スポット画像認識方法及びスポット画像認識システム
【課題】認識が正確に行なわれていないスポットを簡便に見つけ出すことができ、さらにそのようなスポットに対する画像認識の補正をユーザが行うことができ、また、認識が正確に行なわれていないスポットの補正を自動的に行なうことができるスポット画像認識方法及びスポット画像認識システムを提供する。
【解決手段】 スポット認識領域のサイズを変化させながら画素のシグナル強度を取得し、シグナル強度分布の中央値及び平均値からスポット認識パラメータを計算し、スポット認識領域のサイズの変化に従がって前記スポット認識パラメータが変化するパターンを用いて、スポット画像を認識する。
【解決手段】 スポット認識領域のサイズを変化させながら画素のシグナル強度を取得し、シグナル強度分布の中央値及び平均値からスポット認識パラメータを計算し、スポット認識領域のサイズの変化に従がって前記スポット認識パラメータが変化するパターンを用いて、スポット画像を認識する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロアレイを用いた分子生物学的実験などで得られるスポット画像において、個々のスポットを精確に認識するための画像認識方法及び画像認識システムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、分子生物学における実験手法の進歩により、ＤＮＡマイクロアレイ等の網羅的な遺伝子解析手法が生み出された。これらの実験結果はコンピュータを利用して解析されるため、蛍光シグナルなどの形で得られる実験結果をアナログデータからデジタルデータに変換する作業が行なわれる。例えば、実験後にＤＮＡマイクロアレイ上のスポットを撮像した画像を解析することにより、スポットのサイズや蛍光シグナル強度などのデータが取得される。
【０００３】
特許文献１には、蛍光シグナルが発生しうる領域を物理的な孔を利用するなどして固定し、該当領域内の外れ値をもつピクセルを除外することで、有効なデータのみを抽出することを特徴とするバイオチップ読み取り装置が記載されている。また、特許文献２には、反復実験結果の誤差推定値を平均して１つの試料における誤差を推定することにより、変換されたデジタルデータの信頼度・信頼限界を確定することを特徴とする化学的及び生物学的アッセイの評価方法が記載されている。
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−１０１３７６号公報。
【特許文献２】特表２００２−５１２３６７号公報。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
現在では、ＤＮＡマイクロアレイ技術の進歩により、かつては数千個程度であったものが、数万個以上という大量の遺伝子断片ＤＮＡを１枚のスライドガラス上に固定化することが可能となっている。画像解析処理能力にともない、各スポットの認識処理をある程度自動化することが可能となってきたが、人間が一切介在しないで完全自動で精確にスポットを認識できるレベルまでには至っていない。画像解析を行った後のデータは数値となってしまうため、正確なスポット認識が行なわれたか否かは判別が困難であるうえに、不正確なスポット認識のデータは解析対象データ内にノイズとして紛れ込み、解析結果に大きな影響を与えてしまう。また、スポット認識のための画像解析に時間がかかるため、同時に解析可能な遺伝子数が大幅に増加したといっても、ハイスループットな解析を行うことはできないという問題点があった。
【０００６】
特許文献２に記載の方法では、物理的な孔のなかにある蛍光強度データの中から外れ値となるピクセルデータを除去する、もしくは、反復実験によりデータ信頼性を高めるといったアプローチをとっているが、１つの試料を用いた１回の実験画像データにおいて不定サイズのスポットをより正確に認識し、数値データにする場合には、この技術を応用することはできない。
【０００７】
本発明は、このような実情に鑑みてなされたものであり、マイクロアレイなどのスポット画像を認識する方法及びシステムであって、認識が正確に行なわれていないスポットを簡便に見つけ出すことができ、さらにそのようなスポットに対する画像認識の補正をユーザが行うことができ、また、認識が正確に行なわれていないスポットの補正を自動的に行なうことができるスポット画像認識方法及びスポット画像認識システムを提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記解決課題に鑑みて鋭意研究の結果、本発明者は、スポット認識用のパラメータとして、スポット認識領域内の画素のシグナル強度分布の中央値及び平均値に着目し、これらの値の相関関係がスポット認識領域のサイズの変化に従って一定のパターンを有していることを発見し、これを利用してスポット認識領域の設定の適切さを判定することに想到した。
【０００９】
すなわち、本発明は、スポット画像を自動的に認識する方法であって、スポット認識領域をサイズを変化させながらスポット画像に適用して、スポット認識領域内の画素のシグナル強度分布を取得し、取得したシグナル強度分布の中央値及び平均値からスポット認識パラメータを計算し、スポット認識領域のサイズの変化に従って前記スポット認識パラメータが変化するパターンが、所定の上方閾値及び下方閾値との間で一定の関係を満たす場合には、前記スポット認識パラメータの変化パターンにおける所定位置に相当するスポット認識領域のサイズを最適サイズと判定し、前記最適サイズのスポット認識領域を適用してスポット画像を認識する方法を提供するものである。
【００１０】
本発明のスポット画像認識方法は、前記スポット認識領域の最適サイズの判定において、スポット認識領域のサイズを最小サイズから最大サイズまで一方向に増加させたときに、スポット認識パラメータの値が、スポット認識領域が最小サイズの時には上方閾値以下かつ下方閾値以上であり、その後上方閾値より大きくなり、その後上方閾値以下となり、その後下方閾値よりも小さくなる場合には、スポット認識パラメータの値が最初に上方閾値より大きくなる直前の位置に相当するスポット認識領域のサイズを最適サイズと判定することを特徴とする。
【００１１】
本発明のスポット画像認識方法は、前記スポット認識領域の最適サイズの判定において、スポット認識領域のサイズを最大サイズから最小サイズまで一方向に減少させたときに、スポット認識パラメータの値が、スポット認識領域が最大サイズの時には下方閾値よりも小さく、その後下方閾値以上となり、その後上方閾値より大きくなり、その後上方閾値以下となり、スポット認識領域が最小サイズの時には上方閾値以下かつ下方閾値以上である場合には、スポット認識パラメータの値が上方閾値より大きくなった後再度上方閾値以下となった直後の位置に相当するスポット認識領域のサイズを最適サイズと判定することを特徴とする。
【００１２】
本発明のスポット画像認識方法は、前記スポット認識パラメータは、スポット認識領域内の画素のシグナル強度分布の中央値及び平均値の差又は比であることを特徴とする。
【００１３】
本発明は、また、スポット認識領域のサイズ設定を補正する方法であって、設定されたスポット認識領域内の画素のシグナル強度分布の中央値及び平均値の差又は比が一定の閾値を超える場合には、上記したスポット画像認識方法を用いて得られる最適サイズにスポット認識領域を設定し直すことを特徴とする方法を提供するものである。
【００１４】
本発明は、また、上記したスポット画像認識方法をコンピュータシステムにおいて実行するためのプログラムを提供するものである。
【００１５】
本発明は、また、スポット画像を自動的に認識するシステムであって、スポット認識領域をサイズを変化させながらスポット画像に適用して、スポット認識領域内の画素のシグナル強度分布を取得する手段と、取得したシグナル強度分布の中央値及び平均値からスポット認識パラメータを計算する手段と、スポット認識領域のサイズの変化に従って前記スポット認識パラメータが変化するパターンが、所定の上方閾値及び下方閾値との間で一定の関係を満たす場合には、前記スポット認識パラメータの変化パターンにおける所定位置に相当するスポット認識領域のサイズを最適サイズと判定する手段と、前記最適サイズのスポット認識領域を適用してスポット画像を認識する手段とを備えたスポット画像認識システムを提供するものである。
【００１６】
本発明のスポット画像認識システムにおいて、前記スポット認識領域の最適サイズを判定する手段は、スポット認識領域のサイズを最小サイズから最大サイズまで一方向に増加させたときに、スポット認識パラメータの値が、スポット認識領域が最小サイズの時には上方閾値以下かつ下方閾値以上であり、その後上方閾値より大きくなり、その後上方閾値以下となり、その後下方閾値よりも小さくなる場合には、スポット認識パラメータの値が最初に上方閾値より大きくなる直前の位置に相当するスポット認識領域のサイズを最適サイズと判定することを特徴とする。
【００１７】
本発明のスポット画像認識システムにおいて、前記スポット認識領域の最適サイズを判定する手段は、スポット認識領域のサイズを最大サイズから最小サイズまで一方向に減少させたときに、スポット認識パラメータの値が、スポット認識領域が最大サイズの時には下方閾値よりも小さく、その後下方閾値以上となり、その後上方閾値より大きくなり、その後上方閾値以下となり、スポット認識領域が最小サイズの時には上方閾値以下かつ下方閾値以上である場合には、スポット認識パラメータの値が上方閾値より大きくなった後再度上方閾値以下となった直後の位置に相当するスポット認識領域のサイズを最適サイズと判定することを特徴とする。
