サンプル中の抗原応答性細胞の検出
本発明は、抗原−主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）などの多元標識付け抗原提示化合物を用いてサンプル中の抗原応答性細胞を検出するための方法に関する。さらに、本発明は、血液サンプルなどの好ましくは単一のサンプルであるサンプル中の抗原応答性細胞を検出するための、抗原−主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）などの本多元標識付け抗原提示化合物の使用に関する。本方法は、Ｔ細胞およびＢ細胞などの特異性抗原応答性細胞の高スループット分析を可能にし、これにより、たとえば、疾患または病状のモニタ、および免疫療法薬、ワクチン、または同定エピトープもしくは免疫原性アミノ酸配列の開発のための高スループットの方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
説明
本発明は、主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）などの多元標識付け抗原提示化合物を用いてサンプル中の抗原応答性細胞を検出するための方法に関する。さらに、本発明は、サンプル、血液サンプルなどの好ましくは単一のサンプルであるサンプル中の抗原応答性細胞を検出するための、抗原−主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）などの本多元標識付け抗原提示化合物の使用に関する。本方法は、Ｔ細胞およびＢ細胞などの特異性抗原応答性細胞の高スループット分析を可能にし、それにより、たとえば、疾患または病状のモニタ、および免疫療法薬、ワクチンまたは同定エピトープもしくは免疫原性アミノ酸配列の開発のための高スループットの方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ細胞およびＢ細胞などの抗原応答性細胞は、とりわけ、クローン特異性Ｔ細胞レセプタ（ＴＣＲ）を用いて疾患特異性ペプチド−主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）の存在をモニタすることにより、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を認識することができる。ヒトＴ細胞の組合せプール上で発現される異なるＴＣＲのレパートリは広く、約２５００万と推定される（Arstila et al., 1999）。
【０００３】
疾患または病状のモニタおよび免疫療法薬またはワクチンの開発のためには、無関係な抗原応答性細胞、すなわち抗原特異性レセプタを備えない細胞の大きなプール内で、たとえば、クローン特異性Ｔ細胞レセプタ（ＴＣＲ）、ペプチド−ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体などの特異性抗原−ＭＨＣ（ａＭＨＣ）複合体を認識するが、Ｔ細胞およびＢ細胞などのそれらの特異性抗原応答性細胞のみを検出、同定、または単離することができることが必須である。
【０００４】
Altman et al., 1996によって初めて示されたように、フローサイトメトリによって抗原特異性Ｔ細胞を検出するのに、蛍光色素に結合される可溶性多量化（multimeric）ｐＭＨＣ複合体を用いることができる。これらの蛍光ＭＨＣマルチマーの使用は、研究および臨床モニタの両者でＴ細胞モニタの基礎となっている。
【０００５】
しかしながら、単一の生体サンプルについて数個の抗原特異性しか（しばしば１つしか）モニタできないことによって、抗原特異性Ｔ細胞の応答性検出のためのＭＨＣマルチマーフローサイトメトリの使用の主な限界が形成されている。この限界は、励起もしくは発光スペクトルのいずれかによって区別可能な、またはフローサイトメトリで検出可能な限られた数の「チャネル」、すなわち蛍光色素などの異なる標識によるものであり、これは一般的に入手可能な単一の末梢血サンプルなどの限られた量の生体材料内で分析可能なＴ細胞応答の数に対して厳しい限界を形成してしまう。
【０００６】
たとえば、生体材料を分析して、感染症または癌の際に起こり得るものなどの自然発生的免疫応答をモニタする。さらに、免疫応答に対するワクチンを含む免疫療法薬の効果について生体材料を分析する。本明細書中で用いられるような免疫療法薬は、ワクチン、非特異性免疫刺激物、免疫抑制剤、細胞に基づいた免疫療法薬、およびその組合せを含む、免疫応答を高めるまたは抑えることを目的とする医学的介入における活性成分として定義される。
【０００７】
新たな無機蛍光色素として最近量子ドット（Qdot）が開発され、かつフローサイトメトリ装置の複数パラメータ検出可能性が着実に大きくなっているにもかかわらず、ｐＭＨＣマルチマー染色による単一のサンプルで分析される異なるＴ細胞集団の最大数は４に留まっている（Chattopadhyay et al., 2006）。
【０００８】
いくつかのグループがいわゆるＭＨＣマイクロアレイを開発しようとしていることにより、抗原特異性Ｔ細胞応答のより包括的な分析を可能にする技術の開発の必要性が強調されている。これらの系では、Ｔ細胞特異性は蛍光色素によってエンコードされるのではなく、空間的にエンコードされる（Soen et al., 2003およびStone et al., 2005）。それらの有望さにもかかわらず、ＭＨＣマイクロアレイは広く採用されておらず、たとえばエピトープ同定などのＴ細胞応答の多量化測定においてその値が文書化された例を入手できない。
【０００９】
単一のサンプルに対して行なうことができる分析の数を増やす多数の設定において組合せコーディング（combinatorial coding）システムが用いられている。Qdotの分野での具体例は、遺伝子型決定を行なうQdotでコードされたマイクロビーズの使用によって形成される（Xu et al., 2003）。さらに、組合せコーディングは、エンコーディングがビーズの大きさ、蛍光色素、および蛍光色素の強度（たとえばＢＤサイトメトリックビーズアレイ）の変化によって行なわれる、ビーズアレイを用いたサイトカインなどの血清製品の測定に用いられてきた。すべてのこれらの例で、溶質は、予めエンコードされたマイクロビーズへの結合によって分析される。
【００１０】
以上を考慮すると、当該技術分野では、高スループットでの抗原特異性Ｔ細胞などの特異性抗原応答性細胞の検出、単離および／または同定を可能にする方法の必要性が残る。
【００１１】
さらに、利用可能なサンプルの量がしばしば限定されていることを考慮すると、当該技術分野では、単一のサンプル中のＴ細胞などの特異性抗原応答性細胞の複数の種の検出、単離および／または同定を可能にする方法の必要性が残る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、とりわけ、本発明の目的は、好ましくは高いスループットで、たとえば単一の末梢血サンプルである単一のサンプル中などの比較的少量の生体材料中の抗原特異性細胞の複数の種を検出するための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
とりわけ、この目的は、添付の請求項１に規定されるような方法によって満たされる。
具体的に、この目的は、（末梢血サンプルなどの生体材料の）サンプル中の抗原応答性細胞を検出するための方法であって、
少なくとも１つの標識を保持する抗原提示化合物に２つ以上の予め定められた抗原を負荷するなどして付与するステップを備え、各々の抗原は少なくとも２つの異なる標識で表わされ（エンコードされ）、さらに
抗原付与された当該抗原提示化合物を当該サンプルと接触させるステップと、
抗原負荷された当該抗原提示化合物の、当該抗原応答性細胞への結合を検出し、これにより当該抗原に応答する細胞を検出するステップとを備え、
当該抗原は、当該抗原を負荷された当該抗原提示化合物によって抗原応答性細胞に結合される当該少なくとも２つの異なる標識の存在を検出することによって検出される、方法によって満たされる。
【００１４】
本発明の好ましい実施形態に従うと、上記２つ以上の予め定められた抗原は、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、２５以上、２６以上、２７以上、および２８以上からなる群から選択される。
【００１５】
本発明は、抗原提示化合物の規定された組合せの結合によって形成される組合せコードの分析により組合せコーディングの概念を拡張する。
【００１６】
具体的に、本発明は、同じ標識を何度も用いて、蛍光色素などの標識の一意な組合せに各々連結される抗原提示化合物の使用により、単一のサンプル中で多数の抗原特異性細胞応答を同時に分析可能であるが、これは毎回蛍光色素などの１つ以上の他の標識との一意な組合せで行なわれるという発見に基づいている。
【００１７】
先行技術に対して、これは、アッセイに特異性のあるコードの新規な作製に係り；これは溶質よりもむしろ細胞の分析に係り；かつこれは抗原特異性細胞応答の並列分析のための組合せコーディングの使用に係る。
【００１８】
抗原特異性細胞の交差反応性が高いという広く持たれている見方にも拘らず、得られたデータは、組合せコーディングによる細胞の検出が実際的かつ現実的可能性であることを示している。組合せコーディングの値は、メラノーマ患者からの末梢血中のメラノーマ関連抗原特異性Ｔ細胞応答の解析により、本発明に従って例示される。
【００１９】
先行する研究は、両者ともが異なる蛍光色素に連結される、抗原特異性Ｔ細胞を含有する２つのＭＨＣマルチマーまたは関連のペプチドの結合による抗原特異性Ｔ細胞を検出すること、したがって単一のサンプル中の単一の抗原の検出、が実施可能であることを示している。ＭＨＣマルチマー二重染色法のこの技術を用いて、単一のペプチドエピトープ（の変異体）に特異性のあるＴ細胞の微細な特異性がわかった（Haanen et al., 1999）。
【００２０】
本発明に従うと、「抗原」という用語は、免疫系によって「異物」または「異種」と認識されるような免疫原性ペプチドまたはポリペプチドを示す。
【００２１】
本発明者は、そのような２色エンコードされたｐＭＨＣの大きなセットを、これらのｐＭＨＣのうち１つに特異性のあるＴ細胞を検出できることと干渉しない単一のサンプル内で組合せることができれば、そのような技術は古典的な単色エンコーディングで可能であるよりもはるかに多数のＴ細胞特異性をエンコードするのに利用可能であると考えられると企図した。
【００２２】
この設定では、特異性Ｔ細胞集団は、先行技術のｐＭＨＣマルチマー染色の場合のように単一の蛍光信号によって規定されることはもはやないであろうが、そのクローン特異性は、単独のまたは組合せた他の蛍光色素のいずれでもない、存在する２つの予め定められた蛍光色素の結合によって視覚化される。そのような組合せエンコーディングスキームのパワーは、利用可能な蛍光色素の数が増大するにつれてますます明らかになっている。
【００２３】
一例として、３つの蛍光色素をエンコードに用いることができる設定では、一重および二重コーディングシステムの両者ともを用いて３つの異なる識別を明らかにすることができる（単色エンコーディングの場合は「Ａ」、「Ｂ」および「Ｃ」、かつ２色エンコーディングの場合は「Ａ−Ｂ」、「Ａ−Ｃ」および「Ｂ−Ｃ」）；８つの蛍光色素をエンコードに用いる場合は、一重および二重コーディングシステムはそれぞれ８および２８の一意なコードを生じ得る；１７（単一のフローサイトメトリ分析に現在利用可能な異なる蛍光色素の最大数）の蛍光色素を用いる場合、一重コーディングシステムは１７の一意なコードを生じる一方で、二重コーディングシステムは１３６までの異なる識別を包含し得る。
【００２４】
本発明は二次元組合せコーディング、したがって単一の抗原をコーディングするための２つの蛍光色素を例示するが、４および５などの３以上の次数の組合せコーディングが同じ原則で働くので、利用可能な蛍光色素の数が増えるにつれて特に魅力的である。これを図示するため、１７の蛍光色素を利用する後者の例では、より高次のエンコーディングスキームにより、数千の一意な特異性のエンコーディングが可能になる。
【００２５】
単一のサンプルにおいて上記組合せエンコーディングを利用可能であるか否かを判定するための重要な要因の１つは、標識が複数回用いられ、複数の別々の抗原−抗原提示化合物にコンジュゲートされる場合に、複数の標識との交互作用によって抗原応答性細胞を測定できることである。別々の抗原−抗原提示化合物にコンジュゲートされる同じ標識の使用は、内在的に、抗原応答性細胞が別々の抗原−抗原提示化合物で標識付けられ、これにより以下の表１に与えられるものなどのコードによってその抗原応答性を明らかにしてしまう可能性を壊してしまい得る恐れが生じる。
【００２６】
Ｔ細胞の交差反応性が高いという広く持たれている見方とは反対に、本発明者らは、驚くべきことに、別々の抗原−抗原提示化合物にコンジュゲートされた同じ標識を複数回使用することにより確かに抗原応答性細胞の検出が可能になることを発見した。
【００２７】
単一のサンプルで上記組合せエンコーディングが利用可能であるか否かを判定する重要な要因の別の１つは、方法の弁別力、または換言すると、蛍光色素などの標識の各個別の組合せを別個に検出できることである。蛍光色素などの標識の使用は、内在的に、それよりも下では特異性検出が不可能であるバックグラウンド信号を与える。このことから、２つの標識を用いる場合、バックグラウンド信号は増大し、こうして検出限界になり、３つの標識などを用いる場合はさらに増大することが内在的にわかる。
