ストレス誘導抗アポトーシス分子（ＩＥＸ−１）由来ペプチド
ＨＬＡ−Ａ３３＋癌患者に対する癌ワクチン候補ペプチドを提供すること。
本発明は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）に認識され、特異的ＣＴＬを誘導できるストレス誘導アポトーシス関連遺伝子（ＩＥＸ−１）由来ペプチドまたはその変異ペプチドおよび該ペプチドを含むポリペプチド、それらをコードする核酸分子、ならびにそれらを含有する医薬組成物等に関する。
本発明は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）に認識され、特異的ＣＴＬを誘導できるストレス誘導アポトーシス関連遺伝子（ＩＥＸ−１）由来ペプチドまたはその変異ペプチドおよび該ペプチドを含むポリペプチド、それらをコードする核酸分子、ならびにそれらを含有する医薬組成物等に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌患者に対する免疫療法に利用可能なストレス誘導抗アポトーシス分子（ＩＥＸ−１）由来ペプチドに関する。詳細には、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）により認識され、特異的なＣＴＬを誘導する、ＩＥＸ−１由来ペプチド、該ペプチドを含むポリペプチドおよびこれらペプチドを含む癌ワクチン等に関する。
【背景技術】
【０００２】
胃癌は、世界で最も普遍的に発生する悪性腫瘍の一つである（文献１−６）。本疾患は、早期では予後は一般的に良好であるが、進行癌においては、外科的切除、化学療法、および放射線療法などの既存の治療法が最近顕著に進歩しているにも係らず、予後が非常に悪い。それゆえ、進行段階の胃癌患者を処置するため、新しい特異的免疫療法のような新規な治療法の開発が必要とされている。
【０００３】
近年、ヒト腫瘍がＣＴＬに認識される抗原性ペプチドを発現していることが明らかになってきており、このようなペプチドはＨＬＡ−Ａ２またはＡ２４アレルを有する癌患者に対するペプチドワクチンとして使用されている（文献１−７）。ＨＬＡ−Ａ２またはＡ２４拘束性ＣＴＬにより認識されるエピトープペプチドについては多くの報告がなされており（文献８−１１）、本発明者らも、最近、ペプチドワクチン処置がＨＬＡ−Ａ２またはＡ２４重症胃癌患者の全体的生存率を延長することを報告した（文献４）。
一方、ＨＬＡ−Ａ３３アレルは世界中の様々な人種において比較的広く発現しているにも拘わらず（文献１４、１５）、ＨＬＡ−Ａ３３拘束性ＣＴＬにより認識される抗原およびペプチドについての報告は非常に限られている（文献１２、１３）。このことは、ＨＬＡ−Ａ３３＋癌患者に対するペプチド基盤特異的免疫療法の開発を妨げている。
【０００４】
ＩＥＸ−１（immediate early response gene X-1)(ｐ２２／ＰＲＧ１（文献２０）、Ｄｉｆ−２（文献２１）、またはマウスホモログｇｙｌ９６（文献２２）としてもまた知られる）は、ストレス誘導遺伝子であり、細胞周期進行およびアポトーシスの調節に関与する。ＩＥＸ−１は、ＴＮＦおよびＦａｓのような様々なアポトーシス誘発因子により誘導されるアポトーシスに対する細胞抵抗性に重要な役割を果たすこと（文献２３）、およびいくつかの細胞株において細胞周期進行を加速すること（文献２４−２６）が報告されている。また、in vivoにおけるＴリンパ球の活性化誘導細胞死に対するＩＥＸ−１の抗アポトーシス効果も報告されている（文献２７）。
ＩＥＸ−１の発現は、放射線照射、成長因子、ウィルス感染、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βのような炎症性サイトカイン、リポポリサッカライド、およびステロイドホルモンを含むいくつかの細胞ストレスによって急速に活性化され得る（文献２７）。ＩＥＸ−１はもともとＮＦ−κＢ／ｒeｌ標的遺伝子として同定されたが（文献２３）、ＩＥＸ−１プロモーターには例えばｐ５３、ＳＰ−１およびｃ−Ｍｙｃのような他の転写因子のためのコンセンサス配列がいくつか含まれる（文献７）。例えば、腫瘍細胞に共通する癌抑制遺伝子ｐ５３の変異がＩＥＸ−１発現を上昇させることが示されている（文献２９）。
以上のように、ＩＥＸ−１は腫瘍細胞の悪性形質転換に関与することが示唆されているが、腫瘍細胞において抗原性ペプチドとして機能するＩＥＸ−１エピトープペプチドは知られていなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ＨＬＡ−Ａ３３＋癌患者に対する癌ワクチンの開発に有用な抗原ペプチドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、重症胃癌患者の腫瘍組織浸潤リンパ球（ＴＩＬ）からＨＬＡ−Ａ３３拘束性ＣＴＬ株を樹立し、ＩＥＸ−１由来の三つのＨＬＡ−Ａ３３結合エピトープを、本細胞株により認識される腫瘍抗原として同定した。さらに、これらの抗原性エピトープが悪性腫瘍疾患患者のＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）においてペプチド特異的ＣＴＬを誘導することを確認したことにより、本発明を完成した。
【０００７】
即ち本発明は、以下を包含する。
（１）細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）によって認識され、特異的なＣＴＬを誘導する、ストレス誘導抗アポトーシス分子（ＩＥＸ−１）由来のペプチドまたはその変異ペプチド。
（２）ＣＴＬがＨＬＡ−Ａ３３拘束性に認識する、（１）記載のペプチド。
（３）連続する８〜１１個のアミノ酸残基からなる、（１）または（２）に記載のペプチド。
（４）配列番号１〜３のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチド、または配列番号１〜３のいずれかに示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＨＬＡ−Ａ３３分子と結合して特異的なＣＴＬを誘導するペプチドである、（１）〜（３）のいずれかに記載のペプチド。
（５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載のペプチドを含むポリペプチド。
（６）単離された抗原提示能を有する細胞の表面に、ＨＬＡ−Ａ３３分子と（１）〜（４）のいずれかに記載のペプチドとの複合体を提示させてなる、抗原提示細胞。
（７）上記（１）〜（４）のいずれかに記載のペプチド、または（５）記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
（８）上記（７）記載の核酸分子を含有するベクター。
（９）上記（１）〜（４）のいずれかに記載のペプチド、（５）記載のポリペプチド、（６）記載の抗原提示細胞、（７）記載の核酸分子、または（８）記載のベクターを含む、特異的なＣＴＬを誘導するための医薬組成物。
（１０）癌ワクチンである、（９）記載の医薬組成物。
（１１）上記（１）〜（４）のいずれかに記載のペプチドとＨＬＡとの複合体、または（６）記載の抗原提示細胞に提示された複合体を認識する、ＩＥＸ−１反応性ＣＴＬ。
（１２）上記（１）〜（４）のいずれかに記載のペプチド、（５）記載のポリペプチド、または（６）記載の抗原提示細胞を用いてＩＥＸ−１反応性ＣＴＬを誘導する方法。
（１３）上記（１）〜（４）のいずれかに記載のペプチドまたは（５）記載のポリペプチドを特異的に認識する抗体。
（１４）次の１）または２）に記載のポリペプチドを含む、特異的なＣＴＬを誘導するための医薬組成物：
１）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または
２）配列番号４に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＨＬＡ−Ａ３３分子と結合して特異的なＣＴＬを誘導するペプチドを与えるポリペプチド。
（１５）癌ワクチンである、（１４）記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【０００８】
本発明は、悪性腫瘍、特にＨＬＡ−Ａ３３陽性の癌患者の治療に適したＩＥＸ−１基盤免疫療法を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】胃腺癌患者（ＨＬＡ−Ａ＊２４０２／Ａ＊３３０３、Ｂ７／Ｂ４４、Ｃｗ７／Ｃｗ１４）の腫瘍浸潤生リンパ球（ＴＩＬ）から樹立した、ＨＬＡ−Ａ３３拘束性８５０Ｂ−ＣＴＬ細胞株の特性を示す図である。Ａは種々の標的細胞に対する認識能を、様々なＥ：Ｔ比（エフェクター細胞：標的細胞）におけるＩＦＮ−γの産生に基づき検討した結果を示す。Ｂは種々の標的細胞に対する細胞傷害活性を、相異なるＥ：Ｔ比における６時間５１Ｃｒ放出試験により試験した結果を示す。Ｃは種々のｍＡｂを用いた阻害実験における、８５０Ｂ−ＣＴＬのＨＬＡ−Ａ３３＋ＬＣ−１細胞に対する反応性の差異を示す図である。
【図２】８５０Ｂ−ＣＴＬ細胞株による、同定された腫瘍抗原遺伝子のＨＬＡ−Ａ３３拘束性認識を示す図である。ＬＣ−１肺腺癌細胞ｃＤＮＡライブラリーから遺伝子発現クローニング法で得たクローンと、ＨＬＡ−Ａ３３０３またはＨＬＡ−Ａ２６０１遺伝子を共にトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞に対する８５０Ｂ−ＣＴＬの反応性をＩＦＮ−γ産生に基づいて検討した。
【図３】ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルにおけるＩＥＸ−１の発現を示す図である。Ａは、様々な正常組織におけるＩＥＸ−１ｍＲＮＡの発現を、３２Ｐ標識ＩＥＸ−１プローブを用いるノーザンブロット解析によって調べた結果を示す写真の模写図である。Ｂは正常および癌細胞におけるＩＥＸ−１遺伝子のｍＲＮＡ発現のノーザンブロット解析におけるオートラジオグラフィーを示す写真の模写図である。Ｃ〜Ｅは様々な腫瘍組織におけるＩＥＸ−１の発現をタンパク質レベルで免疫組織化学的に検討した結果を示す顕微鏡写真の模写図である。Ｃは胃癌組織、Ｄは乳癌、Ｅは肺癌における染色を示している。
【図４】ＩＥＸ−１における抗原性エピトープの同定を示す図である。ＩＥＸ−１の推定アミノ酸配列のＨＬＡ−Ａ３３結合性モチーフに基づくコンピュータ解析でＨＬＡ−Ａ３３に対して強い結合活性を有しうる８個の候補ペプチドを選択し、試験した。Ａは、これら８個の候補ペプチドをＣ１Ｒ−Ａ３３細胞（ＨＬＡ−Ａ＊３３０３ｃＤＮＡをトランスフェクトして安定的に発現させたＣ１Ｒヒト多発性骨髄腫細胞）とともに培養し、さらに８５０Ｂ−ＣＴＬを添加して培養した後、培養上清中のＩＦＮ−γの産生をＥＬＩＳＡにより測定した結果を示す。Ｂは、有意なレベルのＩＦＮ−γ産生を誘導した３つのペプチド（ＩＥＸ４７−５６、ＩＥＸ６１−６９、およびＩＥＸ６５−７３ペプチド）及び１つの対照ペプチドの濃度と、ＩＥＸ−１反応性ＣＴＬ誘導活性との関係を検討した結果を示す。
【図５】ペプチドに対する細胞性応答を示す図である。ＩＥＸ４７−５６、ＩＥＸ６１−６９、およびＩＥＸ６５−７３ペプチドでＨＬＡ−Ａ３３＋上皮癌患者およびＨＬＡ−Ａ３３＋健常人のＰＢＭＣを刺激し、対応するペプチドでパルスしたＣ１Ｒ−Ａ３３細胞または陰性対照のＨＩＶペプチドでパルスしたＣ１Ｒ−Ａ３３細胞で刺激し、ＩＦＮ−γ産生活性に基づいて細胞応答を試験した。
【図６】はペプチド誘導ＣＴＬの細胞傷害性を示す図である。 ＬＣ−１（ＨＬＡ−Ａ３３＋ＩＥＸ−１＋）、ＱＧ５６（ＨＬＡ−Ａ３３−ＩＥＸ−１＋）およびＨＧＣ２７（ＨＬＡ−Ａ３３−ＩＥＸ−１−）細胞をＩＬ−２単独で培養し、相異なるＥ：Ｔ比で６時間51Ｃｒ放出試験を行い、細胞障害活性を検討した。
【図７】モノクローナル抗体による細胞傷害性阻害試験の結果を示す図である。 抗ＨＬＡクラスＩ、抗ＨＬＡクラスＩＩ、抗ＣＤ８（Ｎｕ−Ｔｓ／ｃ、ＩｇＧ２ａ）、抗ＣＤ４（Ｎｕ−Ｔｈ／ｉ、ＩｇＧ１）と対照としての抗ＣＤ１４（ＪＭＬ−Ｈ１４、ＩｇＧ２ａ）ｍＡｂを用い、ペプチド刺激ＰＢＭＣの細胞傷害性に対する阻害作用を検討した。
【図８】特異的細胞傷害性の競合試験の結果を示す図である。 非標識Ｃ１Ｒ細胞を対応ペプチドまたはＨＩＶペプチド（陰性対照）でパルスし、51Ｃｒ放出試験に供した（非標識細胞対標識細胞＝１０：１）。Ｅ／Ｔ比１０：１で５１Ｃｒ放出試験を行った。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明についてさらに詳細に説明する。
ＨＬＡ拘束性ＣＴＬ株
ＨＬＡ拘束性ＣＴＬ株は、目的とするＨＬＡアレルを有する癌患者の腫瘍組織に浸潤しているリンパ球（ＴＩＬ）を採取し、Ｔ細胞の増殖を促すサイトカインであるＩＬ−２と共に培養して増殖させることにより得られる。本方法は当業界において周知である。
遺伝子発現クローニング法
ＨＬＡ拘束性ＣＴＬ株によって認識される腫瘍抗原は、遺伝子発現クローニング法により同定する。本方法は、ｃＤＮＡライブラリーにコードされるタンパク質を哺乳類細胞で一過性に発現させ、樹立したＣＴＬ株が特異的に認識する目的のタンパク質をコードするｃＤＮＡをスクリーニングし、当該タンパク質をコードする遺伝子を単離するものである。本発明では、樹立したＣＴＬ株がタンパク質発現細胞を認識した際に産生するＩＦＮ−γを指標としてスクリーニングを行う。
