サッチ分解菌内包マイクロカプセルと、これを用いた芝生地の保全方法、及び該マイクロカプセルの製造方法
【課題】芝生地におけるサッチを長期にわたって安定的に効率よく分解・減容化し得る手段を提供する。
【解決手段】環境分解性ポリマーからなる多孔質のマイクロカプセルに、サッチ分解菌が内包されてなるサッチ分解菌内包マイクロカプセルを調製し，芝生地に撒布する。
【解決手段】環境分解性ポリマーからなる多孔質のマイクロカプセルに、サッチ分解菌が内包されてなるサッチ分解菌内包マイクロカプセルを調製し，芝生地に撒布する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、芝生地に堆積するサッチを分解除去するのに好適なサッチ分解菌内包マイクロカプセルと、このマイクロカプセルを用いた芝生地の保全方法、及び該マイクロカプセルの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に、ゴルフ場のグリーン、サッカーや野球、競馬等の競技場、庭園等の芝生地では、芝丈を揃えるために定期的に芝刈りを行うが、その際に発生する刈りかすが芝草の間に蓄積してサッチ（thatch) を生じる。このサッチは芝草の前記刈りかすや枯れた葉、茎、根等の堆積層であるが、その堆積が多くなると、土中や芝草の根に対して空気や水が浸透しにくくなると共に、散布した肥料や農薬がサッチに吸収されて効きにくくなり、また病原菌や害虫の繁殖や腐敗による有毒ガスの発生を招き易く、芝草の生育不良や枯死の要因になる。従って、芝生地を健全に保つための手入れとして、サッチの堆積が多くなる前に除去する必要がある。
【０００３】
従来、サッチの除去手段として、ゴルフ場や競技場等の広い芝生地ではバーチカルモアと称される自走式又は牽引式の機械のブレードによってサッチを掻き取る方法が採用され、また庭園等の狭い芝生地ではレーキや熊手を用いて人手でサッチを掻き出すのが普通である（非特許文献１）。しかるに、機械的作業と手作業のいずれにしても、サッチ除去作業には非常に手間が掛かる上、その作業で芝草を痛める懸念も多分にあった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】http://www.takii.co.jp/green/howto/howto5.html(2009/9/11) 「芝・緑化・緑肥｜芝生なんでも百科．タキイ種苗」
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、上述の事情に鑑みて、微生物を用いてサッチを分解・減容化する手段の可否について実験研究を重ねた結果、サッチ分解菌として高い活性を示す微生物が存在し、該微生物を一般的な培養手段によって容易に増殖でき、もって工業的規模での利用が充分に可能であることが判明した。しかるに、このようなサッチ分解菌を芝生地に直接に散布する方法では、日照、温度変化、降雨等の厳しい自然条件の影響を受けるため、該サッチ分解菌が芝生地に定着し難い上に短期間で失活し易く、安定したサッチ分解作用を長期にわたって発揮させることが困難であった。
【０００６】
そこで、本発明者らは、更なる実験研究の過程で、マイクロカプセルによる微生物の固定化に着目し、サッチ分解菌への応用について鋭意検討を重ねた。その結果、環境分解性ポリマーからなる多孔質のマイクロカプセルによれば、サッチ分解菌を安定的に担持させて芝生地に効率よく定着させることが可能であり、しかもサッチ分解菌を環境変化から保護できることに加え、マイクロカプセルの環境分解性ポリマーが食餌となるためにサッチ分解菌の失活が抑制され、散布した芝生地への環境負荷を与えることなく、その高いサッチ分解能力を長期間安定的に発揮させ得ることを見出し、本発明をなすに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
請求項１の発明に係るサッチ分解菌内包マイクロカプセルは、環境分解性ポリマーからなる多孔質のマイクロカプセルに、サッチ分解菌が内包されてなるものとしている。
【０００８】
そして、上記請求項１のサッチ分解菌内包マイクロカプセルの好適態様として、請求項２の発明はサッチ分解菌がBacillus subtilis属菌であること、請求項３の発明は平均粒子径が１０〜３，０００μｍの範囲にあること、をそれぞれ特定している。
【０００９】
また、請求項４の発明は、上記請求項１〜３のいずれかのサッチ分解菌内包マイクロカプセルにおいて、多孔質のマイクロカプセルが内腔部を有し、その内腔部にサッチ分解菌を含む内水相が充満してなる構成としている。そして、この請求項４のサッチ分解菌内包マイクロカプセルの好適態様として、請求項５の発明では多孔質のマイクロカプセルの環境分解性ポリマーがポリ−ε−カプロラクトンを主体とすることを特定している。
【００１０】
同じく請求項６の発明は、上記請求項１〜３のいずれかのサッチ分解菌内包マイクロカプセルにおいて、多孔質のマイクロカプセルがアルギン酸−キトサンゲルビーズからなる構成としている。
【００１１】
請求項７の発明に係る芝生地の保全方法は、上記１〜６の何れかに記載のサッチ分解菌内包マイクロカプセルを芝生地に散布することを特徴としている。
【００１２】
請求項８の発明に係るサッチ分解菌内包マイクロカプセルの製造方法は、環境分解性の壁材ポリマーが低沸点有機溶媒に溶解されてなる有機相中に、サッチ分解菌を含む環境分解性の保護剤ポリマー水溶液を添加混合することにより、該有機相中に内水相としてサッチ分解菌を含む保護剤ポリマー水溶液の液滴が分散したＳ／Ｏエマルションを調製したのち、このＳ／Ｏエマルションを水相中に添加混合して所定時間の攪拌を行うことにより、外水相中に前記Ｓ／Ｏエマルションの液滴が分散したＳ／Ｏ／Ｗエマルションを調製し、次いで有機相中の有機溶媒を加温又は／及び減圧による液中乾燥で除去して壁材ポリマーをゲル化させることにより、環境分解性ポリマーからなる多孔質のマイクロカプセルの内腔部にサッチ分解菌を含む内水相が充満したマイクロカプセルを生成させることを特徴としている。
【００１３】
そして、上記請求項８のサッチ分解菌内包マイクロカプセルにおいて、請求項９の発明は、有機相がポリ−ε−カプロラクトンを主体とする環境分解性ポリマーをジクロロメタンを主成分とする低沸点有機溶剤に溶解したものであり、前記保護剤ポリマー水溶液がアルギン酸塩水溶液である構成としている。更に請求項１０の発明は、請求項１０におけるポリ−ε−カプロラクトンの平均分子量が１０，０００〜５００，０００であるものとしている。
【００１４】
一方、請求項１１の発明に係るサッチ分解菌内包マイクロカプセルの製造方法は、酸成分及び塩化カルシウムを含むキトサン水溶液からなる連続相に、サッチ分解菌を含むアルギン酸塩水溶液を分散相として滴下混合することにより、サッチ分解菌を内包したアルギン酸−キトサンゲルビーズを生成させたのち、ろ過・洗浄して得られたゲルビーズを凍結乾燥することを特徴としている。そして、この請求項１１のサッチ分解菌内包マイクロカプセルの製造方法において、請求項１２の発明はキトサン水溶液の粘度が１０ｍＰａ・ｓ以下である構成としている。
【発明の効果】
【００１５】
請求項１の発明に係るサッチ分解菌内包マイクロカプセルは、サッチ分解菌がマイクロカプセルに安定的に担持されており、芝生地に散布することで効率よく定着させることができると共に、日照、温度変化、降雨等の厳しい自然条件に晒されても内包されたサッチ分解菌は環境変化から保護され、加えてマイクロカプセルを形成している環境分解性ポリマーがサッチ分解菌の食餌となるためにサッチ分解菌の失活が抑制される。従って、該マイクロカプセルを散布した芝生地においては、長期にわたってサッチ分解菌が安定的に放出されて高いサッチ分解能力を持続的に発揮するから、サッチが厚く堆積して土中や芝草の根に対して空気や水が浸透しにくくなったり、散布した肥料や農薬がサッチに吸収されて効きにくくなったりすることがなく、また病原菌や害虫の繁殖や腐敗による有毒ガスの発生も防止され、もって芝草が長期間健全な状態に保持される上、マイクロカプセル自体は自然環境下で経時的に分解されて最終的に消失するから、該マイクロカプセルの散布によって芝生地及びその周辺に環境負荷を与えることもない。
【００１６】
請求項２の発明によれば、上記マイクロカプセルに内包するサッチ分解菌が、高いサッチ分解作用を発揮すると共に、マイクロカプセル内包状態で失活しにくく、且つ比較的に培養し易く安価に入手できるという利点がある。
【００１７】
請求項３の発明によれば、上記のサッチ分解菌内包マイクロカプセルの平均粒子径が特定範囲にあるため、芝生地に散布後、降雨や撒水によって流失しにくく、且つ芝草の植生状況や土壌状況を変化させることもない。
【００１８】
請求項４の発明に係るサッチ分解菌内包マイクロカプセルは、多孔質のマイクロカプセルの内腔部にサッチ分解菌を含む内水相が充満した構成であるため、該内腔部においてサッチ分解菌が環境変化の影響を受けずに盛んに増殖し、マイクロカプセル外への放出による減少分が常時確実に補充され、もって高いサッチ分解能力をより長期にわたって安定的に発揮できる上、高いマイクロカプセル回収率が得られる。
【００１９】
請求項５の発明によれば、上記の内腔部を有するマイクロカプセルの環境分解性ポリマーとして用いたポリ−ε−カプロラクトンが生分解性及び生体適合性に優れる上、サッチ分解菌との相性が特によく、サッチ分解菌が代謝ストレスを受けずに高活性を持続するから、より優れたサッチ分解能力が発揮されるという利点がある。
【００２０】
