サッカロミセス属酵母の検出用プライマーセットおよびその組合せ
【課題】サッカロミセス酵母種を、正確、迅速、かつ簡便に識別できるプライマーセットを提供する。
【解決手段】複数の特定の配列からなるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドからなるプライマーを含んでなる、サッカロミセス・パストリアヌスおよび／またはサッカロミセス・バヤヌスの検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセットからなる。
【解決手段】複数の特定の配列からなるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドからなるプライマーを含んでなる、サッカロミセス・パストリアヌスおよび／またはサッカロミセス・バヤヌスの検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセットからなる。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、サッカロミセス属酵母の検出用プライマーセットおよびその組合せに関し、より詳細には、サッカロミセス属酵母の検出用のＬＡＭＰ法プライマーセットおよびＰＣＲ法プライマーセット並びにそれらの組合せに関する。
【背景技術】
【０００２】
サッカロミセス属酵母は、パン製造の他、ビール、ワイン、日本酒、焼酎、ウィスキー等のアルコール飲料製造に広く用いられている。サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）はエールのような上面発酵タイプのビール、ワイン、日本酒、サイダーのような果実酒等の醸造酒、また焼酎、ウィスキー等の蒸留酒製造に用いられる。サッカロミセス・バヤヌス（Saccharomyces bayanus）はワイン、シェリー酒、あるいは発泡性ワイン等の製造に用いられる。ピルスナータイプのビール製造に用いられる下面発酵酵母は、現在ではサッカロミセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）に分類されている（Kurtzman, C.P. & Fell, J.W. The Yeasts, A Taxonomic Study, 4th edition, 1998, Elsevier Science B.V., The Netherlands、Back, W.：Farbatlas und Handbuch der Geraenkebiologie, Teil I, 1994, Verlag Hans Carl, Nuernberg、Barnett, J.A. et al.：Yeasts, characteristics and identification, 3rd edition, 2000, Cambridge University Press, UK、清酒酵母・麹研究会：「清酒酵母の研究」2003, 新日本印刷, 東京）。このように製造に用いる酵母が適切な酵母かどうか把握するために、サッカロミセス属酵母の菌種を同定する技術は重要である。
【０００３】
しかし、これらの酵母がろ過済みの酒類製品に残存したり、あるいは外部から混入した場合には、過剰に発酵して混濁を起こし、特徴的な臭いを生産し、刺激的な苦い味に変質させて製品品質に影響を与える（Back, W.：Farbatlas und Handbuch der Geraenkebiologie, Teil I, 1994, Verlag Hans Carl, Nuernberg、European Brewery Convention：ANALYTICA - MICROBIOLOGICA - EBC, 2nd ed. 2005 Fachverlag Hans Carl, Nuernberg）。
【０００４】
また、サッカロミセス属酵母は清涼飲料、特に果汁飲料からも分離される事がある。これらの酵母が混入すると、グルコースやサッカロース等の糖から炭酸ガス、エタノール、不快な臭気を生成し、製品品質を大きく損ねる（Back, W.：Farbatlas und Handbuch der Geraenkebiologie, Teil II, 1999, Verlag Hans Carl, Nuernberg）。
【０００５】
このようにサッカロミセス属酵母が製品中で増殖すると産業に与える影響が大きいために、これら酵母を迅速に検出・同定する技術は、品質管理上重要である。また製品から分離されたサッカロミセス属酵母が製造工程で使用していた酵母である場合には、製造工程上流からのリーク、ろ過工程不良等に原因があると考えられ、外部から混入した酵母であった場合には充填機の洗浄不良や配管中の溜まり等の原因が考えられる。従って、汚染があったときに製品から分離された酵母を同定する技術は、対処する目標を明確にするために重要である。
【０００６】
しかし、サッカロミセス・パストリアヌス、サッカロミセス・セレビシェ、サッカロミセス・バヤヌスは分類学的に非常に近縁であり、サッカロミセス・パラドクサス、サッカロミセス・ミカタエ等の数種の酵母とともにSaccharomyces sensu strictoという分類学上のグループを形成している（Naumov, G.I. et al.：Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2000, vol. 50, 1931-1942）。さらにサッカロミセス・パストリアヌスは、サッカロミセス・セレビシエとサッカロミセス・バヤヌスの交雑により形成した種であると考えられており、遺伝子レベル、染色体レベルで両者のハイブリッドであることが確認されている（Kielland-Brandt, M.C. et al.：Genetics of brewing yeast. The Yeast, 2nd edn, vol. 6, pp223-254, Edited by Wheals, et al., Academic Press, New York、Ryu, S.-L. et al.：Yeast, 1996, vol.12, 757、Tamai, Y. et al.：Yeast, 1998, vol. 14, 923-933、Tamai, Y. et al.：Yeast, 2000, vol. 16, 1335-1343）。伝統的な酵母の同定法としては形態学的、生理学的、生化学的手法が用いられ、特に様々な糖の資化能、発酵能を調査する事が多いが、Saccharomyces sensu strictoに属する菌種は表現型的に互いに非常に似通っているため、このような伝統的な方法では区別する事は難しい（Naumova, E.S. et al.：Antonie van Leeuwenhoek, 2003, vol. 83, 155-166）。これらの株を見分ける分子生物学的なアプローチとしては、ＰＣＲフィンガープリンティング、ＤＮＡ／ＤＮＡ再結合キネティクス、核型解析、ミトコンドリアＤＮＡ制限酵素切断解析、ｒＲＮＡ遺伝子塩基配列解析、ｒＤＮＡ制限酵素切断解析、ＵＰ−ＰＣＲ、アイソザイム解析、ＰＣＲ−温度勾配ゲル電気泳動、リアルタイムＰＣＲ等が知られている。
【０００７】
これまでに、サッカロミセス属酵母のＦＬＯ１遺伝子の一部をＰＣＲ法で増幅させる、あるいはｒＲＮＡ遺伝子の一部をＰＣＲ法で増幅させ、ＲＦＬＰでサッカロミセス属酵母かそれ以外の属の酵母か、あるいは醸造用酵母か非醸造用酵母か識別する方法が開発された（特開平１１−５６３６６号公報（特許文献１））。また、下面発酵ビール酵母の２６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子とのスペーサー領域の配列が２種類存在するという知見に基づいて、それぞれに対して特異的なＰＣＲプライマーセットが開発された（特開２００１−８６８４号公報（特許文献２））。更に、下面発酵酵母の検出のために、Ｌｇ−ＦＬＯ１のＮ末端部分と酵母第ＩＸ番染色体の遺伝子が連結したＬｇ−ＦＬＯ１類似遺伝子に特異的なプライマーが開発された（特開２００２−２３３３８２号公報（特許文献３））。
【０００８】
しかし、ＰＣＲやリアルタイムＰＣＲは高度な温度制御や蛍光観察が必要なため、高価な機器を必要とする。またＰＣＲは反応後に電気泳動、染色、写真撮影等が必要であり、遺伝子増幅工程後の結果判定までに時間がかかる。さらにＲＡＰＤ ＰＣＲ、増幅産物の制限酵素処理、塩基配列解析、アイソザイム解析、温度勾配ゲル電気泳動等は通常のＰＣＲ以上に時間と煩雑な操作が必要であり、日々の微生物検査業務の中で行うことには問題があった。
【０００９】
また、サッカロミセス・パストリアヌス検出用ＬＡＭＰ法プライマーセットが開発されているが（ＷＯ２００５／０９３０５９号公報（特許文献４））、検出精度の点で更に改善の余地を残すものであった。
【特許文献１】特開平１１−５６３６６号公報
【特許文献２】特開２００１−８６８４号公報
【特許文献３】特開２００２−２３３３８２号公報
【特許文献４】ＷＯ２００５／０９３０５９号公報
【発明の概要】
【００１０】
本発明者らは、今般、下面発酵酵母に特異的な遺伝子として報告されているＦＳＹ１遺伝子の塩基配列(GenBank Accession No. AJ250992; Goncalves, P. M. et al., J. Bacteriol., 2000, vol.19, 5628-5630)を元にＬＡＭＰ法プライマーセットおよびＰＣＲ法プライマーセットを設計し、サッカロミセス属酵母の菌種別検出を試みた。その結果、作製したプライマーセットが下面発酵酵母のみならずサッカロミセス・バヤヌスとも交差反応することを見いだした。
【００１１】
本発明者らはまた、サッカロミセス・セレビシエのＣＹＳ３遺伝子のプロモーター領域の塩基配列(GenBank Accession No. L05146)を元にＬＡＭＰ法プライマーセットおよびＰＣＲ法プライマーセットを設計し、サッカロミセス属酵母の菌種別検出を試みた。その結果、作製したプライマーセットがサッカロミセス・セレビシエのみならずサッカロミセス・パストリアヌスとも交差反応することを見いだした。
【００１２】
本発明者らは更に、ＦＳＹ１遺伝子を元に作製したプライマーセットと、ＣＹＳ３遺伝子プロモーター領域を元に作製したプライマーセットとを組み合わせて使用することにより、サッカロミセス属酵母を菌種別に、具体的には、サッカロミセス・パストリアヌスと、サッカロミセス・セレビシエと、サッカロミセス・バヤヌスとを区別して、正確に判別できることを見いだした。
【００１３】
本発明の第一の態様によれば、下記ポリヌクレオチドを含んでなる、サッカロミセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）および／またはサッカロミセス・バヤヌス（Saccharomyces bayanus）の検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセットが提供される：
配列番号１の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号２の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号３の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号４の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
【００１４】
本発明の第一の態様によれば、また、配列番号１１の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドと、配列番号１２の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドとを含んでなる、サッカロミセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）および／またはサッカロミセス・バヤヌス（Saccharomyces bayanus）の検出に用いられるＰＣＲ法プライマーセットが提供される。
【００１５】
本発明の第二の態様によれば、下記ポリヌクレオチドを含んでなる、サッカロミセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）および／またはサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセットが提供される：
配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号７の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号８の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号９の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
【００１６】
本発明の第二の態様によれば、また、配列番号１３の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドと、配列番号１４の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドとを含んでなる、サッカロミセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）および／またはサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の検出に用いられるＰＣＲ法プライマーセットが提供される。
【００１７】
本発明によるプライマーセットによれば、サッカロミセス属酵母を菌種レベルで正確に検出することができる。また、本発明によるプライマーセットは、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応に使用することができ、増幅産物の有無により対象菌種を検出することができる。従って、本発明によるプライマーセットによれば、サッカロミセス属酵母を、菌種レベルで、正確、迅速、かつ簡便に識別することができる。
【００１８】
サッカロミセス属酵母は、酒類および清涼飲料などの各種飲料を混濁させる原因菌であり、これらの菌の存在・不存在は各種飲料の品質管理の指標となりうる。従って、本発明によるプライマーセットは、各種飲料（特に、酒類および清涼飲料）の品質管理や環境試料の検査に有用である。
【発明の具体的説明】
【００１９】
プライマーおよびプライマーセット
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットは、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、およびＢ３の４種類のプライマーからなり、これらのプライマーは標的ヌクレオチド配列の６つの領域に対応している。具体的には、標的塩基配列について、３’末端側から５’末端側に向かって順番にＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３という領域をそれぞれ規定し、この６領域に対し、４種類のプライマー、すなわちＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰおよびＢ３を作製する。ここで、Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃの各領域に相補的な領域はそれぞれＦ３、Ｆ２、Ｆ１であり、またＢ１、Ｂ２、Ｂ３の各領域に相補的な領域はそれぞれＢ１ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ３ｃである。
