シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体
【課題】光学異性の相互変換を触媒し、また、酵素の回収、再利用、連続利用を容易とするシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体、その製造方法及び用途を提供する。
【解決手段】光学異性の相互変換を触媒する酵素とシリカ系メソ多孔体の複合体であり、シリカ系メソ多孔体へ固定化された酵素が、光学異性の相互変換を触媒する活性を有していることで特徴付けられるシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体、及びシリカ系メソ多孔体と光学異性の相互変換を触媒する酵素の溶解した溶液とを混合することにより、光学異性相互変換酵素をシリカ系メソ多孔体に固定化するシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体の製造方法、その複合体及び酵素固定化機能性部材。
【効果】酵素の再利用性と保存性を高めたシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体、その製法及び機能性部材を提供する。
【解決手段】光学異性の相互変換を触媒する酵素とシリカ系メソ多孔体の複合体であり、シリカ系メソ多孔体へ固定化された酵素が、光学異性の相互変換を触媒する活性を有していることで特徴付けられるシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体、及びシリカ系メソ多孔体と光学異性の相互変換を触媒する酵素の溶解した溶液とを混合することにより、光学異性相互変換酵素をシリカ系メソ多孔体に固定化するシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体の製造方法、その複合体及び酵素固定化機能性部材。
【効果】酵素の再利用性と保存性を高めたシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体、その製法及び機能性部材を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シリカ系メソ多孔体と光学異性相互変換酵素の複合体に関するものであり、更に詳しくは、表面に未処理あるいは適切な溶液で官能基を付与する処理等が施されたシリカ系メソ多孔体への酵素の吸着現象を、酸素の固定化法として利用して複合化した、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体、その製造方法及びその用途に関するものである。
【０００２】
本発明は、表面を未処理あるいは適切な溶液で官能基を付与する処理等を施したシリカ系メソ多孔体への酵素の吸着現象を、酵素の固定化法として利用し、シリカ系メソ多孔体の細孔内もしくは表面に、酵素を安定に固定し、かつその酵素の機能を発揮させることを可能とすると共に、酵素の再利用性と保存性を高めたシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体、その製造方法、及び、その機能性部材としての用途に関する新技術・新製品を提供するものである。
【背景技術】
【０００３】
酵素を用いた生化学品、食品製造の技術分野においては、従来、酵素を水に溶解させて用いることが多い。この操作法では、タンパク質である酵素の溶解度に限界があり、ある一定濃度以上の酵素が高密度に存在すると、該酵素が、凝集を起こし、活性を失うことがしばしばである。一方、酵素反応を用いた反応系では、酵素の存在量が多いほど、反応速度、ひいては反応生成物の生産速度を高められることが、容易に予想される。
【０００４】
その一方で、シリカ系メソ多孔体は、２〜５０ｎｍの直径の細孔を有することを特徴としており、その細孔内部への酵素の導入、固定が可能である。したがって、シリカ系メソ多孔体は、数ｎｍから十数ｎｍの大きさを有する酵素、すなわち、タンパク質の吸着、固定に対して、有効な表面を多く有している、有望な担体材料と見なすことができる。
【０００５】
このようなシリカ系メソ多孔体を、酵素の固定化のための担体として使用した場合、ある一定濃度以上の高密度に存在する酵素の凝集を防ぐことが可能となり、活性を有する酵素の高集積化が可能となる。このことは、酵素を用いた反応系において、通常の酵素溶液においては、凝集を起こしてしまう量を越えて、酵素を存在させることが可能になることを意味すると考えられる。更には、酵素が容易に凝集を起こしてしまうｐＨ領域においても、酵素が固定化されていることから、凝集を起こさないため、そのようなｐＨ領域でも、反応系を構築できる可能性があると考えられる。
【０００６】
一般に、担体に、酵素を固定化して用いることは、従前より行われてきたことであるが、その目的は、酵素の分離、及び再利用に関するものがほとんどである。例えば、従来の酵素を用いた生化学品、食品製造の技術分野においては、酵素を水に溶解させて用いることが多く、この操作法では、反応生成物と酵素の分離操作が必要不可欠であり、また、分離された酵素は、廃棄されることが一般的である。この酵素の分離工程を省く目的で、酵素を、担体に固定化して用いるための、酵素の固定化技術が盛んに開発されている。
【０００７】
酵素の固定化法としては、例えば、酵素を、樹脂ビーズ等に直接固定化する方法や、酵素へのポリマーの被覆によるマイクロカプセル化、酵素タンパク質表面を修飾して安定化させる表面修飾法等が提案されている。しかしながら、これらの方法は、酵素が固定化担体の表面上に固定されているだけであり、酵素の高集積化や、固定化による酵素機能の向上を目指したものではない
【０００８】
酵素の再利用を目的とした酵素の固定化も検討されているが、この方法の場合も、分離工程の排除を目的とした方法と大きな違いはなく、酵素の各種担体表面への単純な固定を行っているものが多い。酵素を、高分子発泡体に固定化する方法も用いられており、この場合は、発泡体を圧縮することにより、反応生成物を含む溶液を分離すること、等が行われている。
【０００９】
酵素の固定化法の開発により、酵素を用いた生産プロセスにおいて、反応後の酵素の分離回収や、その再利用が可能となり、酵素の固定化が、酵素を用いた生産プロセスの効率化に貢献していることは事実である。しかし、酵素の固定化により、酵素の高集積化や、酵素機能そのものの向上を目的とした検討は、十分には行われていないのが実情である。
【００１０】
このような状況の中で、本発明者らは、酵素の固定化により、酵素の高集積化や、酵素機能そのものの向上を目的として、酵素の担体として有望なシリカ系メソ多孔体への酵素、すなわちタンパク質の吸着・固定化現象を研究し（特許文献１参照）、この過程で、酵素、すなわちタンパク質のシリカ系メソ多孔体の細孔内への固定や、タンパク質の熱安定性や有機溶媒耐性の向上を見出し、シリカ系メソ多孔体を用いたタンパク質の機能賦活方法（特許文献１、及び非特許文献１）を開発するに至った。
【００１１】
シリカ系メソ多孔体としては、一般に、ＭＣＭ、ＦＳＭ、ＳＢＡタイプ等の材料系が知られている。これらのシリカ系メソ多孔体は、２〜５０ｎｍの直径の細孔を有することを特徴とする。酵素、すなわちタンパク質は、数ｎｍから十数ｎｍの大きさを有しており、シリカ系メソ多孔体の有する細孔径と同程度の大きさの分布を有している。
【００１２】
このことから、シリカ系メソ多孔体を、酵素の固定化担体として用いた場合、酵素を、表面のみならずシリカ系メソ多孔体の細孔内にも固定化することができ、シリカ系メソ多孔体の、酵素の固定化に対する有効な表面積が、従来の技術によるものより極めて大きくなり、シリカ系メソ多孔体に大量の酵素を固定化することが可能である。
【００１３】
シリカ系メソ多孔体に、種々の酵素を固定化しようとする試みには、いくつかの報告がある（非特許文献２、３、４）。しかしながら、工業的な利用を想定した場合、種々の問題が未解決であると思われ、また、これらの報告では、光学異性の相互変換を触媒する酵素は、取り扱われた例がない。
【００１４】
このような問題を解決するために、シリカ系メソ多孔体の表面に処理を加え、酵素との結合を形成する官能基を、シリカ系メソ多孔体の表面に形成される方法が報告された（非特許文献５）。しかしながら、ここで用いられている表面処理の方法は、極めて煩雑で、効率の悪いものであり、また、価格的にも利点が少ないものである。生化学品、食品製造の技術分野においては、簡便な方法で、酵素の固定化が行われることが望ましいことは言うまでもない。
【００１５】
生体内のアミノ酸は、ほとんどがＬ形であり、Ｄ形は、ある種の生理活性ペプチドの構成成分として存在する。このことから、Ｄ形アミノ酸を含む物質が、医薬品、生化学品において、特異な性質を示し、ひいては有用な材料となることがしばしばである。それらの製造において、Ｄ形、Ｌ形のアミノ酸を任意に入手できる技術が需要であり、この反応に、光学異性の相互変換を触媒する酵素を利用することが有効である。
【００１６】
すなわち、天然に存在するＬ形アミノ酸を、Ｄ形に変換したり、Ｄ形とＬ形の存在比率を変化させたりすることを効率的に進行させるには、光学異性の相互変換を触媒する多種多様な酵素の働きを利用することが重要である。このことは、工業的な医薬品、生化学品の製造において、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を利用、適用する上でも重要なことである。
【００１７】
光学異性の相互変換を触媒する酵素以外の酵素を、シリカ系メソ多孔体に固定化した例としては、α−アミラーゼを、ＭＣＭもしくはＳＢＡタイプのシリカ系メソ多孔体に固定化した例がある（非特許文献６）。しかしながら、光学異性の相互変換を触媒する酵素を固定化した例はほとんどなく、また、入手が容易ではない光学異性の相互変換を触媒する酵素は、繰り返し利用ができることが望ましく、多種多様なシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体の開発が望まれる。
【００１８】
そのため、当該技術分野においては、シリカ系メソ多孔体において、その細孔内に、光学異性の相互変換を触媒する酵素を固定化することが可能であり、また、高度に集積化することも可能であるシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体、その製造方法及び該酵素の機能賦活技術を確立することが強く望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】特開２００７−５１０７６号公報
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，Ｖｏｌ．８（２００７）６６８−６７４
【非特許文献２】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌ．Ｂ２（１９９６）１１５−１２６
【非特許文献３】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌ．Ｂ１０（２０００）４５３−４６９
【非特許文献４】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌ．Ｂ２２（２００３）１１９−１３３
【非特許文献５】Ｍｉｃｒｏｐｏｒ．Ｍｅｓｏｐｏｒ．Ｍａｔｅｒ．７７（２００５）６７−７７
【非特許文献６】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌ．Ｂ３５（２００５）１５４−１６０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
このような状況下において、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、光学異性の相互変換を触媒する酵素とシリカ系メソ多孔体とを複合化させた、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を開発することを目標として鋭意研究を行った結果、シリカ系メソ多孔体に、光学異性の相互変換を触媒する酵素を、吸着現象を利用して固定化させることで、その酵素が固定化され、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体が形成されること、更に、このシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を用いて、酵素反応及び酵素の繰り返し利用の特性評価を行い、固定化された酵素が、所定の活性を有していること、該酵素の繰り返し利用に対して高活性を維持し得ること及び高い再利用性を有すること等を見出し、本発明を完成するに至った。
【００２２】
本発明は、アミノ酸等の光学異性を相互変換する際に、酵素の分離・回収を容易にし、繰り返し使用も可能とすると共に、基質を連続的に供給することで、光学異性の相互変換を連続的に進行させることができる、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を提供することを目的とするものである。また、本発明は、一般性、及び普遍性が高く、かつ簡単・簡略な操作による光学異性相互変換酵素を利用した連続生産技術を確立することを可能とするシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）光学異性の相互変換を触媒する酵素とシリカ系メソ多孔体との複合体であり、シリカ系メソ多孔体へ固定化された酵素が、光学異性の相互変換を触媒する活性を有していることを特徴とする、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体。
（２）光学異性の相互変換を触媒する酵素が、アミノ酸類に作用するラセマーゼ、ヒドロキシ酸類に作用するラセマーゼ、あるいは炭水化物及びその類縁体に作用するエピメラーゼであり、複合体が、当該酵素と、７．５ｎｍないし８．５ｎｍ径に細孔径分布のピークを持つシリカ系メソ多孔体との複合体であり、光学異性相互変換反応に、繰り返して使用できる再利用性を有する、前記（１）に記載のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体。
（３）シリカ系メソ多孔体が、ケイ素と酸素を必須成分として含む化合物の多孔体である、前記（１）又は（２）に記載のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体。
（４）シリカ系メソ多孔体が、２〜５０ｎｍの直径の細孔を有する、前記（１）から（３）のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体。
（５）シリカ系メソ多孔体が、０．１〜３．５ｍｌ／ｇの全細孔体積を有する、前記（１）から（４）のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体。
（６）シリカ系メソ多孔体が、２００〜１５００ｍ２の比表面積を有する、前記（１）から（５）のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体。
（７）シリカ系メソ多孔体と、光学異性の相互変換を触媒する酵素の溶解した溶液とを混合することにより、光学異性の相互変換を触媒する酵素を、シリカ系メソ多孔体に固定化することを特徴とする、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体の製造方法。
（８）シリカ系メソ多孔体の中心細孔径を変えることにより、固定化される酵素の量と活性を制御する、前記（７）に記載のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体の製造方法。
（９）シリカ系メソ多孔体に、酵素を固定化させる操作を繰り返すことにより、酵素の固定化量を制御もしくは増大する、前記（８）に記載のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体の製造方法。
（１０）シリカ系メソ多孔体が、７．５ｎｍないし８．５ｎｍ径に細孔径分布のピークを持つシリカ系メソ多孔体あり、該メソ多孔体に、酵素を固定化することにより、該酵素の保存性を向上させたシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を作製する、前記（７）に記載のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体の製造方法。
（１１）シリカ系メソ多孔体が、７．５ｎｍないし８．５ｎｍ径に細孔径分布のピークを持つシリカ系メソ多孔体あり、該メソ多孔体に、酵素を固定化することにより、該酵素の再利用性を向上させたシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を作製する、前記（７）に記載のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体の製造方法。
（１２）前記（１）から（６）のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体からなり、機能性を有する酵素を、シリカ系メソ多孔体上、及び細孔内に、安定に吸着、保持させたことを特徴とする酵素固定化機能性部材。
【００２４】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互交換酵素複合体であって、光学異性の相互変換を触媒する酵素とシリカ系メソ多孔体との複合体であり、シリカ系メソ多孔体へ固定化された酵素が、光学異性の相互変換を触媒する活性を有していることを特徴とするものである。
【００２５】
本発明では、光学異性の相互変換を触媒する酵素が、アミノ酸類に作用するラセマーゼ、ヒドロキシ酸類に作用するラセマーゼ、あるいは炭水化物及びその類縁体に作用するエピメラーゼであり、複合体が、当該酵素と、７．５ｎｍないし８．５ｎｍ径に細孔径分布のピークを持つシリカ系メソ多孔体との複合体であり、光学異性相互変換反応に、繰り返して使用できる再利用性を有すること、シリカ系メソ多孔体が、２〜５０ｎｍの直径の細孔を有すること、シリカ系メソ多孔体が、０．１〜３．５ｍｌ／ｇの全細孔体積を有すること、シリカ系メソ多孔体が、２００〜１５００ｍ２の比表面積を有すること、を好ましい実施の態様としている。
【００２６】
また、本発明は、上記シリカ系メソ多孔体−光学異性相互交換酵素複合体を製造する方法であって、シリカ系メソ多孔体と酵素の溶解した溶液とを混合することにより、光学異性の相互変換を触媒する酵素を、シリカ系メソ多孔体に固定化することを特徴とするものである。本発明では、シリカ系メソ多孔体の中心細孔径を変えることにより、固定化される酵素の量や活性を制御すること、シリカ系メソ多孔体に酵素を固定化させる操作を繰り返すことにより、固定化量を制御もしくは増大すること、を好ましい実施の態様としている。
【００２７】
更に、本発明は、酵素固定化機能性部材であって、上記シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体からなり、機能性を有する酵素を、シリカ系メソ多孔体上、及び細孔内に、安定に吸着、保持させたことを特徴とするものである。
【００２８】
本発明のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を構成するシリカ系メソ多孔体としては、ＭＣＭ、ＦＳＭ、ＳＢＡタイプ等の材料系が用いられる。これらの材料系は、その作製法の違いにより分類されるが、基本的構造は、類似したものである。ＭＣＭやＦＳＭタイプのメソ多孔体は、カチオン性界面活性剤を用いて形成されるミセルを鋳型として合成される。ＦＳＭタイプは、層状化合物であるカネマイトを原料として合成される。一方、ＳＢＡでは、中性の非イオン性界面活性剤のブロックコポリマーを用いて形成されるミセルを鋳型としている。
【００２９】
本発明のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体では、このような複数のタイプのシリカ系メソ多孔体が、光学異性の相互変換を触媒する酵素の固定用担体として使用される。しかし、基本的には、シリカ系メソ多孔体の構造を持つものであって、同様の機能・能力を有している限り、全て使用可能であり、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を構成するシリカ系メソ多孔体としては、上述のタイプのものに限定されるものではない。
【００３０】
本発明のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体の作製に際しては、合成されたシリカ系メソ多孔体に対し、特段の表面処理を施すことなく、洗浄の操作のみを行ったものを用いることが可能である。光学異性の相互変換を触媒する酵素を、シリカ系メソ多孔体に固定する操作は、光学異性の相互変換を触媒する酵素を溶解した溶液中に、当該シリカ系メソ多孔体を浸漬・混合する操作のみにより行われ、これらの操作自体は、極めて簡便で、単純な方法である。この場合、シリカ系メソ多孔体に対する表面処理は、必ずしも必要ではない。
【００３１】
しかしながら、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を構成するシリカ系メソ多孔体の、酵素に対する固定化の機能・能力は、基本的には、シリカ系メソ多孔体と酵素との間の吸着現象で発揮される。その際には、シリカ系メソ多孔体表面と酵素との間の親和性が重要となる上に、また、酵素の吸着は、その分散溶媒、分散溶媒中での酵素安定性、更には、分散溶媒のｐＨ等で影響されることが多い。
【００３２】
したがって、対象とする酵素及びそれを含む溶液の成分状況に応じて、本発明のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体は、それを構成するシリカ系メソ多孔体の表面の状態で、酵素に対する固定化の機能・能力が変わることがある。例えば、シリカ系メソ多孔体の表面に残るシラノール基は、反応性が高いため、酵素に対する固定化の機能・能力に悪影響を与えることが多い。そこで、上記複合体を、シラン処理によりシラノール基が不活性化もしくは減らされたシリカ系メソ多孔体で構成することが好ましい。
【００３３】
本発明では、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体の作製に際し、シリカ系メソ多孔体に表面処理を施すことは、適宜可能であるが、その表面処理の有無、処理の方法等は特に限定されるものではない。シリカ系メソ多孔体表面に形成されるべき官能基としては、固定化する酵素との親和性を確保できる官能基、例えば、アルコキシ基、オクタデシル基、オクチル基、フェニル基、ニトリル基、アミノ基、メルカプトプロピル基、チオール基等が挙げられる。これらは、基本的には、シリカ系メソ多孔体の表面に形成可能な官能基であれば良く、ここに例示した官能基に限定されるものではない。
【００３４】
本発明のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を構成する元素は、一般には、ケイ素と酸素であるが、ケイ素の一部が他の元素に置換したシリカ系メソ多孔体も、酵素の固定化機能を有する限り、使用することができる。シリカ系メソ多孔体を構成するケイ素と置換可能な元素の典型としては、例えば、アルミニウム、ホウ素、燐、ガリウム、ニオブ、チタン、錫、鉄、コバルト、銅、ニッケル、亜鉛、クロム、バナジウム、マンガン、ジルコニウム、タンタル、ハフニウム等が挙げられる。
【００３５】
しかし、これらに留まるものではなく、基本的に、シリカ系メソ多孔体の構造を破壊しないものであれば、いずれでも良い。また、その置換量に関しても、シリカ系メソ多孔体の構造を破壊しない量であれば、置換量は、いかなる量でも良く、これらの置換シリカ系メソ多孔体も、酵素固定化用の担体として使用することが可能である。