請求項６の発明に係るサッチ分解菌内包マイクロカプセルは、多孔質のマイクロカプセルがアルギン酸−キトサンゲルビーズからなり、該ゲルビーズの生分解性及び生体適合性がよいため、サッチ分解菌が代謝ストレスを受けずに高活性を持続でき、もって高いサッチ分解能力がより長期にわたって安定的に発揮される。
【００２１】
請求項７の発明に係る芝生地の保全方法によれば、上記のサッチ分解菌内包マイクロカプセルを芝生地に散布することから、長期にわたってサッチ分解菌が安定的に放出されて高いサッチ分解能力を持続的に発揮するから、サッチが厚く堆積して土中や芝草の根に対して空気や水が浸透しにくくなったり、散布した肥料や農薬がサッチに吸収されて効きにくくなったりすることがなく、また病原菌や害虫の繁殖や腐敗による有毒ガスの発生も防止され、もって芝草が長期間健全な状態に保持されると共に、散布された該マイクロカプセルによる環境負荷も生じない。
【００２２】
請求項８の発明に係るサッチ分解菌内包マイクロカプセルの製造方法によれば、環境分解性ポリマーからなる多孔質のマイクロカプセルの内腔部にサッチ分解菌を含む内水相が充満したマイクロカプセルとして、高いサッチ分解能力を長期にわたって安定的に発揮できるものを効率よく容易に量産できる。
【００２３】
請求項９の発明によれば、上記のカプセル内腔部にサッチ分解菌を含む内水相が充満したマイクロカプセルとして、該マイクロカプセルがポリ−ε−カプロラクトンを主体として構成され、高いサッチ分解能力をより長期にわたって安定的に発揮できるものが得られる。
【００２４】
請求項１０の発明によれば、上記のポリ−ε−カプロラクトンを主体として構成されるマイクロカプセルの内腔部にサッチ分解菌を含む内水相が充満したものをより確実に製出できるという利点がある。
【００２５】
請求項１１の発明によれば、アルギン酸−キトサンゲルビーズからなるサッチ分解菌内包マイクロカプセルを容易に製造できる。
【００２６】
請求項１２の発明によれば、サッチ分解菌を内包した上記アルギン酸−キトサンゲルビーズとして特に高品位のものを確実に製出できるという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】サッチ分解菌の培養時間と培地中制菌数及び培地中ｐＨとの関係を示し、（ａ）は培養１回目の相関特性図、（ｂ）は培養２回目の相関特性図である。
【図２】サッチ分解菌の活性評価試験における震とう時間とセルロース分解率の相関特性図である。
【図３】本発明の実施例１〜３で調製したサッチ分解菌内包マイクロカプセルとその断面を示す走査型電子顕微鏡写真図である。
【図４】本発明の実施例４におけるアルギン酸−キトサンゲルビーズの調製試験で得られたゲルビーズを示す走査型電子顕微鏡写真図である。
【図５】同実施例４で調製したサッチ分解菌内包アルギン酸−キトサンゲルビーズとその断面、ならびに前記調製試験で得られた菌なしアルギン酸−キトサンゲルビーズの断面を示す走査型電子顕微鏡写真図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明のサッチ分解菌内包マイクロカプセルは、環境分解性ポリマーからなる多孔質のマイクロカプセルにサッチ分解菌が内包されたものであり、芝生地に散布することにより、長期にわたってサッチ分解菌が安定的に放出されて高いサッチ分解能力を持続的に発揮する。従って、このサッチ分解菌内包マイクロカプセルを散布した芝生地では、サッチが厚く堆積して土中や芝草の根に対して空気や水が浸透しにくくなったり、散布した肥料や農薬がサッチに吸収されて効きにくくなったりすることがなく、また病原菌や害虫の繁殖や腐敗による有毒ガスの発生も防止される結果、芝草が健全な状態で長期間安定的に保持される。そして、マイクロカプセル自体は、これを構成する環境分解性ポリマーがサッチ分解菌の食餌となって該サッチ分解菌の失活防止に寄与する上、自然環境下で経時的に分解されて最終的に消失するから、散布した芝生地及びその周辺に環境負荷を与えることもない。
【００２９】
本発明で用いるサッチ分解菌としては、サッチ分解能力を備えるものであれば特に制約はないが、所謂枯草菌として知られるBacillus subtilis 属菌が好適である。すなわち、Bacillus subtilis 属菌は、サッチ分解能力が高く、且つマイクロカプセル内包状態で失活しにくいことに加え、比較的に培養し易く安価に入手できるという利点がある。
【００３０】
多孔質のマイクロカプセルを構成する環境分解性ポリマーとしては、土壌中で微生物によって水と二酸化炭素に分解される所謂生分解性ポリマーと共に、自然環境下で日光や水等によって経時的に分解する所謂崩壊性ポリマー成分を包含するが、サッチ分解菌の食餌とする上で生分解性ポリマーが好適である。この生分解性ポリマーは、製法的に化学合成系、天然物系、微生物系に分かれるが、そのいずれであってもよく、具体例としてポリカプロラクトン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリブチレンサクシネート、ポリエチレンサクシネートの如き脂肪族ポリエステル類、ポリビニルアルコール、ポリリン酸、ポリアミノ酸類、キトサン、キチン、セルロース、澱粉、酢酸セルロース、バクテリアセルロース、カードラン、プルランの如き多糖類、バイオポリエステル、これらの複合物等が挙げられる。
【００３１】
サッチ分解菌内包マイクロカプセルのサイズは、平均粒子径として１０〜３，０００μｍの範囲が好適であり、小さ過ぎては降雨や撒水によって流失し易く、逆に大き過ぎては芝草の植生状況や土壌状況を変化させる懸念がある。
【００３２】
多孔質のマイクロカプセルの形態には特に制約はないが、その好ましい具体例として、多孔質の肉部内に１つ又は複数の空洞状の内腔部を有し、その内腔部にサッチ分解菌を含む内水相が充満したコアーシェル形態と、皮張り状の表面を有して内部全体が荒目のスポンジ状をなし、そのスポンジ状の空隙部にサッチ分解菌を含む内水相が充満したゲルビーズ形態とが挙げられる。とりわけ、前者のコアーシェル形態では、その内腔部においてサッチ分解菌が環境変化の影響を受けずに盛んに増殖し、マイクロカプセル外への放出による減少分が常時確実に補充され、もって高いサッチ分解能力をより長期にわたって安定的に発揮でき、また高いマイクロカプセル回収率が得られるという利点がある。
【００３３】
上記前者のコアーシェル形態のマイクロカプセルを製造するには、まず環境分解性の壁材ポリマーを低沸点有機溶媒に溶解した有機相Ｏ中に、サッチ分解菌を含む環境分解性の保護剤ポリマー水溶液を添加混合することにより、該有機相Ｏ中に内水相Ｓとしてサッチ分解菌を含む保護剤ポリマー水溶液の液滴が分散したＳ／Ｏエマルションを調製する。そして、このＳ／Ｏエマルションを水相中に添加混合して所定時間の攪拌を行うことにより、外水相Ｗ中にＳ／Ｏエマルションの液滴が分散したＳ／Ｏ／Ｗエマルションを調製する。次に、加温又は／及び減圧による液中乾燥を行い、Ｓ／Ｏ／Ｗエマルションの有機相Ｏ中の有機溶媒を除去して壁材ポリマーをゲル化させることにより、環境分解性ポリマーからなる多孔質のマイクロカプセルの内腔部にサッチ分解菌を含む内水相Ｓが充満したマイクロカプセルを生成させる。
【００３４】
ここで、上記有機相Ｏの低沸点有機溶媒としては、加温又は／及び減圧による液中乾燥を行う上で沸点が８５℃以下の無極性溶剤が好ましく、例えばジクロロメタン（沸点４０℃）、クロロホルム（同６１℃）、酢酸エチル（同７７℃）、１．２−ジクロロエタン（同８３．５℃）等が好適なものとして挙げられ、これらは２種以上を併用してもよいが、ジクロロメタンを単独使用もしくは主体として他と併用することが推奨される。すなわち、ジクロロメタンは特に沸点が低いため、液中乾燥による壁材ポリマーのゲル化が効率よく進行すると共に、液中乾燥に要する温度・圧力条件が緩和されて消費エネルギーを少なくできるという利点がある。
【００３５】
上記有機相Ｏの壁材ポリマーに用いる環境分解性ポリマーは、特に制約されないが、ポリ−ε−カプロラクトンを主体とするものが特に推奨される。これは、ポリ−ε−カプロラクトンを壁材ポリマーとすることにより、回収率及び物理的強度に優れたマイクロカプセルを製出できることに加え、ポリ−ε−カプロラクトンとサッチ分解菌との相性が特によく、これを食餌としてサッチ分解菌の活性が高いレベルで持続するから、より優れたサッチ分解能力が発揮されることによる。なお、このポリ−ε−カプロラクトンとしては、平均分子量が１０，０００〜５００，０００であるものが好適である。
【００３６】
また、有機相Ｏ中には、内水相Ｓ添加によるＳ／Ｏエマルションの調製のために、適当なエマルション安定剤を配合しておくのがよい。このようなエマルション安定剤としては、ソルビタンモノオレエートの如きスパン系界面活性剤を始めとして、一般的にエマルション調製に用いる種々の界面活性剤、水溶性樹脂、水溶性多糖類等がある。
【００３７】
内水相Ｓに用いる環境分解性の保護剤ポリマーとしては、サッチ分解菌の活動及び増殖を妨げない水溶性ポリマーであればよく、例えばアルギン酸塩、κ−カラギーナン、キトサンの如き水溶性高分子多糖類やポリビニルアルコール等が挙げられるが、特にサッチ分解菌との相性の良さからアルギン酸ナトリウムの如きアルギン酸塩が推奨される。このアルギン酸ナトリウムを用いる場合の水溶液濃度は、０．５〜１０質量％程度とするのがよく、高過ぎてはＳ／Ｏエマルションの分散安定性が低下して凝集を生じ易くなる。なお、保護剤ポリマー水溶液中には、サッチ分解菌の栄養源として、ポリペプトン、イーストエキス、硫酸マグネシウム等を適宜配合できる。
【００３８】
