ジペプチドの製造方法
【課題】多種類のジペプチド又はその誘導体を製造すること、ジペプチド又はその誘導体を簡便に製造すること、高い反応速度でジペプチド又はその誘導体を製造すること、高い収率でジペプチド又はその誘導体を製造すること、ジペプチド誘導体の構造を制御すること、疎水性の高いアミノ酸を含むジペプチド又はその誘導体を製造すること等の少なくとも1つを可能にするジペプチド又はその誘導体の製造方法を提供すること。
【解決手段】ペプチダーゼファミリーＭ２８に属し、逆反応活性を有する熱安定性アミノペプチダーゼ及び溶媒の存在下で、アシル供与体とアシル受容体とを反応させてジペプチド又はその誘導体の合成を行なう、ジペプチド又はその誘導体の製造方法。
【解決手段】ペプチダーゼファミリーＭ２８に属し、逆反応活性を有する熱安定性アミノペプチダーゼ及び溶媒の存在下で、アシル供与体とアシル受容体とを反応させてジペプチド又はその誘導体の合成を行なう、ジペプチド又はその誘導体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジペプチド又はその誘導体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生理活性を示す様々なジペプチドが、食品や医薬品等の原料素材として注目を集めている。かかるジペプチドとしては、例えば、強力な甘味料であるアスパルチル−フェニルアラニンメチルエステル（ＡｓｐＰｈｅ−ＯＭｅ）、アンジオテンシンＩ変換酵素活性を阻害するバリル−チロシン（ＶａｌＴｙｒ）等が挙げられる。また、アラニル−チロシン（ＡｌａＴｙｒ）は、水への溶解度が低いチロシンの有力な供給源になる。
【０００３】
ジペプチドの製造方法は、化学合成法と酵素合成法とに大別され、酵素合成法は、温和な反応条件での合成が可能であること、副生成物が少ないこと等の利点を有する。酵素合成法としては、例えば、サーモリシン等のメタロペプチダーゼ、アミノアシル-ｔＲＮＡ合成酵素、アラニンリガーゼ、又は非リボソームペプチド合成酵素を用いる方法等が既に開発されている。中でも、エステル結合のアミノ分解反応を含む酵素合成法（特許文献１）は、サーモリシン等を用いる酵素合成法と異なり、基質として化学的Ｎ-保護アミノ酸を必要とせず、遊離アミノ酸とアミノアシルメチルエステルとからジペプチドを合成し得る。
【特許文献１】国際公開第０３／０１０３０７号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、従来使用されている酵素の中には、コストの観点から、食品、医薬品等の工業的生産における使用に適さないものがある。さらに、従来の酵素合成法では、使用する酵素の基質特異性に偏りがあるため、前記ＡｌａＴｙｒ、ＶａｌＴｙｒ等の生理活性を示すジペプチドを工業的レベルで合成することができない。従って、これらの生理活性を示すジペプチドを含む多種類のジペプチドを簡便に合成し得る新しい酵素合成法の開発が求められている。
【０００５】
本発明の課題は、多種類のジペプチド又はその誘導体を製造すること、ジペプチド又はその誘導体を簡便に製造すること、高い反応速度でジペプチド又はその誘導体を製造すること、高い収率でジペプチド又はその誘導体を製造すること、ジペプチド誘導体の構造を制御すること、疎水性の高いアミノ酸を含むジペプチド又はその誘導体を製造すること等の少なくとも1つを可能にするジペプチド又はその誘導体の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、これまでジペプチド合成活性を有することが知られていなかった特定の性質を有する酵素を用いることにより、上記課題が解決され得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明の要旨は、ペプチダーゼファミリーＭ２８に属し、逆反応活性を有する熱安定性アミノペプチダーゼ及び溶媒の存在下で、アシル供与体とアシル受容体とを反応させてジペプチド又はその誘導体の合成を行なう、ジペプチド又はその誘導体の製造方法に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、多種類のジペプチド又はその誘導体を製造すること、ジペプチド又はその誘導体を簡便に製造すること、高い反応速度でジペプチド又はその誘導体を製造すること、高い収率でジペプチド又はその誘導体を製造すること、ジペプチド誘導体の構造を制御すること、疎水性の高いアミノ酸を含むジペプチド又はその誘導体を製造すること等の少なくとも1つが可能になるという優れた効果が奏され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本明細書において、アミノ酸の表記を、３文字又は１文字で表記する場合がある。すなわち、アラニンは、Ａｌａ又はＡ、アルギニンは、Ａｒｇ又はＲ、アスパラギンは、Ａｓｎ又はＮ、アスパラギン酸は、Ａｓｐ又はＤ、システインは、Ｃｙｓ又はＣ、グルタミン酸は、Ｇｌｕ又はＥ、グルタミンは、Ｇｌｎ又はＱ、グリシンは、Ｇｌｙ又はＧ、ヒスチジンは、Ｈｉｓ又はＨ、イソロイシンは、Ｉｌｅ又はＩ、ロイシンは、Ｌｅｕ又はＬ、リジンは、Ｌｙｓ又はＫ、メチオニンは、Ｍｅｔ又はＭ、フェニルアラニンは、Ｐｈｅ又はＦ、プロリンは、Ｐｒｏ又はＰ、セリンは、Ｓｅｒ又はＳ、スレオニンは、Ｔｈｒ又はＴ、トリプトファンは、Ｔｒｐ又はＷ、チロシンは、Ｔｙｒ又はＹ、バリンは、Ｖａｌ又はＶで表される。また、本明細書においては、特に明記されない限り、Ｌ体のアミノ酸を意味する。
【００１０】
本明細書において、アシル供与体とは、ペプチド結合の形成においてアシル基を提供する化合物をいい、アシル受容体とは、ペプチド結合の形成においてアシル基を受容する化合物をいう。例えば、下記の反応式（１）において、アシル供与体はアラニンであり、アシル受容体はグリシンである。
【００１１】
【化１】
【００１２】
本発明は、ペプチダーゼファミリーＭ２８に属し、逆反応活性を有する熱安定性アミノペプチダーゼ及び溶媒の存在下で、アシル供与体とアシル受容体とを反応させてジペプチド又はその誘導体の合成を行なうことを特徴とする、ジペプチド又はその誘導体の製造方法に関する。
【００１３】
前記特徴を有する本発明の製造方法によれば、前記アミノペプチダーゼが広い基質特異性と逆反応活性とを示すため、種々のアミノ酸等をアシル供与体又はアシル受容体として使用することにより、従来の酵素合成法では製造することが困難であったジペプチドを含む多種類のジペプチド又はその誘導体を製造し得るという優れた効果が奏される。
【００１４】
また、前記特徴を有する本発明の製造方法において、アシル供与体及びアシル受容体は化学的に保護される必要がないため、脱保護工程を要しない。従って、該製造方法によれば、ジペプチド又はその誘導体を簡便に製造し得るという優れた効果が奏される。
【００１５】
また、前記特徴を有する本発明の製造方法においては、アミノアシルアルキルエステルが優れたアシル受容体として機能し得る。従って、アシル受容体としてアミノアシルアルキルエステルを用いることにより、ジペプチド合成反応の速度及び／又は収率が顕著に向上するため、高い反応速度及び／又は高い収率でジペプチド誘導体を製造し得るという優れた効果が奏される。
【００１６】
また、前記特徴を有する本発明の製造方法によれば、アシル供与体とアシル受容体との組合せとして、アミノ酸とアミノアシルアルキルエステルとを用いた場合に、エステル結合のアミノ分解反応が実質的に生じないため、該アミノ酸由来のアミノ酸残基がＮ末端側、該アミノアシルアルキルエステル由来のアミノ酸残基がＣ末端側に存在するジペプチド誘導体が製造される。即ち、ジペプチド誘導体の構造を制御し得るという優れた効果が奏される。
【００１７】
また、前記特徴を有する本発明の製造方法によれば、熱安定性であるアミノペプチダーゼは高い有機溶媒耐性を示し得るため、有機溶媒の存在下で疎水性の高いペプチドを含むジペプチド又はその誘導体を効率的に製造し得るという優れた効果が奏される。
【００１８】
本発明において使用されるアミノペプチダーゼは、ペプチダーゼファミリーＭ２８に属し、逆反応活性を有する熱安定性アミノペプチダーゼである。
【００１９】
ペプチダーゼファミリーＭ２８に属するアミノペプチダーゼとは、活性部位に共触媒性の２つの亜鉛イオンを有するメタロペプチダーゼである（Ｒａｗｌｉｎｇｓら、１９９５、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２４８:１８３−２２８参照）。
【００２０】
本明細書において、熱安定性アミノペプチダーゼとは、至適温度でのアミノペプチダーゼ活性の５０％熱不活性化温度が６０℃以上であるアミノペプチダーゼをいう。なお、該熱安定性は、アミノペプチダーゼの活性測定に先立って、種々の温度で、３０分間、アミノペプチダーゼをインキュベーションし、得られたアミノペプチダーゼを用いて、活性を測定することにより評価され得る。
【００２１】
本明細書において、アミノペプチダーゼの活性測定、具体的には、加水分解活性の測定は、例えば、測定対象の酵素を含む反応液〔組成：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０〕に、最終濃度 ３．２ｍＭとなるように基質としてアミノアシル−ｐ−ニトロアニリドを添加し、３７℃で、４０５ｎｍでの連続光学測定を行なって、ｐ−ニトロアニリンの遊離を検出することにより行なわれ得る。酵素反応の初速度は、光学密度プロファイルの直線部分から決定され得る。なお、本明細書において、アミノペプチダーゼ活性の１単位は、１分あたり１μｍｏｌのｐ−ニトロアニリンを遊離させる酵素量として定義される。
【００２２】
また、本明細書中において、アミノペプチダーゼの逆反応とは、アミノ酸のカルボキシル基とアミノ酸又はアミノ酸誘導体のアミノ基とを脱水縮合し、ペプチド結合を形成する反応をいう。また、アミノペプチダーゼの逆反応活性（以後、「ジペプチド合成活性」と称することがある）は、例えば、後述の実施例の通り、測定対象のアミノペプチダーゼとアシル受容体とアシル供与体とを溶媒中でインキュベートして得られる試料を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）等で分析し、ジペプチド又はその誘導体の生成を検出することにより確認され得る。
【００２３】
本発明において使用されるアミノペプチダーゼとしては、例えば、ストレプトマイセス属、アエロモナス属、シュードモナス属、又はバシラス属等に属する微生物由来のアミノペプチダーゼ（例えば、シュードモナス アエルギノサ由来アミノペプチダーゼ、Ｃａｈａｎら、２００１、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６：４３６４５−４３６５２参照）が挙げられる。
【００２４】
さらに、本発明において使用されるアミノペプチダーゼの具体例としては、
（Ａ）配列番号：１に示されるアミノ酸配列において６３位のアラニン残基から３４５位のセリン残基までのアミノ酸配列（配列Ａ）からなるポリペプチド、
（Ａ’）配列Ａにおいて少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加を有するアミノ酸配列を含有し、かつアミノペプチダーゼの逆反応活性を有するポリペプチド、
（Ｂ）配列番号：３に示されるアミノ酸配列において４６位のアラニン残基から３２９位のスレオニン残基までのアミノ酸配列（配列Ｂ）からなるポリペプチド、（Ｂ’）配列Ｂにおいて少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加を有するアミノ酸配列を含有し、かつアミノペプチダーゼの逆反応活性を有するポリペプチド、
（Ｃ）配列番号：５に示されるアミノ酸配列において２６位のメチオニン残基から３２５位のグリシン残基までのアミノ酸配列（配列Ｃ）からなるポリペプチド、又は（Ｃ’）配列Ｃにおいて少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加を有するアミノ酸配列を含有し、かつアミノペプチダーゼの逆反応活性を有するポリペプチド、
が挙げられる。
【００２５】
なお、本明細書中において、「少なくとも１つ」とは、１若しくは複数個、又はそれ以上、好ましくは１個又は数個をいう。
【００２６】
前記のアミノペプチダーゼ（Ａ）としては、例えば、ストレプトマイセス属に属する微生物等により産生されるアミノペプチダーゼが挙げられ、具体的には、ストレプトマイセス セプタタス ＴＨ−２より産生されるアミノペプチダーゼ（以下、「ＳＳＡＰ」と称することがある）が挙げられる。なお、ストレプトマイセス セプタタス ＴＨ−２は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ． ＴＨ−２と命名・表示され、寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１７３２９（寄託日：１９９９年３月２４日）として、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１−１）に寄託されている。
【００２７】
前記ストレプトマイセス セプタタス ＴＨ−２より産生されるアミノペプチダーゼは、特に限定されないが、例えば、４℃で、下記ステップ：
− 前記ストレプトマイセス セプタタス ＴＨ−２を、培地〔組成：０．５重量％ グルコース、０．５重量％ クエン酸、０．２重量％ Ｋ2ＨＰＯ4、０．０５重量％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．５重量％ ポリペプトン及び０．５重量％ 酵母エキス〕中２８℃で７２時間、定常期になるまで、好気的に培養し、
− 得られた培養物を、４００００×ｇ、１０分間の遠心分離若しくは濾紙で濾過して、培地濾過物（上清）を得、
− 得られた培地濾過物を、撹拌しながら、６５℃で３０分間加熱し、生じた沈殿を除去し、