【００１８】
本発明のスポット画像認識システムにおいて、前記スポット認識パラメータは、スポット認識領域内の画素のシグナル強度分布の中央値及び平均値の差又は比であることを特徴とする。
【００１９】
本発明のスポット画像認識システムは、また、既にサイズ設定されているスポット認識領域について、当該スポット認識領域内の画素のシグナル強度分布の中央値及び平均値の差又は比を計算し、その値が一定の閾値を超える場合には、スポット認識領域のサイズを設定し直すスポット認識領域再設定手段をさらに備えていることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２０】
以上説明したように、本発明のスポット画像認識方法及びスポット画像認識システムによれば、ＤＮＡマイクロアレイなどの実験結果として得られるスポット画像に対してスポット認識を精確に行うことが可能となる。本発明のスポット認識領域の最適サイズの自動設定機能を利用すれば、ユーザが手動でスポット認識領域を設定した場合にも、設定に誤りがある可能性が高いものから順に、ユーザに設定の補正を促すことが可能である。あるいは、ユーザが手動でスポット認識領域を設定したもののうち、設定に誤りがあると認められるもののみを、上記自動設定機能によって自動的に補正することも可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、添付図面を参照しながら、本発明のスポット画像認識方法及びスポット画像認識システムを実施するための最良の形態を詳細に説明する。図１〜図８は、本発明の実施の形態を例示する図であり、これらの図において、同一の符号を付した部分は同一物を表わし、基本的な構成及び動作は同様であるものとする。
【００２２】
スポット画像認識システムの構成
図１は、本実施形態のスポット画像認識システムの内部構成を概略的に示す図である。図１において、スポット画像認識システムは、プログラムからの指示に従って演算処理等を行う中央処理装置１０１と、スポット画像認識処理を行うための各種プログラムを格納するプログラムメモリ１０２と、処理対象となるデータや設定情報などを記憶する外部記憶装置１０３と、プログラムの作業領域として一時的にデータを保持するデータメモリ１０４と、ユーザからの操作入力を受け付けるための入力デバイス１０５と、処理結果や必要な情報を表示する表示装置１０６とを備えている。
【００２３】
プログラムメモリ１０２は、処理対象とするデータを取得するスポット画像データ取得プログラム１２１、スポット画像に所定サイズのスポット認識領域を適用するスポット認識領域適用プログラム１２２、スポット認識用パラメータ計算プログラム１２３、スポット自動認識プログラム１２４、ユーザにスポット認識の修正等を手動で行わせるスポット認識問合せプログラム１２５及びスポット認識状態表示プログラム１２６を格納している。外部記憶装置１０３は、実験結果として得られたスポット画像データ１３１及びスポットの認識結果であるスポット認識結果データ１３２を記憶している。データメモリ１０４は、本システムによるスポット画像認識処理の対象として外部記憶装置１０３のスポット画像データ１３１から取得された所定のデータ（スポット輝度データ１４１及びスポット認識データ１４２）を格納している。入力デバイス１０５は、ポインティングデバイス１５１やキーボード１５２等を含んでいる。
【００２４】
図２は、データメモリ１０４に格納されているスポット輝度データ１４１及びスポット認識データ１４２のデータ構成を概略的に示す図である。スポット輝度データテーブル２０１は、各スポットの位置情報とスポット画像のシグナル強度値（輝度値）とを格納している。スポット認識データテーブル２０２は、スポットごとにスポット認識領域、スポット認識領域内の画像のシグナル強度値の中央値及び平均値、さらにそれらの値の差と比を格納している。尚、中央値、平均値等の値は、スポット輝度データから計算されるものであり、スポット認識領域の設定範囲によって値が変化する。
【００２５】
スポット画像認識システムにおけるスポット画像認識の原理
次に、本実施形態のスポット画像認識システムによるスポット画像認識の原理ついて説明する。図３は、あるスポット画像に対して４種類のサイズが異なるスポット認識領域を適用した場合に認識されるシグナル強度の分布を示したグラフである。円形のスポット認識領域３０１〜３０４を適用したときのシグナル強度分布は、それぞれ、プロット３０５〜３０８で表されている。スポット認識領域３０１は、その設定範囲がスポット画像のスポット部分よりも大幅に広く、シグナル強度が非常に低いバックグラウンドのピクセルが認識対象に多く含まれるため、そのシグナル強度分布３０５は低シグナル強度に大きく偏っている。スポット認識領域３０２も、その設定範囲がスポット画像のスポット部分よりもやや広いので、そのシグナル強度分布３０６は低シグナル強度にやや偏っている。スポット認識領域３０３は、その設定範囲がスポット画像のスポット部分の輪郭とほぼ一致しているので、そのシグナル強度分布３０７は低シグナル強度側にノイズを持たず、大部分がスポット部分のシグナルをしたものとなっている。スポット認識領域３０４は、その設定範囲がスポット画像のスポット部分よりも狭く、ほぼスポット画像のスポット部分のみを含んでいるので、そのシグナル強度分布３０８は低シグナル強度側にノイズを持たず、大部分がスポット部分のシグナルをしたものとなっている。
【００２６】
図４は、図３に示したスポット認識領域３０１〜３０４とそれらを適用したときのシグナル強度分布をそれぞれ別個に示すグラフである。それぞれのグラフにおいて、シグナル強度の中央値４０１〜４０４と平均値４１１〜４１４とを表示している。以下において、各グラフにおける中央値及び平均値の関係について考慮する。
【００２７】
設定範囲がスポット画像のスポット部分よりも大幅に広いスポット認識領域３０１については、シグナル強度の低いバックグラウンドピクセルが大量に認識されているため、中央値４０１が低シグナル強度側に引きずられて平均値４１１よりも大幅に低い値となる。設定範囲がスポット画像のスポット部分よりもやや広いスポット認識領域３０２については、シグナル強度の低いバックグラウンドピクセルがある程度認識されているが、スポット部分からのシグナル強度も広く分布しているため、スポット認識領域３０１の場合に比べると中央値４０２がより中央に近くなり、平均値４１２が中央値４０２よりも低い値となる。設定範囲がスポット画像のスポット部分とほぼ一致するスポット認識領域３０３については、低シグナル強度に側にノイズを持たず、スポット部分からのシグナル強度が広く分布しているため、中央値４０３と平均値４１３はほぼ同じ値となる。同様に、設定範囲がスポット画像のスポット部分よりも狭いスポット認識領域３０４についても、中央値４０４と平均値４１４はほぼ同じ値となる。
【００２８】
そこで、このようなスポット認識領域のサイズ変化によるシグナル強度分布の平均値及び中央値の推移を観察してみる。図５は、スポット認識領域の設定範囲（サイズ）の変化に対するシグナル強度分布の中央値、平均値などの指標値の推移を示すグラフである。図５に示すグラフでは、横軸にスポット認識領域の設定範囲（サイズ）をとり、縦軸にシグナル強度又は比をとっている。スポット認識領域の設定範囲については、２７段階のサイズを設定し、各サイズのスポット認識領域を設定してスポット画像を認識したときのシグナル強度の中央値及び平均値を測定した。グラフには、中央値のプロット５０１、平均値のプロット５０２、中央値と平均値との差のプロット５０３、並びに中央値と平均値との比のプロット５０４を表している。中央値、平均値及び中央値と平均値との差についてはグラフ左側のシグナル強度の目盛りに従い、中央値と平均値との比についてはグラフ右側の比の目盛りに従うものとする。尚、図３のスポット認識領域３０１，３０２，３０３，３０４は、それぞれ、サイズの小さい方から数えて２２段階目、１３段階目、９段階目、１段階目に相当している。
【００２９】
図５のグラフにおいて、中央値のプロット５０１は、スポット認識領域のサイズを大きくしていくと、スポット認識領域がスポット部分よりもやや大きくなるあたりまでは値があまり変動しないが、スポット認識領域がスポット部分の２倍程度の大きさになるあたりで急激に低下し、その後下げ止まっている。一方、平均値のプロット５０２は、スポット認識領域のサイズを大きくしていくと、スポット認識領域がスポット部分の内側に収まっている間は値があまり変動しないが、スポット認識領域がスポット部分よりも大きくなるあたりから一定割合で低下している。この中央値と平均値との関係から、以下に説明するように中央値と平均値との差や比の値は共に特徴的な推移をすることになる。
【００３０】
中央値と平均値との差（中央値−平均値）のプロット５０３は、スポット認識領域のサイズを大きくしていくと、スポット認識領域とスポット部分とがほぼ同じ大きさになるまでは０付近で推移し、スポット認識領域がスポット部分よりも大きくなると平均値の低下により正の値となり、スポット認識領域がさらに大きくなると中央値の急落により負の値に転じている。一方、中央値と平均値との比（中央値／平均値）のプロット５０４は、スポット認識領域のサイズを大きくしていくと、スポット認識領域とスポット部分とがほぼ同じ大きさになるまでは１付近で推移し、スポット認識領域がスポット部分よりも大きくなると平均値の低下により１より大きな値となり、スポット認識領域がさらに大きくなると中央値の急落により１よりも小さい値に転じている。
