妨げるのに役立つ。乾燥は、例えば、風乾、真空乾燥、凍結乾燥又はオーブン乾燥（加熱）によって実施し得る。試薬混合物は、典型的には、試料が試薬混合物と接触したとき、電極との接触も起きるように、電極の付近に配置される。
【００６４】
当該装置には、任意に、試験する試料が、試薬混合物と接触する前に通過する膜が含まれ得る。当該膜は、例えば、赤血球（red blood cell）、赤血球（erythrocyte）及び／又はリンパ球等の成分を濾過で除去するために用いることができる。血液濾過膜を含む好適な濾過膜は、当該技術において公知である。Ｐｒｅｓｅｎｃｅ ２００及びＰａｌｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎのＰＡＬＬ ＢＴＳ ＳＰ３００、Ｗｈａｔｍａｎ ＶＦ２， Ｗｈａｔｍａｎ Ｃｙｃｌｏｐｏｒｅ， Ｓｐｅｃｔｒａｌ ＮＸ及びＳｐｅｃｔｒａｌ Ｘが血液濾過膜の例である。繊維ガラスフィルター（例えばＷｈａｔｍａｎ ＶＦ２）は全血から血漿を分離でき、また、全血検査試料が装置に供給され、且つ試験される試料が血漿である場合に好適に用いられる。
【００６５】
使用前に親水的又は疎水的処理を経てきたものを含む、代替的、又は付加的な膜も用いられ得る。所望により、当該膜の表面の他の特徴も改変してもよい。例えば、所望の試料の膜を通る流れを促進するために、水中における膜の接触角を修正するための処理を用いてもよい。当該膜は１又は２以上の材料層を含んでもよく、各々は同じであっても、異なっていてもよい。例えば、異なる膜材料の２層を有する、従来の二重層膜を用いてもよい。
【００６６】
本発明において用いるための適切な装置には、ＷＯ２００３／０５６３１９及びＷＯ２００６／０００８２８に記載のものが含まれる。
【００６７】
本発明の１つの実施形態による装置の電気化学セルを、図１に示す。この実施形態においては、作用電極５は、ミクロ電極である。本発明の目的のために、ミクロ電極は、５０μｍを超えない少なくとも１つの、作業寸法を有する電極である。本発明のミクロ電極は、巨大なサイズの（即ち５０μｍを上回る）寸法を有してもよい。
【００６８】
セルは、底部１及び壁（単数又は複数）２を有するレセプタクル又は容器の形態である。典型的には、レセプタクルは、２５〜１０００μｍの深さ（即ち、上部から底部まで）を有するであろう。１つの実施形態においては、レセプタクルの深さは、５０〜５００μｍ、例えば１００〜２５０μｍである。代替の実施形態においては、レセプタクルの深さは５０〜１０００μｍ、好ましくは２００〜８００μｍであり、例えば３００〜６００μｍである。レセプタクルの長さ及び幅（即ち、壁から壁まで）、又はレセプタクルが円筒状の場合はその直径は、典型的には、０．１〜５ｍｍ、例えば０．５〜１．５ｍｍ（１ｍｍ等）である。
【００６９】
レセプタクル３の開口端は、部分的に不透過性材料で覆われてもよく、又は半透性又は透過性の膜等の、半透性又は透過性の材料で覆われてもよい。レセプタクルの開口端は、実質的に、半透性又は透過性の膜４で覆われるのが好ましい。膜４は、とりわけ、埃又は他の混入物質がレセプタクルに入ることを防ぐのに役立つ。
【００７０】
作用電極５は、レセプタクルの壁に位置する。作用電極は、例えば、レセプタクルの壁周囲の連続した帯の形態である。作用電極の厚みは、典型的には０．０１〜２５μｍ、好ましくは０．０５〜１５μｍであり、例えば０．１〜２０μｍである。より厚みのある作用電極、例えば、０．１〜５０μｍ、好ましくは５〜２０μｍの厚みを有する電極も想定している。作用電極の厚みは、レセプタクルをその底部に置く場合は、その垂直方向の寸法である。作用電極の厚みは、その有効作業寸法、即ち、試験する試料と接触する、電極の寸法である。作用電極は、例えば、導電性インクの形態の、炭素、パラジウム、金又は白金で形成するのが好ましい。当該導電性インクは、例えば、白金、及び／又はグラファイトといった更なる材料を含有する改良インクであり得る。作用電極を形成するために２以上の層を用いてもよく、当該層は、同じか、又は異なった材料で形成される。
【００７１】
セルはまた、例えば、レセプタクルの底部、レセプタクルの壁（単数又は複数）中、又はレセプタクルの周囲若しくは付近の装置の領域中に存在し得る擬似参照電極（示さず）を含有する。擬似参照電極は、典型的には、Ag/AgClから作るが、他の材料も用い得る。擬似参照電極として用いるための好適な材料は、当業者に公知である。この実施形態においては、セルは、擬似参照電極が対向電極及び参照電極の両方として働く２電極システムである。セルが参照電極及び別個の対向電極を含む、代替の実施形態も想定できる。
【００７２】
擬似参照（又は参照）電極は、典型的には、作用電極５と同様のサイズの、又はそれより小さい、或いは大きい（例えば相当大きい）表面積を有する。典型的には、擬似参照（又は参照）電極の表面積の、作用電極の表面積に対する比率は、少なくとも１：１、例えば少なくとも２：１、又は少なくとも３：１である。好ましい比率は、少なくとも４：１である。擬似参照（又は参照）電極は、例えば、マクロ電極であってもよい。好ましい擬似参照（又は参照）電極は、０．０１ｍｍ又はそれを上回る、例えば、０．１ｍｍ又はそれを上回る、寸法を有する。これは例えば、０．１ｍｍ又はそれを上回る、寸法である。擬似参照（又は参照）電極の典型的な面積は、０．００１ｍｍ２〜１００ｍｍ２、好ましくは０．１ｍｍ２〜６０ｍｍ２であり、例えば、１ｍｍ２〜５０ｍｍ２である。作用電極と擬似参照（又は参照）電極との間の最短距離は、例えば、１０〜１０００μｍである。
【００７３】
セルが機能できるためには、電極は各々絶縁材料６によって分離されなければならない。絶縁材料は、典型的には、例えば、アクリレート、ポリウレタン、ＰＥＴ，ポリオレフィン、ポリエステルといったポリマー又は他の任意の安定な絶縁材料である。ポリカーボネート並びに他のプラスチック及びセラミックも、好適な絶縁材料である。絶縁層はポリマー溶液から溶媒を蒸発させることによって形成され得る。塗布後硬化する液体、例えばワニスも、用いられ得る。或いは、例えば、熱若しくはＵＶへの曝露によって、又は２成分の架橋可能なシステムの活性部分と混合することによって架橋される、架橋可能なポリマー溶液を用いても良い。しかるべき場合には、絶縁層を形成するために、誘電性インクも用いられ得る。代替の実施形態においては、絶縁層は装置にラミネートされる（例えば熱でラミネートされる）。
【００７４】
電気化学セルの電極は、好適な任意の手段によって、必要な任意の測定機器に、接続され得る。典型的には、電極は、導電性のトラックに接続され、該導電性のトラックは、必要な測定機器にそれ自身接続されるか、又は接続され得る。
【００７５】
図１中の７に示す通り、必要な試薬は、典型的にはレセプタクル内に含有させる。典型的には、単一の試薬混合物の形態の試薬は、液体の形態でレセプタクル内に挿入された後、組成物を固定するのに役立つよう乾燥させる。試薬混合物は、例えば、風乾、真空乾燥、凍結乾燥、又はオーブン乾燥（加熱）してもよく、最も好ましくは、凍結乾燥される。
【００７６】
本発明の装置は、１以上の電気化学セルを含む。ストリップＳ上に４つの電気化学セル１０を有する装置を、図２に示す。各セルは、作用電極を含み、且つ対向電極を更に含み得る。好ましくは、図２に示すように、単層の擬似参照電極材料５を、ストリップ６１、６２の表面上に与え、各レセプタクルを囲んで、且つレセプタクルの周囲と擬似参照電極層の端との間のブランク領域１３を残す。当該電極は、伝導トラック１２を介して必要な機器に接続する。
【００７７】
本発明の実施形態は、多くの測定が同時になされるのを可能にする。この実施形態の好ましい態様において、セルの１つはＨＤＬコレステロール試験を実施するための試薬混合物を含有し、第二のセルが総コレステロール試験を実施するための試薬を含有する。
【００７８】
更なるセルをコントロールセルとして用いてもよい。コントロールセルは、典型的には、界面活性剤、補酵素、酸化還元試薬及び任意にレダクターゼ並びに所望の緩衝剤、安定化剤及び賦形剤を含む、更なるシリーズの試薬を含む。典型的には、コントロール試薬は、コレステロールと反応する酵素が存在しないことを除いて、ＨＤＬコレステロール及び総コレステロール試験を実施するために用いる試薬と同じか、又は非常に似たものである。試料をコントロール試薬と反応させ、続いて任意の電気化学的応答を測定することで、当業者は、試料中の妨害物質に起因する応答を決定できる。その後、妨害物質に起因する応答を、総コレステロール試験及びＨＤＬコレステロール試験の測定結果から差し引いて、妨害物質の効果が低減又は除去された、より正確な結果を得ることができる。更に、試験される試料が、当該試験をうまくいかなくさせる任意の著しい量の妨害物質を含有する場合には、コントロール反応を用いて、これを同定できる。
【００７９】
本発明のキットは、電気化学セル（例、図２に記載及び上記のもの）を含むストリップＳ、及び、当該ストリップＳと電子的な接触を形成できる電子装置（例、携帯型電子装置）を含み得る。例えば、当該電子装置は、電極へ電位を提供するための電源並びに電気化学的応答を検出するための測定機器及び他の必要な任意の測定機器を内蔵し得る。当該電子装置はまた、非ＨＤＬコレステロール含量を決定するための計算装置も含み得る。１以上のこれらのシステムを、コンピュータプログラムによって作動させてもよい。
【００８０】
本発明の装置は、試料を装置に提供すること、及び試料が各試薬混合物に接触するのを可能にすることによって機能させる。固体形態の試薬混合物の場合、当該試薬混合物を試料中で溶解／懸濁することを可能とするため、及び、反応が起こることを可能にするために、典型的には概ね２０秒の含水（wet-up）時間が与えられる。しかしながら、この含水時間は、用いる装置の性質に依存して変えてもよい。例えば、試薬と接触させる前に試料を濾過するための膜が存在する場合、最大５分の含水時間を用い得る。試料／試薬混合物は、電極で電気化学反応が起こり得るように、対応する作用電極と電子的に接触していなくてはならない。
【００８１】
次いで、各セルに電位を印加し、そして各セルの電気化学的応答を測定する。これは、典型的には、電流を測定することによって実現される。典型的には、試料と試薬とを混合した時点から１０秒間〜５００秒間、例えば、１０秒間〜４００秒間又は１０秒間〜１８０秒間（例、少なくとも１０秒又は１５秒、且つ最大９０秒、６０秒又は３０秒、例えば概ね２０秒間）の後に、電位を印加し、そして測定する。この好ましい範囲内の時間を用いることで、ＨＤＬコレステロールアッセイでＨＤＬに結合したコレステロールのみを検出することを保証するのに役立つ。
【００８２】
単一のセルを用いて、試料のＨＤＬコレステロール及び総コレステロール含量を測定する場合、更なる経過時間の後、セルに第二の電位を印加する。例えば、第二の電位は、試料と試薬とを混合した時点から少なくとも１２０秒又は少なくとも１５０秒又は１８０秒で印加され得る。この第二の電位の印加の間に電流を測定することで、総コレステロール含量に対応する結果が与えられる。
【００８３】
典型的には、Ｒｕ（ＩＩ）が作用電極で検出すべき生成物の場合、セルに印加する電位は０．１Ｖ〜０．３Ｖである。０．１５Ｖが好ましい印加電位である。（本明細書中で述べる電圧はすべて、０．１Ｍ塩化物ありでの、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極に対する値である。）好ましい実施形態においては、電位が約１秒間、０．１５Ｖの正の印加電位であるのが最初の段階である。還元電流の測定を望む場合、次いで、−０．４〜−０．６Ｖの負の電位を印加する。二重の電位段階の使用は、ＷＯ ０３／０９７８６０（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。異なる酸化還元剤を用いる場合、酸化／還元ピークが生じる電位に従って、印加電位を変えることができる。
【００８４】
従って、本発明の電気化学的試験で、非ＨＤＬコレステロールの測定を、試料を装置にアプライしてから非常に短時間で、典型的には約５分以内で、好ましくは３分以内で、２分以内で、又は１分以内にでさえ、行うことが可能になる。状況によっては、試料を装置にアプライしてからわずか１５秒又は３０秒で結果を得ることができるかもしれない。
【実施例】
【００８５】
実施例１：ＨＤＬ選択的界面活性剤の解析
本実施例において、界面活性剤が選択的にＨＤＬコレステロールを破壊するか、従って本発明のＨＤＬコレステロールアッセイに使用するのにふさわしいかどうか、を決定するための試験プロトコルを記載する。
【００８６】
緩衝溶液の調製（トリス緩衝液−５％グリシン ｐＨ９．０）
結晶化トリス及びトリスＨＣｌを含有するトリズマプレセット結晶（Trizma Pre-Set Crystals）（ｐＨ９．０、シグマ、Ｔ−１４４４）を９５０ｍｌのｄＨ２Ｏに溶解し、ｐＨを記録した。続いて、５０ｇのグリシン（シグマ、Ｇ−７４０３）を該トリス溶液に加え、ｐＨを記録した。次いで、１０Ｍ 水酸化カリウム（シグマ、Ｐ−５９５８）を用いてｐＨを８．８−９．２の範囲内に調整し、ｄＨ２Ｏにより該溶液を１０００ｍｌとし、最終ｐＨを記録した（ｐＨ９．１）。使用期限を１ヶ月とし、４℃にて、該溶液を保存した。
【００８７】
界面活性剤溶液の調製
事前調製した緩衝溶液にアンヒトール ２０Ｎ（花王）を加えることにより、界面活性剤溶液を調製し、１０％アンヒトール ２０Ｎ緩衝溶液を得た。
【００８８】
ＬＤＬ及びＨＤＬ試料の調製
脱脂血清（dilipidated serum）（Ｓｃｉｐａｃ、Ｓ１３９）を用いて、ＬＤＬ（Ｓｃｉｐａｃ、Ｐ２３２−８）及びＨＤＬ（Ｓｃｉｐａｃ、Ｐ２３３−８）試料を、必要濃度の１０倍で作成した（最終テスト混合物中で１：１０で希釈するため）。次いで、スペースクリニカルアナライザー（Space clinical analyser）（Ｓｃｈｉａｐｐａｎｅｌｌｉ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ）を用いて試料を解析した。ＬＤＬ及びＨＤＬの適切な濃度は１０ｍＭであり、最終テスト混合物中で１ｍＭを与える。
【００８９】
酵素混合物の調製
事前調製した緩衝溶液に以下を加えることにより、酵素混合物を調製した：
１６０ｍＭ 塩化ルテニウムヘキサアミン（Hexaammine）（ＩＩＩ）（アルファ・エイサー、１０５１１）
１７．７ｍＭ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（オリエンタル酵母工業株式会社）
８．４ｍｇ／ｍｌ プチダレドキシンレダクターゼ（バイオカタリスト）
６．７ｍｇ／ｍｌ コレステロールエステラーゼ（Ｓｏｒａｃｈｉｍ／東洋紡、ＣＯＥ−３１１）
４４．４ｍｇ／ｍｌ コレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチンフリー（アマノ、ＣＨＤＨ−６）
【００９０】
テストプロトコル
９μｌの界面活性剤溶液を９μｌの酵素混合物と混合した。Ｔ＝−３０秒において、２μｌの試料（１０倍濃度ＬＤＬ若しくは１０倍濃度ＨＤＬのいずれか、又は２μｌの脱脂血清）を得られた界面活性剤と混合した：酵素混合物及び９μｌの得られた溶液を電極上に置いた。Ｔ＝０秒においてクロノアンペロメトリーテストを開始した。０．１５Ｖの酸化電位を印加し、続いて−０．４５Ｖの還元電位を印加した。酸化電位の印加中、５つのタイムポイント（Ｔ＝０、３２、６３、９０及び１１８秒）にて電流を測定した。各試料を重複してテストした。
【００９１】
結果
ＨＤＬ及びＬＤＬテストの結果を、コントロールとしての脱脂試料と共に、図３に示す。特に短いタイムピリオドにおいて、アンヒトール ２０ＮがＬＤＬよりもＨＤＬに対して選択的であることが、図３より明らかである。
【００９２】
ディファレンシエーションの値を決定するため、測定したＨＤＬ電流を既知のＨＤＬ濃度に対してプロットし、各タイムポイントでのグラジエントを測定した。同様に、各ＬＤＬ測定結果に対するグラジエントを計算した。Ｔ＝３２秒（試薬に試料を加えた後合計６２秒）において、ＨＤＬグラジエント（ＧＨＤＬ）は、０．７９６ｍＭの既知のＨＤＬ濃度に基づいて４３３．０８、ＬＤＬグラジエント（ＧＬＤＬ）は、０．７４４ｍＭの既知のＬＤＬ濃度に基づいて１７１．１０、並びに得られたディファレンシエーションの値は６０．４９だった。
【００９３】
他の選択的界面活性剤に対するいくつかのディファレンシエーションの値を下の表１に示すが、全てＴ＝３２秒において測定している：
【００９４】
【表１】
【００９５】
実施例２：非ＨＤＬコレステロール含量の決定
図２に従う電気化学センサストリップを使用した。各ストリップは図１に従う２つの電気化学セルを含有していた。
【００９６】
第１の電気化学セルは、総コレステロールテストを実行するための製剤を含有していた。該製剤は以下の通りであった：
０．１Ｍ トリス（ｐＨ９．０）、５０ｍＭ ＭｇＳＯ４、５％ｗ／ｖ グリシン、１％ｗ／ｖ ミオイノシトール、１％ｗ／ｖ エクトイン、５％ｗ／ｖ ＣＨＡＰＳ、５％ｗ／ｖ デオキシｂｉｇＣＨＡＰ、８０ｍＭ Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３、８．８ｍＭ ＴＮＡＤ、４．４ｍｇ／ｍＬ ＰｄＲ、３．３ｍｇ／ｍＬ ＣｈＥ及び６６ｍｇ／ｍＬゼラチンフリーＣｈＤＨ。
【００９７】
第２の電気化学セルは、ＨＤＬコレステロールテストを実行するための製剤を含有していた。該製剤は以下の通りであった：
０．１Ｍ トリス（ｐＨ９．０）、２％ｗ／ｖ ＭｇＣｌ２、３％ｗ／ｖ グリシン、１％ｗ／ｖ ヒドロキシエクトイン、１％ｗ／ｖ ラクチトール、１％ｗ／ｖ ラクトース、２％ｗ／ｖ エマルゲン Ｂ６６、２０ｍＭ Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３、１．６６ｍＭ ＴＮＡＤ、２ｍｇ／ｍＬ ＰｄＲ、３．３ｍｇ／ｍＬ クロモバクテリウム・ビスコサム由来ジェンザイムリパーゼ、２０ｍｇ／ｍＬゼラチンフリーＣｈＤＨ。
【００９８】
各製剤を、水性の溶液／懸濁液として作成して、各電気化学セルに挿入し、乾燥した。
【００９９】
１日目は１０人のドナー及び２日目は２０人のドナーにより、実験を２日に渡って行った。ドナーは絶食させなかった。全血試料をＬｉヘパリン採血管内に採取した。これらの試料を遠心し、血漿を採取した。
【０１００】
