シャクヤクの組織培養法および褐変化抑制方法
【課題】薬用として優れた品種であるが、雄性不稔のため種子繁殖ができない大和シャクヤクの組織培養法に関するものであり、大和シャクヤクの大量生産に繋がる方法を提供することを目的とする。
【解決手段】大和シャクヤク（Ｐａｅｏｎｉａ ｌａｃｔｉｆｌｏｒａ Ｐａｌｌａｓ ｖａｒ．ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ Ｂｕｎｇｅ）の根茎の生長点の組織培養において、低酸素条件下にて培養することにより培養物の褐変化を抑制することができ、さらに培地の鉄分としてキレート鉄を用いることが、培養物の褐変化抑制には効果的であることを見出すとともに、大和シャクヤクの生長点からシュート形成させ、発根させるための好適条件などを提供する。
【解決手段】大和シャクヤク（Ｐａｅｏｎｉａ ｌａｃｔｉｆｌｏｒａ Ｐａｌｌａｓ ｖａｒ．ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ Ｂｕｎｇｅ）の根茎の生長点の組織培養において、低酸素条件下にて培養することにより培養物の褐変化を抑制することができ、さらに培地の鉄分としてキレート鉄を用いることが、培養物の褐変化抑制には効果的であることを見出すとともに、大和シャクヤクの生長点からシュート形成させ、発根させるための好適条件などを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シャクヤク（Ｐａｅｏｎｉａ ｌａｃｔｉｆｌｏａｒａ Ｐａｌｌａｓ）を含む木本植物の組織培養における培養物の褐変化抑制方法、ならびにその方法を用いるシャクヤクの組織培養法に関するものである。具体的には大和シャクヤク（Ｐａｅｏｎｉａ ｌａｃｔｉｆｌｏｒａ Ｐａｌｌａｓ ｖａｒ． ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ Ｂｕｎｇｅ）の組織培養において、褐変化を抑制する条件下にて、根茎の生長点からシュートを誘導する方法、得られたシュートを発根培地で発根させることにより大和シャクヤクの植物体を得る方法に関するもので、大和シャクヤクの大量増殖法に繋がる技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
シャクヤクはその花が、美しいため、かつて中国では同属のボタンと同様に貴ばれ、「花相」と称されていた。日本には自生せず、奈良時代に薬として渡来したと言われている。江戸時代には観賞用として和芍と総称される多くの園芸品種が作り出された。現在、シャクヤクには江戸時代から育成されてきた和芍系統、シベリア及び中国から欧米に渡り、１８世紀に作出された洋芍系統、ヨーロッパにもともと自生しているものを園芸的に改良したオランダ芍薬系統等があり、近年は雑種間によって得られたハイブリッド系統も増えている。薬用には和芍系統の品種が用いられ、ボタン同様、薬用を目的に栽培する場合、根の発育が良くなるように花の蕾を摘み取る。特に「大和シャクヤク」と称され、古くから奈良県下で栽培、育成され、薬用に用いられる優良品種は、白花、青茎品とされ、一茎に三花を付け、花弁が５〜２０個の重弁のもので、雄蕊が狭長な花辧に変化しているため雄蕊が全く無く、即ち葯が形成されない雄性不稔である。このように大和シャクヤクは、種子や腋芽が形成されないことから、栽培は全て根茎の株分けでしか繁殖させることができず、大量増殖が難しく、ごく一部の篤農家によって栽培が続けられているという状況にある。
【０００３】
一方、植物組織を培養容器内で栄養繁殖、あるいは増殖させて大量のクローン苗を生産する組織培養技術は、栄養繁殖性の花卉、作物のみならず、優良形質を備えた植物個体を大量生産する方法として近年盛んに用いられており、生産品の均一化や高収量化等、大きな効果をもたらす一方、木本植物、即ち樹木においても、挿し木等が困難な種を中心として、その適用によるクローン苗の生産・大量増殖が期待されている。これは、優良生薬原料である大和シャクヤクにおいても例外ではないが、これまでに大和シャクヤクの組織培養による報告例は全くなく、大和シャクヤクの組織培養法の確立が望まれていた。
【０００４】
他方、シャクヤクを含む木本植物は、一般に細胞壁木化のためリグニンが多量に存在し、その前駆物質として多量のポリフェノール類、カテキン類等が細胞内に含有されている。事実、生薬として用いられるシャクヤクは、ペンタガロイルグルコース等没食子酸およびその誘導体等を含むことが報告されている（非特許文献１）。このため、木本植物の組織培養において、細胞の障害、破損や培養物の２次代謝物分泌などにより、培地に溶出したこれらのポリフェノール類等が酸化され、木本植物の培養物の褐変化を招き、致命的な成長阻害をもたらす。このため褐変化抑制方法に関する検討もなされ、培地に活性炭を添加する方法（非特許文献２）、高粘度液体培地を用いる方法（特許文献１）、セルロースを含む固体培地を使用する方法（特許文献２）等が報告されているが、適用範囲に限界があり新たな褐変化抑制方法の開発が望まれていた。
【０００５】
【特許文献１】特開平６−４６８３８号公報
【特許文献２】特開２０００−１３９２５２号公報
【非特許文献１】Ｗ．Ｃ．Ｃｈｕａｎｇら、Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄｉｃａ，６２巻、３４７−３５１頁（１９９６年）
