センサ基板及びバイオセンサ
【課題】異常反射の変化率が金より大きいセンサ基板を提供する。
【解決手段】光に対する異常反射の反射率変化から吸着又は結合する対象分子３を検出するセンサ基板１であって、金等の非酸化性金属を基礎成分とし、銀等の酸化性金属又は酸化銀等の金属酸化物を含む、波長３８０ないし５００ｎｍのいずれかの光に対して非酸化性金属より実部が大きく虚部が小さい所定の範囲の複素誘電率を呈する。
【解決手段】光に対する異常反射の反射率変化から吸着又は結合する対象分子３を検出するセンサ基板１であって、金等の非酸化性金属を基礎成分とし、銀等の酸化性金属又は酸化銀等の金属酸化物を含む、波長３８０ないし５００ｎｍのいずれかの光に対して非酸化性金属より実部が大きく虚部が小さい所定の範囲の複素誘電率を呈する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はセンサ基板及びバイオセンサに関する。詳しくは、異常反射を用いて検出対象物質を高感度に検出するためのセンサ基板及びバイオセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡや蛋白質などのバイオセンシングは、検出対象分子（アナライト）に特異的な相互作用を有するリガンド分子を金などの基板や微粒子上に塗布し、そこへのアナライトの結合の有無を検出する。
【０００３】
図１１はバイオセンシングの原理を説明するための図である。金などのセンサ基板１上に検出対象分子２（ａｎａｌｙｔｅ：アナライト）に相補的な（親和性の強い）分子３（ｌｉｇａｎｄ：リガンド）の分子層を形成する。この基板１を試料溶液中に浸した際に、アナライト２があれば、その相互作用（親和力）により選択的にリガンド３に吸着又は結合する。アナライト２とリガンド３は互いに相補的であるため鍵と鍵穴のような関係になっており、相補的な物質同士の相互作用は大変強力であるが、相補的でない物質同士の相互作用は非常に弱い。センサ基板１に光を照射し、相補的な分子の吸着や結合による屈折率変化などを反射光強度、散乱光強度、共鳴波長などの光信号の変化により検出する。たとえば、リガンド３としてオリゴヌクレオチドを用いれば、相補的な塩基配列を持つオリゴＤＮＡがハイブリダイゼーションを起し、その検出ができる。また、リガンド３として抗体を用いた実験では、検出対象となる抗リガンド抗体を高感度に検出することが可能である。同様の原理で、脂質−タンパク質、糖−タンパク質の相互作用の検出も可能であり、この手法の汎用性は高い。
【０００４】
アナライト２の結合量は１ｎｇ／ｍｍ２以下であり非常に少ない。結合に伴う反射率変化は小さく、通常の光学的手法でそれを検出することは困難である。そのため、表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：ＳＰＲ）や金ナノ微粒子中の局在プラズモン共鳴（ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：ＬＰＲ）などを用いて増感が行なわれてきた。ＳＰＲを用いたバイオセンシングでは、一般に全反射減衰法（ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｔｏｔａｌ ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＲ）を用いてプリズム底面に堆積された金属薄膜中に生じる伝搬型表面プラズモン（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎｓ：ＳＰｓ）を励起する。かかる手法を以下ＡＴＲ−ＳＰＲと呼ぶ。
【０００５】
図１２は従来の全反射減衰法（ＡＴＲ）によるバイオセンサを説明するための図である。図１２（ａ）にバイオセンサ１０Ａの構成例を示す。プリズム５の底面に金等の金属薄膜６（例えば４６．５ｎｍ厚）が堆積され、金属薄膜６の表面にはリガンド３が固定されている。このバイオセンサ１０Ａを容器に入れて、容器に検出対象分子（アナライト）２を含む試料を注入する。プリズム５の底面に対する法線から入射角θ（全反射が起こる条件）で入射光７を入射する。ｐ−偏光の光の反射率は、共鳴角θｒで最小となり、表面プラズモン共鳴により金属薄膜６の表面に表面プラズモン（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎｓ：ＳＰｓ）８が生成され、入射光７のエネルギーは薄膜中の表面プラズモン８に変換され、反射光９の反射率が減少する。反射光９を光検出器で検出する。図１２（ｂ）に光の入射角θと反射率Ｒの関係を示す。共鳴角θｒは金属薄膜６近傍の屈折率や物質の有無に敏感であるため、その表面をあらかじめリガンド３で修飾しておけばアナライト２の結合を共鳴角変化Δθｒとして読み取ることができる。例えば屈折率が１．５で厚さが１ｎｍの超薄膜が表面に吸着することにより、共鳴角は高角度側へ約０．２度シフトし、反射率に差が生じる。この表面プラズモンセンサ１０Ａは高感度であり、超薄膜試料に蛍光色素などのラベルを用いなくても単分子層以下のアナライト２の吸着や脱離を観測可能である。
【０００６】
この方法を利用したバイオセンサはすでに市販品も多く、現在では生化学や遺伝子工学の分野では欠くことのできないツールとなっている。しかしながら、固定化された光学系が必要であり全反射減衰法を用いなければならず他の測定手法との組み合わせに制限がある、金の膜厚が４５〜５５ｎｍの間でなければ高感度の測定が難しいなどの改良すべき点も多い。他方、ＬＰＲは金ナノ微粒子や粗い金属表面などに励起される表面プラズモンである。ＡＴＲ−ＳＰＲとは異なり、ＬＰＲを励起するためには微粒子に光を照射すればよい。特定の入射角で光を入射する必要がないため固定化された光学系を組む必要がなく、市販の分光器を用いて透過や反射、散乱スペクトル測定を行うことによりセンシング可能であるなどの利点がある。
【０００７】
数年前に発明者達は、青や紫の光に対する金表面の反射率が５０％以下となることを利用して、単純な反射測定でＤＮＡや蛋白質の検出が可能であることを示した。金は金属であるが、光学的には青や紫の光に対しては誘電体的な性質を示す。そのため、青や紫の光に対する反射率は５０％程度であり、それゆえ黄色がかった色を呈する。これらの光に対する金表面の反射率は、物質の吸着や結合に伴い比較的大きく低下する。例えば、空気中で金の表面は波長４７０ｎｍの光に対して１ｎｇ／ｍｍ２の分子の結合により約１．３％の反射率変化を与える。これを金の異常反射（ａｎｏｍａｌｏｕｓ ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＲ）という。金の異常反射（ＡＲ）を利用した分子間相互作用測定法は、波長５００ｎｍ以下の光を入射して金の反射率が低下する現象を利用したもので、金表面上に分子膜が生成すると、分子と金表面の間に多重反射が起こることにより、結合量を高い感度で検知できる。銀やアルミニウムなどの金属の場合には可視光領域では１ｎｇ／ｍｍ２の分子の結合による反射率変化は０．０２％程度である。金でも、赤や黄色の光に対しては同程度の反射率変化を示すが、青や紫の光に対しては、金属的というよりはむしろ誘電体的な反射応答をするためにこのような現象が起こる。（非特許文献１、非特許文献２参照）
【０００８】
【非特許文献１】Ｍｉｔｓｕａｋｉ Ｗａｔａｎａｂｅ ａｎｄ Ｋｏｔａｒｏ Ｋａｊｉｋａｗａ，“Ａｎ ｏｐｔｉｃａｌ ｆｉｂｅｒ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｎｏｍａｌｏｕｓ ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｏｌｄ” Ｓｅｎｓ．Ａｃｔｕａｔｏｒｓ Ｂ８９ （２００３） １２６−１３０．
【非特許文献２】Ｓ．Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｋ．Ｕｓｕｉ，Ｋ．−Ｙ．Ｔｏｍｉｚａｋｉ，Ｋ．Ｋａｊｉｋａｗａ，Ｈ．Ｍｉｈａｒａ，“Ａｎｏｍａｌｏｕｓ Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｏｌｄ Ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｆｏｒ ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｃｈｉｐ Ｐｌａｔｆｏｒｍ” Ｍｏｌ．ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ １ （２００５） ３６３−３６５．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
局在型表面プラズモン（ＬＰＲ）において、定量的な測定をするためには、あらかじめ検量線を作る必要がある、分子のサイズにより感度の補正が必要であるなどの問題があった。
【００１０】
他方、異常反射（ＡＲ）は、垂直入射でも斜め入射でもよく、金薄膜の膜厚制限も無い。そのため、垂直入射での単純な反射率測定により金表面に結合、吸着した微量物質を定量的に計測することが可能であり、測定光学系の構成も簡易にできる。また、入射光の単色性もあまり問題とならないため発光ダイオード（ｌｉｇｈｔ ｅｍｉｔｔｉｎｇ ｄｉｏｄｅ：ＬＥＤ）などのインコヒーレント光源を利用できるので、装置の小型化、低コスト化も容易である。金を用いた場合には感度はＳＰＲと比べて幾分劣るが、単純な光学系を用いるため様々な使い方が可能である。空気中で１ｎｇ／ｍｍ２の分子の結合によりＡＴＲ−ＳＰＲでは最大１２％の反射率変化を得られるが、金表面でのＡＲでの反射率変化は約１．３％である。金表面でのＡＲは感度が低いことが欠点であるが、発明者達は、これを改善する金属合金や金属と金属酸化物、誘電体などとの混合材料を生み出すことを検討した。
【００１１】
本発明は、異常反射の変化率が金より大きいセンサ基板を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記課題を解決するために、本発明による第１の態様のセンサ基板１は、例えば図３に示すように、光に対する異常反射の反射率変化から吸着又は結合する対象物質２を検出するセンサ基板１であって、金等の非酸化性金属を基礎成分とし、銀等の酸化性金属又は酸化銀等の金属酸化物を含む、波長３８０ないし５００ｎｍのいずれかの光に対して非酸化性金属より実部が大きく虚部が小さい所定の範囲の複素誘電率を呈する。