有機相Ｏ中に内水相Ｓを添加混合してＳ／Ｏエマルションを調製する際には、サッチ分解菌を保護するために氷冷下で攪拌を行うことが推奨される。また、Ｓ／Ｏ／Ｗエマルションの外水相Ｗに用いる水相には、分散安定剤を含むことが望ましい。この分散安定剤としては、特に制約はなく、一般的にエマルション調製に使用されるものをいずれも使用できるが、高分子量のエマルション安定剤を用いることで優れたエマルション効果が得られる点から、ゼラチンが特に好適なものとして挙げられる。このゼラチンを使用する場合の外水相における濃度は０．１〜１０質量％程度が好適である。更に、液中乾燥後には、高分子量のゼラチンを低分子量へ分解し、調製したマイクロカプセルと外水相との濾過特性を向上させる目的で、パパインの如き蛋白質分解酵素を添加してもよい。
【００３９】
上記液中乾燥では有機相の低沸点有機溶媒を揮散除去するために、攪拌下で加温と減圧の一方もしくは両方を行うが、処理効率面より加温と減圧を同時に行うことが推奨される。その加温ではエマルションの液温を数時間をかけて段階的又は連続的に昇温してゆけばよいが、最高到達温度は低沸点有機溶媒の沸点より低い温度でよい。また減圧ではエマルションの液面が接する雰囲気の圧力を同様に数時間をかけて段階的又は連続的に減じてゆけばよいが、最高減圧は大気圧の数分の１程度まででよい。しかして、有機相の低沸点有機溶媒がジクロロメタンを主体とする場合、加温と減圧を同時に行う液中乾燥では最高到達温度は３０℃程度、最高減圧は４００ｈＰａ程度で済む。なお、この液中乾燥における攪拌速度は、５０〜５００ｒｐｍ程度とするのがよい。
【００４０】
一方、ゲルビーズ形態のマイクロカプセルとしては、特に制約されないが、アルギン酸−キトサンゲルビーズが、サッチ分解菌の担持性及び棲息適性に優れ、高いサッチ分解能力をより長期にわたって安定的に発揮できることに加え、ゲルビーズの調製が容易である点から推奨される。
【００４１】
このサッチ分解菌を内包したアルギン酸−キトサンゲルビーズからなる多孔質のマイクロカプセルを製造するには、キトサンを水に溶解させるための酸成分とアルギン酸のゲル化剤である塩化カルシウムとを含むキトサン水溶液からなる連続相に、サッチ分解菌を含むアルギン酸塩水溶液を分散相として滴下混合することにより、サッチ分解菌を内包したアルギン酸−キトサンゲルビーズを生成させたのち、ろ過・洗浄して得られるゲルビーズを凍結乾燥して回収すればよい。
【００４２】
この製造方法における上記連続相では、サッチ分解菌の活性を高めることと、アルギン酸とキトサンとの間の静電的相互作用による複合膜形成促進のために、水酸化ナトリウム等のアルカリ添加でｐＨを５〜５．５程度の弱酸性に調整することが望ましい。また、この連続相に分散相のサッチ分解菌を含むアルギン酸塩水溶液を滴下混合する際、サッチ分解菌を保護するのために液温を１〜２０℃適度の低温に設定することが望ましい。
【００４３】
なお、キトサンとしては、市販のキトサン水溶液を使用できるが、その粘度によって製出するアルギン酸−キトサンゲルビーズの性状に差異を生じる。因みに、キトサン水溶液の市販品として代表的な和光純薬工業社製の商品名キトサン５，キトサン５０，キトサン３００の３種では、その粘度及びｐＨが次のように異なっている。
粘度（ｍＰａ・ｓ） ｐＨ（10ｇ／ｌ水浸液，25℃）
キトサン５ ・・・・ ０〜10 ・・・・・・8.0〜10.0
キトサン５０ ・・・・ 10〜100 ・・・・・・7.0〜 9.0
キトサン３００・・・・ 100〜500 ・・・・・・6.0〜 8.0
しかして、これら３種のいずれのキトサンを用いてもアルギン酸−キトサンゲルビーズの調製は可能であるが、上記のアルカリ添加で連続相のｐＨを上げてゆくと、キトサン５０及びキトサン３００ではゲルビーズの生成と共に一部に凝集を生じ易いが、キトサン５ではｐＨ５．４まで上昇させても凝集を生じないという結果が得られている。従って、ｐＨを弱酸性に調整してサッチ分解菌の活性を高める上では、キトサン水溶液として粘度が１０ｍＰａ・ｓ以下のものを用いることが推奨される。
【実施例】
【００４４】
〔サッチ分解菌の培養〕
減菌処理した702 培地（蒸留水１００ｍｌに１ｇのポリペプトンと０．２ｇのYeast exract及び０．１ｇ のＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏを溶解、ＰＨ７．０）に、サッチ分解菌としてBacillus su-btilis ＮＢＲＣ１３７１９を添加し、インキュベーター内においてシェイカーで温度３０℃、攪拌速度１７０ｒｐｍの条件で所定日数の培養を行い、培養後の702 培地の液０．１ｍｌを採取して０．９重量％生理食塩水０．９ｍｌに混合し、その混合液の０．１ｍｌを採取して同様の生理食塩水０．９ｍｌに混合する操作を繰り返すことで702 培地を１億容積倍まで希釈し、この希釈液０．１ｍｌを802 寒天培地（蒸留水１００ｍｌに１ｇのポリペプトン、０．２ｇのYeast extract、０．１ｇ のＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2Ｏ、１．５ｇの寒天を溶解、ＰＨ７．０）に添加し、インキュベーターで３０℃にて静置し、１日、２日，３日後に形成したサッチ分解菌のコロニーをカウントして生菌数を計測すると共に、培地中のｐＨをｐＨメーターによって測定した。なお、この培養試験は、再現性を確認するために同一条件で２回行った。その結果、702 培地での培養時間（日数＝day ）と、１日〜３日の各カウント日における802 寒天培地中の生菌数（CFU/ml）及び培地中ｐＨとの関係は、１回目の試験では図１（ａ）、２回目の試験では図１（ｂ）に示す通りであった。
【００４５】
図１（ａ）（ｂ）で示すように、サッチ分解菌の生菌数は２〜３日の培養でピークに達し、培養時間が長くなるに伴って培地中ｐＨは上昇する傾向を示すが、やがてｐＨ９未満で略一定になることが確認された。
【００４６】
〔サッチ分解菌の活性評価〕
０．９重量％生理食塩水１０ｍｌにセルロース０．２５ｇを溶解させた試料液を試験管に収容して減菌処理し、その試料液中に前記培養試験（試験１回目の培養日数 日、寒天培地静置３日後）で得られたサッチ分解菌を湿潤重量で０．０９６７ｇ添加混合して試験管を密栓し、これを３０℃、１５０ｒｐｍで所定時間（０日、０．５日、１日、２日、３日、４日、５日 ）震とうさせたのち、混合液をろ過して回収したセルロースを凍結乾燥させ、その乾燥重量を測定した。そして、震とう０日と震とうｎ日後の乾燥重量の差をセルロースの重量減少量として、各震とう時間によるセルロース分解率を求めたところ、図２に示す結果が得られた。この図２より、震とう時間（日数）と共にセルロース分解率が上昇し、震とう４日でセルロース分解率５０％近くに達しており、このサッチ分解菌が高いサッチ分解能力を備えることが明らかである。
【００４７】
実施例１
＜Ｓ／Ｏエマルションの調製＞
５０ｍｌのジクロロメタンに平均分子量１０，０００のポリ−ε−カプロラクトン５ｇと０．１重量％のソルビタンモノオレエートを添加混合して有機相Ｏを調製する一方、１重量％アルギン酸ナトリウム水溶液（粘度８０〜１２０ｃｐ）にサッチ分解菌として前記の培養した Bacillus su-btilis ＮＢＲＣ１３７１９を湿潤重量で１ｇ添加混合して内水相Ｓを調製し、この内水相Ｓを前記有機相Ｏに添加して氷冷下でホモジナイザーによって攪拌速度６，０００ｒｐｍで１０分間の攪拌を行うことにより、Ｓ／Ｏエマルションを調製した。
【００４８】
＜Ｓ／Ｏ／Ｗエマルションの調製＞
給排気口及びウォータージャケットを備えた密閉式の攪拌槽内に外水相Ｗとして０．５重量％ゼラチン水溶液２００ｍｌを収容し、この攪拌槽内に前記の調製したＳ／Ｏエマルションの全量を添加し、水冷によって液温を１５℃に保持しつつ、攪拌速度１５０ｒｐｍで１０分間の攪拌を行うことにより、外水相Ｗ中にＳ／Ｏエマルションの液滴が分散したＳ／Ｏ／Ｗエマルションを調製した。
【００４９】
＜液中乾燥及びマイクロカプセル回収＞
前記の調製したＳ／Ｏ／Ｗエマルションについて、攪拌速度１５０ｒｐｍを維持しつつ、排気口からの真空吸引とウォータージャケットへの温水流通により、第一段では液温２５℃，雰囲気圧６００ｈＰａで２時間、第二段階では液温３０℃，雰囲気圧６００ｈＰａで３時間、第三段階では液温３０℃，雰囲気圧５００ｈＰａで４時間、第四段階では液温３０℃，雰囲気圧４００ｈＰａで５時間の四段階の液中乾燥処理を行ったのち、パパインを外水相に対して０．５ｇ／Ｌの割合で添加混合し、製出したサッチ分解菌内包マイクロカプセルをろ過分離し、蒸留水で洗浄して回収した。
【００５０】
実施例２，３
有機相Ｏのポリ−ε−カプロラクトンとして、実施例２では平均分子量４０，０００のものを、実施例３では平均分子量７０，０００〜１００，０００のものを、それぞれ５ｇ使用した以外は実施例１と同様にしてサッチ分解菌内包マイクロカプセルを調製して、回収した。
【００５１】
上記実施例１〜３におけるＳ／Ｏエマルション(S/O−ＥＭ）及びＷ／Ｓ／Ｏエマルション（W/S/O-ＥＭ）の液滴平均径、得られたマイクロカプセル（ＭＣ）の平均粒径と回収量及び回収率を、使用したポリ−ε−カプロラクトン（ＰＣＬ）の平均分子量と共に次の表１に示す。また、各実施例で得られたマイクロカプセルの全体及び断面の走査型電子顕微鏡写真図を図３に、それぞれ実施例番号に対応した番号（１）〜（３）として示す。なお、表１におけるエマルションの液滴平均径は実体顕微鏡写真から、同じくマイクロカプセルの平均粒子径は走査型電子顕微鏡写真から、それぞれ５０個のサンプルを実測して平均値を求めたものである。また、マイクロカプセルの回収率（％）は、（マイクロカプセル乾燥重量×１００）／（アルギン酸Ｎａ質量＋ポリ−ε−カプロラクトン質量＋ソルビタンモノオレエート質量）として算出した。
