ステロイドの高感度測定法
【課題】生体由来試料中に微量に含まれる水酸基を有するステロイドをＬＣ−ＭＳで測定する方法を提供すること。
【解決手段】生体由来試料中のステロイドの水酸基に下記式（Ｉ）で示される化合物を反応させてエステル誘導体とし、得られたエステル誘導体をＬＣ−ＭＳで測定する。
〔式中、Ｒは水素原子、アルキル基、アルコキシ基、アリルアルコキシ基、ジアルキルアミノ基、ニトロ基等を表し、ＣＯＸはカルボン酸又はその反応性官能基を表す。〕
【解決手段】生体由来試料中のステロイドの水酸基に下記式（Ｉ）で示される化合物を反応させてエステル誘導体とし、得られたエステル誘導体をＬＣ−ＭＳで測定する。
〔式中、Ｒは水素原子、アルキル基、アルコキシ基、アリルアルコキシ基、ジアルキルアミノ基、ニトロ基等を表し、ＣＯＸはカルボン酸又はその反応性官能基を表す。〕
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に含まれるステロイドを液体クロマトグラフィー−質量分析計（Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＬＣ−ＭＳ）を用いて測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ステロイドは生体内において極微量で強力な生理作用を示すため、その量を正確に把握することは、臨床診断及び病態解析の上で重要である。しかしながら、その量は微量（数ｐｇ／ｍＬ）である上、構造類似化合物も存在することから、測定には高感度、高特異性などが必要となる。
【０００３】
ステロイドの測定には、通常、ラジオイムノアッセイ（Ｒａｄｉｏ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＲＩＡ）、酵素免疫反応（Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＥＩＡ）、ガスクロマトグラフィー−質量分析計（Ｇａｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：GＣ−ＭＳ）、ＬＣ−ＭＳ等が用いられる。このうち、ＲＩＡ及びＥＩＡについては、それら免疫法の一般的な定量限界は１０ｐｇ／ｍＬであり、それに加えて試料中には測定対象化合物の構造類似体や性ホルモン結合蛋白も存在しているため、定量値が大きく変動する可能性がある。最近になって、シーアイエス ダイアグノスティックス社から、検出感度が１．４ｐｇ／ｍＬと極めて高感度のエストラジオールＲＩＡ測定キットが発売されたが、この測定キットはエストラジオール−１７β グルクロナイドとの交差性にあまり優れておらず、エストラジオール特異性に問題が残っている。
【０００４】
ＬＣ−ＭＳについては、測定対象を誘導体化して検出感度を高め、微量測定を行う方法が種々試みられている。例えば、非特許文献１〜４には、ステロイド化合物に電子親和性原子団を導入し、ＬＣと正イオンモードの大気圧化学イオン化ＭＳ（Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＡＰＣＩ／ＭＳ）を組み合わせて測定する方法（ＬＣ−ＡＰＣＩ／ＭＳ）が示されている。また、ステロイドのカルボニル基をｐ−トルエンスルホンヒドラゾン化してＬＣ−ＭＳ測定する方法（非特許文献５参照）、ステロイドのアルコール性水酸基をＮ−アルキルピリジニウム化してＬＣとエレクトロスプレーイオン化ＭＳ（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＥＳＩ／ＭＳ）を組み合わせて測定する方法（特許文献１参照）も提案されている。しかし、これらの方法における測定限界は数１０〜１００ｐｇ／ｍＬである。
【０００５】
非特許文献６には、種々の化合物をペンタフルオロベンジル化すると、ＬＣ−ＡＰＣＩ／ＭＳによりエストロン等を数ｐｇのレベルで測定できることが記載されている。しかし、この文献においては、アンドロゲン、エストラジオール等の測定は行われておらず、この方法でステロイド類全般が同様のレベルで測定できるかどうか不明である。また、特許文献２には、ステロイドのフェノール性水酸基をペンタフルオロベンゾイル化し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより測定する方法が記載されているが、この誘導体は安定性に欠けるという欠点があり、またこの文献には測定感度が記載されていない。
【０００６】
非特許文献７には、ステロイドのフェノール性水酸基をダンシル化（５−ジメチルアミノナフタレン−１−イルスルホン化）し、これをＬＣ−ＭＳ／ＭＳで測定することにより、例えばエストラジオールの測定限界として６．３ｐｇを達成できたことが記載されている。しかし、この方法においては特異性があまり優れておらず、またダンシル化した後の化合物の安定性に欠けるという欠点がある。
【０００７】
特許文献３には、ステロイドをフェニルヒドラゾン化又はフェニルアミノフェニルボロネート化した後、ＬＣ−負イオンＡＰＣＩ／ＭＳで測定することにより、ステロイドを数ｐｇのレベルで測定できることが記載されている。また、このときの測定感度は、ペンタフルオロベンジル化のときと比べて最大で７倍上昇することも示されている。しかしながら、この方法は、オキソ基又はビシナルジオール基を有するステロイドに対してのみ使用可能である。
【特許文献１】特開２００３−１６１７２６号公報
【特許文献２】特開２０００−８８８３４号公報
【特許文献３】特開２００４−２５７９４９号公報
【非特許文献１】Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，１６，１５９０，２００２
【非特許文献２】Ｂｉｏｍｅｄ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１５，１３３，２００１
【非特許文献３】Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，Ｂ，７７２，２２９，２００２
【非特許文献４】Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，Ｂ，７１４，１５３，１９９８
【非特許文献５】Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，Ｂ，７８０，３１５，２００２
【非特許文献６】Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７２，３００７，２０００
【非特許文献７】Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，５０（２），３７３，２００４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、試料中に含まれるステロイドをＬＣ−ＭＳにより測定する方法を提供することである。
【０００９】
また、本発明の別の目的は、ＬＣ−ＭＳを用いるステロイド測定用の試薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、ステロイドの水酸基をピリジルカルボニル化してピリジルカルボン酸エステル誘導体とすることにより、ステロイドをＬＣ−ＭＳにより数ｐｇのレベルで測定できることを見出した。
【００１１】
すなわち、本発明は、試料中に含まれるステロイドをＬＣ−ＭＳを用いて測定する方法であって、
１）試料中のステロイドの水酸基に下記式
【００１２】
