セセルニン−１の使用、滑膜肉腫の予後予測方法及び検査用試薬キット
【課題】滑膜肉腫の予後を簡易かつ的確に予測できる方法を提供する。
【解決手段】
セセルニン−１（secernin-1）を滑膜肉腫の予後を予測するバイオマーカーとして使用する。セセルニン−１の発現量を測定し、セセルニン−１の発現量が上昇している場合、滑膜肉腫に対する予後が良好と予測することを特徴とする。セセルニン−１の発現量の測定は、例えばウェスタンブロット法のように、セセルニン−１特異的抗体を用いた免疫学的方法によって測定される。予後は、外科手術に限定されず、化学療法、放射線療法、温熱療法、又は免疫療法等の予後である。
【解決手段】
セセルニン−１（secernin-1）を滑膜肉腫の予後を予測するバイオマーカーとして使用する。セセルニン−１の発現量を測定し、セセルニン−１の発現量が上昇している場合、滑膜肉腫に対する予後が良好と予測することを特徴とする。セセルニン−１の発現量の測定は、例えばウェスタンブロット法のように、セセルニン−１特異的抗体を用いた免疫学的方法によって測定される。予後は、外科手術に限定されず、化学療法、放射線療法、温熱療法、又は免疫療法等の予後である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セセルニン−１の使用、セセルニン−１を使用する滑膜肉腫の予後予測方法、及び、滑膜肉腫を患う患者の予後を予測するための検査用試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
滑膜肉腫（synovial sarcoma）は、四肢関節近傍に好発する悪性軟部腫瘍であり、組織学的には上皮性細胞と紡錘形細胞とからなる二相型biphasic typeと紡錘形細胞からなる単相型monophasictypeとに分類される。
【０００３】
滑膜肉腫は、一般的には極めて悪性度が高く、軟部腫瘍の中では悪性線維性組織球腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫に次いで発生頻度が高い腫瘍である。５年生存率は３０〜５０％、１０年生存率は１５〜３０％とする報告も有り、局所再発・転移ともに治療から時間が立ってから発生する症例も存在し、長期にわたる経過観察が必要な腫瘍である。
【０００４】
滑膜肉腫は、男女間の発生率に大きな性差は見られないものの、傾向として男性に若干多く発生する。発生年代としては、１０〜４０歳代に多く発生し、特に比較的若年者の１０〜２０代の若い人に発生しやすい。発生部位としては、大腿、膝関節部を主として下肢に好発し、関節包、滑液包、腱鞘、腱等に接して発生するものが多いが、これらの組織と関係しない頸部、体幹等にも発生することもある。
【０００５】
滑膜肉腫は、約半数の患者で痛みを伴い、その他は無症状であるが腫瘍はゆっくりと大きくなる。腫瘍は、比較的軟らかいものから硬いものまでまちまちである。
【０００６】
治療には広範切除術（腫瘍をできるだけ広めに正常組織で包むようにして切除する手術）を施すが、大関節付近に生じた症例では切離断術が適応とされる。また、神経や血管及び重要な筋肉の腱の周囲に発生することが多いため、これらをいっしょに切除しなければならないことが多く、機能を再建する手術が同時に必要となる。
【０００７】
また、遠隔転移の可能性があるため、腫瘍の手術切除の他に、補助化学療法が治療に用いられることが通例であり、一般的に３剤併用療法あるいは４剤併用療法が試みられている。
【０００８】
滑膜肉腫には、悪性増殖する予後不良群と、機構は不明ながら自然退縮する予後良好群とが存在する。滑膜肉腫には、局所再発・転移とも緩徐な例がしばしばあるため、術後最低でも１０年間の長期にわたる外来followが必要となることが通例であるが、予後を的確に予測できれば、より正確にfollow upの治療方針をたてることができる。
【０００９】
また、予後を正確に予測できれば、不必要な放射線治療や化学療法を避けることが可能となる。特に滑膜肉腫細胞は抗がん剤に対する感受性が低く、上記の化学療法の併用療法をもってしても著効が示されるには至っていない上に、化学療法は一定の割合で奏効性を示す一方で重篤な副作用も引き起こすことが報告されている。そのため、予後良好又は予後不良となる症例を事前に見極めることができれば、不必要な化学療法を避けることが可能となる利益は大きく、また患者のクオリティ・オブ・ライフ（QOL）に資する。
【００１０】
滑膜肉腫では、染色体転座t（X；18）（p11.2；q11.2）が高頻度に認められることが報告されている。切断点近傍のゲノムDNAの単離から、t（X；18）が染色体18q11.2に位置するSYT遺伝子と染色体Xp11.2に位置するSSX遺伝子を融合させ、これによりキメラタンパク質SYT-SSXが発現することが明らかになっている。SYT-SSXの発現は滑膜肉腫症例のほぼ全例で観察されているため、これは腫瘍発生において中心的な役割を果たすものと考えられる。SYT-SSX1やSYT-SSX2融合と、腫瘍の形態及び５年生存率との間には、ある程度の関連性があることが特許文献１に記載されている。
【００１１】
また、非特許文献１には、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によって、滑膜肉腫４５例(単相性３３人及び二相性１２人)のSYT-SSX融合転写物を分析し、関連する臨床及び病理データと比較した結果、SYT-SSX1及びSYT-SSX2融合転写物はそれぞれ、腫瘍の２９例（64%）及び１６例（36%）に検出され、局所腫瘍を有する患者３９人のKaplan-Meier法による分析では、SYT-SSX2を有する患者１５人は、SYT-SSX1を有する患者２４人より無転移生存率が有意に良好であることを示す（多変量解析によりP=0.03;相対危険度3.0）ことが記載されている。
【００１２】
また、非特許文献２には、凍結材料サンプル３３例について、SYT-SSX1/SSX2 融合遺伝子を検索したところ、SYT-SSX1は、SYT-SSX2に比し有意な予後不良因子（５年無転移生存率：SYT-SSX1 42％ VS SYT-SSX2 89％）であることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開２００３−２５２８０２号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】The New England Journal of Medicine 1998;338:153-60,川井章
【非特許文献２】Synovial sarcoma. A Scandinavian Sarcoma Group project,Acta Orthop Scand Suppl/291巻，1-28頁/2000年,Skytting B
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
上述の転座遺伝子SYT-SSXは、滑膜肉腫の９０％以上で特異的に発現することが知られているが、発現しない場合もある。
【００１６】
本発明は、新規で的確な滑膜肉腫の予後予測方法を提供するとともに、滑膜肉腫の予後を簡易且つ的確に予想できるセセルニン−１の使用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の第１の観点に係るセセルニン−１の使用は、滑膜肉腫の予後を予測するバイオマーカーとしての使用である。