【００１３】
ここにおいて、非酸化性金属と酸化性金属又は金属酸化物とは、粒子混合構造で（粒状で混じり合って）も良く、２相混合構造で（２相が相互に入り乱れて混じり合って）も良く（１つの相が他の相内に分散している分散構造を含む）、合金構造で（合金として混じり合って）も良く、積層構造で（交互に積層されて交じり合って）も良い。また、酸化性金属がセンサ基板表面に露出している場合は露出面が酸化されていても良く（大気中では自然酸化される）、粒状で存在する場合は粒表面が酸化されていても良い。また、酸化は意図的になされても良く、自然酸化でも良い。また、金属酸化物は金属全体が酸化されていても良く、一部が酸化されていても良い。また、波長３８０ないし５００ｎｍの任意の波長で所定の範囲の複素誘電率を満たせば良いが、全範囲で満たしても良く、一部の範囲で満たしても良い。このように構成すると、センサ基板は非酸化性金属より実部が大きく虚部が小さい所定の範囲の複素誘電率を有するために、異常反射の反射率変化が大きくなり、高感度のセンサ基板を提供できる。なお、所定の範囲については第６の態様を参照されたい。
【００１４】
また、本発明による第２の態様は、第１の態様のセンサ基板において、非酸化性金属が金であり、酸化性金属が銀であるか又は金属酸化物が酸化銀であって、金と銀の重量比が１００対１から５０対５０である。
このように構成すると、金と銀の合金でセンサ基板を構成でき、高感度のセンサ基板を容易に提供できる。
【００１５】
また、本発明による第３の態様のセンサ基板は、光に対する異常反射の反射率変化から吸着又は結合する対象物質２を検出するセンサ基板１であって、金等の非酸化性金属を基礎成分とし、シリコン酸化物、フッ化マグネシウム等の誘電体を含む、波長３８０ないし５００ｎｍのいずれかの光に対して非酸化性金属より実部が大きく虚部が小さい所定の範囲の複素誘電率を呈する。
このように構成すると、誘電体の存在により、センサ基板は非酸化性金属より実部が大きく虚部が小さい複素誘電率を有するために、異常反射の反射率変化が大きくなり、高感度のセンサを提供できる。
【００１６】
また、本発明による第４の態様は、第３の態様のセンサ基板において、非酸化性金属と前記誘電体の組み合わせは、粒子混合構造、２相混合構造（分散構造を含む）又は積層構造である。
ここにおいて各構造については第１の態様を参照されたい。また、交互積層膜の膜厚は反射光間の干渉が無いように波長に比べて十分小さくすることが好ましい。このように構成すると、誘電体を含むセンサ基板を上記いずれかの構造で比較的容易に作製できる。
【００１７】
また、本発明による第５の態様のセンサ基板は、光に対する異常反射の反射率変化から吸着又は結合する対象物質２を検出するセンサ基板１であって、金等の非酸化性金属からなり、又は非酸化性金属を基礎成分とし、多孔性構造とすることにより、波長３８０ないし５００ｎｍのいずれかの光に対して非酸化性金属より実部が大きく虚部が小さい所定の範囲の複素誘電率を呈する。
ここにおいて、多孔性構造は空孔を多数有する構造でも良く、粒子混合構造で粒子間に局在化した多数の空隙が存在する構造でも良い。空孔は光の散乱が無いように波長に比して充分小さくすることが好ましい。このように構成すると、多孔性構造により、センサ基板は誘電率１の空孔を多数有するために、異常反射の反射率変化が大きくなり、高感度のセンサを提供できる。
【００１８】
また、本発明による第６の態様は、第１ないし第５の態様のセンサ基板において、非酸化性金属が金であり、所定の範囲は実部が−１ないし３、虚部が０．３ないし４．５である。
このように構成すると、図２より略１．５％以上の反射率変化ΔＲが得られ好適である。所定の範囲を実部が０ないし２、虚部が０．３ないし３とすると、略２％以上の反射率変化ΔＲが得られなお好適である。所定の範囲を実部が０ないし２、虚部が０．３ないし２とすると、略３％以上の反射率変化ΔＲが得られさらに好適である。
【００１９】
また、本発明による第７の態様のバイオセンサ１０は、第１ないし第６の態様のセンサ基板を備え、センサ基板１表面にリガンド３を形成したものである。
このように構成すると、高感度のセンサ基板を用いて、高感度のバイオセンサを提供できる。
【００２０】
また、本発明による第８の態様のバイオセンサの製造方法は、例えば図４に示すように、第１ないし第４の態様のセンサ基板１として金等の非酸化性金属を基礎成分とし、銀等の酸化性金属、酸化銀等の金属酸化物又はシリコン酸化物、フッ化マグネシウム等の誘電体を含むものを堆積して形成する工程（Ｓ００１）と、センサ基板１の表面に自己組織化単分子層４（図５参照）を浸漬法により形成する工程（Ｓ００２）と、自己組織化単分子層４を浸漬法によりリガンド化する工程（Ｓ００３）とを備える。
ここにおいて、センサ基板の堆積は、例えば、蒸着、スパッタリング、気相成長、沈積により可能である。このように構成すると、高感度のバイオセンサを容易に製造できる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、異常反射の変化率が金より大きいセンサ基板を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
［異常反射の反射率変化］
図１はセンサ基板１からの異常反射を説明するための図である。図１（ａ）にセンサ基板表面の媒質の配置を示す。媒質Ｍ１は通常空気、あるいは水であり屈折率ｎ１とする。媒質Ｍ２はバイオセンシングする対象物質（ＤＮＡや蛋白質など）であり、屈折率ｎ２、膜厚ｄ２の連続誘電体媒質とみなす。媒質Ｍ３は屈折率ｎ３の金属媒質であり、ｎ３は複素数である。７は入射光、９は反射光である。図１（ａ）の配置を用いて光の反射を計算する。図１（ｂ）に屈折率ｎ２＝１．５の媒質Ｍ２が媒質Ｍ３としての金に吸着した際の金表面の反射率変化ΔＲの波長依存性を示す。媒質Ｍ２が存在しない場合の反射率をＲ０、存在する場合の反射率をＲ、反射率変化ΔＲ＝（Ｒ−Ｒ０）／Ｒ０とし、反射率Ｒを光波長に対してプロットしたものである。金の誘電率は、非特許文献３（Ｐ．Ｂ．Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｒ．Ｗ．Ｃｒｉｓｔｙ，“Ｏｐｔｉｃａｌ Ｃｏｎｓｔａｎｔｓ ｏｆ Ｎｏｂｌｅ Ｍｅｔａｌｓ”，Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．６（１９７２）４７３０−４３７９）の値を基に補間計算した。波長５００ｎｍ以下の領域において媒質Ｍ２の吸着により約１．２５％の反射率変化が生じることがわかる。一方、波長７００ｎｍ付近の長波長領域では媒質Ｍ２が吸着しても反射率変化は無視できるほど小さい。これは、金に波長５００ｎｍ以下の光を入射すると金の反射率が低下するという異常反射（ＡＲ）の現象に基づくものであり、金の表面上に分子膜が生成すると、分子膜と金表面の間に多重反射が起こることにより、反射率変化が増大される。通常、反射率変化は膜厚に比例するので（非特許文献１参照）、これにより、分子膜の結合量を高い感度で検知できる。
【００２３】
図２は反射率変化ΔＲを媒質Ｍ３の誘電率ε３の実部、虚部に対してプロットした図である。ここで、媒質Ｍ２の屈折率ｎ２＝１．５、膜厚ｄ２＝１．０ｎｍとした。誘電率εと屈折率ｎの間にはε＝ｎ２の関係がある。明度が低い部分ほど反射率変化が大きい。非特許文献３の値から計算した波長４７０ｎｍにおける金Ａｕと銀Ａｇの誘電率を図中の○印で示した。Ａｇでは反射率変化ΔＲ＝約０．２％と小さいが、Ａｕでは反射率変化ΔＲ＝約１．２％と大きい。さらに、発明者達は、媒質Ｍ３の誘電率ε３を矢印の方向に制御できれば、より一層大きな反射率変化ΔＲが得られ、高い感度でＡＲを用いたセンサ基板を作成できることに注目した。
【００２４】
図２の矢印で示すような、媒質Ｍ３としての金等の非酸化性金属より実部が大きく虚部が小さい所定の範囲の複素誘電率を呈するセンサ基板を作製し、媒質Ｍ２としてのバイオ由来分子が結合すれば大きな反射率の変化が生じるので、バイオ由来分子を高感度で検出できる。所定の範囲を実部が−１ないし３、虚部が０．３ないし４．５であるとすると、図２より略１．５％以上の反射率変化ΔＲが得られ好適である。所定の範囲を実部が０ないし２、虚部が０．３ないし３とすると、略２％以上の反射率変化ΔＲが得られなお好適である。所定の範囲を実部が０ないし２、虚部が０．３ないし２とすると、略３％以上の反射率変化ΔＲが得られさらに好適である。異常反射の反射率変化の測定は簡単な光学系で構成できるので、バイオセンシングチップやその検出システムの低コスト化が可能となる。これまで、この種の検査には表面プラズモン共鳴が広く用いられているが、異常反射の反射率変化の大きいセンサ基板や当該基板を用いたバイオセンサを供給できれば、表面プラズモン共鳴に代替してバイオセンシングに使用できる可能性がある。
【００２５】
〔第１の実施の形態〕
図３に第１の実施の形態におけるバイオセンサ１０の構成例を示す。センサ基板１は、光に対する異常反射の反射率変化から吸着又は結合する対象物質（アナライト）２を検出するためのものである。センサ基板１表面にアナライト２に相補的なリガンド３を形成する。センサ基板１は金Ａｕ等の非酸化性金属を基礎成分とし、銀Ａｇ等の酸化性金属を含むものであれば良いが、本実施の形態では、センサ基板１は、ＡｕとＡｇの合金で作成し、Ａｇを酸化したものである。酸化方法は空気中の酸素による自然酸化でも良く、紫外線照射でオゾンを発生させて酸化しても良い。Ａｇ自体の誘電率は図２に示すように負の値を有するが、Ａｇの酸化物は一般に誘電体であり、誘電率は正の値を有する。そのため、Ａｕを基礎成分としＡｇを含む媒質Ｍ３としてのセンサ基板１の誘電率εは、Ａｇの酸化により図２の矢印の方向に変化する。すなわち、波長３８０ないし５００ｎｍの光に対して、非酸化性金属であるＡｕより実部が大きく虚部が小さい所定の範囲の複素誘電率を呈するように変化する。そのため、大きな反射率変化ΔＲを有するセンサ基板１を作製できる。センサ基板１は例えば石英板、ガラス板、プラスチック板等のチップ１１上或いはガラスファイバ等の端面に作製される。また、このセンサ基板１を用いてバイオセンサ１０を構成すれば、高感度のバイオセンサを供給できる。