【００３１】
そこで、本実施形態のスポット画像認識システムでは、スポット認識領域のサイズ変化に従うシグナル強度の中央値及び平均値の差又は比の特徴的な推移に着目して、スポット認識領域を適切な範囲に設定することにより、適切なスポット画像認識を行うことが可能となっている。図５のグラフによれば、スポット認識領域が最適なサイズとなる位置、すなわちスポット認識領域３０３あたりの位置に注目すると、中央値と平均値との差及び比の値が一定である領域（サイズがより小さい側）と値が上昇する領域（サイズがより大きい側）との境目となっていることが分かる。したがって、スポット認識領域のサイズ変化に従うシグナル強度の中央値及び平均値の差又は比の変化を分析してこの境目が特定されれば、スポット認識領域の適切な設定サイズが割り出されることになる。以下に、その具体的な処理手順について説明する。
【００３２】
スポット画像認識システムの処理手順
図６は、本実施形態のスポット画像認識システムにおいて、スポット認識領域の最適サイズを自動的に設定する処理の流れを示すフローチャートである。これらの処理は、プログラムメモリ１０２の各プログラム１２１〜１２５が単独であるいは協働して実行するものである。
【００３３】
図６において、まず、外部記憶装置１０３のスポット画像データ１３１から処理対象とするスポット画像データを取得する（ステップ６００）。これにより１つのスポット画像の輝度データがデータメモリ１０４に読み出される。続いて、スポット認識領域のとり得るサイズの範囲（最小サイズ及び最大サイズ）、スポット認識に用いるパラメータの種類（「中央値−平均値」の値を使うか「中央値／平均値」の値を使うか）、同パラメータの閾値（上限値及び下限値）を取得する（ステップ６０１）。これらの値は、予め設定されている値として取得してもよいし、あるいはユーザに問い合わせて取得してもよい。取得されたスポット画像に対して各サイズのスポット認識領域を順に適用し、その際の輝度の平均値・中央値を取得する（ステップ６０２）。スポット認識領域のサイズは、ステップ６０１で取得した最小サイズから最大サイズまでの間で連続的あるいは段階的に変化させる。適用したスポット認識領域のサイズごとに、スポット認識用パラメータを計算する（ステップ６０３）。すなわち、スポット認識領域の各サイズにつき、スポット画像の輝度の「中央値−平均値」又は「中央値／平均値」の値が計算されることになる。
【００３４】
続いて、最小サイズのスポット認識領域を適用したときのスポット認識用パラメータの値が閾値により設定される範囲（上限値から下限値までの範囲）を超えているかどうかを判定し（ステップ６０４）、超えている場合にはスポット認識処理ができないとして処理を終了する（ステップ６０５）。最小サイズのスポット認識領域を適用したときには、バックグラウンドノイズがほとんど含まれず、中央値と平均値の差又は比が最も小さくなると考えられるので、このときのスポット認識用パラメータが閾値の範囲内になければ、異常な値であると判定することとしている。スポット認識領域のサイズを最小サイズから漸進的に大きくしていくに従って、スポット認識用パラメータが閾値の上限値を超える点があるかどうかを判定する（ステップ６０６）。そのようなスポット認識用パラメータの値が存在しない場合にはスポット認識処理ができないとして処理を終了する（ステップ６０７）。スポット認識領域のサイズの変化に従って、輝度値の中央値と平均値との関係が図４及び図５に示すような推移をしないのでは、上記したスポット画像認識の原理が当てはまらなくなるからである。
【００３５】
続いて、ステップ６０６で検出した点からさらにスポット認識領域のサイズを漸進的に大きくしていったときに、スポット認識用パラメータの値が閾値の上限値以下となる点があるかどうかを判定する（ステップ６０８）。そのようなスポット認識用パラメータの値が存在しない場合にはスポット認識処理ができないとして処理を終了する（ステップ６０９）。スポット認識領域のサイズの変化に従って、輝度値の中央値と平均値との関係が図４及び図５に示すような推移をしないのでは、上記したスポット画像認識の原理が当てはまらなくなるからである。ステップ６０８で検出した点からさらにスポット認識領域のサイズを漸進的に大きくしていき、スポット認識用パラメータの値が閾値の下限値以下となる点があるかどうかを判定する（ステップ６１０）。そのようなスポット認識用パラメータの値が存在しない場合にはスポット認識処理ができないとして処理を終了する（ステップ６１１）。スポット認識領域のサイズの変化に従って、輝度値の中央値と平均値との関係が図４及び図５に示すような推移をしないのでは、上記したスポット画像認識の原理が当てはまらなくなるからである。
【００３６】
上記のステップ６０４，６０６，６０８，６１０における条件をクリアしたスポット画像データについては、スポット認識領域サイズを最小サイズから大きくしてゆきスポット認識用パラメータが閾値の上限を超える直前の点を検出し、そのときのスポット認識領域のサイズを最適なスポット認識領域のサイズと判定する（ステップ６１２）。尚、スポット認識用パラメータの閾値については、多くのスポット画像を認識した結果、経験的に決定されるものであるが、例えば、スポット画像の輝度の「中央値／平均値」の値を用いる場合には、１±０．０５程度の範囲に設定するとよい。
【００３７】
図７は、以上に説明したスポット認識領域の最適サイズを自動的に設定する処理を、グラフを用いて模式的に説明する図である。このグラフにおいて、スポット認識領域のサイズが最小の位置Ａでのスポット認識用パラメータが閾値の上限から下限までの範囲内にあり（ステップ６０４における判定）、Ａより右に行くとスポット認識用パラメータが閾値の上限を超える点Ｂがあり（ステップ６０６における判定）、Ｂより右に行くとスポット認識用パラメータが閾値の上限を再度下回る点Ｃがあり（ステップ６０８における判定）、Ｃより右に行くとスポット認識用パラメータが閾値の下限を下回る点Ｄがある（ステップ６１０における判定）ことが確認されれば、このスポット画像データに対しては上記したスポット画像認識の原理が適用できるので、Ｂ付近にスポット認識領域の最適サイズをとることができる。尚、本実施形態では、スポット認識領域のサイズが小さい側から順にスポット認識用パラメータの値を追って判定処理を行っているが、スポット認識領域のサイズが大きい側から順にスポット認識用パラメータの値を追っても同様の判定処理を行うことができるのは明らかである。
【００３８】
また、本実施形態のスポット画像認識システムでは、スポット認識領域の最適サイズを自動的に設定する処理以外にも、様々な形態の処理が可能である。例えば、ユーザが手動によりスポット認識領域の最適サイズを設定した後に、スポット認識領域がうまく当てはまっていないスポット画像についてユーザに補正を促す機能を追加することができる。一般的にスポット内部の輝度に大きなムラが存在しない場合、最適なサイズのスポット認識領域を設定すると、その領域内の輝度の中央値と平均値はほぼ一致する。そうすると、スポット認識領域内の輝度の中央値と平均値の乖離が大きい場合には、スポット認識領域の設定が誤っている可能性がある。例えば、スポット認識領域を実際のスポット画像より非常に大きな範囲に設定した場合には中央値が平均値を下回り、スポット認識領域を実際のスポットよりやや大きな範囲に設定した場合には平均値が中央値を下回ることになる。また、スポット画像に大きなムラがある場合にも平均値と中央値が大きく乖離する。そこで、このように中央値と平均値の乖離が大きいものから順に、ユーザに補正を促すような機能を追加することができる。あるいは、中央値と平均値の乖離が一定以上であるものは全て上記した自動設定処理により、スポット認識領域のサイズを自動的に設定するようにしてもよい。
【００３９】
スポット画像認識システムの表示画面
図８は、本実施形態のスポット画像認識システムにおいて表示装置１０６に表示される画面の例を示す図である。この画面を表示する処理は、スポット認識状態表示プログラム１２６によって実行される。
【００４０】
図８に示す画面において、８０１はスポット認識領域のサイズごとにスポット画像の中央値、平均値、「中央値−平均値」、「中央値／平均値」などの値を示すリストである。各項目はヘッダ行をダブルクリックすることなどにより昇順・降順に並べ替えることが可能である。８０２は処理対象のスポット画像である。ＤＮＡマイクロアレイの実験は２色蛍光法を用いて行なわれる場合があるため、それぞれの蛍光色素からのシグナルを読み取ったスポット画像と、両方のシグナルを重ね合わせたスポット画像とを表示している。８０３は上記２種類の蛍光色素（チャンネル）のうちいずれを処理対象とするかを選択するためのラジオボタンである。８０４はスポット認識領域のサイズ順にリスト８０１の値をプロットした結果を示すプロットウィンドウである。８０５は現在スポット認識領域の最適サイズと判定している位置を示すバーである。このバーはマウス等のポインティングデバイスを利用したドラッグ操作などによりユーザが任意に移動することが可能である。８０６はスポット認識用パラメータの種類（「中央値−平均値」か「中央値／平均値」か）を選択するためのラジオボタンである。８０７は１つ前のスポット画像データの表示に切り替えるSmallボタン、８０８は１つ後のスポット画像データの表示に切り替えるLargeボタンである。８０９は処理対象のスポット画像にムラがある場合などの理由で、実験データとして相応しくないとユーザが判断した場合にフラグを立てるためのBad Spotチェックボックスである。８１０は処理対象のスポット画像に現在選択しているスポット認識用パラメータを用いて、スポット認識領域の最適サイズを自動判定するためのAutoボタンである。８１１はこの自動判定処理を全てのスポット画像データに対して行うためのAuto Allボタンである。８１２は現在表示されているスポット認識領域のサイズを最適サイズとして決定するためのOKボタンである。
