ジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤およびその中間体の製造方法
【課題】ジペプチジルペプチダーゼＩＶのシクロプロピル縮合ピロリジンベースの阻害剤の製造方法の提供。
【解決手段】構造１の酸をギ酸アンモニウム，ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド，ジチオスレイトール及び部分精製フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ／ギ酸デヒドロゲナーゼ酵素濃縮物（ＰＤＨ／ＦＤＨ）と処理することにより還元アミノ化に供し、単離することなく、得られた（αＳ）−α−アミノ−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン−１−酢酸をジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネートと処理して製造する。
【解決手段】構造１の酸をギ酸アンモニウム，ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド，ジチオスレイトール及び部分精製フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ／ギ酸デヒドロゲナーゼ酵素濃縮物（ＰＤＨ／ＦＤＨ）と処理することにより還元アミノ化に供し、単離することなく、得られた（αＳ）−α−アミノ−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン−１−酢酸をジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネートと処理して製造する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００４年４月１４日に出願された米国仮出願番号60/561,986号による優先権を主張し、該出願の全開示を参照により本明細書に引用する。
【０００２】
本発明は、糖尿病およびその合併症、高血糖症、Ｘ症候群、高インスリン血症、肥満およびアテローム性動脈硬化症および関連疾患、並びに免疫変調性疾患および慢性炎症性腸疾患の治療に用いられるジペプチジルペプチダーゼＩＶのシクロプロピル縮合ピロリジンベースの阻害剤を製造するための中間体として用いられる（αＳ）−α−［［（１，１−ジメチルエトキシ）カルボニル］−アミノ］−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ジペプチジルペプチダーゼＩＶは、膜に結合した非古典的なセリンアミノペプチダーゼであり、これらに限らないが腸、肝臓、肺および腎臓を含む様々な組織に存在している。この酵素はまた、循環しているＴ−リンパ球にも存在しており、そこではＣＤ−２６と称される。ジペプチジルペプチダーゼＩＶは、インビボで内因性のペプチドＧＬＰ−１（７−３６）およびグルカゴンの代謝的開裂を担っており、他のペプチド、例えばＧＨＲＨ、ＮＰＹ、ＧＬＰ−２およびＶＩＰに対してインビトロでタンパク質分解活性を示している。
【０００４】
ＧＬＰ−１（７−３６）は、小腸におけるプログルカゴンの翻訳後プロセシングの結果生じる２９個のアミノ酸のペプチドである。このペプチドは、インビボで多数の作用を有する。例えば、ＧＬＰ−１（７−３６）は、インスリン分泌を刺激し、グルカゴン分泌を阻害する。このペプチドは満腹感を促進し、胃内容排出を遅らせる。ＧＬＰ−１（７−３６）の連続注入による外部からの投与は、糖尿病患者に有効であることが示されている。しかし、外部からのペプチドは連続的に治療に用いるには余りにも速く分解されてしまう。
【０００５】
ＧＬＰ−１（７，３６）の内因性レベルを増強するために、ジペプチジルペプチダーゼＩＶの阻害剤が開発されている。Hamannらによる米国特許第6,395,767号は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶのシクロプロピル縮合ピロリジンベースの阻害剤を開示している。これら阻害剤を化学的に合成する方法は、米国特許第6,395,767号並びに文献に開示されている。例えば、Sagnardら、Tet-Lett. 1995 36: 3148-3152；Tverezovskyら、Tetrahedron 1997 53: 14773-14792；およびHanessianら、Bioorg. Med. Chem. Lett. 1998 8: 2123-2128を参照されたい。米国特許第6,395,767号に開示されている好ましい阻害剤は、式Ｍ'：
【化１】
で示される（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）−２−［（２Ｓ）−２−アミノ−２−（３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］−１−デシル）−１−オキソエチル］−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−３−カルボニトリルおよびそれに対応する一水和物である（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）−２−［（２Ｓ）−２−アミノ−２−（３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］−１−デシル）−１−オキソエチル］−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−３−カルボニトリル（Ｍ”）である。
【０００６】
このジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤の製造に用いる中間体を製造するために適用した方法が、EP 0 808 824 A2に開示されている。ImashiroおよびKurodaのTetrahedron Letters 2001 42: 1313-1315、ReetzらのChem. Int. Ed. Engl. 1979 18: 72、ReetzおよびHeimbachらのChem. Ber. 1983 116: 3702-3707、ReetzらのChem. Ber. 1983 116: 3708-3724も参照のこと。
【０００７】
本発明は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶのシクロプロピル縮合ピロリジンベースの阻害剤の製造に使用するための新規な製造方法および化合物を提供する。
【０００８】
米国特許第6,395,767においてHamannらは、遊離塩基Ｍ’またはその塩の製造に用いられる中間体である（αＳ）−α−［［（１，１−ジメチルエトキシ）カルボニル］−アミノ］−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸の合成方法であって、アダマンタンカルボン酸から８工程の合成を含む方法を記載している。
【０００９】
米国特許出願第10/716,012（２００３年１１月１８日出願）（弁護士ファイルLA84NP）は、（αＳ）−α−［［（１，１−ジメチルエトキシ）カルボニル］−アミノ］−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸の製造方法であって、出発物質として３−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸を使用し、酵素還元的アミノ化を用いて（αＳ）−α−アミノ−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸を製造、単離し、これを別工程で所望の生成物に変換する方法を開示している。
【００１０】
酵素還元的アミノ化工程には、ギ酸アンモニウム、ＤＴＴおよびＮＡＤの存在下、水酸化アンモニウムをｐＨ調整のために用い、酵素ギ酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＦＤＨ）と組み合わせた様々な形の酵素フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）の使用が含まれる。過剰なアンモニウムイオンが存在する場合には、ＢＯＣ基の導入との干渉の可能性を避けるために、さらに後続の工程の前にアンモニアを除去することが必要であろう。
【００１１】
ＰＤＨおよび/またはＦＤＨ酵素を製造する細胞を、発酵ブロスから単離し、使用に供するまで保存する。使用前に、細胞から酵素を放出させるために細胞をミクロ流動化（microfluidized）し、共に存在する細胞破砕物は還元的アミノ化における使用に供する前に除去しなければならない。
【発明の概要】
【００１２】
本発明に従い、部分精製されたフェニルアラニンデヒドロゲナーゼおよび／またはギ酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＰＤＨ／ＦＤＨ）濃縮物を製造する方法であって、以下の工程：
ａ．フェニルアラニンデヒドロゲナーゼおよび／またはギ酸デヒドロゲナーゼを製造し得る微生物の発酵ブロスを製造し；
ｂ．該ブロスをミクロ流動化（microfluidization）させて、得られた細胞から活性を放出させ、ＰＤＨおよび/またはＦＤＨ活性を有するミクロ流動化ブロスを得；
ｃ．細胞破砕物を凝集させてＤＮＡおよび不要なタンパク質を除去するために、該ブロスを凝集剤で処理することにより清浄化し；
ｄ．清浄化ブロスを濾過し；そして
ｅ．該ブロスを濃縮して、ＰＤＨについて少なくとも約４００ＩＵ／ｍｌ、ＦＤＨについて少なくとも約２０ＩＵ／ｍｌのＰＤＨ／ＦＤＨ活性を有する部分精製された酵素濃縮物を得ること
を含む方法が提供される。
【００１３】
さらに、本発明に従い、以下の構造：
【化２】
を有するアミン体を製造する方法であって、以下の工程：
ａ．以下の構造：
【化３】
を有するケト酸の水溶液を、最大約２モル当量のギ酸アンモニウム、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ジチオスレイトールおよび部分精製されたフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ／ギ酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＰＤＨ／ＦＤＨ）と処理し；そして
ｂ．反応物のｐＨを水酸化ナトリウムで約７．０〜約８．６、好ましくは８．０＋／−０．２に維持して、望ましくない過剰アンモニウムイオンを実質的に含まない所望のアミン体を得ること
を含む方法が提供される。
【００１４】
さらに本発明に従い、以下の構造：
【化４】
を有するＢＯＣ保護アミン体を製造するための方法であって、以下の工程：
ａ．以下の構造を有するアミノ酸（αＳ）−α−アミノ−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸：
【化５】
（部分精製フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ／ギ酸デヒドロゲナーゼ酵素を用いて、上記ケト酸１：
【化６】
の還元的アミノ化において製造される）
の水溶液を提供し；そして
ｂ．上記水溶液をジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネートと処理してＢＯＣ保護アミン体を得ること
を含む方法が提供される。
【００１５】
本発明の別の態様において、以下の構造３：
【化７】
を有するＢＯＣ保護アミン体を製造する方法であって、以下の工程：
ａ．部分精製されたフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ／ギ酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＰＤＨ／ＦＤＨ）を製造し（上述のように）；
ｂ．以下の構造１：
【化８】
を有するケト酸の水溶液をギ酸アンモニウム、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ジチオスレイトールおよび部分精製フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ／ギ酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＰＤＨ／ＦＤＨ）と処理し；
ｃ．反応混合物のｐＨを水酸化ナトリウムで約７．０〜約８．６、好ましくは８．０＋／−０．２に維持して、望ましくない過剰アンモニウムイオンを実質的に含まない所望のアミン２：
【化９】
を得；そして
ｄ．アミノ酸中間体２を単離せずに、上記水溶液をジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネートと処理して構造３のＢＯＣ保護アミンを得ること
を含む方法が提供される。
【００１６】
本発明の方法は、部分的に精製された酵素を用い、水酸化アンモニウムに対してｐＨ調整用に水酸化ナトリウムを用いることにより顕著に改善された処理方法を提供し、処理時間を短縮し、中間体の単離を必要とせずに結晶生成物の単離を可能にする。さらに、本発明の方法は、後続の工程に存在するアンモニウムイオンを最小量にしてＢＯＣ基の導入と干渉しないようにし得る反応条件を用いる部分精製ＰＤＨ／ＦＤＨ酵素の製造を提供する。さらに、式１の酸の還元的アミノ化において、部分精製ＰＤＨ／ＦＤＨ酵素濃縮物を使用することにより、生物変換反応後の、式２の上記アミノ酸中間体の樹脂カラムによる単離の必要性をなくすことを可能にする。反応工程は、ＢＯＣ化反応、得られる所望のＢＯＣ保護中間体の抽出および結晶化を直接継続するのに十分にきれいなもの（細胞破砕物が含まれておらず、タンパク質レベルが低い）であろう。
【００１７】
好ましい態様において、以下の式Ｍ：
【化１０】
で示されるジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤である（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）−２−［（２Ｓ）−２−アミノ−２−（３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］−１−デシル）−１−オキソエチル］−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−３−カルボニトリル安息香酸塩（１：１）、またはその遊離塩基Ｍ’：
【化１１】
およびその一水和物Ｍ”
【化１２】
を製造するための本発明の方法における中間体としてＢＯＣ保護化合物３を用いる。
【００１８】
これらの阻害剤は、以下の式３：
【化１３】
で示されるＢＯＣ保護された（αＳ）−α−アミノ−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（本発明に従い製造される部分精製されたＰＤＨ／ＦＤＨ酵素を用いることにより製造する）および以下の式Ｊ：
【化１４】
で示される（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−３−カルボキサミド酸塩、例えば塩酸塩またはメタンスルホン酸塩（メシルまたはＭＳＡ塩）の２つのフラグメントのカップリングにより最終的に生成される。
【００１９】
（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）−２−［（２Ｓ）−２−アミノ−２−（３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］−１−デシル）−１−オキソエチル］−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−３−カルボニトリル安息香酸塩（１：１）およびその対応する遊離塩基およびその一水和物などのシクロプロピル縮合ピロリジンベースの化合物は、糖尿病およびその合併症、高血糖症、Ｘ症候群、高インスリン血症、肥満およびアテローム性動脈硬化症および関連疾患、並びに免疫変調性疾患および慢性炎症性腸疾患の治療に有用なジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤である。本発明において、ＢＯＣ保護された化合物（本発明に従い部分精製されたＰＤＨ／ＦＤＨ酵素を用いた還元的アミノ化工程を経て製造される）を、（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）−２−［（２Ｓ）−２−アミノ−２−（３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］−１−デシル）−１−オキソエチル］−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−３−カルボニトリル安息香酸塩（１：１）およびその対応する遊離塩基およびその一水和物などのシクロプロピル縮合ピロリジンベースの化合物の製造に用いる。
【００２０】
（発明の詳細な説明）
本発明の部分精製ＰＤＨ／ＦＤＨ酵素濃縮物の製造実施においては、ＰＤＨおよび/またはＦＤＨ活性を発現している微生物を発酵させる。発酵ブロスを、８０００〜約３００００ｐｓｉの範囲内、好ましくは約１２０００〜約２００００ｐｓｉの圧力下で、約４℃〜３０℃の範囲内、好ましくは約８℃〜約１５℃、より好ましくは４０℃以下の温度でブロスを維持しながら操作するミクロフルイダイザー(microfluidizer)を通すことになろう。全ブロスは、好ましくは珪藻土(例えば、Dicalite(Grefco Minerals,Inc.の登録商標)およびセライト(World Minerals,Inc.の登録商標))などの濾過助剤およびポリエチレンイミン水溶液などの凝集剤または加熱などの他の凝集因子をブロスに加えることによりＤＮＡおよび他の高分子タンパク質を除去して、清浄化されるであろう。次いで、この混合物をフィルタープレスを用いて濾過し、濾液を回収する。濾過ケーキを水で洗浄し、その水を回収して濾液に加えるが、それら全てを清浄化ブロスと称する。
【００２１】
清浄化ブロスを１０００００ＭＷＣＯ（分子量カットオフ）膜を通して限外濾過して、より低い分子量（１０００００以下）の不純物を除去する。
【００２２】
清浄化した濾液を濃縮して、ＰＤＨ力価が約４００〜約１０００ＩＵ／ｍｌ、好ましくは約５００〜約６００ＩＵ／ｍｌであって、ＦＤＨ力価が約２０〜約２００ＩＵ／ｍｌ、好ましくは約７５〜約１５０ＩＵ／ｍｌである酵素濃縮物を得る。
【００２３】
濃縮物中の全酵素活性回収率は、約６５〜約９５％、好ましくは約７５〜約９０％の範囲内であろう。
【００２４】
本明細書中で用いられる「部分精製（された）」ＰＤＨ／ＦＤＨ酵素という用語は、少なくともＤＮＡの一部および他の高分子量タンパク質およびより低い分子量の不純物が除去されたＰＤＨ／ＦＤＨ酵素を示す。
【００２５】
３−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式１の酸）の還元的アミノ化反応の実施において、式１の酸の混合水溶液を製造し、その混合物を、強アルカリ金属塩基、例えばアルカリ金属水酸化物、好ましくはＮａＯＨを用いて、約７．０〜約８．６、好ましくは約７．８〜約８．２の範囲内のｐＨに調整して式１の酸の溶液を得る。炭素（例えば、Darco KB）を加えて混合物を濾過し、濾液および洗浄液を合わせて澄明な液体を得てもよい。
【００２６】
この溶液に、ギ酸アンモニウムを、ギ酸アンモニウム：式１の酸のモル比が約１．９：１〜約２．５：１、好ましくは約２：１の範囲内となる量で加える。得られた混合物のｐＨを、強アルカリ金属塩基、例えばアルカリ金属水酸化物、好ましくはＮａＯＨを用いて約７．０〜約８．６、好ましくは約７．８〜約８．２の範囲内に調整する。
【００２７】
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）および所望により還元剤、例えばジチオスレイトールまたはβ−メルカプトエタノール、好ましくはジチオスレイトールを、ＮＡＤ：式１の酸のモル比が約５００：１〜約１５００：１、好ましくは約９００：１〜約１２００：１の範囲内となる量で加える。固体を溶解後、部分精製したＰＤＨ／ＦＤＨ酵素濃縮物（式１の１グラム当たり約４００〜約６００ＩＵ ＰＤＨ）を加える。ＮａＯＨなどの強塩基を用いてｐＨを約７．０〜約８．６、好ましくは約７．７〜約８．２の範囲内に再調整する。
【００２８】
この混合物を約２５〜４５℃、好ましくは約３７〜約４０℃の範囲内の温度に温め、水で希釈し、式１の酸の還元的アミノ化反応を実施して、（αＳ）−α−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式２のアミン体）を生成する間、前述のアルカリ金属塩基、好ましくはＮａＯＨで、ｐＨを約７．０〜約８．６、好ましくは約７．８〜約８．２の範囲内に維持する。
【００２９】
式２のアミン体のＢＯＣ保護は、式２のアミン体を単離せずに達成されるが、これはアミン体２が細胞破砕物を含まないであろうことを理由とする。ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネート：式２のアミン体のモル比が約２：１〜約２．５：１、好ましくは約２．０：１〜約２．２：１の範囲内となるように、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネートを式２のアミン体溶液の少なくとも一部に加える。反応混合物のｐＨを前述のＮａＯＨなどの強塩基を用いて約８．５〜約１２．５、好ましくは約９．５〜約１０．５の範囲内に調整する。
【００３０】
得られたＢＯＣ保護化合物（式３）を抽出し、回収し、結晶化してＢＯＣ保護された式３のアミン体を得る。
【００３１】
上記に示したように本発明の一態様として、中間体化合物である、３−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式１）の還元的アミノ化またはトランスアミノ化によりフラグメント（αＳ）−α−アミノ−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式２）を製造する方法が提供される。この方法の好ましい態様において、３−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式１）は、上記の本発明の部分精製されたフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ／ギ酸デヒドロゲナーゼ酵素濃縮物を用いて酵素的に行う還元的アミノ化により、（αＳ）−α−アミノ−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式２）に変換される。本発明において、有用なフェニルアラニンデヒドロゲナーゼの例としては、これらに限定されないが、スポロサルシナ（Sporosarcina）種由来のもの、またはサーモアクチノミセス・インターミディアス（Thermoactinomyces intermedius）などのサーモアクチノミセス（Thermoactinomyces）種由来のフェニルアラニンデヒドロゲナーゼが挙げられる。還元的アミノ化は、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）またはピキア・パストリス（Pichia pastoris）において発現されるサーモアクチノミセス・インターミディアス（Thermoactinomyces intermedius）、ATCC 33205のフェニルアラニンデヒドロゲナーゼを用いて行うのが好ましい。フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ サーモアクチノミセス・インターミディアス（Thermoactinomyces intermedius）、ATCC 33205を発現するE.coliおよびピキア・パストリス（Pichia pastoris）の組換え株の構築および増殖は、Hansonらの文献：Enzyme and Microbial Technology 2000 26: 348-358により記載されている。また、メタノールでのピキア・パストリス（Pichia pastoris）の増殖は、ギ酸デヒドロゲナーゼの産生を惹起する(Hansonら、Enzyme and Microbial Technology 2000 26: 348-358)。
【００３２】
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）(ATCC 20864)ギ酸デヒドロゲナーゼおよびサーモアクチノミセス・インターミディアス（Thermoactinomyces intermedius）(ATCC 33205)フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子の改変形を発現するプラスミドを含むE.coli細胞は、ブダペスト条約の規定のもと、国際寄託当局に寄託および受領されている。寄託は、2002年6月25日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(10801 University Boulevard in Manassas、Virginia、20110-2209)に行った。ATCC受託番号はPTA-4520である。この細胞株への公的アクセスに対する全ての制限は、本特許出願への特許付与により除かれ、取り消し不可であろう。寄託は、公的寄託機関において寄託の日から３０年の期間または試料の最後の請求から５年間または特許の有効期間のいずれか遅い日まで維持されるであろう。上記細胞株は寄託の際に生存していた。生存試料が寄託機関により分配され得ない場合には、該寄託は交換されるであろう。
【００３３】
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）(ATCC 20864)のギ酸デヒドロゲナーゼおよびサーモアクチノミセス・インターミディアス（Thermoactinomyces intermedius）(ATCC 33205)のフェニルアラニンデヒドロゲナーゼの修飾形を発現するプラスミドpBMS-2000-PPFDH-PDH mod.を含むエシェリキア・コリ（Escherichia coli） JM110のフェニルアラニンヒドロゲナーゼが最も好ましい。
【００３４】
３−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式１）の（αＳ）−α−アミノ−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式２）への還元的アミノ化を以下の反応式Ｉに示す：
【化１５】
【００３５】
反応式Ｉに示すように、この反応にはアンモニアおよび還元されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）が必要である。この反応で生成したニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）は、ギ酸デヒドロゲナーゼによるギ酸の二酸化炭素への酸化によってＮＮＡＤＨにリサイクルされる。この反応からの（αＳ）−α−アミノ−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式２）の予測収率は８０〜１００％であり、予測鏡像体過剰率は９９％を超える。また、本明細書の実施例１〜７を参照のこと。
【００３６】
中間体化合物３−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式１）を、以下の反応式ＩＩ：
【化１６】
に示す方法に従い製造することができる。
【００３７】
反応式ＩＩに示すように、この方法において、臭化アダマンチル（式Ａ）を塩化亜鉛触媒によりアルキル化して、α−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式Ｂ）を得る。次いで、α−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式Ｂ）をメタノール中の塩化アセチルを用いてエステル化し、α−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸メチルエステル（式Ｃ）を生成する。次いで、α−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸メチルエステル（式Ｃ）をスワン酸化によりα−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸メチルエステル（式Ｄ）に変換する。次いで、α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸メチルエステル（式Ｄ）をヒドロキシル化して３−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸メチルエステル（式１ａ）を生成し、次いでこれを加水分解して３−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式１）を生成する。
【００３８】
または、中間体化合物である３−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式１）を反応式ＩＩＩに示す方法に従って製造することができる。
【化１７】
【００３９】
反応式ＩＩＩに示すように、（２，２−ジクロロ−１−メトキシ-ビニルオキシ）トリメチルシラン１ｂを、わずかに改変したKurodaら(EP 08 08 824A3；Imashiro and Kuroda Tetrahedron Letters 2001 42: 1313-1315)の方法により製造する。ブロモアダマンタンを塩化亜鉛の影響下１ｂで処理すると(Reetzら、Chem.Int.Ed.Engl. 1979 18:72, ReetzおよびHeimbach Chem. Ber. 1983 116: 3702-3707、Reetzら、Chem. Ber. 1983 116: 3708-3724)、式ＶＩＩで示されるアダマンタン−１−イルジクロロ酢酸メチルエステルが得られる。次いで、式ＶＩＩで示されるアダマンタン−１−イルジクロロ酢酸メチルエステルを濃硫酸中の一酸化窒素でヒドロキシル化して式ＶＩＩＩで示されるジクロロ（３−ヒドロキシアダマンタン−１−イル）酢酸メチルエステルを定量的収量で得る。式ＶＩＩＩ化合物をメタノール中の水酸化ナトリウム水溶液で室温にて加水分解すると式ＩＸで示されるジクロロ（３−ヒドロキシアダマンタン−１−イル）酢酸が得られる。引き続きジクロロ（３−ヒドロキシアダマンタン−１−イル）酢酸（式ＩＸ）を弱塩基、好ましくは重炭酸ナトリウムを用いて、高温で処理すると中間体化合物である３−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式１）のみが生成する。