〔式中、Ｒはハロゲン原子、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−４アルコキシ基、アリルＣ１−４アルコキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基、Ｃ１−４アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１−４アルキル）アミノ基、ニトロ基又はシアノ基を表し、ＣＯＸはカルボン酸又はその反応性官能基を表す。〕
で示される化合物を反応させてエステル誘導体とする工程、
２）上記エステル誘導体をＬＣ−ＭＳを用いて測定する工程、
を含むことを特徴とする測定方法に関するものである。
【００１３】
また、本発明は、上記式（Ｉ）で示される化合物を含むことを特徴とする、ＬＣ−ＭＳを用いるステロイド測定用試薬に関するものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の測定方法におけるエステル誘導体化操作は、試料をろ過、カラムろ過、遠心分離等の簡易な精製手段に付した後、エステル誘導体化試薬を添加するというもので極めて容易に行うことができ、その反応成績体である該エステル誘導体も安定である。また、水酸基を複数有するステロイドに対して同一の試薬により複数箇所エステル誘導体化する場合は、１箇所のみ誘導体化する場合に比べて測定感度が低下することも多いが、本発明の方法においては、ステロイドの複数箇所の水酸基をエステル誘導体化する場合であっても１箇所のみ誘導体化する場合と同等の測定感度を有している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本明細書において、「ステロイド」とは、ステロイド化合物及びビタミンＤ３類縁体を意味し、水酸基を含有するものであれば特に制限されず、例えば、テストステロン、ジヒドロテストステロン、デヒドロエピアンドロステロン、プレグネノロン、アロプレグネノロン、エストロン、エストラジオール、エストリオール、カテコールエストロゲン、コルチゾール、コルチゾン等のステロイド化合物及び２４，２５−（ジヒドロキシ）ビタミンＤ３、１，２４，２５−（トリヒドロキシ）ビタミンＤ３等のビタミンＤ３類縁体を挙げることができる。この中、テストステロン、ジヒドロテストステロン及びエストラジオールが好ましい。
【００１６】
本明細書において、「水酸基」は、アルコール性でもフェノール性でもよく、また、一級でも二級でもよい。更に、「水酸基」は、ステロイド骨格上にあっても、ステロイド骨格の側鎖上にあってもよい。
【００１７】
本明細書において、「ＬＣ−ＭＳ」とは、例えば、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ及びＬＣ−ＡＰＣＩ／ＭＳを挙げることができ、中でも、ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳが好ましい。
【００１８】
本発明の測定方法においては、使用する下記式
【００１９】
〔式中、Ｒはハロゲン原子、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−４アルコキシ基、アリルＣ１−４アルコキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基、Ｃ１−４アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１−４アルキル）アミノ基、ニトロ基又はシアノ基を表し、ＣＯＸはカルボン酸又はその反応性官能基を表す。〕
で示される化合物におけるＲがハロゲン原子、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−４アルコキシ基、アリルＣ１−４アルコキシ基又はジ（Ｃ１−４アルキル）アミノ基を表す場合が好ましく、中でも、ＲがＣ１−４アルキル基を表す場合が好適である。
【００２０】
また、本発明の測定方法において、上記式（Ｉ）で示される化合物におけるＣＯＸはカルボン酸の反応性官能基を表す場合が好ましく、その「反応性官能基」としては、例えば、酸ハライド、酸無水物、混合酸無水物、活性アミド、活性エステル等を挙げることができる。この中、ＣＯＸが酸ハライドを表す場合がより好ましく、特にＣＯＸが酸クロライドを表す場合が好適である。
【００２１】
さらに、本発明の測定方法において、前記式（Ｉ）で示される化合物における−ＣＯＸの置換位置は、特に制限されることはないが、より好ましくはピリジン環の２位である。
【００２２】
なお、前記式（Ｉ）の化合物はその殆んどが既知であり、たとえ新規であったとしても、既知化合物から既知の方法により容易に合成することができる。
【００２３】
本明細書において、「試料」とは、生物、環境又は工業製品いずれの由来のものであってもよい。生物由来の試料としては、例えば、ヒトを含む動物の血清、唾液、涙液、尿、糞、培養細胞、又は臓器から得られる調製物、あるいは植物からの抽出物等を挙げることができる。また、環境由来の試料としては、例えば、土壌、汚水、廃水、排水、河川水、湖沼水、海水等が挙げられる。更に、工業製品由来の試料としては、例えば、食料品等が挙げられる。
【００２４】
本発明の測定方法について、以下に具体的に説明する。
試料の調製
試料は、必要に応じて有機溶媒による抽出を行った後、簡易カラムクロマトグラフィー、例えば、ウォーターズ社製ＯＡＳＩＳ ＨＬＢ（登録商標）カートリッジ、バリアン社製Ｂｏｎｄ ＥＬＵＴ Ｃ１８（登録商標）カートリッジ等による分離精製等の一般的な調製方法を適宜選択して調製し、次のエステル誘導体化反応に供することができる。
エステル誘導体化
上記で調製した試料に対し、前記式（Ｉ）の化合物を反応させて、ステロイドをエステル誘導体に変換する。
【００２５】
この反応は、一般に、不活性有機溶媒、例えば、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン等のエーテル類；ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類；ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等のアミド類；アセトニトリル；ジメチルスルホキシド等の不活性有機溶媒もしくはそれと水との混合溶媒に溶解又は懸濁した状態にて、適当な塩基、例えば、水素化ナトリウム、炭酸カリウム、トリエチルアミン、ピリジン等の存在下にて行うことができる。反応温度は、通常、−５℃乃至８０℃の範囲内の温度とすることができ、好ましくは１０℃乃至３０℃の範囲内の温度が適している。また、反応時間は、通常５〜２４０分の範囲内の時間とすることができ、好ましくは３０〜９０分の範囲内の時間が適している。
【００２６】
上記エステル誘導体化反応において、試料の量に対する前記式（Ｉ）の化合物の使用割合は、特に制限されるものではないが、一般に、試料１ｍＬあたり前記式（Ｉ）の化合物を少なくとも０．２ｍｇ、好ましくは１〜５ｍｇの範囲内で用いることができる。
【００２７】
また、上記エステル誘導体化反応において使用する塩基の量は、特に制限されるものではないが、一般に、試料１ｍＬあたり塩基を少なくとも０．１ミリモル、好ましくは０．１〜０．５ミリモルの範囲内とすることができる。
【００２８】