【００２０】
ＦＩＰは、標的配列のＦ２ｃ領域と相補的なＦ２領域を３’末端側にもち、５’末端側に標的遺伝子のＦ１ｃ領域と同じ配列を持つように作製されたプライマーである。必要ならば、ＦＩＰプライマーのＦ１ｃとＦ２の間に制限酵素部位を導入することもできる。
【００２１】
Ｆ３は、標的遺伝子のＦ３ｃ領域と相補的なＦ３領域をもつように作製されたプライマーである。
【００２２】
ＢＩＰは、標的配列のＢ２ｃ領域と相補的なＢ２領域を３’末端側にもち、５’末端側に標的遺伝子のＢ１ｃ領域と同じ配列を持つように作製されたプライマーである。必要ならば、ＢＩＰプライマーのＢ１ｃとＢ２の間に制限酵素部位を導入することもできる。
【００２３】
Ｂ３は、標的遺伝子のＢ３ｃ領域と相補的なＢ３領域をもつように作製されたプライマーである。
【００２４】
ＦＩＰおよびＢＩＰプライマーに制限酵素部位が含まれる場合、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応後に増幅産物を制限酵素で処理することによって、電気泳動後に１つのバンドとして観察することができる。この場合、もし標的配列に制限酵素部位があれば、プライマーに人為的に制限酵素部位を導入しなくてもよい。
【００２５】
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットの実施に当たっては、核酸の増幅反応を加速するためにループプライマー（ＬＦプライマーまたはＬＢプライマー）を１種類あるいは２種類追加してもよい。ループプライマーをＦ１−Ｆ２間の領域、あるいはＢ１−Ｂ２間の領域にアニールするように設計し、ＬＡＭＰ法反応系に追加して使用すると、これらのプライマーが核酸増幅工程で利用されていないループ部分に結合することにより、全てのループ部分を起点として核酸反応が進み、核酸増幅反応が加速される（例えば、特開２００２−３４５４９９号公報参照）。
【００２６】
具体的には、第一の態様のＬＡＭＰ法プライマーセットは、配列番号５の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＢ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドを、ループプライマーとして、更に含んでいてもよい。
【００２７】
第二の態様のＬＡＭＰ法プライマーセットは、配列番号１０の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＢ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドを、ループプライマーとして、更に含んでいてもよい。
【００２８】
本発明では、配列番号１〜１４の塩基配列で表されるポリヌクレオチドのみならず、配列番号１〜１４の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「相同ポリヌクレオチド」と言うことがある）も、プライマーとして用いることができる。なお、これらのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドもプライマーとして用いることができることはいうまでもない。
【００２９】
本明細書において「ハイブリダイズする」とは、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、標的ポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドには、実質的にはハイブリダイズしないことを意味する。ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で実施することができる。ここで「ストリンジェントな条件」は、プライマー配列とその相補鎖との二重鎖のＴｍ（℃）および必要な塩濃度などに依存して決定でき、プローブとなる配列を選択した後にそれに応じたストリンジェントな条件を設定することは当業者に周知の技術である（例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition,Cold Spring Harbor Laboratory(1989)等参照）。ストリンジェントな条件としては、ハイブリダイゼーションに通常用いられる適切な緩衝液中で、ヌクレオチド配列によって決定されるＴｍよりわずかに低い温度（例えば、Ｔｍよりも０〜約５℃低い温度）においてハイブリダイゼーション反応を実施することが挙げられる。ストリンジェントな条件としてはまた、ハイブリダイゼーション反応後の洗浄を高濃度低塩濃度溶液で実施することが挙げられる。ストリンジェントな条件の例としては、６×ＳＳＣ／０．０５％ピロリン酸ナトリウム溶液中で、３７℃（約１４塩基のオリゴヌクレオチドについて）、４８℃（約１７塩基のオリゴヌクレオチドについて）、５５℃（約２０塩基のオリゴヌクレオチドについて）、６０℃（約２３塩基のオリゴヌクレオチドについて）の洗浄条件が挙げられる。
【００３０】
相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、少なくとも１０塩基である。
【００３１】
ＬＡＭＰ法プライマーでは、ＦＩＰおよびＢＩＰの相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、好ましくは、少なくとも３０塩基（例えば、３０〜６０塩基）、より好ましくは少なくとも４２塩基（例えば、４２〜４７塩基）とすることができる。また、Ｆ３、Ｂ３、ＬＦ、およびＬＢの相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、好ましくは、少なくとも１２塩基（例えば、１２〜３０塩基）、より好ましくは、少なくとも２０塩基（例えば、２０〜２８塩基）とすることができる。
【００３２】
ＰＣＲ法プライマーでは、配列番号１１〜１４の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、好ましくは、少なくとも１５塩基（例えば、１５〜３０塩基）、より好ましくは、少なくとも１７塩基（例えば、１７〜２６塩基）とすることができる。
【００３３】
相同ポリヌクレオチドは、それぞれ、対応する塩基配列の連続する少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、より好ましくは少なくとも１８個、特に好ましくは少なくとも２０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドであることができる。
【００３４】
配列番号１〜１４の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチドの例を示すと以下の通りである。
【００３５】
・配列番号１の塩基配列で表されるＦＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号１の連続する少なくとも３８個（３８〜４６個）、より好ましくは、少なくとも４２個（４２〜４６個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５３塩基、より好ましくは最大で４７塩基とすることができる）。
【００３６】
・配列番号２の塩基配列で表されるＦ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号２の連続する少なくとも１９個（１９〜２２個）、より好ましくは、少なくとも２０個（２０〜２２個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２８塩基、より好ましくは最大で２５塩基とすることができる）。
【００３７】
・配列番号３の塩基配列で表されるＢＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号３の連続する少なくとも３６個（３６〜４２個）、より好ましくは、少なくとも３８個（３８〜４２個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５３塩基、より好ましくは最大で４７塩基とすることができる）。
【００３８】
・配列番号４の塩基配列で表されるＢ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号４の連続する少なくとも１９個（１９〜２３個）、より好ましくは、少なくとも２０個（２０〜２３個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２８塩基、より好ましくは最大で２５塩基とすることができる）。
【００３９】
・配列番号５の塩基配列で表されるＬＢの相同ポリヌクレオチド：配列番号５の連続する少なくとも２０個（２０〜２８個）、より好ましくは、少なくとも２３個（２３〜２８個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基とすることができる）。
【００４０】
・配列番号６の塩基配列で表されるＦＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号６の連続する少なくとも３８個（３８〜４７個）、より好ましくは、少なくとも４２個（４２〜４７個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５３塩基とすることができる）。
【００４１】
・配列番号７の塩基配列で表されるＦ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号７の連続する少なくとも１８個（１８〜２０個）、より好ましくは、少なくとも１９個（１９〜２０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２８塩基、より好ましくは最大で２５塩基とすることができる）。
【００４２】
・配列番号８の塩基配列で表されるＢＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号８の連続する少なくとも３６個（３６〜４２個）、より好ましくは、少なくとも３８個（３８〜４２個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５３塩基、より好ましくは最大で４７塩基とすることができる）。
【００４３】
・配列番号９の塩基配列で表されるＢ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号９の連続する少なくとも１８個（１８〜２０個）、より好ましくは、少なくとも１９個（１９〜２０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２８塩基、より好ましくは最大で２５塩基とすることができる）。
【００４４】
・配列番号１０の塩基配列で表されるＬＢの相同ポリヌクレオチド：配列番号１０の連続する少なくとも１８個（１８〜２０個）、より好ましくは、少なくとも１９個（１９〜２０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２８塩基、より好ましくは最大で２５塩基とすることができる）。
【００４５】
・配列番号１１の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチド：配列番号１１の連続する少なくとも１５個（例えば、１５〜２６個）、より好ましくは、少なくとも１７個（例えば、１７〜２６個）、特に好ましくは、少なくとも２１個（例えば、２１〜２６個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２８塩基とすることができる）。
【００４６】
・配列番号１２の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチド：配列番号１２の連続する少なくとも１５個（例えば、１５〜２１個）、より好ましくは、少なくとも１７個（例えば、１７〜２１個）、特に好ましくは、少なくとも１８個（例えば、１８〜２１個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２６塩基、より好ましくは最大で２４塩基とすることができる）。
【００４７】
・配列番号１３の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチド：配列番号１３の連続する少なくとも１５個（例えば、１５〜１８個）、より好ましくは、少なくとも１７個（例えば、１７〜１８個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２６塩基、より好ましくは最大で２１塩基とすることができる）。
【００４８】
・配列番号１４の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチド：配列番号１４の連続する少なくとも１５個（例えば、１５〜１７個）、より好ましくは、少なくとも１６個（例えば、１６〜１７個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２６塩基、より好ましくは最大で２１塩基とすることができる）。
【００４９】
相同ポリヌクレオチドは、また、それぞれ、対応する塩基配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチドであることができる。同一性の数値は、当業界において周知のアルゴリズムに従って算出することができ、例えば、ＢＬＡＳＴ（http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/blast-j.html）を使用して同一性の数値を算出することができる。
【００５０】
相同ポリヌクレオチドは、更に、それぞれ、配列番号１〜１４の塩基配列に１または数個の変異が導入された改変塩基配列からなり、かつ配列番号１〜１４の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドであることができる。
【００５１】
ここで「変異」は、同一または異なっていてもよく、置換、欠失、挿入、および付加から選択でき、好ましくは、ある１個の塩基を他の１個の塩基に置換する「一塩基置換」、ある１個の塩基を欠失させる「一塩基欠失」、ある１個の塩基を挿入する「一塩基挿入」、およびある１個の塩基を付加する「一塩基付加」から選択できる。また、変異の個数は、１〜６個、１、２、３、または４個、１または２個、あるいは１個とすることができる。
【００５２】
本発明において「ポリヌクレオチド」とはＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ（peptide nucleic acid）を含む意味で用いられる。
【００５３】
本発明によるプライマーセット等を構成するポリヌクレオチドは、例えばホスファイト・トリエステル法（Hunkapiller,M.et al., Nature, 310,105, 1984）等の通常の方法に準じて、核酸の化学合成を行うことにより調製してもよいし、検出対象の菌株の全ＤＮＡを取得し、本明細書に開示されるヌクレオチド配列に基づいて目的のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ法等で適宜取得してもよい。