【００２８】
本発明者らは、驚くべきことに、バックグラウンド（非特異性）信号の増大による予測される弁別力の低下とは反対に、蛍光色素などの２つ以上の標識を用いた複数の抗原のエンコーディングは、２標識抗原コーディングシステムではバックグラウンド信号を１０倍低減し、これによりシステムの感受性の実質的な増大が可能になることを発見した。システムのこの増大した感受性により、抗原の複数の検出、すなわち複数種の抗原応答性細胞の検出が可能性となり、これにより本発明に従う方法を提供する。
【００２９】
さらに、とりわけ、バックグラウンド信号の上記観察される低下、したがって増大した感受性により、抗原提示化合物非特異性結合によるアッセイの感受性に対する予測される好ましくない影響が大幅に低減され、これにより本発明に従う方法がさらに提供される。
【００３０】
本方法の好ましい実施形態に従うと、抗原提示化合物には１つの標識が付与され、抗原は、少なくとも２つの異なって標識付けされた抗原提示化合物によって表わされるかまたはエンコードされる。
【００３１】
換言すると、この好ましい実施形態に従うと、検出すべき各個別の抗原（またはエピトープ）は、異なる蛍光発光蛍光色素などの異なって検出可能な標識を各々が有する少なくとも２つの抗原提示化合物に負荷される。
【００３２】
本方法の別の好ましい実施形態に従うと、抗原提示化合物は、たとえばＭＨＣにコンジュゲートされるまたは共有結合される、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つなど少なくとも２つの異なる標識を付与され、抗原は１つの複数標識付け抗原提示化合物によって表わされる（またはエンコードされる）。
【００３３】
換言すると、この好ましい実施形態に従うと、検出すべき各個別の抗原（またはエピトープ）は、異なる蛍光発光蛍光色素などの少なくとも２つの異なる標識を付与された単一の抗原提示化合物に負荷される。
【００３４】
本発明に従う抗原は好ましくはペプチドである。このペプチドは、たとえばウイルスまたは腫瘍細胞などの既知の免疫原性エピトープを表わし、これによりたとえばこの抗原に応答する免疫細胞の存在の検出、およびその後のウイルス感染または癌の診断を可能にすることができる。
【００３５】
本ペプチドは未知のエピトープも表わすことができ、このエピトープに応答する細胞の検出は、このペプチド内の免疫原性アミノ酸配列の存在を示し、これにより、たとえばポリペプチドなどの免疫原性領域またはエピトープの同定を可能にする。
【００３６】
本発明に従う抗原提示化合物は、好ましくは、添付された標識または複数の標識に抗原をリンクする。Ｔ細胞の場合、本発明に従う抗原提示化合物は好ましくは主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）であり、好ましくは４以上の多量化主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）であることがより好ましい。たとえばＢ細胞の場合ではなくＴ細胞の場合、抗原提示化合物は好ましくは抗原と抗原応答性細胞との間の交互作用に強く寄与し、したがってこれを増大させる。
【００３７】
主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）の使用は、これらの化合物が自然に抗原提示可能であるからだけでなく、本方法で用いるのに本標識付け抗原提示化合物を与えるために、容易に利用可能な技術を利用可能であるからという理由で有利である（Rodenko et al., 2006）。
【００３８】
本発明に従う好ましい抗原応答性細胞はＴ細胞および／またはＢ細胞であり、より好ましくはＴ細胞である。
【００３９】
本発明に従う標識は好ましくは蛍光標識であり、より好ましくは、当該技術分野のようにQdotとして指定される蛍光標識である。
【００４０】
本方法の好ましい実施形態に従うと、単一のアッセイで用いられる異なる標識の数は、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、および８以上からなる群から選択される。
【００４１】
さらに別の好ましい実施形態に従うと、各個別の抗原は、少なくとも３つまたは少なくとも４つの異なる標識で表わされる。Qdotなどの３以上または４以上すらの標識を用いて単一の抗原をエンコードすることにより、単一の中で検出すべき潜在的抗原応答性細胞の数が劇的に増大する。これは、単一の抗原をエンコードするまたは表わすのに利用可能なチャネルまたは組合せの数を示す図１に例示されている。
【００４２】
単一の抗原をエンコードする単一の標識は、利用可能な標識の数と同数の種の抗原応答性細胞の弁別を可能にするであろう一方で、２つ、３つまたは４つの標識による同じ抗原のエンコーディングは検出可能な抗原を表わす細胞の種の数を劇的に増大させる。
【００４３】
本発明に従うと、本方法は好ましくは単一のサンプルにおいて行なわれ、サンプルは好ましくは血液サンプルである。
【００４４】
本明細書中で定義されるように、「血液サンプル」という用語は、個体から直接に得られた血液サンプルに限定されるだけではなく、直接に得られた血液サンプル由来のまたはそれらから発するサンプルにも限定される。ただしこれは、これらの由来サンプルが元々存在する抗原応答性細胞を依然として備えるという制限の下でである。
【００４５】
本方法の特に好ましい実施形態に従うと、抗原応答性細胞の検出はフローサイトメトリ分析を備える。
【００４６】
上記を考慮して、本発明は、別の局面で、サンプル中の抗原応答性細胞の検出のための、単一の抗原を表わす本少なくとも２つの標識の使用にも関する。
【００４７】
さらなる局面に従うと、本発明は、癌などの疾患または病状の診断のための本方法の使用に関する。
【００４８】
またさらなる局面に従うと、本発明は、免疫療法薬を開発するための本方法の使用に関する。
【００４９】
別の局面に従うと、本発明は、ワクチン開発のための本方法の使用に関する。
また別の局面に従うと、本発明は、ポリペプチド中のエピトープまたは免疫原性アミノ酸配列の同定のための本方法の使用に関する。この局面は、本発明に従う方法を用いて、未知のＨＬＡ−Ａ３関連Ｔ細胞抗原であるＱＬＲＡＬＤＧＧＮＫ，ＳＬＹＲＤＰＬＰＲ，ＨＡＹＩＱＳＬＬＫ，ＲＭＹＮＭＶＰＦＦおよびＧＴＹＥＧＬＬＲＲの同定に例示される。
【００５０】
したがって、本発明は、ＱＬＲＡＬＤＧＧＮＫ，ＳＬＹＲＤＰＬＰＲ，ＨＡＹＩＱＳＬＬＫ，ＲＭＹＮＭＶＰＦＦおよびＧＴＹＥＧＬＬＲＲからなる群から選択されるＨＬＡ−Ａ３関連Ｔ細胞抗原；免疫療法薬およびワクチンのモニタにおける本ＨＬＡ−Ａ３関連Ｔ細胞抗原またはその機能的誘導体の使用；ならびに、免疫療法薬およびワクチンの開発における本ＨＬＡ−Ａ３関連Ｔ細胞抗原またはその機能的誘導体の使用にも関する。
【００５１】
本発明の原則は、本発明の好ましい実施形態を示す実施例でさらに詳細に説明されるであろう。実施例では、以下の図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】一および二次元（左）または一−四次元（右）コーディングスキームにおける増大する数の蛍光色素を用いて行なうことができる一意な色組合せの理論的数を示す図である。
【図２】８つの蛍光色素の二次元マトリックスを用いて抗原をエンコードするのに使用可能な２８の一意な色組合せを示す図である。
【図３】２色エンコードされたｐＭＨＣマルチマーの使用によるバックグラウンド信号の低減を示し、灰色の棒は、ＣＭＶNLVエピトープ（「ＣＭＶ」）または対照ｐ＊ペプチド（バックグラウンド）のいずれかを含有するＭＨＣマルチマーの２５の異なる２色エンコードされた組合せで染色されたＰＢＭＣであり、黒の棒は、ＣＭＶNLVエピトープ（「ＣＭＶ」）または対照ｐ＊ペプチド（「バックグラウンド」）のいずれかを含有する８つの異なる単色エンコードされたＭＨＣマルチマー（ＰＥ、ＡＰＣ、Ｑ５６５、Ｑ５８５、Ｑ６０５、Ｑ６５５、Ｑ７０５およびＱ８００）で染色されたＰＶＭＣである、図である。
【図４】２色エンコードされたｐＭＨＣマルチマーで染色した後のｐＭＨＣ特異性Ｔ細胞の同定に用いられるゲーティングストラテジーの概略図である。
【図５】組合せコーディングによるウイルス特異性Ｔ細胞応答の多重検出を示し、ウイルス特異性Ｔ細胞応答は３人の健常なドナーのＰＢＭＣにおいて：Ｉ）各々が２色コードでエンコードされた２５の異なるｐＭＨＣマルチマーのミックスで１つのサンプルを染色することによって；ＩＩ）特異性２色コードに連結された２５のペプチドのうち１つを含有するｐＭＨＣマルチマーで２５の個別のサンプルを染色することによって；III）２５のペプチドのうち１つを含有する古典的なＰＥ標識付けＭＨＣマルチマーで２５の個別のサンプルを染色することによって；またＩＶ）各々が２色コードでエンコードされた無関係のｐＭＨＣマルチマーのミックスで１つのサンプルを染色することによって分析され：Ｉ−ＩＶは、′Ｉでの頻度＞０．０３％で検出された抗原特異性Ｔ細胞集団の点プロットであり、Ｖは、ＰＥ標識付けＭＨＣマルチマー染色（塗り潰し四角）によって；サンプル当たり２５の特異性を有する２色エンコードされたＭＨＣマルチマー（塗り潰し菱形）によって；サンプル当たり１つのｐＭＨＣ特異性を有する２色エンコードされたＭＨＣマルチマー（塗り潰し三角）によって；対照ペプチドで負荷された２色エンコードされたＭＨＣマルチマー（白抜き菱形）によって検出されるような、用いる２５のエピトープに対して向けられる抗原特異性ＣＤ８+Ｔ細胞の頻度をグラフで表わす（補足の表１）、図である。
【図６】組合せコーディングによるウイルス特異性Ｔ細胞応答の多重検出を示し、ウイルス特異性Ｔ細胞応答は３人の健常なドナーのＰＢＭＣにおいて：Ｉ）各々が２色コードでエンコードされた２５の異なるｐＭＨＣマルチマーのミックスで１つのサンプルを染色することによって；ＩＩ）特異性２色コードに連結された２５のペプチドのうち１つを含有するｐＭＨＣマルチマーで２５の個別のサンプルを染色することによって；III）２５のペプチドのうち１つを含有する古典的なＰＥ標識付けＭＨＣマルチマーで２５の個別のサンプルを染色することによって；またＩＶ）各々が２色コードでエンコードされた無関係のｐＭＨＣマルチマーのミックスで１つのサンプルを染色することによって分析され：Ｉ−ＩＶは、′Ｉでの頻度＞０．０３％で検出された抗原特異性Ｔ細胞集団の点プロットであり、Ｖは、ＰＥ標識付けＭＨＣマルチマー染色（塗り潰し四角）によって；サンプル当たり２５の特異性を有する２色エンコードされたＭＨＣマルチマー（塗り潰し菱形）によって；サンプル当たり１つのｐＭＨＣ特異性を有する２色エンコードされたＭＨＣマルチマー（塗り潰し三角）によって；対照ペプチドで負荷された２色エンコードされたＭＨＣマルチマー（白抜き菱形）によって検出されるような、用いる２５のエピトープに対して向けられる抗原特異性ＣＤ８+Ｔ細胞の頻度をグラフで表わす（補足の表１）、図である。
【図７】組合せコーディングによるウイルス特異性Ｔ細胞応答の多重検出を示し、ウイルス特異性Ｔ細胞応答は３人の健常なドナーのＰＢＭＣにおいて：Ｉ）各々が２色コードでエンコードされた２５の異なるｐＭＨＣマルチマーのミックスで１つのサンプルを染色することによって；ＩＩ）特異性２色コードに連結された２５のペプチドのうち１つを含有するｐＭＨＣマルチマーで２５の個別のサンプルを染色することによって；III）２５のペプチドのうち１つを含有する古典的なＰＥ標識付けＭＨＣマルチマーで２５の個別のサンプルを染色することによって；またＩＶ）各々が２色コードでエンコードされた無関係のｐＭＨＣマルチマーのミックスで１つのサンプルを染色することによって分析され：Ｉ−ＩＶは、′Ｉでの頻度＞０．０３％で検出された抗原特異性Ｔ細胞集団の点プロットであり、Ｖは、ＰＥ標識付けＭＨＣマルチマー染色（塗り潰し四角）によって；サンプル当たり２５の特異性を有する２色エンコードされたＭＨＣマルチマー（塗り潰し菱形）によって；サンプル当たり１つのｐＭＨＣ特異性を有する２色エンコードされたＭＨＣマルチマー（塗り潰し三角）によって；対照ペプチドで負荷された２色エンコードされたＭＨＣマルチマー（白抜き菱形）によって検出されるような、用いる２５のエピトープに対して向けられる抗原特異性ＣＤ８+Ｔ細胞の頻度をグラフで表わす（補足の表１）、図である。
【図８】異なるＴ細胞染色アプローチ間の相関を示し、古典的なＰＥ標識付けＭＨＣマルチマー染色（Ｘ軸）およびサンプル当たり２５の特異性を有する２色エンコードされたＭＨＣマルチマー染色（Ｙ軸）によって検出されるような抗原特異性Ｔ細胞頻度間の相関を示す、図である。
【図９】異なるＴ細胞染色アプローチ間の相関を示し、サンプル当たり１つのｐＭＨＣ特異性を有する２色エンコードされたＭＨＣマルチマー（Ｘ軸）およびサンプル当たり２５の特異性を有する２色エンコードされたＭＨＣマルチマー染色（Ｙ軸）によって検出されるような抗原特異性Ｔ細胞頻度間の相関を示す、図である。
【図１０】メラノーマ関連ペプチドに対するＴ細胞の応答を示し、ＨＬＡ−Ａ３−拘束性ウイルス由来Ｔ細胞エピトープ（ＥＶＢRLR、ＥＶＢRVR、ＦＬＵILR）、直接エクスビボ検出（塗り潰し三角）；２２のメラノーマ拘束性ペプチド、直接エクスビボ検出（塗り潰し四角）；またはＴ細胞強化およびインビトロ増殖後の２２のメラノーマ拘束性ペプチド（＊）に対して向けられた、メラノーマ患者および健常ドナーにおいて検出された抗原特異性Ｔ細胞応答の要約を示す、図である。
【図１１】組合せコーディングによって規定されるＭＨＣマルチマー応答性Ｔ細胞集団のペプチド特異性を確認する細胞内ＩＦＮγ染色を示し、ペプチド番号は表２の配列を参照する、図である。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