【非特許文献２】Ｊ．Ｍ．Ｂｏｎｇａら編、「Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｔｒｅｅｓ」、４８頁、１９９２年発行（Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ出版）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、木本植物の組織培養における培養物の褐変化抑制方法、およびそれを用いたシャクヤクの組織培養法に関するもので、特に薬用として優れた品種である大和シャクヤクの大量生産に繋がる方法を提供することを目的とする。大和シャクヤクは、雄性不稔であり種子ができないため、その組織培養法及び大量培養法の確立が望まれており、種々検討を開始したが、培養段階における生長点組織の褐変化が大きな問題であることが判明し、その解決がのぞまれた。
【０００７】
本発明の目的は、シャクヤクを含む木本植物の組織培養における培養物の褐変化抑制する方法とともに、それを用いた組織培養法によりシャクヤク、特に大和シャクヤクの植物体を得る方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は上記目的を達成すべく鋭意検討した結果、大和シャクヤクの根茎の生長点の組織培養において、低酸素条件下にて培養することにより培養物の褐変化を抑制することができ、また、培地の鉄分としてキレート鉄を用いることが、培養物の褐変化抑制には効果的であることを見出した。さらに大和シャクヤクの生長点からシュート形成させる好適条件、ならびに発根させるための好適条件を見出し、大和シャクヤクの生長点から植物体を得る方法を確立し、本発明を完成した。
【０００９】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）シャクヤク（Ｐａｅｏｎｉａ ｌａｃｔｉｆｌｏｒａ Ｐａｌｌａｓ）組織の培養において、低酸素条件下および／またはキレート鉄（ＮａＦｅＥＤＴＡ）含有培地で培養することを特徴とする組織培養法；
（２）シャクヤクが大和シャクヤク（Ｐａｅｏｎｉａ ｌａｃｔｉｆｌｏｒａ Ｐａｌｌａｓ ｖａｒ． ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ Ｂｕｎｇｅ）である（１）記載の組織培養法；
（３）シャクヤク組織が生長点である（１）または（２）記載の組織培養法；
（４）低酸素条件が酸素濃度１５％〜１％（ｖ／ｖ）であることを特徴とする（１）〜（３）いずれかに記載の組織培養法；
（５）キレート鉄（ＮａＦｅＥＤＴＡ）の培地中の濃度が１０μＭ〜１００μＭであることを特徴とする（１）〜（３）いずれかに記載の組織培養法；
（６）大和シャクヤクの生長点の組織培養において、生長点をジベレリンおよびサイトカイニン系植物ホルモンを含有する培地中で培養することによりシュートを形成させ、該シュートを、オーキシン系植物ホルモンを含有する培地中にて発根させて大和シャクヤク植物体を得ることを特徴とする（１）〜（５）いずれかに記載の組織培養法；
（７）木本植物組織の組織培養において、低酸素条件下および／またはキレート鉄（ＮａＦｅＥＤＴＡ）含有培地で培養することを特徴とする培養物の褐変化抑制方法；
（８）木本植物が大和シャクヤクである（７）記載の褐変化抑制方法；
（９）木本植物組織が生長点である（７）または（８）記載の褐変化抑制方法；
（１０）低酸素条件が酸素濃度１５％〜１％（ｖ／ｖ）であることを特徴とする（７）〜（９）いずれかに記載の褐変化抑制方法；
（１１）キレート鉄（ＮａＦｅＥＤＴＡ）の培地中の濃度が１０μＭ〜１００μＭであることを特徴とする（７）〜（９）いずれかに記載の褐変化抑制方法；
などを提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、木本植物の組織培養における培養物の褐変化抑制方法、ならびにその方法を用いた雄性不稔で種子ができない大和シャクヤクの生長点の組織培養による大和シャクヤク増殖技術を確立し、生薬原料として優良形質を備えた大和シャクヤクのクローン苗を大量生産することが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下において、本発明を詳細に説明する。本明細書における木本植物とは、木（樹木）のことであり、茎および根が肥大成長して多量の木部をつくり、年々その細胞壁が木化して硬くなる多年生植物をいい、生薬「シャクヤク（Ｐａｅｏｎｉａ ｌａｃｔｉｆｌｏｒａ Ｐａｌｌａｓ）」の基原植物も含む。大和シャクヤクとは、学名がＰａｅｏｎｉａ ｌａｃｔｉｆｌｏｒａ Ｐａｌｌａｓ ｖａｒ．ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ Ｂｕｎｇｅであり、花弁が５〜２０個の重弁のもので、雄蕊が狭長な花辧に変化しているため雄蕊が全く無く、即ち葯が形成されない雄性不稔であり、種子ができないという特徴を持っている。
【００１２】
本発明の組織培養に用いられるシャクヤク組織は特に限定されないが、生長点およびそれを含む組織が用いられ、特に根茎の生長点が好ましい。生長点とは、植物の茎頂部や根の先端で細胞分裂を繰り返ししている分裂組織をいう。生長点を組織培養に用いる場合、採取した生長点は、通常の方法に従って、エタノールおよび次亜塩素酸ナトリウムあるいは過酸化水素水等で表面殺菌を行い、滅菌水で洗浄後に、培地中で培養する。
【００１３】