【００１１】
ペプチドおよびポリペプチド
本発明のＩＥＸ−１由来ペプチドは、ＨＬＡと結合して特異的ＣＴＬを誘導しうるペプチドである。本発明ペプチドはＩＥＸ−１の連続する８〜１１個のアミノ酸残基からなることが好ましい。このようなＩＥＸ−１の部分ペプチドの具体例として、ＩＥＸ４７−５６、（配列番号：１）、ＩＥＸ６１−６９（配列番号：２）、またはＩＥＸ６５−７３（配列番号：３）が挙げられる。ＩＥＸ−１遺伝子の全ヌクレオチド配列および推定のアミノ酸配列は、受入番号ＮＭ＿００３８９７としてGeneBankに登録されている（配列番号：４）。特異的なＣＴＬを誘導する他のＩＥＸ−１由来ペプチドは、本明細書の実施例に準じた方法により容易に決定および選択できる。
【００１２】
「ＨＬＡと結合して特異的なＣＴＬを誘導しうる」とは、本発明のペプチドがＨＬＡと結合して複合体を形成し、かかる複合体をＣＴＬが認識できることをいう。換言すれば、本発明のペプチドが、ＨＬＡとの結合活性を有し、かつ、ＨＬＡとの複合体の形で、ペプチド特異的なＣＴＬを誘導する活性を有することを意味する。本発明において好ましいＨＬＡは、ＨＬＡ−Ａ３３である。
【００１３】
また、本発明は、ＨＬＡと結合して特異的なＣＴＬを誘導しうるＩＥＸ−１由来ペプチドの変異ペプチドであって、同等のＣＴＬ誘導能を有する変異ペプチドも包含する。変異は、本発明のＩＥＸ−１由来ペプチドに対して一個または数個のアミノ酸の欠失、置換、付加、挿入などを行うことにより導入することができ、その手段は当業界にて周知である。変異が他のアミノ酸による置換または付加を含む場合、他のアミノ酸は、天然のアミノ酸またはアミノ酸アナログであってよく、アミノ酸アナログとしては、種々のアミノ酸のＮ−アシル化物、Ｏ−アシル化物、エステル化物、酸アミド化物、アルキル化物等が挙げられる。本発明のペプチドの変異体を得るには、例えば、配列番号１〜３に記載のアミノ酸配列の１〜数個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１個または２個のアミノ酸残基が欠失しているか、他のアミノ酸残基またはアミノ酸アナログで置換された、またはそれが付加された候補ペプチドを合成し、該候補ペプチドとＨＬＡ−Ａ３３分子との複合体がＣＴＬにより認識されるか否かをアッセイすることにより、同定することができる。
【００１４】
アッセイは例えば、後述するＣＴＬ誘導法に準じて行うことができる。即ち、in vitroで候補ペプチドを添加して刺激した場合に、該候補ペプチドをパルスしたＨＬＡ−Ａ３３陽性細胞を特異的に認識するＣＴＬが誘導されるか否かを調べる。ここで、ＣＴＬ誘導の有無は、例えば、抗原ペプチド提示細胞に反応してＣＴＬが産生する種々のサイトカイン（IFN-γ等）の量を酵素免疫測定法（ELISA）等により測定することによって調べることができる。または、51Crで標識した抗原ペプチド提示細胞に対するＣＴＬの傷害性を測定する方法（51Cr リリースアッセイ、Int．J．Cancer，58:p317,1994）によっても調べることができる。前記アッセイで用いるＨＬＡ−Ａ３３陽性細胞としては、実施例に記載のＨＬＡ−Ａ３３陽性細胞が挙げられる。
変異ペプチドのアミノ酸残基数は、抗原提示細胞表面上に提示され、かつＣＴＬ認識エピトープとしての性質を有する数であればよく、通常少なくとも約８個以上であり、好ましくは約９個以上であって、１２個以下、好ましくは１１以下、さらに好ましくは１０個以下である。特に好ましアミノ酸残基数は９個ないし１０個である。
【００１５】
本発明はさらに、特異的なＣＴＬの誘導活性を有する、本発明のＩＥＸ−１由来ペプチドまたはその変異ペプチドを含有するポリペプチドを包含する。ポリペプチドを構成するアミノ酸数は、特に限定されず、本発明が属する分野での技術常識に従う。通常、アミノ酸残基数約１００個以下の長さであり、好ましくは約５０個以下、より好ましくは約３０個以下程度である。
本発明のポリペプチドはＨＬＡ−Ａ３３陽性細胞内で断片化されて特異的ＣＴＬ誘導活性を有するペプチド断片を与えることができるものである。そのようなポリペプチドは、配列番号：１、配列番号：２、または配列番号：３で示される本発明のペプチドに相当する部分配列、または本発明ペプチドの変異体に相当する配列を含有することが特に好ましい。
【００１６】
また、機能を著しく障害しない程度に構成アミノ酸またはカルボキシル基などを修飾して、本発明のペプチドおよびポリペプチドを改変することもできる。例えば、Ｎ末端や遊離のアミノ基には、ホルミル基、アセチル基、ｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）基等が結合していてもよく、抗原ペプチドのＣ末端や遊離のカルボキシル基には、メチル基、エチル基、ｔ−ブチル基、ベンジル基等が結合していてもよい。さらに、本発明のペプチドは、生体内への導入を容易にするように、修飾されていてもよい。
一般に、ＨＬＡ分子と結合する腫瘍抗原 ペプチドのアミノ酸配列には、ＨＬＡの型により異なるモチーフ（規則的配列）が存在することが知られており、変異または改変は、そのモチーフ上、許容されるものであることが好ましい。変異の導入において、ペプチドまたはポリペプチドの基本的な性質（物性、機能、生理活性または免疫学的活性等）を変化させないという観点からは、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互置換は容易に想定される。
本発明のペプチドおよびポリペプチドは、ペプチド化学における一般的な公知方法により製造できる。
【００１７】
「抗原提示細胞（ＡＰＣ）」とは、ＨＬＡと抗原ペプチドとの複合体を細胞表面に提示する細胞を意味する。従って、抗原提示細胞は、本発明の腫瘍抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ３３分子との複合体を細胞表面に提示することにより、ＨＬＡ−Ａ３３拘束性ＣＴＬの活性化をもたらす機能を有する。そのような細胞には、ＣＴＬ細胞障害作用の標的である腫瘍細胞も含まれる。
本発明の抗原提示細胞は、単離された抗原提示能を有する細胞の表面に、ＨＬＡ−Ａ３３分子と本発明の腫瘍抗原ペプチドとの複合体を提示している。そのような細胞は、in vitroで誘導することもでき、具体的には、ＨＬＡ−Ａ３３陽性の抗原提示能を有する細胞に本発明の腫瘍抗原ペプチドをパルスしてＨＬＡ−Ａ３３と該ペプチドとの複合体をその細胞表面に提示させることにより得られる。「抗原提示能を有する細胞」とは、本発明の腫瘍抗原ペプチドを提示可能なＨＬＡ-Ａ２４抗原を細胞表面に発現している細胞であれば特に限定されないが、特に抗原提示能が高いとされる樹状細胞が好ましい。特に、ＨＬＡ−Ａ３３陽性腫瘍患者由来の単離された抗原提示能を有する細胞の表面に、ＨＬＡ−Ａ３３分子と本発明の腫瘍抗原ペプチドとの複合体を提示させた抗原提示細胞が好ましい。
【００１８】
核酸分子
本発明の核酸分子は、本発明のＩＥＸ−１由来ペプチドまたはその変異ペプチドおよび該ぺプチドを含むポリペプチドの、アミノ酸配列をコードする一本鎖（相補鎖を含む）および二本鎖ポリヌクレオチドを含む。本発明の核酸分子はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。これら核酸分子がコードするアミノ酸配列を有するペプチドは、それ自体がＣＴＬにより認識され、該ＣＴＬを活性化するか、そのような活性を有するペプチド断片を与えることができ、腫瘍抗原として機能し得る。
また、本発明の核酸分子は、本発明のペプチドをコードする領域に対応する少なくとも２４個以上の塩基からなるポリヌクレオチドおよびその相補鎖であってよい。このようなポリヌクレオチドは、例えば公知のタンパク質発現系を利用して発現ペプチドを確認することにより選択できる。
【００１９】
抗体
本発明の抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれであってもよい。本発明のＩＥＸ−１由来ペプチドまたはポリペプチドの中から選ばれる１つのペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列中、連続する少なくとも５個のアミノ酸残基からなるエピトープペプチドまたはポリペプチドを特異的に認識するものである。
抗体はそれらのエピトープペプチドを使用して作製でき、そのエピトープペプチドは少なくとも５個、好ましくは少なくとも８〜１０個のアミノ酸で構成される。本発明は、この少なくとも５個のアミノ酸残基からなるペプチドおよびそれをコードする核酸分子も包含する。
本発明の抗体は、エピトープペプチドを単独で、または担体と結合した形で、アジュバントの存在または非存在下に例えばマウス、ラット、ウサギ、ヤギ等に免疫し産生を誘導することができる。得られたポリクローナル抗体は、公知の方法により血清から回収することができる。
一方、モノクローナル抗体は、上記のように免疫応答を誘導した動物から回収した抗体産生細胞を、永久増殖性細胞と融合することで生産できる。本方法は当業界において周知である。
これらのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は、精製用抗体、試薬、標識マーカー等として利用することができる。また、ヒト型化して治療用に供する場合もあり得る。
【００２０】
医薬組成物
本発明の医薬組成物は、本発明のＩＥＸ−１由来ペプチド、変異体ペプチド、ポリペプチド、ＨＬＡ分子とペプチドとの複合体を細胞表面に提示している抗原提示細胞、ペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸分子、該核酸分子の塩基配列情報に基づき作製した組換えベクター、または本発明の抗体を、単独または複数組み合わせて利用することにより調製できる。
具体的には、本発明のＩＥＸ−１由来ペプチドまたはその変異体、該ペプチドを含むポリペプチド、抗原提示細胞は癌ワクチンとして使用することができる。一種類のペプチドでも癌ワクチンとして有効であるが、複数種類のペプチドを組み合わせて使用するのが好ましい。これは、癌患者のＣＴＬが複数の異なる種類の腫瘍抗原を認識する細胞の集団であることから、複数種類の腫瘍抗原を組み合わせて癌ワクチンとして使用する方がより効果的であると期待されるからである。本発明に係るペプチド等を他のペプチドと共に複数種類組み合わせて使用してもよい。
【００２１】
本発明の癌ワクチンは、適当なアジュバントの存在または非存在下で、単独で、または製薬的に許容される担体と結合して使用することができる。担体は、人体に有害な作用を起こさない限り限定されるものではなく、例えば、セルロース、重合アミノ酸、アルブミン等が使用できる。剤形は、ペプチド製剤について周知の剤形が選択可能である。投与量は、ＣＴＬによる認識性、治療すべき疾患、患者の年齢、体重等により変化するが、ペプチドの場合、活性本体として、通常、0.0001mg〜1000mg、好ましくは0.001mg〜1000mg、より好ましくは0.1mg〜100mg、さらに好ましくは0.1〜10ｍｇ／日／成人ヒトである。これを数日ないし数周あるいは数ヶ月に一回投与する。
【００２２】
本発明の医薬組成物はまた、本発明に係るペプチドをコードする核酸配列を適当なベクターに組み込み、in vivoまたはex vivoで導入するのに利用することができる。ベクターとしては、例えばレトロウィルス、アデノウィルス、ワクシニアウィルス等が挙げられるが、レトロウィルス系が好ましい。投与量は、ＣＴＬによる認識性により変化するが、ＤＮＡ含量として０．１μg-１００ｍｇ／日／成人ヒト、好ましくは１μg−５０ｍｇ／日／成人ヒトである。これを数日ないし数ヶ月に一回投与する。
【００２３】
ＩＥＸ−１反応性ＣＴＬおよびその誘導方法
「ＩＥＸ−１反応性ＣＴＬ」とは、本発明のＩＥＸ−１由来ペプチドまたはその変異体とＨＬＡとの複合体を認識し、誘導されるＣＴＬを意味する。該ＣＴＬはＨＬＡ−Ａ３３拘束性ＣＴＬである。
そのようなＣＴＬは、例えばＨＬＡ−Ａ３３＋胃癌患者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から本発明に係るペプチドを用いて誘導することができる。
つまり、本発明のペプチドでパルスした抗原提示細胞（ＡＰＣ）とともにＨＬＡ−Ａ３３＋胃癌患者のＰＢＭＣをインキュベートしてＣＴＬを誘導し、ＩＦＮ-γ産生を指標として評価する。さらに、誘導されたＣＴＬの活性は、51Ｃｒ放出試験等により腫瘍細胞傷害性を指標として確認できる。
【００２４】
上記の方法は、in vitroで誘導した抗原特異的ＣＴＬを患者体内に戻し腫瘍細胞を傷害する、養子免疫療法に利用できる。すなわち、メラノーマにおいては、患者本人の腫瘍内浸潤Ｔ細胞を体外で大量に培養して、これを患者に戻す養子免疫療法に治療効果が認められている（J. Natl.Cancer.Inst.,86:1159、1994）。またマウスのメラノーマにおいては、脾細胞をin vitroで腫瘍抗原ペプチドTRP-2で刺激し、腫瘍抗原ペプチドに特異的なＣＴＬを増殖させ、該ＣＴＬをメラノーマ移植マウスに投与することにより、転移抑制が認められている（J. Exp.Med.，185:453, 1997）。これは、抗原提示細胞のＨＬＡ抗原と腫瘍抗原ペプチドとの複合体を特異的に認識するＣＴＬをin vitroで増殖させた結果に基づくものである。本発明の腫瘍抗原ペプチドを用いて、in vitroで患者末梢血リンパ球を刺激して腫瘍特異的ＣＴＬを増やした後、このＣＴＬを患者に戻すことにより腫瘍を治療することが可能である。
