スフェロイドの製造方法、およびスフェロイドアレイ
【課題】均一な大きさを有する胚性幹細胞由来のスフェロイドを、一度に大量に形成することが可能なスフェロイドの製造方法を提供する。
【解決手段】基材と、前記基材上に配置され、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の３以上と前記ポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基とを有する分岐ポリアルキレングリコール誘導体を含有する感光性組成物を硬化させて形成された複数の親水性領域および疎水性領域と、を含む基板上に、胚性幹細胞を播種することと、播種された胚性幹細胞を培養することと、培養された胚性幹細胞由来のスフェロイドを形成させることと、を含むスフェロイドの製造方法である。
【解決手段】基材と、前記基材上に配置され、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の３以上と前記ポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基とを有する分岐ポリアルキレングリコール誘導体を含有する感光性組成物を硬化させて形成された複数の親水性領域および疎水性領域と、を含む基板上に、胚性幹細胞を播種することと、播種された胚性幹細胞を培養することと、培養された胚性幹細胞由来のスフェロイドを形成させることと、を含むスフェロイドの製造方法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スフェロイドの製造方法、およびスフェロイドアレイに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、種々の組織細胞に分化する潜在的能力を保持した胚性幹細胞を用いて、人工的に各種組織細胞への分化誘導を行い、再生医療等へ応用することが検討されている。胚性幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで、種々の組織細胞へ分化誘導する方法としては、サイトカインや成長因子を作用させる方法、遺伝子を導入する方法等が知られている。
例えば、胚性幹細胞から形成した胚様体に、ウイルスベクターを用いて特定の遺伝子を導入することで、特定の組織細胞への分化を促進させる方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
また、胚性幹細胞から胚葉体を形成する方法としては、ハンギングドロップ中で胚性幹細胞を培養する方法や、ペトリディッシュに播種する方法等が一般に知られている。さらに特定の形状を有する培養容器中で胚性幹細胞を培養することで質的に安定した胚葉体を効率的に形成する方法が開示されている（例えば、特許文献２参照）。
【特許文献１】特開２００６−２５４８７２号公報
【特許文献２】特開２００６−２５４６２２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１に記載の方法では、形成される胚様体の大きさが不揃いとなりやすいため、分化誘導の効率が十分とは言い難く、また安定的に分化誘導を行うことが困難であった。また、特許文献２に記載の方法では、形成される肺様体の大きさを均一に制御することが困難であり、また一度に形成できる肺様体の数も十分であるとは言い難かった。
【０００５】
本発明は、均一な大きさを有する胚性幹細胞由来のスフェロイドを、一度に大量に形成することが可能なスフェロイドの製造方法を提供することを課題とする。また本発明は均一な大きさを有する胚性幹細胞由来のスフェロイドが、アレイ状に配置されたスフェロイドアレイを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第１の態様は、基材と、前記基材上に配置され、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の３以上と前記ポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基とを有する分岐ポリアルキレングリコール誘導体を含有する感光性組成物を硬化させて形成された複数の親水性領域および疎水性領域と、を含む基板上に、胚性幹細胞を播種することと、播種された胚性幹細胞を培養することと、培養された胚性幹細胞由来のスフェロイドを形成させることと、を含むスフェロイドの製造方法である。
前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体は重合度が５〜１０００のポリアルキレングリコール基を４以上有することが好ましい。
【０００７】
本発明の第２の態様は、前記スフェロイドの製造方法で製造され、内胚葉系マーカーであるＡＦＰの発現量が、中胚葉系マーカーであるＦｌＫ−１及び外胚葉系マーカーであるＮＣＡＭの少なくとも一方の発現量よりも大きいスフェロイドである。
【０００８】
本発明の第３の態様は、基材と、前記基材上に配置され、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の３以上と前記ポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基とを有する分岐ポリアルキレングリコール誘導体を含有する感光性組成物を硬化させて、アレイ状に形成された複数の親水性領域および疎水性領域と、を含む基板と、前記疎水性領域に配置された胚性幹細胞由来の複数のスフェロイドと、を含むスフェロイドアレイである。
【０００９】
本発明の第４の態様は、前記スフェロイドアレイを用いる薬物スクリーニング方法である。前記薬物スクリーニング方法は、高分子ミセルに内包された薬物を前記スフェロイドに接触させることを含むことが好ましい。
【００１０】
本発明の第５の態様は、基材と、前記基材上に配置され、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の３以上と前記ポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基とを有する分岐ポリアルキレングリコール誘導体を含有する感光性組成物を硬化させて形成された複数の親水性領域および疎水性領域と、を含む基板上に、胚性幹細胞を播種することと、分化誘導因子の存在下に播種された胚性幹細胞を培養することと、培養された胚性幹細胞から分化誘導された細胞を得ることと、を含む胚性幹細胞の分化誘導方法である。また前記分化誘導因子は高分子ミセルに内包された状態で添加されることが好ましい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、均一な大きさを有する胚性幹細胞由来のスフェロイドを、一度に大量に形成することが可能なスフェロイドの製造方法を提供することができる。また本発明によれば、均一な大きさを有する胚性幹細胞由来のスフェロイドが、アレイ状に配置されたスフェロイドアレイを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のスフェロイドの製造方法は、基材と、前記基材上に配置され、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の３以上と前記ポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基とを有する分岐ポリアルキレングリコール誘導体を含有する感光性組成物を硬化させて形成された複数の親水性領域および疎水性領域と、を含む基板上に、胚性幹細胞を播種することと、播種された胚性幹細胞を培養することと、培養された胚性幹細胞由来のスフェロイドを形成させることと、を含むことを特徴とする。
かかる基板を用いることで、均一な大きさを有する胚性幹細胞由来のスフェロイドを、一度に大量に形成することができる。
【００１３】
本発明における基板は、基材と、後述する特定構造の分岐ポリアルキレングリコール誘導体を含む感光性組成物を用いて、基材上に形成された複数の親水性領域および疎水性領域とを含む。前記親水性領域は、前記感光性組成物が硬化した架橋体が形成された領域であり、また前記疎水性領域は、前記親水性領域以外の領域であって基材が露出した領域である。
【００１４】
本発明における基板は、複数の前記親水性領域と複数の疎水性領域とが区画化されて形成された基板であることが好ましい。また前記親水性領域および疎水性領域の数、大きさおよびその形状には特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。尚、本発明における基板およびその作製方法の詳細については後述する。
【００１５】
本発明においては、均一な大きさのスフェロイドを形成する観点から、前記複数の疎水性領域が均一な大きさおよび形状を有していることが好ましい。
また、大量の均質なスフェロイドを効率的に形成する観点から、前記疎水性領域を例えば円状に形成した場合の大きさとして、直径が５０〜５００μｍであることが好ましく、１００〜３００μｍであることがより好ましい。
【００１６】
本発明のスフェロイドの作製方法は、前記基板上に、胚性幹細胞を播種することと、播種された胚性幹細胞を培養することと、培養された胚性幹細胞由来のスフェロイドを形成させることを含む。
前記基板上に胚性幹細胞を播種し、培養することで、前記基板上の疎水性領域に胚性幹細胞由来のスフェロイドを形成することができる。すなわち、前記基板上の疎水性領域にのみ胚性幹細胞が配置され、親水性領域には胚性幹細胞が接着しないことにより、疎水性領域の数、大きさ、およびその形状に応じた胚性幹細胞由来のスフェロイドを形成することができる。
【００１７】
前記胚性幹細胞は、異なる機能を持つ種々の細胞に分化可能な細胞である。このような胚性幹細胞の由来は、哺乳動物であれば特に制限はなく、霊長類（例えば、ヒト、サルなど）、有蹄類（例えば、ブタ、ウシ、ウマなど）、小型哺乳類のげっ歯類（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）の種々の動物から、使用目的に応じて適宜選択することができる。
胚性幹細胞の調製方法は、当該技術分野において周知の方法を用いて行うことができる。例えば、胚性幹細胞のみを選択的に生育させることができるような培養条件下で細胞を培養することで得ることができる。
【００１８】
胚性幹細胞の培養には、通常使用される培地を使用することができる。培養に用いられる培地としては、一般に動物細胞の培養に用いられる培地であればよく、例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）等を挙げることができる。
この培地には、細胞の増殖を促進するための血清を添加するか、あるいは血清に代替するものとして、例えばＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ等の細胞増殖因子やトランスフェリン等の既知血清成分を添加してもよい。なお、血清を添加する場合の濃度は、そのときの培養状態によって適宜変更することができるが、通常５容量％〜１０容量％とすることができる。また、適宜、各種ビタミンやストレプトマイシン等の抗生物質（ＡＢ）を添加したものであってもよい。さらに培地には、胚性幹細胞の自己複製能を維持しつつ、種々の組織細胞への分化を抑制する因子（例えば、白血病抑制因子（ＬＩＦ）等）が含まれていてもよい。
【００１９】
胚性幹細胞の培養には、通常の培養条件、例えば３７℃の温度で５％ＣＯ２濃度のインキュベーター内での培養が適用される。
また胚性幹細胞由来のスフェロイドの形成においては、通常の培養条件で２時間〜２日程度培養を行うことでスフェロイドを形成することができる。
【００２０】
本発明における胚性幹細胞の培養に用いる培地としては、効率的なスフェロイド形成の観点から、ＬＩＦを含まない培地を用いることが好ましく、ＬＩＦを含まずレチノイン酸を含む培地を用いることがより好ましい。
【００２１】
前記基板上に、胚性幹細胞を播種する方法に特に制限はなく通常の方法を適宜用いることができる。また播種する胚性幹細胞の密度については、スフェロイドが形成可能であれば特に制限はなく、基板の大きさ、疎水性領域の数及び大きさ等に応じて適宜選択することができる。例えば、１×１０４〜１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬとすることができ、１×１０４〜１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬであることが好ましい。
【００２２】
本発明において胚性幹細胞由来のスフェロイドの形成は、形態観察に基づいて判断することができる。すなわち、播種された胚性幹細胞は、培養期間の経過に伴って、疎水性領域上に集合し、細胞凝集塊（スフェロイド）の形成をする
またスフェロイド形成の他の指標として、培養期間の経過に伴うアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性が低下を用いてもよい。
【００２３】
本発明のスフェロイドの製造方法によれば、均一な大きさで且つ大量のスフェロイドを基板上に形成することができる。このようなスフェロイドは、細胞の性質もほぼ均質なものであるため、種々の挙動において同様の傾向を示すことができる。
したがって本発明のスフェロイドの製造方法で形成されたスフェロイドを、例えば、薬物スクリーニングに適用することで、より高感度かつ高精度な薬物スクリーニングが可能となる。また、かかるスフェロイドは、所定の刺激に対応して同程度の分化を誘導することができる。
【００２４】
本発明のスフェロイドの製造方法で形成された胚性幹細胞由来のスフェロイドにおいては、内胚葉系マーカーであるＡＦＰの発現量が、中胚葉系マーカーであるＦｌｋ−１の発現量および外胚葉系マーカーであるＮＣＡＭの発現量の少なくとも一方よりも大きいことを特徴とするが、さらに未分化性マーカーであるＯｃｔ４の発現量が低下していることが好ましい。
これにより本発明のスフェロイドを、内胚葉系の組織細胞への分化誘導に好適に適用することができる。
【００２５】
また前記ＡＦＰの発現量は、Ｆｌｋ−１の発現量およびＮＣＡＭの発現量の少なくとも一方の５０倍以上であることが好ましく、２００倍以上であることがより好ましい。
本発明においてＡＦＰ等のマーカーの発現量は、ＲＴ−ＰＣＲを用いて通常の方法で測定した発現量を意味する。
【００２６】
本発明のスフェロイドアレイは、基材と、前記基材上に配置され、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の３以上と前記ポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基とを有する分岐ポリアルキレングリコール誘導体を含有する感光性組成物を硬化させて、アレイ状に形成された複数の親水性領域および疎水性領域と、を含む基板と、前記疎水性領域に配置された胚性幹細胞由来の複数のスフェロイドと、を含むことを特徴とする。
本発明における基板および胚性幹細胞については、前記スフェロイドの製造方法における基板および胚性幹細胞と同様である。
【００２７】
本発明のスフェロイドアレイにおけるスフェロイドの配置及び個数は、基板上に形成された疎水性領域の配置及び個数に応じたものである。ここで疎水性領域の配置は基板上にアレイ状に配置されていれば特に制限はなく、疎水性領域の個数と共に、スフェロイドアレイの目的等に応じて適宜変更することができる。
【００２８】
本発明のスフェロイドアレイにおいては、アレイ状に配置された各スフェロイドを、その大きさが均一になるように、また基板上に大量にかつ効率よく形成することができる。かかるスフェロイドアレイにおいては、各スフェロイドの薬物感受性等の性質を均質に揃えることができる。これを例えば、薬物スクリーニングに用いる場合には、高精度かつ良好な再現性の薬物スクリーニングが実現できる。また例えば、組織細胞への分化誘導に用いる場合には、大量の組織細胞凝集塊を良好な再現性で得ることができる。
【００２９】
本発明のスフェロイドアレイにおいては、基材上に形成された複数の親水性領域および疎水性領域が区画化されて形成され、親水性領域に囲まれた疎水性領域がアレイ状に配置されている。かかる形状に疎水性領域を形成する方法としては、後述の本発明における基板の作製方法を好適に挙げることができる。
本発明において前記疎水性領域は、形成されるスフェロイドの均一性の観点から、均一な大きさおよび形状であることが好ましい。
本発明のスフェロイドアレイは、例えば、前記スフェロイドの製造方法を用いて製造することができる。
【００３０】
本発明の薬物スクリーニング方法は、前記スフェロイドアレイを用いることを特徴とする。これにより高精度かつ良好な再現性の薬物スクリーニングが実現できる。
また本発明の薬物スクリーニング方法は、スフェロイドアレイを構成するスフェロイドに、高分子ミセルに内包された薬物を接触させることを含むことが好ましい。これにより、より効率的にスフェロイドと薬物を接触させることができ、より高感度に薬物スクリーニングを行うことができる。
【００３１】
本発明の薬物スクリーニングにおけるスフェロイドアレイは、胚性幹細胞由来のスフェロイドがアレイ状に配置されて構成される。スフェロイド（細胞凝集塊）を用いてスクリーニングを行うことにより、薬物に対する細胞応答をより明確かつ高感度に判定することができる。例えば、薬物に対する細胞応答を発色、発光、蛍光等で検出する場合には、凝集した複数の細胞からの応答として検出できるため、明確かつ高感度に判定することができる。
またスフェロイドがアレイ状に配置されていることにより、薬物に対する細胞応答を再現性よくかつ高感度に判定することができ、また複数の薬物に対する細胞応答を同時に判定することができる。
【００３２】
本発明においてスクリーニング対象となる薬物には特に制限はなく、胚性幹細胞由来のスフェロイドに何らかの応答変化を生じさせる薬物であればよい。具体的には、分化誘導因子、成長因子等を挙げることができる。本発明においては、スクリーニング感度の観点から、分化誘導因子であることが好ましい。
また前記薬物は、低分子化合物であっても、高分子化合物であってもよい。前記高分子化合物としては、例えば、蛋白質、ポリヌクレオチド等を挙げることができる。
【００３３】
本発明の薬物スクリーニング方法において、薬物とスフェロイドとを接触させる方法には特に制限はなく、通常用いられる方法を適用することができる。
例えばスクリーニング対象となる薬物がポリヌクレオチドの場合、薬物とスフェロイドを接触させる方法としては、ウイルスベクターを用いる方法（例えば、特開２００６−２５４８７２号公報参照）が一般的に用いられている。本発明においてはポリヌクレオチドが高分子ミセルに内包された状態でスフェロイドと接触することが好ましい。これにより、ウイルスベクターに由来する細胞毒性の発現を回避することができ、薬物とスフェロイドの接触をより効率的に行うことができる。
【００３４】
本発明において用いられることがある高分子ミセルは、親水性構成単位と疎水性構成単位とを含むブロックコポリマーから構成することができる。前記親水性構成単位としては非イオン性の親水性構成単位であることが好ましく、ポリアルキレングリコールであることがより好ましい。また疎水性構成単位は、内包する薬物に応じて適宜選択することができる。例えば、ポリアスパラギン酸などの金属錯体と相互作用しうる構成単位、カチオン性蛋白質と相互作用しうるアニオン性の構成単位、ポリヌクレオチドと相互作用しうるカチオン性の構成単位等を挙げることができる。
【００３５】
本発明においてスクリーニング対象の薬物が、例えばポリヌクレオチドの場合、高分子ミセルを構成するブロックコポリマーは疎水性構成単位としてカチオン性の構成単位を含むことが好ましい。かかるブロックコポリマーの具体例としては、例えば、特開２００４−３５２９７２号公報に記載のポリエチレングリコール−ポリカチオンブロック共重合体を好適に挙げることができる。
【００３６】
本発明において前記胚性幹細胞は、スクリーニング目的に応じた応答遺伝子を含むことが好ましい。これにより、より高精度かつ高感度に薬物スクリーニングを行うことができる。前記応答遺伝子はスクリーニング目的に応じて適宜選択される。例えば、特定の組織細胞への分化誘導因子のスクリーニングに用いる場合、その組織細胞特異的に発現する遺伝子のプロモーターを応答遺伝子として好適に用いることができる。
具体的には、例えば、骨芽様細胞への分化誘導因子のスクリーニングに適用する場合、Ｉ型またはＩＩ型のコラーゲンプロモーターを応答遺伝子として用いることができる。
【００３７】
本発明において前記応答遺伝子は、それによって発現制御されるレポーター遺伝子を、その下流に連結していることが好ましい。レポーター遺伝子としては通常使用されるものを特に制限なく用いることができ、例えば、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子を好適に用いることができる。
【００３８】
本発明の薬物スクリーニング方法を、骨芽様細胞への分化誘導因子のスクリーニングに適用する場合、前記スフェロイドを形成する胚性幹細胞はＩ型またはＩＩ型のコラーゲンプロモーターとこれに発現制御されるレポーター遺伝子とを含むことが好ましい。
【００３９】