【００５２】
【表１】
【００５３】
表１で示すように、実施例１〜３のいずれにおいても８５％以上という高いマイクロカプセル回収率が得られている。また、実施例１〜３の対比より、有機相Ｏに用いたポリ−ε−カプロラクトンの平均分子量が大きいほど、Ｗ／Ｓ／Ｏエマルションの液滴平均径とマイクロカプセルの平均粒子径が大きくなるが、Ｓ／Ｏエマルションの液滴平均径とマイクロカプセル回収率についてはε−カプロラクトンの平均分子量による差異が殆どないことが判る。一方、図４の電子顕微鏡写真図から、実施例１〜３で得られたサッチ分解菌内包マイクロカプセルは、いずれも多孔質の肉部内に複数の空洞状の内腔部を有するコアーシェル形態であることが判る。
【００５４】
実施例４
＜アルギン酸−キトサンゲルビーズの調製試験＞
既述キトサンの規格による３種のキトサンをそれぞれ用い、ウォータージャケットを備えた密閉式の攪拌槽内で、４ｇ／Ｌ濃度のキトサン水溶液１５０ｍｌに０．１重量％相当の塩酸０．４１７ｇと０．０５Ｍ相当の塩化カルシウム０．８３３ｇを添加混合して連続相を調製すると共に、１Ｍ−水溶液ナトリウム水溶液を加えてｐＨ調整を行い、この連続相を水冷によって液温４℃に維持しつつ、分散相として１．８ｗ／ｖ％のアルギン酸ナトリウム水溶液（粘度５００〜６００ｃｐ）２０ｍｌをシリンジによって滴下し、１２０ｒｐｍで緩やかに３０分間攪拌してアルギン酸−キトサンゲルビーズを生成させたのち、ろ過・洗浄して得られるゲルビーズを凍結乾燥して回収した。
【００５５】
このゲルビーズの回収量及び回収率とゲルビーズ生成状況を、使用したキトサンの粘度及び連続相ｐＨと共に表２に示す。また、図４に、キトサン種と連続相ｐＨが異なる各調製条件で得られたゲルビーズの走査型電子顕微鏡写真図を示す。なお、回収率は、〔回収したゲルビーズ（凝集物を含む）の重量×１００〕／（アルギン酸Ｎａ質量＋キトサン質量）として算出した。なお、ゲルビーズ生成状況は次の５段階で評価した。
◎・・・最も良好な生成状況で、乾燥後の状態もよい。
○・・・良好なゲルビースが生成している。
△・・・ゲルビーズが生成するが、一部に凝集がみられる。
▲・・・ゲルビーズが生成するが、柔らかく脆い。
×・・・ゲルビーズが生成していない。
【００５６】
【表２】
【００５７】
図４の電子顕微鏡写真図で示すように、３種のキトサン用いて各々連続相のｐＨを２．２と５．４のいずれに設定した場合でもゲルビーズが生成している。また、表２で示すように、キトサン種及び連続相ｐＨの違いによるゲルビーズ回収量及び回収率の差は殆どない。しかるに、キトサン５０，３００を用いて水溶液ナトリウム水溶液による連続相のｐＨ調整を行った場合、ゲルビーズの生成と共に一部に凝集を生じている。これに対し、キトサン５を用いた場合では、連続相のｐＨを５．４まで上昇させても上記凝集を生じていない。この結果から、次のサッチ分解菌内包アルギン酸−キトサンゲルビーズの調製ではキトサン５を使用した。
【００５８】
＜サッチ分解菌内包アルギン酸−キトサンゲルビーズの調製＞
キトサンとしてキトサン５を用いると共に、分散相のアルギン酸ナトリウム水溶液にサッチ分解菌として前記の培養した Bacillus su-btilis ＮＢＲＣ１３７１９を湿潤重量で０．６５ｇ添加した以外は、前記アルギン酸−キトサンゲルビーズの調製試験と同様にしてサッチ分解菌内包アルギン酸−キトサンゲルビーズを調製した。
【００５９】
得られたサッチ分解菌内包ゲルビーズの回収量及び回収率を連続相ｐＨと共に表３に示す。また、図５に、連続相ｐＨが２．２及び５．４の場合の得られたサッチ分解菌内包ゲルビーズの走査型電子顕微鏡写真図（ａ）（ｂ）と、連続相ｐＨ２．２で得られたサッチ分解菌内包ゲルビーズの断面の走査型電子顕微鏡写真図（ｃ）と、前記調製試験でキトサン５を用いて連続相ｐＨ２．２の条件で調製した菌なしのゲルビーズの断面の走査型電子顕微鏡写真図（ｄ）を示す。なお、回収率は、〔回収したゲルビーズ（凝集物を含む）の重量×１００〕／（アルギン酸Ｎａ質量＋キトサン質量＋菌重量）として算出した。
【００６０】
【表３】
【００６１】
図５の電子顕微鏡写真から、調製したサッチ分解菌内包アルギン酸−キトサンゲルビーズは、皮張り状の表面を有して内部全体が荒目のスポンジ状をなし、そのスポンジ状の空隙部にサッチ分解菌を含む内水相が充満したゲルビーズ形態であることが判る。また、表２の結果から、サッチ分解菌内包ゲルビーズの回収率が菌なしゲルビーズの回収率（表１参照）よりも若干低下している。これは、分散相のアルギン酸ナトリウム水溶液がサッチ分解菌を含むことで、連続相に対する分散性が低下する傾向を示している。
【００６２】
参考例
既述キトサンの規格による３種のキトサンをそれぞれ用い、その１ｗ／ｗ％濃度のキトサン水溶液１０ｍｌに１ｖ／ｖ％相当の酢酸を添加混合して分散相を調製すると共に、ウォータージャケットを備えた密閉式の攪拌槽内に４ｗ／ｗ濃度のポリリン酸水溶液１００ｍｌを収容し、１Ｍ−水溶液ナトリウム水溶液を加えてｐＨ調整を行い、この連続相を水冷によって液温４℃に維持しつつ、前記分散相のキトサン水溶液をシリンジによって滴下し、１２０ｒｐｍで緩やかに３０分間攪拌してポリリン酸−キトサンゲルビーズを生成させたのち、ろ過・洗浄して得られるゲルビーズを凍結乾燥して回収した。
【００６３】
このゲルビーズの回収量及び回収率とゲルビーズ生成状況を、使用したキトサンの粘度及び連続相ｐＨと共に表４に示す。なお、回収率（％）は、〔回収したゲルビーズ（凝集物を含む）の重量×１００〕／（ポリリン酸質量＋キトサン質量）として算出した。また、ゲルビーズ生成状況は前記アルギン酸−キトサンゲルビーズの場合と同じ５段階で評価した。
【００６４】
【表４】
【００６５】
表４に示すように、キトサン５０，３００を用いて連続相のｐＨを５．４に調整した場合はゲルビーズが生成するが、キトサン５を用いた場合やキトサン５０，３００を用いても連続相のｐＨが未調整（ｐＨ２．２）である場合は良好なゲルビーズを生成できない。そこで、キトサン５０，３００を用いて連続相のｐＨを５．４に調整する条件で、分散相のキトサン水溶液にサッチ分解菌を添加混合し、前記同様にしてポリリン酸−キトサンゲルビーズを調製することを試みたが、連続相に分散相を分散させることが困難であり、良好なサッチ分解菌内包ゲルビーズを調製できなかった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、芝生地に堆積するサッチを分解除去するのに好適なサッチ分解菌内包マイクロカプセルと、このマイクロカプセルを用いた芝生地の保全方法、及び該マイクロカプセルの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に、ゴルフ場のグリーン、サッカーや野球、競馬等の競技場、庭園等の芝生地では、芝丈を揃えるために定期的に芝刈りを行うが、その際に発生する刈りかすが芝草の間に蓄積してサッチ（thatch) を生じる。このサッチは芝草の前記刈りかすや枯れた葉、茎、根等の堆積層であるが、その堆積が多くなると、土中や芝草の根に対して空気や水が浸透しにくくなると共に、散布した肥料や農薬がサッチに吸収されて効きにくくなり、また病原菌や害虫の繁殖や腐敗による有毒ガスの発生を招き易く、芝草の生育不良や枯死の要因になる。従って、芝生地を健全に保つための手入れとして、サッチの堆積が多くなる前に除去する必要がある。
【０００３】
従来、サッチの除去手段として、ゴルフ場や競技場等の広い芝生地ではバーチカルモアと称される自走式又は牽引式の機械のブレードによってサッチを掻き取る方法が採用され、また庭園等の狭い芝生地ではレーキや熊手を用いて人手でサッチを掻き出すのが普通である（非特許文献１）。しかるに、機械的作業と手作業のいずれにしても、サッチ除去作業には非常に手間が掛かる上、その作業で芝草を痛める懸念も多分にあった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】http://www.takii.co.jp/green/howto/howto5.html(2009/9/11) 「芝・緑化・緑肥｜芝生なんでも百科．タキイ種苗」
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、上述の事情に鑑みて、微生物を用いてサッチを分解・減容化する手段の可否について実験研究を重ねた結果、サッチ分解菌として高い活性を示す微生物が存在し、該微生物を一般的な培養手段によって容易に増殖でき、もって工業的規模での利用が充分に可能であることが判明した。しかるに、このようなサッチ分解菌を芝生地に直接に散布する方法では、日照、温度変化、降雨等の厳しい自然条件の影響を受けるため、該サッチ分解菌が芝生地に定着し難い上に短期間で失活し易く、安定したサッチ分解作用を長期にわたって発揮させることが困難であった。
【０００６】
そこで、本発明者らは、更なる実験研究の過程で、マイクロカプセルによる微生物の固定化に着目し、サッチ分解菌への応用について鋭意検討を重ねた。その結果、環境分解性ポリマーからなる多孔質のマイクロカプセルによれば、サッチ分解菌を安定的に担持させて芝生地に効率よく定着させることが可能であり、しかもサッチ分解菌を環境変化から保護できることに加え、マイクロカプセルの環境分解性ポリマーが食餌となるためにサッチ分解菌の失活が抑制され、散布した芝生地への環境負荷を与えることなく、その高いサッチ分解能力を長期間安定的に発揮させ得ることを見出し、本発明をなすに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
