タバコ中のノルニコチン合成を最小限にするための組成物および方法
タバコ植物およびその植物部分におけるノルニコチンおよびＮ’−ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ）のレベルを低減するための組成物および方法が提供される。組成物は、これらの植物におけるニコチンからノルニコチンへの代謝変換に関与する根特異的ニコチン脱メチル化酵素ＣＹＰ８２Ｅ１０およびそのバリアントについての単離ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含む。本発明の組成物は、ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素をコードする遺伝子において変異を含むタバコ植物またはその植物部分も含み、該変異は、ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素の発現または機能の低減をもたらす。これらのタバコ植物の種子またはその子孫、および本発明のタバコ植物またはその植物部分もしくは子孫から調製されるタバコ製品も提供される。タバコ植物またはその植物部分におけるノルニコチンのレベルを低減するかまたはニコチンからノルニコチンへの変換率を低減する方法も提供される。これらの方法は、タバコ植物のゲノムに、少なくとも３つのニコチン脱メチル化酵素遺伝子のそれぞれの少なくとも１つの対立遺伝子内の変異を導入することを含み、前記変異は、ニコチン脱メチル化酵素遺伝子の発現を低減し、これらのニコチン脱メチル化酵素遺伝子の第１のものは、タバコ植物またはその植物部分におけるニコチンからノルニコチンへの代謝変換に関与する根特異的ニコチン脱メチル化酵素をコードする。これらの方法は、ノルニコチンおよびその発癌性代謝産物ＮＮＮのレベルが低減され、よってこれらのタバコ製品を消費するかまたはこれらの製品に由来する二次的な煙に曝露される個体についての発癌可能性が低減されたタバコ製品の製造において用いられる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［配列表の組込み］
配列表の正式な写しを、２０１１年１月１２日に作成した１４９ＫＢのサイズの「４００７１２ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」というファイル名を有するＡＳＣＩＩフォーマットされた配列表として、ＥＦＳ−Ｗｅｂを通じて電子的に提出し、本明細書と同時に出願する。このＡＳＣＩＩフォーマットされた文書に含まれる配列表は、明細書の一部分であり、参照することによりその全体が本明細書の一部をなすものとする。
【０００２】
［発明の分野］
本発明は、タバコ植物およびその植物部分におけるノルニコチン合成、よって、その代謝産物であるＮ’−ニトロソノルニコチンを最小限にするための組成物および方法、特に根特異的ニコチン脱メチル化酵素と緑葉および老化誘導性ニコチン脱メチル化酵素との組合せの発現または機能を阻害するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
商業的なタバコ品種で見出される主なアルカロイドはニコチンであり、典型的に、全アルカロイドプールの９０〜９５％を占める。残りのアルカロイド画分は、３つのさらなるピリジンアルカロイド、すなわちノルニコチン、アナバシンおよびアナタビンで主に構成される。ノルニコチンは、ニコチンＮ脱メチル化酵素の酵素活性により、ニコチンから直接産生される。ノルニコチンは、通常、全ピリジンアルカロイドプールの５％未満であるが、「変換」と呼ばれるプロセスにより、最初は非常に少量のノルニコチンを生成するタバコ植物が、大きいパーセンテージの葉ニコチンをノルニコチンに代謝的に「変換」する子孫を生じさせる。遺伝的に変換されたタバコ植物（「コンバータ」と称する）において、ノルニコチン生成の大部分は、成熟葉の老化および乾燥の間に起こる（ＷｅｒｎｓｍａｎおよびＭａｔｚｉｎｇｅｒ（１９６８）Ｔｏｂ．Ｓｃｉ．１２：２２６〜２２８頁）。バーレータバコ（Ｂｕｒｌｅｙ ｔｏｂａｃｃｏ）は、特に遺伝子変換を受けやすく、いくつかの栽培変種では世代あたり２０％という高い割合である。
【０００４】
タバコの葉の乾燥および加工の間に、ノルニコチンの一部は、実験動物において発癌性が主張されているタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）であるＮ−ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ）という化合物に代謝される（ＨｅｃｈｔおよびＨｏｆｆｍａｎｎ（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｒｖｅｙｓ ８：２７３〜２９４頁；Ｈｏｆｆｍａｎｎら（１９９４）Ｊ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｈｅａｌｔｈ ４１：１〜５２頁；Ｈｅｃｈｔ（１９９８）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１１：５５９〜６０３頁）。