【００１８】
前記予後は、例えば、外科手術、化学療法、放射線療法、温熱療法、及び免疫療法の少なくとも何れか一つを含む治療後である。
【００１９】
本発明の第２の観点に係る滑膜肉腫の予後予測方法は、セセルニン−１の発現量を測定し、前記セセルニン−１の発現量が上昇している場合、滑膜肉腫に対する予後が良好と予測することを特徴とする。
【００２０】
前記セセルニン−１の発現量の測定は、セセルニン−１特異的抗体を用いた免疫学的方法によって測定されることが好ましい。
【００２１】
前記免疫学的方法は、例えば、ウエスタンブロット法、免疫沈降法、ドットブロット法、スロットブロット法、及びELISA法から選ばれるいずれかの方法である。
【００２２】
前記予後は、例えば、外科手術、化学療法、放射線療法、温熱療法、及び免疫療法の少なくとも何れか一つを含む治療後である。
【００２３】
本発明の第３の観点に係る検査用試薬キットは、滑膜肉腫を患う患者の予後を予測するためのキットであって、前記患者から得られた試料におけるセセルニン−１の発現量を検出又は定量する手段を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、簡易かつ的確に、滑膜肉腫の予後を予測できる。そのため、術後の治療方針を正確にたてることで、follow upの治療期間を短縮することができ、緻密で最適化された個別化医療を可能にすることができる。また、不必要な放射線治療や化学療法を避けることが可能となり、更には滑膜肉腫の新規治療法の開発に有益である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】2D-DIGE法の工程を示す。
【図２】電気泳動実験のタンパク質スポットの検出を示す。
【図３】電気泳動分離実験の再現性を示す。
【図４】タンパク質スポットとタンパク質名との対応を示す。
【図５】主成分分析の結果を示す。
【図６】生存率についてのログランクテストを示す。
【図７】無転移率についてのログランクテストを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本実施形態においては、患者のセセルニン−１（secernin-1）の発現量を測定する。セセルニンには１〜３までのタイプがあるが、本発明では、セセルニン−１の発現量に着目する。
【００２７】
そして、セセルニン−１の発現量が上昇している場合、滑膜肉腫に対する予後が良好と予測する。
【００２８】
セセルニン−１の発現量の測定は、特に限定されるものではなく、単にセセルニン−１の有無を検出するものであってもよく、またセセルニン−１の発現量を相対的又は絶対的に決定するものでもよい。セセルニン−１の発現量の測定は、免疫学的手法によるのが好適であり、例えば、電気泳動法による分離と蛍光、酵素、放射性同位元素等による検出又は定量との組み合わせ（ウェスタンブロット法、蛍光二次元電気泳動法を含む）、免疫染色法（蛍光抗体法、酵素抗体法、重金属標識抗体法、放射性同位元素標識抗体法を含む）、酵素免疫測定吸着法（ELISA）、ドット・ブロッティング法等により行うことができる。本実施形態では、患者から生体組織を採取し、その生体組織内に含有されるタンパク質について電気泳動を行い、蛍光色素によりセセルニン−１の有無及び量を測定することによりなされる。
【００２９】
予後を予測できる治療は、特に限定されるものではないが、例えば外科手術、化学療法、放射線療法、温熱療法、又は免疫療法である。
【００３０】
滑膜肉腫の外科手術は、広範切除術が通例である。滑膜肉腫では、肉眼的に確認できる腫瘤の周囲に腫瘍細胞がしみこんでいるため、一見正常な周囲の組織を含めて大きく切除する必要があるためである。なお、広範切除術を行ったため、皮膚が大量になくなると、化学療法や放射線療法ができなくなるので、体の他の部分から血管をつけた皮膚を持って来る皮弁形成術を行う必要がある。
【００３１】
滑膜肉腫の化学療法は、一般的には、３剤併用療法あるいは４剤併用療法が試みられている。３剤併用療法の代表例は、例えばMAID療法（Mesna：副作用軽減剤、Adriacin：アドリアマイシン、Ifomide：イフォスファミド、Dacarbazine：ダカルバジン）である。また、４剤併用療法の代表例は、例えばCyVADIC療法（Cyclophosphamide：シクロフォスファミド、Vincristine：ビンクリスチン、Adriacin：アドリアマイシン、dacarbazine：ダカルバジン）である。
【００３２】
滑膜肉腫の放射線療法は、一般の放射線療法と同様に、照射体積の大きさにより、同じ照射線量でも生体反応（耐容線量）が全く異なり、放射線療法が単独で実施されるか、化学療法と併用されるか、手術の前か後かは治療医の判断によって調節される。腫瘍制御に必要な線量は、腫瘍の感受性により異なり、用量は例えば60〜70Gyである。用量としては、小線量を１日１回、週４〜５回照射する分割照射が多く行われ、分割照射の場合は、一回線量は例えば1.8〜2Gyである。
【００３３】
温熱療法は、熱を加えることで腫瘍の内部温度を上げ、癌を死滅させることを目的とした治療である。適用される温度は例えば４３℃程度であり、熱が加わった際に血管が拡張し血流が増加する正常な細胞と比べて、腫瘍細胞にはこの血管の拡張が無いため、熱を蓄積しやすい。
【００３４】
免疫療法は、身体が自然に有している疾患への防御機構への働きかけを向上させる治療法であり、通常は局所あるいは全身の免疫系を賦活させることで治療する。具体的には、抗腫瘍効果を持つリンパ球を用いた免疫療法、癌ワクチン療法、癌ワクチンテーラーメード治療、DNAワクチン療法、RNAワクチン療法等である。
【００３５】
本発明において予後が良好であるとは、５年以上の期間において無転移率又は生存率の統計学的有意差が存在することである。
【００３６】
本実施形態に係るキットは、滑膜肉腫を患う患者の予後を予測するための検査用試薬キットであり、患者から得られた試料におけるセセルニン−１の発現量を検出又は定量する手段を含む。免疫学的手法により検査を行う場合には、少なくとも抗セセルニン−１抗体が検査用試薬に含まれる。抗セセルニン−１抗体は、セセルニン−１の発現を検出しうる抗体であればよく、特に限定されないが、例えばモノクローナル及びポリクローナル抗体、標識化抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体並びにこれらの結合活性断片等が挙げられる。また検査用試薬キットには、上記抗体のほか検出用に用いる標識を含んでいてもよい。キットには、緩衝液、発色基質、二次抗体、ブロッキング剤等の試薬を含むことができる。
【００３７】
滑膜肉腫では、病理組織診断目的に原発組織により生検を行うことが普通であり、その際に生体組織を採取すれば、患者に新たな負担を強いることにはならない。
【００３８】
また、本実施形態に係る発明によれば、例えばウェスタンブロット装置の準備さえあれば、セセルニン−１の発現量の測定ができるため、簡易な手法にて滑膜肉腫の予後予測ができる。また、例えばセセルニン−１に特異的に発現する抗体を用いればウェスタンブロット以外の方法、例えば免疫染色によっても鋭敏にセセルニン−１の発現量の測定ができる。
【実施例】
【００３９】
（実施例１）
〈患者及び臨床情報〉
滑膜肉腫患者から得られた、１３個の凍結腫瘍組織を検査した。凍結腫瘍組織は、１３の滑膜肉腫の症例にて入手し、プロテオミクス解析にて使用された。診断及び分類は、軟組織腫瘍のＷＨＯ分類システムに基づいた。また、SYT-SSX1及びSYT-SSX2発現の検査も行った。結果を下記表１に示す。