【００４１】
以上、本発明のスポット画像認識方法及びスポット画像認識システムについて、具体的な実施の形態を示して説明したが、本発明はこれらに限定されるものではない。当業者であれば、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において、上記各実施形態又は他の実施形態にかかる発明の構成及び機能に様々な変更・改良を加えることが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明のスポット画像認識方法及びスポット画像認識システムは、マイクロアレイなどを読み取る解析装置において、スポット画像を精確に認識するための画像認識モジュールとして組み込んで利用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】本発明のスポット画像認識システムの内部構成を概略的に示す図である。
【図２】図１に示すスポット画像認識システムのデータメモリに格納されているスポット認識データ及びスポット輝度データのデータ構成を概略的に示す図である。
【図３】あるスポット画像に対して４種類の異なるスポット認識領域を適用した場合に認識されるピクセルシグナル強度の分布を示したグラフである。
【図４】図３に示すスポット認識領域とそれらを適用したときのピクセルシグナル強度分布をそれぞれ別個に示すグラフである。
【図５】スポット認識領域の設定範囲（サイズ）の変化に対するシグナル強度分布の中央値、平均値などの指標値の推移を示すグラフである。
【図６】図１に示すスポット画像認識システムにおいて、スポット認識領域の最適サイズを自動的に設定する処理の流れを示すフローチャートである。
【図７】図６に示すスポット認識領域の最適サイズを自動的に設定する処理を、グラフを用いて模式的に説明する図である。
【図８】図１に示すスポット画像認識システムにおいて表示装置に表示される画面の例を示す図である。
【符号の説明】
【００４４】
１０１ 中央処理装置
１０２ プログラムメモリ
１０３ 外部記憶装置
１０４ データメモリ
１０５ 入力デバイス
１０６ 表示装置
１２１ スポット画像データ取得プログラム
１２２ スポット認識領域適用プログラム
１２３ スポット認識用パラメータ計算プログラム
１２４ スポット自動認識プログラム
１２５ スポット認識問合せプログラム
１２６ スポット認識状態表示プログラム
１３１ スポット画像データ
１３２ スポット認識結果データ
１４１ スポット輝度データ
１４２ スポット認識データ
１５１ ポインティングデバイス
１５２ キーボード
２０１ スポット輝度データテーブル
２０２ スポット認識データテーブル
３０１，３０２，３０３，３０４ スポット認識領域
３０５，３０６，３０７，３０８ スポット認識領域３０１〜３０４に対応するシグナル強度分布のプロット
４０１，４０２，４０３，４０４ 中央値
４１１，４１２，４１３，４１４ 平均値
５０１ 中央値のプロット
５０２ 平均値のプロット
５０３ 中央値と平均値との差のプロット
５０４ 中央値と平均値との比のプロット
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロアレイを用いた分子生物学的実験などで得られるスポット画像において、個々のスポットを精確に認識するための画像認識方法及び画像認識システムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、分子生物学における実験手法の進歩により、ＤＮＡマイクロアレイ等の網羅的な遺伝子解析手法が生み出された。これらの実験結果はコンピュータを利用して解析されるため、蛍光シグナルなどの形で得られる実験結果をアナログデータからデジタルデータに変換する作業が行なわれる。例えば、実験後にＤＮＡマイクロアレイ上のスポットを撮像した画像を解析することにより、スポットのサイズや蛍光シグナル強度などのデータが取得される。
【０００３】
特許文献１には、蛍光シグナルが発生しうる領域を物理的な孔を利用するなどして固定し、該当領域内の外れ値をもつピクセルを除外することで、有効なデータのみを抽出することを特徴とするバイオチップ読み取り装置が記載されている。また、特許文献２には、反復実験結果の誤差推定値を平均して１つの試料における誤差を推定することにより、変換されたデジタルデータの信頼度・信頼限界を確定することを特徴とする化学的及び生物学的アッセイの評価方法が記載されている。
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−１０１３７６号公報。
【特許文献２】特表２００２−５１２３６７号公報。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
現在では、ＤＮＡマイクロアレイ技術の進歩により、かつては数千個程度であったものが、数万個以上という大量の遺伝子断片ＤＮＡを１枚のスライドガラス上に固定化することが可能となっている。画像解析処理能力にともない、各スポットの認識処理をある程度自動化することが可能となってきたが、人間が一切介在しないで完全自動で精確にスポットを認識できるレベルまでには至っていない。画像解析を行った後のデータは数値となってしまうため、正確なスポット認識が行なわれたか否かは判別が困難であるうえに、不正確なスポット認識のデータは解析対象データ内にノイズとして紛れ込み、解析結果に大きな影響を与えてしまう。また、スポット認識のための画像解析に時間がかかるため、同時に解析可能な遺伝子数が大幅に増加したといっても、ハイスループットな解析を行うことはできないという問題点があった。
【０００６】
特許文献２に記載の方法では、物理的な孔のなかにある蛍光強度データの中から外れ値となるピクセルデータを除去する、もしくは、反復実験によりデータ信頼性を高めるといったアプローチをとっているが、１つの試料を用いた１回の実験画像データにおいて不定サイズのスポットをより正確に認識し、数値データにする場合には、この技術を応用することはできない。
【０００７】
本発明は、このような実情に鑑みてなされたものであり、マイクロアレイなどのスポット画像を認識する方法及びシステムであって、認識が正確に行なわれていないスポットを簡便に見つけ出すことができ、さらにそのようなスポットに対する画像認識の補正をユーザが行うことができ、また、認識が正確に行なわれていないスポットの補正を自動的に行なうことができるスポット画像認識方法及びスポット画像認識システムを提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記解決課題に鑑みて鋭意研究の結果、本発明者は、スポット認識用のパラメータとして、スポット認識領域内の画素のシグナル強度分布の中央値及び平均値に着目し、これらの値の相関関係がスポット認識領域のサイズの変化に従って一定のパターンを有していることを発見し、これを利用してスポット認識領域の設定の適切さを判定することに想到した。
【０００９】
すなわち、本発明は、スポット画像を自動的に認識する方法であって、スポット認識領域をサイズを変化させながらスポット画像に適用して、スポット認識領域内の画素のシグナル強度分布を取得し、取得したシグナル強度分布の中央値及び平均値からスポット認識パラメータを計算し、スポット認識領域のサイズの変化に従って前記スポット認識パラメータが変化するパターンが、所定の上方閾値及び下方閾値との間で一定の関係を満たす場合には、前記スポット認識パラメータの変化パターンにおける所定位置に相当するスポット認識領域のサイズを最適サイズと判定し、前記最適サイズのスポット認識領域を適用してスポット画像を認識する方法を提供するものである。
【００１０】
本発明のスポット画像認識方法は、前記スポット認識領域の最適サイズの判定において、スポット認識領域のサイズを最小サイズから最大サイズまで一方向に増加させたときに、スポット認識パラメータの値が、スポット認識領域が最小サイズの時には上方閾値以下かつ下方閾値以上であり、その後上方閾値より大きくなり、その後上方閾値以下となり、その後下方閾値よりも小さくなる場合には、スポット認識パラメータの値が最初に上方閾値より大きくなる直前の位置に相当するスポット認識領域のサイズを最適サイズと判定することを特徴とする。
【００１１】
本発明のスポット画像認識方法は、前記スポット認識領域の最適サイズの判定において、スポット認識領域のサイズを最大サイズから最小サイズまで一方向に減少させたときに、スポット認識パラメータの値が、スポット認識領域が最大サイズの時には下方閾値よりも小さく、その後下方閾値以上となり、その後上方閾値より大きくなり、その後上方閾値以下となり、スポット認識領域が最小サイズの時には上方閾値以下かつ下方閾値以上である場合には、スポット認識パラメータの値が上方閾値より大きくなった後再度上方閾値以下となった直後の位置に相当するスポット認識領域のサイズを最適サイズと判定することを特徴とする。