熱風乾燥タバコでは、ＴＳＮＡは、伝統的な乾燥小屋で見られる直火加熱システムにより形成される燃焼ガス中に存在する微量の窒素酸化物とのアルカロイドの反応により主に形成されることが見出されている（ＰｅｅｌｅおよびＧｅｎｔｒｙ（１９９９）「Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｏｂａｃｃｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｎｉｔｒｏｓａｍｉｎｅｓ ｉｎ Ｆｌｕｅ−ｃｕｒｅｄ Ｔｏｂａｃｃｏ」、ＣＯＲＥＳＴＡ Ｍｅｅｔｉｎｇ、Ａｇｒｏ−Ｐｈｙｔｏ Ｇｒｏｕｐｓ、Ｓｕｚｈｏｕ、Ｃｈｉｎａ）。これらの乾燥小屋を改造して熱交換器を設置することにより、燃焼ガスと乾燥空気との混合を実質的に排除し、この様式で乾燥させたタバコ中のＴＳＮＡの形成を劇的に低減させた（ＢｏｙｅｔｔｅおよびＨａｍｍ（２００１）Ｒｅｃ．Ａｄｖ．Ｔｏｂ．Ｓｃｉ．２７：１７〜２２頁）。これとは対照的に、空気乾燥バーレータバコでは、ＴＳＮＡ形成は、葉媒介微生物により触媒されるプロセスであるタバコアルカロイドと亜硝酸塩との反応により主に進行する（Ｂｕｓｈら（２００１）Ｒｅｃ．Ａｄｖ．Ｔｏｂ．Ｓｃｉ．２７：２３〜４６頁）。これまで、許容できる品質基準を維持しながら乾燥条件を改変することによりＴＳＮＡを低減するための試みは、空気乾燥タバコについて成功していない。
【０００５】
ＮＮＮの前駆体として機能することに加え、最近の研究は、タバコ製品で見られるノルニコチンが、さらなる望ましくない健康上の結果を有し得ることを示唆している。ＤｉｃｋｅｒｓｏｎおよびＪａｎｄａ（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１５０８４〜１５０８８頁は、ノルニコチンが、細胞内の異常なタンパク質グリケーションの原因となることを証明した。ノルニコチンで修飾されたタンパク質の濃度は、非喫煙者と比較して、喫煙者の血漿中でより高いことが見出された。また、これと同じ研究により、ノルニコチンが、プレドニゾンのような一般的なステロイド処方薬を共有結合的に修飾し得ることが示された。このような修飾は、これらの薬物の効力および毒性の両方を変更する可能性を有する。さらに、タバコ製品で見られるノルニコチンと、加齢黄斑変性、先天異常および歯周疾患との関連が、研究で報告されている（Ｂｒｏｇａｎら（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：１０４３３〜１０４３８頁；Ｋａｔｚら（２００５）Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．７６：１１７１〜１１７４頁）。
【０００６】
バーレータバコでは、葉のノルニコチン含量と、乾燥させた生成物中に蓄積されるＮＮＮの量との間に正の相関が見出されている（Ｂｕｓｈら（２００１）Ｒｅｃ．Ａｄｖ．Ｔｏｂ．Ｓｃｉ、２７：２３〜４６頁；Ｓｈｉら（２０００）Ｔｏｂ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｃｏｎｆ．５４：要約２７）。よって、葉のノルニコチン含量を効果的に低減できる方策は、上記のようなノルニコチン自体の潜在的な負の健康上の結果を改善するのに役立つだけでなく、ＮＮＮレベルも付随して低減させるはずである。この相関は、Ｌｅｗｉｓら（２００８）Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｊ．６：３４６〜３５４頁による最近の研究でさらに強固にされ、彼らは、老化誘導性ニコチン脱メチル化酵素をコードするＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２遺伝子を対象とするＲＮＡｉ導入遺伝子構築物を用いてノルニコチンのレベルを低下することにより、乾燥させた葉のＮＮＮ含量が付随して低減されたことを証明した。この研究は、トランスジェニック技術を用いて、タバコのノルニコチンおよびＮＮＮの含量を大きく低減できることを証明したが、公共認識と知的財産の問題との組合せにより、トランスジェニック植物から得られる製品を商業化することが非常に困難になっている。
【０００７】
よって、トランスジェニックの使用に依存しない、タバコ中のノルニコチン蓄積を効果的に最小限にするための手段への大きな必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００８】
タバコ植物およびその植物部分におけるノルニコチン含量を最小限にするための組成物および方法が提供される。組成物は、配列番号１に示すＣＹＰ８２Ｅ１０ポリヌクレオチドと称する単離根特異的シトクロムＰ４５０ポリヌクレオチド、および、それによりコードされる、配列番号２に示すＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素ポリペプチド、ならびに配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３に示す配列を含むポリペプチド、および配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３に示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むがこれらに限定されないそれらのバリアントおよび断片を含む。