【００５４】
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットは、それぞれ単独で使用しても、適宜組み合わせて使用してもよい。本発明によるプライマーセットを組み合わせて実施することにより、サッカロミセス・パストリアヌスと、サッカロミセス・セレビシエと、サッカロミセス・バヤヌスとをより正確に区別して検出することが可能となる。
【００５５】
本発明による第一の態様のプライマーセットは、サッカロミセス・パストリアヌスとサッカロミセス・バヤヌスを検出することができる。本発明による第二の態様のプライマーセットは、サッカロミセス・パストリアヌスとサッカロミセス・セレビシエを検出することができる。サッカロミセス・パストリアヌス、サッカロミセス・バヤヌス、およびサッカロミセス・セレビシエを、菌種ごとに正確に検出したい場合には、本発明による第一の態様のプライマーセットと本発明による第二の態様のプライマーセットとを組み合わせて使用することが好ましい。この場合、本発明による第一の態様のプライマーセットと、第二の態様のプライマーセットとの両方で増幅反応が認められた場合には、試料中にサッカロミセス・パストリアヌスが存在すると判断することができる。本発明による第一の態様のプライマーセットに増幅反応が認められ、本発明による第二の態様のプライマーセットに増幅反応が認められなかった場合には、試料中にサッカロミセス・バヤヌスが存在すると判断することができる。本発明による第二の態様のプライマーセットに増幅反応が認められ、本発明による第一の態様のプライマーセットに増幅反応が認められなかった場合には、試料中にサッカロミセス・セレビシエが存在すると判断することができる。本発明による第一の態様のプライマーセットと本発明による第二の態様のプライマーセットのいずれにも増幅反応が認められなかった場合には、試料中にサッカロミセス・パストリアヌス、サッカロミセス・バヤヌス、サッカロミセス・セレビシエのいずれも存在しないと判断することができる。
【００５６】
サッカロミセス・パストリアヌス、サッカロミセス・セレビシェ、サッカロミセス・バヤヌスは、それぞれに特異的なプライマーを用いることにより検出できるが、その場合、１試料に対して３つのプライマーセットによる検査が必要となる。しかし、本発明による第一の態様のプライマーセットと第二の態様のプライマーセットとを組合せて用いれば、１試料に対して２つのプライマーセットを用いることにより３菌種を識別することができ、１試料あたりの試薬使用量を減らすことができる。
【００５７】
また、本発明による第二の態様のプライマーセットは、サッカロミセス・パストリアヌス検出用プライマーセットと組み合わせることで、より正確にサッカロミセス・パストリアヌスを判定することが出来る。サッカロミセス・パストリアヌス用プライマーはゲノム構造が均一でないサッカロミセス・バヤヌスと交差反応することがある。本発明による第二の態様のプライマーセットは、サッカロミセス・パストリアヌスに含まれるサッカロミセス・セレビシェのゲノム配列と反応するが、サッカロミセス・バヤヌスはこのサッカロミセス・セレビシェのゲノム配列を持たないため、本発明による第二の態様のプライマーセットとは反応しない。この場合、サッカロミセス・パストリアヌス検出用プライマーセットと、本発明による第二の態様のプライマーセットの両方で増幅反応が認められた場合には、試料中にサッカロミセス・パストリアヌスが存在すると判断することができる。サッカロミセス・パストリアヌス検出用プライマーで増幅反応が起こり、本発明による第二の態様のプライマーセットで増幅反応が認められない場合には、試料中にサッカロミセス・バヤヌスが存在すると判断することができる。
【００５８】
本発明によるプライマーセットは、また、単独で、あるいは組み合わせて、キットの形態で提供することができる。従って、本発明によれば、第一の態様のプライマーセット、第二の態様のプライマーセット、またはこれらの組み合わせからなる、サッカロミセス属酵母の検出キットが提供される。
【００５９】
ＬＡＭＰ法プライマーセットを含む本発明によるキットは、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応の実施に必要な試薬（例えば、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、反応用試薬混合液）や器具（例えば、反応用チューブ）を含んでいてもよい。
【００６０】
ＰＣＲ法プライマーセットを含む本発明によるキットは、ＰＣＲ法による核酸増幅反応の実施に必要な試薬（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、精製水）や器具（例えば、反応用チューブ）を含んでいてもよい。
【００６１】
本発明によるプライマーセットを用いて核酸増幅反応を実施すると、酒類や清涼飲料の品質低下の原因となるサッカロミセス属酵母を菌種レベルで正確に識別することができる。従って、本発明によるプライマーセットおよびキットは、酒類（例えば、ビール、発泡酒、ワイン、果実酒、日本酒）および／または清涼飲料（例えば、果汁飲料）の品質管理や、環境試料（例えば、原料用水）の検査に用いることができる。
【００６２】
サッカロミセス・パストリアヌス、サッカロミセス・セレビシエ、およびサッカロミセス・バヤヌスは、ビールおよび発泡酒の製造工程あるいは最終製品に、品質劣化の原因酵母種として見いだされることがある。従って、本発明によるプライマーセットおよびそれらの組合せは、好ましくは、ビールおよび発泡酒の品質管理に用いることができる。
【００６３】
サッカロミセス・セレビシエおよびサッカロミセス・バヤヌスは、ワインの製造工程あるいは最終製品に、品質劣化の原因酵母種として見いだされることがある。従って、本発明によるプライマーセットおよびそれらの組合せは、好ましくは、ワインの品質管理に用いることができる。
【００６４】
サッカロミセス・セレビシエおよびサッカロミセス・バヤヌスは、清涼飲料（特に、果汁飲料）の製造工程あるいは最終製品に、品質劣化の原因酵母種として見いだされることがある。従って、本発明によるプライマーセットおよびそれらの組合せは、好ましくは、清涼飲料（特に、果汁飲料）の品質管理に用いることができる。
【００６５】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットは、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応のプライマーとして用いることができる。本発明によるプライマーセットはまた、ＬＡＭＰ法のみならず、ＬＡＭＰ法を改良した核酸増幅反応のプライマーとしても用いることができる。ＬＡＭＰ法の原理およびそれを利用した核酸増幅方法は周知であり、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応の実施に当たっては、例えば、ＷＯ００／２８０８２号公報やNotomi T. et al., Nucleic Acids Research, 28(12),e63(2000)の開示を参照することができる。
【００６６】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応は、市販のＬＡＭＰ法遺伝子増幅試薬キットに従って実施することができるが、例えば、サンプルのＤＮＡ、プライマー溶液、および市販のＬＡＭＰ法遺伝子増幅試薬キット（例えば、栄研化学社製Loopamp ＤＮＡ増幅キット）で提供される試薬を、キットに添付されている説明書に従って混合して一定温度（６０〜６５℃）に保ち、一定時間（標準で１時間）反応させることにより実施できる。
【００６７】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応は、以下のような工程を経て実施することができる。
（ｉ）鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの働きにより、ＦＩＰのＦ２領域の３’末端を起点として鋳型ＤＮＡと相補的なＤＮＡ鎖が合成される。
（ii）ＦＩＰの外側に、Ｆ３プライマーがアニールし、その３’末端を起点として鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの働きによって、先に合成されているＦＩＰからのＤＮＡ鎖を剥がしながらＤＮＡ合成が伸長する。
（iii）Ｆ３プライマーから合成されたＤＮＡ鎖と鋳型ＤＮＡが二本鎖となる。
（iv）ＦＩＰから先に合成されたＤＮＡ鎖は、Ｆ３プライマーからのＤＮＡ鎖によって剥がされて一本鎖ＤＮＡとなるが、このＤＮＡ鎖は、５’末端側に相補的な領域Ｆ１ｃ、Ｆ１をもち、自己アニールを起こし、ループを形成する。
（ｖ）上記（iv）の過程でループを形成したＤＮＡ鎖に対し、ＢＩＰがアニールし、このＢＩＰの３’末端を起点として相補的なＤＮＡが合成される。この過程でループが剥がされて伸びる。さらに、ＢＩＰの外側にＢ３プライマーがアニールし、その３’末端を起点として鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの働きによって、先に合成されたＢＩＰからのＤＮＡ鎖を剥がしながらＤＮＡ合成が伸長する。
（vi）上記（ｖ）の過程で二本鎖ＤＮＡが形成される。
（vii）上記（ｖ）の過程で剥がされたＢＩＰから合成されたＤＮＡ鎖は両端に相補的な配列を持つため、自己アニールし、ループを形成してダンベル様の構造となる。
（viii）上記ダンベル構造のＤＮＡ鎖を起点として、ＦＩＰ次いでＢＩＰのアニ−リングを介して所望ＤＮＡの増幅サイクルが行われる。
【００６８】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応は、上記の工程を適宜改変して実施できることは当業者に自明であろう。本発明によるプライマーセットはそのような改変された方法にも用いることができる。
【００６９】
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットは、約６０〜約６５℃（例えば６５℃）においてアニーリングと同時にＤＮＡ鎖の合成も起こす。アニ−リング反応およびＤＮＡ鎖合成により約１時間反応を行うことにより１０９〜１０１０倍に核酸を増幅させることができる。
【００７０】
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットをＬＡＭＰ法による核酸増幅反応の条件の下で試料核酸と反応させると、検出対象の菌株の中のターゲット領域が増幅される。このような増幅反応が起こると、副産物として形成されるピロリン酸マグネシウムの影響で反応液が白濁するため、この濁度に基づき増幅の有無が目視により判定できる。増幅の有無は、濁度測定装置を用いて濁度を光学的に測定してもよく、また、アガロースゲル電気泳動法などを利用してＤＮＡ断片の有無を確認し検出してもよい。
【００７１】
核酸増幅が観察されるならば、標的塩基配列が存在することを意味し、プライマーセットの検出対象である菌種陽性（＋）を表す。逆に、核酸増幅が観察されない場合には、標的塩基配列が不存在であることを意味し、プライマーセットの検出対象である菌種陰性（−）を表す。
【００７２】
ＰＣＲ法による核酸増幅反応
本発明によるＰＣＲ法プライマーセットは、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ等の核酸増幅法を利用して、サッカロミセス属酵母の識別に用いることができる。
【００７３】
核酸増幅物が観察されるならば、標的塩基配列が存在することを意味し、プライマーセットの検出対象である菌種陽性（＋）を表す。逆に、核酸増幅が観察されない場合には、標的塩基配列が不存在であることを意味し、プライマーセットの検出対象である菌種陰性（−）を表す。
【００７４】
ＰＣＲ法では、アガロースゲル電気泳動など周知の方法に従って核酸増幅物を検出することができる。また、リアルタイムＰＣＲ法では、インターカレーターや蛍光標識プローブを使用し、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計とが一体化された装置において、核酸増幅物を経時的に検出することができる。
【００７５】
検出対象試料とその調製
本発明によるプライマーセットおよびキットの検出の対象となる試料としては、ビール、発泡酒、ワインなどの酒類；サイダー、ラムネ、炭酸水などの清涼飲料；原料用に採取された水等の環境試料；酒類や清涼飲料等の製造工程から採取された半製品などが挙げられる。
【００７６】
これらをＬＡＭＰ法やＰＣＲ法の試料として用いる場合には、試料中に存在する菌の濃縮、分離、および培養、菌体からの核酸分離、核酸の濃縮などの操作を前処理として実施してもよい。試料中に存在する菌の濃縮や分離の方法としては、ろ過、遠心分離などが挙げられ、適宜選択できる。また試料から濃縮、分離した菌を、さらに培養して菌数を増やしてもよい。培養には、対象とする酵母株の増殖に適切な寒天固体培地や液体培地を用いることができ、また対象とする酵母菌株を選択するために硫酸銅などの薬剤を添加してもよい。飲料試料や環境試料などに存在する菌体、あるいは培養した菌体から核酸を遊離させるためには、例えば、市販のキットを使用する方法や、アルカリ溶液などによって菌体を処理し、１００℃での加熱により菌体から核酸を遊離させる方法を選択することができる。また、核酸を更に精製する必要があれば、フェノール／クロロホルム処理、エタノール沈殿や遠心等により核酸の精製を行い、最終的にＴＥ緩衝液などに再溶解させ鋳型ＤＮＡとして試験に供してもよい（European Brewery Convention:ANALYTICA - MICROBIOLOGICA - EBC, 2nd ed. 2005 Fachverlag Hans Carl, Nuernberg、Rolfsら:PCR - Clinical diagnostics and research, Springer-Verlag, Berlin, 1992、大嶋泰治ら：蛋白 核酸 酵素， vol. 35, 2523-2541, 1990）。
【００７７】
本発明によるプライマーセットおよびキットを用いたサッカロミセス属酵母の検出は、例えば、以下のように実施することができる。
【００７８】
まず、試料中に存在すると考えられるサッカロミセス属酵母を適切な培地で増菌培養する。次いで、寒天培地上に形成されたコロニーからＤＮＡを分離し、このＤＮＡに対して本発明によるプライマーセットを用いたＬＡＭＰ法またはＰＣＲ法を実施し、サッカロミセス属酵母の特定遺伝子領域を増幅する。遺伝子増幅産物の存在は、プライマーセットが標的とする菌種の存在を示す。
【実施例】
【００７９】
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００８０】
実施例１：ＬＡＭＰ法プライマーセットによるサッカロミセス酵母の検出
（ａ）ゲノムＤＮＡ抽出法
寒天平板培地上で培養した菌体をかき取り、滅菌蒸留水に懸濁した。この懸濁液を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分間）し、上澄みを捨てた。沈殿した菌体に再度滅菌蒸留水を添加、懸濁し、遠心分離した。上澄みを捨て、得られた菌体にＰｒｅｐＭａｎ Ｕｌｔｒａ（アプライドバイオシステムズ社製）の溶液１００μｌを添加し、９５℃、１０分間加熱した。その後、１５０００ｒｐｍ、１分間遠心分離し、上澄みをゲノムＤＮＡ溶液として使用した。あるいは洗浄した菌体に０．１Ｎ ＮａＯＨ溶液を１００μｌ添加し、９５℃、１０分間加熱した。その後、１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて中和し、上澄みをゲノムＤＮＡ溶液として使用した。