【００４０】
【表１】
【００４１】
表１に示すように、滑膜肉腫サンプルは２つのグループに分類された。即ち、滑膜肉腫の予後不良（P-SS）として死亡した患者から採取した５つのサンプル（サンプルナンバーは、1,2,3,4,5である。）と、滑膜肉腫の予後良好（G-SS）として術後５年以内に転移がなかった８つのサンプル（サンプルナンバーは、6,7,8,9,10,11,12,13である。）とに分類された。なお、DOD（dead of disease）は病死、AWD（alive with disease）は病気状態での生存、NED（no evidence disease）は病気確証無しでの生存、CDF（continuous disease free）は無病生存を意味する。
【００４２】
〈タンパク質発現のプロファイリング〉
凍結サンプルは、液体窒素で冷却した後、クライオプレス（登録商標、マイクロテック・ニチオン,千葉，日本）で粉状に粉砕された。凍結サンプルは、urea lysis 緩衝液（６Ｍ ウレア, ２Ｍ チオウレア, ３％ CHAPS, １％ Triton X-100）にて調整された。１５,０００rpmにて３０分間遠心分離した後、上澄み液が取り出され、細胞タンパク質のソースとして使用された。
【００４３】
その後、2D-DIGE（2 Dimensional Fluorescence Difference Gel Electrophoresis）により泳動分離がなされた。2D-DIGE法は、泳動前に比較したいサンプルを異なる蛍光色素でラベルし、このラベル化したサンプルを混合してから電気泳動を行う手法である。図１は、2D-DIGE法の工程を示す工程図である。コントロールサンプル(internal control sample)は、全ての生検検体の一部を混合させて作成したものであり、５μｇ用いた。コントロールサンプルは、図１に示すように、Cy3(登録商標、CyDye DIGE Fluor saturation dye, GE Healthcare Biosciences, Uppsala, Sweden)によりラベルされた。また、夫々の生検検体は５μｇ用いられ、Cy5(登録商標、CyDye DIGE Fluor saturation dye, GE Healthcare Biosciences, Uppsala, Sweden)によりラベルされた。
【００４４】
第１次分離は、IPG緩衝液及びDryStripゲル(24 cm length, pI range between 4 and 7, GE Healthcare Biosciences)にて実行された。第２次分離は、大きめのゲル(38 cm length, Bio-craft, Itabashi, Tokyo, Japan)を使用し、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE：EttanDalt II GE Healthcare Biosciences)にて実行された。ゲルは、レーザー照射(Tyhoon Trio（登録商標）, GE Healthcare Biosciences)によりスキャンされた。全てのスポットにおいて、Cy5の強度はCy3の強度により初期化され、ゲル間の差はDeCyderイメージソフトウェア（GE Healthcare Biosciences）により補正された。結果を図２に示す。
【００４５】
図３は、電気泳動分離実験の再現性を示す。図３に示すように、同一サンプルにつき、３回の独立した電気泳動分離実験(exp1,exp2,exp3)を比較することにより、再現性が存在することが実証された。散乱プロット解析により、スポットの９６％以上の標準強度が、２倍差（2 fold difference）の範囲内であった。
【００４６】
〈データ分析〉
タンパク質スポットの強度は統計学的に２グループ間において有意差が認められた（Wilcoxon test P値＜0.01）。階層毎のまとめ、主成分分析、相関マトリクス調査、及びスポットランキングは、発現ソフトウエア（Genedata,Bersel,Swissland）を使用して実行された。
【００４７】
〈質量分析によるタンパク質同定〉
Cy3でラベルされたコントロールサンプルのイメージの少なくとも７５％に表れる１６６３個のタンパク質スポットを選択した。質量分析によりタンパク質スポットに対応する蛋白質が同定された。2D-PAGEにて分離されたCy5でラベルされたタンパク質はゲルプラグにリカバーされ、改良トリプシン（Promega,Madison,WI）にてまとめられた。質量分析は、ナノ・エレクトロスプレイイオン供給源(AMR,東京)を有するFinnigan(登録商標) LTQ(登録商標) linear イオントラップ質量分析装置(Thermo Electron, San Jose, CA)を使用した。マスコットソフトウエア（バージョン2.1,Matrix Science,London,UK）が使用され、SWISS-PROTデータベース（Homo sapiens,12867 sequence in Sprot 47.8 fasta file）に対するペプチドイオンピークの質量調査がなされた。３５又はそれ以上のマスコットスコアは、陽性タンパク質同定を示すものとみなされた。結果を図４に示す。２０個のタンパク質スポットが、２グループ間（P＜0.01）で重要な差異を有していた。
【００４８】
〈タンパク質の分類〉
また、同定されたタンパク質の機能分類は、下記表２に示すように、遺伝子オントロジーの分類に基づいた。
【００４９】
【表２】
【００５０】
質量分析装置を用いたタンパク質同定の結果、表２及び図４に示すように、セセルニン−１というタンパク質に由来するタンパク質スポット（セセルニン−１・スポット）が、２０個のスポット中に３個含まれていた。１２個のタンパク質スポットの強度は予後不良（P-SS）では減少しており、８個のタンパク質スポットの強度は予後不良（P-SS）では増加していた。
【００５１】
滑膜肉腫患者から得られた１３個の凍結腫瘍組織についてセセルニン−１の発現を調べたところ、セセルニン−１・スポットの濃度は、前述の予後不良であった５症例に低発現しており、予後良好であった８症例に高発現していた。
【００５２】
主成分分析により１３個の滑膜肉腫サンプルを正確に予後良好（G-SS）か予後不良（P-SS）グループに分類した。主成分分析とは、多変量で表されるデータの統計から一次結合で表現される新たな変量を構成し、互いに無相関な主成分に要約する方法である。図５に示すように、１３個のタンパク質スポットのプロファイルは同じグループのサンプル間では同様であったが、２つのグループ間では異なるものであった。以上より、セセルニン−１が滑膜肉腫の予後を予測するバイオマーカーとして使用できること示された。
【００５３】
(実施例２)
セセルニン−１の予後予測能をさらに検証する目的で、セセルニン−１に対する特異抗体を新規に作成し、免疫染色を４５症例に対して実施した。
【００５４】
〈抗体の生成〉
全長セセルニン−１のペプチド長３５４−３７０に対応するペプチドを合成し、そしてウサギを免疫化した。抗血清は、抗原ペプチドを使用する親和性カラムクロマトグラフィにより精製された。セセルニン−１の特異性はウエスタンブロットにより確認された。
【００５５】