− 得られた溶液を、緩衝液Ａ〔組成：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０〕に対して透析し、
− 透析後の溶液を緩衝液Ａで平衡化した陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、具体的には、ＤＥＡＥ−セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）カラム（内径１．６×１０ｃｍ、２０ｍＬ）に負荷し、結合したタンパク質を、緩衝液０−０．５Ｍ ＮａＣｌのリニアグラジェントで平均流速２ｍＬ／分で溶出させ、
− 得られた溶出画分のうち、高比活性を示す画分を集め、８０％ 飽和硫酸アンモニウムによる塩析でタンパク質を沈殿させ、
− 得られた沈殿物を、２００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液Ａに溶解させ、得られた溶液を、２００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液Ａに対して透析し、
− 透析後に得られた溶液を、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー、具体的には、商品名：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ゲル濾過カラム〔ファルマシア バイオテック（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）社製、内径１．６×６０ｃｍ、６０ｍＬ〕に負荷し、２００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液Ａにより、平均流速１ｍＬ／分でタンパク質を溶出させること
を行なうことにより得られ得る。
【００２８】
前記のアミノペプチダーゼ（Ｂ）としては、例えば、ストレプトマイセス属に属する微生物等により産生されるアミノペプチダーゼが挙げられ、具体的には、ストレプトマイセス グリセウスより産生されるアミノペプチダーゼ（以下、「ＳＧＡＰ」と称することがある）が挙げられる。ＳＧＡＰは、特に限定されないが、例えば、Ｓｐｕｎｇｉｎら、１９８９、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８３：４７１−４７７に記載される方法により得られ得る。
【００２９】
前記のアミノペプチダーゼ（Ｃ）としては、例えば、アエロモナス属に属する微生物等により産生されるアミノペプチダーゼが挙げられ、具体的には、アエロモナス プロテオライティカより産生されるアミノペプチダーゼ（以下、「ＡＡＰ」と称することがある）が挙げられる。ＡＡＰは、特に限定されないが、例えば、Ｐｒｅｓｃｏｔｔら、１９７６、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４５Ｂ：５３０−５４３に記載される方法により得られ得る。
【００３０】
アミノペプチダーゼ（Ａ’）は、好ましくはアミノペプチダーゼ（Ａ）と、同等又はそれ以上のアミノペプチダーゼ活性及びその逆反応活性を示す。例えば、アミノペプチダーゼ（Ａ）とアミノペプチダーゼ（Ａ’）とを同条件のアミノペプチダーゼ活性測定及びジペプチド合成反応に供した場合、アミノペプチダーゼ（Ａ’）は、アミノペプチダーゼ（Ａ）の１０％以上、好ましくは５０％以上のアミノペプチダーゼ活性及びその逆反応活性を示す。
【００３１】
アミノペプチダーゼ（Ｂ’）とアミノペプチダーゼ（Ｂ）との酵素活性の関係、及びアミノペプチダーゼ（Ｃ’）とアミノペプチダーゼ（Ｃ）との酵素活性の関係もまた、前記のアミノペプチダーゼ（Ａ’）とアミノペプチダーゼ（Ａ）との酵素活性の関係と同様であれば良い。
【００３２】
また、前記アミノペプチダーゼ（Ａ）〜（Ｃ’）は、該酵素をコードする核酸を公知の遺伝子工学的手法を用いて、大腸菌、放線菌、酵母、カビ、植物細胞、動物細胞等の当該分野で公知の宿主に導入し、発現させることによっても得られ得る。かかる場合、アミノペプチダーゼ（Ａ）〜（Ｃ’）は、精製を容易にするための因子、例えば、細胞外分泌シグナル、融合パートナー（Ｈｉｓタグ、ｐｅｌＢシグナル等）等を付加されてもよい。また、アミノペプチダーゼ（Ａ）〜（Ｃ’）は、シグナル配列やプロペプチド配列を伴った状態で発現されてもよい。
【００３３】
アミノペプチダーゼ（Ａ）又は（Ａ’）をコードする核酸としては、例えば、
（ｉ）配列番号：１に示されるアミノ酸配列において６３位のアラニン残基から３４５位のセリン残基までのアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｉｉ）配列番号：２に示される塩基配列において塩基番号１８７〜１０３８までの塩基配列、
（ｉｉｉ）前記（ｉ）又は（ｉｉ）の塩基配列において、少なくとも１つのヌクレオチド残基の置換、欠失、付加又は挿入を有する塩基配列であり、かつコードされるポリペプチドが、アミノペプチダーゼの逆反応活性を示すものである塩基配列、又は
（ｉｖ）前記（ｉ）又は（ｉｉ）の塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸の塩基配列であり、かつコードされるポリペプチドが、アミノペプチダーゼの逆反応活性を示すものである塩基配列
等が挙げられる。
【００３４】
前記（ｉｖ）において、「ストリンジェントな条件」とは、中ストリンジェンシーの条件、好ましくは、高ストリンジェンシーの条件をいい、具体的には、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー発行、ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第３版及び第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ ｅｄ．（２００１年発行）、２ｎｄ ｅｄ．（１９８９年発行））等に記載された条件が挙げられる。具体的には、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５％ ＳＤＳと５×デンハルトと１００ｍｇ／ｍＬ ニシン精子ＤＮＡとを含む溶液中、プローブとともに６５℃で一晩インキュベーションするという条件が挙げられる。
【００３５】
なお、前記「ストリンジェントな条件」下におけるハイブリダイゼーションにおいて、より精度を高める観点から、より低イオン強度、例えば、５×ＳＳＣ、よりストリンジェントには、２×ＳＳＣ等の条件及び／又はより高温、例えば、前記（ｉ）又は（ｉｉ）の塩基配列を含有した核酸のＴｍ値（８０〜９０）の２５℃下、よりストリンジェントには、２２℃下、さらにストリンジェントには、２０℃下、よりさらにストリンジェントには、１０℃下、特にストリンジェントには、５℃下等の条件下でのハイブリダイゼーション；より厳しい洗浄条件、具体的には、低イオン強度の緩衝液、例えば、６×ＳＳＣ、よりストリンジェントには、５×ＳＳＣ、よりストリンジェントには、２×ＳＳＣ等を使用し、より高い温度、例えば、前記Ｔｍ値の５５℃下、よりストリンジェントには、５０℃下、さらにストリンジェントには、３０℃下、よりさらにストリンジェントには、２５℃下等の条件下での洗浄等を行なうことにより、例えば、前記配列番号：１のアミノ酸配列と少なくとも７５％、よりストリンジェントには、８０％以上、さらにストリンジェントには、８５％以上、よりさらにストリンジェントには、９０％以上、より一層ストリンジェントには、９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸を得ることが可能になる。
【００３６】
アミノペプチダーゼ（Ｂ）又は（Ｂ’）をコードする核酸としては、例えば、
（ｖ）配列番号：３に示されるアミノ酸配列において４６位のアラニン残基から３２９位のスレオニン残基までのアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｖｉ）配列番号：４に示される塩基配列において塩基番号１３６〜９８７までの塩基配列、（ｖｉｉ）前記（ｖ）又は（ｖｉ）の塩基配列において、少なくとも１つのヌクレオチド残基の置換、欠失、付加又は挿入を有する塩基配列であり、かつコードされるポリペプチドが、アミノペプチダーゼの逆反応活性を示すものである塩基配列、又は
（ｖｉｉｉ）前記（ｖ）又は（ｖｉ）の塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸の塩基配列であり、かつコードされるポリペプチドが、アミノペプチダーゼの逆反応活性を示すものである塩基配列等が挙げられる。
【００３７】
アミノペプチダーゼ（Ｃ）又は（Ｃ’）をコードする核酸としては、例えば、
（ｉｘ）配列番号：５に示されるアミノ酸配列において２６位のメチオニン残基から３２５位のグリシン残基までのアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｘ）配列番号：６に示される塩基配列において塩基番号７６〜９７５までの塩基配列、
（ｘｉ）前記（ｉｘ）又は（ｘ）の塩基配列において、少なくとも１つのヌクレオチド残基の置換、欠失、付加又は挿入を有する塩基配列であり、かつコードされるポリペプチドが、アミノペプチダーゼの逆反応活性を示すものである塩基配列、又は
（ｘｉｉ）前記（ｉｘ）又は（ｘ）の塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸の塩基配列であり、かつコードされるポリペプチドが、アミノペプチダーゼの逆反応活性を示すものである塩基配列
等が挙げられる。
【００３８】
なお、前記（ｖｉｉｉ）及び（ｘｉｉ）における「ストリンジェントな条件」とは、前記（ｉｖ）における「ストリンジェントな条件」と同様である。
【００３９】
また、前記核酸は、例えば、ストレプトマイセス セプタタス ＴＨ−２、ストレプトマイセス グリセウス、アエロモナス プロテオライティカのゲノムＤＮＡから、慣用の手段、例えば、適切なプローブを用いたハイブリダイゼーション、適切なプライマー対を用いたＰＣＲ等により単離することができる。
【００４０】
前記アミノペプチダーゼは、精製物、粗精製物、未精製物のいずれであってもよい。従って、例えば、前記核酸を導入された組換え体、ストレプトマイセス セプタタス ＴＨ−２、ストレプトマイセス グリセウス、アエロモナス プロテオライティカ等の前記アミノペプチダーゼを産生する細胞、該細胞破砕物、該細胞抽出物、培養上清等もまた、ジペプチド合成活性を示す限り、アミノペプチダーゼとして使用され得る。
【００４１】
前記アミノペプチダーゼは、広い基質特異性を示すため、多種類のアシル供与体及びアシル受容体を基質としてジペプチドを合成し得る。従って、本発明の製造方法によれば、多種類のジペプチド又はその誘導体を製造することができる。
【００４２】
本発明において使用されるアシル供与体としては、前記アミノペプチダーゼのジペプチド合成反応におけるアシル供与体として機能する限り、特に制限はない。該アシル供与体としては、例えば、天然型アミノ酸又は非天然型アミノ酸が使用され得る。
【００４３】
アシル供与体として機能する天然型アミノ酸としては、高い反応速度を得る観点から、好ましくは、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、及びＴｙｒからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくは、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、及びＡｓｐからなる群より選択されるアミノ酸が使用され得る。
【００４４】
アシル供与体として機能する非天然型アミノ酸としては、例えば、アミノ酸側鎖が修飾されたアミノ酸、アミノ酸側鎖が他のアミノ酸と結合したアミノ酸等が使用され得る。かかる非天然型アミノ酸の具体例としては、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、パラヒドロキシフェニルグリシン、ホモフェニルアラニン、ホモアルギニン、ノルバリン、ノルロイシン、アゼチジン、アジリジン、シスチン、ε‐オリゴリジン、等が挙げられる。
【００４５】
本発明において使用されるアシル受容体としては、前記アミノペプチダーゼのジペプチド合成反応におけるアシル受容体として機能する限り、特に制限はない。該アシル受容体としては、例えば、天然型アミノ酸、非天然型アミノ酸、アミノ酸誘導体が使用され得る。
【００４６】
アシル受容体として機能する天然型アミノ酸及び非天然型アミノ酸としては、アシル供与体として例示したものと同様のものが使用され得る。
【００４７】
アシル受容体として機能するアミノ酸誘導体としては、例えば、アミノアシルメチルエステル、アミノアシルエチルエステル等のアミノアシルアルキルエステル及びアミノアシルアミドが好ましく使用され得る。
【００４８】
中でも、ジペプチド合成反応の高速化及び高収率化の観点から、好ましくはアミノアシルアルキルエステル及びアミノアシルアミド、より好ましくはアミノアシルメチルエステルがアシル受容体として使用され得る。アミノアシルアルキルエステルとしては、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、及びＬｙｓからなる群より選択されるアミノ酸のアミノアシルアルキルエステルが好ましく、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、及びＡｓｎからなる群より選択されるアミノ酸のアミノアシルアルキルエステルがより好ましい。
【００４９】
前記アミノペプチダーゼによるジペプチド合成反応においては、基質としてアミノ酸とアミノアシルアルキルエステルとを使用すると、エステル結合のアミノ分解反応が実質的に生じないため、アミノ酸由来のアミノ酸残基がジペプチドのＮ末端側、アミノアシルアルキルエステル由来のアミノ酸残基がＣ末端側に配置される。従って、本発明の製造方法によれば、ジペプチド誘導体の配列を制御し得るという優れた効果が奏される。