事前調製した電気化学センサストリップを用いて、各試料の総コレステロール及びＨＤＬコレステロール含量をテストした。各ストリップに２０ｕＬの血漿をアプライして、各電気化学セルを満たした。試料を加えた後、以下の時間で０．１５Ｖの酸化電位を印加し、続いて−０．４５Ｖの還元電位を印加した：ＨＤＬ：３６秒；総コレステロール：１１０秒。酸化及び還元電流のバルブ（valves）の両方を測定した。個々のセンサストリップでの８反復の測定を、各試料で行った。
【０１０１】
また、各試料中の総コレステロール、ＨＤＬコレステロール及びＬＤＬコレステロールの濃度を、ランドックススペースクリニカルアナライザー（Randox SPACE clinical analyzer）を用いて決定した。アナライザーでの各測定を重複して行い、平均濃度値を決定した。
【０１０２】
総コレステロール（ＴＣ）テストの結果を図４ａ及び４ｂ（それぞれ１日目及び２日目）に示す。これらの図は、ランドックススペースクリニカルアナライザーにより決定されたＴＣ含量に対してプロットした酸化電流応答を示す。同様に、ＨＤＬコレステロールテストの結果を図５ａ及び５ｂに示すが、ランドックススペースクリニカルアナライザーにより決定されたＨＤＬコレステロール含量に対して酸化電流をプロットしている。
【０１０３】
直線回帰を各グラフに対して行った。各グラフの最良の直線近似由来の勾配及び切片を用いて、各電流応答に対する分析物濃度を予測した：
【０１０４】
【数２】
【０１０５】
ＴＣ及びＨＤＬコレステロールに関して計算された分析物の値を用いて、下の式に従って非ＨＤＬコレステロールの濃度を計算した：
【０１０６】
【数３】
【０１０７】
ランドックススペースクリニカルアナライザーにより決定された、［ＬＤＬ］（ｘ軸）に対する、各試料の測定されたＨＤＬコレステロール及びＴＣから決定された［非ＨＤＬ］（ｙ軸）のプロットを図６ａ及び６ｂに示す。非ＨＤＬコレステロール濃度とＬＤＬコレステロール濃度との間に良好な相関が観察された。
【０１０８】
また、本発明に従って測定された非ＨＤＬコレステロール含量を、フリードワルド式を用いて決定されたＬＤＬコレステロール含量と比較した：
【０１０９】
【数４】
【０１１０】
式中、［総コレステロール］は試料中のコレステロールの総濃度であり、［ＨＤＬ］は高密度リポタンパク質に結合したコレステロールの濃度であり、［トリグリセリド］は試料のトリグリセリド濃度であり、濃度はｍｍｏｌ ｄｍ−３で測定している。
【０１１１】
非ＨＤＬコレステロール含量に対してプロットした結果を、図７に示す。非ＨＤＬコレステロール含量とフリードワルド式を用いて決定されたＬＤＬコレステロール含量との間に良好な相関が見られた。
【０１１２】
実施例３：ＭＥＧＡ−８
本実験の目的は、短い測定時間でのＨＤＬへの応答及び長い測定時間でのＴＣへの応答を用いることによって、ＬＤＬへの応答を判定するための、１００ｍＭ ＭＥＧＡ−８を含有するシングルセンサの使用を調べることであった。
【０１１３】
１０％β−ラクトース緩衝液
０．１Ｍ トリス ｐＨ９．０、３０ｍＭ ＫＯＨ及び１０％ β−ラクトースを含有する緩衝溶液を調製した。
【０１１４】
３０ｍＭ ＲｕＡｃａｃ溶液：
上記１０％ラクトース緩衝液にＲｕＡｃａｃを加えることにより、３０ｍＭ ＲｕＡｃａｃ溶液を作成した。Ｃｏｖａｒｉｓのアコースティックミキサーを用いて、この溶液を混合した。
ＲｕＡｃａｃ＝Ｃｉｓ−［Ｒｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２）］
【０１１５】
ＭＥＧＡ溶液
上記ＲｕＡｃａｃ溶液にＭＥＧＡを加え、以下の最終濃度にすることにより２倍強度ＭＥＧＡ溶液を作成した：
ＭＥＧＡ−８（Ｓｏｌｔｅｃ Ｖｅｎｔｕｒｅｓ Ｓ１１６）
２００ｍＭ（２９２μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中に、０．０１８８ｇ）
【０１１６】
酵素混合物
ＲｕＡｃａｃ溶液に酵素を加え、以下の最終濃度にすることにより２倍強度で酵素混合物を作成した：
１７．７ｍＭ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（オリエンタル酵母工業株式会社）
８．４ｍｇ／ｍｌ プチダレドキシンレダクターゼ（バイオカタリスト）
６．７ｍｇ／ｍｌリパーゼ（ジェンザイム）
４４．４ｍｇ／ｍｌコレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチンフリー（アマノ、ＣＨＤＨ−６）
Ｃｏｖａｒｉｓのアコースティックミキサーを用いて、この溶液を混合した。
【０１１７】
分注及び凍結乾燥
最終酵素溶液のために、等量（約５０ｕｌ）の２倍濃度酵素溶液及びＭＥＧＡ溶液を１：１で混合し、酵素／界面活性剤の最終混合物を得た。電動ピペットを用いて、０．４μｌ／ウェルの各溶液を、ＷＯ０３５６３１９に記載の通りのセンサ上に分注した。次いで、分注したセンサシートを凍結乾燥した。
【０１１８】
血漿試料
血漿試料を３０分間解凍した後、２９００ＲＣＦで５分間遠心した。脱脂血清（Ｓｃｉｐａｃ、Ｓ１３９）も、試料として使用した。試料について、ＴＣ濃度、ＴＧ濃度、ＨＤＬ濃度及びＬＤＬ濃度を、スペースクリニカルアナライザー（Ｓｃｈｉａｐｐａｎｅｌｌｉ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ）を用いて解析した。
【０１１９】
テストプロトコル
１２−１５μｌの血漿試料を電極ごとに用いた。血漿を加えて、Ａｕｔｏｌａｂに連結されたマルチプレクサーを用いて、クロノアンペロメトリーテストを開始した。１３のタイムポイント（０、３２、６４、９６、１２８、１６０，１９２、２２４、２５６、２８８、３２０、３５２及び３８４秒）にて、０．１５Ｖで酸化電流を測定し、最後のタイムポイント（４１６秒）にて、−０．４５Ｖで還元電流を測定した。各試料を重複してテストした。
【０１２０】
解析
各タイムポイントにおけるＨＤＬ若しくはＴＣに対する較正プロットを構築した。
【０１２１】
結果
３２秒におけるＨＤＬに対して、及び３８４秒におけるＴＣに対して良好な較正プロットが観察された。これらを図８に示す。
【０１２２】
個々の電極に関して、３２秒における電流値を用いて、グラジエント及び切片の値を用いて、ＨＤＬ較正プロットにより予測されるＨＤＬ値を計算した。同様に、個々の電極に関して、３８４秒における電流値を用いて、グラジエント及び切片値を用いて、ＴＣ較正プロットにより予測されるＴＣ値を計算した。
【０１２３】
個々の電極に関して、これらのＨＤＬ及びＴＣの予測値を用いて、ＴＣ−ＨＤＬの値を計算した。これらのＴＣ−ＨＤＬの値を、ランドックスアナライザーで測定した血漿試料のＬＤＬ値に対してプロットした。
【０１２４】
ランドックスＬＤＬに対する、計算されたＴＣ−ＨＤＬのプロットを図９に示す。ＴＣ−ＨＤＬの計算値は、参照の方法により測定したＬＤＬの値と妥当な相関を与えた。
【０１２５】
結論
短期間でのＨＤＬ、及び長期間でのＴＣへの応答を測定し、ＬＤＬ＝ＴＣ−ＨＤＬを計算することにより、ＬＤＬへの応答を計算するために、１００ｍＭ ＭＥＧＡ−８に基づいたシングルセンサを使用することができる。
【０１２６】
実施例４：様々な酵素
本実験の目的は、様々なコレステロールエステル加水分解酵素（リパーゼ若しくはコレステロールエステラーゼ）又は様々なＮＡＤＨオキシダーゼ（プチタドキシン（Putitadoxin）レダクターゼ若しくはジアホラーゼ）で調製したＴＣ及びＨＤＬセンサを用いた、ＴＣ−ＨＤＬ値からの血漿ＬＤＬの決定を調べることであった。
【０１２７】
３つの別々のＴＣセンサ及び３つの別々のＨＤＬセンサを調製した。各センサに用いた試薬の違いを下の表にまとめる：
【０１２８】
【表２】
【０１２９】
２つの別々の酵素混合物を以下のように調製したが、１つは８０ｍＭ Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３メディエーターを有し、１つは３０ｍＭ ＲｕＡｃａｃメディエーターを有していた。
８０ｍＭ Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３メディエーターを有する酵素混合物：
１０％β−ラクトース緩衝液；
０．１Ｍ トリス ｐＨ９．０、３０ｍＭ ＫＯＨ及び１０％β−ラクトースを含有する緩衝溶液を調製した。
【０１３０】
界面活性剤溶液
ラクトース溶液に界面活性剤を加え、以下の最終濃度にすることにより２倍強度界面活性剤溶液を作成した。
１０％ ＣＨＡＰＳ（シグマ−アルドリッチ、Ｃ５０７０）
５００ｕｌ ラクトース溶液中に０．０５ｇ。
１０％デオキシｂｉｇＣＨＡＰ（Ｓｏｌｔｅｃ Ｖｅｎｔｕｒｅｓ、Ｓ１１５）
３８０ｕｌ ＣＨＡＰＳ溶液中に０．０３８ｇ。
【０１３１】
８０ｍＭ Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３溶液：
１０％ＣＨＡＰＳ／デオキシＢＩＧＣＨＡＰ溶液にＲｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３を加えることにより、８０ｍＭ Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３溶液を作成した。
【０１３２】
酵素混合物
Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３溶液に酵素を加え、以下の最終濃度にすることにより２倍強度で酵素混合物を作成した：
１７．７ｍＭ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（オリエンタル酵母工業株式会社）
８．４ｍｇ／ｍｌ プチダレドキシンレダクターゼ（バイオカタリスト）若しくは８．４ｍｇ／ｍＬジアホラーゼ（ユニチカ）
６．７ｍｇ／ｍｌ コレステロールエステラーゼ（東洋紡、ＣＯＥ−３１１）若しくはリパーゼ（東洋紡、ＬＰＬ３１１）
４４．４ｍｇ／ｍｌ コレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチンフリー（アマノ、ＣＨＤＨ−６）
【０１３３】
各最終酵素溶液のために、等量（約５０ｕＬ）の２倍濃度酵素溶液及び界面活性剤溶液を１：１で混合し、酵素／界面活性剤の最終混合物を得た。
【０１３４】
３０ｍＭ ＲｕＡｃａｃメディエーターを有する酵素混合物：
１０％β−ラクトース緩衝液；
０．１Ｍ トリス ｐＨ９．０、３０ｍＭ ＫＯＨ及び１０％ β−ラクトースを含有する緩衝溶液を調製した。
３０ｍＭ ＲｕＡｃａｃ溶液：
上記１０％ラクトース緩衝液にＲｕＡｃａｃを加えることにより、３０ｍＭ ＲｕＡｃａｃ溶液を作成した。Ｃｏｖａｒｉｓのアコースティックミキサーを用いて、この溶液を混合した。
ＲｕＡｃａｃ＝Ｃｉｓ−［Ｒｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２）］
【０１３５】
界面活性剤溶液
ＲｕＡｃａｃ溶液に界面活性剤を加え、以下の最終濃度にすることにより２倍濃度界面活性剤溶液を作成した：
２００ｍＭ ＳＭＣ（同仁堂、ＳＯ２１−１２）
３０３ｕｌのＲｕＡｃａｃ溶液中０．０２９８ｇ
２００ｍＭ ＨＥＧＡ−９（アナトレース、Ｈ１０９）
２０４ｕｌのＲｕＡｃａｃ溶液中０．０１４９ｇ
【０１３６】
酵素混合物
ＲｕＡｃａｃ溶液に酵素を加え、以下の最終濃度にすることにより２倍強度で酵素混合物を作成した：
１７．７ｍＭチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（オリエンタル酵母工業株式会社）
８．４ｍｇ／ｍｌプチダレドキシンレダクターゼ（バイオカタリスト）若しくはジアホラーゼ（ユニチカ）
２０．１ｍｇ／ｍｌリパーゼ（ジェンザイム）若しくはコレステロールエステラーゼ（ジェンザイム）
４４．４ｍｇ／ｍｌコレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチンフリー（アマノ、ＣＨＤＨ−６）
Ｃｏｖａｒｉｓのアコースティックミキサーを用いて、この溶液を混合した。
【０１３７】
血漿試料の分注、凍結乾燥、調製及び試験プロトコルは、ＨＥＧＡ−９を有するセンサを除き、実施例３に記載の通りであり、ＨＥＧＡ−９を有するセンサは、６反復の酸化（０、５９、１１８、１７７、２３６及び２９５秒のタイムポイントにて）を用いてテストし、最後のタイムポイント（３５４秒）にて−０．４５Ｖで還元電流を測定した。トランジェント時間は、８秒だった。
【０１３８】
解析
各タイムポイントにおけるＨＤＬ若しくはＴＣに対する較正プロットを構築した。
【０１３９】
結果
ＴＣセンサの応答を、それぞれ１９２秒、２２４秒若しくは２２４秒の測定時間で、ＴＣ濃度に対するＴＣ１、ＴＣ２及びＴＣ３に関してプロットした。ＨＤＬセンサの応答を、ＨＤＬ１、ＨＤＬ２、ＨＤＬ３に対して、それぞれ３８４秒、３８４秒及び２９５秒の測定時間で、血漿ＨＤＬ濃度に対してプロットした。
【０１４０】
これらの各較正プロットに関して、最良直線近似の勾配及び切片を用いて各電流値のＴＣ（若しくはＨＤＬ）濃度を計算した。次いで、濃度値を各試料について平均化した（ｎ＝８）。
【０１４１】
ＴＣ及びＨＤＬセンサの全ての可能な組み合わせについて、ＴＣ−ＨＤＬ濃度値を各血漿試料について計算し、ラボアナライザーにより測定された試料のＬＤＬ濃度に対してプロットした。これらの較正プロットを図１０に示す。
【０１４２】
図１０説明文：
Ａ：ＴＣセンサ１及びＨＤＬセンサ１
Ｂ：ＴＣセンサ１及びＨＤＬセンサ２
Ｃ：ＴＣセンサ１及びＨＤＬセンサ３
Ｄ：ＴＣセンサ２及びＨＤＬセンサ１
Ｅ：ＴＣセンサ２及びＨＤＬセンサ２
Ｆ：ＴＣセンサ２及びＨＤＬセンサ３
Ｇ：ＴＣセンサ３及びＨＤＬセンサ１
Ｈ：ＴＣセンサ３及びＨＤＬセンサ２
Ｉ：ＴＣセンサ３及びＨＤＬセンサ３
【０１４３】
結論
様々な酵素で調製したＴＣ及びＨＤＬセンサに関して、標準方法により決定された血漿ＴＣ−ＨＤＬ及び血漿ＬＤＬの計算値の間に良好な相関が観察される。
【０１４４】
実施例５：様々な界面活性剤
本実験の目的は、一連の界面活性剤の型で調製したＴＣ及びＨＤＬセンサを用いて、ＴＣ−ＨＤＬ値からの血漿ＬＤＬの決定を調べることであった。
【０１４５】
２つの別々の酵素混合物を調製したが、１つは８０ｍＭ Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３メディエーターを有しており、１つは３０ｍＭ ＲｕＡｃａｃメディエーターを有していた。８０ｍＭ Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３メディエーター溶液及び３０ｍＭ ＲｕＡｃａｃメディエーター溶液を、実施例４に記載の通りに調製した。
【０１４６】
８０ｍＭ Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３メディエーターを有する酵素混合物
界面活性剤溶液
Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３溶液に界面活性剤を加え、以下の最終濃度にすることにより２倍の濃度の界面活性剤溶液を作成した：
１０％ＣＨＡＰＳＯ（シグマ−アルドリッチ、Ｃ４６９５）
１８０ｕｌのＲｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３溶液中に、０．０１８ｇ
１０％デオキシｂｉｇＣＨＡＰ（Ｓｏｌｔｅｃ Ｖｅｎｔｕｒｅｓ、Ｓ１１５）
２２７ｕｌのＲｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３溶液中に、０．０２２７ｇ
【０１４７】
酵素混合物
Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３溶液に酵素を加え、以下の最終濃度にすることにより２倍強度で酵素混合物を作成した：
１７．７ｍＭチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（オリエンタル酵母工業株式会社）
８．４ｍｇ／ｍｌプチダレドキシンレダクターゼ（バイオカタリスト）
６．７ｍｇ／ｍｌコレステロールエステラーゼ（東洋紡、ＣＯＥ−３１１）
４４．４ｍｇ／ｍｌコレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチンフリー（アマノ、ＣＨＤＨ−６）
【０１４８】
３０ｍＭＲｕＡｃａｃメディエーターを有する酵素混合物：
界面活性剤溶液
ＲｕＡｃａｃ溶液に界面活性剤を加え、以下の最終濃度にすることにより２倍強度界面活性剤溶液を作成した：
１０％ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（アナトレース、Ｎ３２４）
１９２ｕｌのＲｕＡｃａｃ溶液中に、０．０１９２ｇ
１００ｍＭスクロースモノドデカノエート（カルビオケム、３２４３７４）
１７３ｕｌのＲｕＡｃａｃ溶液中に、０．００９１ｇ
２００ｍＭ ＨＥＧＡ−９（アナトレース、Ｈ１０９）
２０３ｕｌのＲｕＡｃａｃ溶液中に、０．０１４８ｇ
２００ｍＭ ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトピラノシド（アナトレース、Ｏ３１０）
２１１ｕｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中に、０．０１９１ｇ
【０１４９】
酵素混合物
ＲｕＡｃａｃに酵素を加え、以下の最終濃度にすることにより２倍強度で酵素混合物を作成した：
１７．７ｍＭチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（オリエンタル酵母工業株式会社）
８．４ｍｇ／ｍｌプチダレドキシンレダクターゼ（バイオカタリスト）
２０．１ｍｇ／ｍｌリパーゼ（ジェンザイム）
４４．４ｍｇ／ｍｌコレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチンフリー（アマノ、ＣＨＤＨ−６）
Ｃｏｖａｒｉｓのアコースティックミキサーを用いて、この溶液を混合した。
【０１５０】
血漿試料の分注、凍結乾燥、調製及び試験プロトコルはＨＥＧＡ−９を有するセンサを除き、４秒のトランジェント時間で、実施例３に記載の通りであり、ＨＥＧＡ−９を有するセンサは、６反復の酸化（０、５９、１１８、１７７、２３６及び２９５秒のタイムポイントにて）を用いてテストし、最後のタイムポイント（３５４秒）にて−０．４５Ｖで還元電位を測定した。トランジェント時間は、８秒だった。各試料を重複してテストした。