４５の患者から治療前に４５のパラフィン標本組織を検査した。免疫組織化学で使用された患者の臨床情報は、下記表３及び表４にまとめる。
【００５６】
【表３】
【００５７】
【表４】
【００５８】
〈セセルニン−１に対する免疫組織化学〉
セセルニン−１の発現は、パラフィン標本組織を使用して免疫組織化学的に調べられた。４μｍ厚の組織切片が、１０ｍＭクエン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）にて、１２１℃で３０分間オートクレーブで処理され、セセルニン−１に対する抗体で培養された（1:200希釈）。免疫染色は、ダコ・エンビジョンシステム(エンビジョン・プラス標識:DAKO,CA)のビオチンフリー西洋ワサビペルオキシダーゼにて標識されて実行された。二人の認証病理学者（N.T及びD.K）が、臨床データ（年齢、性別、解剖結果）により陽性染色を決定した。抗セセルニン−１抗体に陽性である腫瘍細胞の２０％以上のケースがセセルニン−１陽性であるとされ、セセルニン−１陽性の２０％以下のケースがセセルニン−１陰性であるとされた。
【００５９】
〈分子分析〉
４５ケースのうちRNAサンプルが利用できる３１のケースにおいて、SYT-SSX1とSYT-SSX2との融合遺伝子を調査した。プライマーSYT 5′CAA CAG CAA GAT GCA TAC CA3′、SSX1 5′GGT GCA GTT GTT TCC CAT CG3′、及びSSX2 5′GGC ACA GCT CTT TCC CAT CA3′を使用する逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)により、全ての３１のケースが分析された。
【００６０】
上記表３及び表４に示すように、４５症例中、セセルニン−１陽性症例は２７症例（サンプルナンバーは、3,4,9,10,11,17,20,21,22,24,25,27,29,30,32,33,34,35,36,38,39,40,41,42,43,44,45）、セセルニン−１陰性症例は１８症例（サンプルナンバーは、1,2,5,6,7,8,12,13,14,15,16,18,19,23,26,28,31,37）だった。これらの症例について、治療開始後の転移とセセルニン−１の発現の相関を調べた。治療開始後の転移について臨床情報が得られたのは４５症例中全症例である。４５人の患者間で、１５人の患者が継続的に無病で生存し（continuous disease free（CDF)）、５人の患者が病気の確証無く生存し（no evidence disease (NED)）、３人の患者が病気の状態で生存し（alive with disease (AWD)）、２２人の患者が病気のために死亡した（dead of disease (DOD)）。
【００６１】
下記表５に示すように、転移はセセルニン−１陽性症例において２７症例中１２症例（４４．４％）であり、陰性症例では１８症例中１５症例（８３．３％）であった。セセルニン−１陽性腫瘍の患者と比較してセセルニン−１陰性腫瘍の患者は、極めて高い比率で転移が観測された（15/18 vs 12/27 cases, χ２:P=0.0140）。
【００６２】
【表５】
【００６３】
また、下記表６に示すように、死亡はセセルニン−１陽性症例において２７症例中９症例（３３．３％）、陰性症例では１８症例中１３症例（７２．２％）であった。免疫組織化学により、生存した２３人の患者のうち５人がセセルニン−１陰性であり、生存した２３人の患者のうち１８人がセセルニン−１陽性であった（χ２:P=0.0170）。
【００６４】
【表６】
【００６５】
次に、セセルニン-1の発現と、治療開始後５年間の無転移率及び生存率との関係を調べた。
【００６６】
〈統計学的解析〉
初期腫瘍の第１治療から、腫瘍特異的原因又は転移の存在に起因する死亡まで、腫瘍特異的及び転移無しで生存した期間が計算された。死亡発生ごとの生存率はKaplan-Meier法により計算された。ログランクテストを使用する単変量解析により、潜在的予後因子が同定された。独立予後因子が、Cox比例ハザードモデル及びステップワイズ法を使用して評価された。chi-squareテスト値に基づくモデルの一致に重度に貢献している場合にのみ、共分散分析がモデル中に選択された。Ｐ差＜０．０５が重要と判断された。統計学的分析はSPSS統計パッケージを使用して実行された（SPSS,Chicago,Illinois）。
【００６７】
図６は、生存率についてのログランクテストの結果である。下記表７及び図６に示すように、セセルニン−１に対する免疫反応性が陽性である患者の５年生存率は７７．６％であり、セセルニン−１に対する免疫反応性が陰性である患者の５年生存率は２１．８％であった（P=0.0015）。
【００６８】
図７は、無転移率についてのログランクテストの結果である。下記表７及び図７に示すように、無転移率はセセルニン−１の発現が陽性症例で６２．８％、陰性症例では１６．７％であった。セセルニン−１陰性腫瘍の患者と比較してセセルニン−１陽性腫瘍の患者は、極めて高い割合で５年無転移生存が観測された（62.8% vs 16.7%; P=0.0012）。
【００６９】
【表７】
【００７０】
以上より、セセルニン−１発現の有無は滑膜肉腫の生命予後に統計学的有意な相関を示しており、セセルニン−１は滑膜肉腫診断時における予後予測バイオマーカーとして有用であることが実証された。臨床現場では滑膜肉腫の診断時にセセルニン−１の発現を調べることで、滑膜肉腫患者の予後を正確に予測し、補助的化学療法の有無等の的確な治療法を選択することができ、緻密で最適化された個別化医療を可能にすることができる。滑膜肉腫を含めた軟部肉腫では必ず病理組織診断目的に原発組織より生検を行うため、本検査に使用する生検材料は患者に新たな負担をかけることなく採取できる。また、免疫染色はルーチンに行われている検査である。そのため、本発明による滑膜肉腫の予後予測は、臨床検査として実用化が容易であり、本発明によって多くの滑膜肉腫患者が極めて大きな恩恵を受けることが可能である。
【配列表フリーテキスト】
【００７１】
配列番号１〜３：プライマー
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セセルニン−１の使用、セセルニン−１を使用する滑膜肉腫の予後予測方法、及び、滑膜肉腫を患う患者の予後を予測するための検査用試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
滑膜肉腫（synovial sarcoma）は、四肢関節近傍に好発する悪性軟部腫瘍であり、組織学的には上皮性細胞と紡錘形細胞とからなる二相型biphasic typeと紡錘形細胞からなる単相型monophasictypeとに分類される。
【０００３】
滑膜肉腫は、一般的には極めて悪性度が高く、軟部腫瘍の中では悪性線維性組織球腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫に次いで発生頻度が高い腫瘍である。５年生存率は３０〜５０％、１０年生存率は１５〜３０％とする報告も有り、局所再発・転移ともに治療から時間が立ってから発生する症例も存在し、長期にわたる経過観察が必要な腫瘍である。
【０００４】