【００２６】
図４に本実施の形態におけるバイオセンサの製造方法の例を示す。なお、バイオセンサの構成については図３を参照されたい。まず、ガラス板１１等のチップ上にセンサ基板１として金Ａｕ等の非酸化性金属と銀Ａｇ等の酸化性金属の合金を堆積して形成すれば良いが、ここでは、ＡｕとＡｇの合金を堆積する（ステップＳ００１）。合金は非酸化性金属が基礎成分であり、酸化性金属を含むものである。合金の堆積は、蒸着、スパッタリング等で可能である。次に、Ａｇを酸化するが、酸化方法は空気中の酸素による自然酸化でも良く、紫外線ＵＶ照射でオゾンを発生させて酸化しても良い。次に、センサ基板１の表面に自己組織化単分子層４（図５参照）を形成する（ステップＳ００２）。自己組織化単分子層４はリガンド化させて基板１にリガンド３を固定化するためのものであり、自己組織化単分子層４の形成は浸漬法を用いれば容易である。例えば、自己組織化単分子層４としてアミノエタンチオールＡＥＴ、アミノヘキサンチオールＡＨＴ、アミノオクタンチオールＡＯＴ、アミノウンデカンチオールＡＵＴを用いる場合には、Ａｕ−Ａｇ合金基板をそれぞれ、アミノエタンチオール、アミノヘキサンチオール、アミノオクタンチオール、アミノウンデカンチオールのエタノール溶液に浸漬すれば良い。次に、自己組織化単分子層４をリガンド化する（ステップＳ００３）。リガンド化も浸漬法を用いれば容易である。例えば、リガンド３として、ビオチンを用いる場合には、ビオチンＯｓｕの超純粋溶液に浸漬すれば良い。
【００２７】
図５に自己組織化単分子層４とリガンド３の例として、ＡＯＴ（アミノオクタンチオール）とビオチンＯｓｕ（ビオチンＮ−ハイドロキシスルフォサクシンイミドエステル)の化学構造式を示す。ＡＯＴ４は８個のＣＨ２の連鎖の一端にＨ２Ｎ，他端にＳＨが結合されたものであるが、ビオチンＯｓｕの超純粋溶液に浸漬すれば、分子の一部が置換されてビオチンＯｓｕに変化する。これにより、センサ基板１にリガンドとしてのビオチン（ビオチンＯｓｕ）３が固定化される。
【００２８】
［比較例］
図６に、比較例として、センサ基板１の媒質Ｍ３として純粋な金Ａｕを用いた場合の異常反射の実験例を示す。センサ基板１は、タングステンボートにＡｕを載せ、抵抗加熱法によりガラス板１１上に蒸着した。膜厚は約１００ｎｍである。図にＡｕ基板の表面に自己組織化単分子層（Ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ：ＳＡＭ）を形成した状態、ＳＡＭをビオチン化した状態、さらにビオチンに対応する抗体である抗ビオチン抗体を結合させた状態での反射スペクトルを示す。縦軸に反射率Ｒ，横軸に光の波長（ｎｍ）を示す。ＳＡＭとしてアミノオクタンチオールＡＯＴを用いることとし、ＳＡＭはＡｕ基板をＡＯＴの濃度１ｍＭのエタノール溶液に１時間浸漬した後に、エタノールでリンスして余分な分子を洗い流し、乾燥して作製された。このＳＡＭは０．６〜１．４ｎｍ厚の媒質Ｍ２としてはたらく。図より、ＳＡＭは可視光領域（３８０ｎｍ−７６０ｎｍ）において光吸収がないのに拘わらず、３８０ｎｍから５００ｎｍの光に対して反射率が１００％から低下しており、また、低下量はＳＡＭの膜厚が厚いほど大きくなる。ＡＯＴについて、波長４００ｎｍにおける反射率変化ΔＲが約１．６％であることよりＡＯＴ自己組織化単分子層の厚さを計算すると、ＳＡＭの屈折率を１．５と仮定した場合には約１．２ｎｍとなる。
【００２９】
次に、ＡＯＴ自己組織化単分子層をビオチンＯｓｕの濃度１２０ｎＭの超純水溶液に１時間浸漬した後に、超純粋でリンスしてビオチン化し、ビオチンをＡｕ基板に固定化した。さらに、これを抗ビオチン抗体の濃度１２０ｎＭのＰＢＳ緩衝溶液（燐酸緩衝塩）に１時間浸漬した後に、ＰＢＳ緩衝溶液でリンスして抗ビオチン抗体をビオチンに結合させた。その後、それぞれＡＯＴ、ビオチン、抗ビオチン抗体が形成された段階のＡｕ基板について乾燥した後に反射率変化ΔＲを測定した。ビオチンが形成された段階では、反射率の変化は少ないが、抗ビオチン抗体が形成された段階では、波長４００ｎｍにおいて５．２％の変化が見られた。ＡＯＴのビオチン化されたＳＡＭ（０．３ｎｍ増加するとみなす）と抗ビオチン抗体層の厚さの和は４．７ｎｍであることから、抗ビオチン抗体層の厚さは３．２ｎｍと見積もられる。
【００３０】
［実施例１］
図７はセンサ基板１の媒質Ｍ３としてＡｕとＡｇを１：１の重量比で蒸着し、その後空気中で自然酸化した場合の異常反射の実験例を示す。センサ基板１は、２つのタングステンボートを並列に接続し、それぞれのボートにＡｕとＡｇを重量比１：１の割合で載せ、抵抗加熱法によりガラス板１１上に蒸着して作製した。膜厚は約１００ｎｍである。センサ基板１上に図６と同じ方法でＡＯＴ４、ビオチン３、抗ビオチン抗体２を形成した試料についての反射スペクトルを示す。図７より、３８０ｎｍから５００ｎｍの光に対して反射率が１００％から低下し、低下量は媒質Ｍ３が純粋な金の場合（比較例）より大きくなっている。ＡＯＴについて波長４００ｎｍにおける反射率変化ΔＲは約２．８％であり、純粋な金の場合に比べて約１．８倍になっている。また、ビオチン３が形成された段階では、反射率の変化は少ないが、抗ビオチン抗体２が形成された段階では、波長４００ｎｍにおいて約８．５％の変化が見られた。抗ビオチン抗体２まで結合した場合の全体の変化率ΔＲは媒質Ｍ３が純粋な金の場合に比べて約１．６倍になっている。
【００３１】
［実施例２］
図８にセンサ基板１の媒質Ｍ３としてＡｕとＡｇを１：１の重量比で蒸着し、その後ＵＶオゾンで酸化した場合の異常反射の実験例を示す。センサ基板１は、２つのタングステンボートを並列に接続し、それぞれのボートにＡｕとＡｇを重量比１：１の割合で載せ、抵抗加熱法によりガラス板１１上に蒸着した。膜厚は約１００ｎｍである。ＵＶオゾン処理には光源に波長１８３ｎｍの光を多く含む低圧水銀ランプを用い、照射は２時間行なった。センサ基板１上に図６と同じ方法でＡＯＴ４、ビオチン３、抗ビオチン抗体２を形成した試料についての反射スペクトルを示す。図８より、ＡＯＴについて波長４００ｎｍにおける反射率変化ΔＲは約３．３％であり、純粋な金の場合に比べて約２．１倍になっている。また、ビオチン３が形成された段階では、反射率の変化は少ないが、抗ビオチン抗体２が形成された段階では、波長４００ｎｍにおいて約９．７％の変化が見られた。抗ビオチン抗体２まで結合した場合の全体の変化率ΔＲは純粋な金の場合に比べて約１．９倍になっている。
【００３２】
［実施例３］
図９にセンサ基板１の媒質Ｍ３としてＡｕとＡｇを３：１の重量比（Ａｕ７５％：Ａｇ２５％）で蒸着し、その後空気中で自然酸化した場合の異常反射の実験例を示す。センサ基板１は、２つのタングステンボートを並列に接続し、それぞれのボートにＡｕとＡｇを重量比３：１の割合で載せ、抵抗加熱法によりガラス板１１上に蒸着した。膜厚は約１００ｎｍである。センサ基板１上に図６と同じ方法でＡＯＴ４、ビオチン３、抗ビオチン抗体２を形成した試料についての反射スペクトルを示す。図９より、３８０ｎｍから５００ｎｍの光に対して反射率が１００％から低下し、低下量は比較例とほぼ同じ程度である。ＡＯＴについて波長４００ｎｍにおける反射率変化ΔＲは約２．２％であり、純粋な金の場合に比べて約１．５倍になっている。また、ビオチン３が形成された段階では、反射率の変化は少ないが、抗ビオチン抗体２が形成された段階では、波長４００ｎｍにおいて約７．８％の変化が見られた。抗ビオチン抗体２まで結合した場合の全体の変化率ΔＲは純粋な金の場合に比べて約１．５倍になっている。
【００３３】
［実施例４］
図１０にセンサ基板１の媒質Ｍ３としてＡｕとＡｇを３：１の重量比（Ａｕ７５％：Ａｇ２５％）で蒸着し、その後ＵＶオゾンで酸化した場合の異常反射の実験例を示す。センサ基板１は、２つのタングステンボートを並列に接続し、それぞれのボートにＡｕとＡｇを重量比３：１の割合で載せ、抵抗加熱法によりガラス板１１上に蒸着した。膜厚は約１００ｎｍである。ＵＶオゾン処理条件は図８の場合と同様である。センサ基板１上に図６と同じ方法でＡＯＴ４、ビオチン３、抗ビオチン抗体２を形成した試料についての反射スペクトルを示す。図１０より、３８０ｎｍから５００ｎｍの光に対して反射率が１００％から低下し、低下量の範囲は広がっている。ＡＯＴについて波長４００ｎｍにおける反射率変化ΔＲは約９．５％であり、純粋な金の場合に比べて約６．３倍になっている。また、ビオチン３が形成された段階で、反射率の変化は４％、抗ビオチン抗体２が形成された段階では、波長４００ｎｍにおいて約２０．０％の変化が見られた。抗ビオチン抗体２まで結合した場合の全体の変化率ΔＲは純粋な金の場合に比べて約３．８倍になっている。
【００３４】
以上の実施例より、ＡＲによる反射率変化は、（１）Ａｕのみの場合よりもＡｕとＡｇの合金の方がＡＲによる反射率変化が大きいこと、（２）ＡｕとＡｇの合金をＵＶオゾン処理した方がＡＲによる反射率変化が大きいことがわかる。また、ＡｕとＡｇの合金ではＡｇの一部が酸化して誘電体としての性質を示すようになり、その結果、Ａｕのみの場合に比べて、合金全体の誘電率の実部が増加し虚部が減少する。すなわち、図２の図の矢印の方向（所定の範囲の方向）に誘電率変化が生じるため、反射率変化の量が大きくなると考えられる。このことは、ＵＶオゾン処理によりさらに大きな反射率変化が得られたことからも裏付けられる。
【００３５】
［第２の実施の形態］
第１の実施の形態では、センサ基板１は金等の非酸化性金属を基礎成分とし、銀等の酸化性金属を含む例について説明したが、本実施の形態では、センサ基板１は金等の非酸化性金属を基礎成分とし、酸化銀等の金属酸化物を含む例について説明する。第１の実施の形態では、銀等の酸化性金属を酸化することにより、波長３８０ないし５００ｎｍの光に対して非酸化性金属より実部が大きく虚部が小さい所定の範囲の複素誘電率を呈するセンサ基板１を作製したが、酸化銀などの金属酸化物は、酸化しなくても誘電率は正の値を有するため、金等の非酸化性金属にこれらの金属酸化物を混ぜたセンサ基板１を作製すれば、媒質Ｍ３の誘電率は図２の矢印の方向（所定の範囲の方向）に変化する。すなわち、波長３８０ないし５００ｎｍの光に対して非酸化性金属より実部が大きく虚部が小さい所定の範囲の複素誘電率を呈するようになる。これにより、第１の実施の形態と同様に、自己組織化単分子層４を形成した試料についての反射率は低下し、センサ基板１上に自己組織化単分子層４、ビオチン３、抗ビオチン抗体２を形成した試料についての反射率変化は非酸化性金属に比して大きくなる。センサ基板１の形成は、例えば、金と酸化銀を共にスパッタリングする、金蒸着と酸化銀のスパッタリングを交互に行なう等により可能である。