【００４０】
反応式ＩＩＩＡ
【化１８】
反応式ＩＩＩＡに示すように、中間体化合物である３−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式Ｉ）を１ポット法で製造することができる。示したように、式ＶＩＩＩの化合物をアルゴンなどの不活性雰囲気中、テトラヒドロフラン（または水酸化カリウムや水酸化リチウムなどの他の塩基）中の水酸化ナトリウム水溶液で処理して対応のナトリウム塩を得る。このナトリウム塩を回収することなく、このナトリウム塩を含有する反応混合物を塩酸などの酸で処理してｐＨを約０．５０、好ましくは約０．２０以下まで下げて対応のケト酸ＩＩを生成し、これを水から再結晶させてケト酸Ｉの結晶を生成させることができる。
【００４１】
（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）−２−［（２Ｓ）−２−アミノ−２−（３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］−１−デシル）−１−オキソエチル］−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−３−カルボニトリルの製造に用いるフラグメント（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−３−カルボキサミド（式Ｊ）を、下記反応式ＩＶに示す方法に従い製造することができる。
【化１９】
【００４２】
反応式ＩＶに示すように、Ｌ−ピログルタミン酸（式Ｅ）を、まずエステル化し、Ｌ−ピログルタミン酸エチルエステル（式Ｆ；SQ 7539）を得る。次いで、このＬ−ピログルタミン酸エチルエステルを窒素原子上でＢＯＣ保護して（５Ｓ）−２−オキソピロリジン−１，５−ジカルボン酸 １−（１，１−ジメチルエチル），５−エチルエステル（式Ｇ）を得る。次いで、スーパーハイドライド（SuperHydride）還元および脱離を行って、４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１，５−ジカルボン酸 １−（１，１−ジメチルエチル），５−エチルエステル（式Ｇ'）を生成する。次いでＢＯＣ−ＤＨＰＥＥ ＩＩＩを水酸化リチウムを用いた鹸化により加水分解してＢＯＣ−ＤＨＰを生成する。次いで、塩化メシル続いてアンモニアを用い、混合無水物を経てＢＯＣ−ＤＨＰでアミド体を生成させて、（５Ｓ）−５−アミノカルボニル−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボン酸 １−（１，１−ジメチルエチル）エステル（式Ｇ”）を製造する。次いで、（５Ｓ）−５−アミノカルボニル−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボン酸 １−（１，１−ジメチルエチル）エステル（式Ｇ”）をシモンズ・スミス反応によりシクロプロパン化して、［１Ｓ−（１α，３β，５α］−３−アミノカルボニル）−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−カルボン酸 １，１−ジメチルエチルエステル（式Ｈ）を生成する。次いで、ＢＯＣ基を除去し、その結果、フラグメント（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−３−カルボキサミド（式Ｊ）の塩酸塩やメタンスルホン酸塩などの酸塩を生成する。
【００４３】
反応式ＩＶに示すように、（５Ｓ）−５−アミノカルボニル−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボン酸 １−（１，１−ジメチルエチル）エステル（式Ｇ”）の［１Ｓ−（１α，３β，５α］−３−アミノカルボニル）−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−カルボン酸 １，１−ジメチルエチルエステル（式Ｈ）への変換は、シモンズ・スミス反応におけるシクロプロパン化により行われる。この反応では、（５Ｓ）−５−アミノカルボニル−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボン酸 １−（１，１−ジメチルエチル）エステルを第一の反応器中で塩化メチレンに溶解する。第二の反応器では塩化メチレンを−３０℃に冷却し、ジメトキシエタンおよびジエチル亜鉛の３０％トルエン溶液を加え、次いでジヨードメタンを加える。次いで、この混合物を第一の反応器に加え、次いで飽和重炭酸塩溶液を加える。得られた反応混合物を沈殿が生じるまで攪拌する。次いで、沈殿物を濾過し、洗浄し、塩化メチレンに２回またはそれ以上再懸濁する。次いで、濾液を水相と有機相に分離し、有機相を半飽和食塩水で洗浄する。溶媒を除去し、ヘプタンと交換してヘプタン中の［１Ｓ−（１α，３β，５α］−３−アミノカルボニル）−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−カルボン酸 １，１−ジメチルエチルエステル（式Ｈ）の粗生成物のスラリーを得る。
【００４４】
別法として、（５Ｓ）−５−アミノカルボニル−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボン酸 １−（１，１−ジメチルエチル）エステル（式Ｇ”）を反応式ＩＶＡに示すように製造することができる。
【化２０】
【００４５】
反応式ＩＶＡに示すように、４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１，５−ジカルボン酸 １−（１，１−ジメチルエチル）エステルのＤＣＨＡ塩Ｘを水酸化ナトリウムなどのアルカリ金属塩基で処理してナトリウム塩などの対応する塩を生成させる。
【００４６】
また、４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１，５−ジカルボン酸 １−（１，１−ジメチルエチル）エステルのナトリウム塩ＸＩは、対応するエチルエステルから、該エチルエステル（好ましくはトルエン中の該エチルエステルの溶液）をエタノールおよび水酸化ナトリウムで処理することにより調製することができる。
【００４７】
ナトリウム塩ＸＩの溶液を塩化アンモニウムやリン酸二水素ナトリウムなどの緩衝液で処理して溶液のｐＨを７未満、好ましくは約６〜６.５に低下させ、ナトリウム塩の緩衝溶液を４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロライド（ＤＭＴ−ＭＭ）で処理して活性化ＤＭＴ−エステル体ＸＩＩを生成し、これをアンモニアまたは硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムまたは水酸化アンモニウムなどの他の塩基で処理して（５Ｓ）−５−アミノカルボニル−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボン酸 １−（１，１−ジメチルエチル）エステルＧ”を生成する。
【００４８】
４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロライド（ＤＴＭ−ＭＭ）の製造は、反応式ＶＩＡに示すように、２−Ｃｌ−４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン（ＣＤＭＴ）およびＮ−メチルモルホリンを約０〜約１０℃の低下した温度で反応させてＤＭＴ−ＭＭを生成することによりなされる。
【００４９】
４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１，５−ジカルボン酸 １−（１，１−ジメチルエチル）エステルのＤＣＨＡ塩Ｘは、対応するナトリウム塩ＸＩから製造することができるが、これは予め調製したＤＣＨＡ塩Ｘの水溶液をメチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）で処理し、反応混合物のｐＨをＨ3ＰＯ4などの酸を用いて２．５〜３に調節することによりなされる。有機層を分離し、食塩水で処理して対応するナトリウム塩ＸＩを生成する。得られた反応混合物を冷却し、ＤＣＨＡで処理して対応するＤＣＨＡ塩Ｘを生成する。
【００５０】
反応式ＩＶＢ
【化２１】
また、反応式ＩＶＡにおける化合物Ｈは、反応式ＩＶＢに示すように、Ｎ−ＢＯＣ ４，５−デヒドロプロリンエチルエステルＧ”のシクロプロパン化により以下のようにして製造できる。
【００５１】
Ｎ−ＢＯＣ ４，５−デヒドロプロリンエチルエステルＧ”をトルエン、塩化メチレンまたはジクロロエタンなどの無水有機溶媒の存在下、約−３０℃〜約０℃の範囲の低下した温度にてジエチル亜鉛およびクロロヨードメタンで処理してＮ−ＢＯＣ ４，５−メタノプロリンエチルエステルＸＶを得る。
【００５２】
得られたＢＯＣ ４，５−メタノプロリンエチルエステルＸＶ（シン異性体とアンチ異性体の８：１混合物）を窒素雰囲気などの不活性雰囲気下、メチルアミン水溶液と処理することにより分離し、シン （Ｓ）−ＢＯＣ−４，５−メタンプロリンエチルエステル（ＸＶI）（ＸＶIIから分離）を回収する。
【００５３】
エタノールまたはトルエンやＴＨＦなどの他の有機溶媒中のｓ−ＢＯＣ−４，５−メタノプロリンエチルエステルＸＶＩを、水酸化リチウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液または水酸化カリウム水溶液などの塩基と処理して対応するｓ−ＢＯＣ−メタノプロリン遊離酸ＸＶＩＩＩを生成する。
【００５４】
Ｎ−メチルモルホリンの存在下、約−８℃を超えないような低温でＴＨＦまたは塩化メチレン；クロロギ酸イソブチルまたは塩化メシルなどの有機溶媒に遊離酸ＸＶＩＩＩを溶解し、次いで反応混合物をアンモニアで処理してｓ−ＢＯＣ−メタノプロリンアミドＨを生成することにより、遊離酸ＸＶＩＩＩを対応するｓ−ＢＯＣ−メタノプロリンアミドＨに変換する。
【００５５】
本発明の別の側面は、（αＳ）−α−アミノ−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式３）および（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−３−カルボキサミド（式Ｊ）のフラグメントをカップリングして、（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）−２−［（２Ｓ）−２−アミノ−２−（３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］−１−デシル）−１−オキソエチル］−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−３−カルボニトリル安息香酸塩（１：１）を生成するカップリングの方法に関する。これらフラグメントのカップリングを下記の反応式Ｖに示す。
【化２２】
【００５６】
実施例３に示すように、単離された（部分精製された）ＰＤＨ／ＦＤＨ酵素濃縮物を用いた生物変換から単離することなく式２の化合物を用いる。
【００５７】
反応式Ｖに示すように、（αＳ）−α−アミノ−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式２）のフラグメントを、まずＢＯＣ保護して（αＳ）−α［［（１，１−ジメチルエトキシ）カルボニル］アミノ］−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式３）を生成するが、これは水酸化ナトリウムなどの塩基の存在下、２をＢＯＣ2Ｏで処理し、酢酸イソプロピル抽出により分離し、次いで酢酸イソプロピル／ヘプタンを用いて結晶化して、遊離酸３を単離することにより行われる（実施例３、工程３を参照）。または、遊離酸３を酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）抽出により分離する（実施例８Ｍを参照）。
【００５８】
テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）などの適当な有機溶媒（約−１０℃〜約０℃の範囲の温度に冷却）中の式３の化合物の溶液を塩化メタンスルホニル（塩化メシル）、およびヒューニッヒ塩基（ジイソプロピルエチルアミンまたはＤＩＰＥＡ）で処理して対応するメタンスルホン酸塩ＶＩを生成する。
【００５９】
次いで、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）または他の公知のカップリング剤の存在下、カップリング反応を用いて（αＳ）−α［［（１，１−ジメチルエトキシ）カルボニル］アミノ］−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式３）メタンスルホン酸塩を（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−３−カルボキサミド（式Ｊ）にカップリングし、３−（アミノカルボニル）−αＳ）−α−（３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］−１−デシル）−β−オキソ−（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−エタンカルバミン酸 １，１−ジメチルエチルエステル（式Ｋ）を生成する。式Ｋの化合物をピリジンやトリエチルアミンなどの有機塩基および無水トリフルオロ酢酸で処理することにより脱水し、次いで約０℃〜約１０℃に冷却し、水酸化ナトリウムまたはＫＯＨやＬｉＯＨなどの他の強塩基を加えることにより反応物を加水分解して化合物Ｌを生成する。次いで、３−シアノ−（αＳ）−α−（３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］−１−デシル）−β−オキソ−（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−エタンカルバミン酸 １，１−ジメチルエチルエステル（式Ｌ）を脱保護（および安息香酸ナトリウムで処理）し、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤である（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）−２−［（２Ｓ）−２−アミノ−２−（３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］−１−デシル）−１−オキソエチル］−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−３−カルボニトリル安息香酸塩（１：１）（式Ｍ）を生成する。
【００６０】
反応式Ｖに戻ると、化合物Ｌを反応式ＶＩＡに記載するように塩酸などの強酸と処理することにより脱保護できる。
【化２３】
【００６１】
反応式ＶＩＡを参照すると、遊離塩基一水和物Ｍ”をＢＯＣ保護中間体Ｌから以下のようにして生成することができる。
【００６２】
ＢＯＣ保護中間体Ｌを、反応温度を約２０〜２５℃の範囲に維持しながら塩化メチレンおよびメタノールの存在下、濃塩酸と処理して塩酸塩Ｌ’を生成する。塩酸塩Ｌ’を塩酸、次いで水酸化ナトリウムまたは他の強塩基と処理して遊離塩基Ｍ’を生成する。次いで、遊離塩基Ｍ’を水と処理して遊離塩基一水和物Ｍ”を生成する。
【００６３】
本発明化合物および方法を用いて製造したジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤は、糖尿病およびその合併症、高血糖症、Ｘ症候群、高インスリン血症、肥満およびアテローム性動脈硬化症および関連疾患、並びに免疫変調性疾患および慢性炎症性腸疾患の治療に有用である。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
以下の実施例は本発明の好ましい態様を表す。
【００６５】
実施例１
プラスミドpBMS2000-PPFDH-PDHmodの構築
発現ベクターpBMS2000-PPFDH-PDHmodの２工程構築を用いた。適合性の制限エンドヌクレアーゼ開裂部位とともにP.pastorisのＦＤＨ遺伝子の５’末端および３’末端を含むオリゴヌクレオチドプライマー：
【化２４】
を用い、P.pastorisのＦＤＨ遺伝子を発現ベクターpBMS2000(pBMS2000はS.W.Liuらの米国特許第6,068,991号(2000年5月30日発行)に開示されている)にサブクローニングした。それぞれ1×TaqPlus反応緩衝液(Stratagene、LaJolla、CA)、０．２ｍＭの各デオキシヌクレオチド三リン酸（dATP、dCTP、dGTPおよびdTTP）、０．４ｎＭの各オリゴヌクレオチド、２．５ＵのTaqPlus ＤＮＡポリメラーゼ(Stratagene)、およびクローン化されたP.pastorisのＦＤＨ遺伝子を含む１０ｐｇのプラスミドＤＮＡを含有する１００μＬずつの反応液４つにおいてP.pastorisのＦＤＨ遺伝子の高忠実度ＰＣＲ増幅を行った。増幅条件は、自動伸長パーキン・エルマー モデル４８０サーモサイクラーを用い、９４℃で４分間インキュベート後、９４℃で１分間；５０℃で１分間；および７２℃で１．５分間の２５サイクルを含むものであった。
【００６６】
このＰＣＲ反応混合物を等容量のフェノール：クロロホルム（１：１）(GibcoBRL、Gaithersburg、MD）で抽出し、13,000×gで５分間遠心した。上部の水相をとり、新たなマイクロ遠心管に入れた。０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２容量の氷冷エタノールを加えてＤＮＡを沈殿させた。13,000×gで５分間遠心分離後、液体を管から吸引し、ペレットを０．５ｍＬの氷冷７０％エタノールで洗浄した。液体を再び吸引し、ペレットを室温で３０分間風乾させた。
【００６７】
増幅したＤＮＡを、各２０単位のBspHIおよびBamHIを用い、３７℃で３時間、全量５０μＬで消化した。これと平行してpBMS2000ベクター（２μｇ）をBspHIおよびBamHIで消化した。消化した試料を１．０％ＴＡＥアガロースゲル上で２時間、１００ｖで電気泳動した。ＦＤＨ遺伝子（１１００塩基対フラグメント）および線状化ベクター（４７００塩基対フラグメント）に対応するバンドを別々にゲルから切り出し、QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen、Chartsworth、CA)を用いて精製した。単離したフラグメントの濃度を低分子量ラダー(Invitrogen Corp.、Carlsbad、CA)に対する電気泳動により推定し、５：１（挿入物：ベクター）のモル比にて全量１０μＬにおいて２２℃で２時間、ライゲートした。１５μＬのｄＨ2Ｏおよび２５０μＬの１−ブタノールを加えてＤＮＡを沈殿させ、マイクロ遠心管中、13,000×gで５分間ペレット化した。液体を吸引除去し、ＤＮＡをSpeedVac(Savant Instruments、Farmingdale、NY)で５分間、低加熱下で乾燥させた。ペレットを５μＬのｄＨ2Ｏに再懸濁した。
【００６８】
再懸濁したＤＮＡを、エレクトロポレーションにより０．０４ｍＬのE.coliDH10Bコンピテント細胞(Invitrogen)に２５μＦおよび２５０Ωで形質転換した。ＳＯＣ培地を直ちに加え（０．９６ｍＬ；ＳＯＣ＝１リットル当たり０．５％酵母抽出物、２％トリプトン、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ＭｇＳＯ4および２０ｍＭグルコース）、細胞をシェーカー中で１時間、３７℃および２２５ｒｐｍでインキュベートした。プラスミドＤＮＡを含むコロニーを、５０μｇ／ｍｌの硫酸カナマイシン(Sigma Chemicals、St.Louis、MO)を含むＬＢ寒天プレートで選択した。所望の挿入物を有するプラスミドは、RapidCycler(Idaho Technology、Salt Lake City、UT)を用いたキャピラリー管でのコロニーＰＣＲにより同定した。各反応混合物は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、４ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．２５ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン、２％スクロース４００、０．１ｍＭクレゾールレッド、０．４ｎＭの各プライマー（配列番号１および配列番号２）、および２．５ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ(Promega Corp.、Madison、WI)を含んでいた。反応混合物を１０μＬずつに分け、丸底マイクロタイタープレートのウェルにピペッティングした。カナマイシン耐性コロニーを使い捨てプラスチック接種針を用いて拾い、反応混合物にかき混ぜて入れ、ＬＢカナマイシン寒天に移した。各反応混合物の一部を３０μＬ容キャピラリー管に入れ、管の両端をフレームシールした。細胞を溶解し、９４℃で３０秒インキュベートしてＤＮＡを変性し、RapidCycler Thermocycler(Idaho Technology、Salt Lake City、UT)を用いて９４℃で０秒間、４０℃で０秒間、および７２℃で６０秒間の３０サイクルを用いて増幅を行った。試料を１．０％ＴＡＥアガロースゲル上で２時間、１００ｖにて電気泳動した。１７の試験した試料のうち７試料が１１００塩基対で強いバンドを示した。このプラスミド（本明細書中でpBMS2000-PPFDHと称する）を含む１つのコロニーをプラスミド構築における次の工程のために選択した。
【００６９】
「PDHmod」は、（３−ヒドロキシアダマンタン−１−イル）オキソ酢酸の（Ｓ）−アミノ（３−ヒドロキシアダマンタン−１−イル）酢酸への完全な変換に必要なカルボキシル末端の最後の２つのアミノ酸および別の１２アミノ酸の変化により、開示されたＤＮＡ配列(Takadaら、J. Biochem. 109, pp. 371-376 [1991])とは異なっている改変したThermoactinomycetes intermediusフェニルアラニンデヒドロゲナーゼをいう。この変化をプラスミドpPDH9K/10(Donovanらの特許WO200004179(2000年1月27日発行)に詳細が記載されている)に導入し、次いでこのプラスミドをP.pastoris SMD1168(ATCC 74408株として寄託)に形質転換した。
【００７０】
天然ＰＤＨ遺伝子の３’末端および対応するアミノ酸を以下に示す：
【化２５】
【００７１】
PDHmod遺伝子の３’末端および対応するアミノ酸を以下に示す（変化したまたは新規なアミノ酸は太字）：
【化２６】
【００７２】
適合性の制限エンドヌクレアーゼ開裂部位とともにPDHmod遺伝子の5'末端および3'末端を含むオリゴヌクレオチドプライマー：
【化２７】
を調製した。
【００７３】
ＰＣＲによるPDHmodの増幅および精製のための反応条件は、ATCC 74408から調製した染色体ＤＮＡを反応のための鋳型として含めた以外はP.pastorisのＦＤＨ遺伝子に用いたものと同じであった。得られたフラグメントを各２０単位のNdeIおよびSmaIを用い、２５℃で１時間、次いで３７℃で２時間、全容量５０μＬで消化した。これと平行して、開始コドンにNdeI部位を有するpBMS2000ベクターのバージョン（２μg）を同一条件を用いてNdeIおよびSmaIで消化した。消化した試料を別々に１．０％ＴＡＥアガロースゲル上で２時間、１００ｖで電気泳動した。PDHmod遺伝子（１２００塩基対フラグメント）および線状化ベクター（４７００塩基対フラグメント）に対応するバンドをゲルから切り出し、QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)を用いて精製した。これら２つのフラグメントのライゲーション、E.coliの形質転換、およびPDHmod遺伝子を有する挿入物(pBMS2000-PDHmodを形成)を含むコロニーのスクリーニングを上記のように行った。
【００７４】
pBMS2000-PPFDH-PDHmodの構築のため、pBMS2000-PDHmod（２μｇ）を５０μＬの反応物中、各１０ＵのHindIIIおよびSmaIを用いて２５℃で１時間、次いで３７℃で１時間開裂させた。１０単位のＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ(Invitrogen)および４つの全てのデオキシリボヌクレオシド三リン酸の２．５ｍＭの混合物（２μＬ）を加え、試料を１１℃で２０分間インキュベートした。反応液を１．０％ＴＡＥアガロースゲル上で２時間、１００ｖで電気泳動した。１８００塩基対フラグメントを切り出し、QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)を用いて単離した。このフラグメントは、順にtacプロモーター、groES遺伝子、およびPDHmod遺伝子（転写融合物として）を含んでいる。次に、pBMS2000-PPFDH（２μｇ）を１０単位の制限エンドヌクレアーゼSmaIを用い、５０μＬ容量で２時間、２５℃で消化し、次いで０．４Ｕのエビアルカリホスファターゼ(United States Biochemicals、Cleveland、OH)で１時間、３７℃で処理した。プラスミドＤＮＡを１．０％ＴＡＥアガロースゲル上で２時間、１００ｖで電気泳動し、単離し、QIAquickキットを用いて抽出した。これら２つのフラグメントを６．５：１（挿入物：ベクター）のモル比で１６℃にて４時間、１０μＬの最終容量でライゲートした。１−ブタノール抽出および遠心分離後、ＤＮＡをエレクトロコンピテントなＤＨ１０Ｂ細胞に形質転換した。カナマイシン耐性コロニーを、ＦＤＨについて既に記載したように２つのPDHmod-特異的プライマーを用いてPDHmod遺伝子の存在についてスクリーニングした。第二ラウンドのＰＣＲスクリーニングは、それぞれＰＰＦＤＨの５’末端およびPDHmod遺伝子の３’末端に相同なＤＮＡプライマーを用いて行った。１４００塩基対フラグメントの増幅を支持することができる構築物のみが２つの遺伝子を同じ方向で有していた。そのようなプラスミドの１つが見出され、方向性がKpnIを用いた診断的制限消化によって確認され、これにより５４２２塩基対および１８２６塩基対の予想されたフラグメントが得られた。このプラスミドを「pBMS2000-PPFDH-PDHmod」と表した。
【００７５】
実施例２
FDHおよびPDHmodの発現
pBMS2000-PPFDH-PDHmodをエシェリキア・コリ（Escherichia coli） JM110に形質転換した。振盪フラスコでの検討においてJM110(pBMS2000-PPFDH-PDHmod)をＭＴ５培地（２．０％ Yeastamine、４．０％グリセロール、０．６％リン酸ナトリウム［二塩基性］、０．３％リン酸カリウム［一塩基性］、０．１２５％硫酸アンモニウム、０．０２５６％硫酸マグネシウム［七水和物；滅菌１Ｍ溶液からオートクレーブ後に添加］、および５０μｇ／ｍＬの硫酸カナマイシン［濾過滅菌した５０ｍｇ／ｍＬ溶液からオートクレーブ後に添加］）中、２８℃、２５０ｒｐｍで１８時間増殖させた。６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ600）を記録し、０．３５の開始ＯＤ600を与えるに十分な細胞を新鮮なＭＴ５／カナマイシン培地に加えた。ＯＤ600が０．８〜１．０となるまで、フラスコを２５０ｒｐｍ、２８℃で振盪した。滅菌濾過した１Ｍイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度３５μＭで加えることにより両遺伝子の発現を誘導し、発酵を２４〜４８時間続けた。細胞を6,500×gで５分間遠心分離することによってペレット化し、等容量の５０ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ７．０）で１回洗浄し、再度ペレット化した。細胞を−２０℃で凍結保存するか、または直ちに用いた。ペレットを５０ｍＭリン酸アンモニウム（ｐＨ７．０）中、１０ｍＬ／ｇ（湿細胞重量）で再懸濁し、Fisher Scientific Model 50 Sonic Dismembrator(Fisher Scientific、Pittsburgh、PA)(マイクロチップで動力設定15)を用いて３×１５秒間超音波処理した。細胞破砕物は、13,000×gにて室温で５分間遠心分離することによりペレット化した。
【００７６】
試料を７０℃で１０分間加熱した。１ｍＬの１Ｍジチオスレイトール溶液を混合物に加え、１０μＬを１０％NuPAGE(登録商標) Bis-Trisポリアクリルアミドミニ・ゲルに適用した。電気泳動を２００ｖで５０〜６０分間行い、ゲルを０．１％（ｗ／ｖ）クマシーブルー(Sigma)、４０％（ｖ／ｖ）エタノールおよび１０％（ｖ／ｖ）酢酸からなる溶液で染色した。染色液に浸漬したゲルを沸騰が明らかとなるまで電子レンジで加熱し、次いでオービタルシェーカーで４０ｒｐｍにて１５分間振盪した。ゲルを脱イオン水で十分に洗浄し、脱色溶液(GelClear(登録商標)；Invitrogen)で覆った。この溶液を再び沸点ちょうどまで加熱し、少なくとも２時間穏やかに振盪した。誘導によりMr 43,000および40,000に２つの顕著なバンドが認められ、これらはFDHおよびPDHmodのサブユニットの予想された分子量に対応していた。また試料は、実施例４、６および７に記載するようにして試験したときにFDHおよびPDHの両活性を有していることがわかった。この組換えE.coli株にSC16496の内部表示を与えた。
【００７７】