【００２５】
以下、本発明を実施例によってより詳細に説明するが、本発明は下記実施例によっていかなる意味においても制限されるものではない。
【実施例】
【００２６】
本発明には、以下の癌細胞株を使用した。
胃腺癌 ＭＫＮ−２８、ＭＫＮ−４５、ＳＳＴＷ−９、ＫＡＴＯ−ＩＩＩ、ＫＷＳ、およびＨＧＣ−２７；肺腺癌 ＬＣ−１；肺偏平上皮癌 ＱＧ−５６；頭頸部癌 ＫＵＭＡ−１；大腸腺癌 ＳＷ６２０およびＣＯＬＯ２０１；膵臓腺癌 Ｐａｎｃ−１；ヒト慢性骨髄性白血病 Ｋ５６２。これらの腫瘍細胞のＨＬＡクラスＩ遺伝子型は以前に示されている（文献１０、１１）。
これらの細胞上のＨＬＡクラスＩまたはＨＬＡ−Ａ３３抗原の発現は、抗ＨＬＡクラスＩ（Ｗ６／３２）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（ＨＬＡクラスＩ分子の単一形領域を認識）、または抗ＨＬＡ−Ａ３３ｍＡｂ（ＨＬＡ−Ａ３３分子の多形領域を認識）（ＩｇＭ、One Lamda, Canoga Park, CA）を用いて、ＦＡＣＳｃａｎ（Becton Dickinson, San Jose, CA）でのフローサイトメトリーによって測定した。
統計学的解析には、本発明すべてにおいて両側 Student ｔ検定を用いた。
【００２７】
実施例１
（８５０Ｂ−ＣＴＬ株の樹立）
ＨＬＡ−Ａ３３拘束性および腫瘍特異的ＣＬＴ株（８５０Ｂ−ＣＴＬ）は、重症胃腺癌患者（ＨＬＡ−Ａ＊２４０２／Ａ＊３３０３、Ｂ７／Ｂ４４、Ｃｗ７／Ｃｗ１４）のＴＩＬを１０％ＦＣＳ（Equitech Bio, Ingram, TX）、１００Ｕ／ｍｌＩＬ−２（Shionogi Pharmaceutical, Osaka, Japan）、および１０μｇ／ｍｌＰＨＡ（Difco, Detroit, MI）含有培養培地（４５％ＲＰＩＭ１６４０培地、４５％ＡＩＭ−Ｖ培地；Life Technologies, Walkersville, MA）で14日間インキュベートし、続いて支持細胞としての放射線照射（３０Ｇｙ）アロジェニック末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の存在下でさらに３０日より長く培養することにより樹立した。本ＣＴＬ株の表現型をＦＩＴＣ結合抗ＣＤ３、ＣＤ４、またはＣＤ８モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いて免疫学的蛍光試験により検討したところ、ＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８＋（＞９５％）であった（データ非提示）。
【００２８】
（８５０Ｂ−ＣＴＬ株の特性）
文献記載の方法に従い、８５０Ｂ−ＣＴＬ株を特性化した（文献９）。
標的細胞を認識することによりＩＦＮ−γを産生する能力について、様々なＥ：Ｔ比（エフェクター細胞：標的細胞）において８５０Ｂ−ＣＴＬ細胞株を試験した。値はＥＬＩＳＡ（検出限界１０ｐｇ／ｍｌ）によるトリプリケート測定の平均を表す。図１Ａに示すように、このＣＴＬ株はＨＬＡ−Ａ３３＋上皮癌細胞、ＬＣ−１およびＫＵＭＡ−１を認識することにより有意なレベルのＩＦＮ−γを産生したが、ＨＬＡ−Ａ３３−標的細胞に対しては反応しなかった。
【００２９】
次に、様々な標的細胞に対する８５０Ｂ−ＣＴＬの細胞傷害活性を、相異なるＥ：Ｔ比において６時間51Ｃｒ放出試験により試験した。本方法は既知である（文献９）。値はトリプリケート測定の平均を表す。８５０Ｂ−ＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ３３＋ＬＣ−１およびＫＵＭＡ−１細胞に対してより強い細胞傷害性を示したが、ＨＬＡ−Ａ３３−標的細胞、ＣＯＳ７細胞、ＮＫ標的細胞株、Ｋ５６２、または健常提供者のＰＢＭＣから得たＨＬＡ−Ａ３３＋ＰＨＡ活性化正常Ｔ細胞（ＰＨＡ幼若化細胞）のいずれに対しても示さなかった。
【００３０】
さらにｍＡｂを用いた阻害実験によって、８５０Ｂ−ＣＴＬの反応性を検討した。抗ＨＬＡクラスＩ（Ｗ６／３２、ＩｇＧ２ａ）、抗ＣＤ８（Ｎｕ−Ｔｓ／ｃ、ＩｇＧ２ａ）、抗ＨＬＡ−Ａ２４（００４１ＨＡ、ＩｇＧ２ａ）、抗ＣＤ４（Ｎｕ−Ｔｈ／ｉ、ＩｇＧ１）、抗ＨＬＡクラスＩＢ,Ｃ（Ｂ１−２３、ＩｇＧ２ａ）、および抗ＨＬＡクラスＩＩ（Ｈ−ＤＲ、ＩｇＧ２ａ）ｍＡｂ（２０μｇ／ｍｌ）を文献記載の方法と同様に使用した（文献１０、１１）。アイソタイプ適合対照ｍＡｂとして、抗ＣＤ１４（ＪＭＬ−Ｈ１４、ＩｇＧ１）または抗ＣＤ１３（ＭＣＳ2、ＩｇＧ２ａ）を準備した。
ＨＬＡ−Ａ３３＋ＬＣ−１細胞の認識による８５０Ｂ−ＣＴＬからのＩＦＮ−γ産生は、抗ＨＬＡクラスＩおよび抗ＣＤ８ｍＡｂ（２０μｇ／ｍｌ）によって阻害されたが、抗ＨＬＡ−Ｂ, Ｃ、抗ＨＬＡクラスＩＩ、抗ＨＬＡ−Ａ２４、抗ＣＤ４、または無関係なアイソタイプ適合抗ＣＤ１３または抗ＣＤ１４ｍＡｂによっては阻害されなかった（図１Ｃ）。
これらの結果は、８５０Ｂ−ＣＴＬ株が腫瘍細胞に対してはＨＬＡ−Ａ３３拘束性細胞傷害性を示すが、正常細胞に対しては示さないことを意味している。
【００３１】
実施例２
（ＩＥＸ−１遺伝子の同定）
遺伝子発現クローニング法（文献９）により、８５０Ｂ−ＣＴＬ株によって認識される腫瘍抗原をコードする遺伝子を同定した。
ＬＣ−１肺腺癌細胞のポリ（Ａ）＋ＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、ＳａｌＩアダプターをライゲートし、そして発現ベクターｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−６（Invitrogen, San Diego, CA）に挿入した。ＨＬＡ−Ａ＊３３０３またはＨＬＡ−Ａ＊２６０１のｃＤＮＡをそれぞれＫＵＭＡ−１またはＫＥ４細胞より回収したＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって作製し、真核細胞発現ベクターｐＣＲ３（Invitrogen）へ挿入してクローニングした。ＬＣ−１ｃＤＮＡライブラリーのプラスミドＤＮＡプールまたはクローン（２００ｎｇ）、およびＨＬＡ−Ａ＊３３０３またはＨＬＡ−Ａ＊２６０１（陰性対照）ｃＤＮＡ（２００ｎｇ）、の両方を、１μｌのリポフェクタミン（Invitrogen）と１２０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Invitrogen）中で４０分間混合した。ＣＯＳ７細胞（５ｘ１０３）をこの混合物５０μｌと６時間インキュベートし、続いて１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地１５０μｌを添加した。２日間培養した後８５０Ｂ−ＣＴＬ（２ｘ１０５細胞／ウェル）を添加し、その後１８時間インキュベートし、上清１００μｌを回収してＥＬＩＳＡによりデュプリケート試験でＩＦＮ−γを測定した（文献９）。
【００３２】
一次スクリーニングにおいて、ＬＣ−１ｃＤＮＡライブラリーから得た１ｘ１０５クローンすべてを、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３ｃＤＮＡとともにＣＯＳ７細胞にトランスフェクションした後に、８５０Ｂ−ＣＴＬによるＩＦＮ−γ産生を刺激する能力について試験した。すなわち、ｃＤＮＡプール（１ｘ１０５クローン）を９６平底プレート中の約２０００の相違するウェルにデュプリケートで分割した（各ウェルの期待されるクローン数：１００クローン／ウェル）。一次スクリーニングでは、１０の異なるウェルで有意なレベルのＩＦＮ−γ産生が得られた。二次スクリーニングとして、陽性ウェルからクローン化して得た各ｃＤＮＡプールを９６平底プレートの約２００の異なるウェルにデュプリケートで分割し、ＩＦＮ−γ産生刺激活性について試験した。
二次スクリーニングの後、更なるアッセイのための二つの陽性クローンを同定した。ＤＮＡシークエンスキットおよびABI PRISM 377 DNA シークエンサー（Perkin-Elmer, Foster, CA）を使用したジデオキシヌクレオチドシークエンス法によりＤＮＡシークエンスを行った。単離された遺伝子の一つについて以下の検討を行った。
【００３３】
図２に示されるように、クローン１およびＨＬＡ−Ａ＊３３０３をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞は、用量依存的に８５０Ｂ−ＣＴＬにおけるＩＦＮ−γ産生を誘導したが、陰性対照としてクローン１とＨＬＡ−Ａ＊２６０１をトランスフェクトした細胞は誘導しなかった。それに対し、クローン１またはＨＬＡ−Ａ＊３３０３のいずれかを単独でトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞は８５０Ｂ−ＣＴＬに認識されなかった（データ非提示）。さらに、ＬＣ−１ｃＤＮＡライブラリーから得られた陰性対照として使用した他のクローンは、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３とともにＣＯＳ７細胞にトランスフェクトした場合に８５０Ｂ−ＣＴＬにおけるＩＦＮ−γ産生を誘導できなかった（データ非提示）。このことはクローン１が８５０Ｂ−ＣＴＬによって特異的に認識される腫瘍抗原をコードすることを示唆している。
GeneBankの検索によって、クローン１のヌクレオチド配列は、ストレス誘導抗アポトーシス遺伝子として報告されているＩＥＸ−１（文献１７）の配列と同一であることがわかった。
【００３４】
実施例３
（正常および癌組織におけるＩＥＸ−１ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現）
様々な腫瘍または正常組織（Multiple Tissue Northern Blots, Clontech, Tokyo, Japan）におけるＩＥＸ−１ｍＲＮＡの発現を、以前に記載した方法に従い３２Ｐ標識ＩＥＸ−１プローブを用いてノーザンブロット解析によって調べた（文献９）（図３Ａ、レーン１：脳、レーン２：心臓、レーン３：骨格筋、レーン４：大腸、レーン５：胸腺、レーン６：脾臓、レーン７：腎臓、レーン８：肝臓、レーン９：小腸、レーン１０：胎盤、レーン１１：肺、レーン１２：ＰＢＬ）。β-アクチンプローブを対照として使用した。図３Ａに示すように、脳（レーン１）を除き試験したすべての正常組織において約〜１．３ｋｂのバンドがはっきりと検出され、心臓（レーン２）、腎臓（レーン７）、肺（レーン１１）、または末梢血リンパ球（ＰＢＬ）（レーン１２）において特に発現が高く、胸腺（レーン５）、脾臓（レーン６）、肝臓（レーン８）、または小腸（レーン９）においては発現が低かった。
【００３５】
次に、正常および癌細胞におけるＩＥＸ−１遺伝子のｍＲＮＡ発現をノーザンブロット解析により検討した（図３Ｂ、レーン1：ＰＢＬ、レーン２：ＭＫＮ４５、レーン３：ＭＫＮ２８、レーン４：ＳＳＴＷ、レーン５：ＨＧＣ２７、レーン６：ＬＣ−１、レーン７：ＱＧ５６、レーン８：ＫＵＭＡ−１、レーン９：Ｐａｎｃ−１、レーン１０：ＳＷ６２０、レーン１１：ＣＯＬＯ２０１、レーン１２：ＫＡＴＯ−ＩＩＩ）。ＩＥＸ−１は、ＨＣＧ２７胃癌細胞株（レーン５）を除き、胃（レーン２−４、１２）、肺（レーン６、７）、頭頸部（レーン８）、膵臓（レーン９）、および大腸（レーン１０、１１）を含む様々な臓器に由来する、被験腺癌およびＳＣＣ細胞株のほとんどにおいて高発現していた。
これらの結果は、この遺伝子があらゆる癌および正常組織において発現していることを意味する。
【００３６】
さらに、様々な腫瘍組織におけるこの遺伝子の発現をタンパク質レベルで検討した。ＩＥＸ−１タンパク質の発現は、抗ＩＥＸ−１抗体（Santa-Cruz biotechnology, Santa-Cruz, CA）とともにVentana Medical Systems 自動化装置（Tucson, AZ）を使用して、ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片上で免疫組織化学によって評価した。
胃癌組織における代表的染色を示す（図３Ｃ）。胃癌においてＩＥＸ−１タンパク質の発現は癌細胞で選択的に増強されていたが、周囲の正常上皮または結合組織においては増強されていなかった。ＩＥＸ−１タンパク質は、乳癌（図３Ｄ）、肺癌（図３Ｅ）、および大腸癌（データ非提示）を含む様々な型の癌組織においてもまた、高くかつ選択的に発現していた。なお、図３Ｃ〜Ｅにおいて、ＩＥＸ−１タンパク質は茶色に染まっており、正常細胞および結合組織は茶色に染まっていない。これら、茶色に染まった数箇所を、便宜上、矢印で示した。
以上の結果より、ＩＥＸ−１は癌の治療において理想的な標的分子の一つであるといえる。
【００３７】
実施例４
（８５０−Ｂ ＣＴＬによって認識されるＩＥＸ−１由来抗原性ペプチドの同定）
ＩＥＸ−１の抗原性エピトープとしてＣＴＬに認識され得るペプチドを同定するため以下の実験を行った。