【００３６】
本発明のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を構成するシリカ系メソ多孔体は、いずれも、熱安定性、化学安定性に優れており、しかも、環境に対する負荷が低い物質であるので、本発明のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体は、例えば、生化学品製造、医薬品製造にとって極めて有用であり、その技術的並びに経済効果は、非常に優れたものと言える。
【００３７】
シリカ系メソ多孔体は、一般には、数ｎｍの細孔径を有する。そして、その細孔径は、シリカ系メソ多孔体の合成条件により制御することが可能である。例えば、固定化すべき酵素が５ｎｍの大きさを有していた場合、その酵素の大きさに相応した細孔径を有するシリカ系メソ多孔体を合成して、酵素固定化用担体として用いる選択肢があり、それにより、酵素の固定量を増加させたり、酵素の安定性を向上させたりすることが可能である。
【００３８】
本発明において、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を作製する際には、シリカ系メソ多孔体の細孔径を制御することが不可欠である。本発明では、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を作製する際に、シリカ系メソ多孔体の細孔径を制御することで、好適なシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を作製し、提供することが可能である。
【００３９】
本発明のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体では、光学異性の相互変換を触媒する酵素として、アミノ酸類に作用するラセマーゼ、ヒドロキシ酸類に作用するラセマーゼ、炭水化物及びその類縁体に作用するエピメラーゼを用いることができる。しかし、基本的には、光学異性の相互変換を行う酵素であれば、どのような種に由来するものでも良く、ここに例示した酵素に限定されるものではない。
【００４０】
本発明では、いずれの酵素を用いた場合であっても、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を作製する際に、シリカ系メソ多孔体の細孔径を制御すること、及び、シリカ系メソ多孔体表面上の官能基を制御すること、が重要である。本発明では、選択された酵素に対して、シリカ系メソ多孔体に対して、最適ないし好適化の処理を施すことが重要である。
【００４１】
本発明は、例えば、酵素を利用した生化学品、医薬品、食品製造の技術分野において、酵素の安定性や耐久性、生産速度の向上等により、連続的生産手法を構築することを可能とすると共に、反応生産物からの酵素の分離工程を排除することを可能とするものであり、その工程を、従来技術に比べ、大幅に効率化、簡略化することができるものである。
【００４２】
本発明では、シリカ系メソ多孔体の細孔への光学異性相互変換酵素の吸着条件、操作方法の具体的な構成は特に限定されるものではなく、固定化すべき酵素に応じて任意に設計することができる。本発明においては、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体は、単に、シリカ系メソ多孔体にラセマーゼを固定化しただけのものではない。
【００４３】
本発明では、これらのシリカ系メソ多孔体とラセマーゼとを複合化することにより、通常の固定化酵素の場合と比較して、１）高い酵素作用が維持できること、２）その耐熱性を向上させることができること、３）酵素の繰り返し利用による活性の低下が抑制できること、更に、４）酵素の回収を容易にできること、等の、従来の技術常識からは予期し得ない、かつシリカ系メソ多孔体とラセマーゼとを組み合わせた場合に特異的に生起される格別の作用効果を得ることを可能とするものであり、これらは、後記する実施例で、具体的かつ詳細に示したように、格別の実験をしてはじめて実証し得たものである。
【００４４】
更に、後記する実施例に記載されるように、酵素の保存性についての評価を行うために、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体の酵素活性測定において、例えば、酵素活性の測定に用いたものと同様のＧｅｏＲａｃＡが固定化された試料を２０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ ７．５），５０ｍＭ ＫＣｌ溶液中にて、４℃で４ヶ月間保存し、比較のため、シリカ系メソ多孔体に固定化されていない溶液に分散した状態のＧｅｏＲａｃＡも４℃で４ヶ月間保存し、両者のそれぞれ２μｇを、２．５ｍｌの１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．５），３ｍＭ Ｌ−アラニンを含む溶液に添加し、３０℃で２０４ｎｍのＣＤの変化を３分間測定し、活性を評価した。
【００４５】
両者の活性評価の結果、溶液に分散した状態のＧｅｏＲａｃＡは、４ヶ月保存することによって、１４％しか活性を保持していなかったが、シリカ系メソ多孔体に固定化されたＧｅｏＲａｃＡは９４％の活性を保持していた。このことは、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体が酵素の保存性を確保していることを示しているものであり、酵素を一時的に保存し、再利用する等の実使用上の利便性は計り知れない。
【発明の効果】
【００４６】
本発明により、以下のような効果が奏される。
（１）シリカ系メソ多孔体に、光学異性相互変換酵素が固定化されていることで、反応系中に、高濃度に酵素を存在させることが容易に達成できる。
（２）シリカ系メソ多孔体に、光学異性相互変換酵素が固定化されていることにより、通常の酵素反応溶液の場合と比較して、酵素濃度が高くても、酵素の凝集を生じさせることなく、酵素反応を進行させることが容易である。
（３）シリカ系メソ多孔体に、光学異性相互変換酵素が固定化されていることにより、溶液中に分散した状態の酵素では、容易に凝集を起こしてしまうｐＨ領域においても、酵素の凝集を生じさせることなく、酵素反応を進行させることが容易である。
（４）シリカ系メソ多孔体に、光学異性相互変換酵素が固定化されていることにより、酵素の安定性が向上し、酵素の耐熱性が増大することから、反応温度を上昇させることができ、酵素を失活させることなく、酵素反応を進行させることが容易である。
（５）シリカ系メソ多孔体に、光学異性相互変換酵素が固定化されていることにより、酵素の回収が容易である。
（６）シリカ系メソ多孔体に、光学異性相互変換酵素が固定化されていることにより、酵素の繰り返し使用が可能である。
【００４７】
（７）アミノ酸や糖類の光学異性の相互変換に際し、原料の性状や特性に応じて最適ないし好適な酵素を選択して、その酵素を用いたシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を、固定化酵素として利用することができる。
（８）本発明のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を用いることで、多種多様なアミノ酸や糖類原料を対象として、酵素反応により光学異性の相互変換が施されたアミノ酸類や糖類を生成させることができる。
（９）光学異性の相互変換を触媒する酵素として、アミノ酸類に作用するラセマーゼ、ヒドロキシ酸類に作用するラセマーゼ、炭水化物及びその類縁体に作用するエピメラーゼを用いることができ、これらの酵素を固定化した、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を提供することができる。
【００４８】
（１０）シリカ系メソ多孔体の、酵素の導入可能な細孔径を制御することで、酵素の吸着可能な表面を大きくして、酵素の高集積化が可能になる。
（１１）シリカ系メソ多孔体へ、酵素の固定化を繰り返すことにより、より多量な酵素を固定化することが可能である。
（１２）高集積化された酵素を、反応系中に存在させることができるため、酵素反応を、より効率的に進めることができる。
（１３）酵素の凝集を避けることができるため、酵素を、溶液に溶解した状態よりも高濃度に反応系中に存在させることが可能となり、酵素反応を、より効率的に進めることが可能である。
（１４）酵素が溶液中に分散した状態では、容易に凝集を起こしてしまうｐＨ領域においても、酵素の凝集を生じさせることなく、酵素反応を進行させることが可能である。
（１５）酵素の安定性が向上し、酵素の耐熱性が増大することから、反応温度を上昇させることができ、酵素を失活させることなく、酵素反応を進行させることが可能となる。
【００４９】
（１６）本発明のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体では、酵素の回収が容易であり、酵素の繰り返し使用が可能であり、基質を連続的にシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体と接触して流通させ、連続的な酵素反応の実施が可能である。
（１７）本発明のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体は、環境に負荷の少ない材料系で構成され、作製原材料は、入手しやすく、作製方法が簡単で、安価である。
（１８）本発明のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体は、適切な溶液による処理で官能基を形成することで、固定化される酵素の量や、固定化状態を制御することができる。
（１９）本発明のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体は、その作製条件の制御により、シリカ系メソ多孔体の中心細孔径を変えることが可能であり、それにより、固定化される酵素の量や、活性を制御することができる。
（２０）本発明のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体は、その作製条件の制御により、シリカ系メソ多孔体の中心細孔径を変えることが可能であり、それにより、固定化される酵素の安定性や、耐久性を向上させることができる。
（２１）上記の効果を組み合わせて利用することにより、新規の光学異性の相互変換プロセスを確立することができる。
（２２）本発明のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体では、固定化された酵素の保存性が確保されるため、酵素を固定化して長期間保存した後でも使用することが可能である。
（２３）本発明のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体では、固定化された酵素の保存性が確保されるため、酵素の繰り返し使用時に反応を一時停止して、酵素を一時的に保存し、再利用することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、シリカ系メソ多孔体への光学異性相互変換酵素の吸着等温線を示す。
【図２】図２は、シリカ系メソ多孔体へ固定化されたＧｅｏＲａｃＡと溶液中に自由に存在するＧｅｏＲａｃＡの耐熱性の評価結果を示す。
【図３】図３は、シリカ系メソ多孔体へ固定化されたＧｅｏＲａｃＡの繰り返し使用の評価結果を示す。
【図４】窒素吸着／脱着等温線及びＦＳＭの細孔径分布を示す。図中、（Ａ）は、窒素吸着／脱着等温線：ＦＳＭ−４吸着（▲）、ＦＳＭ−４脱着（△）、ＦＳＭ−８．５吸着（■）、ＦＳＭ−８．５脱着（□）、（Ｂ）は、細孔径分布：ＦＳＭ−４（▲）、ＦＳＭ−８．５（■）。等温線はＮＯＶＡ３０００分析器を用いて測定した。細孔径分布は、ＢＪＨ法を用いて決定した。試料は、真空下で、２００℃、３時間、前処理（脱ガス等）を行った。
【図５】試料（１μｇ）は、５−１２％ポリアクリルアミドの濃度勾配による電気泳動で分離し、ゲルは、Ｂｉｏ−Ｓａｆｅ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｓｔａｉｎで染色した。
【図６】ＦＳＭ−４（▲）及びＦＳＭ−８．５（■）上でのＧｅｏＲａｃＡの吸着等温線を示す。ＧｅｏＲａｃＡ（１ｍＬ）の各種濃度を、１０ｍｇのＦＳＭに、４℃で、２４時間吸着させ、上清の蛋白質濃度を測定した。
【図７】フリー及びＦＳＭ−固定化ＧｅｏＲａｃＡの熱安定性を示す。フリー（■）又はＦＳＭ−固定化（▲）ＧｅｏＲａｃＡ（０．２ｍｇ／ｍＬ）を、８０℃で、所定時間インキュベートし、残存する活性を測定した。比活性は、熱処理していない試料の活性に対して計算した。
【図８】ＧｅｏＲａｃＡの静電気表面ポテンシャル（図中、赤に相当する薄い部分はマイナス、青に相当する濃い部分はプラス）を、ＧＲＡＳＰ２プログラムを用いて計算した。
【図９】ＦＳＭ−固定化ＧｅｏＲａｃＡの再利用を示す。各サイクルで、ＦＳＭ−固定化ＧｅｏＲａｃＡ（４μｇの蛋白質）を、３０℃で、１分間、３ｍＭ Ｌ−Ａｌａ（３．５ｍＬ）でインキュベートし、Ｄ−Ａｌａの濃度を測定した。数値は、最初のサイクルでの活性を１００％とした場合の比活性として示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
次に、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって何ら制約を受けるものではない。
【実施例１】
【００５２】
本実施例では、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を合成した。
（１）シリカ系メソ多孔体の合成１
シリカ系メソ多孔体のうち、まず、ＦＳＭタイプに属するシリカ系メソ多孔体の作製法を示す。カチオン性界面活性剤である塩化ベヘニルトリメチルアンモニウムを主成分とし、エチルアルコールとの混合物である界面活性剤（アーカード、ライオン株式会社製）８ｇを、超純水１００ｇに混合し、７０℃で、３０分間、撹拌混合した。
【００５３】
この撹拌混合には、ホモミキサーを用いた。別途、カネマイト（プリフィード、トクヤマシルテック株式会社製）５．３３６ｇを、超純水１０４．７ｇと混合し、７０℃で、撹拌混合した。シリカ系メソ多孔体の細孔径を制御する目的で、要する場合に、膨張剤として、トリイソプロピルベンゼンを添加した。
【００５４】
この撹拌混合には、マグネチックスターラーを用いた。それぞれの溶液の所定の撹拌時間を経た後、両者を混合し、更に、７０℃で、２時間、ホモミキサーを用いて、撹拌混合した。この撹拌混合の後、２規定の塩酸を、約１時間かけて滴下し、溶液の状態をｐＨ８．５とした。溶液のｐＨが８．５となった後、更に、３時間、撹拌混合した。
【００５５】
この溶液を、吸引濾過した後、分離された固形物を、７０℃の温水に再分散し、更に、濾過を繰り返した。この操作を３回繰り返した後、固形物を、６０℃で、２４時間、乾燥した。更に、空気気流中において、５５０℃で、６時間焼成することにより、各種の細孔径を有するシリカ系メソ多孔体を得た。
【００５６】
上記手法により合成されたシリカ系メソ多孔体について、粉末Ｘ線回折法、走査電子顕微鏡法、透過電子顕微鏡法、及び窒素吸着等温線の測定を適用した。粉末Ｘ線回折法は、Ｂｒｕｋｅｒ製ＡＸＳ Ｄ８−ＡＤＶＡＮＣＥ Ｖａｒｉｏ−１を用いて実施した。得られたＸ線回折パターンより、上記手法により作製されたシリカ系メソ多孔体は、２次元ヘキサゴナルの細孔配列構造を有していることが分かった。また、回折ピーク位置の解析から、合成時、膨張剤を用いなかった場合のシリカ系メソ多孔体に比較して、膨張剤を用いた場合のシリカ系メソ多孔体の方が、シリカ系メソ多孔体の細孔径が大きくなっていることが確認された。
【００５７】
走査電子顕微鏡による観察から、合成されたシリカ系メソ多孔体は、不定形顆粒状の形態として観察された。また、透過電子顕微鏡による観察から、合成時に、膨張剤を用いなかった場合のシリカ系メソ多孔体では、４ｎｍ径の細孔が分布していることが確認された。膨張剤として、トリイソプロピルベンゼンを４．５ｍｌ添加した場合のシリカ系メソ多孔体では、７．５ｎｍ径の細孔が分布していることが確認され、また、膨張剤として、トリイソプロピルベンゼンを６ｍｌ添加した場合のシリカ系メソ多孔体では、８．５ｎｍ径の細孔が分布していることが確認された。
【００５８】
窒素吸着等温線の測定は、Ｑｕａｎｔａｃｈｒｏｍｅ社製Ａｕｔｏｓｏｒｂによって行った。測定の結果から、膨張剤の添加量に依存して、異なる吸着等温線が得られた。吸着等温線の解析から、細孔径分布等を知ることは容易である。測定の結果、合成時に、膨張剤を用いなかった場合のシリカ系メソ多孔体では、４ｎｍ径の細孔が分布していることが確認された。膨張剤として、トリイソピルベンゼンを４．５ｍｌ、及び６ｍｌ添加した場合のシリカ系メソ多孔体の場合では、それぞれ７．５ｎｍ，８．５ｎｍ径の細孔が分布していることが確認された。
【００５９】
以下、合成時に、膨張剤を用いなかった場合の、４ｎｍ径に細孔径分布のピークを持つシリカ系メソ多孔体を「ＦＳＭ−４」と表記し、膨張剤として、トリイソピルベンゼンを４．５ｍｌ添加して合成した場合の、７．５ｎｍ径に細孔径分布のピークを持つシリカ系メソ多孔体を「ＦＳＭ−７．５」と表記し、同じく、膨張剤として、トリイソピルベンゼンを６ｍｌ添加して合成した場合の、８．５ｎｍ径に細孔径分布のピークを持つシリカ系メソ多孔体を「ＦＳＭ−８．５」と表記する。
【００６０】
（２）シリカ系メソ多孔体の合成２
次に、シリカ系メソ多孔体のうち、ＳＢＡタイプに属するシリカ系メソ多孔体の作製法を示す。中性の非イオン性界面活性剤のブロックコポリマー［ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）−ｂｌｏｃｋ−ｐｏｌｙ（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）−ｂｌｏｃｋ−ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）］（分子量：〜５８００、ＥＯ：ＰＯ：ＥＯ＝２０：７０：２０）１２ｇを、超純水４４９ｍｌに混合し、更に、これに、３５％の塩酸２０ｍｌを加えて、３５℃で、一晩、撹拌混合した。
【００６１】
その後、シリカ源として、ＴＥＯＳ（Ｔｅｔｒａｅｔｈｌｙ Ｏｒｔｈｏｓｉｌｉｃａｔｅ）を２７．４ｍｌ加え、３５℃で、２０時間、撹拌混合した。この撹拌混合には、マグネチックスターラーを用いた。この反応液を、オートクレーブ容器に装填し、３５，７５，１００，１３０℃の各温度で、２４時間静置した。この溶液を、吸引濾過した後、６０℃で、２４時間、乾燥した。更に、空気気流中において、５５０℃で、６時間焼成することにより、各種の細孔径を有するシリカ系メソ多孔体を得た。この合成法によるＳＢＡは、Ｐ６ｍｍ構造のＳＢＡであった。オートクレーブ容器の保持温度により、細孔径が制御された。
【００６２】
Ｉａ３ｄ構造のＳＢＡを合成するために、中性の非イオン性界面活性剤のブロックコポリマー［ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）−ｂｌｏｃｋ−ｐｏｌｙ（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）−ｂｌｏｃｋ−ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）］（分子量：〜５８００、ＥＯ：ＰＯ：ＥＯ＝２０：７０：２０）１２ｇを、超純水４３４ｍｌに混合し、更に、これに、３５％の塩酸２０ｍｌを加えた。しばらく撹拌混合した後、これに、ブタノール１４．８ｍｌを加えて、３５℃で、一晩、撹拌混合した。
【００６３】
その後、シリカ源として、ＴＥＯＳ（Ｔｅｔｒａｅｔｈｌｙ Ｏｒｔｈｏｓｉｌｉｃａｔｅ）を２７．４ｍｌ加え、３５℃で、２０時間、撹拌混合した。この撹拌混合には、マグネチックスターラーを用いた。この反応液を、オートクレーブ容器に装填し、３５，７５，１００，１３０℃の各温度で、２４時間静置した。この溶液を、吸引濾過した後、６０℃で、２４時間、乾燥した。更に、空気気流中において、５５０℃で、６時間焼成することにより、各種の細孔径を有するシリカ系メソ多孔体を得た。
【実施例２】
【００６４】
（１）光学異性相互変換酵素ラセマーゼの準備
ラセマーゼのクローニングは、以下の手順により行った。
準備したラセマーゼは、以下のものである。
・Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ グルタミン酸ラセマーゼ（ＢｓＲａｃＥ）
・Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｉ グルタミン酸ラセマーゼ（ＬｆＲａｃＥ）
・Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ アラニンラセマーゼ（ＧｅｏＲａｃＡ）
・Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉＯＴ３ アスパラギン酸ラセマーゼ（ＰｈＲａｃＤ）
【００６５】
それぞれの遺伝子の入手は、以下により行った。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ菌体は、納豆（おかめ納豆、タカノフーズ株式会社製）より単離した。Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ菌体（ＮＢＲＣ１２５５０）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｉ菌体（ＮＢＲＣ３０７１）、及びＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉＯＴ３ アスパラギン酸ラセマーゼ遺伝子を含むゲノムＤＮＡクローン（Ｓ２ＬＡ２０９）は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部より購入した。
【００６６】
ＰＣＲプライマーとしては、それぞれ、以下のものを用いた。
１）ＢｓＲａｃＡ：
・ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ５‘−ＡＧＡＧＡＣＡＴＡＴＧＧＡＡＣＡＡＣＣＡＡＴＡＧＧＡＧＴＣＡＴＴＧＡＴＴＣＣ
・ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ５‘−ＧＡＧＡＣＴＣＧＡＧＣＴＡＴＣＴＴＴＴＡＡＴＣＧＧＴＴＣＴＴＧＣＡＧＴＧＡＧＡＴ
【００６７】
２）ＬｆＲａｃＥ：
・ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ５‘−ＡＧＡＧＡＣＡＴＡＴＧＧＡＣＡＡＴＣＧＣＣＣＡＡＴＴＧＧＡＧＴＧＡ
・ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ５‘−ＧＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＴＣＣＣＣＣＴＣＴＴＣＡＡＴＴＴＧＧＧＣＧＧＴ
【００６８】
３）ＧｅｏＲａｃＡ：
・ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ５‘−ＡＧＡＧＡＣＡＴＡＴＧＡＡＣＧＡＣＴＴＴＣＡＴＣＧＣＧＡＴＡＣＧＴＧ
・ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ５‘−ＧＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＴＴＡＴＧＣＡＣＴＧＣＴＴＴＣＣＣ
【００６９】
４）ＰｈＲａｃＤ：
・ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ５‘−ＧＡＧＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＣＧＡＴＡＧＧＴＡＴＡＣＴＴＧＧＴＧ
・ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ５‘−ＧＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＴＴＴＴＣＴＡＡＴＧＣＡＡＣＣＴＴＡＡＣＧ
【００７０】
（２）ラセマーゼ遺伝子のクローニング方法
次に、ラセマーゼ遺伝子をクローニングする方法を示す。各バクテリア菌体のラセマーゼの全長遺伝子に、上記ＰＣＲプライマーを使用し、ｉＰｒｏｏｆ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｒｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（バイオラッド社製）により、遺伝子の増幅を行った。鋳型として、ＢｓＲａｃＥ，ＬｆＲａｃＥ，ＧｅｏＲａｃＡは、それぞれの菌体より、ゲノムＤＮＡを抽出したものを使用し、ＰｈＲａｃＤについては、ゲノムＤＮＡクローン（Ｓ２ＬＡ２０９）を用いた。
【００７１】
ＰＣＲ反応の後、増幅されたＤＮＡの末端を、ゲル精製した後、ポリヌクレオチドキナーゼにより、リン酸化した。これらのインサートを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩベクター（ストラタジーン）のＥｃｏＲＶ部位に挿入し、大腸菌ＴＯＰ１０株（インビトロジェン社製）にトランスフォームして培養した後、クローンを回収した。得られたクローンは、ダイデオキシ法により、ＤＮＡ配列の確認を行った。
【００７２】
次に、正しい配列のラセマーゼ遺伝子を、制限酵素ＮｄｅＩ、及びＸｈｏＩで切断し、発現ベクターｐＥＴ２８ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ、ノバジェン社製）のＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ部位に挿入することにより、組換えタンパク質のアミノ酸末端に、６ｘＨｉｓタグを有する発現プラスミドを作製した。これを、ＴＯＰ１０株にトランスフォームし、プラスミドを回収した。
【００７３】
更に、アミノ酸末端側のＤＮＡ配列を確認して、フレームが正しいことを確認した後、ＢｓＲａｃＥ，ＬｆＲａｃＥ，ＧｅｏＲａｃＡは、発現用大腸菌ＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）株（インビトロジェン社製）に、ＰｈＲａｃＤは、Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）株（ノバジェン社製）にトランスフォームした。得られたコロニーから、小スケールで培養を行い、タンパク質の発現を確認した。
【００７４】
（３）ラセマーゼの大量発現
発現の確認されたクローンについて、シングルコロニーを、３０ｍｌの１．５％グルコース及び５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＴｕｒｂｏ Ｂｒｏｔｈ（モレキュラーディメンジョン社製）で、３７℃において、一晩、振盪培養した。このうちの１５ｍｌもしくは２０ｍｌを、１．５Ｌもしくは２Ｌの上記培地に移し、３７℃で、ＯＤ６００が０．６になるまで振盪培養した。
【００７５】
次に、最終濃度１ｍＭのＩｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を加え、更に、３７℃で、４時間、もしくは２０℃で、１０〜２０時間振盪培養することにより、ラセマーゼを発現させた。７５００×ｇで、４℃、５分間遠心し、菌体を回収した。菌体を、８０ｍｌのＣｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ［２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５００ｍＭ ＮａＣｌ］に懸濁した後、液体窒素で凍結させ、−８０℃で保存した。
【００７６】
（４）ラセマーゼの精製
−８０℃で保存していた菌体を溶解した後、最終濃度１ｍＭ Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ−ｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ （ＰＭＳＦ），１０μｇ／ｍｌ ＰｅｐｓｔａｔｉｎＡ，１０ｍＭ ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（２−ＭＥ）及び１ｍｇ／ｍｌリゾチームを加え、氷上で、１時間静置した。次に、Ｓ−２５０ソニファイアー（ブランソン社製）を使用して、超音波処理を行い、菌体を破砕した。１０００００×ｇで、４℃、４０分間遠心して、上清を回収し、０．４５μｍフィルターでろ過して、クルードサンプルを得た。
【００７７】
クルードサンプルを、Ａバッファー［２０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．５），５００ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ］で平衡化したＨｉｓ−Ｔｒａｐ ＨＰ カラム（５ｍｌ×２本連結，ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に通して、ラセマーゼを吸着させた。次に、Ａバッファーで、カラムを洗浄後、Ｂバッファー［２０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．５），５００ｍＭ ＫＣｌ，５００ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ］の０％から１００％のグラジエントをかけて、ラセマーゼを溶出させた。尚、上記の操作は、ＡＫＴＡ１０Ｓ中圧クロマトグラフィー装置（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて行った。
【００７８】
各フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ラセマーゼを含むフラクションを集めた。集めたフラクションを、透析バッファー（ピアス）に入れ、２Ｌの透析バック［２０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．５），５０ｍＭ ＫＣｌ］で、４℃において、一晩透析した。透析後、サンプルを、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ＭＷＣＦ１００００（ミリポア社製）を用いて、タンパク質濃度約５〜１０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。タンパク質濃度は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（バイオラッド社製）を使用して、γ−グロブリンをスタンダードとして、測定した。
【００７９】
また、活性測定を行って、ラセマーゼ活性を保持していることを確認した。活性測定法として、基質溶液［ＢｓＲａｃＥについては、２０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ８．０），１ｍＭ Ｌ−グルタミン酸、ＬｆＲａｃＡについては、２０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ８．０），２ｍＭ Ｌ−グルタミン酸、ＧｅｏＲａｃＡについては、１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．５），３ｍＭ Ｌ−Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄアラニン］に濃縮したサンプルを加え、３０℃で、２０４ｎｍの円二色性の変化を、Ｊ−８２０円二色性分散計（日本分光社製）を用いて測定することにより、評価した。
【００８０】
（５）シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体の作製
光学異性の相互変換を触媒する酵素の固定化用担体として用いたシリカ系メソ多孔体を、以下に示す。また、表１に、各種シリカ系メソ多孔体の表記法、メソ多孔体の分類合成時設定温度［℃］、窒素吸着による細孔径［ｎｍ］を示す。
・Ｐ６ｍｍ構造のＳＢＡ４種：窒素吸着による細孔径が、６．２ｎｍ、６．７ｎｍ、８．０ｎｍ、１１．１ｎｍのシリカ系メソ多孔体。
・Ｉａ３ｄ構造のＳＢＡ４種：窒素吸着による細孔径が、６．１ｎｍ、６．７ｎｍ、９．９ｎｍ、１１．０ｎｍのシリカ系メソ多孔体。
・ＦＳＭタイプのもの３種：窒素吸着による細孔径が、４ｎｍ、７．５ｎｍ、８．５ｎｍのシリカ系メソ多孔体。
【００８１】
【表１】
【００８２】
光学異性の相互変換を触媒する酵素としては、ＢｓＲａｃＥ，ＬｆＲａｃＥ，ＧｅｏＲａｃＡ，ＰｈＲａｃＤのラセマーゼを用いた。本実施例では、代表例として、ラセマーゼとして、ＧｅｏＲａｃＡを用い、シリカ系メソ多孔体として、細孔径が４ｎｍであるＦＳＭ（ＦＳＭ−４と表記）と、細孔径が８．５ｎｍであるＦＳＭ（ＦＳＭ−８．５と表記）を用いた。尚、その他のラセマーゼ、及びシリカ系メソ多孔体を用いた場合についても、以下に示す同様の実験を行って、同様の結果を得ている。表２に、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体の酵素活性評価用に用いたシリカ系メソ多孔体の特性を示す。これら２種のシリカ系メソ多孔体の特性は、窒素吸着等温線の測定結果、及びその結果の解析から、表２のようにまとめられる。
【００８３】
【表２】
【００８４】
１．［２０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ ７．５），５０ｍＭ ＫＣｌ］のバッファーを使用し、該バッファーに溶かした各種濃度のＧｅｏＲａｃＡ溶液１ｍｌと、１０ｍｇのメソポーラスシリカを混合し、４℃で、一晩、転倒混和した。
２．これを遠心して、上清を除いた。
３．上清に遊離してきたＧｅｏＲａｃＡを定量することで、吸着したＧｅｏＲａｃＡ量を算出し、それぞれの濃度における吸着量を算出した。
【００８５】
その結果を、図１に示す。図１は、シリカ系メソ多孔体への光学異性相互変換酵素の吸着等温線をまとめたものである。その結果、ＦＳＭ−８．５に対する吸着量の方が、ＦＳＭ−４に対する吸着量よりも多いことが分かった。これは、ＧｅｏＲａｃＡの大きさが、８．２×５．２×４．２ｎｍであることから、ＧｅｏＲａｃＡが、ＦＳＭ−８．５の細孔内に、より容易に入り込むためと理解できる。
【００８６】
酵素活性を評価するための、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体の作製は、以下の手順により行った。ＦＳＭ−８．５、３０ｍｇに対して、適当なバッファーに溶解した１．２６ｍｇのＧｅｏＲａｃＡを混ぜ、４℃で、２４時間、ゆっくりと回転振盪した。このＧｅｏＲａｃＡの量は、全量吸着する量に設定されるようにした。
【００８７】
遠心分離により、固定化された酵素、すなわち、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を分離回収し、２０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＫＣｌ溶液で、３回以上洗浄し、酵素量が０．２ｍｇ／ｍｌとなるように、懸濁状態のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を含む溶液を得た。
【００８８】
（６）酵素の固定化状態の評価
上記の懸濁状態のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を含む溶液を、乾燥させて粉末とし、窒素吸着等温線の測定を行った。Ｑｕａｎｔａｃｈｒｏｍｅ社製Ａｕｔｏｓｏｒｂを用いて行った測定の結果、メソ孔内に酵素が取り込まれ、細孔体積が減少していることが確認された。
【００８９】
（７）シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体の酵素活性測定
ＧｅｏＲａｃＡは、アラニンの光学異性相互変換を触媒する酵素である。その活性は、アラニンの光学活性相互変換を測定することにより行った。Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニンは、それぞれ、２３．０及び−２３．０ｍｄｅｇ／ｃｍ／ｍＭの旋光性を示す。Ｌ−アラニンからＤ−アラニンへの変換、もしくはその反対の変換により、旋光性が変化する。その変化を、２０４ｎｍの円二色性の変化を、Ｊ−８２０円二色性分散計（日本分光社製）を用いて測定することにより、評価した。
【００９０】
実際の測定手順は、以下のようにした。
１．１０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．５）の溶液に、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニンがそれぞれ、０．５，１．０，２．０，３．０，４．０，５．０，６．０，８．０，１０．０ｍＭ入った各種溶液を用意した。
【００９１】
２．ＦＳＭ−８．５に固定化されたＧｅｏＲａｃＡと、溶液中に分散しているＧｅｏＲａｃＡの、それぞれ２μｇを、上記１の各種溶液のそれぞれ２．５ｍｌに、３０℃にて、混ぜた。
３．次いで、２０４ｎｍの円二色性の変化を測定した。
【００９２】
その結果を、図２に示す。この結果を元にして、最大酵素反応速度（Ｖｍａｘ）と、Ｖｍａｘの半分の速度を示す時の基質の濃度（Ｋｍ）値を、グラフ解析ソフトウエアを用いて算出した。その算出結果を、表３に示す。表３は、シリカ系メソ多孔体へ固定化されたＧｅｏＲａｃＡと溶液中に自由に存在するＧｅｏＲａｃＡの酵素活性評価をまとめたものである。
【００９３】
Ｋｍ値を比較すると、ＦＳＭ−８．５に固定化されたＧｅｏＲａｃＡの方が、少し大きな値を示している。一方、Ｖｍａｘ値は、溶液に分散したＧｅｏＲａｃＡの方が、大きい。このことは、メソ孔内に固定化されている酵素の方が、基質との接触割合が低くなることから、容易に予想されることである。一般的に、固定化された酵素は、Ｋｍ値は高く、Ｖｍａｘ値は低くなる傾向が知られている（非特許文献６）。更に、基質に対する酵素の作用効率の指標として、Ｖｍａｘ／Ｋｍの値が用いられることがあり、この数値が高いほど、酵素の作用が高いことを示す。
【００９４】
表２に示されるように、ＧｅｏＲａｃＡの場合、ＦＳＭ−８．５に固定化されても、５１％のＶｍａｘ／Ｋｍの値を示しており、一般的な固定化酵素が３０％以下の数値になるのに比較して、高い数値を維持していることが分かる。このことは、本発明のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体が、一般的な固定化酵素の場合と比較して、非常に酵素作用が高く、優れたものであることを示していることに他ならない。
【００９５】
【表３】
【００９６】
（８）シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体の熱安定性の評価
酵素を工業的な製造プロセスに用いる場合、その耐熱性の向上は、非常に重要な因子である。シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を構成した酵素が、溶液中に自由に分散しているときに比較して、熱安定性が向上しているかどうかを評価した。その結果を、図２に示す。図２は、シリカ系メソ多孔体へ固定化されたＧｅｏＲａｃＡと溶液中に自由に存在するＧｅｏＲａｃＡの耐熱性の評価結果をまとめたものである。評価は、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を構成した酵素と、溶液中に自由に分散している状態の酵素を、それぞれ８０℃に保持した後、どの程度の酵素活性を有しているかを見る方法により行った。
【００９７】
本実施例では、ＧｅｏＲａｃＡを、酵素として用い、シリカ系メソ多孔体として、ＦＳＭ−８．５を用いた。その結果は、溶液中に自由に分散した酵素の場合、８０℃に、１０分間保持することで、酵素活性は、６０％に減少した。一方、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を構成した酵素の場合、８０℃、１０分間の保持では、１００％の酵素活性を示した。８０℃に、６０分間保持しても、５０％の活性を有していた。このことは、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体が、酵素の耐熱性を大幅に向上させる効果を有していることを示している。
【００９８】
（９）酵素の繰り返し利用についての評価
技術的並びに経済的効果の観点から、酵素が繰り返し利用できることは非常に重要な因子である。シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体の繰り返し使用による、酵素活性の変化を評価した。用いた酵素は、同様に、ＧｅｏＲａｃＡであり、シリカ系メソ多孔体としては、ＦＳＭ−８．５を用いた。
【００９９】
その結果を、図３に示す。図３は、シリカ系メソ多孔体へ固定化されたＧｅｏＲａｃＡの繰り返し使用の評価結果をまとめたものである。最初の活性を１００％として、５回再使用した場合でも、５０％の活性を保持していることが分かり、１０回までの使用では、少しずつ活性が低下していくが、それ以降は、一定の値に落ち着いてくることが分かる。このことは、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体には、酵素の繰り返し使用を可能とする非常に優れた効果があることを示している。
【０１００】
また、本発明で、特に重要なことは、光学異性の相互変換のための反応系において、シリカ系メソ多孔体に固定化されたラセマーゼを共存させることにより、その溶解度を超えた量のラセマーゼを反応系内に存在させることが可能であることである。このことは、反応速度、すなわち光学異性の相互変換速度の向上に大きく寄与するものであり、また、反応生成物からも、酵素を容易に回収できることを意味するものである。
【０１０１】
一般に、酵素、すなわち、タンパク質の溶解度には、限界があり、それを越えると、凝集という現象を起こす。光学異性相互変換酵素の場合も例外ではなく、１５ｍｇ／ｍｌを越えるような高濃度にすると、凝集が起こり、凝集を起こした酵素は、活性に寄与しない。特に、ラセマーゼは、等電点付近のｐＨ領域での凝集が激しい傾向があり、そのｐＨ域では、１ｍｇ／ｍｌ程度の濃度でも、凝集を避けることは困難である。
【０１０２】
一方で、シリカ系メソ多孔体に固定化されたラセマーゼの場合、例えば、ＦＳＭ−８．５ １０ｍｇに対して、光学異性相互変換酵素が、０．４２ｍｇ程度、吸着・固定されたシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を、１ｍｌの反応基質、すなわち、反応基質の溶解した溶液中に、５０ｍｇ分散させることは容易である。
【０１０３】
この反応系においては、溶液１ｍｌに、ラセマーゼを、０．４２×５０／１０＝２．１ｍｇ、活性を有した状態で存在させることができる。したがって、１ｍｇ／ｍｌを超えた酵素量を、反応系内に容易に存在させることができる。この状況は、凝集の激しい等電点付近のｐＨ領域においても、同様に適用でき、本来であれば容易に凝集を起こしてしまうようなｐＨ領域の反応系内に、酵素を、凝集を起こすことなく、活性を有した状態で、安定に存在させることが可能である。
【０１０４】
更に、本発明では、光学異性相互変換酵素が固定化されたシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を、更に固定して、そこに、反応基質を含む溶液を流すような装置を構成することにより、連続的な酵素反応装置の構築と連続的な酵素反応の実施が容易に可能である。
【実施例３】
【０１０５】
（１）材料
本実施例では、実験材料として、Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＮＢＲＣ１２５５０）、ドコシルトリメチルアンモニウムクロライド［Ｃ２２Ｈ４５Ｎ（ＣＨ３）３Ｃｌ；Ｃ２２−ＴＭＡ］（ライオン株式会社）、カネマイト（層状ポリシリケート）（徳山シルテック株式会社）、１，３，５−トリイソプロピルベンゼン（ＴＩＰＢ）（東京化学工業株式会社）、Ｄ−Ａｌａ、Ｌ−Ａｌａ，β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（和光純薬工業株式会社）を使用した。
【０１０６】
（２）ＦＳＭの合成
ここでは、ＦＳＭ−４（細孔径４ｎｍ）については、カネマイト（５．３５ｇ）を、Ｃ２２−ＴＭＡ（８．１６ｇ）含有水溶液（２０５ｍＬ）に分散させ、７０℃で、２時間撹拌した。得られた懸濁液のｐＨを、２ＮＨＣｌで８．５に調整し、更に、７０℃で、３時間インキュベートした。ＦＳＭ−８．５（細孔径８．５ｎｍ）を合成するためには、カネマイトを加える前に、５．５ｍＬのＴＩＰＢを、Ｃ２２−ＴＭＡ溶液に混合した。合成したＦＳＭは、脱イオン水で洗い、６０℃で、一夜乾燥し、空気中で、５５０℃で、６時間焼成して有機化合物を除いた。
【０１０７】
（３）ＧｅｏＲａｃＡのクローニング及び大量発現
ＧｅｏＲａｃＡ遺伝子を、テンプレートとしてＧ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＮＢＲＣ１２５５０）のゲノムＤＮＡを、プライマーとして、フォワードの５’−ＡＧＡＧＡＣＡＴＡＴＧＡＡＣＧＡＣＴＴＴＣＡＴＣＧＣＧＡＴＡＣＧＴＧ−３’及びリバースの５’−ＧＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＴＴＡＴＧＣＡＣＴＧＣＴＴＴＣＣＣ−３’を用いて、ＰＣＲにより増幅させた。
【０１０８】
ＰＣＲ反応物を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（ＳＫ＋）プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ＣＡ、ＵＳＡ）に連結させ、ｄｉｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ法を用いて、配列を決定した。ｐＥＴ２８ｂベクターのＮｄｅＩ−ＸｈｏＩサイトにクローンを挿入することによって、Ｎ−末端にヘキサヒスチジンタグを持つＧｅｏＲａｃＡを作製した。
【０１０９】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株ＢＬ２１Ｓｔａｒ（ＤＥ３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＣＡ、ＵＳＡ）を、ＧｅｏＲａｃＡ発現ベクターで形質転換した。ＧｅｏＲａｃＡの発現は、ターボブロス中で、ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭ加えることにより誘導した。更に、２０℃で、２１時間インキュベートした後、７５００×ｇ、５分の遠心により細胞を得た。この細胞を、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５００ｍＭ ＮａＣｌに再懸濁し、液体Ｎ２で凍結し、−８０℃で保存した。
【０１１０】
（４）ＧｅｏＲａｃＡの精製