なお、上記エステル誘導体化反応において、前記式（Ｉ）の化合物におけるＣＯＸがカルボン酸を表す場合は、この式（Ｉ）の化合物を予め、例えば、１，１−カルボニルジイミダゾール、１，１−チオニルジイミダゾール等で処理して、該カルボン酸を活性アミド等の反応性官能基に変換しておくことが望ましい。また、反応性官能基が酸ハライドの場合、式（Ｉ）の化合物を予め、例えばイミダゾール及びＤＢＵ（１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン）等で処理して、該酸ハライドをイミダゾリド等の他の反応性官能基に変換しておくこともできる。
【００２９】
以上のようにエステル誘導体化反応を行った後、常法により後処理を行い、ＬＣ−ＭＳにより測定する。
ＬＣ−ＭＳ測定
上記エステル誘導体化反応において調製したエステル誘導体のＬＣ−ＭＳによる測定は、一般的なＬＣ、例えば、ヒューレット・パッカード社製ＨＰ１１００、ウォーターズ社製２７９５等のＬＣ、及び一般的なＭＳ、例えば、マイクロマス社製ＱＵＡＴＴＲＯ ＩＩ（登録商標）、ＱＵＡＴＴＲＯ ＭＩＣＲＯ（登録商標）、アプライド・バイオシステムズ社製ＡＰＩ４０００等のＭＳを用いて行うことができる。
実験例１：各種エステル誘導体の合成及びＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ測定
１）各種エステル誘導体の合成
下記表Ａに示す化合物を、以下に述べる方法により合成した。
【００３０】
表Ａ：各種ステロイドの各種エステル誘導体
【００３１】
（１）酸ハライド法
ステロイド（化合物１、３及び４については０．３７ｍｍｏｌ、化合物２については０．１８ｍｍｏｌ）のピリジン２ｍＬ溶液にピコリノイルクロライド塩酸塩１．５ｍｍｏｌを加え、室温にて１〜６時間放置した。反応後、５％重曹水１０ｍＬを加え、酢酸エチル（２０ｍＬ×２回）で抽出し、油層を飽和食塩水、５％塩酸及びもう一度飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下にて溶媒を留去した。得られた粗生成物を酢酸エチル、酢酸エチル−ヘキサン混合溶媒等の適当な溶媒で再結晶し、目的化合物を得た。
（２）混合酸無水物法
ピコリン酸０．５２ｍｍｏｌ及び４−ジメチルアミノピリジン０．３７ｍｍｏｌのＴＨＦ１ｍＬ溶液に２−メチル−６−ニトロ安息香酸無水物０．５２ｍｍｏｌを加え、室温にて５分放置した。次いで、ステロイド（化合物１、３及び４については０．３７ｍｍｏｌ、化合物２については０．１８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ１ｍＬ溶液及びトリエチルアミン０．１ｍＬを順次加え、室温にて３０分放置した。反応後、上記（１）と同様に操作し、目的化合物を得た。なお、ニコチン酸、２−メトキシニコチン酸、イソニコチン酸、６−メチルピコリン酸誘導体については、混合酸無水物法にて合成した。
【００３２】
得られた化合物の融点及びＮＭＲデータを下記表Ｂに示す。
【００３３】
表Ｂ：各種ステロイドの各種エステル誘導体の融点及びＮＭＲデータ
【００３４】
【００３５】
２）ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ測定
上記で得た化合物１ａ−ｅ、２ａ−ｅ、３ａ−ｅ及び４ａ−ｅについて、ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ測定を行った。測定条件を下記表Ｃに、また、その結果を後記表Ｄに示す。
【００３６】
表Ｃ：実験例１におけるＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳの測定条件
【００３７】
表Ｄ：各種ステロイドの各種エステル誘導体のＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ測定結果
【００３８】
実験例２：ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳでの検出感度の比較
上記化合物のうちの２ａ及び４ａの化合物と、先行技術文献に記載の下記（１）〜（３）の誘導体について、ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳでの検出感度を比較した。
（１）テストステロン−１７−Ｏ−Ｎ−メチルピリジニウム−２−エーテル誘導体（特許文献１に記載のＮ−メチルピリジニウム化試薬を用いて合成）、
（２）テストステロン−１７−Ｏ−Ｎ−メチルピリジニウム−２−エーテル−３−エトオキシム誘導体（特許文献１に記載のＮ−メチルピリジニウム化試薬及び非特許文献２に記載のエトオキシム化試薬を用いて合成）、
（３）エストラジオール−３−ペンタフルオロベンジル−１７−Ｏ−Ｎ−メチルピリジニウム−２−エーテル誘導体（特許文献１に記載のＮ−メチルピリジニウム化試薬及び非特許文献７に記載のペンタフルオロベンジル化試薬を用いて合成）。
【００３９】
上記（１）〜（３）の化合物の構造式を、下記表Ｅに示す。
【００４０】
表Ｅ：先行技術文献に記載の誘導体
【００４１】
次に、化合物２ａ及び４ａ並びに上記（１）〜（３）の化合物それぞれ０．０５ｐｇを含有するアセトニトリル溶液２０μＬを調製し、これらをＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳで測定した。そして、得られたクロマトグラムより、Ｓ／Ｎ（シグナル／ノイズ）比を算出した。その結果を下記表Ｆに示す。
【００４２】
表Ｆ：各エステル誘導体のＳ／Ｎ比
【００４３】
上記測定結果より、ピコリノイルエステル誘導体は、これまでのＮ−メチルピリジン−２−イル誘導体、エトオキシム誘導体又はペンタフルオロベンジル誘導体よりもＳ／Ｎ比が大きく、より高感度で測定できることが確認された。
実験例３：エストロン及びエストラジオールの定量限界の比較
１箇所をピコリノイルエステル誘導体化した場合と、複数箇所をピコリノイルエステル誘導体化した場合の測定感度を比較するため、エストロン及びエストラジオールの定量限界を求めた。なお、エストロンは３位にフェノール性水酸基を有し、エストラジオールは３位にフェノール性水酸基及び１７位にアルコール性水酸基を有する。
【００４４】
エストロン及びエストラジオールそれぞれについて、０．２、０．５及び２０ｐｇを含む溶液を調製し、上記実験例１と同様にしてピコリノイルエステル誘導体化及びジピコリノイルエステル誘導体化を行って化合物１ａ及び２ａを合成し、ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ測定を行った。結果を下記表Ｇに示す。
【００４５】
表Ｇ：エストロン及びエストラジオールの定量限界
【００４６】
注１）：測定値＝平均値±標準偏差
注２）：真度＝（測定値／添加量）×１００
注３）：精度＝（標準偏差／平均値）×１００
上記測定におけるエストロン及びエストラジオールそれぞれの定量限界は、真度及び精度より０．５ｐｇ及び０．２ｐｇであり、複数箇所の水酸基がエステル誘導体化された場合であっても、測定感度の低下が生ずることはなかった。
【００４７】
以下、参考例及び実施例により本発明をより詳細に説明する。
＜参考例＞
参考例１：健常女性血清中のエストロン及びエストラジオールの同時測定
１−１）：試料の調製
健常女性１０例より血清０．５ｍＬを採取し、これに内部標準物質として１３Ｃ４−エストロン及び１３Ｃ４−エストラジオールそれぞれ１００ｐｇを加え、ジエチルエーテル４ｍＬを加えて振とうし、ジエチルエーテル層を分取し、窒素気流下で留去した。
１−２）：ピコリノイルエステル誘導体化