本発明の胚性幹細胞の分化誘導方法は、基材と、前記基材上に配置され、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の３以上と前記ポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基とを有する分岐ポリアルキレングリコール誘導体を含有する感光性組成物を硬化させて形成された複数の親水性領域および疎水性領域と、を含む基板上に、胚性幹細胞を播種することと、分化誘導因子の存在下に播種された胚性幹細胞を培養することと、培養された胚性幹細胞から分化誘導された細胞を得ることと、を含むことを特徴とする。
本発明における基板および胚性幹細胞については、前記スフェロイドの製造方法における基板および胚性幹細胞と同様である。
【００４０】
本発明においては前記基板上で胚性幹細胞の分化誘導を行うことで、胚性幹細胞から分化誘導された細胞が基板の疎水性領域においてスフェロイド（細胞凝集塊）を形成する。そのため、分化誘導された細胞を高い均一性で効率よく得ることができる。
【００４１】
本発明における分化誘導としては、胚性幹細胞から、胚性幹細胞とは異なる性質を有する細胞への分化誘導であれば特に制限はなく、例えば、胚様体を構成する細胞、体性幹細胞、組織細胞等への分化誘導を挙げることができる。
本発明における分化誘導因子としては、胚性幹細胞を分化誘導可能な化合物であれば、特に制限なく、目的に応じて適宜選択して用いることができる。また前記分化誘導因子は低分子化合物であっても、高分子化合物であってもよい。ここで高分子化合物には蛋白質やポリヌクレオチド等が含まれる。
【００４２】
本発明の分化誘導方法においては、基板上に胚性幹細胞を播種した後に、基板の疎水性領域に胚性幹細胞由来のスフェロイドを形成させ、その後、分化誘導因子の存在下に胚性幹細胞由来のスフェロイド培養することが好ましい。胚性幹細胞由来のスフェロイドを形成させることにより、より効率的に分化誘導を行うことができる。
基板の疎水性領域に胚性幹細胞由来のスフェロイドを形成させる方法としては、前記スフェロイドの製造方法を好適に適用することができる。
【００４３】
本発明において分化誘導因子の存在下に播種された胚性幹細胞を培養する方法としては、分化誘導因子を添加した培地中で胚性幹細胞を培養する方法を挙げることができる。前記分化誘導因子の添加方法としては特に制限なく、通常用いられる方法を用いることができる。
本発明においては、分化誘導効率の観点から、高分子ミセルに内包された状態の分化誘導因子を添加することが好ましい。尚、高分子ミセルについては前記薬物スクリーニング方法で説明した高分子ミセルを本発明においても好適に適用することができる。
【００４４】
本発明の分化誘導方法においては、用いる分化誘導因子に応じて分化誘導された細胞を得ることができる。
本発明の分化誘導方法によって、例えば骨芽様細胞を得る場合、用いることができる分化誘導因子としては、ＴＨ（例えば、Biochem. Biophys. Res. Commun., 357(4),854-860 (2007)参照）ような低分子化合物や、ｃａＡＬＫ６、Ｒｕｎｘ２、ｃａＳｍｏ、ｃａＬＥＦ−１、ＩＲＳ−１等の遺伝子（ポリヌクレオチド）を挙げることができる。中でも骨芽様細胞への分化誘導効率の観点から、ｃａＡＬＫ６およびＲｕｎｘ２の少なくとも一方であることが好ましい。
また例えば、軟骨様細胞への分化誘導因子として、Ｓｏｘ５、Ｓｏｘ６、Ｓｏｘ９等の遺伝子（ポリヌクレオチド）を挙げることができる。
尚、前記遺伝子の詳細については、例えば、FASEB J., 21, 1777-1787 (2007)、特開２００４−２６７０５２号公報等に記載されている。
【００４５】
本発明の分化誘導方法によって得られる分化誘導された細胞は、高い均一性を有する細胞凝集塊であることから、種々の用途、例えば再生医療等に好適に用いることができる。
【００４６】
以下、本発明における基板について詳細に説明する。
本発明における分岐ポリアルキレングリコール誘導体は、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の３以上と、前記ポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基とを有することを特徴とする。
かかる構成の分岐ポリアルキレングリコール誘導体は、親水性の架橋体を形成することができる。かかる親水性の架橋体は、細胞非接着性の経時安定性が良好であり、例えば、本発明における分岐ポリアルキレングリコール誘導体を用いて基材上に親水性領域と疎水性領域とが高精度に形成された基板は、該基板上で細胞を培養した場合に、疎水性領域にのみ特異的に細胞が接着するため、高精度に区画化された細胞集合体を形成することができる。また、前記親水性領域は細胞非接着性の経時安定性が良好であり、長期に渡って区画化された細胞集合体を維持することができる。更に前記細胞集合体は、例えば、単層の細胞集合体とすることもできるし、細胞が３次元的凝集状態を形成した細胞凝集塊（スフェロイド）とすることもできる。
【００４７】
本発明における分岐ポリアルキレングリコール誘導体において、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の含有数は３以上である。前記ポリアルキレングリコール基の含有数が２以下では、これによって形成された親水性領域の細胞非接着性の経時安定性が不十分であり、区画化された細胞集合体を長期間維持することができない。
また前記ポリアルキレングリコール基の含有数は、経時安定性と良好なスフェロイド形成性の点から、４以上であることが好ましく、４以上６４以下であることがより好ましく、４以上１６以下であることが更に好ましい。
【００４８】
本発明における前記ポリアルキレングリコール基は、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基であれば特に制限はない。
また前記重合性置換基としては重合性の官能基を有する置換基であってポリアルキレングリコールの末端に結合可能なものであれば特に制限はない。重合性置換基のポリアルキレングリコールの末端への結合態様としては、ポリアルキレングリコールに由来する酸素原子を介した結合態様であっても、ポリアルキレングリコールの末端水酸基が他の元素に置換された結合態様であってもよい。
【００４９】
前記重合性置換基は、重合性の官能基そのものであっても、重合性の官能基と連結基とを含んで構成された置換基であってもよい。
本発明における重合性の官能基としては、通常用いられる重合性官能基を特に制限なく用いることができ、例えば、エチレン性不飽和結合を有する基、アジド基等を挙げることができる。本発明においては、親水性領域のパターン形成性の観点から、エチレン性不飽和結合を有する基及びアジド基から選ばれる少なくとも１種であることが好ましく、アジド基であることがより好ましい。
【００５０】
また前記重合性置換基における連結基としては重合性の官能基とポリアルキレングリコール基とを連結可能な基であれば特に制限はなく、例えば、アルキレン基、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、カルボニル基、酸素原子、窒素原子、硫黄原子、ジスルフィド及び水素原子から選ばれる少なくとも１種を含んで構成することができる。
具体的には例えば、カルボニル基、アリーレン基、アルキレンカルボニル基、カルボニルアリーレン基、カルバモイルアリーレン基等を挙げることができる。
更に連結基の価数としては少なくとも２価であればよく、３価以上の連結基であってポリアルキレングリコールと２以上の重合性官能基とを連結する連結基であってもよい。
【００５１】
末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基を構成するポリアルキレングリコール基は、本発明における分岐ポリアルキレングリコール誘導体に親水性を付与可能なポリアルキレングリコール基であれば特に制限はない。例えば、炭素数２〜４のアルキレングリコール構造単位（例えば、エチレンオキシ、ｎ−プロピレンオキシ、イソプロピレンオキシ、ブチレンオキシ、イソブチレンオキシ等）を含むポリアルキレングリコール基を好ましく用いることができる。
【００５２】
前記ポリアルキレングリコール基におけるアルキレングリコール構造単位は、１種のアルキレングリコール構造単位からなるものであっても、２種以上アルキレングリコール構造単位の組合せからなるものであってもよい。ポリアルキレングリコール基が２種以上のアルキレングリコール構造単位の組合せからなる場合、ブロックポリマーであってもランダムポリマーであってもよい。
また、ポリアルキレングリコール基の重合度としては、親水性の観点から５以上であればよく、５〜１０００の重合度を有するポリアルキレングリコール基を好ましく用いることができ、より好ましくは１０〜５００である。
【００５３】
本発明における、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基は、少なくとも３つの前記ポリアルキレングリコール基における重合性置換基が結合していない方の末端と結合し、前記ポリアルキレングリコール基を互いに連結可能なものであれば特に制限はない。結合様式としては共有結合、配位結合、イオン結合のいずれであってもよい。
具体的には例えば、糖類に由来する連結基、多価アルコールに由来する連結基、多価カルボン酸に由来する連結基、配位結合を介して前記ポリアルキレングリコール基を含む基を結合可能な金属原子等を挙げることができる。
【００５４】
前記糖類としては、例えば、グリセルアルデヒド、エリトロース、リボース、グルコース等を挙げることができる。また、多価アルコールとしては、グリセリン、ペンタエリスリトール、キシリトール、ソルビトール等を挙げることができる。更に、多価カルボン酸としては、プロパントリカルボン酸、クエン酸、ベンゼントリカルボン酸等を挙げることができる。また、前記金属原子としては、金、銀、白金、ニッケル、銅等を挙げることができる。
【００５５】
本発明においては、親水性と経時安定性の観点から、多価アルコールに由来する連結基であることが好ましく、グリセリンに由来する連結基又はペンタエリスリトールに由来する連結基がより好ましく、グリセリン、ポリグリセリン、ペンタエリスリトール、及びポリペンタエリスリトールから選ばれる化合物に由来する連結基であることが特に好ましい。
【００５６】
本発明における末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基は、経時安定性と良好なスフェロイド形成性の観点から、下記一般式（１）で表される置換ポリアルキレングリコール基であることが好ましい。
【００５７】
【化１】
【００５８】
一般式（１）中、ｍは２〜４の整数を表すが、２又は３であることが好ましく、２であることがより好ましい。またｎは５〜１０００の整数を表すが、１０〜５００であることが好ましく、１０〜３００であることがより好ましい。
【００５９】
一般式（１）中、Ｘ１は重合性置換基を表す。本発明において前記重合性置換基は、本発明における分岐ポリアルキレングリコール誘導体の架橋硬化性の観点から、下記一般式（３）及び一般式（４）の少なくとも１種で表される重合性置換基であることが好ましい。
【００６０】
【化２】
【００６１】
一般式（３）中、Ｌ３は単結合又は２価の連結基を表す。前記２価の連結基としてはエチレン性不飽和基とポリアルキレングリコール基とを連結可能であれば特に制限はない。例えば、アルキレン基、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、カルボニル基、酸素原子、窒素原子、イミノ基、及び水素原子の少なくとも１種を含んで構成される２価の連結基を挙げることができ、カルボニル基、エステル基、アミド基、フェニレン基、炭素数２〜４のアルキレン基、から選ばれる２価の連結基又はこれらの組合せからなる２価の連結基であることが好ましい。
本発明においてＬ３は、単結合、又は、カルボニル基、カルボニルフェニレン基、カルバモイルフェニレン基から選ばれる２価の連結基であることがより好ましい。
【００６２】
また、Ｒ３は水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表す。炭素数１〜３のアルキル基としては、具体的にはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基を挙げることができる。本発明においては、分岐ポリアルキレングリコール誘導体の架橋反応性の観点から、Ｒ３は水素原子又はメチル基であることが好ましく、水素原子であることがより好ましい。
【００６３】
一般式（４）におけるＬ４は２価の連結基を表すが、その定義及びその好ましい範囲は前記Ｌ３における２価の連結基と同様である。
【００６４】
また本発明においては、前記重合性置換基の少なくとも１つは下記一般式（５）で表される置換基であることが好ましい。これにより、重合性置換基の反応開始がより長波長の光照射によって可能となる。
【００６５】
【化３】
【００６６】
一般式（５）中、Ｌ５は単結合又は２価の連結基を表す。Ｌ５で表される２価の連結基は、前記Ｌ３における２価の連結基と同様である。
また、ｉは１又は２を表す。
【００６７】
一般式（５）中、Ｒ５は置換基を表すが、一般式（５）で表される重合性置換基の極大吸収波長を変化させることができる置換基であれば特に制限はない。中でも一般式（５）で表される重合性置換基の極大吸収波長を長波長側にシフト可能な置換基であることが好ましい。具体的には例えば、ニトロ基、水酸基、アルキルオキシ基、ジアルキルアミノ基、シアノ基、ニトロソ基等を好適に挙げることができる。
ｉが２の場合、２つのＲ５は同一でも異なっていてもよい。
【００６８】
また、本発明における分岐ポリアルキレングリコール誘導体は、親水性と架橋反応性の観点から、下記一般式（２）で表される化合物であることが好ましい。
【００６９】
【化４】
【００７０】
一般式（２）中、Ｌ２は単結合又はメチレン基を表し、ｐは１又は２を表す。ｐが１のときＬ２は単結合であることが好ましく、ｐが２のときＬ２はメチレン基であることが好ましい。
ｑは１〜７０の整数を表す。本発明においては、親水性と架橋反応性の観点から、ｐが１のとき、ｑは１〜６４であることが好ましく、２〜１０であることがより好ましい。またｐが２のとき、ｑは１〜３２であることが好ましく、１〜５であることがより好ましい。
【００７１】
一般式（２）中、Ｒ２は末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基又は末端に水酸基を有するポリアルキレングリコール基を表す。中でも架橋反応性の観点から、Ｒ２は末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基であることが好ましく、前記一般式（１）で表される置換ポリアルキレングリコール基であることがより好ましい。
【００７２】
本発明における分岐ポリアルキレングリコール誘導体は、経時安定性とスフェロイド形成性の観点から、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基を４以上１６以下有し、前記ポリアルキレングリコール基が前記一般式（１）で表されるものであって、前記重合性置換基が前記一般式（３）、一般式（４）及び一般式（５）の少なくとも１種で表されるものであることが好ましい。
【００７３】
本発明における分岐ポリアルキレングリコール誘導体の具体例を以下に例示するが、本発明はこれらに限定されるものではない。尚、下記具体例中のポリアルキレングリコールの重合度（ｎ）は分岐ポリアルキレングリコール誘導体の重量平均分子量から算出される平均重合度を意味する。また、分岐ポリアルキレングリコール誘導体の重量平均分子量は、例えば、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって測定することができる。
【００７４】
【化５】
【００７５】
【化６】
【００７６】
【化７】
【００７７】
本発明における分岐ポリアルキレングリコール誘導体は、例えば、３以上のポリエチレングリコール基を有する化合物（以下、「マルチアームＰＥＧ」ということがある。例えば、日油（株）製、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＰＴＥシリーズ、ＨＧＥＯシリーズ等）の末端水酸基に対して、重合性置換基を、通常用いられる方法を用いてエステル結合、エーテル結合等で結合することによって合成することができる。例えば、エステル結合の形成は酸塩化物法、活性エステル法等で行うことができる。
【００７８】
本発明における分岐ポリアルキレングリコール誘導体は、例えば、後述の感光性組成物の成分とすることができる。また、架橋反応により親水性の架橋体を形成することができる。
【００７９】
本発明における感光性組成物は、前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体の少なくとも１種を含有することを特徴とする。かかる感光性組成物を用いることで、例えば、基材上に高精度に区画化された親水性領域と疎水性領域とを形成することができる。
前記感光性組成物においては、前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体を１種単独で含有することもできるし、２種以上を含有することもできる。
また前記感光性組成物は、前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体に加えて、光重合開始剤、溶剤、細胞培養液、界面活性剤、緩衝液、消泡剤、防腐剤等の各種の添加剤等を含んで構成することができる。
【００８０】
前記光重合開始剤としては、光照射によって重合反応を開始可能なものであれば特に制限はないが、生細胞に対する障害性が低いものであることが好ましい。具体的には、例えば、ＩＲＧＡＣＵＲＥ ２９５９、ＩＲＧＡＣＵＲＥ １８４（いずれもチバ・スペシャリティー・ケミカルズ社製）等を挙げることができ、細胞毒性と水溶性の点からＩＲＧＡＣＵＲＥ ２９５９が好ましい。
【００８１】
前記溶剤としては、前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体を溶解可能であれば特に制限はない。ここでいう溶解可能とは前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体を質量基準で０．１％以上溶解できることをいう。
前記溶剤として具体的には、ベンゼン、トルエン、ＴＨＦ、ＤＭＦ、クロロホルム等の有機溶媒、及び水を好ましく用いることができる。また、溶剤は１種単独でも２種以上を混合して用いてもよい。
【００８２】
前記感光性組成物における前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体の含有率としては、例えば０．１〜５０質量％とすることができ、０．１〜２０質量％であることが好ましい。
【００８３】
本発明における架橋体は、前記感光性組成物を架橋硬化させて形成されたものである。前記架橋硬化は光照射による重合反応に起因するものであれば特に制限はなく、感光性組成物に応じて適宜架橋硬化条件を選択することができる。
【００８４】
本発明における架橋体は、例えば、基材上に形成された前記感光性組成物からなる観光性組成物層を硬化させたものであっても、媒体中で分散状態とした前記感光性組成物を硬化させたものであってもよい。基材上に形成された前記感光性組成物層を硬化させることで、基材上に架橋体からなる親水性領域を形成することができる。また、媒体中で分散状態とした前記感光性組成物を硬化させることで、親水性表面を有する粒子状の架橋体を形成することができる。
【００８５】
本発明における基板は、基材と、前記基材上に配置された前記架橋体とを含むことを特徴とする。本発明における基材としては、通常用いられる基材を特に制限なく用いることができる。基材の材質としては、例えば、ガラス、熱可塑性樹脂、熱硬化性樹脂、シリコーン、ダイヤモンド、金属、及びセラミックス等を挙げることができる。本発明においては、基材と架橋体との接着性の観点から、ガラス又は熱可塑性樹脂であることが好ましく、ガラスであることがより好ましい。
【００８６】
また本発明における基材は、アミノ基を有するシランカップリング剤、エチレン性不飽和基を有するシランカップリング剤、及びポリリジンから選ばれる少なくとも１種で表面処理された基材であることが好ましい。これにより、基材とその上に形成された架橋体との結合安定性を向上させることができる。
また、前記基材は、細胞接着性タンパク質の少なくとも１種で表面処理された基材であることもまた好ましく、アミノ基を有するシランカップリング剤、エチレン性不飽和基を有するシランカップリング剤、及びポリリジンから選ばれる少なくとも１種で表面処理された基材を、細胞接着性タンパク質の少なくとも１種で更に表面処理した基材であることがより好ましい。
表面処理された基材を用いて、基板を構成することにより、例えば、基板上で細胞を培養する場合に、より効率的に細胞集合体を形成することができる。
ここで、細胞接着性タンパク質としては、例えば、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、テイネシン及びエラスチン等を挙げることができ、中でも、細胞集合体の形成性の観点から、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチンが好ましく、コラーゲン、ゼラチンがより好ましい。