実施例
方法
ペプチド−ＭＨＣ複合体の生成
すべてのペプチドは標準的なFmoc化学を用いて社内で合成した、またはPepscanから購入した（オランダ、レリスタット、Pepscan Presto BV）。ＵＶに感受性のあるビルディングブロックＪを記載のように合成した（Toebes et al., 2006）。組換ＨＬＡ−Ａ１、−Ａ２、−Ａ３、および−Ｂ７重鎖およびヒトβ2ｍ軽鎖は大腸菌で生産した。ＭＨＣクラスＩリフォルディング反応は記載のように行なわれ（Garboczi et al., 1992）、かつＭＨＣクラスＩ複合体はＰＢＳにおけるゲルろ過ＨＰＬＣによって精製した（ｐＨ７．４）。
【００５４】
特異性ペプチド−ＨＬＡ複合体はＭＨＣペプチド交換によって生成した。ｐ＊ＨＬＡ複合体（１００μｇ／ｍＬ）を、示されたペプチド（２００μＭ）の存在下で１時間、３６６ｎｍのＵＶ光（Camag）に露光した。交換の後、サンプルを５分間１６，０００ｇでスピンし、上澄みをＭＨＣマルチマー形成に用いた。
【００５５】
ＭＨＣマルチマーの生成
ＭＨＣマルチマーは、ＳＡ−Qdot５６５、ＳＡ−Qdot５８５、ＳＡ−Qdot６０５、ＳＡ−Qdot６５５、ＳＡ−Qdot７０５、ＳＡ−Qdot８００、ＳＡ−フィコエレクチン（phycoerectin）（ＰＥ）およびＳＡ−アロフィコシアニン（ＡＰＣ）という８つの異なる蛍光ストレプトアビジン（ＳＡ）コンジュゲート（Invitrogen）を用いて生成した。ＭＨＣモノマー（濃度１００μｇ／ｍＬ）各１００μＬ毎に、７．０８μＬのＳＡ−Qdotコンジュゲート（１μＭ）、１０．８μＬのＳＡ−ＰＥ（１ｍｇ／ｍｌ）または６μＬのＳＡ−ＡＰＣ（１ｍｇ／ｍｌ）を加え、その後氷の上で２０分間インキュベートした。ＭＨＣペプチド交換後１００％救出されたと仮定すると、これはＳＡ−Qdot当たり３０個のＭＨＣモノマーの占有率という結果となるであろう。ビオチン（Sigma）およびＮａＮ3（Sigma）を、２６．４μＭおよび０．０２％の最終濃度にそれぞれ加え、その後氷の上で２０分間インキュベートした。ＰＥおよびＡＰＣ標識付け複合体を０．０２％のＮａＮ3でＰＢＳ中で２倍に希釈した。各ｐＭＨＣ複合体毎に、表１および表２のスキームに従って２つの異なる蛍光標識でマルチマーを作った。
【００５６】
組合せＴ細胞染色について、同じ特異性のマルチマー複合体は、Ｑ６０５、Ｑ６５５、Ｑ７０５、ＰＥおよびＡＰＣ標識付け複合体については１：１で、任意の他の色と組合せたＱ５６５、Ｑ５８５およびＱ８００標識付け複合体については２：１で混合した。Ｑ５６５、Ｑ５８５およびＱ８００の組合せは除外した。組合せコーディングによるＴ細胞応答の分析のための組合せｐＭＨＣ混合物はプーリングによって生成し、Ｔ細胞染色用の５０倍濃縮されたすぐに使える株として４℃で貯蔵した。使用前に、ＭＨＣマルチマーを２分間１７，０００ｇでスピンし、上澄みを使用した。
【００５７】
Ｔ細胞染色
約１×１０6のＰＢＭＣまたは２×１０5の培養されたＴ細胞のＴ細胞染色について、２μＬの単一のｐＭＨＣマルチマーまたは５０μＬの２色エンコードされたｐＭＨＣコレクション（collections）（最終濃度：初期モノマー濃度ベースで別々のｐＭＨＣ当たり２μｇ／ｍＬ）を用いた。最終染色容量は８０μｌであり、３７℃で１０分間細胞をインキュベートした。次に、ＣＤ８−Alexa７００（Caltech ＭＨＣＤ０２８９）（最終希釈１／２００）、ＣＤ４−ＦＩＴＣ（ＢＤ３４５７６８）（最終希釈１／８）、ＣＤ１４−ＦＩＴＣ（ＢＤ３４５７８４）（最終希釈１／３２）、ＣＤ１９−ＦＩＴＣ（ＢＤ３４５７７６）（最終希釈１／１６）、ＣＤ４０−ＦＩＴＣ（Serotech ＭＣＡ１５９０Ｆ）（最終希釈１／４０）、ＣＤ１６−ＦＩＴＣ（ＢＤ３４７５２３）（最終希釈１／６４）からなる５倍抗体ミックス２０μＬを加え、４℃で２０−３０分間細胞をインキュベートした。フローサイトメトリの前に細胞を２回洗浄し、死んだ細胞を排除できるようにヨウ化プロピジウムを加えた。
【００５８】
フローサイトメトリ
４８８ｎｍのレーザ：ＰＩ：６８５ＬＰ、６９５／４０；ＰＥ：５５０ＬＰ、５７５／２６；ＦＩＴＣ：５０５ＬＰ、５３０／３０；ＳＳＣ：４８８／１０．６３３ｎｍのレーザ：Alexa７００：６８５ＬＰ、７３０／４５；ＡＰＣ：６６０／２０．４０５ｎｍのレーザ：Qdot８００：７７０ＬＰ、８００／３０；Qdot７０５：６８０ＬＰ、７１０／５０；Qdot６５５：６３５ＬＰ、６６０／４０；Qdot６０５：５９５ＬＰ、６５０／１２．３５５ｎｍのレーザ：Qdot５８５：５７５ＬＰ、５８５／１５；Qdot５６５：５４５ＬＰ：５６０／２０という１１色器具設定を用いてFacsDivaソフトウェアでＬＳＲ−ＩＩフローサイトメータ（Becton Dickinson）に対してデータ取得を行なった。
【００５９】
各分析毎に約２００，０００個のリンパ球が記録された。抗原特異性Ｔ細胞を同定するため、以下のゲーティングストラテジーを用いた：１）（ＰＩ陰性、ＦＳＣ−Ｗ／Ｈロー、ＳＳＣ−Ｗ／Ｈロー、ＦＳＣ／ＳＳＣ−Ａを用いた）生きた単一細胞リンパ球の選択、２）ＣＤ８陽性および「ダンプ（dump）」（ＣＤ４、１４、１６、１９、４０）陰性細胞の選択、３）２つのＭＨＣマルチマーチャネルで陽性かつ６つの他のＭＨＣマルチマーチャネルで陰性のＣＤ８+Ｔ細胞の選択。
【００６０】
抗原特異性Ｔ細胞の強化
４℃で１時間、ＰＥ−マルチマーで抗原特異性Ｔ細胞を染色した（１０7のＰＢＭＣについて１．２５μＬの各個別のＰＥ−マルチマーの１００μｇ／ｍＬの株）。その後、細胞を洗浄し、２０μＬの抗ＰＥ Ａｂｓコーティングされた磁気ビーズ（Miltenyi）でインキュベートした。次に、ＬＳカラムを用いてかつ製造者のプロトコールに従って、ＭＡＣＳ（Miltenyi）によって細胞を単離した。溶出した細胞を洗浄し、５０００個の抗ＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズ（Invitrogen）を用いて、１０％のヒト血清（Invitrogen）、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２（Proleukin）、および２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５（Peprotech）で、２００μＬのＴ細胞媒質（ＩＭＤＭ（Gibco）中で再懸濁した。強化された細胞を９６ウェルプレートで培養し、翌日再懸濁した。培養物（cultures）を分け、少なくとも週に２回媒質を取換えた。２、３週間後、組合せコーディングに基づくＭＨＣマルチマーフローサイトメトリによって抗原特異性Ｔ細胞応答を測定した。
【００６１】
Ｔ細胞分類および培養物
関連のｐＭＨＣマルチマーでＴ細胞を染色し、次にMoFlo（Dako）またはFACSAria（Becton Dickinson）上で、１０5個の照射されたフィーダ細胞（JY plus同種ＰＢＭＣ）に分類した。細胞をスピンし、１０％のヒト血清、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２、および０．５μｇ／ｍＬのＰＨＡ（Biochrom AG）でＩＭＤＭ中に再懸濁した。隔週に培養物に再び刺激を与えた。ＭＨＣマルチマー染色により、抗原特異性について樹立された培養物をテストした。
【００６２】
サイトカイン放出アッセイ
示されたペプチドを１時間Ｔ２−Ａ３細胞に負荷し、これを１回洗浄した。次に、示された培養物からの１×１０5個のＴ細胞を、１０％のヒト血清およびタンパク質輸送抑制剤（BD GolgiPlug）を用いて、ＩＭＤＭ中で３７℃で４時間１×１０5個のＴ２−Ａ３細胞とともにインキュベートした。２５℃で１５分間、ＰＥコンジュゲートされた抗ＣＤ８ Ａｂ（ＳＫ１、ＢＤ）で細胞を染色し、固定しかつ透過処理し（BD Cytofix/Cytopermキット）、４℃で３０分間、ＡＰＣコンジュゲートされた抗ＩＦＮガンマＡｂ（２５７２３．１１、ＢＤ）で染色した。フローサイトメトリでサンプルを分析し（Cyan, Dako）、FlowJoを用いてデータ分析を行なった。
【実施例１】
【００６３】
対象の標的細胞に対する規定されたコードのアセンブリに基づく組合せエンコーディングスキームを開発する目的で、まず、抗原特異性Ｔ細胞応答の検出用の６つの異なる量子ドット（Qdot、図２に特性を列挙）のセットを用いる可能性を判定した。
【００６４】
量子ドットとは、多数の蛍光色素を同時に用いる実験によく適合する非常に狭い発光スペクトル（ＲＥＦ）を呈する直径および組成に基づいて別々の発光波長を有する蛍光ナノ結晶である。
【００６５】
末梢血ＣＭＶ特異性ＣＤ８+Ｔ細胞応答の分析により、ストレプトアビジンコンジュゲートされたQdot、または標準的なアロフィコシアニン（ＡＰＣ）、またはフィコエリトリン（ＰＥ）に連結することによってマルチマー化されたＭＨＣ複合体はすべて、抗原特異性Ｔ細胞集団を検出するのに利用可能であることが確立された（データ示されず）。
【００６６】
その後、同じ抗原性ペプチドを含有するが異なる蛍光色素に連結される２つのＭＨＣマルチマーを結合することによって抗原特異性Ｔ細胞集団も確実に同定可能かどうかテストした。異なる２つの蛍光色素のすべての２８の可能な組合せにコンジュゲートされたｐＭＨＣクラスＩ複合体のテストは、そのような二重エンコーディングがすべての場合において適切なＴ細胞集団を同定可能であることを実証した。
【００６７】
同じ抗原性ペプチドを含有する２つの異なって標識付けされたＭＨＣマルチマーで同時にＴ細胞を染色することにより、Ｔ細胞表面上の利用可能なＴＣＲの限られたセットに結合するための競合のために、各チャネル毎の蛍光強度に小さな低下が生じる（等モルで２倍）。抗原特異性Ｔ細胞集団を視覚化できることに対する競合の好ましくない影響を限定するため、フローサイトメトリックシステム（Ｑ５６５、Ｑ５８５およびＱ８００）において最も強度の低い信号を与えた３つのqDotを、他の蛍光色素に対して１：１の比率よりはむしろ２：１の比率で用い、その後の実験では、比率の調整が実際的でないことが明らかであるＱ５６５＋Ｑ５８５、Ｑ５６５＋Ｑ８００、およびＱ５８５＋Ｑ８００の組合せを用いなかった。
【００６８】
本実施例は、同じ抗原で負荷された異なって標識付けされた抗原提示化合物が抗原応答性細胞に結合することができ、それによりこれらの異なる標識の検出を通してサンプル中のこれらの細胞の検出が可能になることを示す。
【実施例２】
【００６９】
抗原特異性Ｔ細胞集団は非常に低頻度で存在し得、ＭＨＣマルチマーはフローサイトメトリにおいてバックグラウンド染色を確かに示す。組合せコードの使用により抗原特異性Ｔ細胞の検出がバックグラウンドレベルに影響するか否か、または検出される抗原特異性Ｔ細胞の頻度をテストするため、ＨＬＡ−Ａ２ ＣＭＶNLV特異性Ｔ細胞を含有するＰＢＭＣを、対照マルチマーでまたはＨＬＡ−Ａ２ ＣＭＶNLVマルチマーで染色し、フローサイトメトリで分析した。
【００７０】
具体的に、ＰＢＭＣは、８つの別個の染色において８つの異なる単一エンコードされたＭＨＣマルチマーで、または２５の別個の染色において２５の二重エンコードされたＭＨＣマルチマーのいずれかでインキュベートされた。（単色染色の場合）１つのチャネルでバックグラウンドより上に染色された場合、または（２色染色の場合）関連チャネルの両方で陽性の染色の場合、Ｔ細胞が陽性と考えられた。
【００７１】
図３に見られるように、バックグラウンドサンプル中の（偽陽性）細胞の頻度は、伝統的な単一染色アプローチと比較して二重エンコーディングスキームを用いた場合は約１０倍低く、ＭＨＣマルチマーの２色エンコーディングがバックグラウンド信号を低減するのに強力なツールであることを示す。
【実施例３】
【００７２】
２色エンコーディングの可能性を確立したので、次に、複数の２色エンコードされたｐＭＨＣマルチマー染色を単一のサンプルに対して並列に行なうことができるか否かを調べた。単一のサンプル中の２色エンコードされたｐＭＨＣマルチマーの任意のものと反応するＴ細胞を分析するため、ゲーティングストラテジーをまず開発した（図４）。
【００７３】
簡単に述べると、前方および側方散乱、細胞の幅／高さ、および陰性ヨウ化プロピジウム染色に基づいて、単一の生細胞を選択した。このプールから、ＣＤ８について陽性、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９およびＣＤ４０について陰性（「ダンプ」チャネル、van Oijen et al., 2004）に染色された細胞が関連のＣＤ８+Ｔ細胞としてさらに同定された。２色エンコードされたｐＭＨＣマルチマーの任意のものと反応する分析されたＴ細胞集団に対して、ＭＨＣマルチマー生成に用いた８つの個別の蛍光色素の各々に基づいてゲートが生成された。
【００７４】
２つのチャネルの所与の組合せにおけるバックグラウンドよりも上の信号を示し、残余の６つのチャネルにおいて陰性であるＴ細胞を同定するこのストラテジーは、バックグラウンド染色を同時に低減しながら、１回のフローサイトメトリ実験において２５の異なる組合せの同時分析を可能にする。
【実施例４】
【００７５】
Ｔ細胞応答の大規模分析において組合せコーディング技術の潜在値をテストするため、ＭＨＣペプチド交換（Toebes et al., 2006；Rodenko et al., 2006；Bakker et al., 2008）によってヒトＭＨＣ対立遺伝子ＨＬＡ−Ａ１、−Ａ２，−Ａ３および−Ｂ７（表１）のための、分かっているウイルスおよび癌関連のエピトープの範囲を含有する２５の異なるＭＨＣマルチマーのパネルを生成した。これらのｐＭＨＣマルチマーの各々はその後、表１に記載の一意なコードのセットを生成する２つの蛍光色素に連結された。