上記１−１）で得た残留物にピコリノイルクロライド塩酸塩のアセトニトリル溶液（１→２０）０．１ｍＬ及びピリジン３０μＬを加えて振り混ぜた後、室温で１時間放置した。反応後、１％塩酸１ｍＬを加え、ジエチルエーテル４ｍＬを加えて振とうし、エーテル層を分取後、窒素気流下で留去した。残留物をアセトニトリル０．２５ｍＬに溶解し、水１ｍＬを加えて希釈後、Bond Elut C18に負荷し、アセトニトリル−水混合液（３→１０）３ｍＬで洗浄し、更にアセトニトリル−水混合液（４→５）２．５ｍＬで溶出した。溶出液を遠心エバポレーターで留去した後、アセトニトリル−水混合液（２→５）１００μＬに溶解し、ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳに供した。
１−３）：ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ測定
上記１−２）で得たアセトニトリル溶液１００μＬのうち、その２０μＬをＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ測定し、血清中のエストロン及びエストラジオール濃度を求めた。その結果を下記表Ｈに示す。
【００４８】
表Ｈ：健常女性血清中のエストロン及びエストラジオールの濃度
【００４９】
ところで、従来はエストロン及びエストラジオールをそれぞれ別個に測定していたが、この方法によれば、１度の測定でエストロン及びエストラジオールを０．５〜５００ｐｇ／ｍＬの範囲で同時定量することができる。
参考例２：健常男性の血清中及び唾液中のテストステロン及びジヒドロテストステロンの同時測定
健常男性の血清２００μＬに内部標準物質（１６，１６，１７−ｄ３−テストステロン及び１６，１６，１７−ｄ３−ジヒドロテストステロン）並びにジエチルエーテル４ｍＬを加えて室温で１０分間振とうした後、窒素気流中で留去した。また、唾液の場合は１ｍＬを採取し、同様に調製した。
【００５０】
上記で得られた残留物にピコリノイルクロライド塩酸塩のアセトニトリル−水混合液（１→４０）２００μＬ及びピリジン５０μＬを加えて振り混ぜた後、室温で９０分間放置した。反応後、水７５０μＬ及びジエチルエーテル５ｍＬを加えて１０分間振り混ぜた後、エーテル層を分取し、水７５０μＬで洗浄し、窒素気流下で留去した。残留物をアセトニトリル２５０μＬに溶解し、Bond Elut C18カラムに負荷し、水１ｍＬ、次いでアセトニトリル−水混合液（２→５）４ｍＬで洗浄し、アセトニトリル−水混合液（７→１０）３ｍＬで溶出した。溶媒を遠心エバポレーターにより留去した後、残留物をアセトニトリル−０．１％ギ酸混合液（７：３）１００μＬに溶解した。
【００５１】
上記で得られた溶液１００μＬのうち２０μＬを用い、テストステロン−１７−Ｏ−ピコリノイルエステル誘導体についてはｍ／ｚ：３９４．４を前駆イオン、ｍ／ｚ：２５３．４を検出イオンとし、また、ジヒドロテストステロン−１７−Ｏ−ピコリノイルエステル誘導体についてはｍ／ｚ：３９６．４を前駆イオン、ｍ／ｚ：２５５．４を検出イオンとしてＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳで測定し、試料中のテストステロン及びジヒドロテストステロンの濃度を求めた。その結果を下記表Ｋに示す。
【００５２】
表Ｋ：健常男性の血清中及び唾液中のテストステロン及びジヒドロテストステロンの濃度
【００５３】
参考例３：ヒト前立腺組織中のテストステロン及びジヒドロテストステロンの測定
前立腺組織約５０ｍｇを精密に量った後、液体窒素により凍結、粉砕し、水４ｍＬを加えてホモジナイズした。この懸濁液を５００μＬ量り、これに内部標準物質として１６，１６，１７−ｄ３−テストステロン及び１６，１６，１７−ｄ３−ジヒドロテストステロンを５００ｐｇずつ加え、更にエタノール４ｍＬを加えて５５℃で３時間振とうした後、冷却遠心分離した。
【００５４】
遠心分離後、上清を分取し遠心エバポレーターにより溶媒を留去し、得られた残留物をメタノール２５０μＬに溶解後、水１ｍＬで希釈した。この液を、あらかじめメタノール６ｍＬ及び水６ｍＬで調製したＢｏｎｄＥｌｕｔ Ｃ１８カラムに負荷し、アセトニトリル−水混合液（３→１０）２ｍLで洗浄した後、アセトニトリル−水混合液（７→１０）２．５ｍＬで溶出した。そして、窒素気流下にて溶媒を留去した。
【００５５】
得られた残留物について、上記実施例２と同様にして、ピコリノイルエステル誘導体化及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定を行い、前立腺組織中のテストステロン及びジヒドロテストステロンの濃度を求めた。その結果を下記表Ｍに示す。
【００５６】
表Ｍ：ヒト前立腺組織中のテストステロン及びジヒドロテストステロンの濃度
【実施例】
【００５７】
実施例１：ラット及びマウス臓器中のエストラジオールの測定
ウイスター系雌性ラット（１１週令）、去勢ウイスター系雌性ラット（正常雌性ラットを去勢し、２日後に使用）及びＣ５７ＢＬ／６Ｊ系雌性マウス（１１週令）の血清、脳及び卵巣を採取し、試料中のエストラジオールを６−メチルピコリノイルエステル誘導体化して、それぞれの試料に含まれるエストラジオールの量をＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳで測定した。その結果を下記表Ｎに示す。
【００５８】
表Ｎ：ラット及びマウス臓器中のエストラジオールの量
【００５９】
（−）：定量下限値以下
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明の方法によれば、試料中のステロイドの有無を検出したり、ステロイドの量を測定したりすることができる。
【００６１】
本発明は、例えば、医学、生化学、公衆衛生、食品検査などの分野で利用できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に含まれるステロイドを液体クロマトグラフィー−質量分析計（Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＬＣ−ＭＳ）を用いて測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ステロイドは生体内において極微量で強力な生理作用を示すため、その量を正確に把握することは、臨床診断及び病態解析の上で重要である。しかしながら、その量は微量（数ｐｇ／ｍＬ）である上、構造類似化合物も存在することから、測定には高感度、高特異性などが必要となる。
【０００３】
ステロイドの測定には、通常、ラジオイムノアッセイ（Ｒａｄｉｏ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＲＩＡ）、酵素免疫反応（Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＥＩＡ）、ガスクロマトグラフィー−質量分析計（Ｇａｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：GＣ−ＭＳ）、ＬＣ−ＭＳ等が用いられる。このうち、ＲＩＡ及びＥＩＡについては、それら免疫法の一般的な定量限界は１０ｐｇ／ｍＬであり、それに加えて試料中には測定対象化合物の構造類似体や性ホルモン結合蛋白も存在しているため、定量値が大きく変動する可能性がある。最近になって、シーアイエス ダイアグノスティックス社から、検出感度が１．４ｐｇ／ｍＬと極めて高感度のエストラジオールＲＩＡ測定キットが発売されたが、この測定キットはエストラジオール−１７β グルクロナイドとの交差性にあまり優れておらず、エストラジオール特異性に問題が残っている。