ＩＥＸ−１の推定アミノ酸配列においてＨＬＡ−Ａ３３分子に結合するためのモチーフ（文献１８、１９）を有する可能性のあるペプチド配列の中で、コンピューター解析（Bioinformatics and Molecular Analysis Section (BIMAS), NIH, Bethesda, MD）ではＨＬＡ−Ａ３３に対してより強い結合活性を有する８の相異なるペプチドを使用した。BioSynthesis, Lewisville, TXより純度＞９５％のペプチドを得た。ペプチド結合アッセイには、ＲＭＡ−Ｓ−Ａ３３細胞（ＨＬＡ−Ａ＊３３０３ｃＤＮＡを安定的にトランスフェクトしたＲＭＡ−Ｓタップ（ペプチドプロセシングに関与するトランスポーター）欠損マウスリンパ腫細胞（Hiroko Takedatsu, et al., Identification of Peptide Vaccine Candidates Sharing Among HLA-A3, -A11, -A31, and -A33 Cancer Patients., Clin Can Res, 2004, in press）（１ｘ１０４細胞／ウェル）を使用した。簡単に言うと、細胞を２６℃で１８時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、細胞（１ｘ１０６細胞）をOpti-MEM（ヒトβ２-ミクログロブリン３μｇ／ｍｌおよびペプチド１０μｇ／ｍｌ含有）に懸濁し、続いて２６℃で３時間そして３７℃で３時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を抗ＨＬＡ−Ａ３３ｍＡｂと４℃で３０分間インキュベートし、続いてＦＩＴＣ結合ウサギ抗マウスＩｇＭ抗体（Cappel, Aurora, OH）と４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳｃａｎで解析し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）により結合活性を評価した。２６℃で、ＴＲＰ２−１９７ペプチド（参考ペプチド）でパルスした細胞、およびパルスしていない細胞も使用した。表１に示すように、若干親和性は異なるが、８ペプチド全てがＲＭＡ−Ｓ−Ａ３３細胞に結合できた。
【表１】
【００３８】
８５０Ｂ-ＣＴＬ株によって認識される抗原性ペプチドの検出のため、Ｃ１Ｒ−Ａ３３細胞（ＨＬＡ−Ａ＊３３０３ｃＤＮＡをトランスフェクトして安定的に発現させたＣ１Ｒヒト多発性骨髄腫細胞（Hiroko Takedatsu, et al., Clin Can Res, 2004, in press）を指示濃度のペプチドとともに培養した。二時間後、８５０Ｂ−ＣＴＬ（２ｘ１０５細胞/ウェル）を添加し、さらに１８時間インキュベートした。培養上清中のＩＦＮ−γの産生はＥＬＩＳＡにより測定した。
ペプチド非ロードＣ１Ｒ−Ａ３３細胞に応答した８５０Ｂ−ＣＴＬによるＩＦＮ−γ産生をバックグラウンドとして、その値から差し引いた。値はトリプリケート試験の平均を示す。
【００３９】
これらペプチドのうち３つ、ＩＥＸ４７−５６、ＩＥＸ６１−６９、およびＩＥＸ６５−７３が、有意なレベルのＩＦＮ−γ産生を用量依存的に誘導した（図４Ａ、４Ｂ）。ＨＬＡ−Ａ３３トランスフェクトＣ１Ｒ細胞上にロードするのに最適な三つのペプチドの濃度は、各ペプチドにおいて０．１−１μＭの範囲にわたり様々であったが（図４Ｂ）、ＲＭＡ−Ｓ−Ａ３３細胞により決定されたＨＬＡ−Ａ３３分子に対するそれらの結合親和性（表１）には依存していなかった。
以上の結果に基づき、ＩＥＸ４７−５６、ＩＥＸ６１−６９、およびＩＥＸ６５−７３を、８５０Ｂ−ＣＴＬ株によって認識されるＩＥＸ−１由来抗原性ペプチドとして同定した。
【００４０】
実施例５
（ＩＥＸ−１由来ペプチドによるＣＴＬの誘導）
ＩＥＸ４７−５６、ＩＥＸ６１−６９、およびＩＥＸ６５−７３ペプチドのＨＬＡ−Ａ３３拘束性および腫瘍特異的ＣＴＬ誘導能について、ＨＬＡ−Ａ３３＋上皮癌患者（ｎ＝４、胃癌患者（２）、肺癌患者（１）、前立腺癌（１））およびＨＬＡ−Ａ３３＋健常人（ＨＤ）のＰＢＭＣにおいて試験した。
ＨＬＡ−Ａ３３＋癌患者およびＨＬＡ−Ａ３３＋健常人ＰＢＭＣ（１ｘ１０５／ウェル）を、９６穴マイクロカルチャープレート(Nunc, Roskiide, Denmark)においてＩＬ−２含有培養液２００μｌ中で各ペプチド（１０μＭ）とインキュベートした（文献１３）。１４日目に各ウェルから別個にペプチド刺激ＰＢＭＣ（８０−１２０ｘ１０４／ウェル）を回収し、洗浄し、４等分した。２つは対応するペプチドをロードしたＣ１Ｒ−Ａ３３細胞で、残りの二つは陰性対照のＨＩＶペプチドをロードしたＣ１Ｒ−Ａ３３細胞で刺激した。１８時間後、上清を回収しそれらのＩＦＮ−γ産生活性について試験した。
４人の患者の代表例を図５に示す。ＨＩＶペプチドに対するＩＦＮ−γ産生（＜５０ｐｇ／ｍｌ）をバックグラウンドとして差し引いた。これら３つのぺプチドで刺激した癌患者由来ＰＢＭＣは、ほとんどの場合において対応するペプチドをロードしたＨＬＡ−Ａ３３トランスフェクトＣ１Ｒ細胞を認識して有意な量のＩＦＮ−γを産生した（図５）。それに対して、５人のＨＤから得たＰＢＭＣはそれらに対して有意な量のＩＦＮ−γを産生しなかった（データ非提示）。
【００４１】
次に、ペプチド誘導ＣＴＬの腫瘍細胞傷害活性を検討した。
有意な量のＩＦＮ−γを産生できた細胞を回収し、ＩＬ−２単独でさらに１０−１４日間培養し、相異なるＥ：Ｔ比で６時間５１Ｃｒ放出試験を行った（文献１３）。ＬＣ−１（ＨＬＡ−Ａ３３＋ＩＥＸ−１＋）、ＱＧ５６（ＨＬＡ−Ａ３３−ＩＥＸ−１＋）、およびＨＧＣ２７（ＨＬＡ−Ａ３３−ＩＥＸ−１−）に対する細胞傷害活性を計測した。対照として、非抗原性ＩＥＸ−１由来ペプチド、ＩＥＸ４３−５１によって刺激した癌患者のＰＢＭＣを使用した。値はトリプリケート測定の平均を示す。
図６に示すように、ＩＥＸ−１由来ペプチドで刺激されたＰＢＭＣは、ＨＬＡ−Ａ３３＋ＩＥＸ−１＋ＬＣ−１腫瘍細胞に対して有意なレベルの細胞傷害性を示したが、ＨＬＡ−Ａ３３−ＨＧＣ２７またはＱＧ５６細胞に対しては示さなかった。また、ＩＥＸ４３−５１（陰性対照ペプチド）は特異的ＣＴＬ活性を示さなかった。この結果は、ＩＥＸ４７−５６、ＩＥＸ６１−６９、およびＩＥＸ６５−７３が、上皮癌患者のＰＢＭＣにおいてＨＬＡ−Ａ３３拘束性に特異的ＣＴＬを誘導できる抗原性エピトープペプチドであることを示唆している。
【００４２】
さらに、細胞傷害性の拘束性およびペプチド特異性を阻害試験および競合試験により確認した。
阻害試験には、抗ＨＬＡクラスＩ（Ｗ６／３２、ＩｇＧ２ａ）、抗ＨＬＡクラスＩＩ（Ｈ−ＤＲ、ＩｇＧ２ａ）、抗ＣＤ８（Ｎｕ−Ｔｓ／ｃ、ＩｇＧ２ａ）、抗ＣＤ４（Ｎｕ−Ｔｈ／ｉ、ＩｇＧ１）（２０μｇ／ｍｌ）を使用した。抗ＣＤ１４（ＪＭＬ−Ｈ１４、ＩｇＧ２ａ）ｍＡｂを対照として使用した。
これらペプチド刺激ＰＢＭＣの細胞傷害性は、試験したすべてのケースで抗ＨＬＡクラスＩまたは抗ＣＤ８抗体によって有意に阻害されたが、他のｍＡｂよっては阻害されなかった（図７）。
競合試験では、対応ペプチドまたはＨＩＶペプチド（陰性対照）でパルスした非標識Ｃ１Ｒ細胞を５１Ｃｒ放出試験に非標識細胞対標識細胞の比率を１０対１で添加した。１０：１のＥ／Ｔ比で５１Ｃｒ放出試験を行った。値は特異的傷害活性（％）の平均±ＳＤを示す。
対応ペプチドパルスＣ１Ｒ−Ａ３３細胞を添加することにより細胞傷害性は阻害されたが、ＨＩＶペプチドパルス細胞では阻害されなかった（図８）。
以上の結果は、ペプチド特異的ＣＴＬ活性が、主としてＨＬＡ−ＡクラスＩ拘束性にＣＤ８＋Ｔ細胞によって発揮されることを示唆している。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明は、ＩＥＸ−１が、胃腺癌に浸潤しているＴ細胞より樹立されたＨＬＡ拘束性および腫瘍特異的ＣＴＬにより認識される腫瘍抗原性エピトープをコードしていることを開示するものである。また、本発明はＩＥＸ−１由来抗原性ペプチドが癌患者のＰＢＭＣ培養においてＨＬＡ拘束性に腫瘍特異的ＣＴＬを誘導できることをも開示するものである。
ＩＥＸ−１は、正常組織、特に、心臓、腎臓、肺およびＰＢＬにおいても発現しているので、これらの臓器はＩＥＸ−１由来抗原性エピトープによる特異的免疫療法の有害事象となる恐れがある。しかしながら、本発明は８５０−ＢＣＴＬ株およびＩＥＸ−１由来ペプチドにより誘導されたＣＴＬのいずれもＨＬＡ−Ａ３３＋腫瘍細胞を溶解する一方、過剰量の対応ペプチドが培養中に存在するにも拘わらずＰＨＡ活性化正常ＨＬＡ−Ａ３３＋Ｔ細胞は傷害しないことを明らかにした。また、発明者らが行っている腫瘍抗原由来ペプチドワクチンを用いる臨床試験では、腫瘍抗原のいくつかは正常組織または臓器に広く発現しているにも拘わらず、深刻な有害事象は観察されていない（文献４−７）。
従って、以上の結果は、本発明のＩＥＸ−１由来ペプチドが癌治療に適したペプチドワクチンとして使用可能であることを示唆している。
【００４４】
また、放射線照射およびいくつかの化学療法薬が、比較的高いレベルでＩＥＸ−１発現を誘導することが報告されているので（文献２６、３０）、本発明のＩＥＸ−１分子を標的とした特異的免疫療法は、特に化学療法または放射線療法抵抗性癌を患う患者の処置にとって新規で魅力的な方法となり得る。
ＨＬＡ−Ａ３３は、アジア人および黒人において最も一般的なＨＬＡ−Ａアレルの一つであり、日本人の１３％、韓国人の１４％、白人の１４％、および黒人の１６％に見られる（文献１４、１５）。またＩＥＸ−１は癌組織に高発現している。従って、本発明の抗原ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ３３＋癌患者に対する特異的免疫療法に広く利用可能であろう。
【００４５】
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文献２６：Grobe, O., Arlt, A., Ungefroren, H., Krupp, G., Folsch, U. R., Schmidt, W. E., and Schafer, H. Functional disruption of IEX-1 expression by concatemeric hammerhead ribozymes alters growth properties of 293 cells. FEBS Lett, 494: 196-200, 2001.
文献２７：Zhang, Y., Schlossman, S. F., Edwards, R. A., Ou, C. N., Gu, J., and Wu, M. X. Impaired apoptosis, extended duration of immune responses, and a lupus-like autoimmune disease in IEX-1-transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A, 99: 878-883, 2002.
文献２８：Garcia, J., Ye, Y., Arranz, V., Letourneux, C., Pezeron, G., and Porteu, F. IEX-1: a new ERK substrate involved in both ERK survival activity and ERK activation. Embo J, 21: 5151-5163, 2002.
文献２９：Huang, Y. H., Wu, J. Y., Zhang, Y., and Wu, M. X. Synergistic and opposing regulation of the stress-responsive gene IEX-1 by p53, c-Myc, and multiple NF-kappaB/rel complexes. Oncogene, 21: 6819-6828, 2002.
文献３０：Kondratyev, A. D., Chung, K. N., and Jung, M. O. Identification and characterization of a radiation-inducible glycosylated human early-response gene. Cancer Res, 56: 1498-1502, 1996.
文献３１：Kittlesen, D. J., Thompson, L. W., Gulden, P. H., Skipper, J. C., Colella, T. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F., Engelhard, V. H., Slingluff, C. L., Jr., and Shabanowitz, J. A. Human melanoma patients recognize an HLA-A1-restricted ＣＴＬ epitope from tyrosinase containing two cysteine residues: implications for tumor vaccine development. J Immunol, 160: 2099-2106, 1998.