【００３６】
［第３の実施の形態］
第１の実施の形態では、センサ基板１は金等の非酸化性金属を基礎成分とし、銀等の酸化性金属を含む例について説明したが、本実施の形態では、金等の非酸化性金属を基礎成分とし、シリコン酸化物等の誘電体を含む例について説明する。第１の実施の形態では、銀等の酸化性金属を酸化することにより、波長３８０ないし５００ｎｍの光に対して非酸化性金属より実部が大きく虚部が小さい所定の範囲の複素誘電率を呈するセンサ基板１を作製したが、ＳｉＯ、ＳｉＯ２などの誘電体は屈折率２〜３程度の値を有するため、金等の非酸化性金属にこれらの誘電体を混ぜたセンサ基板１を作製すれば、媒質Ｍ３の誘電率は図２の矢印の方向（所定の範囲の方向）に変化する。すなわち、波長３８０ないし５００ｎｍの光に対して非酸化性金属より実部が大きく虚部が小さい所定の範囲の複素誘電率を呈するようになる。これにより、第１の実施の形態と同様に、自己組織化単分子層４を形成した試料についての反射率は低下し、センサ基板１上に自己組織化単分子層４、ビオチン３、抗ビオチン抗体２を形成した試料についての反射率変化は非酸化性金属に比して大きくなる。センサ基板１の形成は、例えば、金とＳｉＯを共蒸着する、共にスパッタリングする等により可能である。誘電体として、シリコン酸化物の他にガラス、フッ化マグネシウムＭａＦ２等も使用可能である。
【００３７】
［第４の実施の形態］
第３の実施の形態では、金等の非酸化性金属を基礎成分とし、シリコン酸化物等の誘電体を含むセンサ基板１の媒質Ｍ３としてＡｕ等の非酸化性金属とＳｉＯ、ＳｉＯ２等の誘電体を共蒸着する例を説明したが、本実施の形態では、媒質Ｍ３として金属薄膜と誘電体の交互積層膜を作製する例を説明する。交互積層膜の膜厚は反射光間の干渉が無いように波長に比べて十分小さく（例えば１００ｎｍ以下）する。このようにすれば、交互積層膜は非酸化性金属と誘電体の混合した有効媒質として働き、媒質Ｍ３の誘電率は図２の矢印の方向（所定の範囲の方向）に変化する。すなわち、波長３８０ないし５００ｎｍの光に対して非酸化性金属より実部が大きく虚部が小さい所定の範囲の複素誘電率を呈するようになる。これにより、第３の実施の形態と同様に、自己組織化単分子層４を形成した試料についての反射率は低下し、センサ基板１上に自己組織化単分子層４、ビオチン３、抗ビオチン抗体２を形成した試料についての反射率変化は非酸化性金属に比して大きくなる。交互積層膜の形成は、例えば、金とＳｉＯを交互に蒸着する、交互にスパッタリングする等により可能である。
【００３８】
［第５の実施の形態］
第３の実施の形態では、センサ基板１は金等の非酸化性金属を基礎成分とし、シリコン酸化物等の誘電体を含む例について説明したが、本実施の形態では、センサ基板１は金等の非酸化性金属からなり、又は非酸化性金属を基礎成分とし、多孔性構造とする例について説明する。すなわち、Ａｕ等の非酸化性金属に空孔を作製すると、空孔の誘電率は１であるため、金等の非酸化性金属に多数の空孔を有するセンサ基板１を作製すれば、媒質Ｍ３の誘電率は図２の矢印の方向（所定の範囲の方向）に変化する。空孔は光の散乱が無いように波長に比して充分小さく（例えば１００ｎｍ以下）する。すなわち、波長３８０ないし５００ｎｍの光に対して非酸化性金属より実部が大きく虚部が小さい所定の範囲の複素誘電率を呈するようになる。これにより、第３の実施の形態と同様に、自己組織化単分子層４を形成した試料についての反射率は低下し、センサ基板１上に自己組織化単分子層４、ビオチン３、抗ビオチン抗体２を形成した試料についての反射率変化は非酸化性金属に比して大きくなる。多孔性構造とするには、例えばＡｕとＡｇの合金を作製し、硝酸等でエッチングすることにより可能である。
【００３９】
［第６の実施の形態］
以上の実施の形態では、センサ基板１を主にガラス板等のチップ上に作製して、バイオセンサを構成する例について説明したが、本実施の形態では、センサ基板１をガラスファイバの端面に作製して、バイオセンサを構成する例について説明する。センサ基板１をガラスファイバの端面に形成して、バイオセンサを構成すれば、プローブ部分が微小なセンサを構成でき、プローブ部分を微小セルに挿入でき、微量の試料を測定可能である。また、プローブ部分を測定器から切り離して移動でき、便宜である。
【００４０】
以上、本発明の実施の形態について説明したが、本発明は上記の実施の形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で実施の形態に種々変更を加えられることは明白である。
【００４１】
例えば、以上の実施の形態では、センサ基板の基礎成分としての非酸化性金属が金の場合を主に説明したが、金に代えて銅も使用可能である。銅の場合の波長範囲は金とほぼ同じである。また、以上の実施の形態では、アナライトとリガンドとの組み合わせについては、リガンドがビオチンでアナライトが抗ビオチン抗体の例について主に説明したが、他の組み合わせも可能である。例えば、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ（リボ核酸）、ＤＮＡ−タンパク質、ＤＮＡ−糖、ＤＮＡ−有機化合物、タンパク質−タンパク質、脂質−タンパク質、糖−タンパク質、タンパク質−有機化合物等の相互作用の検出も可能である。また、誘電体の代わりに誘電率の設計が可能なメタ物質（人工的に作り出される負の屈折率を示す物質）の利用も可能であり、金属酸化物、誘電体等も種々選択して使用可能である。また、合金の比率、ＵＶ照射条件、溶液浸漬条件等も適宜変更可能である。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明は、検出対象分子を高感度に検出するためのバイオセンサに利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】センサ基板からの異常反射を説明するための図である。
【図２】反射率変化を媒質Ｍ３の誘電率の実部、虚部に対してプロットした図である。
【図３】第１の実施の形態におけるバイオセンサの構成例を示す図である。
【図４】第１の実施の形態におけるバイオセンサの製造方法の例を示す図である。
【図５】自己組織化単分子層とリガンドの例の化学構造式を示す図である。
【図６】センサ基板の媒質としてＡｕを用いた場合の異常反射の実験例を示す図である。
【図７】センサ基板の媒質としてＡｕとＡｇを１：１の重量比で蒸着し、その後空気中で自然酸化した場合の異常反射の実験例を示す図である。
【図８】センサ基板の媒質としてＡｕとＡｇを１：１の重量比で蒸着し、その後ＵＶオゾンで酸化した場合の異常反射の実験例を示す図である。
【図９】センサ基板の媒質としてＡｕとＡｇを３：１の重量比で蒸着し、その後空気中で自然酸化した場合の異常反射の実験例を示す図である。
【図１０】センサ基板の媒質としてＡｕとＡｇを３：１の重量比で蒸着し、その後ＵＶオゾンで酸化した場合の異常反射の実験例を示す図である。
【図１１】バイオセンシングの原理を説明するための図である。
【図１２】従来の全反射減衰法によるバイオセンサを説明するための図である。
【符号の説明】
【００４４】
１ センサ基板
２ アナライト（対象物質）
３ リガンド
４ 自己組織化単分子層
５ プリズム
６ 金属薄膜
７ 入射光
８ 表面プラズモン
９ 反射光
１０、１０Ａ バイオセンサ
１１ チップ
Ｍ１〜Ｍ３ 媒質
ｎ１〜ｎ３ 屈折率
Ｒ 反射率
ΔＲ 反射率変化
ε 誘電率
θ 入射角
θｒ 共鳴角
【技術分野】
【０００１】
本発明はセンサ基板及びバイオセンサに関する。詳しくは、異常反射を用いて検出対象物質を高感度に検出するためのセンサ基板及びバイオセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡや蛋白質などのバイオセンシングは、検出対象分子（アナライト）に特異的な相互作用を有するリガンド分子を金などの基板や微粒子上に塗布し、そこへのアナライトの結合の有無を検出する。
【０００３】
図１１はバイオセンシングの原理を説明するための図である。金などのセンサ基板１上に検出対象分子２（ａｎａｌｙｔｅ：アナライト）に相補的な（親和性の強い）分子３（ｌｉｇａｎｄ：リガンド）の分子層を形成する。この基板１を試料溶液中に浸した際に、アナライト２があれば、その相互作用（親和力）により選択的にリガンド３に吸着又は結合する。アナライト２とリガンド３は互いに相補的であるため鍵と鍵穴のような関係になっており、相補的な物質同士の相互作用は大変強力であるが、相補的でない物質同士の相互作用は非常に弱い。センサ基板１に光を照射し、相補的な分子の吸着や結合による屈折率変化などを反射光強度、散乱光強度、共鳴波長などの光信号の変化により検出する。たとえば、リガンド３としてオリゴヌクレオチドを用いれば、相補的な塩基配列を持つオリゴＤＮＡがハイブリダイゼーションを起し、その検出ができる。また、リガンド３として抗体を用いた実験では、検出対象となる抗リガンド抗体を高感度に検出することが可能である。同様の原理で、脂質−タンパク質、糖−タンパク質の相互作用の検出も可能であり、この手法の汎用性は高い。
【０００４】
アナライト２の結合量は１ｎｇ／ｍｍ２以下であり非常に少ない。結合に伴う反射率変化は小さく、通常の光学的手法でそれを検出することは困難である。そのため、表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：ＳＰＲ）や金ナノ微粒子中の局在プラズモン共鳴（ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：ＬＰＲ）などを用いて増感が行なわれてきた。ＳＰＲを用いたバイオセンシングでは、一般に全反射減衰法（ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｔｏｔａｌ ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＲ）を用いてプリズム底面に堆積された金属薄膜中に生じる伝搬型表面プラズモン（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎｓ：ＳＰｓ）を励起する。かかる手法を以下ＡＴＲ−ＳＰＲと呼ぶ。