【００１２】
本発明のスポット画像認識方法は、前記スポット認識パラメータは、スポット認識領域内の画素のシグナル強度分布の中央値及び平均値の差又は比であることを特徴とする。
【００１３】
本発明は、また、スポット認識領域のサイズ設定を補正する方法であって、設定されたスポット認識領域内の画素のシグナル強度分布の中央値及び平均値の差又は比が一定の閾値を超える場合には、上記したスポット画像認識方法を用いて得られる最適サイズにスポット認識領域を設定し直すことを特徴とする方法を提供するものである。
【００１４】
本発明は、また、上記したスポット画像認識方法をコンピュータシステムにおいて実行するためのプログラムを提供するものである。
【００１５】
本発明は、また、スポット画像を自動的に認識するシステムであって、スポット認識領域をサイズを変化させながらスポット画像に適用して、スポット認識領域内の画素のシグナル強度分布を取得する手段と、取得したシグナル強度分布の中央値及び平均値からスポット認識パラメータを計算する手段と、スポット認識領域のサイズの変化に従って前記スポット認識パラメータが変化するパターンが、所定の上方閾値及び下方閾値との間で一定の関係を満たす場合には、前記スポット認識パラメータの変化パターンにおける所定位置に相当するスポット認識領域のサイズを最適サイズと判定する手段と、前記最適サイズのスポット認識領域を適用してスポット画像を認識する手段とを備えたスポット画像認識システムを提供するものである。
【００１６】
本発明のスポット画像認識システムにおいて、前記スポット認識領域の最適サイズを判定する手段は、スポット認識領域のサイズを最小サイズから最大サイズまで一方向に増加させたときに、スポット認識パラメータの値が、スポット認識領域が最小サイズの時には上方閾値以下かつ下方閾値以上であり、その後上方閾値より大きくなり、その後上方閾値以下となり、その後下方閾値よりも小さくなる場合には、スポット認識パラメータの値が最初に上方閾値より大きくなる直前の位置に相当するスポット認識領域のサイズを最適サイズと判定することを特徴とする。
【００１７】
本発明のスポット画像認識システムにおいて、前記スポット認識領域の最適サイズを判定する手段は、スポット認識領域のサイズを最大サイズから最小サイズまで一方向に減少させたときに、スポット認識パラメータの値が、スポット認識領域が最大サイズの時には下方閾値よりも小さく、その後下方閾値以上となり、その後上方閾値より大きくなり、その後上方閾値以下となり、スポット認識領域が最小サイズの時には上方閾値以下かつ下方閾値以上である場合には、スポット認識パラメータの値が上方閾値より大きくなった後再度上方閾値以下となった直後の位置に相当するスポット認識領域のサイズを最適サイズと判定することを特徴とする。
【００１８】
本発明のスポット画像認識システムにおいて、前記スポット認識パラメータは、スポット認識領域内の画素のシグナル強度分布の中央値及び平均値の差又は比であることを特徴とする。
【００１９】
本発明のスポット画像認識システムは、また、既にサイズ設定されているスポット認識領域について、当該スポット認識領域内の画素のシグナル強度分布の中央値及び平均値の差又は比を計算し、その値が一定の閾値を超える場合には、スポット認識領域のサイズを設定し直すスポット認識領域再設定手段をさらに備えていることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２０】
以上説明したように、本発明のスポット画像認識方法及びスポット画像認識システムによれば、ＤＮＡマイクロアレイなどの実験結果として得られるスポット画像に対してスポット認識を精確に行うことが可能となる。本発明のスポット認識領域の最適サイズの自動設定機能を利用すれば、ユーザが手動でスポット認識領域を設定した場合にも、設定に誤りがある可能性が高いものから順に、ユーザに設定の補正を促すことが可能である。あるいは、ユーザが手動でスポット認識領域を設定したもののうち、設定に誤りがあると認められるもののみを、上記自動設定機能によって自動的に補正することも可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、添付図面を参照しながら、本発明のスポット画像認識方法及びスポット画像認識システムを実施するための最良の形態を詳細に説明する。図１〜図８は、本発明の実施の形態を例示する図であり、これらの図において、同一の符号を付した部分は同一物を表わし、基本的な構成及び動作は同様であるものとする。
【００２２】
スポット画像認識システムの構成
図１は、本実施形態のスポット画像認識システムの内部構成を概略的に示す図である。図１において、スポット画像認識システムは、プログラムからの指示に従って演算処理等を行う中央処理装置１０１と、スポット画像認識処理を行うための各種プログラムを格納するプログラムメモリ１０２と、処理対象となるデータや設定情報などを記憶する外部記憶装置１０３と、プログラムの作業領域として一時的にデータを保持するデータメモリ１０４と、ユーザからの操作入力を受け付けるための入力デバイス１０５と、処理結果や必要な情報を表示する表示装置１０６とを備えている。
【００２３】
プログラムメモリ１０２は、処理対象とするデータを取得するスポット画像データ取得プログラム１２１、スポット画像に所定サイズのスポット認識領域を適用するスポット認識領域適用プログラム１２２、スポット認識用パラメータ計算プログラム１２３、スポット自動認識プログラム１２４、ユーザにスポット認識の修正等を手動で行わせるスポット認識問合せプログラム１２５及びスポット認識状態表示プログラム１２６を格納している。外部記憶装置１０３は、実験結果として得られたスポット画像データ１３１及びスポットの認識結果であるスポット認識結果データ１３２を記憶している。データメモリ１０４は、本システムによるスポット画像認識処理の対象として外部記憶装置１０３のスポット画像データ１３１から取得された所定のデータ（スポット輝度データ１４１及びスポット認識データ１４２）を格納している。入力デバイス１０５は、ポインティングデバイス１５１やキーボード１５２等を含んでいる。
【００２４】
図２は、データメモリ１０４に格納されているスポット輝度データ１４１及びスポット認識データ１４２のデータ構成を概略的に示す図である。スポット輝度データテーブル２０１は、各スポットの位置情報とスポット画像のシグナル強度値（輝度値）とを格納している。スポット認識データテーブル２０２は、スポットごとにスポット認識領域、スポット認識領域内の画像のシグナル強度値の中央値及び平均値、さらにそれらの値の差と比を格納している。尚、中央値、平均値等の値は、スポット輝度データから計算されるものであり、スポット認識領域の設定範囲によって値が変化する。
【００２５】
スポット画像認識システムにおけるスポット画像認識の原理
次に、本実施形態のスポット画像認識システムによるスポット画像認識の原理ついて説明する。図３は、あるスポット画像に対して４種類のサイズが異なるスポット認識領域を適用した場合に認識されるシグナル強度の分布を示したグラフである。円形のスポット認識領域３０１〜３０４を適用したときのシグナル強度分布は、それぞれ、プロット３０５〜３０８で表されている。スポット認識領域３０１は、その設定範囲がスポット画像のスポット部分よりも大幅に広く、シグナル強度が非常に低いバックグラウンドのピクセルが認識対象に多く含まれるため、そのシグナル強度分布３０５は低シグナル強度に大きく偏っている。スポット認識領域３０２も、その設定範囲がスポット画像のスポット部分よりもやや広いので、そのシグナル強度分布３０６は低シグナル強度にやや偏っている。スポット認識領域３０３は、その設定範囲がスポット画像のスポット部分の輪郭とほぼ一致しているので、そのシグナル強度分布３０７は低シグナル強度側にノイズを持たず、大部分がスポット部分のシグナルをしたものとなっている。スポット認識領域３０４は、その設定範囲がスポット画像のスポット部分よりも狭く、ほぼスポット画像のスポット部分のみを含んでいるので、そのシグナル強度分布３０８は低シグナル強度側にノイズを持たず、大部分がスポット部分のシグナルをしたものとなっている。
【００２６】
図４は、図３に示したスポット認識領域３０１〜３０４とそれらを適用したときのシグナル強度分布をそれぞれ別個に示すグラフである。それぞれのグラフにおいて、シグナル強度の中央値４０１〜４０４と平均値４１１〜４１４とを表示している。以下において、各グラフにおける中央値及び平均値の関係について考慮する。
【００２７】
設定範囲がスポット画像のスポット部分よりも大幅に広いスポット認識領域３０１については、シグナル強度の低いバックグラウンドピクセルが大量に認識されているため、中央値４０１が低シグナル強度側に引きずられて平均値４１１よりも大幅に低い値となる。設定範囲がスポット画像のスポット部分よりもやや広いスポット認識領域３０２については、シグナル強度の低いバックグラウンドピクセルがある程度認識されているが、スポット部分からのシグナル強度も広く分布しているため、スポット認識領域３０１の場合に比べると中央値４０２がより中央に近くなり、平均値４１２が中央値４０２よりも低い値となる。設定範囲がスポット画像のスポット部分とほぼ一致するスポット認識領域３０３については、低シグナル強度に側にノイズを持たず、スポット部分からのシグナル強度が広く分布しているため、中央値４０３と平均値４１３はほぼ同じ値となる。同様に、設定範囲がスポット画像のスポット部分よりも狭いスポット認識領域３０４についても、中央値４０４と平均値４１４はほぼ同じ値となる。