さらに根茎の生長点を組織培養する場合、先ず冬眠打破操作がなされるが、生長点採取時期により、冬眠打破の条件が異なる。例えば、９月頃採取した生長点の場合は、その冬眠打破にはジベレリン処理が必要であるが、２月以降の萌芽時期の生長点組織の場合は、ジベレリン処理はしなくてもよい。冬眠打破に用いられるジベレリン量は、例えば、０．１〜２０ｍｇ／Ｌを培地に添加するが、１〜５ｍｇ／Ｌを添加するのが好ましい。また、冬眠打破には低温処理が必要であるが、その好ましい温度は、例えば７〜１５℃である。冬眠打破に要する期間は、例えば１〜３週間要する。
【００１４】
本発明の組織培養において、培養物の褐変化抑制には、低酸素条件下が好ましいが、通常の空気酸素濃度（２３％（ｖ／ｖ））より低濃度であれば良く、例えば、酸素濃度１５％〜１％（ｖ／ｖ）の範囲で用いられ、好ましい酸素濃度は１０％〜３％（ｖ／ｖ）であり、さらに好ましくは１０％〜５％（ｖ／ｖ）である。一方、二酸化炭素濃度は、自然界濃度よりも高い方が生長点組織の生育が良くなる傾向にある。例えば、酸素濃度が１０％〜５％（ｖ／ｖ）、二酸化炭素濃度５％の組み合わせが好ましい結果が得られる。
【００１５】
本発明の組織培養に用いられる培地としては、公知の培地が用いられる。例えば、ムラシゲ・スクーグ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ Ｓｋｏｏｇ；ＭＳ）培地、ガンボーグ（Ｇａｍｂｏｒｇ）Ｂ５培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地など、またはこれらの培地の組成を改変した培地などを挙げることができ、これらの培地を適宜希釈して用いることができる。
【００１６】
木本植物の褐変化抑制のためには、低酸素条件下に加えて、培地の鉄分として用いる硫酸鉄（硫酸第二鉄または硫酸第一鉄）量を少なくした培地を用いること、例えば硫酸鉄の添加濃度を８μｇ／ｍＬ以下にするのが好ましいが、鉄分として硫酸鉄の変わりに鉄キレート（ＦｅＮａＥＤＴＡ；エチレンジアミン四酢酸鉄ナトリウム塩）を用いることが効果的である。鉄キレートの培地中の濃度は、例えば１０〜１００μＭが好ましく，さらに２０〜７５μＭが好ましい。
【００１７】
培地に用いられ炭素源として糖類が用いられるが、糖類のなかでショ糖とグルコースを用いるのが好ましく、例えば１〜３％濃度を使用するのが好ましい。
【００１８】
組織培養により、生長点からシュート形成は、ジベレリンおよびサイトカイニン系植物ホルモンを添加した培地にて、必要に応じてオーキシン系植物ホルモンを添加して培養されるが、低酸素条件下では、１５〜３０℃、好ましくは２０〜２５℃にて培養するのが好ましい。１日の光照射は、例えば５０００Ｌｕｘで１６時間（８時間暗条件）であり、培養期間は、冬眠打破から１〜数ヶ月培養する。
【００１９】
本発明において、培地に添加して用いられるサイトカイニン類としては、ベンジルアデニン（ＢＡＰ）、１−フェニル−３−(１，２，３−チアジアゾール−５−イル)ウレア（チジアズロン）、Ｎ６−（３−メチルブテ−２−エンイル）アデニン（２−ｉＰ）などが好ましく、培地に添加される量としては、０．１〜５ｍｇ／Ｌが好ましい。オーキシン類としては、１−ナフチル酢酸（ＮＡＡ）、４−インドール−３−イル酪酸（ＩＢＡ）、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）が好ましく、培地に添加される量としては、０．０１〜３ｍｇ／Ｌが好ましい。また、ジベレリンの培地に添加される量としては、例えば０．５〜５ｍｇ／Ｌが好ましい。
【００２０】
シュート形成工程において、例えば鉄キレートを用いる１／２ＭＳ改良培地が好ましく、培地に添加する好ましいジベレリン量は約１ｍｇ／Ｌ、好ましいサイトカイニン類とオーキシン類の組み合わせと添加比率は、例えば、２−ｉＰ（１ｍｇ／Ｌ）と２，４−Ｄ（０．５ｍｇ／Ｌ）、チジアズロン（０．１ｍｇ／Ｌ）とＮＡＡ（０．１ｍｇ／Ｌ）、チジアズロン（０．５ｍｇ／Ｌ）とＩＢＡ（０．１ｍｇ／Ｌ）、チジアズロン（０．５ｍｇ／Ｌ）と２,４−Ｄ（０．１ｍｇ／Ｌ）の組み合わせと使用量が好ましい。さらに低酸素条件下にて、例えば２０〜２５℃範囲で、１〜３ヶ月培養するのが好ましい。
【００２１】
発根工程において、例えば鉄キレートを用いる１／２ＭＳ改良培地が好ましいが、例えば、ジベレリン１ｍｇ／Ｌ、オーキシン類としてＩＡＡ（０．５ｍｇ／Ｌ）を用いて、低酸素条件下にて、２０〜２５℃範囲で培養し発根させるのが好ましい。かくして植物体を得ることができる。
【００２２】
かくして組織培養で多量に得られるシャクヤク、特に大和シャクヤクの植物体の苗は、例えば水耕栽培等の人工栽培で大量に培養することができる。
【００２３】
以下に、本発明を実施例に基づいて説明する。本発明は以下の実施例によってなんら限定されるものではなく、本発明の属する技術分野における通常の変更を加えて実施することが出来ることは言うまでもない。
【実施例】
【００２４】
実施例１（好ましい鉄成分のスクリーニング）
シャクヤク抽出物とシャクヤク含有成分の没食子酸を用いて、培地に添加する好ましい鉄成分のスクリーニングを実施した。
【００２５】
大和シャクヤク根１０ｇを破砕後、１００ｍＬの水を加え、１００℃で１時間加熱し、ろ過したものをシャクヤク抽出物とした。その抽出物ならびに没食子酸溶液（０．ｌｇ／１００ｍＬ）にＨ２Ｏ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、Ｆｅ（ＳＯ４）３・ｎＨ２Ｏ、ＮａＦｅＥＤＴＡおよびＦｅ（III）Ｃｉｔｒａｔｅをそれぞれ１００μＭとなるよう加え、室温で一夜反応させた。反応液の着色度は、分光光度計を用い、６００ｎｍの値を測定した。その結果を表１に示す。表１の示すごとく、鉄分としてＮａＦｅＥＤＴＡを用いると、着色せず好ましい結果が得られた。