滑膜肉腫は、男女間の発生率に大きな性差は見られないものの、傾向として男性に若干多く発生する。発生年代としては、１０〜４０歳代に多く発生し、特に比較的若年者の１０〜２０代の若い人に発生しやすい。発生部位としては、大腿、膝関節部を主として下肢に好発し、関節包、滑液包、腱鞘、腱等に接して発生するものが多いが、これらの組織と関係しない頸部、体幹等にも発生することもある。
【０００５】
滑膜肉腫は、約半数の患者で痛みを伴い、その他は無症状であるが腫瘍はゆっくりと大きくなる。腫瘍は、比較的軟らかいものから硬いものまでまちまちである。
【０００６】
治療には広範切除術（腫瘍をできるだけ広めに正常組織で包むようにして切除する手術）を施すが、大関節付近に生じた症例では切離断術が適応とされる。また、神経や血管及び重要な筋肉の腱の周囲に発生することが多いため、これらをいっしょに切除しなければならないことが多く、機能を再建する手術が同時に必要となる。
【０００７】
また、遠隔転移の可能性があるため、腫瘍の手術切除の他に、補助化学療法が治療に用いられることが通例であり、一般的に３剤併用療法あるいは４剤併用療法が試みられている。
【０００８】
滑膜肉腫には、悪性増殖する予後不良群と、機構は不明ながら自然退縮する予後良好群とが存在する。滑膜肉腫には、局所再発・転移とも緩徐な例がしばしばあるため、術後最低でも１０年間の長期にわたる外来followが必要となることが通例であるが、予後を的確に予測できれば、より正確にfollow upの治療方針をたてることができる。
【０００９】
また、予後を正確に予測できれば、不必要な放射線治療や化学療法を避けることが可能となる。特に滑膜肉腫細胞は抗がん剤に対する感受性が低く、上記の化学療法の併用療法をもってしても著効が示されるには至っていない上に、化学療法は一定の割合で奏効性を示す一方で重篤な副作用も引き起こすことが報告されている。そのため、予後良好又は予後不良となる症例を事前に見極めることができれば、不必要な化学療法を避けることが可能となる利益は大きく、また患者のクオリティ・オブ・ライフ（QOL）に資する。
【００１０】
滑膜肉腫では、染色体転座t（X；18）（p11.2；q11.2）が高頻度に認められることが報告されている。切断点近傍のゲノムDNAの単離から、t（X；18）が染色体18q11.2に位置するSYT遺伝子と染色体Xp11.2に位置するSSX遺伝子を融合させ、これによりキメラタンパク質SYT-SSXが発現することが明らかになっている。SYT-SSXの発現は滑膜肉腫症例のほぼ全例で観察されているため、これは腫瘍発生において中心的な役割を果たすものと考えられる。SYT-SSX1やSYT-SSX2融合と、腫瘍の形態及び５年生存率との間には、ある程度の関連性があることが特許文献１に記載されている。
【００１１】
また、非特許文献１には、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によって、滑膜肉腫４５例(単相性３３人及び二相性１２人)のSYT-SSX融合転写物を分析し、関連する臨床及び病理データと比較した結果、SYT-SSX1及びSYT-SSX2融合転写物はそれぞれ、腫瘍の２９例（64%）及び１６例（36%）に検出され、局所腫瘍を有する患者３９人のKaplan-Meier法による分析では、SYT-SSX2を有する患者１５人は、SYT-SSX1を有する患者２４人より無転移生存率が有意に良好であることを示す（多変量解析によりP=0.03;相対危険度3.0）ことが記載されている。
【００１２】
また、非特許文献２には、凍結材料サンプル３３例について、SYT-SSX1/SSX2 融合遺伝子を検索したところ、SYT-SSX1は、SYT-SSX2に比し有意な予後不良因子（５年無転移生存率：SYT-SSX1 42％ VS SYT-SSX2 89％）であることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開２００３−２５２８０２号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】The New England Journal of Medicine 1998;338:153-60,川井章
【非特許文献２】Synovial sarcoma. A Scandinavian Sarcoma Group project,Acta Orthop Scand Suppl/291巻，1-28頁/2000年,Skytting B
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
上述の転座遺伝子SYT-SSXは、滑膜肉腫の９０％以上で特異的に発現することが知られているが、発現しない場合もある。
【００１６】
本発明は、新規で的確な滑膜肉腫の予後予測方法を提供するとともに、滑膜肉腫の予後を簡易且つ的確に予想できるセセルニン−１の使用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の第１の観点に係るセセルニン−１の使用は、滑膜肉腫の予後を予測するバイオマーカーとしての使用である。
【００１８】
前記予後は、例えば、外科手術、化学療法、放射線療法、温熱療法、及び免疫療法の少なくとも何れか一つを含む治療後である。
【００１９】
本発明の第２の観点に係る滑膜肉腫の予後予測方法は、セセルニン−１の発現量を測定し、前記セセルニン−１の発現量が上昇している場合、滑膜肉腫に対する予後が良好と予測することを特徴とする。
【００２０】
前記セセルニン−１の発現量の測定は、セセルニン−１特異的抗体を用いた免疫学的方法によって測定されることが好ましい。
【００２１】
前記免疫学的方法は、例えば、ウエスタンブロット法、免疫沈降法、ドットブロット法、スロットブロット法、及びELISA法から選ばれるいずれかの方法である。
【００２２】
前記予後は、例えば、外科手術、化学療法、放射線療法、温熱療法、及び免疫療法の少なくとも何れか一つを含む治療後である。
【００２３】
本発明の第３の観点に係る検査用試薬キットは、滑膜肉腫を患う患者の予後を予測するためのキットであって、前記患者から得られた試料におけるセセルニン−１の発現量を検出又は定量する手段を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、簡易かつ的確に、滑膜肉腫の予後を予測できる。そのため、術後の治療方針を正確にたてることで、follow upの治療期間を短縮することができ、緻密で最適化された個別化医療を可能にすることができる。また、不必要な放射線治療や化学療法を避けることが可能となり、更には滑膜肉腫の新規治療法の開発に有益である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】2D-DIGE法の工程を示す。
【図２】電気泳動実験のタンパク質スポットの検出を示す。
【図３】電気泳動分離実験の再現性を示す。
【図４】タンパク質スポットとタンパク質名との対応を示す。
【図５】主成分分析の結果を示す。
【図６】生存率についてのログランクテストを示す。
【図７】無転移率についてのログランクテストを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本実施形態においては、患者のセセルニン−１（secernin-1）の発現量を測定する。セセルニンには１〜３までのタイプがあるが、本発明では、セセルニン−１の発現量に着目する。
【００２７】
そして、セセルニン−１の発現量が上昇している場合、滑膜肉腫に対する予後が良好と予測する。
【００２８】