【００５０】
本発明において使用される溶媒としては、水、有機溶媒、又はこれらの混合溶媒が挙げられる。生成したジペプチド等が、前記アミノペプチダーゼのアミノペプチダーゼ活性によって消化されるのを防ぎ、かつ、前記アミノペプチダーゼのジペプチド合成活性を十分に発揮させる観点から、水と有機溶媒との混合溶媒が好ましく使用される。
【００５１】
前記の有機溶媒としては、ジペプチド合成反応が進行する限り、特に制限はなく、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン等の水混和性有機溶媒が挙げられる。中でも、ジペプチド合成効率の観点から、メタノールが好ましい。
【００５２】
溶媒として、水と水混和性有機溶媒との混合溶媒を使用する場合、生成したジペプチド等が、前記アミノペプチダーゼのアミノペプチダーゼ活性によって消化されるのを防ぎ、かつ、前記アミノペプチダーゼのジペプチド合成活性を十分に発揮させる観点から、水と水混和性有機溶媒の混合比（水：水混和性有機溶媒；体積比）は、好ましくは０．２：９９．８〜３０：７０、より好ましくは１：９９〜２０：８０、さらに好ましくは２：９８〜１０：９０である。
【００５３】
本発明の製造方法においては、前記アミノペプチダーゼ及び溶媒の存在下で、前記アシル供与体とアシル受容体とを反応させてジペプチド又はその誘導体の合成を行なう。
【００５４】
反応させる条件としては、前記アミノペプチダーゼが発揮するジペプチド合成活性により、ジペプチド合成反応が進行する限り、特に制限はないが、好ましくは下記の条件が挙げられる。
【００５５】
反応温度としては、高い反応速度を得る観点から、好ましくは４〜６０℃、より好ましくは１８〜５５℃である。
【００５６】
反応時間としては、トリペプチド等の副生成物の合成を低減する観点から、好ましくは２０分〜５０時間、より好ましくは３０分〜２０時間、さらに好ましくは1時間〜６時間である。
【００５７】
反応ｐＨとしては、好ましくは６．０〜９．０、より好ましくは７．５〜８．５である。
【００５８】
使用する酵素量としては、アミノペプチダーゼ活性として、好ましくは１〜３００ｕｎｉｔ／ｍＬ、より好ましくは２〜１００ｕｎｉｔ／ｍＬ、さらに好ましくは５〜３０ｕｎｉｔ／ｍＬである。
【００５９】
反応時のアシル供与体又はアシル受容体の濃度としては、高い反応速度を得る観点から、天然型又は非天然型アミノ酸を使用する場合は、好ましくは１〜１００ｍＭ、より好ましくは５〜５０ｍＭ、さらに好ましくは６〜３５ｍＭである。また、アミノアシルアルキルエステルを使用する場合の濃度としては、同様の観点から、好ましくは１０〜２００ｍＭ、より好ましくは４０〜１６０ｍＭ、さらに好ましくは５０〜１００ｍＭである。
【００６０】
上記の本発明の製造方法により、多種類のジペプチド又はその誘導体が簡便に製造され得る。また、得られたジペプチド又はその誘導体は、当該分野で公知の方法により回収され、精製され得る。
【実施例】
【００６１】
以下、実施例等により本発明を詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例により限定されるものではない。本明細書において、特に明記しない限り、各種操作は、モレキュラークローニング ア ラボラトリー マニュアル第２版〔ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、（１９８９年）〕に従って行なった。また、遊離のアミノ酸はナカライテスク（株）から購入した。アミノアシルメチルエステル（−ＯＭｅ）及びＬｅｕ ｐ-ニトロアニリドは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（株）から購入した。ジペプチド標品及びトリペプチド標品は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（株）及びＢａｃｈｅｍ社から購入した。
【００６２】
［アミノペプチダーゼ ＳＳＡＰの調製］
ＳＳＡＰの発現プラスミドであるｐＥＴ−ＳＳＡＰ：Ｈｉｓを以下のようにして構築した。即ち、ＳＳＡＰをコードする遺伝子配列の情報を元に２種のプライマー（５’−ＧＣＧＣＣＧＧＡＴＣＣＧＡＣＧＴＧＧＣＧＣＴＧＣＣＧＣＴＣＡ−３’（配列番号７）及び、５’−ＣＡＡＧＧＧＣＣＡＣＧＴＣＡＧＧＡＣＣＡＴＧＧＣＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号８））を設計した。次にストレプトマイセス セプタタス ＴＨ−２のゲノムＤＮＡを鋳型とし、前記プライマーとＧＣ−Ｒｉｃｈ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を用いて、目的とする断片をＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ条件は、９６℃３分 １サイクル、９６℃３０秒と６０℃３０秒と７２℃１分とを１サイクルとして３５サイクル、７２℃７分 １サイクルであった。得られたＰＣＲ増幅断片についてｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いたＴＡクローニングを行ない、次いで、シークエンスにより変異が入っていないことを確認した。得られたプラスミドから、ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩ消化及びゲルカット抽出によりインサート断片を取り出し、同様にＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩ消化した発現用ベクター：ｐＥＴ−ＫｍＳ２（Ｍｉｓｈｉｍａら、１９９７、Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１３:８６４−８６８）とライゲーションすることでＳＳＡＰの発現プラスミドｐＥＴ−ＳＳＡＰ：Ｈｉｓを得た。
【００６３】
得られた発現プラスミドｐＥＴ−ＳＳＡＰ：Ｈｉｓを用いて、大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３を形質転換した。
【００６４】
ｐＥＴ−ＳＳＡＰ：Ｈｉｓを保持するＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ＤＥ３を、５０μg／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地〔１％ ＮａＣｌ、１％ ポリペプトン、０．５％ 酵母エキス〕３ｍＬ中、３７℃で１２時間培養した。次いで、得られた菌体を合成培地〔０．５％ ＫＨ２ＰＯ４、０．５％ Ｋ２ＨＰＯ４、０．４４％ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．３％ (ＮＨ４)２ＳＯ４、０．５％ グルコース、０．３％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．００４％ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．００４％ ＣａＣｌ２、０．０００２９％ ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０００３％ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．００００３６％ Ｎａ２ＭｏＯ・２Ｈ２Ｏ、０．００１％ Ｈ３ＢＯ３、０．００１％ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２％ グリセロール、５０ μg/ｍＬ カナマイシン；重量％〕１００ｍＬに播種し、２２℃で１２時間培養した。終濃度が０．５ｍＭとなるようにイソプロピル−β−チオガラクトピラノシドを加え、同じ条件でさらに２４時間培養を続けた。得られた培養物を遠心分離（7,000×ｇ、10分）して菌体を除去し、粗酵素液として培養上清を得た。
【００６５】
得られた培養上清に、８０％ 飽和硫酸アンモニウムとなるように、硫酸アンモニウムを添加して、タンパク質を沈殿させた。得られた沈殿物を１ｍＭ ＣａＣｌ２を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に溶解し、必要により攪拌しながら６５℃で３０分間加熱した。次いで、遠心分離により、沈殿物を除去し、得られた溶液を２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析した。透析後の溶液を、予め２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したヒドロキシアパタイトカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）に通し、得られた溶液を緩衝液Ａ（組成：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０）に対して透析した。透析後の溶液を、予め緩衝液Ａで平衡化した商品名：Ｖｉｖａｐｕｒｅ−Ｑ ｓｐｉｎ−ｃｏｌｕｍｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に負荷し、結合したタンパク質を２００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液Ａによって溶出させた。得られた溶出液を緩衝液Ａに対して透析することにより、精製ＳＳＡＰを得た。
【００６６】
［アミノペプチダーゼ活性測定］
アミノペプチダーゼ活性測定は、３７℃で、測定対象の酵素を含む１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０） ０．９ｍＬに、基質として３２ｍＭ Ｌｅｕ−ｐＮＡを０．１ｍＬ加え、p-ニトロアニリンの遊離による吸光度の毎分上昇度を４０５ｎｍで測定することにより行なった。酵素反応は、基質の添加により開始させ、吸光度の測定には、Ｕ２８０００ 分光光度計（日立製作所製）を用いた。初速度は、光学密度プロファイルの直線部分から決定した。
【００６７】
［薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によるペプチドの分析］
３μＬの試料をＴＬＣプレート（６０ Ｆ２５４、Ｍｅｒｃｋ社製）にスポットし、ｎ−ブタノール／酢酸／水（７：２：１、ｖ／ｖ）を展開液として約1時間展開させた。アセトン／水（１：１、ｖ／ｖ）に溶解した２．５％ニンヒドリン溶液を噴霧してジペプチド、アミノアシルメチルエステル及びアミノ酸等を検出した。
【００６８】
［逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるペプチドの分析］
Ｃ１８逆相カラム（Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｃ １８、（株）ＹＭＣ製）を装備したＨＰＬＣ装置（Ｗａｔｅｒｓ ２６９０ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ、Ｗａｔｅｒｓ（株）製）を用いてペプチドの定量を行なった。具体的には、フィルター（型番：マイショリディスクＨ−３−２、東ソー社製）でろ過された１０μＬの試料を上記カラムに負荷し、溶媒Ａ：溶媒Ｂ＝７５：２５から溶媒Ａ：溶媒Ｂ＝０：１００への１５分以内の勾配で、流速１ｍＬ／分で溶出した。検出は、Ｗａｔｅｒｓ ４９０Ｅ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｍｕｌｔｉｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ｗａｔｅｒｓ（株）製）を用いて、２１０及び２８０ｎｍの吸光度を測定することによって行なった。溶媒Ａとして、２０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４を、溶媒Ｂとして、１００％メタノールを用いた。得られたデータをＭｉｌｌｅｎｎｉｕｍ ３２コンピュータプログラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）を用いて処理した。基質のピーク面積の減少と生成物のピーク面積の増加とに基づき、ジペプチド合成の初速度及びアミノ酸からジペプチドへの変換速度を測定した。
【００６９】
［マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型−質量分析（MALDI-TOF/MS分析）によるペプチドの分析］
溶媒Ａを超純水に変えた以外は上記「ＨＰＬＣによるペプチド分析」と同様にして、ＨＰＬＣによってペプチドを分離、脱塩した。得られたペプチドをロータリーエバポレーター（型番：ＣＣ１０５、トミー（株）製）を用いて、２時間真空乾燥した。得られた乾燥物を試料として、Ａｕｔｏｆｌｅｘ ＩＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ製）を用いて、ペプチドの質量分析を行なった。ＭＡＬＤＩマトリクスとして、２，５−ジヒドロキシ−安息香酸を用いた。
【００７０】
実験例１ ジペプチドの合成及びＴＬＣ分析
前記のように調製した精製ＳＳＡＰを終濃度１ｍｇ／ｍＬとなるよう10ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）に溶解してＳＳＡＰ溶液（アミノペプチダーゼ活性： 約１００ ｕｎｉｔ／ｍＬ）を得た。得られたＳＳＡＰ溶液 ２０μＬを必要に応じて所定量のアミノ酸を含有する１０μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁した。得られた懸濁液を１．５ｍＬ容マイクロ試験管に入れ、液体窒素に浸漬して凍結させた後、凍結乾燥した。得られた凍結乾燥物を必要に応じて所定量のアミノアシルメチルエステルを含有する１００μＬの９８％メタノールに加えて表１記載の反応混合物１〜３を調製し、２５℃で反応を開始させた。反応混合物を３００ｒｐｍで振盪しながら、反応時間を４時間とした後、１．９ｍＬの１００％メタノールを反応混合物に加えることによって反応を停止させた。また、ＳＳＡＰを含まない反応混合物３を前記と同様に調製し、反応を行なった。反応後の反応混合物１〜３について、上記の通りＴＬＣ分析を行なった。ＴＬＣ分析の結果を図１に示す。なお、凍結乾燥後のＳＳＡＰのアミノペプチダーゼ活性は、凍結乾燥前の約７８％であった。