【０００４】
ＬＣ−ＭＳについては、測定対象を誘導体化して検出感度を高め、微量測定を行う方法が種々試みられている。例えば、非特許文献１〜４には、ステロイド化合物に電子親和性原子団を導入し、ＬＣと正イオンモードの大気圧化学イオン化ＭＳ（Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＡＰＣＩ／ＭＳ）を組み合わせて測定する方法（ＬＣ−ＡＰＣＩ／ＭＳ）が示されている。また、ステロイドのカルボニル基をｐ−トルエンスルホンヒドラゾン化してＬＣ−ＭＳ測定する方法（非特許文献５参照）、ステロイドのアルコール性水酸基をＮ−アルキルピリジニウム化してＬＣとエレクトロスプレーイオン化ＭＳ（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＥＳＩ／ＭＳ）を組み合わせて測定する方法（特許文献１参照）も提案されている。しかし、これらの方法における測定限界は数１０〜１００ｐｇ／ｍＬである。
【０００５】
非特許文献６には、種々の化合物をペンタフルオロベンジル化すると、ＬＣ−ＡＰＣＩ／ＭＳによりエストロン等を数ｐｇのレベルで測定できることが記載されている。しかし、この文献においては、アンドロゲン、エストラジオール等の測定は行われておらず、この方法でステロイド類全般が同様のレベルで測定できるかどうか不明である。また、特許文献２には、ステロイドのフェノール性水酸基をペンタフルオロベンゾイル化し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより測定する方法が記載されているが、この誘導体は安定性に欠けるという欠点があり、またこの文献には測定感度が記載されていない。
【０００６】
非特許文献７には、ステロイドのフェノール性水酸基をダンシル化（５−ジメチルアミノナフタレン−１−イルスルホン化）し、これをＬＣ−ＭＳ／ＭＳで測定することにより、例えばエストラジオールの測定限界として６．３ｐｇを達成できたことが記載されている。しかし、この方法においては特異性があまり優れておらず、またダンシル化した後の化合物の安定性に欠けるという欠点がある。
【０００７】
特許文献３には、ステロイドをフェニルヒドラゾン化又はフェニルアミノフェニルボロネート化した後、ＬＣ−負イオンＡＰＣＩ／ＭＳで測定することにより、ステロイドを数ｐｇのレベルで測定できることが記載されている。また、このときの測定感度は、ペンタフルオロベンジル化のときと比べて最大で７倍上昇することも示されている。しかしながら、この方法は、オキソ基又はビシナルジオール基を有するステロイドに対してのみ使用可能である。
【特許文献１】特開２００３−１６１７２６号公報
【特許文献２】特開２０００−８８８３４号公報
【特許文献３】特開２００４−２５７９４９号公報
【非特許文献１】Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，１６，１５９０，２００２
【非特許文献２】Ｂｉｏｍｅｄ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１５，１３３，２００１
【非特許文献３】Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，Ｂ，７７２，２２９，２００２
【非特許文献４】Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，Ｂ，７１４，１５３，１９９８
【非特許文献５】Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，Ｂ，７８０，３１５，２００２
【非特許文献６】Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７２，３００７，２０００
【非特許文献７】Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，５０（２），３７３，２００４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、試料中に含まれるステロイドをＬＣ−ＭＳにより測定する方法を提供することである。
【０００９】
また、本発明の別の目的は、ＬＣ−ＭＳを用いるステロイド測定用の試薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、ステロイドの水酸基をピリジルカルボニル化してピリジルカルボン酸エステル誘導体とすることにより、ステロイドをＬＣ−ＭＳにより数ｐｇのレベルで測定できることを見出した。
【００１１】
すなわち、本発明は、試料中に含まれるステロイドをＬＣ−ＭＳを用いて測定する方法であって、
１）試料中のステロイドの水酸基に下記式
【００１２】
〔式中、Ｒはハロゲン原子、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−４アルコキシ基、アリルＣ１−４アルコキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基、Ｃ１−４アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１−４アルキル）アミノ基、ニトロ基又はシアノ基を表し、ＣＯＸはカルボン酸又はその反応性官能基を表す。〕
で示される化合物を反応させてエステル誘導体とする工程、
２）上記エステル誘導体をＬＣ−ＭＳを用いて測定する工程、
を含むことを特徴とする測定方法に関するものである。
【００１３】
また、本発明は、上記式（Ｉ）で示される化合物を含むことを特徴とする、ＬＣ−ＭＳを用いるステロイド測定用試薬に関するものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の測定方法におけるエステル誘導体化操作は、試料をろ過、カラムろ過、遠心分離等の簡易な精製手段に付した後、エステル誘導体化試薬を添加するというもので極めて容易に行うことができ、その反応成績体である該エステル誘導体も安定である。また、水酸基を複数有するステロイドに対して同一の試薬により複数箇所エステル誘導体化する場合は、１箇所のみ誘導体化する場合に比べて測定感度が低下することも多いが、本発明の方法においては、ステロイドの複数箇所の水酸基をエステル誘導体化する場合であっても１箇所のみ誘導体化する場合と同等の測定感度を有している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本明細書において、「ステロイド」とは、ステロイド化合物及びビタミンＤ３類縁体を意味し、水酸基を含有するものであれば特に制限されず、例えば、テストステロン、ジヒドロテストステロン、デヒドロエピアンドロステロン、プレグネノロン、アロプレグネノロン、エストロン、エストラジオール、エストリオール、カテコールエストロゲン、コルチゾール、コルチゾン等のステロイド化合物及び２４，２５−（ジヒドロキシ）ビタミンＤ３、１，２４，２５−（トリヒドロキシ）ビタミンＤ３等のビタミンＤ３類縁体を挙げることができる。この中、テストステロン、ジヒドロテストステロン及びエストラジオールが好ましい。
【００１６】
本明細書において、「水酸基」は、アルコール性でもフェノール性でもよく、また、一級でも二級でもよい。更に、「水酸基」は、ステロイド骨格上にあっても、ステロイド骨格の側鎖上にあってもよい。