セセルニン−１の発現量の測定は、特に限定されるものではなく、単にセセルニン−１の有無を検出するものであってもよく、またセセルニン−１の発現量を相対的又は絶対的に決定するものでもよい。セセルニン−１の発現量の測定は、免疫学的手法によるのが好適であり、例えば、電気泳動法による分離と蛍光、酵素、放射性同位元素等による検出又は定量との組み合わせ（ウェスタンブロット法、蛍光二次元電気泳動法を含む）、免疫染色法（蛍光抗体法、酵素抗体法、重金属標識抗体法、放射性同位元素標識抗体法を含む）、酵素免疫測定吸着法（ELISA）、ドット・ブロッティング法等により行うことができる。本実施形態では、患者から生体組織を採取し、その生体組織内に含有されるタンパク質について電気泳動を行い、蛍光色素によりセセルニン−１の有無及び量を測定することによりなされる。
【００２９】
予後を予測できる治療は、特に限定されるものではないが、例えば外科手術、化学療法、放射線療法、温熱療法、又は免疫療法である。
【００３０】
滑膜肉腫の外科手術は、広範切除術が通例である。滑膜肉腫では、肉眼的に確認できる腫瘤の周囲に腫瘍細胞がしみこんでいるため、一見正常な周囲の組織を含めて大きく切除する必要があるためである。なお、広範切除術を行ったため、皮膚が大量になくなると、化学療法や放射線療法ができなくなるので、体の他の部分から血管をつけた皮膚を持って来る皮弁形成術を行う必要がある。
【００３１】
滑膜肉腫の化学療法は、一般的には、３剤併用療法あるいは４剤併用療法が試みられている。３剤併用療法の代表例は、例えばMAID療法（Mesna：副作用軽減剤、Adriacin：アドリアマイシン、Ifomide：イフォスファミド、Dacarbazine：ダカルバジン）である。また、４剤併用療法の代表例は、例えばCyVADIC療法（Cyclophosphamide：シクロフォスファミド、Vincristine：ビンクリスチン、Adriacin：アドリアマイシン、dacarbazine：ダカルバジン）である。
【００３２】
滑膜肉腫の放射線療法は、一般の放射線療法と同様に、照射体積の大きさにより、同じ照射線量でも生体反応（耐容線量）が全く異なり、放射線療法が単独で実施されるか、化学療法と併用されるか、手術の前か後かは治療医の判断によって調節される。腫瘍制御に必要な線量は、腫瘍の感受性により異なり、用量は例えば60〜70Gyである。用量としては、小線量を１日１回、週４〜５回照射する分割照射が多く行われ、分割照射の場合は、一回線量は例えば1.8〜2Gyである。
【００３３】
温熱療法は、熱を加えることで腫瘍の内部温度を上げ、癌を死滅させることを目的とした治療である。適用される温度は例えば４３℃程度であり、熱が加わった際に血管が拡張し血流が増加する正常な細胞と比べて、腫瘍細胞にはこの血管の拡張が無いため、熱を蓄積しやすい。
【００３４】
免疫療法は、身体が自然に有している疾患への防御機構への働きかけを向上させる治療法であり、通常は局所あるいは全身の免疫系を賦活させることで治療する。具体的には、抗腫瘍効果を持つリンパ球を用いた免疫療法、癌ワクチン療法、癌ワクチンテーラーメード治療、DNAワクチン療法、RNAワクチン療法等である。
【００３５】
本発明において予後が良好であるとは、５年以上の期間において無転移率又は生存率の統計学的有意差が存在することである。
【００３６】
本実施形態に係るキットは、滑膜肉腫を患う患者の予後を予測するための検査用試薬キットであり、患者から得られた試料におけるセセルニン−１の発現量を検出又は定量する手段を含む。免疫学的手法により検査を行う場合には、少なくとも抗セセルニン−１抗体が検査用試薬に含まれる。抗セセルニン−１抗体は、セセルニン−１の発現を検出しうる抗体であればよく、特に限定されないが、例えばモノクローナル及びポリクローナル抗体、標識化抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体並びにこれらの結合活性断片等が挙げられる。また検査用試薬キットには、上記抗体のほか検出用に用いる標識を含んでいてもよい。キットには、緩衝液、発色基質、二次抗体、ブロッキング剤等の試薬を含むことができる。
【００３７】
滑膜肉腫では、病理組織診断目的に原発組織により生検を行うことが普通であり、その際に生体組織を採取すれば、患者に新たな負担を強いることにはならない。
【００３８】
また、本実施形態に係る発明によれば、例えばウェスタンブロット装置の準備さえあれば、セセルニン−１の発現量の測定ができるため、簡易な手法にて滑膜肉腫の予後予測ができる。また、例えばセセルニン−１に特異的に発現する抗体を用いればウェスタンブロット以外の方法、例えば免疫染色によっても鋭敏にセセルニン−１の発現量の測定ができる。
【実施例】
【００３９】
（実施例１）
〈患者及び臨床情報〉
滑膜肉腫患者から得られた、１３個の凍結腫瘍組織を検査した。凍結腫瘍組織は、１３の滑膜肉腫の症例にて入手し、プロテオミクス解析にて使用された。診断及び分類は、軟組織腫瘍のＷＨＯ分類システムに基づいた。また、SYT-SSX1及びSYT-SSX2発現の検査も行った。結果を下記表１に示す。
【００４０】
【表１】
【００４１】
表１に示すように、滑膜肉腫サンプルは２つのグループに分類された。即ち、滑膜肉腫の予後不良（P-SS）として死亡した患者から採取した５つのサンプル（サンプルナンバーは、1,2,3,4,5である。）と、滑膜肉腫の予後良好（G-SS）として術後５年以内に転移がなかった８つのサンプル（サンプルナンバーは、6,7,8,9,10,11,12,13である。）とに分類された。なお、DOD（dead of disease）は病死、AWD（alive with disease）は病気状態での生存、NED（no evidence disease）は病気確証無しでの生存、CDF（continuous disease free）は無病生存を意味する。
【００４２】
〈タンパク質発現のプロファイリング〉
凍結サンプルは、液体窒素で冷却した後、クライオプレス（登録商標、マイクロテック・ニチオン,千葉，日本）で粉状に粉砕された。凍結サンプルは、urea lysis 緩衝液（６Ｍ ウレア, ２Ｍ チオウレア, ３％ CHAPS, １％ Triton X-100）にて調整された。１５,０００rpmにて３０分間遠心分離した後、上澄み液が取り出され、細胞タンパク質のソースとして使用された。
【００４３】
その後、2D-DIGE（2 Dimensional Fluorescence Difference Gel Electrophoresis）により泳動分離がなされた。2D-DIGE法は、泳動前に比較したいサンプルを異なる蛍光色素でラベルし、このラベル化したサンプルを混合してから電気泳動を行う手法である。図１は、2D-DIGE法の工程を示す工程図である。コントロールサンプル(internal control sample)は、全ての生検検体の一部を混合させて作成したものであり、５μｇ用いた。コントロールサンプルは、図１に示すように、Cy3(登録商標、CyDye DIGE Fluor saturation dye, GE Healthcare Biosciences, Uppsala, Sweden)によりラベルされた。また、夫々の生検検体は５μｇ用いられ、Cy5(登録商標、CyDye DIGE Fluor saturation dye, GE Healthcare Biosciences, Uppsala, Sweden)によりラベルされた。