【００７１】
【表１】
【００７２】
図１に示されるとおり、反応混合物１ではＰｈｅＰｈｅジペプチド標品と同じ位置に生成物のものと推測されるスポットが確認された。このことから、反応混合物１ではＰｈｅＰｈｅジペプチドが合成されたことがわかる。また、反応混合物２ではＰｈｅＰｈｅジペプチド標品と少し異なる位置に生成物のものと推測されるスポットが確認された。反応混合物２では基質としてＰｈｅとＰｈｅ−ＯＭｅとを用いていることから、該スポットはＰｈｅＰｈｅ−ＯＭｅジペプチド誘導体のものであると推測された。一方、ＳＳＡＰが添加されていない反応混合物３では、新たなスポットは確認されなかった。
【００７３】
実験例２ ジペプチドの合成及びＨＰＬＣ分析
実験例１と同様にして表２の反応混合物を調製し、反応時間を８時間にする以外は実験例１と同様にして反応を行なった。反応後の反応混合物４〜５について、上記の通りＨＰＬＣ分析を行なった。ＨＰＬＣ分析の結果を図２に示す。
【００７４】
【表２】
【００７５】
図２に示されるとおり、反応混合物４では、ＰｈｅＰｈｅジペプチド標品と同じ溶出時間に生成物のものと推測されるピークが検出された。このことから、反応混合物４においては、ＰｈｅＰｈｅジペプチドが合成されたことがわかる。また、反応混合物５ではＰｈｅＰｈｅジペプチド標品及びＰｈｅＰｈｅＰｈｅトリペプチド標品と異なる溶出時間に生成物のものと推測されるピークが検出された。
【００７６】
反応混合物５において生成物のものと推測されるピークを分取して吸引乾燥した。得られた乾燥試料に、１μg／ｍＬのＳＳＡＰを含有する１００μＬの０．１Ｍ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ８．０）又は１００μＬの０．１Ｎ水酸化ナトリウムを添加して溶解させた。次いで、溶解した試料を室温で３０分間放置することにより、それぞれＳＳＡＰ処理又はアルカリ処理を行なった。前記処理により得られた試料について、上記の通りＨＰＬＣ分析を行なった。ＨＰＬＣ分析の結果を図３に示す。
【００７７】
図３に示されるとおり、アルカリ処理により得られた試料では、ＰｈｅＰｈｅジペプチド標品と同じ溶出時間にピークが検出された。また、ＳＳＡＰ処理により得られた試料では、Ｐｈｅ標品及びＰｈｅ−ＯＭｅ標品と同じ溶出時間にピークが検出された。このことから、反応混合物５においては、ＰｈｅＰｈｅ−ＯＭｅジペプチド誘導体が合成されたことがわかる。
【００７８】
さらに、分取された反応混合物５の生成物について、MALDI-TOF/MS分析を行ない、生成物のモル質量を測定した。結果を図４に示す。
【００７９】
図４に示されるとおり、生成物の実測質量は３２７．２であり、ＰｈｅＰｈｅ−ＯＭｅジペプチド誘導体の理論値とほぼ同じであった。
【００８０】
実験例３ ジペプチド配列の検討
実験例１と同様にして表３の反応混合物を調製し、実験例１と同様にして反応を行なった。反応後の反応混合物６及び７について、上記の通りＨＰＬＣ分析を行なった。反応混合物６のＨＰＬＣ分析の結果を図５Ａのパネル（ａ）に示し、反応混合物７のＨＰＬＣ分析の結果を図５Ｂのパネル（ａ）に示す。
【００８１】
【表３】
【００８２】
図５Ａのパネル（ａ）及び図５Ｂのパネル（ａ）に示されるとおり、反応混合物６及び７では生成物のものと推測されるピークが検出された。該ピークを分取して、MALDI-TOF/MS分析を行ない、生成物のモル質量を測定した。結果を図６に示す。
【００８３】
図６Ａに示されるとおり、反応混合物６の生成物の実測質量は３６６．３であり、ＰｈｅＴｒｐ−ＯＭｅジペプチド誘導体の理論値とほぼ同じであった。また、図６Ｂに示されるとおり、反応混合物７の生成物の実測質量は３６６．３であり、ＴｒｐＰｈｅ−ＯＭｅジペプチド誘導体の理論値とほぼ同じであった。
【００８４】
さらに、前記で分取したピークのそれぞれについて、実験例２と同様にしてＳＳＡＰ処理を行なった。次いで、ＳＳＡＰ処理により得られた試料について、上記の通りＨＰＬＣ分析を行なった。反応混合物６の生成物の分析結果を図５Ａのパネル（ｂ）に示し、反応混合物７の生成物の分析結果を図５Ｂのパネル（ｂ）に示す。
【００８５】
図５Ａのパネル（ｂ）に示されるとおり、反応混合物６の生成物のＳＳＡＰ処理により得られた試料では、Ｐｈｅ標品及びＴｒｐ−ＯＭｅ標品と同じ溶出時間にピークが検出された。このことから、反応混合物６においては、ＰｈｅＴｒｐ−ＯＭｅジペプチド誘導体が合成されたことがわかる。また、図５Ｂのパネル（ｂ）に示されるとおり、反応混合物７の生成物のＳＳＡＰ処理により得られた試料では、Ｔｒｐ標品及びＰｈｅ−ＯＭｅ標品と同じ溶出時間にピークが検出された。このことから、反応混合物７においては、ＴｒｐＰｈｅ−ＯＭｅジペプチド誘導体が合成されたことがわかる。
【００８６】
このことから、ジペプチド合成反応の基質として、アミノ酸とアミノアシルアルキルエステルを使用した場合、アミノ酸がアシル供与体として機能し、アミノアシルアルキルエステルがアシル受容体として機能することがわかる。即ち、本発明のジペプチドの製造方法によれば、ジペプチド誘導体の配列を制御し得ることがわかる。
【００８７】
実験例４ 生理活性を示すジペプチドの合成
実験例１と同様にして表４の反応混合物を調製し、反応時間を１２時間にする以外は実験例１と同様にして反応を行なった。反応後の反応混合物８〜１５について、上記の通りＨＰＬＣ分析を行なった。ＨＰＬＣ分析の結果を図７Ａ〜Ｄに示す。
【００８８】
【表４】
【００８９】
図７Ａ〜Ｄに示されるとおり、ＳＳＡＰを含有する反応混合物では、生成物のものと推測されるピークが検出された。該ピークを分取して、MALDI-TOF/MS分析を行ない、生成物のモル質量を測定した。結果を図７Ａ’〜Ｄ’に示す。
【００９０】
図７Ａ’に示されるとおり、反応混合物８の生成物の実測質量は、２９５．２であり、ＡｓｐＰｈｅ−ＯＭｅジペプチド誘導体の理論値とほぼ同じであった。また、図７Ｂ’に示されるとおり、反応混合物１０の生成物の実測質量は、２９５．２であり、ＶａｌＴｙｒ−ＯＭｅジペプチド誘導体の理論値とほぼ同じであった。また、図７Ｃ’に示されるとおり、反応混合物１２の生成物の実測質量は、２６７．２であり、ＡｌａＴｙｒ−ＯＭｅジペプチド誘導体の理論値とほぼ同じであった。また、図７Ｄ’に示されるとおり、反応混合物１４の生成物の実測質量は、２８３．２であり、ＡｌａＤＯＰＡ−ＯＭｅジペプチド誘導体の理論値とほぼ同じであった。
【００９１】
なお、反応混合物８、１０、１２及び１４においては、アミノ酸からジペプチド誘導体への変換率は２５％以上、中でも反応混合物１０における変換率は３７％以上の高効率であった。
【００９２】
実験例５ ＳＧＡＰ、ＡＡＰを用いたジペプチド合成
ＳＧＡＰ（リコンビナント大腸菌から菌体外に生産させ、精製）及びＡＡＰ（シグマより購入）を終濃度１ｍｇ／ｍＬとなるよう10ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）に溶解して酵素溶液（アミノペプチダーゼ活性： １００〜３００ ｕｎｉｔ／ｍＬ）を得た。得られた各酵素溶液２０μＬを必要に応じて所定量のアミノ酸を含有する１０μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁した。得られた懸濁液を１．５ｍＬ容マイクロ試験管に入れ、液体窒素に浸漬して凍結させた後、凍結乾燥した。得られた凍結乾燥物を必要に応じて所定量のアミノアシルメチルエステルを含有する１００μＬの９８％メタノールに加えて表５記載の反応混合物１７〜１８を調製し、２５℃で反応を開始させた。反応混合物を３００ｒｐｍで振盪しながら、反応時間を４時間とした後、１．９ｍＬの１００％メタノールを反応混合物に加えることによって反応を停止させた。また、酵素を含まない反応混合物１６を前記と同様に調製し、反応を行なった。反応後の反応混合物１６〜１８について、上記の通りＴＬＣ分析を行なった。ＴＬＣ分析の結果を図８に示す。
【００９３】
【表５】
【００９４】
図８に示されるとおり、反応混合物１７と１８ではＰｈｅＰｈｅ−ＯＭｅジペプチド誘導体のスポットが確認された。一方、酵素が添加されていない反応混合物１６では、新たなスポットは確認されなかった。
【００９５】
以上より、本発明の製造方法により、従来の製造方法では合成することが困難であった生理活性を示すジペプチドを含む多種類のジペプチド又はその誘導体が製造され得ることがわかる。
【００９６】
参考例１ 熱安定性測定
酵素（ＳＳＡＰ、ＳＧＡＰ、ＡＡＰ）を終濃度２μｇ／ｍＬとなるよう10ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）（ＳＧＡＰの場合は10ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ １ｍＭ 塩化カルシウム）に溶解して酵素溶液を得た。得られた酵素溶液 ２００μＬを５０℃から９０℃の範囲で３０分間加熱処理し、処理後即座に氷中に移し冷却した。加熱処理後の酵素液１００μＬを使用し、前記に示したアミノペプチダーゼ活性測定法の通りに熱処理後の酵素の残存活性を測定した。また、熱処理を行っていない酵素の活性値を１００として処理後の酵素の相対活性値を求め、各酵素の５０％熱不活性温度を測定した。結果を表６に示す。
【００９７】
【表６】
【００９８】
表６に示されるように、上記参考例で使用したアミノペプチダーゼは、いずれも熱安定性であった。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明の製造方法により、種々のジペプチド又はジペプチド誘導体を効率的に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】図１は、ＴＬＣ分析の結果を示す。
【図２】図２は、ＨＰＬＣ分析の結果を示す。
【図３】図３は、ＨＰＬＣ分析の結果を示す。
【図４】図４は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ分析の結果を示す。
【図５】図中、Ａは、反応混合物６についてのＨＰＬＣ分析の結果を示し、Ｂは、反応混合物７についてのＨＰＬＣ分析の結果を示す。
【図６】図中、Ａは、反応混合物６の生成物についてのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ分析の結果を示し、Ｂは、反応混合物７の生成物についてのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ分析の結果を示す。
【図７】図中、Ａの上段が反応混合物８、下段が反応混合物９、Ｂの上段が反応混合物１０、下段が反応混合物１１、Ｃの上段が反応混合物１２、下段が反応混合物１３、Ｄの上段が反応混合物１４、下段が反応混合物１５についてのＨＰＬＣ分析の結果を示す。また、Ａ’〜Ｄ’は、それぞれ反応混合物８、１０、１２及び１４の生成物についてのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ分析の結果を示す。
【図８】図８は、ＴＬＣ分析の結果を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１０１】
配列番号：７は、ＳＳＡＰ遺伝子増幅用のＰＣＲプライマーである。
【０１０２】
配列番号：８は、ＳＳＡＰ遺伝子増幅用のＰＣＲプライマーである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジペプチド又はその誘導体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生理活性を示す様々なジペプチドが、食品や医薬品等の原料素材として注目を集めている。かかるジペプチドとしては、例えば、強力な甘味料であるアスパルチル−フェニルアラニンメチルエステル（ＡｓｐＰｈｅ−ＯＭｅ）、アンジオテンシンＩ変換酵素活性を阻害するバリル−チロシン（ＶａｌＴｙｒ）等が挙げられる。また、アラニル−チロシン（ＡｌａＴｙｒ）は、水への溶解度が低いチロシンの有力な供給源になる。
【０００３】
ジペプチドの製造方法は、化学合成法と酵素合成法とに大別され、酵素合成法は、温和な反応条件での合成が可能であること、副生成物が少ないこと等の利点を有する。酵素合成法としては、例えば、サーモリシン等のメタロペプチダーゼ、アミノアシル-ｔＲＮＡ合成酵素、アラニンリガーゼ、又は非リボソームペプチド合成酵素を用いる方法等が既に開発されている。中でも、エステル結合のアミノ分解反応を含む酵素合成法（特許文献１）は、サーモリシン等を用いる酵素合成法と異なり、基質として化学的Ｎ-保護アミノ酸を必要とせず、遊離アミノ酸とアミノアシルメチルエステルとからジペプチドを合成し得る。
【特許文献１】国際公開第０３／０１０３０７号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、従来使用されている酵素の中には、コストの観点から、食品、医薬品等の工業的生産における使用に適さないものがある。さらに、従来の酵素合成法では、使用する酵素の基質特異性に偏りがあるため、前記ＡｌａＴｙｒ、ＶａｌＴｙｒ等の生理活性を示すジペプチドを工業的レベルで合成することができない。従って、これらの生理活性を示すジペプチドを含む多種類のジペプチドを簡便に合成し得る新しい酵素合成法の開発が求められている。
【０００５】