【００８７】
本発明における基板を作製する方法は、例えば、基材上に前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体を含む感光性組成物を付与して感光性組成物層を形成する工程と、前記感光性組成物層を、露光処理する硬化工程とを含むことができる。これにより、基材上に、前記架橋体が形成された基板を作製することができる。
前記基板を作製する方法は、必要に応じて、前記硬化工程後に加熱工程、洗浄工程、乾燥工程、滅菌工程等を更に含むことができる。
【００８８】
本発明において、基材上に感光性組成物層を形成する工程には、特に制限なく通常の薄膜形成方法を適用することができ、例えば、塗布法、ディップコート法、スピンコート法等を好適に適用することができる。
基材上に形成された感光性組成物層の層厚としては、特に制限はなく基板の使用目的に応じて適宜選択することができ、例えば、５ｎｍ〜１０００μｍとすることができる。特に、本発明の基板を後述の細胞培養基板として使用する場合には、１０ｎｍ〜１０００ｎｍとすることが好ましく、１０ｎｍ〜５００ｎｍであることがより好ましい。
【００８９】
前記基材上に感光性組成物層を形成する工程は、必要に応じて、感光性組成物中の溶剤を除去する工程を含むことができる。前記溶剤を除去する工程としては、前記溶剤に応じて適宜その条件を選択することができ、常温乾燥であっても、加熱乾燥であってもよい。例えば、３０〜１５０℃で１分〜１０時間とすることができ、好ましくは３５〜１２０℃で３分〜１時間である。
【００９０】
前記硬化工程における露光処理は、前記感光性組成物層を全面露光する工程であっても、所望のパターン様に部分露光する工程であってもよい。本発明においては、所望のパターン様に部分露光する工程であることが好ましく、前記部分露光する工程後に更に現像工程を含むことがより好ましい。これにより、前記架橋体からなる親水性領域と架橋体が形成されていない疎水性領域とが、パターン様に基材上に形成された基板を作製することができる。
【００９１】
前記所望のパターン様に部分露光する工程は、所望のパターン様に光透過性を有するマスク（フォトマスク）を介して、部分露光する工程であることが好ましい。また、前記マスクを感光性組成物層に密着させて部分露光を行うことにより、より高精度でパターン様に露光することができる。
【００９２】
露光に用いる光源としては、前記感光性組成物層を硬化可能な光源であれば特に制限はない。光源として例えば、Ｘ線、電子線、エキシマレーザー、キセノンランプ、メタルハライドランプ、低圧水銀ランプ及び高圧水銀ランプ等を挙げることができる。中でも低圧又は高圧水銀ランプを好適に用いることができ、１０〜２０００Ｗの高圧水銀ランプであることが好ましい。
また露光波長及び露光量についても特に制限はなく、前記感光性組成物に応じて適宜選択することができる。露光波長としては、例えば２００〜４００ｎｍとすることができ、２８０〜４００ｎｍであることが好ましい。露光量としては、例えば、０．１〜１０００ｍＪ／ｃｍ２とすることができ、１〜２００ｍＪ／ｃｍ２であることが好ましく、１０〜２０ｍＪ／ｃｍ２であることがより好ましい。
【００９３】
前記現像工程は、前記感光性組成物層における未露光領域を基材上から除去できる方法であれば特に制限はなく、例えば、溶剤を用いた洗浄、及び溶剤への浸漬等を挙げることができ、本発明においては、溶剤として水を用いる洗浄及び水への浸漬であることが好ましい。
【００９４】
本発明における基板は、例えば、架橋体からなる親水性領域と、基材が露出した疎水性領域とが区画化（パターニング）されて基材上に形成された基板として作製することにより、細胞培養基板として好適に用いることができる。すなわち、前記疎水性領域にのみ細胞が配置され、前記親水性領域には細胞が接着しないことにより、所望のパターン様に細胞が配置可能な細胞培養基板とすることができる。
【００９５】
本発明における基板を胚性幹細胞の培養用基板として用いる方法としては、通常の胚性幹細胞の培養方法を制限なく適用することができる。例えば、本発明の基板上に細胞培養培地を配置し、前記細胞培養培地へ所望の胚性幹細胞を播種した後、所望の胚性幹細胞に応じて選択される培養条件を適用することで、基板上の疎水性領域に所望の胚性幹細胞を選択的に配置することができる。
【００９６】
本発明における親水性領域及び疎水性領域の形状には特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、疎水性領域を円状、三角形をはじめとする多角形状、楕円状、ストライプ状等に形成することができる。また親水性領域及び疎水性領域の大きさについても特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００９７】
本発明における基板を胚性幹細胞の培養基板として使用する場合、疎水性領域を円状に形成した場合の大きさとしては、直径として５〜１０００μｍとすることが好ましく、５０〜５００μｍとすることがより好ましい。また、隣接する疎水性領域を隔てる親水性領域の幅としては、５０〜５００μｍであることが好ましく、１００〜２００μｍであることがより好ましい。更に前記親水性領域における層の厚みとしては、１０ｎｍ〜１０００ｎｍであることが好ましく１０ｎｍ〜５００ｎｍであることがより好ましい。
本発明における親水性領域及び疎水性領域の形状及び大きさは、上述の硬化工程における露光処理を、マスクを介した露光処理とすることで、容易にかつ高い精度で制御することができる。
【００９８】
本発明における基板は、特に胚性幹細胞由来のスフェロイド形成用の細胞培養用基板として好適に用いることができる。本発明における基板は、前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体からなる親水性領域を有するため、高精度にパターニングされた疎水性領域を形成することができる。また、前記親水性領域は細胞非接着性の経時安定性が極めて良好であり、長期間にわたって良好な機能性を示すスフェロイドを維持することが可能となる。すなわち、スフェロイドを形成する各実質細胞に特異的な機能が維持されうる。例えば、肝細胞にあっては高レベルの肝細胞機能（例えば、高レベルのアルブミン産生能、薬物代謝活性）、膵β細胞にあってはインスリン分泌機能、心筋細胞にあっては拍動運動機能等が長期間にわたって維持される。
このようなスフェロイドが形成された基板は、例えば、各種細胞に影響を及ぼし得る環境又は物質のスクリーニングに用いることができる。各種細胞に対する影響は、スフェロイドの形態の変化や産生物（例えば、肝細胞におけるアルブミン、モデル薬物の代謝生成物等）の産生能の変化をモニターすることで評価することができる。
【００９９】
本発明における基板においては、前記親水性領域を、分岐ポリアルキレングリコール誘導体として、末端に重合性置換基を有する重合度が５〜１０００のポリアルキレングリコール基を４以上有する化合物を用いて形成することで、形成されたスフェロイドの経時安定性が顕著に向上する。
【０１００】
本発明における基板をスフェロイド形成用基板として使用する場合、疎水性領域を例えば、円状に形成した場合の大きさとしては、直径として５〜１０００μｍとすることができる。好ましくは５０〜５００μｍであり、より好ましくは１００〜３００μｍである。また、隣接する疎水性領域を隔てる親水性領域の幅としては、５０〜５００μｍであることが好ましく、１００〜２００μｍであることがより好ましい。また親水性領域における層の厚みとしては１０ｎｍ〜１０００ｎｍであることが好ましく１０ｎｍ〜５００ｎｍがより好ましい。
親水性領域と疎水性領域とを前記大きさで構成することにより、機能性の高いスフェロイドをより効率的に作成することができ、更により長期に渡って維持することが可能となる。
【０１０１】
本発明における基板をスフェロイド形成用基板として用いる場合、必要に応じて前記疎水性領域に予めフィーダー細胞を配置することができる。すなわち本発明においては、本発明の基板上の疎水性領域にフィーダー細胞層を形成し、形成されたフィーダー細胞層上で、胚性幹細胞を培養することができる。
予めフィーダー細胞層を形成することで、胚性幹細胞由来のスフェロイド形成がより効率的に進行し、スフェロイドの安定性が向上する。前記フィーダー細胞としては、例えば、ＣＯＳ−１細胞、血管内皮細胞（例えば、大日本製薬製「ヒト臍帯静脈血管内皮細胞」）、繊維芽細胞等を挙げることができる。
【実施例】
【０１０２】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。尚、特に断りのない限り「％」は質量基準であり、平均分子量は重量平均分子量である。
【０１０３】
まず、本発明に用いられる分岐ポリアルキレングリコール誘導体、および該ポリアルキレングリコールを含む感光性組成物を用いて作製された基板について具体的に説明する。
（参考例１）
〜分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＡ２０Ｋ）の合成〜
４−アジド−安息香酸１２ｇ（９３．６ｍｍｏｌ）を４０ｍＬの塩化チオニルに溶解し、１．５時間、加熱還流した。反応混合物を減圧で濃縮、少量のヘキサンを加えて再度減圧で濃縮した後、真空下で乾燥し、白色固体として目的物の４−アジド−安息香酸クロリド９．３ｇ（５１．２ｍｍｏｌ、収率７０％）を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.11-8.15 (2H, ｍ), 7.11-7.16 (2H, m).
【０１０４】
次に、３ｍＬのジクロロメタン（脱水）に、トリエチルアミン８１ｍｇ（０．８ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン１４７ｍｇ（１．２ｍｏｌ）を加え、氷浴で冷却しながら攪拌した。この溶液に、上記で得られた４−アジド−安息香酸クロリド３６３ｍｇ（２．０ｍｍｏｌ、マルチアームＰＥＧの末端ＯＨ基に対して５モル当量）のジクロロメタン（脱水）溶液（５ｍＬ）を滴下し、そのまま５分攪拌を続けた後、反応容器を遮光し、マルチアームＰＥＧ（日油（株）製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標） ＰＴＥ−２００００、４つのポリエチレングリコール基を有するペンタエリスリトール誘導体）２ｇ（０．１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（脱水）溶液（２０ｍＬ）をゆっくり滴下した。反応溶液を氷浴からはずし、そのまま室温で１８時間攪拌した。反応混合物を減圧で濃縮し、ベンゼンを加えて懸濁させたものをろ過して塩を除いた後、再び減圧で濃縮した。粗生成物を少量のベンゼンに溶解し、０℃に冷却したイソプロピルエーテルに滴下して得られた沈殿を濾取する工程を３回繰り返して、得られた白色固体を減圧下で乾燥し、目的物とする分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＡ２０Ｋ）１．７４ｇ（収率８５％）を得た。
１Ｈ-ＮＭＲの積分比より算出した末端水酸基の重合性置換基への置換率は、８５％であった。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2145H, m).
【０１０５】
マルチアームＰＥＧとしてＰＴＥ−２００００の代わりに下記表１に示したマルチアームＰＥＧを用いた以外は、参考例１と同様にして分岐ポリアルキレングリコール誘導体を合成した。収率、性状等を表１に示した。
【０１０６】
【表１】
【０１０７】
（参考例２）
５−アミノ−サリチル酸１５．３ｇ（０．１ｍｏｌ）を蒸留水８０ｍＬと濃塩酸２０ｍＬの混合溶液に懸濁させ、室温で３０分攪拌した。混合溶液を氷浴中で冷却した後、亜硝酸ナトリウム６．９ｇ（０．１ｍｏｌ）の水溶液１０ｍＬを溶液の反応液の液温が５℃を超えないような速度で滴下し、そのまま１時間攪拌した。続いて、アジ化ナトリウム７．１５ ｇ（０．１１ｍｏｌ）の水溶液３０ｍＬを反応液の液温が１０℃を超えない速度で滴下した。氷浴を外して室温に戻しつつ、気泡が発生しなくなるまで激しく攪拌した。生成した沈殿を濾取し、さらに沈殿を蒸留水で洗浄した。得られた固体は、暗所で風乾した後、減圧下で完全に乾燥し、５−アジド−サリチル酸を白色固体として１２．０ｇ（６７．０ｍｍｏｌ、収率＝６７％）得た。
1H-NMR(DMSO-d6) δ: 11.14(1H, bs), 7.41 (1H, d, J = 3.0 Hz), 6.88 (1H, dd, J = 8.5, 3.0 Hz), 6.68 (1H, d, J = 8.4 Hz).
【０１０８】
得られた５−アジド−サリチル酸５ｇ（２７．９ｍｍｏｌ）を塩化チオニル５０ｍＬに懸濁し、７０℃で１時間攪拌した。反応混合物を室温まで放冷し、過剰の塩化チオニルを減圧で除き、５−アジド−サリチル酸クロリドの赤色固体を定量的に得た。
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 7.39 (1H, d, J = 2.9 Hz), 7.26 (1H, dd, J = 8.8, 2.9 Hz), 7.00 (1H, d, J = 8.8 Hz).
【０１０９】
次に、３ｍＬのジクロロメタン（脱水）に、トリエチルアミン８１ｍｇ（０．８ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン１４７ｍｇ（１．２ｍｏｌ）を加え、氷浴で冷却しながら攪拌した。この溶液に、上記で得られた５−アジド−サリチル酸クロリド３５８ｍｇ（２ｍｍｏｌ、マルチアームＰＥＧの末端ＯＨ基に対して５モル当量）のジクロロメタン（脱水）溶液（５ｍＬ）を滴下し、そのまま５分攪拌を続けた後、反応容器を遮光し、マルチアームＰＥＧ（日油（株）製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標） ＰＴＥ−２００００、４つのポリエチレングリコール基を有する化合物）２ｇ（０．１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（脱水）溶液（２０ｍＬ）をゆっくり滴下した。反応溶液を氷浴からはずし、そのまま室温で１８時間攪拌した。反応混合物を減圧で濃縮し、ベンゼンを加えて懸濁させたものをろ過して塩を除いた後、再び減圧で濃縮した。粗生成物を少量のベンゼンに溶解し、０℃に冷却したイソプロピルエーテルに滴下して得られた沈殿を濾取する工程を３回繰り返して、得られた白色固体を減圧下で乾燥し、目的物とする分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＢ２０Ｋ）１．７７ｇ（収率８５％）を得た。
１Ｈ-ＮＭＲの積分比より算出した末端水酸基の重合性置換基への置換率は、８５％であった。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2145H, m).
【０１１０】
（参考例３）
参考例２において、マルチアームＰＥＧとしてＰＴＥ−２００００の代わりにＨＧＥＯ−２００００（日油（株）製、８つのポリエチレングリコール基を有するヘキサグリセリン誘導体）を用いた以外は実施例４と同様にして、目的物とする分岐ポリアルキレングリコール誘導体（８ＰＢ２０Ｋ）１．７２ｇ（収率８５％）を得た。
１Ｈ-ＮＭＲの積分比より算出した末端水酸基の重合性置換基への置換率は、８５％であった。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2145H, m).
【０１１１】
（参考例４）
５−アミノ−２−ニトロ安息香酸１８．１ｇ（０．１ｍｏｌ）を蒸留水８０ｍＬと濃塩酸２０ｍＬの混合溶液に懸濁させ、室温で３０分攪拌した。混合溶液を氷浴中で冷却した後、亜硝酸ナトリウム６．９ｇ（０．１ｍｏｌ）の水溶液１０ｍＬを溶液の反応液の液温が５℃を超えないような速度で滴下し、そのまま１時間攪拌した。続いて、アジ化ナトリウム７．１５ ｇ（０．１１ｍｏｌ）の水溶液３０ｍＬを反応液の液温が１０℃を超えない速度で滴下した。氷浴を外して室温に戻しつつ、気泡が発生しなくなるまで激しく攪拌した。生成した沈殿を濾取し、さらに沈殿を蒸留水で洗浄した。得られた固体は、暗所で風乾した後、減圧下で完全に乾燥し、５−アジド−２−ニトロ安息香酸を白色固体として１９．２ｇ（９２．４ｍｍｏｌ、収率＝９２％）を得た。
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 13.99(1H, bs), 8.09-8.06 (1H, m), 7.45-7.42 (2H, m).
【０１１２】
得られた５−アジド−２−ニトロ安息香酸１．０ｇ（４．８ｍｍｏｌ）を塩化チオニル１０ｍＬに懸濁し、７０℃で１時間攪拌した。反応混合物を室温まで放冷し、過剰の塩化チオニルを減圧で除き、５−アジド−サリチル酸クロリドの赤色固体を定量的に得た。
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 8.10-8.07 (1H, m), 7.46-7.42 (2H, m).
【０１１３】
次に、３ｍＬのジクロロメタン（脱水）に、トリエチルアミン８１ｍｇ（０．８ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン１４７ｍｇ（１．２ｍｏｌ）を加え、氷浴で冷却しながら攪拌した。この溶液に、上記で得られた５−アジド−２−ニトロ安息香酸クロリド４１７ｍｇ（２ｍｍｏｌ、マルチアームＰＥＧの末端ＯＨ基に対して５モル当量）のジクロロメタン（脱水）溶液（５ｍＬ）を滴下し、そのまま５分攪拌を続けた後、反応容器を遮光し、マルチアームＰＥＧ（日油（株）製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標） ＰＴＥ−２００００、４つのポリエチレングリコール基を有する化合物）２ｇ（０．１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（脱水）溶液（２０ｍＬ）をゆっくり滴下した。反応溶液を氷浴からはずし、そのまま室温で１８時間攪拌した。反応混合物を減圧で濃縮し、ベンゼンを加えて懸濁させたものをろ過して塩を除いた後、再び減圧で濃縮した。粗生成物を少量のベンゼンに溶解し、０℃に冷却したイソプロピルエーテルに滴下して得られた沈殿を濾取する工程を３回繰り返して、得られた白色固体を減圧下で乾燥し、目的物とする分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＣ２０Ｋ）１．８１（収率８５％）を得た。
１Ｈ-ＮＭＲの積分比より算出した末端水酸基の重合性置換基への置換率は、８５％であった。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2145H, m).
【０１１４】
（参考例５）
参考例４において、マルチアームＰＥＧとしてＰＴＥ−２００００の代わりにＨＧＥＯ−２００００（日油（株）製、８つのポリエチレングリコール基を有するヘキサグリセリン誘導体）を用いた以外は参考例４と同様にして、目的物とする分岐ポリアルキレングリコール誘導体（８ＰＣ２０Ｋ）１．７１ｇ（収率８５％）を得た。
１Ｈ-ＮＭＲの積分比より算出した末端水酸基の重合性置換基への置換率は、８５％であった。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2145H, m).
【０１１５】
（参考例６）
アクリロイルクロリド１８１ｍｇ（２．０ｍｍｏｌ、マルチアームＰＥＧの末端ＯＨ基に対して５モル当量）のベンゼン（脱水）溶液（５ｍＬ）を滴下し、そのまま５分攪拌を続けた後、反応容器を遮光し、マルチアームＰＥＧ（日油（株）製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標） ＰＴＥ−２００００、４つのポリエチレングリコール基を有するペンタエリスリトール誘導体）２ｇ（０．１ｍｍｏｌ）のベンゼン（脱水）溶液（２０ｍＬ）をゆっくり滴下した。反応溶液を氷浴からはずし、そのまま室温で１８時間攪拌した。反応混合物を減圧で濃縮し、ベンゼンを加えて懸濁させたものをろ過して塩を除いた後、再び減圧で濃縮した。粗生成物を少量のベンゼンに溶解し、０℃に冷却したイソプロピルエーテルに滴下して得られた沈殿を濾取する工程を３回繰り返して、得られた白色固体を減圧下で乾燥し、目的物とする分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＤ２０Ｋ）１．７４ｇ（収率８５％）を得た。
１Ｈ-ＮＭＲの積分比より算出した末端水酸基の重合性置換基への置換率は、８５％であった。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2145H, m).
【０１１６】
（参考例７）
参考例６において、マルチアームＰＥＧとしてＰＴＥ−２００００の代わりに、ＨＧＥＯ−２００００（日油（株）製、８つのポリエチレングリコール基を有するヘキサグリセリン誘導体）を用いた以外は、参考例６と同様にして、目的物とする分岐ポリアルキレングリコール誘導体（８ＰＤ２０Ｋ）１．７４ｇ（収率８５％）を得た。
１Ｈ-ＮＭＲの積分比より算出した末端水酸基の重合性置換基への置換率は、８５％であった。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2145H, m).