【００７６】
組合せコーディングによって得られたデータを従来のＭＨＣマルチマー分析と比較できるように、２５の異なるｐＭＨＣマルチマーのセットをＰＥにも連結した。さらに、組合せエンコーディングのバックグラウンドを判定するため、すべての２つの色組合せにおける無関係ｐＭＨＣマルチマーのセットも準備した。その後、１）ｐＭＨＣマルチマーを含有する２色エンコードされたウイルスおよび癌エピトープのコレクションでの１回の単一染色、２）２色エンコードされた無関係ｐＭＨＣマルチマーのミックスでの１回の単一染色、３）すべての２５のＰＥ標識付けｐＭＨＣマルチマーでの２５の別個の染色、または４）すべての個別の２色エンコードされたｐＭＨＣマルチマーでの２５の別個の染色によって、すべての４つのＨＬＡ対立遺伝子をカバーする３人の健常ドナーからのＰＢＭＣを次に分析した。
【００７７】
「１」および「４」の比較は特に関心がある。というのも、これは、同じ蛍光色素で標識付けされる大量の無関係のｐＭＨＣマルチマーの同時の存在、または高いｐＭＨＣ濃度の存在がバックグラウンド信号に影響するか否かを明らかにするからである。
【００７８】
実験は、ドナーのＨＬＡハプロタイプに対して、およびこれらのドナーにおける抗原特異性Ｔ細胞応答の先の分析に対しての両方について盲検法で行なわれた。これらのアプローチを用いた３人のドナーにおける疾患／病原体特異性Ｔ細胞応答の分析は、ｐＭＨＣマルチマーの組合せエンコーディングにより１つの単一のサンプルにおける多数の抗原特異性Ｔ細胞集団の視覚化が可能になることを明らかにした（図５−図７）。
【００７９】
重要なことに、多数の一連の個別のＰＥマルチマー染色によって分析した際に同じウイルス特異性Ｔ細胞集団が各ドナーに見つかった。さらに、別個のＰＥ連結ＭＨＣマルチマー染色と２５の二重コードされたＭＨＣマルチマーのコレクションを用いた多重染色との直接の比較により高頻度および低頻度のＴ細胞集団を両方調べると（図８）、抗原特異性Ｔ細胞集団を視覚化するための２つのアプローチの間に非常に高い相関が明らかになる。
【００８０】
さらに、２５の別個の染色で用いた２色エンコードされたｐＭＨＣマルチマーの同じセットに対する１つのサンプル中の２色エンコードされたｐＭＨＣマルチマーのコレクションで染色されたＰＢＭＣの分析によって得られたデータの比較も、非常に高い相関を明らかにする（図９）。
【００８１】
この後者の発見は、異なるペプチドを含有する多数のＭＨＣ複合体に同じ蛍光色素が連結された場合ですら、各ｐＭＨＣマルチマーが蛍光色素の別々の組合せに連結されるＭＨＣマルチマーのセットを用いたインキュベーションによる複数の抗原特異性の同時測定の可能性があることを示す。
【００８２】
このように、染色ミックス中の多くの無関係ｐＭＨＣ複合体のうち任意のものとのＴ細胞の潜在的な交差反応は問題ではないことが示される。さらに、これらの観察は、高濃度の多量化ＭＨＣ分子を含有する混合物を用いることがＭＨＣマルチマー染色に干渉しないことを示している。最終的に、疾患／病原体関連エピトープで占有された２色エンコードされたｐＭＨＣのセットを用いた場合に観察される信号を２５の無関係ＭＨＣマルチマーのコレクションを用いた場合に観察される信号と比較することにより、アプローチの感受性が高く、ＣＤ８陽性細胞の０．０３％程度に頻度の低いＴ細胞集団を同定可能であることが示される（図５−図７）。
【実施例５】
【００８３】
以上の実験は、単一のサンプル中の多数のＴ細胞集団を視覚化するのに企図される組合せコーディングアプローチを利用可能であることを実証したので、エピトープ同定におけるその潜在値を評価した。
【００８４】
潜在的ＨＬＡ−Ａ３関連メラノーマエピトープを同定するために設置される最新のスクリーンにおいて、ＨＬＡ−Ａ３について高い結合親和性を表示した４つの異なるメラノーマ関連タンパク質から２２のペプチドを同定した。このセットはすべての４つの以前に記載されたＨＬＡ−Ａ３関連のエピトープおよび１８の潜在的な新規のエピトープを含んだ。
【００８５】
（潜在的な）エピトープのセットに対する応答について小さな患者サンプルをスクリーニングする可能性を扱うため、すべての２２のエピトープならびに３つのＨＬＡ−Ａ３関連ＥＢＶ−およびインフルエンザＡ由来エピトープについて、ペプチド交換によってＭＨＣ試薬を生成した。低レベルのＴ細胞応答も明らかにできるように、可能な腫瘍関連エピトープを含有する２２のｐＭＨＣマルチマーを用いた単一のＭＡＣＳベースの強化ステップを行ない、その後短期の強化細胞のインビトロ増殖を行なった。
【００８６】
次に二次元組合せコーディングスキームにおいて２５の異なるｐＭＨＣマルチマーを２つの蛍光色素に連結し、２７のＨＬＡ−Ａ３陽性メラノーマ患者からの強化ＰＢＭＣをスクリーニングするのに用いた。
【００８７】
並列ＭＨＣマルチマー染色のこのアプローチを用いて、３つの前述のｇｐ１００関連エピトープに対して向けられたＴ細胞応答の存在を確認することができた。さらに、ヒトｇｐ１００（ＱＬＲＡＬＤＧＧＮＫ）由来の以前は未知のエピトープに対して、ノーダル（Nodal）（ＳＬＹＲＤＰＬＰＲおよびＨＡＹＩＱＳＬＬＫ）由来の以前は未知の２つのエピトープに対して、およびＴｙｒｐ２（ＲＭＹＮＭＶＰＦＦ）由来の以前は未知の１つのエピトープに対して、ＣＤ８+Ｔ細胞応答が観察された（表２）。
【００８８】
重要なことに、１０人の健常なＨＬＡ−Ａ３+ドナーからのＰＢＭＣを同じ態様で分析した場合、ドナーのいずれにも応答が観察されなかった一方で、ウイルスエピトープに対するＴ細胞応答は両方のグループで等しく豊富であった（図１０）。
【００８９】
観察されたＴ細胞集団が対応のペプチドを表示する標的細胞に対して機能的活性を示すか否かを判定するため、異なる患者からのＰＢＭＣから抗原特異性Ｔ細胞を分類し、インビトロで増殖した。次に、結果的に得られたＴ細胞集団を、ペプチドを負荷された標的細胞でのインキュベーション後に細胞内サイトカインアッセイを用いて抗原特異性についてテストした（図１１）。
【００９０】
すべての培養物は、それらの同源の抗原でインキュベートされるとＩＦＮガンマ発生を表示した（図１１）。ペプチドで負荷されなかった細胞でＴ細胞培養物がインキュベートされた場合、応答は観察されなかった。
【００９１】
これらの結果は、ＨＬＡ−Ａ３に対して高い結合親和性を有する前述のペプチドの一覧が、メラノーマ患者においてＴ細胞応答を観察可能な少なくとも８つのメラノーマ関連エピトープ、なおそのうち５つは前述されていないが、これを含有していることを示す。さらに、入手可能な患者材料に対して行なわれたスクリーンは、本発明に従う抗原特異性の多色エンコーディングによって与えられる多重分析の可能性なしには見込みがなかったであろう。
【００９２】
結論
本発明に従う組合せコーディング技術は、複数の免疫応答の同時検出および分析のための貴重なツールであることが実証される。
【００９３】
単一のサンプル内の多数の異なるＴ細胞集団の並列検出を可能にする組合せコーディングストラテジーが開発された。組合せコーディングによる末梢血からの抗原特異性Ｔ細胞の検出は、従来のＰＥ標識付けマルチマーを用いた検出と同程度に効率的であるが、結果的に大幅に増大した感受性をもたらし、最も重要なことには、患者材料に対して包括的なスクリーンを行なえることである。
【００９４】
メラノーマ患者の末梢血中の分かっているおよび潜在的なメラノーマ関連抗原に対するＴ細胞応答を分析することにより、患者材料の大規模スクリーニングの可能性が実証された。これらのスクリーンは、分かっているＴ細胞エピトープに対するＴ細胞応答の存在を確認し、ＨＬＡ−Ａ３の文脈で多数の新規なメラノーマ関連Ｔ細胞応答の同定をもたらした。
【００９５】
ペプチド−ＭＨＣコンジュゲートの組合せコーディングは、単一のサンプル中の抗原特異性Ｔ細胞免疫性の高スループット分析を可能にすると結論付けられる。
【００９６】
【表１】
【００９７】
【表２】
【００９８】
【表３】
【００９９】
【表４】
【技術分野】
【０００１】
説明
本発明は、主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）などの多元標識付け抗原提示化合物を用いてサンプル中の抗原応答性細胞を検出するための方法に関する。さらに、本発明は、サンプル、血液サンプルなどの好ましくは単一のサンプルであるサンプル中の抗原応答性細胞を検出するための、抗原−主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）などの本多元標識付け抗原提示化合物の使用に関する。本方法は、Ｔ細胞およびＢ細胞などの特異性抗原応答性細胞の高スループット分析を可能にし、それにより、たとえば、疾患または病状のモニタ、および免疫療法薬、ワクチンまたは同定エピトープもしくは免疫原性アミノ酸配列の開発のための高スループットの方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ細胞およびＢ細胞などの抗原応答性細胞は、とりわけ、クローン特異性Ｔ細胞レセプタ（ＴＣＲ）を用いて疾患特異性ペプチド−主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）の存在をモニタすることにより、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を認識することができる。ヒトＴ細胞の組合せプール上で発現される異なるＴＣＲのレパートリは広く、約２５００万と推定される（Arstila et al., 1999）。
【０００３】
疾患または病状のモニタおよび免疫療法薬またはワクチンの開発のためには、無関係な抗原応答性細胞、すなわち抗原特異性レセプタを備えない細胞の大きなプール内で、たとえば、クローン特異性Ｔ細胞レセプタ（ＴＣＲ）、ペプチド−ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体などの特異性抗原−ＭＨＣ（ａＭＨＣ）複合体を認識するが、Ｔ細胞およびＢ細胞などのそれらの特異性抗原応答性細胞のみを検出、同定、または単離することができることが必須である。
【０００４】
Altman et al., 1996によって初めて示されたように、フローサイトメトリによって抗原特異性Ｔ細胞を検出するのに、蛍光色素に結合される可溶性多量化（multimeric）ｐＭＨＣ複合体を用いることができる。これらの蛍光ＭＨＣマルチマーの使用は、研究および臨床モニタの両者でＴ細胞モニタの基礎となっている。
【０００５】
しかしながら、単一の生体サンプルについて数個の抗原特異性しか（しばしば１つしか）モニタできないことによって、抗原特異性Ｔ細胞の応答性検出のためのＭＨＣマルチマーフローサイトメトリの使用の主な限界が形成されている。この限界は、励起もしくは発光スペクトルのいずれかによって区別可能な、またはフローサイトメトリで検出可能な限られた数の「チャネル」、すなわち蛍光色素などの異なる標識によるものであり、これは一般的に入手可能な単一の末梢血サンプルなどの限られた量の生体材料内で分析可能なＴ細胞応答の数に対して厳しい限界を形成してしまう。
【０００６】
たとえば、生体材料を分析して、感染症または癌の際に起こり得るものなどの自然発生的免疫応答をモニタする。さらに、免疫応答に対するワクチンを含む免疫療法薬の効果について生体材料を分析する。本明細書中で用いられるような免疫療法薬は、ワクチン、非特異性免疫刺激物、免疫抑制剤、細胞に基づいた免疫療法薬、およびその組合せを含む、免疫応答を高めるまたは抑えることを目的とする医学的介入における活性成分として定義される。
【０００７】
新たな無機蛍光色素として最近量子ドット（Qdot）が開発され、かつフローサイトメトリ装置の複数パラメータ検出可能性が着実に大きくなっているにもかかわらず、ｐＭＨＣマルチマー染色による単一のサンプルで分析される異なるＴ細胞集団の最大数は４に留まっている（Chattopadhyay et al., 2006）。
【０００８】
いくつかのグループがいわゆるＭＨＣマイクロアレイを開発しようとしていることにより、抗原特異性Ｔ細胞応答のより包括的な分析を可能にする技術の開発の必要性が強調されている。これらの系では、Ｔ細胞特異性は蛍光色素によってエンコードされるのではなく、空間的にエンコードされる（Soen et al., 2003およびStone et al., 2005）。それらの有望さにもかかわらず、ＭＨＣマイクロアレイは広く採用されておらず、たとえばエピトープ同定などのＴ細胞応答の多量化測定においてその値が文書化された例を入手できない。
【０００９】
単一のサンプルに対して行なうことができる分析の数を増やす多数の設定において組合せコーディング（combinatorial coding）システムが用いられている。Qdotの分野での具体例は、遺伝子型決定を行なうQdotでコードされたマイクロビーズの使用によって形成される（Xu et al., 2003）。さらに、組合せコーディングは、エンコーディングがビーズの大きさ、蛍光色素、および蛍光色素の強度（たとえばＢＤサイトメトリックビーズアレイ）の変化によって行なわれる、ビーズアレイを用いたサイトカインなどの血清製品の測定に用いられてきた。すべてのこれらの例で、溶質は、予めエンコードされたマイクロビーズへの結合によって分析される。
【００１０】