【０１５１】
解析
各タイムポイントにおけるＨＤＬ若しくはＴＣに対する較正プロットを構築した。
【０１５２】
結果
ＣＨＡＰＳＯ、デオキシｂｉｇＣＨＡＰ又はｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを含有するセンサの応答を、それぞれ２２４秒、１６０秒及び２８８秒の測定時間で、ＴＣ濃度に対してプロットした。スクロースドデカノエート、ＨＥＧＡ−９又はｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトピラノシドを含有するセンサの応答を、それぞれ３８４秒、１１８秒及び３８４秒の測定時間で、血漿ＨＤＬ濃度に対してプロットした。
【０１５３】
これらの較正プロットごとに、最良直線近似の勾配及び切片を用いて各電流値のＴＣ（若しくはＨＤＬ）濃度を計算した。次いで、濃度の値を各試料に関して平均化した（ｎ＝８）。
【０１５４】
ＴＣ及びＨＤＬセンサの全ての可能な組み合わせに関して、各血漿試料に対してＴＣ−ＨＤＬ濃度の値を計算して、ラボアナライザーにより測定された試料のＬＤＬ濃度に対してプロットした。これらの較正プロットを図１１に示す。
【０１５５】
図１１説明文：
Ａ：ＴＣセンサは５％ＣＨＡＰＳＯを含有し、ＨＤＬセンサは５０ｍＭ スクロースモノドデカノエートを含有する。
Ｂ：ＴＣセンサは５％ＣＨＡＰＳＯを含有し、ＨＤＬセンサは１００ｍＭ ＨＥＧＡ−９を含有する。
Ｃ：ＴＣセンサは５％ＣＨＡＰＳＯを含有し、ＨＤＬセンサは１００ｍＭ ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトシドを含有する。
Ｄ：ＴＣセンサは５％デオキシｂｉｇＣＨＡＰを含有し、ＨＤＬセンサは５０ｍＭスクロースモノドデカノエートを含有する。
Ｅ：ＴＣセンサは５％デオキシｂｉｇＣＨＡＰを含有し、ＨＤＬセンサは１００ｍＭ ＨＥＧＡ−９を含有する。
Ｆ：ＴＣセンサは５％デオキシｂｉｇＣＨＡＰを含有し、ＨＤＬセンサは１００ｍＭ ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトシドを含有する。
Ｇ：ＴＣセンサは５％ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを含有し、ＨＤＬセンサは５０ｍＭスクロースモノドデカノエートを含有する。
Ｈ：ＴＣセンサは５％ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを含有し、ＨＤＬセンサは１００ｍＭ ＨＥＧＡ−９を含有する。
Ｉ：ＴＣセンサは５％ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを含有し、ＨＤＬセンサは１００ｍＭ ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトシドを含有する。
【０１５６】
結論
様々な界面活性剤で調製したＴＣ及びＨＤＬセンサに関して、標準方法により決定した血漿ＴＣ−ＨＤＬ及び血漿ＬＤＬの計算値との間に良好な相関が観察される。
【０１５７】
実施例６：総コレステロール及びＨＤＬコレステロール電気化学センサストリップを用いた非ＨＤＬコレステロールの測定
ＴＣ及びＨＤＬ用の複数分析物電気化学センサストリップを社内で調製した。各センサストリップは、ＴＣ及びＨＤＬ用の個々のセンサを含有し、乾燥酵素試薬及びスクリーン印刷微小電極（センサの詳細はＷＯ２００３５６３１９を参照）を含んでいた。各センサストリップを、乾燥剤と共に個々に包装した。
【０１５８】
ＴＣセンサに使用した製剤は以下の通りであった：
０．１Ｍ トリス（ｐＨ９．０）、５０ｍＭ ＭｇＳＯ４、５％ｗ／ｖ グリシン、１％ｗ／ｖ ミオイノシトール、１％ｗ／ｖ エクトイン、５％ｗ／ｖ ＣＨＡＰＳ、５％ ｗ／ｖ デオキシｂｉｇＣＨＡＰ、８０ｍＭ Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３、８．８ｍＭ ＴＮＡＤ、４．２ｍｇ／ｍＬ ＰｄＲ、３．３ｍｇ／ｍＬ ＣｈＥ及び６６ｍｇ／ｍＬゼラチンフリーＣｈＤＨ。
【０１５９】
ＨＤＬセンサに使用した製剤は以下の通りであった：
０．１Ｍ トリス（ｐＨ９．０）、１０％ｗ／ｖ ラクトース、５％ｗ／ｖ スクロースモノカプレート、８０ｍＭ Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３、８．８ｍＭ ＴＮＡＤ、４．２ｍｇ／ｍＬ ＰｄＲ、３．４ｍｇ／ｍＬ クロモバクテリウム・ビスコサム由来ジェンザイムリパーゼ、２２ｍｇ／ｍＬ ゼラチンフリーＣｈＤＨ。
【０１６０】
実験は１日で、３０人のドナーで行った（１０人は絶食並びに２０人は非絶食）。全血試料をＬｉヘパリン採決管に採取した。これらの試料を遠心して、血漿を採取した。各試料中のＴＣ、ＨＤＬ及びＬＤＬの濃度は、ランドックススペースクリニカルアナライザーを用いて決定した。アナライザーでの各測定を重複して行い、平均濃度値を使用した。
【０１６１】
ａｕｔｏｌａｂ及びマルチプレクサーを用いてストリップごと２０ｕＬ 血漿を用いて電気化学センサ応答を決定した。１４秒間隔で、１５のタイムポイントにて酸化電流（ｎＡ）を測定した。個々のセンサでの８反復の測定を各試料を用いて行った。
【０１６２】
各タイムポイントにおいて、各センサ応答を酸化電流値（ｎＡ）として記録した。
【０１６３】
結果
ＴＣ及びＨＤＬに関する較正グラフを、ランドックススペースクリニカルアナライザーから得られた濃度値を用いて、分析物の濃度に対するフィルター処理した酸化電流の応答から作成した。
【０１６４】
各グラフに関して直線回帰を行った。グラフを図１２（ａ）（ＴＣ）及び図１２（ｂ）（ＨＤＬ）に示したが、１８２秒及び１５４秒における較正プロットを用いている。各グラフの最良直線近似からの勾配及び切片を用いて各電流応答に関する分析物濃度を予測した：
【０１６５】
【数５】
【０１６６】
ＴＣ及びＨＤＬコレステロールの計算した分析物の値を用いて、下の式に従って非ＨＤＬコレステロールの濃度を計算した：
【０１６７】
【数６】
【０１６８】
［ＬＤＬ］（ｘ軸）に対する［非ＨＤＬ］（ｙ軸）のプロットを作成した。このグラフを図１３に示す。非ＨＤＬコレステロール濃度とＬＤＬコレステロール濃度との間に良好な相関が観察された。
【０１６９】
結論
総コレステロール及びＨＤＬコレステロールセンサを含有する電気化学センサストリップは、血漿の非ＨＤＬコレステロール濃度を決定するために使用することができ、これは血漿のＬＤＬコレステロールの測定値に対して良好な相関を与える。
【０１７０】
本発明を、様々な具体的な実施形態及び実施例に関して説明してきた。しかし、本発明はこれらの具体的な実施形態及び実施例に決して限定されるものではないことを理解するべきである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リポタンパク質を含有する試料中の、高密度リポタンパク質以外のリポタンパク質に結合したコレステロール量を決定するための方法に関する。本発明はまた、そのような方法において用いるためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
血漿中のコレステロールは、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、中密度リポタンパク質（ＩＤＬ）、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）及びキロミクロン（ＣＭ）中に含有される。ＨＤＬコレステロール含量は、心疾患の危険性を低減することが示されているので、ＨＤＬ中のコレステロールは、しばしば「善玉」コレステロールと考えられる。他方、高ＬＤＬコレステロール含量は心疾患の危険性を増大することが示されているので、ＬＤＬ中のコレステロールは、しばしば「悪玉」コレステロールと考えられる。従って、米国コレステロール教育プログラム第３ガイドライン（National Cholesterol Education Program 3rd guidelines）により、心疾患の危険性の指標として、ＬＤＬコレステロールを測定することが推奨されている。
【０００３】
ＬＤＬコレステロールレベルを決定するために、過去においては、２つのタイプの技法を典型的に用いてきた。１つの技法においては、試料の総コレステロール、ＨＤＬコレステロール及びトリグリセリド含量を測定し、そしてＦｒｉｅｄｗａｌｄ式を、ＬＤＬコレステロール含量を算出するために用いる。しかしながら、このタイプの測定は、絶食時の試料に関してしか正確に実施できないトリグリセリドアッセイを伴う。そのような試料は、常に分析用に入手可能なわけではないので、この方法では、常に信頼できる結果を得られるわけではない。絶食時の試料が不要な技法が望ましい。
【０００４】
これに代わる技法では、ＬＤＬコレステロール含量の直接的測定を目的とする。研究技法から適合された、初期の検査室的方法は、例えば超遠心分離による、手作業の分離段階の後、各リポタンパク質画分中のコレステロール含量の、個別の分析を必要とするものであった。しかしながら、そのような技法は完全には自動化できず、且つ複雑な処理段階を実施する必要がある。より最近になって、様々なリポタンパク質画分の分離を事前に必要とせず、且つ処理の自動化を可能にする、いくつかの技法が提示されてきた。１つのアプローチにおいては、様々なリポタンパク質画分を異なる速度で分解する、ある種の界面活性剤を用いる。例えば、ある界面活性剤は、はじめはＨＤＬとより迅速に反応するかもしれず、そしてＬＤＬとの反応はより緩やかに起こるかもしれない。界面活性剤を加えた後、所定の時間にコレステロール含量を測定することによって、ＨＤＬコレステロール含量よりもＬＤＬコレステロール含量により大きく依存する測定を実施できることが分かってきた。
【０００５】
しかしながら、この後者のアプローチは、その結果に必要な精度及び信頼性を生じてきておらず、また、測定は、依然としてある程度の、ＨＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭ中のコレステロール含量への依存性を残していた。従って、簡単であるが信頼でき、且つ正確な心疾患の危険性の指標を提供する、異なるアプローチが必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明の要旨
本発明は、試料の総コレステロール及びＨＤＬコレステロール含量のみの測定を頼りにする、別のアプローチを用いる。従って、当該技法はトリグリセリド含量の測定を必要とせず、また、絶食時の試料を必要としない。本発明においては、非ＨＤＬコレステロール含量（即ち、ＨＤＬ以外のリポタンパク質、即ちＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭ中のコレステロール含量）は、総コレステロール含量から、ＨＤＬコレステロール含量を差し引くことによって決定される。この測定結果は、試料のＬＤＬ−コレステロール含量との良好な相関、従って心疾患の危険性との良好な相関も与えることが分かってきている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
従って、本発明は、リポタンパク質を含有する試料中の、高密度リポタンパク質以外のリポタンパク質中のコレステロール量を決定するための方法であって、（a）試料中の高密度リポタンパク質に結合したコレステロールの量を電気化学的に決定すること、（b）試料中の総コレステロール量を電気化学的に決定すること、及び（b）の結果から（a）の結果を差し引くことを含む、方法を提供する。
【０００８】
電気化学的分析を用いることによって、本発明は、非ＨＤＬコレステロール含量を分析するための、特別に簡単且つ迅速な方法を提供する。特に、決定（ａ）及び（ｂ）は、同時又は実質的に同時に実施でき、非ＨＤＬコレステロール含量の決定が、試料を試験装置に添加してからほんの１分又は数分で可能になる。更に、当該試験は未熟な技術者が実施でき、専門的な（specialist）設備も必要としない。１つの実施形態において、当該試験は、例えば、医師の外科手術、病室若しくは病棟といった医療環境における使用、又は患者自身による家庭での使用に適切な、携帯型装置で実施できる。
【０００９】
本発明はまた、リポタンパク質を含有する試料中の、高密度リポタンパク質以外のリポタンパク質中のコレステロール量を決定するためのキットであって、
− 作用電極、参照又は擬似参照電極及び任意に別個の対向電極を有する第一の電気化学セル；
− 当該第一の電気化学セルに使われる、試料のＨＤＬコレステロール含量を決定するための第一のシリーズの試薬；
− 作用電極、参照又は擬似参照電極及び任意に別個の対向電極を有する第二の電気化学セル；
− 当該第二の電気化学セルに使われる、試料の総コレステロール含量を決定するための第二のシリーズの試薬；
−各セルに電位を印加するための電源；
−結果生じる、各セルの電気化学的応答を測定するための測定機器；並びに
−高密度リポタンパク質以外のリポタンパク質中のコレステロール量を算出するための計算装置、
を含む、キットを提供する。
【００１０】
また、本発明のキットを使用する方法であって、
（i）試料を第一のシリーズの試薬と、結果生じる試料と第一のシリーズの試薬との混合物が第一の電気化学セルの作用電極に接触するように接触させること；
（ii）試料を第二のシリーズの試薬と、結果生じる試料と第二のシリーズの試薬との混合物が第二の電気化学セルの作用電極に接触するように接触させること；
（iii）各電気化学セルに電位を印加すること；
（iv）結果生じる、電気化学的応答を測定することによって、各セルにおいて形成した生成物量を電気化学的に検出すること；及び
（v）試料中の非ＨＤＬリポタンパク質に結合したコレステロール量を算出すること
を含む、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明による装置の電気化学セルを示す。
【図２】図２は、本発明による装置の、電気化学センサストリップを示す。
【図３】図３は、界面活性剤アンヒトール２０Ｎが、ＨＤＬを選択的に分解するかどうかを決定するための、試験プロトコルの結果を示す。
【図４】図４ａ及びｂは、ドナーの血漿試料を用いて実施した、総コレステロール試験の結果のプロットである。
【図５】図５ａ及びｂは、ドナーの血漿試料を用いて実施した、ＨＤＬコレステロール試験の結果のプロットである。
【図６】図６ａ及びｂは、本発明に従って測定した血漿試料の非ＨＤＬコレステロール含量と、Ｒａｎｄｏｘ ＳＰＡＣＥ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｅｒによって測定した、試料のＬＤＬコレステロール含量との相関のプロットである。
【図７】図７は、本発明に従って測定した血漿試料の非ＨＤＬコレステロール含量と、Ｆｒｉｅｄｗａｌｄ式を用いて決定した、試料のＬＤＬコレステロール含量との相関を示す。
【図８】図８（ａ）及び（ｂ）は、実施例３に従って製造したセンサについての、ＨＤＬ及びＴＣそれぞれについての、較正プロット（ＩＯＸ（ｎＡ）対濃度（ｍＭ））を示す。
【図９】図９は、参照の方法を用いて測定したＬＤＬ含量と、実施例３〜５のセンサを用いて行ったＴＣ及びＨＤＬ測定から決定したＬＤＬ含量との関係を示す。
【図１０】図１０は、参照の方法を用いて測定したＬＤＬ含量と、実施例３〜５のセンサを用いて行ったＴＣ及びＨＤＬ測定から決定したＬＤＬ含量との関係を示す。
【図１１】図１１は、参照の方法を用いて測定した通りのＬＤＬ含量と、実施例３〜５のセンサを用いて行ったＴＣ及びＨＤＬ測定から決定したＬＤＬ含量との関係を示す。
【図１２】図１２（ａ）及び（ｂ）は、実施例７のセンサについての、ＨＤＬ及びＴＣについての較正プロット（ＩＯＸ（ｎＡ）対濃度（ｍＭ））を示す。
【図１３】図１３は、Ｒａｎｄｏｘ ａｎａｌｙｓｅｒによって測定したＬＤＬ含量と、実施例７のセンサを用いて行ったＴＣ及びＨＤＬ測定を用いて本発明により算出したＬＤＬ含量との関係を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の方法は、試料のＨＤＬコレステロール含量及び試料の総コレステロール含量についての試験を実施すること、並びに簡単な減算により非ＨＤＬコレステロール含量を決定することを含む。この非常に簡単な技法で、試料のＬＤＬコレステロール含量、ひいては心疾患の危険性との良好な相関を持つことが分かった。
【００１３】
ＨＤＬコレステロール試験は、任意の電気化学的方法により実施し得る。電気化学的方法は、コレステロールの反応を、電極での電気化学的応答を測定することによって検出するものである。典型的には、選択的試薬を加え、測定の時間枠内では、確実にＨＤＬコレステロールしか反応し得ないようにする。次いで、試料をコレステロールエステル加水分解試薬及び、コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼのいずれかと反応させる。コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼと反応したコレステロールの量は、電極での電気化学的応答を測定することによって決定する。
【００１４】
選択的試薬は、ＨＤＬコレステロールをコレステロールエステル加水分解試薬及びコレステロールオキシダーゼ又はデヒドロゲナーゼと反応できるようにする、任意の物質であり得る。好適な選択的試薬としてはＨＤＬ以外のリポタンパク質と錯体を形成する錯化剤が挙げられる。錯化剤の例としては、多価陰イオン類、多価陰イオン類の２価の金属塩との組み合わせ、及びａｐｏＢ含有リポタンパク質に結合できる抗体が挙げられる。多価陰イオン類は、リンタングステン酸及びその塩、デキストラン硫酸及びその塩、ポリエチレングリコール並びにヘパリン及びその塩から選択できる。一度錯化された形態になると、ＨＤＬ以外のリポタンパク質は反応に利用できず、従ってコレステロール測定を妨げない。
【００１５】
好ましい実施形態において、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭよりも、ＨＤＬに対して高度に選択的な特異的界面活性剤と、試料を反応させることによって選択性を実現する。従って、当該界面活性剤は、ＨＤＬに結合するコレステロール及びコレステロールエステル類についての測定を可能にするが、一方でＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭに結合するものはリポタンパク質構造に結合したままであり、後のコレステロール含量の測定において実質的に反応しない。