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌患者に対する免疫療法に利用可能なストレス誘導抗アポトーシス分子（ＩＥＸ−１）由来ペプチドに関する。詳細には、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）により認識され、特異的なＣＴＬを誘導する、ＩＥＸ−１由来ペプチド、該ペプチドを含むポリペプチドおよびこれらペプチドを含む癌ワクチン等に関する。
【背景技術】
【０００２】
胃癌は、世界で最も普遍的に発生する悪性腫瘍の一つである（文献１−６）。本疾患は、早期では予後は一般的に良好であるが、進行癌においては、外科的切除、化学療法、および放射線療法などの既存の治療法が最近顕著に進歩しているにも係らず、予後が非常に悪い。それゆえ、進行段階の胃癌患者を処置するため、新しい特異的免疫療法のような新規な治療法の開発が必要とされている。
【０００３】
近年、ヒト腫瘍がＣＴＬに認識される抗原性ペプチドを発現していることが明らかになってきており、このようなペプチドはＨＬＡ−Ａ２またはＡ２４アレルを有する癌患者に対するペプチドワクチンとして使用されている（文献１−７）。ＨＬＡ−Ａ２またはＡ２４拘束性ＣＴＬにより認識されるエピトープペプチドについては多くの報告がなされており（文献８−１１）、本発明者らも、最近、ペプチドワクチン処置がＨＬＡ−Ａ２またはＡ２４重症胃癌患者の全体的生存率を延長することを報告した（文献４）。
一方、ＨＬＡ−Ａ３３アレルは世界中の様々な人種において比較的広く発現しているにも拘わらず（文献１４、１５）、ＨＬＡ−Ａ３３拘束性ＣＴＬにより認識される抗原およびペプチドについての報告は非常に限られている（文献１２、１３）。このことは、ＨＬＡ−Ａ３３＋癌患者に対するペプチド基盤特異的免疫療法の開発を妨げている。
【０００４】
ＩＥＸ−１（immediate early response gene X-1)(ｐ２２／ＰＲＧ１（文献２０）、Ｄｉｆ−２（文献２１）、またはマウスホモログｇｙｌ９６（文献２２）としてもまた知られる）は、ストレス誘導遺伝子であり、細胞周期進行およびアポトーシスの調節に関与する。ＩＥＸ−１は、ＴＮＦおよびＦａｓのような様々なアポトーシス誘発因子により誘導されるアポトーシスに対する細胞抵抗性に重要な役割を果たすこと（文献２３）、およびいくつかの細胞株において細胞周期進行を加速すること（文献２４−２６）が報告されている。また、in vivoにおけるＴリンパ球の活性化誘導細胞死に対するＩＥＸ−１の抗アポトーシス効果も報告されている（文献２７）。
ＩＥＸ−１の発現は、放射線照射、成長因子、ウィルス感染、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βのような炎症性サイトカイン、リポポリサッカライド、およびステロイドホルモンを含むいくつかの細胞ストレスによって急速に活性化され得る（文献２７）。ＩＥＸ−１はもともとＮＦ−κＢ／ｒeｌ標的遺伝子として同定されたが（文献２３）、ＩＥＸ−１プロモーターには例えばｐ５３、ＳＰ−１およびｃ−Ｍｙｃのような他の転写因子のためのコンセンサス配列がいくつか含まれる（文献７）。例えば、腫瘍細胞に共通する癌抑制遺伝子ｐ５３の変異がＩＥＸ−１発現を上昇させることが示されている（文献２９）。
以上のように、ＩＥＸ−１は腫瘍細胞の悪性形質転換に関与することが示唆されているが、腫瘍細胞において抗原性ペプチドとして機能するＩＥＸ−１エピトープペプチドは知られていなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ＨＬＡ−Ａ３３＋癌患者に対する癌ワクチンの開発に有用な抗原ペプチドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、重症胃癌患者の腫瘍組織浸潤リンパ球（ＴＩＬ）からＨＬＡ−Ａ３３拘束性ＣＴＬ株を樹立し、ＩＥＸ−１由来の三つのＨＬＡ−Ａ３３結合エピトープを、本細胞株により認識される腫瘍抗原として同定した。さらに、これらの抗原性エピトープが悪性腫瘍疾患患者のＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）においてペプチド特異的ＣＴＬを誘導することを確認したことにより、本発明を完成した。
【０００７】
即ち本発明は、以下を包含する。
（１）細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）によって認識され、特異的なＣＴＬを誘導する、ストレス誘導抗アポトーシス分子（ＩＥＸ−１）由来のペプチドまたはその変異ペプチド。
（２）ＣＴＬがＨＬＡ−Ａ３３拘束性に認識する、（１）記載のペプチド。
（３）連続する８〜１１個のアミノ酸残基からなる、（１）または（２）に記載のペプチド。
（４）配列番号１〜３のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチド、または配列番号１〜３のいずれかに示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＨＬＡ−Ａ３３分子と結合して特異的なＣＴＬを誘導するペプチドである、（１）〜（３）のいずれかに記載のペプチド。
（５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載のペプチドを含むポリペプチド。
（６）単離された抗原提示能を有する細胞の表面に、ＨＬＡ−Ａ３３分子と（１）〜（４）のいずれかに記載のペプチドとの複合体を提示させてなる、抗原提示細胞。
（７）上記（１）〜（４）のいずれかに記載のペプチド、または（５）記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
（８）上記（７）記載の核酸分子を含有するベクター。
（９）上記（１）〜（４）のいずれかに記載のペプチド、（５）記載のポリペプチド、（６）記載の抗原提示細胞、（７）記載の核酸分子、または（８）記載のベクターを含む、特異的なＣＴＬを誘導するための医薬組成物。
（１０）癌ワクチンである、（９）記載の医薬組成物。
（１１）上記（１）〜（４）のいずれかに記載のペプチドとＨＬＡとの複合体、または（６）記載の抗原提示細胞に提示された複合体を認識する、ＩＥＸ−１反応性ＣＴＬ。
（１２）上記（１）〜（４）のいずれかに記載のペプチド、（５）記載のポリペプチド、または（６）記載の抗原提示細胞を用いてＩＥＸ−１反応性ＣＴＬを誘導する方法。
（１３）上記（１）〜（４）のいずれかに記載のペプチドまたは（５）記載のポリペプチドを特異的に認識する抗体。
（１４）次の１）または２）に記載のポリペプチドを含む、特異的なＣＴＬを誘導するための医薬組成物：
１）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または
２）配列番号４に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＨＬＡ−Ａ３３分子と結合して特異的なＣＴＬを誘導するペプチドを与えるポリペプチド。
（１５）癌ワクチンである、（１４）記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【０００８】
本発明は、悪性腫瘍、特にＨＬＡ−Ａ３３陽性の癌患者の治療に適したＩＥＸ−１基盤免疫療法を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】胃腺癌患者（ＨＬＡ−Ａ＊２４０２／Ａ＊３３０３、Ｂ７／Ｂ４４、Ｃｗ７／Ｃｗ１４）の腫瘍浸潤生リンパ球（ＴＩＬ）から樹立した、ＨＬＡ−Ａ３３拘束性８５０Ｂ−ＣＴＬ細胞株の特性を示す図である。Ａは種々の標的細胞に対する認識能を、様々なＥ：Ｔ比（エフェクター細胞：標的細胞）におけるＩＦＮ−γの産生に基づき検討した結果を示す。Ｂは種々の標的細胞に対する細胞傷害活性を、相異なるＥ：Ｔ比における６時間５１Ｃｒ放出試験により試験した結果を示す。Ｃは種々のｍＡｂを用いた阻害実験における、８５０Ｂ−ＣＴＬのＨＬＡ−Ａ３３＋ＬＣ−１細胞に対する反応性の差異を示す図である。
【図２】８５０Ｂ−ＣＴＬ細胞株による、同定された腫瘍抗原遺伝子のＨＬＡ−Ａ３３拘束性認識を示す図である。ＬＣ−１肺腺癌細胞ｃＤＮＡライブラリーから遺伝子発現クローニング法で得たクローンと、ＨＬＡ−Ａ３３０３またはＨＬＡ−Ａ２６０１遺伝子を共にトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞に対する８５０Ｂ−ＣＴＬの反応性をＩＦＮ−γ産生に基づいて検討した。
【図３】ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルにおけるＩＥＸ−１の発現を示す図である。Ａは、様々な正常組織におけるＩＥＸ−１ｍＲＮＡの発現を、３２Ｐ標識ＩＥＸ−１プローブを用いるノーザンブロット解析によって調べた結果を示す写真の模写図である。Ｂは正常および癌細胞におけるＩＥＸ−１遺伝子のｍＲＮＡ発現のノーザンブロット解析におけるオートラジオグラフィーを示す写真の模写図である。Ｃ〜Ｅは様々な腫瘍組織におけるＩＥＸ−１の発現をタンパク質レベルで免疫組織化学的に検討した結果を示す顕微鏡写真の模写図である。Ｃは胃癌組織、Ｄは乳癌、Ｅは肺癌における染色を示している。
【図４】ＩＥＸ−１における抗原性エピトープの同定を示す図である。ＩＥＸ−１の推定アミノ酸配列のＨＬＡ−Ａ３３結合性モチーフに基づくコンピュータ解析でＨＬＡ−Ａ３３に対して強い結合活性を有しうる８個の候補ペプチドを選択し、試験した。Ａは、これら８個の候補ペプチドをＣ１Ｒ−Ａ３３細胞（ＨＬＡ−Ａ＊３３０３ｃＤＮＡをトランスフェクトして安定的に発現させたＣ１Ｒヒト多発性骨髄腫細胞）とともに培養し、さらに８５０Ｂ−ＣＴＬを添加して培養した後、培養上清中のＩＦＮ−γの産生をＥＬＩＳＡにより測定した結果を示す。Ｂは、有意なレベルのＩＦＮ−γ産生を誘導した３つのペプチド（ＩＥＸ４７−５６、ＩＥＸ６１−６９、およびＩＥＸ６５−７３ペプチド）及び１つの対照ペプチドの濃度と、ＩＥＸ−１反応性ＣＴＬ誘導活性との関係を検討した結果を示す。
【図５】ペプチドに対する細胞性応答を示す図である。ＩＥＸ４７−５６、ＩＥＸ６１−６９、およびＩＥＸ６５−７３ペプチドでＨＬＡ−Ａ３３＋上皮癌患者およびＨＬＡ−Ａ３３＋健常人のＰＢＭＣを刺激し、対応するペプチドでパルスしたＣ１Ｒ−Ａ３３細胞または陰性対照のＨＩＶペプチドでパルスしたＣ１Ｒ−Ａ３３細胞で刺激し、ＩＦＮ−γ産生活性に基づいて細胞応答を試験した。
【図６】はペプチド誘導ＣＴＬの細胞傷害性を示す図である。 ＬＣ−１（ＨＬＡ−Ａ３３＋ＩＥＸ−１＋）、ＱＧ５６（ＨＬＡ−Ａ３３−ＩＥＸ−１＋）およびＨＧＣ２７（ＨＬＡ−Ａ３３−ＩＥＸ−１−）細胞をＩＬ−２単独で培養し、相異なるＥ：Ｔ比で６時間51Ｃｒ放出試験を行い、細胞障害活性を検討した。
【図７】モノクローナル抗体による細胞傷害性阻害試験の結果を示す図である。 抗ＨＬＡクラスＩ、抗ＨＬＡクラスＩＩ、抗ＣＤ８（Ｎｕ−Ｔｓ／ｃ、ＩｇＧ２ａ）、抗ＣＤ４（Ｎｕ−Ｔｈ／ｉ、ＩｇＧ１）と対照としての抗ＣＤ１４（ＪＭＬ−Ｈ１４、ＩｇＧ２ａ）ｍＡｂを用い、ペプチド刺激ＰＢＭＣの細胞傷害性に対する阻害作用を検討した。
【図８】特異的細胞傷害性の競合試験の結果を示す図である。 非標識Ｃ１Ｒ細胞を対応ペプチドまたはＨＩＶペプチド（陰性対照）でパルスし、51Ｃｒ放出試験に供した（非標識細胞対標識細胞＝１０：１）。Ｅ／Ｔ比１０：１で５１Ｃｒ放出試験を行った。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明についてさらに詳細に説明する。
ＨＬＡ拘束性ＣＴＬ株
ＨＬＡ拘束性ＣＴＬ株は、目的とするＨＬＡアレルを有する癌患者の腫瘍組織に浸潤しているリンパ球（ＴＩＬ）を採取し、Ｔ細胞の増殖を促すサイトカインであるＩＬ−２と共に培養して増殖させることにより得られる。本方法は当業界において周知である。
遺伝子発現クローニング法
ＨＬＡ拘束性ＣＴＬ株によって認識される腫瘍抗原は、遺伝子発現クローニング法により同定する。本方法は、ｃＤＮＡライブラリーにコードされるタンパク質を哺乳類細胞で一過性に発現させ、樹立したＣＴＬ株が特異的に認識する目的のタンパク質をコードするｃＤＮＡをスクリーニングし、当該タンパク質をコードする遺伝子を単離するものである。本発明では、樹立したＣＴＬ株がタンパク質発現細胞を認識した際に産生するＩＦＮ−γを指標としてスクリーニングを行う。
【００１１】
ペプチドおよびポリペプチド
本発明のＩＥＸ−１由来ペプチドは、ＨＬＡと結合して特異的ＣＴＬを誘導しうるペプチドである。本発明ペプチドはＩＥＸ−１の連続する８〜１１個のアミノ酸残基からなることが好ましい。このようなＩＥＸ−１の部分ペプチドの具体例として、ＩＥＸ４７−５６、（配列番号：１）、ＩＥＸ６１−６９（配列番号：２）、またはＩＥＸ６５−７３（配列番号：３）が挙げられる。ＩＥＸ−１遺伝子の全ヌクレオチド配列および推定のアミノ酸配列は、受入番号ＮＭ＿００３８９７としてGeneBankに登録されている（配列番号：４）。特異的なＣＴＬを誘導する他のＩＥＸ−１由来ペプチドは、本明細書の実施例に準じた方法により容易に決定および選択できる。
【００１２】
「ＨＬＡと結合して特異的なＣＴＬを誘導しうる」とは、本発明のペプチドがＨＬＡと結合して複合体を形成し、かかる複合体をＣＴＬが認識できることをいう。換言すれば、本発明のペプチドが、ＨＬＡとの結合活性を有し、かつ、ＨＬＡとの複合体の形で、ペプチド特異的なＣＴＬを誘導する活性を有することを意味する。本発明において好ましいＨＬＡは、ＨＬＡ−Ａ３３である。
【００１３】
また、本発明は、ＨＬＡと結合して特異的なＣＴＬを誘導しうるＩＥＸ−１由来ペプチドの変異ペプチドであって、同等のＣＴＬ誘導能を有する変異ペプチドも包含する。変異は、本発明のＩＥＸ−１由来ペプチドに対して一個または数個のアミノ酸の欠失、置換、付加、挿入などを行うことにより導入することができ、その手段は当業界にて周知である。変異が他のアミノ酸による置換または付加を含む場合、他のアミノ酸は、天然のアミノ酸またはアミノ酸アナログであってよく、アミノ酸アナログとしては、種々のアミノ酸のＮ−アシル化物、Ｏ−アシル化物、エステル化物、酸アミド化物、アルキル化物等が挙げられる。本発明のペプチドの変異体を得るには、例えば、配列番号１〜３に記載のアミノ酸配列の１〜数個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１個または２個のアミノ酸残基が欠失しているか、他のアミノ酸残基またはアミノ酸アナログで置換された、またはそれが付加された候補ペプチドを合成し、該候補ペプチドとＨＬＡ−Ａ３３分子との複合体がＣＴＬにより認識されるか否かをアッセイすることにより、同定することができる。
【００１４】
アッセイは例えば、後述するＣＴＬ誘導法に準じて行うことができる。即ち、in vitroで候補ペプチドを添加して刺激した場合に、該候補ペプチドをパルスしたＨＬＡ−Ａ３３陽性細胞を特異的に認識するＣＴＬが誘導されるか否かを調べる。ここで、ＣＴＬ誘導の有無は、例えば、抗原ペプチド提示細胞に反応してＣＴＬが産生する種々のサイトカイン（IFN-γ等）の量を酵素免疫測定法（ELISA）等により測定することによって調べることができる。または、51Crで標識した抗原ペプチド提示細胞に対するＣＴＬの傷害性を測定する方法（51Cr リリースアッセイ、Int．J．Cancer，58:p317,1994）によっても調べることができる。前記アッセイで用いるＨＬＡ−Ａ３３陽性細胞としては、実施例に記載のＨＬＡ−Ａ３３陽性細胞が挙げられる。
変異ペプチドのアミノ酸残基数は、抗原提示細胞表面上に提示され、かつＣＴＬ認識エピトープとしての性質を有する数であればよく、通常少なくとも約８個以上であり、好ましくは約９個以上であって、１２個以下、好ましくは１１以下、さらに好ましくは１０個以下である。特に好ましアミノ酸残基数は９個ないし１０個である。
【００１５】
本発明はさらに、特異的なＣＴＬの誘導活性を有する、本発明のＩＥＸ−１由来ペプチドまたはその変異ペプチドを含有するポリペプチドを包含する。ポリペプチドを構成するアミノ酸数は、特に限定されず、本発明が属する分野での技術常識に従う。通常、アミノ酸残基数約１００個以下の長さであり、好ましくは約５０個以下、より好ましくは約３０個以下程度である。