【００８１】
（ｂ）ＬＡＭＰ法プライマー
以下の検出用プライマーを、富士通システムソリューションズ社のeGenome Order（http://genome.e-mp.jp/index.html）、あるいはそれと同等の方法で化学合成し、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）で１００μＭの濃度になるように溶解した。これらの溶液を、ＦＩＰ、ＢＩＰプライマー：１６μＭ、Ｆ３、Ｂ３プライマー：２μＭ、ＬＦ、ＬＢプライマー：８μＭとなるように混合し、希釈した。
［ＬＡＭＰ法プライマーセットＬＧＦ１ＬＢ１］
FIP： CTGTCGTGCGAAGCAACGTCTGTGAAAGAAGAAGGCAATAAAATCG （配列番号１）
F3： ACGTCTGGAAAAGACTAAGAGA （配列番号２）
BIP： GTCCGTGTTCCACGTAACCGCCCAGTTAATTGACCCAGACCA （配列番号３）
B3： TGGACATGTAATACATGATGGCA （配列番号４）
LB： CGTGCTTTGGTATATTCTTGTATGATGA （配列番号５）
［ＬＡＭＰ法プライマーセットＳＣＣ１ＬＢ１］
FIP： CCTCTTCCAGTTCTTGACTCTTTTCCTAAGATGAAAGTGCCGGGAGA （配列番号６）
F3： ACGAAGATGAGAAAGAGGCG （配列番号７）
BIP： TGACAGCAAGGAGAAGAGCACCCCTCGTTGTTTTCCTCCTCA （配列番号８）
B3： GTGCTGTATGCTCGTTTTCG （配列番号９）
LB： GAGCAAGGGGACGAAGGTGA （配列番号１０）
【００８２】
（ｃ）ＬＡＭＰ増幅反応溶液調製
ＬＡＭＰ法のための遺伝子増幅試薬キットとして、栄研化学社製Ｌｏｏｐａｍｐ ＤＮＡ増幅キットを使用した。反応用チューブに、ゲノムＤＮＡ溶液：２．５μｌ、プライマー溶液：２．５μｌ、２倍濃度反応用緩衝液：１２．５μｌ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ：１μｌ、滅菌水：６．５μｌを添加し、全量２５μｌの反応液を調製した。
【００８３】
（ｄ）ＬＡＭＰ反応
ＬＡＭＰ反応には、テラメックス社製リアルタイム濁度計ＬＡ−２００、あるいは栄研化学社製ＬＡ−３２０Ｃを使用した。反応チューブをセットし、６５℃一定（ボンネットは７５℃）で反応させ、その間の濁度変化を６秒毎に計測した。濁度が上昇するものを陽性、濁度の上昇が認められないものを陰性とした。
【００８４】
（ｅ）プライマーの評価
ＬＧＦ１ＬＢ１を使った場合には、下面発酵酵母以外にサッカロミセス・バヤヌスからも遅れて増幅が見られた。ＳＣＣ１ＬＢ１を使った場合には、サッカロミセス・セレビシエとサッカロミセス・パストリアヌスからも増幅が見られた。
【００８５】
このようにＬＧＦ１ＬＢ１とＳＣＣ１ＬＢ１は１菌種にのみ特異的なプライマーとは言えないが、両者を組み合わせると、ＳＣＣ１ＬＢ１が陽性でＬＧＦ１ＬＢ１が陰性の場合はサッカロミセス・セレビシエと、ＳＣＣ１ＬＢ１が陰性でＬＧＦ１ＬＢ１が遅れて陽性になった場合はサッカロミセス・バヤヌスと、ＳＣＣ１ＬＢ１とＬＧＦ１ＬＢ１の両者が陽性の場合はサッカロミセス・パストリアヌスと、それぞれ判定できる。
【００８６】
表１：各種サッカロミセス属酵母標準株を用いたプライマーの評価（マス内の数字：増幅が起こるまでの反応時間、−：反応８０分以内に増幅なし）
【表１】
表２：各種酵母標準株およびビール醸造酵母を用いたプライマーの評価（マス内の数字：増幅が起こるまでの反応時間、−：反応８０分以内に増幅なし）
【表２】
【００８７】
実施例２：ＰＣＲ法プライマーによるサッカロミセス酵母の検出
（ａ）ＰＣＲ法プライマー
ＬＡＭＰ法プライマーセットＬＧＦ１ＬＢ１の設計の元になった塩基配列からＰＣＲ法用のＦＳＹプライマーセットを、ＬＡＭＰ法プライマーセットＳＣＣ１ＬＢ１の設計の元になった塩基配列からＰＣＲ用のＣＹＳプライマーセットを、それぞれ設計し、各種サッカロミセス属酵母で評価した。
【００８８】
ＰＣＲ法にはタカラバイオ社製Ｅｘ Ｔａｑを用いた。ＰＣＲに用いた各プライマーの塩基配列は次の通りである。
［ＦＳＹプライマーセット（増幅産物：約３５０ｂｐ）］
FSY3：GGTATATTCTTGTATGATGATTGGTC （配列番号１１）
FSY5：GCATATGATCCAAAAGCCATG （配列番号１２）
［ＣＹＳプライマーセット（増幅産物：約４２０ｂｐ）］
CYS3S3：GTCAAGAACTGGAAGAGG （配列番号１３）
CYS3S4：GTCCTGGTAGCGATTGT （配列番号１４）
【００８９】
これらの試薬をタカラバイオ社製Ｅｘ Ｔａｑの説明書に従って混合し（全量５０μl）、サーマルサイクラーにセットして９４℃・３０秒、５０℃・３０秒、７２℃・１分の温度プログラムを２５回繰り返してＰＣＲ反応を実施した。
【００９０】
その結果、ＦＳＹプライマーセットを使用した場合には、サッカロミセス・バヤヌスとサッカロミセス・パストリアヌスに、ＣＹＳプライマーセットを使用した場合には、サッカロミセス・セレビシエとサッカロミセス・パストリアヌスに、それぞれ予想された分子量のバンドが出現し、ＰＣＲ法プライマーセットもＬＡＭＰ法プライマーセットと同様の検出特性を示す事が判明した。
【００９１】
表３：各種サッカロミセス属酵母標準株を使ったプライマーの評価（＋：増幅あり、−：増幅なし）
【表３】
【００９２】
実施例３：特許文献にあるプライマーの評価
（ａ）特許文献のプライマー
土屋らの特許文献（ＷＯ２００５／０９３０５９号公報）に記載されていた以下のサッカロミセス属検出用プライマーセット（ＳＳＣ１ＬＢ１）および下面発酵酵母検出用プライマーセット（ＳＢＦＹ１ＬＦ１ＬＢ１）を、実施例１（ｂ）と同様にＬＡＭＰ法用プライマー溶液を調製した。サッカロミセス属検出用プライマーセット（ＳＳＣ１ＬＢ１）はｒＲＮＡ遺伝子のＤ２領域を、下面発酵酵母検出用プライマーセット（ＳＢＦＹ１ＬＦ１ＬＢ１）はメリビアーゼ遺伝子を標的としている。
［サッカロミセス属検出用プライマーセット（ＳＳＣ１ＬＢ１）］
FIP： TGCGAGATTCCCCTACCCCAGACATGGTGTTTTGTGCC（配列番号１５）
F3： AGACCGATAGCGAACAAGTA （配列番号１６）
BIP： CTGTGGGAATACTGCCAGCTGGCCGTGTTTCAAGACGGGCGG（配列番号１７）
B3： CTTGGTCCGTGTTTCAAGAC（配列番号１８）
LB： CAAGGATGCTGGCATAATGGTT （配列番号１９）
［下面発酵酵母検出用プライマーセット（ＳＢＦＹ１ＬＦ１ＬＢ１）］
FIP： GCAATTGCTCACTGACGTCGCACACCCCTCAAATGGGTTGG （配列番号２０）
F3： CCGAGTTACAATGGCCTTGG（配列番号２１）
BIP： ACCGCTGACCGGATTTCTGAAAACTAGACCAGCAGTCATCCA（配列番号２２）
B3： CCTTGTCTGCAACGAGTGT （配列番号２３）
LF： GGCAAATGTGTTCCAATTGTC （配列番号２４）
LB： GGACTAAAGGATTTGGGTTACAC（配列番号２５）
【００９３】
実施例１（ｃ）および（ｄ）の記載に従って、上記プライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法により各種菌株の検出を行った。結果は図１および図２に示される通りであった。
【００９４】
（ｂ）プライマーの評価
その結果、ＳＳＣ１ＬＢ１は試験したサッカロミセス属酵母のほとんどの菌種と反応し、サッカロミセス属酵母の中での識別は出来ないことが分かった。また、ＳＢＦＹ１ＬＦ１ＬＢ１は下面発酵酵母以外にサッカロミセス・バヤヌスと反応した。ＳＢＦＹ１ＬＦ１ＬＢ１は下面発酵酵母のメリビアーゼ遺伝子から設計されているが、設計に使用された領域はサッカロミセス・バヤヌスのゲノム中にも９６％相同性がある塩基配列が存在していたため、交差反応したと考えられた。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】サッカロミセス属検出用プライマーセット（ＳＳＣ１ＬＢ１）の検出対象菌種への反応特異性を示した図である。使用菌株は次の通りである。サッカロミセス・セレビシエＮＢＲＣ１０２１７、サッカロミセス・バヤヌスＮＢＲＣ１１０２２、サッカロミセス・パストリアヌスＮＢＲＣ１１０２４、ＮＢＲＣ１１０２３、ＮＢＲＣ１０６１０、サッカロミセス・セレビシエ・ディアスタティカスＤＳＭ７０４８７、サッカロミセス・パラドクサスＮＢＲＣ１０６０９、サッカロミセス・カリオカヌスＮＢＲＣ１０９４７、サッカロミセス・ミカタエＮＢＲＣ１８１５、サッカロミセス・クドリアヴゼヴィＮＢＲＣ１８０２、サッカロミセス・エクシグスＮＢＲＣ１１２８、サッカロミセス・セルバジーＮＢＲＣ１８３８、サッカロミセス・ウニスポラスＮＢＲＣ０３１６、サッカロミセス・ダイレネンシスＮＢＲＣ０２１１、サッカロミセス・クルイベリＮＢＲＣ１６８５、Ｎｅｇａ：ゲノムＤＮＡ無添加。
【図２】下面発酵酵母検出用プライマーセット（ＳＢＦＹ１ＬＦ１ＬＢ１）の検出対象菌種への反応特異性を示した図である。使用菌株は次の通りである。サッカロミセス・セレビシエＮＢＲＣ１０２１７、サッカロミセス・バヤヌスＮＢＲＣ１１０２２、サッカロミセス・パストリアヌスＮＢＲＣ１１０２４、ＮＢＲＣ１１０２３、ＮＢＲＣ１０６１０、サッカロミセス・セレビシエ・ディアスタティカスＤＳＭ７０４８７、サッカロミセス・パラドクサスＮＢＲＣ１０６０９、サッカロミセス・カリオカヌスＮＢＲＣ１０９４７、サッカロミセス・ミカタエＮＢＲＣ１８１５、サッカロミセス・クドリアヴゼヴィＮＢＲＣ１８０２、サッカロミセス・エクシグスＮＢＲＣ１１２８、サッカロミセス・セルバジーＮＢＲＣ１８３８、サッカロミセス・ウニスポラスＮＢＲＣ０３１６、サッカロミセス・ダイレネンシスＮＢＲＣ０２１１、サッカロミセス・クルイベリＮＢＲＣ１６８５、Ｎｅｇａ：ゲノムＤＮＡ無添加。
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、サッカロミセス属酵母の検出用プライマーセットおよびその組合せに関し、より詳細には、サッカロミセス属酵母の検出用のＬＡＭＰ法プライマーセットおよびＰＣＲ法プライマーセット並びにそれらの組合せに関する。
【背景技術】
【０００２】
サッカロミセス属酵母は、パン製造の他、ビール、ワイン、日本酒、焼酎、ウィスキー等のアルコール飲料製造に広く用いられている。サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）はエールのような上面発酵タイプのビール、ワイン、日本酒、サイダーのような果実酒等の醸造酒、また焼酎、ウィスキー等の蒸留酒製造に用いられる。サッカロミセス・バヤヌス（Saccharomyces bayanus）はワイン、シェリー酒、あるいは発泡性ワイン等の製造に用いられる。ピルスナータイプのビール製造に用いられる下面発酵酵母は、現在ではサッカロミセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）に分類されている（Kurtzman, C.P. & Fell, J.W. The Yeasts, A Taxonomic Study, 4th edition, 1998, Elsevier Science B.V., The Netherlands、Back, W.：Farbatlas und Handbuch der Geraenkebiologie, Teil I, 1994, Verlag Hans Carl, Nuernberg、Barnett, J.A. et al.：Yeasts, characteristics and identification, 3rd edition, 2000, Cambridge University Press, UK、清酒酵母・麹研究会：「清酒酵母の研究」2003, 新日本印刷, 東京）。このように製造に用いる酵母が適切な酵母かどうか把握するために、サッカロミセス属酵母の菌種を同定する技術は重要である。
【０００３】
しかし、これらの酵母がろ過済みの酒類製品に残存したり、あるいは外部から混入した場合には、過剰に発酵して混濁を起こし、特徴的な臭いを生産し、刺激的な苦い味に変質させて製品品質に影響を与える（Back, W.：Farbatlas und Handbuch der Geraenkebiologie, Teil I, 1994, Verlag Hans Carl, Nuernberg、European Brewery Convention：ANALYTICA - MICROBIOLOGICA - EBC, 2nd ed. 2005 Fachverlag Hans Carl, Nuernberg）。
【０００４】
また、サッカロミセス属酵母は清涼飲料、特に果汁飲料からも分離される事がある。これらの酵母が混入すると、グルコースやサッカロース等の糖から炭酸ガス、エタノール、不快な臭気を生成し、製品品質を大きく損ねる（Back, W.：Farbatlas und Handbuch der Geraenkebiologie, Teil II, 1999, Verlag Hans Carl, Nuernberg）。
【０００５】
このようにサッカロミセス属酵母が製品中で増殖すると産業に与える影響が大きいために、これら酵母を迅速に検出・同定する技術は、品質管理上重要である。また製品から分離されたサッカロミセス属酵母が製造工程で使用していた酵母である場合には、製造工程上流からのリーク、ろ過工程不良等に原因があると考えられ、外部から混入した酵母であった場合には充填機の洗浄不良や配管中の溜まり等の原因が考えられる。従って、汚染があったときに製品から分離された酵母を同定する技術は、対処する目標を明確にするために重要である。
【０００６】
しかし、サッカロミセス・パストリアヌス、サッカロミセス・セレビシェ、サッカロミセス・バヤヌスは分類学的に非常に近縁であり、サッカロミセス・パラドクサス、サッカロミセス・ミカタエ等の数種の酵母とともにSaccharomyces sensu strictoという分類学上のグループを形成している（Naumov, G.I. et al.：Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2000, vol. 50, 1931-1942）。さらにサッカロミセス・パストリアヌスは、サッカロミセス・セレビシエとサッカロミセス・バヤヌスの交雑により形成した種であると考えられており、遺伝子レベル、染色体レベルで両者のハイブリッドであることが確認されている（Kielland-Brandt, M.C. et al.：Genetics of brewing yeast. The Yeast, 2nd edn, vol. 6, pp223-254, Edited by Wheals, et al., Academic Press, New York、Ryu, S.-L. et al.：Yeast, 1996, vol.12, 757、Tamai, Y. et al.：Yeast, 1998, vol. 14, 923-933、Tamai, Y. et al.：Yeast, 2000, vol. 16, 1335-1343）。伝統的な酵母の同定法としては形態学的、生理学的、生化学的手法が用いられ、特に様々な糖の資化能、発酵能を調査する事が多いが、Saccharomyces sensu strictoに属する菌種は表現型的に互いに非常に似通っているため、このような伝統的な方法では区別する事は難しい（Naumova, E.S. et al.：Antonie van Leeuwenhoek, 2003, vol. 83, 155-166）。これらの株を見分ける分子生物学的なアプローチとしては、ＰＣＲフィンガープリンティング、ＤＮＡ／ＤＮＡ再結合キネティクス、核型解析、ミトコンドリアＤＮＡ制限酵素切断解析、ｒＲＮＡ遺伝子塩基配列解析、ｒＤＮＡ制限酵素切断解析、ＵＰ−ＰＣＲ、アイソザイム解析、ＰＣＲ−温度勾配ゲル電気泳動、リアルタイムＰＣＲ等が知られている。