【００１６】
この実施形態において用いる界面活性剤は、試料中の高密度リポタンパク質を選択的に分解すると考えられるものである。しかしながら本発明は、この作用様式に限られない。従って、当該界面活性剤は、コレステロールアッセイにおいて、ＨＤＬコレステロールの反応を選択的に可能にするものであるが、一方でＬＤＬコレステロールは実質的に反応できない。これは、当該界面活性剤は、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭと比較して、ＨＤＬと選択的に反応することを意味する。本発明の文脈では、ＨＤＬを選択的に分解する界面活性剤、即ち、コレステロールアッセイにおいてＨＤＬコレステロールが反応することを選択的に可能にする界面活性剤は、典型的には、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は最も好ましくは少なくとも９０％の、ＨＤＬとＬＤＬとの間のディファレンシエーション（differentiation）を有する、界面活性剤である。
【００１７】
ＨＤＬとＬＤＬとの間のディファレンシエーションは、式（ｉ）：
【００１８】
【数１】
【００１９】
（式中、ＧｘはＸに対する、測定された応答のグラジエント（例、既知の濃度のＸに対する、測定された電流）である）に従って決定できる。測定される応答は、リポタンパク質濃度に関係する（又は対応する）任意のパラメータであり得る（例、それは、当該濃度に比例するパラメータであり得る）。
【００２０】
従って、当業者は、（ＬＤＬを含有しない、）ＨＤＬコレステロール含量が既知の試料の、ＨＤＬコレステロール含量を測定するために、選択した界面活性剤を用いることによって、そして対応して同じ手順を用いて、（ＨＤＬを含有しない、）ＬＤＬコレステロール含量が既知の試料の、ＬＤＬコレステロール含量を測定することによって、任意の所与の界面活性剤がＨＤＬを選択的に分解するものかどうかを、容易に決定できる。結果からディファレンシエーションの値が計算できる。界面活性剤アンヒトール２０Ｎを用いた、コレステロール含量の測定についての手順の例を、実施例１において示す。
【００２１】
本発明において、ＨＤＬ濃度は典型的には、コレステロールのコレステノンへの電気化学的変換に際して、電極で生じる電流を決定することによって電気化学的に測定される。従って、典型的には、測定電流値を、グラジエントを決定するために用いる。
【００２２】
好ましい実施形態においては、本発明の選択的界面活性剤は、実質的にＬＤＬを分解しない。従って、ＨＤＬとＬＤＬとの間のディファレンシエーションは、経時的に一定である。しかしながら、それでもいくつかの界面活性剤は、依然として非常に緩やかではあるがＬＤＬを分解し得る。この場合、ＨＤＬとＬＤＬとの間のディファレンシエーションは、時間と共に変動し得る。ディファレンシエーションは、ＨＤＬコレステロール試験の間に用いる経過時間と同じの、試料への試薬の添加と、コレステロール含量の測定との間の経過時間を用いて測定しなくてはならない。そのような経過時間は、典型的には、３分以下、好ましくは１２０秒以下、９０秒以下又は６０秒以下のオーダーである。本発明の文脈では、選択的界面活性剤は、実施例１に記載する手順及び試料への試薬の添加と測定との間の、６２秒の経過時間を用いてコレステロール含量を測定した場合、典型的には、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０%、少なくとも７０%、少なくとも８０%又は最も好ましくは少なくとも９０%の、ＨＤＬとＬＤＬとの間のディファレンシエーションを有する界面活性剤である。
【００２３】
ＨＤＬと選択的に反応する界面活性剤の例としては、ポリオキシアルキレン誘導体類、ペルフルオロアルカン類又はペルフルオロアルキル基含有化合物類、スクロースエステル類、テトラメチルデシンジオール及びエトキシ化テトラメチルデシンジオール類、任意にポリアルキレンオキシドと結合される、ポリアルキレンオキシド修飾ポリジメチルシロキサン、イソノニルフェノキシポリ（グリシドール）、ヒドロキシエチルグルカミド誘導体類、Ｎ−メチル−Ｎ−アシルグルカミド誘導体類、マルトシド類及びチオマルトシド類等の非イオン性界面活性剤並びにアルキルベタイン誘導体類、アルキルアミンオキシド類及びアンモニオアルキルスルホン酸塩類等の両性界面活性剤が挙げられる。
【００２４】
本発明の１つの実施形態において、当該界面活性剤は、ポリオキシアルキレン誘導体類、ペルフルオロアルカン類又はペルフルオロアルキル基含有化合物、スクロースエステル類、テトラメチルデシンジオール及びエトキシ化テトラメチルデシンジオール類、任意にポリアルキレンオキシドと結合される、ポリアルキレンオキシド修飾ポリジメチルシロキサン、イソノニルフェノキシポリ（グリシドール）及びヒドロキシエチルグルカミド誘導体類等の非イオン性界面活性剤、並びにアルキルベタイン誘導体類、アルキルアミンオキシド類及びアンモニオアルキルスルホン酸塩類等の両性界面活性剤から選択される。
【００２５】
本発明のＨＤＬアッセイにおいて用いるための、好ましい界面活性剤としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、エマルゲン１０９Ｐ（花王株式会社）、エマルゲン１１３５Ｓ−７０（花王株式会社）、ポリオキシアルキレンジスチレン化フェニルエーテル（エマルゲンＡ−９０、花王株式会社）、ポリオキシアルキレンアリルフェニルエーテル（ニューカルゲンＦＳ１２、竹本油脂株式会社）、ｐ−イソノニルフェノキシポリ（グリシドール）（Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ １０Ｇ、Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｔｏｏｌ Ｋｉｔ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）、シルウェットＬ−７６００（Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｔｏｏｌ Ｋｉｔ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）、ＰＥＧ−３０テトラメチルデシンジオール（スルフィノール ４８５、Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｔｏｏｌ Ｋｉｔ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）、スクロースモノカプレート（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ． Ｌｔｄ）、ペルフルオロＣ６−Ｃ１６アルカン類（ゾニール ＦＳＮ１００、Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｔｏｏｌ Ｋｉｔ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）、ＨＥＧＡ−８、ＨＥＧＡ−９、ＨＥＧＡ−１０、Ｃ−ＨＥＧＡ−９、Ｃ−ＨＥＧＡ−１０、ｎ−オクチル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸塩（ツヴィッタージェント３−０８、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ラウリルジメチルアミンオキシド（アンヒトール２０Ｎ、花王株式会社）、コカミドプロピルベタイン（ソフタゾリン ＣＰＢ、川研ファインケミカル株式会社）及びラウラミドプロピルベタイン（ソフタゾリン ＬＰＢ−Ｒ、川研ファインケミカル株式会社）が挙げられる。
【００２６】
本発明の１つの実施形態において、ＨＤＬアッセイで用いられる好ましい界面活性剤、エマルゲン１１３５Ｓ−７０（花王株式会社）、ポリオキシアルキレンアリルフェニルエーテル（ニューカルゲンＦＳ１２、竹本油脂株式会社）、ｐ−イソノニルフェノキシポリ（グリシドール）（Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ １０Ｇ、Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｔｏｏｌ Ｋｉｔ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）、シルウェットＬ−７６００（Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｔｏｏｌ Ｋｉｔ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）、ＰＥＧ−３０テトラメチルデシンジオール（スルフィノール ４８５、Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｔｏｏｌ Ｋｉｔ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）、スクロースモノカプレート（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ． Ｌｔｄ）、ペルフルロ（perfluro）Ｃ６−Ｃ１６アルカン類（ゾニール ＦＳＮ１００、Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｔｏｏｌ Ｋｉｔ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）、ＨＥＧＡ−８、ＨＥＧＡ−９、ＨＥＧＡ−１０、Ｃ−ＨＥＧＡ−９、Ｃ−ＨＥＧＡ−１０、ｎ−オクチル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸塩（ツヴィッタージェント３−０８、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ラウリルジメチルアミンオキシド（アンヒトール２０Ｎ、花王株式会社）、コカミドプロピルベタイン（ソフタゾリン ＣＰＢ、川研ファインケミカル株式会社）及びラウラミドプロピルベタイン（ソフタゾリン ＬＰＢ−Ｒ、川研ファインケミカル株式会社）。
【００２７】
更なる実施形態において、ＨＤＬアッセイで用いられる、好ましい界面活性剤としては、エマルゲン１１３５Ｓ−７０（花王株式会社）、ｐ−イソノニルフェノキシポリ（グリシドール）（Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ １０Ｇ、Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｔｏｏｌ Ｋｉｔ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）、シルウェットＬ−７６００（Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｔｏｏｌ Ｋｉｔ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）、ＰＥＧ−３０テトラメチルデシンジオール（スルフィノール ４８５、Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｔｏｏｌ Ｋｉｔ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）、スクロースモノカプレート、ペルフルロ（perfluro）Ｃ６−Ｃ１６アルカン類（ゾニール ＦＳＮ１００、Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｔｏｏｌ Ｋｉｔ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）、ＨＥＧＡ−８、ＨＥＧＡ−９、ＨＥＧＡ−１０、Ｃ−ＨＥＧＡ−９、Ｃ−ＨＥＧＡ−１０、ｎ−オクチル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸塩（ツヴィッタージェント３−０８、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ラウリルジメチルアミンオキシド（アンヒトール２０Ｎ、花王株式会社）、コカミドプロピルベタイン（ソフタゾリン ＣＰＢ、川研ファインケミカル株式会社）及びラウラミドプロピルベタイン（ソフタゾリン ＬＰＢ−Ｒ、川研ファインケミカル株式会社）が挙げられる。エマルゲン１１３５Ｓ−７０（花王株式会社）及びHEGA-8、HEGA-10、C-HEGA-9、C-HEGA-10を含むヒドロキシエチルグルカミド誘導体類が特に好ましい。スクロースモノカプレートも好ましい。
【００２８】
本発明の１つの実施形態においては、好ましい界面活性剤は、スクロースエステル類、マルトシド類である。特に好ましい界面活性剤は、スクロースモノカプレート、スクロースモノデカノエート、ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトシド Ｃｙｍａｌ−４及びＣｙｍａｌ−５である。
【００２９】
代替の実施形態においては、好ましい界面活性剤は、ヒドロキシエチルグルカミド誘導体類及びＮ−アシル−Ｎ−メチルグルカミン誘導体類である。ＨＥＧＡ−８、ＨＥＧＡ−１０、ＨＥＧＡ−９、Ｃ−ＨＥＧＡ−９、Ｃ−ＨＥＧＡ−１０及びＭＥＧＡ−８が特に好ましい界面活性剤である。
【００３０】
界面活性剤は個々に用いてもよく、又は２以上の異なる界面活性剤を組み合わせて用いてもよい。典型的には、使用する界面活性剤の総量は、試験試料１ｍｌ当たり最大２００ｍｇ、好ましくは最大１００ｍｇ／ｍｌ、例えば最大約５０ｍｇ／ｍｌである。
【００３１】
選択的界面活性剤又は他の選択的試薬に加えて、典型的には、試料を、コレステロールエステル加水分解試薬及びコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼと反応させる。ＨＤＬリポタンパク質中に含有されるコレステロールは、遊離コレステロール又はコレステロールエステル類の形態であり得る。従って、コレステロールエステル加水分解試薬が、任意のコレステロールエステル類を遊離コレステロールに分解するために用いられる。コレステロールエステル類をコレステロールに加水分解できる任意の試薬が用いられ得る。試薬は、コレステロールとコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼとの反応、及び、アッセイにおけるその後の任意の段階を、妨げないものでなくてはならない。好ましいコレステロールエステル加水分解試薬は、酵素、例えば、コレステロールエステラーゼ及びリパーゼである。好適なリパーゼは、例えば、シュードモナス（pseudomonas）又はクロモバクテリウム・ビスコスム（chromobacterium viscosum）種由来のリパーゼである。任意に安定化剤又は保存剤等の添加剤を含有する市販の酵素（例、東洋紡又はアマノから入手可能なもの）を用い得る。コレステロールエステル加水分解試薬は、試料１ｍｌあたり０．１〜２０ｍｇ、好ましくは１ｍｌあたり０．５〜１５ｍｇの量で用いられ得る。
【００３２】
市販されている任意の形態のコレステロールオキシダーゼ及びコレステロールデヒドロゲナーゼを用いることができる。例えば、コレステロールデヒドロゲナーゼは、例えばノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）種由来である。コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼは、試薬混合物１ｍｌあたり０．０１〜１００ｍｇの量で用いてよい。１つの実施形態においては、コレステロールオキシダーゼ又はデヒドロゲナーゼは、試料１ｍｌあたり０．１〜８０ｍｇ、好ましくは１ｍｌあたり０．５〜３０ｍｇの量で用いてもよい。
【００３３】
各酵素は、安定化剤又は保存剤等の添加剤を含有し得る。更に、各酵素は、化学的に修飾され得る。
【００３４】
当該界面活性剤又は他の選択的試薬は、試料に対して、他の試薬を加える前に加えてもよく、又は他の試薬を加えるのと同時に加えてもよい。好ましい実施形態においては、コレステロールエステル加水分解試薬、コレステロールオキシダーゼ又はデヒドロゲナーゼ及び選択的界面活性剤は、単一の段階で試料と混合される単一の試薬混合物の状態で存在する。特に好ましい実施形態において、当該方法は、試料を試薬と接触させる単一の段階を含み、そのため単一の試薬混合物のみ提供される必要がある。本発明の試薬混合物は、典型的には、コレステロールエステル加水分解試薬を試料１ｍｌ当たり０．１〜２５ｍｇ（例、０．１〜２０ｍｇ）、好ましくは０．５〜１０ｍｇの量で含み、且つコレステロールデヒドロゲナーゼを試料１ｍｌ当たり０．１〜８０ｍｇ、好ましくは０．５〜２５ｍｇの量で含む。選択的試薬も存在し、典型的には選択的界面活性剤は、試料１ｍｌ当たり最大５０ｍｇ、好ましくは最大２０ｍｇ、例えば約５ｍｇの量である。
【００３５】
電極でコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼの反応を検出するために、典型的には試料をまた、コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼと相互作用できる補酵素、及び酸化又は還元されて電極で電気化学的に検出できる生成物を形成することができる酸化還元試薬と反応させる。試料と試薬との混合物は、生じる酸化還元反応が検出できるように、電気化学セルの作用電極と接触させる。セルに電位を印加し、結果生じる電気化学的応答、典型的には電流を測定する。
【００３６】
この好ましい実施形態においては、ＨＤＬ−コレステロール量は、以下のアッセイ：
【００３７】
【化１】
【００３８】
（式中、ＣｈＤはコレステロールデヒドロゲナーゼである）に従って測定する。このアッセイにおいて、所望により、コレステロールデヒドロゲナーゼは、コレステロールオキシダーゼと置き換えることができる。当該アッセイによって生成した、還元された酸化還元試薬量を電気化学的に測定する。しかるべき場合には、更なる試薬もまた、このアッセイに含めてもよい。