【０１１７】
（参考例８）
〜基板の作製〜
以下の作業は、すべてイエロールーム内で行った。
参考例１で作製した分岐ポリアルキレングリコール誘導体（マルチアームＰＥＧ−アジド：４ＰＡ２０Ｋ）をトルエンに溶解し、感光性組成物Ａとして４ＰＡ２０Ｋのトルエン溶液（１％）を調製した。基材としてポリ−Ｌ−リジンコートスライドガラス（松浪硝子工業（株）製。白切放ＮＯ．１スライドガラス丸型２１ｍｍΦ。以下「ＰＬＬコートガラス」と略す）を使用し、ＰＬＬコートガラス上に、感光性組成物Ａを１１０μＬ滴下後、スピンコート法（５００ｒｐｍ×５秒＋３０００ｒｐｍ×２０秒＋６０００ｒｐｍ×１秒）により成膜し、常温で放置して乾燥させた。これに、石英ガラス製フォトマスク（直径２００μｍの円形パターンが多数配置されたもの）を密着させ、高圧水銀灯（２００Ｗ）を用いて４０秒間露光を行った後、脱イオン水で洗浄（現像工程：流水１５秒間＋浸漬２０分間）した。常温で乾燥し、表面に微細加工された親水性の架橋体を有する基板を得た。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡（倍率×１００）により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
【０１１８】
（参考例９）
参考例８において、基材としてＰＬＬコートガラスに代えて、アミノプロピルシランコートガラス（松浪硝子工業（株）製。ＡＰＳコートＮＯ．１カバーガラス丸型２１ｍｍΦ。以下「ＡＰＳコートガラス」と略す）を用いた以外は、参考例８と同様にして基板を作製し、表面に微細加工された親水性の架橋体を有する基板を得た。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
【０１１９】
（参考例１０）
参考例８において、基材としてＰＬＬコートガラスに代えて、ＭＡＳコートガラス（松浪硝子工業（株）製）を用いた以外は、参考例８と同様にして基板を作製し、表面に微細加工された親水性の架橋体を有する基板を得た。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
【０１２０】
（参考例１１）
参考例８において、基材としてＰＬＬコートガラスに代えて、ＰＬＬコート上にコラーゲンをさらにコーティングした「コラーゲンコートガラス」を用いた以外は、参考例８と同様にして基板を作製し、表面に微細加工された親水性の架橋体を有する基板を得た。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡（倍率×１００）により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
尚、コラーゲンコートガラスは、ＰＬＬコートガラス上にブタＩ型コラーゲン（日本ハム（株）製）の０．１％水溶液を４００μＬ滴下し、スピンコート法（３５０ｒｐｍ×５秒＋５００ｒｐｍ×５秒＋１０００ｒｐｍ×１０秒＋１５００ｒｐｍ×１０秒＋６０００ｒｐｍ×１秒）にて成膜した後、室温で乾燥する工程を２回繰り返して作製した。
【０１２１】
（参考例１２）
参考例８において、基材としてＰＬＬコートガラスに代えて、ＰＬＬコート上にゼラチンをさらにコーティングした「ゼラチンコートガラス」を用いた以外は、参考例８と同様にして基板を作製し、表面に微細加工された親水性の架橋体を有する基板を得た。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
尚、ゼラチンコートガラスは、ＰＬＬコートガラスを用い、ゼラチン（新田ゼラチン社製）の０．１％溶液を４００μＬ滴下し、スピンコート法（３５０ｒｐｍ×５秒＋５００ｒｐｍ×５秒＋１０００ｒｐｍ×１０秒＋１５００ｒｐｍ×１０秒＋６０００ｒｐｍ×１秒）にて成膜した後、室温で乾燥して作製した。
【０１２２】
（参考例１３）
参考例１１において、コラーゲンコートガラスの作製方法を、ＰＬＬコートガラスをブタＩ型コラーゲン（日本ハム（株）製）の０．０２％水溶液に３時間浸漬後、脱イオン水の流水で洗浄、乾燥させる方法に変更した以外は、参考例１１と同様の方法で基板を作製した。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
【０１２３】
（参考例１４）
参考例８において、感光性組成物Ａに代えて、マルチアームＰＥＧ−アジド（４ＰＡ２０Ｋ）の濃度を０．５％とした感光性組成物Ｂを用いた以外は、参考例８と同様の方法で基板を作製した。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
【０１２４】
（参考例１５）
参考例８において、分岐ポリアルキレングリコール誘導体として４ＰＡ２０Ｋに代えて、参考例２〜５で合成した各種の分岐ポリアルキレングリコール誘導体をそれぞれ用いた以外は参考例８と同様の方法で基板を作製した。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
【０１２５】
（実施例１６）
参考例８において、分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＡ２０Ｋ）に代えて、参考例４で合成した分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＣ２０Ｋ）を用い、露光条件として高圧水銀灯（２００Ｗ）で３秒間とした以外は、参考例８と同様の方法で基板を作製した。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡（倍率×１００）により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
【０１２６】
（参考例１７）
参考例８において、分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＡ２０Ｋ）に代えて、参考例４で合成した分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＣ２０Ｋ）を用い、露光条件をフォトマスク上にフィルター（シグマ光機（株）製、ＵＴＶＡＦ３６Ｕ）を配置して、高圧水銀灯（２００Ｗ）で１０秒間の露光とした以外は、実施例１０と同様の方法で基板を作製した。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡（倍率×１００）により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
【０１２７】
（参考例１８）
参考例９〜１３において、分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＡ２０Ｋ）に代えて、参考例２で合成した分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＢ２０Ｋ）又は参考例４で合成した分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＣ２０Ｋ）を用い、露光条件をフォトマスク上にフィルター（シグマ光機（株）製、ＵＴＶＡＦ３６Ｕ）を配置して、高圧水銀灯（２００Ｗ）で１０秒間の露光とした以外は、参考例９〜１３とそれぞれ同様の方法で基板を作製した。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
【０１２８】
（参考例１９）
参考例６及び参考例７で作製した分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＤ２０Ｋ、８ＰＤ２０Ｋ）の濃度が１％であって、光重合開始剤としてＩＲＧＡＣＵＲＥ２９５９の濃度が０．０５％となるようにトルエンに溶解して、感光性組成物Ｄを調製した。基材としてポリ−Ｌ−リジンコートスライドガラス（松浪硝子工業（株）製。白切放ＮＯ．１スライドガラス丸型２１ｍｍΦ。以下「ＰＬＬコートガラス」と略す）を使用し、ＰＬＬコートガラス上に、感光性組成物Ｄを１１０μＬ滴下後、スピンコート法（５００ｒｐｍ×５秒＋３０００ｒｐｍ×２０秒＋６０００ｒｐｍ×１秒）により成膜し、常温で放置して乾燥させた。これに、石英ガラス製フォトマスク（直径１００μｍの円形パターンが多数配置されたもの）を密着させ、高圧水銀灯（２００Ｗ）を用いて４０秒間露光を行った後、脱イオン水で洗浄（現像工程：流水１５秒間＋浸漬２０分間）した。常温で乾燥し、表面に微細加工された親水性の架橋体を有する基板を得た。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡（倍率×１００）により観察したところ、いずれの分岐ポリアルキレングリコール誘導体を用いた場合にも、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
【０１２９】
（実施例１）
〜胚性幹細胞の調製〜
Ｉ型コラーゲンαプロモーターで発現制御されたＧＦＰ遺伝子を組み換えたトランスジェニックマウス由来の胚性幹細胞（ＣＯＬ１−ＧＦＰ）を、ＦＡＳＥＢ Ｊ．，２１，１７７７-１７８７(２００７)に記載された方法に従って作製し、下記ＬＩＦ（＋）培地を用いて継代培養を行った。
ＬＩＦ（＋）培地：ＤＭＥＭ（シグマ・アルドリッチ社製）５００ｍＬ、ＦＢＳ ７５ｍＬ、ＡＢ ５ｍＬ、ＧｌｕｔａＭＡＸ ５ｍＬ、非必須アミノ酸溶液 ５ｍＬ、α−ＬＩＦ ５０μＬ、２−メルカプトエタノール ３．８μＬ。
また、同様にしてＩＩ型コラーゲンプロモーターで発現制御されたＧＦＰ遺伝子を組み換えたＷＴマウス由来の胚性幹細胞（ＣＯＬ２−ＧＦＰ）を作製し、同様にＬＩＦ（＋）培地を用いて継代培養を行った。
【０１３０】
〜スフェロイド形成〜
ＬＩＦ（＋）培地で継代培養してきた胚性幹細胞（ＣＯＬ１−ＧＦＰ）をトリプシン（１Ｘ）処理し、遠心分離後、ＬＩＦ（＋）培地に細胞を分散させた。
参考例８において作製した後、滅菌作業を行った基板を、ＦＡＬＣＯＮ社製１２ウェルプレート底面にセットし、培地としてＬＩＦ（＋）培地を添加し、ＬＩＦ（＋）培地に分散させた胚性幹細胞（ＣＯＬ１−ＧＦＰ）を細胞濃度１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬで播種した。次いで培地を下記ＬＩＦ（−）ＡＴＲＡ（＋）培地に交換し、培養条件５％ＣＯ２、３７℃で６日間培養した。
ＬＩＦ（−）ＡＴＲＡ（＋）培地：上記ＬＩＦ（＋）培地において、α−ＬＩＦ ５０μＬの代わりに、レチノイン酸（ＡＴＲＡ） ５０μＬを添加した。
【０１３１】
１日以内に基材上に形成した疎水性領域に対応してアレイ状に並んだ、均一な大きさを有する多数の胚性幹細胞由来のスフェロイド（細胞凝集塊）が得られた。培養開始１日後の顕微鏡写真（倍率×４００）を図１に、６日後の顕微鏡写真（倍率×４００）を図２に示した。
【０１３２】
（実施例２）
実施例１において、基板として直径２００μｍの円形パターンの代わりに、直径１００μｍおよび５００μｍの円形パターンの疎水性領域がそれぞれ形成された基板を用いた以外は実施例１と同様にして、胚性幹細胞（ＣＯＬ１−ＧＦＰ）を培養した。
直径１００μｍの円形パターンを形成した基板を用いた場合には、実施例１と同様に均一な大きさを有し、アレイ状に配置された胚性幹細胞由来のスフェロイドが得られた。また、５００μｍの円形パターンを用いた場合には、基板中央部分の疎水性領域では胚性幹細胞由来のスフェロイドが形成されていた。
【０１３３】
（実施例３）
実施例１において、参考例８で作製した基板の代わりに、参考例９〜１９で作製した基板を用いた以外は実施例１と同様にして、胚性幹細胞（ＣＯＬ１−ＧＦＰ）を培養した。
いずれの基板を用いた場合でも、実施例１と同様に、均一な大きさを有しアレイ状に配置された多数の胚性幹細胞由来のスフェロイドが得られた。
【０１３４】
（比較例１）
実施例１において、参考例８で作製した基板の代わりにペトリディッシュを用いた以外は実施例１と同様にして、胚性幹細胞（ＣＯＬ１−ＧＦＰ）を培養した。
形成された肺様体（ＥＢ）の培養６日後の顕微鏡写真（倍率×４００）を図３に示した。
【０１３５】
（実施例４）
ＬＩＦ(+)培地で継代培養した胚性幹細胞（ＣＯＬ１−ＧＦＰ）を参考例１で作製した基板に播種した。培地は基板に播種時にＬＩＦ(-)ＡＴＲＡ(+)に交換した。基板に播種する直前の細胞を０ｄａｙとし、播種後１日後および６日後にそれぞれ培養細胞を回収し、常法によりアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を測定した。
培養細胞はすべてトリプシン処理により回収し、ＰＢＳ(-)洗浄後（このとき細胞数をカウント）、１％ＳＤＳを加えて５分静置し、これをサンプルとした。９６ｗｅｌｌプレート中に基質溶液１００μＬをあらかじめ加えておき、ここにサンプル溶液を２０μＬ加えた。この時点から３７℃で、１５分間インキュベートし、反応停止液を８０μＬ加えて反応を停止した。この後、４０５ｎｍにおける吸光度をプレートリーダーにより測定し、あらかじめ作成しておいた検量線よりｐ−ニトロフェノール濃度を算出し、ＡＬＰ活性を求めた。結果を図４に示した。
【０１３６】
図４から、本発明にかかる基板上で胚性幹細胞を培養することにより、経時的にＡＬＰ活性が低下することがわかる。
【０１３７】
（実施例５）
〜ＲＴ−ＰＣＲによるマーカー遺伝子発現量評価〜
ＬＩＦ(+)培地で継代培養した胚性幹細胞（ＣＯＬ１−ＧＦＰ）を参考例１で作製した基板に播種した。培地は基板に播種時にＬＩＦ(-)ＡＴＲＡ(+)培地に交換した。基板に播種する直前の細胞を０ｄａｙとし、播種後１日後、５日後および７日後にそれぞれ培養細胞を回収した。ＲＴ−ＰＣＲを用いた常法により、未分化性マーカーＯｃｔ４、外胚葉系マーカーＮＣＡＭ、中胚葉系マーカーＦｌｋ−１、および内胚葉系マーカーＡＦＰの発現量を、以下のプロトコールに従って、それぞれ評価した。結果を図５〜図８に示した。
【０１３８】
ＲＮＡ抽出：基板上の培地を取り除き、ＰＢＳ(-)で２回洗浄した後、ＴＲＩｚｏｌを５００μＬ添加し、５分間室温にて静置した。よくピペッティングした後、エッペンチューブに移し、−８０℃にて保存した。
ＲＮＡ精製：ＴＲＩｚｏｌ ５００μＬに対し、クロロホルム １００μＬを添加し、手でよく攪拌後、１２０００ｒｐｍ、５分間、４℃で遠心分離を行った。ついで、ＩＰＡ ４００μＬの入った別のエッペンチューブに遠心分離後の上清から２００μＬを添加し、転倒混和を行い、１５０００ｒｐｍ、１０分間、４℃で遠心分離を行った。デカンテーションにより上清を取り除き、さらにキムワイプの上に伏せておき、完全に上清を除去した。７５％ＥｔＯＨ ５００μＬを添加し、ＶＯＲＴＥＸにより攪拌後、１５０００ｒｐｍ、５分間、４℃で遠心分離を行った。再びデカンテーションにより上清を取り除き、さらにエッペンで上清を完全に除去し、ＲＮＡ Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒを２０μＬ加えて溶解した。
ＲＴ：Ｔａｋａｒａ ＥｘＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔを用い、添付のプロトコルに従って操作を行った。
ＰＣＲ：設定条件は以下のとおりである。９４℃、５ｍｉｎ；９４℃、３０ｓｅｃ；５８℃、３０ｓｅｃ；７２℃、３０ｓｅｃ；７２℃、７ｍｉｎ；４℃、∞；Ｃｙｃｌｅ数 ３５。
【０１３９】
図５〜図８より、胚性幹細胞の経時培養により、Ｏｃｔ４の発現量が減少し、三胚葉系のマーカーの発現量が増加していることわかる。更に内胚葉系マーカーの発現量が突出して増加していることがわかる。
【０１４０】
（実施例６）
〜高分子ミセルを用いた分化誘導〜
非ウイルス系遺伝子ベクターとして、特開２００４−３５２９７２号公報に記載されたポリエチレングリコール−ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）−Ａｃ共重合体のジエチレントリアミン付加体（以下「ＰＥＧ−ＤＥＴ」という）を用いて、Ｒｕｎｘ２およびｃａＡＬＫ６遺伝子を内包する高分子ミセルを調製した。
尚、Ｒｕｎｘ２およびｃａＡＬＫ６遺伝子は、ＦＡＳＥＢ Ｊ．，２１，１７７７−１７８７（２００７）に記載の方法に準じて調製した。また、これらの遺伝子はヒト皮膚繊維芽細胞に対する軟骨分化誘導能を有することが知られている。
また高分子ミセルの調製、培養細胞への添加条件は、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１５(９)，１６５５-１６６２(２００７)に記載の方法に準じて行った。
【０１４１】
実施例１と同様にして胚性幹細胞由来のスフェロイドがアレイ状に配置された基板（スフェロイドアレイ）を作製し、これにＲｕｎｘ２およびｃａＡＬＫ６遺伝子を内包する高分子ミセルを添加して、５％ＣＯ２、３７℃で５日間培養したところ、ＧＦＰ由来の蛍光を観察することができた。
【０１４２】
（実施例７）
〜高分子ミセルを用いた分化誘導〜
非ウイルス系遺伝子ベクターとして、特開２００４−３５２９７２号公報に記載されたポリエチレングリコール−ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）−Ａｃ共重合体のジエチレントリアミン付加体（以下「ＰＥＧ−ＤＥＴ」という）を用いて、Ｓｏｘ５、Ｓｏｘ６、およびＳｏｘ９遺伝子を内包する高分子ミセルを調製した。
尚、Ｓｏｘ５、Ｓｏｘ６、およびＳｏｘ９遺伝子は、特開２００４−２６７０５２号公報に記載の方法に準じて調製した。また、これらの遺伝子はヒト皮膚繊維芽細胞に対する軟骨分化誘導能を有することが知られている。
また高分子ミセルの調製、培養細胞への添加条件は、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１５(９)，１６５５-１６６２(２００７)に記載の方法に準じて行った。
【０１４３】
実施例１において、胚性幹細胞（ＣＯＬ１−ＧＦＰ）の代わりに胚性幹細胞（ＣＯＬ２−ＧＦＰ）を用いた以外は、実施例１と同様にして胚性幹細胞由来のスフェロイドがアレイ状に配置された基板（スフェロイドアレイ）を作製した。
これにＳｏｘ５、Ｓｏｘ６、およびＳｏｘ９遺伝子を内包する高分子ミセルを添加して、５％ＣＯ２、３７℃で５日間培養したところ、ＧＦＰ由来の蛍光を観察することができた。
【０１４４】
（実施例８）
〜低分子化合物による分化誘導〜
実施例１において、胚性幹細胞（ＣＯＬ１−ＧＦＰ）の代わりに胚性幹細胞（ＣＯＬ２−ＧＦＰ）を用いた以外は、実施例１と同様にして胚性幹細胞由来のスフェロイドがアレイ状に配置された基板（スフェロイドアレイ）を作製した。
これに、低分子化合物ＴＨ（Biochem. Biophys. Res. Com., 357(4), 854-860 (2007)参照）を添加して、５％ＣＯ２、３７℃で５日間培養したところ、ＧＦＰ由来の蛍光を観察することができた。
【０１４５】
上記の結果から、本発明における基板上で胚性幹細胞を培養することにより、均一な大きさを有する胚性幹細胞由来のスフェロイドを大量に製造することができた。
また、本発明における基板上にアレイ状に配置された疎水性領域を形成することにより、疎水性領域に胚性幹細胞由来のスフェロイドが形成されたスフェロイドアレイが得られた。
さらに本発明のスフェロイドアレイを用いることで、薬物スクリーニングおよび胚性幹細胞の分化誘導が可能であった。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】培養１日後の胚性幹細胞の拡大写真である。
【図２】培養６日後の胚性幹細胞の拡大写真である。
【図３】培養６日後の胚様体の拡大写真である。
【図４】ＡＬＰ活性の変化を示す図である。
【図５】Ｏｃｔ４遺伝子の発現量変化を示す図である。
【図６】ＮＣＡＭ遺伝子の発現量変化を示す図である。
【図７】Ｆｌｋ−１遺伝子の発現量変化を示す図である。
【図８】ＡＦＰ遺伝子の発現量変化を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スフェロイドの製造方法、およびスフェロイドアレイに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、種々の組織細胞に分化する潜在的能力を保持した胚性幹細胞を用いて、人工的に各種組織細胞への分化誘導を行い、再生医療等へ応用することが検討されている。胚性幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで、種々の組織細胞へ分化誘導する方法としては、サイトカインや成長因子を作用させる方法、遺伝子を導入する方法等が知られている。
例えば、胚性幹細胞から形成した胚様体に、ウイルスベクターを用いて特定の遺伝子を導入することで、特定の組織細胞への分化を促進させる方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
また、胚性幹細胞から胚葉体を形成する方法としては、ハンギングドロップ中で胚性幹細胞を培養する方法や、ペトリディッシュに播種する方法等が一般に知られている。さらに特定の形状を有する培養容器中で胚性幹細胞を培養することで質的に安定した胚葉体を効率的に形成する方法が開示されている（例えば、特許文献２参照）。
【特許文献１】特開２００６−２５４８７２号公報
【特許文献２】特開２００６−２５４６２２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１に記載の方法では、形成される胚様体の大きさが不揃いとなりやすいため、分化誘導の効率が十分とは言い難く、また安定的に分化誘導を行うことが困難であった。また、特許文献２に記載の方法では、形成される肺様体の大きさを均一に制御することが困難であり、また一度に形成できる肺様体の数も十分であるとは言い難かった。
【０００５】
本発明は、均一な大きさを有する胚性幹細胞由来のスフェロイドを、一度に大量に形成することが可能なスフェロイドの製造方法を提供することを課題とする。また本発明は均一な大きさを有する胚性幹細胞由来のスフェロイドが、アレイ状に配置されたスフェロイドアレイを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第１の態様は、基材と、前記基材上に配置され、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の３以上と前記ポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基とを有する分岐ポリアルキレングリコール誘導体を含有する感光性組成物を硬化させて形成された複数の親水性領域および疎水性領域と、を含む基板上に、胚性幹細胞を播種することと、播種された胚性幹細胞を培養することと、培養された胚性幹細胞由来のスフェロイドを形成させることと、を含むスフェロイドの製造方法である。
前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体は重合度が５〜１０００のポリアルキレングリコール基を４以上有することが好ましい。
【０００７】
本発明の第２の態様は、前記スフェロイドの製造方法で製造され、内胚葉系マーカーであるＡＦＰの発現量が、中胚葉系マーカーであるＦｌＫ−１及び外胚葉系マーカーであるＮＣＡＭの少なくとも一方の発現量よりも大きいスフェロイドである。
【０００８】