請求項１の発明に係るサッチ分解菌内包マイクロカプセルは、環境分解性ポリマーからなる多孔質のマイクロカプセルに、サッチ分解菌が内包されてなるものとしている。
【０００８】
そして、上記請求項１のサッチ分解菌内包マイクロカプセルの好適態様として、請求項２の発明はサッチ分解菌がBacillus subtilis属菌であること、請求項３の発明は平均粒子径が１０〜３，０００μｍの範囲にあること、をそれぞれ特定している。
【０００９】
また、請求項４の発明は、上記請求項１〜３のいずれかのサッチ分解菌内包マイクロカプセルにおいて、多孔質のマイクロカプセルが内腔部を有し、その内腔部にサッチ分解菌を含む内水相が充満してなる構成としている。そして、この請求項４のサッチ分解菌内包マイクロカプセルの好適態様として、請求項５の発明では多孔質のマイクロカプセルの環境分解性ポリマーがポリ−ε−カプロラクトンを主体とすることを特定している。
【００１０】
同じく請求項６の発明は、上記請求項１〜３のいずれかのサッチ分解菌内包マイクロカプセルにおいて、多孔質のマイクロカプセルがアルギン酸−キトサンゲルビーズからなる構成としている。
【００１１】
請求項７の発明に係る芝生地の保全方法は、上記１〜６の何れかに記載のサッチ分解菌内包マイクロカプセルを芝生地に散布することを特徴としている。
【００１２】
請求項８の発明に係るサッチ分解菌内包マイクロカプセルの製造方法は、環境分解性の壁材ポリマーが低沸点有機溶媒に溶解されてなる有機相中に、サッチ分解菌を含む環境分解性の保護剤ポリマー水溶液を添加混合することにより、該有機相中に内水相としてサッチ分解菌を含む保護剤ポリマー水溶液の液滴が分散したＳ／Ｏエマルションを調製したのち、このＳ／Ｏエマルションを水相中に添加混合して所定時間の攪拌を行うことにより、外水相中に前記Ｓ／Ｏエマルションの液滴が分散したＳ／Ｏ／Ｗエマルションを調製し、次いで有機相中の有機溶媒を加温又は／及び減圧による液中乾燥で除去して壁材ポリマーをゲル化させることにより、環境分解性ポリマーからなる多孔質のマイクロカプセルの内腔部にサッチ分解菌を含む内水相が充満したマイクロカプセルを生成させることを特徴としている。
【００１３】
そして、上記請求項８のサッチ分解菌内包マイクロカプセルにおいて、請求項９の発明は、有機相がポリ−ε−カプロラクトンを主体とする環境分解性ポリマーをジクロロメタンを主成分とする低沸点有機溶剤に溶解したものであり、前記保護剤ポリマー水溶液がアルギン酸塩水溶液である構成としている。更に請求項１０の発明は、請求項１０におけるポリ−ε−カプロラクトンの平均分子量が１０，０００〜５００，０００であるものとしている。
【００１４】
一方、請求項１１の発明に係るサッチ分解菌内包マイクロカプセルの製造方法は、酸成分及び塩化カルシウムを含むキトサン水溶液からなる連続相に、サッチ分解菌を含むアルギン酸塩水溶液を分散相として滴下混合することにより、サッチ分解菌を内包したアルギン酸−キトサンゲルビーズを生成させたのち、ろ過・洗浄して得られたゲルビーズを凍結乾燥することを特徴としている。そして、この請求項１１のサッチ分解菌内包マイクロカプセルの製造方法において、請求項１２の発明はキトサン水溶液の粘度が１０ｍＰａ・ｓ以下である構成としている。
【発明の効果】
【００１５】
請求項１の発明に係るサッチ分解菌内包マイクロカプセルは、サッチ分解菌がマイクロカプセルに安定的に担持されており、芝生地に散布することで効率よく定着させることができると共に、日照、温度変化、降雨等の厳しい自然条件に晒されても内包されたサッチ分解菌は環境変化から保護され、加えてマイクロカプセルを形成している環境分解性ポリマーがサッチ分解菌の食餌となるためにサッチ分解菌の失活が抑制される。従って、該マイクロカプセルを散布した芝生地においては、長期にわたってサッチ分解菌が安定的に放出されて高いサッチ分解能力を持続的に発揮するから、サッチが厚く堆積して土中や芝草の根に対して空気や水が浸透しにくくなったり、散布した肥料や農薬がサッチに吸収されて効きにくくなったりすることがなく、また病原菌や害虫の繁殖や腐敗による有毒ガスの発生も防止され、もって芝草が長期間健全な状態に保持される上、マイクロカプセル自体は自然環境下で経時的に分解されて最終的に消失するから、該マイクロカプセルの散布によって芝生地及びその周辺に環境負荷を与えることもない。
【００１６】
請求項２の発明によれば、上記マイクロカプセルに内包するサッチ分解菌が、高いサッチ分解作用を発揮すると共に、マイクロカプセル内包状態で失活しにくく、且つ比較的に培養し易く安価に入手できるという利点がある。
【００１７】
請求項３の発明によれば、上記のサッチ分解菌内包マイクロカプセルの平均粒子径が特定範囲にあるため、芝生地に散布後、降雨や撒水によって流失しにくく、且つ芝草の植生状況や土壌状況を変化させることもない。
【００１８】
請求項４の発明に係るサッチ分解菌内包マイクロカプセルは、多孔質のマイクロカプセルの内腔部にサッチ分解菌を含む内水相が充満した構成であるため、該内腔部においてサッチ分解菌が環境変化の影響を受けずに盛んに増殖し、マイクロカプセル外への放出による減少分が常時確実に補充され、もって高いサッチ分解能力をより長期にわたって安定的に発揮できる上、高いマイクロカプセル回収率が得られる。
【００１９】
請求項５の発明によれば、上記の内腔部を有するマイクロカプセルの環境分解性ポリマーとして用いたポリ−ε−カプロラクトンが生分解性及び生体適合性に優れる上、サッチ分解菌との相性が特によく、サッチ分解菌が代謝ストレスを受けずに高活性を持続するから、より優れたサッチ分解能力が発揮されるという利点がある。
【００２０】
請求項６の発明に係るサッチ分解菌内包マイクロカプセルは、多孔質のマイクロカプセルがアルギン酸−キトサンゲルビーズからなり、該ゲルビーズの生分解性及び生体適合性がよいため、サッチ分解菌が代謝ストレスを受けずに高活性を持続でき、もって高いサッチ分解能力がより長期にわたって安定的に発揮される。
【００２１】
請求項７の発明に係る芝生地の保全方法によれば、上記のサッチ分解菌内包マイクロカプセルを芝生地に散布することから、長期にわたってサッチ分解菌が安定的に放出されて高いサッチ分解能力を持続的に発揮するから、サッチが厚く堆積して土中や芝草の根に対して空気や水が浸透しにくくなったり、散布した肥料や農薬がサッチに吸収されて効きにくくなったりすることがなく、また病原菌や害虫の繁殖や腐敗による有毒ガスの発生も防止され、もって芝草が長期間健全な状態に保持されると共に、散布された該マイクロカプセルによる環境負荷も生じない。
【００２２】
請求項８の発明に係るサッチ分解菌内包マイクロカプセルの製造方法によれば、環境分解性ポリマーからなる多孔質のマイクロカプセルの内腔部にサッチ分解菌を含む内水相が充満したマイクロカプセルとして、高いサッチ分解能力を長期にわたって安定的に発揮できるものを効率よく容易に量産できる。
【００２３】
請求項９の発明によれば、上記のカプセル内腔部にサッチ分解菌を含む内水相が充満したマイクロカプセルとして、該マイクロカプセルがポリ−ε−カプロラクトンを主体として構成され、高いサッチ分解能力をより長期にわたって安定的に発揮できるものが得られる。
【００２４】
請求項１０の発明によれば、上記のポリ−ε−カプロラクトンを主体として構成されるマイクロカプセルの内腔部にサッチ分解菌を含む内水相が充満したものをより確実に製出できるという利点がある。
【００２５】
請求項１１の発明によれば、アルギン酸−キトサンゲルビーズからなるサッチ分解菌内包マイクロカプセルを容易に製造できる。
【００２６】
請求項１２の発明によれば、サッチ分解菌を内包した上記アルギン酸−キトサンゲルビーズとして特に高品位のものを確実に製出できるという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】サッチ分解菌の培養時間と培地中制菌数及び培地中ｐＨとの関係を示し、（ａ）は培養１回目の相関特性図、（ｂ）は培養２回目の相関特性図である。
【図２】サッチ分解菌の活性評価試験における震とう時間とセルロース分解率の相関特性図である。
【図３】本発明の実施例１〜３で調製したサッチ分解菌内包マイクロカプセルとその断面を示す走査型電子顕微鏡写真図である。
【図４】本発明の実施例４におけるアルギン酸−キトサンゲルビーズの調製試験で得られたゲルビーズを示す走査型電子顕微鏡写真図である。
【図５】同実施例４で調製したサッチ分解菌内包アルギン酸−キトサンゲルビーズとその断面、ならびに前記調製試験で得られた菌なしアルギン酸−キトサンゲルビーズの断面を示す走査型電子顕微鏡写真図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明のサッチ分解菌内包マイクロカプセルは、環境分解性ポリマーからなる多孔質のマイクロカプセルにサッチ分解菌が内包されたものであり、芝生地に散布することにより、長期にわたってサッチ分解菌が安定的に放出されて高いサッチ分解能力を持続的に発揮する。従って、このサッチ分解菌内包マイクロカプセルを散布した芝生地では、サッチが厚く堆積して土中や芝草の根に対して空気や水が浸透しにくくなったり、散布した肥料や農薬がサッチに吸収されて効きにくくなったりすることがなく、また病原菌や害虫の繁殖や腐敗による有毒ガスの発生も防止される結果、芝草が健全な状態で長期間安定的に保持される。そして、マイクロカプセル自体は、これを構成する環境分解性ポリマーがサッチ分解菌の食餌となって該サッチ分解菌の失活防止に寄与する上、自然環境下で経時的に分解されて最終的に消失するから、散布した芝生地及びその周辺に環境負荷を与えることもない。