【００３９】
典型的には、補酵素はＮＡＤ＋又はそのアナログである。ＮＡＤ＋のアナログは、ＮＡＤ＋と共通する構造的特徴を有し、且つコレステロールデヒドロゲナーゼの補酵素としても働く化合物である。ＮＡＤ＋のアナログの例としては、ＡＰＡＤ（アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド）；ＴＮＡＤ（チオＮＡＤ）；ＡＨＤ（アセチルピリジンヒポキサンチンジヌクレオチド）；ＮａＡＤ（ニコチン酸アデニンジヌクレオチド）；ＮＨＤ（ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド）；及びＮＧＤ（ニコチンアミドグアニンジヌクレオチド）が挙げられる。補酵素は、典型的には、１〜２０ｍＭ、例えば３〜１５ｍＭ、好ましくは５〜１０ｍＭの量で、試薬混合物中に存在する。
【００４０】
典型的には、酸化還元剤は、上に示したアッセイに従って還元できるものでなくてはならない。この場合、酸化還元剤は補酵素から（又は後述のようなレダクターゼから）電子を受容でき、且つ電子を電極に伝達できるものでなくてはならない。酸化還元剤は分子又はイオン錯体であり得る。タンパク質等の、天然に存在する電子受容体であってもよく、又は合成分子であってもよい。酸化還元剤は、典型的には、少なくとも２つの酸化状態を有するであろう。
【００４１】
好ましくは、酸化還元剤は無機錯体である。当該剤は金属イオンを含んでいてもよく、少なくとも２価を有することが好ましいであろう。特に、当該剤は、遷移金属イオンを含んでいてもよく、好ましい遷移金属イオンとしては、コバルト、銅、鉄、クロム、マンガン、ニッケル、オスミウム又はルテニウムのイオン、例えば、コバルト、銅、鉄、クロム、マンガン、ニッケル、又はルテニウムのイオンが挙げられる。酸化還元剤は帯電していてもよく、例えば、カチオン性又はその代わりにアニオン性であり得る。好適なカチオン性の剤の例は、Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋等のルテニウム錯体であり、好適なアニオン性の剤の例は、Ｆｅ（ＣＮ）６３−等のフェリシアン化錯体である。用いられ得る錯体の例としては、Ｃｕ（ＥＤＴＡ）２−、Ｆｅ（ＣＮ）６３−、Ｆｅ（ＣＮ）５（Ｏ２ＣＲ）３−、Ｆｅ（ＣＮ）４（シュウ酸塩）３−、Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋、Ｒｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２）（エチレンジアミン等の）それらのキレートアミンリガンド誘導体類、Ｒｕ（ＮＨ３）５（ｐｙ）３＋、フェロセニウム、及び、−ＮＨ２、−ＮＨＲ、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、及びＣＯ２Ｈ等の１以上の基が、２つのシクロペンタジエニル環の一方又は両方へと置換されたその誘導体類が挙げられる。無機錯体は、好ましくはＦｅ（ＣＮ）６３−、Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋、又はフェロセニウムモノカルボン酸（ＦＭＣＡ）である。Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋及びＲｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２）が好ましい。
【００４２】
酸化還元剤は、典型的には、１０〜２００ｍＭ、例えば２０〜１５０ｍＭ、好ましくは３０〜１００ｍＭ又は最大８０ｍＭの量で試薬混合物中に存在する。
【００４３】
好ましい実施形態においては、電気化学的アッセイにおいて用いる試薬混合物は、レダクターゼを更に含む。レダクターゼは、典型的には、還元型ＮＡＤから２個の電子を伝達され、酸化還元剤へ２個の電子を伝達する。従って、レダクターゼの使用により、素早い電子の伝達がもたらされる。
【００４４】
用いられ得るレダクターゼの例としては、ジアホラーゼ並びにチトクロームＰ４５０レダクターゼ、特に、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）由来のチトクロームＰ４５０ｃａｍ酵素系のプチダレドキシンレダクターゼ、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のＰ４５０ＢＭ−３酵素のフラビン（ＦＡＤ／ＦＭＮ）ドメイン、ホウレンソウフェレドキシン（ferrodoxin）レダクターゼ、アドレノドキシンレダクターゼ、硝酸還元酵素、チトクロームｂ５レダクターゼ、トウモロコシ硝酸還元酵素、テルプレドキシンレダクターゼ及び酵母、ラット、ウサギ及びヒトＮＡＤＰＨチトクロームＰ４５０レダクターゼが挙げられる。本発明で用いるための好ましいレダクターゼとしては、ジアホラーゼ及びプチダレドキシンレダクターゼが挙げられる。
【００４５】
レダクターゼは組み換えタンパク質、又は精製若しくは単離した天然に存在するタンパク質であってもよい。レダクターゼは、電子の伝達を行う速度又は基質特異性を最適化する等、その性能を向上するために変異されていてもよい。
【００４６】
レダクターゼは、典型的には、０．５〜１００ｍｇ／ｍｌ、例えば１〜５０ｍｇ／ｍｌ、１〜３０ｍｇ／ｍｌ又は２〜２０ｍｇ／ｍｌの量で試薬混合物中に存在する。
【００４７】
本発明の好ましい実施形態においては、電気化学的アッセイの大まかなスキームは、以下：
【００４８】
【化２】
【００４９】
（式中、
ＰｄＲはプチダレドキシンレダクターゼであり
Ｄｉａはジアホラーゼであり
ＣｈＤはコレステロールデヒドロゲナーゼである）
の通りである。
【００５０】
試薬混合物は、任意に、１以上の更なる成分、例えば、賦形剤及び／又は緩衝剤及び／又は安定化剤を含有する。混合物を安定化するため、並びに任意で、試薬混合物を本発明の装置上で乾燥する場合に当該乾燥混合物に多孔性を提供するために、当該試薬混合物に賦形剤を含めることが好ましい。好適な賦形剤の例としては、マンニトール、イノシトール及びラクトース等の糖類、並びにＰＥＧが挙げられる。グリシンもまた、賦形剤として用いることができる。至適酵素活性のために必要なｐＨを提供するために、緩衝剤も含めてもよい。例えば、トリス緩衝剤（ｐＨ９）を用いてもよい。例えば酵素の安定性を高めるために、安定化剤を加えてもよい。好適な安定化剤の例は、アミノ酸（例、グリシン及びエクトイン）である。
【００５１】
典型的には、試料は単一の段階で全ての試薬と接触する。従って、アッセイを実施するために、必要な試薬を全て含有し、且つ試料と容易に接触できる試薬混合物を提供する。好ましい実施形態においては、本発明のＨＤＬコレステロールアッセイのための試薬混合物は、高密度リポタンパク質を選択的に分解する界面活性剤；コレステロールエステラーゼ又はリパーゼ；コレステロールデヒドロゲナーゼ；ＮＡＤ＋又はそのアナログ；レダクターゼ；及び酸化還元剤を含む。より好ましい実施形態においては、ＨＤＬコレステロールアッセイのための試薬混合物は、高密度リポタンパク質を選択的に分解する界面活性剤、コレステロールエステラーゼ又はリパーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ＋又はそのアナログ、ジアホラーゼ又はプチダレドキシンレダクターゼ及びＲｕ（ＮＨ３）６３＋を含む。
【００５２】
本発明はまた、試料の総コレステロール含量のためのアッセイを包含する。総コレステロール含量を電気化学的に検出する、任意の方法を用いてもよい。好ましい方法においては、全てのリポタンパク質を分解する界面活性剤を試料に添加し、全てのリポタンパク質に結合するコレステロール及びコレステロールエステル類を、反応のために利用可能にする。次いで、当該試料をコレステロールエステル加水分解試薬及びコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼ、並びに典型的には補酵素及び酸化還元試薬並びに任意にレダクターゼと反応させる。コレステロールエステル加水分解試薬、コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼ及び任意の他の成分を用いるコレステロールの測定は、典型的には、ＨＤＬコレステロール試験についての上述したのと同様の方法で実施する。
【００５３】
本発明の１つの実施形態において、総コレステロール試験は、ＨＤＬコレステロール試験とは別個のシリーズの試薬を用いて実施する。この実施形態においては、試料に、ＨＤＬコレステロール試験を実施するために第一のシリーズの試薬を添加し、そして分けた、試料の一部に、総コレステロール試験を実施するために第二のシリーズの試薬を添加する。総コレステロールアッセイにおいて用いる界面活性剤は、典型的には、胆汁酸誘導体類又はその塩であるが、それはこれらが全てのタイプのリポタンパク質を効率的に分解することが分かってきたからである。好適な胆汁酸誘導体類の例としては、コール酸、タウロコール酸、グリココール酸、リトコール酸、デオキシコール酸、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コールアミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］プロパン）、ＣＨＡＰＳＯ、ＢＩＧＣＨＡＰ及びデオキシＢＩＧＣＨＡＰが挙げられる。２以上の胆汁酸誘導体類又はその塩の組み合わせも用い得る。例えば、ＣＨＡＰＳ単独での使用では、時折、酵素の沈殿を生じることが分かってきている。従って、ＣＨＡＰＳと、この効果を有しない、異なる界面活性剤（例、デオキシＢＩＧＣＨＡＰ）との組み合わせが、よいことが分かってきている。好ましい実施形態において、ＣＨＡＰＳとデオキシＢＩＧＣＨＡＰは、１：１の比率で用いられる。グルコピラノシド類もまた、界面活性剤として用いられ得る（例、ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド）。
【００５４】
存在する界面活性剤の総量は、コレステロールデヒドロゲナーゼ酵素の重量に対して、典型的には６０〜８５重量％、好ましくは７０〜８０重量％である。
【００５５】
総コレステロール試験において用いる試薬は、典型的には、単一の試薬混合物の形態で提供され、単一の段階で試料と反応させることができる。試薬混合物には、好ましくは、胆汁酸誘導体類又はその塩；コレステロールエステラーゼ又はリパーゼ；コレステロールデヒドロゲナーゼ；ＮＡＤ＋又はそのアナログ；レダクターゼ；及び酸化還元試薬が含まれる。より好ましい実施形態においては、総コレステロールアッセイのための試薬混合物には、ＣＨＡＰＳ、デオキシＢＩＧＣＨＡＰ、コレステロールエステラーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、ＴＮＡＤ＋、プチダレドキシンレダクターゼ及びＲｕ（ＮＨ３）６３＋が含まれる。
【００５６】
本発明の別の実施形態においては、ＨＤＬコレステロール試験及び総コレステロール試験を実施するために、同一の試薬を用いる。この実施形態においては、上記した通りの選択的試薬（例、選択的界面活性剤）を、試料のＨＤＬコレステロール含量の測定を提供するために用いる。しかしながら、用いる選択的試薬は、他のリポタンパク質との反応を完全に抑制するものではなく、ＨＤＬと選択的に反応するものである。このように、ＨＤＬコレステロール試験は、まず、ＨＤＬが選択的に反応する時間に試料／試薬混合物の電気化学的応答を測定することによって実施される。次いで、反応を継続させ、そして全てのリポタンパク質が反応する時間に、第二の電気化学的測定を行う。このように、単一の電気化学セル中の単一の試薬混合物を、試料のＨＤＬ含量に対応する第一の測定結果を提供するために用い、そして試料の総コレステロール含量に対応する第二の測定結果のために用い得る。
【００５７】
ＨＤＬ及び総コレステロール含量に対応する２回の測定を行い得る時間は、用いる特定の選択的試薬の反応速度に依存するであろう。当業者は、任意の特定の選択的試薬についての測定のための、しかるべき時点を、決定することができるであろう。多くの場合において、ＨＤＬコレステロール試験は、試料を試薬混合物に添加して約１分以内（例、３０秒以内）に完了するであろうし、且つ総コレステロール試験は、試料を試薬混合物に添加してから約２分後に完了するであろう。
【００５８】
各ＨＤＬコレステロールアッセイのための試薬混合物及び、総コレステロールアッセイのための試薬混合物を用いる場合、それらは、典型的には、固形形態（例えば、乾燥形態）又はゲルとして提供される。任意に、当該試薬を凍結乾燥してもよい。代替的にはそれらは、溶液又は懸濁液の形態であり得る。試薬混合物中に存在する各成分の量は、上ではモル濃度又はｗ／ｖで表しているが、当業者は、存在する各成分の相対量が同じままであるようにして、これらの量を乾燥混合物又はゲルに好適な単位に適合させることができるであろう。
【００５９】
本発明の好ましい実施形態においては、試料の一部をＨＤＬコレステロールアッセイのための試薬と反応させ、且つ同時又は実質的に同時（例、３０秒以内又は１５秒以内）に、試料の更に一部を総コレステロールアッセイのための試薬と反応させる。これで、決定すべき試料の非ＨＤＬコレステロール含量の算出が、非常に短時間で可能になる。好ましい実施形態において、ＨＤＬコレステロール及び総コレステロールアッセイは、試料を試薬に添加してから５分以内、好ましくは３分、２分、９０秒又は６０秒以内に完了する。
【００６０】
電気化学的測定が全血で実施される場合、得られる測定結果はヘマトクリット値に依存し得る。従って、測定結果は理想的には、少なくとも部分的に、この要因を説明するために調整するべきである。或いは、アッセイを実施する前に、試料を濾過することによって赤血球を除去できる。
【００６１】
本発明のキットは、各セルが、作用電極、参照電極又は擬似参照電極及び任意に別個の対向電極を有する電気化学セルを、少なくとも１つ、例えば少なくとも２つ有する装置を含む。当該セルが所望の電気化学的試験を提供するために、シリーズの試薬が当該セル又は各セルに使われる。当該試薬が電気化学セルに使われるということによって意味されるのは、一度試料が試薬と接触すると、試薬と試料の混合物が電気化学セルの作用電極に接触することになるように、試薬は位置するということである。当該キットはまた、各セルに電位を印加するための電源及び結果生じる、各セルの電気化学的応答を測定するための測定機器を含む。
【００６２】
本発明の装置は、ＨＤＬコレステロールアッセイを実施するための上記の第一のシリーズの試薬が使われる、少なくとも１つの電気化学セルを有する。１つの実施形態において、この単一セルは、ＨＤＬコレステロール試験及び総コレステロール試験を実施するために用いる。代替の実施形態において、当該装置は、総コレステロールアッセイを実施するための、上記の第二のシリーズの試薬が使われる、少なくとも１つの第二の電気化学セルを含む。当該キットはまた、総コレステロールの結果からＨＤＬコレステロールの結果を差し引くことによって、試料の非ＨＤＬコレステロール含量を決定するための、算出手段、典型的には、コンピュータプログラムを含む。
【００６３】
典型的には、各シリーズの試薬は、単一の試薬混合物の形態（即ち、各シリーズの試薬について、１つの試薬混合物が提供される）で装置中に与えられる。試薬混合物は、液体又は固体のいずれかの形態で存在し得るが、固体形態が好ましい。典型的には、試薬混合物は、好適な液体（例、水）中に懸濁／溶解させて装置中に挿入するか又は装置上に置き、次いで所定の位置で乾燥させる。装置中／上で物質を乾燥させる段階は、当該物質を望ましい場所に保持するのに役立ち、且つ試薬が、装置の一方の電気化学セルからもう一方へと移動するのを妨げるのに役立つ。乾燥は、例えば、風乾、真空乾燥、凍結乾燥又はオーブン乾燥（加熱）によって実施し得る。試薬混合物は、典型的には、試料が試薬混合物と接触したとき、電極との接触も起きるように、電極の付近に配置される。
【００６４】
当該装置には、任意に、試験する試料が、試薬混合物と接触する前に通過する膜が含まれ得る。当該膜は、例えば、赤血球（red blood cell）、赤血球（erythrocyte）及び／又はリンパ球等の成分を濾過で除去するために用いることができる。血液濾過膜を含む好適な濾過膜は、当該技術において公知である。Ｐｒｅｓｅｎｃｅ ２００及びＰａｌｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎのＰＡＬＬ ＢＴＳ ＳＰ３００、Ｗｈａｔｍａｎ ＶＦ２， Ｗｈａｔｍａｎ Ｃｙｃｌｏｐｏｒｅ， Ｓｐｅｃｔｒａｌ ＮＸ及びＳｐｅｃｔｒａｌ Ｘが血液濾過膜の例である。繊維ガラスフィルター（例えばＷｈａｔｍａｎ ＶＦ２）は全血から血漿を分離でき、また、全血検査試料が装置に供給され、且つ試験される試料が血漿である場合に好適に用いられる。
【００６５】
使用前に親水的又は疎水的処理を経てきたものを含む、代替的、又は付加的な膜も用いられ得る。所望により、当該膜の表面の他の特徴も改変してもよい。例えば、所望の試料の膜を通る流れを促進するために、水中における膜の接触角を修正するための処理を用いてもよい。当該膜は１又は２以上の材料層を含んでもよく、各々は同じであっても、異なっていてもよい。例えば、異なる膜材料の２層を有する、従来の二重層膜を用いてもよい。
【００６６】
本発明において用いるための適切な装置には、ＷＯ２００３／０５６３１９及びＷＯ２００６／０００８２８に記載のものが含まれる。
【００６７】
本発明の１つの実施形態による装置の電気化学セルを、図１に示す。この実施形態においては、作用電極５は、ミクロ電極である。本発明の目的のために、ミクロ電極は、５０μｍを超えない少なくとも１つの、作業寸法を有する電極である。本発明のミクロ電極は、巨大なサイズの（即ち５０μｍを上回る）寸法を有してもよい。
【００６８】
セルは、底部１及び壁（単数又は複数）２を有するレセプタクル又は容器の形態である。典型的には、レセプタクルは、２５〜１０００μｍの深さ（即ち、上部から底部まで）を有するであろう。１つの実施形態においては、レセプタクルの深さは、５０〜５００μｍ、例えば１００〜２５０μｍである。代替の実施形態においては、レセプタクルの深さは５０〜１０００μｍ、好ましくは２００〜８００μｍであり、例えば３００〜６００μｍである。レセプタクルの長さ及び幅（即ち、壁から壁まで）、又はレセプタクルが円筒状の場合はその直径は、典型的には、０．１〜５ｍｍ、例えば０．５〜１．５ｍｍ（１ｍｍ等）である。