本発明の第３の態様は、基材と、前記基材上に配置され、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の３以上と前記ポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基とを有する分岐ポリアルキレングリコール誘導体を含有する感光性組成物を硬化させて、アレイ状に形成された複数の親水性領域および疎水性領域と、を含む基板と、前記疎水性領域に配置された胚性幹細胞由来の複数のスフェロイドと、を含むスフェロイドアレイである。
【０００９】
本発明の第４の態様は、前記スフェロイドアレイを用いる薬物スクリーニング方法である。前記薬物スクリーニング方法は、高分子ミセルに内包された薬物を前記スフェロイドに接触させることを含むことが好ましい。
【００１０】
本発明の第５の態様は、基材と、前記基材上に配置され、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の３以上と前記ポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基とを有する分岐ポリアルキレングリコール誘導体を含有する感光性組成物を硬化させて形成された複数の親水性領域および疎水性領域と、を含む基板上に、胚性幹細胞を播種することと、分化誘導因子の存在下に播種された胚性幹細胞を培養することと、培養された胚性幹細胞から分化誘導された細胞を得ることと、を含む胚性幹細胞の分化誘導方法である。また前記分化誘導因子は高分子ミセルに内包された状態で添加されることが好ましい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、均一な大きさを有する胚性幹細胞由来のスフェロイドを、一度に大量に形成することが可能なスフェロイドの製造方法を提供することができる。また本発明によれば、均一な大きさを有する胚性幹細胞由来のスフェロイドが、アレイ状に配置されたスフェロイドアレイを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のスフェロイドの製造方法は、基材と、前記基材上に配置され、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の３以上と前記ポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基とを有する分岐ポリアルキレングリコール誘導体を含有する感光性組成物を硬化させて形成された複数の親水性領域および疎水性領域と、を含む基板上に、胚性幹細胞を播種することと、播種された胚性幹細胞を培養することと、培養された胚性幹細胞由来のスフェロイドを形成させることと、を含むことを特徴とする。
かかる基板を用いることで、均一な大きさを有する胚性幹細胞由来のスフェロイドを、一度に大量に形成することができる。
【００１３】
本発明における基板は、基材と、後述する特定構造の分岐ポリアルキレングリコール誘導体を含む感光性組成物を用いて、基材上に形成された複数の親水性領域および疎水性領域とを含む。前記親水性領域は、前記感光性組成物が硬化した架橋体が形成された領域であり、また前記疎水性領域は、前記親水性領域以外の領域であって基材が露出した領域である。
【００１４】
本発明における基板は、複数の前記親水性領域と複数の疎水性領域とが区画化されて形成された基板であることが好ましい。また前記親水性領域および疎水性領域の数、大きさおよびその形状には特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。尚、本発明における基板およびその作製方法の詳細については後述する。
【００１５】
本発明においては、均一な大きさのスフェロイドを形成する観点から、前記複数の疎水性領域が均一な大きさおよび形状を有していることが好ましい。
また、大量の均質なスフェロイドを効率的に形成する観点から、前記疎水性領域を例えば円状に形成した場合の大きさとして、直径が５０〜５００μｍであることが好ましく、１００〜３００μｍであることがより好ましい。
【００１６】
本発明のスフェロイドの作製方法は、前記基板上に、胚性幹細胞を播種することと、播種された胚性幹細胞を培養することと、培養された胚性幹細胞由来のスフェロイドを形成させることを含む。
前記基板上に胚性幹細胞を播種し、培養することで、前記基板上の疎水性領域に胚性幹細胞由来のスフェロイドを形成することができる。すなわち、前記基板上の疎水性領域にのみ胚性幹細胞が配置され、親水性領域には胚性幹細胞が接着しないことにより、疎水性領域の数、大きさ、およびその形状に応じた胚性幹細胞由来のスフェロイドを形成することができる。
【００１７】
前記胚性幹細胞は、異なる機能を持つ種々の細胞に分化可能な細胞である。このような胚性幹細胞の由来は、哺乳動物であれば特に制限はなく、霊長類（例えば、ヒト、サルなど）、有蹄類（例えば、ブタ、ウシ、ウマなど）、小型哺乳類のげっ歯類（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）の種々の動物から、使用目的に応じて適宜選択することができる。
胚性幹細胞の調製方法は、当該技術分野において周知の方法を用いて行うことができる。例えば、胚性幹細胞のみを選択的に生育させることができるような培養条件下で細胞を培養することで得ることができる。
【００１８】
胚性幹細胞の培養には、通常使用される培地を使用することができる。培養に用いられる培地としては、一般に動物細胞の培養に用いられる培地であればよく、例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）等を挙げることができる。
この培地には、細胞の増殖を促進するための血清を添加するか、あるいは血清に代替するものとして、例えばＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ等の細胞増殖因子やトランスフェリン等の既知血清成分を添加してもよい。なお、血清を添加する場合の濃度は、そのときの培養状態によって適宜変更することができるが、通常５容量％〜１０容量％とすることができる。また、適宜、各種ビタミンやストレプトマイシン等の抗生物質（ＡＢ）を添加したものであってもよい。さらに培地には、胚性幹細胞の自己複製能を維持しつつ、種々の組織細胞への分化を抑制する因子（例えば、白血病抑制因子（ＬＩＦ）等）が含まれていてもよい。
【００１９】
胚性幹細胞の培養には、通常の培養条件、例えば３７℃の温度で５％ＣＯ２濃度のインキュベーター内での培養が適用される。
また胚性幹細胞由来のスフェロイドの形成においては、通常の培養条件で２時間〜２日程度培養を行うことでスフェロイドを形成することができる。
【００２０】
本発明における胚性幹細胞の培養に用いる培地としては、効率的なスフェロイド形成の観点から、ＬＩＦを含まない培地を用いることが好ましく、ＬＩＦを含まずレチノイン酸を含む培地を用いることがより好ましい。
【００２１】
前記基板上に、胚性幹細胞を播種する方法に特に制限はなく通常の方法を適宜用いることができる。また播種する胚性幹細胞の密度については、スフェロイドが形成可能であれば特に制限はなく、基板の大きさ、疎水性領域の数及び大きさ等に応じて適宜選択することができる。例えば、１×１０４〜１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬとすることができ、１×１０４〜１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬであることが好ましい。
【００２２】
本発明において胚性幹細胞由来のスフェロイドの形成は、形態観察に基づいて判断することができる。すなわち、播種された胚性幹細胞は、培養期間の経過に伴って、疎水性領域上に集合し、細胞凝集塊（スフェロイド）の形成をする
またスフェロイド形成の他の指標として、培養期間の経過に伴うアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性が低下を用いてもよい。
【００２３】
本発明のスフェロイドの製造方法によれば、均一な大きさで且つ大量のスフェロイドを基板上に形成することができる。このようなスフェロイドは、細胞の性質もほぼ均質なものであるため、種々の挙動において同様の傾向を示すことができる。
したがって本発明のスフェロイドの製造方法で形成されたスフェロイドを、例えば、薬物スクリーニングに適用することで、より高感度かつ高精度な薬物スクリーニングが可能となる。また、かかるスフェロイドは、所定の刺激に対応して同程度の分化を誘導することができる。
【００２４】
本発明のスフェロイドの製造方法で形成された胚性幹細胞由来のスフェロイドにおいては、内胚葉系マーカーであるＡＦＰの発現量が、中胚葉系マーカーであるＦｌｋ−１の発現量および外胚葉系マーカーであるＮＣＡＭの発現量の少なくとも一方よりも大きいことを特徴とするが、さらに未分化性マーカーであるＯｃｔ４の発現量が低下していることが好ましい。
これにより本発明のスフェロイドを、内胚葉系の組織細胞への分化誘導に好適に適用することができる。
【００２５】
また前記ＡＦＰの発現量は、Ｆｌｋ−１の発現量およびＮＣＡＭの発現量の少なくとも一方の５０倍以上であることが好ましく、２００倍以上であることがより好ましい。
本発明においてＡＦＰ等のマーカーの発現量は、ＲＴ−ＰＣＲを用いて通常の方法で測定した発現量を意味する。
【００２６】
本発明のスフェロイドアレイは、基材と、前記基材上に配置され、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の３以上と前記ポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基とを有する分岐ポリアルキレングリコール誘導体を含有する感光性組成物を硬化させて、アレイ状に形成された複数の親水性領域および疎水性領域と、を含む基板と、前記疎水性領域に配置された胚性幹細胞由来の複数のスフェロイドと、を含むことを特徴とする。
本発明における基板および胚性幹細胞については、前記スフェロイドの製造方法における基板および胚性幹細胞と同様である。
【００２７】
本発明のスフェロイドアレイにおけるスフェロイドの配置及び個数は、基板上に形成された疎水性領域の配置及び個数に応じたものである。ここで疎水性領域の配置は基板上にアレイ状に配置されていれば特に制限はなく、疎水性領域の個数と共に、スフェロイドアレイの目的等に応じて適宜変更することができる。
【００２８】
本発明のスフェロイドアレイにおいては、アレイ状に配置された各スフェロイドを、その大きさが均一になるように、また基板上に大量にかつ効率よく形成することができる。かかるスフェロイドアレイにおいては、各スフェロイドの薬物感受性等の性質を均質に揃えることができる。これを例えば、薬物スクリーニングに用いる場合には、高精度かつ良好な再現性の薬物スクリーニングが実現できる。また例えば、組織細胞への分化誘導に用いる場合には、大量の組織細胞凝集塊を良好な再現性で得ることができる。
【００２９】
本発明のスフェロイドアレイにおいては、基材上に形成された複数の親水性領域および疎水性領域が区画化されて形成され、親水性領域に囲まれた疎水性領域がアレイ状に配置されている。かかる形状に疎水性領域を形成する方法としては、後述の本発明における基板の作製方法を好適に挙げることができる。
本発明において前記疎水性領域は、形成されるスフェロイドの均一性の観点から、均一な大きさおよび形状であることが好ましい。
本発明のスフェロイドアレイは、例えば、前記スフェロイドの製造方法を用いて製造することができる。
【００３０】
本発明の薬物スクリーニング方法は、前記スフェロイドアレイを用いることを特徴とする。これにより高精度かつ良好な再現性の薬物スクリーニングが実現できる。
また本発明の薬物スクリーニング方法は、スフェロイドアレイを構成するスフェロイドに、高分子ミセルに内包された薬物を接触させることを含むことが好ましい。これにより、より効率的にスフェロイドと薬物を接触させることができ、より高感度に薬物スクリーニングを行うことができる。
【００３１】
本発明の薬物スクリーニングにおけるスフェロイドアレイは、胚性幹細胞由来のスフェロイドがアレイ状に配置されて構成される。スフェロイド（細胞凝集塊）を用いてスクリーニングを行うことにより、薬物に対する細胞応答をより明確かつ高感度に判定することができる。例えば、薬物に対する細胞応答を発色、発光、蛍光等で検出する場合には、凝集した複数の細胞からの応答として検出できるため、明確かつ高感度に判定することができる。
またスフェロイドがアレイ状に配置されていることにより、薬物に対する細胞応答を再現性よくかつ高感度に判定することができ、また複数の薬物に対する細胞応答を同時に判定することができる。
【００３２】
本発明においてスクリーニング対象となる薬物には特に制限はなく、胚性幹細胞由来のスフェロイドに何らかの応答変化を生じさせる薬物であればよい。具体的には、分化誘導因子、成長因子等を挙げることができる。本発明においては、スクリーニング感度の観点から、分化誘導因子であることが好ましい。
また前記薬物は、低分子化合物であっても、高分子化合物であってもよい。前記高分子化合物としては、例えば、蛋白質、ポリヌクレオチド等を挙げることができる。
【００３３】
本発明の薬物スクリーニング方法において、薬物とスフェロイドとを接触させる方法には特に制限はなく、通常用いられる方法を適用することができる。
例えばスクリーニング対象となる薬物がポリヌクレオチドの場合、薬物とスフェロイドを接触させる方法としては、ウイルスベクターを用いる方法（例えば、特開２００６−２５４８７２号公報参照）が一般的に用いられている。本発明においてはポリヌクレオチドが高分子ミセルに内包された状態でスフェロイドと接触することが好ましい。これにより、ウイルスベクターに由来する細胞毒性の発現を回避することができ、薬物とスフェロイドの接触をより効率的に行うことができる。
【００３４】
本発明において用いられることがある高分子ミセルは、親水性構成単位と疎水性構成単位とを含むブロックコポリマーから構成することができる。前記親水性構成単位としては非イオン性の親水性構成単位であることが好ましく、ポリアルキレングリコールであることがより好ましい。また疎水性構成単位は、内包する薬物に応じて適宜選択することができる。例えば、ポリアスパラギン酸などの金属錯体と相互作用しうる構成単位、カチオン性蛋白質と相互作用しうるアニオン性の構成単位、ポリヌクレオチドと相互作用しうるカチオン性の構成単位等を挙げることができる。
【００３５】
本発明においてスクリーニング対象の薬物が、例えばポリヌクレオチドの場合、高分子ミセルを構成するブロックコポリマーは疎水性構成単位としてカチオン性の構成単位を含むことが好ましい。かかるブロックコポリマーの具体例としては、例えば、特開２００４−３５２９７２号公報に記載のポリエチレングリコール−ポリカチオンブロック共重合体を好適に挙げることができる。
【００３６】
本発明において前記胚性幹細胞は、スクリーニング目的に応じた応答遺伝子を含むことが好ましい。これにより、より高精度かつ高感度に薬物スクリーニングを行うことができる。前記応答遺伝子はスクリーニング目的に応じて適宜選択される。例えば、特定の組織細胞への分化誘導因子のスクリーニングに用いる場合、その組織細胞特異的に発現する遺伝子のプロモーターを応答遺伝子として好適に用いることができる。
具体的には、例えば、骨芽様細胞への分化誘導因子のスクリーニングに適用する場合、Ｉ型またはＩＩ型のコラーゲンプロモーターを応答遺伝子として用いることができる。
【００３７】
本発明において前記応答遺伝子は、それによって発現制御されるレポーター遺伝子を、その下流に連結していることが好ましい。レポーター遺伝子としては通常使用されるものを特に制限なく用いることができ、例えば、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子を好適に用いることができる。
【００３８】
本発明の薬物スクリーニング方法を、骨芽様細胞への分化誘導因子のスクリーニングに適用する場合、前記スフェロイドを形成する胚性幹細胞はＩ型またはＩＩ型のコラーゲンプロモーターとこれに発現制御されるレポーター遺伝子とを含むことが好ましい。
【００３９】
本発明の胚性幹細胞の分化誘導方法は、基材と、前記基材上に配置され、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の３以上と前記ポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基とを有する分岐ポリアルキレングリコール誘導体を含有する感光性組成物を硬化させて形成された複数の親水性領域および疎水性領域と、を含む基板上に、胚性幹細胞を播種することと、分化誘導因子の存在下に播種された胚性幹細胞を培養することと、培養された胚性幹細胞から分化誘導された細胞を得ることと、を含むことを特徴とする。
本発明における基板および胚性幹細胞については、前記スフェロイドの製造方法における基板および胚性幹細胞と同様である。
【００４０】
本発明においては前記基板上で胚性幹細胞の分化誘導を行うことで、胚性幹細胞から分化誘導された細胞が基板の疎水性領域においてスフェロイド（細胞凝集塊）を形成する。そのため、分化誘導された細胞を高い均一性で効率よく得ることができる。
【００４１】
本発明における分化誘導としては、胚性幹細胞から、胚性幹細胞とは異なる性質を有する細胞への分化誘導であれば特に制限はなく、例えば、胚様体を構成する細胞、体性幹細胞、組織細胞等への分化誘導を挙げることができる。
本発明における分化誘導因子としては、胚性幹細胞を分化誘導可能な化合物であれば、特に制限なく、目的に応じて適宜選択して用いることができる。また前記分化誘導因子は低分子化合物であっても、高分子化合物であってもよい。ここで高分子化合物には蛋白質やポリヌクレオチド等が含まれる。
【００４２】
本発明の分化誘導方法においては、基板上に胚性幹細胞を播種した後に、基板の疎水性領域に胚性幹細胞由来のスフェロイドを形成させ、その後、分化誘導因子の存在下に胚性幹細胞由来のスフェロイド培養することが好ましい。胚性幹細胞由来のスフェロイドを形成させることにより、より効率的に分化誘導を行うことができる。
基板の疎水性領域に胚性幹細胞由来のスフェロイドを形成させる方法としては、前記スフェロイドの製造方法を好適に適用することができる。
【００４３】
本発明において分化誘導因子の存在下に播種された胚性幹細胞を培養する方法としては、分化誘導因子を添加した培地中で胚性幹細胞を培養する方法を挙げることができる。前記分化誘導因子の添加方法としては特に制限なく、通常用いられる方法を用いることができる。
本発明においては、分化誘導効率の観点から、高分子ミセルに内包された状態の分化誘導因子を添加することが好ましい。尚、高分子ミセルについては前記薬物スクリーニング方法で説明した高分子ミセルを本発明においても好適に適用することができる。
【００４４】
本発明の分化誘導方法においては、用いる分化誘導因子に応じて分化誘導された細胞を得ることができる。
本発明の分化誘導方法によって、例えば骨芽様細胞を得る場合、用いることができる分化誘導因子としては、ＴＨ（例えば、Biochem. Biophys. Res. Commun., 357(4),854-860 (2007)参照）ような低分子化合物や、ｃａＡＬＫ６、Ｒｕｎｘ２、ｃａＳｍｏ、ｃａＬＥＦ−１、ＩＲＳ−１等の遺伝子（ポリヌクレオチド）を挙げることができる。中でも骨芽様細胞への分化誘導効率の観点から、ｃａＡＬＫ６およびＲｕｎｘ２の少なくとも一方であることが好ましい。
また例えば、軟骨様細胞への分化誘導因子として、Ｓｏｘ５、Ｓｏｘ６、Ｓｏｘ９等の遺伝子（ポリヌクレオチド）を挙げることができる。
尚、前記遺伝子の詳細については、例えば、FASEB J., 21, 1777-1787 (2007)、特開２００４−２６７０５２号公報等に記載されている。
【００４５】
本発明の分化誘導方法によって得られる分化誘導された細胞は、高い均一性を有する細胞凝集塊であることから、種々の用途、例えば再生医療等に好適に用いることができる。
【００４６】
以下、本発明における基板について詳細に説明する。
本発明における分岐ポリアルキレングリコール誘導体は、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の３以上と、前記ポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基とを有することを特徴とする。
かかる構成の分岐ポリアルキレングリコール誘導体は、親水性の架橋体を形成することができる。かかる親水性の架橋体は、細胞非接着性の経時安定性が良好であり、例えば、本発明における分岐ポリアルキレングリコール誘導体を用いて基材上に親水性領域と疎水性領域とが高精度に形成された基板は、該基板上で細胞を培養した場合に、疎水性領域にのみ特異的に細胞が接着するため、高精度に区画化された細胞集合体を形成することができる。また、前記親水性領域は細胞非接着性の経時安定性が良好であり、長期に渡って区画化された細胞集合体を維持することができる。更に前記細胞集合体は、例えば、単層の細胞集合体とすることもできるし、細胞が３次元的凝集状態を形成した細胞凝集塊（スフェロイド）とすることもできる。
【００４７】
本発明における分岐ポリアルキレングリコール誘導体において、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の含有数は３以上である。前記ポリアルキレングリコール基の含有数が２以下では、これによって形成された親水性領域の細胞非接着性の経時安定性が不十分であり、区画化された細胞集合体を長期間維持することができない。
また前記ポリアルキレングリコール基の含有数は、経時安定性と良好なスフェロイド形成性の点から、４以上であることが好ましく、４以上６４以下であることがより好ましく、４以上１６以下であることが更に好ましい。
【００４８】
本発明における前記ポリアルキレングリコール基は、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基であれば特に制限はない。
また前記重合性置換基としては重合性の官能基を有する置換基であってポリアルキレングリコールの末端に結合可能なものであれば特に制限はない。重合性置換基のポリアルキレングリコールの末端への結合態様としては、ポリアルキレングリコールに由来する酸素原子を介した結合態様であっても、ポリアルキレングリコールの末端水酸基が他の元素に置換された結合態様であってもよい。
【００４９】
前記重合性置換基は、重合性の官能基そのものであっても、重合性の官能基と連結基とを含んで構成された置換基であってもよい。
本発明における重合性の官能基としては、通常用いられる重合性官能基を特に制限なく用いることができ、例えば、エチレン性不飽和結合を有する基、アジド基等を挙げることができる。本発明においては、親水性領域のパターン形成性の観点から、エチレン性不飽和結合を有する基及びアジド基から選ばれる少なくとも１種であることが好ましく、アジド基であることがより好ましい。
【００５０】
また前記重合性置換基における連結基としては重合性の官能基とポリアルキレングリコール基とを連結可能な基であれば特に制限はなく、例えば、アルキレン基、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、カルボニル基、酸素原子、窒素原子、硫黄原子、ジスルフィド及び水素原子から選ばれる少なくとも１種を含んで構成することができる。
具体的には例えば、カルボニル基、アリーレン基、アルキレンカルボニル基、カルボニルアリーレン基、カルバモイルアリーレン基等を挙げることができる。