本発明のポリペプチドはＨＬＡ−Ａ３３陽性細胞内で断片化されて特異的ＣＴＬ誘導活性を有するペプチド断片を与えることができるものである。そのようなポリペプチドは、配列番号：１、配列番号：２、または配列番号：３で示される本発明のペプチドに相当する部分配列、または本発明ペプチドの変異体に相当する配列を含有することが特に好ましい。
【００１６】
また、機能を著しく障害しない程度に構成アミノ酸またはカルボキシル基などを修飾して、本発明のペプチドおよびポリペプチドを改変することもできる。例えば、Ｎ末端や遊離のアミノ基には、ホルミル基、アセチル基、ｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）基等が結合していてもよく、抗原ペプチドのＣ末端や遊離のカルボキシル基には、メチル基、エチル基、ｔ−ブチル基、ベンジル基等が結合していてもよい。さらに、本発明のペプチドは、生体内への導入を容易にするように、修飾されていてもよい。
一般に、ＨＬＡ分子と結合する腫瘍抗原 ペプチドのアミノ酸配列には、ＨＬＡの型により異なるモチーフ（規則的配列）が存在することが知られており、変異または改変は、そのモチーフ上、許容されるものであることが好ましい。変異の導入において、ペプチドまたはポリペプチドの基本的な性質（物性、機能、生理活性または免疫学的活性等）を変化させないという観点からは、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互置換は容易に想定される。
本発明のペプチドおよびポリペプチドは、ペプチド化学における一般的な公知方法により製造できる。
【００１７】
「抗原提示細胞（ＡＰＣ）」とは、ＨＬＡと抗原ペプチドとの複合体を細胞表面に提示する細胞を意味する。従って、抗原提示細胞は、本発明の腫瘍抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ３３分子との複合体を細胞表面に提示することにより、ＨＬＡ−Ａ３３拘束性ＣＴＬの活性化をもたらす機能を有する。そのような細胞には、ＣＴＬ細胞障害作用の標的である腫瘍細胞も含まれる。
本発明の抗原提示細胞は、単離された抗原提示能を有する細胞の表面に、ＨＬＡ−Ａ３３分子と本発明の腫瘍抗原ペプチドとの複合体を提示している。そのような細胞は、in vitroで誘導することもでき、具体的には、ＨＬＡ−Ａ３３陽性の抗原提示能を有する細胞に本発明の腫瘍抗原ペプチドをパルスしてＨＬＡ−Ａ３３と該ペプチドとの複合体をその細胞表面に提示させることにより得られる。「抗原提示能を有する細胞」とは、本発明の腫瘍抗原ペプチドを提示可能なＨＬＡ-Ａ２４抗原を細胞表面に発現している細胞であれば特に限定されないが、特に抗原提示能が高いとされる樹状細胞が好ましい。特に、ＨＬＡ−Ａ３３陽性腫瘍患者由来の単離された抗原提示能を有する細胞の表面に、ＨＬＡ−Ａ３３分子と本発明の腫瘍抗原ペプチドとの複合体を提示させた抗原提示細胞が好ましい。
【００１８】
核酸分子
本発明の核酸分子は、本発明のＩＥＸ−１由来ペプチドまたはその変異ペプチドおよび該ぺプチドを含むポリペプチドの、アミノ酸配列をコードする一本鎖（相補鎖を含む）および二本鎖ポリヌクレオチドを含む。本発明の核酸分子はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。これら核酸分子がコードするアミノ酸配列を有するペプチドは、それ自体がＣＴＬにより認識され、該ＣＴＬを活性化するか、そのような活性を有するペプチド断片を与えることができ、腫瘍抗原として機能し得る。
また、本発明の核酸分子は、本発明のペプチドをコードする領域に対応する少なくとも２４個以上の塩基からなるポリヌクレオチドおよびその相補鎖であってよい。このようなポリヌクレオチドは、例えば公知のタンパク質発現系を利用して発現ペプチドを確認することにより選択できる。
【００１９】
抗体
本発明の抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれであってもよい。本発明のＩＥＸ−１由来ペプチドまたはポリペプチドの中から選ばれる１つのペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列中、連続する少なくとも５個のアミノ酸残基からなるエピトープペプチドまたはポリペプチドを特異的に認識するものである。
抗体はそれらのエピトープペプチドを使用して作製でき、そのエピトープペプチドは少なくとも５個、好ましくは少なくとも８〜１０個のアミノ酸で構成される。本発明は、この少なくとも５個のアミノ酸残基からなるペプチドおよびそれをコードする核酸分子も包含する。
本発明の抗体は、エピトープペプチドを単独で、または担体と結合した形で、アジュバントの存在または非存在下に例えばマウス、ラット、ウサギ、ヤギ等に免疫し産生を誘導することができる。得られたポリクローナル抗体は、公知の方法により血清から回収することができる。
一方、モノクローナル抗体は、上記のように免疫応答を誘導した動物から回収した抗体産生細胞を、永久増殖性細胞と融合することで生産できる。本方法は当業界において周知である。
これらのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は、精製用抗体、試薬、標識マーカー等として利用することができる。また、ヒト型化して治療用に供する場合もあり得る。
【００２０】
医薬組成物
本発明の医薬組成物は、本発明のＩＥＸ−１由来ペプチド、変異体ペプチド、ポリペプチド、ＨＬＡ分子とペプチドとの複合体を細胞表面に提示している抗原提示細胞、ペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸分子、該核酸分子の塩基配列情報に基づき作製した組換えベクター、または本発明の抗体を、単独または複数組み合わせて利用することにより調製できる。
具体的には、本発明のＩＥＸ−１由来ペプチドまたはその変異体、該ペプチドを含むポリペプチド、抗原提示細胞は癌ワクチンとして使用することができる。一種類のペプチドでも癌ワクチンとして有効であるが、複数種類のペプチドを組み合わせて使用するのが好ましい。これは、癌患者のＣＴＬが複数の異なる種類の腫瘍抗原を認識する細胞の集団であることから、複数種類の腫瘍抗原を組み合わせて癌ワクチンとして使用する方がより効果的であると期待されるからである。本発明に係るペプチド等を他のペプチドと共に複数種類組み合わせて使用してもよい。
【００２１】
本発明の癌ワクチンは、適当なアジュバントの存在または非存在下で、単独で、または製薬的に許容される担体と結合して使用することができる。担体は、人体に有害な作用を起こさない限り限定されるものではなく、例えば、セルロース、重合アミノ酸、アルブミン等が使用できる。剤形は、ペプチド製剤について周知の剤形が選択可能である。投与量は、ＣＴＬによる認識性、治療すべき疾患、患者の年齢、体重等により変化するが、ペプチドの場合、活性本体として、通常、0.0001mg〜1000mg、好ましくは0.001mg〜1000mg、より好ましくは0.1mg〜100mg、さらに好ましくは0.1〜10ｍｇ／日／成人ヒトである。これを数日ないし数周あるいは数ヶ月に一回投与する。
【００２２】
本発明の医薬組成物はまた、本発明に係るペプチドをコードする核酸配列を適当なベクターに組み込み、in vivoまたはex vivoで導入するのに利用することができる。ベクターとしては、例えばレトロウィルス、アデノウィルス、ワクシニアウィルス等が挙げられるが、レトロウィルス系が好ましい。投与量は、ＣＴＬによる認識性により変化するが、ＤＮＡ含量として０．１μg-１００ｍｇ／日／成人ヒト、好ましくは１μg−５０ｍｇ／日／成人ヒトである。これを数日ないし数ヶ月に一回投与する。
【００２３】
ＩＥＸ−１反応性ＣＴＬおよびその誘導方法
「ＩＥＸ−１反応性ＣＴＬ」とは、本発明のＩＥＸ−１由来ペプチドまたはその変異体とＨＬＡとの複合体を認識し、誘導されるＣＴＬを意味する。該ＣＴＬはＨＬＡ−Ａ３３拘束性ＣＴＬである。
そのようなＣＴＬは、例えばＨＬＡ−Ａ３３＋胃癌患者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から本発明に係るペプチドを用いて誘導することができる。
つまり、本発明のペプチドでパルスした抗原提示細胞（ＡＰＣ）とともにＨＬＡ−Ａ３３＋胃癌患者のＰＢＭＣをインキュベートしてＣＴＬを誘導し、ＩＦＮ-γ産生を指標として評価する。さらに、誘導されたＣＴＬの活性は、51Ｃｒ放出試験等により腫瘍細胞傷害性を指標として確認できる。
【００２４】
上記の方法は、in vitroで誘導した抗原特異的ＣＴＬを患者体内に戻し腫瘍細胞を傷害する、養子免疫療法に利用できる。すなわち、メラノーマにおいては、患者本人の腫瘍内浸潤Ｔ細胞を体外で大量に培養して、これを患者に戻す養子免疫療法に治療効果が認められている（J. Natl.Cancer.Inst.,86:1159、1994）。またマウスのメラノーマにおいては、脾細胞をin vitroで腫瘍抗原ペプチドTRP-2で刺激し、腫瘍抗原ペプチドに特異的なＣＴＬを増殖させ、該ＣＴＬをメラノーマ移植マウスに投与することにより、転移抑制が認められている（J. Exp.Med.，185:453, 1997）。これは、抗原提示細胞のＨＬＡ抗原と腫瘍抗原ペプチドとの複合体を特異的に認識するＣＴＬをin vitroで増殖させた結果に基づくものである。本発明の腫瘍抗原ペプチドを用いて、in vitroで患者末梢血リンパ球を刺激して腫瘍特異的ＣＴＬを増やした後、このＣＴＬを患者に戻すことにより腫瘍を治療することが可能である。
【００２５】
以下、本発明を実施例によってより詳細に説明するが、本発明は下記実施例によっていかなる意味においても制限されるものではない。
【実施例】
【００２６】
本発明には、以下の癌細胞株を使用した。
胃腺癌 ＭＫＮ−２８、ＭＫＮ−４５、ＳＳＴＷ−９、ＫＡＴＯ−ＩＩＩ、ＫＷＳ、およびＨＧＣ−２７；肺腺癌 ＬＣ−１；肺偏平上皮癌 ＱＧ−５６；頭頸部癌 ＫＵＭＡ−１；大腸腺癌 ＳＷ６２０およびＣＯＬＯ２０１；膵臓腺癌 Ｐａｎｃ−１；ヒト慢性骨髄性白血病 Ｋ５６２。これらの腫瘍細胞のＨＬＡクラスＩ遺伝子型は以前に示されている（文献１０、１１）。
これらの細胞上のＨＬＡクラスＩまたはＨＬＡ−Ａ３３抗原の発現は、抗ＨＬＡクラスＩ（Ｗ６／３２）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（ＨＬＡクラスＩ分子の単一形領域を認識）、または抗ＨＬＡ−Ａ３３ｍＡｂ（ＨＬＡ−Ａ３３分子の多形領域を認識）（ＩｇＭ、One Lamda, Canoga Park, CA）を用いて、ＦＡＣＳｃａｎ（Becton Dickinson, San Jose, CA）でのフローサイトメトリーによって測定した。
統計学的解析には、本発明すべてにおいて両側 Student ｔ検定を用いた。
【００２７】
実施例１
（８５０Ｂ−ＣＴＬ株の樹立）
ＨＬＡ−Ａ３３拘束性および腫瘍特異的ＣＬＴ株（８５０Ｂ−ＣＴＬ）は、重症胃腺癌患者（ＨＬＡ−Ａ＊２４０２／Ａ＊３３０３、Ｂ７／Ｂ４４、Ｃｗ７／Ｃｗ１４）のＴＩＬを１０％ＦＣＳ（Equitech Bio, Ingram, TX）、１００Ｕ／ｍｌＩＬ−２（Shionogi Pharmaceutical, Osaka, Japan）、および１０μｇ／ｍｌＰＨＡ（Difco, Detroit, MI）含有培養培地（４５％ＲＰＩＭ１６４０培地、４５％ＡＩＭ−Ｖ培地；Life Technologies, Walkersville, MA）で14日間インキュベートし、続いて支持細胞としての放射線照射（３０Ｇｙ）アロジェニック末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の存在下でさらに３０日より長く培養することにより樹立した。本ＣＴＬ株の表現型をＦＩＴＣ結合抗ＣＤ３、ＣＤ４、またはＣＤ８モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いて免疫学的蛍光試験により検討したところ、ＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８＋（＞９５％）であった（データ非提示）。
【００２８】
（８５０Ｂ−ＣＴＬ株の特性）
文献記載の方法に従い、８５０Ｂ−ＣＴＬ株を特性化した（文献９）。
標的細胞を認識することによりＩＦＮ−γを産生する能力について、様々なＥ：Ｔ比（エフェクター細胞：標的細胞）において８５０Ｂ−ＣＴＬ細胞株を試験した。値はＥＬＩＳＡ（検出限界１０ｐｇ／ｍｌ）によるトリプリケート測定の平均を表す。図１Ａに示すように、このＣＴＬ株はＨＬＡ−Ａ３３＋上皮癌細胞、ＬＣ−１およびＫＵＭＡ−１を認識することにより有意なレベルのＩＦＮ−γを産生したが、ＨＬＡ−Ａ３３−標的細胞に対しては反応しなかった。
【００２９】
次に、様々な標的細胞に対する８５０Ｂ−ＣＴＬの細胞傷害活性を、相異なるＥ：Ｔ比において６時間51Ｃｒ放出試験により試験した。本方法は既知である（文献９）。値はトリプリケート測定の平均を表す。８５０Ｂ−ＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ３３＋ＬＣ−１およびＫＵＭＡ−１細胞に対してより強い細胞傷害性を示したが、ＨＬＡ−Ａ３３−標的細胞、ＣＯＳ７細胞、ＮＫ標的細胞株、Ｋ５６２、または健常提供者のＰＢＭＣから得たＨＬＡ−Ａ３３＋ＰＨＡ活性化正常Ｔ細胞（ＰＨＡ幼若化細胞）のいずれに対しても示さなかった。
【００３０】
さらにｍＡｂを用いた阻害実験によって、８５０Ｂ−ＣＴＬの反応性を検討した。抗ＨＬＡクラスＩ（Ｗ６／３２、ＩｇＧ２ａ）、抗ＣＤ８（Ｎｕ−Ｔｓ／ｃ、ＩｇＧ２ａ）、抗ＨＬＡ−Ａ２４（００４１ＨＡ、ＩｇＧ２ａ）、抗ＣＤ４（Ｎｕ−Ｔｈ／ｉ、ＩｇＧ１）、抗ＨＬＡクラスＩＢ,Ｃ（Ｂ１−２３、ＩｇＧ２ａ）、および抗ＨＬＡクラスＩＩ（Ｈ−ＤＲ、ＩｇＧ２ａ）ｍＡｂ（２０μｇ／ｍｌ）を文献記載の方法と同様に使用した（文献１０、１１）。アイソタイプ適合対照ｍＡｂとして、抗ＣＤ１４（ＪＭＬ−Ｈ１４、ＩｇＧ１）または抗ＣＤ１３（ＭＣＳ2、ＩｇＧ２ａ）を準備した。
ＨＬＡ−Ａ３３＋ＬＣ−１細胞の認識による８５０Ｂ−ＣＴＬからのＩＦＮ−γ産生は、抗ＨＬＡクラスＩおよび抗ＣＤ８ｍＡｂ（２０μｇ／ｍｌ）によって阻害されたが、抗ＨＬＡ−Ｂ, Ｃ、抗ＨＬＡクラスＩＩ、抗ＨＬＡ−Ａ２４、抗ＣＤ４、または無関係なアイソタイプ適合抗ＣＤ１３または抗ＣＤ１４ｍＡｂによっては阻害されなかった（図１Ｃ）。
これらの結果は、８５０Ｂ−ＣＴＬ株が腫瘍細胞に対してはＨＬＡ−Ａ３３拘束性細胞傷害性を示すが、正常細胞に対しては示さないことを意味している。
【００３１】
実施例２
（ＩＥＸ−１遺伝子の同定）
遺伝子発現クローニング法（文献９）により、８５０Ｂ−ＣＴＬ株によって認識される腫瘍抗原をコードする遺伝子を同定した。
ＬＣ−１肺腺癌細胞のポリ（Ａ）＋ＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、ＳａｌＩアダプターをライゲートし、そして発現ベクターｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−６（Invitrogen, San Diego, CA）に挿入した。ＨＬＡ−Ａ＊３３０３またはＨＬＡ−Ａ＊２６０１のｃＤＮＡをそれぞれＫＵＭＡ−１またはＫＥ４細胞より回収したＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって作製し、真核細胞発現ベクターｐＣＲ３（Invitrogen）へ挿入してクローニングした。ＬＣ−１ｃＤＮＡライブラリーのプラスミドＤＮＡプールまたはクローン（２００ｎｇ）、およびＨＬＡ−Ａ＊３３０３またはＨＬＡ−Ａ＊２６０１（陰性対照）ｃＤＮＡ（２００ｎｇ）、の両方を、１μｌのリポフェクタミン（Invitrogen）と１２０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Invitrogen）中で４０分間混合した。ＣＯＳ７細胞（５ｘ１０３）をこの混合物５０μｌと６時間インキュベートし、続いて１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地１５０μｌを添加した。２日間培養した後８５０Ｂ−ＣＴＬ（２ｘ１０５細胞／ウェル）を添加し、その後１８時間インキュベートし、上清１００μｌを回収してＥＬＩＳＡによりデュプリケート試験でＩＦＮ−γを測定した（文献９）。
【００３２】