以上を考慮すると、当該技術分野では、高スループットでの抗原特異性Ｔ細胞などの特異性抗原応答性細胞の検出、単離および／または同定を可能にする方法の必要性が残る。
【００１１】
さらに、利用可能なサンプルの量がしばしば限定されていることを考慮すると、当該技術分野では、単一のサンプル中のＴ細胞などの特異性抗原応答性細胞の複数の種の検出、単離および／または同定を可能にする方法の必要性が残る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、とりわけ、本発明の目的は、好ましくは高いスループットで、たとえば単一の末梢血サンプルである単一のサンプル中などの比較的少量の生体材料中の抗原特異性細胞の複数の種を検出するための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
とりわけ、この目的は、添付の請求項１に規定されるような方法によって満たされる。
具体的に、この目的は、（末梢血サンプルなどの生体材料の）サンプル中の抗原応答性細胞を検出するための方法であって、
少なくとも１つの標識を保持する抗原提示化合物に２つ以上の予め定められた抗原を負荷するなどして付与するステップを備え、各々の抗原は少なくとも２つの異なる標識で表わされ（エンコードされ）、さらに
抗原付与された当該抗原提示化合物を当該サンプルと接触させるステップと、
抗原負荷された当該抗原提示化合物の、当該抗原応答性細胞への結合を検出し、これにより当該抗原に応答する細胞を検出するステップとを備え、
当該抗原は、当該抗原を負荷された当該抗原提示化合物によって抗原応答性細胞に結合される当該少なくとも２つの異なる標識の存在を検出することによって検出される、方法によって満たされる。
【００１４】
本発明の好ましい実施形態に従うと、上記２つ以上の予め定められた抗原は、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、２５以上、２６以上、２７以上、および２８以上からなる群から選択される。
【００１５】
本発明は、抗原提示化合物の規定された組合せの結合によって形成される組合せコードの分析により組合せコーディングの概念を拡張する。
【００１６】
具体的に、本発明は、同じ標識を何度も用いて、蛍光色素などの標識の一意な組合せに各々連結される抗原提示化合物の使用により、単一のサンプル中で多数の抗原特異性細胞応答を同時に分析可能であるが、これは毎回蛍光色素などの１つ以上の他の標識との一意な組合せで行なわれるという発見に基づいている。
【００１７】
先行技術に対して、これは、アッセイに特異性のあるコードの新規な作製に係り；これは溶質よりもむしろ細胞の分析に係り；かつこれは抗原特異性細胞応答の並列分析のための組合せコーディングの使用に係る。
【００１８】
抗原特異性細胞の交差反応性が高いという広く持たれている見方にも拘らず、得られたデータは、組合せコーディングによる細胞の検出が実際的かつ現実的可能性であることを示している。組合せコーディングの値は、メラノーマ患者からの末梢血中のメラノーマ関連抗原特異性Ｔ細胞応答の解析により、本発明に従って例示される。
【００１９】
先行する研究は、両者ともが異なる蛍光色素に連結される、抗原特異性Ｔ細胞を含有する２つのＭＨＣマルチマーまたは関連のペプチドの結合による抗原特異性Ｔ細胞を検出すること、したがって単一のサンプル中の単一の抗原の検出、が実施可能であることを示している。ＭＨＣマルチマー二重染色法のこの技術を用いて、単一のペプチドエピトープ（の変異体）に特異性のあるＴ細胞の微細な特異性がわかった（Haanen et al., 1999）。
【００２０】
本発明に従うと、「抗原」という用語は、免疫系によって「異物」または「異種」と認識されるような免疫原性ペプチドまたはポリペプチドを示す。
【００２１】
本発明者は、そのような２色エンコードされたｐＭＨＣの大きなセットを、これらのｐＭＨＣのうち１つに特異性のあるＴ細胞を検出できることと干渉しない単一のサンプル内で組合せることができれば、そのような技術は古典的な単色エンコーディングで可能であるよりもはるかに多数のＴ細胞特異性をエンコードするのに利用可能であると考えられると企図した。
【００２２】
この設定では、特異性Ｔ細胞集団は、先行技術のｐＭＨＣマルチマー染色の場合のように単一の蛍光信号によって規定されることはもはやないであろうが、そのクローン特異性は、単独のまたは組合せた他の蛍光色素のいずれでもない、存在する２つの予め定められた蛍光色素の結合によって視覚化される。そのような組合せエンコーディングスキームのパワーは、利用可能な蛍光色素の数が増大するにつれてますます明らかになっている。
【００２３】
一例として、３つの蛍光色素をエンコードに用いることができる設定では、一重および二重コーディングシステムの両者ともを用いて３つの異なる識別を明らかにすることができる（単色エンコーディングの場合は「Ａ」、「Ｂ」および「Ｃ」、かつ２色エンコーディングの場合は「Ａ−Ｂ」、「Ａ−Ｃ」および「Ｂ−Ｃ」）；８つの蛍光色素をエンコードに用いる場合は、一重および二重コーディングシステムはそれぞれ８および２８の一意なコードを生じ得る；１７（単一のフローサイトメトリ分析に現在利用可能な異なる蛍光色素の最大数）の蛍光色素を用いる場合、一重コーディングシステムは１７の一意なコードを生じる一方で、二重コーディングシステムは１３６までの異なる識別を包含し得る。
【００２４】
本発明は二次元組合せコーディング、したがって単一の抗原をコーディングするための２つの蛍光色素を例示するが、４および５などの３以上の次数の組合せコーディングが同じ原則で働くので、利用可能な蛍光色素の数が増えるにつれて特に魅力的である。これを図示するため、１７の蛍光色素を利用する後者の例では、より高次のエンコーディングスキームにより、数千の一意な特異性のエンコーディングが可能になる。
【００２５】
単一のサンプルにおいて上記組合せエンコーディングを利用可能であるか否かを判定するための重要な要因の１つは、標識が複数回用いられ、複数の別々の抗原−抗原提示化合物にコンジュゲートされる場合に、複数の標識との交互作用によって抗原応答性細胞を測定できることである。別々の抗原−抗原提示化合物にコンジュゲートされる同じ標識の使用は、内在的に、抗原応答性細胞が別々の抗原−抗原提示化合物で標識付けられ、これにより以下の表１に与えられるものなどのコードによってその抗原応答性を明らかにしてしまう可能性を壊してしまい得る恐れが生じる。
【００２６】
Ｔ細胞の交差反応性が高いという広く持たれている見方とは反対に、本発明者らは、驚くべきことに、別々の抗原−抗原提示化合物にコンジュゲートされた同じ標識を複数回使用することにより確かに抗原応答性細胞の検出が可能になることを発見した。
【００２７】
単一のサンプルで上記組合せエンコーディングが利用可能であるか否かを判定する重要な要因の別の１つは、方法の弁別力、または換言すると、蛍光色素などの標識の各個別の組合せを別個に検出できることである。蛍光色素などの標識の使用は、内在的に、それよりも下では特異性検出が不可能であるバックグラウンド信号を与える。このことから、２つの標識を用いる場合、バックグラウンド信号は増大し、こうして検出限界になり、３つの標識などを用いる場合はさらに増大することが内在的にわかる。
【００２８】
本発明者らは、驚くべきことに、バックグラウンド（非特異性）信号の増大による予測される弁別力の低下とは反対に、蛍光色素などの２つ以上の標識を用いた複数の抗原のエンコーディングは、２標識抗原コーディングシステムではバックグラウンド信号を１０倍低減し、これによりシステムの感受性の実質的な増大が可能になることを発見した。システムのこの増大した感受性により、抗原の複数の検出、すなわち複数種の抗原応答性細胞の検出が可能性となり、これにより本発明に従う方法を提供する。
【００２９】
さらに、とりわけ、バックグラウンド信号の上記観察される低下、したがって増大した感受性により、抗原提示化合物非特異性結合によるアッセイの感受性に対する予測される好ましくない影響が大幅に低減され、これにより本発明に従う方法がさらに提供される。
【００３０】
本方法の好ましい実施形態に従うと、抗原提示化合物には１つの標識が付与され、抗原は、少なくとも２つの異なって標識付けされた抗原提示化合物によって表わされるかまたはエンコードされる。
【００３１】
換言すると、この好ましい実施形態に従うと、検出すべき各個別の抗原（またはエピトープ）は、異なる蛍光発光蛍光色素などの異なって検出可能な標識を各々が有する少なくとも２つの抗原提示化合物に負荷される。
【００３２】
本方法の別の好ましい実施形態に従うと、抗原提示化合物は、たとえばＭＨＣにコンジュゲートされるまたは共有結合される、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つなど少なくとも２つの異なる標識を付与され、抗原は１つの複数標識付け抗原提示化合物によって表わされる（またはエンコードされる）。
【００３３】
換言すると、この好ましい実施形態に従うと、検出すべき各個別の抗原（またはエピトープ）は、異なる蛍光発光蛍光色素などの少なくとも２つの異なる標識を付与された単一の抗原提示化合物に負荷される。
【００３４】
本発明に従う抗原は好ましくはペプチドである。このペプチドは、たとえばウイルスまたは腫瘍細胞などの既知の免疫原性エピトープを表わし、これによりたとえばこの抗原に応答する免疫細胞の存在の検出、およびその後のウイルス感染または癌の診断を可能にすることができる。
【００３５】
本ペプチドは未知のエピトープも表わすことができ、このエピトープに応答する細胞の検出は、このペプチド内の免疫原性アミノ酸配列の存在を示し、これにより、たとえばポリペプチドなどの免疫原性領域またはエピトープの同定を可能にする。
【００３６】
本発明に従う抗原提示化合物は、好ましくは、添付された標識または複数の標識に抗原をリンクする。Ｔ細胞の場合、本発明に従う抗原提示化合物は好ましくは主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）であり、好ましくは４以上の多量化主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）であることがより好ましい。たとえばＢ細胞の場合ではなくＴ細胞の場合、抗原提示化合物は好ましくは抗原と抗原応答性細胞との間の交互作用に強く寄与し、したがってこれを増大させる。
【００３７】
主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）の使用は、これらの化合物が自然に抗原提示可能であるからだけでなく、本方法で用いるのに本標識付け抗原提示化合物を与えるために、容易に利用可能な技術を利用可能であるからという理由で有利である（Rodenko et al., 2006）。
【００３８】
本発明に従う好ましい抗原応答性細胞はＴ細胞および／またはＢ細胞であり、より好ましくはＴ細胞である。
【００３９】
本発明に従う標識は好ましくは蛍光標識であり、より好ましくは、当該技術分野のようにQdotとして指定される蛍光標識である。
【００４０】
本方法の好ましい実施形態に従うと、単一のアッセイで用いられる異なる標識の数は、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、および８以上からなる群から選択される。
【００４１】
さらに別の好ましい実施形態に従うと、各個別の抗原は、少なくとも３つまたは少なくとも４つの異なる標識で表わされる。Qdotなどの３以上または４以上すらの標識を用いて単一の抗原をエンコードすることにより、単一の中で検出すべき潜在的抗原応答性細胞の数が劇的に増大する。これは、単一の抗原をエンコードするまたは表わすのに利用可能なチャネルまたは組合せの数を示す図１に例示されている。
【００４２】
単一の抗原をエンコードする単一の標識は、利用可能な標識の数と同数の種の抗原応答性細胞の弁別を可能にするであろう一方で、２つ、３つまたは４つの標識による同じ抗原のエンコーディングは検出可能な抗原を表わす細胞の種の数を劇的に増大させる。
【００４３】
本発明に従うと、本方法は好ましくは単一のサンプルにおいて行なわれ、サンプルは好ましくは血液サンプルである。
【００４４】
本明細書中で定義されるように、「血液サンプル」という用語は、個体から直接に得られた血液サンプルに限定されるだけではなく、直接に得られた血液サンプル由来のまたはそれらから発するサンプルにも限定される。ただしこれは、これらの由来サンプルが元々存在する抗原応答性細胞を依然として備えるという制限の下でである。
【００４５】
本方法の特に好ましい実施形態に従うと、抗原応答性細胞の検出はフローサイトメトリ分析を備える。
【００４６】
上記を考慮して、本発明は、別の局面で、サンプル中の抗原応答性細胞の検出のための、単一の抗原を表わす本少なくとも２つの標識の使用にも関する。
【００４７】
さらなる局面に従うと、本発明は、癌などの疾患または病状の診断のための本方法の使用に関する。
【００４８】
またさらなる局面に従うと、本発明は、免疫療法薬を開発するための本方法の使用に関する。
【００４９】
別の局面に従うと、本発明は、ワクチン開発のための本方法の使用に関する。
また別の局面に従うと、本発明は、ポリペプチド中のエピトープまたは免疫原性アミノ酸配列の同定のための本方法の使用に関する。この局面は、本発明に従う方法を用いて、未知のＨＬＡ−Ａ３関連Ｔ細胞抗原であるＱＬＲＡＬＤＧＧＮＫ，ＳＬＹＲＤＰＬＰＲ，ＨＡＹＩＱＳＬＬＫ，ＲＭＹＮＭＶＰＦＦおよびＧＴＹＥＧＬＬＲＲの同定に例示される。
【００５０】