【００２６】
【表１】
【００２７】
実施例２（褐変化抑止効果試験）
（１）シャクヤク生長点の滅菌
大和シャクヤク根茎に形成された生長点組織（約０．５〜１．５ｃｍ）を摘出し、それらを水道水で洗浄後、７０％エタノール溶液で３０秒、１％次亜塩素酸ナトリウム（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む）溶液で２０分間処理により滅菌した。滅菌水で数回洗浄後、生長点の周りに形成された子葉をメスで切り取り、実験に供試した。
【００２８】
（２）比較実験
低酸素ガスは、Ａｓｔｅｃ社製のガス混合機ＧＡＳ Ｍｉｘｅｒ（ＧＭＳ−２ＧＡ）を
用い、窒素ガスと二酸化炭素ガスを流入させることにより調製した。密閉型のデシケータ
ーに混合ガスを送り込み、その中で供試材料を培養した。
【００２９】
滅菌された生長点を０．２５％のゲルライトと植物ホルモンを含むＭＳ培地またはＭＳ培地改変培地（ＭＳ培地成分のＦｅＳＯ４・７Ｈ２ＯおよびＥＤＴＡ・２ＮａをＦｅＮａＥＤＴＡに換えたもので、表２に成分組成を示す）に置床し、２５℃１６時間光照射（８時間暗条件）下で１ヶ月間培養した。植物ホルモンとして、サイトカイニンであるＢｅｎｚｙｌａｄｅｎｉｎｅ（ＢＡＰ）または１−ｐｈｅｎｙｌ−３−（１，２，３−ｔｈｉａｄｉａｚｏｌ−５−ｙｌ）ｕｒｅａ（Ｔｈｉｄｉａｚｕｒｏｎ）を１ｍｇ／Ｌ，ジベレリンを１ｍｇ／Ｌ添加した。また、培養で調整した酸素および二酸化炭素濃度については、５％酸素と５％二酸化炭素、ならびに対照区として酸素濃度２３％、二酸化炭素濃０．０３％を設けた。結果を表３に示す。表３より、低酸素条件及びＦｅＮａＥＤＴＡ（２５μＭ）の使用の組み合わせが最も良い結果が得られた。
【００３０】
【表２】
【００３１】
【表３】
【００３２】
実施例３（シュート形成実験）
実施例２と同様に、酸素と二酸化炭素濃度を、それぞれ５％と５％ならびに１０％と５％に調製した雰囲気下にて、滅菌した生長点を０．２５％のゲルライトと植物ホルモンを含むＭＳ改変培地に置床し、２５℃１６時間光照射（８時間暗条件）下で１ヶ月間培養した。植物ホルモンは、Ｂｅｎｚｙｌａｄｅｎｉｎｅ（ＢＡＰ）または１−ｐｈｅｎｙｌ−３−（１，２，３−ｔｈｉａｄｉａｚｏｌ−５−ｙｌ）ｕｒｅａ（Ｔｈｉｄｉａｚｕｒｏｎ）のサイトカイニン系のホルモンを使用し、１ｍｇ／Ｌを培地に添加した。また、休眠打破のためジベレリンを１ｍｇ／Ｌ添加した。１ヶ月間培養した結果を図１に示す。いずれの実験も褐変化を起こしていなかった。
【００３３】
実施例４（シュートの発根実験）
低酸素条件下（酸素濃度５％、二酸化炭素濃度５％）で、３−ｉｎｄｏｌｅａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（ＩＡＡ）を１ｍｇ／Ｌ添加した１／２ＭＳ改変培地に、実施例３と同様にして得られたシュートを移殖し、１４日間培養すると、図２に示すように褐変化せず発根が誘導され、植物体が得られた。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明により、木本植物の組織培養における培養物の褐変化抑制を提供し、さらに雄性不稔であり種子のできないが、生薬優良原料である大和シャクヤクの根茎の生長点を組織培養から植物体を育成し、優良品種のクローン苗の大量培養法を提供した。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】実施例３のシュート形成実験において、培養１ヶ月目のシュートであり、いずれも褐変化していない。
【図２】実施例４のシュートの発根実験において、培養１４日で、褐変化せず発根したシュート（大和シャクヤク植物体）が得られた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シャクヤク（Ｐａｅｏｎｉａ ｌａｃｔｉｆｌｏａｒａ Ｐａｌｌａｓ）を含む木本植物の組織培養における培養物の褐変化抑制方法、ならびにその方法を用いるシャクヤクの組織培養法に関するものである。具体的には大和シャクヤク（Ｐａｅｏｎｉａ ｌａｃｔｉｆｌｏｒａ Ｐａｌｌａｓ ｖａｒ． ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ Ｂｕｎｇｅ）の組織培養において、褐変化を抑制する条件下にて、根茎の生長点からシュートを誘導する方法、得られたシュートを発根培地で発根させることにより大和シャクヤクの植物体を得る方法に関するもので、大和シャクヤクの大量増殖法に繋がる技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
シャクヤクはその花が、美しいため、かつて中国では同属のボタンと同様に貴ばれ、「花相」と称されていた。日本には自生せず、奈良時代に薬として渡来したと言われている。江戸時代には観賞用として和芍と総称される多くの園芸品種が作り出された。現在、シャクヤクには江戸時代から育成されてきた和芍系統、シベリア及び中国から欧米に渡り、１８世紀に作出された洋芍系統、ヨーロッパにもともと自生しているものを園芸的に改良したオランダ芍薬系統等があり、近年は雑種間によって得られたハイブリッド系統も増えている。薬用には和芍系統の品種が用いられ、ボタン同様、薬用を目的に栽培する場合、根の発育が良くなるように花の蕾を摘み取る。特に「大和シャクヤク」と称され、古くから奈良県下で栽培、育成され、薬用に用いられる優良品種は、白花、青茎品とされ、一茎に三花を付け、花弁が５〜２０個の重弁のもので、雄蕊が狭長な花辧に変化しているため雄蕊が全く無く、即ち葯が形成されない雄性不稔である。このように大和シャクヤクは、種子や腋芽が形成されないことから、栽培は全て根茎の株分けでしか繁殖させることができず、大量増殖が難しく、ごく一部の篤農家によって栽培が続けられているという状況にある。