SC16496を引き続き１５リットルおよび２５０リットル容量で発酵させた。１５リットル発酵のために、１ｍＬの凍結SC16496を入れた一つのバイアルを室温で解凍し、４リットルフラスコ中の５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む１リットルのＭＴ５培地に加えた。このフラスコを２８℃、２５０ｒｐｍで２４時間インキュベートし、Braun発酵装置中の１３リットルのＭＴ５培地（１５Ｌの最終容量に基づいて成分を１回分とした）に移した。それぞれ５０μｇ／ｍＬおよび０．０２４６％の最終濃度を与えるのに十分な硫酸カナマイシンおよび硫酸マグネシウム七水和物を５００ｍＬの蒸留水に溶解し、０．２ミクロン酢酸セルロース濾過ユニットにより濾過滅菌した。この溶液をタンクに加え、直ちに接種した。最初のＯＤ600は約０．３５であった。
【００７８】
発酵作業パラメーターは以下の通りであった：
作業容量：１６リットル
温度：２８℃
換気：１．０ｖｖｍ
圧力：６９０ｍｂａｒ
攪拌：５００ｒｐｍ
必要に応じてＮＨ4ＯＨを用いてｐＨを６．８に調節
発泡は必要に応じてＵＣＯＮ(Dow Chemical Companyにより製造されたフルオロカーボン溶媒混合物)を添加して調節した。
【００７９】
ＯＤ600 ０．８〜１．０（接種後約２時間）で濾過滅菌したＩＰＴＧ（５００ｍＬのｄＨ2Ｏに溶解）を無菌的に加えて最終濃度を３５μＭとした。発酵をさらに４８時間続けた時点でタンクの内容物を１０℃に過冷した。細胞を遠心分離により回収し、０．１用量の５０ｍＭギ酸アンモニウム、ｐＨ７．０で１回すすいだ。細胞ペーストをプラスチック容器に入れ、必要とされるまで−７０℃で保存した。
【００８０】
２５０Ｌタンクについては、接種物は以下のようにして調製した：１ｍＬの凍結SC16496を解凍し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを有する３００ｍＬのＭＴ５培地に加えた。フラスコを２８℃、２５０ｒｐｍで２４時間増殖させた。ＯＤ600を決定し、８０ ＯＤ単位を与える適当な容量の細胞を取り、２５０ｍＬの新鮮なＭＴ５培地に加えた。細胞をBraun発酵装置中の１０ＬのＭＴ５／カナマイシン培地に無菌的に加え（最初のＯＤ600〜０．００８）、上で開示した発酵作業パラメーター下で１６時間増殖させた。次いで、培養液を適当な濃度のカナマイシンおよび硫酸マグネシウムを含む２５０ＬのＭＴ５に移した。これら条件下でのSC16496の倍加時間が９０分であることに基づき、２５０Ｌ中の１０Ｌの接種物は０．３０〜０．３５の開始ＯＤ600を与えるはずである。誘発、増殖、回収および保存は、１５Ｌ発酵について記載したものと同様に行った。
【００８１】
実施例３
単離した(部分精製)ＰＤＨ／ＦＤＨ酵素濃縮物を用いた、３−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式１）からの（αＳ）−α−アミノ−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式２）を介した（αＳ）−α−［［（１，１−ジメチルエトキシ）カルボニル］アミノ］−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式３）の短縮(telescoped)製造
【００８２】
工程１：ＰＤＨ／ＦＤＨ酵素濃縮物の単離
エシェリキア・コリ（Escherichia coli） JM110(pBMS2000-PPFDH-PDHmod)の発酵ブロス（３０リットル）を４０００Ｌタンク発酵（実施例２と類似した方法を用いて製造）から得、マイクロフルイダイザー(MicrofluidicsモデルM-110Y、作動圧力12,000〜20,000psi)に通し（１回）、ブロスの温度を４０℃以下に保ちながら細胞から活性を放出させた。ミクロ流動化ブロスのＰＤＨ／ＦＤＨ活性は、ＰＤＨについては３２ＩＵ／ＭＬ、ＦＤＨについては８ＩＵ／ｍｌであった。
【００８３】
ブロス全体を清澄化するため、十分に攪拌したブロスに４．５ｋｇのセライトを加えた。次いで、０．２０１Ｌの３０％ポリエチレンイミン水溶液を加え、３０分間混合した。次いで、混合物をフィルタープレス(Ertel Alsopモデル8-ESSC-10)を用いて濾過し、１８Ｌの濾液を得た。濾過ケークを１２Ｌの水で洗浄して容量を３０Ｌに戻した。この工程の収率は、活性が３１ＩＵ／ｍｌとなったＰＤＨでは９７％の活性の回収がなされ、ＦＤＨの活性は８ＩＵ／ｍｌであった。
【００８４】
清澄化したブロスを１０００００ＭＷＣＯフィルターカセット(Millipore Pellicon ２ユニット、ポリエーテルスルホン低タンパク質結合カセット、０．５ｍ2フィルター面積）により限外濾過した。ポンプの循環速度は４００ｍＬ／分であった。清澄化した濾液を１．５Ｌに濃縮し、ＰＤＨ力価が５６７ＩＵ／ｍＬでＦＤＨ力価が１３６ＩＵ／ｍＬの酵素濃縮物を得た。浸透液をアッセイしたところ、活性は認められなかった。濃縮物中の全酵素活性回収率は８４％であった。
【００８５】
工程２：還元的アミノ化
３−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式１）（１．００ｋｇ；４．４６ｍｏｌ）を２０Ｌ容器に加え、次いで水（５Ｌ）を加えた。この混合物を攪拌し、１０Ｎ ＮａＯＨでｐＨを調節してｐＨ〜８として溶液を得た。Darco KBBカーボン（１００ｇ）を加え、混合物を５分間攪拌し、次いで５μの濾紙を用いてブフナー漏斗で濾過した。フィルターを水で洗浄し（２×１Ｌ）、濾液および洗液を合わせて透明な溶液を得た。
【００８６】
攪拌しながらギ酸アンモニウム（０．５６２Ｋｇ；８．９２ｍｏｌ）を加え、１０Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨを再び〜７．５に調節した。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（２．６５ｇ）およびジチオスレイトール（１．５４ｇ）を加えた。固形分が溶解したときにＰＤＨ／ＦＤＨ酵素濃縮物を加えた（１．０３Ｌ；ＰＤＨを５０００００ＩＵ）。１０Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨを周囲温度で〜８．０に再調節した。
【００８７】
次いで、混合物を〜４０℃に温め、水で全容量１０Ｌに希釈した。４２時間攪拌している間、ｐＨを７．７〜８．３に維持した。得られた溶液は、０．９５５Ｋｇ（９５．１％）の生成物（αＳ）−α−アミノ−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式２）を含んでいた。
【００８８】
工程３：ＢＯＣ保護
（αＳ）−α−アミノ−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式２）の溶液の一部（４７７．５ｇ；２．１２ｍｏｌ）にジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネート（１．０２２ｋｇ；４．６８ｍｏｌ）を加えた。この混合物を、ｐＨスタット滴定器で１０Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨを１０に調節し維持しながら周囲温度で攪拌した。反応はＢｏｃ2Ｏの添加後４時間で完了し、このとき残存する出発物質は１．０％未満であった。
【００８９】
混合物のｐＨを３５％Ｈ2ＳＯ4で〜８に調節し、混合物にｉ−ＰｒＯＡｃ（５．０Ｌ）を加えた。次いで、混合物のｐＨを３５％Ｈ2ＳＯ4で２．０に調節し、このｐＨで５〜１０分間維持した。Dicalite（２５０ｇ）を加え、混合物を〜１０分間攪拌し、次いでブフナー漏斗中の濾紙上のDicalite（２５０ｇ）のパッドで濾過した。Dicaliteパッドを２．５Ｌのｉ−ＰｒＯＡｃでさらに洗浄した。
【００９０】
濾液を１０Ｎ ＮａＯＨでｐＨ８に調節した。１時間沈殿させた後、界面を含む有機層を廃棄した。水層にｉ−ＰｒＯＡｃ（７．５Ｌ）を加えた。混合物を３５％Ｈ2ＳＯ4でｐＨ〜２．０の酸性にし、次いで〜４０℃に加熱し、穏やかに攪拌しながら４時間維持した。層を分離し、有機抽出物を取っておいた。界面を含む水層をｉ−ＰｒＯＡｃ（３．７５Ｌ）で抽出し、２時間後に４０℃で層を再び分離した。界面を含む水層をｉ−ＰｒＯＡｃ（３．７５Ｌ）で再び抽出し、２時間後に４０℃で層を分離した。
【００９１】
合わせた有機抽出物（〜１５Ｌ）を蒸留により〜４．５Ｌに濃縮した。次いで、この溶液にヘプタン（〜１０Ｌ）を１０〜１５分間かけて加え、その間温度を〜８２−８９℃に維持した。反応器ジャケットの温度を７０℃に設定し、この温度で１時間維持した。冷却後すぐに結晶化が生じた。次いで、反応器ジャケットの温度を４０℃に設定し、この温度で３０分間維持した。
【００９２】
懸濁液を周囲温度に冷却し、次いでさらに０〜５℃に冷却した。０〜５℃で１時間攪拌した後、生成物を濾過した。生成物をヘプタン（２．５Ｌ）で洗浄し、次いで４０℃で真空乾燥して６０７．０ｇ（８８％収率）の（αＳ）−α−［［（１，１−ジメチルエトキシ）カルボニル］アミノ］−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式３）を得た。
【００９３】
実施例４
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼアッセイＡ
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼアッセイＡは、４０℃で１ｍＬ中に以下のものを含んでいた：０．４ｍＭ ＮＡＤＨ、５ｍＭフェニルピルビン酸ナトリウム、ＨＣｌでｐＨ８．７５に調節した０．７５Ｍ ＮＨ4ＯＨ。吸光度の低下を３４０ｎｍでモニターした。酵素活性単位は、吸光度の変化速度に基づき、μモル／分として計算した。
【００９４】
実施例５
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼアッセイＢ
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼアッセイＢは、４０℃で１ｍＬ中に以下のものを含んでいた：１ｍＭ ＮＡＤ、１０ｍＭ Ｌ−フェニルアラニン、１Ｎ ＮａＯＨでｐＨ１０．０に調節した０．１Ｍ Ｋ2ＨＰＯ4。吸光度の増加を３４０ｎｍでモニターした。酵素活性単位は、吸光度の変化速度に基づき、μモル／分として計算した。
【００９５】
実施例６
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼアッセイＣ
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼアッセイＣは、４０℃で１．０ｍＬ中に以下のものを含んでいた：０．４ｍＭ ＮＡＤＨ、５０ｍＭ ３−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（１当量のＮａＯＨ溶液に溶解）、ＨＣｌでｐＨ８．７５に調節した０．７５Ｍ ＮＨ4ＯＨ。吸光度の低下を３４０ｎｍでモニターした。酵素活性単位は、吸光度の変化速度に基づき、μモル／分として計算した。
【００９６】
実施例７
ギ酸デヒドロゲナーゼアッセイ
ギ酸デヒドロゲナーゼアッセイは、４０℃で１ｍＬ中に以下のものを含んでいた：１ｍＭ ＮＡＤ、１００ｍＭギ酸アンモニウム、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）。吸光度の増加を３４０ｎｍでモニターした。酵素活性単位は、吸光度の変化速度に基づき、μモル／分として計算した。
【００９７】
実施例８
式Ｍ'：
【化２８】
の製造
Ａ．ＺｎＣｌ2触媒された臭化アダマンチル（式Ａ）のカップリング
乾燥容器に７．５ｋｇの臭化アダマンチルを入れた。次いで、塩化メチレン（２２．５リットル）を室温で加えて固形の臭化アダマンタンを溶解した。溶解は吸熱性であるので、次の工程の前に反応混合物の温度を２０℃に戻した。次いで、反応混合物に塩化亜鉛（１．０５ｋｇ）を入れ、２０℃で約５分間攪拌した。次いで、反応温度を２０〜２５℃に維持しながら反応混合物にトリス（トリメチルシロキシ）エチレン（１５．３ｋｇ）を入れ、得られた混合物を２時間攪拌した。この混合後にトリス（トリメチルシロキシ）エチレン（５．１０ｋｇ）を加えた。この添加の間、温度を３０℃以下に維持した。反応液をさらに１２〜１５時間、２０〜２５℃に維持し、この時点で反応混合物を塩化メチレン（１５Ｌ）で希釈し、０〜５℃に冷却した。次いで、反応混合物を半飽和ＮＨ4Ｃｌ溶液を用いて、最初は滴下の様式により処理した。添加の間、温度を３０℃未満に維持した。濃い懸濁液が得られた。この懸濁液に酢酸エチル（９３．７５Ｌ）を加えた。混合物を１５分間激しく攪拌すると、有機層と水層は分離した。有機層を保存し、水層を酢酸エチル（各洗浄で１８．７５Ｌ）で２回洗浄した。次いで、酢酸エチル洗液および有機層を合わせ、水（３７．５Ｌ）、次いで食塩水で半飽和した水（３７．５Ｌ）で洗浄した。有機層を再び分離し、蒸発させて結晶を生成させた。次いで、２２．５Ｌの最終容量でヘプタンへの溶媒交換を行った。得られた懸濁液を５〜１０℃に１時間冷却し、生成物のα−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式Ｂ）を濾過により得た。α−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式Ｂ）の収量は６．９６ｋｇ（３３．１１ｍｏｌ，９５％）であった。
【００９８】
Ｂ．α−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式Ｂ）のエステル化による式Ｃのエステル体の生成
まず不活性雰囲気を反応器内に生じさせた。次いで、反応器にメタノール（３５．００Ｌ）、次いでα−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式Ｂ）（１４．００ｋｇ）を入れて懸濁液を生成した。懸濁液を０〜５℃に冷却し、塩化アセチルを反応混合物の温度が５〜１０℃に維持されるような様式で加えた。塩化アセチルの添加完了後、反応混合物を２０〜２５℃に温め、２０〜２５℃で２時間攪拌した。次いで、反応混合物を真空下、４０℃で濃縮すると薄い油状物が得られた。この油状物を酢酸エチル（７１．９６Ｌ）に溶解し、室温に戻した。得られた混合物を水（各洗浄で２８．７８Ｌ）で２回洗浄し、各洗浄後に有機層と水層とを分離した。有機層を保存し、一方、水層は合わせて３Ｎ ＮａＯＨ溶液でｐＨ９．５に調節した。次いで、合わせた水層を酢酸エチル（各抽出に１４．３９Ｌ）で２回抽出した。各抽出後の有機層を分離し、保存した有機層と合わせた。次いで、これら合わせた有機層を飽和重炭酸ナトリウム溶液（２８．７８Ｌ）、次いで食塩水（４３．１８Ｌ）で洗浄した。次いで、全ての揮発成分を真空下、４０℃で除去し、静置により結晶化する無色から薄黄色の油状物が得られた。この油状物は、１３．２９ｋｇ（５９．２６ｍｏｌ，８９％）のα−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸メチルエステル（式Ｃ）を含んでいた。
【００９９】
Ｃ．α−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸メチルエステル（式Ｃ）のスワン酸化によるα−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸メチルエステル（式Ｄ）の生成
三頸フラスコ（２２Ｌ）は、メカニカルスターラー、温度プローブおよび滴下漏斗を備えており、窒素を一晩パージした。次いで、塩化オキサリル（５００ｍＬ，５．７３ｍｏｌ）を加え、次いでＣＨ2Ｃｌ2（８Ｌ）を加えた。得られた溶液をアセトン／ドライアイス浴で−６９℃に冷却した。次いで、内部温度を−６０℃以下に維持しながら、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；７００ｍＬ，９．８６ｍｏｌ）の溶液を約３０分かけてゆっくり加えた。温度を−６０〜−７０℃に維持しながら、溶液を２０分間攪拌した。内部温度を−６０℃以下に維持しながら、ＣＨ2Ｃｌ2（１．７Ｌ）中のα−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸メチルエステル（式Ｃ）（９９０ｇ，４．４２ｍｏｌ）の溶液を約３０分間かけてゆっくりと加えた。得られた溶液を３０分間攪拌した。次いで、ＮＥｔ3（３Ｌ，２１．５ｍｏｌ）を加えてトリエチルアミン塩酸塩の重いスラリーを生成した。反応混合物を室温に温め、水（１Ｌ）を加えてトリエチルアンモニウム塩（ＴＥＡ塩）を溶解させた。次いで、反応混合物を丸底フラスコに移し、濃縮減量してジクロロメタン（ＤＣＭ）およびＮＥｔ3を除去した。ＥｔＯＡｃ（１２Ｌ）を加え、得られた水層および有機層を分離した。有機層を水（各洗浄に２Ｌ）で３回洗浄し、次いで食塩水で洗浄した（２Ｌ）。次いで、有機層を無水Ｎａ2ＳＯ4で蒸発乾燥させてα−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸メチルエステル（式Ｄ）のわずかに黄色の固体を得た。収率は約１０４％であった。
【０１００】
Ｄ．α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸メチルエステル（式Ｄ）の３−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸メチルエステル（式１ａ）へのヒドロキシル化
エルレンマイヤーフラスコに９５〜９８％Ｈ2ＳＯ4（４９５ｍＬ）を入れ、氷浴で８℃に冷却した。次いで、ＨＮＯ3（３０ｍＬの水に５０ｍＬの７０％ＨＮＯ3を加えることにより調製した５０％を４７．５ｍＬ）をフラスコに加え、混合物を再び氷浴で８℃に冷却した。固体のα−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸メチルエステル（式Ｄ）（１００ｇ，０．４５ｍｏｌ）を３０〜６０分かけて少しずつ混合物に加え、２８℃未満の温度を維持した。氷浴で冷却しながら、反応混合物を攪拌した。反応の進行を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のどちらかでモニターした。ＴＬＣについては、シリカゲルを用い、溶媒はＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ／ヘキサン（９／１／１０）；ＫＭｎＯ4であった。ＨＰＬＣについては、４．６×５０ｍｍ、Ｃ１８、３ミクロン、１２０オングストロームカラムを、１０％アセトニトリル／Ｈ2Ｏから１００％アセトニトリルへの７分間での勾配、２．５ｍＬ／分の流速で用いた。モニター波長は２００ｎｍであった。反応が完了したら（約１時間後）、冷水（１．５Ｌ）およびＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）を加えて反応をクエンチした。さらに水およびＥｔＯＡｃ（各５００ｍＬ）を加えて水層と有機層との分離を助けた。次いで、水層を３等量（各５００ｍＬ）のＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を合わせて、食塩水（４００ｍＬ）で洗浄した。次いで洗浄した有機層を減圧下で濃縮して３−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸メチルエステル（式１ａ）を含む１３０ｇの黄色の油状残渣を得た。
【０１０１】
Ｅ．３−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式１）への３−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸メチルエステル（式１ａ）の加水分解
実施例Ｄの黄色の油状残渣をテトラヒドロフラン（３００ｍＬ）に溶解し、氷浴で５℃に冷却した。温度を３０℃以下に維持しながら、１リットルの１Ｎ水酸化ナトリウムを溶液にゆっくりと加えてｐＨを約７に調節した。次いで、さらに５００ｍＬの１Ｎ ＮａＯＨを加えてｐＨを約１４に調節した。次いで、氷浴で冷却しながら反応混合物を攪拌し、反応の進行を実施例２３に記載のようにＴＬＣまたはＨＰＬＣによりモニターした。約３０分後に反応が完了したら、ＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）を加え、水層と有機層を分離した。水層をさらに５００ｍＬのＥｔＯＡｃで洗浄した。水層を濃ＨＣｌで酸性にした。溶液がｐＨ７に達したときにＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）を加え、次いでｐＨが０．７に達するまでさらに濃ＨＣｌを加えた。添加した濃ＨＣｌの全量は１５０ｍＬであった。次いで、水層をＥｔＯＡｃ（４×４００ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層を４００ｍＬの水、次いで４００ｍＬの食塩水で洗浄した。次いで、洗浄した有機層をＭｇＳＯ4で乾燥させ、濃縮した。収量は薄黄色の固体が８８ｇであった。この固体を１００ｍＬのＥｔＯＡｃおよび３００ｍＬのヘプタンに３０分間攪拌しながら溶解し、次いで濾過および風乾すると８５ｇの褐色の固体（８５％；３−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式１））が得られた。
【０１０２】
Ｅ’．１ポット法を用いる３−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式１）の製造
１．ジクロロ（３−ヒドロキシアダマンタン−１−イル）酢酸メチルエステル（式ＶＩＩＩ）の製造
１０Ｎ ＨＮＯ3の調製：１００ｍＬ容の容量フラスコに濃ＨＮＯ3（８８．２５ｇ，〜６２．５８ｍＬ，〜１．０ｍｏｌ）を入れ、氷浴で冷却した。水（３５ｍＬ）を加えた。混合の熱が放散した後、溶液を室温に温めた。次いで、フラスコに水をマークのところまで満たして１０Ｎ ＨＮＯ3を得た。
【０１０３】
熱電対温度計を備えた２５０ｍＬ三頸フラスコに、濃Ｈ2ＳＯ4（１０３ｇ，〜５６ｍＬ）を入れた。氷浴で０．４℃に冷却後、１０Ｎ ＨＮＯ3（５．６８ｍＬ，５６．８ｍｍｏｌ）を〜３０分かけて加えた。この酸混合物の温度が〜１．０℃に下がったら冷浴を除いた。式ＶＩＩのアダマンタン−１−イルジクロロ酢酸メチルエステル（１５．０ｇ，５４．１１ｍｍｏｌ；乳鉢／乳棒で軽く砕いて大きな塊／結晶を破砕）を少しずつ（１０分毎に１．２５ｇ；１時間５０分の添加時間）加えた。〜５時間後、反応混合物は透明で薄黄色の溶液であった。
【０１０４】
〜２４時間攪拌後、反応混合物は非常に薄い黄色の溶液であった。メカニカルスターラーおよび熱電対温度計を備えた四頸Mortonフラスコ（１Ｌ）に、水（２５０ｍＬ）および尿素（８．０ｇ，０．１３３ｍｏｌ、ＨＮＯ3に対して〜２．３４当量）を入れた。得られた溶液に酢酸エチル（２３０ｍＬ）を加えた。得られた２相混合物を氷浴で〜１．０℃に冷却した。上記の反応混合物を、冷却したＥｔＯＡｃ／水／尿素混合物に〜１５分かけて加えた。さらに酢酸エチルおよび水（各〜５０ｍＬ）を用いて、移し入れを完了した。〜４５分間攪拌した後、冷浴を除き、混合物を攪拌して温めた。４．５時間後に（クエンチの開始から）、得られた混合物をさらに酢酸エチル（〜１００ｍＬ）を用いて分液漏斗（１Ｌ）に移し、移すのを完了した。水性画分を除き、酢酸エチル（１×８０ｍＬ）で抽出した。有機画分を合わせて、水（２×９０ｍＬ）、１Ｎ ＮａＨＣＯ3（４×９０ｍＬ）および食塩水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧下で除去して式ＶＩＩＩのジクロロ（３−ヒドロキシアダマンタン−１−イル）酢酸メチルエステルを無色に近い固体として得た：１５．６７ｇ（９８．７％粗生成物収率）。この粗物質は、精製することなく式ＩＸのジクロロ（３−ヒドロキシアダマンタン−１−イル）酢酸を調製するのに用いることができる。しかし所望なら、この粗物質（１５．６５ｇ）をメタノール（１０２ｍＬ）および水（８５ｍＬ）から再結晶して綿毛状の固体（ｍｐ １１４．８〜１１５．０℃）を９１％の収率で得ることができる。
【０１０５】
元素分析値：C13H18Cl2O3：
計算値：C, 53.25; H, 6.18; Cl, 24.18%
実測値：C, 53.24; H, 6.24; Cl, 24.31%
1H NMR (500.16MHz, CDCl3)δ3.857 (s, 3H), 2.298 (br m, 2H), 1.824 (s, 2H), 1.793 (d, 4H, =2.75Hz), 1.682, 1.629 (br AB q, 4H), 1.529 (m, 3H) ppm
13C NMR (127.78 MHz, CDCl3)δ165.929, 94.281, 68.932, 54.150, 44.478, 44.529, 44.020, 35.750, 34.759, 30.149 ppm
Lab HPLC:
YMC ODS-A S3 120Å(4.6×50mm),λ=200nm, 2.5ml/分
溶媒：A = 水中の0.2%H3PO4
B = 水中の90%CH3CN
勾配：10分間で20%Ａから100%Ｂへ
【０１０６】
２．３−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸の製造
圧を均等にする滴下漏斗およびアルゴン導入口を備えた２５０ｍＬ容三頸フラスコに、上記工程１に記載の方法により製造したジクロロ（３−ヒドロキシアダマンタン−１−イル）酢酸メチルエステル（式ＶＩＩＩ）（１５ｇ，５１．１６ｍｍｏｌ）を入れ、次いでテトラヒドロフラン（３０ｍＬ，不安定化）を加えた。数分攪拌した後、式ＶＩＩＩのメチルエステルの大部分は溶解して濁った溶液を生成した。この溶液に蒸留水（３０ｍＬ）を加えると、ゆるい懸濁液が生成した。滴下漏斗に１Ｎ ＮａＯＨ（６９ｍＬ、６９ｍｍｏｌ、式ＶＩＩＩの化合物の投入量に対して〜１．３５当量）を入れた。ＮａＯＨを７０分かけて滴下により加えてほぼ無色の溶液を得、これを周囲温度で攪拌した。
【０１０７】
〜１６時間でのＨＰＬＣ分析は、式ＶＩＩＩ化合物の加水分解が完了したことを示した。この反応混合物はｐＨが１３．２４の透明な無色溶液であり、これに〜６Ｎ ＨＣｌ（２．８ｍＬ）を加えてｐＨ７．４０に調節した。固体のＮａＨＣＯ3（１１．２ｇ，０．１３３ｍｏｌ、２．６０当量）を加えて懸濁液を生成した。
【０１０８】
４時間１５分加熱した後のＨＰＬＣ分析は、反応が完了したことを示す。５時間加熱後、熱源を除き、反応混合物（透明で無色な溶液）を冷却した。室温に冷却した後、反応混合物を冷蔵庫（＋４℃）で４日間保存した。
【０１０９】
冷所で４日間保存した後、反応混合物は依然として透明で無色な溶液であり、ＨＰＬＣ分析は保存による変化を殆ど示さない。室温に温めた後、混合物（ｐＨ７．７７）に濃ＨＣｌ（１１ｍＬ必要、ＣＯ2発生；ｐＨ〜１．４０にて無色の固体が沈殿し始めた）を注意深く加えてｐＨ０．２０の酸性にした。その結果得られた懸濁液をＥｔＯＡｃ（×４、全量〜５００ｍＬ；各ＥｔＯＡｃ抽出後に水性画分についてＨＰＬＣ分析を行った）で抽出した。１回目のＥｔＯＡｃ抽出後の水層（ｐＨ０．３８）に濃ＨＣｌ（〜１．６ｍＬ必要）を加えてｐＨ０．１８に調節した。２回目のＥｔＯＡｃ抽出後の水層（ｐＨ０．３７）に濃ＨＣｌ（〜０．８ｍＬ必要）を加えてｐＨ０．１７に調節した。水層は、残りのＥｔＯＡｃ抽出(抽出＃３、ｐＨ０．１９；抽出＃４、ｐＨ０．１９）の後にさらなるｐＨ調節は必要なかった。有機画分を合わせた。乾燥（ＭｇＳＯ4）後、溶媒を減圧下で除去して粗の標記の式ＩＩ化合物を無色に近い顆粒状の固体として得、これを真空（ポンプ）下で１６時間乾燥させた：１１．４２ｇ（９９．５３％収率）；ＨＰＬＣ，１００％（面積％）。
元素分析値：C12H16Cl2O3 [55465-020-31、TR46373]
計算値：C, 64.27%; H, 7.19%
実測値：C, 64.19%; H, 7.09%
【０１１０】
粗生成物である式１ａの化合物（５．０ｇ）を蒸留水（１９ｍＬ）中で〜８５℃に加熱しながら溶解し、次いで熱源から取り出し、冷却した。この物質は〜５３℃で結晶化し始めた。室温で〜２時間静置した後、固体を濾過により回収し、氷冷水で洗浄した。濾過ケークに窒素を引くことにより水の大部分を除去した。次いでこの物質を真空下（ポンプ）で１７時間乾燥させて標記の式１ａ化合物を大きな無色針状物として得た：４．３３ｇ（８６．６％回収）；融点164.5〜165.6℃(Mettler FP800システムにて)；ＨＰＬＣ，１００％（面積％）。
元素分析値：C12H16Cl2O3 [55465-023-15、TR46905]
計算値：C, 64.27%; H, 7.19%
実測値：C, 64.42%; H, 7.04%
【０１１１】
Ｆ．Ｌ−ピログルタミン酸（式Ｅ）のエステル化によるＬ−ピログルタミン酸エチルエステル（式Ｆ）の生成
反応容器にエタノール（４９．０Ｌ）を入れ、−５℃に冷却した。次いで、混合物の温度が０℃を超えない方法で反応容器に塩化チオニル（４．９７ｋｇ）を入れた。塩化チオニルの添加完了後、混合物を再び−５℃に冷却し、添加の間に温度が０℃と−５℃との間に維持されるようにＬ−ピログルタミン酸（式Ｅ）を少しずつ加えた。酸添加後、反応混合物を２０〜２５℃に加熱し、５時間攪拌した。次いで、反応混合物を最初の容量の約１５％まで真空下（Ｔｍａｘ ４５℃）で蒸発させた。次いで、残存する油状物をトルエン（４９Ｌ）に溶解した。次いで、トルエン溶液を約１０℃に冷却し、最大温度が２０〜２５℃となるようにトリエチルアミン（８．４５ｋｇ）をゆっくり加えた。得られた懸濁液を３０分間攪拌し、次いで濾過した。濾過ケークをトルエン（約５Ｌ）で洗浄した。濾液を５０℃、真空下で全量約１０Ｌまで減らした。シクロヘキサン（８Ｌ）を５０℃でゆっくり加え、その後に約３０℃に冷却することにより結晶化を開始した。種晶生成後、混合物を２０〜２５℃に冷却し、シクロヘキサンの２回目の８Ｌ分を入れた。次いで、混合物を６〜８℃に冷却し、１時間攪拌し、得られた結晶を濾去した。この結晶をシクロヘキサン（各４Ｌ）で２回洗浄した。収量は、無色針状物としてのＬ−ピログルタミン酸エチルエステル（式Ｆ）が４．８９ｋｇ（８２％）であった。
【０１１２】
Ｇ．Ｌ−ピログルタミン酸エチルエステル（式Ｇ）のＢＯＣ保護
Ｌ−ピログルタミン酸エチルエステル（式Ｆ）（５．００ｋｇ）を室温でトルエン（２４．９７Ｌ）に溶解した。次いで、この溶液に４−ジメチルアミノピリジン（０．１９ｋｇ）を加えた。次いで、反応混合物の温度が２５℃を超えないような方法でトルエン（２４．９７Ｌ）に溶解した無水ＢＯＣ（７．２９ｋｇ）の溶液を反応混合物に入れた。完全に添加した後、反応混合物を２５℃で３時間攪拌した。次いで、反応混合物に半飽和ＮａＨＣＯ3溶液（４９．９４Ｌ）を入れ、１０分間激しく攪拌し、その後に有機層と水層を分離した。分離した有機層を水（２４．９７Ｌ）で２回洗浄した。次いで、有機層を真空下、最高５０℃で溶媒から蒸発させた。残存する無色からわずかに黄色がかった油状物は静置すると結晶化した。理論的収量は、（５Ｓ）−２−オキソピロリジン−１，５−ジカルボン酸，１−（１，１−ジメチルエチル），５−エチルエステル（式Ｇ）８．１８ｋｇ（３１．８１ｍｏｌ）であった。