【００１７】
本明細書において、「ＬＣ−ＭＳ」とは、例えば、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ及びＬＣ−ＡＰＣＩ／ＭＳを挙げることができ、中でも、ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳが好ましい。
【００１８】
本発明の測定方法においては、使用する下記式
【００１９】
〔式中、Ｒはハロゲン原子、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−４アルコキシ基、アリルＣ１−４アルコキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基、Ｃ１−４アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１−４アルキル）アミノ基、ニトロ基又はシアノ基を表し、ＣＯＸはカルボン酸又はその反応性官能基を表す。〕
で示される化合物におけるＲがハロゲン原子、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−４アルコキシ基、アリルＣ１−４アルコキシ基又はジ（Ｃ１−４アルキル）アミノ基を表す場合が好ましく、中でも、ＲがＣ１−４アルキル基を表す場合が好適である。
【００２０】
また、本発明の測定方法において、上記式（Ｉ）で示される化合物におけるＣＯＸはカルボン酸の反応性官能基を表す場合が好ましく、その「反応性官能基」としては、例えば、酸ハライド、酸無水物、混合酸無水物、活性アミド、活性エステル等を挙げることができる。この中、ＣＯＸが酸ハライドを表す場合がより好ましく、特にＣＯＸが酸クロライドを表す場合が好適である。
【００２１】
さらに、本発明の測定方法において、前記式（Ｉ）で示される化合物における−ＣＯＸの置換位置は、特に制限されることはないが、より好ましくはピリジン環の２位である。
【００２２】
なお、前記式（Ｉ）の化合物はその殆んどが既知であり、たとえ新規であったとしても、既知化合物から既知の方法により容易に合成することができる。
【００２３】
本明細書において、「試料」とは、生物、環境又は工業製品いずれの由来のものであってもよい。生物由来の試料としては、例えば、ヒトを含む動物の血清、唾液、涙液、尿、糞、培養細胞、又は臓器から得られる調製物、あるいは植物からの抽出物等を挙げることができる。また、環境由来の試料としては、例えば、土壌、汚水、廃水、排水、河川水、湖沼水、海水等が挙げられる。更に、工業製品由来の試料としては、例えば、食料品等が挙げられる。
【００２４】
本発明の測定方法について、以下に具体的に説明する。
試料の調製
試料は、必要に応じて有機溶媒による抽出を行った後、簡易カラムクロマトグラフィー、例えば、ウォーターズ社製ＯＡＳＩＳ ＨＬＢ（登録商標）カートリッジ、バリアン社製Ｂｏｎｄ ＥＬＵＴ Ｃ１８（登録商標）カートリッジ等による分離精製等の一般的な調製方法を適宜選択して調製し、次のエステル誘導体化反応に供することができる。
エステル誘導体化
上記で調製した試料に対し、前記式（Ｉ）の化合物を反応させて、ステロイドをエステル誘導体に変換する。
【００２５】
この反応は、一般に、不活性有機溶媒、例えば、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン等のエーテル類；ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類；ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等のアミド類；アセトニトリル；ジメチルスルホキシド等の不活性有機溶媒もしくはそれと水との混合溶媒に溶解又は懸濁した状態にて、適当な塩基、例えば、水素化ナトリウム、炭酸カリウム、トリエチルアミン、ピリジン等の存在下にて行うことができる。反応温度は、通常、−５℃乃至８０℃の範囲内の温度とすることができ、好ましくは１０℃乃至３０℃の範囲内の温度が適している。また、反応時間は、通常５〜２４０分の範囲内の時間とすることができ、好ましくは３０〜９０分の範囲内の時間が適している。
【００２６】
上記エステル誘導体化反応において、試料の量に対する前記式（Ｉ）の化合物の使用割合は、特に制限されるものではないが、一般に、試料１ｍＬあたり前記式（Ｉ）の化合物を少なくとも０．２ｍｇ、好ましくは１〜５ｍｇの範囲内で用いることができる。
【００２７】
また、上記エステル誘導体化反応において使用する塩基の量は、特に制限されるものではないが、一般に、試料１ｍＬあたり塩基を少なくとも０．１ミリモル、好ましくは０．１〜０．５ミリモルの範囲内とすることができる。
【００２８】
なお、上記エステル誘導体化反応において、前記式（Ｉ）の化合物におけるＣＯＸがカルボン酸を表す場合は、この式（Ｉ）の化合物を予め、例えば、１，１−カルボニルジイミダゾール、１，１−チオニルジイミダゾール等で処理して、該カルボン酸を活性アミド等の反応性官能基に変換しておくことが望ましい。また、反応性官能基が酸ハライドの場合、式（Ｉ）の化合物を予め、例えばイミダゾール及びＤＢＵ（１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン）等で処理して、該酸ハライドをイミダゾリド等の他の反応性官能基に変換しておくこともできる。
【００２９】
以上のようにエステル誘導体化反応を行った後、常法により後処理を行い、ＬＣ−ＭＳにより測定する。
ＬＣ−ＭＳ測定
上記エステル誘導体化反応において調製したエステル誘導体のＬＣ−ＭＳによる測定は、一般的なＬＣ、例えば、ヒューレット・パッカード社製ＨＰ１１００、ウォーターズ社製２７９５等のＬＣ、及び一般的なＭＳ、例えば、マイクロマス社製ＱＵＡＴＴＲＯ ＩＩ（登録商標）、ＱＵＡＴＴＲＯ ＭＩＣＲＯ（登録商標）、アプライド・バイオシステムズ社製ＡＰＩ４０００等のＭＳを用いて行うことができる。
実験例１：各種エステル誘導体の合成及びＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ測定
１）各種エステル誘導体の合成
下記表Ａに示す化合物を、以下に述べる方法により合成した。
【００３０】
表Ａ：各種ステロイドの各種エステル誘導体
【００３１】
（１）酸ハライド法
ステロイド（化合物１、３及び４については０．３７ｍｍｏｌ、化合物２については０．１８ｍｍｏｌ）のピリジン２ｍＬ溶液にピコリノイルクロライド塩酸塩１．５ｍｍｏｌを加え、室温にて１〜６時間放置した。反応後、５％重曹水１０ｍＬを加え、酢酸エチル（２０ｍＬ×２回）で抽出し、油層を飽和食塩水、５％塩酸及びもう一度飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下にて溶媒を留去した。得られた粗生成物を酢酸エチル、酢酸エチル−ヘキサン混合溶媒等の適当な溶媒で再結晶し、目的化合物を得た。
（２）混合酸無水物法
ピコリン酸０．５２ｍｍｏｌ及び４−ジメチルアミノピリジン０．３７ｍｍｏｌのＴＨＦ１ｍＬ溶液に２−メチル−６−ニトロ安息香酸無水物０．５２ｍｍｏｌを加え、室温にて５分放置した。次いで、ステロイド（化合物１、３及び４については０．３７ｍｍｏｌ、化合物２については０．１８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ１ｍＬ溶液及びトリエチルアミン０．１ｍＬを順次加え、室温にて３０分放置した。反応後、上記（１）と同様に操作し、目的化合物を得た。なお、ニコチン酸、２−メトキシニコチン酸、イソニコチン酸、６−メチルピコリン酸誘導体については、混合酸無水物法にて合成した。