一次スクリーニングにおいて、ＬＣ−１ｃＤＮＡライブラリーから得た１ｘ１０５クローンすべてを、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３ｃＤＮＡとともにＣＯＳ７細胞にトランスフェクションした後に、８５０Ｂ−ＣＴＬによるＩＦＮ−γ産生を刺激する能力について試験した。すなわち、ｃＤＮＡプール（１ｘ１０５クローン）を９６平底プレート中の約２０００の相違するウェルにデュプリケートで分割した（各ウェルの期待されるクローン数：１００クローン／ウェル）。一次スクリーニングでは、１０の異なるウェルで有意なレベルのＩＦＮ−γ産生が得られた。二次スクリーニングとして、陽性ウェルからクローン化して得た各ｃＤＮＡプールを９６平底プレートの約２００の異なるウェルにデュプリケートで分割し、ＩＦＮ−γ産生刺激活性について試験した。
二次スクリーニングの後、更なるアッセイのための二つの陽性クローンを同定した。ＤＮＡシークエンスキットおよびABI PRISM 377 DNA シークエンサー（Perkin-Elmer, Foster, CA）を使用したジデオキシヌクレオチドシークエンス法によりＤＮＡシークエンスを行った。単離された遺伝子の一つについて以下の検討を行った。
【００３３】
図２に示されるように、クローン１およびＨＬＡ−Ａ＊３３０３をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞は、用量依存的に８５０Ｂ−ＣＴＬにおけるＩＦＮ−γ産生を誘導したが、陰性対照としてクローン１とＨＬＡ−Ａ＊２６０１をトランスフェクトした細胞は誘導しなかった。それに対し、クローン１またはＨＬＡ−Ａ＊３３０３のいずれかを単独でトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞は８５０Ｂ−ＣＴＬに認識されなかった（データ非提示）。さらに、ＬＣ−１ｃＤＮＡライブラリーから得られた陰性対照として使用した他のクローンは、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３とともにＣＯＳ７細胞にトランスフェクトした場合に８５０Ｂ−ＣＴＬにおけるＩＦＮ−γ産生を誘導できなかった（データ非提示）。このことはクローン１が８５０Ｂ−ＣＴＬによって特異的に認識される腫瘍抗原をコードすることを示唆している。
GeneBankの検索によって、クローン１のヌクレオチド配列は、ストレス誘導抗アポトーシス遺伝子として報告されているＩＥＸ−１（文献１７）の配列と同一であることがわかった。
【００３４】
実施例３
（正常および癌組織におけるＩＥＸ−１ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現）
様々な腫瘍または正常組織（Multiple Tissue Northern Blots, Clontech, Tokyo, Japan）におけるＩＥＸ−１ｍＲＮＡの発現を、以前に記載した方法に従い３２Ｐ標識ＩＥＸ−１プローブを用いてノーザンブロット解析によって調べた（文献９）（図３Ａ、レーン１：脳、レーン２：心臓、レーン３：骨格筋、レーン４：大腸、レーン５：胸腺、レーン６：脾臓、レーン７：腎臓、レーン８：肝臓、レーン９：小腸、レーン１０：胎盤、レーン１１：肺、レーン１２：ＰＢＬ）。β-アクチンプローブを対照として使用した。図３Ａに示すように、脳（レーン１）を除き試験したすべての正常組織において約〜１．３ｋｂのバンドがはっきりと検出され、心臓（レーン２）、腎臓（レーン７）、肺（レーン１１）、または末梢血リンパ球（ＰＢＬ）（レーン１２）において特に発現が高く、胸腺（レーン５）、脾臓（レーン６）、肝臓（レーン８）、または小腸（レーン９）においては発現が低かった。
【００３５】
次に、正常および癌細胞におけるＩＥＸ−１遺伝子のｍＲＮＡ発現をノーザンブロット解析により検討した（図３Ｂ、レーン1：ＰＢＬ、レーン２：ＭＫＮ４５、レーン３：ＭＫＮ２８、レーン４：ＳＳＴＷ、レーン５：ＨＧＣ２７、レーン６：ＬＣ−１、レーン７：ＱＧ５６、レーン８：ＫＵＭＡ−１、レーン９：Ｐａｎｃ−１、レーン１０：ＳＷ６２０、レーン１１：ＣＯＬＯ２０１、レーン１２：ＫＡＴＯ−ＩＩＩ）。ＩＥＸ−１は、ＨＣＧ２７胃癌細胞株（レーン５）を除き、胃（レーン２−４、１２）、肺（レーン６、７）、頭頸部（レーン８）、膵臓（レーン９）、および大腸（レーン１０、１１）を含む様々な臓器に由来する、被験腺癌およびＳＣＣ細胞株のほとんどにおいて高発現していた。
これらの結果は、この遺伝子があらゆる癌および正常組織において発現していることを意味する。
【００３６】
さらに、様々な腫瘍組織におけるこの遺伝子の発現をタンパク質レベルで検討した。ＩＥＸ−１タンパク質の発現は、抗ＩＥＸ−１抗体（Santa-Cruz biotechnology, Santa-Cruz, CA）とともにVentana Medical Systems 自動化装置（Tucson, AZ）を使用して、ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片上で免疫組織化学によって評価した。
胃癌組織における代表的染色を示す（図３Ｃ）。胃癌においてＩＥＸ−１タンパク質の発現は癌細胞で選択的に増強されていたが、周囲の正常上皮または結合組織においては増強されていなかった。ＩＥＸ−１タンパク質は、乳癌（図３Ｄ）、肺癌（図３Ｅ）、および大腸癌（データ非提示）を含む様々な型の癌組織においてもまた、高くかつ選択的に発現していた。なお、図３Ｃ〜Ｅにおいて、ＩＥＸ−１タンパク質は茶色に染まっており、正常細胞および結合組織は茶色に染まっていない。これら、茶色に染まった数箇所を、便宜上、矢印で示した。
以上の結果より、ＩＥＸ−１は癌の治療において理想的な標的分子の一つであるといえる。
【００３７】
実施例４
（８５０−Ｂ ＣＴＬによって認識されるＩＥＸ−１由来抗原性ペプチドの同定）
ＩＥＸ−１の抗原性エピトープとしてＣＴＬに認識され得るペプチドを同定するため以下の実験を行った。
ＩＥＸ−１の推定アミノ酸配列においてＨＬＡ−Ａ３３分子に結合するためのモチーフ（文献１８、１９）を有する可能性のあるペプチド配列の中で、コンピューター解析（Bioinformatics and Molecular Analysis Section (BIMAS), NIH, Bethesda, MD）ではＨＬＡ−Ａ３３に対してより強い結合活性を有する８の相異なるペプチドを使用した。BioSynthesis, Lewisville, TXより純度＞９５％のペプチドを得た。ペプチド結合アッセイには、ＲＭＡ−Ｓ−Ａ３３細胞（ＨＬＡ−Ａ＊３３０３ｃＤＮＡを安定的にトランスフェクトしたＲＭＡ−Ｓタップ（ペプチドプロセシングに関与するトランスポーター）欠損マウスリンパ腫細胞（Hiroko Takedatsu, et al., Identification of Peptide Vaccine Candidates Sharing Among HLA-A3, -A11, -A31, and -A33 Cancer Patients., Clin Can Res, 2004, in press）（１ｘ１０４細胞／ウェル）を使用した。簡単に言うと、細胞を２６℃で１８時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、細胞（１ｘ１０６細胞）をOpti-MEM（ヒトβ２-ミクログロブリン３μｇ／ｍｌおよびペプチド１０μｇ／ｍｌ含有）に懸濁し、続いて２６℃で３時間そして３７℃で３時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を抗ＨＬＡ−Ａ３３ｍＡｂと４℃で３０分間インキュベートし、続いてＦＩＴＣ結合ウサギ抗マウスＩｇＭ抗体（Cappel, Aurora, OH）と４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳｃａｎで解析し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）により結合活性を評価した。２６℃で、ＴＲＰ２−１９７ペプチド（参考ペプチド）でパルスした細胞、およびパルスしていない細胞も使用した。表１に示すように、若干親和性は異なるが、８ペプチド全てがＲＭＡ−Ｓ−Ａ３３細胞に結合できた。
【表１】
【００３８】
８５０Ｂ-ＣＴＬ株によって認識される抗原性ペプチドの検出のため、Ｃ１Ｒ−Ａ３３細胞（ＨＬＡ−Ａ＊３３０３ｃＤＮＡをトランスフェクトして安定的に発現させたＣ１Ｒヒト多発性骨髄腫細胞（Hiroko Takedatsu, et al., Clin Can Res, 2004, in press）を指示濃度のペプチドとともに培養した。二時間後、８５０Ｂ−ＣＴＬ（２ｘ１０５細胞/ウェル）を添加し、さらに１８時間インキュベートした。培養上清中のＩＦＮ−γの産生はＥＬＩＳＡにより測定した。
ペプチド非ロードＣ１Ｒ−Ａ３３細胞に応答した８５０Ｂ−ＣＴＬによるＩＦＮ−γ産生をバックグラウンドとして、その値から差し引いた。値はトリプリケート試験の平均を示す。
【００３９】
これらペプチドのうち３つ、ＩＥＸ４７−５６、ＩＥＸ６１−６９、およびＩＥＸ６５−７３が、有意なレベルのＩＦＮ−γ産生を用量依存的に誘導した（図４Ａ、４Ｂ）。ＨＬＡ−Ａ３３トランスフェクトＣ１Ｒ細胞上にロードするのに最適な三つのペプチドの濃度は、各ペプチドにおいて０．１−１μＭの範囲にわたり様々であったが（図４Ｂ）、ＲＭＡ−Ｓ−Ａ３３細胞により決定されたＨＬＡ−Ａ３３分子に対するそれらの結合親和性（表１）には依存していなかった。
以上の結果に基づき、ＩＥＸ４７−５６、ＩＥＸ６１−６９、およびＩＥＸ６５−７３を、８５０Ｂ−ＣＴＬ株によって認識されるＩＥＸ−１由来抗原性ペプチドとして同定した。
【００４０】
実施例５
（ＩＥＸ−１由来ペプチドによるＣＴＬの誘導）
ＩＥＸ４７−５６、ＩＥＸ６１−６９、およびＩＥＸ６５−７３ペプチドのＨＬＡ−Ａ３３拘束性および腫瘍特異的ＣＴＬ誘導能について、ＨＬＡ−Ａ３３＋上皮癌患者（ｎ＝４、胃癌患者（２）、肺癌患者（１）、前立腺癌（１））およびＨＬＡ−Ａ３３＋健常人（ＨＤ）のＰＢＭＣにおいて試験した。
ＨＬＡ−Ａ３３＋癌患者およびＨＬＡ−Ａ３３＋健常人ＰＢＭＣ（１ｘ１０５／ウェル）を、９６穴マイクロカルチャープレート(Nunc, Roskiide, Denmark)においてＩＬ−２含有培養液２００μｌ中で各ペプチド（１０μＭ）とインキュベートした（文献１３）。１４日目に各ウェルから別個にペプチド刺激ＰＢＭＣ（８０−１２０ｘ１０４／ウェル）を回収し、洗浄し、４等分した。２つは対応するペプチドをロードしたＣ１Ｒ−Ａ３３細胞で、残りの二つは陰性対照のＨＩＶペプチドをロードしたＣ１Ｒ−Ａ３３細胞で刺激した。１８時間後、上清を回収しそれらのＩＦＮ−γ産生活性について試験した。
４人の患者の代表例を図５に示す。ＨＩＶペプチドに対するＩＦＮ−γ産生（＜５０ｐｇ／ｍｌ）をバックグラウンドとして差し引いた。これら３つのぺプチドで刺激した癌患者由来ＰＢＭＣは、ほとんどの場合において対応するペプチドをロードしたＨＬＡ−Ａ３３トランスフェクトＣ１Ｒ細胞を認識して有意な量のＩＦＮ−γを産生した（図５）。それに対して、５人のＨＤから得たＰＢＭＣはそれらに対して有意な量のＩＦＮ−γを産生しなかった（データ非提示）。
【００４１】
次に、ペプチド誘導ＣＴＬの腫瘍細胞傷害活性を検討した。
有意な量のＩＦＮ−γを産生できた細胞を回収し、ＩＬ−２単独でさらに１０−１４日間培養し、相異なるＥ：Ｔ比で６時間５１Ｃｒ放出試験を行った（文献１３）。ＬＣ−１（ＨＬＡ−Ａ３３＋ＩＥＸ−１＋）、ＱＧ５６（ＨＬＡ−Ａ３３−ＩＥＸ−１＋）、およびＨＧＣ２７（ＨＬＡ−Ａ３３−ＩＥＸ−１−）に対する細胞傷害活性を計測した。対照として、非抗原性ＩＥＸ−１由来ペプチド、ＩＥＸ４３−５１によって刺激した癌患者のＰＢＭＣを使用した。値はトリプリケート測定の平均を示す。
図６に示すように、ＩＥＸ−１由来ペプチドで刺激されたＰＢＭＣは、ＨＬＡ−Ａ３３＋ＩＥＸ−１＋ＬＣ−１腫瘍細胞に対して有意なレベルの細胞傷害性を示したが、ＨＬＡ−Ａ３３−ＨＧＣ２７またはＱＧ５６細胞に対しては示さなかった。また、ＩＥＸ４３−５１（陰性対照ペプチド）は特異的ＣＴＬ活性を示さなかった。この結果は、ＩＥＸ４７−５６、ＩＥＸ６１−６９、およびＩＥＸ６５−７３が、上皮癌患者のＰＢＭＣにおいてＨＬＡ−Ａ３３拘束性に特異的ＣＴＬを誘導できる抗原性エピトープペプチドであることを示唆している。
【００４２】
さらに、細胞傷害性の拘束性およびペプチド特異性を阻害試験および競合試験により確認した。
阻害試験には、抗ＨＬＡクラスＩ（Ｗ６／３２、ＩｇＧ２ａ）、抗ＨＬＡクラスＩＩ（Ｈ−ＤＲ、ＩｇＧ２ａ）、抗ＣＤ８（Ｎｕ−Ｔｓ／ｃ、ＩｇＧ２ａ）、抗ＣＤ４（Ｎｕ−Ｔｈ／ｉ、ＩｇＧ１）（２０μｇ／ｍｌ）を使用した。抗ＣＤ１４（ＪＭＬ−Ｈ１４、ＩｇＧ２ａ）ｍＡｂを対照として使用した。
これらペプチド刺激ＰＢＭＣの細胞傷害性は、試験したすべてのケースで抗ＨＬＡクラスＩまたは抗ＣＤ８抗体によって有意に阻害されたが、他のｍＡｂよっては阻害されなかった（図７）。
競合試験では、対応ペプチドまたはＨＩＶペプチド（陰性対照）でパルスした非標識Ｃ１Ｒ細胞を５１Ｃｒ放出試験に非標識細胞対標識細胞の比率を１０対１で添加した。１０：１のＥ／Ｔ比で５１Ｃｒ放出試験を行った。値は特異的傷害活性（％）の平均±ＳＤを示す。
対応ペプチドパルスＣ１Ｒ−Ａ３３細胞を添加することにより細胞傷害性は阻害されたが、ＨＩＶペプチドパルス細胞では阻害されなかった（図８）。
以上の結果は、ペプチド特異的ＣＴＬ活性が、主としてＨＬＡ−ＡクラスＩ拘束性にＣＤ８＋Ｔ細胞によって発揮されることを示唆している。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明は、ＩＥＸ−１が、胃腺癌に浸潤しているＴ細胞より樹立されたＨＬＡ拘束性および腫瘍特異的ＣＴＬにより認識される腫瘍抗原性エピトープをコードしていることを開示するものである。また、本発明はＩＥＸ−１由来抗原性ペプチドが癌患者のＰＢＭＣ培養においてＨＬＡ拘束性に腫瘍特異的ＣＴＬを誘導できることをも開示するものである。
ＩＥＸ−１は、正常組織、特に、心臓、腎臓、肺およびＰＢＬにおいても発現しているので、これらの臓器はＩＥＸ−１由来抗原性エピトープによる特異的免疫療法の有害事象となる恐れがある。しかしながら、本発明は８５０−ＢＣＴＬ株およびＩＥＸ−１由来ペプチドにより誘導されたＣＴＬのいずれもＨＬＡ−Ａ３３＋腫瘍細胞を溶解する一方、過剰量の対応ペプチドが培養中に存在するにも拘わらずＰＨＡ活性化正常ＨＬＡ−Ａ３３＋Ｔ細胞は傷害しないことを明らかにした。また、発明者らが行っている腫瘍抗原由来ペプチドワクチンを用いる臨床試験では、腫瘍抗原のいくつかは正常組織または臓器に広く発現しているにも拘わらず、深刻な有害事象は観察されていない（文献４−７）。
従って、以上の結果は、本発明のＩＥＸ−１由来ペプチドが癌治療に適したペプチドワクチンとして使用可能であることを示唆している。
【００４４】
また、放射線照射およびいくつかの化学療法薬が、比較的高いレベルでＩＥＸ−１発現を誘導することが報告されているので（文献２６、３０）、本発明のＩＥＸ−１分子を標的とした特異的免疫療法は、特に化学療法または放射線療法抵抗性癌を患う患者の処置にとって新規で魅力的な方法となり得る。
ＨＬＡ−Ａ３３は、アジア人および黒人において最も一般的なＨＬＡ−Ａアレルの一つであり、日本人の１３％、韓国人の１４％、白人の１４％、および黒人の１６％に見られる（文献１４、１５）。またＩＥＸ−１は癌組織に高発現している。従って、本発明の抗原ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ３３＋癌患者に対する特異的免疫療法に広く利用可能であろう。
【００４５】
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文献１４：Imanishi I, A. T., Kimura A, Tokunaga K, Gojobori T. Allele and haprotype frequencies for HLA and complement loci in various ethnic groups. In, pp. 1065-1220: Oxford University Press, 1992.
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文献１６：Macdonald, J. S. Advances in the therapy of gastric cancer. Gastric Cancer, 5 Suppl 1: 35-40, 2002.