【０００３】
一方、植物組織を培養容器内で栄養繁殖、あるいは増殖させて大量のクローン苗を生産する組織培養技術は、栄養繁殖性の花卉、作物のみならず、優良形質を備えた植物個体を大量生産する方法として近年盛んに用いられており、生産品の均一化や高収量化等、大きな効果をもたらす一方、木本植物、即ち樹木においても、挿し木等が困難な種を中心として、その適用によるクローン苗の生産・大量増殖が期待されている。これは、優良生薬原料である大和シャクヤクにおいても例外ではないが、これまでに大和シャクヤクの組織培養による報告例は全くなく、大和シャクヤクの組織培養法の確立が望まれていた。
【０００４】
他方、シャクヤクを含む木本植物は、一般に細胞壁木化のためリグニンが多量に存在し、その前駆物質として多量のポリフェノール類、カテキン類等が細胞内に含有されている。事実、生薬として用いられるシャクヤクは、ペンタガロイルグルコース等没食子酸およびその誘導体等を含むことが報告されている（非特許文献１）。このため、木本植物の組織培養において、細胞の障害、破損や培養物の２次代謝物分泌などにより、培地に溶出したこれらのポリフェノール類等が酸化され、木本植物の培養物の褐変化を招き、致命的な成長阻害をもたらす。このため褐変化抑制方法に関する検討もなされ、培地に活性炭を添加する方法（非特許文献２）、高粘度液体培地を用いる方法（特許文献１）、セルロースを含む固体培地を使用する方法（特許文献２）等が報告されているが、適用範囲に限界があり新たな褐変化抑制方法の開発が望まれていた。
【０００５】
【特許文献１】特開平６−４６８３８号公報
【特許文献２】特開２０００−１３９２５２号公報
【非特許文献１】Ｗ．Ｃ．Ｃｈｕａｎｇら、Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄｉｃａ，６２巻、３４７−３５１頁（１９９６年）
【非特許文献２】Ｊ．Ｍ．Ｂｏｎｇａら編、「Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｔｒｅｅｓ」、４８頁、１９９２年発行（Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ出版）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、木本植物の組織培養における培養物の褐変化抑制方法、およびそれを用いたシャクヤクの組織培養法に関するもので、特に薬用として優れた品種である大和シャクヤクの大量生産に繋がる方法を提供することを目的とする。大和シャクヤクは、雄性不稔であり種子ができないため、その組織培養法及び大量培養法の確立が望まれており、種々検討を開始したが、培養段階における生長点組織の褐変化が大きな問題であることが判明し、その解決がのぞまれた。
【０００７】
本発明の目的は、シャクヤクを含む木本植物の組織培養における培養物の褐変化抑制する方法とともに、それを用いた組織培養法によりシャクヤク、特に大和シャクヤクの植物体を得る方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は上記目的を達成すべく鋭意検討した結果、大和シャクヤクの根茎の生長点の組織培養において、低酸素条件下にて培養することにより培養物の褐変化を抑制することができ、また、培地の鉄分としてキレート鉄を用いることが、培養物の褐変化抑制には効果的であることを見出した。さらに大和シャクヤクの生長点からシュート形成させる好適条件、ならびに発根させるための好適条件を見出し、大和シャクヤクの生長点から植物体を得る方法を確立し、本発明を完成した。
【０００９】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）シャクヤク（Ｐａｅｏｎｉａ ｌａｃｔｉｆｌｏｒａ Ｐａｌｌａｓ）組織の培養において、低酸素条件下および／またはキレート鉄（ＮａＦｅＥＤＴＡ）含有培地で培養することを特徴とする組織培養法；
（２）シャクヤクが大和シャクヤク（Ｐａｅｏｎｉａ ｌａｃｔｉｆｌｏｒａ Ｐａｌｌａｓ ｖａｒ． ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ Ｂｕｎｇｅ）である（１）記載の組織培養法；
（３）シャクヤク組織が生長点である（１）または（２）記載の組織培養法；
（４）低酸素条件が酸素濃度１５％〜１％（ｖ／ｖ）であることを特徴とする（１）〜（３）いずれかに記載の組織培養法；
（５）キレート鉄（ＮａＦｅＥＤＴＡ）の培地中の濃度が１０μＭ〜１００μＭであることを特徴とする（１）〜（３）いずれかに記載の組織培養法；
（６）大和シャクヤクの生長点の組織培養において、生長点をジベレリンおよびサイトカイニン系植物ホルモンを含有する培地中で培養することによりシュートを形成させ、該シュートを、オーキシン系植物ホルモンを含有する培地中にて発根させて大和シャクヤク植物体を得ることを特徴とする（１）〜（５）いずれかに記載の組織培養法；
（７）木本植物組織の組織培養において、低酸素条件下および／またはキレート鉄（ＮａＦｅＥＤＴＡ）含有培地で培養することを特徴とする培養物の褐変化抑制方法；
（８）木本植物が大和シャクヤクである（７）記載の褐変化抑制方法；