解凍させた細胞に、１ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオライド、１μｇ／ｍＬペプスタチンＡ、０．５ｍｇ／ｍＬリゾチーム、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ユニットのＤＮａｓｅＩ、１０μＭピリドキサール−５’−リン酸、及び１０ｍＭイミダゾールを加えた。４℃で、３０分培養した後、細胞を超音波処理して破砕し、４℃で、１００，０００×ｇ、４５分間遠心した。上清を、０．４５μｍフィルターで濾過し、ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ液体クロマトグラフィーシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ社）のＨｉｓＴｒａｐＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ社、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）にかけた。
【０１１１】
蛋白質を、２０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）、５００ｍＭ ＫＣｌ中の１０−５００ｍＭイミダゾールの濃度勾配により溶出させた。ピークフラクションを集め、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＭＡ、ＵＳＡ）で濃縮し、２０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＫＣｌ、で透析した。酵素の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。
【０１１２】
（５）ＦＳＭへのＧｅｏＲａｃＡの吸着
ＦＳＭへのＧｅｏＲａｃＡの吸着を調べるために、一定量のＦＳＭ（１０ｍｇ）を、各濃度（０．１−４ｍｇ／ｍＬ）の１ｍＬ ＧｅｏＲａｃＡ溶液で、Ｒｏｔａｔｏｒ ＲＴ−５０（タイテック株式会社）で、４℃で、２４時間振盪した。ＦＳＭを、４℃で、２０，８００×ｇ、５分間の遠心で除き、上清液中の蛋白質濃度を測定した。吸着した蛋白質量は、遠心後の上清の蛋白質量を、吸着前のＧｅｏＲａｃＡの量から引くことにより計算した。
【０１１３】
酵素活性を調べるために、３０ｍｇのＦＳＭ−８．５を、２０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＫＣｌ中の１．２６ｍｇのＧｅｏＲａｃＡ（１ｍｇ／ｍＬ）と、４℃で、２４時間インキュベートした。ＦＳＭ−固定化ＧｅｏＲａｃＡを、４℃で、１０，６００×ｇ、３分の遠心で集めた。固定化ＧｅｏＲａｃＡの量は、上清の未結合の蛋白質を測定することによって計算した。ＦＳＭ−固定化ＧｅｏＲａｃＡを３回洗い、緩衝液に懸濁して、蛋白質濃度０．２ｍｇ／ｍＬとした。
【０１１４】
（６）キャラクタリゼーション
窒素吸着等温線を、液体Ｎ２（７７Ｋ）の濃度で、ＮＯＶＡ３００分析器（Ｑｕａｎｔａｃｈｖｏｍｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、ＦＬ、ＵＳＡ）を用いて、測定した。測定の前に、真空下で、試料を、２００℃で、３時間脱ガス処理した。比表面積を、Ｂｒｕｎａｕｒ−Ｅｍｍｅｔｔ−Ｔｅｌｌｅｒ（ＢＥＴ）法で、Ｐ／Ｐ０＝０．０５−０．３０の相対圧力範囲の吸着データを用いて計算した。総細孔体積は、最大相対圧力におけるＮ２吸着から推定した。細孔径分布は、Ｂａｒｒｅｔｔ−Ｊｏｙｎｅｒ−Ｈａｌｅｎｄａ（ＢＪＨ）法を用いて、吸着曲線から決定した。
【０１１５】
（７）酵素活性
アラニンラセマーゼ活性は、Ｊａｓｃｏ Ｊ−８２０ ＣＤ分光施光計（日本分光株式会社）を用いて、２０４ｎｍでのモル楕円率の変化をモニターすることによって測定した。Ｌ−Ａｌａ及びＤ−Ａｌａのモル楕円率は、それぞれ２３．０及び−２３．０ｍｄｅｇ／ｃｍ／ｍＭであった。反応速度定数は、１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）中での、Ｌ−Ａｌａ又はＤ−Ａｌａの各濃度（０．５、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、８．０及び１０ｍＭ）での酵素活性を測定することによって計算した。
【０１１６】
ＦＳＭに固定化した、又はフリーのＧｅｏＲａｃＡ試料（２μｇ蛋白質）を２．５ｍＬの１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）、３ｍＭ Ｌ−Ａｌａに加えた。３０℃での２０４ｎｍのモル楕円率の減少割合から酵素活性を計算した。Ｖｍａｘ及びＫｍ値は、Ｐｒｉｓｍ４ソフト（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、曲線を外挿して計算した。
【０１１７】
（８）熱安定性試験
酵素の熱安定性を調べるために、０．２ｍｇ／ｍＬ ＦＳＭ−固定化又はフリーのＧｅｏＲａｃＡ試料の５０μＬ量を、８０℃で処理した。その後、１０μＬの試料を、２．５ｍＬの１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）、３ｍＭ Ｌ−Ａｌａに加え、３０℃で酵素の残存活性を測定した。
【０１１８】
（９）再利用試験
ＦＳＭ−固定化ＧｅｏＲａｃＡの再利用性を評価するために、４μｇのＦＳＭ−固定化ＧｅｏＲａｃＡを１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）、３ｍＭ Ｌ−Ａｌａに加え、３０℃で、１分間振盪した。４℃、２１５０×ｇで５分遠心することによってＦＳＭ−固定化ＧｅｏＲａｃＡを沈殿させ、上清のＤ−Ａｌａの濃度を測定した。更に、沈殿に新たな３．５ｍＬの１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）、３ｍＭ Ｌ−Ａｌａを加えた。このサイクルを繰り返した。
【０１１９】
（１０）実験結果
１）ＦＳＭのキャラクタリゼーション
細孔径４ｎｍ（ＦＳＭ−４）及び８．５ｎｍ（ＦＳＭ−８．５）のＦＳＭを合成した。窒素吸着等温線及び細孔分布を図４Ａ及びＢに示す。ＦＳＭｓの構造パラメータを、表４に示す。
【０１２０】
【表４】
【０１２１】
図４Ａに示されるように、ＦＳＭ−４及びＦＳＭ−８．５の窒素吸着等温線は、ＩＵＰＡＣ分類により、メソポーラスシリカの特徴であるタイプＩＶであった。ＦＳＭ−４及びＦＳＭ−８．５の細孔径は、４及び８．５ｎｍであり（図４Ｂ）、これらの総細孔体積は、１．３０及び２．５７ｃｍ３／ｇであった。それらの表面積は、両者とも約１１００ｍ２／ｇ（表４）であった。
【０１２２】
これらの値は、ＭＣＭ−４１及びＳＢＡのような、同様の細孔径を有する他のＭＰｓの値と比べて、非常に高い。また、ＦＳＭ−８．５の細孔径分布は、ＦＳＭ−４のものよりも広かった（図４Ｂ）。尚、ＦＳＭの細孔径は、膨潤剤の量の増加に応じて増加するが、細孔径分布も広くなる傾向がある。
【０１２３】
２）ＧｅｏＲａｃＡの分離及び精製
ＧｅｏＲａｃＡのｃＤＮＡクローンを、バクテリア発現ベクターｐＥＴ２８ｂにサブクローンして、Ｎ−末端にヘキサヒスチジンをタグを有した蛋白質を発現させた。
【０１２４】
ＧｅｏＲａｃＡ発現ベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉ株（ＢＬ２１Ｓｔａｒ（ＤＥ３）に導入し、ＧｅｏＲａｃＡ蛋白質発現を誘導させた。ＧｅｏＲａｃＡは、ＨｉｓＴｒａｐＨＰカラムで精製した。精製ＧｅｏＲａｃＡの最終の収量は、培養１Ｌ当たり〜３００ｍｇであった。また、図５に示されるように、ほぼ均一に精製された。
【０１２５】
精製ＧｅｏＲａｃＡは、５−７のｐＨ範囲の緩衝液中では凝集、沈殿が起こったため、塩（５０ｍＭ ＫＣｌ）を含んでいるｐＨ７．５の緩衝液を用いて、凝集を抑えた。ＧｅｏＲａｃＡの等電点（ｐＩ）は６．７であり、該ｐＩでは、ＧｅｏＲａｃＡは不安定であり、沈殿すると考えられる。
【０１２６】
３）ＦＳＭに対するＧｅｏＲａｃＡの吸着
図６に、ＦＳＭ−４及びＦＳＭ−８．５でのＧｅｏＲａｃＡの吸着等温線を示す。飽和能力は、ＦＳＭ−４よりも細孔の大きいＦＳＭ８．５がより高い（２８及び６２ｍｇ／ｇ）。
【０１２７】
ＧｅｏＲａｃＡは、４３ｋＤａの２つの同一のサブユニットからなり、ユニットセル寸法は、８８×５２×４２Åである（文献：Ｊ．Ｐ．Ｓｈａｗ，Ｇ．Ａ．Ｐｅｔｓｋｏ，Ｄ．Ｒｉｎｇｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６（１９９７）１３２９−１３４２）。ＧｅｏＲａｃＡの寸法は、ＦＳＭ−４の細孔径より大きいので、吸着された少量は、粒子の細孔入口及び／又は外表面に存在していると考えられる。
【０１２８】
ＦＳＭ−４及びＦＳＭ−８．５の表面積は、同様であるが、ＦＳＭ−８．５の総細孔体積は、ＦＳＭ−４の約２倍の大きさであり（表４）、その細孔径は、ＧｅｏＲａｃＡより大きいことから、ＧｅｏＲａｃＡは、ＦＳＭ−８．５の細孔内に固定化されていることが示唆される。
【０１２９】
ＦＳＭに吸着されたＧｅｏＲａｃＡの量を、他の蛋白質の吸着と比べると、ＨＲＰ（１８３ｍｇ／ｇ）及びヘモグロビン（２１２ｍｇ／ｇ）のものより低かった［文献：１）Ｈ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｂ．Ｌｉ，Ｔ．Ｓａｓａｋｉ，Ｃ．Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｔ．Ｋａｊｉｎｏ，Ｓ．Ｉｎａｇａｋｉ，Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．１２（２０００）３３０１−３３０５、２）Ｙ．Ｕｒａｂｅ，Ｔ．Ｓｈｉｏｍｉ，Ｔ．Ｉｔｏｈ，Ａ．Ｋａｗａｉ，Ｔ．Ｔｓｕｎｏｄａ，Ｆ．Ｍｉｚｕｋａｍｉ，Ｋ．Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．８（２００７）６６８−６７４］。この低い吸着は、用いた緩衝液のｐＨがＧｅｏＲａｃＡのｐＩより高いことによると考えられる。
【０１３０】
一般的に、シリカ支持体への酵素の吸着は、緩衝液のｐＨが蛋白質のｐＩ付近で、最大化され、そのｐＩより上では減少する。本実施例で用いた緩衝液のｐＨは、７．５であり、ＧｅｏＲａｃＡのｐＩ（６．７）より高い。このとき、ＧｅｏＲａｃＡは全体的にはマイナス電荷を有していると考えられる。また、シリカ支持体の表面は、ｐＨ＜２でマイナスに電荷を有している。よって、ｐＨは、７．５の緩衝液中では、シリカ表面及びＧｅｏＲａｃＡは共にマイナスの電荷を有しているので、吸着が低くなる。分子進化のような、分子生物学技術を用いて酵素のｐＩを修正することは、この問題を解決すると思われる。
【０１３１】
本実施例では、ＳＢＡタイプのメソポーラスシリカも調べた。ＳＢＡの細孔径（９．８ｎｍ）及び表面積（９５５ｍ２／ｇ）はＦＳＭ−８．５と同様であったが、ＳＢＡに吸着されたＧｅｏＲａｃＡの量は、ＦＳＭ−８．５に吸着された量の約半分であった。
【０１３２】
ＦＳＭの表面シラノール基の組成は、ＳＢＡを含む他のアモルファスシリカと比べて、ユニークである。例えば、アモルファスシリカは、Ｑ２（２０％）及びＱ３（８％）シラノール基を表面に含んでいるが、ＦＳＭのシラノール基は、Ｑ３である。ＦＳＭの表層シラノール基は、アモルファスシリカのものよりも、より酸性である。
【０１３３】
ＦＳＭのこれらのユニークな表面特性は、ＳＢＡよりも、蛋白質の吸着をより高くさせることが可能である。一般に、高い酵素能力は、固定化酵素支持体の経済性にとって重要であり、酵素が固定化のメリットを最大限に享受されるためには、メソポーラスシリカの細孔内に吸着される必要があると考えられる［文献：１）Ｓ．Ｈｕｄｓｏｎ，Ｊ．Ｃｏｏｎｅｙ，Ｅ．Ｍａｇｎｅｒ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４７（２００８）８５８２−８５９４、２）Ｃ．Ｉｓｐａｓ，Ｉ．Ｓｏｋｏｌｏｖ，Ｓ．Ａｎｄｒｅｅｓｃｕ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．３９３（２００９）５４３−５５４］。
【０１３４】
４）ＦＳＭ−固定化及びフリーＧｅｏＲａｃＡの反応速度
表５に、フリー、又はＦＳＭ−固定化ＧｅｏＲａｃＡの反応速度定数を示す。ＦＳＭ−固定化ＧｅｏＲａｃＡのＬ−からＤ−Ａｌａ、及び、Ｄ−からＬ−ＡｌａへのＫｍ値は、４．３５及び３．３９ｍＭであり、フリーのＧｅｏＲａｃＡより少し高かった（３．７１及び２．１３ｍＭ）。
【０１３５】
【表５】
【０１３６】
Ｖｍａｘ値は、固定化によって減少した。これらの結果は、固定化酵素は、その基質との接触が制限されていることを示唆している。酵素の形態の変化及び／又は活性部位のブロックは、酵素−支持体の相互作用によって誘導されると考えられる。ＧｅｏＲａｃＡは、ホモ二量体であり、各サブユニットの相互作用は、活性部位を維持する上で重要である。したがって、二量体の活性は、単量体酵素よりも、形態変化に対してより影響される可能性がある。
【０１３７】
ＦＳＭ−固定化、又はフリーのＧｅｏＲａｃＡのＶｍａｘ／Ｋｍ比（これは、基質に対する酵素の触媒効率に影響する）は、両方向で０．０５８／ｍｉｎ及び０．１１４／ｍｉｎである。触媒効率は、ＦＳＭ上の固定酵素によって減少するとしても、５１％の効率が、非固定酵素と比べて残っている。この値は、酵素の固定化に用いられる支持体として合理的なものであると思われる。
【０１３８】
５）ＦＳＭ−固定化及びフリーのＧｅｏＲａｃＡの熱安定性
ＨＲＰ及びヘモグロビンの熱安定性が、それらをＦＳＭの細孔中に固定化することによって増加することが報告されている［文献：１）Ｈ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｂ．Ｌｉ，Ｔ．Ｓａｓａｋｉ，Ｃ．Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｔ．Ｋａｊｉｎｏ，Ｓ．Ｉｎａｇａｋｉ，Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．１２（２０００）３３０１−３３０５、２）Ｙ．Ｕｒａｂｅ，Ｔ．Ｓｈｉｏｍｉ，Ｔ．Ｉｔｏｈ，Ａ．Ｋａｗａｉ，Ｔ．Ｔｓｕｎｏｄａ，Ｆ．Ｍｉｚｕｋａｍｉ，Ｋ．Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．８（２００７）６６８−６７４］。熱安定性を調べるために、フリー、又はＦＳＭ−固定ＧｅｏＲａｃＡを、８０℃でインキュベートした後に残っている活性を測定した。図７に示されるように、非固定酵素の活性は、１０分間のインキュベーションで、６０％に減少し、その後、活性は減少し続けた。
【０１３９】
これに対し、ＦＳＭ−固定ＧｅｏＲａｃＡは、１０分後で、活性が１００％残存し、６０分後でも、５０％の活性が残存した。この結果は、酵素の熱安定性は、ＦＳＭの細孔に固定化することによって、促進されたことを明白に示している。
【０１４０】
フリーのＧｅｏＲａｃＡでは糸くず様の沈殿が熱処理後に見られたが、これはフリーの酵素は、熱処理により変性、凝集したことを示している。これに対し、蛋白質の変性は、ＦＳＭへの固定化によって防がれた。この理由として、酵素の表面がＦＳＭの細孔の壁の多数箇所との結合することにより、熱による酵素の構造の揺らぎが制限されるために、熱安定性が促進される可能性が考えられる。
【０１４１】
図８に示されるように、マイナスに電荷した点は、ＧｅｏＲａｃＡの表面に分散して存在している。ＧｅｏＲａｃＡの総電荷が、用いられる実験条件下（緩衝液ｐＨ＞ｐＩ）でマイナスであるとしても、アルギニン及びリジンの残基は、イオン化しており、このことは、ＦＳＭ表面のシラノール基と作用できることを意味している。
【０１４２】
シロキサン結合に由来するＦＳＭ表面の疎水性の特性も、酵素の表面との結合に関与している。酵素の熱安定性は、狭いシリカ細孔中における分子の水和によって与えられ、シリカ表面のシラノール基の特異的な水−構造を与える性質によって誘導される（文献：Ｒ．Ｒａｖｉｎｄｒａ，Ｚ．Ｓｈｕａｎｇ，Ｈ．Ｇｉｅｓ，Ｒ．Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２６（２００４）１２２２４−１２２２５）。ＦＳＭ−固定化ＧｅｏＲａｃＡは、４℃で、４ヶ月間貯蔵した後でも、活性が９４％残存していて（０ヶ月で１３５μｍｏｌ／分／ｍｇに対し、４ヶ月で、１２７μｍｏｌ／分／ｍｇである）、フリーのＧｅｏＲａｃＡでは、活性の１４％が残存していた（０ヶ月で２３９μｍｏｌ／分／ｍｇに対し、４ヶ月で、３４．３μｍｏｌ／分／ｍｇである）。
【０１４３】
この結果は、ＦＳＭへの酵素の固定化は、その活性を維持する助けとなり得ることを示している。酵素は、液相に貯蔵することができ、必要に応じて、調製できるので、上記の結果は、工業的にも有用である。一般に、市販の酵素は粉末形態であるが、分散することが難しく、粉が舞うことによりプラントへのコンタミ等の原因となる。
【０１４４】
（１１）ＦＳＭ−固定化ＧｅｏＲａｃＡの再利用性
固定化酵素の再利用性は、経済的理由により、重要である。そこで、ＦＳＭ−固定化ＧｅｏＲａｃＡの再利用性を価値する実験を行った。図９に、その実験結果を示す。最初のサイクルにおけるＦＳＭ−固定化ＧｅｏＲａｃＡの当初の活性を１００％として、５サイクルの利用後に、当初の活性の５０％が残存していた。その後、活性は減少したが、１０サイクルで停滞した。
【０１４５】
この結果は、酵素の固定化の支持体としてのＦＳＭの利用可能性を示している。活性の減少は、各サイクルで固定化酵素が遠心により集められる際に酵素の浸出及び／又は崩壊の結果によるものである可能性がある。シリカ表面のシラノール基は、Ａｌａのアミノ基に作用し得るので、基質（Ｌ−Ａｌａ）がＦＳＭに吸着され、酵素の活性に影響することも考えられる。
【０１４６】
Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のアラニン、ラセマーゼを、直径４又は８．５ｎｍの細孔を有するメソポーラスシリカ（ＦＳＭ）に固定化して、ラセマーゼの活性、熱安定性、及び再利用性を調べた。大きい細孔径のＦＳＭは、ラセマーゼを多く吸着したが、これは、細孔径が、酵素を吸着するのに十分な大きさを有するからと考えられる。
【０１４７】
固定化ラセマーゼは、Ｌ−アラニン（Ｌ−Ａｌａ）からＤ−Ａｌａ及びＤ−ＡｌａからＬ−Ａｌａの反応の両者におけるフリーの酵素と比べて、約５１％の活性が残存していた。ラセマーゼは、顕著な熱安定性を示し、ＦＳＭに固定した場合、少なくとも６回使用可能であった。これらの結果は、酵素の固定化の支持体として、ＦＳＭの有用性を示すものである。
【産業上の利用可能性】
【０１４８】
以上詳述したように、本発明は、シリカ系メソ多孔体への酵素の吸着現象を、酵素の固定化法として利用した、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体、その製造方法及びその用途に係るものであり、本発明により、シリカ系メソ多孔体の表面に未処理もしくは適切な溶液による処理で官能基を付与することにより、また、その合成条件の制御により、細孔径の制御されたシリカ系メソ多孔体に、光学異性相互変換酵素が固定化された、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を提供することができる。本発明では、光学異性の相互変換に際し、原料アミノ酸等や糖類等の性状や特性に応じて、好適な酵素を選択して、その酵素を用いたシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を、固定化された酵素として選択することが可能である。また、本発明では、酵素の回収が容易であり、繰り返し使用も可能となり、更には、基質を連続的にシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体と接触して流通させる連続的な酵素反応の実施も可能である。本発明によれば、固定化により高集積化された酵素を利用することで、酵素の凝集を避けることができ、酵素を溶液に溶解した状態よりも高濃度に反応系中に存在させることが可能となり、酵素反応をより効率的に進めることに寄与できる。本発明は、例えば、多種多様なアミノ酸類や糖類等の原料から、複数の酵素を作用させた状態で、良質な光学異性の相互変換を効率的に進行させることができる新規光学異性相互変換プロセス・システムを構築することを可能にするものとして有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シリカ系メソ多孔体と光学異性相互変換酵素の複合体に関するものであり、更に詳しくは、表面に未処理あるいは適切な溶液で官能基を付与する処理等が施されたシリカ系メソ多孔体への酵素の吸着現象を、酸素の固定化法として利用して複合化した、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体、その製造方法及びその用途に関するものである。
【０００２】
本発明は、表面を未処理あるいは適切な溶液で官能基を付与する処理等を施したシリカ系メソ多孔体への酵素の吸着現象を、酵素の固定化法として利用し、シリカ系メソ多孔体の細孔内もしくは表面に、酵素を安定に固定し、かつその酵素の機能を発揮させることを可能とすると共に、酵素の再利用性と保存性を高めたシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体、その製造方法、及び、その機能性部材としての用途に関する新技術・新製品を提供するものである。
【背景技術】
【０００３】
酵素を用いた生化学品、食品製造の技術分野においては、従来、酵素を水に溶解させて用いることが多い。この操作法では、タンパク質である酵素の溶解度に限界があり、ある一定濃度以上の酵素が高密度に存在すると、該酵素が、凝集を起こし、活性を失うことがしばしばである。一方、酵素反応を用いた反応系では、酵素の存在量が多いほど、反応速度、ひいては反応生成物の生産速度を高められることが、容易に予想される。
【０００４】
その一方で、シリカ系メソ多孔体は、２〜５０ｎｍの直径の細孔を有することを特徴としており、その細孔内部への酵素の導入、固定が可能である。したがって、シリカ系メソ多孔体は、数ｎｍから十数ｎｍの大きさを有する酵素、すなわち、タンパク質の吸着、固定に対して、有効な表面を多く有している、有望な担体材料と見なすことができる。
【０００５】
このようなシリカ系メソ多孔体を、酵素の固定化のための担体として使用した場合、ある一定濃度以上の高密度に存在する酵素の凝集を防ぐことが可能となり、活性を有する酵素の高集積化が可能となる。このことは、酵素を用いた反応系において、通常の酵素溶液においては、凝集を起こしてしまう量を越えて、酵素を存在させることが可能になることを意味すると考えられる。更には、酵素が容易に凝集を起こしてしまうｐＨ領域においても、酵素が固定化されていることから、凝集を起こさないため、そのようなｐＨ領域でも、反応系を構築できる可能性があると考えられる。
【０００６】
一般に、担体に、酵素を固定化して用いることは、従前より行われてきたことであるが、その目的は、酵素の分離、及び再利用に関するものがほとんどである。例えば、従来の酵素を用いた生化学品、食品製造の技術分野においては、酵素を水に溶解させて用いることが多く、この操作法では、反応生成物と酵素の分離操作が必要不可欠であり、また、分離された酵素は、廃棄されることが一般的である。この酵素の分離工程を省く目的で、酵素を、担体に固定化して用いるための、酵素の固定化技術が盛んに開発されている。
【０００７】
酵素の固定化法としては、例えば、酵素を、樹脂ビーズ等に直接固定化する方法や、酵素へのポリマーの被覆によるマイクロカプセル化、酵素タンパク質表面を修飾して安定化させる表面修飾法等が提案されている。しかしながら、これらの方法は、酵素が固定化担体の表面上に固定されているだけであり、酵素の高集積化や、固定化による酵素機能の向上を目指したものではない