更に連結基の価数としては少なくとも２価であればよく、３価以上の連結基であってポリアルキレングリコールと２以上の重合性官能基とを連結する連結基であってもよい。
【００５１】
末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基を構成するポリアルキレングリコール基は、本発明における分岐ポリアルキレングリコール誘導体に親水性を付与可能なポリアルキレングリコール基であれば特に制限はない。例えば、炭素数２〜４のアルキレングリコール構造単位（例えば、エチレンオキシ、ｎ−プロピレンオキシ、イソプロピレンオキシ、ブチレンオキシ、イソブチレンオキシ等）を含むポリアルキレングリコール基を好ましく用いることができる。
【００５２】
前記ポリアルキレングリコール基におけるアルキレングリコール構造単位は、１種のアルキレングリコール構造単位からなるものであっても、２種以上アルキレングリコール構造単位の組合せからなるものであってもよい。ポリアルキレングリコール基が２種以上のアルキレングリコール構造単位の組合せからなる場合、ブロックポリマーであってもランダムポリマーであってもよい。
また、ポリアルキレングリコール基の重合度としては、親水性の観点から５以上であればよく、５〜１０００の重合度を有するポリアルキレングリコール基を好ましく用いることができ、より好ましくは１０〜５００である。
【００５３】
本発明における、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基は、少なくとも３つの前記ポリアルキレングリコール基における重合性置換基が結合していない方の末端と結合し、前記ポリアルキレングリコール基を互いに連結可能なものであれば特に制限はない。結合様式としては共有結合、配位結合、イオン結合のいずれであってもよい。
具体的には例えば、糖類に由来する連結基、多価アルコールに由来する連結基、多価カルボン酸に由来する連結基、配位結合を介して前記ポリアルキレングリコール基を含む基を結合可能な金属原子等を挙げることができる。
【００５４】
前記糖類としては、例えば、グリセルアルデヒド、エリトロース、リボース、グルコース等を挙げることができる。また、多価アルコールとしては、グリセリン、ペンタエリスリトール、キシリトール、ソルビトール等を挙げることができる。更に、多価カルボン酸としては、プロパントリカルボン酸、クエン酸、ベンゼントリカルボン酸等を挙げることができる。また、前記金属原子としては、金、銀、白金、ニッケル、銅等を挙げることができる。
【００５５】
本発明においては、親水性と経時安定性の観点から、多価アルコールに由来する連結基であることが好ましく、グリセリンに由来する連結基又はペンタエリスリトールに由来する連結基がより好ましく、グリセリン、ポリグリセリン、ペンタエリスリトール、及びポリペンタエリスリトールから選ばれる化合物に由来する連結基であることが特に好ましい。
【００５６】
本発明における末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基は、経時安定性と良好なスフェロイド形成性の観点から、下記一般式（１）で表される置換ポリアルキレングリコール基であることが好ましい。
【００５７】
【化１】
【００５８】
一般式（１）中、ｍは２〜４の整数を表すが、２又は３であることが好ましく、２であることがより好ましい。またｎは５〜１０００の整数を表すが、１０〜５００であることが好ましく、１０〜３００であることがより好ましい。
【００５９】
一般式（１）中、Ｘ１は重合性置換基を表す。本発明において前記重合性置換基は、本発明における分岐ポリアルキレングリコール誘導体の架橋硬化性の観点から、下記一般式（３）及び一般式（４）の少なくとも１種で表される重合性置換基であることが好ましい。
【００６０】
【化２】
【００６１】
一般式（３）中、Ｌ３は単結合又は２価の連結基を表す。前記２価の連結基としてはエチレン性不飽和基とポリアルキレングリコール基とを連結可能であれば特に制限はない。例えば、アルキレン基、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、カルボニル基、酸素原子、窒素原子、イミノ基、及び水素原子の少なくとも１種を含んで構成される２価の連結基を挙げることができ、カルボニル基、エステル基、アミド基、フェニレン基、炭素数２〜４のアルキレン基、から選ばれる２価の連結基又はこれらの組合せからなる２価の連結基であることが好ましい。
本発明においてＬ３は、単結合、又は、カルボニル基、カルボニルフェニレン基、カルバモイルフェニレン基から選ばれる２価の連結基であることがより好ましい。
【００６２】
また、Ｒ３は水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表す。炭素数１〜３のアルキル基としては、具体的にはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基を挙げることができる。本発明においては、分岐ポリアルキレングリコール誘導体の架橋反応性の観点から、Ｒ３は水素原子又はメチル基であることが好ましく、水素原子であることがより好ましい。
【００６３】
一般式（４）におけるＬ４は２価の連結基を表すが、その定義及びその好ましい範囲は前記Ｌ３における２価の連結基と同様である。
【００６４】
また本発明においては、前記重合性置換基の少なくとも１つは下記一般式（５）で表される置換基であることが好ましい。これにより、重合性置換基の反応開始がより長波長の光照射によって可能となる。
【００６５】
【化３】
【００６６】
一般式（５）中、Ｌ５は単結合又は２価の連結基を表す。Ｌ５で表される２価の連結基は、前記Ｌ３における２価の連結基と同様である。
また、ｉは１又は２を表す。
【００６７】
一般式（５）中、Ｒ５は置換基を表すが、一般式（５）で表される重合性置換基の極大吸収波長を変化させることができる置換基であれば特に制限はない。中でも一般式（５）で表される重合性置換基の極大吸収波長を長波長側にシフト可能な置換基であることが好ましい。具体的には例えば、ニトロ基、水酸基、アルキルオキシ基、ジアルキルアミノ基、シアノ基、ニトロソ基等を好適に挙げることができる。
ｉが２の場合、２つのＲ５は同一でも異なっていてもよい。
【００６８】
また、本発明における分岐ポリアルキレングリコール誘導体は、親水性と架橋反応性の観点から、下記一般式（２）で表される化合物であることが好ましい。
【００６９】
【化４】
【００７０】
一般式（２）中、Ｌ２は単結合又はメチレン基を表し、ｐは１又は２を表す。ｐが１のときＬ２は単結合であることが好ましく、ｐが２のときＬ２はメチレン基であることが好ましい。
ｑは１〜７０の整数を表す。本発明においては、親水性と架橋反応性の観点から、ｐが１のとき、ｑは１〜６４であることが好ましく、２〜１０であることがより好ましい。またｐが２のとき、ｑは１〜３２であることが好ましく、１〜５であることがより好ましい。
【００７１】
一般式（２）中、Ｒ２は末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基又は末端に水酸基を有するポリアルキレングリコール基を表す。中でも架橋反応性の観点から、Ｒ２は末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基であることが好ましく、前記一般式（１）で表される置換ポリアルキレングリコール基であることがより好ましい。
【００７２】
本発明における分岐ポリアルキレングリコール誘導体は、経時安定性とスフェロイド形成性の観点から、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基を４以上１６以下有し、前記ポリアルキレングリコール基が前記一般式（１）で表されるものであって、前記重合性置換基が前記一般式（３）、一般式（４）及び一般式（５）の少なくとも１種で表されるものであることが好ましい。
【００７３】
本発明における分岐ポリアルキレングリコール誘導体の具体例を以下に例示するが、本発明はこれらに限定されるものではない。尚、下記具体例中のポリアルキレングリコールの重合度（ｎ）は分岐ポリアルキレングリコール誘導体の重量平均分子量から算出される平均重合度を意味する。また、分岐ポリアルキレングリコール誘導体の重量平均分子量は、例えば、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって測定することができる。
【００７４】
【化５】
【００７５】
【化６】
【００７６】
【化７】
【００７７】
本発明における分岐ポリアルキレングリコール誘導体は、例えば、３以上のポリエチレングリコール基を有する化合物（以下、「マルチアームＰＥＧ」ということがある。例えば、日油（株）製、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＰＴＥシリーズ、ＨＧＥＯシリーズ等）の末端水酸基に対して、重合性置換基を、通常用いられる方法を用いてエステル結合、エーテル結合等で結合することによって合成することができる。例えば、エステル結合の形成は酸塩化物法、活性エステル法等で行うことができる。
【００７８】
本発明における分岐ポリアルキレングリコール誘導体は、例えば、後述の感光性組成物の成分とすることができる。また、架橋反応により親水性の架橋体を形成することができる。
【００７９】
本発明における感光性組成物は、前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体の少なくとも１種を含有することを特徴とする。かかる感光性組成物を用いることで、例えば、基材上に高精度に区画化された親水性領域と疎水性領域とを形成することができる。
前記感光性組成物においては、前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体を１種単独で含有することもできるし、２種以上を含有することもできる。
また前記感光性組成物は、前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体に加えて、光重合開始剤、溶剤、細胞培養液、界面活性剤、緩衝液、消泡剤、防腐剤等の各種の添加剤等を含んで構成することができる。
【００８０】
前記光重合開始剤としては、光照射によって重合反応を開始可能なものであれば特に制限はないが、生細胞に対する障害性が低いものであることが好ましい。具体的には、例えば、ＩＲＧＡＣＵＲＥ ２９５９、ＩＲＧＡＣＵＲＥ １８４（いずれもチバ・スペシャリティー・ケミカルズ社製）等を挙げることができ、細胞毒性と水溶性の点からＩＲＧＡＣＵＲＥ ２９５９が好ましい。
【００８１】
前記溶剤としては、前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体を溶解可能であれば特に制限はない。ここでいう溶解可能とは前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体を質量基準で０．１％以上溶解できることをいう。
前記溶剤として具体的には、ベンゼン、トルエン、ＴＨＦ、ＤＭＦ、クロロホルム等の有機溶媒、及び水を好ましく用いることができる。また、溶剤は１種単独でも２種以上を混合して用いてもよい。
【００８２】
前記感光性組成物における前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体の含有率としては、例えば０．１〜５０質量％とすることができ、０．１〜２０質量％であることが好ましい。
【００８３】
本発明における架橋体は、前記感光性組成物を架橋硬化させて形成されたものである。前記架橋硬化は光照射による重合反応に起因するものであれば特に制限はなく、感光性組成物に応じて適宜架橋硬化条件を選択することができる。
【００８４】
本発明における架橋体は、例えば、基材上に形成された前記感光性組成物からなる観光性組成物層を硬化させたものであっても、媒体中で分散状態とした前記感光性組成物を硬化させたものであってもよい。基材上に形成された前記感光性組成物層を硬化させることで、基材上に架橋体からなる親水性領域を形成することができる。また、媒体中で分散状態とした前記感光性組成物を硬化させることで、親水性表面を有する粒子状の架橋体を形成することができる。
【００８５】
本発明における基板は、基材と、前記基材上に配置された前記架橋体とを含むことを特徴とする。本発明における基材としては、通常用いられる基材を特に制限なく用いることができる。基材の材質としては、例えば、ガラス、熱可塑性樹脂、熱硬化性樹脂、シリコーン、ダイヤモンド、金属、及びセラミックス等を挙げることができる。本発明においては、基材と架橋体との接着性の観点から、ガラス又は熱可塑性樹脂であることが好ましく、ガラスであることがより好ましい。
【００８６】
また本発明における基材は、アミノ基を有するシランカップリング剤、エチレン性不飽和基を有するシランカップリング剤、及びポリリジンから選ばれる少なくとも１種で表面処理された基材であることが好ましい。これにより、基材とその上に形成された架橋体との結合安定性を向上させることができる。
また、前記基材は、細胞接着性タンパク質の少なくとも１種で表面処理された基材であることもまた好ましく、アミノ基を有するシランカップリング剤、エチレン性不飽和基を有するシランカップリング剤、及びポリリジンから選ばれる少なくとも１種で表面処理された基材を、細胞接着性タンパク質の少なくとも１種で更に表面処理した基材であることがより好ましい。
表面処理された基材を用いて、基板を構成することにより、例えば、基板上で細胞を培養する場合に、より効率的に細胞集合体を形成することができる。
ここで、細胞接着性タンパク質としては、例えば、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、テイネシン及びエラスチン等を挙げることができ、中でも、細胞集合体の形成性の観点から、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチンが好ましく、コラーゲン、ゼラチンがより好ましい。
【００８７】
本発明における基板を作製する方法は、例えば、基材上に前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体を含む感光性組成物を付与して感光性組成物層を形成する工程と、前記感光性組成物層を、露光処理する硬化工程とを含むことができる。これにより、基材上に、前記架橋体が形成された基板を作製することができる。
前記基板を作製する方法は、必要に応じて、前記硬化工程後に加熱工程、洗浄工程、乾燥工程、滅菌工程等を更に含むことができる。
【００８８】
本発明において、基材上に感光性組成物層を形成する工程には、特に制限なく通常の薄膜形成方法を適用することができ、例えば、塗布法、ディップコート法、スピンコート法等を好適に適用することができる。
基材上に形成された感光性組成物層の層厚としては、特に制限はなく基板の使用目的に応じて適宜選択することができ、例えば、５ｎｍ〜１０００μｍとすることができる。特に、本発明の基板を後述の細胞培養基板として使用する場合には、１０ｎｍ〜１０００ｎｍとすることが好ましく、１０ｎｍ〜５００ｎｍであることがより好ましい。
【００８９】
前記基材上に感光性組成物層を形成する工程は、必要に応じて、感光性組成物中の溶剤を除去する工程を含むことができる。前記溶剤を除去する工程としては、前記溶剤に応じて適宜その条件を選択することができ、常温乾燥であっても、加熱乾燥であってもよい。例えば、３０〜１５０℃で１分〜１０時間とすることができ、好ましくは３５〜１２０℃で３分〜１時間である。
【００９０】
前記硬化工程における露光処理は、前記感光性組成物層を全面露光する工程であっても、所望のパターン様に部分露光する工程であってもよい。本発明においては、所望のパターン様に部分露光する工程であることが好ましく、前記部分露光する工程後に更に現像工程を含むことがより好ましい。これにより、前記架橋体からなる親水性領域と架橋体が形成されていない疎水性領域とが、パターン様に基材上に形成された基板を作製することができる。
【００９１】
前記所望のパターン様に部分露光する工程は、所望のパターン様に光透過性を有するマスク（フォトマスク）を介して、部分露光する工程であることが好ましい。また、前記マスクを感光性組成物層に密着させて部分露光を行うことにより、より高精度でパターン様に露光することができる。
【００９２】
露光に用いる光源としては、前記感光性組成物層を硬化可能な光源であれば特に制限はない。光源として例えば、Ｘ線、電子線、エキシマレーザー、キセノンランプ、メタルハライドランプ、低圧水銀ランプ及び高圧水銀ランプ等を挙げることができる。中でも低圧又は高圧水銀ランプを好適に用いることができ、１０〜２０００Ｗの高圧水銀ランプであることが好ましい。
また露光波長及び露光量についても特に制限はなく、前記感光性組成物に応じて適宜選択することができる。露光波長としては、例えば２００〜４００ｎｍとすることができ、２８０〜４００ｎｍであることが好ましい。露光量としては、例えば、０．１〜１０００ｍＪ／ｃｍ２とすることができ、１〜２００ｍＪ／ｃｍ２であることが好ましく、１０〜２０ｍＪ／ｃｍ２であることがより好ましい。
【００９３】
前記現像工程は、前記感光性組成物層における未露光領域を基材上から除去できる方法であれば特に制限はなく、例えば、溶剤を用いた洗浄、及び溶剤への浸漬等を挙げることができ、本発明においては、溶剤として水を用いる洗浄及び水への浸漬であることが好ましい。
【００９４】
本発明における基板は、例えば、架橋体からなる親水性領域と、基材が露出した疎水性領域とが区画化（パターニング）されて基材上に形成された基板として作製することにより、細胞培養基板として好適に用いることができる。すなわち、前記疎水性領域にのみ細胞が配置され、前記親水性領域には細胞が接着しないことにより、所望のパターン様に細胞が配置可能な細胞培養基板とすることができる。
【００９５】
本発明における基板を胚性幹細胞の培養用基板として用いる方法としては、通常の胚性幹細胞の培養方法を制限なく適用することができる。例えば、本発明の基板上に細胞培養培地を配置し、前記細胞培養培地へ所望の胚性幹細胞を播種した後、所望の胚性幹細胞に応じて選択される培養条件を適用することで、基板上の疎水性領域に所望の胚性幹細胞を選択的に配置することができる。
【００９６】
本発明における親水性領域及び疎水性領域の形状には特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、疎水性領域を円状、三角形をはじめとする多角形状、楕円状、ストライプ状等に形成することができる。また親水性領域及び疎水性領域の大きさについても特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００９７】
本発明における基板を胚性幹細胞の培養基板として使用する場合、疎水性領域を円状に形成した場合の大きさとしては、直径として５〜１０００μｍとすることが好ましく、５０〜５００μｍとすることがより好ましい。また、隣接する疎水性領域を隔てる親水性領域の幅としては、５０〜５００μｍであることが好ましく、１００〜２００μｍであることがより好ましい。更に前記親水性領域における層の厚みとしては、１０ｎｍ〜１０００ｎｍであることが好ましく１０ｎｍ〜５００ｎｍであることがより好ましい。
本発明における親水性領域及び疎水性領域の形状及び大きさは、上述の硬化工程における露光処理を、マスクを介した露光処理とすることで、容易にかつ高い精度で制御することができる。
【００９８】
本発明における基板は、特に胚性幹細胞由来のスフェロイド形成用の細胞培養用基板として好適に用いることができる。本発明における基板は、前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体からなる親水性領域を有するため、高精度にパターニングされた疎水性領域を形成することができる。また、前記親水性領域は細胞非接着性の経時安定性が極めて良好であり、長期間にわたって良好な機能性を示すスフェロイドを維持することが可能となる。すなわち、スフェロイドを形成する各実質細胞に特異的な機能が維持されうる。例えば、肝細胞にあっては高レベルの肝細胞機能（例えば、高レベルのアルブミン産生能、薬物代謝活性）、膵β細胞にあってはインスリン分泌機能、心筋細胞にあっては拍動運動機能等が長期間にわたって維持される。
このようなスフェロイドが形成された基板は、例えば、各種細胞に影響を及ぼし得る環境又は物質のスクリーニングに用いることができる。各種細胞に対する影響は、スフェロイドの形態の変化や産生物（例えば、肝細胞におけるアルブミン、モデル薬物の代謝生成物等）の産生能の変化をモニターすることで評価することができる。
【００９９】
本発明における基板においては、前記親水性領域を、分岐ポリアルキレングリコール誘導体として、末端に重合性置換基を有する重合度が５〜１０００のポリアルキレングリコール基を４以上有する化合物を用いて形成することで、形成されたスフェロイドの経時安定性が顕著に向上する。
【０１００】
本発明における基板をスフェロイド形成用基板として使用する場合、疎水性領域を例えば、円状に形成した場合の大きさとしては、直径として５〜１０００μｍとすることができる。好ましくは５０〜５００μｍであり、より好ましくは１００〜３００μｍである。また、隣接する疎水性領域を隔てる親水性領域の幅としては、５０〜５００μｍであることが好ましく、１００〜２００μｍであることがより好ましい。また親水性領域における層の厚みとしては１０ｎｍ〜１０００ｎｍであることが好ましく１０ｎｍ〜５００ｎｍがより好ましい。
親水性領域と疎水性領域とを前記大きさで構成することにより、機能性の高いスフェロイドをより効率的に作成することができ、更により長期に渡って維持することが可能となる。
【０１０１】
本発明における基板をスフェロイド形成用基板として用いる場合、必要に応じて前記疎水性領域に予めフィーダー細胞を配置することができる。すなわち本発明においては、本発明の基板上の疎水性領域にフィーダー細胞層を形成し、形成されたフィーダー細胞層上で、胚性幹細胞を培養することができる。
予めフィーダー細胞層を形成することで、胚性幹細胞由来のスフェロイド形成がより効率的に進行し、スフェロイドの安定性が向上する。前記フィーダー細胞としては、例えば、ＣＯＳ−１細胞、血管内皮細胞（例えば、大日本製薬製「ヒト臍帯静脈血管内皮細胞」）、繊維芽細胞等を挙げることができる。
【実施例】
【０１０２】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。尚、特に断りのない限り「％」は質量基準であり、平均分子量は重量平均分子量である。
【０１０３】
まず、本発明に用いられる分岐ポリアルキレングリコール誘導体、および該ポリアルキレングリコールを含む感光性組成物を用いて作製された基板について具体的に説明する。
（参考例１）
〜分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＡ２０Ｋ）の合成〜
４−アジド−安息香酸１２ｇ（９３．６ｍｍｏｌ）を４０ｍＬの塩化チオニルに溶解し、１．５時間、加熱還流した。反応混合物を減圧で濃縮、少量のヘキサンを加えて再度減圧で濃縮した後、真空下で乾燥し、白色固体として目的物の４−アジド−安息香酸クロリド９．３ｇ（５１．２ｍｍｏｌ、収率７０％）を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.11-8.15 (2H, ｍ), 7.11-7.16 (2H, m).