本発明の課題は、多種類のジペプチド又はその誘導体を製造すること、ジペプチド又はその誘導体を簡便に製造すること、高い反応速度でジペプチド又はその誘導体を製造すること、高い収率でジペプチド又はその誘導体を製造すること、ジペプチド誘導体の構造を制御すること、疎水性の高いアミノ酸を含むジペプチド又はその誘導体を製造すること等の少なくとも1つを可能にするジペプチド又はその誘導体の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、これまでジペプチド合成活性を有することが知られていなかった特定の性質を有する酵素を用いることにより、上記課題が解決され得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明の要旨は、ペプチダーゼファミリーＭ２８に属し、逆反応活性を有する熱安定性アミノペプチダーゼ及び溶媒の存在下で、アシル供与体とアシル受容体とを反応させてジペプチド又はその誘導体の合成を行なう、ジペプチド又はその誘導体の製造方法に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、多種類のジペプチド又はその誘導体を製造すること、ジペプチド又はその誘導体を簡便に製造すること、高い反応速度でジペプチド又はその誘導体を製造すること、高い収率でジペプチド又はその誘導体を製造すること、ジペプチド誘導体の構造を制御すること、疎水性の高いアミノ酸を含むジペプチド又はその誘導体を製造すること等の少なくとも1つが可能になるという優れた効果が奏され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本明細書において、アミノ酸の表記を、３文字又は１文字で表記する場合がある。すなわち、アラニンは、Ａｌａ又はＡ、アルギニンは、Ａｒｇ又はＲ、アスパラギンは、Ａｓｎ又はＮ、アスパラギン酸は、Ａｓｐ又はＤ、システインは、Ｃｙｓ又はＣ、グルタミン酸は、Ｇｌｕ又はＥ、グルタミンは、Ｇｌｎ又はＱ、グリシンは、Ｇｌｙ又はＧ、ヒスチジンは、Ｈｉｓ又はＨ、イソロイシンは、Ｉｌｅ又はＩ、ロイシンは、Ｌｅｕ又はＬ、リジンは、Ｌｙｓ又はＫ、メチオニンは、Ｍｅｔ又はＭ、フェニルアラニンは、Ｐｈｅ又はＦ、プロリンは、Ｐｒｏ又はＰ、セリンは、Ｓｅｒ又はＳ、スレオニンは、Ｔｈｒ又はＴ、トリプトファンは、Ｔｒｐ又はＷ、チロシンは、Ｔｙｒ又はＹ、バリンは、Ｖａｌ又はＶで表される。また、本明細書においては、特に明記されない限り、Ｌ体のアミノ酸を意味する。
【００１０】
本明細書において、アシル供与体とは、ペプチド結合の形成においてアシル基を提供する化合物をいい、アシル受容体とは、ペプチド結合の形成においてアシル基を受容する化合物をいう。例えば、下記の反応式（１）において、アシル供与体はアラニンであり、アシル受容体はグリシンである。
【００１１】
【化１】
【００１２】
本発明は、ペプチダーゼファミリーＭ２８に属し、逆反応活性を有する熱安定性アミノペプチダーゼ及び溶媒の存在下で、アシル供与体とアシル受容体とを反応させてジペプチド又はその誘導体の合成を行なうことを特徴とする、ジペプチド又はその誘導体の製造方法に関する。
【００１３】
前記特徴を有する本発明の製造方法によれば、前記アミノペプチダーゼが広い基質特異性と逆反応活性とを示すため、種々のアミノ酸等をアシル供与体又はアシル受容体として使用することにより、従来の酵素合成法では製造することが困難であったジペプチドを含む多種類のジペプチド又はその誘導体を製造し得るという優れた効果が奏される。
【００１４】
また、前記特徴を有する本発明の製造方法において、アシル供与体及びアシル受容体は化学的に保護される必要がないため、脱保護工程を要しない。従って、該製造方法によれば、ジペプチド又はその誘導体を簡便に製造し得るという優れた効果が奏される。
【００１５】
また、前記特徴を有する本発明の製造方法においては、アミノアシルアルキルエステルが優れたアシル受容体として機能し得る。従って、アシル受容体としてアミノアシルアルキルエステルを用いることにより、ジペプチド合成反応の速度及び／又は収率が顕著に向上するため、高い反応速度及び／又は高い収率でジペプチド誘導体を製造し得るという優れた効果が奏される。
【００１６】
また、前記特徴を有する本発明の製造方法によれば、アシル供与体とアシル受容体との組合せとして、アミノ酸とアミノアシルアルキルエステルとを用いた場合に、エステル結合のアミノ分解反応が実質的に生じないため、該アミノ酸由来のアミノ酸残基がＮ末端側、該アミノアシルアルキルエステル由来のアミノ酸残基がＣ末端側に存在するジペプチド誘導体が製造される。即ち、ジペプチド誘導体の構造を制御し得るという優れた効果が奏される。
【００１７】
また、前記特徴を有する本発明の製造方法によれば、熱安定性であるアミノペプチダーゼは高い有機溶媒耐性を示し得るため、有機溶媒の存在下で疎水性の高いペプチドを含むジペプチド又はその誘導体を効率的に製造し得るという優れた効果が奏される。
【００１８】
本発明において使用されるアミノペプチダーゼは、ペプチダーゼファミリーＭ２８に属し、逆反応活性を有する熱安定性アミノペプチダーゼである。
【００１９】
ペプチダーゼファミリーＭ２８に属するアミノペプチダーゼとは、活性部位に共触媒性の２つの亜鉛イオンを有するメタロペプチダーゼである（Ｒａｗｌｉｎｇｓら、１９９５、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２４８:１８３−２２８参照）。
【００２０】
本明細書において、熱安定性アミノペプチダーゼとは、至適温度でのアミノペプチダーゼ活性の５０％熱不活性化温度が６０℃以上であるアミノペプチダーゼをいう。なお、該熱安定性は、アミノペプチダーゼの活性測定に先立って、種々の温度で、３０分間、アミノペプチダーゼをインキュベーションし、得られたアミノペプチダーゼを用いて、活性を測定することにより評価され得る。
【００２１】
本明細書において、アミノペプチダーゼの活性測定、具体的には、加水分解活性の測定は、例えば、測定対象の酵素を含む反応液〔組成：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０〕に、最終濃度 ３．２ｍＭとなるように基質としてアミノアシル−ｐ−ニトロアニリドを添加し、３７℃で、４０５ｎｍでの連続光学測定を行なって、ｐ−ニトロアニリンの遊離を検出することにより行なわれ得る。酵素反応の初速度は、光学密度プロファイルの直線部分から決定され得る。なお、本明細書において、アミノペプチダーゼ活性の１単位は、１分あたり１μｍｏｌのｐ−ニトロアニリンを遊離させる酵素量として定義される。
【００２２】
また、本明細書中において、アミノペプチダーゼの逆反応とは、アミノ酸のカルボキシル基とアミノ酸又はアミノ酸誘導体のアミノ基とを脱水縮合し、ペプチド結合を形成する反応をいう。また、アミノペプチダーゼの逆反応活性（以後、「ジペプチド合成活性」と称することがある）は、例えば、後述の実施例の通り、測定対象のアミノペプチダーゼとアシル受容体とアシル供与体とを溶媒中でインキュベートして得られる試料を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）等で分析し、ジペプチド又はその誘導体の生成を検出することにより確認され得る。
【００２３】
本発明において使用されるアミノペプチダーゼとしては、例えば、ストレプトマイセス属、アエロモナス属、シュードモナス属、又はバシラス属等に属する微生物由来のアミノペプチダーゼ（例えば、シュードモナス アエルギノサ由来アミノペプチダーゼ、Ｃａｈａｎら、２００１、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６：４３６４５−４３６５２参照）が挙げられる。
【００２４】
さらに、本発明において使用されるアミノペプチダーゼの具体例としては、
（Ａ）配列番号：１に示されるアミノ酸配列において６３位のアラニン残基から３４５位のセリン残基までのアミノ酸配列（配列Ａ）からなるポリペプチド、
（Ａ’）配列Ａにおいて少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加を有するアミノ酸配列を含有し、かつアミノペプチダーゼの逆反応活性を有するポリペプチド、
（Ｂ）配列番号：３に示されるアミノ酸配列において４６位のアラニン残基から３２９位のスレオニン残基までのアミノ酸配列（配列Ｂ）からなるポリペプチド、（Ｂ’）配列Ｂにおいて少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加を有するアミノ酸配列を含有し、かつアミノペプチダーゼの逆反応活性を有するポリペプチド、
（Ｃ）配列番号：５に示されるアミノ酸配列において２６位のメチオニン残基から３２５位のグリシン残基までのアミノ酸配列（配列Ｃ）からなるポリペプチド、又は（Ｃ’）配列Ｃにおいて少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加を有するアミノ酸配列を含有し、かつアミノペプチダーゼの逆反応活性を有するポリペプチド、
が挙げられる。
【００２５】
なお、本明細書中において、「少なくとも１つ」とは、１若しくは複数個、又はそれ以上、好ましくは１個又は数個をいう。
【００２６】
前記のアミノペプチダーゼ（Ａ）としては、例えば、ストレプトマイセス属に属する微生物等により産生されるアミノペプチダーゼが挙げられ、具体的には、ストレプトマイセス セプタタス ＴＨ−２より産生されるアミノペプチダーゼ（以下、「ＳＳＡＰ」と称することがある）が挙げられる。なお、ストレプトマイセス セプタタス ＴＨ−２は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ． ＴＨ−２と命名・表示され、寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１７３２９（寄託日：１９９９年３月２４日）として、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１−１）に寄託されている。
【００２７】
前記ストレプトマイセス セプタタス ＴＨ−２より産生されるアミノペプチダーゼは、特に限定されないが、例えば、４℃で、下記ステップ：
− 前記ストレプトマイセス セプタタス ＴＨ−２を、培地〔組成：０．５重量％ グルコース、０．５重量％ クエン酸、０．２重量％ Ｋ2ＨＰＯ4、０．０５重量％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．５重量％ ポリペプトン及び０．５重量％ 酵母エキス〕中２８℃で７２時間、定常期になるまで、好気的に培養し、
− 得られた培養物を、４００００×ｇ、１０分間の遠心分離若しくは濾紙で濾過して、培地濾過物（上清）を得、
− 得られた培地濾過物を、撹拌しながら、６５℃で３０分間加熱し、生じた沈殿を除去し、
− 得られた溶液を、緩衝液Ａ〔組成：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０〕に対して透析し、
− 透析後の溶液を緩衝液Ａで平衡化した陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、具体的には、ＤＥＡＥ−セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）カラム（内径１．６×１０ｃｍ、２０ｍＬ）に負荷し、結合したタンパク質を、緩衝液０−０．５Ｍ ＮａＣｌのリニアグラジェントで平均流速２ｍＬ／分で溶出させ、
− 得られた溶出画分のうち、高比活性を示す画分を集め、８０％ 飽和硫酸アンモニウムによる塩析でタンパク質を沈殿させ、
− 得られた沈殿物を、２００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液Ａに溶解させ、得られた溶液を、２００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液Ａに対して透析し、
− 透析後に得られた溶液を、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー、具体的には、商品名：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ゲル濾過カラム〔ファルマシア バイオテック（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）社製、内径１．６×６０ｃｍ、６０ｍＬ〕に負荷し、２００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液Ａにより、平均流速１ｍＬ／分でタンパク質を溶出させること
を行なうことにより得られ得る。
【００２８】
前記のアミノペプチダーゼ（Ｂ）としては、例えば、ストレプトマイセス属に属する微生物等により産生されるアミノペプチダーゼが挙げられ、具体的には、ストレプトマイセス グリセウスより産生されるアミノペプチダーゼ（以下、「ＳＧＡＰ」と称することがある）が挙げられる。ＳＧＡＰは、特に限定されないが、例えば、Ｓｐｕｎｇｉｎら、１９８９、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８３：４７１−４７７に記載される方法により得られ得る。
【００２９】
前記のアミノペプチダーゼ（Ｃ）としては、例えば、アエロモナス属に属する微生物等により産生されるアミノペプチダーゼが挙げられ、具体的には、アエロモナス プロテオライティカより産生されるアミノペプチダーゼ（以下、「ＡＡＰ」と称することがある）が挙げられる。ＡＡＰは、特に限定されないが、例えば、Ｐｒｅｓｃｏｔｔら、１９７６、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４５Ｂ：５３０−５４３に記載される方法により得られ得る。
【００３０】