【０００８】
酵素の再利用を目的とした酵素の固定化も検討されているが、この方法の場合も、分離工程の排除を目的とした方法と大きな違いはなく、酵素の各種担体表面への単純な固定を行っているものが多い。酵素を、高分子発泡体に固定化する方法も用いられており、この場合は、発泡体を圧縮することにより、反応生成物を含む溶液を分離すること、等が行われている。
【０００９】
酵素の固定化法の開発により、酵素を用いた生産プロセスにおいて、反応後の酵素の分離回収や、その再利用が可能となり、酵素の固定化が、酵素を用いた生産プロセスの効率化に貢献していることは事実である。しかし、酵素の固定化により、酵素の高集積化や、酵素機能そのものの向上を目的とした検討は、十分には行われていないのが実情である。
【００１０】
このような状況の中で、本発明者らは、酵素の固定化により、酵素の高集積化や、酵素機能そのものの向上を目的として、酵素の担体として有望なシリカ系メソ多孔体への酵素、すなわちタンパク質の吸着・固定化現象を研究し（特許文献１参照）、この過程で、酵素、すなわちタンパク質のシリカ系メソ多孔体の細孔内への固定や、タンパク質の熱安定性や有機溶媒耐性の向上を見出し、シリカ系メソ多孔体を用いたタンパク質の機能賦活方法（特許文献１、及び非特許文献１）を開発するに至った。
【００１１】
シリカ系メソ多孔体としては、一般に、ＭＣＭ、ＦＳＭ、ＳＢＡタイプ等の材料系が知られている。これらのシリカ系メソ多孔体は、２〜５０ｎｍの直径の細孔を有することを特徴とする。酵素、すなわちタンパク質は、数ｎｍから十数ｎｍの大きさを有しており、シリカ系メソ多孔体の有する細孔径と同程度の大きさの分布を有している。
【００１２】
このことから、シリカ系メソ多孔体を、酵素の固定化担体として用いた場合、酵素を、表面のみならずシリカ系メソ多孔体の細孔内にも固定化することができ、シリカ系メソ多孔体の、酵素の固定化に対する有効な表面積が、従来の技術によるものより極めて大きくなり、シリカ系メソ多孔体に大量の酵素を固定化することが可能である。
【００１３】
シリカ系メソ多孔体に、種々の酵素を固定化しようとする試みには、いくつかの報告がある（非特許文献２、３、４）。しかしながら、工業的な利用を想定した場合、種々の問題が未解決であると思われ、また、これらの報告では、光学異性の相互変換を触媒する酵素は、取り扱われた例がない。
【００１４】
このような問題を解決するために、シリカ系メソ多孔体の表面に処理を加え、酵素との結合を形成する官能基を、シリカ系メソ多孔体の表面に形成される方法が報告された（非特許文献５）。しかしながら、ここで用いられている表面処理の方法は、極めて煩雑で、効率の悪いものであり、また、価格的にも利点が少ないものである。生化学品、食品製造の技術分野においては、簡便な方法で、酵素の固定化が行われることが望ましいことは言うまでもない。
【００１５】
生体内のアミノ酸は、ほとんどがＬ形であり、Ｄ形は、ある種の生理活性ペプチドの構成成分として存在する。このことから、Ｄ形アミノ酸を含む物質が、医薬品、生化学品において、特異な性質を示し、ひいては有用な材料となることがしばしばである。それらの製造において、Ｄ形、Ｌ形のアミノ酸を任意に入手できる技術が需要であり、この反応に、光学異性の相互変換を触媒する酵素を利用することが有効である。
【００１６】
すなわち、天然に存在するＬ形アミノ酸を、Ｄ形に変換したり、Ｄ形とＬ形の存在比率を変化させたりすることを効率的に進行させるには、光学異性の相互変換を触媒する多種多様な酵素の働きを利用することが重要である。このことは、工業的な医薬品、生化学品の製造において、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を利用、適用する上でも重要なことである。
【００１７】
光学異性の相互変換を触媒する酵素以外の酵素を、シリカ系メソ多孔体に固定化した例としては、α−アミラーゼを、ＭＣＭもしくはＳＢＡタイプのシリカ系メソ多孔体に固定化した例がある（非特許文献６）。しかしながら、光学異性の相互変換を触媒する酵素を固定化した例はほとんどなく、また、入手が容易ではない光学異性の相互変換を触媒する酵素は、繰り返し利用ができることが望ましく、多種多様なシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体の開発が望まれる。
【００１８】
そのため、当該技術分野においては、シリカ系メソ多孔体において、その細孔内に、光学異性の相互変換を触媒する酵素を固定化することが可能であり、また、高度に集積化することも可能であるシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体、その製造方法及び該酵素の機能賦活技術を確立することが強く望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】特開２００７−５１０７６号公報
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，Ｖｏｌ．８（２００７）６６８−６７４
【非特許文献２】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌ．Ｂ２（１９９６）１１５−１２６
【非特許文献３】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌ．Ｂ１０（２０００）４５３−４６９
【非特許文献４】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌ．Ｂ２２（２００３）１１９−１３３
【非特許文献５】Ｍｉｃｒｏｐｏｒ．Ｍｅｓｏｐｏｒ．Ｍａｔｅｒ．７７（２００５）６７−７７
【非特許文献６】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌ．Ｂ３５（２００５）１５４−１６０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
このような状況下において、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、光学異性の相互変換を触媒する酵素とシリカ系メソ多孔体とを複合化させた、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を開発することを目標として鋭意研究を行った結果、シリカ系メソ多孔体に、光学異性の相互変換を触媒する酵素を、吸着現象を利用して固定化させることで、その酵素が固定化され、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体が形成されること、更に、このシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を用いて、酵素反応及び酵素の繰り返し利用の特性評価を行い、固定化された酵素が、所定の活性を有していること、該酵素の繰り返し利用に対して高活性を維持し得ること及び高い再利用性を有すること等を見出し、本発明を完成するに至った。
【００２２】
本発明は、アミノ酸等の光学異性を相互変換する際に、酵素の分離・回収を容易にし、繰り返し使用も可能とすると共に、基質を連続的に供給することで、光学異性の相互変換を連続的に進行させることができる、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を提供することを目的とするものである。また、本発明は、一般性、及び普遍性が高く、かつ簡単・簡略な操作による光学異性相互変換酵素を利用した連続生産技術を確立することを可能とするシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）光学異性の相互変換を触媒する酵素とシリカ系メソ多孔体との複合体であり、シリカ系メソ多孔体へ固定化された酵素が、光学異性の相互変換を触媒する活性を有していることを特徴とする、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体。
（２）光学異性の相互変換を触媒する酵素が、アミノ酸類に作用するラセマーゼ、ヒドロキシ酸類に作用するラセマーゼ、あるいは炭水化物及びその類縁体に作用するエピメラーゼであり、複合体が、当該酵素と、７．５ｎｍないし８．５ｎｍ径に細孔径分布のピークを持つシリカ系メソ多孔体との複合体であり、光学異性相互変換反応に、繰り返して使用できる再利用性を有する、前記（１）に記載のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体。
（３）シリカ系メソ多孔体が、ケイ素と酸素を必須成分として含む化合物の多孔体である、前記（１）又は（２）に記載のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体。
（４）シリカ系メソ多孔体が、２〜５０ｎｍの直径の細孔を有する、前記（１）から（３）のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体。
（５）シリカ系メソ多孔体が、０．１〜３．５ｍｌ／ｇの全細孔体積を有する、前記（１）から（４）のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体。
（６）シリカ系メソ多孔体が、２００〜１５００ｍ２の比表面積を有する、前記（１）から（５）のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体。
（７）シリカ系メソ多孔体と、光学異性の相互変換を触媒する酵素の溶解した溶液とを混合することにより、光学異性の相互変換を触媒する酵素を、シリカ系メソ多孔体に固定化することを特徴とする、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体の製造方法。
（８）シリカ系メソ多孔体の中心細孔径を変えることにより、固定化される酵素の量と活性を制御する、前記（７）に記載のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体の製造方法。
（９）シリカ系メソ多孔体に、酵素を固定化させる操作を繰り返すことにより、酵素の固定化量を制御もしくは増大する、前記（８）に記載のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体の製造方法。
（１０）シリカ系メソ多孔体が、７．５ｎｍないし８．５ｎｍ径に細孔径分布のピークを持つシリカ系メソ多孔体あり、該メソ多孔体に、酵素を固定化することにより、該酵素の保存性を向上させたシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を作製する、前記（７）に記載のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体の製造方法。
（１１）シリカ系メソ多孔体が、７．５ｎｍないし８．５ｎｍ径に細孔径分布のピークを持つシリカ系メソ多孔体あり、該メソ多孔体に、酵素を固定化することにより、該酵素の再利用性を向上させたシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を作製する、前記（７）に記載のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体の製造方法。
（１２）前記（１）から（６）のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体からなり、機能性を有する酵素を、シリカ系メソ多孔体上、及び細孔内に、安定に吸着、保持させたことを特徴とする酵素固定化機能性部材。
【００２４】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互交換酵素複合体であって、光学異性の相互変換を触媒する酵素とシリカ系メソ多孔体との複合体であり、シリカ系メソ多孔体へ固定化された酵素が、光学異性の相互変換を触媒する活性を有していることを特徴とするものである。
【００２５】
本発明では、光学異性の相互変換を触媒する酵素が、アミノ酸類に作用するラセマーゼ、ヒドロキシ酸類に作用するラセマーゼ、あるいは炭水化物及びその類縁体に作用するエピメラーゼであり、複合体が、当該酵素と、７．５ｎｍないし８．５ｎｍ径に細孔径分布のピークを持つシリカ系メソ多孔体との複合体であり、光学異性相互変換反応に、繰り返して使用できる再利用性を有すること、シリカ系メソ多孔体が、２〜５０ｎｍの直径の細孔を有すること、シリカ系メソ多孔体が、０．１〜３．５ｍｌ／ｇの全細孔体積を有すること、シリカ系メソ多孔体が、２００〜１５００ｍ２の比表面積を有すること、を好ましい実施の態様としている。
【００２６】
また、本発明は、上記シリカ系メソ多孔体−光学異性相互交換酵素複合体を製造する方法であって、シリカ系メソ多孔体と酵素の溶解した溶液とを混合することにより、光学異性の相互変換を触媒する酵素を、シリカ系メソ多孔体に固定化することを特徴とするものである。本発明では、シリカ系メソ多孔体の中心細孔径を変えることにより、固定化される酵素の量や活性を制御すること、シリカ系メソ多孔体に酵素を固定化させる操作を繰り返すことにより、固定化量を制御もしくは増大すること、を好ましい実施の態様としている。
【００２７】
更に、本発明は、酵素固定化機能性部材であって、上記シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体からなり、機能性を有する酵素を、シリカ系メソ多孔体上、及び細孔内に、安定に吸着、保持させたことを特徴とするものである。
【００２８】
本発明のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を構成するシリカ系メソ多孔体としては、ＭＣＭ、ＦＳＭ、ＳＢＡタイプ等の材料系が用いられる。これらの材料系は、その作製法の違いにより分類されるが、基本的構造は、類似したものである。ＭＣＭやＦＳＭタイプのメソ多孔体は、カチオン性界面活性剤を用いて形成されるミセルを鋳型として合成される。ＦＳＭタイプは、層状化合物であるカネマイトを原料として合成される。一方、ＳＢＡでは、中性の非イオン性界面活性剤のブロックコポリマーを用いて形成されるミセルを鋳型としている。
【００２９】
本発明のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体では、このような複数のタイプのシリカ系メソ多孔体が、光学異性の相互変換を触媒する酵素の固定用担体として使用される。しかし、基本的には、シリカ系メソ多孔体の構造を持つものであって、同様の機能・能力を有している限り、全て使用可能であり、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を構成するシリカ系メソ多孔体としては、上述のタイプのものに限定されるものではない。
【００３０】
本発明のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体の作製に際しては、合成されたシリカ系メソ多孔体に対し、特段の表面処理を施すことなく、洗浄の操作のみを行ったものを用いることが可能である。光学異性の相互変換を触媒する酵素を、シリカ系メソ多孔体に固定する操作は、光学異性の相互変換を触媒する酵素を溶解した溶液中に、当該シリカ系メソ多孔体を浸漬・混合する操作のみにより行われ、これらの操作自体は、極めて簡便で、単純な方法である。この場合、シリカ系メソ多孔体に対する表面処理は、必ずしも必要ではない。
【００３１】
しかしながら、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を構成するシリカ系メソ多孔体の、酵素に対する固定化の機能・能力は、基本的には、シリカ系メソ多孔体と酵素との間の吸着現象で発揮される。その際には、シリカ系メソ多孔体表面と酵素との間の親和性が重要となる上に、また、酵素の吸着は、その分散溶媒、分散溶媒中での酵素安定性、更には、分散溶媒のｐＨ等で影響されることが多い。
【００３２】
したがって、対象とする酵素及びそれを含む溶液の成分状況に応じて、本発明のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体は、それを構成するシリカ系メソ多孔体の表面の状態で、酵素に対する固定化の機能・能力が変わることがある。例えば、シリカ系メソ多孔体の表面に残るシラノール基は、反応性が高いため、酵素に対する固定化の機能・能力に悪影響を与えることが多い。そこで、上記複合体を、シラン処理によりシラノール基が不活性化もしくは減らされたシリカ系メソ多孔体で構成することが好ましい。
【００３３】
本発明では、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体の作製に際し、シリカ系メソ多孔体に表面処理を施すことは、適宜可能であるが、その表面処理の有無、処理の方法等は特に限定されるものではない。シリカ系メソ多孔体表面に形成されるべき官能基としては、固定化する酵素との親和性を確保できる官能基、例えば、アルコキシ基、オクタデシル基、オクチル基、フェニル基、ニトリル基、アミノ基、メルカプトプロピル基、チオール基等が挙げられる。これらは、基本的には、シリカ系メソ多孔体の表面に形成可能な官能基であれば良く、ここに例示した官能基に限定されるものではない。
【００３４】
本発明のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を構成する元素は、一般には、ケイ素と酸素であるが、ケイ素の一部が他の元素に置換したシリカ系メソ多孔体も、酵素の固定化機能を有する限り、使用することができる。シリカ系メソ多孔体を構成するケイ素と置換可能な元素の典型としては、例えば、アルミニウム、ホウ素、燐、ガリウム、ニオブ、チタン、錫、鉄、コバルト、銅、ニッケル、亜鉛、クロム、バナジウム、マンガン、ジルコニウム、タンタル、ハフニウム等が挙げられる。
【００３５】
しかし、これらに留まるものではなく、基本的に、シリカ系メソ多孔体の構造を破壊しないものであれば、いずれでも良い。また、その置換量に関しても、シリカ系メソ多孔体の構造を破壊しない量であれば、置換量は、いかなる量でも良く、これらの置換シリカ系メソ多孔体も、酵素固定化用の担体として使用することが可能である。
【００３６】
本発明のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を構成するシリカ系メソ多孔体は、いずれも、熱安定性、化学安定性に優れており、しかも、環境に対する負荷が低い物質であるので、本発明のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体は、例えば、生化学品製造、医薬品製造にとって極めて有用であり、その技術的並びに経済効果は、非常に優れたものと言える。
【００３７】
シリカ系メソ多孔体は、一般には、数ｎｍの細孔径を有する。そして、その細孔径は、シリカ系メソ多孔体の合成条件により制御することが可能である。例えば、固定化すべき酵素が５ｎｍの大きさを有していた場合、その酵素の大きさに相応した細孔径を有するシリカ系メソ多孔体を合成して、酵素固定化用担体として用いる選択肢があり、それにより、酵素の固定量を増加させたり、酵素の安定性を向上させたりすることが可能である。
【００３８】
本発明において、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を作製する際には、シリカ系メソ多孔体の細孔径を制御することが不可欠である。本発明では、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を作製する際に、シリカ系メソ多孔体の細孔径を制御することで、好適なシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を作製し、提供することが可能である。
【００３９】
本発明のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体では、光学異性の相互変換を触媒する酵素として、アミノ酸類に作用するラセマーゼ、ヒドロキシ酸類に作用するラセマーゼ、炭水化物及びその類縁体に作用するエピメラーゼを用いることができる。しかし、基本的には、光学異性の相互変換を行う酵素であれば、どのような種に由来するものでも良く、ここに例示した酵素に限定されるものではない。
【００４０】
本発明では、いずれの酵素を用いた場合であっても、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を作製する際に、シリカ系メソ多孔体の細孔径を制御すること、及び、シリカ系メソ多孔体表面上の官能基を制御すること、が重要である。本発明では、選択された酵素に対して、シリカ系メソ多孔体に対して、最適ないし好適化の処理を施すことが重要である。
【００４１】
本発明は、例えば、酵素を利用した生化学品、医薬品、食品製造の技術分野において、酵素の安定性や耐久性、生産速度の向上等により、連続的生産手法を構築することを可能とすると共に、反応生産物からの酵素の分離工程を排除することを可能とするものであり、その工程を、従来技術に比べ、大幅に効率化、簡略化することができるものである。
【００４２】
本発明では、シリカ系メソ多孔体の細孔への光学異性相互変換酵素の吸着条件、操作方法の具体的な構成は特に限定されるものではなく、固定化すべき酵素に応じて任意に設計することができる。本発明においては、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体は、単に、シリカ系メソ多孔体にラセマーゼを固定化しただけのものではない。
【００４３】
本発明では、これらのシリカ系メソ多孔体とラセマーゼとを複合化することにより、通常の固定化酵素の場合と比較して、１）高い酵素作用が維持できること、２）その耐熱性を向上させることができること、３）酵素の繰り返し利用による活性の低下が抑制できること、更に、４）酵素の回収を容易にできること、等の、従来の技術常識からは予期し得ない、かつシリカ系メソ多孔体とラセマーゼとを組み合わせた場合に特異的に生起される格別の作用効果を得ることを可能とするものであり、これらは、後記する実施例で、具体的かつ詳細に示したように、格別の実験をしてはじめて実証し得たものである。
【００４４】
更に、後記する実施例に記載されるように、酵素の保存性についての評価を行うために、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体の酵素活性測定において、例えば、酵素活性の測定に用いたものと同様のＧｅｏＲａｃＡが固定化された試料を２０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ ７．５），５０ｍＭ ＫＣｌ溶液中にて、４℃で４ヶ月間保存し、比較のため、シリカ系メソ多孔体に固定化されていない溶液に分散した状態のＧｅｏＲａｃＡも４℃で４ヶ月間保存し、両者のそれぞれ２μｇを、２．５ｍｌの１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．５），３ｍＭ Ｌ−アラニンを含む溶液に添加し、３０℃で２０４ｎｍのＣＤの変化を３分間測定し、活性を評価した。
【００４５】
両者の活性評価の結果、溶液に分散した状態のＧｅｏＲａｃＡは、４ヶ月保存することによって、１４％しか活性を保持していなかったが、シリカ系メソ多孔体に固定化されたＧｅｏＲａｃＡは９４％の活性を保持していた。このことは、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体が酵素の保存性を確保していることを示しているものであり、酵素を一時的に保存し、再利用する等の実使用上の利便性は計り知れない。
【発明の効果】