【０１０４】
次に、３ｍＬのジクロロメタン（脱水）に、トリエチルアミン８１ｍｇ（０．８ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン１４７ｍｇ（１．２ｍｏｌ）を加え、氷浴で冷却しながら攪拌した。この溶液に、上記で得られた４−アジド−安息香酸クロリド３６３ｍｇ（２．０ｍｍｏｌ、マルチアームＰＥＧの末端ＯＨ基に対して５モル当量）のジクロロメタン（脱水）溶液（５ｍＬ）を滴下し、そのまま５分攪拌を続けた後、反応容器を遮光し、マルチアームＰＥＧ（日油（株）製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標） ＰＴＥ−２００００、４つのポリエチレングリコール基を有するペンタエリスリトール誘導体）２ｇ（０．１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（脱水）溶液（２０ｍＬ）をゆっくり滴下した。反応溶液を氷浴からはずし、そのまま室温で１８時間攪拌した。反応混合物を減圧で濃縮し、ベンゼンを加えて懸濁させたものをろ過して塩を除いた後、再び減圧で濃縮した。粗生成物を少量のベンゼンに溶解し、０℃に冷却したイソプロピルエーテルに滴下して得られた沈殿を濾取する工程を３回繰り返して、得られた白色固体を減圧下で乾燥し、目的物とする分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＡ２０Ｋ）１．７４ｇ（収率８５％）を得た。
１Ｈ-ＮＭＲの積分比より算出した末端水酸基の重合性置換基への置換率は、８５％であった。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2145H, m).
【０１０５】
マルチアームＰＥＧとしてＰＴＥ−２００００の代わりに下記表１に示したマルチアームＰＥＧを用いた以外は、参考例１と同様にして分岐ポリアルキレングリコール誘導体を合成した。収率、性状等を表１に示した。
【０１０６】
【表１】
【０１０７】
（参考例２）
５−アミノ−サリチル酸１５．３ｇ（０．１ｍｏｌ）を蒸留水８０ｍＬと濃塩酸２０ｍＬの混合溶液に懸濁させ、室温で３０分攪拌した。混合溶液を氷浴中で冷却した後、亜硝酸ナトリウム６．９ｇ（０．１ｍｏｌ）の水溶液１０ｍＬを溶液の反応液の液温が５℃を超えないような速度で滴下し、そのまま１時間攪拌した。続いて、アジ化ナトリウム７．１５ ｇ（０．１１ｍｏｌ）の水溶液３０ｍＬを反応液の液温が１０℃を超えない速度で滴下した。氷浴を外して室温に戻しつつ、気泡が発生しなくなるまで激しく攪拌した。生成した沈殿を濾取し、さらに沈殿を蒸留水で洗浄した。得られた固体は、暗所で風乾した後、減圧下で完全に乾燥し、５−アジド−サリチル酸を白色固体として１２．０ｇ（６７．０ｍｍｏｌ、収率＝６７％）得た。
1H-NMR(DMSO-d6) δ: 11.14(1H, bs), 7.41 (1H, d, J = 3.0 Hz), 6.88 (1H, dd, J = 8.5, 3.0 Hz), 6.68 (1H, d, J = 8.4 Hz).
【０１０８】
得られた５−アジド−サリチル酸５ｇ（２７．９ｍｍｏｌ）を塩化チオニル５０ｍＬに懸濁し、７０℃で１時間攪拌した。反応混合物を室温まで放冷し、過剰の塩化チオニルを減圧で除き、５−アジド−サリチル酸クロリドの赤色固体を定量的に得た。
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 7.39 (1H, d, J = 2.9 Hz), 7.26 (1H, dd, J = 8.8, 2.9 Hz), 7.00 (1H, d, J = 8.8 Hz).
【０１０９】
次に、３ｍＬのジクロロメタン（脱水）に、トリエチルアミン８１ｍｇ（０．８ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン１４７ｍｇ（１．２ｍｏｌ）を加え、氷浴で冷却しながら攪拌した。この溶液に、上記で得られた５−アジド−サリチル酸クロリド３５８ｍｇ（２ｍｍｏｌ、マルチアームＰＥＧの末端ＯＨ基に対して５モル当量）のジクロロメタン（脱水）溶液（５ｍＬ）を滴下し、そのまま５分攪拌を続けた後、反応容器を遮光し、マルチアームＰＥＧ（日油（株）製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標） ＰＴＥ−２００００、４つのポリエチレングリコール基を有する化合物）２ｇ（０．１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（脱水）溶液（２０ｍＬ）をゆっくり滴下した。反応溶液を氷浴からはずし、そのまま室温で１８時間攪拌した。反応混合物を減圧で濃縮し、ベンゼンを加えて懸濁させたものをろ過して塩を除いた後、再び減圧で濃縮した。粗生成物を少量のベンゼンに溶解し、０℃に冷却したイソプロピルエーテルに滴下して得られた沈殿を濾取する工程を３回繰り返して、得られた白色固体を減圧下で乾燥し、目的物とする分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＢ２０Ｋ）１．７７ｇ（収率８５％）を得た。
１Ｈ-ＮＭＲの積分比より算出した末端水酸基の重合性置換基への置換率は、８５％であった。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2145H, m).
【０１１０】
（参考例３）
参考例２において、マルチアームＰＥＧとしてＰＴＥ−２００００の代わりにＨＧＥＯ−２００００（日油（株）製、８つのポリエチレングリコール基を有するヘキサグリセリン誘導体）を用いた以外は実施例４と同様にして、目的物とする分岐ポリアルキレングリコール誘導体（８ＰＢ２０Ｋ）１．７２ｇ（収率８５％）を得た。
１Ｈ-ＮＭＲの積分比より算出した末端水酸基の重合性置換基への置換率は、８５％であった。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2145H, m).
【０１１１】
（参考例４）
５−アミノ−２−ニトロ安息香酸１８．１ｇ（０．１ｍｏｌ）を蒸留水８０ｍＬと濃塩酸２０ｍＬの混合溶液に懸濁させ、室温で３０分攪拌した。混合溶液を氷浴中で冷却した後、亜硝酸ナトリウム６．９ｇ（０．１ｍｏｌ）の水溶液１０ｍＬを溶液の反応液の液温が５℃を超えないような速度で滴下し、そのまま１時間攪拌した。続いて、アジ化ナトリウム７．１５ ｇ（０．１１ｍｏｌ）の水溶液３０ｍＬを反応液の液温が１０℃を超えない速度で滴下した。氷浴を外して室温に戻しつつ、気泡が発生しなくなるまで激しく攪拌した。生成した沈殿を濾取し、さらに沈殿を蒸留水で洗浄した。得られた固体は、暗所で風乾した後、減圧下で完全に乾燥し、５−アジド−２−ニトロ安息香酸を白色固体として１９．２ｇ（９２．４ｍｍｏｌ、収率＝９２％）を得た。
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 13.99(1H, bs), 8.09-8.06 (1H, m), 7.45-7.42 (2H, m).
【０１１２】
得られた５−アジド−２−ニトロ安息香酸１．０ｇ（４．８ｍｍｏｌ）を塩化チオニル１０ｍＬに懸濁し、７０℃で１時間攪拌した。反応混合物を室温まで放冷し、過剰の塩化チオニルを減圧で除き、５−アジド−サリチル酸クロリドの赤色固体を定量的に得た。
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 8.10-8.07 (1H, m), 7.46-7.42 (2H, m).
【０１１３】
次に、３ｍＬのジクロロメタン（脱水）に、トリエチルアミン８１ｍｇ（０．８ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン１４７ｍｇ（１．２ｍｏｌ）を加え、氷浴で冷却しながら攪拌した。この溶液に、上記で得られた５−アジド−２−ニトロ安息香酸クロリド４１７ｍｇ（２ｍｍｏｌ、マルチアームＰＥＧの末端ＯＨ基に対して５モル当量）のジクロロメタン（脱水）溶液（５ｍＬ）を滴下し、そのまま５分攪拌を続けた後、反応容器を遮光し、マルチアームＰＥＧ（日油（株）製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標） ＰＴＥ−２００００、４つのポリエチレングリコール基を有する化合物）２ｇ（０．１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（脱水）溶液（２０ｍＬ）をゆっくり滴下した。反応溶液を氷浴からはずし、そのまま室温で１８時間攪拌した。反応混合物を減圧で濃縮し、ベンゼンを加えて懸濁させたものをろ過して塩を除いた後、再び減圧で濃縮した。粗生成物を少量のベンゼンに溶解し、０℃に冷却したイソプロピルエーテルに滴下して得られた沈殿を濾取する工程を３回繰り返して、得られた白色固体を減圧下で乾燥し、目的物とする分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＣ２０Ｋ）１．８１（収率８５％）を得た。
１Ｈ-ＮＭＲの積分比より算出した末端水酸基の重合性置換基への置換率は、８５％であった。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2145H, m).
【０１１４】
（参考例５）
参考例４において、マルチアームＰＥＧとしてＰＴＥ−２００００の代わりにＨＧＥＯ−２００００（日油（株）製、８つのポリエチレングリコール基を有するヘキサグリセリン誘導体）を用いた以外は参考例４と同様にして、目的物とする分岐ポリアルキレングリコール誘導体（８ＰＣ２０Ｋ）１．７１ｇ（収率８５％）を得た。
１Ｈ-ＮＭＲの積分比より算出した末端水酸基の重合性置換基への置換率は、８５％であった。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2145H, m).
【０１１５】
（参考例６）
アクリロイルクロリド１８１ｍｇ（２．０ｍｍｏｌ、マルチアームＰＥＧの末端ＯＨ基に対して５モル当量）のベンゼン（脱水）溶液（５ｍＬ）を滴下し、そのまま５分攪拌を続けた後、反応容器を遮光し、マルチアームＰＥＧ（日油（株）製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標） ＰＴＥ−２００００、４つのポリエチレングリコール基を有するペンタエリスリトール誘導体）２ｇ（０．１ｍｍｏｌ）のベンゼン（脱水）溶液（２０ｍＬ）をゆっくり滴下した。反応溶液を氷浴からはずし、そのまま室温で１８時間攪拌した。反応混合物を減圧で濃縮し、ベンゼンを加えて懸濁させたものをろ過して塩を除いた後、再び減圧で濃縮した。粗生成物を少量のベンゼンに溶解し、０℃に冷却したイソプロピルエーテルに滴下して得られた沈殿を濾取する工程を３回繰り返して、得られた白色固体を減圧下で乾燥し、目的物とする分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＤ２０Ｋ）１．７４ｇ（収率８５％）を得た。
１Ｈ-ＮＭＲの積分比より算出した末端水酸基の重合性置換基への置換率は、８５％であった。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2145H, m).
【０１１６】
（参考例７）
参考例６において、マルチアームＰＥＧとしてＰＴＥ−２００００の代わりに、ＨＧＥＯ−２００００（日油（株）製、８つのポリエチレングリコール基を有するヘキサグリセリン誘導体）を用いた以外は、参考例６と同様にして、目的物とする分岐ポリアルキレングリコール誘導体（８ＰＤ２０Ｋ）１．７４ｇ（収率８５％）を得た。
１Ｈ-ＮＭＲの積分比より算出した末端水酸基の重合性置換基への置換率は、８５％であった。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2145H, m).