【００２８】
そこで、このようなスポット認識領域のサイズ変化によるシグナル強度分布の平均値及び中央値の推移を観察してみる。図５は、スポット認識領域の設定範囲（サイズ）の変化に対するシグナル強度分布の中央値、平均値などの指標値の推移を示すグラフである。図５に示すグラフでは、横軸にスポット認識領域の設定範囲（サイズ）をとり、縦軸にシグナル強度又は比をとっている。スポット認識領域の設定範囲については、２７段階のサイズを設定し、各サイズのスポット認識領域を設定してスポット画像を認識したときのシグナル強度の中央値及び平均値を測定した。グラフには、中央値のプロット５０１、平均値のプロット５０２、中央値と平均値との差のプロット５０３、並びに中央値と平均値との比のプロット５０４を表している。中央値、平均値及び中央値と平均値との差についてはグラフ左側のシグナル強度の目盛りに従い、中央値と平均値との比についてはグラフ右側の比の目盛りに従うものとする。尚、図３のスポット認識領域３０１，３０２，３０３，３０４は、それぞれ、サイズの小さい方から数えて２２段階目、１３段階目、９段階目、１段階目に相当している。
【００２９】
図５のグラフにおいて、中央値のプロット５０１は、スポット認識領域のサイズを大きくしていくと、スポット認識領域がスポット部分よりもやや大きくなるあたりまでは値があまり変動しないが、スポット認識領域がスポット部分の２倍程度の大きさになるあたりで急激に低下し、その後下げ止まっている。一方、平均値のプロット５０２は、スポット認識領域のサイズを大きくしていくと、スポット認識領域がスポット部分の内側に収まっている間は値があまり変動しないが、スポット認識領域がスポット部分よりも大きくなるあたりから一定割合で低下している。この中央値と平均値との関係から、以下に説明するように中央値と平均値との差や比の値は共に特徴的な推移をすることになる。
【００３０】
中央値と平均値との差（中央値−平均値）のプロット５０３は、スポット認識領域のサイズを大きくしていくと、スポット認識領域とスポット部分とがほぼ同じ大きさになるまでは０付近で推移し、スポット認識領域がスポット部分よりも大きくなると平均値の低下により正の値となり、スポット認識領域がさらに大きくなると中央値の急落により負の値に転じている。一方、中央値と平均値との比（中央値／平均値）のプロット５０４は、スポット認識領域のサイズを大きくしていくと、スポット認識領域とスポット部分とがほぼ同じ大きさになるまでは１付近で推移し、スポット認識領域がスポット部分よりも大きくなると平均値の低下により１より大きな値となり、スポット認識領域がさらに大きくなると中央値の急落により１よりも小さい値に転じている。
【００３１】
そこで、本実施形態のスポット画像認識システムでは、スポット認識領域のサイズ変化に従うシグナル強度の中央値及び平均値の差又は比の特徴的な推移に着目して、スポット認識領域を適切な範囲に設定することにより、適切なスポット画像認識を行うことが可能となっている。図５のグラフによれば、スポット認識領域が最適なサイズとなる位置、すなわちスポット認識領域３０３あたりの位置に注目すると、中央値と平均値との差及び比の値が一定である領域（サイズがより小さい側）と値が上昇する領域（サイズがより大きい側）との境目となっていることが分かる。したがって、スポット認識領域のサイズ変化に従うシグナル強度の中央値及び平均値の差又は比の変化を分析してこの境目が特定されれば、スポット認識領域の適切な設定サイズが割り出されることになる。以下に、その具体的な処理手順について説明する。
【００３２】
スポット画像認識システムの処理手順
図６は、本実施形態のスポット画像認識システムにおいて、スポット認識領域の最適サイズを自動的に設定する処理の流れを示すフローチャートである。これらの処理は、プログラムメモリ１０２の各プログラム１２１〜１２５が単独であるいは協働して実行するものである。
【００３３】
図６において、まず、外部記憶装置１０３のスポット画像データ１３１から処理対象とするスポット画像データを取得する（ステップ６００）。これにより１つのスポット画像の輝度データがデータメモリ１０４に読み出される。続いて、スポット認識領域のとり得るサイズの範囲（最小サイズ及び最大サイズ）、スポット認識に用いるパラメータの種類（「中央値−平均値」の値を使うか「中央値／平均値」の値を使うか）、同パラメータの閾値（上限値及び下限値）を取得する（ステップ６０１）。これらの値は、予め設定されている値として取得してもよいし、あるいはユーザに問い合わせて取得してもよい。取得されたスポット画像に対して各サイズのスポット認識領域を順に適用し、その際の輝度の平均値・中央値を取得する（ステップ６０２）。スポット認識領域のサイズは、ステップ６０１で取得した最小サイズから最大サイズまでの間で連続的あるいは段階的に変化させる。適用したスポット認識領域のサイズごとに、スポット認識用パラメータを計算する（ステップ６０３）。すなわち、スポット認識領域の各サイズにつき、スポット画像の輝度の「中央値−平均値」又は「中央値／平均値」の値が計算されることになる。
【００３４】
続いて、最小サイズのスポット認識領域を適用したときのスポット認識用パラメータの値が閾値により設定される範囲（上限値から下限値までの範囲）を超えているかどうかを判定し（ステップ６０４）、超えている場合にはスポット認識処理ができないとして処理を終了する（ステップ６０５）。最小サイズのスポット認識領域を適用したときには、バックグラウンドノイズがほとんど含まれず、中央値と平均値の差又は比が最も小さくなると考えられるので、このときのスポット認識用パラメータが閾値の範囲内になければ、異常な値であると判定することとしている。スポット認識領域のサイズを最小サイズから漸進的に大きくしていくに従って、スポット認識用パラメータが閾値の上限値を超える点があるかどうかを判定する（ステップ６０６）。そのようなスポット認識用パラメータの値が存在しない場合にはスポット認識処理ができないとして処理を終了する（ステップ６０７）。スポット認識領域のサイズの変化に従って、輝度値の中央値と平均値との関係が図４及び図５に示すような推移をしないのでは、上記したスポット画像認識の原理が当てはまらなくなるからである。
【００３５】
続いて、ステップ６０６で検出した点からさらにスポット認識領域のサイズを漸進的に大きくしていったときに、スポット認識用パラメータの値が閾値の上限値以下となる点があるかどうかを判定する（ステップ６０８）。そのようなスポット認識用パラメータの値が存在しない場合にはスポット認識処理ができないとして処理を終了する（ステップ６０９）。スポット認識領域のサイズの変化に従って、輝度値の中央値と平均値との関係が図４及び図５に示すような推移をしないのでは、上記したスポット画像認識の原理が当てはまらなくなるからである。ステップ６０８で検出した点からさらにスポット認識領域のサイズを漸進的に大きくしていき、スポット認識用パラメータの値が閾値の下限値以下となる点があるかどうかを判定する（ステップ６１０）。そのようなスポット認識用パラメータの値が存在しない場合にはスポット認識処理ができないとして処理を終了する（ステップ６１１）。スポット認識領域のサイズの変化に従って、輝度値の中央値と平均値との関係が図４及び図５に示すような推移をしないのでは、上記したスポット画像認識の原理が当てはまらなくなるからである。
【００３６】
上記のステップ６０４，６０６，６０８，６１０における条件をクリアしたスポット画像データについては、スポット認識領域サイズを最小サイズから大きくしてゆきスポット認識用パラメータが閾値の上限を超える直前の点を検出し、そのときのスポット認識領域のサイズを最適なスポット認識領域のサイズと判定する（ステップ６１２）。尚、スポット認識用パラメータの閾値については、多くのスポット画像を認識した結果、経験的に決定されるものであるが、例えば、スポット画像の輝度の「中央値／平均値」の値を用いる場合には、１±０．０５程度の範囲に設定するとよい。
【００３７】
図７は、以上に説明したスポット認識領域の最適サイズを自動的に設定する処理を、グラフを用いて模式的に説明する図である。このグラフにおいて、スポット認識領域のサイズが最小の位置Ａでのスポット認識用パラメータが閾値の上限から下限までの範囲内にあり（ステップ６０４における判定）、Ａより右に行くとスポット認識用パラメータが閾値の上限を超える点Ｂがあり（ステップ６０６における判定）、Ｂより右に行くとスポット認識用パラメータが閾値の上限を再度下回る点Ｃがあり（ステップ６０８における判定）、Ｃより右に行くとスポット認識用パラメータが閾値の下限を下回る点Ｄがある（ステップ６１０における判定）ことが確認されれば、このスポット画像データに対しては上記したスポット画像認識の原理が適用できるので、Ｂ付近にスポット認識領域の最適サイズをとることができる。尚、本実施形態では、スポット認識領域のサイズが小さい側から順にスポット認識用パラメータの値を追って判定処理を行っているが、スポット認識領域のサイズが大きい側から順にスポット認識用パラメータの値を追っても同様の判定処理を行うことができるのは明らかである。