【００６９】
レセプタクル３の開口端は、部分的に不透過性材料で覆われてもよく、又は半透性又は透過性の膜等の、半透性又は透過性の材料で覆われてもよい。レセプタクルの開口端は、実質的に、半透性又は透過性の膜４で覆われるのが好ましい。膜４は、とりわけ、埃又は他の混入物質がレセプタクルに入ることを防ぐのに役立つ。
【００７０】
作用電極５は、レセプタクルの壁に位置する。作用電極は、例えば、レセプタクルの壁周囲の連続した帯の形態である。作用電極の厚みは、典型的には０．０１〜２５μｍ、好ましくは０．０５〜１５μｍであり、例えば０．１〜２０μｍである。より厚みのある作用電極、例えば、０．１〜５０μｍ、好ましくは５〜２０μｍの厚みを有する電極も想定している。作用電極の厚みは、レセプタクルをその底部に置く場合は、その垂直方向の寸法である。作用電極の厚みは、その有効作業寸法、即ち、試験する試料と接触する、電極の寸法である。作用電極は、例えば、導電性インクの形態の、炭素、パラジウム、金又は白金で形成するのが好ましい。当該導電性インクは、例えば、白金、及び／又はグラファイトといった更なる材料を含有する改良インクであり得る。作用電極を形成するために２以上の層を用いてもよく、当該層は、同じか、又は異なった材料で形成される。
【００７１】
セルはまた、例えば、レセプタクルの底部、レセプタクルの壁（単数又は複数）中、又はレセプタクルの周囲若しくは付近の装置の領域中に存在し得る擬似参照電極（示さず）を含有する。擬似参照電極は、典型的には、Ag/AgClから作るが、他の材料も用い得る。擬似参照電極として用いるための好適な材料は、当業者に公知である。この実施形態においては、セルは、擬似参照電極が対向電極及び参照電極の両方として働く２電極システムである。セルが参照電極及び別個の対向電極を含む、代替の実施形態も想定できる。
【００７２】
擬似参照（又は参照）電極は、典型的には、作用電極５と同様のサイズの、又はそれより小さい、或いは大きい（例えば相当大きい）表面積を有する。典型的には、擬似参照（又は参照）電極の表面積の、作用電極の表面積に対する比率は、少なくとも１：１、例えば少なくとも２：１、又は少なくとも３：１である。好ましい比率は、少なくとも４：１である。擬似参照（又は参照）電極は、例えば、マクロ電極であってもよい。好ましい擬似参照（又は参照）電極は、０．０１ｍｍ又はそれを上回る、例えば、０．１ｍｍ又はそれを上回る、寸法を有する。これは例えば、０．１ｍｍ又はそれを上回る、寸法である。擬似参照（又は参照）電極の典型的な面積は、０．００１ｍｍ２〜１００ｍｍ２、好ましくは０．１ｍｍ２〜６０ｍｍ２であり、例えば、１ｍｍ２〜５０ｍｍ２である。作用電極と擬似参照（又は参照）電極との間の最短距離は、例えば、１０〜１０００μｍである。
【００７３】
セルが機能できるためには、電極は各々絶縁材料６によって分離されなければならない。絶縁材料は、典型的には、例えば、アクリレート、ポリウレタン、ＰＥＴ，ポリオレフィン、ポリエステルといったポリマー又は他の任意の安定な絶縁材料である。ポリカーボネート並びに他のプラスチック及びセラミックも、好適な絶縁材料である。絶縁層はポリマー溶液から溶媒を蒸発させることによって形成され得る。塗布後硬化する液体、例えばワニスも、用いられ得る。或いは、例えば、熱若しくはＵＶへの曝露によって、又は２成分の架橋可能なシステムの活性部分と混合することによって架橋される、架橋可能なポリマー溶液を用いても良い。しかるべき場合には、絶縁層を形成するために、誘電性インクも用いられ得る。代替の実施形態においては、絶縁層は装置にラミネートされる（例えば熱でラミネートされる）。
【００７４】
電気化学セルの電極は、好適な任意の手段によって、必要な任意の測定機器に、接続され得る。典型的には、電極は、導電性のトラックに接続され、該導電性のトラックは、必要な測定機器にそれ自身接続されるか、又は接続され得る。
【００７５】
図１中の７に示す通り、必要な試薬は、典型的にはレセプタクル内に含有させる。典型的には、単一の試薬混合物の形態の試薬は、液体の形態でレセプタクル内に挿入された後、組成物を固定するのに役立つよう乾燥させる。試薬混合物は、例えば、風乾、真空乾燥、凍結乾燥、又はオーブン乾燥（加熱）してもよく、最も好ましくは、凍結乾燥される。
【００７６】
本発明の装置は、１以上の電気化学セルを含む。ストリップＳ上に４つの電気化学セル１０を有する装置を、図２に示す。各セルは、作用電極を含み、且つ対向電極を更に含み得る。好ましくは、図２に示すように、単層の擬似参照電極材料５を、ストリップ６１、６２の表面上に与え、各レセプタクルを囲んで、且つレセプタクルの周囲と擬似参照電極層の端との間のブランク領域１３を残す。当該電極は、伝導トラック１２を介して必要な機器に接続する。
【００７７】
本発明の実施形態は、多くの測定が同時になされるのを可能にする。この実施形態の好ましい態様において、セルの１つはＨＤＬコレステロール試験を実施するための試薬混合物を含有し、第二のセルが総コレステロール試験を実施するための試薬を含有する。
【００７８】
更なるセルをコントロールセルとして用いてもよい。コントロールセルは、典型的には、界面活性剤、補酵素、酸化還元試薬及び任意にレダクターゼ並びに所望の緩衝剤、安定化剤及び賦形剤を含む、更なるシリーズの試薬を含む。典型的には、コントロール試薬は、コレステロールと反応する酵素が存在しないことを除いて、ＨＤＬコレステロール及び総コレステロール試験を実施するために用いる試薬と同じか、又は非常に似たものである。試料をコントロール試薬と反応させ、続いて任意の電気化学的応答を測定することで、当業者は、試料中の妨害物質に起因する応答を決定できる。その後、妨害物質に起因する応答を、総コレステロール試験及びＨＤＬコレステロール試験の測定結果から差し引いて、妨害物質の効果が低減又は除去された、より正確な結果を得ることができる。更に、試験される試料が、当該試験をうまくいかなくさせる任意の著しい量の妨害物質を含有する場合には、コントロール反応を用いて、これを同定できる。
【００７９】
本発明のキットは、電気化学セル（例、図２に記載及び上記のもの）を含むストリップＳ、及び、当該ストリップＳと電子的な接触を形成できる電子装置（例、携帯型電子装置）を含み得る。例えば、当該電子装置は、電極へ電位を提供するための電源並びに電気化学的応答を検出するための測定機器及び他の必要な任意の測定機器を内蔵し得る。当該電子装置はまた、非ＨＤＬコレステロール含量を決定するための計算装置も含み得る。１以上のこれらのシステムを、コンピュータプログラムによって作動させてもよい。
【００８０】
本発明の装置は、試料を装置に提供すること、及び試料が各試薬混合物に接触するのを可能にすることによって機能させる。固体形態の試薬混合物の場合、当該試薬混合物を試料中で溶解／懸濁することを可能とするため、及び、反応が起こることを可能にするために、典型的には概ね２０秒の含水（wet-up）時間が与えられる。しかしながら、この含水時間は、用いる装置の性質に依存して変えてもよい。例えば、試薬と接触させる前に試料を濾過するための膜が存在する場合、最大５分の含水時間を用い得る。試料／試薬混合物は、電極で電気化学反応が起こり得るように、対応する作用電極と電子的に接触していなくてはならない。
【００８１】
次いで、各セルに電位を印加し、そして各セルの電気化学的応答を測定する。これは、典型的には、電流を測定することによって実現される。典型的には、試料と試薬とを混合した時点から１０秒間〜５００秒間、例えば、１０秒間〜４００秒間又は１０秒間〜１８０秒間（例、少なくとも１０秒又は１５秒、且つ最大９０秒、６０秒又は３０秒、例えば概ね２０秒間）の後に、電位を印加し、そして測定する。この好ましい範囲内の時間を用いることで、ＨＤＬコレステロールアッセイでＨＤＬに結合したコレステロールのみを検出することを保証するのに役立つ。
【００８２】
単一のセルを用いて、試料のＨＤＬコレステロール及び総コレステロール含量を測定する場合、更なる経過時間の後、セルに第二の電位を印加する。例えば、第二の電位は、試料と試薬とを混合した時点から少なくとも１２０秒又は少なくとも１５０秒又は１８０秒で印加され得る。この第二の電位の印加の間に電流を測定することで、総コレステロール含量に対応する結果が与えられる。
【００８３】
典型的には、Ｒｕ（ＩＩ）が作用電極で検出すべき生成物の場合、セルに印加する電位は０．１Ｖ〜０．３Ｖである。０．１５Ｖが好ましい印加電位である。（本明細書中で述べる電圧はすべて、０．１Ｍ塩化物ありでの、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極に対する値である。）好ましい実施形態においては、電位が約１秒間、０．１５Ｖの正の印加電位であるのが最初の段階である。還元電流の測定を望む場合、次いで、−０．４〜−０．６Ｖの負の電位を印加する。二重の電位段階の使用は、ＷＯ ０３／０９７８６０（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。異なる酸化還元剤を用いる場合、酸化／還元ピークが生じる電位に従って、印加電位を変えることができる。
【００８４】
従って、本発明の電気化学的試験で、非ＨＤＬコレステロールの測定を、試料を装置にアプライしてから非常に短時間で、典型的には約５分以内で、好ましくは３分以内で、２分以内で、又は１分以内にでさえ、行うことが可能になる。状況によっては、試料を装置にアプライしてからわずか１５秒又は３０秒で結果を得ることができるかもしれない。
【実施例】
【００８５】
実施例１：ＨＤＬ選択的界面活性剤の解析
本実施例において、界面活性剤が選択的にＨＤＬコレステロールを破壊するか、従って本発明のＨＤＬコレステロールアッセイに使用するのにふさわしいかどうか、を決定するための試験プロトコルを記載する。
【００８６】
緩衝溶液の調製（トリス緩衝液−５％グリシン ｐＨ９．０）
結晶化トリス及びトリスＨＣｌを含有するトリズマプレセット結晶（Trizma Pre-Set Crystals）（ｐＨ９．０、シグマ、Ｔ−１４４４）を９５０ｍｌのｄＨ２Ｏに溶解し、ｐＨを記録した。続いて、５０ｇのグリシン（シグマ、Ｇ−７４０３）を該トリス溶液に加え、ｐＨを記録した。次いで、１０Ｍ 水酸化カリウム（シグマ、Ｐ−５９５８）を用いてｐＨを８．８−９．２の範囲内に調整し、ｄＨ２Ｏにより該溶液を１０００ｍｌとし、最終ｐＨを記録した（ｐＨ９．１）。使用期限を１ヶ月とし、４℃にて、該溶液を保存した。
【００８７】
界面活性剤溶液の調製
事前調製した緩衝溶液にアンヒトール ２０Ｎ（花王）を加えることにより、界面活性剤溶液を調製し、１０％アンヒトール ２０Ｎ緩衝溶液を得た。
【００８８】
ＬＤＬ及びＨＤＬ試料の調製
脱脂血清（dilipidated serum）（Ｓｃｉｐａｃ、Ｓ１３９）を用いて、ＬＤＬ（Ｓｃｉｐａｃ、Ｐ２３２−８）及びＨＤＬ（Ｓｃｉｐａｃ、Ｐ２３３−８）試料を、必要濃度の１０倍で作成した（最終テスト混合物中で１：１０で希釈するため）。次いで、スペースクリニカルアナライザー（Space clinical analyser）（Ｓｃｈｉａｐｐａｎｅｌｌｉ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ）を用いて試料を解析した。ＬＤＬ及びＨＤＬの適切な濃度は１０ｍＭであり、最終テスト混合物中で１ｍＭを与える。
【００８９】
酵素混合物の調製
事前調製した緩衝溶液に以下を加えることにより、酵素混合物を調製した：
１６０ｍＭ 塩化ルテニウムヘキサアミン（Hexaammine）（ＩＩＩ）（アルファ・エイサー、１０５１１）
１７．７ｍＭ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（オリエンタル酵母工業株式会社）
８．４ｍｇ／ｍｌ プチダレドキシンレダクターゼ（バイオカタリスト）
６．７ｍｇ／ｍｌ コレステロールエステラーゼ（Ｓｏｒａｃｈｉｍ／東洋紡、ＣＯＥ−３１１）
４４．４ｍｇ／ｍｌ コレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチンフリー（アマノ、ＣＨＤＨ−６）
【００９０】
テストプロトコル
９μｌの界面活性剤溶液を９μｌの酵素混合物と混合した。Ｔ＝−３０秒において、２μｌの試料（１０倍濃度ＬＤＬ若しくは１０倍濃度ＨＤＬのいずれか、又は２μｌの脱脂血清）を得られた界面活性剤と混合した：酵素混合物及び９μｌの得られた溶液を電極上に置いた。Ｔ＝０秒においてクロノアンペロメトリーテストを開始した。０．１５Ｖの酸化電位を印加し、続いて−０．４５Ｖの還元電位を印加した。酸化電位の印加中、５つのタイムポイント（Ｔ＝０、３２、６３、９０及び１１８秒）にて電流を測定した。各試料を重複してテストした。
【００９１】
結果
ＨＤＬ及びＬＤＬテストの結果を、コントロールとしての脱脂試料と共に、図３に示す。特に短いタイムピリオドにおいて、アンヒトール ２０ＮがＬＤＬよりもＨＤＬに対して選択的であることが、図３より明らかである。
【００９２】
ディファレンシエーションの値を決定するため、測定したＨＤＬ電流を既知のＨＤＬ濃度に対してプロットし、各タイムポイントでのグラジエントを測定した。同様に、各ＬＤＬ測定結果に対するグラジエントを計算した。Ｔ＝３２秒（試薬に試料を加えた後合計６２秒）において、ＨＤＬグラジエント（ＧＨＤＬ）は、０．７９６ｍＭの既知のＨＤＬ濃度に基づいて４３３．０８、ＬＤＬグラジエント（ＧＬＤＬ）は、０．７４４ｍＭの既知のＬＤＬ濃度に基づいて１７１．１０、並びに得られたディファレンシエーションの値は６０．４９だった。
【００９３】
他の選択的界面活性剤に対するいくつかのディファレンシエーションの値を下の表１に示すが、全てＴ＝３２秒において測定している：
【００９４】
【表１】
【００９５】
実施例２：非ＨＤＬコレステロール含量の決定
図２に従う電気化学センサストリップを使用した。各ストリップは図１に従う２つの電気化学セルを含有していた。
【００９６】
第１の電気化学セルは、総コレステロールテストを実行するための製剤を含有していた。該製剤は以下の通りであった：
０．１Ｍ トリス（ｐＨ９．０）、５０ｍＭ ＭｇＳＯ４、５％ｗ／ｖ グリシン、１％ｗ／ｖ ミオイノシトール、１％ｗ／ｖ エクトイン、５％ｗ／ｖ ＣＨＡＰＳ、５％ｗ／ｖ デオキシｂｉｇＣＨＡＰ、８０ｍＭ Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３、８．８ｍＭ ＴＮＡＤ、４．４ｍｇ／ｍＬ ＰｄＲ、３．３ｍｇ／ｍＬ ＣｈＥ及び６６ｍｇ／ｍＬゼラチンフリーＣｈＤＨ。
【００９７】
第２の電気化学セルは、ＨＤＬコレステロールテストを実行するための製剤を含有していた。該製剤は以下の通りであった：
０．１Ｍ トリス（ｐＨ９．０）、２％ｗ／ｖ ＭｇＣｌ２、３％ｗ／ｖ グリシン、１％ｗ／ｖ ヒドロキシエクトイン、１％ｗ／ｖ ラクチトール、１％ｗ／ｖ ラクトース、２％ｗ／ｖ エマルゲン Ｂ６６、２０ｍＭ Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３、１．６６ｍＭ ＴＮＡＤ、２ｍｇ／ｍＬ ＰｄＲ、３．３ｍｇ／ｍＬ クロモバクテリウム・ビスコサム由来ジェンザイムリパーゼ、２０ｍｇ／ｍＬゼラチンフリーＣｈＤＨ。
【００９８】
各製剤を、水性の溶液／懸濁液として作成して、各電気化学セルに挿入し、乾燥した。
【００９９】
１日目は１０人のドナー及び２日目は２０人のドナーにより、実験を２日に渡って行った。ドナーは絶食させなかった。全血試料をＬｉヘパリン採血管内に採取した。これらの試料を遠心し、血漿を採取した。
【０１００】
事前調製した電気化学センサストリップを用いて、各試料の総コレステロール及びＨＤＬコレステロール含量をテストした。各ストリップに２０ｕＬの血漿をアプライして、各電気化学セルを満たした。試料を加えた後、以下の時間で０．１５Ｖの酸化電位を印加し、続いて−０．４５Ｖの還元電位を印加した：ＨＤＬ：３６秒；総コレステロール：１１０秒。酸化及び還元電流のバルブ（valves）の両方を測定した。個々のセンサストリップでの８反復の測定を、各試料で行った。
【０１０１】
また、各試料中の総コレステロール、ＨＤＬコレステロール及びＬＤＬコレステロールの濃度を、ランドックススペースクリニカルアナライザー（Randox SPACE clinical analyzer）を用いて決定した。アナライザーでの各測定を重複して行い、平均濃度値を決定した。
【０１０２】
総コレステロール（ＴＣ）テストの結果を図４ａ及び４ｂ（それぞれ１日目及び２日目）に示す。これらの図は、ランドックススペースクリニカルアナライザーにより決定されたＴＣ含量に対してプロットした酸化電流応答を示す。同様に、ＨＤＬコレステロールテストの結果を図５ａ及び５ｂに示すが、ランドックススペースクリニカルアナライザーにより決定されたＨＤＬコレステロール含量に対して酸化電流をプロットしている。
【０１０３】
直線回帰を各グラフに対して行った。各グラフの最良の直線近似由来の勾配及び切片を用いて、各電流応答に対する分析物濃度を予測した：
【０１０４】
【数２】
【０１０５】
ＴＣ及びＨＤＬコレステロールに関して計算された分析物の値を用いて、下の式に従って非ＨＤＬコレステロールの濃度を計算した：
【０１０６】
【数３】
【０１０７】
ランドックススペースクリニカルアナライザーにより決定された、［ＬＤＬ］（ｘ軸）に対する、各試料の測定されたＨＤＬコレステロール及びＴＣから決定された［非ＨＤＬ］（ｙ軸）のプロットを図６ａ及び６ｂに示す。非ＨＤＬコレステロール濃度とＬＤＬコレステロール濃度との間に良好な相関が観察された。
【０１０８】
また、本発明に従って測定された非ＨＤＬコレステロール含量を、フリードワルド式を用いて決定されたＬＤＬコレステロール含量と比較した：
【０１０９】
【数４】
【０１１０】
式中、［総コレステロール］は試料中のコレステロールの総濃度であり、［ＨＤＬ］は高密度リポタンパク質に結合したコレステロールの濃度であり、［トリグリセリド］は試料のトリグリセリド濃度であり、濃度はｍｍｏｌ ｄｍ−３で測定している。
【０１１１】
非ＨＤＬコレステロール含量に対してプロットした結果を、図７に示す。非ＨＤＬコレステロール含量とフリードワルド式を用いて決定されたＬＤＬコレステロール含量との間に良好な相関が見られた。
【０１１２】
実施例３：ＭＥＧＡ−８