【０１１７】
（参考例８）
〜基板の作製〜
以下の作業は、すべてイエロールーム内で行った。
参考例１で作製した分岐ポリアルキレングリコール誘導体（マルチアームＰＥＧ−アジド：４ＰＡ２０Ｋ）をトルエンに溶解し、感光性組成物Ａとして４ＰＡ２０Ｋのトルエン溶液（１％）を調製した。基材としてポリ−Ｌ−リジンコートスライドガラス（松浪硝子工業（株）製。白切放ＮＯ．１スライドガラス丸型２１ｍｍΦ。以下「ＰＬＬコートガラス」と略す）を使用し、ＰＬＬコートガラス上に、感光性組成物Ａを１１０μＬ滴下後、スピンコート法（５００ｒｐｍ×５秒＋３０００ｒｐｍ×２０秒＋６０００ｒｐｍ×１秒）により成膜し、常温で放置して乾燥させた。これに、石英ガラス製フォトマスク（直径２００μｍの円形パターンが多数配置されたもの）を密着させ、高圧水銀灯（２００Ｗ）を用いて４０秒間露光を行った後、脱イオン水で洗浄（現像工程：流水１５秒間＋浸漬２０分間）した。常温で乾燥し、表面に微細加工された親水性の架橋体を有する基板を得た。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡（倍率×１００）により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
【０１１８】
（参考例９）
参考例８において、基材としてＰＬＬコートガラスに代えて、アミノプロピルシランコートガラス（松浪硝子工業（株）製。ＡＰＳコートＮＯ．１カバーガラス丸型２１ｍｍΦ。以下「ＡＰＳコートガラス」と略す）を用いた以外は、参考例８と同様にして基板を作製し、表面に微細加工された親水性の架橋体を有する基板を得た。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
【０１１９】
（参考例１０）
参考例８において、基材としてＰＬＬコートガラスに代えて、ＭＡＳコートガラス（松浪硝子工業（株）製）を用いた以外は、参考例８と同様にして基板を作製し、表面に微細加工された親水性の架橋体を有する基板を得た。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
【０１２０】
（参考例１１）
参考例８において、基材としてＰＬＬコートガラスに代えて、ＰＬＬコート上にコラーゲンをさらにコーティングした「コラーゲンコートガラス」を用いた以外は、参考例８と同様にして基板を作製し、表面に微細加工された親水性の架橋体を有する基板を得た。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡（倍率×１００）により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
尚、コラーゲンコートガラスは、ＰＬＬコートガラス上にブタＩ型コラーゲン（日本ハム（株）製）の０．１％水溶液を４００μＬ滴下し、スピンコート法（３５０ｒｐｍ×５秒＋５００ｒｐｍ×５秒＋１０００ｒｐｍ×１０秒＋１５００ｒｐｍ×１０秒＋６０００ｒｐｍ×１秒）にて成膜した後、室温で乾燥する工程を２回繰り返して作製した。
【０１２１】
（参考例１２）
参考例８において、基材としてＰＬＬコートガラスに代えて、ＰＬＬコート上にゼラチンをさらにコーティングした「ゼラチンコートガラス」を用いた以外は、参考例８と同様にして基板を作製し、表面に微細加工された親水性の架橋体を有する基板を得た。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
尚、ゼラチンコートガラスは、ＰＬＬコートガラスを用い、ゼラチン（新田ゼラチン社製）の０．１％溶液を４００μＬ滴下し、スピンコート法（３５０ｒｐｍ×５秒＋５００ｒｐｍ×５秒＋１０００ｒｐｍ×１０秒＋１５００ｒｐｍ×１０秒＋６０００ｒｐｍ×１秒）にて成膜した後、室温で乾燥して作製した。
【０１２２】
（参考例１３）
参考例１１において、コラーゲンコートガラスの作製方法を、ＰＬＬコートガラスをブタＩ型コラーゲン（日本ハム（株）製）の０．０２％水溶液に３時間浸漬後、脱イオン水の流水で洗浄、乾燥させる方法に変更した以外は、参考例１１と同様の方法で基板を作製した。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
【０１２３】
（参考例１４）
参考例８において、感光性組成物Ａに代えて、マルチアームＰＥＧ−アジド（４ＰＡ２０Ｋ）の濃度を０．５％とした感光性組成物Ｂを用いた以外は、参考例８と同様の方法で基板を作製した。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
【０１２４】
（参考例１５）
参考例８において、分岐ポリアルキレングリコール誘導体として４ＰＡ２０Ｋに代えて、参考例２〜５で合成した各種の分岐ポリアルキレングリコール誘導体をそれぞれ用いた以外は参考例８と同様の方法で基板を作製した。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
【０１２５】
（実施例１６）
参考例８において、分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＡ２０Ｋ）に代えて、参考例４で合成した分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＣ２０Ｋ）を用い、露光条件として高圧水銀灯（２００Ｗ）で３秒間とした以外は、参考例８と同様の方法で基板を作製した。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡（倍率×１００）により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
【０１２６】
（参考例１７）
参考例８において、分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＡ２０Ｋ）に代えて、参考例４で合成した分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＣ２０Ｋ）を用い、露光条件をフォトマスク上にフィルター（シグマ光機（株）製、ＵＴＶＡＦ３６Ｕ）を配置して、高圧水銀灯（２００Ｗ）で１０秒間の露光とした以外は、実施例１０と同様の方法で基板を作製した。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡（倍率×１００）により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
【０１２７】
（参考例１８）
参考例９〜１３において、分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＡ２０Ｋ）に代えて、参考例２で合成した分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＢ２０Ｋ）又は参考例４で合成した分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＣ２０Ｋ）を用い、露光条件をフォトマスク上にフィルター（シグマ光機（株）製、ＵＴＶＡＦ３６Ｕ）を配置して、高圧水銀灯（２００Ｗ）で１０秒間の露光とした以外は、参考例９〜１３とそれぞれ同様の方法で基板を作製した。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
【０１２８】
（参考例１９）
参考例６及び参考例７で作製した分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＤ２０Ｋ、８ＰＤ２０Ｋ）の濃度が１％であって、光重合開始剤としてＩＲＧＡＣＵＲＥ２９５９の濃度が０．０５％となるようにトルエンに溶解して、感光性組成物Ｄを調製した。基材としてポリ−Ｌ−リジンコートスライドガラス（松浪硝子工業（株）製。白切放ＮＯ．１スライドガラス丸型２１ｍｍΦ。以下「ＰＬＬコートガラス」と略す）を使用し、ＰＬＬコートガラス上に、感光性組成物Ｄを１１０μＬ滴下後、スピンコート法（５００ｒｐｍ×５秒＋３０００ｒｐｍ×２０秒＋６０００ｒｐｍ×１秒）により成膜し、常温で放置して乾燥させた。これに、石英ガラス製フォトマスク（直径１００μｍの円形パターンが多数配置されたもの）を密着させ、高圧水銀灯（２００Ｗ）を用いて４０秒間露光を行った後、脱イオン水で洗浄（現像工程：流水１５秒間＋浸漬２０分間）した。常温で乾燥し、表面に微細加工された親水性の架橋体を有する基板を得た。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡（倍率×１００）により観察したところ、いずれの分岐ポリアルキレングリコール誘導体を用いた場合にも、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
【０１２９】
（実施例１）
〜胚性幹細胞の調製〜
Ｉ型コラーゲンαプロモーターで発現制御されたＧＦＰ遺伝子を組み換えたトランスジェニックマウス由来の胚性幹細胞（ＣＯＬ１−ＧＦＰ）を、ＦＡＳＥＢ Ｊ．，２１，１７７７-１７８７(２００７)に記載された方法に従って作製し、下記ＬＩＦ（＋）培地を用いて継代培養を行った。
ＬＩＦ（＋）培地：ＤＭＥＭ（シグマ・アルドリッチ社製）５００ｍＬ、ＦＢＳ ７５ｍＬ、ＡＢ ５ｍＬ、ＧｌｕｔａＭＡＸ ５ｍＬ、非必須アミノ酸溶液 ５ｍＬ、α−ＬＩＦ ５０μＬ、２−メルカプトエタノール ３．８μＬ。
また、同様にしてＩＩ型コラーゲンプロモーターで発現制御されたＧＦＰ遺伝子を組み換えたＷＴマウス由来の胚性幹細胞（ＣＯＬ２−ＧＦＰ）を作製し、同様にＬＩＦ（＋）培地を用いて継代培養を行った。
【０１３０】
〜スフェロイド形成〜
ＬＩＦ（＋）培地で継代培養してきた胚性幹細胞（ＣＯＬ１−ＧＦＰ）をトリプシン（１Ｘ）処理し、遠心分離後、ＬＩＦ（＋）培地に細胞を分散させた。
参考例８において作製した後、滅菌作業を行った基板を、ＦＡＬＣＯＮ社製１２ウェルプレート底面にセットし、培地としてＬＩＦ（＋）培地を添加し、ＬＩＦ（＋）培地に分散させた胚性幹細胞（ＣＯＬ１−ＧＦＰ）を細胞濃度１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬで播種した。次いで培地を下記ＬＩＦ（−）ＡＴＲＡ（＋）培地に交換し、培養条件５％ＣＯ２、３７℃で６日間培養した。
ＬＩＦ（−）ＡＴＲＡ（＋）培地：上記ＬＩＦ（＋）培地において、α−ＬＩＦ ５０μＬの代わりに、レチノイン酸（ＡＴＲＡ） ５０μＬを添加した。
【０１３１】
１日以内に基材上に形成した疎水性領域に対応してアレイ状に並んだ、均一な大きさを有する多数の胚性幹細胞由来のスフェロイド（細胞凝集塊）が得られた。培養開始１日後の顕微鏡写真（倍率×４００）を図１に、６日後の顕微鏡写真（倍率×４００）を図２に示した。
【０１３２】
（実施例２）
実施例１において、基板として直径２００μｍの円形パターンの代わりに、直径１００μｍおよび５００μｍの円形パターンの疎水性領域がそれぞれ形成された基板を用いた以外は実施例１と同様にして、胚性幹細胞（ＣＯＬ１−ＧＦＰ）を培養した。
直径１００μｍの円形パターンを形成した基板を用いた場合には、実施例１と同様に均一な大きさを有し、アレイ状に配置された胚性幹細胞由来のスフェロイドが得られた。また、５００μｍの円形パターンを用いた場合には、基板中央部分の疎水性領域では胚性幹細胞由来のスフェロイドが形成されていた。
【０１３３】
（実施例３）
実施例１において、参考例８で作製した基板の代わりに、参考例９〜１９で作製した基板を用いた以外は実施例１と同様にして、胚性幹細胞（ＣＯＬ１−ＧＦＰ）を培養した。
いずれの基板を用いた場合でも、実施例１と同様に、均一な大きさを有しアレイ状に配置された多数の胚性幹細胞由来のスフェロイドが得られた。
【０１３４】
（比較例１）
実施例１において、参考例８で作製した基板の代わりにペトリディッシュを用いた以外は実施例１と同様にして、胚性幹細胞（ＣＯＬ１−ＧＦＰ）を培養した。
形成された肺様体（ＥＢ）の培養６日後の顕微鏡写真（倍率×４００）を図３に示した。
【０１３５】
（実施例４）
ＬＩＦ(+)培地で継代培養した胚性幹細胞（ＣＯＬ１−ＧＦＰ）を参考例１で作製した基板に播種した。培地は基板に播種時にＬＩＦ(-)ＡＴＲＡ(+)に交換した。基板に播種する直前の細胞を０ｄａｙとし、播種後１日後および６日後にそれぞれ培養細胞を回収し、常法によりアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を測定した。
培養細胞はすべてトリプシン処理により回収し、ＰＢＳ(-)洗浄後（このとき細胞数をカウント）、１％ＳＤＳを加えて５分静置し、これをサンプルとした。９６ｗｅｌｌプレート中に基質溶液１００μＬをあらかじめ加えておき、ここにサンプル溶液を２０μＬ加えた。この時点から３７℃で、１５分間インキュベートし、反応停止液を８０μＬ加えて反応を停止した。この後、４０５ｎｍにおける吸光度をプレートリーダーにより測定し、あらかじめ作成しておいた検量線よりｐ−ニトロフェノール濃度を算出し、ＡＬＰ活性を求めた。結果を図４に示した。
【０１３６】
図４から、本発明にかかる基板上で胚性幹細胞を培養することにより、経時的にＡＬＰ活性が低下することがわかる。
【０１３７】
（実施例５）
〜ＲＴ−ＰＣＲによるマーカー遺伝子発現量評価〜
ＬＩＦ(+)培地で継代培養した胚性幹細胞（ＣＯＬ１−ＧＦＰ）を参考例１で作製した基板に播種した。培地は基板に播種時にＬＩＦ(-)ＡＴＲＡ(+)培地に交換した。基板に播種する直前の細胞を０ｄａｙとし、播種後１日後、５日後および７日後にそれぞれ培養細胞を回収した。ＲＴ−ＰＣＲを用いた常法により、未分化性マーカーＯｃｔ４、外胚葉系マーカーＮＣＡＭ、中胚葉系マーカーＦｌｋ−１、および内胚葉系マーカーＡＦＰの発現量を、以下のプロトコールに従って、それぞれ評価した。結果を図５〜図８に示した。
【０１３８】
ＲＮＡ抽出：基板上の培地を取り除き、ＰＢＳ(-)で２回洗浄した後、ＴＲＩｚｏｌを５００μＬ添加し、５分間室温にて静置した。よくピペッティングした後、エッペンチューブに移し、−８０℃にて保存した。
ＲＮＡ精製：ＴＲＩｚｏｌ ５００μＬに対し、クロロホルム １００μＬを添加し、手でよく攪拌後、１２０００ｒｐｍ、５分間、４℃で遠心分離を行った。ついで、ＩＰＡ ４００μＬの入った別のエッペンチューブに遠心分離後の上清から２００μＬを添加し、転倒混和を行い、１５０００ｒｐｍ、１０分間、４℃で遠心分離を行った。デカンテーションにより上清を取り除き、さらにキムワイプの上に伏せておき、完全に上清を除去した。７５％ＥｔＯＨ ５００μＬを添加し、ＶＯＲＴＥＸにより攪拌後、１５０００ｒｐｍ、５分間、４℃で遠心分離を行った。再びデカンテーションにより上清を取り除き、さらにエッペンで上清を完全に除去し、ＲＮＡ Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒを２０μＬ加えて溶解した。
ＲＴ：Ｔａｋａｒａ ＥｘＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔを用い、添付のプロトコルに従って操作を行った。
ＰＣＲ：設定条件は以下のとおりである。９４℃、５ｍｉｎ；９４℃、３０ｓｅｃ；５８℃、３０ｓｅｃ；７２℃、３０ｓｅｃ；７２℃、７ｍｉｎ；４℃、∞；Ｃｙｃｌｅ数 ３５。
【０１３９】
図５〜図８より、胚性幹細胞の経時培養により、Ｏｃｔ４の発現量が減少し、三胚葉系のマーカーの発現量が増加していることわかる。更に内胚葉系マーカーの発現量が突出して増加していることがわかる。
【０１４０】
（実施例６）
〜高分子ミセルを用いた分化誘導〜
非ウイルス系遺伝子ベクターとして、特開２００４−３５２９７２号公報に記載されたポリエチレングリコール−ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）−Ａｃ共重合体のジエチレントリアミン付加体（以下「ＰＥＧ−ＤＥＴ」という）を用いて、Ｒｕｎｘ２およびｃａＡＬＫ６遺伝子を内包する高分子ミセルを調製した。
尚、Ｒｕｎｘ２およびｃａＡＬＫ６遺伝子は、ＦＡＳＥＢ Ｊ．，２１，１７７７−１７８７（２００７）に記載の方法に準じて調製した。また、これらの遺伝子はヒト皮膚繊維芽細胞に対する軟骨分化誘導能を有することが知られている。
また高分子ミセルの調製、培養細胞への添加条件は、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１５(９)，１６５５-１６６２(２００７)に記載の方法に準じて行った。
【０１４１】
実施例１と同様にして胚性幹細胞由来のスフェロイドがアレイ状に配置された基板（スフェロイドアレイ）を作製し、これにＲｕｎｘ２およびｃａＡＬＫ６遺伝子を内包する高分子ミセルを添加して、５％ＣＯ２、３７℃で５日間培養したところ、ＧＦＰ由来の蛍光を観察することができた。
【０１４２】
（実施例７）
〜高分子ミセルを用いた分化誘導〜
非ウイルス系遺伝子ベクターとして、特開２００４−３５２９７２号公報に記載されたポリエチレングリコール−ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）−Ａｃ共重合体のジエチレントリアミン付加体（以下「ＰＥＧ−ＤＥＴ」という）を用いて、Ｓｏｘ５、Ｓｏｘ６、およびＳｏｘ９遺伝子を内包する高分子ミセルを調製した。
尚、Ｓｏｘ５、Ｓｏｘ６、およびＳｏｘ９遺伝子は、特開２００４−２６７０５２号公報に記載の方法に準じて調製した。また、これらの遺伝子はヒト皮膚繊維芽細胞に対する軟骨分化誘導能を有することが知られている。
また高分子ミセルの調製、培養細胞への添加条件は、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１５(９)，１６５５-１６６２(２００７)に記載の方法に準じて行った。
【０１４３】
実施例１において、胚性幹細胞（ＣＯＬ１−ＧＦＰ）の代わりに胚性幹細胞（ＣＯＬ２−ＧＦＰ）を用いた以外は、実施例１と同様にして胚性幹細胞由来のスフェロイドがアレイ状に配置された基板（スフェロイドアレイ）を作製した。
これにＳｏｘ５、Ｓｏｘ６、およびＳｏｘ９遺伝子を内包する高分子ミセルを添加して、５％ＣＯ２、３７℃で５日間培養したところ、ＧＦＰ由来の蛍光を観察することができた。
【０１４４】
（実施例８）
〜低分子化合物による分化誘導〜
実施例１において、胚性幹細胞（ＣＯＬ１−ＧＦＰ）の代わりに胚性幹細胞（ＣＯＬ２−ＧＦＰ）を用いた以外は、実施例１と同様にして胚性幹細胞由来のスフェロイドがアレイ状に配置された基板（スフェロイドアレイ）を作製した。
これに、低分子化合物ＴＨ（Biochem. Biophys. Res. Com., 357(4), 854-860 (2007)参照）を添加して、５％ＣＯ２、３７℃で５日間培養したところ、ＧＦＰ由来の蛍光を観察することができた。
【０１４５】
上記の結果から、本発明における基板上で胚性幹細胞を培養することにより、均一な大きさを有する胚性幹細胞由来のスフェロイドを大量に製造することができた。
また、本発明における基板上にアレイ状に配置された疎水性領域を形成することにより、疎水性領域に胚性幹細胞由来のスフェロイドが形成されたスフェロイドアレイが得られた。
さらに本発明のスフェロイドアレイを用いることで、薬物スクリーニングおよび胚性幹細胞の分化誘導が可能であった。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】培養１日後の胚性幹細胞の拡大写真である。
【図２】培養６日後の胚性幹細胞の拡大写真である。
【図３】培養６日後の胚様体の拡大写真である。
【図４】ＡＬＰ活性の変化を示す図である。
【図５】Ｏｃｔ４遺伝子の発現量変化を示す図である。
【図６】ＮＣＡＭ遺伝子の発現量変化を示す図である。
【図７】Ｆｌｋ−１遺伝子の発現量変化を示す図である。
【図８】ＡＦＰ遺伝子の発現量変化を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材と、前記基材上に配置され、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の３以上と前記ポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基とを有する分岐ポリアルキレングリコール誘導体を含有する感光性組成物を硬化させて形成された複数の親水性領域および疎水性領域と、を含む基板上に、
胚性幹細胞を播種することと、
播種された胚性幹細胞を培養することと、
培養された胚性幹細胞由来のスフェロイドを形成させることと、
を含むスフェロイドの製造方法。
【請求項２】
前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体は、重合度が５〜１０００のポリアルキレングリコール基を４以上有する、請求項１に記載のスフェロイドの製造方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載のスフェロイドの製造方法で製造され、内胚葉系マーカーであるＡＦＰの発現量が、中胚葉系マーカーであるＦｌｋ−１及び外胚葉系マーカーであるＮＣＡＭの少なくとも一方の発現量よりも大きいスフェロイド。
【請求項４】
基材と、前記基材上に配置され、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の３以上と前記ポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基とを有する分岐ポリアルキレングリコール誘導体を含有する感光性組成物を硬化させて、アレイ状に形成された複数の親水性領域および疎水性領域と、を含む基板と、
前記疎水性領域に配置された胚性幹細胞由来の複数のスフェロイドと、
を含むスフェロイドアレイ。
【請求項５】
請求項４に記載のスフェロイドアレイを用いる薬物スクリーニング方法。
【請求項６】
高分子ミセルに内包された薬物を前記スフェロイドに接触させることを含む、請求項５に記載の薬物スクリーニング方法。
【請求項７】
基材と、前記基材上に配置され、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の３以上と前記ポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基とを有する分岐ポリアルキレングリコール誘導体を含有する感光性組成物を硬化させて形成された複数の親水性領域および疎水性領域と、を含む基板上に、
胚性幹細胞を播種することと、
分化誘導因子の存在下で胚性幹細胞を培養することと、
培養された胚性幹細胞から分化誘導された細胞を得ることと、
を含む胚性幹細胞の分化誘導方法。
【請求項８】
前記分化誘導因子を高分子ミセルに内包した状態で添加することを更に含む、請求項７に記載の胚性幹細胞の分化誘導方法。
【請求項１】
基材と、前記基材上に配置され、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の３以上と前記ポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基とを有する分岐ポリアルキレングリコール誘導体を含有する感光性組成物を硬化させて形成された複数の親水性領域および疎水性領域と、を含む基板上に、
胚性幹細胞を播種することと、
播種された胚性幹細胞を培養することと、
培養された胚性幹細胞由来のスフェロイドを形成させることと、
を含むスフェロイドの製造方法。
【請求項２】
前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体は、重合度が５〜１０００のポリアルキレングリコール基を４以上有する、請求項１に記載のスフェロイドの製造方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載のスフェロイドの製造方法で製造され、内胚葉系マーカーであるＡＦＰの発現量が、中胚葉系マーカーであるＦｌｋ−１及び外胚葉系マーカーであるＮＣＡＭの少なくとも一方の発現量よりも大きいスフェロイド。
【請求項４】
基材と、前記基材上に配置され、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の３以上と前記ポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基とを有する分岐ポリアルキレングリコール誘導体を含有する感光性組成物を硬化させて、アレイ状に形成された複数の親水性領域および疎水性領域と、を含む基板と、
前記疎水性領域に配置された胚性幹細胞由来の複数のスフェロイドと、
を含むスフェロイドアレイ。
【請求項５】
請求項４に記載のスフェロイドアレイを用いる薬物スクリーニング方法。
【請求項６】
高分子ミセルに内包された薬物を前記スフェロイドに接触させることを含む、請求項５に記載の薬物スクリーニング方法。
【請求項７】
基材と、前記基材上に配置され、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の３以上と前記ポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基とを有する分岐ポリアルキレングリコール誘導体を含有する感光性組成物を硬化させて形成された複数の親水性領域および疎水性領域と、を含む基板上に、
胚性幹細胞を播種することと、
分化誘導因子の存在下で胚性幹細胞を培養することと、
培養された胚性幹細胞から分化誘導された細胞を得ることと、
を含む胚性幹細胞の分化誘導方法。
【請求項８】
前記分化誘導因子を高分子ミセルに内包した状態で添加することを更に含む、請求項７に記載の胚性幹細胞の分化誘導方法。
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００９−２７８９６０（Ｐ２００９−２７８９６０Ａ）
【公開日】平成２１年１２月３日（２００９．１２．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１３７２２４（Ｐ２００８−１３７２２４）
【出願日】平成２０年５月２６日（２００８．５．２６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１９年１１月２６日 日本バイオマテリアル化学会発行の「第２９回日本バイオマテリアル学会大会講演予稿集」に発表
【出願人】（８０３０００１１５）学校法人東京理科大学 (545)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１２月３日（２００９．１２．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月２６日（２００８．５．２６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１９年１１月２６日 日本バイオマテリアル化学会発行の「第２９回日本バイオマテリアル学会大会講演予稿集」に発表
【出願人】（８０３０００１１５）学校法人東京理科大学 (545)
【Ｆターム（参考）】
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