文献１７：Wu, M. X. Roles of the stress-induced gene IEX-1 in regulation of cell death and oncogenesis. Apoptosis, 8: 11-18, 2003.
文献１８：Takiguchi, M., Matsuda, T., Tomiyama, H., and Miwa, K. Analysis of three HLA-A*3303 binding peptide anchors using an HLA-A*3303 stabilization assay. Tissue Antigens, 55: 296-302, 2000.
文献１９：Takiguchi, M., Matsuda, T., and Tomiyama, H. Polarity of the P1 anchor residue determines peptide binding specificity between HLA-A*3101 and HLA-A*3303. Tissue Antigens, 56: 501-506, 2000.
文献２０：Schafer, H., Trauzold, A., Siegel, E. G., Folsch, U. R., and Schmidt, W. E. PRG1: a novel early-response gene transcriptionally induced by pituitary adenylate cyclase activating polypeptide in a pancreatic carcinoma cell line. Cancer Res, 56: 2641-2648, 1996.
文献２１：Pietzsch, A., Buchler, C., Aslanidis, C., and Schmitz, G. Identification and characterization of a novel monocyte/macrophage differentiation-dependent gene that is responsive to lipopolysaccharide, ceramide, and lysophosphatidylcholine. Biochem Biophys Res Commun, 235: 4-9, 1997.
文献２２：Charles, C. H., Yoon, J. K., Simske, J. S., and Lau, L. F. Genomic structure, cDNA sequence, and expression of gly96, a growth factor-inducible immediate-early gene encoding a short-lived glycosylated protein. Oncogene, 8: 797-801, 1993.
文献２３：Wu, M. X., Ao, Z., Prasad, K. V., Wu, R., and Schlossman, S. F. IEX-1L, an apoptosis inhibitor involved in NF-kappaB-mediated cell survival. Science, 281: 998-1001, 1998.
文献２４：Kumar, R., Kobayashi, T., Warner, G. M., Wu, Y., Salisbury, J. L., Lingle, W., and Pittelkow, M. R. A novel immediate early response gene, IEX-1, is induced by ultraviolet radiation in human keratinocytes. Biochem Biophys Res Commun, 253: 336-341, 1998.
文献２５：Schafer, H., Lettau, P., Trauzold, A., Banasch, M., and Schmidt, W. E. Human PACAP response gene 1 (p22/PRG1): proliferation-associated expression in pancreatic carcinoma cells. Pancreas, 18: 378-384, 1999.
文献２６：Grobe, O., Arlt, A., Ungefroren, H., Krupp, G., Folsch, U. R., Schmidt, W. E., and Schafer, H. Functional disruption of IEX-1 expression by concatemeric hammerhead ribozymes alters growth properties of 293 cells. FEBS Lett, 494: 196-200, 2001.
文献２７：Zhang, Y., Schlossman, S. F., Edwards, R. A., Ou, C. N., Gu, J., and Wu, M. X. Impaired apoptosis, extended duration of immune responses, and a lupus-like autoimmune disease in IEX-1-transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A, 99: 878-883, 2002.
文献２８：Garcia, J., Ye, Y., Arranz, V., Letourneux, C., Pezeron, G., and Porteu, F. IEX-1: a new ERK substrate involved in both ERK survival activity and ERK activation. Embo J, 21: 5151-5163, 2002.
文献２９：Huang, Y. H., Wu, J. Y., Zhang, Y., and Wu, M. X. Synergistic and opposing regulation of the stress-responsive gene IEX-1 by p53, c-Myc, and multiple NF-kappaB/rel complexes. Oncogene, 21: 6819-6828, 2002.
文献３０：Kondratyev, A. D., Chung, K. N., and Jung, M. O. Identification and characterization of a radiation-inducible glycosylated human early-response gene. Cancer Res, 56: 1498-1502, 1996.
文献３１：Kittlesen, D. J., Thompson, L. W., Gulden, P. H., Skipper, J. C., Colella, T. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F., Engelhard, V. H., Slingluff, C. L., Jr., and Shabanowitz, J. A. Human melanoma patients recognize an HLA-A1-restricted ＣＴＬ epitope from tyrosinase containing two cysteine residues: implications for tumor vaccine development. J Immunol, 160: 2099-2106, 1998.
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）によって認識され、特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導する、ストレス誘導抗アポトーシス分子（ＩＥＸ−１）由来のペプチドまたはその変異ペプチド。
【請求項２】
ＣＴＬがＨＬＡ−Ａ３３拘束性に認識する、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
連続する８〜１１個のアミノ酸残基からなる、請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項４】
配列番号１〜３のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチド、または配列番号１〜３のいずれかに示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＨＬＡ−Ａ３３分子と結合して特異的なＣＴＬを誘導するペプチドである、請求項１〜３のいずれかに記載のペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のペプチドを含むポリペプチド。＊請求項１〜３は、9あるいは10アミノ酸残基よりなるペプチドでポリペプチドではない＊
【請求項６】
単離された抗原提示能を有する細胞の表面に、ＨＬＡ−Ａ３３分子と請求項１〜４のいずれかに記載のペプチドとの複合体を提示させてなる、抗原提示細胞。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載のペプチド、または請求項５記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項８】
請求項７記載の核酸分子を含有するベクター。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれかに記載のペプチド、請求項５記載のポリペプチド、請求項６記載の抗原提示細胞、請求項７記載の核酸分子、または請求項８記載のベクターを含む、特異的なＣＴＬを誘導するための医薬組成物。
【請求項１０】
癌ワクチンである、請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれかに記載のペプチドとＨＬＡとの複合体、または請求項６記載の抗原提示細胞に提示された複合体を認識する、ＩＥＸ−１反応性ＣＴＬ。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれかに記載のペプチド、請求項５記載のポリペプチドまたは請求項６記載の抗原提示細胞を用いてＩＥＸ−１反応性ＣＴＬを誘導する方法。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれかに記載のペプチドまたは請求項５記載のポリペプチドを特異的に認識する抗体。
【請求項１４】
次の（１）または（２）に記載のポリペプチドを含む、特異的なＣＴＬを誘導するための医薬組成物：
（１）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または
（２）配列番号４に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＨＬＡ−Ａ３３分子と結合して特異的なＣＴＬを誘導するペプチドを与えるポリペプチド。
【請求項１５】
癌ワクチンである、請求項１４記載の医薬組成物。
【請求項１】
細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）によって認識され、特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導する、ストレス誘導抗アポトーシス分子（ＩＥＸ−１）由来のペプチドまたはその変異ペプチド。
【請求項２】
ＣＴＬがＨＬＡ−Ａ３３拘束性に認識する、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
連続する８〜１１個のアミノ酸残基からなる、請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項４】
配列番号１〜３のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチド、または配列番号１〜３のいずれかに示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＨＬＡ−Ａ３３分子と結合して特異的なＣＴＬを誘導するペプチドである、請求項１〜３のいずれかに記載のペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のペプチドを含むポリペプチド。＊請求項１〜３は、9あるいは10アミノ酸残基よりなるペプチドでポリペプチドではない＊
【請求項６】
単離された抗原提示能を有する細胞の表面に、ＨＬＡ−Ａ３３分子と請求項１〜４のいずれかに記載のペプチドとの複合体を提示させてなる、抗原提示細胞。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載のペプチド、または請求項５記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項８】
請求項７記載の核酸分子を含有するベクター。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれかに記載のペプチド、請求項５記載のポリペプチド、請求項６記載の抗原提示細胞、請求項７記載の核酸分子、または請求項８記載のベクターを含む、特異的なＣＴＬを誘導するための医薬組成物。
【請求項１０】
癌ワクチンである、請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれかに記載のペプチドとＨＬＡとの複合体、または請求項６記載の抗原提示細胞に提示された複合体を認識する、ＩＥＸ−１反応性ＣＴＬ。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれかに記載のペプチド、請求項５記載のポリペプチドまたは請求項６記載の抗原提示細胞を用いてＩＥＸ−１反応性ＣＴＬを誘導する方法。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれかに記載のペプチドまたは請求項５記載のポリペプチドを特異的に認識する抗体。
【請求項１４】
次の（１）または（２）に記載のポリペプチドを含む、特異的なＣＴＬを誘導するための医薬組成物：
（１）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または
（２）配列番号４に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＨＬＡ−Ａ３３分子と結合して特異的なＣＴＬを誘導するペプチドを与えるポリペプチド。
【請求項１５】
癌ワクチンである、請求項１４記載の医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０７５６４６
【国際公開日】平成１７年８月１８日（２００５．８．１８）
【発行日】平成１９年１０月１１日（２００７．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１７７０５（Ｐ２００５−５１７７０５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００５／００１５０８
【国際出願日】平成１７年２月２日（２００５．２．２）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り
【出願人】（５９９０４５９０３）学校法人 久留米大学 (72)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年８月１８日（２００５．８．１８）
【発行日】平成１９年１０月１１日（２００７．１０．１１）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００５／００１５０８
【国際出願日】平成１７年２月２日（２００５．２．２）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り
【出願人】（５９９０４５９０３）学校法人 久留米大学 (72)
【Ｆターム（参考）】
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