本実験の目的は、短い測定時間でのＨＤＬへの応答及び長い測定時間でのＴＣへの応答を用いることによって、ＬＤＬへの応答を判定するための、１００ｍＭ ＭＥＧＡ−８を含有するシングルセンサの使用を調べることであった。
【０１１３】
１０％β−ラクトース緩衝液
０．１Ｍ トリス ｐＨ９．０、３０ｍＭ ＫＯＨ及び１０％ β−ラクトースを含有する緩衝溶液を調製した。
【０１１４】
３０ｍＭ ＲｕＡｃａｃ溶液：
上記１０％ラクトース緩衝液にＲｕＡｃａｃを加えることにより、３０ｍＭ ＲｕＡｃａｃ溶液を作成した。Ｃｏｖａｒｉｓのアコースティックミキサーを用いて、この溶液を混合した。
ＲｕＡｃａｃ＝Ｃｉｓ−［Ｒｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２）］
【０１１５】
ＭＥＧＡ溶液
上記ＲｕＡｃａｃ溶液にＭＥＧＡを加え、以下の最終濃度にすることにより２倍強度ＭＥＧＡ溶液を作成した：
ＭＥＧＡ−８（Ｓｏｌｔｅｃ Ｖｅｎｔｕｒｅｓ Ｓ１１６）
２００ｍＭ（２９２μｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中に、０．０１８８ｇ）
【０１１６】
酵素混合物
ＲｕＡｃａｃ溶液に酵素を加え、以下の最終濃度にすることにより２倍強度で酵素混合物を作成した：
１７．７ｍＭ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（オリエンタル酵母工業株式会社）
８．４ｍｇ／ｍｌ プチダレドキシンレダクターゼ（バイオカタリスト）
６．７ｍｇ／ｍｌリパーゼ（ジェンザイム）
４４．４ｍｇ／ｍｌコレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチンフリー（アマノ、ＣＨＤＨ−６）
Ｃｏｖａｒｉｓのアコースティックミキサーを用いて、この溶液を混合した。
【０１１７】
分注及び凍結乾燥
最終酵素溶液のために、等量（約５０ｕｌ）の２倍濃度酵素溶液及びＭＥＧＡ溶液を１：１で混合し、酵素／界面活性剤の最終混合物を得た。電動ピペットを用いて、０．４μｌ／ウェルの各溶液を、ＷＯ０３５６３１９に記載の通りのセンサ上に分注した。次いで、分注したセンサシートを凍結乾燥した。
【０１１８】
血漿試料
血漿試料を３０分間解凍した後、２９００ＲＣＦで５分間遠心した。脱脂血清（Ｓｃｉｐａｃ、Ｓ１３９）も、試料として使用した。試料について、ＴＣ濃度、ＴＧ濃度、ＨＤＬ濃度及びＬＤＬ濃度を、スペースクリニカルアナライザー（Ｓｃｈｉａｐｐａｎｅｌｌｉ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ）を用いて解析した。
【０１１９】
テストプロトコル
１２−１５μｌの血漿試料を電極ごとに用いた。血漿を加えて、Ａｕｔｏｌａｂに連結されたマルチプレクサーを用いて、クロノアンペロメトリーテストを開始した。１３のタイムポイント（０、３２、６４、９６、１２８、１６０，１９２、２２４、２５６、２８８、３２０、３５２及び３８４秒）にて、０．１５Ｖで酸化電流を測定し、最後のタイムポイント（４１６秒）にて、−０．４５Ｖで還元電流を測定した。各試料を重複してテストした。
【０１２０】
解析
各タイムポイントにおけるＨＤＬ若しくはＴＣに対する較正プロットを構築した。
【０１２１】
結果
３２秒におけるＨＤＬに対して、及び３８４秒におけるＴＣに対して良好な較正プロットが観察された。これらを図８に示す。
【０１２２】
個々の電極に関して、３２秒における電流値を用いて、グラジエント及び切片の値を用いて、ＨＤＬ較正プロットにより予測されるＨＤＬ値を計算した。同様に、個々の電極に関して、３８４秒における電流値を用いて、グラジエント及び切片値を用いて、ＴＣ較正プロットにより予測されるＴＣ値を計算した。
【０１２３】
個々の電極に関して、これらのＨＤＬ及びＴＣの予測値を用いて、ＴＣ−ＨＤＬの値を計算した。これらのＴＣ−ＨＤＬの値を、ランドックスアナライザーで測定した血漿試料のＬＤＬ値に対してプロットした。
【０１２４】
ランドックスＬＤＬに対する、計算されたＴＣ−ＨＤＬのプロットを図９に示す。ＴＣ−ＨＤＬの計算値は、参照の方法により測定したＬＤＬの値と妥当な相関を与えた。
【０１２５】
結論
短期間でのＨＤＬ、及び長期間でのＴＣへの応答を測定し、ＬＤＬ＝ＴＣ−ＨＤＬを計算することにより、ＬＤＬへの応答を計算するために、１００ｍＭ ＭＥＧＡ−８に基づいたシングルセンサを使用することができる。
【０１２６】
実施例４：様々な酵素
本実験の目的は、様々なコレステロールエステル加水分解酵素（リパーゼ若しくはコレステロールエステラーゼ）又は様々なＮＡＤＨオキシダーゼ（プチタドキシン（Putitadoxin）レダクターゼ若しくはジアホラーゼ）で調製したＴＣ及びＨＤＬセンサを用いた、ＴＣ−ＨＤＬ値からの血漿ＬＤＬの決定を調べることであった。
【０１２７】
３つの別々のＴＣセンサ及び３つの別々のＨＤＬセンサを調製した。各センサに用いた試薬の違いを下の表にまとめる：
【０１２８】
【表２】
【０１２９】
２つの別々の酵素混合物を以下のように調製したが、１つは８０ｍＭ Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３メディエーターを有し、１つは３０ｍＭ ＲｕＡｃａｃメディエーターを有していた。
８０ｍＭ Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３メディエーターを有する酵素混合物：
１０％β−ラクトース緩衝液；
０．１Ｍ トリス ｐＨ９．０、３０ｍＭ ＫＯＨ及び１０％β−ラクトースを含有する緩衝溶液を調製した。
【０１３０】
界面活性剤溶液
ラクトース溶液に界面活性剤を加え、以下の最終濃度にすることにより２倍強度界面活性剤溶液を作成した。
１０％ ＣＨＡＰＳ（シグマ−アルドリッチ、Ｃ５０７０）
５００ｕｌ ラクトース溶液中に０．０５ｇ。
１０％デオキシｂｉｇＣＨＡＰ（Ｓｏｌｔｅｃ Ｖｅｎｔｕｒｅｓ、Ｓ１１５）
３８０ｕｌ ＣＨＡＰＳ溶液中に０．０３８ｇ。
【０１３１】
８０ｍＭ Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３溶液：
１０％ＣＨＡＰＳ／デオキシＢＩＧＣＨＡＰ溶液にＲｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３を加えることにより、８０ｍＭ Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３溶液を作成した。
【０１３２】
酵素混合物
Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３溶液に酵素を加え、以下の最終濃度にすることにより２倍強度で酵素混合物を作成した：
１７．７ｍＭ チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（オリエンタル酵母工業株式会社）
８．４ｍｇ／ｍｌ プチダレドキシンレダクターゼ（バイオカタリスト）若しくは８．４ｍｇ／ｍＬジアホラーゼ（ユニチカ）
６．７ｍｇ／ｍｌ コレステロールエステラーゼ（東洋紡、ＣＯＥ−３１１）若しくはリパーゼ（東洋紡、ＬＰＬ３１１）
４４．４ｍｇ／ｍｌ コレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチンフリー（アマノ、ＣＨＤＨ−６）
【０１３３】
各最終酵素溶液のために、等量（約５０ｕＬ）の２倍濃度酵素溶液及び界面活性剤溶液を１：１で混合し、酵素／界面活性剤の最終混合物を得た。
【０１３４】
３０ｍＭ ＲｕＡｃａｃメディエーターを有する酵素混合物：
１０％β−ラクトース緩衝液；
０．１Ｍ トリス ｐＨ９．０、３０ｍＭ ＫＯＨ及び１０％ β−ラクトースを含有する緩衝溶液を調製した。
３０ｍＭ ＲｕＡｃａｃ溶液：
上記１０％ラクトース緩衝液にＲｕＡｃａｃを加えることにより、３０ｍＭ ＲｕＡｃａｃ溶液を作成した。Ｃｏｖａｒｉｓのアコースティックミキサーを用いて、この溶液を混合した。
ＲｕＡｃａｃ＝Ｃｉｓ−［Ｒｕ（ａｃａｃ）２（Ｐｙ−３−ＣＯ２Ｈ）（Ｐｙ−３−ＣＯ２）］
【０１３５】
界面活性剤溶液
ＲｕＡｃａｃ溶液に界面活性剤を加え、以下の最終濃度にすることにより２倍濃度界面活性剤溶液を作成した：
２００ｍＭ ＳＭＣ（同仁堂、ＳＯ２１−１２）
３０３ｕｌのＲｕＡｃａｃ溶液中０．０２９８ｇ
２００ｍＭ ＨＥＧＡ−９（アナトレース、Ｈ１０９）
２０４ｕｌのＲｕＡｃａｃ溶液中０．０１４９ｇ
【０１３６】
酵素混合物
ＲｕＡｃａｃ溶液に酵素を加え、以下の最終濃度にすることにより２倍強度で酵素混合物を作成した：
１７．７ｍＭチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（オリエンタル酵母工業株式会社）
８．４ｍｇ／ｍｌプチダレドキシンレダクターゼ（バイオカタリスト）若しくはジアホラーゼ（ユニチカ）
２０．１ｍｇ／ｍｌリパーゼ（ジェンザイム）若しくはコレステロールエステラーゼ（ジェンザイム）
４４．４ｍｇ／ｍｌコレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチンフリー（アマノ、ＣＨＤＨ−６）
Ｃｏｖａｒｉｓのアコースティックミキサーを用いて、この溶液を混合した。
【０１３７】
血漿試料の分注、凍結乾燥、調製及び試験プロトコルは、ＨＥＧＡ−９を有するセンサを除き、実施例３に記載の通りであり、ＨＥＧＡ−９を有するセンサは、６反復の酸化（０、５９、１１８、１７７、２３６及び２９５秒のタイムポイントにて）を用いてテストし、最後のタイムポイント（３５４秒）にて−０．４５Ｖで還元電流を測定した。トランジェント時間は、８秒だった。
【０１３８】
解析
各タイムポイントにおけるＨＤＬ若しくはＴＣに対する較正プロットを構築した。
【０１３９】
結果
ＴＣセンサの応答を、それぞれ１９２秒、２２４秒若しくは２２４秒の測定時間で、ＴＣ濃度に対するＴＣ１、ＴＣ２及びＴＣ３に関してプロットした。ＨＤＬセンサの応答を、ＨＤＬ１、ＨＤＬ２、ＨＤＬ３に対して、それぞれ３８４秒、３８４秒及び２９５秒の測定時間で、血漿ＨＤＬ濃度に対してプロットした。
【０１４０】
これらの各較正プロットに関して、最良直線近似の勾配及び切片を用いて各電流値のＴＣ（若しくはＨＤＬ）濃度を計算した。次いで、濃度値を各試料について平均化した（ｎ＝８）。
【０１４１】
ＴＣ及びＨＤＬセンサの全ての可能な組み合わせについて、ＴＣ−ＨＤＬ濃度値を各血漿試料について計算し、ラボアナライザーにより測定された試料のＬＤＬ濃度に対してプロットした。これらの較正プロットを図１０に示す。
【０１４２】
図１０説明文：
Ａ：ＴＣセンサ１及びＨＤＬセンサ１
Ｂ：ＴＣセンサ１及びＨＤＬセンサ２
Ｃ：ＴＣセンサ１及びＨＤＬセンサ３
Ｄ：ＴＣセンサ２及びＨＤＬセンサ１
Ｅ：ＴＣセンサ２及びＨＤＬセンサ２
Ｆ：ＴＣセンサ２及びＨＤＬセンサ３
Ｇ：ＴＣセンサ３及びＨＤＬセンサ１
Ｈ：ＴＣセンサ３及びＨＤＬセンサ２
Ｉ：ＴＣセンサ３及びＨＤＬセンサ３
【０１４３】
結論
様々な酵素で調製したＴＣ及びＨＤＬセンサに関して、標準方法により決定された血漿ＴＣ−ＨＤＬ及び血漿ＬＤＬの計算値の間に良好な相関が観察される。
【０１４４】
実施例５：様々な界面活性剤
本実験の目的は、一連の界面活性剤の型で調製したＴＣ及びＨＤＬセンサを用いて、ＴＣ−ＨＤＬ値からの血漿ＬＤＬの決定を調べることであった。
【０１４５】
２つの別々の酵素混合物を調製したが、１つは８０ｍＭ Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３メディエーターを有しており、１つは３０ｍＭ ＲｕＡｃａｃメディエーターを有していた。８０ｍＭ Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３メディエーター溶液及び３０ｍＭ ＲｕＡｃａｃメディエーター溶液を、実施例４に記載の通りに調製した。
【０１４６】
８０ｍＭ Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３メディエーターを有する酵素混合物
界面活性剤溶液
Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３溶液に界面活性剤を加え、以下の最終濃度にすることにより２倍の濃度の界面活性剤溶液を作成した：
１０％ＣＨＡＰＳＯ（シグマ−アルドリッチ、Ｃ４６９５）
１８０ｕｌのＲｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３溶液中に、０．０１８ｇ
１０％デオキシｂｉｇＣＨＡＰ（Ｓｏｌｔｅｃ Ｖｅｎｔｕｒｅｓ、Ｓ１１５）
２２７ｕｌのＲｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３溶液中に、０．０２２７ｇ
【０１４７】
酵素混合物
Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３溶液に酵素を加え、以下の最終濃度にすることにより２倍強度で酵素混合物を作成した：
１７．７ｍＭチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（オリエンタル酵母工業株式会社）
８．４ｍｇ／ｍｌプチダレドキシンレダクターゼ（バイオカタリスト）
６．７ｍｇ／ｍｌコレステロールエステラーゼ（東洋紡、ＣＯＥ−３１１）
４４．４ｍｇ／ｍｌコレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチンフリー（アマノ、ＣＨＤＨ−６）
【０１４８】
３０ｍＭＲｕＡｃａｃメディエーターを有する酵素混合物：
界面活性剤溶液
ＲｕＡｃａｃ溶液に界面活性剤を加え、以下の最終濃度にすることにより２倍強度界面活性剤溶液を作成した：
１０％ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（アナトレース、Ｎ３２４）
１９２ｕｌのＲｕＡｃａｃ溶液中に、０．０１９２ｇ
１００ｍＭスクロースモノドデカノエート（カルビオケム、３２４３７４）
１７３ｕｌのＲｕＡｃａｃ溶液中に、０．００９１ｇ
２００ｍＭ ＨＥＧＡ−９（アナトレース、Ｈ１０９）
２０３ｕｌのＲｕＡｃａｃ溶液中に、０．０１４８ｇ
２００ｍＭ ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトピラノシド（アナトレース、Ｏ３１０）
２１１ｕｌ ＲｕＡｃａｃ溶液中に、０．０１９１ｇ
【０１４９】
酵素混合物
ＲｕＡｃａｃに酵素を加え、以下の最終濃度にすることにより２倍強度で酵素混合物を作成した：
１７．７ｍＭチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（オリエンタル酵母工業株式会社）
８．４ｍｇ／ｍｌプチダレドキシンレダクターゼ（バイオカタリスト）
２０．１ｍｇ／ｍｌリパーゼ（ジェンザイム）
４４．４ｍｇ／ｍｌコレステロールデヒドロゲナーゼ、ゼラチンフリー（アマノ、ＣＨＤＨ−６）
Ｃｏｖａｒｉｓのアコースティックミキサーを用いて、この溶液を混合した。
【０１５０】
血漿試料の分注、凍結乾燥、調製及び試験プロトコルはＨＥＧＡ−９を有するセンサを除き、４秒のトランジェント時間で、実施例３に記載の通りであり、ＨＥＧＡ−９を有するセンサは、６反復の酸化（０、５９、１１８、１７７、２３６及び２９５秒のタイムポイントにて）を用いてテストし、最後のタイムポイント（３５４秒）にて−０．４５Ｖで還元電位を測定した。トランジェント時間は、８秒だった。各試料を重複してテストした。
【０１５１】
解析
各タイムポイントにおけるＨＤＬ若しくはＴＣに対する較正プロットを構築した。
【０１５２】
結果
ＣＨＡＰＳＯ、デオキシｂｉｇＣＨＡＰ又はｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを含有するセンサの応答を、それぞれ２２４秒、１６０秒及び２８８秒の測定時間で、ＴＣ濃度に対してプロットした。スクロースドデカノエート、ＨＥＧＡ−９又はｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトピラノシドを含有するセンサの応答を、それぞれ３８４秒、１１８秒及び３８４秒の測定時間で、血漿ＨＤＬ濃度に対してプロットした。
【０１５３】
これらの較正プロットごとに、最良直線近似の勾配及び切片を用いて各電流値のＴＣ（若しくはＨＤＬ）濃度を計算した。次いで、濃度の値を各試料に関して平均化した（ｎ＝８）。
【０１５４】
ＴＣ及びＨＤＬセンサの全ての可能な組み合わせに関して、各血漿試料に対してＴＣ−ＨＤＬ濃度の値を計算して、ラボアナライザーにより測定された試料のＬＤＬ濃度に対してプロットした。これらの較正プロットを図１１に示す。
【０１５５】
図１１説明文：
Ａ：ＴＣセンサは５％ＣＨＡＰＳＯを含有し、ＨＤＬセンサは５０ｍＭ スクロースモノドデカノエートを含有する。
Ｂ：ＴＣセンサは５％ＣＨＡＰＳＯを含有し、ＨＤＬセンサは１００ｍＭ ＨＥＧＡ−９を含有する。
Ｃ：ＴＣセンサは５％ＣＨＡＰＳＯを含有し、ＨＤＬセンサは１００ｍＭ ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトシドを含有する。
Ｄ：ＴＣセンサは５％デオキシｂｉｇＣＨＡＰを含有し、ＨＤＬセンサは５０ｍＭスクロースモノドデカノエートを含有する。
Ｅ：ＴＣセンサは５％デオキシｂｉｇＣＨＡＰを含有し、ＨＤＬセンサは１００ｍＭ ＨＥＧＡ−９を含有する。
Ｆ：ＴＣセンサは５％デオキシｂｉｇＣＨＡＰを含有し、ＨＤＬセンサは１００ｍＭ ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトシドを含有する。
Ｇ：ＴＣセンサは５％ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを含有し、ＨＤＬセンサは５０ｍＭスクロースモノドデカノエートを含有する。
Ｈ：ＴＣセンサは５％ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを含有し、ＨＤＬセンサは１００ｍＭ ＨＥＧＡ−９を含有する。
Ｉ：ＴＣセンサは５％ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを含有し、ＨＤＬセンサは１００ｍＭ ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトシドを含有する。