【００４６】
本発明により、以下のような効果が奏される。
（１）シリカ系メソ多孔体に、光学異性相互変換酵素が固定化されていることで、反応系中に、高濃度に酵素を存在させることが容易に達成できる。
（２）シリカ系メソ多孔体に、光学異性相互変換酵素が固定化されていることにより、通常の酵素反応溶液の場合と比較して、酵素濃度が高くても、酵素の凝集を生じさせることなく、酵素反応を進行させることが容易である。
（３）シリカ系メソ多孔体に、光学異性相互変換酵素が固定化されていることにより、溶液中に分散した状態の酵素では、容易に凝集を起こしてしまうｐＨ領域においても、酵素の凝集を生じさせることなく、酵素反応を進行させることが容易である。
（４）シリカ系メソ多孔体に、光学異性相互変換酵素が固定化されていることにより、酵素の安定性が向上し、酵素の耐熱性が増大することから、反応温度を上昇させることができ、酵素を失活させることなく、酵素反応を進行させることが容易である。
（５）シリカ系メソ多孔体に、光学異性相互変換酵素が固定化されていることにより、酵素の回収が容易である。
（６）シリカ系メソ多孔体に、光学異性相互変換酵素が固定化されていることにより、酵素の繰り返し使用が可能である。
【００４７】
（７）アミノ酸や糖類の光学異性の相互変換に際し、原料の性状や特性に応じて最適ないし好適な酵素を選択して、その酵素を用いたシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を、固定化酵素として利用することができる。
（８）本発明のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を用いることで、多種多様なアミノ酸や糖類原料を対象として、酵素反応により光学異性の相互変換が施されたアミノ酸類や糖類を生成させることができる。
（９）光学異性の相互変換を触媒する酵素として、アミノ酸類に作用するラセマーゼ、ヒドロキシ酸類に作用するラセマーゼ、炭水化物及びその類縁体に作用するエピメラーゼを用いることができ、これらの酵素を固定化した、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を提供することができる。
【００４８】
（１０）シリカ系メソ多孔体の、酵素の導入可能な細孔径を制御することで、酵素の吸着可能な表面を大きくして、酵素の高集積化が可能になる。
（１１）シリカ系メソ多孔体へ、酵素の固定化を繰り返すことにより、より多量な酵素を固定化することが可能である。
（１２）高集積化された酵素を、反応系中に存在させることができるため、酵素反応を、より効率的に進めることができる。
（１３）酵素の凝集を避けることができるため、酵素を、溶液に溶解した状態よりも高濃度に反応系中に存在させることが可能となり、酵素反応を、より効率的に進めることが可能である。
（１４）酵素が溶液中に分散した状態では、容易に凝集を起こしてしまうｐＨ領域においても、酵素の凝集を生じさせることなく、酵素反応を進行させることが可能である。
（１５）酵素の安定性が向上し、酵素の耐熱性が増大することから、反応温度を上昇させることができ、酵素を失活させることなく、酵素反応を進行させることが可能となる。
【００４９】
（１６）本発明のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体では、酵素の回収が容易であり、酵素の繰り返し使用が可能であり、基質を連続的にシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体と接触して流通させ、連続的な酵素反応の実施が可能である。
（１７）本発明のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体は、環境に負荷の少ない材料系で構成され、作製原材料は、入手しやすく、作製方法が簡単で、安価である。
（１８）本発明のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体は、適切な溶液による処理で官能基を形成することで、固定化される酵素の量や、固定化状態を制御することができる。
（１９）本発明のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体は、その作製条件の制御により、シリカ系メソ多孔体の中心細孔径を変えることが可能であり、それにより、固定化される酵素の量や、活性を制御することができる。
（２０）本発明のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体は、その作製条件の制御により、シリカ系メソ多孔体の中心細孔径を変えることが可能であり、それにより、固定化される酵素の安定性や、耐久性を向上させることができる。
（２１）上記の効果を組み合わせて利用することにより、新規の光学異性の相互変換プロセスを確立することができる。
（２２）本発明のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体では、固定化された酵素の保存性が確保されるため、酵素を固定化して長期間保存した後でも使用することが可能である。
（２３）本発明のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体では、固定化された酵素の保存性が確保されるため、酵素の繰り返し使用時に反応を一時停止して、酵素を一時的に保存し、再利用することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、シリカ系メソ多孔体への光学異性相互変換酵素の吸着等温線を示す。
【図２】図２は、シリカ系メソ多孔体へ固定化されたＧｅｏＲａｃＡと溶液中に自由に存在するＧｅｏＲａｃＡの耐熱性の評価結果を示す。
【図３】図３は、シリカ系メソ多孔体へ固定化されたＧｅｏＲａｃＡの繰り返し使用の評価結果を示す。
【図４】窒素吸着／脱着等温線及びＦＳＭの細孔径分布を示す。図中、（Ａ）は、窒素吸着／脱着等温線：ＦＳＭ−４吸着（▲）、ＦＳＭ−４脱着（△）、ＦＳＭ−８．５吸着（■）、ＦＳＭ−８．５脱着（□）、（Ｂ）は、細孔径分布：ＦＳＭ−４（▲）、ＦＳＭ−８．５（■）。等温線はＮＯＶＡ３０００分析器を用いて測定した。細孔径分布は、ＢＪＨ法を用いて決定した。試料は、真空下で、２００℃、３時間、前処理（脱ガス等）を行った。
【図５】試料（１μｇ）は、５−１２％ポリアクリルアミドの濃度勾配による電気泳動で分離し、ゲルは、Ｂｉｏ−Ｓａｆｅ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｓｔａｉｎで染色した。
【図６】ＦＳＭ−４（▲）及びＦＳＭ−８．５（■）上でのＧｅｏＲａｃＡの吸着等温線を示す。ＧｅｏＲａｃＡ（１ｍＬ）の各種濃度を、１０ｍｇのＦＳＭに、４℃で、２４時間吸着させ、上清の蛋白質濃度を測定した。
【図７】フリー及びＦＳＭ−固定化ＧｅｏＲａｃＡの熱安定性を示す。フリー（■）又はＦＳＭ−固定化（▲）ＧｅｏＲａｃＡ（０．２ｍｇ／ｍＬ）を、８０℃で、所定時間インキュベートし、残存する活性を測定した。比活性は、熱処理していない試料の活性に対して計算した。
【図８】ＧｅｏＲａｃＡの静電気表面ポテンシャル（図中、赤に相当する薄い部分はマイナス、青に相当する濃い部分はプラス）を、ＧＲＡＳＰ２プログラムを用いて計算した。
【図９】ＦＳＭ−固定化ＧｅｏＲａｃＡの再利用を示す。各サイクルで、ＦＳＭ−固定化ＧｅｏＲａｃＡ（４μｇの蛋白質）を、３０℃で、１分間、３ｍＭ Ｌ−Ａｌａ（３．５ｍＬ）でインキュベートし、Ｄ−Ａｌａの濃度を測定した。数値は、最初のサイクルでの活性を１００％とした場合の比活性として示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
次に、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって何ら制約を受けるものではない。
【実施例１】
【００５２】
本実施例では、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を合成した。
（１）シリカ系メソ多孔体の合成１
シリカ系メソ多孔体のうち、まず、ＦＳＭタイプに属するシリカ系メソ多孔体の作製法を示す。カチオン性界面活性剤である塩化ベヘニルトリメチルアンモニウムを主成分とし、エチルアルコールとの混合物である界面活性剤（アーカード、ライオン株式会社製）８ｇを、超純水１００ｇに混合し、７０℃で、３０分間、撹拌混合した。
【００５３】
この撹拌混合には、ホモミキサーを用いた。別途、カネマイト（プリフィード、トクヤマシルテック株式会社製）５．３３６ｇを、超純水１０４．７ｇと混合し、７０℃で、撹拌混合した。シリカ系メソ多孔体の細孔径を制御する目的で、要する場合に、膨張剤として、トリイソプロピルベンゼンを添加した。
【００５４】
この撹拌混合には、マグネチックスターラーを用いた。それぞれの溶液の所定の撹拌時間を経た後、両者を混合し、更に、７０℃で、２時間、ホモミキサーを用いて、撹拌混合した。この撹拌混合の後、２規定の塩酸を、約１時間かけて滴下し、溶液の状態をｐＨ８．５とした。溶液のｐＨが８．５となった後、更に、３時間、撹拌混合した。
【００５５】
この溶液を、吸引濾過した後、分離された固形物を、７０℃の温水に再分散し、更に、濾過を繰り返した。この操作を３回繰り返した後、固形物を、６０℃で、２４時間、乾燥した。更に、空気気流中において、５５０℃で、６時間焼成することにより、各種の細孔径を有するシリカ系メソ多孔体を得た。
【００５６】
上記手法により合成されたシリカ系メソ多孔体について、粉末Ｘ線回折法、走査電子顕微鏡法、透過電子顕微鏡法、及び窒素吸着等温線の測定を適用した。粉末Ｘ線回折法は、Ｂｒｕｋｅｒ製ＡＸＳ Ｄ８−ＡＤＶＡＮＣＥ Ｖａｒｉｏ−１を用いて実施した。得られたＸ線回折パターンより、上記手法により作製されたシリカ系メソ多孔体は、２次元ヘキサゴナルの細孔配列構造を有していることが分かった。また、回折ピーク位置の解析から、合成時、膨張剤を用いなかった場合のシリカ系メソ多孔体に比較して、膨張剤を用いた場合のシリカ系メソ多孔体の方が、シリカ系メソ多孔体の細孔径が大きくなっていることが確認された。
【００５７】
走査電子顕微鏡による観察から、合成されたシリカ系メソ多孔体は、不定形顆粒状の形態として観察された。また、透過電子顕微鏡による観察から、合成時に、膨張剤を用いなかった場合のシリカ系メソ多孔体では、４ｎｍ径の細孔が分布していることが確認された。膨張剤として、トリイソプロピルベンゼンを４．５ｍｌ添加した場合のシリカ系メソ多孔体では、７．５ｎｍ径の細孔が分布していることが確認され、また、膨張剤として、トリイソプロピルベンゼンを６ｍｌ添加した場合のシリカ系メソ多孔体では、８．５ｎｍ径の細孔が分布していることが確認された。
【００５８】
窒素吸着等温線の測定は、Ｑｕａｎｔａｃｈｒｏｍｅ社製Ａｕｔｏｓｏｒｂによって行った。測定の結果から、膨張剤の添加量に依存して、異なる吸着等温線が得られた。吸着等温線の解析から、細孔径分布等を知ることは容易である。測定の結果、合成時に、膨張剤を用いなかった場合のシリカ系メソ多孔体では、４ｎｍ径の細孔が分布していることが確認された。膨張剤として、トリイソピルベンゼンを４．５ｍｌ、及び６ｍｌ添加した場合のシリカ系メソ多孔体の場合では、それぞれ７．５ｎｍ，８．５ｎｍ径の細孔が分布していることが確認された。
【００５９】
以下、合成時に、膨張剤を用いなかった場合の、４ｎｍ径に細孔径分布のピークを持つシリカ系メソ多孔体を「ＦＳＭ−４」と表記し、膨張剤として、トリイソピルベンゼンを４．５ｍｌ添加して合成した場合の、７．５ｎｍ径に細孔径分布のピークを持つシリカ系メソ多孔体を「ＦＳＭ−７．５」と表記し、同じく、膨張剤として、トリイソピルベンゼンを６ｍｌ添加して合成した場合の、８．５ｎｍ径に細孔径分布のピークを持つシリカ系メソ多孔体を「ＦＳＭ−８．５」と表記する。
【００６０】
（２）シリカ系メソ多孔体の合成２
次に、シリカ系メソ多孔体のうち、ＳＢＡタイプに属するシリカ系メソ多孔体の作製法を示す。中性の非イオン性界面活性剤のブロックコポリマー［ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）−ｂｌｏｃｋ−ｐｏｌｙ（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）−ｂｌｏｃｋ−ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）］（分子量：〜５８００、ＥＯ：ＰＯ：ＥＯ＝２０：７０：２０）１２ｇを、超純水４４９ｍｌに混合し、更に、これに、３５％の塩酸２０ｍｌを加えて、３５℃で、一晩、撹拌混合した。
【００６１】
その後、シリカ源として、ＴＥＯＳ（Ｔｅｔｒａｅｔｈｌｙ Ｏｒｔｈｏｓｉｌｉｃａｔｅ）を２７．４ｍｌ加え、３５℃で、２０時間、撹拌混合した。この撹拌混合には、マグネチックスターラーを用いた。この反応液を、オートクレーブ容器に装填し、３５，７５，１００，１３０℃の各温度で、２４時間静置した。この溶液を、吸引濾過した後、６０℃で、２４時間、乾燥した。更に、空気気流中において、５５０℃で、６時間焼成することにより、各種の細孔径を有するシリカ系メソ多孔体を得た。この合成法によるＳＢＡは、Ｐ６ｍｍ構造のＳＢＡであった。オートクレーブ容器の保持温度により、細孔径が制御された。
【００６２】
Ｉａ３ｄ構造のＳＢＡを合成するために、中性の非イオン性界面活性剤のブロックコポリマー［ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）−ｂｌｏｃｋ−ｐｏｌｙ（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）−ｂｌｏｃｋ−ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）］（分子量：〜５８００、ＥＯ：ＰＯ：ＥＯ＝２０：７０：２０）１２ｇを、超純水４３４ｍｌに混合し、更に、これに、３５％の塩酸２０ｍｌを加えた。しばらく撹拌混合した後、これに、ブタノール１４．８ｍｌを加えて、３５℃で、一晩、撹拌混合した。
【００６３】
その後、シリカ源として、ＴＥＯＳ（Ｔｅｔｒａｅｔｈｌｙ Ｏｒｔｈｏｓｉｌｉｃａｔｅ）を２７．４ｍｌ加え、３５℃で、２０時間、撹拌混合した。この撹拌混合には、マグネチックスターラーを用いた。この反応液を、オートクレーブ容器に装填し、３５，７５，１００，１３０℃の各温度で、２４時間静置した。この溶液を、吸引濾過した後、６０℃で、２４時間、乾燥した。更に、空気気流中において、５５０℃で、６時間焼成することにより、各種の細孔径を有するシリカ系メソ多孔体を得た。
【実施例２】
【００６４】
（１）光学異性相互変換酵素ラセマーゼの準備
ラセマーゼのクローニングは、以下の手順により行った。
準備したラセマーゼは、以下のものである。
・Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ グルタミン酸ラセマーゼ（ＢｓＲａｃＥ）
・Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｉ グルタミン酸ラセマーゼ（ＬｆＲａｃＥ）
・Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ アラニンラセマーゼ（ＧｅｏＲａｃＡ）
・Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉＯＴ３ アスパラギン酸ラセマーゼ（ＰｈＲａｃＤ）
【００６５】
それぞれの遺伝子の入手は、以下により行った。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ菌体は、納豆（おかめ納豆、タカノフーズ株式会社製）より単離した。Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ菌体（ＮＢＲＣ１２５５０）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｉ菌体（ＮＢＲＣ３０７１）、及びＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉＯＴ３ アスパラギン酸ラセマーゼ遺伝子を含むゲノムＤＮＡクローン（Ｓ２ＬＡ２０９）は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部より購入した。
【００６６】
ＰＣＲプライマーとしては、それぞれ、以下のものを用いた。
１）ＢｓＲａｃＡ：
・ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ５‘−ＡＧＡＧＡＣＡＴＡＴＧＧＡＡＣＡＡＣＣＡＡＴＡＧＧＡＧＴＣＡＴＴＧＡＴＴＣＣ
・ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ５‘−ＧＡＧＡＣＴＣＧＡＧＣＴＡＴＣＴＴＴＴＡＡＴＣＧＧＴＴＣＴＴＧＣＡＧＴＧＡＧＡＴ
【００６７】
２）ＬｆＲａｃＥ：
・ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ５‘−ＡＧＡＧＡＣＡＴＡＴＧＧＡＣＡＡＴＣＧＣＣＣＡＡＴＴＧＧＡＧＴＧＡ
・ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ５‘−ＧＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＴＣＣＣＣＣＴＣＴＴＣＡＡＴＴＴＧＧＧＣＧＧＴ
【００６８】
３）ＧｅｏＲａｃＡ：
・ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ５‘−ＡＧＡＧＡＣＡＴＡＴＧＡＡＣＧＡＣＴＴＴＣＡＴＣＧＣＧＡＴＡＣＧＴＧ
・ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ５‘−ＧＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＴＴＡＴＧＣＡＣＴＧＣＴＴＴＣＣＣ
【００６９】
４）ＰｈＲａｃＤ：
・ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ５‘−ＧＡＧＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＣＧＡＴＡＧＧＴＡＴＡＣＴＴＧＧＴＧ
・ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ５‘−ＧＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＴＴＴＴＣＴＡＡＴＧＣＡＡＣＣＴＴＡＡＣＧ
【００７０】
（２）ラセマーゼ遺伝子のクローニング方法
次に、ラセマーゼ遺伝子をクローニングする方法を示す。各バクテリア菌体のラセマーゼの全長遺伝子に、上記ＰＣＲプライマーを使用し、ｉＰｒｏｏｆ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｒｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（バイオラッド社製）により、遺伝子の増幅を行った。鋳型として、ＢｓＲａｃＥ，ＬｆＲａｃＥ，ＧｅｏＲａｃＡは、それぞれの菌体より、ゲノムＤＮＡを抽出したものを使用し、ＰｈＲａｃＤについては、ゲノムＤＮＡクローン（Ｓ２ＬＡ２０９）を用いた。
【００７１】
ＰＣＲ反応の後、増幅されたＤＮＡの末端を、ゲル精製した後、ポリヌクレオチドキナーゼにより、リン酸化した。これらのインサートを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩベクター（ストラタジーン）のＥｃｏＲＶ部位に挿入し、大腸菌ＴＯＰ１０株（インビトロジェン社製）にトランスフォームして培養した後、クローンを回収した。得られたクローンは、ダイデオキシ法により、ＤＮＡ配列の確認を行った。
【００７２】
次に、正しい配列のラセマーゼ遺伝子を、制限酵素ＮｄｅＩ、及びＸｈｏＩで切断し、発現ベクターｐＥＴ２８ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ、ノバジェン社製）のＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ部位に挿入することにより、組換えタンパク質のアミノ酸末端に、６ｘＨｉｓタグを有する発現プラスミドを作製した。これを、ＴＯＰ１０株にトランスフォームし、プラスミドを回収した。
【００７３】
更に、アミノ酸末端側のＤＮＡ配列を確認して、フレームが正しいことを確認した後、ＢｓＲａｃＥ，ＬｆＲａｃＥ，ＧｅｏＲａｃＡは、発現用大腸菌ＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）株（インビトロジェン社製）に、ＰｈＲａｃＤは、Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）株（ノバジェン社製）にトランスフォームした。得られたコロニーから、小スケールで培養を行い、タンパク質の発現を確認した。
【００７４】
（３）ラセマーゼの大量発現
発現の確認されたクローンについて、シングルコロニーを、３０ｍｌの１．５％グルコース及び５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＴｕｒｂｏ Ｂｒｏｔｈ（モレキュラーディメンジョン社製）で、３７℃において、一晩、振盪培養した。このうちの１５ｍｌもしくは２０ｍｌを、１．５Ｌもしくは２Ｌの上記培地に移し、３７℃で、ＯＤ６００が０．６になるまで振盪培養した。
【００７５】
次に、最終濃度１ｍＭのＩｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を加え、更に、３７℃で、４時間、もしくは２０℃で、１０〜２０時間振盪培養することにより、ラセマーゼを発現させた。７５００×ｇで、４℃、５分間遠心し、菌体を回収した。菌体を、８０ｍｌのＣｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ［２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５００ｍＭ ＮａＣｌ］に懸濁した後、液体窒素で凍結させ、−８０℃で保存した。
【００７６】
（４）ラセマーゼの精製
−８０℃で保存していた菌体を溶解した後、最終濃度１ｍＭ Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ−ｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ （ＰＭＳＦ），１０μｇ／ｍｌ ＰｅｐｓｔａｔｉｎＡ，１０ｍＭ ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（２−ＭＥ）及び１ｍｇ／ｍｌリゾチームを加え、氷上で、１時間静置した。次に、Ｓ−２５０ソニファイアー（ブランソン社製）を使用して、超音波処理を行い、菌体を破砕した。１０００００×ｇで、４℃、４０分間遠心して、上清を回収し、０．４５μｍフィルターでろ過して、クルードサンプルを得た。
【００７７】
クルードサンプルを、Ａバッファー［２０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．５），５００ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ］で平衡化したＨｉｓ−Ｔｒａｐ ＨＰ カラム（５ｍｌ×２本連結，ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に通して、ラセマーゼを吸着させた。次に、Ａバッファーで、カラムを洗浄後、Ｂバッファー［２０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．５），５００ｍＭ ＫＣｌ，５００ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ］の０％から１００％のグラジエントをかけて、ラセマーゼを溶出させた。尚、上記の操作は、ＡＫＴＡ１０Ｓ中圧クロマトグラフィー装置（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて行った。