（９）木本植物組織が生長点である（７）または（８）記載の褐変化抑制方法；
（１０）低酸素条件が酸素濃度１５％〜１％（ｖ／ｖ）であることを特徴とする（７）〜（９）いずれかに記載の褐変化抑制方法；
（１１）キレート鉄（ＮａＦｅＥＤＴＡ）の培地中の濃度が１０μＭ〜１００μＭであることを特徴とする（７）〜（９）いずれかに記載の褐変化抑制方法；
などを提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、木本植物の組織培養における培養物の褐変化抑制方法、ならびにその方法を用いた雄性不稔で種子ができない大和シャクヤクの生長点の組織培養による大和シャクヤク増殖技術を確立し、生薬原料として優良形質を備えた大和シャクヤクのクローン苗を大量生産することが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下において、本発明を詳細に説明する。本明細書における木本植物とは、木（樹木）のことであり、茎および根が肥大成長して多量の木部をつくり、年々その細胞壁が木化して硬くなる多年生植物をいい、生薬「シャクヤク（Ｐａｅｏｎｉａ ｌａｃｔｉｆｌｏｒａ Ｐａｌｌａｓ）」の基原植物も含む。大和シャクヤクとは、学名がＰａｅｏｎｉａ ｌａｃｔｉｆｌｏｒａ Ｐａｌｌａｓ ｖａｒ．ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ Ｂｕｎｇｅであり、花弁が５〜２０個の重弁のもので、雄蕊が狭長な花辧に変化しているため雄蕊が全く無く、即ち葯が形成されない雄性不稔であり、種子ができないという特徴を持っている。
【００１２】
本発明の組織培養に用いられるシャクヤク組織は特に限定されないが、生長点およびそれを含む組織が用いられ、特に根茎の生長点が好ましい。生長点とは、植物の茎頂部や根の先端で細胞分裂を繰り返ししている分裂組織をいう。生長点を組織培養に用いる場合、採取した生長点は、通常の方法に従って、エタノールおよび次亜塩素酸ナトリウムあるいは過酸化水素水等で表面殺菌を行い、滅菌水で洗浄後に、培地中で培養する。
【００１３】
さらに根茎の生長点を組織培養する場合、先ず冬眠打破操作がなされるが、生長点採取時期により、冬眠打破の条件が異なる。例えば、９月頃採取した生長点の場合は、その冬眠打破にはジベレリン処理が必要であるが、２月以降の萌芽時期の生長点組織の場合は、ジベレリン処理はしなくてもよい。冬眠打破に用いられるジベレリン量は、例えば、０．１〜２０ｍｇ／Ｌを培地に添加するが、１〜５ｍｇ／Ｌを添加するのが好ましい。また、冬眠打破には低温処理が必要であるが、その好ましい温度は、例えば７〜１５℃である。冬眠打破に要する期間は、例えば１〜３週間要する。
【００１４】
本発明の組織培養において、培養物の褐変化抑制には、低酸素条件下が好ましいが、通常の空気酸素濃度（２３％（ｖ／ｖ））より低濃度であれば良く、例えば、酸素濃度１５％〜１％（ｖ／ｖ）の範囲で用いられ、好ましい酸素濃度は１０％〜３％（ｖ／ｖ）であり、さらに好ましくは１０％〜５％（ｖ／ｖ）である。一方、二酸化炭素濃度は、自然界濃度よりも高い方が生長点組織の生育が良くなる傾向にある。例えば、酸素濃度が１０％〜５％（ｖ／ｖ）、二酸化炭素濃度５％の組み合わせが好ましい結果が得られる。
【００１５】
本発明の組織培養に用いられる培地としては、公知の培地が用いられる。例えば、ムラシゲ・スクーグ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ Ｓｋｏｏｇ；ＭＳ）培地、ガンボーグ（Ｇａｍｂｏｒｇ）Ｂ５培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地など、またはこれらの培地の組成を改変した培地などを挙げることができ、これらの培地を適宜希釈して用いることができる。
【００１６】
木本植物の褐変化抑制のためには、低酸素条件下に加えて、培地の鉄分として用いる硫酸鉄（硫酸第二鉄または硫酸第一鉄）量を少なくした培地を用いること、例えば硫酸鉄の添加濃度を８μｇ／ｍＬ以下にするのが好ましいが、鉄分として硫酸鉄の変わりに鉄キレート（ＦｅＮａＥＤＴＡ；エチレンジアミン四酢酸鉄ナトリウム塩）を用いることが効果的である。鉄キレートの培地中の濃度は、例えば１０〜１００μＭが好ましく，さらに２０〜７５μＭが好ましい。
【００１７】
培地に用いられ炭素源として糖類が用いられるが、糖類のなかでショ糖とグルコースを用いるのが好ましく、例えば１〜３％濃度を使用するのが好ましい。
【００１８】
組織培養により、生長点からシュート形成は、ジベレリンおよびサイトカイニン系植物ホルモンを添加した培地にて、必要に応じてオーキシン系植物ホルモンを添加して培養されるが、低酸素条件下では、１５〜３０℃、好ましくは２０〜２５℃にて培養するのが好ましい。１日の光照射は、例えば５０００Ｌｕｘで１６時間（８時間暗条件）であり、培養期間は、冬眠打破から１〜数ヶ月培養する。
【００１９】
本発明において、培地に添加して用いられるサイトカイニン類としては、ベンジルアデニン（ＢＡＰ）、１−フェニル−３−(１，２，３−チアジアゾール−５−イル)ウレア（チジアズロン）、Ｎ６−（３−メチルブテ−２−エンイル）アデニン（２−ｉＰ）などが好ましく、培地に添加される量としては、０．１〜５ｍｇ／Ｌが好ましい。オーキシン類としては、１−ナフチル酢酸（ＮＡＡ）、４−インドール−３−イル酪酸（ＩＢＡ）、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）が好ましく、培地に添加される量としては、０．０１〜３ｍｇ／Ｌが好ましい。また、ジベレリンの培地に添加される量としては、例えば０．５〜５ｍｇ／Ｌが好ましい。