したがって、本発明は、ＱＬＲＡＬＤＧＧＮＫ，ＳＬＹＲＤＰＬＰＲ，ＨＡＹＩＱＳＬＬＫ，ＲＭＹＮＭＶＰＦＦおよびＧＴＹＥＧＬＬＲＲからなる群から選択されるＨＬＡ−Ａ３関連Ｔ細胞抗原；免疫療法薬およびワクチンのモニタにおける本ＨＬＡ−Ａ３関連Ｔ細胞抗原またはその機能的誘導体の使用；ならびに、免疫療法薬およびワクチンの開発における本ＨＬＡ−Ａ３関連Ｔ細胞抗原またはその機能的誘導体の使用にも関する。
【００５１】
本発明の原則は、本発明の好ましい実施形態を示す実施例でさらに詳細に説明されるであろう。実施例では、以下の図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】一および二次元（左）または一−四次元（右）コーディングスキームにおける増大する数の蛍光色素を用いて行なうことができる一意な色組合せの理論的数を示す図である。
【図２】８つの蛍光色素の二次元マトリックスを用いて抗原をエンコードするのに使用可能な２８の一意な色組合せを示す図である。
【図３】２色エンコードされたｐＭＨＣマルチマーの使用によるバックグラウンド信号の低減を示し、灰色の棒は、ＣＭＶNLVエピトープ（「ＣＭＶ」）または対照ｐ＊ペプチド（バックグラウンド）のいずれかを含有するＭＨＣマルチマーの２５の異なる２色エンコードされた組合せで染色されたＰＢＭＣであり、黒の棒は、ＣＭＶNLVエピトープ（「ＣＭＶ」）または対照ｐ＊ペプチド（「バックグラウンド」）のいずれかを含有する８つの異なる単色エンコードされたＭＨＣマルチマー（ＰＥ、ＡＰＣ、Ｑ５６５、Ｑ５８５、Ｑ６０５、Ｑ６５５、Ｑ７０５およびＱ８００）で染色されたＰＶＭＣである、図である。
【図４】２色エンコードされたｐＭＨＣマルチマーで染色した後のｐＭＨＣ特異性Ｔ細胞の同定に用いられるゲーティングストラテジーの概略図である。
【図５】組合せコーディングによるウイルス特異性Ｔ細胞応答の多重検出を示し、ウイルス特異性Ｔ細胞応答は３人の健常なドナーのＰＢＭＣにおいて：Ｉ）各々が２色コードでエンコードされた２５の異なるｐＭＨＣマルチマーのミックスで１つのサンプルを染色することによって；ＩＩ）特異性２色コードに連結された２５のペプチドのうち１つを含有するｐＭＨＣマルチマーで２５の個別のサンプルを染色することによって；III）２５のペプチドのうち１つを含有する古典的なＰＥ標識付けＭＨＣマルチマーで２５の個別のサンプルを染色することによって；またＩＶ）各々が２色コードでエンコードされた無関係のｐＭＨＣマルチマーのミックスで１つのサンプルを染色することによって分析され：Ｉ−ＩＶは、′Ｉでの頻度＞０．０３％で検出された抗原特異性Ｔ細胞集団の点プロットであり、Ｖは、ＰＥ標識付けＭＨＣマルチマー染色（塗り潰し四角）によって；サンプル当たり２５の特異性を有する２色エンコードされたＭＨＣマルチマー（塗り潰し菱形）によって；サンプル当たり１つのｐＭＨＣ特異性を有する２色エンコードされたＭＨＣマルチマー（塗り潰し三角）によって；対照ペプチドで負荷された２色エンコードされたＭＨＣマルチマー（白抜き菱形）によって検出されるような、用いる２５のエピトープに対して向けられる抗原特異性ＣＤ８+Ｔ細胞の頻度をグラフで表わす（補足の表１）、図である。
【図６】組合せコーディングによるウイルス特異性Ｔ細胞応答の多重検出を示し、ウイルス特異性Ｔ細胞応答は３人の健常なドナーのＰＢＭＣにおいて：Ｉ）各々が２色コードでエンコードされた２５の異なるｐＭＨＣマルチマーのミックスで１つのサンプルを染色することによって；ＩＩ）特異性２色コードに連結された２５のペプチドのうち１つを含有するｐＭＨＣマルチマーで２５の個別のサンプルを染色することによって；III）２５のペプチドのうち１つを含有する古典的なＰＥ標識付けＭＨＣマルチマーで２５の個別のサンプルを染色することによって；またＩＶ）各々が２色コードでエンコードされた無関係のｐＭＨＣマルチマーのミックスで１つのサンプルを染色することによって分析され：Ｉ−ＩＶは、′Ｉでの頻度＞０．０３％で検出された抗原特異性Ｔ細胞集団の点プロットであり、Ｖは、ＰＥ標識付けＭＨＣマルチマー染色（塗り潰し四角）によって；サンプル当たり２５の特異性を有する２色エンコードされたＭＨＣマルチマー（塗り潰し菱形）によって；サンプル当たり１つのｐＭＨＣ特異性を有する２色エンコードされたＭＨＣマルチマー（塗り潰し三角）によって；対照ペプチドで負荷された２色エンコードされたＭＨＣマルチマー（白抜き菱形）によって検出されるような、用いる２５のエピトープに対して向けられる抗原特異性ＣＤ８+Ｔ細胞の頻度をグラフで表わす（補足の表１）、図である。
【図７】組合せコーディングによるウイルス特異性Ｔ細胞応答の多重検出を示し、ウイルス特異性Ｔ細胞応答は３人の健常なドナーのＰＢＭＣにおいて：Ｉ）各々が２色コードでエンコードされた２５の異なるｐＭＨＣマルチマーのミックスで１つのサンプルを染色することによって；ＩＩ）特異性２色コードに連結された２５のペプチドのうち１つを含有するｐＭＨＣマルチマーで２５の個別のサンプルを染色することによって；III）２５のペプチドのうち１つを含有する古典的なＰＥ標識付けＭＨＣマルチマーで２５の個別のサンプルを染色することによって；またＩＶ）各々が２色コードでエンコードされた無関係のｐＭＨＣマルチマーのミックスで１つのサンプルを染色することによって分析され：Ｉ−ＩＶは、′Ｉでの頻度＞０．０３％で検出された抗原特異性Ｔ細胞集団の点プロットであり、Ｖは、ＰＥ標識付けＭＨＣマルチマー染色（塗り潰し四角）によって；サンプル当たり２５の特異性を有する２色エンコードされたＭＨＣマルチマー（塗り潰し菱形）によって；サンプル当たり１つのｐＭＨＣ特異性を有する２色エンコードされたＭＨＣマルチマー（塗り潰し三角）によって；対照ペプチドで負荷された２色エンコードされたＭＨＣマルチマー（白抜き菱形）によって検出されるような、用いる２５のエピトープに対して向けられる抗原特異性ＣＤ８+Ｔ細胞の頻度をグラフで表わす（補足の表１）、図である。
【図８】異なるＴ細胞染色アプローチ間の相関を示し、古典的なＰＥ標識付けＭＨＣマルチマー染色（Ｘ軸）およびサンプル当たり２５の特異性を有する２色エンコードされたＭＨＣマルチマー染色（Ｙ軸）によって検出されるような抗原特異性Ｔ細胞頻度間の相関を示す、図である。
【図９】異なるＴ細胞染色アプローチ間の相関を示し、サンプル当たり１つのｐＭＨＣ特異性を有する２色エンコードされたＭＨＣマルチマー（Ｘ軸）およびサンプル当たり２５の特異性を有する２色エンコードされたＭＨＣマルチマー染色（Ｙ軸）によって検出されるような抗原特異性Ｔ細胞頻度間の相関を示す、図である。
【図１０】メラノーマ関連ペプチドに対するＴ細胞の応答を示し、ＨＬＡ−Ａ３−拘束性ウイルス由来Ｔ細胞エピトープ（ＥＶＢRLR、ＥＶＢRVR、ＦＬＵILR）、直接エクスビボ検出（塗り潰し三角）；２２のメラノーマ拘束性ペプチド、直接エクスビボ検出（塗り潰し四角）；またはＴ細胞強化およびインビトロ増殖後の２２のメラノーマ拘束性ペプチド（＊）に対して向けられた、メラノーマ患者および健常ドナーにおいて検出された抗原特異性Ｔ細胞応答の要約を示す、図である。
【図１１】組合せコーディングによって規定されるＭＨＣマルチマー応答性Ｔ細胞集団のペプチド特異性を確認する細胞内ＩＦＮγ染色を示し、ペプチド番号は表２の配列を参照する、図である。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
実施例
方法
ペプチド−ＭＨＣ複合体の生成
すべてのペプチドは標準的なFmoc化学を用いて社内で合成した、またはPepscanから購入した（オランダ、レリスタット、Pepscan Presto BV）。ＵＶに感受性のあるビルディングブロックＪを記載のように合成した（Toebes et al., 2006）。組換ＨＬＡ−Ａ１、−Ａ２、−Ａ３、および−Ｂ７重鎖およびヒトβ2ｍ軽鎖は大腸菌で生産した。ＭＨＣクラスＩリフォルディング反応は記載のように行なわれ（Garboczi et al., 1992）、かつＭＨＣクラスＩ複合体はＰＢＳにおけるゲルろ過ＨＰＬＣによって精製した（ｐＨ７．４）。
【００５４】
特異性ペプチド−ＨＬＡ複合体はＭＨＣペプチド交換によって生成した。ｐ＊ＨＬＡ複合体（１００μｇ／ｍＬ）を、示されたペプチド（２００μＭ）の存在下で１時間、３６６ｎｍのＵＶ光（Camag）に露光した。交換の後、サンプルを５分間１６，０００ｇでスピンし、上澄みをＭＨＣマルチマー形成に用いた。
【００５５】
ＭＨＣマルチマーの生成
ＭＨＣマルチマーは、ＳＡ−Qdot５６５、ＳＡ−Qdot５８５、ＳＡ−Qdot６０５、ＳＡ−Qdot６５５、ＳＡ−Qdot７０５、ＳＡ−Qdot８００、ＳＡ−フィコエレクチン（phycoerectin）（ＰＥ）およびＳＡ−アロフィコシアニン（ＡＰＣ）という８つの異なる蛍光ストレプトアビジン（ＳＡ）コンジュゲート（Invitrogen）を用いて生成した。ＭＨＣモノマー（濃度１００μｇ／ｍＬ）各１００μＬ毎に、７．０８μＬのＳＡ−Qdotコンジュゲート（１μＭ）、１０．８μＬのＳＡ−ＰＥ（１ｍｇ／ｍｌ）または６μＬのＳＡ−ＡＰＣ（１ｍｇ／ｍｌ）を加え、その後氷の上で２０分間インキュベートした。ＭＨＣペプチド交換後１００％救出されたと仮定すると、これはＳＡ−Qdot当たり３０個のＭＨＣモノマーの占有率という結果となるであろう。ビオチン（Sigma）およびＮａＮ3（Sigma）を、２６．４μＭおよび０．０２％の最終濃度にそれぞれ加え、その後氷の上で２０分間インキュベートした。ＰＥおよびＡＰＣ標識付け複合体を０．０２％のＮａＮ3でＰＢＳ中で２倍に希釈した。各ｐＭＨＣ複合体毎に、表１および表２のスキームに従って２つの異なる蛍光標識でマルチマーを作った。
【００５６】
組合せＴ細胞染色について、同じ特異性のマルチマー複合体は、Ｑ６０５、Ｑ６５５、Ｑ７０５、ＰＥおよびＡＰＣ標識付け複合体については１：１で、任意の他の色と組合せたＱ５６５、Ｑ５８５およびＱ８００標識付け複合体については２：１で混合した。Ｑ５６５、Ｑ５８５およびＱ８００の組合せは除外した。組合せコーディングによるＴ細胞応答の分析のための組合せｐＭＨＣ混合物はプーリングによって生成し、Ｔ細胞染色用の５０倍濃縮されたすぐに使える株として４℃で貯蔵した。使用前に、ＭＨＣマルチマーを２分間１７，０００ｇでスピンし、上澄みを使用した。
【００５７】
Ｔ細胞染色
約１×１０6のＰＢＭＣまたは２×１０5の培養されたＴ細胞のＴ細胞染色について、２μＬの単一のｐＭＨＣマルチマーまたは５０μＬの２色エンコードされたｐＭＨＣコレクション（collections）（最終濃度：初期モノマー濃度ベースで別々のｐＭＨＣ当たり２μｇ／ｍＬ）を用いた。最終染色容量は８０μｌであり、３７℃で１０分間細胞をインキュベートした。次に、ＣＤ８−Alexa７００（Caltech ＭＨＣＤ０２８９）（最終希釈１／２００）、ＣＤ４−ＦＩＴＣ（ＢＤ３４５７６８）（最終希釈１／８）、ＣＤ１４−ＦＩＴＣ（ＢＤ３４５７８４）（最終希釈１／３２）、ＣＤ１９−ＦＩＴＣ（ＢＤ３４５７７６）（最終希釈１／１６）、ＣＤ４０−ＦＩＴＣ（Serotech ＭＣＡ１５９０Ｆ）（最終希釈１／４０）、ＣＤ１６−ＦＩＴＣ（ＢＤ３４７５２３）（最終希釈１／６４）からなる５倍抗体ミックス２０μＬを加え、４℃で２０−３０分間細胞をインキュベートした。フローサイトメトリの前に細胞を２回洗浄し、死んだ細胞を排除できるようにヨウ化プロピジウムを加えた。
【００５８】
フローサイトメトリ
４８８ｎｍのレーザ：ＰＩ：６８５ＬＰ、６９５／４０；ＰＥ：５５０ＬＰ、５７５／２６；ＦＩＴＣ：５０５ＬＰ、５３０／３０；ＳＳＣ：４８８／１０．６３３ｎｍのレーザ：Alexa７００：６８５ＬＰ、７３０／４５；ＡＰＣ：６６０／２０．４０５ｎｍのレーザ：Qdot８００：７７０ＬＰ、８００／３０；Qdot７０５：６８０ＬＰ、７１０／５０；Qdot６５５：６３５ＬＰ、６６０／４０；Qdot６０５：５９５ＬＰ、６５０／１２．３５５ｎｍのレーザ：Qdot５８５：５７５ＬＰ、５８５／１５；Qdot５６５：５４５ＬＰ：５６０／２０という１１色器具設定を用いてFacsDivaソフトウェアでＬＳＲ−ＩＩフローサイトメータ（Becton Dickinson）に対してデータ取得を行なった。
【００５９】
各分析毎に約２００，０００個のリンパ球が記録された。抗原特異性Ｔ細胞を同定するため、以下のゲーティングストラテジーを用いた：１）（ＰＩ陰性、ＦＳＣ−Ｗ／Ｈロー、ＳＳＣ−Ｗ／Ｈロー、ＦＳＣ／ＳＳＣ−Ａを用いた）生きた単一細胞リンパ球の選択、２）ＣＤ８陽性および「ダンプ（dump）」（ＣＤ４、１４、１６、１９、４０）陰性細胞の選択、３）２つのＭＨＣマルチマーチャネルで陽性かつ６つの他のＭＨＣマルチマーチャネルで陰性のＣＤ８+Ｔ細胞の選択。
【００６０】
抗原特異性Ｔ細胞の強化
４℃で１時間、ＰＥ−マルチマーで抗原特異性Ｔ細胞を染色した（１０7のＰＢＭＣについて１．２５μＬの各個別のＰＥ−マルチマーの１００μｇ／ｍＬの株）。その後、細胞を洗浄し、２０μＬの抗ＰＥ Ａｂｓコーティングされた磁気ビーズ（Miltenyi）でインキュベートした。次に、ＬＳカラムを用いてかつ製造者のプロトコールに従って、ＭＡＣＳ（Miltenyi）によって細胞を単離した。溶出した細胞を洗浄し、５０００個の抗ＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズ（Invitrogen）を用いて、１０％のヒト血清（Invitrogen）、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２（Proleukin）、および２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５（Peprotech）で、２００μＬのＴ細胞媒質（ＩＭＤＭ（Gibco）中で再懸濁した。強化された細胞を９６ウェルプレートで培養し、翌日再懸濁した。培養物（cultures）を分け、少なくとも週に２回媒質を取換えた。２、３週間後、組合せコーディングに基づくＭＨＣマルチマーフローサイトメトリによって抗原特異性Ｔ細胞応答を測定した。