【０００５】
図１２は従来の全反射減衰法（ＡＴＲ）によるバイオセンサを説明するための図である。図１２（ａ）にバイオセンサ１０Ａの構成例を示す。プリズム５の底面に金等の金属薄膜６（例えば４６．５ｎｍ厚）が堆積され、金属薄膜６の表面にはリガンド３が固定されている。このバイオセンサ１０Ａを容器に入れて、容器に検出対象分子（アナライト）２を含む試料を注入する。プリズム５の底面に対する法線から入射角θ（全反射が起こる条件）で入射光７を入射する。ｐ−偏光の光の反射率は、共鳴角θｒで最小となり、表面プラズモン共鳴により金属薄膜６の表面に表面プラズモン（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎｓ：ＳＰｓ）８が生成され、入射光７のエネルギーは薄膜中の表面プラズモン８に変換され、反射光９の反射率が減少する。反射光９を光検出器で検出する。図１２（ｂ）に光の入射角θと反射率Ｒの関係を示す。共鳴角θｒは金属薄膜６近傍の屈折率や物質の有無に敏感であるため、その表面をあらかじめリガンド３で修飾しておけばアナライト２の結合を共鳴角変化Δθｒとして読み取ることができる。例えば屈折率が１．５で厚さが１ｎｍの超薄膜が表面に吸着することにより、共鳴角は高角度側へ約０．２度シフトし、反射率に差が生じる。この表面プラズモンセンサ１０Ａは高感度であり、超薄膜試料に蛍光色素などのラベルを用いなくても単分子層以下のアナライト２の吸着や脱離を観測可能である。
【０００６】
この方法を利用したバイオセンサはすでに市販品も多く、現在では生化学や遺伝子工学の分野では欠くことのできないツールとなっている。しかしながら、固定化された光学系が必要であり全反射減衰法を用いなければならず他の測定手法との組み合わせに制限がある、金の膜厚が４５〜５５ｎｍの間でなければ高感度の測定が難しいなどの改良すべき点も多い。他方、ＬＰＲは金ナノ微粒子や粗い金属表面などに励起される表面プラズモンである。ＡＴＲ−ＳＰＲとは異なり、ＬＰＲを励起するためには微粒子に光を照射すればよい。特定の入射角で光を入射する必要がないため固定化された光学系を組む必要がなく、市販の分光器を用いて透過や反射、散乱スペクトル測定を行うことによりセンシング可能であるなどの利点がある。
【０００７】
数年前に発明者達は、青や紫の光に対する金表面の反射率が５０％以下となることを利用して、単純な反射測定でＤＮＡや蛋白質の検出が可能であることを示した。金は金属であるが、光学的には青や紫の光に対しては誘電体的な性質を示す。そのため、青や紫の光に対する反射率は５０％程度であり、それゆえ黄色がかった色を呈する。これらの光に対する金表面の反射率は、物質の吸着や結合に伴い比較的大きく低下する。例えば、空気中で金の表面は波長４７０ｎｍの光に対して１ｎｇ／ｍｍ２の分子の結合により約１．３％の反射率変化を与える。これを金の異常反射（ａｎｏｍａｌｏｕｓ ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＲ）という。金の異常反射（ＡＲ）を利用した分子間相互作用測定法は、波長５００ｎｍ以下の光を入射して金の反射率が低下する現象を利用したもので、金表面上に分子膜が生成すると、分子と金表面の間に多重反射が起こることにより、結合量を高い感度で検知できる。銀やアルミニウムなどの金属の場合には可視光領域では１ｎｇ／ｍｍ２の分子の結合による反射率変化は０．０２％程度である。金でも、赤や黄色の光に対しては同程度の反射率変化を示すが、青や紫の光に対しては、金属的というよりはむしろ誘電体的な反射応答をするためにこのような現象が起こる。（非特許文献１、非特許文献２参照）
【０００８】
【非特許文献１】Ｍｉｔｓｕａｋｉ Ｗａｔａｎａｂｅ ａｎｄ Ｋｏｔａｒｏ Ｋａｊｉｋａｗａ，“Ａｎ ｏｐｔｉｃａｌ ｆｉｂｅｒ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｎｏｍａｌｏｕｓ ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｏｌｄ” Ｓｅｎｓ．Ａｃｔｕａｔｏｒｓ Ｂ８９ （２００３） １２６−１３０．
【非特許文献２】Ｓ．Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｋ．Ｕｓｕｉ，Ｋ．−Ｙ．Ｔｏｍｉｚａｋｉ，Ｋ．Ｋａｊｉｋａｗａ，Ｈ．Ｍｉｈａｒａ，“Ａｎｏｍａｌｏｕｓ Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｏｌｄ Ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｆｏｒ ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｃｈｉｐ Ｐｌａｔｆｏｒｍ” Ｍｏｌ．ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ １ （２００５） ３６３−３６５．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
局在型表面プラズモン（ＬＰＲ）において、定量的な測定をするためには、あらかじめ検量線を作る必要がある、分子のサイズにより感度の補正が必要であるなどの問題があった。
【００１０】
他方、異常反射（ＡＲ）は、垂直入射でも斜め入射でもよく、金薄膜の膜厚制限も無い。そのため、垂直入射での単純な反射率測定により金表面に結合、吸着した微量物質を定量的に計測することが可能であり、測定光学系の構成も簡易にできる。また、入射光の単色性もあまり問題とならないため発光ダイオード（ｌｉｇｈｔ ｅｍｉｔｔｉｎｇ ｄｉｏｄｅ：ＬＥＤ）などのインコヒーレント光源を利用できるので、装置の小型化、低コスト化も容易である。金を用いた場合には感度はＳＰＲと比べて幾分劣るが、単純な光学系を用いるため様々な使い方が可能である。空気中で１ｎｇ／ｍｍ２の分子の結合によりＡＴＲ−ＳＰＲでは最大１２％の反射率変化を得られるが、金表面でのＡＲでの反射率変化は約１．３％である。金表面でのＡＲは感度が低いことが欠点であるが、発明者達は、これを改善する金属合金や金属と金属酸化物、誘電体などとの混合材料を生み出すことを検討した。
【００１１】
本発明は、異常反射の変化率が金より大きいセンサ基板を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記課題を解決するために、本発明による第１の態様のセンサ基板１は、例えば図３に示すように、光に対する異常反射の反射率変化から吸着又は結合する対象物質２を検出するセンサ基板１であって、金等の非酸化性金属を基礎成分とし、銀等の酸化性金属又は酸化銀等の金属酸化物を含む、波長３８０ないし５００ｎｍのいずれかの光に対して非酸化性金属より実部が大きく虚部が小さい所定の範囲の複素誘電率を呈する。
【００１３】
ここにおいて、非酸化性金属と酸化性金属又は金属酸化物とは、粒子混合構造で（粒状で混じり合って）も良く、２相混合構造で（２相が相互に入り乱れて混じり合って）も良く（１つの相が他の相内に分散している分散構造を含む）、合金構造で（合金として混じり合って）も良く、積層構造で（交互に積層されて交じり合って）も良い。また、酸化性金属がセンサ基板表面に露出している場合は露出面が酸化されていても良く（大気中では自然酸化される）、粒状で存在する場合は粒表面が酸化されていても良い。また、酸化は意図的になされても良く、自然酸化でも良い。また、金属酸化物は金属全体が酸化されていても良く、一部が酸化されていても良い。また、波長３８０ないし５００ｎｍの任意の波長で所定の範囲の複素誘電率を満たせば良いが、全範囲で満たしても良く、一部の範囲で満たしても良い。このように構成すると、センサ基板は非酸化性金属より実部が大きく虚部が小さい所定の範囲の複素誘電率を有するために、異常反射の反射率変化が大きくなり、高感度のセンサ基板を提供できる。なお、所定の範囲については第６の態様を参照されたい。
【００１４】
また、本発明による第２の態様は、第１の態様のセンサ基板において、非酸化性金属が金であり、酸化性金属が銀であるか又は金属酸化物が酸化銀であって、金と銀の重量比が１００対１から５０対５０である。
このように構成すると、金と銀の合金でセンサ基板を構成でき、高感度のセンサ基板を容易に提供できる。
【００１５】
また、本発明による第３の態様のセンサ基板は、光に対する異常反射の反射率変化から吸着又は結合する対象物質２を検出するセンサ基板１であって、金等の非酸化性金属を基礎成分とし、シリコン酸化物、フッ化マグネシウム等の誘電体を含む、波長３８０ないし５００ｎｍのいずれかの光に対して非酸化性金属より実部が大きく虚部が小さい所定の範囲の複素誘電率を呈する。
このように構成すると、誘電体の存在により、センサ基板は非酸化性金属より実部が大きく虚部が小さい複素誘電率を有するために、異常反射の反射率変化が大きくなり、高感度のセンサを提供できる。
【００１６】
また、本発明による第４の態様は、第３の態様のセンサ基板において、非酸化性金属と前記誘電体の組み合わせは、粒子混合構造、２相混合構造（分散構造を含む）又は積層構造である。
ここにおいて各構造については第１の態様を参照されたい。また、交互積層膜の膜厚は反射光間の干渉が無いように波長に比べて十分小さくすることが好ましい。このように構成すると、誘電体を含むセンサ基板を上記いずれかの構造で比較的容易に作製できる。
【００１７】
また、本発明による第５の態様のセンサ基板は、光に対する異常反射の反射率変化から吸着又は結合する対象物質２を検出するセンサ基板１であって、金等の非酸化性金属からなり、又は非酸化性金属を基礎成分とし、多孔性構造とすることにより、波長３８０ないし５００ｎｍのいずれかの光に対して非酸化性金属より実部が大きく虚部が小さい所定の範囲の複素誘電率を呈する。