【０１１３】
Ｈ．SuperHydride還元および脱離
（５Ｓ）−２−オキソピロリジン−１，５−ジカルボン酸，１−（１，１−ジメチルエチル），５−エチルエステル（式Ｇ）（４．８０ｋｇ）をトルエン（３０．９７Ｌ；Ｋｆ ｍａｘ ０．０１％水）に溶解し、−５０℃に冷却した。この溶液に反応温度が−４５℃を超えないような方法で、SuperHydride（ＬｉＥｔ3ＢＨ：ＴＨＦ中に１Ｍ；１９．９６Ｌ）を入れた。添加完了後、混合物を−４５〜−５０℃で３０分間攪拌した。次いで、温度が−４５℃を超えないような方法で反応混合物にＮ−エチルジイソプロピルアミン（ＤＩＰＥＡ；１４．４７Ｌ）を加えた。ジメチルアミノピリジン（０．０３０ｋｇ）を固体として混合物に加えた。次いで、反応温度が−４５℃を超えないような方法で反応混合物に無水トリフルオロ酢酸（ＴＦＡＡ）（４．７０ｋｇ）を加えた。添加完了後、反応混合物を２０〜２５℃に１時間内温め、この温度でさらに２時間維持した。次いで、反応混合物を０℃に冷却し、反応温度が５℃を超えないような方法でゆっくりと水（４８．００Ｌ）を入れた。次いで、水層と有機層を分離し、有機層を再び４８Ｌの水（０〜５℃）で洗浄した。次いで、有機層を蒸発させ、４０℃で脱気した。黄味を帯びた油状物が、４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１，５−ジカルボン酸，１−（１−ジメチルエチル），５−エチルエステル（ＢＯＣ−ＤＨＰＥＥ）（式Ｇ’）の収量４．５ｋｇ（１８．６６ｍｏｌ、１００％）で得られた。
【０１１４】
Ｉ．ＢＯＣ−ＤＨＰＥＥ（式Ｇ’）の加水分解
４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１，５−ジカルボン酸，１−（１，１−ジメチルエチル），５−エチルエステル（ＢＯＣ−ＤＨＰＥＥ）（式Ｇ’）（６．００ｋｇ）およびエタノール（２４．００Ｌ）から製造した溶液を０〜５℃に冷却し、この温度で水（２０．８７Ｌ）中の水酸化リチウム水和物（２．０９ｋｇ）の溶液でゆっくりと処理して濁った溶液を生成した。次いで、この濁った溶液を２０〜２５℃に温め、この温度で２時間攪拌した。次いで、反応混合物を最高温度４０℃、真空下で約１０．５Ｌの容量まで蒸発させ、水（２４．００Ｌ）およびｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥまたはＭＴＢＥ、２４Ｌ）を入れ、１０分間混合した。得られた有機層と水層を分離し、水層に再び２４ＬのＴＭＢＥを入れた。次いで、この混合物を５〜１０℃に冷却し、激しく攪拌しながらＨ3ＰＯ4 ８５％−水（１：４）を用いてｐＨを２．３〜２．３に調節した。この工程の間、安定性のために温度を５〜１０℃に維持した。得られた有機層と水層を分離した。有機層を保存し、水層を、予め５〜１０℃に冷却した２４ＬのＴＢＭＥで再び抽出した。得られた有機層を保存していた有機層と合わせ、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（４．８２ｋｇ）を入れた。次いで、溶液を蒸発させ、最高温度３０℃、真空下で脱気した。収量は７．８４ｋｇ（２２．８８ｍｏｌ，９２％）［Ｎ−ＢＯＣデヒドロプロリン*ＤＩＰＥＡ（ＢＯＣ−ＤＨＰ）］であった。
【０１１５】
Ｊ．ＢＯＣ−ＤＨＰのアミド生成
実施例Ｉに記載の鹸化によって合成したＢＯＣ−ＤＨＰは、水を含んでいるかもしれない。従って、反応を行う前にトルエンとの共沸蒸留を適用した。しかし、試薬が過剰なため、原料は水を除去する前のＢＯＣ−ＤＨＰの量に基づいて計算した。共沸蒸留では、ＢＯＣ−ＤＨＰをトルエンを用いて約３０％溶液まで希釈した。トルエンを真空下、４０℃で除いた。次いで、処理したＢＯＣ−ＤＨＰ（６．００ｋｇ）をＴＨＦ（４８．０Ｌ）に溶解した。この溶液にＤＩＰＥＡ（２．２６ｋｇ）を入れ、反応混合物を−２０〜−２５℃に冷却した。次いで、塩化メシル（３．０１ｋｇ）をゆっくり加えた。この添加の間に塩酸ＤＩＰＥＡが沈殿した。次いで、得られた懸濁液を−２０℃で２時間攪拌し、次いで表面下の気体導入口によりアンモニアで飽和させた。アンモニアを添加する間、反応物を０℃に加熱した。飽和後、反応混合物を２０℃に加熱し、３時間攪拌した。攪拌後、反応混合物を濾過して塩酸塩を除去した。濾過ケークをＴＨＦ（１２Ｌ）で数回洗浄した。濾液を真空下、最高温度４０℃で濃縮し、次いで塩化メチレン（３３．３３Ｌ）に溶解した。この溶液を水（２６．６６Ｌ）で洗浄した。得られた有機層と水層を分離し、水層を塩化メチレン（各２０Ｌ）で２回抽出した。得られた有機層を合わせ、真空濃縮および脱気して過剰のヒューニッヒ塩基を除去した。収量は（５Ｓ）−５−アミノカルボニル−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボン酸 １−（１，１−ジメチルエチル）エステル（ＢＯＣ−ＤＨＰＡ）（式Ｇ”）について、３．３５ｋｇ（１５．７７ｍｏｌ，９０％）であった。
【０１１６】
Ｋ．（５Ｓ）−５−アミノカルボニル−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボン酸 １−（１，１−ジメチルエチル）エステル（式Ｇ”）のシクロプロパン化
第一の反応器である反応器Ａに、塩化メチレン（１８．０Ｌ）に溶解した（ＢＯＣ−ＤＨＰＡ）（式ＩＶ）（４ｋｇ）を入れ、２０℃に維持した。第二の反応器である反応器Ｂには塩化メチレン（１８．００Ｌ）を入れ、−３０℃に冷却した。次いで、反応器Ｂにジメトキシエタン（ＤＭＥ）（３．３６ｋｇ）、次いでトルエン中のジエチル亜鉛（１５．３６ｋｇ）の３０％溶液を−３０〜−２５℃の温度に維持しながら入れた。次いで、反応温度を−３０〜−２５℃に維持しながら、ジヨードメタン（１９．９９ｋｇ）を反応器Ｂに入れた。ジヨードメタンの添加完了後、混合物を−３０〜−２５℃で４５分間攪拌した。次いで、この混合物を冷却パイプ（−２０〜−２５℃）により反応器Ａに入れた。反応が完了するまで反応器Ａの反応温度が２２〜２４℃に維持されるように、約５％の部分にて添加をゆっくりと行った。反応完了後、反応器Ａの混合物を５〜１０℃に冷却した。次いで、この反応混合物に、反応温度が１５℃を超えない方法で飽和重炭酸塩溶液（２１．６Ｌ）をゆっくりと入れた。この添加後、反応混合物を少なくとも１時間攪拌すると、その間に沈殿が生成した。懸濁液を濾過した。得られた濾過ケークを容器に戻し、塩化メチレン（１４．４Ｌ）で３０分間再度スラリー化し、再度濾過した。この第二の濾過後、濾過ケークをさらに塩化メチレン（７．２Ｌ）で洗浄した。次いで、濾液を水層と有機層に分離し、有機層を半飽和食塩水（２１．６Ｌ）で洗浄した。次いで、溶媒を最高温度３０℃で真空除去し、ヘプタンと交換した。ヘプタン中の粗生成物のスラリーが得られた。溶媒交換後のこの懸濁液の最終容量は１４．４Ｌであった。粗生成物を濾過により単離した。濾過ケークをヘプタン（２．９Ｌ）で洗浄し、次いで真空乾燥して一定の重量とした。粗生成物の収量は２．７６ｋｇ（１２．２ｍｏｌ，７２％）［１Ｓ−（１α，３β，５α］−３−アミノカルボニル）−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−カルボン酸 １，１−ジメチルエチルエステル（式Ｈ）であった。精製するため、この粗物質を８倍量の酢酸ブチル／ヘプタンの１：１混合物中に２０〜２２℃で４時間スラリー化した。この物質を濾過し、濾過ケークを約１倍量のヘプタンで洗浄した。収量は２．１１ｋｇ（９．３３ｍｏｌ，５５％）［１Ｓ−（１α，３β，５α］−３−アミノカルボニル）−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−カルボン酸 １，１−ジメチルエチルエステル（式Ｈ）であった。
【０１１７】
Ｌ．［１Ｓ−（１α，３β，５α）］−３−（アミノカルボニル）−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−カルボン酸 １，１−ジメチルエチルエステル（式Ｈ）の脱保護による（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−３−カルボキサミド（式Ｊ）の生成
メカニカルスターラーおよび熱電対を備えた１００ｍＬの二頸フラスコに［１Ｓ−（１α，３β，５α］−３−アミノカルボニル）−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−カルボン酸 １，１−ジメチルエチルエステル（式Ｈ）（５．０ｇ，２２．１ｍｍｏｌ）およびＴＨＦ（２０ｍＬ）を入れた。次いで、ＨＣｌ（ＥｔＯＡｃ中２．５Ｍ，２５ｍＬ，６２．５ｍｍｏｌ）を懸濁液に加えた。得られた溶液を室温で１８時間攪拌すると、その間に沈殿が観察された。反応の完了をＨＰＬＣによりモニターした。メチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）（３０ｍＬ）を懸濁液に加え、攪拌をさらに３０分間続けた。次いで、懸濁液をＮ2保護下に濾過して白色固体を得、これをＭＴＢＥ（２０ｍＬ）で洗浄した。該固体をオーブン中、減圧下で４８時間乾燥させて、（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−３−カルボキサミドの塩酸塩（式Ｊ；３．６ｇ，１００％）を得た。
【０１１８】
Ｍ．（αＳ）−α−アミノ−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式２）のＢＯＣ保護による（αＳ）−α［［（１，１−ジメチルエトキシ）カルボニル］アミノ］−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸、式３の酸の生成
遊離酸（式３）を製造するための好ましい方法を実施例３に記載する。別法として、以下の方法を用いて遊離酸を製造することができる：
（αＳ）−α−アミノ−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式２）（４６９ｇ，２．０８ｍｏｌ）を、温度プローブおよびｐＨプローブを備えた相分離器中、氷冷１Ｎ ＮａＯＨ（５Ｌ，５ｍｏｌ，２．４当量）に溶解した。ＴＨＦ（２．５Ｌ）を溶液に加えた。次いで、固体のＢｏｃ2Ｏを加え、反応混合物を周囲温度で約１時間攪拌した。次いで、ＥｔＯＡｃ（４Ｌ）を攪拌しながら加え、得られた有機層と水層を分離した。水層のｐＨを濃ＨＣｌで７に調節した。次いで、ＥｔＯＡｃ（４Ｌ）を加え、さらにＨＣｌを加えてｐＨを約１に下げた。添加した濃ＨＣｌの全量は５１０ｍＬであった。有機層と水層を再び分離し、水層をＥｔＯＡｃ（３×３Ｌ）で抽出した。次いで、有機層を合わせ、水（３Ｌ）および食塩水（３Ｌ）で洗浄した。次いで、洗浄した有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、エバポレーターにおいて室温で濃縮して乾燥させた。収量は（αＳ）−α［［（１，１−ジメチルエトキシ）カルボニル］アミノ］−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式３）について５４２ｇであった。
【０１１９】
Ｎ．３−シアノ−（αＳ）−α−（３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］−１−デシル）−β−オキソ−（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−エタンカルバミン酸 １，１−ジメチルエチルエステル（式Ｋ）を生成するカップリング反応
温度計、メカニカルスターラーおよび気体導入口を備えた２Ｌ容の三頸フラスコに、（αＳ）−α［［（１，１−ジメチルエトキシ）カルボニル］アミノ］−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式３）（５０ｇ，１５３．８ｍｍｏｌ）を入れた。ＴＨＦ（２００ｍＬ）を加え、攪拌して透明な溶液を得た。この溶液をアセトン−ドライアイス−水浴で−６℃に冷却した。次いで、塩化メタンスルホニル（Ｍｅｓ−Ｃｌ）（１３．１ｍＬ，１６９ｍｍｏｌ、１．１当量）を一度に加え、次いでジイソプロピルエチルアミン（９４ｍＬ，５３９ｍｍｏｌ，１．１当量）を加えた。このジイソプロピルエチルアミンは約４分かけてゆっくり加えて内部温度を８℃以下に保った。全ての酸が混合無水物に変換されるまで、反応混合物を０℃で攪拌した。次いで、（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−３−カルボキサミド塩酸塩（３２．５ｇ、２００ｍｍｏｌ，１．１当量）およびヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）（１．０４ｇ，７．６ｍｍｏｌ，０．０５当量）を一度に加え、フラスコを冷浴から取り出した。反応混合物を室温で２時間攪拌し、次いで室温で終夜放置した。
【０１２０】
Ｏ．３−シアノ−（αＳ）−α−（３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］−１−デシル）−β−オキソ−（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−エタンカルバミン酸 １，１−ジメチルエチルエステル（式Ｌ）を生成する脱水および加水分解
実施例Ｎの反応混合物にピリジン（６当量，９２２ｍｍｏｌ，７４．６ｍＬ）を加え、反応混合物を冷浴で−８℃に冷却した。次いで、温度を１０℃以下に維持しながら、無水トリフルオロ酢酸（ＴＦＡＡ）（４当量，６１６ｍｍｏｌ，８７ｍＬ）を６分かけてゆっくり加えた。反応液を２４℃で０．５時間攪拌し、ＨＰＬＣ（３０ｍＬ，０．５ｍＬ ＡｃＮ，０．５ｍＬ Ｈ2Ｏ）で実施例Ｎの化合物（Ｋ）の消失についてチェックした。
【０１２１】
次いで、反応液を冷浴で約−３℃に冷却した。反応温度を１０℃以下に維持しながら、ＮａＯＨ（５Ｎ，６当量，０．９２５ｍｏｌ，１８５ｍＬ）を反応液に１０分かけて加えた（水性ｐＨ＝９．９）。Ｋ2ＣＯ3水溶液（３１９ｇ，１５当量，５１０ｍＬのＨ2Ｏに溶解）を５分かけて加えた（温度＝８℃、水性ｐＨ１１．１）。反応を７時間４０分かけて行った。ＨＰＬＣ（３０μＬ，０．５ｍＬ ＡｃＮ，０．５ｍＬ Ｈ2Ｏ）によって測定されるように全ての中間体が最後から２番目まで加水分解されたときに反応は完了した。
【０１２２】
次いでＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）を反応混合物に加え、得られた水層と有機層とを分離した。有機層を５００ｍＬの緩衝溶液（２Ｍ Ｈ3ＰＯ4，１Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4）で洗浄した。温度は１５℃から２３℃に上昇した；添加時間：５分、水性Ｖ＝５６０ｍＬ、ｐＨ＝４．５、ＨＰＬＣにより３２ｍｇの生成物；有機性Ｖ＝１０８０ｍＬ。有機層を第二の５００ｍＬ緩衝溶液で洗浄した；水性Ｖ＝７８０ｍＬ、ｐＨ＝２．５、ＨＰＬＣにより４１５ｍｇの生成物；有機性Ｖ＝８００ｍＬ、１．０２ｖ／ｖ％ピリジン。有機層を３００ｍＬの食塩水で洗浄した；水性Ｖ＝３５０ｍＬ、ｐＨ＝１．８，ＨＰＬＣにより２０ｍｇの生成物。有機層を１３０ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ3溶液で洗浄した；水性Ｖ＝１７６ｍＬ、ｐＨ＝６．０、７８０ｍｇの生成物。有機層を３００ｍＬの半飽和食塩水で洗浄した；水性Ｖ＝３３０ｍＬ、ｐＨ＝５．２、２５ｍｇの生成物；有機性Ｖ＝６５０ｍＬ、ピリジン０．０４５ｖ／ｖ％。５ｇのDarcoを有機層に加え、５分間攪拌し、５０ｇのシリカで濾過し、４×２５ｍＬのＥｔＯＡｃで洗浄、有機性Ｖ＝７５０ｍＬ、ピリジン０．０４ｖ／ｖ％。
【０１２３】
次いで、有機層を約１３３ｍＬまで蒸留した。溶液が曇るまで有機層を１時間攪拌した。１３３ｍＬのヘプタンを１５分かけて加え、スラリーを終夜攪拌した。１３３ｍＬのヘプタンを一晩かけて加えた。混合物を機械的攪拌により２０分間激しく攪拌した。固形分を濾去し、濾過ケークを５０ｍＬの５％ＥｔＯＡｃ／ヘプタンで洗浄した；母液からの溶媒除去後に３．４ｇの生成物が８．８６ｇの粗生成物において見出された。乾燥生成物の結晶を真空下、５０℃で終夜加熱した。４６７ｇの生成物が得られた、〜７３％、９６．６ＡＰ。
【０１２４】
Ｐ．（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）−２−［（２Ｓ）−２−アミノ−２−（３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］−１−デシル）−１−オキソエチル］−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−３−カルボニトリル安息香酸塩（１：１）（式Ｍ）を生成する脱保護
３−シアノ−（αＳ）−α−（３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］−１−デシル）−β−オキソ−（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−エタンカルバミン酸 １，１−ジメチルエチルエステル（式Ｌ）（５．０ｇ，１２．０４ｍｍｏｌ）を、温度計、メカニカルスターラー、および気体導入口を備えた三頸フラスコに入れた。ＥｔＯＡｃ（約４５〜５０ｍＬ）を加えて透明な溶液とした。濃ＨＣｌ（３．００ｍＬ，３７％ｗ／ｗ％，３６．１４ｍｍｏｌ，３当量）を室温で加え、固体が生成するまで反応混合物を攪拌した。次いで、水（３０ｍＬ）を加え、混合物を１〜２分間攪拌した。この反応混合物を分液漏斗に移し、反応混合物の層を、明確に相が分割するまで分離させた。温度を２５℃以下に維持しながら、水層を２５％ＮａＯＨで約６より低いｐＨに調節した。
【０１２５】
次いで、水層にイソプロピルアルコール（ＩＰＡ；２〜３ｍＬ）を加え、次いで安息香酸ナトリウム（６．５ｍＬの水に２．６ｇの安息香酸ナトリウムを溶解することにより調製した安息香酸ナトリウム溶液を０．６５ｍＬ）を加えることによって塩交換した。次いで、残りの安息香酸ナトリウム溶液を滴下漏斗で滴下して加えた。得られた反応混合物を室温で１６〜２４時間攪拌した。次いで、反応混合物中の固形分をブフナー漏斗で濾過し、ＡｇＮＯ3を用いたＣｌテストで固体が陰性を示すまで水で洗浄した。次いで、固体をヘプタン（１０ｍＬ）で洗浄して水を除去し、漏斗上で風乾し、真空オーブンにおいて３５℃で、ＫＦ≦５％まで乾燥させた。収率は７９％、４．１ｇであった。
【０１２６】
Ｑ．化合物Ｌ：
【化２９】
の脱保護による遊離塩基Ｍ’：
【化３０】
の製造
実施例Ｏの化合物（Ｌ）（３００ｇ，０．７２３ｍｏｌ、効力９０．６％）、塩化メチレン（３Ｌ）、メタノール（２８８ｍＬ，７．２３ｍｏｌ）および濃塩酸（３６％）（２８８ｍＬ、７．２３ｍｏｌ）を、メカニカルスターラー、温度プローブおよびＮ2ガス導入口を備えた三頸の１２Ｌフラスコに入れた。反応温度を約２０〜約２５℃の範囲に維持しながら反応を行った。反応混合物を１８時間攪拌し、２層に分離し、上部の水層を回収した。水層に塩化メチレン（６Ｌ）および水（７２０ｍＬ）を加え、５Ｎ ＮａＯＨ（〜６００ｍＬ）を滴下して加えてｐＨを９．０〜１０．５に調節した。
【０１２７】
式：
【化３１】
の塩酸塩（ＨＰＬＣにより同定）（式Ｌ’）を含む有機相を塩化メチレン（６Ｌ）および水（７２０ｍＬ）で処理し、反応温度を２０〜２５℃に維持しながら５Ｎ水酸化ナトリウム溶液（〜６００ｍＬ）を滴下して加えて、ｐＨを９〜１０．５に調節した。ＮａＣｌ（１２０ｇ）を加え、混合物を２０分間攪拌して層を分離させた。有機層（６．２Ｌ）を回収し（〜１７４ｇの化合物Ｍ’を含有）、水層（１．７５Ｌ）は廃棄した（６．５ｇの化合物Ｍ’を含有）。
【０１２８】
有機層を１％ＮＨ4Ｃｌ食塩水溶液（４５０ｍＬ）で洗浄した（１％ＮＨ4Ｃｌ食塩水溶液は１ｇのＮＨ4Ｃｌ、２５ｇのＮａＣｌおよび７４ｇのＨ2Ｏを含んでいた）。得られた相分離から６．０Ｌの有機層を回収し（溶液中に〜１７６ｇの化合物Ｍ’を含んでいた）、１．４ｇの化合物Ｍ’（〜０．４％）を含む水層（０．４５Ｌ）は廃棄した。
【０１２９】
２５℃／５０ｍｍＨｇでＣＨ2Ｃｌ2を留去しながら酢酸エチル（〜４Ｌ）を有機層に加えた。最終容量が２．５Ｌに達したら蒸留を停止した。有機層をポリッシュ(polish)濾過して固体のＮａＣｌを除去し、〜１Ｋｇ（１Ｌの酢酸エチル中に化合物Ｍ’が〜１７０ｇ）ＧＣ分析：ＤＣＭ＜０．１％まで濃縮した。水（１７ｍＬ）を滴下して加え、１０分後に結晶化が始まった。１７ｍＬの水を加え、得られたスラリーを３０分間攪拌し、濾過し、濾過ケークを酢酸エチルで洗浄し、室温で乾燥させて１８６ｇの化合物Ｍ’を収率８１％で得た。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００４年４月１４日に出願された米国仮出願番号60/561,986号による優先権を主張し、該出願の全開示を参照により本明細書に引用する。
【０００２】
本発明は、糖尿病およびその合併症、高血糖症、Ｘ症候群、高インスリン血症、肥満およびアテローム性動脈硬化症および関連疾患、並びに免疫変調性疾患および慢性炎症性腸疾患の治療に用いられるジペプチジルペプチダーゼＩＶのシクロプロピル縮合ピロリジンベースの阻害剤を製造するための中間体として用いられる（αＳ）−α−［［（１，１−ジメチルエトキシ）カルボニル］−アミノ］−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ジペプチジルペプチダーゼＩＶは、膜に結合した非古典的なセリンアミノペプチダーゼであり、これらに限らないが腸、肝臓、肺および腎臓を含む様々な組織に存在している。この酵素はまた、循環しているＴ−リンパ球にも存在しており、そこではＣＤ−２６と称される。ジペプチジルペプチダーゼＩＶは、インビボで内因性のペプチドＧＬＰ−１（７−３６）およびグルカゴンの代謝的開裂を担っており、他のペプチド、例えばＧＨＲＨ、ＮＰＹ、ＧＬＰ−２およびＶＩＰに対してインビトロでタンパク質分解活性を示している。
【０００４】
ＧＬＰ−１（７−３６）は、小腸におけるプログルカゴンの翻訳後プロセシングの結果生じる２９個のアミノ酸のペプチドである。このペプチドは、インビボで多数の作用を有する。例えば、ＧＬＰ−１（７−３６）は、インスリン分泌を刺激し、グルカゴン分泌を阻害する。このペプチドは満腹感を促進し、胃内容排出を遅らせる。ＧＬＰ−１（７−３６）の連続注入による外部からの投与は、糖尿病患者に有効であることが示されている。しかし、外部からのペプチドは連続的に治療に用いるには余りにも速く分解されてしまう。
【０００５】
ＧＬＰ−１（７，３６）の内因性レベルを増強するために、ジペプチジルペプチダーゼＩＶの阻害剤が開発されている。Hamannらによる米国特許第6,395,767号は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶのシクロプロピル縮合ピロリジンベースの阻害剤を開示している。これら阻害剤を化学的に合成する方法は、米国特許第6,395,767号並びに文献に開示されている。例えば、Sagnardら、Tet-Lett. 1995 36: 3148-3152；Tverezovskyら、Tetrahedron 1997 53: 14773-14792；およびHanessianら、Bioorg. Med. Chem. Lett. 1998 8: 2123-2128を参照されたい。米国特許第6,395,767号に開示されている好ましい阻害剤は、式Ｍ'：
【化１】
で示される（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）−２−［（２Ｓ）−２−アミノ−２−（３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］−１−デシル）−１−オキソエチル］−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−３−カルボニトリルおよびそれに対応する一水和物である（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）−２−［（２Ｓ）−２−アミノ−２−（３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］−１−デシル）−１−オキソエチル］−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−３−カルボニトリル（Ｍ”）である。
【０００６】
このジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤の製造に用いる中間体を製造するために適用した方法が、EP 0 808 824 A2に開示されている。ImashiroおよびKurodaのTetrahedron Letters 2001 42: 1313-1315、ReetzらのChem. Int. Ed. Engl. 1979 18: 72、ReetzおよびHeimbachらのChem. Ber. 1983 116: 3702-3707、ReetzらのChem. Ber. 1983 116: 3708-3724も参照のこと。
【０００７】
本発明は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶのシクロプロピル縮合ピロリジンベースの阻害剤の製造に使用するための新規な製造方法および化合物を提供する。
【０００８】
米国特許第6,395,767においてHamannらは、遊離塩基Ｍ’またはその塩の製造に用いられる中間体である（αＳ）−α−［［（１，１−ジメチルエトキシ）カルボニル］−アミノ］−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸の合成方法であって、アダマンタンカルボン酸から８工程の合成を含む方法を記載している。
【０００９】
米国特許出願第10/716,012（２００３年１１月１８日出願）（弁護士ファイルLA84NP）は、（αＳ）−α−［［（１，１−ジメチルエトキシ）カルボニル］−アミノ］−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸の製造方法であって、出発物質として３−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸を使用し、酵素還元的アミノ化を用いて（αＳ）−α−アミノ−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸を製造、単離し、これを別工程で所望の生成物に変換する方法を開示している。
【００１０】
酵素還元的アミノ化工程には、ギ酸アンモニウム、ＤＴＴおよびＮＡＤの存在下、水酸化アンモニウムをｐＨ調整のために用い、酵素ギ酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＦＤＨ）と組み合わせた様々な形の酵素フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）の使用が含まれる。過剰なアンモニウムイオンが存在する場合には、ＢＯＣ基の導入との干渉の可能性を避けるために、さらに後続の工程の前にアンモニアを除去することが必要であろう。
【００１１】
ＰＤＨおよび/またはＦＤＨ酵素を製造する細胞を、発酵ブロスから単離し、使用に供するまで保存する。使用前に、細胞から酵素を放出させるために細胞をミクロ流動化（microfluidized）し、共に存在する細胞破砕物は還元的アミノ化における使用に供する前に除去しなければならない。
【発明の概要】
【００１２】
本発明に従い、部分精製されたフェニルアラニンデヒドロゲナーゼおよび／またはギ酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＰＤＨ／ＦＤＨ）濃縮物を製造する方法であって、以下の工程：
ａ．フェニルアラニンデヒドロゲナーゼおよび／またはギ酸デヒドロゲナーゼを製造し得る微生物の発酵ブロスを製造し；
ｂ．該ブロスをミクロ流動化（microfluidization）させて、得られた細胞から活性を放出させ、ＰＤＨおよび/またはＦＤＨ活性を有するミクロ流動化ブロスを得；
ｃ．細胞破砕物を凝集させてＤＮＡおよび不要なタンパク質を除去するために、該ブロスを凝集剤で処理することにより清浄化し；
ｄ．清浄化ブロスを濾過し；そして
ｅ．該ブロスを濃縮して、ＰＤＨについて少なくとも約４００ＩＵ／ｍｌ、ＦＤＨについて少なくとも約２０ＩＵ／ｍｌのＰＤＨ／ＦＤＨ活性を有する部分精製された酵素濃縮物を得ること
を含む方法が提供される。
【００１３】
さらに、本発明に従い、以下の構造：
【化２】
を有するアミン体を製造する方法であって、以下の工程：
ａ．以下の構造：
【化３】
を有するケト酸の水溶液を、最大約２モル当量のギ酸アンモニウム、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ジチオスレイトールおよび部分精製されたフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ／ギ酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＰＤＨ／ＦＤＨ）と処理し；そして
ｂ．反応物のｐＨを水酸化ナトリウムで約７．０〜約８．６、好ましくは８．０＋／−０．２に維持して、望ましくない過剰アンモニウムイオンを実質的に含まない所望のアミン体を得ること
を含む方法が提供される。
【００１４】
さらに本発明に従い、以下の構造：
【化４】
を有するＢＯＣ保護アミン体を製造するための方法であって、以下の工程：
ａ．以下の構造を有するアミノ酸（αＳ）−α−アミノ−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸：
【化５】
（部分精製フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ／ギ酸デヒドロゲナーゼ酵素を用いて、上記ケト酸１：
【化６】
の還元的アミノ化において製造される）
の水溶液を提供し；そして