【０１５６】
結論
様々な界面活性剤で調製したＴＣ及びＨＤＬセンサに関して、標準方法により決定した血漿ＴＣ−ＨＤＬ及び血漿ＬＤＬの計算値との間に良好な相関が観察される。
【０１５７】
実施例６：総コレステロール及びＨＤＬコレステロール電気化学センサストリップを用いた非ＨＤＬコレステロールの測定
ＴＣ及びＨＤＬ用の複数分析物電気化学センサストリップを社内で調製した。各センサストリップは、ＴＣ及びＨＤＬ用の個々のセンサを含有し、乾燥酵素試薬及びスクリーン印刷微小電極（センサの詳細はＷＯ２００３５６３１９を参照）を含んでいた。各センサストリップを、乾燥剤と共に個々に包装した。
【０１５８】
ＴＣセンサに使用した製剤は以下の通りであった：
０．１Ｍ トリス（ｐＨ９．０）、５０ｍＭ ＭｇＳＯ４、５％ｗ／ｖ グリシン、１％ｗ／ｖ ミオイノシトール、１％ｗ／ｖ エクトイン、５％ｗ／ｖ ＣＨＡＰＳ、５％ ｗ／ｖ デオキシｂｉｇＣＨＡＰ、８０ｍＭ Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３、８．８ｍＭ ＴＮＡＤ、４．２ｍｇ／ｍＬ ＰｄＲ、３．３ｍｇ／ｍＬ ＣｈＥ及び６６ｍｇ／ｍＬゼラチンフリーＣｈＤＨ。
【０１５９】
ＨＤＬセンサに使用した製剤は以下の通りであった：
０．１Ｍ トリス（ｐＨ９．０）、１０％ｗ／ｖ ラクトース、５％ｗ／ｖ スクロースモノカプレート、８０ｍＭ Ｒｕ（ＮＨ３）６Ｃｌ３、８．８ｍＭ ＴＮＡＤ、４．２ｍｇ／ｍＬ ＰｄＲ、３．４ｍｇ／ｍＬ クロモバクテリウム・ビスコサム由来ジェンザイムリパーゼ、２２ｍｇ／ｍＬ ゼラチンフリーＣｈＤＨ。
【０１６０】
実験は１日で、３０人のドナーで行った（１０人は絶食並びに２０人は非絶食）。全血試料をＬｉヘパリン採決管に採取した。これらの試料を遠心して、血漿を採取した。各試料中のＴＣ、ＨＤＬ及びＬＤＬの濃度は、ランドックススペースクリニカルアナライザーを用いて決定した。アナライザーでの各測定を重複して行い、平均濃度値を使用した。
【０１６１】
ａｕｔｏｌａｂ及びマルチプレクサーを用いてストリップごと２０ｕＬ 血漿を用いて電気化学センサ応答を決定した。１４秒間隔で、１５のタイムポイントにて酸化電流（ｎＡ）を測定した。個々のセンサでの８反復の測定を各試料を用いて行った。
【０１６２】
各タイムポイントにおいて、各センサ応答を酸化電流値（ｎＡ）として記録した。
【０１６３】
結果
ＴＣ及びＨＤＬに関する較正グラフを、ランドックススペースクリニカルアナライザーから得られた濃度値を用いて、分析物の濃度に対するフィルター処理した酸化電流の応答から作成した。
【０１６４】
各グラフに関して直線回帰を行った。グラフを図１２（ａ）（ＴＣ）及び図１２（ｂ）（ＨＤＬ）に示したが、１８２秒及び１５４秒における較正プロットを用いている。各グラフの最良直線近似からの勾配及び切片を用いて各電流応答に関する分析物濃度を予測した：
【０１６５】
【数５】
【０１６６】
ＴＣ及びＨＤＬコレステロールの計算した分析物の値を用いて、下の式に従って非ＨＤＬコレステロールの濃度を計算した：
【０１６７】
【数６】
【０１６８】
［ＬＤＬ］（ｘ軸）に対する［非ＨＤＬ］（ｙ軸）のプロットを作成した。このグラフを図１３に示す。非ＨＤＬコレステロール濃度とＬＤＬコレステロール濃度との間に良好な相関が観察された。
【０１６９】
結論
総コレステロール及びＨＤＬコレステロールセンサを含有する電気化学センサストリップは、血漿の非ＨＤＬコレステロール濃度を決定するために使用することができ、これは血漿のＬＤＬコレステロールの測定値に対して良好な相関を与える。
【０１７０】
本発明を、様々な具体的な実施形態及び実施例に関して説明してきた。しかし、本発明はこれらの具体的な実施形態及び実施例に決して限定されるものではないことを理解するべきである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポタンパク質を含有する試料中の、高密度リポタンパク質以外のリポタンパク質中のコレステロール量を決定するための方法であって、（ａ）試料中の高密度リポタンパク質に結合したコレステロールの量を電気化学的に決定すること、（ｂ）試料中の総コレステロール量を電気化学的に決定すること、及び（ｂ）の結果から（ａ）の結果を差し引くことを含む、方法。
【請求項２】
段階（ａ）が試料を
（ａ１）コレステロールエステル加水分解試薬；
（ａ２）コレステロールデヒドロゲナーゼ；
（ａ３）補酵素；
（ａ４）酸化又は還元されて生成物を形成することができる酸化還元剤；及び
（ａ５）高密度リポタンパク質を選択的に分解する界面活性剤、
を含む第一のシリーズの試薬と反応させること、並びに形成された生成物の量を電気化学的に検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
界面活性剤（a5）が、少なくとも５０％を下回る、式（i）：
【数１】
［式中、測定（ＨＤＬコレステロール）又は測定（ＬＤＬコレステロール）は、それぞれＨＤＬ又はＬＤＬコレステロール濃度に関係する測定値である］で与えられるＬＤＬに対するＨＤＬのディファレンシエーションを有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
界面活性剤（a5）が、スクロースエステル、マルトシド、ヒドロキシエチルグルカミド誘導体又はＮ−メチル−Ｎ−アシルグルカミン誘導体である、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
界面活性剤（a5）が、式ＣＨ３（ＣＨ２）１３（ＯＣＨ２ＣＨ２）３３．５ＯＨの界面活性剤、ヒドロキシエチルグルカミド誘導体又はスクロースモノカプレートである、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
段階（b）が、試料を
（b1）コレステロールエステル加水分解試薬；
（b2）コレステロールデヒドロゲナーゼ；
（b3）補酵素；
（b4）酸化又は還元されて生成物を形成することができる酸化還元剤；及び任意に
（b5）界面活性剤、
を含む第二のシリーズの試薬と反応させること、並びに形成された生成物の量を電気化学的に検出することを含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
界面活性剤（b5）が、１以上の胆汁酸誘導体類又はその塩を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
試料を実質的に同時に第一のシリーズの試薬及び第二のシリーズの試薬と反応させる、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
段階（a）が、試料を第一のシリーズの試薬と反応させること及び形成された生成物を、高密度リポタンパク質が選択的に反応する時間に電気化学的に検出することを含み；且つ段階（b）が、試料と第一のシリーズの試薬との間の反応を継続すること及び形成された生成物を、全てのリポタンパク質が反応する時間に電気化学的に検出することを含む、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
第一及び／又は第二のシリーズの試薬が更にレダクターゼを含む、請求項２〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
リポタンパク質を含有する試料が全血であり、且つ方法が、赤血球を除去するために、試料を濾過する段階を更に含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
方法が、全体で３分以下の時間内で完了する、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
リポタンパク質を含有する試料中の、高密度リポタンパク質以外のリポタンパク質中のコレステロール量を決定するためのキットであって、
− 作用電極、参照又は擬似参照電極及び任意に別個の対向電極を有する第一の電気化学セル；
− 請求項２〜５又は８のいずれか１項で規定された通りの第一のシリーズの試薬であって、当該第一の電気化学セルに使われる、第一のシリーズの試薬；
− 作用電極、参照又は擬似参照電極及び任意に別個の対向電極を有する第二の電気化学セル；
− 請求項６〜８のいずれか１項で規定された通りの第二のシリーズの試薬であって、当該第二の電気化学セルに使われる、第二のシリーズの試薬；
− 各セルに電位を印加するための電源；
− 結果生じる、各セルの電気化学的応答を測定するための測定機器；及び
− 高密度リポタンパク質以外のリポタンパク質中のコレステロール量を算出するための計算装置、
を含む、キット。
【請求項１４】
第一のシリーズの試薬が、単一の、第一の試薬混合物の形態で存在し、且つ第二のシリーズの試薬が、単一の、第二の試薬混合物の形態で存在する、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
各試薬混合物が乾燥した形態である、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
キットを、請求項１３〜１５のいずれか１項において規定された通りに使用する方法であって、
（i）試料を第一のシリーズの試薬と、結果生じる試料と第一のシリーズの試薬との混合物が第一の電気化学セルの作用電極に接触するように接触させること；
（ii）試料を第二のシリーズの試薬と、結果生じる試料と第二のシリーズの試薬との混合物が第二の電気化学セルの作用電極に接触するように接触させること；
（iii）各電気化学セルに電位を印加すること；
（iv）結果生じる、電気化学的応答を測定することによって、各セルにおいて形成された生成物の量を電気化学的に検出すること；及び
（v）試料中の非ＨＤＬリポタンパク質に結合したコレステロールの量を算出すること
を含む、方法。
【請求項１７】
段階（i）及び（ii）が、実質的に同時に実施される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
段階（v）が、試料を第一及び／又は第二のシリーズの試薬と接触させた時間から最大３分以内の時間で完了する、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１】
リポタンパク質を含有する試料中の、高密度リポタンパク質以外のリポタンパク質中のコレステロール量を決定するための方法であって、（ａ）試料中の高密度リポタンパク質に結合したコレステロールの量を電気化学的に決定すること、（ｂ）試料中の総コレステロール量を電気化学的に決定すること、及び（ｂ）の結果から（ａ）の結果を差し引くことを含む、方法。
【請求項２】
段階（ａ）が試料を
（ａ１）コレステロールエステル加水分解試薬；
（ａ２）コレステロールデヒドロゲナーゼ；
（ａ３）補酵素；
（ａ４）酸化又は還元されて生成物を形成することができる酸化還元剤；及び
（ａ５）高密度リポタンパク質を選択的に分解する界面活性剤、
を含む第一のシリーズの試薬と反応させること、並びに形成された生成物の量を電気化学的に検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
界面活性剤（a5）が、少なくとも５０％を下回る、式（i）：
【数１】
［式中、測定（ＨＤＬコレステロール）又は測定（ＬＤＬコレステロール）は、それぞれＨＤＬ又はＬＤＬコレステロール濃度に関係する測定値である］で与えられるＬＤＬに対するＨＤＬのディファレンシエーションを有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
界面活性剤（a5）が、スクロースエステル、マルトシド、ヒドロキシエチルグルカミド誘導体又はＮ−メチル−Ｎ−アシルグルカミン誘導体である、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
界面活性剤（a5）が、式ＣＨ３（ＣＨ２）１３（ＯＣＨ２ＣＨ２）３３．５ＯＨの界面活性剤、ヒドロキシエチルグルカミド誘導体又はスクロースモノカプレートである、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
段階（b）が、試料を
（b1）コレステロールエステル加水分解試薬；
（b2）コレステロールデヒドロゲナーゼ；
（b3）補酵素；
（b4）酸化又は還元されて生成物を形成することができる酸化還元剤；及び任意に
（b5）界面活性剤、
を含む第二のシリーズの試薬と反応させること、並びに形成された生成物の量を電気化学的に検出することを含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
界面活性剤（b5）が、１以上の胆汁酸誘導体類又はその塩を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
試料を実質的に同時に第一のシリーズの試薬及び第二のシリーズの試薬と反応させる、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
段階（a）が、試料を第一のシリーズの試薬と反応させること及び形成された生成物を、高密度リポタンパク質が選択的に反応する時間に電気化学的に検出することを含み；且つ段階（b）が、試料と第一のシリーズの試薬との間の反応を継続すること及び形成された生成物を、全てのリポタンパク質が反応する時間に電気化学的に検出することを含む、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
第一及び／又は第二のシリーズの試薬が更にレダクターゼを含む、請求項２〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
リポタンパク質を含有する試料が全血であり、且つ方法が、赤血球を除去するために、試料を濾過する段階を更に含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
方法が、全体で３分以下の時間内で完了する、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
リポタンパク質を含有する試料中の、高密度リポタンパク質以外のリポタンパク質中のコレステロール量を決定するためのキットであって、
− 作用電極、参照又は擬似参照電極及び任意に別個の対向電極を有する第一の電気化学セル；
− 請求項２〜５又は８のいずれか１項で規定された通りの第一のシリーズの試薬であって、当該第一の電気化学セルに使われる、第一のシリーズの試薬；
− 作用電極、参照又は擬似参照電極及び任意に別個の対向電極を有する第二の電気化学セル；
− 請求項６〜８のいずれか１項で規定された通りの第二のシリーズの試薬であって、当該第二の電気化学セルに使われる、第二のシリーズの試薬；
− 各セルに電位を印加するための電源；
− 結果生じる、各セルの電気化学的応答を測定するための測定機器；及び
− 高密度リポタンパク質以外のリポタンパク質中のコレステロール量を算出するための計算装置、
を含む、キット。
【請求項１４】
第一のシリーズの試薬が、単一の、第一の試薬混合物の形態で存在し、且つ第二のシリーズの試薬が、単一の、第二の試薬混合物の形態で存在する、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
各試薬混合物が乾燥した形態である、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
キットを、請求項１３〜１５のいずれか１項において規定された通りに使用する方法であって、
（i）試料を第一のシリーズの試薬と、結果生じる試料と第一のシリーズの試薬との混合物が第一の電気化学セルの作用電極に接触するように接触させること；
（ii）試料を第二のシリーズの試薬と、結果生じる試料と第二のシリーズの試薬との混合物が第二の電気化学セルの作用電極に接触するように接触させること；
（iii）各電気化学セルに電位を印加すること；
（iv）結果生じる、電気化学的応答を測定することによって、各セルにおいて形成された生成物の量を電気化学的に検出すること；及び
（v）試料中の非ＨＤＬリポタンパク質に結合したコレステロールの量を算出すること
を含む、方法。
【請求項１７】
段階（i）及び（ii）が、実質的に同時に実施される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
段階（v）が、試料を第一及び／又は第二のシリーズの試薬と接触させた時間から最大３分以内の時間で完了する、請求項１６又は１７に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２００９−５３７０２０（Ｐ２００９−５３７０２０Ａ）
【公表日】平成２１年１０月２２日（２００９．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１０５３５（Ｐ２００９−５１０５３５）
【出願日】平成１９年５月１４日（２００７．５．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００７／００１７６９
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１３２２２６
【国際公開日】平成１９年１１月２２日（２００７．１１．２２）
【出願人】（５００４７２３２７）オックスフォード バイオセンサーズ リミテッド (19)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１０月２２日（２００９．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月１４日（２００７．５．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００７／００１７６９
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１３２２２６
【国際公開日】平成１９年１１月２２日（２００７．１１．２２）
【出願人】（５００４７２３２７）オックスフォード バイオセンサーズ リミテッド (19)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]