アミノペプチダーゼ（Ａ’）は、好ましくはアミノペプチダーゼ（Ａ）と、同等又はそれ以上のアミノペプチダーゼ活性及びその逆反応活性を示す。例えば、アミノペプチダーゼ（Ａ）とアミノペプチダーゼ（Ａ’）とを同条件のアミノペプチダーゼ活性測定及びジペプチド合成反応に供した場合、アミノペプチダーゼ（Ａ’）は、アミノペプチダーゼ（Ａ）の１０％以上、好ましくは５０％以上のアミノペプチダーゼ活性及びその逆反応活性を示す。
【００３１】
アミノペプチダーゼ（Ｂ’）とアミノペプチダーゼ（Ｂ）との酵素活性の関係、及びアミノペプチダーゼ（Ｃ’）とアミノペプチダーゼ（Ｃ）との酵素活性の関係もまた、前記のアミノペプチダーゼ（Ａ’）とアミノペプチダーゼ（Ａ）との酵素活性の関係と同様であれば良い。
【００３２】
また、前記アミノペプチダーゼ（Ａ）〜（Ｃ’）は、該酵素をコードする核酸を公知の遺伝子工学的手法を用いて、大腸菌、放線菌、酵母、カビ、植物細胞、動物細胞等の当該分野で公知の宿主に導入し、発現させることによっても得られ得る。かかる場合、アミノペプチダーゼ（Ａ）〜（Ｃ’）は、精製を容易にするための因子、例えば、細胞外分泌シグナル、融合パートナー（Ｈｉｓタグ、ｐｅｌＢシグナル等）等を付加されてもよい。また、アミノペプチダーゼ（Ａ）〜（Ｃ’）は、シグナル配列やプロペプチド配列を伴った状態で発現されてもよい。
【００３３】
アミノペプチダーゼ（Ａ）又は（Ａ’）をコードする核酸としては、例えば、
（ｉ）配列番号：１に示されるアミノ酸配列において６３位のアラニン残基から３４５位のセリン残基までのアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｉｉ）配列番号：２に示される塩基配列において塩基番号１８７〜１０３８までの塩基配列、
（ｉｉｉ）前記（ｉ）又は（ｉｉ）の塩基配列において、少なくとも１つのヌクレオチド残基の置換、欠失、付加又は挿入を有する塩基配列であり、かつコードされるポリペプチドが、アミノペプチダーゼの逆反応活性を示すものである塩基配列、又は
（ｉｖ）前記（ｉ）又は（ｉｉ）の塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸の塩基配列であり、かつコードされるポリペプチドが、アミノペプチダーゼの逆反応活性を示すものである塩基配列
等が挙げられる。
【００３４】
前記（ｉｖ）において、「ストリンジェントな条件」とは、中ストリンジェンシーの条件、好ましくは、高ストリンジェンシーの条件をいい、具体的には、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー発行、ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第３版及び第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ ｅｄ．（２００１年発行）、２ｎｄ ｅｄ．（１９８９年発行））等に記載された条件が挙げられる。具体的には、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５％ ＳＤＳと５×デンハルトと１００ｍｇ／ｍＬ ニシン精子ＤＮＡとを含む溶液中、プローブとともに６５℃で一晩インキュベーションするという条件が挙げられる。
【００３５】
なお、前記「ストリンジェントな条件」下におけるハイブリダイゼーションにおいて、より精度を高める観点から、より低イオン強度、例えば、５×ＳＳＣ、よりストリンジェントには、２×ＳＳＣ等の条件及び／又はより高温、例えば、前記（ｉ）又は（ｉｉ）の塩基配列を含有した核酸のＴｍ値（８０〜９０）の２５℃下、よりストリンジェントには、２２℃下、さらにストリンジェントには、２０℃下、よりさらにストリンジェントには、１０℃下、特にストリンジェントには、５℃下等の条件下でのハイブリダイゼーション；より厳しい洗浄条件、具体的には、低イオン強度の緩衝液、例えば、６×ＳＳＣ、よりストリンジェントには、５×ＳＳＣ、よりストリンジェントには、２×ＳＳＣ等を使用し、より高い温度、例えば、前記Ｔｍ値の５５℃下、よりストリンジェントには、５０℃下、さらにストリンジェントには、３０℃下、よりさらにストリンジェントには、２５℃下等の条件下での洗浄等を行なうことにより、例えば、前記配列番号：１のアミノ酸配列と少なくとも７５％、よりストリンジェントには、８０％以上、さらにストリンジェントには、８５％以上、よりさらにストリンジェントには、９０％以上、より一層ストリンジェントには、９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸を得ることが可能になる。
【００３６】
アミノペプチダーゼ（Ｂ）又は（Ｂ’）をコードする核酸としては、例えば、
（ｖ）配列番号：３に示されるアミノ酸配列において４６位のアラニン残基から３２９位のスレオニン残基までのアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｖｉ）配列番号：４に示される塩基配列において塩基番号１３６〜９８７までの塩基配列、（ｖｉｉ）前記（ｖ）又は（ｖｉ）の塩基配列において、少なくとも１つのヌクレオチド残基の置換、欠失、付加又は挿入を有する塩基配列であり、かつコードされるポリペプチドが、アミノペプチダーゼの逆反応活性を示すものである塩基配列、又は
（ｖｉｉｉ）前記（ｖ）又は（ｖｉ）の塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸の塩基配列であり、かつコードされるポリペプチドが、アミノペプチダーゼの逆反応活性を示すものである塩基配列等が挙げられる。
【００３７】
アミノペプチダーゼ（Ｃ）又は（Ｃ’）をコードする核酸としては、例えば、
（ｉｘ）配列番号：５に示されるアミノ酸配列において２６位のメチオニン残基から３２５位のグリシン残基までのアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｘ）配列番号：６に示される塩基配列において塩基番号７６〜９７５までの塩基配列、
（ｘｉ）前記（ｉｘ）又は（ｘ）の塩基配列において、少なくとも１つのヌクレオチド残基の置換、欠失、付加又は挿入を有する塩基配列であり、かつコードされるポリペプチドが、アミノペプチダーゼの逆反応活性を示すものである塩基配列、又は
（ｘｉｉ）前記（ｉｘ）又は（ｘ）の塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸の塩基配列であり、かつコードされるポリペプチドが、アミノペプチダーゼの逆反応活性を示すものである塩基配列
等が挙げられる。
【００３８】
なお、前記（ｖｉｉｉ）及び（ｘｉｉ）における「ストリンジェントな条件」とは、前記（ｉｖ）における「ストリンジェントな条件」と同様である。
【００３９】
また、前記核酸は、例えば、ストレプトマイセス セプタタス ＴＨ−２、ストレプトマイセス グリセウス、アエロモナス プロテオライティカのゲノムＤＮＡから、慣用の手段、例えば、適切なプローブを用いたハイブリダイゼーション、適切なプライマー対を用いたＰＣＲ等により単離することができる。
【００４０】
前記アミノペプチダーゼは、精製物、粗精製物、未精製物のいずれであってもよい。従って、例えば、前記核酸を導入された組換え体、ストレプトマイセス セプタタス ＴＨ−２、ストレプトマイセス グリセウス、アエロモナス プロテオライティカ等の前記アミノペプチダーゼを産生する細胞、該細胞破砕物、該細胞抽出物、培養上清等もまた、ジペプチド合成活性を示す限り、アミノペプチダーゼとして使用され得る。
【００４１】
前記アミノペプチダーゼは、広い基質特異性を示すため、多種類のアシル供与体及びアシル受容体を基質としてジペプチドを合成し得る。従って、本発明の製造方法によれば、多種類のジペプチド又はその誘導体を製造することができる。
【００４２】
本発明において使用されるアシル供与体としては、前記アミノペプチダーゼのジペプチド合成反応におけるアシル供与体として機能する限り、特に制限はない。該アシル供与体としては、例えば、天然型アミノ酸又は非天然型アミノ酸が使用され得る。
【００４３】
アシル供与体として機能する天然型アミノ酸としては、高い反応速度を得る観点から、好ましくは、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、及びＴｙｒからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくは、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、及びＡｓｐからなる群より選択されるアミノ酸が使用され得る。
【００４４】
アシル供与体として機能する非天然型アミノ酸としては、例えば、アミノ酸側鎖が修飾されたアミノ酸、アミノ酸側鎖が他のアミノ酸と結合したアミノ酸等が使用され得る。かかる非天然型アミノ酸の具体例としては、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、パラヒドロキシフェニルグリシン、ホモフェニルアラニン、ホモアルギニン、ノルバリン、ノルロイシン、アゼチジン、アジリジン、シスチン、ε‐オリゴリジン、等が挙げられる。
【００４５】
本発明において使用されるアシル受容体としては、前記アミノペプチダーゼのジペプチド合成反応におけるアシル受容体として機能する限り、特に制限はない。該アシル受容体としては、例えば、天然型アミノ酸、非天然型アミノ酸、アミノ酸誘導体が使用され得る。
【００４６】
アシル受容体として機能する天然型アミノ酸及び非天然型アミノ酸としては、アシル供与体として例示したものと同様のものが使用され得る。
【００４７】
アシル受容体として機能するアミノ酸誘導体としては、例えば、アミノアシルメチルエステル、アミノアシルエチルエステル等のアミノアシルアルキルエステル及びアミノアシルアミドが好ましく使用され得る。
【００４８】
中でも、ジペプチド合成反応の高速化及び高収率化の観点から、好ましくはアミノアシルアルキルエステル及びアミノアシルアミド、より好ましくはアミノアシルメチルエステルがアシル受容体として使用され得る。アミノアシルアルキルエステルとしては、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、及びＬｙｓからなる群より選択されるアミノ酸のアミノアシルアルキルエステルが好ましく、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、及びＡｓｎからなる群より選択されるアミノ酸のアミノアシルアルキルエステルがより好ましい。
【００４９】
前記アミノペプチダーゼによるジペプチド合成反応においては、基質としてアミノ酸とアミノアシルアルキルエステルとを使用すると、エステル結合のアミノ分解反応が実質的に生じないため、アミノ酸由来のアミノ酸残基がジペプチドのＮ末端側、アミノアシルアルキルエステル由来のアミノ酸残基がＣ末端側に配置される。従って、本発明の製造方法によれば、ジペプチド誘導体の配列を制御し得るという優れた効果が奏される。
【００５０】
本発明において使用される溶媒としては、水、有機溶媒、又はこれらの混合溶媒が挙げられる。生成したジペプチド等が、前記アミノペプチダーゼのアミノペプチダーゼ活性によって消化されるのを防ぎ、かつ、前記アミノペプチダーゼのジペプチド合成活性を十分に発揮させる観点から、水と有機溶媒との混合溶媒が好ましく使用される。
【００５１】
前記の有機溶媒としては、ジペプチド合成反応が進行する限り、特に制限はなく、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン等の水混和性有機溶媒が挙げられる。中でも、ジペプチド合成効率の観点から、メタノールが好ましい。
【００５２】
溶媒として、水と水混和性有機溶媒との混合溶媒を使用する場合、生成したジペプチド等が、前記アミノペプチダーゼのアミノペプチダーゼ活性によって消化されるのを防ぎ、かつ、前記アミノペプチダーゼのジペプチド合成活性を十分に発揮させる観点から、水と水混和性有機溶媒の混合比（水：水混和性有機溶媒；体積比）は、好ましくは０．２：９９．８〜３０：７０、より好ましくは１：９９〜２０：８０、さらに好ましくは２：９８〜１０：９０である。
【００５３】
本発明の製造方法においては、前記アミノペプチダーゼ及び溶媒の存在下で、前記アシル供与体とアシル受容体とを反応させてジペプチド又はその誘導体の合成を行なう。
【００５４】
反応させる条件としては、前記アミノペプチダーゼが発揮するジペプチド合成活性により、ジペプチド合成反応が進行する限り、特に制限はないが、好ましくは下記の条件が挙げられる。
【００５５】
反応温度としては、高い反応速度を得る観点から、好ましくは４〜６０℃、より好ましくは１８〜５５℃である。
【００５６】
反応時間としては、トリペプチド等の副生成物の合成を低減する観点から、好ましくは２０分〜５０時間、より好ましくは３０分〜２０時間、さらに好ましくは1時間〜６時間である。
【００５７】
反応ｐＨとしては、好ましくは６．０〜９．０、より好ましくは７．５〜８．５である。
【００５８】
使用する酵素量としては、アミノペプチダーゼ活性として、好ましくは１〜３００ｕｎｉｔ／ｍＬ、より好ましくは２〜１００ｕｎｉｔ／ｍＬ、さらに好ましくは５〜３０ｕｎｉｔ／ｍＬである。
【００５９】
反応時のアシル供与体又はアシル受容体の濃度としては、高い反応速度を得る観点から、天然型又は非天然型アミノ酸を使用する場合は、好ましくは１〜１００ｍＭ、より好ましくは５〜５０ｍＭ、さらに好ましくは６〜３５ｍＭである。また、アミノアシルアルキルエステルを使用する場合の濃度としては、同様の観点から、好ましくは１０〜２００ｍＭ、より好ましくは４０〜１６０ｍＭ、さらに好ましくは５０〜１００ｍＭである。
【００６０】
上記の本発明の製造方法により、多種類のジペプチド又はその誘導体が簡便に製造され得る。また、得られたジペプチド又はその誘導体は、当該分野で公知の方法により回収され、精製され得る。
【実施例】
【００６１】