【００２０】
シュート形成工程において、例えば鉄キレートを用いる１／２ＭＳ改良培地が好ましく、培地に添加する好ましいジベレリン量は約１ｍｇ／Ｌ、好ましいサイトカイニン類とオーキシン類の組み合わせと添加比率は、例えば、２−ｉＰ（１ｍｇ／Ｌ）と２，４−Ｄ（０．５ｍｇ／Ｌ）、チジアズロン（０．１ｍｇ／Ｌ）とＮＡＡ（０．１ｍｇ／Ｌ）、チジアズロン（０．５ｍｇ／Ｌ）とＩＢＡ（０．１ｍｇ／Ｌ）、チジアズロン（０．５ｍｇ／Ｌ）と２,４−Ｄ（０．１ｍｇ／Ｌ）の組み合わせと使用量が好ましい。さらに低酸素条件下にて、例えば２０〜２５℃範囲で、１〜３ヶ月培養するのが好ましい。
【００２１】
発根工程において、例えば鉄キレートを用いる１／２ＭＳ改良培地が好ましいが、例えば、ジベレリン１ｍｇ／Ｌ、オーキシン類としてＩＡＡ（０．５ｍｇ／Ｌ）を用いて、低酸素条件下にて、２０〜２５℃範囲で培養し発根させるのが好ましい。かくして植物体を得ることができる。
【００２２】
かくして組織培養で多量に得られるシャクヤク、特に大和シャクヤクの植物体の苗は、例えば水耕栽培等の人工栽培で大量に培養することができる。
【００２３】
以下に、本発明を実施例に基づいて説明する。本発明は以下の実施例によってなんら限定されるものではなく、本発明の属する技術分野における通常の変更を加えて実施することが出来ることは言うまでもない。
【実施例】
【００２４】
実施例１（好ましい鉄成分のスクリーニング）
シャクヤク抽出物とシャクヤク含有成分の没食子酸を用いて、培地に添加する好ましい鉄成分のスクリーニングを実施した。
【００２５】
大和シャクヤク根１０ｇを破砕後、１００ｍＬの水を加え、１００℃で１時間加熱し、ろ過したものをシャクヤク抽出物とした。その抽出物ならびに没食子酸溶液（０．ｌｇ／１００ｍＬ）にＨ２Ｏ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、Ｆｅ（ＳＯ４）３・ｎＨ２Ｏ、ＮａＦｅＥＤＴＡおよびＦｅ（III）Ｃｉｔｒａｔｅをそれぞれ１００μＭとなるよう加え、室温で一夜反応させた。反応液の着色度は、分光光度計を用い、６００ｎｍの値を測定した。その結果を表１に示す。表１の示すごとく、鉄分としてＮａＦｅＥＤＴＡを用いると、着色せず好ましい結果が得られた。
【００２６】
【表１】
【００２７】
実施例２（褐変化抑止効果試験）
（１）シャクヤク生長点の滅菌
大和シャクヤク根茎に形成された生長点組織（約０．５〜１．５ｃｍ）を摘出し、それらを水道水で洗浄後、７０％エタノール溶液で３０秒、１％次亜塩素酸ナトリウム（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む）溶液で２０分間処理により滅菌した。滅菌水で数回洗浄後、生長点の周りに形成された子葉をメスで切り取り、実験に供試した。
【００２８】
（２）比較実験
低酸素ガスは、Ａｓｔｅｃ社製のガス混合機ＧＡＳ Ｍｉｘｅｒ（ＧＭＳ−２ＧＡ）を
用い、窒素ガスと二酸化炭素ガスを流入させることにより調製した。密閉型のデシケータ
ーに混合ガスを送り込み、その中で供試材料を培養した。
【００２９】
滅菌された生長点を０．２５％のゲルライトと植物ホルモンを含むＭＳ培地またはＭＳ培地改変培地（ＭＳ培地成分のＦｅＳＯ４・７Ｈ２ＯおよびＥＤＴＡ・２ＮａをＦｅＮａＥＤＴＡに換えたもので、表２に成分組成を示す）に置床し、２５℃１６時間光照射（８時間暗条件）下で１ヶ月間培養した。植物ホルモンとして、サイトカイニンであるＢｅｎｚｙｌａｄｅｎｉｎｅ（ＢＡＰ）または１−ｐｈｅｎｙｌ−３−（１，２，３−ｔｈｉａｄｉａｚｏｌ−５−ｙｌ）ｕｒｅａ（Ｔｈｉｄｉａｚｕｒｏｎ）を１ｍｇ／Ｌ，ジベレリンを１ｍｇ／Ｌ添加した。また、培養で調整した酸素および二酸化炭素濃度については、５％酸素と５％二酸化炭素、ならびに対照区として酸素濃度２３％、二酸化炭素濃０．０３％を設けた。結果を表３に示す。表３より、低酸素条件及びＦｅＮａＥＤＴＡ（２５μＭ）の使用の組み合わせが最も良い結果が得られた。
【００３０】
【表２】
【００３１】
【表３】
【００３２】
実施例３（シュート形成実験）
実施例２と同様に、酸素と二酸化炭素濃度を、それぞれ５％と５％ならびに１０％と５％に調製した雰囲気下にて、滅菌した生長点を０．２５％のゲルライトと植物ホルモンを含むＭＳ改変培地に置床し、２５℃１６時間光照射（８時間暗条件）下で１ヶ月間培養した。植物ホルモンは、Ｂｅｎｚｙｌａｄｅｎｉｎｅ（ＢＡＰ）または１−ｐｈｅｎｙｌ−３−（１，２，３−ｔｈｉａｄｉａｚｏｌ−５−ｙｌ）ｕｒｅａ（Ｔｈｉｄｉａｚｕｒｏｎ）のサイトカイニン系のホルモンを使用し、１ｍｇ／Ｌを培地に添加した。また、休眠打破のためジベレリンを１ｍｇ／Ｌ添加した。１ヶ月間培養した結果を図１に示す。いずれの実験も褐変化を起こしていなかった。
【００３３】
実施例４（シュートの発根実験）
低酸素条件下（酸素濃度５％、二酸化炭素濃度５％）で、３−ｉｎｄｏｌｅａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（ＩＡＡ）を１ｍｇ／Ｌ添加した１／２ＭＳ改変培地に、実施例３と同様にして得られたシュートを移殖し、１４日間培養すると、図２に示すように褐変化せず発根が誘導され、植物体が得られた。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明により、木本植物の組織培養における培養物の褐変化抑制を提供し、さらに雄性不稔であり種子のできないが、生薬優良原料である大和シャクヤクの根茎の生長点を組織培養から植物体を育成し、優良品種のクローン苗の大量培養法を提供した。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】実施例３のシュート形成実験において、培養１ヶ月目のシュートであり、いずれも褐変化していない。