【００２９】
本発明で用いるサッチ分解菌としては、サッチ分解能力を備えるものであれば特に制約はないが、所謂枯草菌として知られるBacillus subtilis 属菌が好適である。すなわち、Bacillus subtilis 属菌は、サッチ分解能力が高く、且つマイクロカプセル内包状態で失活しにくいことに加え、比較的に培養し易く安価に入手できるという利点がある。
【００３０】
多孔質のマイクロカプセルを構成する環境分解性ポリマーとしては、土壌中で微生物によって水と二酸化炭素に分解される所謂生分解性ポリマーと共に、自然環境下で日光や水等によって経時的に分解する所謂崩壊性ポリマー成分を包含するが、サッチ分解菌の食餌とする上で生分解性ポリマーが好適である。この生分解性ポリマーは、製法的に化学合成系、天然物系、微生物系に分かれるが、そのいずれであってもよく、具体例としてポリカプロラクトン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリブチレンサクシネート、ポリエチレンサクシネートの如き脂肪族ポリエステル類、ポリビニルアルコール、ポリリン酸、ポリアミノ酸類、キトサン、キチン、セルロース、澱粉、酢酸セルロース、バクテリアセルロース、カードラン、プルランの如き多糖類、バイオポリエステル、これらの複合物等が挙げられる。
【００３１】
サッチ分解菌内包マイクロカプセルのサイズは、平均粒子径として１０〜３，０００μｍの範囲が好適であり、小さ過ぎては降雨や撒水によって流失し易く、逆に大き過ぎては芝草の植生状況や土壌状況を変化させる懸念がある。
【００３２】
多孔質のマイクロカプセルの形態には特に制約はないが、その好ましい具体例として、多孔質の肉部内に１つ又は複数の空洞状の内腔部を有し、その内腔部にサッチ分解菌を含む内水相が充満したコアーシェル形態と、皮張り状の表面を有して内部全体が荒目のスポンジ状をなし、そのスポンジ状の空隙部にサッチ分解菌を含む内水相が充満したゲルビーズ形態とが挙げられる。とりわけ、前者のコアーシェル形態では、その内腔部においてサッチ分解菌が環境変化の影響を受けずに盛んに増殖し、マイクロカプセル外への放出による減少分が常時確実に補充され、もって高いサッチ分解能力をより長期にわたって安定的に発揮でき、また高いマイクロカプセル回収率が得られるという利点がある。
【００３３】
上記前者のコアーシェル形態のマイクロカプセルを製造するには、まず環境分解性の壁材ポリマーを低沸点有機溶媒に溶解した有機相Ｏ中に、サッチ分解菌を含む環境分解性の保護剤ポリマー水溶液を添加混合することにより、該有機相Ｏ中に内水相Ｓとしてサッチ分解菌を含む保護剤ポリマー水溶液の液滴が分散したＳ／Ｏエマルションを調製する。そして、このＳ／Ｏエマルションを水相中に添加混合して所定時間の攪拌を行うことにより、外水相Ｗ中にＳ／Ｏエマルションの液滴が分散したＳ／Ｏ／Ｗエマルションを調製する。次に、加温又は／及び減圧による液中乾燥を行い、Ｓ／Ｏ／Ｗエマルションの有機相Ｏ中の有機溶媒を除去して壁材ポリマーをゲル化させることにより、環境分解性ポリマーからなる多孔質のマイクロカプセルの内腔部にサッチ分解菌を含む内水相Ｓが充満したマイクロカプセルを生成させる。
【００３４】
ここで、上記有機相Ｏの低沸点有機溶媒としては、加温又は／及び減圧による液中乾燥を行う上で沸点が８５℃以下の無極性溶剤が好ましく、例えばジクロロメタン（沸点４０℃）、クロロホルム（同６１℃）、酢酸エチル（同７７℃）、１．２−ジクロロエタン（同８３．５℃）等が好適なものとして挙げられ、これらは２種以上を併用してもよいが、ジクロロメタンを単独使用もしくは主体として他と併用することが推奨される。すなわち、ジクロロメタンは特に沸点が低いため、液中乾燥による壁材ポリマーのゲル化が効率よく進行すると共に、液中乾燥に要する温度・圧力条件が緩和されて消費エネルギーを少なくできるという利点がある。
【００３５】
上記有機相Ｏの壁材ポリマーに用いる環境分解性ポリマーは、特に制約されないが、ポリ−ε−カプロラクトンを主体とするものが特に推奨される。これは、ポリ−ε−カプロラクトンを壁材ポリマーとすることにより、回収率及び物理的強度に優れたマイクロカプセルを製出できることに加え、ポリ−ε−カプロラクトンとサッチ分解菌との相性が特によく、これを食餌としてサッチ分解菌の活性が高いレベルで持続するから、より優れたサッチ分解能力が発揮されることによる。なお、このポリ−ε−カプロラクトンとしては、平均分子量が１０，０００〜５００，０００であるものが好適である。
【００３６】
また、有機相Ｏ中には、内水相Ｓ添加によるＳ／Ｏエマルションの調製のために、適当なエマルション安定剤を配合しておくのがよい。このようなエマルション安定剤としては、ソルビタンモノオレエートの如きスパン系界面活性剤を始めとして、一般的にエマルション調製に用いる種々の界面活性剤、水溶性樹脂、水溶性多糖類等がある。
【００３７】
内水相Ｓに用いる環境分解性の保護剤ポリマーとしては、サッチ分解菌の活動及び増殖を妨げない水溶性ポリマーであればよく、例えばアルギン酸塩、κ−カラギーナン、キトサンの如き水溶性高分子多糖類やポリビニルアルコール等が挙げられるが、特にサッチ分解菌との相性の良さからアルギン酸ナトリウムの如きアルギン酸塩が推奨される。このアルギン酸ナトリウムを用いる場合の水溶液濃度は、０．５〜１０質量％程度とするのがよく、高過ぎてはＳ／Ｏエマルションの分散安定性が低下して凝集を生じ易くなる。なお、保護剤ポリマー水溶液中には、サッチ分解菌の栄養源として、ポリペプトン、イーストエキス、硫酸マグネシウム等を適宜配合できる。
【００３８】
有機相Ｏ中に内水相Ｓを添加混合してＳ／Ｏエマルションを調製する際には、サッチ分解菌を保護するために氷冷下で攪拌を行うことが推奨される。また、Ｓ／Ｏ／Ｗエマルションの外水相Ｗに用いる水相には、分散安定剤を含むことが望ましい。この分散安定剤としては、特に制約はなく、一般的にエマルション調製に使用されるものをいずれも使用できるが、高分子量のエマルション安定剤を用いることで優れたエマルション効果が得られる点から、ゼラチンが特に好適なものとして挙げられる。このゼラチンを使用する場合の外水相における濃度は０．１〜１０質量％程度が好適である。更に、液中乾燥後には、高分子量のゼラチンを低分子量へ分解し、調製したマイクロカプセルと外水相との濾過特性を向上させる目的で、パパインの如き蛋白質分解酵素を添加してもよい。
【００３９】
上記液中乾燥では有機相の低沸点有機溶媒を揮散除去するために、攪拌下で加温と減圧の一方もしくは両方を行うが、処理効率面より加温と減圧を同時に行うことが推奨される。その加温ではエマルションの液温を数時間をかけて段階的又は連続的に昇温してゆけばよいが、最高到達温度は低沸点有機溶媒の沸点より低い温度でよい。また減圧ではエマルションの液面が接する雰囲気の圧力を同様に数時間をかけて段階的又は連続的に減じてゆけばよいが、最高減圧は大気圧の数分の１程度まででよい。しかして、有機相の低沸点有機溶媒がジクロロメタンを主体とする場合、加温と減圧を同時に行う液中乾燥では最高到達温度は３０℃程度、最高減圧は４００ｈＰａ程度で済む。なお、この液中乾燥における攪拌速度は、５０〜５００ｒｐｍ程度とするのがよい。
【００４０】
一方、ゲルビーズ形態のマイクロカプセルとしては、特に制約されないが、アルギン酸−キトサンゲルビーズが、サッチ分解菌の担持性及び棲息適性に優れ、高いサッチ分解能力をより長期にわたって安定的に発揮できることに加え、ゲルビーズの調製が容易である点から推奨される。
【００４１】
このサッチ分解菌を内包したアルギン酸−キトサンゲルビーズからなる多孔質のマイクロカプセルを製造するには、キトサンを水に溶解させるための酸成分とアルギン酸のゲル化剤である塩化カルシウムとを含むキトサン水溶液からなる連続相に、サッチ分解菌を含むアルギン酸塩水溶液を分散相として滴下混合することにより、サッチ分解菌を内包したアルギン酸−キトサンゲルビーズを生成させたのち、ろ過・洗浄して得られるゲルビーズを凍結乾燥して回収すればよい。
【００４２】
この製造方法における上記連続相では、サッチ分解菌の活性を高めることと、アルギン酸とキトサンとの間の静電的相互作用による複合膜形成促進のために、水酸化ナトリウム等のアルカリ添加でｐＨを５〜５．５程度の弱酸性に調整することが望ましい。また、この連続相に分散相のサッチ分解菌を含むアルギン酸塩水溶液を滴下混合する際、サッチ分解菌を保護するのために液温を１〜２０℃適度の低温に設定することが望ましい。
【００４３】
なお、キトサンとしては、市販のキトサン水溶液を使用できるが、その粘度によって製出するアルギン酸−キトサンゲルビーズの性状に差異を生じる。因みに、キトサン水溶液の市販品として代表的な和光純薬工業社製の商品名キトサン５，キトサン５０，キトサン３００の３種では、その粘度及びｐＨが次のように異なっている。
粘度（ｍＰａ・ｓ） ｐＨ（10ｇ／ｌ水浸液，25℃）
キトサン５ ・・・・ ０〜10 ・・・・・・8.0〜10.0
キトサン５０ ・・・・ 10〜100 ・・・・・・7.0〜 9.0
キトサン３００・・・・ 100〜500 ・・・・・・6.0〜 8.0
しかして、これら３種のいずれのキトサンを用いてもアルギン酸−キトサンゲルビーズの調製は可能であるが、上記のアルカリ添加で連続相のｐＨを上げてゆくと、キトサン５０及びキトサン３００ではゲルビーズの生成と共に一部に凝集を生じ易いが、キトサン５ではｐＨ５．４まで上昇させても凝集を生じないという結果が得られている。従って、ｐＨを弱酸性に調整してサッチ分解菌の活性を高める上では、キトサン水溶液として粘度が１０ｍＰａ・ｓ以下のものを用いることが推奨される。