【０００７】
これまでに、サッカロミセス属酵母のＦＬＯ１遺伝子の一部をＰＣＲ法で増幅させる、あるいはｒＲＮＡ遺伝子の一部をＰＣＲ法で増幅させ、ＲＦＬＰでサッカロミセス属酵母かそれ以外の属の酵母か、あるいは醸造用酵母か非醸造用酵母か識別する方法が開発された（特開平１１−５６３６６号公報（特許文献１））。また、下面発酵ビール酵母の２６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子とのスペーサー領域の配列が２種類存在するという知見に基づいて、それぞれに対して特異的なＰＣＲプライマーセットが開発された（特開２００１−８６８４号公報（特許文献２））。更に、下面発酵酵母の検出のために、Ｌｇ−ＦＬＯ１のＮ末端部分と酵母第ＩＸ番染色体の遺伝子が連結したＬｇ−ＦＬＯ１類似遺伝子に特異的なプライマーが開発された（特開２００２−２３３３８２号公報（特許文献３））。
【０００８】
しかし、ＰＣＲやリアルタイムＰＣＲは高度な温度制御や蛍光観察が必要なため、高価な機器を必要とする。またＰＣＲは反応後に電気泳動、染色、写真撮影等が必要であり、遺伝子増幅工程後の結果判定までに時間がかかる。さらにＲＡＰＤ ＰＣＲ、増幅産物の制限酵素処理、塩基配列解析、アイソザイム解析、温度勾配ゲル電気泳動等は通常のＰＣＲ以上に時間と煩雑な操作が必要であり、日々の微生物検査業務の中で行うことには問題があった。
【０００９】
また、サッカロミセス・パストリアヌス検出用ＬＡＭＰ法プライマーセットが開発されているが（ＷＯ２００５／０９３０５９号公報（特許文献４））、検出精度の点で更に改善の余地を残すものであった。
【特許文献１】特開平１１−５６３６６号公報
【特許文献２】特開２００１−８６８４号公報
【特許文献３】特開２００２−２３３３８２号公報
【特許文献４】ＷＯ２００５／０９３０５９号公報
【発明の概要】
【００１０】
本発明者らは、今般、下面発酵酵母に特異的な遺伝子として報告されているＦＳＹ１遺伝子の塩基配列(GenBank Accession No. AJ250992; Goncalves, P. M. et al., J. Bacteriol., 2000, vol.19, 5628-5630)を元にＬＡＭＰ法プライマーセットおよびＰＣＲ法プライマーセットを設計し、サッカロミセス属酵母の菌種別検出を試みた。その結果、作製したプライマーセットが下面発酵酵母のみならずサッカロミセス・バヤヌスとも交差反応することを見いだした。
【００１１】
本発明者らはまた、サッカロミセス・セレビシエのＣＹＳ３遺伝子のプロモーター領域の塩基配列(GenBank Accession No. L05146)を元にＬＡＭＰ法プライマーセットおよびＰＣＲ法プライマーセットを設計し、サッカロミセス属酵母の菌種別検出を試みた。その結果、作製したプライマーセットがサッカロミセス・セレビシエのみならずサッカロミセス・パストリアヌスとも交差反応することを見いだした。
【００１２】
本発明者らは更に、ＦＳＹ１遺伝子を元に作製したプライマーセットと、ＣＹＳ３遺伝子プロモーター領域を元に作製したプライマーセットとを組み合わせて使用することにより、サッカロミセス属酵母を菌種別に、具体的には、サッカロミセス・パストリアヌスと、サッカロミセス・セレビシエと、サッカロミセス・バヤヌスとを区別して、正確に判別できることを見いだした。
【００１３】
本発明の第一の態様によれば、下記ポリヌクレオチドを含んでなる、サッカロミセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）および／またはサッカロミセス・バヤヌス（Saccharomyces bayanus）の検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセットが提供される：
配列番号１の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号２の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号３の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号４の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
【００１４】
本発明の第一の態様によれば、また、配列番号１１の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドと、配列番号１２の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドとを含んでなる、サッカロミセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）および／またはサッカロミセス・バヤヌス（Saccharomyces bayanus）の検出に用いられるＰＣＲ法プライマーセットが提供される。
【００１５】
本発明の第二の態様によれば、下記ポリヌクレオチドを含んでなる、サッカロミセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）および／またはサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセットが提供される：
配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号７の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号８の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号９の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
【００１６】
本発明の第二の態様によれば、また、配列番号１３の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドと、配列番号１４の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドとを含んでなる、サッカロミセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）および／またはサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の検出に用いられるＰＣＲ法プライマーセットが提供される。
【００１７】
本発明によるプライマーセットによれば、サッカロミセス属酵母を菌種レベルで正確に検出することができる。また、本発明によるプライマーセットは、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応に使用することができ、増幅産物の有無により対象菌種を検出することができる。従って、本発明によるプライマーセットによれば、サッカロミセス属酵母を、菌種レベルで、正確、迅速、かつ簡便に識別することができる。
【００１８】
サッカロミセス属酵母は、酒類および清涼飲料などの各種飲料を混濁させる原因菌であり、これらの菌の存在・不存在は各種飲料の品質管理の指標となりうる。従って、本発明によるプライマーセットは、各種飲料（特に、酒類および清涼飲料）の品質管理や環境試料の検査に有用である。
【発明の具体的説明】
【００１９】
プライマーおよびプライマーセット
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットは、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、およびＢ３の４種類のプライマーからなり、これらのプライマーは標的ヌクレオチド配列の６つの領域に対応している。具体的には、標的塩基配列について、３’末端側から５’末端側に向かって順番にＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３という領域をそれぞれ規定し、この６領域に対し、４種類のプライマー、すなわちＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰおよびＢ３を作製する。ここで、Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃの各領域に相補的な領域はそれぞれＦ３、Ｆ２、Ｆ１であり、またＢ１、Ｂ２、Ｂ３の各領域に相補的な領域はそれぞれＢ１ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ３ｃである。
【００２０】
ＦＩＰは、標的配列のＦ２ｃ領域と相補的なＦ２領域を３’末端側にもち、５’末端側に標的遺伝子のＦ１ｃ領域と同じ配列を持つように作製されたプライマーである。必要ならば、ＦＩＰプライマーのＦ１ｃとＦ２の間に制限酵素部位を導入することもできる。
【００２１】
Ｆ３は、標的遺伝子のＦ３ｃ領域と相補的なＦ３領域をもつように作製されたプライマーである。
【００２２】
ＢＩＰは、標的配列のＢ２ｃ領域と相補的なＢ２領域を３’末端側にもち、５’末端側に標的遺伝子のＢ１ｃ領域と同じ配列を持つように作製されたプライマーである。必要ならば、ＢＩＰプライマーのＢ１ｃとＢ２の間に制限酵素部位を導入することもできる。
【００２３】
Ｂ３は、標的遺伝子のＢ３ｃ領域と相補的なＢ３領域をもつように作製されたプライマーである。
【００２４】
ＦＩＰおよびＢＩＰプライマーに制限酵素部位が含まれる場合、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応後に増幅産物を制限酵素で処理することによって、電気泳動後に１つのバンドとして観察することができる。この場合、もし標的配列に制限酵素部位があれば、プライマーに人為的に制限酵素部位を導入しなくてもよい。
【００２５】
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットの実施に当たっては、核酸の増幅反応を加速するためにループプライマー（ＬＦプライマーまたはＬＢプライマー）を１種類あるいは２種類追加してもよい。ループプライマーをＦ１−Ｆ２間の領域、あるいはＢ１−Ｂ２間の領域にアニールするように設計し、ＬＡＭＰ法反応系に追加して使用すると、これらのプライマーが核酸増幅工程で利用されていないループ部分に結合することにより、全てのループ部分を起点として核酸反応が進み、核酸増幅反応が加速される（例えば、特開２００２−３４５４９９号公報参照）。
【００２６】
具体的には、第一の態様のＬＡＭＰ法プライマーセットは、配列番号５の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＢ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドを、ループプライマーとして、更に含んでいてもよい。
【００２７】
第二の態様のＬＡＭＰ法プライマーセットは、配列番号１０の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＢ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドを、ループプライマーとして、更に含んでいてもよい。
【００２８】
本発明では、配列番号１〜１４の塩基配列で表されるポリヌクレオチドのみならず、配列番号１〜１４の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「相同ポリヌクレオチド」と言うことがある）も、プライマーとして用いることができる。なお、これらのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドもプライマーとして用いることができることはいうまでもない。
【００２９】
本明細書において「ハイブリダイズする」とは、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、標的ポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドには、実質的にはハイブリダイズしないことを意味する。ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で実施することができる。ここで「ストリンジェントな条件」は、プライマー配列とその相補鎖との二重鎖のＴｍ（℃）および必要な塩濃度などに依存して決定でき、プローブとなる配列を選択した後にそれに応じたストリンジェントな条件を設定することは当業者に周知の技術である（例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition,Cold Spring Harbor Laboratory(1989)等参照）。ストリンジェントな条件としては、ハイブリダイゼーションに通常用いられる適切な緩衝液中で、ヌクレオチド配列によって決定されるＴｍよりわずかに低い温度（例えば、Ｔｍよりも０〜約５℃低い温度）においてハイブリダイゼーション反応を実施することが挙げられる。ストリンジェントな条件としてはまた、ハイブリダイゼーション反応後の洗浄を高濃度低塩濃度溶液で実施することが挙げられる。ストリンジェントな条件の例としては、６×ＳＳＣ／０．０５％ピロリン酸ナトリウム溶液中で、３７℃（約１４塩基のオリゴヌクレオチドについて）、４８℃（約１７塩基のオリゴヌクレオチドについて）、５５℃（約２０塩基のオリゴヌクレオチドについて）、６０℃（約２３塩基のオリゴヌクレオチドについて）の洗浄条件が挙げられる。
【００３０】
相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、少なくとも１０塩基である。
【００３１】
ＬＡＭＰ法プライマーでは、ＦＩＰおよびＢＩＰの相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、好ましくは、少なくとも３０塩基（例えば、３０〜６０塩基）、より好ましくは少なくとも４２塩基（例えば、４２〜４７塩基）とすることができる。また、Ｆ３、Ｂ３、ＬＦ、およびＬＢの相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、好ましくは、少なくとも１２塩基（例えば、１２〜３０塩基）、より好ましくは、少なくとも２０塩基（例えば、２０〜２８塩基）とすることができる。
【００３２】