ここにおいて、多孔性構造は空孔を多数有する構造でも良く、粒子混合構造で粒子間に局在化した多数の空隙が存在する構造でも良い。空孔は光の散乱が無いように波長に比して充分小さくすることが好ましい。このように構成すると、多孔性構造により、センサ基板は誘電率１の空孔を多数有するために、異常反射の反射率変化が大きくなり、高感度のセンサを提供できる。
【００１８】
また、本発明による第６の態様は、第１ないし第５の態様のセンサ基板において、非酸化性金属が金であり、所定の範囲は実部が−１ないし３、虚部が０．３ないし４．５である。
このように構成すると、図２より略１．５％以上の反射率変化ΔＲが得られ好適である。所定の範囲を実部が０ないし２、虚部が０．３ないし３とすると、略２％以上の反射率変化ΔＲが得られなお好適である。所定の範囲を実部が０ないし２、虚部が０．３ないし２とすると、略３％以上の反射率変化ΔＲが得られさらに好適である。
【００１９】
また、本発明による第７の態様のバイオセンサ１０は、第１ないし第６の態様のセンサ基板を備え、センサ基板１表面にリガンド３を形成したものである。
このように構成すると、高感度のセンサ基板を用いて、高感度のバイオセンサを提供できる。
【００２０】
また、本発明による第８の態様のバイオセンサの製造方法は、例えば図４に示すように、第１ないし第４の態様のセンサ基板１として金等の非酸化性金属を基礎成分とし、銀等の酸化性金属、酸化銀等の金属酸化物又はシリコン酸化物、フッ化マグネシウム等の誘電体を含むものを堆積して形成する工程（Ｓ００１）と、センサ基板１の表面に自己組織化単分子層４（図５参照）を浸漬法により形成する工程（Ｓ００２）と、自己組織化単分子層４を浸漬法によりリガンド化する工程（Ｓ００３）とを備える。
ここにおいて、センサ基板の堆積は、例えば、蒸着、スパッタリング、気相成長、沈積により可能である。このように構成すると、高感度のバイオセンサを容易に製造できる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、異常反射の変化率が金より大きいセンサ基板を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
［異常反射の反射率変化］
図１はセンサ基板１からの異常反射を説明するための図である。図１（ａ）にセンサ基板表面の媒質の配置を示す。媒質Ｍ１は通常空気、あるいは水であり屈折率ｎ１とする。媒質Ｍ２はバイオセンシングする対象物質（ＤＮＡや蛋白質など）であり、屈折率ｎ２、膜厚ｄ２の連続誘電体媒質とみなす。媒質Ｍ３は屈折率ｎ３の金属媒質であり、ｎ３は複素数である。７は入射光、９は反射光である。図１（ａ）の配置を用いて光の反射を計算する。図１（ｂ）に屈折率ｎ２＝１．５の媒質Ｍ２が媒質Ｍ３としての金に吸着した際の金表面の反射率変化ΔＲの波長依存性を示す。媒質Ｍ２が存在しない場合の反射率をＲ０、存在する場合の反射率をＲ、反射率変化ΔＲ＝（Ｒ−Ｒ０）／Ｒ０とし、反射率Ｒを光波長に対してプロットしたものである。金の誘電率は、非特許文献３（Ｐ．Ｂ．Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｒ．Ｗ．Ｃｒｉｓｔｙ，“Ｏｐｔｉｃａｌ Ｃｏｎｓｔａｎｔｓ ｏｆ Ｎｏｂｌｅ Ｍｅｔａｌｓ”，Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．６（１９７２）４７３０−４３７９）の値を基に補間計算した。波長５００ｎｍ以下の領域において媒質Ｍ２の吸着により約１．２５％の反射率変化が生じることがわかる。一方、波長７００ｎｍ付近の長波長領域では媒質Ｍ２が吸着しても反射率変化は無視できるほど小さい。これは、金に波長５００ｎｍ以下の光を入射すると金の反射率が低下するという異常反射（ＡＲ）の現象に基づくものであり、金の表面上に分子膜が生成すると、分子膜と金表面の間に多重反射が起こることにより、反射率変化が増大される。通常、反射率変化は膜厚に比例するので（非特許文献１参照）、これにより、分子膜の結合量を高い感度で検知できる。
【００２３】
図２は反射率変化ΔＲを媒質Ｍ３の誘電率ε３の実部、虚部に対してプロットした図である。ここで、媒質Ｍ２の屈折率ｎ２＝１．５、膜厚ｄ２＝１．０ｎｍとした。誘電率εと屈折率ｎの間にはε＝ｎ２の関係がある。明度が低い部分ほど反射率変化が大きい。非特許文献３の値から計算した波長４７０ｎｍにおける金Ａｕと銀Ａｇの誘電率を図中の○印で示した。Ａｇでは反射率変化ΔＲ＝約０．２％と小さいが、Ａｕでは反射率変化ΔＲ＝約１．２％と大きい。さらに、発明者達は、媒質Ｍ３の誘電率ε３を矢印の方向に制御できれば、より一層大きな反射率変化ΔＲが得られ、高い感度でＡＲを用いたセンサ基板を作成できることに注目した。
【００２４】
図２の矢印で示すような、媒質Ｍ３としての金等の非酸化性金属より実部が大きく虚部が小さい所定の範囲の複素誘電率を呈するセンサ基板を作製し、媒質Ｍ２としてのバイオ由来分子が結合すれば大きな反射率の変化が生じるので、バイオ由来分子を高感度で検出できる。所定の範囲を実部が−１ないし３、虚部が０．３ないし４．５であるとすると、図２より略１．５％以上の反射率変化ΔＲが得られ好適である。所定の範囲を実部が０ないし２、虚部が０．３ないし３とすると、略２％以上の反射率変化ΔＲが得られなお好適である。所定の範囲を実部が０ないし２、虚部が０．３ないし２とすると、略３％以上の反射率変化ΔＲが得られさらに好適である。異常反射の反射率変化の測定は簡単な光学系で構成できるので、バイオセンシングチップやその検出システムの低コスト化が可能となる。これまで、この種の検査には表面プラズモン共鳴が広く用いられているが、異常反射の反射率変化の大きいセンサ基板や当該基板を用いたバイオセンサを供給できれば、表面プラズモン共鳴に代替してバイオセンシングに使用できる可能性がある。
【００２５】
〔第１の実施の形態〕
図３に第１の実施の形態におけるバイオセンサ１０の構成例を示す。センサ基板１は、光に対する異常反射の反射率変化から吸着又は結合する対象物質（アナライト）２を検出するためのものである。センサ基板１表面にアナライト２に相補的なリガンド３を形成する。センサ基板１は金Ａｕ等の非酸化性金属を基礎成分とし、銀Ａｇ等の酸化性金属を含むものであれば良いが、本実施の形態では、センサ基板１は、ＡｕとＡｇの合金で作成し、Ａｇを酸化したものである。酸化方法は空気中の酸素による自然酸化でも良く、紫外線照射でオゾンを発生させて酸化しても良い。Ａｇ自体の誘電率は図２に示すように負の値を有するが、Ａｇの酸化物は一般に誘電体であり、誘電率は正の値を有する。そのため、Ａｕを基礎成分としＡｇを含む媒質Ｍ３としてのセンサ基板１の誘電率εは、Ａｇの酸化により図２の矢印の方向に変化する。すなわち、波長３８０ないし５００ｎｍの光に対して、非酸化性金属であるＡｕより実部が大きく虚部が小さい所定の範囲の複素誘電率を呈するように変化する。そのため、大きな反射率変化ΔＲを有するセンサ基板１を作製できる。センサ基板１は例えば石英板、ガラス板、プラスチック板等のチップ１１上或いはガラスファイバ等の端面に作製される。また、このセンサ基板１を用いてバイオセンサ１０を構成すれば、高感度のバイオセンサを供給できる。
【００２６】
図４に本実施の形態におけるバイオセンサの製造方法の例を示す。なお、バイオセンサの構成については図３を参照されたい。まず、ガラス板１１等のチップ上にセンサ基板１として金Ａｕ等の非酸化性金属と銀Ａｇ等の酸化性金属の合金を堆積して形成すれば良いが、ここでは、ＡｕとＡｇの合金を堆積する（ステップＳ００１）。合金は非酸化性金属が基礎成分であり、酸化性金属を含むものである。合金の堆積は、蒸着、スパッタリング等で可能である。次に、Ａｇを酸化するが、酸化方法は空気中の酸素による自然酸化でも良く、紫外線ＵＶ照射でオゾンを発生させて酸化しても良い。次に、センサ基板１の表面に自己組織化単分子層４（図５参照）を形成する（ステップＳ００２）。自己組織化単分子層４はリガンド化させて基板１にリガンド３を固定化するためのものであり、自己組織化単分子層４の形成は浸漬法を用いれば容易である。例えば、自己組織化単分子層４としてアミノエタンチオールＡＥＴ、アミノヘキサンチオールＡＨＴ、アミノオクタンチオールＡＯＴ、アミノウンデカンチオールＡＵＴを用いる場合には、Ａｕ−Ａｇ合金基板をそれぞれ、アミノエタンチオール、アミノヘキサンチオール、アミノオクタンチオール、アミノウンデカンチオールのエタノール溶液に浸漬すれば良い。次に、自己組織化単分子層４をリガンド化する（ステップＳ００３）。リガンド化も浸漬法を用いれば容易である。例えば、リガンド３として、ビオチンを用いる場合には、ビオチンＯｓｕの超純粋溶液に浸漬すれば良い。
【００２７】
図５に自己組織化単分子層４とリガンド３の例として、ＡＯＴ（アミノオクタンチオール）とビオチンＯｓｕ（ビオチンＮ−ハイドロキシスルフォサクシンイミドエステル)の化学構造式を示す。ＡＯＴ４は８個のＣＨ２の連鎖の一端にＨ２Ｎ，他端にＳＨが結合されたものであるが、ビオチンＯｓｕの超純粋溶液に浸漬すれば、分子の一部が置換されてビオチンＯｓｕに変化する。これにより、センサ基板１にリガンドとしてのビオチン（ビオチンＯｓｕ）３が固定化される。
【００２８】
［比較例］
図６に、比較例として、センサ基板１の媒質Ｍ３として純粋な金Ａｕを用いた場合の異常反射の実験例を示す。センサ基板１は、タングステンボートにＡｕを載せ、抵抗加熱法によりガラス板１１上に蒸着した。膜厚は約１００ｎｍである。図にＡｕ基板の表面に自己組織化単分子層（Ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ：ＳＡＭ）を形成した状態、ＳＡＭをビオチン化した状態、さらにビオチンに対応する抗体である抗ビオチン抗体を結合させた状態での反射スペクトルを示す。縦軸に反射率Ｒ，横軸に光の波長（ｎｍ）を示す。ＳＡＭとしてアミノオクタンチオールＡＯＴを用いることとし、ＳＡＭはＡｕ基板をＡＯＴの濃度１ｍＭのエタノール溶液に１時間浸漬した後に、エタノールでリンスして余分な分子を洗い流し、乾燥して作製された。このＳＡＭは０．６〜１．４ｎｍ厚の媒質Ｍ２としてはたらく。図より、ＳＡＭは可視光領域（３８０ｎｍ−７６０ｎｍ）において光吸収がないのに拘わらず、３８０ｎｍから５００ｎｍの光に対して反射率が１００％から低下しており、また、低下量はＳＡＭの膜厚が厚いほど大きくなる。ＡＯＴについて、波長４００ｎｍにおける反射率変化ΔＲが約１．６％であることよりＡＯＴ自己組織化単分子層の厚さを計算すると、ＳＡＭの屈折率を１．５と仮定した場合には約１．２ｎｍとなる。