【実施例】
【００４４】
〔サッチ分解菌の培養〕
減菌処理した702 培地（蒸留水１００ｍｌに１ｇのポリペプトンと０．２ｇのYeast exract及び０．１ｇ のＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏを溶解、ＰＨ７．０）に、サッチ分解菌としてBacillus su-btilis ＮＢＲＣ１３７１９を添加し、インキュベーター内においてシェイカーで温度３０℃、攪拌速度１７０ｒｐｍの条件で所定日数の培養を行い、培養後の702 培地の液０．１ｍｌを採取して０．９重量％生理食塩水０．９ｍｌに混合し、その混合液の０．１ｍｌを採取して同様の生理食塩水０．９ｍｌに混合する操作を繰り返すことで702 培地を１億容積倍まで希釈し、この希釈液０．１ｍｌを802 寒天培地（蒸留水１００ｍｌに１ｇのポリペプトン、０．２ｇのYeast extract、０．１ｇ のＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2Ｏ、１．５ｇの寒天を溶解、ＰＨ７．０）に添加し、インキュベーターで３０℃にて静置し、１日、２日，３日後に形成したサッチ分解菌のコロニーをカウントして生菌数を計測すると共に、培地中のｐＨをｐＨメーターによって測定した。なお、この培養試験は、再現性を確認するために同一条件で２回行った。その結果、702 培地での培養時間（日数＝day ）と、１日〜３日の各カウント日における802 寒天培地中の生菌数（CFU/ml）及び培地中ｐＨとの関係は、１回目の試験では図１（ａ）、２回目の試験では図１（ｂ）に示す通りであった。
【００４５】
図１（ａ）（ｂ）で示すように、サッチ分解菌の生菌数は２〜３日の培養でピークに達し、培養時間が長くなるに伴って培地中ｐＨは上昇する傾向を示すが、やがてｐＨ９未満で略一定になることが確認された。
【００４６】
〔サッチ分解菌の活性評価〕
０．９重量％生理食塩水１０ｍｌにセルロース０．２５ｇを溶解させた試料液を試験管に収容して減菌処理し、その試料液中に前記培養試験（試験１回目の培養日数 日、寒天培地静置３日後）で得られたサッチ分解菌を湿潤重量で０．０９６７ｇ添加混合して試験管を密栓し、これを３０℃、１５０ｒｐｍで所定時間（０日、０．５日、１日、２日、３日、４日、５日 ）震とうさせたのち、混合液をろ過して回収したセルロースを凍結乾燥させ、その乾燥重量を測定した。そして、震とう０日と震とうｎ日後の乾燥重量の差をセルロースの重量減少量として、各震とう時間によるセルロース分解率を求めたところ、図２に示す結果が得られた。この図２より、震とう時間（日数）と共にセルロース分解率が上昇し、震とう４日でセルロース分解率５０％近くに達しており、このサッチ分解菌が高いサッチ分解能力を備えることが明らかである。
【００４７】
実施例１
＜Ｓ／Ｏエマルションの調製＞
５０ｍｌのジクロロメタンに平均分子量１０，０００のポリ−ε−カプロラクトン５ｇと０．１重量％のソルビタンモノオレエートを添加混合して有機相Ｏを調製する一方、１重量％アルギン酸ナトリウム水溶液（粘度８０〜１２０ｃｐ）にサッチ分解菌として前記の培養した Bacillus su-btilis ＮＢＲＣ１３７１９を湿潤重量で１ｇ添加混合して内水相Ｓを調製し、この内水相Ｓを前記有機相Ｏに添加して氷冷下でホモジナイザーによって攪拌速度６，０００ｒｐｍで１０分間の攪拌を行うことにより、Ｓ／Ｏエマルションを調製した。
【００４８】
＜Ｓ／Ｏ／Ｗエマルションの調製＞
給排気口及びウォータージャケットを備えた密閉式の攪拌槽内に外水相Ｗとして０．５重量％ゼラチン水溶液２００ｍｌを収容し、この攪拌槽内に前記の調製したＳ／Ｏエマルションの全量を添加し、水冷によって液温を１５℃に保持しつつ、攪拌速度１５０ｒｐｍで１０分間の攪拌を行うことにより、外水相Ｗ中にＳ／Ｏエマルションの液滴が分散したＳ／Ｏ／Ｗエマルションを調製した。
【００４９】
＜液中乾燥及びマイクロカプセル回収＞
前記の調製したＳ／Ｏ／Ｗエマルションについて、攪拌速度１５０ｒｐｍを維持しつつ、排気口からの真空吸引とウォータージャケットへの温水流通により、第一段では液温２５℃，雰囲気圧６００ｈＰａで２時間、第二段階では液温３０℃，雰囲気圧６００ｈＰａで３時間、第三段階では液温３０℃，雰囲気圧５００ｈＰａで４時間、第四段階では液温３０℃，雰囲気圧４００ｈＰａで５時間の四段階の液中乾燥処理を行ったのち、パパインを外水相に対して０．５ｇ／Ｌの割合で添加混合し、製出したサッチ分解菌内包マイクロカプセルをろ過分離し、蒸留水で洗浄して回収した。
【００５０】
実施例２，３
有機相Ｏのポリ−ε−カプロラクトンとして、実施例２では平均分子量４０，０００のものを、実施例３では平均分子量７０，０００〜１００，０００のものを、それぞれ５ｇ使用した以外は実施例１と同様にしてサッチ分解菌内包マイクロカプセルを調製して、回収した。
【００５１】
上記実施例１〜３におけるＳ／Ｏエマルション(S/O−ＥＭ）及びＷ／Ｓ／Ｏエマルション（W/S/O-ＥＭ）の液滴平均径、得られたマイクロカプセル（ＭＣ）の平均粒径と回収量及び回収率を、使用したポリ−ε−カプロラクトン（ＰＣＬ）の平均分子量と共に次の表１に示す。また、各実施例で得られたマイクロカプセルの全体及び断面の走査型電子顕微鏡写真図を図３に、それぞれ実施例番号に対応した番号（１）〜（３）として示す。なお、表１におけるエマルションの液滴平均径は実体顕微鏡写真から、同じくマイクロカプセルの平均粒子径は走査型電子顕微鏡写真から、それぞれ５０個のサンプルを実測して平均値を求めたものである。また、マイクロカプセルの回収率（％）は、（マイクロカプセル乾燥重量×１００）／（アルギン酸Ｎａ質量＋ポリ−ε−カプロラクトン質量＋ソルビタンモノオレエート質量）として算出した。
【００５２】
【表１】
【００５３】
表１で示すように、実施例１〜３のいずれにおいても８５％以上という高いマイクロカプセル回収率が得られている。また、実施例１〜３の対比より、有機相Ｏに用いたポリ−ε−カプロラクトンの平均分子量が大きいほど、Ｗ／Ｓ／Ｏエマルションの液滴平均径とマイクロカプセルの平均粒子径が大きくなるが、Ｓ／Ｏエマルションの液滴平均径とマイクロカプセル回収率についてはε−カプロラクトンの平均分子量による差異が殆どないことが判る。一方、図４の電子顕微鏡写真図から、実施例１〜３で得られたサッチ分解菌内包マイクロカプセルは、いずれも多孔質の肉部内に複数の空洞状の内腔部を有するコアーシェル形態であることが判る。
【００５４】
実施例４
＜アルギン酸−キトサンゲルビーズの調製試験＞
既述キトサンの規格による３種のキトサンをそれぞれ用い、ウォータージャケットを備えた密閉式の攪拌槽内で、４ｇ／Ｌ濃度のキトサン水溶液１５０ｍｌに０．１重量％相当の塩酸０．４１７ｇと０．０５Ｍ相当の塩化カルシウム０．８３３ｇを添加混合して連続相を調製すると共に、１Ｍ−水溶液ナトリウム水溶液を加えてｐＨ調整を行い、この連続相を水冷によって液温４℃に維持しつつ、分散相として１．８ｗ／ｖ％のアルギン酸ナトリウム水溶液（粘度５００〜６００ｃｐ）２０ｍｌをシリンジによって滴下し、１２０ｒｐｍで緩やかに３０分間攪拌してアルギン酸−キトサンゲルビーズを生成させたのち、ろ過・洗浄して得られるゲルビーズを凍結乾燥して回収した。
【００５５】
このゲルビーズの回収量及び回収率とゲルビーズ生成状況を、使用したキトサンの粘度及び連続相ｐＨと共に表２に示す。また、図４に、キトサン種と連続相ｐＨが異なる各調製条件で得られたゲルビーズの走査型電子顕微鏡写真図を示す。なお、回収率は、〔回収したゲルビーズ（凝集物を含む）の重量×１００〕／（アルギン酸Ｎａ質量＋キトサン質量）として算出した。なお、ゲルビーズ生成状況は次の５段階で評価した。
◎・・・最も良好な生成状況で、乾燥後の状態もよい。
○・・・良好なゲルビースが生成している。
△・・・ゲルビーズが生成するが、一部に凝集がみられる。
▲・・・ゲルビーズが生成するが、柔らかく脆い。
×・・・ゲルビーズが生成していない。
【００５６】
【表２】
【００５７】
図４の電子顕微鏡写真図で示すように、３種のキトサン用いて各々連続相のｐＨを２．２と５．４のいずれに設定した場合でもゲルビーズが生成している。また、表２で示すように、キトサン種及び連続相ｐＨの違いによるゲルビーズ回収量及び回収率の差は殆どない。しかるに、キトサン５０，３００を用いて水溶液ナトリウム水溶液による連続相のｐＨ調整を行った場合、ゲルビーズの生成と共に一部に凝集を生じている。これに対し、キトサン５を用いた場合では、連続相のｐＨを５．４まで上昇させても上記凝集を生じていない。この結果から、次のサッチ分解菌内包アルギン酸−キトサンゲルビーズの調製ではキトサン５を使用した。
【００５８】
＜サッチ分解菌内包アルギン酸−キトサンゲルビーズの調製＞
キトサンとしてキトサン５を用いると共に、分散相のアルギン酸ナトリウム水溶液にサッチ分解菌として前記の培養した Bacillus su-btilis ＮＢＲＣ１３７１９を湿潤重量で０．６５ｇ添加した以外は、前記アルギン酸−キトサンゲルビーズの調製試験と同様にしてサッチ分解菌内包アルギン酸−キトサンゲルビーズを調製した。
【００５９】