【００６１】
Ｔ細胞分類および培養物
関連のｐＭＨＣマルチマーでＴ細胞を染色し、次にMoFlo（Dako）またはFACSAria（Becton Dickinson）上で、１０5個の照射されたフィーダ細胞（JY plus同種ＰＢＭＣ）に分類した。細胞をスピンし、１０％のヒト血清、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２、および０．５μｇ／ｍＬのＰＨＡ（Biochrom AG）でＩＭＤＭ中に再懸濁した。隔週に培養物に再び刺激を与えた。ＭＨＣマルチマー染色により、抗原特異性について樹立された培養物をテストした。
【００６２】
サイトカイン放出アッセイ
示されたペプチドを１時間Ｔ２−Ａ３細胞に負荷し、これを１回洗浄した。次に、示された培養物からの１×１０5個のＴ細胞を、１０％のヒト血清およびタンパク質輸送抑制剤（BD GolgiPlug）を用いて、ＩＭＤＭ中で３７℃で４時間１×１０5個のＴ２−Ａ３細胞とともにインキュベートした。２５℃で１５分間、ＰＥコンジュゲートされた抗ＣＤ８ Ａｂ（ＳＫ１、ＢＤ）で細胞を染色し、固定しかつ透過処理し（BD Cytofix/Cytopermキット）、４℃で３０分間、ＡＰＣコンジュゲートされた抗ＩＦＮガンマＡｂ（２５７２３．１１、ＢＤ）で染色した。フローサイトメトリでサンプルを分析し（Cyan, Dako）、FlowJoを用いてデータ分析を行なった。
【実施例１】
【００６３】
対象の標的細胞に対する規定されたコードのアセンブリに基づく組合せエンコーディングスキームを開発する目的で、まず、抗原特異性Ｔ細胞応答の検出用の６つの異なる量子ドット（Qdot、図２に特性を列挙）のセットを用いる可能性を判定した。
【００６４】
量子ドットとは、多数の蛍光色素を同時に用いる実験によく適合する非常に狭い発光スペクトル（ＲＥＦ）を呈する直径および組成に基づいて別々の発光波長を有する蛍光ナノ結晶である。
【００６５】
末梢血ＣＭＶ特異性ＣＤ８+Ｔ細胞応答の分析により、ストレプトアビジンコンジュゲートされたQdot、または標準的なアロフィコシアニン（ＡＰＣ）、またはフィコエリトリン（ＰＥ）に連結することによってマルチマー化されたＭＨＣ複合体はすべて、抗原特異性Ｔ細胞集団を検出するのに利用可能であることが確立された（データ示されず）。
【００６６】
その後、同じ抗原性ペプチドを含有するが異なる蛍光色素に連結される２つのＭＨＣマルチマーを結合することによって抗原特異性Ｔ細胞集団も確実に同定可能かどうかテストした。異なる２つの蛍光色素のすべての２８の可能な組合せにコンジュゲートされたｐＭＨＣクラスＩ複合体のテストは、そのような二重エンコーディングがすべての場合において適切なＴ細胞集団を同定可能であることを実証した。
【００６７】
同じ抗原性ペプチドを含有する２つの異なって標識付けされたＭＨＣマルチマーで同時にＴ細胞を染色することにより、Ｔ細胞表面上の利用可能なＴＣＲの限られたセットに結合するための競合のために、各チャネル毎の蛍光強度に小さな低下が生じる（等モルで２倍）。抗原特異性Ｔ細胞集団を視覚化できることに対する競合の好ましくない影響を限定するため、フローサイトメトリックシステム（Ｑ５６５、Ｑ５８５およびＱ８００）において最も強度の低い信号を与えた３つのqDotを、他の蛍光色素に対して１：１の比率よりはむしろ２：１の比率で用い、その後の実験では、比率の調整が実際的でないことが明らかであるＱ５６５＋Ｑ５８５、Ｑ５６５＋Ｑ８００、およびＱ５８５＋Ｑ８００の組合せを用いなかった。
【００６８】
本実施例は、同じ抗原で負荷された異なって標識付けされた抗原提示化合物が抗原応答性細胞に結合することができ、それによりこれらの異なる標識の検出を通してサンプル中のこれらの細胞の検出が可能になることを示す。
【実施例２】
【００６９】
抗原特異性Ｔ細胞集団は非常に低頻度で存在し得、ＭＨＣマルチマーはフローサイトメトリにおいてバックグラウンド染色を確かに示す。組合せコードの使用により抗原特異性Ｔ細胞の検出がバックグラウンドレベルに影響するか否か、または検出される抗原特異性Ｔ細胞の頻度をテストするため、ＨＬＡ−Ａ２ ＣＭＶNLV特異性Ｔ細胞を含有するＰＢＭＣを、対照マルチマーでまたはＨＬＡ−Ａ２ ＣＭＶNLVマルチマーで染色し、フローサイトメトリで分析した。
【００７０】
具体的に、ＰＢＭＣは、８つの別個の染色において８つの異なる単一エンコードされたＭＨＣマルチマーで、または２５の別個の染色において２５の二重エンコードされたＭＨＣマルチマーのいずれかでインキュベートされた。（単色染色の場合）１つのチャネルでバックグラウンドより上に染色された場合、または（２色染色の場合）関連チャネルの両方で陽性の染色の場合、Ｔ細胞が陽性と考えられた。
【００７１】
図３に見られるように、バックグラウンドサンプル中の（偽陽性）細胞の頻度は、伝統的な単一染色アプローチと比較して二重エンコーディングスキームを用いた場合は約１０倍低く、ＭＨＣマルチマーの２色エンコーディングがバックグラウンド信号を低減するのに強力なツールであることを示す。
【実施例３】
【００７２】
２色エンコーディングの可能性を確立したので、次に、複数の２色エンコードされたｐＭＨＣマルチマー染色を単一のサンプルに対して並列に行なうことができるか否かを調べた。単一のサンプル中の２色エンコードされたｐＭＨＣマルチマーの任意のものと反応するＴ細胞を分析するため、ゲーティングストラテジーをまず開発した（図４）。
【００７３】
簡単に述べると、前方および側方散乱、細胞の幅／高さ、および陰性ヨウ化プロピジウム染色に基づいて、単一の生細胞を選択した。このプールから、ＣＤ８について陽性、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９およびＣＤ４０について陰性（「ダンプ」チャネル、van Oijen et al., 2004）に染色された細胞が関連のＣＤ８+Ｔ細胞としてさらに同定された。２色エンコードされたｐＭＨＣマルチマーの任意のものと反応する分析されたＴ細胞集団に対して、ＭＨＣマルチマー生成に用いた８つの個別の蛍光色素の各々に基づいてゲートが生成された。
【００７４】
２つのチャネルの所与の組合せにおけるバックグラウンドよりも上の信号を示し、残余の６つのチャネルにおいて陰性であるＴ細胞を同定するこのストラテジーは、バックグラウンド染色を同時に低減しながら、１回のフローサイトメトリ実験において２５の異なる組合せの同時分析を可能にする。
【実施例４】
【００７５】
Ｔ細胞応答の大規模分析において組合せコーディング技術の潜在値をテストするため、ＭＨＣペプチド交換（Toebes et al., 2006；Rodenko et al., 2006；Bakker et al., 2008）によってヒトＭＨＣ対立遺伝子ＨＬＡ−Ａ１、−Ａ２，−Ａ３および−Ｂ７（表１）のための、分かっているウイルスおよび癌関連のエピトープの範囲を含有する２５の異なるＭＨＣマルチマーのパネルを生成した。これらのｐＭＨＣマルチマーの各々はその後、表１に記載の一意なコードのセットを生成する２つの蛍光色素に連結された。
【００７６】
組合せコーディングによって得られたデータを従来のＭＨＣマルチマー分析と比較できるように、２５の異なるｐＭＨＣマルチマーのセットをＰＥにも連結した。さらに、組合せエンコーディングのバックグラウンドを判定するため、すべての２つの色組合せにおける無関係ｐＭＨＣマルチマーのセットも準備した。その後、１）ｐＭＨＣマルチマーを含有する２色エンコードされたウイルスおよび癌エピトープのコレクションでの１回の単一染色、２）２色エンコードされた無関係ｐＭＨＣマルチマーのミックスでの１回の単一染色、３）すべての２５のＰＥ標識付けｐＭＨＣマルチマーでの２５の別個の染色、または４）すべての個別の２色エンコードされたｐＭＨＣマルチマーでの２５の別個の染色によって、すべての４つのＨＬＡ対立遺伝子をカバーする３人の健常ドナーからのＰＢＭＣを次に分析した。
【００７７】
「１」および「４」の比較は特に関心がある。というのも、これは、同じ蛍光色素で標識付けされる大量の無関係のｐＭＨＣマルチマーの同時の存在、または高いｐＭＨＣ濃度の存在がバックグラウンド信号に影響するか否かを明らかにするからである。
【００７８】
実験は、ドナーのＨＬＡハプロタイプに対して、およびこれらのドナーにおける抗原特異性Ｔ細胞応答の先の分析に対しての両方について盲検法で行なわれた。これらのアプローチを用いた３人のドナーにおける疾患／病原体特異性Ｔ細胞応答の分析は、ｐＭＨＣマルチマーの組合せエンコーディングにより１つの単一のサンプルにおける多数の抗原特異性Ｔ細胞集団の視覚化が可能になることを明らかにした（図５−図７）。
【００７９】
重要なことに、多数の一連の個別のＰＥマルチマー染色によって分析した際に同じウイルス特異性Ｔ細胞集団が各ドナーに見つかった。さらに、別個のＰＥ連結ＭＨＣマルチマー染色と２５の二重コードされたＭＨＣマルチマーのコレクションを用いた多重染色との直接の比較により高頻度および低頻度のＴ細胞集団を両方調べると（図８）、抗原特異性Ｔ細胞集団を視覚化するための２つのアプローチの間に非常に高い相関が明らかになる。
【００８０】
さらに、２５の別個の染色で用いた２色エンコードされたｐＭＨＣマルチマーの同じセットに対する１つのサンプル中の２色エンコードされたｐＭＨＣマルチマーのコレクションで染色されたＰＢＭＣの分析によって得られたデータの比較も、非常に高い相関を明らかにする（図９）。
【００８１】
この後者の発見は、異なるペプチドを含有する多数のＭＨＣ複合体に同じ蛍光色素が連結された場合ですら、各ｐＭＨＣマルチマーが蛍光色素の別々の組合せに連結されるＭＨＣマルチマーのセットを用いたインキュベーションによる複数の抗原特異性の同時測定の可能性があることを示す。
【００８２】
このように、染色ミックス中の多くの無関係ｐＭＨＣ複合体のうち任意のものとのＴ細胞の潜在的な交差反応は問題ではないことが示される。さらに、これらの観察は、高濃度の多量化ＭＨＣ分子を含有する混合物を用いることがＭＨＣマルチマー染色に干渉しないことを示している。最終的に、疾患／病原体関連エピトープで占有された２色エンコードされたｐＭＨＣのセットを用いた場合に観察される信号を２５の無関係ＭＨＣマルチマーのコレクションを用いた場合に観察される信号と比較することにより、アプローチの感受性が高く、ＣＤ８陽性細胞の０．０３％程度に頻度の低いＴ細胞集団を同定可能であることが示される（図５−図７）。
【実施例５】
【００８３】
以上の実験は、単一のサンプル中の多数のＴ細胞集団を視覚化するのに企図される組合せコーディングアプローチを利用可能であることを実証したので、エピトープ同定におけるその潜在値を評価した。
【００８４】
潜在的ＨＬＡ−Ａ３関連メラノーマエピトープを同定するために設置される最新のスクリーンにおいて、ＨＬＡ−Ａ３について高い結合親和性を表示した４つの異なるメラノーマ関連タンパク質から２２のペプチドを同定した。このセットはすべての４つの以前に記載されたＨＬＡ−Ａ３関連のエピトープおよび１８の潜在的な新規のエピトープを含んだ。
【００８５】
（潜在的な）エピトープのセットに対する応答について小さな患者サンプルをスクリーニングする可能性を扱うため、すべての２２のエピトープならびに３つのＨＬＡ−Ａ３関連ＥＢＶ−およびインフルエンザＡ由来エピトープについて、ペプチド交換によってＭＨＣ試薬を生成した。低レベルのＴ細胞応答も明らかにできるように、可能な腫瘍関連エピトープを含有する２２のｐＭＨＣマルチマーを用いた単一のＭＡＣＳベースの強化ステップを行ない、その後短期の強化細胞のインビトロ増殖を行なった。
【００８６】
次に二次元組合せコーディングスキームにおいて２５の異なるｐＭＨＣマルチマーを２つの蛍光色素に連結し、２７のＨＬＡ−Ａ３陽性メラノーマ患者からの強化ＰＢＭＣをスクリーニングするのに用いた。
【００８７】
並列ＭＨＣマルチマー染色のこのアプローチを用いて、３つの前述のｇｐ１００関連エピトープに対して向けられたＴ細胞応答の存在を確認することができた。さらに、ヒトｇｐ１００（ＱＬＲＡＬＤＧＧＮＫ）由来の以前は未知のエピトープに対して、ノーダル（Nodal）（ＳＬＹＲＤＰＬＰＲおよびＨＡＹＩＱＳＬＬＫ）由来の以前は未知の２つのエピトープに対して、およびＴｙｒｐ２（ＲＭＹＮＭＶＰＦＦ）由来の以前は未知の１つのエピトープに対して、ＣＤ８+Ｔ細胞応答が観察された（表２）。
【００８８】
重要なことに、１０人の健常なＨＬＡ−Ａ３+ドナーからのＰＢＭＣを同じ態様で分析した場合、ドナーのいずれにも応答が観察されなかった一方で、ウイルスエピトープに対するＴ細胞応答は両方のグループで等しく豊富であった（図１０）。
【００８９】
観察されたＴ細胞集団が対応のペプチドを表示する標的細胞に対して機能的活性を示すか否かを判定するため、異なる患者からのＰＢＭＣから抗原特異性Ｔ細胞を分類し、インビトロで増殖した。次に、結果的に得られたＴ細胞集団を、ペプチドを負荷された標的細胞でのインキュベーション後に細胞内サイトカインアッセイを用いて抗原特異性についてテストした（図１１）。
【００９０】
すべての培養物は、それらの同源の抗原でインキュベートされるとＩＦＮガンマ発生を表示した（図１１）。ペプチドで負荷されなかった細胞でＴ細胞培養物がインキュベートされた場合、応答は観察されなかった。