【００２９】
次に、ＡＯＴ自己組織化単分子層をビオチンＯｓｕの濃度１２０ｎＭの超純水溶液に１時間浸漬した後に、超純粋でリンスしてビオチン化し、ビオチンをＡｕ基板に固定化した。さらに、これを抗ビオチン抗体の濃度１２０ｎＭのＰＢＳ緩衝溶液（燐酸緩衝塩）に１時間浸漬した後に、ＰＢＳ緩衝溶液でリンスして抗ビオチン抗体をビオチンに結合させた。その後、それぞれＡＯＴ、ビオチン、抗ビオチン抗体が形成された段階のＡｕ基板について乾燥した後に反射率変化ΔＲを測定した。ビオチンが形成された段階では、反射率の変化は少ないが、抗ビオチン抗体が形成された段階では、波長４００ｎｍにおいて５．２％の変化が見られた。ＡＯＴのビオチン化されたＳＡＭ（０．３ｎｍ増加するとみなす）と抗ビオチン抗体層の厚さの和は４．７ｎｍであることから、抗ビオチン抗体層の厚さは３．２ｎｍと見積もられる。
【００３０】
［実施例１］
図７はセンサ基板１の媒質Ｍ３としてＡｕとＡｇを１：１の重量比で蒸着し、その後空気中で自然酸化した場合の異常反射の実験例を示す。センサ基板１は、２つのタングステンボートを並列に接続し、それぞれのボートにＡｕとＡｇを重量比１：１の割合で載せ、抵抗加熱法によりガラス板１１上に蒸着して作製した。膜厚は約１００ｎｍである。センサ基板１上に図６と同じ方法でＡＯＴ４、ビオチン３、抗ビオチン抗体２を形成した試料についての反射スペクトルを示す。図７より、３８０ｎｍから５００ｎｍの光に対して反射率が１００％から低下し、低下量は媒質Ｍ３が純粋な金の場合（比較例）より大きくなっている。ＡＯＴについて波長４００ｎｍにおける反射率変化ΔＲは約２．８％であり、純粋な金の場合に比べて約１．８倍になっている。また、ビオチン３が形成された段階では、反射率の変化は少ないが、抗ビオチン抗体２が形成された段階では、波長４００ｎｍにおいて約８．５％の変化が見られた。抗ビオチン抗体２まで結合した場合の全体の変化率ΔＲは媒質Ｍ３が純粋な金の場合に比べて約１．６倍になっている。
【００３１】
［実施例２］
図８にセンサ基板１の媒質Ｍ３としてＡｕとＡｇを１：１の重量比で蒸着し、その後ＵＶオゾンで酸化した場合の異常反射の実験例を示す。センサ基板１は、２つのタングステンボートを並列に接続し、それぞれのボートにＡｕとＡｇを重量比１：１の割合で載せ、抵抗加熱法によりガラス板１１上に蒸着した。膜厚は約１００ｎｍである。ＵＶオゾン処理には光源に波長１８３ｎｍの光を多く含む低圧水銀ランプを用い、照射は２時間行なった。センサ基板１上に図６と同じ方法でＡＯＴ４、ビオチン３、抗ビオチン抗体２を形成した試料についての反射スペクトルを示す。図８より、ＡＯＴについて波長４００ｎｍにおける反射率変化ΔＲは約３．３％であり、純粋な金の場合に比べて約２．１倍になっている。また、ビオチン３が形成された段階では、反射率の変化は少ないが、抗ビオチン抗体２が形成された段階では、波長４００ｎｍにおいて約９．７％の変化が見られた。抗ビオチン抗体２まで結合した場合の全体の変化率ΔＲは純粋な金の場合に比べて約１．９倍になっている。
【００３２】
［実施例３］
図９にセンサ基板１の媒質Ｍ３としてＡｕとＡｇを３：１の重量比（Ａｕ７５％：Ａｇ２５％）で蒸着し、その後空気中で自然酸化した場合の異常反射の実験例を示す。センサ基板１は、２つのタングステンボートを並列に接続し、それぞれのボートにＡｕとＡｇを重量比３：１の割合で載せ、抵抗加熱法によりガラス板１１上に蒸着した。膜厚は約１００ｎｍである。センサ基板１上に図６と同じ方法でＡＯＴ４、ビオチン３、抗ビオチン抗体２を形成した試料についての反射スペクトルを示す。図９より、３８０ｎｍから５００ｎｍの光に対して反射率が１００％から低下し、低下量は比較例とほぼ同じ程度である。ＡＯＴについて波長４００ｎｍにおける反射率変化ΔＲは約２．２％であり、純粋な金の場合に比べて約１．５倍になっている。また、ビオチン３が形成された段階では、反射率の変化は少ないが、抗ビオチン抗体２が形成された段階では、波長４００ｎｍにおいて約７．８％の変化が見られた。抗ビオチン抗体２まで結合した場合の全体の変化率ΔＲは純粋な金の場合に比べて約１．５倍になっている。
【００３３】
［実施例４］
図１０にセンサ基板１の媒質Ｍ３としてＡｕとＡｇを３：１の重量比（Ａｕ７５％：Ａｇ２５％）で蒸着し、その後ＵＶオゾンで酸化した場合の異常反射の実験例を示す。センサ基板１は、２つのタングステンボートを並列に接続し、それぞれのボートにＡｕとＡｇを重量比３：１の割合で載せ、抵抗加熱法によりガラス板１１上に蒸着した。膜厚は約１００ｎｍである。ＵＶオゾン処理条件は図８の場合と同様である。センサ基板１上に図６と同じ方法でＡＯＴ４、ビオチン３、抗ビオチン抗体２を形成した試料についての反射スペクトルを示す。図１０より、３８０ｎｍから５００ｎｍの光に対して反射率が１００％から低下し、低下量の範囲は広がっている。ＡＯＴについて波長４００ｎｍにおける反射率変化ΔＲは約９．５％であり、純粋な金の場合に比べて約６．３倍になっている。また、ビオチン３が形成された段階で、反射率の変化は４％、抗ビオチン抗体２が形成された段階では、波長４００ｎｍにおいて約２０．０％の変化が見られた。抗ビオチン抗体２まで結合した場合の全体の変化率ΔＲは純粋な金の場合に比べて約３．８倍になっている。
【００３４】
以上の実施例より、ＡＲによる反射率変化は、（１）Ａｕのみの場合よりもＡｕとＡｇの合金の方がＡＲによる反射率変化が大きいこと、（２）ＡｕとＡｇの合金をＵＶオゾン処理した方がＡＲによる反射率変化が大きいことがわかる。また、ＡｕとＡｇの合金ではＡｇの一部が酸化して誘電体としての性質を示すようになり、その結果、Ａｕのみの場合に比べて、合金全体の誘電率の実部が増加し虚部が減少する。すなわち、図２の図の矢印の方向（所定の範囲の方向）に誘電率変化が生じるため、反射率変化の量が大きくなると考えられる。このことは、ＵＶオゾン処理によりさらに大きな反射率変化が得られたことからも裏付けられる。
【００３５】
［第２の実施の形態］
第１の実施の形態では、センサ基板１は金等の非酸化性金属を基礎成分とし、銀等の酸化性金属を含む例について説明したが、本実施の形態では、センサ基板１は金等の非酸化性金属を基礎成分とし、酸化銀等の金属酸化物を含む例について説明する。第１の実施の形態では、銀等の酸化性金属を酸化することにより、波長３８０ないし５００ｎｍの光に対して非酸化性金属より実部が大きく虚部が小さい所定の範囲の複素誘電率を呈するセンサ基板１を作製したが、酸化銀などの金属酸化物は、酸化しなくても誘電率は正の値を有するため、金等の非酸化性金属にこれらの金属酸化物を混ぜたセンサ基板１を作製すれば、媒質Ｍ３の誘電率は図２の矢印の方向（所定の範囲の方向）に変化する。すなわち、波長３８０ないし５００ｎｍの光に対して非酸化性金属より実部が大きく虚部が小さい所定の範囲の複素誘電率を呈するようになる。これにより、第１の実施の形態と同様に、自己組織化単分子層４を形成した試料についての反射率は低下し、センサ基板１上に自己組織化単分子層４、ビオチン３、抗ビオチン抗体２を形成した試料についての反射率変化は非酸化性金属に比して大きくなる。センサ基板１の形成は、例えば、金と酸化銀を共にスパッタリングする、金蒸着と酸化銀のスパッタリングを交互に行なう等により可能である。
【００３６】
［第３の実施の形態］
第１の実施の形態では、センサ基板１は金等の非酸化性金属を基礎成分とし、銀等の酸化性金属を含む例について説明したが、本実施の形態では、金等の非酸化性金属を基礎成分とし、シリコン酸化物等の誘電体を含む例について説明する。第１の実施の形態では、銀等の酸化性金属を酸化することにより、波長３８０ないし５００ｎｍの光に対して非酸化性金属より実部が大きく虚部が小さい所定の範囲の複素誘電率を呈するセンサ基板１を作製したが、ＳｉＯ、ＳｉＯ２などの誘電体は屈折率２〜３程度の値を有するため、金等の非酸化性金属にこれらの誘電体を混ぜたセンサ基板１を作製すれば、媒質Ｍ３の誘電率は図２の矢印の方向（所定の範囲の方向）に変化する。すなわち、波長３８０ないし５００ｎｍの光に対して非酸化性金属より実部が大きく虚部が小さい所定の範囲の複素誘電率を呈するようになる。これにより、第１の実施の形態と同様に、自己組織化単分子層４を形成した試料についての反射率は低下し、センサ基板１上に自己組織化単分子層４、ビオチン３、抗ビオチン抗体２を形成した試料についての反射率変化は非酸化性金属に比して大きくなる。センサ基板１の形成は、例えば、金とＳｉＯを共蒸着する、共にスパッタリングする等により可能である。誘電体として、シリコン酸化物の他にガラス、フッ化マグネシウムＭａＦ２等も使用可能である。
【００３７】
［第４の実施の形態］
第３の実施の形態では、金等の非酸化性金属を基礎成分とし、シリコン酸化物等の誘電体を含むセンサ基板１の媒質Ｍ３としてＡｕ等の非酸化性金属とＳｉＯ、ＳｉＯ２等の誘電体を共蒸着する例を説明したが、本実施の形態では、媒質Ｍ３として金属薄膜と誘電体の交互積層膜を作製する例を説明する。交互積層膜の膜厚は反射光間の干渉が無いように波長に比べて十分小さく（例えば１００ｎｍ以下）する。このようにすれば、交互積層膜は非酸化性金属と誘電体の混合した有効媒質として働き、媒質Ｍ３の誘電率は図２の矢印の方向（所定の範囲の方向）に変化する。すなわち、波長３８０ないし５００ｎｍの光に対して非酸化性金属より実部が大きく虚部が小さい所定の範囲の複素誘電率を呈するようになる。これにより、第３の実施の形態と同様に、自己組織化単分子層４を形成した試料についての反射率は低下し、センサ基板１上に自己組織化単分子層４、ビオチン３、抗ビオチン抗体２を形成した試料についての反射率変化は非酸化性金属に比して大きくなる。交互積層膜の形成は、例えば、金とＳｉＯを交互に蒸着する、交互にスパッタリングする等により可能である。
【００３８】
［第５の実施の形態］