【００３８】
また、本実施形態のスポット画像認識システムでは、スポット認識領域の最適サイズを自動的に設定する処理以外にも、様々な形態の処理が可能である。例えば、ユーザが手動によりスポット認識領域の最適サイズを設定した後に、スポット認識領域がうまく当てはまっていないスポット画像についてユーザに補正を促す機能を追加することができる。一般的にスポット内部の輝度に大きなムラが存在しない場合、最適なサイズのスポット認識領域を設定すると、その領域内の輝度の中央値と平均値はほぼ一致する。そうすると、スポット認識領域内の輝度の中央値と平均値の乖離が大きい場合には、スポット認識領域の設定が誤っている可能性がある。例えば、スポット認識領域を実際のスポット画像より非常に大きな範囲に設定した場合には中央値が平均値を下回り、スポット認識領域を実際のスポットよりやや大きな範囲に設定した場合には平均値が中央値を下回ることになる。また、スポット画像に大きなムラがある場合にも平均値と中央値が大きく乖離する。そこで、このように中央値と平均値の乖離が大きいものから順に、ユーザに補正を促すような機能を追加することができる。あるいは、中央値と平均値の乖離が一定以上であるものは全て上記した自動設定処理により、スポット認識領域のサイズを自動的に設定するようにしてもよい。
【００３９】
スポット画像認識システムの表示画面
図８は、本実施形態のスポット画像認識システムにおいて表示装置１０６に表示される画面の例を示す図である。この画面を表示する処理は、スポット認識状態表示プログラム１２６によって実行される。
【００４０】
図８に示す画面において、８０１はスポット認識領域のサイズごとにスポット画像の中央値、平均値、「中央値−平均値」、「中央値／平均値」などの値を示すリストである。各項目はヘッダ行をダブルクリックすることなどにより昇順・降順に並べ替えることが可能である。８０２は処理対象のスポット画像である。ＤＮＡマイクロアレイの実験は２色蛍光法を用いて行なわれる場合があるため、それぞれの蛍光色素からのシグナルを読み取ったスポット画像と、両方のシグナルを重ね合わせたスポット画像とを表示している。８０３は上記２種類の蛍光色素（チャンネル）のうちいずれを処理対象とするかを選択するためのラジオボタンである。８０４はスポット認識領域のサイズ順にリスト８０１の値をプロットした結果を示すプロットウィンドウである。８０５は現在スポット認識領域の最適サイズと判定している位置を示すバーである。このバーはマウス等のポインティングデバイスを利用したドラッグ操作などによりユーザが任意に移動することが可能である。８０６はスポット認識用パラメータの種類（「中央値−平均値」か「中央値／平均値」か）を選択するためのラジオボタンである。８０７は１つ前のスポット画像データの表示に切り替えるSmallボタン、８０８は１つ後のスポット画像データの表示に切り替えるLargeボタンである。８０９は処理対象のスポット画像にムラがある場合などの理由で、実験データとして相応しくないとユーザが判断した場合にフラグを立てるためのBad Spotチェックボックスである。８１０は処理対象のスポット画像に現在選択しているスポット認識用パラメータを用いて、スポット認識領域の最適サイズを自動判定するためのAutoボタンである。８１１はこの自動判定処理を全てのスポット画像データに対して行うためのAuto Allボタンである。８１２は現在表示されているスポット認識領域のサイズを最適サイズとして決定するためのOKボタンである。
【００４１】
以上、本発明のスポット画像認識方法及びスポット画像認識システムについて、具体的な実施の形態を示して説明したが、本発明はこれらに限定されるものではない。当業者であれば、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において、上記各実施形態又は他の実施形態にかかる発明の構成及び機能に様々な変更・改良を加えることが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明のスポット画像認識方法及びスポット画像認識システムは、マイクロアレイなどを読み取る解析装置において、スポット画像を精確に認識するための画像認識モジュールとして組み込んで利用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】本発明のスポット画像認識システムの内部構成を概略的に示す図である。
【図２】図１に示すスポット画像認識システムのデータメモリに格納されているスポット認識データ及びスポット輝度データのデータ構成を概略的に示す図である。
【図３】あるスポット画像に対して４種類の異なるスポット認識領域を適用した場合に認識されるピクセルシグナル強度の分布を示したグラフである。
【図４】図３に示すスポット認識領域とそれらを適用したときのピクセルシグナル強度分布をそれぞれ別個に示すグラフである。
【図５】スポット認識領域の設定範囲（サイズ）の変化に対するシグナル強度分布の中央値、平均値などの指標値の推移を示すグラフである。
【図６】図１に示すスポット画像認識システムにおいて、スポット認識領域の最適サイズを自動的に設定する処理の流れを示すフローチャートである。
【図７】図６に示すスポット認識領域の最適サイズを自動的に設定する処理を、グラフを用いて模式的に説明する図である。
【図８】図１に示すスポット画像認識システムにおいて表示装置に表示される画面の例を示す図である。
【符号の説明】
【００４４】
１０１ 中央処理装置
１０２ プログラムメモリ
１０３ 外部記憶装置
１０４ データメモリ
１０５ 入力デバイス
１０６ 表示装置
１２１ スポット画像データ取得プログラム
１２２ スポット認識領域適用プログラム
１２３ スポット認識用パラメータ計算プログラム
１２４ スポット自動認識プログラム
１２５ スポット認識問合せプログラム
１２６ スポット認識状態表示プログラム
１３１ スポット画像データ
１３２ スポット認識結果データ
１４１ スポット輝度データ
１４２ スポット認識データ
１５１ ポインティングデバイス
１５２ キーボード
２０１ スポット輝度データテーブル
２０２ スポット認識データテーブル
３０１，３０２，３０３，３０４ スポット認識領域
３０５，３０６，３０７，３０８ スポット認識領域３０１〜３０４に対応するシグナル強度分布のプロット
４０１，４０２，４０３，４０４ 中央値
４１１，４１２，４１３，４１４ 平均値
５０１ 中央値のプロット
５０２ 平均値のプロット
５０３ 中央値と平均値との差のプロット
５０４ 中央値と平均値との比のプロット
【特許請求の範囲】
【請求項１】
スポット画像を自動的に認識する方法であって、
スポット認識領域をサイズを変化させながらスポット画像に適用して、スポット認識領域内の画素のシグナル強度分布を取得し、
取得したシグナル強度分布の中央値及び平均値からスポット認識パラメータを計算し、
スポット認識領域のサイズの変化に従って前記スポット認識パラメータが変化するパターンが、所定の上方閾値及び下方閾値との間で一定の関係を満たす場合には、前記スポット認識パラメータの変化パターンにおける所定位置に相当するスポット認識領域のサイズを最適サイズと判定し、
前記最適サイズのスポット認識領域を適用してスポット画像を認識する方法。
【請求項２】
前記スポット認識領域の最適サイズの判定において、
スポット認識領域のサイズを最小サイズから最大サイズまで一方向に増加させたときに、
スポット認識パラメータの値が、スポット認識領域が最小サイズの時には上方閾値以下かつ下方閾値以上であり、その後上方閾値より大きくなり、その後上方閾値以下となり、その後下方閾値よりも小さくなる場合には、スポット認識パラメータの値が最初に上方閾値より大きくなる直前の位置に相当するスポット認識領域のサイズを最適サイズと判定することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記スポット認識領域の最適サイズの判定において、
スポット認識領域のサイズを最大サイズから最小サイズまで一方向に減少させたときに、
スポット認識パラメータの値が、スポット認識領域が最大サイズの時には下方閾値よりも小さく、その後下方閾値以上となり、その後上方閾値より大きくなり、その後上方閾値以下となり、スポット認識領域が最小サイズの時には上方閾値以下かつ下方閾値以上である場合には、スポット認識パラメータの値が上方閾値より大きくなった後再度上方閾値以下となった直後の位置に相当するスポット認識領域のサイズを最適サイズと判定することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記スポット認識パラメータは、スポット認識領域内の画素のシグナル強度分布の中央値及び平均値の差又は比であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
スポット認識領域のサイズ設定を補正する方法であって、
設定されたスポット認識領域内の画素のシグナル強度分布の中央値及び平均値の差又は比が一定の閾値を超える場合には、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法を用いて得られる最適サイズにスポット認識領域を設定し直すことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１から４のいずれか１項に記載の方法をスポット画像認識システムにおいて実行するためのプログラム。