ｂ．上記水溶液をジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネートと処理してＢＯＣ保護アミン体を得ること
を含む方法が提供される。
【００１５】
本発明の別の態様において、以下の構造３：
【化７】
を有するＢＯＣ保護アミン体を製造する方法であって、以下の工程：
ａ．部分精製されたフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ／ギ酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＰＤＨ／ＦＤＨ）を製造し（上述のように）；
ｂ．以下の構造１：
【化８】
を有するケト酸の水溶液をギ酸アンモニウム、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ジチオスレイトールおよび部分精製フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ／ギ酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＰＤＨ／ＦＤＨ）と処理し；
ｃ．反応混合物のｐＨを水酸化ナトリウムで約７．０〜約８．６、好ましくは８．０＋／−０．２に維持して、望ましくない過剰アンモニウムイオンを実質的に含まない所望のアミン２：
【化９】
を得；そして
ｄ．アミノ酸中間体２を単離せずに、上記水溶液をジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネートと処理して構造３のＢＯＣ保護アミンを得ること
を含む方法が提供される。
【００１６】
本発明の方法は、部分的に精製された酵素を用い、水酸化アンモニウムに対してｐＨ調整用に水酸化ナトリウムを用いることにより顕著に改善された処理方法を提供し、処理時間を短縮し、中間体の単離を必要とせずに結晶生成物の単離を可能にする。さらに、本発明の方法は、後続の工程に存在するアンモニウムイオンを最小量にしてＢＯＣ基の導入と干渉しないようにし得る反応条件を用いる部分精製ＰＤＨ／ＦＤＨ酵素の製造を提供する。さらに、式１の酸の還元的アミノ化において、部分精製ＰＤＨ／ＦＤＨ酵素濃縮物を使用することにより、生物変換反応後の、式２の上記アミノ酸中間体の樹脂カラムによる単離の必要性をなくすことを可能にする。反応工程は、ＢＯＣ化反応、得られる所望のＢＯＣ保護中間体の抽出および結晶化を直接継続するのに十分にきれいなもの（細胞破砕物が含まれておらず、タンパク質レベルが低い）であろう。
【００１７】
好ましい態様において、以下の式Ｍ：
【化１０】
で示されるジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤である（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）−２−［（２Ｓ）−２−アミノ−２−（３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］−１−デシル）−１−オキソエチル］−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−３−カルボニトリル安息香酸塩（１：１）、またはその遊離塩基Ｍ’：
【化１１】
およびその一水和物Ｍ”
【化１２】
を製造するための本発明の方法における中間体としてＢＯＣ保護化合物３を用いる。
【００１８】
これらの阻害剤は、以下の式３：
【化１３】
で示されるＢＯＣ保護された（αＳ）−α−アミノ−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（本発明に従い製造される部分精製されたＰＤＨ／ＦＤＨ酵素を用いることにより製造する）および以下の式Ｊ：
【化１４】
で示される（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−３−カルボキサミド酸塩、例えば塩酸塩またはメタンスルホン酸塩（メシルまたはＭＳＡ塩）の２つのフラグメントのカップリングにより最終的に生成される。
【００１９】
（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）−２−［（２Ｓ）−２−アミノ−２−（３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］−１−デシル）−１−オキソエチル］−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−３−カルボニトリル安息香酸塩（１：１）およびその対応する遊離塩基およびその一水和物などのシクロプロピル縮合ピロリジンベースの化合物は、糖尿病およびその合併症、高血糖症、Ｘ症候群、高インスリン血症、肥満およびアテローム性動脈硬化症および関連疾患、並びに免疫変調性疾患および慢性炎症性腸疾患の治療に有用なジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤である。本発明において、ＢＯＣ保護された化合物（本発明に従い部分精製されたＰＤＨ／ＦＤＨ酵素を用いた還元的アミノ化工程を経て製造される）を、（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）−２−［（２Ｓ）−２−アミノ−２−（３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］−１−デシル）−１−オキソエチル］−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−３−カルボニトリル安息香酸塩（１：１）およびその対応する遊離塩基およびその一水和物などのシクロプロピル縮合ピロリジンベースの化合物の製造に用いる。
【００２０】
（発明の詳細な説明）
本発明の部分精製ＰＤＨ／ＦＤＨ酵素濃縮物の製造実施においては、ＰＤＨおよび/またはＦＤＨ活性を発現している微生物を発酵させる。発酵ブロスを、８０００〜約３００００ｐｓｉの範囲内、好ましくは約１２０００〜約２００００ｐｓｉの圧力下で、約４℃〜３０℃の範囲内、好ましくは約８℃〜約１５℃、より好ましくは４０℃以下の温度でブロスを維持しながら操作するミクロフルイダイザー(microfluidizer)を通すことになろう。全ブロスは、好ましくは珪藻土(例えば、Dicalite(Grefco Minerals,Inc.の登録商標)およびセライト(World Minerals,Inc.の登録商標))などの濾過助剤およびポリエチレンイミン水溶液などの凝集剤または加熱などの他の凝集因子をブロスに加えることによりＤＮＡおよび他の高分子タンパク質を除去して、清浄化されるであろう。次いで、この混合物をフィルタープレスを用いて濾過し、濾液を回収する。濾過ケーキを水で洗浄し、その水を回収して濾液に加えるが、それら全てを清浄化ブロスと称する。
【００２１】
清浄化ブロスを１０００００ＭＷＣＯ（分子量カットオフ）膜を通して限外濾過して、より低い分子量（１０００００以下）の不純物を除去する。
【００２２】
清浄化した濾液を濃縮して、ＰＤＨ力価が約４００〜約１０００ＩＵ／ｍｌ、好ましくは約５００〜約６００ＩＵ／ｍｌであって、ＦＤＨ力価が約２０〜約２００ＩＵ／ｍｌ、好ましくは約７５〜約１５０ＩＵ／ｍｌである酵素濃縮物を得る。
【００２３】
濃縮物中の全酵素活性回収率は、約６５〜約９５％、好ましくは約７５〜約９０％の範囲内であろう。
【００２４】
本明細書中で用いられる「部分精製（された）」ＰＤＨ／ＦＤＨ酵素という用語は、少なくともＤＮＡの一部および他の高分子量タンパク質およびより低い分子量の不純物が除去されたＰＤＨ／ＦＤＨ酵素を示す。
【００２５】
３−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式１の酸）の還元的アミノ化反応の実施において、式１の酸の混合水溶液を製造し、その混合物を、強アルカリ金属塩基、例えばアルカリ金属水酸化物、好ましくはＮａＯＨを用いて、約７．０〜約８．６、好ましくは約７．８〜約８．２の範囲内のｐＨに調整して式１の酸の溶液を得る。炭素（例えば、Darco KB）を加えて混合物を濾過し、濾液および洗浄液を合わせて澄明な液体を得てもよい。
【００２６】
この溶液に、ギ酸アンモニウムを、ギ酸アンモニウム：式１の酸のモル比が約１．９：１〜約２．５：１、好ましくは約２：１の範囲内となる量で加える。得られた混合物のｐＨを、強アルカリ金属塩基、例えばアルカリ金属水酸化物、好ましくはＮａＯＨを用いて約７．０〜約８．６、好ましくは約７．８〜約８．２の範囲内に調整する。
【００２７】
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）および所望により還元剤、例えばジチオスレイトールまたはβ−メルカプトエタノール、好ましくはジチオスレイトールを、ＮＡＤ：式１の酸のモル比が約５００：１〜約１５００：１、好ましくは約９００：１〜約１２００：１の範囲内となる量で加える。固体を溶解後、部分精製したＰＤＨ／ＦＤＨ酵素濃縮物（式１の１グラム当たり約４００〜約６００ＩＵ ＰＤＨ）を加える。ＮａＯＨなどの強塩基を用いてｐＨを約７．０〜約８．６、好ましくは約７．７〜約８．２の範囲内に再調整する。
【００２８】
この混合物を約２５〜４５℃、好ましくは約３７〜約４０℃の範囲内の温度に温め、水で希釈し、式１の酸の還元的アミノ化反応を実施して、（αＳ）−α−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式２のアミン体）を生成する間、前述のアルカリ金属塩基、好ましくはＮａＯＨで、ｐＨを約７．０〜約８．６、好ましくは約７．８〜約８．２の範囲内に維持する。
【００２９】
式２のアミン体のＢＯＣ保護は、式２のアミン体を単離せずに達成されるが、これはアミン体２が細胞破砕物を含まないであろうことを理由とする。ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネート：式２のアミン体のモル比が約２：１〜約２．５：１、好ましくは約２．０：１〜約２．２：１の範囲内となるように、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネートを式２のアミン体溶液の少なくとも一部に加える。反応混合物のｐＨを前述のＮａＯＨなどの強塩基を用いて約８．５〜約１２．５、好ましくは約９．５〜約１０．５の範囲内に調整する。
【００３０】
得られたＢＯＣ保護化合物（式３）を抽出し、回収し、結晶化してＢＯＣ保護された式３のアミン体を得る。
【００３１】
上記に示したように本発明の一態様として、中間体化合物である、３−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式１）の還元的アミノ化またはトランスアミノ化によりフラグメント（αＳ）−α−アミノ−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式２）を製造する方法が提供される。この方法の好ましい態様において、３−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式１）は、上記の本発明の部分精製されたフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ／ギ酸デヒドロゲナーゼ酵素濃縮物を用いて酵素的に行う還元的アミノ化により、（αＳ）−α−アミノ−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式２）に変換される。本発明において、有用なフェニルアラニンデヒドロゲナーゼの例としては、これらに限定されないが、スポロサルシナ（Sporosarcina）種由来のもの、またはサーモアクチノミセス・インターミディアス（Thermoactinomyces intermedius）などのサーモアクチノミセス（Thermoactinomyces）種由来のフェニルアラニンデヒドロゲナーゼが挙げられる。還元的アミノ化は、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）またはピキア・パストリス（Pichia pastoris）において発現されるサーモアクチノミセス・インターミディアス（Thermoactinomyces intermedius）、ATCC 33205のフェニルアラニンデヒドロゲナーゼを用いて行うのが好ましい。フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ サーモアクチノミセス・インターミディアス（Thermoactinomyces intermedius）、ATCC 33205を発現するE.coliおよびピキア・パストリス（Pichia pastoris）の組換え株の構築および増殖は、Hansonらの文献：Enzyme and Microbial Technology 2000 26: 348-358により記載されている。また、メタノールでのピキア・パストリス（Pichia pastoris）の増殖は、ギ酸デヒドロゲナーゼの産生を惹起する(Hansonら、Enzyme and Microbial Technology 2000 26: 348-358)。
【００３２】
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）(ATCC 20864)ギ酸デヒドロゲナーゼおよびサーモアクチノミセス・インターミディアス（Thermoactinomyces intermedius）(ATCC 33205)フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子の改変形を発現するプラスミドを含むE.coli細胞は、ブダペスト条約の規定のもと、国際寄託当局に寄託および受領されている。寄託は、2002年6月25日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(10801 University Boulevard in Manassas、Virginia、20110-2209)に行った。ATCC受託番号はPTA-4520である。この細胞株への公的アクセスに対する全ての制限は、本特許出願への特許付与により除かれ、取り消し不可であろう。寄託は、公的寄託機関において寄託の日から３０年の期間または試料の最後の請求から５年間または特許の有効期間のいずれか遅い日まで維持されるであろう。上記細胞株は寄託の際に生存していた。生存試料が寄託機関により分配され得ない場合には、該寄託は交換されるであろう。
【００３３】
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）(ATCC 20864)のギ酸デヒドロゲナーゼおよびサーモアクチノミセス・インターミディアス（Thermoactinomyces intermedius）(ATCC 33205)のフェニルアラニンデヒドロゲナーゼの修飾形を発現するプラスミドpBMS-2000-PPFDH-PDH mod.を含むエシェリキア・コリ（Escherichia coli） JM110のフェニルアラニンヒドロゲナーゼが最も好ましい。
【００３４】
３−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式１）の（αＳ）−α−アミノ−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式２）への還元的アミノ化を以下の反応式Ｉに示す：
【化１５】
【００３５】
反応式Ｉに示すように、この反応にはアンモニアおよび還元されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）が必要である。この反応で生成したニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）は、ギ酸デヒドロゲナーゼによるギ酸の二酸化炭素への酸化によってＮＮＡＤＨにリサイクルされる。この反応からの（αＳ）−α−アミノ−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式２）の予測収率は８０〜１００％であり、予測鏡像体過剰率は９９％を超える。また、本明細書の実施例１〜７を参照のこと。
【００３６】
中間体化合物３−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式１）を、以下の反応式ＩＩ：
【化１６】
に示す方法に従い製造することができる。
【００３７】
反応式ＩＩに示すように、この方法において、臭化アダマンチル（式Ａ）を塩化亜鉛触媒によりアルキル化して、α−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式Ｂ）を得る。次いで、α−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式Ｂ）をメタノール中の塩化アセチルを用いてエステル化し、α−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸メチルエステル（式Ｃ）を生成する。次いで、α−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸メチルエステル（式Ｃ）をスワン酸化によりα−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸メチルエステル（式Ｄ）に変換する。次いで、α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸メチルエステル（式Ｄ）をヒドロキシル化して３−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸メチルエステル（式１ａ）を生成し、次いでこれを加水分解して３−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式１）を生成する。
【００３８】
または、中間体化合物である３−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式１）を反応式ＩＩＩに示す方法に従って製造することができる。
【化１７】
【００３９】
反応式ＩＩＩに示すように、（２，２−ジクロロ−１−メトキシ-ビニルオキシ）トリメチルシラン１ｂを、わずかに改変したKurodaら(EP 08 08 824A3；Imashiro and Kuroda Tetrahedron Letters 2001 42: 1313-1315)の方法により製造する。ブロモアダマンタンを塩化亜鉛の影響下１ｂで処理すると(Reetzら、Chem.Int.Ed.Engl. 1979 18:72, ReetzおよびHeimbach Chem. Ber. 1983 116: 3702-3707、Reetzら、Chem. Ber. 1983 116: 3708-3724)、式ＶＩＩで示されるアダマンタン−１−イルジクロロ酢酸メチルエステルが得られる。次いで、式ＶＩＩで示されるアダマンタン−１−イルジクロロ酢酸メチルエステルを濃硫酸中の一酸化窒素でヒドロキシル化して式ＶＩＩＩで示されるジクロロ（３−ヒドロキシアダマンタン−１−イル）酢酸メチルエステルを定量的収量で得る。式ＶＩＩＩ化合物をメタノール中の水酸化ナトリウム水溶液で室温にて加水分解すると式ＩＸで示されるジクロロ（３−ヒドロキシアダマンタン−１−イル）酢酸が得られる。引き続きジクロロ（３−ヒドロキシアダマンタン−１−イル）酢酸（式ＩＸ）を弱塩基、好ましくは重炭酸ナトリウムを用いて、高温で処理すると中間体化合物である３−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式１）のみが生成する。
【００４０】
反応式ＩＩＩＡ
【化１８】
反応式ＩＩＩＡに示すように、中間体化合物である３−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式Ｉ）を１ポット法で製造することができる。示したように、式ＶＩＩＩの化合物をアルゴンなどの不活性雰囲気中、テトラヒドロフラン（または水酸化カリウムや水酸化リチウムなどの他の塩基）中の水酸化ナトリウム水溶液で処理して対応のナトリウム塩を得る。このナトリウム塩を回収することなく、このナトリウム塩を含有する反応混合物を塩酸などの酸で処理してｐＨを約０．５０、好ましくは約０．２０以下まで下げて対応のケト酸ＩＩを生成し、これを水から再結晶させてケト酸Ｉの結晶を生成させることができる。
【００４１】
（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）−２−［（２Ｓ）−２−アミノ−２−（３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］−１−デシル）−１−オキソエチル］−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−３−カルボニトリルの製造に用いるフラグメント（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−３−カルボキサミド（式Ｊ）を、下記反応式ＩＶに示す方法に従い製造することができる。
【化１９】
【００４２】
反応式ＩＶに示すように、Ｌ−ピログルタミン酸（式Ｅ）を、まずエステル化し、Ｌ−ピログルタミン酸エチルエステル（式Ｆ；SQ 7539）を得る。次いで、このＬ−ピログルタミン酸エチルエステルを窒素原子上でＢＯＣ保護して（５Ｓ）−２−オキソピロリジン−１，５−ジカルボン酸 １−（１，１−ジメチルエチル），５−エチルエステル（式Ｇ）を得る。次いで、スーパーハイドライド（SuperHydride）還元および脱離を行って、４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１，５−ジカルボン酸 １−（１，１−ジメチルエチル），５−エチルエステル（式Ｇ'）を生成する。次いでＢＯＣ−ＤＨＰＥＥ ＩＩＩを水酸化リチウムを用いた鹸化により加水分解してＢＯＣ−ＤＨＰを生成する。次いで、塩化メシル続いてアンモニアを用い、混合無水物を経てＢＯＣ−ＤＨＰでアミド体を生成させて、（５Ｓ）−５−アミノカルボニル−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボン酸 １−（１，１−ジメチルエチル）エステル（式Ｇ”）を製造する。次いで、（５Ｓ）−５−アミノカルボニル−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボン酸 １−（１，１−ジメチルエチル）エステル（式Ｇ”）をシモンズ・スミス反応によりシクロプロパン化して、［１Ｓ−（１α，３β，５α］−３−アミノカルボニル）−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−カルボン酸 １，１−ジメチルエチルエステル（式Ｈ）を生成する。次いで、ＢＯＣ基を除去し、その結果、フラグメント（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−３−カルボキサミド（式Ｊ）の塩酸塩やメタンスルホン酸塩などの酸塩を生成する。
【００４３】
反応式ＩＶに示すように、（５Ｓ）−５−アミノカルボニル−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボン酸 １−（１，１−ジメチルエチル）エステル（式Ｇ”）の［１Ｓ−（１α，３β，５α］−３−アミノカルボニル）−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−カルボン酸 １，１−ジメチルエチルエステル（式Ｈ）への変換は、シモンズ・スミス反応におけるシクロプロパン化により行われる。この反応では、（５Ｓ）−５−アミノカルボニル−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボン酸 １−（１，１−ジメチルエチル）エステルを第一の反応器中で塩化メチレンに溶解する。第二の反応器では塩化メチレンを−３０℃に冷却し、ジメトキシエタンおよびジエチル亜鉛の３０％トルエン溶液を加え、次いでジヨードメタンを加える。次いで、この混合物を第一の反応器に加え、次いで飽和重炭酸塩溶液を加える。得られた反応混合物を沈殿が生じるまで攪拌する。次いで、沈殿物を濾過し、洗浄し、塩化メチレンに２回またはそれ以上再懸濁する。次いで、濾液を水相と有機相に分離し、有機相を半飽和食塩水で洗浄する。溶媒を除去し、ヘプタンと交換してヘプタン中の［１Ｓ−（１α，３β，５α］−３−アミノカルボニル）−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−カルボン酸 １，１−ジメチルエチルエステル（式Ｈ）の粗生成物のスラリーを得る。
【００４４】
別法として、（５Ｓ）−５−アミノカルボニル−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボン酸 １−（１，１−ジメチルエチル）エステル（式Ｇ”）を反応式ＩＶＡに示すように製造することができる。
【化２０】
【００４５】
反応式ＩＶＡに示すように、４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１，５−ジカルボン酸 １−（１，１−ジメチルエチル）エステルのＤＣＨＡ塩Ｘを水酸化ナトリウムなどのアルカリ金属塩基で処理してナトリウム塩などの対応する塩を生成させる。
【００４６】
また、４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１，５−ジカルボン酸 １−（１，１−ジメチルエチル）エステルのナトリウム塩ＸＩは、対応するエチルエステルから、該エチルエステル（好ましくはトルエン中の該エチルエステルの溶液）をエタノールおよび水酸化ナトリウムで処理することにより調製することができる。
【００４７】
ナトリウム塩ＸＩの溶液を塩化アンモニウムやリン酸二水素ナトリウムなどの緩衝液で処理して溶液のｐＨを７未満、好ましくは約６〜６.５に低下させ、ナトリウム塩の緩衝溶液を４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロライド（ＤＭＴ−ＭＭ）で処理して活性化ＤＭＴ−エステル体ＸＩＩを生成し、これをアンモニアまたは硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムまたは水酸化アンモニウムなどの他の塩基で処理して（５Ｓ）−５−アミノカルボニル−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボン酸 １−（１，１−ジメチルエチル）エステルＧ”を生成する。
【００４８】
４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロライド（ＤＴＭ−ＭＭ）の製造は、反応式ＶＩＡに示すように、２−Ｃｌ−４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン（ＣＤＭＴ）およびＮ−メチルモルホリンを約０〜約１０℃の低下した温度で反応させてＤＭＴ−ＭＭを生成することによりなされる。
【００４９】
４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１，５−ジカルボン酸 １−（１，１−ジメチルエチル）エステルのＤＣＨＡ塩Ｘは、対応するナトリウム塩ＸＩから製造することができるが、これは予め調製したＤＣＨＡ塩Ｘの水溶液をメチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）で処理し、反応混合物のｐＨをＨ3ＰＯ4などの酸を用いて２．５〜３に調節することによりなされる。有機層を分離し、食塩水で処理して対応するナトリウム塩ＸＩを生成する。得られた反応混合物を冷却し、ＤＣＨＡで処理して対応するＤＣＨＡ塩Ｘを生成する。
【００５０】
反応式ＩＶＢ
【化２１】
また、反応式ＩＶＡにおける化合物Ｈは、反応式ＩＶＢに示すように、Ｎ−ＢＯＣ ４，５−デヒドロプロリンエチルエステルＧ”のシクロプロパン化により以下のようにして製造できる。
【００５１】
Ｎ−ＢＯＣ ４，５−デヒドロプロリンエチルエステルＧ”をトルエン、塩化メチレンまたはジクロロエタンなどの無水有機溶媒の存在下、約−３０℃〜約０℃の範囲の低下した温度にてジエチル亜鉛およびクロロヨードメタンで処理してＮ−ＢＯＣ ４，５−メタノプロリンエチルエステルＸＶを得る。
【００５２】
得られたＢＯＣ ４，５−メタノプロリンエチルエステルＸＶ（シン異性体とアンチ異性体の８：１混合物）を窒素雰囲気などの不活性雰囲気下、メチルアミン水溶液と処理することにより分離し、シン （Ｓ）−ＢＯＣ−４，５−メタンプロリンエチルエステル（ＸＶI）（ＸＶIIから分離）を回収する。
【００５３】
エタノールまたはトルエンやＴＨＦなどの他の有機溶媒中のｓ−ＢＯＣ−４，５−メタノプロリンエチルエステルＸＶＩを、水酸化リチウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液または水酸化カリウム水溶液などの塩基と処理して対応するｓ−ＢＯＣ−メタノプロリン遊離酸ＸＶＩＩＩを生成する。
【００５４】
Ｎ−メチルモルホリンの存在下、約−８℃を超えないような低温でＴＨＦまたは塩化メチレン；クロロギ酸イソブチルまたは塩化メシルなどの有機溶媒に遊離酸ＸＶＩＩＩを溶解し、次いで反応混合物をアンモニアで処理してｓ−ＢＯＣ−メタノプロリンアミドＨを生成することにより、遊離酸ＸＶＩＩＩを対応するｓ−ＢＯＣ−メタノプロリンアミドＨに変換する。
【００５５】
本発明の別の側面は、（αＳ）−α−アミノ−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式３）および（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−３−カルボキサミド（式Ｊ）のフラグメントをカップリングして、（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）−２−［（２Ｓ）−２−アミノ−２−（３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］−１−デシル）−１−オキソエチル］−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−３−カルボニトリル安息香酸塩（１：１）を生成するカップリングの方法に関する。これらフラグメントのカップリングを下記の反応式Ｖに示す。