【００７８】
各フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ラセマーゼを含むフラクションを集めた。集めたフラクションを、透析バッファー（ピアス）に入れ、２Ｌの透析バック［２０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．５），５０ｍＭ ＫＣｌ］で、４℃において、一晩透析した。透析後、サンプルを、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ＭＷＣＦ１００００（ミリポア社製）を用いて、タンパク質濃度約５〜１０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。タンパク質濃度は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（バイオラッド社製）を使用して、γ−グロブリンをスタンダードとして、測定した。
【００７９】
また、活性測定を行って、ラセマーゼ活性を保持していることを確認した。活性測定法として、基質溶液［ＢｓＲａｃＥについては、２０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ８．０），１ｍＭ Ｌ−グルタミン酸、ＬｆＲａｃＡについては、２０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ８．０），２ｍＭ Ｌ−グルタミン酸、ＧｅｏＲａｃＡについては、１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．５），３ｍＭ Ｌ−Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄアラニン］に濃縮したサンプルを加え、３０℃で、２０４ｎｍの円二色性の変化を、Ｊ−８２０円二色性分散計（日本分光社製）を用いて測定することにより、評価した。
【００８０】
（５）シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体の作製
光学異性の相互変換を触媒する酵素の固定化用担体として用いたシリカ系メソ多孔体を、以下に示す。また、表１に、各種シリカ系メソ多孔体の表記法、メソ多孔体の分類合成時設定温度［℃］、窒素吸着による細孔径［ｎｍ］を示す。
・Ｐ６ｍｍ構造のＳＢＡ４種：窒素吸着による細孔径が、６．２ｎｍ、６．７ｎｍ、８．０ｎｍ、１１．１ｎｍのシリカ系メソ多孔体。
・Ｉａ３ｄ構造のＳＢＡ４種：窒素吸着による細孔径が、６．１ｎｍ、６．７ｎｍ、９．９ｎｍ、１１．０ｎｍのシリカ系メソ多孔体。
・ＦＳＭタイプのもの３種：窒素吸着による細孔径が、４ｎｍ、７．５ｎｍ、８．５ｎｍのシリカ系メソ多孔体。
【００８１】
【表１】
【００８２】
光学異性の相互変換を触媒する酵素としては、ＢｓＲａｃＥ，ＬｆＲａｃＥ，ＧｅｏＲａｃＡ，ＰｈＲａｃＤのラセマーゼを用いた。本実施例では、代表例として、ラセマーゼとして、ＧｅｏＲａｃＡを用い、シリカ系メソ多孔体として、細孔径が４ｎｍであるＦＳＭ（ＦＳＭ−４と表記）と、細孔径が８．５ｎｍであるＦＳＭ（ＦＳＭ−８．５と表記）を用いた。尚、その他のラセマーゼ、及びシリカ系メソ多孔体を用いた場合についても、以下に示す同様の実験を行って、同様の結果を得ている。表２に、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体の酵素活性評価用に用いたシリカ系メソ多孔体の特性を示す。これら２種のシリカ系メソ多孔体の特性は、窒素吸着等温線の測定結果、及びその結果の解析から、表２のようにまとめられる。
【００８３】
【表２】
【００８４】
１．［２０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ ７．５），５０ｍＭ ＫＣｌ］のバッファーを使用し、該バッファーに溶かした各種濃度のＧｅｏＲａｃＡ溶液１ｍｌと、１０ｍｇのメソポーラスシリカを混合し、４℃で、一晩、転倒混和した。
２．これを遠心して、上清を除いた。
３．上清に遊離してきたＧｅｏＲａｃＡを定量することで、吸着したＧｅｏＲａｃＡ量を算出し、それぞれの濃度における吸着量を算出した。
【００８５】
その結果を、図１に示す。図１は、シリカ系メソ多孔体への光学異性相互変換酵素の吸着等温線をまとめたものである。その結果、ＦＳＭ−８．５に対する吸着量の方が、ＦＳＭ−４に対する吸着量よりも多いことが分かった。これは、ＧｅｏＲａｃＡの大きさが、８．２×５．２×４．２ｎｍであることから、ＧｅｏＲａｃＡが、ＦＳＭ−８．５の細孔内に、より容易に入り込むためと理解できる。
【００８６】
酵素活性を評価するための、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体の作製は、以下の手順により行った。ＦＳＭ−８．５、３０ｍｇに対して、適当なバッファーに溶解した１．２６ｍｇのＧｅｏＲａｃＡを混ぜ、４℃で、２４時間、ゆっくりと回転振盪した。このＧｅｏＲａｃＡの量は、全量吸着する量に設定されるようにした。
【００８７】
遠心分離により、固定化された酵素、すなわち、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を分離回収し、２０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＫＣｌ溶液で、３回以上洗浄し、酵素量が０．２ｍｇ／ｍｌとなるように、懸濁状態のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を含む溶液を得た。
【００８８】
（６）酵素の固定化状態の評価
上記の懸濁状態のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を含む溶液を、乾燥させて粉末とし、窒素吸着等温線の測定を行った。Ｑｕａｎｔａｃｈｒｏｍｅ社製Ａｕｔｏｓｏｒｂを用いて行った測定の結果、メソ孔内に酵素が取り込まれ、細孔体積が減少していることが確認された。
【００８９】
（７）シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体の酵素活性測定
ＧｅｏＲａｃＡは、アラニンの光学異性相互変換を触媒する酵素である。その活性は、アラニンの光学活性相互変換を測定することにより行った。Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニンは、それぞれ、２３．０及び−２３．０ｍｄｅｇ／ｃｍ／ｍＭの旋光性を示す。Ｌ−アラニンからＤ−アラニンへの変換、もしくはその反対の変換により、旋光性が変化する。その変化を、２０４ｎｍの円二色性の変化を、Ｊ−８２０円二色性分散計（日本分光社製）を用いて測定することにより、評価した。
【００９０】
実際の測定手順は、以下のようにした。
１．１０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．５）の溶液に、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニンがそれぞれ、０．５，１．０，２．０，３．０，４．０，５．０，６．０，８．０，１０．０ｍＭ入った各種溶液を用意した。
【００９１】
２．ＦＳＭ−８．５に固定化されたＧｅｏＲａｃＡと、溶液中に分散しているＧｅｏＲａｃＡの、それぞれ２μｇを、上記１の各種溶液のそれぞれ２．５ｍｌに、３０℃にて、混ぜた。
３．次いで、２０４ｎｍの円二色性の変化を測定した。
【００９２】
その結果を、図２に示す。この結果を元にして、最大酵素反応速度（Ｖｍａｘ）と、Ｖｍａｘの半分の速度を示す時の基質の濃度（Ｋｍ）値を、グラフ解析ソフトウエアを用いて算出した。その算出結果を、表３に示す。表３は、シリカ系メソ多孔体へ固定化されたＧｅｏＲａｃＡと溶液中に自由に存在するＧｅｏＲａｃＡの酵素活性評価をまとめたものである。
【００９３】
Ｋｍ値を比較すると、ＦＳＭ−８．５に固定化されたＧｅｏＲａｃＡの方が、少し大きな値を示している。一方、Ｖｍａｘ値は、溶液に分散したＧｅｏＲａｃＡの方が、大きい。このことは、メソ孔内に固定化されている酵素の方が、基質との接触割合が低くなることから、容易に予想されることである。一般的に、固定化された酵素は、Ｋｍ値は高く、Ｖｍａｘ値は低くなる傾向が知られている（非特許文献６）。更に、基質に対する酵素の作用効率の指標として、Ｖｍａｘ／Ｋｍの値が用いられることがあり、この数値が高いほど、酵素の作用が高いことを示す。
【００９４】
表２に示されるように、ＧｅｏＲａｃＡの場合、ＦＳＭ−８．５に固定化されても、５１％のＶｍａｘ／Ｋｍの値を示しており、一般的な固定化酵素が３０％以下の数値になるのに比較して、高い数値を維持していることが分かる。このことは、本発明のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体が、一般的な固定化酵素の場合と比較して、非常に酵素作用が高く、優れたものであることを示していることに他ならない。
【００９５】
【表３】
【００９６】
（８）シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体の熱安定性の評価
酵素を工業的な製造プロセスに用いる場合、その耐熱性の向上は、非常に重要な因子である。シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を構成した酵素が、溶液中に自由に分散しているときに比較して、熱安定性が向上しているかどうかを評価した。その結果を、図２に示す。図２は、シリカ系メソ多孔体へ固定化されたＧｅｏＲａｃＡと溶液中に自由に存在するＧｅｏＲａｃＡの耐熱性の評価結果をまとめたものである。評価は、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を構成した酵素と、溶液中に自由に分散している状態の酵素を、それぞれ８０℃に保持した後、どの程度の酵素活性を有しているかを見る方法により行った。
【００９７】
本実施例では、ＧｅｏＲａｃＡを、酵素として用い、シリカ系メソ多孔体として、ＦＳＭ−８．５を用いた。その結果は、溶液中に自由に分散した酵素の場合、８０℃に、１０分間保持することで、酵素活性は、６０％に減少した。一方、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を構成した酵素の場合、８０℃、１０分間の保持では、１００％の酵素活性を示した。８０℃に、６０分間保持しても、５０％の活性を有していた。このことは、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体が、酵素の耐熱性を大幅に向上させる効果を有していることを示している。
【００９８】
（９）酵素の繰り返し利用についての評価
技術的並びに経済的効果の観点から、酵素が繰り返し利用できることは非常に重要な因子である。シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体の繰り返し使用による、酵素活性の変化を評価した。用いた酵素は、同様に、ＧｅｏＲａｃＡであり、シリカ系メソ多孔体としては、ＦＳＭ−８．５を用いた。
【００９９】
その結果を、図３に示す。図３は、シリカ系メソ多孔体へ固定化されたＧｅｏＲａｃＡの繰り返し使用の評価結果をまとめたものである。最初の活性を１００％として、５回再使用した場合でも、５０％の活性を保持していることが分かり、１０回までの使用では、少しずつ活性が低下していくが、それ以降は、一定の値に落ち着いてくることが分かる。このことは、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体には、酵素の繰り返し使用を可能とする非常に優れた効果があることを示している。
【０１００】
また、本発明で、特に重要なことは、光学異性の相互変換のための反応系において、シリカ系メソ多孔体に固定化されたラセマーゼを共存させることにより、その溶解度を超えた量のラセマーゼを反応系内に存在させることが可能であることである。このことは、反応速度、すなわち光学異性の相互変換速度の向上に大きく寄与するものであり、また、反応生成物からも、酵素を容易に回収できることを意味するものである。
【０１０１】
一般に、酵素、すなわち、タンパク質の溶解度には、限界があり、それを越えると、凝集という現象を起こす。光学異性相互変換酵素の場合も例外ではなく、１５ｍｇ／ｍｌを越えるような高濃度にすると、凝集が起こり、凝集を起こした酵素は、活性に寄与しない。特に、ラセマーゼは、等電点付近のｐＨ領域での凝集が激しい傾向があり、そのｐＨ域では、１ｍｇ／ｍｌ程度の濃度でも、凝集を避けることは困難である。
【０１０２】
一方で、シリカ系メソ多孔体に固定化されたラセマーゼの場合、例えば、ＦＳＭ−８．５ １０ｍｇに対して、光学異性相互変換酵素が、０．４２ｍｇ程度、吸着・固定されたシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を、１ｍｌの反応基質、すなわち、反応基質の溶解した溶液中に、５０ｍｇ分散させることは容易である。
【０１０３】
この反応系においては、溶液１ｍｌに、ラセマーゼを、０．４２×５０／１０＝２．１ｍｇ、活性を有した状態で存在させることができる。したがって、１ｍｇ／ｍｌを超えた酵素量を、反応系内に容易に存在させることができる。この状況は、凝集の激しい等電点付近のｐＨ領域においても、同様に適用でき、本来であれば容易に凝集を起こしてしまうようなｐＨ領域の反応系内に、酵素を、凝集を起こすことなく、活性を有した状態で、安定に存在させることが可能である。
【０１０４】
更に、本発明では、光学異性相互変換酵素が固定化されたシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を、更に固定して、そこに、反応基質を含む溶液を流すような装置を構成することにより、連続的な酵素反応装置の構築と連続的な酵素反応の実施が容易に可能である。
【実施例３】
【０１０５】
（１）材料
本実施例では、実験材料として、Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＮＢＲＣ１２５５０）、ドコシルトリメチルアンモニウムクロライド［Ｃ２２Ｈ４５Ｎ（ＣＨ３）３Ｃｌ；Ｃ２２−ＴＭＡ］（ライオン株式会社）、カネマイト（層状ポリシリケート）（徳山シルテック株式会社）、１，３，５−トリイソプロピルベンゼン（ＴＩＰＢ）（東京化学工業株式会社）、Ｄ−Ａｌａ、Ｌ−Ａｌａ，β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（和光純薬工業株式会社）を使用した。
【０１０６】
（２）ＦＳＭの合成
ここでは、ＦＳＭ−４（細孔径４ｎｍ）については、カネマイト（５．３５ｇ）を、Ｃ２２−ＴＭＡ（８．１６ｇ）含有水溶液（２０５ｍＬ）に分散させ、７０℃で、２時間撹拌した。得られた懸濁液のｐＨを、２ＮＨＣｌで８．５に調整し、更に、７０℃で、３時間インキュベートした。ＦＳＭ−８．５（細孔径８．５ｎｍ）を合成するためには、カネマイトを加える前に、５．５ｍＬのＴＩＰＢを、Ｃ２２−ＴＭＡ溶液に混合した。合成したＦＳＭは、脱イオン水で洗い、６０℃で、一夜乾燥し、空気中で、５５０℃で、６時間焼成して有機化合物を除いた。
【０１０７】
（３）ＧｅｏＲａｃＡのクローニング及び大量発現
ＧｅｏＲａｃＡ遺伝子を、テンプレートとしてＧ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＮＢＲＣ１２５５０）のゲノムＤＮＡを、プライマーとして、フォワードの５’−ＡＧＡＧＡＣＡＴＡＴＧＡＡＣＧＡＣＴＴＴＣＡＴＣＧＣＧＡＴＡＣＧＴＧ−３’及びリバースの５’−ＧＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＴＴＡＴＧＣＡＣＴＧＣＴＴＴＣＣＣ−３’を用いて、ＰＣＲにより増幅させた。
【０１０８】
ＰＣＲ反応物を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（ＳＫ＋）プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ＣＡ、ＵＳＡ）に連結させ、ｄｉｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ法を用いて、配列を決定した。ｐＥＴ２８ｂベクターのＮｄｅＩ−ＸｈｏＩサイトにクローンを挿入することによって、Ｎ−末端にヘキサヒスチジンタグを持つＧｅｏＲａｃＡを作製した。
【０１０９】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株ＢＬ２１Ｓｔａｒ（ＤＥ３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＣＡ、ＵＳＡ）を、ＧｅｏＲａｃＡ発現ベクターで形質転換した。ＧｅｏＲａｃＡの発現は、ターボブロス中で、ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭ加えることにより誘導した。更に、２０℃で、２１時間インキュベートした後、７５００×ｇ、５分の遠心により細胞を得た。この細胞を、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５００ｍＭ ＮａＣｌに再懸濁し、液体Ｎ２で凍結し、−８０℃で保存した。
【０１１０】
（４）ＧｅｏＲａｃＡの精製
解凍させた細胞に、１ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオライド、１μｇ／ｍＬペプスタチンＡ、０．５ｍｇ／ｍＬリゾチーム、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ユニットのＤＮａｓｅＩ、１０μＭピリドキサール−５’−リン酸、及び１０ｍＭイミダゾールを加えた。４℃で、３０分培養した後、細胞を超音波処理して破砕し、４℃で、１００，０００×ｇ、４５分間遠心した。上清を、０．４５μｍフィルターで濾過し、ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ液体クロマトグラフィーシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ社）のＨｉｓＴｒａｐＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ社、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）にかけた。
【０１１１】
蛋白質を、２０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）、５００ｍＭ ＫＣｌ中の１０−５００ｍＭイミダゾールの濃度勾配により溶出させた。ピークフラクションを集め、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＭＡ、ＵＳＡ）で濃縮し、２０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＫＣｌ、で透析した。酵素の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。
【０１１２】
（５）ＦＳＭへのＧｅｏＲａｃＡの吸着
ＦＳＭへのＧｅｏＲａｃＡの吸着を調べるために、一定量のＦＳＭ（１０ｍｇ）を、各濃度（０．１−４ｍｇ／ｍＬ）の１ｍＬ ＧｅｏＲａｃＡ溶液で、Ｒｏｔａｔｏｒ ＲＴ−５０（タイテック株式会社）で、４℃で、２４時間振盪した。ＦＳＭを、４℃で、２０，８００×ｇ、５分間の遠心で除き、上清液中の蛋白質濃度を測定した。吸着した蛋白質量は、遠心後の上清の蛋白質量を、吸着前のＧｅｏＲａｃＡの量から引くことにより計算した。
【０１１３】
酵素活性を調べるために、３０ｍｇのＦＳＭ−８．５を、２０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＫＣｌ中の１．２６ｍｇのＧｅｏＲａｃＡ（１ｍｇ／ｍＬ）と、４℃で、２４時間インキュベートした。ＦＳＭ−固定化ＧｅｏＲａｃＡを、４℃で、１０，６００×ｇ、３分の遠心で集めた。固定化ＧｅｏＲａｃＡの量は、上清の未結合の蛋白質を測定することによって計算した。ＦＳＭ−固定化ＧｅｏＲａｃＡを３回洗い、緩衝液に懸濁して、蛋白質濃度０．２ｍｇ／ｍＬとした。
【０１１４】
（６）キャラクタリゼーション
窒素吸着等温線を、液体Ｎ２（７７Ｋ）の濃度で、ＮＯＶＡ３００分析器（Ｑｕａｎｔａｃｈｖｏｍｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、ＦＬ、ＵＳＡ）を用いて、測定した。測定の前に、真空下で、試料を、２００℃で、３時間脱ガス処理した。比表面積を、Ｂｒｕｎａｕｒ−Ｅｍｍｅｔｔ−Ｔｅｌｌｅｒ（ＢＥＴ）法で、Ｐ／Ｐ０＝０．０５−０．３０の相対圧力範囲の吸着データを用いて計算した。総細孔体積は、最大相対圧力におけるＮ２吸着から推定した。細孔径分布は、Ｂａｒｒｅｔｔ−Ｊｏｙｎｅｒ−Ｈａｌｅｎｄａ（ＢＪＨ）法を用いて、吸着曲線から決定した。
【０１１５】
（７）酵素活性
アラニンラセマーゼ活性は、Ｊａｓｃｏ Ｊ−８２０ ＣＤ分光施光計（日本分光株式会社）を用いて、２０４ｎｍでのモル楕円率の変化をモニターすることによって測定した。Ｌ−Ａｌａ及びＤ−Ａｌａのモル楕円率は、それぞれ２３．０及び−２３．０ｍｄｅｇ／ｃｍ／ｍＭであった。反応速度定数は、１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）中での、Ｌ−Ａｌａ又はＤ−Ａｌａの各濃度（０．５、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、８．０及び１０ｍＭ）での酵素活性を測定することによって計算した。
【０１１６】
ＦＳＭに固定化した、又はフリーのＧｅｏＲａｃＡ試料（２μｇ蛋白質）を２．５ｍＬの１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）、３ｍＭ Ｌ−Ａｌａに加えた。３０℃での２０４ｎｍのモル楕円率の減少割合から酵素活性を計算した。Ｖｍａｘ及びＫｍ値は、Ｐｒｉｓｍ４ソフト（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、曲線を外挿して計算した。
【０１１７】
（８）熱安定性試験
酵素の熱安定性を調べるために、０．２ｍｇ／ｍＬ ＦＳＭ−固定化又はフリーのＧｅｏＲａｃＡ試料の５０μＬ量を、８０℃で処理した。その後、１０μＬの試料を、２．５ｍＬの１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）、３ｍＭ Ｌ−Ａｌａに加え、３０℃で酵素の残存活性を測定した。
【０１１８】
（９）再利用試験
ＦＳＭ−固定化ＧｅｏＲａｃＡの再利用性を評価するために、４μｇのＦＳＭ−固定化ＧｅｏＲａｃＡを１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）、３ｍＭ Ｌ−Ａｌａに加え、３０℃で、１分間振盪した。４℃、２１５０×ｇで５分遠心することによってＦＳＭ−固定化ＧｅｏＲａｃＡを沈殿させ、上清のＤ−Ａｌａの濃度を測定した。更に、沈殿に新たな３．５ｍＬの１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）、３ｍＭ Ｌ−Ａｌａを加えた。このサイクルを繰り返した。