【００９１】
これらの結果は、ＨＬＡ−Ａ３に対して高い結合親和性を有する前述のペプチドの一覧が、メラノーマ患者においてＴ細胞応答を観察可能な少なくとも８つのメラノーマ関連エピトープ、なおそのうち５つは前述されていないが、これを含有していることを示す。さらに、入手可能な患者材料に対して行なわれたスクリーンは、本発明に従う抗原特異性の多色エンコーディングによって与えられる多重分析の可能性なしには見込みがなかったであろう。
【００９２】
結論
本発明に従う組合せコーディング技術は、複数の免疫応答の同時検出および分析のための貴重なツールであることが実証される。
【００９３】
単一のサンプル内の多数の異なるＴ細胞集団の並列検出を可能にする組合せコーディングストラテジーが開発された。組合せコーディングによる末梢血からの抗原特異性Ｔ細胞の検出は、従来のＰＥ標識付けマルチマーを用いた検出と同程度に効率的であるが、結果的に大幅に増大した感受性をもたらし、最も重要なことには、患者材料に対して包括的なスクリーンを行なえることである。
【００９４】
メラノーマ患者の末梢血中の分かっているおよび潜在的なメラノーマ関連抗原に対するＴ細胞応答を分析することにより、患者材料の大規模スクリーニングの可能性が実証された。これらのスクリーンは、分かっているＴ細胞エピトープに対するＴ細胞応答の存在を確認し、ＨＬＡ−Ａ３の文脈で多数の新規なメラノーマ関連Ｔ細胞応答の同定をもたらした。
【００９５】
ペプチド−ＭＨＣコンジュゲートの組合せコーディングは、単一のサンプル中の抗原特異性Ｔ細胞免疫性の高スループット分析を可能にすると結論付けられる。
【００９６】
【表１】
【００９７】
【表２】
【００９８】
【表３】
【００９９】
【表４】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の抗原応答性細胞を検出するための方法であって、
少なくとも１つの標識を保持する抗原提示化合物に２つ以上の予め定められた抗原を付与するステップを備え、各々の抗原は少なくとも２つの異なる標識で表わされ、さらに
抗原を担持する前記抗原提示化合物を前記サンプルと接触させるステップと、
抗原を負荷された前記抗原提示化合物の、前記抗原応答性細胞への結合を検出し、これにより前記抗原に応答する細胞を検出するステップとを備え、
前記抗原は、前記抗原を負荷された前記抗原提示化合物によって抗原応答性細胞に結合される前記少なくとも２つの異なる標識の存在を検出することによって検出される、方法。
【請求項２】
前記２つ以上の予め定められた抗原は、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、２５以上、２６以上、２７以上、および２８以上からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗原提示化合物には１つの標識が付与され、前記抗原は、少なくとも２つの異なって標識付けられた抗原提示化合物によって表わされるかまたはエンコードされる、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗原提示化合物には少なくとも２つの異なる標識が付与され、前記抗原は、１つの標識付けされた抗原提示化合物によって表わされるかまたはエンコードされる、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記抗原はペプチドである、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記抗原提示化合物は主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）である、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）は、好ましくは少なくとも４つのモノマーからなる多量化主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記抗原応答性細胞はＴ細胞および／またはＢ細胞である、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記標識は蛍光標識である、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記蛍光標識はqDotを備える、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
異なる標識の数は、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、および８以上からなる群から選択される、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記抗原は少なくとも３つまたは少なくとも４つの異なる標識で表わされる、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記サンプルは血液サンプルまたは血液由来のサンプルである、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記検出はフローサイトメトリを備える、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
サンプル中の抗原応答性細胞を検出するための単一の抗原を表わす、請求項１から１４のいずれかに規定されるような少なくとも２つの標識の使用。
【請求項１６】
好ましくは癌である疾患または病状の診断における、請求項１から１４のいずれかに記載の方法の使用。
【請求項１７】
免疫療法薬の開発における、請求項１から１４のいずれかに記載の方法の使用。
【請求項１８】
ワクチンの開発における、請求項１から１４のいずれかに記載の方法の使用。
【請求項１９】
エピトープの同定のための、請求項１から１４のいずれかに記載の方法の使用。
【請求項２０】
請求項１から１４のいずれかに規定されるような、少なくとも２つの標識を用いてリガンドを標識付けするステップを備える、細胞または細胞結合レセプタへのリガンドの結合を検出するための方法。
【請求項２１】
ＱＬＲＡＬＤＧＧＮＫ，ＳＬＹＲＤＰＬＰＲ，ＨＡＹＩＱＳＬＬＫ，ＲＭＹＮＭＶＰＦＦ、およびＧＴＹＥＧＬＬＲＲからなる群から選択されるＨＬＡ−Ａ３関連Ｔ細胞抗原。
【請求項２２】
免疫療法薬およびワクチンのモニタにおける、請求項２１に記載のＨＬＡ−Ａ３関連Ｔ細胞抗原またはその機能的誘導体の使用。
【請求項２３】
免疫療法薬およびワクチンの開発における、請求項２１に記載のＨＬＡ−Ａ３関連Ｔ細胞抗原またはその機能的誘導体の使用。
【請求項１】
サンプル中の抗原応答性細胞を検出するための方法であって、
少なくとも１つの標識を保持する抗原提示化合物に２つ以上の予め定められた抗原を付与するステップを備え、各々の抗原は少なくとも２つの異なる標識で表わされ、さらに
抗原を担持する前記抗原提示化合物を前記サンプルと接触させるステップと、
抗原を負荷された前記抗原提示化合物の、前記抗原応答性細胞への結合を検出し、これにより前記抗原に応答する細胞を検出するステップとを備え、
前記抗原は、前記抗原を負荷された前記抗原提示化合物によって抗原応答性細胞に結合される前記少なくとも２つの異なる標識の存在を検出することによって検出される、方法。
【請求項２】
前記２つ以上の予め定められた抗原は、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、２５以上、２６以上、２７以上、および２８以上からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗原提示化合物には１つの標識が付与され、前記抗原は、少なくとも２つの異なって標識付けられた抗原提示化合物によって表わされるかまたはエンコードされる、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗原提示化合物には少なくとも２つの異なる標識が付与され、前記抗原は、１つの標識付けされた抗原提示化合物によって表わされるかまたはエンコードされる、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記抗原はペプチドである、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記抗原提示化合物は主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）である、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）は、好ましくは少なくとも４つのモノマーからなる多量化主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記抗原応答性細胞はＴ細胞および／またはＢ細胞である、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記標識は蛍光標識である、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記蛍光標識はqDotを備える、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
異なる標識の数は、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、および８以上からなる群から選択される、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記抗原は少なくとも３つまたは少なくとも４つの異なる標識で表わされる、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記サンプルは血液サンプルまたは血液由来のサンプルである、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記検出はフローサイトメトリを備える、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
サンプル中の抗原応答性細胞を検出するための単一の抗原を表わす、請求項１から１４のいずれかに規定されるような少なくとも２つの標識の使用。
【請求項１６】
好ましくは癌である疾患または病状の診断における、請求項１から１４のいずれかに記載の方法の使用。
【請求項１７】
免疫療法薬の開発における、請求項１から１４のいずれかに記載の方法の使用。
【請求項１８】
ワクチンの開発における、請求項１から１４のいずれかに記載の方法の使用。
【請求項１９】
エピトープの同定のための、請求項１から１４のいずれかに記載の方法の使用。
【請求項２０】
請求項１から１４のいずれかに規定されるような、少なくとも２つの標識を用いてリガンドを標識付けするステップを備える、細胞または細胞結合レセプタへのリガンドの結合を検出するための方法。
【請求項２１】
ＱＬＲＡＬＤＧＧＮＫ，ＳＬＹＲＤＰＬＰＲ，ＨＡＹＩＱＳＬＬＫ，ＲＭＹＮＭＶＰＦＦ、およびＧＴＹＥＧＬＬＲＲからなる群から選択されるＨＬＡ−Ａ３関連Ｔ細胞抗原。
【請求項２２】
免疫療法薬およびワクチンのモニタにおける、請求項２１に記載のＨＬＡ−Ａ３関連Ｔ細胞抗原またはその機能的誘導体の使用。
【請求項２３】
免疫療法薬およびワクチンの開発における、請求項２１に記載のＨＬＡ−Ａ３関連Ｔ細胞抗原またはその機能的誘導体の使用。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１】
【公表番号】特表２０１２−５０７２６７（Ｐ２０１２−５０７２６７Ａ）
【公表日】平成２４年３月２９日（２０１２．３．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３３５４２（Ｐ２０１１−５３３５４２）
【出願日】平成２０年１１月３日（２００８．１１．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００９３５６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０６０４３９
【国際公開日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【出願人】（５０４４０３８４０）
【出願人】（５１００５０１８８）スティヒティング ヘット ネーデルランド カンケル インスティテュート (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年３月２９日（２０１２．３．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月３日（２００８．１１．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００９３５６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０６０４３９
【国際公開日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【出願人】（５０４４０３８４０）
【出願人】（５１００５０１８８）スティヒティング ヘット ネーデルランド カンケル インスティテュート (3)
【Ｆターム（参考）】
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