【図２】実施例４のシュートの発根実験において、培養１４日で、褐変化せず発根したシュート（大和シャクヤク植物体）が得られた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シャクヤク（Ｐａｅｏｎｉａ ｌａｃｔｉｆｌｏｒａ Ｐａｌｌａｓ）組織の培養において、低酸素条件下および／またはキレート鉄（ＮａＦｅＥＤＴＡ）含有培地で培養することを特徴とする組織培養法。
【請求項２】
シャクヤクが大和シャクヤク（Ｐａｅｏｎｉａ ｌａｃｔｉｆｌｏｒａ Ｐａｌｌａｓ ｖａｒ． ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ Ｂｕｎｇｅ）である請求項１記載の組織培養法。
【請求項３】
シャクヤク組織が生長点である請求項１または２記載の組織培養法。
【請求項４】
低酸素条件が酸素濃度１５％〜１％（ｖ／ｖ）であることを特徴とする請求項１〜３いずれか１項記載の組織培養法。
【請求項５】
キレート鉄（ＮａＦｅＥＤＴＡ）の培地中の濃度が１０μＭ〜１００μＭであることを特徴とする請求項１〜３いずれか１項記載の組織培養法。
【請求項６】
大和シャクヤクの生長点の組織培養において、生長点をジベレリンおよびサイトカイニン系植物ホルモンを含有する培地中で培養することによりシュートを形成させ、該シュートを、オーキシン系植物ホルモンを含有する培地中にて発根させて大和シャクヤク植物体を得ることを特徴とする請求項１〜５いずれか１項記載の組織培養法。
【請求項７】
木本植物組織の組織培養において、低酸素条件下および／またはキレート鉄（ＮａＦｅＥＤＴＡ）含有培地で培養することを特徴とする培養物の褐変化抑制方法。
【請求項８】
木本植物が大和シャクヤクである請求項７記載の褐変化抑制方法。
【請求項９】
木本植物組織が生長点である請求項７または８記載の褐変化抑制方法。
【請求項１０】
低酸素条件が酸素濃度１５％〜１％（ｖ／ｖ）であることを特徴とする請求項７〜９いずれか１項記載の褐変化抑制方法。
【請求項１１】
キレート鉄（ＮａＦｅＥＤＴＡ）の培地中の濃度が１０μＭ〜１００μＭであることを特徴とする請求項７〜９いずれか１項記載の褐変化抑制方法。
【請求項１】
シャクヤク（Ｐａｅｏｎｉａ ｌａｃｔｉｆｌｏｒａ Ｐａｌｌａｓ）組織の培養において、低酸素条件下および／またはキレート鉄（ＮａＦｅＥＤＴＡ）含有培地で培養することを特徴とする組織培養法。
【請求項２】
シャクヤクが大和シャクヤク（Ｐａｅｏｎｉａ ｌａｃｔｉｆｌｏｒａ Ｐａｌｌａｓ ｖａｒ． ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ Ｂｕｎｇｅ）である請求項１記載の組織培養法。
【請求項３】
シャクヤク組織が生長点である請求項１または２記載の組織培養法。
【請求項４】
低酸素条件が酸素濃度１５％〜１％（ｖ／ｖ）であることを特徴とする請求項１〜３いずれか１項記載の組織培養法。
【請求項５】
キレート鉄（ＮａＦｅＥＤＴＡ）の培地中の濃度が１０μＭ〜１００μＭであることを特徴とする請求項１〜３いずれか１項記載の組織培養法。
【請求項６】
大和シャクヤクの生長点の組織培養において、生長点をジベレリンおよびサイトカイニン系植物ホルモンを含有する培地中で培養することによりシュートを形成させ、該シュートを、オーキシン系植物ホルモンを含有する培地中にて発根させて大和シャクヤク植物体を得ることを特徴とする請求項１〜５いずれか１項記載の組織培養法。
【請求項７】
木本植物組織の組織培養において、低酸素条件下および／またはキレート鉄（ＮａＦｅＥＤＴＡ）含有培地で培養することを特徴とする培養物の褐変化抑制方法。
【請求項８】
木本植物が大和シャクヤクである請求項７記載の褐変化抑制方法。
【請求項９】
木本植物組織が生長点である請求項７または８記載の褐変化抑制方法。
【請求項１０】
低酸素条件が酸素濃度１５％〜１％（ｖ／ｖ）であることを特徴とする請求項７〜９いずれか１項記載の褐変化抑制方法。
【請求項１１】
キレート鉄（ＮａＦｅＥＤＴＡ）の培地中の濃度が１０μＭ〜１００μＭであることを特徴とする請求項７〜９いずれか１項記載の褐変化抑制方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００９−２３２６９１（Ｐ２００９−２３２６９１Ａ）
【公開日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−７９４２８（Ｐ２００８−７９４２８）
【出願日】平成２０年３月２６日（２００８．３．２６）
【出願人】（３０６０２３３３６）財団法人奈良県中小企業支援センター (18)
【出願人】（０００１２５３４７）学校法人近畿大学 (389)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月２６日（２００８．３．２６）
【出願人】（３０６０２３３３６）財団法人奈良県中小企業支援センター (18)
【出願人】（０００１２５３４７）学校法人近畿大学 (389)
【Ｆターム（参考）】
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