【化２２】
【００５６】
実施例３に示すように、単離された（部分精製された）ＰＤＨ／ＦＤＨ酵素濃縮物を用いた生物変換から単離することなく式２の化合物を用いる。
【００５７】
反応式Ｖに示すように、（αＳ）−α−アミノ−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式２）のフラグメントを、まずＢＯＣ保護して（αＳ）−α［［（１，１−ジメチルエトキシ）カルボニル］アミノ］−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式３）を生成するが、これは水酸化ナトリウムなどの塩基の存在下、２をＢＯＣ2Ｏで処理し、酢酸イソプロピル抽出により分離し、次いで酢酸イソプロピル／ヘプタンを用いて結晶化して、遊離酸３を単離することにより行われる（実施例３、工程３を参照）。または、遊離酸３を酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）抽出により分離する（実施例８Ｍを参照）。
【００５８】
テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）などの適当な有機溶媒（約−１０℃〜約０℃の範囲の温度に冷却）中の式３の化合物の溶液を塩化メタンスルホニル（塩化メシル）、およびヒューニッヒ塩基（ジイソプロピルエチルアミンまたはＤＩＰＥＡ）で処理して対応するメタンスルホン酸塩ＶＩを生成する。
【００５９】
次いで、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）または他の公知のカップリング剤の存在下、カップリング反応を用いて（αＳ）−α［［（１，１−ジメチルエトキシ）カルボニル］アミノ］−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式３）メタンスルホン酸塩を（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−３−カルボキサミド（式Ｊ）にカップリングし、３−（アミノカルボニル）−αＳ）−α−（３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］−１−デシル）−β−オキソ−（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−エタンカルバミン酸 １，１−ジメチルエチルエステル（式Ｋ）を生成する。式Ｋの化合物をピリジンやトリエチルアミンなどの有機塩基および無水トリフルオロ酢酸で処理することにより脱水し、次いで約０℃〜約１０℃に冷却し、水酸化ナトリウムまたはＫＯＨやＬｉＯＨなどの他の強塩基を加えることにより反応物を加水分解して化合物Ｌを生成する。次いで、３−シアノ−（αＳ）−α−（３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］−１−デシル）−β−オキソ−（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−エタンカルバミン酸 １，１−ジメチルエチルエステル（式Ｌ）を脱保護（および安息香酸ナトリウムで処理）し、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤である（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）−２−［（２Ｓ）−２−アミノ−２−（３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］−１−デシル）−１−オキソエチル］−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−３−カルボニトリル安息香酸塩（１：１）（式Ｍ）を生成する。
【００６０】
反応式Ｖに戻ると、化合物Ｌを反応式ＶＩＡに記載するように塩酸などの強酸と処理することにより脱保護できる。
【化２３】
【００６１】
反応式ＶＩＡを参照すると、遊離塩基一水和物Ｍ”をＢＯＣ保護中間体Ｌから以下のようにして生成することができる。
【００６２】
ＢＯＣ保護中間体Ｌを、反応温度を約２０〜２５℃の範囲に維持しながら塩化メチレンおよびメタノールの存在下、濃塩酸と処理して塩酸塩Ｌ’を生成する。塩酸塩Ｌ’を塩酸、次いで水酸化ナトリウムまたは他の強塩基と処理して遊離塩基Ｍ’を生成する。次いで、遊離塩基Ｍ’を水と処理して遊離塩基一水和物Ｍ”を生成する。
【００６３】
本発明化合物および方法を用いて製造したジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤は、糖尿病およびその合併症、高血糖症、Ｘ症候群、高インスリン血症、肥満およびアテローム性動脈硬化症および関連疾患、並びに免疫変調性疾患および慢性炎症性腸疾患の治療に有用である。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
以下の実施例は本発明の好ましい態様を表す。
【００６５】
実施例１
プラスミドpBMS2000-PPFDH-PDHmodの構築
発現ベクターpBMS2000-PPFDH-PDHmodの２工程構築を用いた。適合性の制限エンドヌクレアーゼ開裂部位とともにP.pastorisのＦＤＨ遺伝子の５’末端および３’末端を含むオリゴヌクレオチドプライマー：
【化２４】
を用い、P.pastorisのＦＤＨ遺伝子を発現ベクターpBMS2000(pBMS2000はS.W.Liuらの米国特許第6,068,991号(2000年5月30日発行)に開示されている)にサブクローニングした。それぞれ1×TaqPlus反応緩衝液(Stratagene、LaJolla、CA)、０．２ｍＭの各デオキシヌクレオチド三リン酸（dATP、dCTP、dGTPおよびdTTP）、０．４ｎＭの各オリゴヌクレオチド、２．５ＵのTaqPlus ＤＮＡポリメラーゼ(Stratagene)、およびクローン化されたP.pastorisのＦＤＨ遺伝子を含む１０ｐｇのプラスミドＤＮＡを含有する１００μＬずつの反応液４つにおいてP.pastorisのＦＤＨ遺伝子の高忠実度ＰＣＲ増幅を行った。増幅条件は、自動伸長パーキン・エルマー モデル４８０サーモサイクラーを用い、９４℃で４分間インキュベート後、９４℃で１分間；５０℃で１分間；および７２℃で１．５分間の２５サイクルを含むものであった。
【００６６】
このＰＣＲ反応混合物を等容量のフェノール：クロロホルム（１：１）(GibcoBRL、Gaithersburg、MD）で抽出し、13,000×gで５分間遠心した。上部の水相をとり、新たなマイクロ遠心管に入れた。０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２容量の氷冷エタノールを加えてＤＮＡを沈殿させた。13,000×gで５分間遠心分離後、液体を管から吸引し、ペレットを０．５ｍＬの氷冷７０％エタノールで洗浄した。液体を再び吸引し、ペレットを室温で３０分間風乾させた。
【００６７】
増幅したＤＮＡを、各２０単位のBspHIおよびBamHIを用い、３７℃で３時間、全量５０μＬで消化した。これと平行してpBMS2000ベクター（２μｇ）をBspHIおよびBamHIで消化した。消化した試料を１．０％ＴＡＥアガロースゲル上で２時間、１００ｖで電気泳動した。ＦＤＨ遺伝子（１１００塩基対フラグメント）および線状化ベクター（４７００塩基対フラグメント）に対応するバンドを別々にゲルから切り出し、QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen、Chartsworth、CA)を用いて精製した。単離したフラグメントの濃度を低分子量ラダー(Invitrogen Corp.、Carlsbad、CA)に対する電気泳動により推定し、５：１（挿入物：ベクター）のモル比にて全量１０μＬにおいて２２℃で２時間、ライゲートした。１５μＬのｄＨ2Ｏおよび２５０μＬの１−ブタノールを加えてＤＮＡを沈殿させ、マイクロ遠心管中、13,000×gで５分間ペレット化した。液体を吸引除去し、ＤＮＡをSpeedVac(Savant Instruments、Farmingdale、NY)で５分間、低加熱下で乾燥させた。ペレットを５μＬのｄＨ2Ｏに再懸濁した。
【００６８】
再懸濁したＤＮＡを、エレクトロポレーションにより０．０４ｍＬのE.coliDH10Bコンピテント細胞(Invitrogen)に２５μＦおよび２５０Ωで形質転換した。ＳＯＣ培地を直ちに加え（０．９６ｍＬ；ＳＯＣ＝１リットル当たり０．５％酵母抽出物、２％トリプトン、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ＭｇＳＯ4および２０ｍＭグルコース）、細胞をシェーカー中で１時間、３７℃および２２５ｒｐｍでインキュベートした。プラスミドＤＮＡを含むコロニーを、５０μｇ／ｍｌの硫酸カナマイシン(Sigma Chemicals、St.Louis、MO)を含むＬＢ寒天プレートで選択した。所望の挿入物を有するプラスミドは、RapidCycler(Idaho Technology、Salt Lake City、UT)を用いたキャピラリー管でのコロニーＰＣＲにより同定した。各反応混合物は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、４ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．２５ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン、２％スクロース４００、０．１ｍＭクレゾールレッド、０．４ｎＭの各プライマー（配列番号１および配列番号２）、および２．５ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ(Promega Corp.、Madison、WI)を含んでいた。反応混合物を１０μＬずつに分け、丸底マイクロタイタープレートのウェルにピペッティングした。カナマイシン耐性コロニーを使い捨てプラスチック接種針を用いて拾い、反応混合物にかき混ぜて入れ、ＬＢカナマイシン寒天に移した。各反応混合物の一部を３０μＬ容キャピラリー管に入れ、管の両端をフレームシールした。細胞を溶解し、９４℃で３０秒インキュベートしてＤＮＡを変性し、RapidCycler Thermocycler(Idaho Technology、Salt Lake City、UT)を用いて９４℃で０秒間、４０℃で０秒間、および７２℃で６０秒間の３０サイクルを用いて増幅を行った。試料を１．０％ＴＡＥアガロースゲル上で２時間、１００ｖにて電気泳動した。１７の試験した試料のうち７試料が１１００塩基対で強いバンドを示した。このプラスミド（本明細書中でpBMS2000-PPFDHと称する）を含む１つのコロニーをプラスミド構築における次の工程のために選択した。
【００６９】
「PDHmod」は、（３−ヒドロキシアダマンタン−１−イル）オキソ酢酸の（Ｓ）−アミノ（３−ヒドロキシアダマンタン−１−イル）酢酸への完全な変換に必要なカルボキシル末端の最後の２つのアミノ酸および別の１２アミノ酸の変化により、開示されたＤＮＡ配列(Takadaら、J. Biochem. 109, pp. 371-376 [1991])とは異なっている改変したThermoactinomycetes intermediusフェニルアラニンデヒドロゲナーゼをいう。この変化をプラスミドpPDH9K/10(Donovanらの特許WO200004179(2000年1月27日発行)に詳細が記載されている)に導入し、次いでこのプラスミドをP.pastoris SMD1168(ATCC 74408株として寄託)に形質転換した。
【００７０】
天然ＰＤＨ遺伝子の３’末端および対応するアミノ酸を以下に示す：
【化２５】
【００７１】
PDHmod遺伝子の３’末端および対応するアミノ酸を以下に示す（変化したまたは新規なアミノ酸は太字）：
【化２６】
【００７２】
適合性の制限エンドヌクレアーゼ開裂部位とともにPDHmod遺伝子の5'末端および3'末端を含むオリゴヌクレオチドプライマー：
【化２７】
を調製した。
【００７３】
ＰＣＲによるPDHmodの増幅および精製のための反応条件は、ATCC 74408から調製した染色体ＤＮＡを反応のための鋳型として含めた以外はP.pastorisのＦＤＨ遺伝子に用いたものと同じであった。得られたフラグメントを各２０単位のNdeIおよびSmaIを用い、２５℃で１時間、次いで３７℃で２時間、全容量５０μＬで消化した。これと平行して、開始コドンにNdeI部位を有するpBMS2000ベクターのバージョン（２μg）を同一条件を用いてNdeIおよびSmaIで消化した。消化した試料を別々に１．０％ＴＡＥアガロースゲル上で２時間、１００ｖで電気泳動した。PDHmod遺伝子（１２００塩基対フラグメント）および線状化ベクター（４７００塩基対フラグメント）に対応するバンドをゲルから切り出し、QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)を用いて精製した。これら２つのフラグメントのライゲーション、E.coliの形質転換、およびPDHmod遺伝子を有する挿入物(pBMS2000-PDHmodを形成)を含むコロニーのスクリーニングを上記のように行った。
【００７４】
pBMS2000-PPFDH-PDHmodの構築のため、pBMS2000-PDHmod（２μｇ）を５０μＬの反応物中、各１０ＵのHindIIIおよびSmaIを用いて２５℃で１時間、次いで３７℃で１時間開裂させた。１０単位のＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ(Invitrogen)および４つの全てのデオキシリボヌクレオシド三リン酸の２．５ｍＭの混合物（２μＬ）を加え、試料を１１℃で２０分間インキュベートした。反応液を１．０％ＴＡＥアガロースゲル上で２時間、１００ｖで電気泳動した。１８００塩基対フラグメントを切り出し、QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)を用いて単離した。このフラグメントは、順にtacプロモーター、groES遺伝子、およびPDHmod遺伝子（転写融合物として）を含んでいる。次に、pBMS2000-PPFDH（２μｇ）を１０単位の制限エンドヌクレアーゼSmaIを用い、５０μＬ容量で２時間、２５℃で消化し、次いで０．４Ｕのエビアルカリホスファターゼ(United States Biochemicals、Cleveland、OH)で１時間、３７℃で処理した。プラスミドＤＮＡを１．０％ＴＡＥアガロースゲル上で２時間、１００ｖで電気泳動し、単離し、QIAquickキットを用いて抽出した。これら２つのフラグメントを６．５：１（挿入物：ベクター）のモル比で１６℃にて４時間、１０μＬの最終容量でライゲートした。１−ブタノール抽出および遠心分離後、ＤＮＡをエレクトロコンピテントなＤＨ１０Ｂ細胞に形質転換した。カナマイシン耐性コロニーを、ＦＤＨについて既に記載したように２つのPDHmod-特異的プライマーを用いてPDHmod遺伝子の存在についてスクリーニングした。第二ラウンドのＰＣＲスクリーニングは、それぞれＰＰＦＤＨの５’末端およびPDHmod遺伝子の３’末端に相同なＤＮＡプライマーを用いて行った。１４００塩基対フラグメントの増幅を支持することができる構築物のみが２つの遺伝子を同じ方向で有していた。そのようなプラスミドの１つが見出され、方向性がKpnIを用いた診断的制限消化によって確認され、これにより５４２２塩基対および１８２６塩基対の予想されたフラグメントが得られた。このプラスミドを「pBMS2000-PPFDH-PDHmod」と表した。
【００７５】
実施例２
FDHおよびPDHmodの発現
pBMS2000-PPFDH-PDHmodをエシェリキア・コリ（Escherichia coli） JM110に形質転換した。振盪フラスコでの検討においてJM110(pBMS2000-PPFDH-PDHmod)をＭＴ５培地（２．０％ Yeastamine、４．０％グリセロール、０．６％リン酸ナトリウム［二塩基性］、０．３％リン酸カリウム［一塩基性］、０．１２５％硫酸アンモニウム、０．０２５６％硫酸マグネシウム［七水和物；滅菌１Ｍ溶液からオートクレーブ後に添加］、および５０μｇ／ｍＬの硫酸カナマイシン［濾過滅菌した５０ｍｇ／ｍＬ溶液からオートクレーブ後に添加］）中、２８℃、２５０ｒｐｍで１８時間増殖させた。６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ600）を記録し、０．３５の開始ＯＤ600を与えるに十分な細胞を新鮮なＭＴ５／カナマイシン培地に加えた。ＯＤ600が０．８〜１．０となるまで、フラスコを２５０ｒｐｍ、２８℃で振盪した。滅菌濾過した１Ｍイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度３５μＭで加えることにより両遺伝子の発現を誘導し、発酵を２４〜４８時間続けた。細胞を6,500×gで５分間遠心分離することによってペレット化し、等容量の５０ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ７．０）で１回洗浄し、再度ペレット化した。細胞を−２０℃で凍結保存するか、または直ちに用いた。ペレットを５０ｍＭリン酸アンモニウム（ｐＨ７．０）中、１０ｍＬ／ｇ（湿細胞重量）で再懸濁し、Fisher Scientific Model 50 Sonic Dismembrator(Fisher Scientific、Pittsburgh、PA)(マイクロチップで動力設定15)を用いて３×１５秒間超音波処理した。細胞破砕物は、13,000×gにて室温で５分間遠心分離することによりペレット化した。
【００７６】
試料を７０℃で１０分間加熱した。１ｍＬの１Ｍジチオスレイトール溶液を混合物に加え、１０μＬを１０％NuPAGE(登録商標) Bis-Trisポリアクリルアミドミニ・ゲルに適用した。電気泳動を２００ｖで５０〜６０分間行い、ゲルを０．１％（ｗ／ｖ）クマシーブルー(Sigma)、４０％（ｖ／ｖ）エタノールおよび１０％（ｖ／ｖ）酢酸からなる溶液で染色した。染色液に浸漬したゲルを沸騰が明らかとなるまで電子レンジで加熱し、次いでオービタルシェーカーで４０ｒｐｍにて１５分間振盪した。ゲルを脱イオン水で十分に洗浄し、脱色溶液(GelClear(登録商標)；Invitrogen)で覆った。この溶液を再び沸点ちょうどまで加熱し、少なくとも２時間穏やかに振盪した。誘導によりMr 43,000および40,000に２つの顕著なバンドが認められ、これらはFDHおよびPDHmodのサブユニットの予想された分子量に対応していた。また試料は、実施例４、６および７に記載するようにして試験したときにFDHおよびPDHの両活性を有していることがわかった。この組換えE.coli株にSC16496の内部表示を与えた。
【００７７】
SC16496を引き続き１５リットルおよび２５０リットル容量で発酵させた。１５リットル発酵のために、１ｍＬの凍結SC16496を入れた一つのバイアルを室温で解凍し、４リットルフラスコ中の５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む１リットルのＭＴ５培地に加えた。このフラスコを２８℃、２５０ｒｐｍで２４時間インキュベートし、Braun発酵装置中の１３リットルのＭＴ５培地（１５Ｌの最終容量に基づいて成分を１回分とした）に移した。それぞれ５０μｇ／ｍＬおよび０．０２４６％の最終濃度を与えるのに十分な硫酸カナマイシンおよび硫酸マグネシウム七水和物を５００ｍＬの蒸留水に溶解し、０．２ミクロン酢酸セルロース濾過ユニットにより濾過滅菌した。この溶液をタンクに加え、直ちに接種した。最初のＯＤ600は約０．３５であった。
【００７８】
発酵作業パラメーターは以下の通りであった：
作業容量：１６リットル
温度：２８℃
換気：１．０ｖｖｍ
圧力：６９０ｍｂａｒ
攪拌：５００ｒｐｍ
必要に応じてＮＨ4ＯＨを用いてｐＨを６．８に調節
発泡は必要に応じてＵＣＯＮ(Dow Chemical Companyにより製造されたフルオロカーボン溶媒混合物)を添加して調節した。
【００７９】
ＯＤ600 ０．８〜１．０（接種後約２時間）で濾過滅菌したＩＰＴＧ（５００ｍＬのｄＨ2Ｏに溶解）を無菌的に加えて最終濃度を３５μＭとした。発酵をさらに４８時間続けた時点でタンクの内容物を１０℃に過冷した。細胞を遠心分離により回収し、０．１用量の５０ｍＭギ酸アンモニウム、ｐＨ７．０で１回すすいだ。細胞ペーストをプラスチック容器に入れ、必要とされるまで−７０℃で保存した。
【００８０】
２５０Ｌタンクについては、接種物は以下のようにして調製した：１ｍＬの凍結SC16496を解凍し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを有する３００ｍＬのＭＴ５培地に加えた。フラスコを２８℃、２５０ｒｐｍで２４時間増殖させた。ＯＤ600を決定し、８０ ＯＤ単位を与える適当な容量の細胞を取り、２５０ｍＬの新鮮なＭＴ５培地に加えた。細胞をBraun発酵装置中の１０ＬのＭＴ５／カナマイシン培地に無菌的に加え（最初のＯＤ600〜０．００８）、上で開示した発酵作業パラメーター下で１６時間増殖させた。次いで、培養液を適当な濃度のカナマイシンおよび硫酸マグネシウムを含む２５０ＬのＭＴ５に移した。これら条件下でのSC16496の倍加時間が９０分であることに基づき、２５０Ｌ中の１０Ｌの接種物は０．３０〜０．３５の開始ＯＤ600を与えるはずである。誘発、増殖、回収および保存は、１５Ｌ発酵について記載したものと同様に行った。
【００８１】
実施例３
単離した(部分精製)ＰＤＨ／ＦＤＨ酵素濃縮物を用いた、３−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式１）からの（αＳ）−α−アミノ−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式２）を介した（αＳ）−α−［［（１，１−ジメチルエトキシ）カルボニル］アミノ］−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式３）の短縮(telescoped)製造
【００８２】
工程１：ＰＤＨ／ＦＤＨ酵素濃縮物の単離
エシェリキア・コリ（Escherichia coli） JM110(pBMS2000-PPFDH-PDHmod)の発酵ブロス（３０リットル）を４０００Ｌタンク発酵（実施例２と類似した方法を用いて製造）から得、マイクロフルイダイザー(MicrofluidicsモデルM-110Y、作動圧力12,000〜20,000psi)に通し（１回）、ブロスの温度を４０℃以下に保ちながら細胞から活性を放出させた。ミクロ流動化ブロスのＰＤＨ／ＦＤＨ活性は、ＰＤＨについては３２ＩＵ／ＭＬ、ＦＤＨについては８ＩＵ／ｍｌであった。
【００８３】
ブロス全体を清澄化するため、十分に攪拌したブロスに４．５ｋｇのセライトを加えた。次いで、０．２０１Ｌの３０％ポリエチレンイミン水溶液を加え、３０分間混合した。次いで、混合物をフィルタープレス(Ertel Alsopモデル8-ESSC-10)を用いて濾過し、１８Ｌの濾液を得た。濾過ケークを１２Ｌの水で洗浄して容量を３０Ｌに戻した。この工程の収率は、活性が３１ＩＵ／ｍｌとなったＰＤＨでは９７％の活性の回収がなされ、ＦＤＨの活性は８ＩＵ／ｍｌであった。
【００８４】
清澄化したブロスを１０００００ＭＷＣＯフィルターカセット(Millipore Pellicon ２ユニット、ポリエーテルスルホン低タンパク質結合カセット、０．５ｍ2フィルター面積）により限外濾過した。ポンプの循環速度は４００ｍＬ／分であった。清澄化した濾液を１．５Ｌに濃縮し、ＰＤＨ力価が５６７ＩＵ／ｍＬでＦＤＨ力価が１３６ＩＵ／ｍＬの酵素濃縮物を得た。浸透液をアッセイしたところ、活性は認められなかった。濃縮物中の全酵素活性回収率は８４％であった。
【００８５】
工程２：還元的アミノ化
３−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式１）（１．００ｋｇ；４．４６ｍｏｌ）を２０Ｌ容器に加え、次いで水（５Ｌ）を加えた。この混合物を攪拌し、１０Ｎ ＮａＯＨでｐＨを調節してｐＨ〜８として溶液を得た。Darco KBBカーボン（１００ｇ）を加え、混合物を５分間攪拌し、次いで５μの濾紙を用いてブフナー漏斗で濾過した。フィルターを水で洗浄し（２×１Ｌ）、濾液および洗液を合わせて透明な溶液を得た。
【００８６】
攪拌しながらギ酸アンモニウム（０．５６２Ｋｇ；８．９２ｍｏｌ）を加え、１０Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨを再び〜７．５に調節した。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（２．６５ｇ）およびジチオスレイトール（１．５４ｇ）を加えた。固形分が溶解したときにＰＤＨ／ＦＤＨ酵素濃縮物を加えた（１．０３Ｌ；ＰＤＨを５０００００ＩＵ）。１０Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨを周囲温度で〜８．０に再調節した。
【００８７】
次いで、混合物を〜４０℃に温め、水で全容量１０Ｌに希釈した。４２時間攪拌している間、ｐＨを７．７〜８．３に維持した。得られた溶液は、０．９５５Ｋｇ（９５．１％）の生成物（αＳ）−α−アミノ−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式２）を含んでいた。
【００８８】
工程３：ＢＯＣ保護
（αＳ）−α−アミノ−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式２）の溶液の一部（４７７．５ｇ；２．１２ｍｏｌ）にジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネート（１．０２２ｋｇ；４．６８ｍｏｌ）を加えた。この混合物を、ｐＨスタット滴定器で１０Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨを１０に調節し維持しながら周囲温度で攪拌した。反応はＢｏｃ2Ｏの添加後４時間で完了し、このとき残存する出発物質は１．０％未満であった。
【００８９】
混合物のｐＨを３５％Ｈ2ＳＯ4で〜８に調節し、混合物にｉ−ＰｒＯＡｃ（５．０Ｌ）を加えた。次いで、混合物のｐＨを３５％Ｈ2ＳＯ4で２．０に調節し、このｐＨで５〜１０分間維持した。Dicalite（２５０ｇ）を加え、混合物を〜１０分間攪拌し、次いでブフナー漏斗中の濾紙上のDicalite（２５０ｇ）のパッドで濾過した。Dicaliteパッドを２．５Ｌのｉ−ＰｒＯＡｃでさらに洗浄した。
【００９０】
濾液を１０Ｎ ＮａＯＨでｐＨ８に調節した。１時間沈殿させた後、界面を含む有機層を廃棄した。水層にｉ−ＰｒＯＡｃ（７．５Ｌ）を加えた。混合物を３５％Ｈ2ＳＯ4でｐＨ〜２．０の酸性にし、次いで〜４０℃に加熱し、穏やかに攪拌しながら４時間維持した。層を分離し、有機抽出物を取っておいた。界面を含む水層をｉ−ＰｒＯＡｃ（３．７５Ｌ）で抽出し、２時間後に４０℃で層を再び分離した。界面を含む水層をｉ−ＰｒＯＡｃ（３．７５Ｌ）で再び抽出し、２時間後に４０℃で層を分離した。
【００９１】
合わせた有機抽出物（〜１５Ｌ）を蒸留により〜４．５Ｌに濃縮した。次いで、この溶液にヘプタン（〜１０Ｌ）を１０〜１５分間かけて加え、その間温度を〜８２−８９℃に維持した。反応器ジャケットの温度を７０℃に設定し、この温度で１時間維持した。冷却後すぐに結晶化が生じた。次いで、反応器ジャケットの温度を４０℃に設定し、この温度で３０分間維持した。
【００９２】
懸濁液を周囲温度に冷却し、次いでさらに０〜５℃に冷却した。０〜５℃で１時間攪拌した後、生成物を濾過した。生成物をヘプタン（２．５Ｌ）で洗浄し、次いで４０℃で真空乾燥して６０７．０ｇ（８８％収率）の（αＳ）−α−［［（１，１−ジメチルエトキシ）カルボニル］アミノ］−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式３）を得た。
【００９３】
実施例４
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼアッセイＡ
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼアッセイＡは、４０℃で１ｍＬ中に以下のものを含んでいた：０．４ｍＭ ＮＡＤＨ、５ｍＭフェニルピルビン酸ナトリウム、ＨＣｌでｐＨ８．７５に調節した０．７５Ｍ ＮＨ4ＯＨ。吸光度の低下を３４０ｎｍでモニターした。酵素活性単位は、吸光度の変化速度に基づき、μモル／分として計算した。
【００９４】
実施例５
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼアッセイＢ
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼアッセイＢは、４０℃で１ｍＬ中に以下のものを含んでいた：１ｍＭ ＮＡＤ、１０ｍＭ Ｌ−フェニルアラニン、１Ｎ ＮａＯＨでｐＨ１０．０に調節した０．１Ｍ Ｋ2ＨＰＯ4。吸光度の増加を３４０ｎｍでモニターした。酵素活性単位は、吸光度の変化速度に基づき、μモル／分として計算した。
【００９５】
実施例６
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼアッセイＣ
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼアッセイＣは、４０℃で１．０ｍＬ中に以下のものを含んでいた：０．４ｍＭ ＮＡＤＨ、５０ｍＭ ３−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（１当量のＮａＯＨ溶液に溶解）、ＨＣｌでｐＨ８．７５に調節した０．７５Ｍ ＮＨ4ＯＨ。吸光度の低下を３４０ｎｍでモニターした。酵素活性単位は、吸光度の変化速度に基づき、μモル／分として計算した。
【００９６】
実施例７
ギ酸デヒドロゲナーゼアッセイ
ギ酸デヒドロゲナーゼアッセイは、４０℃で１ｍＬ中に以下のものを含んでいた：１ｍＭ ＮＡＤ、１００ｍＭギ酸アンモニウム、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）。吸光度の増加を３４０ｎｍでモニターした。酵素活性単位は、吸光度の変化速度に基づき、μモル／分として計算した。