【請求項７】
スポット画像を自動的に認識するシステムであって、
スポット認識領域をサイズを変化させながらスポット画像に適用して、スポット認識領域内の画素のシグナル強度分布を取得する手段と、
取得したシグナル強度分布の中央値及び平均値からスポット認識パラメータを計算する手段と、
スポット認識領域のサイズの変化に従って前記スポット認識パラメータが変化するパターンが、所定の上方閾値及び下方閾値との間で一定の関係を満たす場合には、前記スポット認識パラメータの変化パターンにおける所定位置に相当するスポット認識領域のサイズを最適サイズと判定する手段と、
前記最適サイズのスポット認識領域を適用してスポット画像を認識する手段とを備えたスポット画像認識システム。
【請求項８】
前記スポット認識領域の最適サイズを判定する手段は、
スポット認識領域のサイズを最小サイズから最大サイズまで一方向に増加させたときに、
スポット認識パラメータの値が、スポット認識領域が最小サイズの時には上方閾値以下かつ下方閾値以上であり、その後上方閾値より大きくなり、その後上方閾値以下となり、その後下方閾値よりも小さくなる場合には、スポット認識パラメータの値が最初に上方閾値より大きくなる直前の位置に相当するスポット認識領域のサイズを最適サイズと判定することを特徴とする請求項７に記載のスポット画像認識システム。
【請求項９】
前記スポット認識領域の最適サイズを判定する手段は、
スポット認識領域のサイズを最大サイズから最小サイズまで一方向に減少させたときに、
スポット認識パラメータの値が、スポット認識領域が最大サイズの時には下方閾値よりも小さく、その後下方閾値以上となり、その後上方閾値より大きくなり、その後上方閾値以下となり、スポット認識領域が最小サイズの時には上方閾値以下かつ下方閾値以上である場合には、スポット認識パラメータの値が上方閾値より大きくなった後再度上方閾値以下となった直後の位置に相当するスポット認識領域のサイズを最適サイズと判定することを特徴とする請求項７に記載のスポット画像認識システム。
【請求項１０】
前記スポット認識パラメータは、スポット認識領域内の画素のシグナル強度分布の中央値及び平均値の差又は比であることを特徴とする請求項７から９のいずれか１項に記載のスポット画像認識システム。
【請求項１１】
既にサイズ設定されているスポット認識領域について、当該スポット認識領域内の画素のシグナル強度分布の中央値及び平均値の差又は比を計算し、その値が一定の閾値を超える場合には、スポット認識領域のサイズを設定し直すスポット認識領域再設定手段をさらに備えていることを特徴とするスポット画像認識システム。
【請求項１】
スポット画像を自動的に認識する方法であって、
スポット認識領域をサイズを変化させながらスポット画像に適用して、スポット認識領域内の画素のシグナル強度分布を取得し、
取得したシグナル強度分布の中央値及び平均値からスポット認識パラメータを計算し、
スポット認識領域のサイズの変化に従って前記スポット認識パラメータが変化するパターンが、所定の上方閾値及び下方閾値との間で一定の関係を満たす場合には、前記スポット認識パラメータの変化パターンにおける所定位置に相当するスポット認識領域のサイズを最適サイズと判定し、
前記最適サイズのスポット認識領域を適用してスポット画像を認識する方法。
【請求項２】
前記スポット認識領域の最適サイズの判定において、
スポット認識領域のサイズを最小サイズから最大サイズまで一方向に増加させたときに、
スポット認識パラメータの値が、スポット認識領域が最小サイズの時には上方閾値以下かつ下方閾値以上であり、その後上方閾値より大きくなり、その後上方閾値以下となり、その後下方閾値よりも小さくなる場合には、スポット認識パラメータの値が最初に上方閾値より大きくなる直前の位置に相当するスポット認識領域のサイズを最適サイズと判定することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記スポット認識領域の最適サイズの判定において、
スポット認識領域のサイズを最大サイズから最小サイズまで一方向に減少させたときに、
スポット認識パラメータの値が、スポット認識領域が最大サイズの時には下方閾値よりも小さく、その後下方閾値以上となり、その後上方閾値より大きくなり、その後上方閾値以下となり、スポット認識領域が最小サイズの時には上方閾値以下かつ下方閾値以上である場合には、スポット認識パラメータの値が上方閾値より大きくなった後再度上方閾値以下となった直後の位置に相当するスポット認識領域のサイズを最適サイズと判定することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記スポット認識パラメータは、スポット認識領域内の画素のシグナル強度分布の中央値及び平均値の差又は比であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
スポット認識領域のサイズ設定を補正する方法であって、
設定されたスポット認識領域内の画素のシグナル強度分布の中央値及び平均値の差又は比が一定の閾値を超える場合には、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法を用いて得られる最適サイズにスポット認識領域を設定し直すことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１から４のいずれか１項に記載の方法をスポット画像認識システムにおいて実行するためのプログラム。
【請求項７】
スポット画像を自動的に認識するシステムであって、
スポット認識領域をサイズを変化させながらスポット画像に適用して、スポット認識領域内の画素のシグナル強度分布を取得する手段と、
取得したシグナル強度分布の中央値及び平均値からスポット認識パラメータを計算する手段と、
スポット認識領域のサイズの変化に従って前記スポット認識パラメータが変化するパターンが、所定の上方閾値及び下方閾値との間で一定の関係を満たす場合には、前記スポット認識パラメータの変化パターンにおける所定位置に相当するスポット認識領域のサイズを最適サイズと判定する手段と、
前記最適サイズのスポット認識領域を適用してスポット画像を認識する手段とを備えたスポット画像認識システム。
【請求項８】
前記スポット認識領域の最適サイズを判定する手段は、
スポット認識領域のサイズを最小サイズから最大サイズまで一方向に増加させたときに、
スポット認識パラメータの値が、スポット認識領域が最小サイズの時には上方閾値以下かつ下方閾値以上であり、その後上方閾値より大きくなり、その後上方閾値以下となり、その後下方閾値よりも小さくなる場合には、スポット認識パラメータの値が最初に上方閾値より大きくなる直前の位置に相当するスポット認識領域のサイズを最適サイズと判定することを特徴とする請求項７に記載のスポット画像認識システム。
【請求項９】
前記スポット認識領域の最適サイズを判定する手段は、
スポット認識領域のサイズを最大サイズから最小サイズまで一方向に減少させたときに、
スポット認識パラメータの値が、スポット認識領域が最大サイズの時には下方閾値よりも小さく、その後下方閾値以上となり、その後上方閾値より大きくなり、その後上方閾値以下となり、スポット認識領域が最小サイズの時には上方閾値以下かつ下方閾値以上である場合には、スポット認識パラメータの値が上方閾値より大きくなった後再度上方閾値以下となった直後の位置に相当するスポット認識領域のサイズを最適サイズと判定することを特徴とする請求項７に記載のスポット画像認識システム。
【請求項１０】
前記スポット認識パラメータは、スポット認識領域内の画素のシグナル強度分布の中央値及び平均値の差又は比であることを特徴とする請求項７から９のいずれか１項に記載のスポット画像認識システム。
【請求項１１】
既にサイズ設定されているスポット認識領域について、当該スポット認識領域内の画素のシグナル強度分布の中央値及び平均値の差又は比を計算し、その値が一定の閾値を超える場合には、スポット認識領域のサイズを設定し直すスポット認識領域再設定手段をさらに備えていることを特徴とするスポット画像認識システム。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００６−８４２８１（Ｐ２００６−８４２８１Ａ）
【公開日】平成１８年３月３０日（２００６．３．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２６８２３７（Ｐ２００４−２６８２３７）
【出願日】平成１６年９月１５日（２００４．９．１５）
【出願人】（０００２３３０５５）日立ソフトウエアエンジニアリング株式会社 (1,610)
【出願人】（５０１００２１７２）株式会社ＤＮＡチップ研究所 (33)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年３月３０日（２００６．３．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月１５日（２００４．９．１５）
【出願人】（０００２３３０５５）日立ソフトウエアエンジニアリング株式会社 (1,610)
【出願人】（５０１００２１７２）株式会社ＤＮＡチップ研究所 (33)
【Ｆターム（参考）】
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