以下、実施例等により本発明を詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例により限定されるものではない。本明細書において、特に明記しない限り、各種操作は、モレキュラークローニング ア ラボラトリー マニュアル第２版〔ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、（１９８９年）〕に従って行なった。また、遊離のアミノ酸はナカライテスク（株）から購入した。アミノアシルメチルエステル（−ＯＭｅ）及びＬｅｕ ｐ-ニトロアニリドは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（株）から購入した。ジペプチド標品及びトリペプチド標品は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（株）及びＢａｃｈｅｍ社から購入した。
【００６２】
［アミノペプチダーゼ ＳＳＡＰの調製］
ＳＳＡＰの発現プラスミドであるｐＥＴ−ＳＳＡＰ：Ｈｉｓを以下のようにして構築した。即ち、ＳＳＡＰをコードする遺伝子配列の情報を元に２種のプライマー（５’−ＧＣＧＣＣＧＧＡＴＣＣＧＡＣＧＴＧＧＣＧＣＴＧＣＣＧＣＴＣＡ−３’（配列番号７）及び、５’−ＣＡＡＧＧＧＣＣＡＣＧＴＣＡＧＧＡＣＣＡＴＧＧＣＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号８））を設計した。次にストレプトマイセス セプタタス ＴＨ−２のゲノムＤＮＡを鋳型とし、前記プライマーとＧＣ−Ｒｉｃｈ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を用いて、目的とする断片をＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ条件は、９６℃３分 １サイクル、９６℃３０秒と６０℃３０秒と７２℃１分とを１サイクルとして３５サイクル、７２℃７分 １サイクルであった。得られたＰＣＲ増幅断片についてｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いたＴＡクローニングを行ない、次いで、シークエンスにより変異が入っていないことを確認した。得られたプラスミドから、ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩ消化及びゲルカット抽出によりインサート断片を取り出し、同様にＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩ消化した発現用ベクター：ｐＥＴ−ＫｍＳ２（Ｍｉｓｈｉｍａら、１９９７、Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１３:８６４−８６８）とライゲーションすることでＳＳＡＰの発現プラスミドｐＥＴ−ＳＳＡＰ：Ｈｉｓを得た。
【００６３】
得られた発現プラスミドｐＥＴ−ＳＳＡＰ：Ｈｉｓを用いて、大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３を形質転換した。
【００６４】
ｐＥＴ−ＳＳＡＰ：Ｈｉｓを保持するＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ＤＥ３を、５０μg／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地〔１％ ＮａＣｌ、１％ ポリペプトン、０．５％ 酵母エキス〕３ｍＬ中、３７℃で１２時間培養した。次いで、得られた菌体を合成培地〔０．５％ ＫＨ２ＰＯ４、０．５％ Ｋ２ＨＰＯ４、０．４４％ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．３％ (ＮＨ４)２ＳＯ４、０．５％ グルコース、０．３％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．００４％ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．００４％ ＣａＣｌ２、０．０００２９％ ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０００３％ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．００００３６％ Ｎａ２ＭｏＯ・２Ｈ２Ｏ、０．００１％ Ｈ３ＢＯ３、０．００１％ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２％ グリセロール、５０ μg/ｍＬ カナマイシン；重量％〕１００ｍＬに播種し、２２℃で１２時間培養した。終濃度が０．５ｍＭとなるようにイソプロピル−β−チオガラクトピラノシドを加え、同じ条件でさらに２４時間培養を続けた。得られた培養物を遠心分離（7,000×ｇ、10分）して菌体を除去し、粗酵素液として培養上清を得た。
【００６５】
得られた培養上清に、８０％ 飽和硫酸アンモニウムとなるように、硫酸アンモニウムを添加して、タンパク質を沈殿させた。得られた沈殿物を１ｍＭ ＣａＣｌ２を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に溶解し、必要により攪拌しながら６５℃で３０分間加熱した。次いで、遠心分離により、沈殿物を除去し、得られた溶液を２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析した。透析後の溶液を、予め２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したヒドロキシアパタイトカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）に通し、得られた溶液を緩衝液Ａ（組成：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０）に対して透析した。透析後の溶液を、予め緩衝液Ａで平衡化した商品名：Ｖｉｖａｐｕｒｅ−Ｑ ｓｐｉｎ−ｃｏｌｕｍｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に負荷し、結合したタンパク質を２００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液Ａによって溶出させた。得られた溶出液を緩衝液Ａに対して透析することにより、精製ＳＳＡＰを得た。
【００６６】
［アミノペプチダーゼ活性測定］
アミノペプチダーゼ活性測定は、３７℃で、測定対象の酵素を含む１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０） ０．９ｍＬに、基質として３２ｍＭ Ｌｅｕ−ｐＮＡを０．１ｍＬ加え、p-ニトロアニリンの遊離による吸光度の毎分上昇度を４０５ｎｍで測定することにより行なった。酵素反応は、基質の添加により開始させ、吸光度の測定には、Ｕ２８０００ 分光光度計（日立製作所製）を用いた。初速度は、光学密度プロファイルの直線部分から決定した。
【００６７】
［薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によるペプチドの分析］
３μＬの試料をＴＬＣプレート（６０ Ｆ２５４、Ｍｅｒｃｋ社製）にスポットし、ｎ−ブタノール／酢酸／水（７：２：１、ｖ／ｖ）を展開液として約1時間展開させた。アセトン／水（１：１、ｖ／ｖ）に溶解した２．５％ニンヒドリン溶液を噴霧してジペプチド、アミノアシルメチルエステル及びアミノ酸等を検出した。
【００６８】
［逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるペプチドの分析］
Ｃ１８逆相カラム（Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｃ １８、（株）ＹＭＣ製）を装備したＨＰＬＣ装置（Ｗａｔｅｒｓ ２６９０ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ、Ｗａｔｅｒｓ（株）製）を用いてペプチドの定量を行なった。具体的には、フィルター（型番：マイショリディスクＨ−３−２、東ソー社製）でろ過された１０μＬの試料を上記カラムに負荷し、溶媒Ａ：溶媒Ｂ＝７５：２５から溶媒Ａ：溶媒Ｂ＝０：１００への１５分以内の勾配で、流速１ｍＬ／分で溶出した。検出は、Ｗａｔｅｒｓ ４９０Ｅ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｍｕｌｔｉｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ｗａｔｅｒｓ（株）製）を用いて、２１０及び２８０ｎｍの吸光度を測定することによって行なった。溶媒Ａとして、２０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４を、溶媒Ｂとして、１００％メタノールを用いた。得られたデータをＭｉｌｌｅｎｎｉｕｍ ３２コンピュータプログラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）を用いて処理した。基質のピーク面積の減少と生成物のピーク面積の増加とに基づき、ジペプチド合成の初速度及びアミノ酸からジペプチドへの変換速度を測定した。
【００６９】
［マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型−質量分析（MALDI-TOF/MS分析）によるペプチドの分析］
溶媒Ａを超純水に変えた以外は上記「ＨＰＬＣによるペプチド分析」と同様にして、ＨＰＬＣによってペプチドを分離、脱塩した。得られたペプチドをロータリーエバポレーター（型番：ＣＣ１０５、トミー（株）製）を用いて、２時間真空乾燥した。得られた乾燥物を試料として、Ａｕｔｏｆｌｅｘ ＩＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ製）を用いて、ペプチドの質量分析を行なった。ＭＡＬＤＩマトリクスとして、２，５−ジヒドロキシ−安息香酸を用いた。
【００７０】
実験例１ ジペプチドの合成及びＴＬＣ分析
前記のように調製した精製ＳＳＡＰを終濃度１ｍｇ／ｍＬとなるよう10ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）に溶解してＳＳＡＰ溶液（アミノペプチダーゼ活性： 約１００ ｕｎｉｔ／ｍＬ）を得た。得られたＳＳＡＰ溶液 ２０μＬを必要に応じて所定量のアミノ酸を含有する１０μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁した。得られた懸濁液を１．５ｍＬ容マイクロ試験管に入れ、液体窒素に浸漬して凍結させた後、凍結乾燥した。得られた凍結乾燥物を必要に応じて所定量のアミノアシルメチルエステルを含有する１００μＬの９８％メタノールに加えて表１記載の反応混合物１〜３を調製し、２５℃で反応を開始させた。反応混合物を３００ｒｐｍで振盪しながら、反応時間を４時間とした後、１．９ｍＬの１００％メタノールを反応混合物に加えることによって反応を停止させた。また、ＳＳＡＰを含まない反応混合物３を前記と同様に調製し、反応を行なった。反応後の反応混合物１〜３について、上記の通りＴＬＣ分析を行なった。ＴＬＣ分析の結果を図１に示す。なお、凍結乾燥後のＳＳＡＰのアミノペプチダーゼ活性は、凍結乾燥前の約７８％であった。
【００７１】
【表１】
【００７２】
図１に示されるとおり、反応混合物１ではＰｈｅＰｈｅジペプチド標品と同じ位置に生成物のものと推測されるスポットが確認された。このことから、反応混合物１ではＰｈｅＰｈｅジペプチドが合成されたことがわかる。また、反応混合物２ではＰｈｅＰｈｅジペプチド標品と少し異なる位置に生成物のものと推測されるスポットが確認された。反応混合物２では基質としてＰｈｅとＰｈｅ−ＯＭｅとを用いていることから、該スポットはＰｈｅＰｈｅ−ＯＭｅジペプチド誘導体のものであると推測された。一方、ＳＳＡＰが添加されていない反応混合物３では、新たなスポットは確認されなかった。
【００７３】
実験例２ ジペプチドの合成及びＨＰＬＣ分析
実験例１と同様にして表２の反応混合物を調製し、反応時間を８時間にする以外は実験例１と同様にして反応を行なった。反応後の反応混合物４〜５について、上記の通りＨＰＬＣ分析を行なった。ＨＰＬＣ分析の結果を図２に示す。
【００７４】
【表２】
【００７５】
図２に示されるとおり、反応混合物４では、ＰｈｅＰｈｅジペプチド標品と同じ溶出時間に生成物のものと推測されるピークが検出された。このことから、反応混合物４においては、ＰｈｅＰｈｅジペプチドが合成されたことがわかる。また、反応混合物５ではＰｈｅＰｈｅジペプチド標品及びＰｈｅＰｈｅＰｈｅトリペプチド標品と異なる溶出時間に生成物のものと推測されるピークが検出された。
【００７６】
反応混合物５において生成物のものと推測されるピークを分取して吸引乾燥した。得られた乾燥試料に、１μg／ｍＬのＳＳＡＰを含有する１００μＬの０．１Ｍ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ８．０）又は１００μＬの０．１Ｎ水酸化ナトリウムを添加して溶解させた。次いで、溶解した試料を室温で３０分間放置することにより、それぞれＳＳＡＰ処理又はアルカリ処理を行なった。前記処理により得られた試料について、上記の通りＨＰＬＣ分析を行なった。ＨＰＬＣ分析の結果を図３に示す。
【００７７】
図３に示されるとおり、アルカリ処理により得られた試料では、ＰｈｅＰｈｅジペプチド標品と同じ溶出時間にピークが検出された。また、ＳＳＡＰ処理により得られた試料では、Ｐｈｅ標品及びＰｈｅ−ＯＭｅ標品と同じ溶出時間にピークが検出された。このことから、反応混合物５においては、ＰｈｅＰｈｅ−ＯＭｅジペプチド誘導体が合成されたことがわかる。
【００７８】