【００３２】
得られた化合物の融点及びＮＭＲデータを下記表Ｂに示す。
【００３３】
表Ｂ：各種ステロイドの各種エステル誘導体の融点及びＮＭＲデータ
【００３４】
【００３５】
２）ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ測定
上記で得た化合物１ａ−ｅ、２ａ−ｅ、３ａ−ｅ及び４ａ−ｅについて、ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ測定を行った。測定条件を下記表Ｃに、また、その結果を後記表Ｄに示す。
【００３６】
表Ｃ：実験例１におけるＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳの測定条件
【００３７】
表Ｄ：各種ステロイドの各種エステル誘導体のＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ測定結果
【００３８】
実験例２：ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳでの検出感度の比較
上記化合物のうちの２ａ及び４ａの化合物と、先行技術文献に記載の下記（１）〜（３）の誘導体について、ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳでの検出感度を比較した。
（１）テストステロン−１７−Ｏ−Ｎ−メチルピリジニウム−２−エーテル誘導体（特許文献１に記載のＮ−メチルピリジニウム化試薬を用いて合成）、
（２）テストステロン−１７−Ｏ−Ｎ−メチルピリジニウム−２−エーテル−３−エトオキシム誘導体（特許文献１に記載のＮ−メチルピリジニウム化試薬及び非特許文献２に記載のエトオキシム化試薬を用いて合成）、
（３）エストラジオール−３−ペンタフルオロベンジル−１７−Ｏ−Ｎ−メチルピリジニウム−２−エーテル誘導体（特許文献１に記載のＮ−メチルピリジニウム化試薬及び非特許文献７に記載のペンタフルオロベンジル化試薬を用いて合成）。
【００３９】
上記（１）〜（３）の化合物の構造式を、下記表Ｅに示す。
【００４０】
表Ｅ：先行技術文献に記載の誘導体
【００４１】
次に、化合物２ａ及び４ａ並びに上記（１）〜（３）の化合物それぞれ０．０５ｐｇを含有するアセトニトリル溶液２０μＬを調製し、これらをＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳで測定した。そして、得られたクロマトグラムより、Ｓ／Ｎ（シグナル／ノイズ）比を算出した。その結果を下記表Ｆに示す。
【００４２】
表Ｆ：各エステル誘導体のＳ／Ｎ比
【００４３】
上記測定結果より、ピコリノイルエステル誘導体は、これまでのＮ−メチルピリジン−２−イル誘導体、エトオキシム誘導体又はペンタフルオロベンジル誘導体よりもＳ／Ｎ比が大きく、より高感度で測定できることが確認された。
実験例３：エストロン及びエストラジオールの定量限界の比較
１箇所をピコリノイルエステル誘導体化した場合と、複数箇所をピコリノイルエステル誘導体化した場合の測定感度を比較するため、エストロン及びエストラジオールの定量限界を求めた。なお、エストロンは３位にフェノール性水酸基を有し、エストラジオールは３位にフェノール性水酸基及び１７位にアルコール性水酸基を有する。
【００４４】
エストロン及びエストラジオールそれぞれについて、０．２、０．５及び２０ｐｇを含む溶液を調製し、上記実験例１と同様にしてピコリノイルエステル誘導体化及びジピコリノイルエステル誘導体化を行って化合物１ａ及び２ａを合成し、ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ測定を行った。結果を下記表Ｇに示す。
【００４５】
表Ｇ：エストロン及びエストラジオールの定量限界
【００４６】
注１）：測定値＝平均値±標準偏差
注２）：真度＝（測定値／添加量）×１００
注３）：精度＝（標準偏差／平均値）×１００
上記測定におけるエストロン及びエストラジオールそれぞれの定量限界は、真度及び精度より０．５ｐｇ及び０．２ｐｇであり、複数箇所の水酸基がエステル誘導体化された場合であっても、測定感度の低下が生ずることはなかった。
【００４７】
以下、参考例及び実施例により本発明をより詳細に説明する。
＜参考例＞
参考例１：健常女性血清中のエストロン及びエストラジオールの同時測定
１−１）：試料の調製
健常女性１０例より血清０．５ｍＬを採取し、これに内部標準物質として１３Ｃ４−エストロン及び１３Ｃ４−エストラジオールそれぞれ１００ｐｇを加え、ジエチルエーテル４ｍＬを加えて振とうし、ジエチルエーテル層を分取し、窒素気流下で留去した。
１−２）：ピコリノイルエステル誘導体化
上記１−１）で得た残留物にピコリノイルクロライド塩酸塩のアセトニトリル溶液（１→２０）０．１ｍＬ及びピリジン３０μＬを加えて振り混ぜた後、室温で１時間放置した。反応後、１％塩酸１ｍＬを加え、ジエチルエーテル４ｍＬを加えて振とうし、エーテル層を分取後、窒素気流下で留去した。残留物をアセトニトリル０．２５ｍＬに溶解し、水１ｍＬを加えて希釈後、Bond Elut C18に負荷し、アセトニトリル−水混合液（３→１０）３ｍＬで洗浄し、更にアセトニトリル−水混合液（４→５）２．５ｍＬで溶出した。溶出液を遠心エバポレーターで留去した後、アセトニトリル−水混合液（２→５）１００μＬに溶解し、ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳに供した。
１−３）：ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ測定
上記１−２）で得たアセトニトリル溶液１００μＬのうち、その２０μＬをＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ測定し、血清中のエストロン及びエストラジオール濃度を求めた。その結果を下記表Ｈに示す。
【００４８】
表Ｈ：健常女性血清中のエストロン及びエストラジオールの濃度
【００４９】
ところで、従来はエストロン及びエストラジオールをそれぞれ別個に測定していたが、この方法によれば、１度の測定でエストロン及びエストラジオールを０．５〜５００ｐｇ／ｍＬの範囲で同時定量することができる。
参考例２：健常男性の血清中及び唾液中のテストステロン及びジヒドロテストステロンの同時測定
健常男性の血清２００μＬに内部標準物質（１６，１６，１７−ｄ３−テストステロン及び１６，１６，１７−ｄ３−ジヒドロテストステロン）並びにジエチルエーテル４ｍＬを加えて室温で１０分間振とうした後、窒素気流中で留去した。また、唾液の場合は１ｍＬを採取し、同様に調製した。
【００５０】
上記で得られた残留物にピコリノイルクロライド塩酸塩のアセトニトリル−水混合液（１→４０）２００μＬ及びピリジン５０μＬを加えて振り混ぜた後、室温で９０分間放置した。反応後、水７５０μＬ及びジエチルエーテル５ｍＬを加えて１０分間振り混ぜた後、エーテル層を分取し、水７５０μＬで洗浄し、窒素気流下で留去した。残留物をアセトニトリル２５０μＬに溶解し、Bond Elut C18カラムに負荷し、水１ｍＬ、次いでアセトニトリル−水混合液（２→５）４ｍＬで洗浄し、アセトニトリル−水混合液（７→１０）３ｍＬで溶出した。溶媒を遠心エバポレーターにより留去した後、残留物をアセトニトリル−０．１％ギ酸混合液（７：３）１００μＬに溶解した。