ＰＣＲ法プライマーでは、配列番号１１〜１４の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、好ましくは、少なくとも１５塩基（例えば、１５〜３０塩基）、より好ましくは、少なくとも１７塩基（例えば、１７〜２６塩基）とすることができる。
【００３３】
相同ポリヌクレオチドは、それぞれ、対応する塩基配列の連続する少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、より好ましくは少なくとも１８個、特に好ましくは少なくとも２０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドであることができる。
【００３４】
配列番号１〜１４の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチドの例を示すと以下の通りである。
【００３５】
・配列番号１の塩基配列で表されるＦＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号１の連続する少なくとも３８個（３８〜４６個）、より好ましくは、少なくとも４２個（４２〜４６個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５３塩基、より好ましくは最大で４７塩基とすることができる）。
【００３６】
・配列番号２の塩基配列で表されるＦ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号２の連続する少なくとも１９個（１９〜２２個）、より好ましくは、少なくとも２０個（２０〜２２個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２８塩基、より好ましくは最大で２５塩基とすることができる）。
【００３７】
・配列番号３の塩基配列で表されるＢＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号３の連続する少なくとも３６個（３６〜４２個）、より好ましくは、少なくとも３８個（３８〜４２個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５３塩基、より好ましくは最大で４７塩基とすることができる）。
【００３８】
・配列番号４の塩基配列で表されるＢ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号４の連続する少なくとも１９個（１９〜２３個）、より好ましくは、少なくとも２０個（２０〜２３個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２８塩基、より好ましくは最大で２５塩基とすることができる）。
【００３９】
・配列番号５の塩基配列で表されるＬＢの相同ポリヌクレオチド：配列番号５の連続する少なくとも２０個（２０〜２８個）、より好ましくは、少なくとも２３個（２３〜２８個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基とすることができる）。
【００４０】
・配列番号６の塩基配列で表されるＦＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号６の連続する少なくとも３８個（３８〜４７個）、より好ましくは、少なくとも４２個（４２〜４７個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５３塩基とすることができる）。
【００４１】
・配列番号７の塩基配列で表されるＦ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号７の連続する少なくとも１８個（１８〜２０個）、より好ましくは、少なくとも１９個（１９〜２０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２８塩基、より好ましくは最大で２５塩基とすることができる）。
【００４２】
・配列番号８の塩基配列で表されるＢＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号８の連続する少なくとも３６個（３６〜４２個）、より好ましくは、少なくとも３８個（３８〜４２個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５３塩基、より好ましくは最大で４７塩基とすることができる）。
【００４３】
・配列番号９の塩基配列で表されるＢ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号９の連続する少なくとも１８個（１８〜２０個）、より好ましくは、少なくとも１９個（１９〜２０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２８塩基、より好ましくは最大で２５塩基とすることができる）。
【００４４】
・配列番号１０の塩基配列で表されるＬＢの相同ポリヌクレオチド：配列番号１０の連続する少なくとも１８個（１８〜２０個）、より好ましくは、少なくとも１９個（１９〜２０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２８塩基、より好ましくは最大で２５塩基とすることができる）。
【００４５】
・配列番号１１の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチド：配列番号１１の連続する少なくとも１５個（例えば、１５〜２６個）、より好ましくは、少なくとも１７個（例えば、１７〜２６個）、特に好ましくは、少なくとも２１個（例えば、２１〜２６個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２８塩基とすることができる）。
【００４６】
・配列番号１２の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチド：配列番号１２の連続する少なくとも１５個（例えば、１５〜２１個）、より好ましくは、少なくとも１７個（例えば、１７〜２１個）、特に好ましくは、少なくとも１８個（例えば、１８〜２１個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２６塩基、より好ましくは最大で２４塩基とすることができる）。
【００４７】
・配列番号１３の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチド：配列番号１３の連続する少なくとも１５個（例えば、１５〜１８個）、より好ましくは、少なくとも１７個（例えば、１７〜１８個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２６塩基、より好ましくは最大で２１塩基とすることができる）。
【００４８】
・配列番号１４の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチド：配列番号１４の連続する少なくとも１５個（例えば、１５〜１７個）、より好ましくは、少なくとも１６個（例えば、１６〜１７個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２６塩基、より好ましくは最大で２１塩基とすることができる）。
【００４９】
相同ポリヌクレオチドは、また、それぞれ、対応する塩基配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチドであることができる。同一性の数値は、当業界において周知のアルゴリズムに従って算出することができ、例えば、ＢＬＡＳＴ（http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/blast-j.html）を使用して同一性の数値を算出することができる。
【００５０】
相同ポリヌクレオチドは、更に、それぞれ、配列番号１〜１４の塩基配列に１または数個の変異が導入された改変塩基配列からなり、かつ配列番号１〜１４の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドであることができる。
【００５１】
ここで「変異」は、同一または異なっていてもよく、置換、欠失、挿入、および付加から選択でき、好ましくは、ある１個の塩基を他の１個の塩基に置換する「一塩基置換」、ある１個の塩基を欠失させる「一塩基欠失」、ある１個の塩基を挿入する「一塩基挿入」、およびある１個の塩基を付加する「一塩基付加」から選択できる。また、変異の個数は、１〜６個、１、２、３、または４個、１または２個、あるいは１個とすることができる。
【００５２】
本発明において「ポリヌクレオチド」とはＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ（peptide nucleic acid）を含む意味で用いられる。
【００５３】
本発明によるプライマーセット等を構成するポリヌクレオチドは、例えばホスファイト・トリエステル法（Hunkapiller,M.et al., Nature, 310,105, 1984）等の通常の方法に準じて、核酸の化学合成を行うことにより調製してもよいし、検出対象の菌株の全ＤＮＡを取得し、本明細書に開示されるヌクレオチド配列に基づいて目的のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ法等で適宜取得してもよい。
【００５４】
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットは、それぞれ単独で使用しても、適宜組み合わせて使用してもよい。本発明によるプライマーセットを組み合わせて実施することにより、サッカロミセス・パストリアヌスと、サッカロミセス・セレビシエと、サッカロミセス・バヤヌスとをより正確に区別して検出することが可能となる。
【００５５】
本発明による第一の態様のプライマーセットは、サッカロミセス・パストリアヌスとサッカロミセス・バヤヌスを検出することができる。本発明による第二の態様のプライマーセットは、サッカロミセス・パストリアヌスとサッカロミセス・セレビシエを検出することができる。サッカロミセス・パストリアヌス、サッカロミセス・バヤヌス、およびサッカロミセス・セレビシエを、菌種ごとに正確に検出したい場合には、本発明による第一の態様のプライマーセットと本発明による第二の態様のプライマーセットとを組み合わせて使用することが好ましい。この場合、本発明による第一の態様のプライマーセットと、第二の態様のプライマーセットとの両方で増幅反応が認められた場合には、試料中にサッカロミセス・パストリアヌスが存在すると判断することができる。本発明による第一の態様のプライマーセットに増幅反応が認められ、本発明による第二の態様のプライマーセットに増幅反応が認められなかった場合には、試料中にサッカロミセス・バヤヌスが存在すると判断することができる。本発明による第二の態様のプライマーセットに増幅反応が認められ、本発明による第一の態様のプライマーセットに増幅反応が認められなかった場合には、試料中にサッカロミセス・セレビシエが存在すると判断することができる。本発明による第一の態様のプライマーセットと本発明による第二の態様のプライマーセットのいずれにも増幅反応が認められなかった場合には、試料中にサッカロミセス・パストリアヌス、サッカロミセス・バヤヌス、サッカロミセス・セレビシエのいずれも存在しないと判断することができる。
【００５６】
サッカロミセス・パストリアヌス、サッカロミセス・セレビシェ、サッカロミセス・バヤヌスは、それぞれに特異的なプライマーを用いることにより検出できるが、その場合、１試料に対して３つのプライマーセットによる検査が必要となる。しかし、本発明による第一の態様のプライマーセットと第二の態様のプライマーセットとを組合せて用いれば、１試料に対して２つのプライマーセットを用いることにより３菌種を識別することができ、１試料あたりの試薬使用量を減らすことができる。
【００５７】
また、本発明による第二の態様のプライマーセットは、サッカロミセス・パストリアヌス検出用プライマーセットと組み合わせることで、より正確にサッカロミセス・パストリアヌスを判定することが出来る。サッカロミセス・パストリアヌス用プライマーはゲノム構造が均一でないサッカロミセス・バヤヌスと交差反応することがある。本発明による第二の態様のプライマーセットは、サッカロミセス・パストリアヌスに含まれるサッカロミセス・セレビシェのゲノム配列と反応するが、サッカロミセス・バヤヌスはこのサッカロミセス・セレビシェのゲノム配列を持たないため、本発明による第二の態様のプライマーセットとは反応しない。この場合、サッカロミセス・パストリアヌス検出用プライマーセットと、本発明による第二の態様のプライマーセットの両方で増幅反応が認められた場合には、試料中にサッカロミセス・パストリアヌスが存在すると判断することができる。サッカロミセス・パストリアヌス検出用プライマーで増幅反応が起こり、本発明による第二の態様のプライマーセットで増幅反応が認められない場合には、試料中にサッカロミセス・バヤヌスが存在すると判断することができる。
【００５８】
本発明によるプライマーセットは、また、単独で、あるいは組み合わせて、キットの形態で提供することができる。従って、本発明によれば、第一の態様のプライマーセット、第二の態様のプライマーセット、またはこれらの組み合わせからなる、サッカロミセス属酵母の検出キットが提供される。
【００５９】
ＬＡＭＰ法プライマーセットを含む本発明によるキットは、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応の実施に必要な試薬（例えば、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、反応用試薬混合液）や器具（例えば、反応用チューブ）を含んでいてもよい。
【００６０】
ＰＣＲ法プライマーセットを含む本発明によるキットは、ＰＣＲ法による核酸増幅反応の実施に必要な試薬（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、精製水）や器具（例えば、反応用チューブ）を含んでいてもよい。
【００６１】
本発明によるプライマーセットを用いて核酸増幅反応を実施すると、酒類や清涼飲料の品質低下の原因となるサッカロミセス属酵母を菌種レベルで正確に識別することができる。従って、本発明によるプライマーセットおよびキットは、酒類（例えば、ビール、発泡酒、ワイン、果実酒、日本酒）および／または清涼飲料（例えば、果汁飲料）の品質管理や、環境試料（例えば、原料用水）の検査に用いることができる。
【００６２】
サッカロミセス・パストリアヌス、サッカロミセス・セレビシエ、およびサッカロミセス・バヤヌスは、ビールおよび発泡酒の製造工程あるいは最終製品に、品質劣化の原因酵母種として見いだされることがある。従って、本発明によるプライマーセットおよびそれらの組合せは、好ましくは、ビールおよび発泡酒の品質管理に用いることができる。
【００６３】
サッカロミセス・セレビシエおよびサッカロミセス・バヤヌスは、ワインの製造工程あるいは最終製品に、品質劣化の原因酵母種として見いだされることがある。従って、本発明によるプライマーセットおよびそれらの組合せは、好ましくは、ワインの品質管理に用いることができる。
【００６４】
サッカロミセス・セレビシエおよびサッカロミセス・バヤヌスは、清涼飲料（特に、果汁飲料）の製造工程あるいは最終製品に、品質劣化の原因酵母種として見いだされることがある。従って、本発明によるプライマーセットおよびそれらの組合せは、好ましくは、清涼飲料（特に、果汁飲料）の品質管理に用いることができる。