さらに、分取された反応混合物５の生成物について、MALDI-TOF/MS分析を行ない、生成物のモル質量を測定した。結果を図４に示す。
【００７９】
図４に示されるとおり、生成物の実測質量は３２７．２であり、ＰｈｅＰｈｅ−ＯＭｅジペプチド誘導体の理論値とほぼ同じであった。
【００８０】
実験例３ ジペプチド配列の検討
実験例１と同様にして表３の反応混合物を調製し、実験例１と同様にして反応を行なった。反応後の反応混合物６及び７について、上記の通りＨＰＬＣ分析を行なった。反応混合物６のＨＰＬＣ分析の結果を図５Ａのパネル（ａ）に示し、反応混合物７のＨＰＬＣ分析の結果を図５Ｂのパネル（ａ）に示す。
【００８１】
【表３】
【００８２】
図５Ａのパネル（ａ）及び図５Ｂのパネル（ａ）に示されるとおり、反応混合物６及び７では生成物のものと推測されるピークが検出された。該ピークを分取して、MALDI-TOF/MS分析を行ない、生成物のモル質量を測定した。結果を図６に示す。
【００８３】
図６Ａに示されるとおり、反応混合物６の生成物の実測質量は３６６．３であり、ＰｈｅＴｒｐ−ＯＭｅジペプチド誘導体の理論値とほぼ同じであった。また、図６Ｂに示されるとおり、反応混合物７の生成物の実測質量は３６６．３であり、ＴｒｐＰｈｅ−ＯＭｅジペプチド誘導体の理論値とほぼ同じであった。
【００８４】
さらに、前記で分取したピークのそれぞれについて、実験例２と同様にしてＳＳＡＰ処理を行なった。次いで、ＳＳＡＰ処理により得られた試料について、上記の通りＨＰＬＣ分析を行なった。反応混合物６の生成物の分析結果を図５Ａのパネル（ｂ）に示し、反応混合物７の生成物の分析結果を図５Ｂのパネル（ｂ）に示す。
【００８５】
図５Ａのパネル（ｂ）に示されるとおり、反応混合物６の生成物のＳＳＡＰ処理により得られた試料では、Ｐｈｅ標品及びＴｒｐ−ＯＭｅ標品と同じ溶出時間にピークが検出された。このことから、反応混合物６においては、ＰｈｅＴｒｐ−ＯＭｅジペプチド誘導体が合成されたことがわかる。また、図５Ｂのパネル（ｂ）に示されるとおり、反応混合物７の生成物のＳＳＡＰ処理により得られた試料では、Ｔｒｐ標品及びＰｈｅ−ＯＭｅ標品と同じ溶出時間にピークが検出された。このことから、反応混合物７においては、ＴｒｐＰｈｅ−ＯＭｅジペプチド誘導体が合成されたことがわかる。
【００８６】
このことから、ジペプチド合成反応の基質として、アミノ酸とアミノアシルアルキルエステルを使用した場合、アミノ酸がアシル供与体として機能し、アミノアシルアルキルエステルがアシル受容体として機能することがわかる。即ち、本発明のジペプチドの製造方法によれば、ジペプチド誘導体の配列を制御し得ることがわかる。
【００８７】
実験例４ 生理活性を示すジペプチドの合成
実験例１と同様にして表４の反応混合物を調製し、反応時間を１２時間にする以外は実験例１と同様にして反応を行なった。反応後の反応混合物８〜１５について、上記の通りＨＰＬＣ分析を行なった。ＨＰＬＣ分析の結果を図７Ａ〜Ｄに示す。
【００８８】
【表４】
【００８９】
図７Ａ〜Ｄに示されるとおり、ＳＳＡＰを含有する反応混合物では、生成物のものと推測されるピークが検出された。該ピークを分取して、MALDI-TOF/MS分析を行ない、生成物のモル質量を測定した。結果を図７Ａ’〜Ｄ’に示す。
【００９０】
図７Ａ’に示されるとおり、反応混合物８の生成物の実測質量は、２９５．２であり、ＡｓｐＰｈｅ−ＯＭｅジペプチド誘導体の理論値とほぼ同じであった。また、図７Ｂ’に示されるとおり、反応混合物１０の生成物の実測質量は、２９５．２であり、ＶａｌＴｙｒ−ＯＭｅジペプチド誘導体の理論値とほぼ同じであった。また、図７Ｃ’に示されるとおり、反応混合物１２の生成物の実測質量は、２６７．２であり、ＡｌａＴｙｒ−ＯＭｅジペプチド誘導体の理論値とほぼ同じであった。また、図７Ｄ’に示されるとおり、反応混合物１４の生成物の実測質量は、２８３．２であり、ＡｌａＤＯＰＡ−ＯＭｅジペプチド誘導体の理論値とほぼ同じであった。
【００９１】
なお、反応混合物８、１０、１２及び１４においては、アミノ酸からジペプチド誘導体への変換率は２５％以上、中でも反応混合物１０における変換率は３７％以上の高効率であった。
【００９２】
実験例５ ＳＧＡＰ、ＡＡＰを用いたジペプチド合成
ＳＧＡＰ（リコンビナント大腸菌から菌体外に生産させ、精製）及びＡＡＰ（シグマより購入）を終濃度１ｍｇ／ｍＬとなるよう10ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）に溶解して酵素溶液（アミノペプチダーゼ活性： １００〜３００ ｕｎｉｔ／ｍＬ）を得た。得られた各酵素溶液２０μＬを必要に応じて所定量のアミノ酸を含有する１０μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁した。得られた懸濁液を１．５ｍＬ容マイクロ試験管に入れ、液体窒素に浸漬して凍結させた後、凍結乾燥した。得られた凍結乾燥物を必要に応じて所定量のアミノアシルメチルエステルを含有する１００μＬの９８％メタノールに加えて表５記載の反応混合物１７〜１８を調製し、２５℃で反応を開始させた。反応混合物を３００ｒｐｍで振盪しながら、反応時間を４時間とした後、１．９ｍＬの１００％メタノールを反応混合物に加えることによって反応を停止させた。また、酵素を含まない反応混合物１６を前記と同様に調製し、反応を行なった。反応後の反応混合物１６〜１８について、上記の通りＴＬＣ分析を行なった。ＴＬＣ分析の結果を図８に示す。
【００９３】
【表５】
【００９４】
図８に示されるとおり、反応混合物１７と１８ではＰｈｅＰｈｅ−ＯＭｅジペプチド誘導体のスポットが確認された。一方、酵素が添加されていない反応混合物１６では、新たなスポットは確認されなかった。
【００９５】
以上より、本発明の製造方法により、従来の製造方法では合成することが困難であった生理活性を示すジペプチドを含む多種類のジペプチド又はその誘導体が製造され得ることがわかる。
【００９６】
参考例１ 熱安定性測定
酵素（ＳＳＡＰ、ＳＧＡＰ、ＡＡＰ）を終濃度２μｇ／ｍＬとなるよう10ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）（ＳＧＡＰの場合は10ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ １ｍＭ 塩化カルシウム）に溶解して酵素溶液を得た。得られた酵素溶液 ２００μＬを５０℃から９０℃の範囲で３０分間加熱処理し、処理後即座に氷中に移し冷却した。加熱処理後の酵素液１００μＬを使用し、前記に示したアミノペプチダーゼ活性測定法の通りに熱処理後の酵素の残存活性を測定した。また、熱処理を行っていない酵素の活性値を１００として処理後の酵素の相対活性値を求め、各酵素の５０％熱不活性温度を測定した。結果を表６に示す。
【００９７】
【表６】
【００９８】
表６に示されるように、上記参考例で使用したアミノペプチダーゼは、いずれも熱安定性であった。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明の製造方法により、種々のジペプチド又はジペプチド誘導体を効率的に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】図１は、ＴＬＣ分析の結果を示す。
【図２】図２は、ＨＰＬＣ分析の結果を示す。
【図３】図３は、ＨＰＬＣ分析の結果を示す。
【図４】図４は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ分析の結果を示す。
【図５】図中、Ａは、反応混合物６についてのＨＰＬＣ分析の結果を示し、Ｂは、反応混合物７についてのＨＰＬＣ分析の結果を示す。
【図６】図中、Ａは、反応混合物６の生成物についてのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ分析の結果を示し、Ｂは、反応混合物７の生成物についてのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ分析の結果を示す。
【図７】図中、Ａの上段が反応混合物８、下段が反応混合物９、Ｂの上段が反応混合物１０、下段が反応混合物１１、Ｃの上段が反応混合物１２、下段が反応混合物１３、Ｄの上段が反応混合物１４、下段が反応混合物１５についてのＨＰＬＣ分析の結果を示す。また、Ａ’〜Ｄ’は、それぞれ反応混合物８、１０、１２及び１４の生成物についてのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ分析の結果を示す。
【図８】図８は、ＴＬＣ分析の結果を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１０１】
配列番号：７は、ＳＳＡＰ遺伝子増幅用のＰＣＲプライマーである。
【０１０２】
配列番号：８は、ＳＳＡＰ遺伝子増幅用のＰＣＲプライマーである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチダーゼファミリーＭ２８に属し、逆反応活性を有する熱安定性アミノペプチダーゼ及び溶媒の存在下で、アシル供与体とアシル受容体とを反応させてジペプチド又はその誘導体の合成を行なう、ジペプチド又はその誘導体の製造方法。
【請求項２】
アミノペプチダーゼが、ストレプトマイセス属、アエロモナス属、シュードモナス属又はバシラス属のいずれかに属する微生物由来である、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
アミノペプチダーゼが、
（Ａ）配列番号：１に示されるアミノ酸配列において６３位のアラニン残基から３４５位のセリン残基までのアミノ酸配列（配列Ａ）からなるポリペプチド、
（Ａ’）配列Ａにおいて少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加を有するアミノ酸配列を含有し、かつアミノペプチダーゼの逆反応活性を有するポリペプチド、
（Ｂ）配列番号：３に示されるアミノ酸配列において４６位のアラニン残基から３２９位のスレオニン残基までのアミノ酸配列（配列Ｂ）からなるポリペプチド、（Ｂ’）配列Ｂにおいて少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加を有するアミノ酸配列を含有し、かつアミノペプチダーゼの逆反応活性を有するポリペプチド、
（Ｃ）配列番号：５に示されるアミノ酸配列において２６位のメチオニン残基から３２５位のグリシン残基までのアミノ酸配列（配列Ｃ）からなるポリペプチド、又は（Ｃ’）配列Ｃにおいて少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加を有するアミノ酸配列を含有し、かつアミノペプチダーゼの逆反応活性を有するポリペプチド
である、請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項４】
溶媒が有機溶媒を含む、請求項１〜３いずれか記載の製造方法。
【請求項５】
アシル受容体がアミノアシルアルキルエステルである、請求項１〜４いずれか記載の製造方法。
【請求項１】
ペプチダーゼファミリーＭ２８に属し、逆反応活性を有する熱安定性アミノペプチダーゼ及び溶媒の存在下で、アシル供与体とアシル受容体とを反応させてジペプチド又はその誘導体の合成を行なう、ジペプチド又はその誘導体の製造方法。
【請求項２】
アミノペプチダーゼが、ストレプトマイセス属、アエロモナス属、シュードモナス属又はバシラス属のいずれかに属する微生物由来である、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
アミノペプチダーゼが、
（Ａ）配列番号：１に示されるアミノ酸配列において６３位のアラニン残基から３４５位のセリン残基までのアミノ酸配列（配列Ａ）からなるポリペプチド、
（Ａ’）配列Ａにおいて少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加を有するアミノ酸配列を含有し、かつアミノペプチダーゼの逆反応活性を有するポリペプチド、
（Ｂ）配列番号：３に示されるアミノ酸配列において４６位のアラニン残基から３２９位のスレオニン残基までのアミノ酸配列（配列Ｂ）からなるポリペプチド、（Ｂ’）配列Ｂにおいて少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加を有するアミノ酸配列を含有し、かつアミノペプチダーゼの逆反応活性を有するポリペプチド、
（Ｃ）配列番号：５に示されるアミノ酸配列において２６位のメチオニン残基から３２５位のグリシン残基までのアミノ酸配列（配列Ｃ）からなるポリペプチド、又は（Ｃ’）配列Ｃにおいて少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加を有するアミノ酸配列を含有し、かつアミノペプチダーゼの逆反応活性を有するポリペプチド
である、請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項４】
溶媒が有機溶媒を含む、請求項１〜３いずれか記載の製造方法。
【請求項５】
アシル受容体がアミノアシルアルキルエステルである、請求項１〜４いずれか記載の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００７−３１９０６３（Ｐ２００７−３１９０６３Ａ）
【公開日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１５１９０７（Ｐ２００６−１５１９０７）
【出願日】平成１８年５月３１日（２００６．５．３１）
【出願人】（５９１０６０９８０）岡山県 (96)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年５月３１日（２００６．５．３１）
【出願人】（５９１０６０９８０）岡山県 (96)
【Ｆターム（参考）】
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