【００４４】
第１次分離は、IPG緩衝液及びDryStripゲル(24 cm length, pI range between 4 and 7, GE Healthcare Biosciences)にて実行された。第２次分離は、大きめのゲル(38 cm length, Bio-craft, Itabashi, Tokyo, Japan)を使用し、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE：EttanDalt II GE Healthcare Biosciences)にて実行された。ゲルは、レーザー照射(Tyhoon Trio（登録商標）, GE Healthcare Biosciences)によりスキャンされた。全てのスポットにおいて、Cy5の強度はCy3の強度により初期化され、ゲル間の差はDeCyderイメージソフトウェア（GE Healthcare Biosciences）により補正された。結果を図２に示す。
【００４５】
図３は、電気泳動分離実験の再現性を示す。図３に示すように、同一サンプルにつき、３回の独立した電気泳動分離実験(exp1,exp2,exp3)を比較することにより、再現性が存在することが実証された。散乱プロット解析により、スポットの９６％以上の標準強度が、２倍差（2 fold difference）の範囲内であった。
【００４６】
〈データ分析〉
タンパク質スポットの強度は統計学的に２グループ間において有意差が認められた（Wilcoxon test P値＜0.01）。階層毎のまとめ、主成分分析、相関マトリクス調査、及びスポットランキングは、発現ソフトウエア（Genedata,Bersel,Swissland）を使用して実行された。
【００４７】
〈質量分析によるタンパク質同定〉
Cy3でラベルされたコントロールサンプルのイメージの少なくとも７５％に表れる１６６３個のタンパク質スポットを選択した。質量分析によりタンパク質スポットに対応する蛋白質が同定された。2D-PAGEにて分離されたCy5でラベルされたタンパク質はゲルプラグにリカバーされ、改良トリプシン（Promega,Madison,WI）にてまとめられた。質量分析は、ナノ・エレクトロスプレイイオン供給源(AMR,東京)を有するFinnigan(登録商標) LTQ(登録商標) linear イオントラップ質量分析装置(Thermo Electron, San Jose, CA)を使用した。マスコットソフトウエア（バージョン2.1,Matrix Science,London,UK）が使用され、SWISS-PROTデータベース（Homo sapiens,12867 sequence in Sprot 47.8 fasta file）に対するペプチドイオンピークの質量調査がなされた。３５又はそれ以上のマスコットスコアは、陽性タンパク質同定を示すものとみなされた。結果を図４に示す。２０個のタンパク質スポットが、２グループ間（P＜0.01）で重要な差異を有していた。
【００４８】
〈タンパク質の分類〉
また、同定されたタンパク質の機能分類は、下記表２に示すように、遺伝子オントロジーの分類に基づいた。
【００４９】
【表２】
【００５０】
質量分析装置を用いたタンパク質同定の結果、表２及び図４に示すように、セセルニン−１というタンパク質に由来するタンパク質スポット（セセルニン−１・スポット）が、２０個のスポット中に３個含まれていた。１２個のタンパク質スポットの強度は予後不良（P-SS）では減少しており、８個のタンパク質スポットの強度は予後不良（P-SS）では増加していた。
【００５１】
滑膜肉腫患者から得られた１３個の凍結腫瘍組織についてセセルニン−１の発現を調べたところ、セセルニン−１・スポットの濃度は、前述の予後不良であった５症例に低発現しており、予後良好であった８症例に高発現していた。
【００５２】
主成分分析により１３個の滑膜肉腫サンプルを正確に予後良好（G-SS）か予後不良（P-SS）グループに分類した。主成分分析とは、多変量で表されるデータの統計から一次結合で表現される新たな変量を構成し、互いに無相関な主成分に要約する方法である。図５に示すように、１３個のタンパク質スポットのプロファイルは同じグループのサンプル間では同様であったが、２つのグループ間では異なるものであった。以上より、セセルニン−１が滑膜肉腫の予後を予測するバイオマーカーとして使用できること示された。
【００５３】
(実施例２)
セセルニン−１の予後予測能をさらに検証する目的で、セセルニン−１に対する特異抗体を新規に作成し、免疫染色を４５症例に対して実施した。
【００５４】
〈抗体の生成〉
全長セセルニン−１のペプチド長３５４−３７０に対応するペプチドを合成し、そしてウサギを免疫化した。抗血清は、抗原ペプチドを使用する親和性カラムクロマトグラフィにより精製された。セセルニン−１の特異性はウエスタンブロットにより確認された。
【００５５】
４５の患者から治療前に４５のパラフィン標本組織を検査した。免疫組織化学で使用された患者の臨床情報は、下記表３及び表４にまとめる。
【００５６】
【表３】
【００５７】
【表４】
【００５８】
〈セセルニン−１に対する免疫組織化学〉
セセルニン−１の発現は、パラフィン標本組織を使用して免疫組織化学的に調べられた。４μｍ厚の組織切片が、１０ｍＭクエン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）にて、１２１℃で３０分間オートクレーブで処理され、セセルニン−１に対する抗体で培養された（1:200希釈）。免疫染色は、ダコ・エンビジョンシステム(エンビジョン・プラス標識:DAKO,CA)のビオチンフリー西洋ワサビペルオキシダーゼにて標識されて実行された。二人の認証病理学者（N.T及びD.K）が、臨床データ（年齢、性別、解剖結果）により陽性染色を決定した。抗セセルニン−１抗体に陽性である腫瘍細胞の２０％以上のケースがセセルニン−１陽性であるとされ、セセルニン−１陽性の２０％以下のケースがセセルニン−１陰性であるとされた。
【００５９】
〈分子分析〉
４５ケースのうちRNAサンプルが利用できる３１のケースにおいて、SYT-SSX1とSYT-SSX2との融合遺伝子を調査した。プライマーSYT 5′CAA CAG CAA GAT GCA TAC CA3′、SSX1 5′GGT GCA GTT GTT TCC CAT CG3′、及びSSX2 5′GGC ACA GCT CTT TCC CAT CA3′を使用する逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)により、全ての３１のケースが分析された。
【００６０】
上記表３及び表４に示すように、４５症例中、セセルニン−１陽性症例は２７症例（サンプルナンバーは、3,4,9,10,11,17,20,21,22,24,25,27,29,30,32,33,34,35,36,38,39,40,41,42,43,44,45）、セセルニン−１陰性症例は１８症例（サンプルナンバーは、1,2,5,6,7,8,12,13,14,15,16,18,19,23,26,28,31,37）だった。これらの症例について、治療開始後の転移とセセルニン−１の発現の相関を調べた。治療開始後の転移について臨床情報が得られたのは４５症例中全症例である。４５人の患者間で、１５人の患者が継続的に無病で生存し（continuous disease free（CDF)）、５人の患者が病気の確証無く生存し（no evidence disease (NED)）、３人の患者が病気の状態で生存し（alive with disease (AWD)）、２２人の患者が病気のために死亡した（dead of disease (DOD)）。