【００６５】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットは、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応のプライマーとして用いることができる。本発明によるプライマーセットはまた、ＬＡＭＰ法のみならず、ＬＡＭＰ法を改良した核酸増幅反応のプライマーとしても用いることができる。ＬＡＭＰ法の原理およびそれを利用した核酸増幅方法は周知であり、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応の実施に当たっては、例えば、ＷＯ００／２８０８２号公報やNotomi T. et al., Nucleic Acids Research, 28(12),e63(2000)の開示を参照することができる。
【００６６】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応は、市販のＬＡＭＰ法遺伝子増幅試薬キットに従って実施することができるが、例えば、サンプルのＤＮＡ、プライマー溶液、および市販のＬＡＭＰ法遺伝子増幅試薬キット（例えば、栄研化学社製Loopamp ＤＮＡ増幅キット）で提供される試薬を、キットに添付されている説明書に従って混合して一定温度（６０〜６５℃）に保ち、一定時間（標準で１時間）反応させることにより実施できる。
【００６７】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応は、以下のような工程を経て実施することができる。
（ｉ）鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの働きにより、ＦＩＰのＦ２領域の３’末端を起点として鋳型ＤＮＡと相補的なＤＮＡ鎖が合成される。
（ii）ＦＩＰの外側に、Ｆ３プライマーがアニールし、その３’末端を起点として鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの働きによって、先に合成されているＦＩＰからのＤＮＡ鎖を剥がしながらＤＮＡ合成が伸長する。
（iii）Ｆ３プライマーから合成されたＤＮＡ鎖と鋳型ＤＮＡが二本鎖となる。
（iv）ＦＩＰから先に合成されたＤＮＡ鎖は、Ｆ３プライマーからのＤＮＡ鎖によって剥がされて一本鎖ＤＮＡとなるが、このＤＮＡ鎖は、５’末端側に相補的な領域Ｆ１ｃ、Ｆ１をもち、自己アニールを起こし、ループを形成する。
（ｖ）上記（iv）の過程でループを形成したＤＮＡ鎖に対し、ＢＩＰがアニールし、このＢＩＰの３’末端を起点として相補的なＤＮＡが合成される。この過程でループが剥がされて伸びる。さらに、ＢＩＰの外側にＢ３プライマーがアニールし、その３’末端を起点として鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの働きによって、先に合成されたＢＩＰからのＤＮＡ鎖を剥がしながらＤＮＡ合成が伸長する。
（vi）上記（ｖ）の過程で二本鎖ＤＮＡが形成される。
（vii）上記（ｖ）の過程で剥がされたＢＩＰから合成されたＤＮＡ鎖は両端に相補的な配列を持つため、自己アニールし、ループを形成してダンベル様の構造となる。
（viii）上記ダンベル構造のＤＮＡ鎖を起点として、ＦＩＰ次いでＢＩＰのアニ−リングを介して所望ＤＮＡの増幅サイクルが行われる。
【００６８】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応は、上記の工程を適宜改変して実施できることは当業者に自明であろう。本発明によるプライマーセットはそのような改変された方法にも用いることができる。
【００６９】
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットは、約６０〜約６５℃（例えば６５℃）においてアニーリングと同時にＤＮＡ鎖の合成も起こす。アニ−リング反応およびＤＮＡ鎖合成により約１時間反応を行うことにより１０９〜１０１０倍に核酸を増幅させることができる。
【００７０】
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットをＬＡＭＰ法による核酸増幅反応の条件の下で試料核酸と反応させると、検出対象の菌株の中のターゲット領域が増幅される。このような増幅反応が起こると、副産物として形成されるピロリン酸マグネシウムの影響で反応液が白濁するため、この濁度に基づき増幅の有無が目視により判定できる。増幅の有無は、濁度測定装置を用いて濁度を光学的に測定してもよく、また、アガロースゲル電気泳動法などを利用してＤＮＡ断片の有無を確認し検出してもよい。
【００７１】
核酸増幅が観察されるならば、標的塩基配列が存在することを意味し、プライマーセットの検出対象である菌種陽性（＋）を表す。逆に、核酸増幅が観察されない場合には、標的塩基配列が不存在であることを意味し、プライマーセットの検出対象である菌種陰性（−）を表す。
【００７２】
ＰＣＲ法による核酸増幅反応
本発明によるＰＣＲ法プライマーセットは、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ等の核酸増幅法を利用して、サッカロミセス属酵母の識別に用いることができる。
【００７３】
核酸増幅物が観察されるならば、標的塩基配列が存在することを意味し、プライマーセットの検出対象である菌種陽性（＋）を表す。逆に、核酸増幅が観察されない場合には、標的塩基配列が不存在であることを意味し、プライマーセットの検出対象である菌種陰性（−）を表す。
【００７４】
ＰＣＲ法では、アガロースゲル電気泳動など周知の方法に従って核酸増幅物を検出することができる。また、リアルタイムＰＣＲ法では、インターカレーターや蛍光標識プローブを使用し、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計とが一体化された装置において、核酸増幅物を経時的に検出することができる。
【００７５】
検出対象試料とその調製
本発明によるプライマーセットおよびキットの検出の対象となる試料としては、ビール、発泡酒、ワインなどの酒類；サイダー、ラムネ、炭酸水などの清涼飲料；原料用に採取された水等の環境試料；酒類や清涼飲料等の製造工程から採取された半製品などが挙げられる。
【００７６】
これらをＬＡＭＰ法やＰＣＲ法の試料として用いる場合には、試料中に存在する菌の濃縮、分離、および培養、菌体からの核酸分離、核酸の濃縮などの操作を前処理として実施してもよい。試料中に存在する菌の濃縮や分離の方法としては、ろ過、遠心分離などが挙げられ、適宜選択できる。また試料から濃縮、分離した菌を、さらに培養して菌数を増やしてもよい。培養には、対象とする酵母株の増殖に適切な寒天固体培地や液体培地を用いることができ、また対象とする酵母菌株を選択するために硫酸銅などの薬剤を添加してもよい。飲料試料や環境試料などに存在する菌体、あるいは培養した菌体から核酸を遊離させるためには、例えば、市販のキットを使用する方法や、アルカリ溶液などによって菌体を処理し、１００℃での加熱により菌体から核酸を遊離させる方法を選択することができる。また、核酸を更に精製する必要があれば、フェノール／クロロホルム処理、エタノール沈殿や遠心等により核酸の精製を行い、最終的にＴＥ緩衝液などに再溶解させ鋳型ＤＮＡとして試験に供してもよい（European Brewery Convention:ANALYTICA - MICROBIOLOGICA - EBC, 2nd ed. 2005 Fachverlag Hans Carl, Nuernberg、Rolfsら:PCR - Clinical diagnostics and research, Springer-Verlag, Berlin, 1992、大嶋泰治ら：蛋白 核酸 酵素， vol. 35, 2523-2541, 1990）。
【００７７】
本発明によるプライマーセットおよびキットを用いたサッカロミセス属酵母の検出は、例えば、以下のように実施することができる。
【００７８】
まず、試料中に存在すると考えられるサッカロミセス属酵母を適切な培地で増菌培養する。次いで、寒天培地上に形成されたコロニーからＤＮＡを分離し、このＤＮＡに対して本発明によるプライマーセットを用いたＬＡＭＰ法またはＰＣＲ法を実施し、サッカロミセス属酵母の特定遺伝子領域を増幅する。遺伝子増幅産物の存在は、プライマーセットが標的とする菌種の存在を示す。
【実施例】
【００７９】
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００８０】
実施例１：ＬＡＭＰ法プライマーセットによるサッカロミセス酵母の検出
（ａ）ゲノムＤＮＡ抽出法
寒天平板培地上で培養した菌体をかき取り、滅菌蒸留水に懸濁した。この懸濁液を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分間）し、上澄みを捨てた。沈殿した菌体に再度滅菌蒸留水を添加、懸濁し、遠心分離した。上澄みを捨て、得られた菌体にＰｒｅｐＭａｎ Ｕｌｔｒａ（アプライドバイオシステムズ社製）の溶液１００μｌを添加し、９５℃、１０分間加熱した。その後、１５０００ｒｐｍ、１分間遠心分離し、上澄みをゲノムＤＮＡ溶液として使用した。あるいは洗浄した菌体に０．１Ｎ ＮａＯＨ溶液を１００μｌ添加し、９５℃、１０分間加熱した。その後、１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて中和し、上澄みをゲノムＤＮＡ溶液として使用した。
【００８１】
（ｂ）ＬＡＭＰ法プライマー
以下の検出用プライマーを、富士通システムソリューションズ社のeGenome Order（http://genome.e-mp.jp/index.html）、あるいはそれと同等の方法で化学合成し、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）で１００μＭの濃度になるように溶解した。これらの溶液を、ＦＩＰ、ＢＩＰプライマー：１６μＭ、Ｆ３、Ｂ３プライマー：２μＭ、ＬＦ、ＬＢプライマー：８μＭとなるように混合し、希釈した。
［ＬＡＭＰ法プライマーセットＬＧＦ１ＬＢ１］
FIP： CTGTCGTGCGAAGCAACGTCTGTGAAAGAAGAAGGCAATAAAATCG （配列番号１）
F3： ACGTCTGGAAAAGACTAAGAGA （配列番号２）
BIP： GTCCGTGTTCCACGTAACCGCCCAGTTAATTGACCCAGACCA （配列番号３）
B3： TGGACATGTAATACATGATGGCA （配列番号４）
LB： CGTGCTTTGGTATATTCTTGTATGATGA （配列番号５）
［ＬＡＭＰ法プライマーセットＳＣＣ１ＬＢ１］
FIP： CCTCTTCCAGTTCTTGACTCTTTTCCTAAGATGAAAGTGCCGGGAGA （配列番号６）
F3： ACGAAGATGAGAAAGAGGCG （配列番号７）
BIP： TGACAGCAAGGAGAAGAGCACCCCTCGTTGTTTTCCTCCTCA （配列番号８）
B3： GTGCTGTATGCTCGTTTTCG （配列番号９）
LB： GAGCAAGGGGACGAAGGTGA （配列番号１０）
【００８２】
（ｃ）ＬＡＭＰ増幅反応溶液調製
ＬＡＭＰ法のための遺伝子増幅試薬キットとして、栄研化学社製Ｌｏｏｐａｍｐ ＤＮＡ増幅キットを使用した。反応用チューブに、ゲノムＤＮＡ溶液：２．５μｌ、プライマー溶液：２．５μｌ、２倍濃度反応用緩衝液：１２．５μｌ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ：１μｌ、滅菌水：６．５μｌを添加し、全量２５μｌの反応液を調製した。
【００８３】
（ｄ）ＬＡＭＰ反応
ＬＡＭＰ反応には、テラメックス社製リアルタイム濁度計ＬＡ−２００、あるいは栄研化学社製ＬＡ−３２０Ｃを使用した。反応チューブをセットし、６５℃一定（ボンネットは７５℃）で反応させ、その間の濁度変化を６秒毎に計測した。濁度が上昇するものを陽性、濁度の上昇が認められないものを陰性とした。
【００８４】
（ｅ）プライマーの評価
ＬＧＦ１ＬＢ１を使った場合には、下面発酵酵母以外にサッカロミセス・バヤヌスからも遅れて増幅が見られた。ＳＣＣ１ＬＢ１を使った場合には、サッカロミセス・セレビシエとサッカロミセス・パストリアヌスからも増幅が見られた。
【００８５】
このようにＬＧＦ１ＬＢ１とＳＣＣ１ＬＢ１は１菌種にのみ特異的なプライマーとは言えないが、両者を組み合わせると、ＳＣＣ１ＬＢ１が陽性でＬＧＦ１ＬＢ１が陰性の場合はサッカロミセス・セレビシエと、ＳＣＣ１ＬＢ１が陰性でＬＧＦ１ＬＢ１が遅れて陽性になった場合はサッカロミセス・バヤヌスと、ＳＣＣ１ＬＢ１とＬＧＦ１ＬＢ１の両者が陽性の場合はサッカロミセス・パストリアヌスと、それぞれ判定できる。
【００８６】
表１：各種サッカロミセス属酵母標準株を用いたプライマーの評価（マス内の数字：増幅が起こるまでの反応時間、−：反応８０分以内に増幅なし）
【表１】
表２：各種酵母標準株およびビール醸造酵母を用いたプライマーの評価（マス内の数字：増幅が起こるまでの反応時間、−：反応８０分以内に増幅なし）
【表２】
【００８７】
実施例２：ＰＣＲ法プライマーによるサッカロミセス酵母の検出
（ａ）ＰＣＲ法プライマー
ＬＡＭＰ法プライマーセットＬＧＦ１ＬＢ１の設計の元になった塩基配列からＰＣＲ法用のＦＳＹプライマーセットを、ＬＡＭＰ法プライマーセットＳＣＣ１ＬＢ１の設計の元になった塩基配列からＰＣＲ用のＣＹＳプライマーセットを、それぞれ設計し、各種サッカロミセス属酵母で評価した。
【００８８】
ＰＣＲ法にはタカラバイオ社製Ｅｘ Ｔａｑを用いた。ＰＣＲに用いた各プライマーの塩基配列は次の通りである。
［ＦＳＹプライマーセット（増幅産物：約３５０ｂｐ）］
FSY3：GGTATATTCTTGTATGATGATTGGTC （配列番号１１）
FSY5：GCATATGATCCAAAAGCCATG （配列番号１２）
［ＣＹＳプライマーセット（増幅産物：約４２０ｂｐ）］
CYS3S3：GTCAAGAACTGGAAGAGG （配列番号１３）
CYS3S4：GTCCTGGTAGCGATTGT （配列番号１４）
【００８９】
これらの試薬をタカラバイオ社製Ｅｘ Ｔａｑの説明書に従って混合し（全量５０μl）、サーマルサイクラーにセットして９４℃・３０秒、５０℃・３０秒、７２℃・１分の温度プログラムを２５回繰り返してＰＣＲ反応を実施した。
【００９０】
その結果、ＦＳＹプライマーセットを使用した場合には、サッカロミセス・バヤヌスとサッカロミセス・パストリアヌスに、ＣＹＳプライマーセットを使用した場合には、サッカロミセス・セレビシエとサッカロミセス・パストリアヌスに、それぞれ予想された分子量のバンドが出現し、ＰＣＲ法プライマーセットもＬＡＭＰ法プライマーセットと同様の検出特性を示す事が判明した。
【００９１】
表３：各種サッカロミセス属酵母標準株を使ったプライマーの評価（＋：増幅あり、−：増幅なし）
【表３】
【００９２】
実施例３：特許文献にあるプライマーの評価
（ａ）特許文献のプライマー
土屋らの特許文献（ＷＯ２００５／０９３０５９号公報）に記載されていた以下のサッカロミセス属検出用プライマーセット（ＳＳＣ１ＬＢ１）および下面発酵酵母検出用プライマーセット（ＳＢＦＹ１ＬＦ１ＬＢ１）を、実施例１（ｂ）と同様にＬＡＭＰ法用プライマー溶液を調製した。サッカロミセス属検出用プライマーセット（ＳＳＣ１ＬＢ１）はｒＲＮＡ遺伝子のＤ２領域を、下面発酵酵母検出用プライマーセット（ＳＢＦＹ１ＬＦ１ＬＢ１）はメリビアーゼ遺伝子を標的としている。