【００９７】
実施例８
式Ｍ'：
【化２８】
の製造
Ａ．ＺｎＣｌ2触媒された臭化アダマンチル（式Ａ）のカップリング
乾燥容器に７．５ｋｇの臭化アダマンチルを入れた。次いで、塩化メチレン（２２．５リットル）を室温で加えて固形の臭化アダマンタンを溶解した。溶解は吸熱性であるので、次の工程の前に反応混合物の温度を２０℃に戻した。次いで、反応混合物に塩化亜鉛（１．０５ｋｇ）を入れ、２０℃で約５分間攪拌した。次いで、反応温度を２０〜２５℃に維持しながら反応混合物にトリス（トリメチルシロキシ）エチレン（１５．３ｋｇ）を入れ、得られた混合物を２時間攪拌した。この混合後にトリス（トリメチルシロキシ）エチレン（５．１０ｋｇ）を加えた。この添加の間、温度を３０℃以下に維持した。反応液をさらに１２〜１５時間、２０〜２５℃に維持し、この時点で反応混合物を塩化メチレン（１５Ｌ）で希釈し、０〜５℃に冷却した。次いで、反応混合物を半飽和ＮＨ4Ｃｌ溶液を用いて、最初は滴下の様式により処理した。添加の間、温度を３０℃未満に維持した。濃い懸濁液が得られた。この懸濁液に酢酸エチル（９３．７５Ｌ）を加えた。混合物を１５分間激しく攪拌すると、有機層と水層は分離した。有機層を保存し、水層を酢酸エチル（各洗浄で１８．７５Ｌ）で２回洗浄した。次いで、酢酸エチル洗液および有機層を合わせ、水（３７．５Ｌ）、次いで食塩水で半飽和した水（３７．５Ｌ）で洗浄した。有機層を再び分離し、蒸発させて結晶を生成させた。次いで、２２．５Ｌの最終容量でヘプタンへの溶媒交換を行った。得られた懸濁液を５〜１０℃に１時間冷却し、生成物のα−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式Ｂ）を濾過により得た。α−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式Ｂ）の収量は６．９６ｋｇ（３３．１１ｍｏｌ，９５％）であった。
【００９８】
Ｂ．α−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式Ｂ）のエステル化による式Ｃのエステル体の生成
まず不活性雰囲気を反応器内に生じさせた。次いで、反応器にメタノール（３５．００Ｌ）、次いでα−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式Ｂ）（１４．００ｋｇ）を入れて懸濁液を生成した。懸濁液を０〜５℃に冷却し、塩化アセチルを反応混合物の温度が５〜１０℃に維持されるような様式で加えた。塩化アセチルの添加完了後、反応混合物を２０〜２５℃に温め、２０〜２５℃で２時間攪拌した。次いで、反応混合物を真空下、４０℃で濃縮すると薄い油状物が得られた。この油状物を酢酸エチル（７１．９６Ｌ）に溶解し、室温に戻した。得られた混合物を水（各洗浄で２８．７８Ｌ）で２回洗浄し、各洗浄後に有機層と水層とを分離した。有機層を保存し、一方、水層は合わせて３Ｎ ＮａＯＨ溶液でｐＨ９．５に調節した。次いで、合わせた水層を酢酸エチル（各抽出に１４．３９Ｌ）で２回抽出した。各抽出後の有機層を分離し、保存した有機層と合わせた。次いで、これら合わせた有機層を飽和重炭酸ナトリウム溶液（２８．７８Ｌ）、次いで食塩水（４３．１８Ｌ）で洗浄した。次いで、全ての揮発成分を真空下、４０℃で除去し、静置により結晶化する無色から薄黄色の油状物が得られた。この油状物は、１３．２９ｋｇ（５９．２６ｍｏｌ，８９％）のα−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸メチルエステル（式Ｃ）を含んでいた。
【００９９】
Ｃ．α−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸メチルエステル（式Ｃ）のスワン酸化によるα−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸メチルエステル（式Ｄ）の生成
三頸フラスコ（２２Ｌ）は、メカニカルスターラー、温度プローブおよび滴下漏斗を備えており、窒素を一晩パージした。次いで、塩化オキサリル（５００ｍＬ，５．７３ｍｏｌ）を加え、次いでＣＨ2Ｃｌ2（８Ｌ）を加えた。得られた溶液をアセトン／ドライアイス浴で−６９℃に冷却した。次いで、内部温度を−６０℃以下に維持しながら、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；７００ｍＬ，９．８６ｍｏｌ）の溶液を約３０分かけてゆっくり加えた。温度を−６０〜−７０℃に維持しながら、溶液を２０分間攪拌した。内部温度を−６０℃以下に維持しながら、ＣＨ2Ｃｌ2（１．７Ｌ）中のα−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸メチルエステル（式Ｃ）（９９０ｇ，４．４２ｍｏｌ）の溶液を約３０分間かけてゆっくりと加えた。得られた溶液を３０分間攪拌した。次いで、ＮＥｔ3（３Ｌ，２１．５ｍｏｌ）を加えてトリエチルアミン塩酸塩の重いスラリーを生成した。反応混合物を室温に温め、水（１Ｌ）を加えてトリエチルアンモニウム塩（ＴＥＡ塩）を溶解させた。次いで、反応混合物を丸底フラスコに移し、濃縮減量してジクロロメタン（ＤＣＭ）およびＮＥｔ3を除去した。ＥｔＯＡｃ（１２Ｌ）を加え、得られた水層および有機層を分離した。有機層を水（各洗浄に２Ｌ）で３回洗浄し、次いで食塩水で洗浄した（２Ｌ）。次いで、有機層を無水Ｎａ2ＳＯ4で蒸発乾燥させてα−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸メチルエステル（式Ｄ）のわずかに黄色の固体を得た。収率は約１０４％であった。
【０１００】
Ｄ．α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸メチルエステル（式Ｄ）の３−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸メチルエステル（式１ａ）へのヒドロキシル化
エルレンマイヤーフラスコに９５〜９８％Ｈ2ＳＯ4（４９５ｍＬ）を入れ、氷浴で８℃に冷却した。次いで、ＨＮＯ3（３０ｍＬの水に５０ｍＬの７０％ＨＮＯ3を加えることにより調製した５０％を４７．５ｍＬ）をフラスコに加え、混合物を再び氷浴で８℃に冷却した。固体のα−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸メチルエステル（式Ｄ）（１００ｇ，０．４５ｍｏｌ）を３０〜６０分かけて少しずつ混合物に加え、２８℃未満の温度を維持した。氷浴で冷却しながら、反応混合物を攪拌した。反応の進行を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のどちらかでモニターした。ＴＬＣについては、シリカゲルを用い、溶媒はＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ／ヘキサン（９／１／１０）；ＫＭｎＯ4であった。ＨＰＬＣについては、４．６×５０ｍｍ、Ｃ１８、３ミクロン、１２０オングストロームカラムを、１０％アセトニトリル／Ｈ2Ｏから１００％アセトニトリルへの７分間での勾配、２．５ｍＬ／分の流速で用いた。モニター波長は２００ｎｍであった。反応が完了したら（約１時間後）、冷水（１．５Ｌ）およびＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）を加えて反応をクエンチした。さらに水およびＥｔＯＡｃ（各５００ｍＬ）を加えて水層と有機層との分離を助けた。次いで、水層を３等量（各５００ｍＬ）のＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を合わせて、食塩水（４００ｍＬ）で洗浄した。次いで洗浄した有機層を減圧下で濃縮して３−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸メチルエステル（式１ａ）を含む１３０ｇの黄色の油状残渣を得た。
【０１０１】
Ｅ．３−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式１）への３−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸メチルエステル（式１ａ）の加水分解
実施例Ｄの黄色の油状残渣をテトラヒドロフラン（３００ｍＬ）に溶解し、氷浴で５℃に冷却した。温度を３０℃以下に維持しながら、１リットルの１Ｎ水酸化ナトリウムを溶液にゆっくりと加えてｐＨを約７に調節した。次いで、さらに５００ｍＬの１Ｎ ＮａＯＨを加えてｐＨを約１４に調節した。次いで、氷浴で冷却しながら反応混合物を攪拌し、反応の進行を実施例２３に記載のようにＴＬＣまたはＨＰＬＣによりモニターした。約３０分後に反応が完了したら、ＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）を加え、水層と有機層を分離した。水層をさらに５００ｍＬのＥｔＯＡｃで洗浄した。水層を濃ＨＣｌで酸性にした。溶液がｐＨ７に達したときにＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）を加え、次いでｐＨが０．７に達するまでさらに濃ＨＣｌを加えた。添加した濃ＨＣｌの全量は１５０ｍＬであった。次いで、水層をＥｔＯＡｃ（４×４００ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層を４００ｍＬの水、次いで４００ｍＬの食塩水で洗浄した。次いで、洗浄した有機層をＭｇＳＯ4で乾燥させ、濃縮した。収量は薄黄色の固体が８８ｇであった。この固体を１００ｍＬのＥｔＯＡｃおよび３００ｍＬのヘプタンに３０分間攪拌しながら溶解し、次いで濾過および風乾すると８５ｇの褐色の固体（８５％；３−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式１））が得られた。
【０１０２】
Ｅ’．１ポット法を用いる３−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式１）の製造
１．ジクロロ（３−ヒドロキシアダマンタン−１−イル）酢酸メチルエステル（式ＶＩＩＩ）の製造
１０Ｎ ＨＮＯ3の調製：１００ｍＬ容の容量フラスコに濃ＨＮＯ3（８８．２５ｇ，〜６２．５８ｍＬ，〜１．０ｍｏｌ）を入れ、氷浴で冷却した。水（３５ｍＬ）を加えた。混合の熱が放散した後、溶液を室温に温めた。次いで、フラスコに水をマークのところまで満たして１０Ｎ ＨＮＯ3を得た。
【０１０３】
熱電対温度計を備えた２５０ｍＬ三頸フラスコに、濃Ｈ2ＳＯ4（１０３ｇ，〜５６ｍＬ）を入れた。氷浴で０．４℃に冷却後、１０Ｎ ＨＮＯ3（５．６８ｍＬ，５６．８ｍｍｏｌ）を〜３０分かけて加えた。この酸混合物の温度が〜１．０℃に下がったら冷浴を除いた。式ＶＩＩのアダマンタン−１−イルジクロロ酢酸メチルエステル（１５．０ｇ，５４．１１ｍｍｏｌ；乳鉢／乳棒で軽く砕いて大きな塊／結晶を破砕）を少しずつ（１０分毎に１．２５ｇ；１時間５０分の添加時間）加えた。〜５時間後、反応混合物は透明で薄黄色の溶液であった。
【０１０４】
〜２４時間攪拌後、反応混合物は非常に薄い黄色の溶液であった。メカニカルスターラーおよび熱電対温度計を備えた四頸Mortonフラスコ（１Ｌ）に、水（２５０ｍＬ）および尿素（８．０ｇ，０．１３３ｍｏｌ、ＨＮＯ3に対して〜２．３４当量）を入れた。得られた溶液に酢酸エチル（２３０ｍＬ）を加えた。得られた２相混合物を氷浴で〜１．０℃に冷却した。上記の反応混合物を、冷却したＥｔＯＡｃ／水／尿素混合物に〜１５分かけて加えた。さらに酢酸エチルおよび水（各〜５０ｍＬ）を用いて、移し入れを完了した。〜４５分間攪拌した後、冷浴を除き、混合物を攪拌して温めた。４．５時間後に（クエンチの開始から）、得られた混合物をさらに酢酸エチル（〜１００ｍＬ）を用いて分液漏斗（１Ｌ）に移し、移すのを完了した。水性画分を除き、酢酸エチル（１×８０ｍＬ）で抽出した。有機画分を合わせて、水（２×９０ｍＬ）、１Ｎ ＮａＨＣＯ3（４×９０ｍＬ）および食塩水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧下で除去して式ＶＩＩＩのジクロロ（３−ヒドロキシアダマンタン−１−イル）酢酸メチルエステルを無色に近い固体として得た：１５．６７ｇ（９８．７％粗生成物収率）。この粗物質は、精製することなく式ＩＸのジクロロ（３−ヒドロキシアダマンタン−１−イル）酢酸を調製するのに用いることができる。しかし所望なら、この粗物質（１５．６５ｇ）をメタノール（１０２ｍＬ）および水（８５ｍＬ）から再結晶して綿毛状の固体（ｍｐ １１４．８〜１１５．０℃）を９１％の収率で得ることができる。
【０１０５】
元素分析値：C13H18Cl2O3：
計算値：C, 53.25; H, 6.18; Cl, 24.18%
実測値：C, 53.24; H, 6.24; Cl, 24.31%
1H NMR (500.16MHz, CDCl3)δ3.857 (s, 3H), 2.298 (br m, 2H), 1.824 (s, 2H), 1.793 (d, 4H, =2.75Hz), 1.682, 1.629 (br AB q, 4H), 1.529 (m, 3H) ppm
13C NMR (127.78 MHz, CDCl3)δ165.929, 94.281, 68.932, 54.150, 44.478, 44.529, 44.020, 35.750, 34.759, 30.149 ppm
Lab HPLC:
YMC ODS-A S3 120Å(4.6×50mm),λ=200nm, 2.5ml/分
溶媒：A = 水中の0.2%H3PO4
B = 水中の90%CH3CN
勾配：10分間で20%Ａから100%Ｂへ
【０１０６】
２．３−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸の製造
圧を均等にする滴下漏斗およびアルゴン導入口を備えた２５０ｍＬ容三頸フラスコに、上記工程１に記載の方法により製造したジクロロ（３−ヒドロキシアダマンタン−１−イル）酢酸メチルエステル（式ＶＩＩＩ）（１５ｇ，５１．１６ｍｍｏｌ）を入れ、次いでテトラヒドロフラン（３０ｍＬ，不安定化）を加えた。数分攪拌した後、式ＶＩＩＩのメチルエステルの大部分は溶解して濁った溶液を生成した。この溶液に蒸留水（３０ｍＬ）を加えると、ゆるい懸濁液が生成した。滴下漏斗に１Ｎ ＮａＯＨ（６９ｍＬ、６９ｍｍｏｌ、式ＶＩＩＩの化合物の投入量に対して〜１．３５当量）を入れた。ＮａＯＨを７０分かけて滴下により加えてほぼ無色の溶液を得、これを周囲温度で攪拌した。
【０１０７】
〜１６時間でのＨＰＬＣ分析は、式ＶＩＩＩ化合物の加水分解が完了したことを示した。この反応混合物はｐＨが１３．２４の透明な無色溶液であり、これに〜６Ｎ ＨＣｌ（２．８ｍＬ）を加えてｐＨ７．４０に調節した。固体のＮａＨＣＯ3（１１．２ｇ，０．１３３ｍｏｌ、２．６０当量）を加えて懸濁液を生成した。
【０１０８】
４時間１５分加熱した後のＨＰＬＣ分析は、反応が完了したことを示す。５時間加熱後、熱源を除き、反応混合物（透明で無色な溶液）を冷却した。室温に冷却した後、反応混合物を冷蔵庫（＋４℃）で４日間保存した。
【０１０９】
冷所で４日間保存した後、反応混合物は依然として透明で無色な溶液であり、ＨＰＬＣ分析は保存による変化を殆ど示さない。室温に温めた後、混合物（ｐＨ７．７７）に濃ＨＣｌ（１１ｍＬ必要、ＣＯ2発生；ｐＨ〜１．４０にて無色の固体が沈殿し始めた）を注意深く加えてｐＨ０．２０の酸性にした。その結果得られた懸濁液をＥｔＯＡｃ（×４、全量〜５００ｍＬ；各ＥｔＯＡｃ抽出後に水性画分についてＨＰＬＣ分析を行った）で抽出した。１回目のＥｔＯＡｃ抽出後の水層（ｐＨ０．３８）に濃ＨＣｌ（〜１．６ｍＬ必要）を加えてｐＨ０．１８に調節した。２回目のＥｔＯＡｃ抽出後の水層（ｐＨ０．３７）に濃ＨＣｌ（〜０．８ｍＬ必要）を加えてｐＨ０．１７に調節した。水層は、残りのＥｔＯＡｃ抽出(抽出＃３、ｐＨ０．１９；抽出＃４、ｐＨ０．１９）の後にさらなるｐＨ調節は必要なかった。有機画分を合わせた。乾燥（ＭｇＳＯ4）後、溶媒を減圧下で除去して粗の標記の式ＩＩ化合物を無色に近い顆粒状の固体として得、これを真空（ポンプ）下で１６時間乾燥させた：１１．４２ｇ（９９．５３％収率）；ＨＰＬＣ，１００％（面積％）。
元素分析値：C12H16Cl2O3 [55465-020-31、TR46373]
計算値：C, 64.27%; H, 7.19%
実測値：C, 64.19%; H, 7.09%
【０１１０】
粗生成物である式１ａの化合物（５．０ｇ）を蒸留水（１９ｍＬ）中で〜８５℃に加熱しながら溶解し、次いで熱源から取り出し、冷却した。この物質は〜５３℃で結晶化し始めた。室温で〜２時間静置した後、固体を濾過により回収し、氷冷水で洗浄した。濾過ケークに窒素を引くことにより水の大部分を除去した。次いでこの物質を真空下（ポンプ）で１７時間乾燥させて標記の式１ａ化合物を大きな無色針状物として得た：４．３３ｇ（８６．６％回収）；融点164.5〜165.6℃(Mettler FP800システムにて)；ＨＰＬＣ，１００％（面積％）。
元素分析値：C12H16Cl2O3 [55465-023-15、TR46905]
計算値：C, 64.27%; H, 7.19%
実測値：C, 64.42%; H, 7.04%
【０１１１】
Ｆ．Ｌ−ピログルタミン酸（式Ｅ）のエステル化によるＬ−ピログルタミン酸エチルエステル（式Ｆ）の生成
反応容器にエタノール（４９．０Ｌ）を入れ、−５℃に冷却した。次いで、混合物の温度が０℃を超えない方法で反応容器に塩化チオニル（４．９７ｋｇ）を入れた。塩化チオニルの添加完了後、混合物を再び−５℃に冷却し、添加の間に温度が０℃と−５℃との間に維持されるようにＬ−ピログルタミン酸（式Ｅ）を少しずつ加えた。酸添加後、反応混合物を２０〜２５℃に加熱し、５時間攪拌した。次いで、反応混合物を最初の容量の約１５％まで真空下（Ｔｍａｘ ４５℃）で蒸発させた。次いで、残存する油状物をトルエン（４９Ｌ）に溶解した。次いで、トルエン溶液を約１０℃に冷却し、最大温度が２０〜２５℃となるようにトリエチルアミン（８．４５ｋｇ）をゆっくり加えた。得られた懸濁液を３０分間攪拌し、次いで濾過した。濾過ケークをトルエン（約５Ｌ）で洗浄した。濾液を５０℃、真空下で全量約１０Ｌまで減らした。シクロヘキサン（８Ｌ）を５０℃でゆっくり加え、その後に約３０℃に冷却することにより結晶化を開始した。種晶生成後、混合物を２０〜２５℃に冷却し、シクロヘキサンの２回目の８Ｌ分を入れた。次いで、混合物を６〜８℃に冷却し、１時間攪拌し、得られた結晶を濾去した。この結晶をシクロヘキサン（各４Ｌ）で２回洗浄した。収量は、無色針状物としてのＬ−ピログルタミン酸エチルエステル（式Ｆ）が４．８９ｋｇ（８２％）であった。
【０１１２】
Ｇ．Ｌ−ピログルタミン酸エチルエステル（式Ｇ）のＢＯＣ保護
Ｌ−ピログルタミン酸エチルエステル（式Ｆ）（５．００ｋｇ）を室温でトルエン（２４．９７Ｌ）に溶解した。次いで、この溶液に４−ジメチルアミノピリジン（０．１９ｋｇ）を加えた。次いで、反応混合物の温度が２５℃を超えないような方法でトルエン（２４．９７Ｌ）に溶解した無水ＢＯＣ（７．２９ｋｇ）の溶液を反応混合物に入れた。完全に添加した後、反応混合物を２５℃で３時間攪拌した。次いで、反応混合物に半飽和ＮａＨＣＯ3溶液（４９．９４Ｌ）を入れ、１０分間激しく攪拌し、その後に有機層と水層を分離した。分離した有機層を水（２４．９７Ｌ）で２回洗浄した。次いで、有機層を真空下、最高５０℃で溶媒から蒸発させた。残存する無色からわずかに黄色がかった油状物は静置すると結晶化した。理論的収量は、（５Ｓ）−２−オキソピロリジン−１，５−ジカルボン酸，１−（１，１−ジメチルエチル），５−エチルエステル（式Ｇ）８．１８ｋｇ（３１．８１ｍｏｌ）であった。
【０１１３】
Ｈ．SuperHydride還元および脱離
（５Ｓ）−２−オキソピロリジン−１，５−ジカルボン酸，１−（１，１−ジメチルエチル），５−エチルエステル（式Ｇ）（４．８０ｋｇ）をトルエン（３０．９７Ｌ；Ｋｆ ｍａｘ ０．０１％水）に溶解し、−５０℃に冷却した。この溶液に反応温度が−４５℃を超えないような方法で、SuperHydride（ＬｉＥｔ3ＢＨ：ＴＨＦ中に１Ｍ；１９．９６Ｌ）を入れた。添加完了後、混合物を−４５〜−５０℃で３０分間攪拌した。次いで、温度が−４５℃を超えないような方法で反応混合物にＮ−エチルジイソプロピルアミン（ＤＩＰＥＡ；１４．４７Ｌ）を加えた。ジメチルアミノピリジン（０．０３０ｋｇ）を固体として混合物に加えた。次いで、反応温度が−４５℃を超えないような方法で反応混合物に無水トリフルオロ酢酸（ＴＦＡＡ）（４．７０ｋｇ）を加えた。添加完了後、反応混合物を２０〜２５℃に１時間内温め、この温度でさらに２時間維持した。次いで、反応混合物を０℃に冷却し、反応温度が５℃を超えないような方法でゆっくりと水（４８．００Ｌ）を入れた。次いで、水層と有機層を分離し、有機層を再び４８Ｌの水（０〜５℃）で洗浄した。次いで、有機層を蒸発させ、４０℃で脱気した。黄味を帯びた油状物が、４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１，５−ジカルボン酸，１−（１−ジメチルエチル），５−エチルエステル（ＢＯＣ−ＤＨＰＥＥ）（式Ｇ’）の収量４．５ｋｇ（１８．６６ｍｏｌ、１００％）で得られた。
【０１１４】
Ｉ．ＢＯＣ−ＤＨＰＥＥ（式Ｇ’）の加水分解
４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１，５−ジカルボン酸，１−（１，１−ジメチルエチル），５−エチルエステル（ＢＯＣ−ＤＨＰＥＥ）（式Ｇ’）（６．００ｋｇ）およびエタノール（２４．００Ｌ）から製造した溶液を０〜５℃に冷却し、この温度で水（２０．８７Ｌ）中の水酸化リチウム水和物（２．０９ｋｇ）の溶液でゆっくりと処理して濁った溶液を生成した。次いで、この濁った溶液を２０〜２５℃に温め、この温度で２時間攪拌した。次いで、反応混合物を最高温度４０℃、真空下で約１０．５Ｌの容量まで蒸発させ、水（２４．００Ｌ）およびｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥまたはＭＴＢＥ、２４Ｌ）を入れ、１０分間混合した。得られた有機層と水層を分離し、水層に再び２４ＬのＴＭＢＥを入れた。次いで、この混合物を５〜１０℃に冷却し、激しく攪拌しながらＨ3ＰＯ4 ８５％−水（１：４）を用いてｐＨを２．３〜２．３に調節した。この工程の間、安定性のために温度を５〜１０℃に維持した。得られた有機層と水層を分離した。有機層を保存し、水層を、予め５〜１０℃に冷却した２４ＬのＴＢＭＥで再び抽出した。得られた有機層を保存していた有機層と合わせ、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（４．８２ｋｇ）を入れた。次いで、溶液を蒸発させ、最高温度３０℃、真空下で脱気した。収量は７．８４ｋｇ（２２．８８ｍｏｌ，９２％）［Ｎ−ＢＯＣデヒドロプロリン*ＤＩＰＥＡ（ＢＯＣ−ＤＨＰ）］であった。
【０１１５】
Ｊ．ＢＯＣ−ＤＨＰのアミド生成
実施例Ｉに記載の鹸化によって合成したＢＯＣ−ＤＨＰは、水を含んでいるかもしれない。従って、反応を行う前にトルエンとの共沸蒸留を適用した。しかし、試薬が過剰なため、原料は水を除去する前のＢＯＣ−ＤＨＰの量に基づいて計算した。共沸蒸留では、ＢＯＣ−ＤＨＰをトルエンを用いて約３０％溶液まで希釈した。トルエンを真空下、４０℃で除いた。次いで、処理したＢＯＣ−ＤＨＰ（６．００ｋｇ）をＴＨＦ（４８．０Ｌ）に溶解した。この溶液にＤＩＰＥＡ（２．２６ｋｇ）を入れ、反応混合物を−２０〜−２５℃に冷却した。次いで、塩化メシル（３．０１ｋｇ）をゆっくり加えた。この添加の間に塩酸ＤＩＰＥＡが沈殿した。次いで、得られた懸濁液を−２０℃で２時間攪拌し、次いで表面下の気体導入口によりアンモニアで飽和させた。アンモニアを添加する間、反応物を０℃に加熱した。飽和後、反応混合物を２０℃に加熱し、３時間攪拌した。攪拌後、反応混合物を濾過して塩酸塩を除去した。濾過ケークをＴＨＦ（１２Ｌ）で数回洗浄した。濾液を真空下、最高温度４０℃で濃縮し、次いで塩化メチレン（３３．３３Ｌ）に溶解した。この溶液を水（２６．６６Ｌ）で洗浄した。得られた有機層と水層を分離し、水層を塩化メチレン（各２０Ｌ）で２回抽出した。得られた有機層を合わせ、真空濃縮および脱気して過剰のヒューニッヒ塩基を除去した。収量は（５Ｓ）−５−アミノカルボニル−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボン酸 １−（１，１−ジメチルエチル）エステル（ＢＯＣ−ＤＨＰＡ）（式Ｇ”）について、３．３５ｋｇ（１５．７７ｍｏｌ，９０％）であった。
【０１１６】
Ｋ．（５Ｓ）−５−アミノカルボニル−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボン酸 １−（１，１−ジメチルエチル）エステル（式Ｇ”）のシクロプロパン化
第一の反応器である反応器Ａに、塩化メチレン（１８．０Ｌ）に溶解した（ＢＯＣ−ＤＨＰＡ）（式ＩＶ）（４ｋｇ）を入れ、２０℃に維持した。第二の反応器である反応器Ｂには塩化メチレン（１８．００Ｌ）を入れ、−３０℃に冷却した。次いで、反応器Ｂにジメトキシエタン（ＤＭＥ）（３．３６ｋｇ）、次いでトルエン中のジエチル亜鉛（１５．３６ｋｇ）の３０％溶液を−３０〜−２５℃の温度に維持しながら入れた。次いで、反応温度を−３０〜−２５℃に維持しながら、ジヨードメタン（１９．９９ｋｇ）を反応器Ｂに入れた。ジヨードメタンの添加完了後、混合物を−３０〜−２５℃で４５分間攪拌した。次いで、この混合物を冷却パイプ（−２０〜−２５℃）により反応器Ａに入れた。反応が完了するまで反応器Ａの反応温度が２２〜２４℃に維持されるように、約５％の部分にて添加をゆっくりと行った。反応完了後、反応器Ａの混合物を５〜１０℃に冷却した。次いで、この反応混合物に、反応温度が１５℃を超えない方法で飽和重炭酸塩溶液（２１．６Ｌ）をゆっくりと入れた。この添加後、反応混合物を少なくとも１時間攪拌すると、その間に沈殿が生成した。懸濁液を濾過した。得られた濾過ケークを容器に戻し、塩化メチレン（１４．４Ｌ）で３０分間再度スラリー化し、再度濾過した。この第二の濾過後、濾過ケークをさらに塩化メチレン（７．２Ｌ）で洗浄した。次いで、濾液を水層と有機層に分離し、有機層を半飽和食塩水（２１．６Ｌ）で洗浄した。次いで、溶媒を最高温度３０℃で真空除去し、ヘプタンと交換した。ヘプタン中の粗生成物のスラリーが得られた。溶媒交換後のこの懸濁液の最終容量は１４．４Ｌであった。粗生成物を濾過により単離した。濾過ケークをヘプタン（２．９Ｌ）で洗浄し、次いで真空乾燥して一定の重量とした。粗生成物の収量は２．７６ｋｇ（１２．２ｍｏｌ，７２％）［１Ｓ−（１α，３β，５α］−３−アミノカルボニル）−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−カルボン酸 １，１−ジメチルエチルエステル（式Ｈ）であった。精製するため、この粗物質を８倍量の酢酸ブチル／ヘプタンの１：１混合物中に２０〜２２℃で４時間スラリー化した。この物質を濾過し、濾過ケークを約１倍量のヘプタンで洗浄した。収量は２．１１ｋｇ（９．３３ｍｏｌ，５５％）［１Ｓ−（１α，３β，５α］−３−アミノカルボニル）−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−カルボン酸 １，１−ジメチルエチルエステル（式Ｈ）であった。
【０１１７】
Ｌ．［１Ｓ−（１α，３β，５α）］−３−（アミノカルボニル）−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−カルボン酸 １，１−ジメチルエチルエステル（式Ｈ）の脱保護による（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−３−カルボキサミド（式Ｊ）の生成
メカニカルスターラーおよび熱電対を備えた１００ｍＬの二頸フラスコに［１Ｓ−（１α，３β，５α］−３−アミノカルボニル）−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−カルボン酸 １，１−ジメチルエチルエステル（式Ｈ）（５．０ｇ，２２．１ｍｍｏｌ）およびＴＨＦ（２０ｍＬ）を入れた。次いで、ＨＣｌ（ＥｔＯＡｃ中２．５Ｍ，２５ｍＬ，６２．５ｍｍｏｌ）を懸濁液に加えた。得られた溶液を室温で１８時間攪拌すると、その間に沈殿が観察された。反応の完了をＨＰＬＣによりモニターした。メチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）（３０ｍＬ）を懸濁液に加え、攪拌をさらに３０分間続けた。次いで、懸濁液をＮ2保護下に濾過して白色固体を得、これをＭＴＢＥ（２０ｍＬ）で洗浄した。該固体をオーブン中、減圧下で４８時間乾燥させて、（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−３−カルボキサミドの塩酸塩（式Ｊ；３．６ｇ，１００％）を得た。
【０１１８】
Ｍ．（αＳ）−α−アミノ−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式２）のＢＯＣ保護による（αＳ）−α［［（１，１−ジメチルエトキシ）カルボニル］アミノ］−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸、式３の酸の生成
遊離酸（式３）を製造するための好ましい方法を実施例３に記載する。別法として、以下の方法を用いて遊離酸を製造することができる：
（αＳ）−α−アミノ−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式２）（４６９ｇ，２．０８ｍｏｌ）を、温度プローブおよびｐＨプローブを備えた相分離器中、氷冷１Ｎ ＮａＯＨ（５Ｌ，５ｍｏｌ，２．４当量）に溶解した。ＴＨＦ（２．５Ｌ）を溶液に加えた。次いで、固体のＢｏｃ2Ｏを加え、反応混合物を周囲温度で約１時間攪拌した。次いで、ＥｔＯＡｃ（４Ｌ）を攪拌しながら加え、得られた有機層と水層を分離した。水層のｐＨを濃ＨＣｌで７に調節した。次いで、ＥｔＯＡｃ（４Ｌ）を加え、さらにＨＣｌを加えてｐＨを約１に下げた。添加した濃ＨＣｌの全量は５１０ｍＬであった。有機層と水層を再び分離し、水層をＥｔＯＡｃ（３×３Ｌ）で抽出した。次いで、有機層を合わせ、水（３Ｌ）および食塩水（３Ｌ）で洗浄した。次いで、洗浄した有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、エバポレーターにおいて室温で濃縮して乾燥させた。収量は（αＳ）−α［［（１，１−ジメチルエトキシ）カルボニル］アミノ］−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式３）について５４２ｇであった。