得られたサッチ分解菌内包ゲルビーズの回収量及び回収率を連続相ｐＨと共に表３に示す。また、図５に、連続相ｐＨが２．２及び５．４の場合の得られたサッチ分解菌内包ゲルビーズの走査型電子顕微鏡写真図（ａ）（ｂ）と、連続相ｐＨ２．２で得られたサッチ分解菌内包ゲルビーズの断面の走査型電子顕微鏡写真図（ｃ）と、前記調製試験でキトサン５を用いて連続相ｐＨ２．２の条件で調製した菌なしのゲルビーズの断面の走査型電子顕微鏡写真図（ｄ）を示す。なお、回収率は、〔回収したゲルビーズ（凝集物を含む）の重量×１００〕／（アルギン酸Ｎａ質量＋キトサン質量＋菌重量）として算出した。
【００６０】
【表３】
【００６１】
図５の電子顕微鏡写真から、調製したサッチ分解菌内包アルギン酸−キトサンゲルビーズは、皮張り状の表面を有して内部全体が荒目のスポンジ状をなし、そのスポンジ状の空隙部にサッチ分解菌を含む内水相が充満したゲルビーズ形態であることが判る。また、表２の結果から、サッチ分解菌内包ゲルビーズの回収率が菌なしゲルビーズの回収率（表１参照）よりも若干低下している。これは、分散相のアルギン酸ナトリウム水溶液がサッチ分解菌を含むことで、連続相に対する分散性が低下する傾向を示している。
【００６２】
参考例
既述キトサンの規格による３種のキトサンをそれぞれ用い、その１ｗ／ｗ％濃度のキトサン水溶液１０ｍｌに１ｖ／ｖ％相当の酢酸を添加混合して分散相を調製すると共に、ウォータージャケットを備えた密閉式の攪拌槽内に４ｗ／ｗ濃度のポリリン酸水溶液１００ｍｌを収容し、１Ｍ−水溶液ナトリウム水溶液を加えてｐＨ調整を行い、この連続相を水冷によって液温４℃に維持しつつ、前記分散相のキトサン水溶液をシリンジによって滴下し、１２０ｒｐｍで緩やかに３０分間攪拌してポリリン酸−キトサンゲルビーズを生成させたのち、ろ過・洗浄して得られるゲルビーズを凍結乾燥して回収した。
【００６３】
このゲルビーズの回収量及び回収率とゲルビーズ生成状況を、使用したキトサンの粘度及び連続相ｐＨと共に表４に示す。なお、回収率（％）は、〔回収したゲルビーズ（凝集物を含む）の重量×１００〕／（ポリリン酸質量＋キトサン質量）として算出した。また、ゲルビーズ生成状況は前記アルギン酸−キトサンゲルビーズの場合と同じ５段階で評価した。
【００６４】
【表４】
【００６５】
表４に示すように、キトサン５０，３００を用いて連続相のｐＨを５．４に調整した場合はゲルビーズが生成するが、キトサン５を用いた場合やキトサン５０，３００を用いても連続相のｐＨが未調整（ｐＨ２．２）である場合は良好なゲルビーズを生成できない。そこで、キトサン５０，３００を用いて連続相のｐＨを５．４に調整する条件で、分散相のキトサン水溶液にサッチ分解菌を添加混合し、前記同様にしてポリリン酸−キトサンゲルビーズを調製することを試みたが、連続相に分散相を分散させることが困難であり、良好なサッチ分解菌内包ゲルビーズを調製できなかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
環境分解性ポリマーからなる多孔質のマイクロカプセルに、サッチ分解菌が内包されてなるサッチ分解菌内包マイクロカプセル。
【請求項２】
サッチ分解菌がBacillus subtilis属菌である請求項１に記載のサッチ分解菌内包マイクロカプセル。
【請求項３】
平均粒子径が１０〜３，０００μｍの範囲にある請求項１又は２に記載のサッチ分解菌内包マイクロカプセル。
【請求項４】
前記多孔質のマイクロカプセルが内腔部を有し、その内腔部にサッチ分解菌を含む内水相が充満してなる請求項１〜３の何れかに記載のサッチ分解菌内包マイクロカプセル。
【請求項５】
前記多孔質のマイクロカプセルの環境分解性ポリマーがポリ−ε−カプロラクトンを主体とする請求項４に記載のサッチ分解菌内包マイクロカプセル。
【請求項６】
前記多孔質のマイクロカプセルがアルギン酸−キトサンゲルビーズからなる請求項１〜３の何れかに記載のサッチ分解菌内包マイクロカプセル。
【請求項７】
前記請求項１〜６の何れかに記載のサッチ分解菌内包マイクロカプセルを芝生地に散布することを特徴とする芝生地の保全方法。
【請求項８】
環境分解性の壁材ポリマーが低沸点有機溶媒に溶解されてなる有機相中に、サッチ分解菌を含む環境分解性の保護剤ポリマー水溶液を添加混合することにより、該有機相中に内水相としてサッチ分解菌を含む保護剤ポリマー水溶液の液滴が分散したＳ／Ｏエマルションを調製したのち、このＳ／Ｏエマルションを水相中に添加混合して所定時間の攪拌を行うことにより、外水相中に前記Ｓ／Ｏエマルションの液滴が分散したＳ／Ｏ／Ｗエマルションを調製し、次いで有機相中の有機溶媒を加温又は／及び減圧による液中乾燥で除去して壁材ポリマーをゲル化させることにより、環境分解性ポリマーからなる多孔質のマイクロカプセルの内腔部にサッチ分解菌を含む内水相が充満したマイクロカプセルを生成させることを特徴とするサッチ分解菌内包マイクロカプセルの製造方法。
【請求項９】
前記有機相がポリ−ε−カプロラクトンを主体とする環境分解性ポリマーをジクロロメタンを主成分とする低沸点有機溶剤に溶解したものであり、前記保護剤ポリマー水溶液がアルギン酸塩水溶液である請求項８に記載のサッチ分解菌内包マイクロカプセルの製造方法。
【請求項１０】
前記ポリ−ε−カプロラクトンの平均分子量が１０，０００〜５００，０００である請求項９に記載のサッチ分解菌内包マイクロカプセルの製造方法。
【請求項１１】
酸成分及び塩化カルシウムを含むキトサン水溶液からなる連続相に、サッチ分解菌を含むアルギン酸塩水溶液を分散相として滴下混合することにより、サッチ分解菌を内包したアルギン酸−キトサンゲルビーズを生成させたのち、ろ過・洗浄して得られたゲルビーズを凍結乾燥することを特徴とするサッチ分解菌内包マイクロカプセルの製造方法。
【請求項１２】
前記キトサン水溶液の粘度が１０ｍＰａ・ｓ以下である請求項１１に記載のサッチ分解菌内包マイクロカプセルの製造方法。
【請求項１】
環境分解性ポリマーからなる多孔質のマイクロカプセルに、サッチ分解菌が内包されてなるサッチ分解菌内包マイクロカプセル。
【請求項２】
サッチ分解菌がBacillus subtilis属菌である請求項１に記載のサッチ分解菌内包マイクロカプセル。
【請求項３】
平均粒子径が１０〜３，０００μｍの範囲にある請求項１又は２に記載のサッチ分解菌内包マイクロカプセル。
【請求項４】
前記多孔質のマイクロカプセルが内腔部を有し、その内腔部にサッチ分解菌を含む内水相が充満してなる請求項１〜３の何れかに記載のサッチ分解菌内包マイクロカプセル。
【請求項５】
前記多孔質のマイクロカプセルの環境分解性ポリマーがポリ−ε−カプロラクトンを主体とする請求項４に記載のサッチ分解菌内包マイクロカプセル。
【請求項６】
前記多孔質のマイクロカプセルがアルギン酸−キトサンゲルビーズからなる請求項１〜３の何れかに記載のサッチ分解菌内包マイクロカプセル。
【請求項７】
前記請求項１〜６の何れかに記載のサッチ分解菌内包マイクロカプセルを芝生地に散布することを特徴とする芝生地の保全方法。
【請求項８】
環境分解性の壁材ポリマーが低沸点有機溶媒に溶解されてなる有機相中に、サッチ分解菌を含む環境分解性の保護剤ポリマー水溶液を添加混合することにより、該有機相中に内水相としてサッチ分解菌を含む保護剤ポリマー水溶液の液滴が分散したＳ／Ｏエマルションを調製したのち、このＳ／Ｏエマルションを水相中に添加混合して所定時間の攪拌を行うことにより、外水相中に前記Ｓ／Ｏエマルションの液滴が分散したＳ／Ｏ／Ｗエマルションを調製し、次いで有機相中の有機溶媒を加温又は／及び減圧による液中乾燥で除去して壁材ポリマーをゲル化させることにより、環境分解性ポリマーからなる多孔質のマイクロカプセルの内腔部にサッチ分解菌を含む内水相が充満したマイクロカプセルを生成させることを特徴とするサッチ分解菌内包マイクロカプセルの製造方法。
【請求項９】
前記有機相がポリ−ε−カプロラクトンを主体とする環境分解性ポリマーをジクロロメタンを主成分とする低沸点有機溶剤に溶解したものであり、前記保護剤ポリマー水溶液がアルギン酸塩水溶液である請求項８に記載のサッチ分解菌内包マイクロカプセルの製造方法。
【請求項１０】
前記ポリ−ε−カプロラクトンの平均分子量が１０，０００〜５００，０００である請求項９に記載のサッチ分解菌内包マイクロカプセルの製造方法。
【請求項１１】
酸成分及び塩化カルシウムを含むキトサン水溶液からなる連続相に、サッチ分解菌を含むアルギン酸塩水溶液を分散相として滴下混合することにより、サッチ分解菌を内包したアルギン酸−キトサンゲルビーズを生成させたのち、ろ過・洗浄して得られたゲルビーズを凍結乾燥することを特徴とするサッチ分解菌内包マイクロカプセルの製造方法。
【請求項１２】
前記キトサン水溶液の粘度が１０ｍＰａ・ｓ以下である請求項１１に記載のサッチ分解菌内包マイクロカプセルの製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１１−８３２２２（Ｐ２０１１−８３２２２Ａ）
【公開日】平成２３年４月２８日（２０１１．４．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２３７９８４（Ｐ２００９−２３７９８４）
【出願日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【出願人】（５０４２５８５２７）国立大学法人 鹿児島大学 (284)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年４月２８日（２０１１．４．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【出願人】（５０４２５８５２７）国立大学法人 鹿児島大学 (284)
【Ｆターム（参考）】
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