【０１１９】
（１０）実験結果
１）ＦＳＭのキャラクタリゼーション
細孔径４ｎｍ（ＦＳＭ−４）及び８．５ｎｍ（ＦＳＭ−８．５）のＦＳＭを合成した。窒素吸着等温線及び細孔分布を図４Ａ及びＢに示す。ＦＳＭｓの構造パラメータを、表４に示す。
【０１２０】
【表４】
【０１２１】
図４Ａに示されるように、ＦＳＭ−４及びＦＳＭ−８．５の窒素吸着等温線は、ＩＵＰＡＣ分類により、メソポーラスシリカの特徴であるタイプＩＶであった。ＦＳＭ−４及びＦＳＭ−８．５の細孔径は、４及び８．５ｎｍであり（図４Ｂ）、これらの総細孔体積は、１．３０及び２．５７ｃｍ３／ｇであった。それらの表面積は、両者とも約１１００ｍ２／ｇ（表４）であった。
【０１２２】
これらの値は、ＭＣＭ−４１及びＳＢＡのような、同様の細孔径を有する他のＭＰｓの値と比べて、非常に高い。また、ＦＳＭ−８．５の細孔径分布は、ＦＳＭ−４のものよりも広かった（図４Ｂ）。尚、ＦＳＭの細孔径は、膨潤剤の量の増加に応じて増加するが、細孔径分布も広くなる傾向がある。
【０１２３】
２）ＧｅｏＲａｃＡの分離及び精製
ＧｅｏＲａｃＡのｃＤＮＡクローンを、バクテリア発現ベクターｐＥＴ２８ｂにサブクローンして、Ｎ−末端にヘキサヒスチジンをタグを有した蛋白質を発現させた。
【０１２４】
ＧｅｏＲａｃＡ発現ベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉ株（ＢＬ２１Ｓｔａｒ（ＤＥ３）に導入し、ＧｅｏＲａｃＡ蛋白質発現を誘導させた。ＧｅｏＲａｃＡは、ＨｉｓＴｒａｐＨＰカラムで精製した。精製ＧｅｏＲａｃＡの最終の収量は、培養１Ｌ当たり〜３００ｍｇであった。また、図５に示されるように、ほぼ均一に精製された。
【０１２５】
精製ＧｅｏＲａｃＡは、５−７のｐＨ範囲の緩衝液中では凝集、沈殿が起こったため、塩（５０ｍＭ ＫＣｌ）を含んでいるｐＨ７．５の緩衝液を用いて、凝集を抑えた。ＧｅｏＲａｃＡの等電点（ｐＩ）は６．７であり、該ｐＩでは、ＧｅｏＲａｃＡは不安定であり、沈殿すると考えられる。
【０１２６】
３）ＦＳＭに対するＧｅｏＲａｃＡの吸着
図６に、ＦＳＭ−４及びＦＳＭ−８．５でのＧｅｏＲａｃＡの吸着等温線を示す。飽和能力は、ＦＳＭ−４よりも細孔の大きいＦＳＭ８．５がより高い（２８及び６２ｍｇ／ｇ）。
【０１２７】
ＧｅｏＲａｃＡは、４３ｋＤａの２つの同一のサブユニットからなり、ユニットセル寸法は、８８×５２×４２Åである（文献：Ｊ．Ｐ．Ｓｈａｗ，Ｇ．Ａ．Ｐｅｔｓｋｏ，Ｄ．Ｒｉｎｇｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６（１９９７）１３２９−１３４２）。ＧｅｏＲａｃＡの寸法は、ＦＳＭ−４の細孔径より大きいので、吸着された少量は、粒子の細孔入口及び／又は外表面に存在していると考えられる。
【０１２８】
ＦＳＭ−４及びＦＳＭ−８．５の表面積は、同様であるが、ＦＳＭ−８．５の総細孔体積は、ＦＳＭ−４の約２倍の大きさであり（表４）、その細孔径は、ＧｅｏＲａｃＡより大きいことから、ＧｅｏＲａｃＡは、ＦＳＭ−８．５の細孔内に固定化されていることが示唆される。
【０１２９】
ＦＳＭに吸着されたＧｅｏＲａｃＡの量を、他の蛋白質の吸着と比べると、ＨＲＰ（１８３ｍｇ／ｇ）及びヘモグロビン（２１２ｍｇ／ｇ）のものより低かった［文献：１）Ｈ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｂ．Ｌｉ，Ｔ．Ｓａｓａｋｉ，Ｃ．Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｔ．Ｋａｊｉｎｏ，Ｓ．Ｉｎａｇａｋｉ，Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．１２（２０００）３３０１−３３０５、２）Ｙ．Ｕｒａｂｅ，Ｔ．Ｓｈｉｏｍｉ，Ｔ．Ｉｔｏｈ，Ａ．Ｋａｗａｉ，Ｔ．Ｔｓｕｎｏｄａ，Ｆ．Ｍｉｚｕｋａｍｉ，Ｋ．Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．８（２００７）６６８−６７４］。この低い吸着は、用いた緩衝液のｐＨがＧｅｏＲａｃＡのｐＩより高いことによると考えられる。
【０１３０】
一般的に、シリカ支持体への酵素の吸着は、緩衝液のｐＨが蛋白質のｐＩ付近で、最大化され、そのｐＩより上では減少する。本実施例で用いた緩衝液のｐＨは、７．５であり、ＧｅｏＲａｃＡのｐＩ（６．７）より高い。このとき、ＧｅｏＲａｃＡは全体的にはマイナス電荷を有していると考えられる。また、シリカ支持体の表面は、ｐＨ＜２でマイナスに電荷を有している。よって、ｐＨは、７．５の緩衝液中では、シリカ表面及びＧｅｏＲａｃＡは共にマイナスの電荷を有しているので、吸着が低くなる。分子進化のような、分子生物学技術を用いて酵素のｐＩを修正することは、この問題を解決すると思われる。
【０１３１】
本実施例では、ＳＢＡタイプのメソポーラスシリカも調べた。ＳＢＡの細孔径（９．８ｎｍ）及び表面積（９５５ｍ２／ｇ）はＦＳＭ−８．５と同様であったが、ＳＢＡに吸着されたＧｅｏＲａｃＡの量は、ＦＳＭ−８．５に吸着された量の約半分であった。
【０１３２】
ＦＳＭの表面シラノール基の組成は、ＳＢＡを含む他のアモルファスシリカと比べて、ユニークである。例えば、アモルファスシリカは、Ｑ２（２０％）及びＱ３（８％）シラノール基を表面に含んでいるが、ＦＳＭのシラノール基は、Ｑ３である。ＦＳＭの表層シラノール基は、アモルファスシリカのものよりも、より酸性である。
【０１３３】
ＦＳＭのこれらのユニークな表面特性は、ＳＢＡよりも、蛋白質の吸着をより高くさせることが可能である。一般に、高い酵素能力は、固定化酵素支持体の経済性にとって重要であり、酵素が固定化のメリットを最大限に享受されるためには、メソポーラスシリカの細孔内に吸着される必要があると考えられる［文献：１）Ｓ．Ｈｕｄｓｏｎ，Ｊ．Ｃｏｏｎｅｙ，Ｅ．Ｍａｇｎｅｒ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４７（２００８）８５８２−８５９４、２）Ｃ．Ｉｓｐａｓ，Ｉ．Ｓｏｋｏｌｏｖ，Ｓ．Ａｎｄｒｅｅｓｃｕ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．３９３（２００９）５４３−５５４］。
【０１３４】
４）ＦＳＭ−固定化及びフリーＧｅｏＲａｃＡの反応速度
表５に、フリー、又はＦＳＭ−固定化ＧｅｏＲａｃＡの反応速度定数を示す。ＦＳＭ−固定化ＧｅｏＲａｃＡのＬ−からＤ−Ａｌａ、及び、Ｄ−からＬ−ＡｌａへのＫｍ値は、４．３５及び３．３９ｍＭであり、フリーのＧｅｏＲａｃＡより少し高かった（３．７１及び２．１３ｍＭ）。
【０１３５】
【表５】
【０１３６】
Ｖｍａｘ値は、固定化によって減少した。これらの結果は、固定化酵素は、その基質との接触が制限されていることを示唆している。酵素の形態の変化及び／又は活性部位のブロックは、酵素−支持体の相互作用によって誘導されると考えられる。ＧｅｏＲａｃＡは、ホモ二量体であり、各サブユニットの相互作用は、活性部位を維持する上で重要である。したがって、二量体の活性は、単量体酵素よりも、形態変化に対してより影響される可能性がある。
【０１３７】
ＦＳＭ−固定化、又はフリーのＧｅｏＲａｃＡのＶｍａｘ／Ｋｍ比（これは、基質に対する酵素の触媒効率に影響する）は、両方向で０．０５８／ｍｉｎ及び０．１１４／ｍｉｎである。触媒効率は、ＦＳＭ上の固定酵素によって減少するとしても、５１％の効率が、非固定酵素と比べて残っている。この値は、酵素の固定化に用いられる支持体として合理的なものであると思われる。
【０１３８】
５）ＦＳＭ−固定化及びフリーのＧｅｏＲａｃＡの熱安定性
ＨＲＰ及びヘモグロビンの熱安定性が、それらをＦＳＭの細孔中に固定化することによって増加することが報告されている［文献：１）Ｈ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｂ．Ｌｉ，Ｔ．Ｓａｓａｋｉ，Ｃ．Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｔ．Ｋａｊｉｎｏ，Ｓ．Ｉｎａｇａｋｉ，Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．１２（２０００）３３０１−３３０５、２）Ｙ．Ｕｒａｂｅ，Ｔ．Ｓｈｉｏｍｉ，Ｔ．Ｉｔｏｈ，Ａ．Ｋａｗａｉ，Ｔ．Ｔｓｕｎｏｄａ，Ｆ．Ｍｉｚｕｋａｍｉ，Ｋ．Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．８（２００７）６６８−６７４］。熱安定性を調べるために、フリー、又はＦＳＭ−固定ＧｅｏＲａｃＡを、８０℃でインキュベートした後に残っている活性を測定した。図７に示されるように、非固定酵素の活性は、１０分間のインキュベーションで、６０％に減少し、その後、活性は減少し続けた。
【０１３９】
これに対し、ＦＳＭ−固定ＧｅｏＲａｃＡは、１０分後で、活性が１００％残存し、６０分後でも、５０％の活性が残存した。この結果は、酵素の熱安定性は、ＦＳＭの細孔に固定化することによって、促進されたことを明白に示している。
【０１４０】
フリーのＧｅｏＲａｃＡでは糸くず様の沈殿が熱処理後に見られたが、これはフリーの酵素は、熱処理により変性、凝集したことを示している。これに対し、蛋白質の変性は、ＦＳＭへの固定化によって防がれた。この理由として、酵素の表面がＦＳＭの細孔の壁の多数箇所との結合することにより、熱による酵素の構造の揺らぎが制限されるために、熱安定性が促進される可能性が考えられる。
【０１４１】
図８に示されるように、マイナスに電荷した点は、ＧｅｏＲａｃＡの表面に分散して存在している。ＧｅｏＲａｃＡの総電荷が、用いられる実験条件下（緩衝液ｐＨ＞ｐＩ）でマイナスであるとしても、アルギニン及びリジンの残基は、イオン化しており、このことは、ＦＳＭ表面のシラノール基と作用できることを意味している。
【０１４２】
シロキサン結合に由来するＦＳＭ表面の疎水性の特性も、酵素の表面との結合に関与している。酵素の熱安定性は、狭いシリカ細孔中における分子の水和によって与えられ、シリカ表面のシラノール基の特異的な水−構造を与える性質によって誘導される（文献：Ｒ．Ｒａｖｉｎｄｒａ，Ｚ．Ｓｈｕａｎｇ，Ｈ．Ｇｉｅｓ，Ｒ．Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２６（２００４）１２２２４−１２２２５）。ＦＳＭ−固定化ＧｅｏＲａｃＡは、４℃で、４ヶ月間貯蔵した後でも、活性が９４％残存していて（０ヶ月で１３５μｍｏｌ／分／ｍｇに対し、４ヶ月で、１２７μｍｏｌ／分／ｍｇである）、フリーのＧｅｏＲａｃＡでは、活性の１４％が残存していた（０ヶ月で２３９μｍｏｌ／分／ｍｇに対し、４ヶ月で、３４．３μｍｏｌ／分／ｍｇである）。
【０１４３】
この結果は、ＦＳＭへの酵素の固定化は、その活性を維持する助けとなり得ることを示している。酵素は、液相に貯蔵することができ、必要に応じて、調製できるので、上記の結果は、工業的にも有用である。一般に、市販の酵素は粉末形態であるが、分散することが難しく、粉が舞うことによりプラントへのコンタミ等の原因となる。
【０１４４】
（１１）ＦＳＭ−固定化ＧｅｏＲａｃＡの再利用性
固定化酵素の再利用性は、経済的理由により、重要である。そこで、ＦＳＭ−固定化ＧｅｏＲａｃＡの再利用性を価値する実験を行った。図９に、その実験結果を示す。最初のサイクルにおけるＦＳＭ−固定化ＧｅｏＲａｃＡの当初の活性を１００％として、５サイクルの利用後に、当初の活性の５０％が残存していた。その後、活性は減少したが、１０サイクルで停滞した。
【０１４５】
この結果は、酵素の固定化の支持体としてのＦＳＭの利用可能性を示している。活性の減少は、各サイクルで固定化酵素が遠心により集められる際に酵素の浸出及び／又は崩壊の結果によるものである可能性がある。シリカ表面のシラノール基は、Ａｌａのアミノ基に作用し得るので、基質（Ｌ−Ａｌａ）がＦＳＭに吸着され、酵素の活性に影響することも考えられる。
【０１４６】
Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のアラニン、ラセマーゼを、直径４又は８．５ｎｍの細孔を有するメソポーラスシリカ（ＦＳＭ）に固定化して、ラセマーゼの活性、熱安定性、及び再利用性を調べた。大きい細孔径のＦＳＭは、ラセマーゼを多く吸着したが、これは、細孔径が、酵素を吸着するのに十分な大きさを有するからと考えられる。
【０１４７】
固定化ラセマーゼは、Ｌ−アラニン（Ｌ−Ａｌａ）からＤ−Ａｌａ及びＤ−ＡｌａからＬ−Ａｌａの反応の両者におけるフリーの酵素と比べて、約５１％の活性が残存していた。ラセマーゼは、顕著な熱安定性を示し、ＦＳＭに固定した場合、少なくとも６回使用可能であった。これらの結果は、酵素の固定化の支持体として、ＦＳＭの有用性を示すものである。
【産業上の利用可能性】
【０１４８】
以上詳述したように、本発明は、シリカ系メソ多孔体への酵素の吸着現象を、酵素の固定化法として利用した、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体、その製造方法及びその用途に係るものであり、本発明により、シリカ系メソ多孔体の表面に未処理もしくは適切な溶液による処理で官能基を付与することにより、また、その合成条件の制御により、細孔径の制御されたシリカ系メソ多孔体に、光学異性相互変換酵素が固定化された、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を提供することができる。本発明では、光学異性の相互変換に際し、原料アミノ酸等や糖類等の性状や特性に応じて、好適な酵素を選択して、その酵素を用いたシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を、固定化された酵素として選択することが可能である。また、本発明では、酵素の回収が容易であり、繰り返し使用も可能となり、更には、基質を連続的にシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体と接触して流通させる連続的な酵素反応の実施も可能である。本発明によれば、固定化により高集積化された酵素を利用することで、酵素の凝集を避けることができ、酵素を溶液に溶解した状態よりも高濃度に反応系中に存在させることが可能となり、酵素反応をより効率的に進めることに寄与できる。本発明は、例えば、多種多様なアミノ酸類や糖類等の原料から、複数の酵素を作用させた状態で、良質な光学異性の相互変換を効率的に進行させることができる新規光学異性相互変換プロセス・システムを構築することを可能にするものとして有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光学異性の相互変換を触媒する酵素とシリカ系メソ多孔体との複合体であり、シリカ系メソ多孔体へ固定化された酵素が、光学異性の相互変換を触媒する活性を有していることを特徴とする、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体。
【請求項２】
光学異性の相互変換を触媒する酵素が、アミノ酸類に作用するラセマーゼ、ヒドロキシ酸類に作用するラセマーゼ、あるいは炭水化物及びその類縁体に作用するエピメラーゼであり、複合体が、当該酵素と、７．５ｎｍないし８．５ｎｍ径に細孔径分布のピークを持つシリカ系メソ多孔体との複合体であり、光学異性相互変換反応に、繰り返して使用できる再利用性を有する、請求項１に記載のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体。
【請求項３】
シリカ系メソ多孔体が、ケイ素と酸素を必須成分として含む化合物の多孔体である、請求項１又は２に記載のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体。
【請求項４】
シリカ系メソ多孔体が、２〜５０ｎｍの直径の細孔を有する、請求項１から３のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体。
【請求項５】
シリカ系メソ多孔体が、０．１〜３．５ｍｌ／ｇの全細孔体積を有する、請求項１から４のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体。
【請求項６】
シリカ系メソ多孔体が、２００〜１５００ｍ２の比表面積を有する、請求項１から５のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体。
【請求項７】
シリカ系メソ多孔体と、光学異性の相互変換を触媒する酵素の溶解した溶液とを混合することにより、光学異性の相互変換を触媒する酵素を、シリカ系メソ多孔体に固定化することを特徴とする、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体の製造方法。
【請求項８】
シリカ系メソ多孔体の中心細孔径を変えることにより、固定化される酵素の量と活性を制御する、請求項７に記載のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体の製造方法。
【請求項９】
シリカ系メソ多孔体に、酵素を固定化させる操作を繰り返すことにより、酵素の固定化量を制御もしくは増大する、請求項８に記載のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体の製造方法。
【請求項１０】
シリカ系メソ多孔体が、７．５ｎｍないし８．５ｎｍ径に細孔径分布のピークを持つシリカ系メソ多孔体あり、該メソ多孔体に、酵素を固定化することにより、該酵素の保存性を向上させたシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を作製する、請求項７に記載のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体の製造方法。
【請求項１１】
シリカ系メソ多孔体が、７．５ｎｍないし８．５ｎｍ径に細孔径分布のピークを持つシリカ系メソ多孔体あり、該メソ多孔体に、酵素を固定化することにより、該酵素の再利用性を向上させたシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を作製する、請求項７に記載のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体の製造方法。
【請求項１２】
請求項１から６のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体からなり、機能性を有する酵素を、シリカ系メソ多孔体上、及び細孔内に、安定に吸着、保持させたことを特徴とする酵素固定化機能性部材。
【請求項１】
光学異性の相互変換を触媒する酵素とシリカ系メソ多孔体との複合体であり、シリカ系メソ多孔体へ固定化された酵素が、光学異性の相互変換を触媒する活性を有していることを特徴とする、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体。
【請求項２】
光学異性の相互変換を触媒する酵素が、アミノ酸類に作用するラセマーゼ、ヒドロキシ酸類に作用するラセマーゼ、あるいは炭水化物及びその類縁体に作用するエピメラーゼであり、複合体が、当該酵素と、７．５ｎｍないし８．５ｎｍ径に細孔径分布のピークを持つシリカ系メソ多孔体との複合体であり、光学異性相互変換反応に、繰り返して使用できる再利用性を有する、請求項１に記載のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体。
【請求項３】
シリカ系メソ多孔体が、ケイ素と酸素を必須成分として含む化合物の多孔体である、請求項１又は２に記載のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体。
【請求項４】
シリカ系メソ多孔体が、２〜５０ｎｍの直径の細孔を有する、請求項１から３のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体。
【請求項５】
シリカ系メソ多孔体が、０．１〜３．５ｍｌ／ｇの全細孔体積を有する、請求項１から４のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体。
【請求項６】
シリカ系メソ多孔体が、２００〜１５００ｍ２の比表面積を有する、請求項１から５のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体。
【請求項７】
シリカ系メソ多孔体と、光学異性の相互変換を触媒する酵素の溶解した溶液とを混合することにより、光学異性の相互変換を触媒する酵素を、シリカ系メソ多孔体に固定化することを特徴とする、シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体の製造方法。
【請求項８】
シリカ系メソ多孔体の中心細孔径を変えることにより、固定化される酵素の量と活性を制御する、請求項７に記載のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体の製造方法。
【請求項９】
シリカ系メソ多孔体に、酵素を固定化させる操作を繰り返すことにより、酵素の固定化量を制御もしくは増大する、請求項８に記載のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体の製造方法。
【請求項１０】
シリカ系メソ多孔体が、７．５ｎｍないし８．５ｎｍ径に細孔径分布のピークを持つシリカ系メソ多孔体あり、該メソ多孔体に、酵素を固定化することにより、該酵素の保存性を向上させたシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を作製する、請求項７に記載のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体の製造方法。
【請求項１１】
シリカ系メソ多孔体が、７．５ｎｍないし８．５ｎｍ径に細孔径分布のピークを持つシリカ系メソ多孔体あり、該メソ多孔体に、酵素を固定化することにより、該酵素の再利用性を向上させたシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体を作製する、請求項７に記載のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体の製造方法。
【請求項１２】
請求項１から６のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体からなり、機能性を有する酵素を、シリカ系メソ多孔体上、及び細孔内に、安定に吸着、保持させたことを特徴とする酵素固定化機能性部材。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図９】
【図５】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図９】
【図５】
【図８】
【公開番号】特開２０１１−１５６１１（Ｐ２０１１−１５６１１Ａ）
【公開日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１５４４２０（Ｐ２００９−１５４４２０）
【出願日】平成２１年６月２９日（２００９．６．２９）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月２９日（２００９．６．２９）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
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