【０１１９】
Ｎ．３−シアノ−（αＳ）−α−（３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］−１−デシル）−β−オキソ−（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−エタンカルバミン酸 １，１−ジメチルエチルエステル（式Ｋ）を生成するカップリング反応
温度計、メカニカルスターラーおよび気体導入口を備えた２Ｌ容の三頸フラスコに、（αＳ）−α［［（１，１−ジメチルエトキシ）カルボニル］アミノ］−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸（式３）（５０ｇ，１５３．８ｍｍｏｌ）を入れた。ＴＨＦ（２００ｍＬ）を加え、攪拌して透明な溶液を得た。この溶液をアセトン−ドライアイス−水浴で−６℃に冷却した。次いで、塩化メタンスルホニル（Ｍｅｓ−Ｃｌ）（１３．１ｍＬ，１６９ｍｍｏｌ、１．１当量）を一度に加え、次いでジイソプロピルエチルアミン（９４ｍＬ，５３９ｍｍｏｌ，１．１当量）を加えた。このジイソプロピルエチルアミンは約４分かけてゆっくり加えて内部温度を８℃以下に保った。全ての酸が混合無水物に変換されるまで、反応混合物を０℃で攪拌した。次いで、（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−３−カルボキサミド塩酸塩（３２．５ｇ、２００ｍｍｏｌ，１．１当量）およびヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）（１．０４ｇ，７．６ｍｍｏｌ，０．０５当量）を一度に加え、フラスコを冷浴から取り出した。反応混合物を室温で２時間攪拌し、次いで室温で終夜放置した。
【０１２０】
Ｏ．３−シアノ−（αＳ）−α−（３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］−１−デシル）−β−オキソ−（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−エタンカルバミン酸 １，１−ジメチルエチルエステル（式Ｌ）を生成する脱水および加水分解
実施例Ｎの反応混合物にピリジン（６当量，９２２ｍｍｏｌ，７４．６ｍＬ）を加え、反応混合物を冷浴で−８℃に冷却した。次いで、温度を１０℃以下に維持しながら、無水トリフルオロ酢酸（ＴＦＡＡ）（４当量，６１６ｍｍｏｌ，８７ｍＬ）を６分かけてゆっくり加えた。反応液を２４℃で０．５時間攪拌し、ＨＰＬＣ（３０ｍＬ，０．５ｍＬ ＡｃＮ，０．５ｍＬ Ｈ2Ｏ）で実施例Ｎの化合物（Ｋ）の消失についてチェックした。
【０１２１】
次いで、反応液を冷浴で約−３℃に冷却した。反応温度を１０℃以下に維持しながら、ＮａＯＨ（５Ｎ，６当量，０．９２５ｍｏｌ，１８５ｍＬ）を反応液に１０分かけて加えた（水性ｐＨ＝９．９）。Ｋ2ＣＯ3水溶液（３１９ｇ，１５当量，５１０ｍＬのＨ2Ｏに溶解）を５分かけて加えた（温度＝８℃、水性ｐＨ１１．１）。反応を７時間４０分かけて行った。ＨＰＬＣ（３０μＬ，０．５ｍＬ ＡｃＮ，０．５ｍＬ Ｈ2Ｏ）によって測定されるように全ての中間体が最後から２番目まで加水分解されたときに反応は完了した。
【０１２２】
次いでＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）を反応混合物に加え、得られた水層と有機層とを分離した。有機層を５００ｍＬの緩衝溶液（２Ｍ Ｈ3ＰＯ4，１Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4）で洗浄した。温度は１５℃から２３℃に上昇した；添加時間：５分、水性Ｖ＝５６０ｍＬ、ｐＨ＝４．５、ＨＰＬＣにより３２ｍｇの生成物；有機性Ｖ＝１０８０ｍＬ。有機層を第二の５００ｍＬ緩衝溶液で洗浄した；水性Ｖ＝７８０ｍＬ、ｐＨ＝２．５、ＨＰＬＣにより４１５ｍｇの生成物；有機性Ｖ＝８００ｍＬ、１．０２ｖ／ｖ％ピリジン。有機層を３００ｍＬの食塩水で洗浄した；水性Ｖ＝３５０ｍＬ、ｐＨ＝１．８，ＨＰＬＣにより２０ｍｇの生成物。有機層を１３０ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ3溶液で洗浄した；水性Ｖ＝１７６ｍＬ、ｐＨ＝６．０、７８０ｍｇの生成物。有機層を３００ｍＬの半飽和食塩水で洗浄した；水性Ｖ＝３３０ｍＬ、ｐＨ＝５．２、２５ｍｇの生成物；有機性Ｖ＝６５０ｍＬ、ピリジン０．０４５ｖ／ｖ％。５ｇのDarcoを有機層に加え、５分間攪拌し、５０ｇのシリカで濾過し、４×２５ｍＬのＥｔＯＡｃで洗浄、有機性Ｖ＝７５０ｍＬ、ピリジン０．０４ｖ／ｖ％。
【０１２３】
次いで、有機層を約１３３ｍＬまで蒸留した。溶液が曇るまで有機層を１時間攪拌した。１３３ｍＬのヘプタンを１５分かけて加え、スラリーを終夜攪拌した。１３３ｍＬのヘプタンを一晩かけて加えた。混合物を機械的攪拌により２０分間激しく攪拌した。固形分を濾去し、濾過ケークを５０ｍＬの５％ＥｔＯＡｃ／ヘプタンで洗浄した；母液からの溶媒除去後に３．４ｇの生成物が８．８６ｇの粗生成物において見出された。乾燥生成物の結晶を真空下、５０℃で終夜加熱した。４６７ｇの生成物が得られた、〜７３％、９６．６ＡＰ。
【０１２４】
Ｐ．（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）−２−［（２Ｓ）−２−アミノ−２−（３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］−１−デシル）−１−オキソエチル］−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−３−カルボニトリル安息香酸塩（１：１）（式Ｍ）を生成する脱保護
３−シアノ−（αＳ）−α−（３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］−１−デシル）−β−オキソ−（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）−２−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−エタンカルバミン酸 １，１−ジメチルエチルエステル（式Ｌ）（５．０ｇ，１２．０４ｍｍｏｌ）を、温度計、メカニカルスターラー、および気体導入口を備えた三頸フラスコに入れた。ＥｔＯＡｃ（約４５〜５０ｍＬ）を加えて透明な溶液とした。濃ＨＣｌ（３．００ｍＬ，３７％ｗ／ｗ％，３６．１４ｍｍｏｌ，３当量）を室温で加え、固体が生成するまで反応混合物を攪拌した。次いで、水（３０ｍＬ）を加え、混合物を１〜２分間攪拌した。この反応混合物を分液漏斗に移し、反応混合物の層を、明確に相が分割するまで分離させた。温度を２５℃以下に維持しながら、水層を２５％ＮａＯＨで約６より低いｐＨに調節した。
【０１２５】
次いで、水層にイソプロピルアルコール（ＩＰＡ；２〜３ｍＬ）を加え、次いで安息香酸ナトリウム（６．５ｍＬの水に２．６ｇの安息香酸ナトリウムを溶解することにより調製した安息香酸ナトリウム溶液を０．６５ｍＬ）を加えることによって塩交換した。次いで、残りの安息香酸ナトリウム溶液を滴下漏斗で滴下して加えた。得られた反応混合物を室温で１６〜２４時間攪拌した。次いで、反応混合物中の固形分をブフナー漏斗で濾過し、ＡｇＮＯ3を用いたＣｌテストで固体が陰性を示すまで水で洗浄した。次いで、固体をヘプタン（１０ｍＬ）で洗浄して水を除去し、漏斗上で風乾し、真空オーブンにおいて３５℃で、ＫＦ≦５％まで乾燥させた。収率は７９％、４．１ｇであった。
【０１２６】
Ｑ．化合物Ｌ：
【化２９】
の脱保護による遊離塩基Ｍ’：
【化３０】
の製造
実施例Ｏの化合物（Ｌ）（３００ｇ，０．７２３ｍｏｌ、効力９０．６％）、塩化メチレン（３Ｌ）、メタノール（２８８ｍＬ，７．２３ｍｏｌ）および濃塩酸（３６％）（２８８ｍＬ、７．２３ｍｏｌ）を、メカニカルスターラー、温度プローブおよびＮ2ガス導入口を備えた三頸の１２Ｌフラスコに入れた。反応温度を約２０〜約２５℃の範囲に維持しながら反応を行った。反応混合物を１８時間攪拌し、２層に分離し、上部の水層を回収した。水層に塩化メチレン（６Ｌ）および水（７２０ｍＬ）を加え、５Ｎ ＮａＯＨ（〜６００ｍＬ）を滴下して加えてｐＨを９．０〜１０．５に調節した。
【０１２７】
式：
【化３１】
の塩酸塩（ＨＰＬＣにより同定）（式Ｌ’）を含む有機相を塩化メチレン（６Ｌ）および水（７２０ｍＬ）で処理し、反応温度を２０〜２５℃に維持しながら５Ｎ水酸化ナトリウム溶液（〜６００ｍＬ）を滴下して加えて、ｐＨを９〜１０．５に調節した。ＮａＣｌ（１２０ｇ）を加え、混合物を２０分間攪拌して層を分離させた。有機層（６．２Ｌ）を回収し（〜１７４ｇの化合物Ｍ’を含有）、水層（１．７５Ｌ）は廃棄した（６．５ｇの化合物Ｍ’を含有）。
【０１２８】
有機層を１％ＮＨ4Ｃｌ食塩水溶液（４５０ｍＬ）で洗浄した（１％ＮＨ4Ｃｌ食塩水溶液は１ｇのＮＨ4Ｃｌ、２５ｇのＮａＣｌおよび７４ｇのＨ2Ｏを含んでいた）。得られた相分離から６．０Ｌの有機層を回収し（溶液中に〜１７６ｇの化合物Ｍ’を含んでいた）、１．４ｇの化合物Ｍ’（〜０．４％）を含む水層（０．４５Ｌ）は廃棄した。
【０１２９】
２５℃／５０ｍｍＨｇでＣＨ2Ｃｌ2を留去しながら酢酸エチル（〜４Ｌ）を有機層に加えた。最終容量が２．５Ｌに達したら蒸留を停止した。有機層をポリッシュ(polish)濾過して固体のＮａＣｌを除去し、〜１Ｋｇ（１Ｌの酢酸エチル中に化合物Ｍ’が〜１７０ｇ）ＧＣ分析：ＤＣＭ＜０．１％まで濃縮した。水（１７ｍＬ）を滴下して加え、１０分後に結晶化が始まった。１７ｍＬの水を加え、得られたスラリーを３０分間攪拌し、濾過し、濾過ケークを酢酸エチルで洗浄し、室温で乾燥させて１８６ｇの化合物Ｍ’を収率８１％で得た。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
部分精製されたフェニルアラニンデヒドロゲナーゼおよび/またはギ酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＰＤＨ／ＦＤＨ）濃縮物を製造する方法であって、以下の工程：
ａ．フェニルアラニンデヒドロゲナーゼおよび/またはギ酸デヒドロゲナーゼを製造し得る微生物の発酵ブロスを製造し；
ｂ．該ブロスをミクロ流動化させて、得られた細胞から活性を放出させ、ＰＤＨおよび/またはＦＤＨ酵素を含むミクロ流動化ブロスを得；
ｃ．該ブロスを凝集剤で処理することにより細胞破砕物を凝集させてＤＮＡおよび不要なタンパク質を除去して、該ブロスを清浄化し；
ｄ．清浄化ブロスを濾過し；そして
ｅ．該ブロスを濃縮して、ＰＤＨについて少なくとも約４００ＩＵ／ｍｌ、ＦＤＨについて少なくとも約２０ＩＵ／ｍｌのＰＤＨ／ＦＤＨ活性を有する部分精製された酵素濃縮物を得ること
を含む方法。
【請求項２】
ブロスを、約１２０００〜約２００００ｐｓｉの範囲内の圧力下でミクロ流動化する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ブロスの温度を約２５℃以下に保ちながら該ブロスをミクロ流動化する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ブロスの温度を約２５℃以下に保つ、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼをSporosarchina、Thermoactinomyces属から得る、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼをThermoactinomyces intermediusから得る、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼが、Thermoactinomyces intermedius、ATCC 33205から得られ、Escherichia coliまたはPichia pastorisにおいて発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
微生物がEsherichia coli JM110(pBMS 2000-PPDFDH-PDH-mod)である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
清浄化ブロスを限外濾過する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
以下の構造：
【化１】
を有するアミン体を製造する方法であって、以下の工程：
ａ．以下の構造：
【化２】
を有するケト酸の水溶液をギ酸アンモニウム、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ジチオスレイトールおよび部分精製されたフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ／ギ酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＰＤＨ／ＦＤＨ）で処理し；そして
ｂ．反応混合物のｐＨを水酸化ナトリウムで調整し、望ましくない過剰なアンモニウムイオンを実質的に含まない所望のアミン体を得ること
を含む方法。
【請求項１１】
部分精製されたフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ／ギ酸デヒドロゲナーゼ酵素を請求項１に記載の方法により製造する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
３−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸、ギ酸アンモニウム、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ジチオスレイトールおよび部分精製されたフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ／ギ酸デヒドロゲナーゼ酵素の水溶液を約３５〜約４０℃の範囲内の温度に温めて約２４〜約４８時間の範囲内の時間、約７．８〜約８．２の範囲内のｐＨで維持してアミン体を製造する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
以下の構造：
【化３】
を有するＢＯＣ保護されたアミン体を製造するための方法であって、以下の工程：
ａ．以下の構造を有するアミノ酸（αＳ）−α−アミノ−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸：
【化４】
（部分精製フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ／ギ酸デヒドロゲナーゼ酵素を用いて、請求項１２に記載のケト酸：
【化５】
の還元的アミノ化において製造される）の水溶液
を提供し；そして
ｂ．上記水溶液をジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネートと処理してＢＯＣ保護アミン体を得ることを
を含む方法。
【請求項１４】
（αＳ）−α−アミノ−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸の水溶液およびジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネートの混合物のｐＨを約８．５〜約１２．５の範囲内に維持する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＢＯＣ保護アミン体を反応混合物から単離して、ＢＯＣ保護アミン体を結晶化させる工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法により製造された部分精製されたフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ／ギ酸デヒドロゲナーゼ酵素。
【請求項１７】
ＰＤＨおよびＦＤＨ活性を有することを特徴とする部分精製されたフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ／ギ酸デヒドロゲナーゼ。
【請求項１８】
以下の構造：
【化６】
を有するＢＯＣ保護アミン体を製造するために提供される方法であって、以下の工程：
ａ．部分精製されたフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ／ギ酸デヒドロゲナーゼ酵素濃縮物を製造し；
ｂ．以下の構造：
【化７】
を有するケト酸の水溶液を、ギ酸アンモニウム、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ジチオスレイトールおよび部分精製フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ／ギ酸デヒドロゲナーゼ酵素濃縮物（ＰＤＨ／ＦＤＨ）と処理し；
ｃ．反応混合物のｐＨを水酸化ナトリウムで調節して、望ましくない過剰アンモニウムイオンを実質的に含まない所望のアミン体：
【化８】
を得；そして
ｄ．アミノ酸中間体を単離せずに、上記水溶液をジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネートと処理して以下の構造：
【化９】
を有するＢＯＣ保護アミン体を得ること
を含む方法。
【請求項１９】
部分精製されたフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ／ギ酸デヒドロゲナーゼ酵素が、以下の工程：
ａ．フェニルアラニンデヒドロゲナーゼおよび／またはギ酸デヒドロゲナーゼを製造し得る微生物の発酵ブロスを製造し；
ｂ．該ブロスをミクロ流動化させて得られた細胞から活性を放出させ、ＰＤＨおよび/またはＦＤＨ活性を有するミクロ流動化ブロスを得；
ｃ．該ブロスを凝集剤と処理することにより細胞破砕物を凝集させて、該ブロスを清浄化し；
ｄ．清浄化ブロスを濾過し；そして
ｅ．該ブロスを濃縮して、ＰＤＨについて少なくとも約４００ＩＵ／ｍｌ、ＦＤＨについて少なくとも約２０ＩＵ／ｍｌのＰＤＨ／ＦＤＨ活性を有する精製された酵素濃縮物を得ること
により製造される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
以下の構造：
【化１０】
を有する遊離塩基化合物を生成するための方法であって、請求項１３に記載の方法により製造した以下の構造：
【化１１】
を有するＢＯＣ保護化合物を提供し、ＢＯＣ保護化合物を塩化メシルおよびヒューニッヒ塩基および以下の構造：
【化１２】
を有する化合物Ｊおよび１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）と処理し、構造Ｋ：
【化１３】
を有するＢＯＣ保護中間体化合物を生成し、ピリジンおよびトリフルオロ酢酸無水物の存在下で中間体Ｋを脱水し、次いで強塩基の存在下で反応生成物を加水分解して以下の化合物Ｌ：
【化１４】
を生成し、そして化合物Ｌを塩酸と処理して対応する以下の塩酸塩Ｌ'：
【化１５】
を生成し、化合物Ｌ'を塩酸および水酸化ナトリウムと処理して遊離塩基化合物Ｍ'を生成する方法。
【請求項１】
部分精製されたフェニルアラニンデヒドロゲナーゼおよび/またはギ酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＰＤＨ／ＦＤＨ）濃縮物を製造する方法であって、以下の工程：
ａ．フェニルアラニンデヒドロゲナーゼおよび/またはギ酸デヒドロゲナーゼを製造し得る微生物の発酵ブロスを製造し；
ｂ．該ブロスをミクロ流動化させて、得られた細胞から活性を放出させ、ＰＤＨおよび/またはＦＤＨ酵素を含むミクロ流動化ブロスを得；
ｃ．該ブロスを凝集剤で処理することにより細胞破砕物を凝集させてＤＮＡおよび不要なタンパク質を除去して、該ブロスを清浄化し；
ｄ．清浄化ブロスを濾過し；そして
ｅ．該ブロスを濃縮して、ＰＤＨについて少なくとも約４００ＩＵ／ｍｌ、ＦＤＨについて少なくとも約２０ＩＵ／ｍｌのＰＤＨ／ＦＤＨ活性を有する部分精製された酵素濃縮物を得ること
を含む方法。
【請求項２】
ブロスを、約１２０００〜約２００００ｐｓｉの範囲内の圧力下でミクロ流動化する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ブロスの温度を約２５℃以下に保ちながら該ブロスをミクロ流動化する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ブロスの温度を約２５℃以下に保つ、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼをSporosarchina、Thermoactinomyces属から得る、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼをThermoactinomyces intermediusから得る、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼが、Thermoactinomyces intermedius、ATCC 33205から得られ、Escherichia coliまたはPichia pastorisにおいて発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
微生物がEsherichia coli JM110(pBMS 2000-PPDFDH-PDH-mod)である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
清浄化ブロスを限外濾過する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
以下の構造：
【化１】
を有するアミン体を製造する方法であって、以下の工程：
ａ．以下の構造：
【化２】
を有するケト酸の水溶液をギ酸アンモニウム、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ジチオスレイトールおよび部分精製されたフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ／ギ酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＰＤＨ／ＦＤＨ）で処理し；そして
ｂ．反応混合物のｐＨを水酸化ナトリウムで調整し、望ましくない過剰なアンモニウムイオンを実質的に含まない所望のアミン体を得ること
を含む方法。
【請求項１１】
部分精製されたフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ／ギ酸デヒドロゲナーゼ酵素を請求項１に記載の方法により製造する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
３−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸、ギ酸アンモニウム、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ジチオスレイトールおよび部分精製されたフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ／ギ酸デヒドロゲナーゼ酵素の水溶液を約３５〜約４０℃の範囲内の温度に温めて約２４〜約４８時間の範囲内の時間、約７．８〜約８．２の範囲内のｐＨで維持してアミン体を製造する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
以下の構造：
【化３】
を有するＢＯＣ保護されたアミン体を製造するための方法であって、以下の工程：
ａ．以下の構造を有するアミノ酸（αＳ）−α−アミノ−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸：
【化４】
（部分精製フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ／ギ酸デヒドロゲナーゼ酵素を用いて、請求項１２に記載のケト酸：
【化５】
の還元的アミノ化において製造される）の水溶液
を提供し；そして
ｂ．上記水溶液をジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネートと処理してＢＯＣ保護アミン体を得ることを
を含む方法。
【請求項１４】
（αＳ）−α−アミノ−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン−１−酢酸の水溶液およびジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネートの混合物のｐＨを約８．５〜約１２．５の範囲内に維持する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＢＯＣ保護アミン体を反応混合物から単離して、ＢＯＣ保護アミン体を結晶化させる工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法により製造された部分精製されたフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ／ギ酸デヒドロゲナーゼ酵素。
【請求項１７】
ＰＤＨおよびＦＤＨ活性を有することを特徴とする部分精製されたフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ／ギ酸デヒドロゲナーゼ。
【請求項１８】
以下の構造：
【化６】
を有するＢＯＣ保護アミン体を製造するために提供される方法であって、以下の工程：
ａ．部分精製されたフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ／ギ酸デヒドロゲナーゼ酵素濃縮物を製造し；
ｂ．以下の構造：
【化７】
を有するケト酸の水溶液を、ギ酸アンモニウム、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ジチオスレイトールおよび部分精製フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ／ギ酸デヒドロゲナーゼ酵素濃縮物（ＰＤＨ／ＦＤＨ）と処理し；
ｃ．反応混合物のｐＨを水酸化ナトリウムで調節して、望ましくない過剰アンモニウムイオンを実質的に含まない所望のアミン体：
【化８】
を得；そして
ｄ．アミノ酸中間体を単離せずに、上記水溶液をジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネートと処理して以下の構造：
【化９】
を有するＢＯＣ保護アミン体を得ること
を含む方法。
【請求項１９】
部分精製されたフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ／ギ酸デヒドロゲナーゼ酵素が、以下の工程：
ａ．フェニルアラニンデヒドロゲナーゼおよび／またはギ酸デヒドロゲナーゼを製造し得る微生物の発酵ブロスを製造し；
ｂ．該ブロスをミクロ流動化させて得られた細胞から活性を放出させ、ＰＤＨおよび/またはＦＤＨ活性を有するミクロ流動化ブロスを得；
ｃ．該ブロスを凝集剤と処理することにより細胞破砕物を凝集させて、該ブロスを清浄化し；
ｄ．清浄化ブロスを濾過し；そして
ｅ．該ブロスを濃縮して、ＰＤＨについて少なくとも約４００ＩＵ／ｍｌ、ＦＤＨについて少なくとも約２０ＩＵ／ｍｌのＰＤＨ／ＦＤＨ活性を有する精製された酵素濃縮物を得ること
により製造される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
以下の構造：
【化１０】
を有する遊離塩基化合物を生成するための方法であって、請求項１３に記載の方法により製造した以下の構造：
【化１１】
を有するＢＯＣ保護化合物を提供し、ＢＯＣ保護化合物を塩化メシルおよびヒューニッヒ塩基および以下の構造：
【化１２】
を有する化合物Ｊおよび１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）と処理し、構造Ｋ：
【化１３】
を有するＢＯＣ保護中間体化合物を生成し、ピリジンおよびトリフルオロ酢酸無水物の存在下で中間体Ｋを脱水し、次いで強塩基の存在下で反応生成物を加水分解して以下の化合物Ｌ：
【化１４】
を生成し、そして化合物Ｌを塩酸と処理して対応する以下の塩酸塩Ｌ'：
【化１５】
を生成し、化合物Ｌ'を塩酸および水酸化ナトリウムと処理して遊離塩基化合物Ｍ'を生成する方法。
【公開番号】特開２０１１−１７７１７７（Ｐ２０１１−１７７１７７Ａ）
【公開日】平成２３年９月１５日（２０１１．９．１５）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−５７７８１（Ｐ２０１１−５７７８１）
【出願日】平成２３年３月１６日（２０１１．３．１６）
【分割の表示】特願２００７−５０８５１３（Ｐ２００７−５０８５１３）の分割
【原出願日】平成１７年４月１３日（２００５．４．１３）
【出願人】（３９１０１５７０８）ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー (494)
【氏名又は名称原語表記】ＢＲＩＳＴＯＬ−ＭＹＥＲＳ ＳＱＵＩＢＢ ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月１５日（２０１１．９．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５７７８１（Ｐ２０１１−５７７８１）
【出願日】平成２３年３月１６日（２０１１．３．１６）
【分割の表示】特願２００７−５０８５１３（Ｐ２００７−５０８５１３）の分割
【原出願日】平成１７年４月１３日（２００５．４．１３）
【出願人】（３９１０１５７０８）ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー (494)
【氏名又は名称原語表記】ＢＲＩＳＴＯＬ−ＭＹＥＲＳ ＳＱＵＩＢＢ ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】
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