［サッカロミセス属検出用プライマーセット（ＳＳＣ１ＬＢ１）］
FIP： TGCGAGATTCCCCTACCCCAGACATGGTGTTTTGTGCC（配列番号１５）
F3： AGACCGATAGCGAACAAGTA （配列番号１６）
BIP： CTGTGGGAATACTGCCAGCTGGCCGTGTTTCAAGACGGGCGG（配列番号１７）
B3： CTTGGTCCGTGTTTCAAGAC（配列番号１８）
LB： CAAGGATGCTGGCATAATGGTT （配列番号１９）
［下面発酵酵母検出用プライマーセット（ＳＢＦＹ１ＬＦ１ＬＢ１）］
FIP： GCAATTGCTCACTGACGTCGCACACCCCTCAAATGGGTTGG （配列番号２０）
F3： CCGAGTTACAATGGCCTTGG（配列番号２１）
BIP： ACCGCTGACCGGATTTCTGAAAACTAGACCAGCAGTCATCCA（配列番号２２）
B3： CCTTGTCTGCAACGAGTGT （配列番号２３）
LF： GGCAAATGTGTTCCAATTGTC （配列番号２４）
LB： GGACTAAAGGATTTGGGTTACAC（配列番号２５）
【００９３】
実施例１（ｃ）および（ｄ）の記載に従って、上記プライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法により各種菌株の検出を行った。結果は図１および図２に示される通りであった。
【００９４】
（ｂ）プライマーの評価
その結果、ＳＳＣ１ＬＢ１は試験したサッカロミセス属酵母のほとんどの菌種と反応し、サッカロミセス属酵母の中での識別は出来ないことが分かった。また、ＳＢＦＹ１ＬＦ１ＬＢ１は下面発酵酵母以外にサッカロミセス・バヤヌスと反応した。ＳＢＦＹ１ＬＦ１ＬＢ１は下面発酵酵母のメリビアーゼ遺伝子から設計されているが、設計に使用された領域はサッカロミセス・バヤヌスのゲノム中にも９６％相同性がある塩基配列が存在していたため、交差反応したと考えられた。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】サッカロミセス属検出用プライマーセット（ＳＳＣ１ＬＢ１）の検出対象菌種への反応特異性を示した図である。使用菌株は次の通りである。サッカロミセス・セレビシエＮＢＲＣ１０２１７、サッカロミセス・バヤヌスＮＢＲＣ１１０２２、サッカロミセス・パストリアヌスＮＢＲＣ１１０２４、ＮＢＲＣ１１０２３、ＮＢＲＣ１０６１０、サッカロミセス・セレビシエ・ディアスタティカスＤＳＭ７０４８７、サッカロミセス・パラドクサスＮＢＲＣ１０６０９、サッカロミセス・カリオカヌスＮＢＲＣ１０９４７、サッカロミセス・ミカタエＮＢＲＣ１８１５、サッカロミセス・クドリアヴゼヴィＮＢＲＣ１８０２、サッカロミセス・エクシグスＮＢＲＣ１１２８、サッカロミセス・セルバジーＮＢＲＣ１８３８、サッカロミセス・ウニスポラスＮＢＲＣ０３１６、サッカロミセス・ダイレネンシスＮＢＲＣ０２１１、サッカロミセス・クルイベリＮＢＲＣ１６８５、Ｎｅｇａ：ゲノムＤＮＡ無添加。
【図２】下面発酵酵母検出用プライマーセット（ＳＢＦＹ１ＬＦ１ＬＢ１）の検出対象菌種への反応特異性を示した図である。使用菌株は次の通りである。サッカロミセス・セレビシエＮＢＲＣ１０２１７、サッカロミセス・バヤヌスＮＢＲＣ１１０２２、サッカロミセス・パストリアヌスＮＢＲＣ１１０２４、ＮＢＲＣ１１０２３、ＮＢＲＣ１０６１０、サッカロミセス・セレビシエ・ディアスタティカスＤＳＭ７０４８７、サッカロミセス・パラドクサスＮＢＲＣ１０６０９、サッカロミセス・カリオカヌスＮＢＲＣ１０９４７、サッカロミセス・ミカタエＮＢＲＣ１８１５、サッカロミセス・クドリアヴゼヴィＮＢＲＣ１８０２、サッカロミセス・エクシグスＮＢＲＣ１１２８、サッカロミセス・セルバジーＮＢＲＣ１８３８、サッカロミセス・ウニスポラスＮＢＲＣ０３１６、サッカロミセス・ダイレネンシスＮＢＲＣ０２１１、サッカロミセス・クルイベリＮＢＲＣ１６８５、Ｎｅｇａ：ゲノムＤＮＡ無添加。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記ポリヌクレオチドを含んでなる、サッカロミセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）および／またはサッカロミセス・バヤヌス（Saccharomyces bayanus）の検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセット：
配列番号１の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号２の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号３の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号４の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号５の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＢ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドを更に含んでなる、請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項３】
下記ポリヌクレオチドを含んでなる、サッカロミセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）および／またはサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセット：
配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号７の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号８の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号９の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号１０の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＢ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドを更に含んでなる、請求項３に記載のプライマーセット。
【請求項５】
下記ポリヌクレオチドを含んでなる、サッカロミセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）および／またはサッカロミセス・バヤヌス（Saccharomyces bayanus）の検出に用いられるＰＣＲ法プライマーセット：
配列番号１１の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号１２の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
【請求項６】
下記ポリヌクレオチドを含んでなる、サッカロミセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）および／またはサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の検出に用いられるＰＣＲ法プライマーセット：
配列番号１３の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号１４の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号１〜１４の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、対応する塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のプライマーセット。
【請求項８】
配列番号１〜１４の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、対応する塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のプライマーセット。
【請求項９】
配列番号１〜１４の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、対応する塩基配列において、１または数個のヌクレオチドが改変された改変塩基配列からなり、かつ対応する塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のプライマーセット。
【請求項１０】
請求項１または２に記載のＬＡＭＰ法プライマーセットと、請求項３または４に記載のＬＡＭＰ法プライマーセットとを組み合わせて含んでなる、サッカロミセス酵母の検出用キット。
【請求項１１】
請求項５に記載のＰＣＲ法プライマーセットと、請求項６に記載のＰＣＲ法プライマーセットとを組み合わせて含んでなる、サッカロミセス酵母の検出用キット。
【請求項１】
下記ポリヌクレオチドを含んでなる、サッカロミセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）および／またはサッカロミセス・バヤヌス（Saccharomyces bayanus）の検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセット：
配列番号１の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号２の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号３の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号４の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号５の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＢ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドを更に含んでなる、請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項３】
下記ポリヌクレオチドを含んでなる、サッカロミセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）および／またはサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセット：
配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号７の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号８の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号９の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号１０の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＢ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドを更に含んでなる、請求項３に記載のプライマーセット。
【請求項５】
下記ポリヌクレオチドを含んでなる、サッカロミセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）および／またはサッカロミセス・バヤヌス（Saccharomyces bayanus）の検出に用いられるＰＣＲ法プライマーセット：
配列番号１１の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号１２の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
【請求項６】
下記ポリヌクレオチドを含んでなる、サッカロミセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）および／またはサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の検出に用いられるＰＣＲ法プライマーセット：
配列番号１３の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号１４の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号１〜１４の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、対応する塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のプライマーセット。
【請求項８】
配列番号１〜１４の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、対応する塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のプライマーセット。
【請求項９】
配列番号１〜１４の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、対応する塩基配列において、１または数個のヌクレオチドが改変された改変塩基配列からなり、かつ対応する塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のプライマーセット。
【請求項１０】
請求項１または２に記載のＬＡＭＰ法プライマーセットと、請求項３または４に記載のＬＡＭＰ法プライマーセットとを組み合わせて含んでなる、サッカロミセス酵母の検出用キット。
【請求項１１】
請求項５に記載のＰＣＲ法プライマーセットと、請求項６に記載のＰＣＲ法プライマーセットとを組み合わせて含んでなる、サッカロミセス酵母の検出用キット。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００８−１６１１８７（Ｐ２００８−１６１１８７Ａ）
【公開日】平成２０年７月１７日（２００８．７．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３１６１０３（Ｐ２００７−３１６１０３）
【出願日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【出願人】（３０７０２７５７７）麒麟麦酒株式会社 (350)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年７月１７日（２００８．７．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【出願人】（３０７０２７５７７）麒麟麦酒株式会社 (350)
【Ｆターム（参考）】
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