第３の実施の形態では、センサ基板１は金等の非酸化性金属を基礎成分とし、シリコン酸化物等の誘電体を含む例について説明したが、本実施の形態では、センサ基板１は金等の非酸化性金属からなり、又は非酸化性金属を基礎成分とし、多孔性構造とする例について説明する。すなわち、Ａｕ等の非酸化性金属に空孔を作製すると、空孔の誘電率は１であるため、金等の非酸化性金属に多数の空孔を有するセンサ基板１を作製すれば、媒質Ｍ３の誘電率は図２の矢印の方向（所定の範囲の方向）に変化する。空孔は光の散乱が無いように波長に比して充分小さく（例えば１００ｎｍ以下）する。すなわち、波長３８０ないし５００ｎｍの光に対して非酸化性金属より実部が大きく虚部が小さい所定の範囲の複素誘電率を呈するようになる。これにより、第３の実施の形態と同様に、自己組織化単分子層４を形成した試料についての反射率は低下し、センサ基板１上に自己組織化単分子層４、ビオチン３、抗ビオチン抗体２を形成した試料についての反射率変化は非酸化性金属に比して大きくなる。多孔性構造とするには、例えばＡｕとＡｇの合金を作製し、硝酸等でエッチングすることにより可能である。
【００３９】
［第６の実施の形態］
以上の実施の形態では、センサ基板１を主にガラス板等のチップ上に作製して、バイオセンサを構成する例について説明したが、本実施の形態では、センサ基板１をガラスファイバの端面に作製して、バイオセンサを構成する例について説明する。センサ基板１をガラスファイバの端面に形成して、バイオセンサを構成すれば、プローブ部分が微小なセンサを構成でき、プローブ部分を微小セルに挿入でき、微量の試料を測定可能である。また、プローブ部分を測定器から切り離して移動でき、便宜である。
【００４０】
以上、本発明の実施の形態について説明したが、本発明は上記の実施の形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で実施の形態に種々変更を加えられることは明白である。
【００４１】
例えば、以上の実施の形態では、センサ基板の基礎成分としての非酸化性金属が金の場合を主に説明したが、金に代えて銅も使用可能である。銅の場合の波長範囲は金とほぼ同じである。また、以上の実施の形態では、アナライトとリガンドとの組み合わせについては、リガンドがビオチンでアナライトが抗ビオチン抗体の例について主に説明したが、他の組み合わせも可能である。例えば、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ（リボ核酸）、ＤＮＡ−タンパク質、ＤＮＡ−糖、ＤＮＡ−有機化合物、タンパク質−タンパク質、脂質−タンパク質、糖−タンパク質、タンパク質−有機化合物等の相互作用の検出も可能である。また、誘電体の代わりに誘電率の設計が可能なメタ物質（人工的に作り出される負の屈折率を示す物質）の利用も可能であり、金属酸化物、誘電体等も種々選択して使用可能である。また、合金の比率、ＵＶ照射条件、溶液浸漬条件等も適宜変更可能である。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明は、検出対象分子を高感度に検出するためのバイオセンサに利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】センサ基板からの異常反射を説明するための図である。
【図２】反射率変化を媒質Ｍ３の誘電率の実部、虚部に対してプロットした図である。
【図３】第１の実施の形態におけるバイオセンサの構成例を示す図である。
【図４】第１の実施の形態におけるバイオセンサの製造方法の例を示す図である。
【図５】自己組織化単分子層とリガンドの例の化学構造式を示す図である。
【図６】センサ基板の媒質としてＡｕを用いた場合の異常反射の実験例を示す図である。
【図７】センサ基板の媒質としてＡｕとＡｇを１：１の重量比で蒸着し、その後空気中で自然酸化した場合の異常反射の実験例を示す図である。
【図８】センサ基板の媒質としてＡｕとＡｇを１：１の重量比で蒸着し、その後ＵＶオゾンで酸化した場合の異常反射の実験例を示す図である。
【図９】センサ基板の媒質としてＡｕとＡｇを３：１の重量比で蒸着し、その後空気中で自然酸化した場合の異常反射の実験例を示す図である。
【図１０】センサ基板の媒質としてＡｕとＡｇを３：１の重量比で蒸着し、その後ＵＶオゾンで酸化した場合の異常反射の実験例を示す図である。
【図１１】バイオセンシングの原理を説明するための図である。
【図１２】従来の全反射減衰法によるバイオセンサを説明するための図である。
【符号の説明】
【００４４】
１ センサ基板
２ アナライト（対象物質）
３ リガンド
４ 自己組織化単分子層
５ プリズム
６ 金属薄膜
７ 入射光
８ 表面プラズモン
９ 反射光
１０、１０Ａ バイオセンサ
１１ チップ
Ｍ１〜Ｍ３ 媒質
ｎ１〜ｎ３ 屈折率
Ｒ 反射率
ΔＲ 反射率変化
ε 誘電率
θ 入射角
θｒ 共鳴角
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光に対する異常反射の反射率変化から吸着又は結合する対象物質を検出するセンサ基板であって、金等の非酸化性金属を基礎成分とし、銀等の酸化性金属又は酸化銀等の金属酸化物を含む、波長３８０ないし５００ｎｍのいずれかの光に対して前記非酸化性金属より実部が大きく虚部が小さい所定の範囲の複素誘電率を呈するセンサ基板。
【請求項２】
前記非酸化性金属が金であり、前記酸化性金属が銀であるか又は前記金属酸化物が酸化銀であって、金と銀の重量比が１００対１から５０対５０である請求項１に記載のセンサ基板。
【請求項３】
光に対する異常反射の反射率変化から吸着又は結合する対象物質を検出するセンサ基板であって、金等の非酸化性金属を基礎成分とし、シリコン酸化物、フッ化マグネシウム等の誘電体を含む、波長３８０ないし５００ｎｍのいずれかの光に対して前記非酸化性金属より実部が大きく虚部が小さい所定の範囲の複素誘電率を呈するセンサ基板。
【請求項４】
前記非酸化性金属と前記誘電体の組み合わせは、粒子混合構造、２相混合構造（分散構造を含む）又は積層構造である請求項３に記載のセンサ基板。
【請求項５】
光に対する異常反射の反射率変化から吸着又は結合する対象物質を検出するセンサ基板であって、金等の非酸化性金属からなり、又は前記非酸化性金属を基礎成分とし、多孔性構造とすることにより、波長３８０ないし５００ｎｍのいずれかの光に対して前記非酸化性金属より実部が大きく虚部が小さい所定の範囲の複素誘電率を呈するセンサ基板。
【請求項６】
前記非酸化性金属が金であり、前記所定の範囲は実部が−１ないし３、虚部が０．３ないし４．５である請求項１ないし請求項５に記載のセンサ基板。
【請求項７】
請求項１ないし請求項６に記載のセンサ基板を備え、前記センサ基板表面にリガンドを形成したバイオセンサ。
【請求項８】
請求項１ないし請求項４に記載のセンサ基板として金等の非酸化性金属を基礎成分とし、銀等の酸化性金属、酸化銀等の金属酸化物又はシリコン酸化物、フッ化マグネシウム等の誘電体を含むものを堆積して形成する工程と、前記センサ基板の表面に自己組織化単分子層を浸漬法により形成する工程と、前記自己組織化単分子層を浸漬法によりリガンド化する工程とを備えるバイオセンサの製造方法。
【請求項１】
光に対する異常反射の反射率変化から吸着又は結合する対象物質を検出するセンサ基板であって、金等の非酸化性金属を基礎成分とし、銀等の酸化性金属又は酸化銀等の金属酸化物を含む、波長３８０ないし５００ｎｍのいずれかの光に対して前記非酸化性金属より実部が大きく虚部が小さい所定の範囲の複素誘電率を呈するセンサ基板。
【請求項２】
前記非酸化性金属が金であり、前記酸化性金属が銀であるか又は前記金属酸化物が酸化銀であって、金と銀の重量比が１００対１から５０対５０である請求項１に記載のセンサ基板。
【請求項３】
光に対する異常反射の反射率変化から吸着又は結合する対象物質を検出するセンサ基板であって、金等の非酸化性金属を基礎成分とし、シリコン酸化物、フッ化マグネシウム等の誘電体を含む、波長３８０ないし５００ｎｍのいずれかの光に対して前記非酸化性金属より実部が大きく虚部が小さい所定の範囲の複素誘電率を呈するセンサ基板。
【請求項４】
前記非酸化性金属と前記誘電体の組み合わせは、粒子混合構造、２相混合構造（分散構造を含む）又は積層構造である請求項３に記載のセンサ基板。
【請求項５】
光に対する異常反射の反射率変化から吸着又は結合する対象物質を検出するセンサ基板であって、金等の非酸化性金属からなり、又は前記非酸化性金属を基礎成分とし、多孔性構造とすることにより、波長３８０ないし５００ｎｍのいずれかの光に対して前記非酸化性金属より実部が大きく虚部が小さい所定の範囲の複素誘電率を呈するセンサ基板。
【請求項６】
前記非酸化性金属が金であり、前記所定の範囲は実部が−１ないし３、虚部が０．３ないし４．５である請求項１ないし請求項５に記載のセンサ基板。
【請求項７】
請求項１ないし請求項６に記載のセンサ基板を備え、前記センサ基板表面にリガンドを形成したバイオセンサ。
【請求項８】
請求項１ないし請求項４に記載のセンサ基板として金等の非酸化性金属を基礎成分とし、銀等の酸化性金属、酸化銀等の金属酸化物又はシリコン酸化物、フッ化マグネシウム等の誘電体を含むものを堆積して形成する工程と、前記センサ基板の表面に自己組織化単分子層を浸漬法により形成する工程と、前記自己組織化単分子層を浸漬法によりリガンド化する工程とを備えるバイオセンサの製造方法。
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１】
【図２】
【図３】
【図１１】
【図１２】
【図５】
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【図１０】
【図１】
【図２】
【図３】
【図１１】
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【公開番号】特開２００９−５８２６３（Ｐ２００９−５８２６３Ａ）
【公開日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２２３９５０（Ｐ２００７−２２３９５０）
【出願日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【出願人】（３０４０２１４１７）国立大学法人東京工業大学 (1,821)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【出願人】（３０４０２１４１７）国立大学法人東京工業大学 (1,821)
【Ｆターム（参考）】
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