【００６１】
下記表５に示すように、転移はセセルニン−１陽性症例において２７症例中１２症例（４４．４％）であり、陰性症例では１８症例中１５症例（８３．３％）であった。セセルニン−１陽性腫瘍の患者と比較してセセルニン−１陰性腫瘍の患者は、極めて高い比率で転移が観測された（15/18 vs 12/27 cases, χ２:P=0.0140）。
【００６２】
【表５】
【００６３】
また、下記表６に示すように、死亡はセセルニン−１陽性症例において２７症例中９症例（３３．３％）、陰性症例では１８症例中１３症例（７２．２％）であった。免疫組織化学により、生存した２３人の患者のうち５人がセセルニン−１陰性であり、生存した２３人の患者のうち１８人がセセルニン−１陽性であった（χ２:P=0.0170）。
【００６４】
【表６】
【００６５】
次に、セセルニン-1の発現と、治療開始後５年間の無転移率及び生存率との関係を調べた。
【００６６】
〈統計学的解析〉
初期腫瘍の第１治療から、腫瘍特異的原因又は転移の存在に起因する死亡まで、腫瘍特異的及び転移無しで生存した期間が計算された。死亡発生ごとの生存率はKaplan-Meier法により計算された。ログランクテストを使用する単変量解析により、潜在的予後因子が同定された。独立予後因子が、Cox比例ハザードモデル及びステップワイズ法を使用して評価された。chi-squareテスト値に基づくモデルの一致に重度に貢献している場合にのみ、共分散分析がモデル中に選択された。Ｐ差＜０．０５が重要と判断された。統計学的分析はSPSS統計パッケージを使用して実行された（SPSS,Chicago,Illinois）。
【００６７】
図６は、生存率についてのログランクテストの結果である。下記表７及び図６に示すように、セセルニン−１に対する免疫反応性が陽性である患者の５年生存率は７７．６％であり、セセルニン−１に対する免疫反応性が陰性である患者の５年生存率は２１．８％であった（P=0.0015）。
【００６８】
図７は、無転移率についてのログランクテストの結果である。下記表７及び図７に示すように、無転移率はセセルニン−１の発現が陽性症例で６２．８％、陰性症例では１６．７％であった。セセルニン−１陰性腫瘍の患者と比較してセセルニン−１陽性腫瘍の患者は、極めて高い割合で５年無転移生存が観測された（62.8% vs 16.7%; P=0.0012）。
【００６９】
【表７】
【００７０】
以上より、セセルニン−１発現の有無は滑膜肉腫の生命予後に統計学的有意な相関を示しており、セセルニン−１は滑膜肉腫診断時における予後予測バイオマーカーとして有用であることが実証された。臨床現場では滑膜肉腫の診断時にセセルニン−１の発現を調べることで、滑膜肉腫患者の予後を正確に予測し、補助的化学療法の有無等の的確な治療法を選択することができ、緻密で最適化された個別化医療を可能にすることができる。滑膜肉腫を含めた軟部肉腫では必ず病理組織診断目的に原発組織より生検を行うため、本検査に使用する生検材料は患者に新たな負担をかけることなく採取できる。また、免疫染色はルーチンに行われている検査である。そのため、本発明による滑膜肉腫の予後予測は、臨床検査として実用化が容易であり、本発明によって多くの滑膜肉腫患者が極めて大きな恩恵を受けることが可能である。
【配列表フリーテキスト】
【００７１】
配列番号１〜３：プライマー
【特許請求の範囲】
【請求項１】
滑膜肉腫の予後を予測するバイオマーカーとしてのセセルニン−１（secernin-1）の使用。
【請求項２】
前記予後は、外科手術、化学療法、放射線療法、温熱療法、及び免疫療法の少なくとも何れか一つを含む治療後であることを特徴とする請求項１記載のセセルニン−１の使用。
【請求項３】
セセルニン−１（secernin-1）の発現量を測定し、前記セセルニン−１の発現量が上昇している場合、滑膜肉腫に対する予後が良好と予測することを特徴とする滑膜肉腫の予後予測方法。
【請求項４】
前記セセルニン−１の発現量の測定は、セセルニン−１特異的抗体を用いた免疫学的方法によって測定されることを特徴とする請求項３記載の滑膜肉腫の予後予測方法。
【請求項５】
前記免疫学的方法が、ウェスタンブロット法、蛍光二次元電気泳動法、蛍光抗体法、酵素抗体法、重金属標識抗体法、放射性同位元素標識抗体法、酵素免疫測定吸着法（ELISA）、又はドット・ブロッティング法から選ばれるいずれかの方法であることを特徴とする請求項４記載の滑膜肉腫の予後予測方法。
【請求項６】
前記予後は、外科手術、化学療法、放射線療法、温熱療法、及び免疫療法の少なくとも何れか一つを含む治療後であることを特徴とする請求項３乃至５の何れか１項に記載の滑膜肉腫の予後予測方法。
【請求項７】
滑膜肉腫を患う患者の予後を予測するためのキットであって、前記患者から得られた試料におけるセセルニン−１（secernin-1）の発現量を検出又は定量する手段を含む検査用試薬キット。
【請求項１】
滑膜肉腫の予後を予測するバイオマーカーとしてのセセルニン−１（secernin-1）の使用。
【請求項２】
前記予後は、外科手術、化学療法、放射線療法、温熱療法、及び免疫療法の少なくとも何れか一つを含む治療後であることを特徴とする請求項１記載のセセルニン−１の使用。
【請求項３】
セセルニン−１（secernin-1）の発現量を測定し、前記セセルニン−１の発現量が上昇している場合、滑膜肉腫に対する予後が良好と予測することを特徴とする滑膜肉腫の予後予測方法。
【請求項４】
前記セセルニン−１の発現量の測定は、セセルニン−１特異的抗体を用いた免疫学的方法によって測定されることを特徴とする請求項３記載の滑膜肉腫の予後予測方法。
【請求項５】
前記免疫学的方法が、ウェスタンブロット法、蛍光二次元電気泳動法、蛍光抗体法、酵素抗体法、重金属標識抗体法、放射性同位元素標識抗体法、酵素免疫測定吸着法（ELISA）、又はドット・ブロッティング法から選ばれるいずれかの方法であることを特徴とする請求項４記載の滑膜肉腫の予後予測方法。
【請求項６】
前記予後は、外科手術、化学療法、放射線療法、温熱療法、及び免疫療法の少なくとも何れか一つを含む治療後であることを特徴とする請求項３乃至５の何れか１項に記載の滑膜肉腫の予後予測方法。
【請求項７】
滑膜肉腫を患う患者の予後を予測するためのキットであって、前記患者から得られた試料におけるセセルニン−１（secernin-1）の発現量を検出又は定量する手段を含む検査用試薬キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１１−１２７９５５（Ｐ２０１１−１２７９５５Ａ）
【公開日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２８５０４５（Ｐ２００９−２８５０４５）
【出願日】平成２１年１２月１６日（２００９．１２．１６）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月１６日（２００９．１２．１６）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
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