【００５１】
上記で得られた溶液１００μＬのうち２０μＬを用い、テストステロン−１７−Ｏ−ピコリノイルエステル誘導体についてはｍ／ｚ：３９４．４を前駆イオン、ｍ／ｚ：２５３．４を検出イオンとし、また、ジヒドロテストステロン−１７−Ｏ−ピコリノイルエステル誘導体についてはｍ／ｚ：３９６．４を前駆イオン、ｍ／ｚ：２５５．４を検出イオンとしてＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳで測定し、試料中のテストステロン及びジヒドロテストステロンの濃度を求めた。その結果を下記表Ｋに示す。
【００５２】
表Ｋ：健常男性の血清中及び唾液中のテストステロン及びジヒドロテストステロンの濃度
【００５３】
参考例３：ヒト前立腺組織中のテストステロン及びジヒドロテストステロンの測定
前立腺組織約５０ｍｇを精密に量った後、液体窒素により凍結、粉砕し、水４ｍＬを加えてホモジナイズした。この懸濁液を５００μＬ量り、これに内部標準物質として１６，１６，１７−ｄ３−テストステロン及び１６，１６，１７−ｄ３−ジヒドロテストステロンを５００ｐｇずつ加え、更にエタノール４ｍＬを加えて５５℃で３時間振とうした後、冷却遠心分離した。
【００５４】
遠心分離後、上清を分取し遠心エバポレーターにより溶媒を留去し、得られた残留物をメタノール２５０μＬに溶解後、水１ｍＬで希釈した。この液を、あらかじめメタノール６ｍＬ及び水６ｍＬで調製したＢｏｎｄＥｌｕｔ Ｃ１８カラムに負荷し、アセトニトリル−水混合液（３→１０）２ｍLで洗浄した後、アセトニトリル−水混合液（７→１０）２．５ｍＬで溶出した。そして、窒素気流下にて溶媒を留去した。
【００５５】
得られた残留物について、上記実施例２と同様にして、ピコリノイルエステル誘導体化及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定を行い、前立腺組織中のテストステロン及びジヒドロテストステロンの濃度を求めた。その結果を下記表Ｍに示す。
【００５６】
表Ｍ：ヒト前立腺組織中のテストステロン及びジヒドロテストステロンの濃度
【実施例】
【００５７】
実施例１：ラット及びマウス臓器中のエストラジオールの測定
ウイスター系雌性ラット（１１週令）、去勢ウイスター系雌性ラット（正常雌性ラットを去勢し、２日後に使用）及びＣ５７ＢＬ／６Ｊ系雌性マウス（１１週令）の血清、脳及び卵巣を採取し、試料中のエストラジオールを６−メチルピコリノイルエステル誘導体化して、それぞれの試料に含まれるエストラジオールの量をＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳで測定した。その結果を下記表Ｎに示す。
【００５８】
表Ｎ：ラット及びマウス臓器中のエストラジオールの量
【００５９】
（−）：定量下限値以下
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明の方法によれば、試料中のステロイドの有無を検出したり、ステロイドの量を測定したりすることができる。
【００６１】
本発明は、例えば、医学、生化学、公衆衛生、食品検査などの分野で利用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に含まれるステロイドをＬＣ−ＭＳを用いて測定する方法であって、
１）試料中のステロイドの水酸基に下記式
〔式中、Ｒはハロゲン原子、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−４アルコキシ基、アリルＣ１−４アルコキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基、Ｃ１−４アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１−４アルキル）アミノ基、ニトロ基又はシアノ基を表し、ＣＯＸはカルボン酸又はその反応性官能基を表す。〕
で示される化合物を反応させてエステル誘導体とする工程、
２）上記エステル誘導体をＬＣ−ＭＳを用いて測定する工程、
を含むことを特徴とする測定方法。
【請求項２】
Ｒがハロゲン原子、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−４アルコキシ基、アリルＣ１−４アルコキシ基又はジ（Ｃ１−４アルキル）アミノ基を表す、請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
ＲがＣ１−４アルキル基を表す、請求項２に記載の測定方法。
【請求項４】
ＣＯＸの置換位置がピリジン環の２位である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項５】
請求項１の式（Ｉ）で示される化合物を含むことを特徴とする、ＬＣ−ＭＳを用いるステロイド測定用試薬。
【請求項１】
試料中に含まれるステロイドをＬＣ−ＭＳを用いて測定する方法であって、
１）試料中のステロイドの水酸基に下記式
〔式中、Ｒはハロゲン原子、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−４アルコキシ基、アリルＣ１−４アルコキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基、Ｃ１−４アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１−４アルキル）アミノ基、ニトロ基又はシアノ基を表し、ＣＯＸはカルボン酸又はその反応性官能基を表す。〕
で示される化合物を反応させてエステル誘導体とする工程、
２）上記エステル誘導体をＬＣ−ＭＳを用いて測定する工程、
を含むことを特徴とする測定方法。
【請求項２】
Ｒがハロゲン原子、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−４アルコキシ基、アリルＣ１−４アルコキシ基又はジ（Ｃ１−４アルキル）アミノ基を表す、請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
ＲがＣ１−４アルキル基を表す、請求項２に記載の測定方法。
【請求項４】
ＣＯＸの置換位置がピリジン環の２位である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項５】
請求項１の式（Ｉ）で示される化合物を含むことを特徴とする、ＬＣ−ＭＳを用いるステロイド測定用試薬。
【公開番号】特開２００８−２７５４２５（Ｐ２００８−２７５４２５Ａ）
【公開日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１１８９６４（Ｐ２００７−１１８９６４）
【出願日】平成１９年４月２７日（２００７．４．２７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り
【出願人】（５０４１２５４５８）株式会社帝国臓器製薬メディカル (6)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月２７日（２００７．４．２７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り
【出願人】（５０４１２５４５８）株式会社帝国臓器製薬メディカル (6)
【Ｆターム（参考）】
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