本発明のＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドは、タバコ植物の根におけるニコチンからノルニコチンへの代謝変換に関与するニコチン脱メチル化酵素である。本発明の単離ポリヌクレオチドは、配列番号３または４に示す配列を含むポリヌクレオチド、ならびにそれらのバリアントおよび断片も含む。本発明の組成物は、ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素をコードする遺伝子において変異を含むタバコ植物またはその植物部分も含み、該変異は、ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素の発現または機能の低減をもたらす。いくつかの実施形態では、本発明のタバコ植物は、ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素をコードする遺伝子における変異および／またはＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素をコードする遺伝子における変異をさらに含み、これらの遺伝子における変異は、ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素またはＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素の発現または機能の低減をもたらす。これらのタバコ植物の種子またはその子孫、および、本発明のタバコ植物またはその植物部分もしくは子孫から調製されたタバコ製品も提供される。
【０００９】
タバコ植物またはその植物部分におけるノルニコチンのレベルを低減するかまたはニコチンからノルニコチンへの変換率を低減するための方法も提供される。これらの方法は、タバコ植物のゲノムに、少なくとも３つのニコチン脱メチル化酵素遺伝子の各々の少なくとも１つの対立遺伝子内の変異を導入するステップを含み、該変異は、ニコチン脱メチル化酵素遺伝子の発現を低減させ、これらのニコチン脱メチル化酵素遺伝子の第１のものは、タバコ植物またはその植物部分におけるニコチンからノルニコチンへの代謝変換に関与する根特異的ニコチン脱メチル化酵素をコードする。いくつかの実施形態では、根特異的ニコチン脱メチル化酵素は、ＣＹＰ８２Ｅ１０またはそのバリアントである。他の実施形態では、これらの方法は、タバコ植物のゲノムに、ＣＹＰ８２Ｅ１０またはそのバリアントをコードするニコチン脱メチル化酵素遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子内の変異と、ＣＹＰ８２Ｅ４もしくはそのバリアントをコードするニコチン脱メチル化酵素および／またはＣＹＰ８２Ｅ５もしくはそのバリアントをコードするニコチン脱メチル化酵素の少なくとも１つの対立遺伝子内の変異とを導入するステップを含む。ノルニコチンのレベルが低いタバコ植物を同定する方法も提供され、植物またはその植物部分を、ＣＹＰ８２Ｅ１０もしくはそのバリアントをコードする遺伝子における変異の存在について単独でスクリーニングするか、あるいはＣＹＰ８２Ｅ４もしくはそのバリアントをコードする遺伝子における変異の存在、および／またはＣＹＰ８２Ｅ５もしくはそのバリアントをコードする遺伝子における変異の存在についてスクリーニングすることと組み合わせる。
【００１０】
以下の実施形態は、本発明に包含される。
【００１１】
１．ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素をコードする遺伝子において変異を含むタバコ植物またはその植物部分であって、前記変異が、前記ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素の発現または機能の低減をもたらすタバコ植物またはその植物部分。
【００１２】
２．前記ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素が、配列番号２、５、６、７、８および９に示す配列からなる群より選択される実施形態１に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【００１３】
３．前記変異が、アミノ酸残基７９、１０７、３８２、４１９およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される位置にて生じる前記ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素の改変をもたらし、前記番号付けが配列番号２に従う実施形態１または２に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【００１４】
４．前記変異が、
ａ）７９位のグリシン残基のセリンによる置換、
ｂ）１０７位のプロリン残基のセリンによる置換、
ｃ）３８２位のプロリン残基のセリンによる置換、
ｄ）４１９位のプロリン残基のセリンによる置換、および
ｅ）それらの任意の組合せ
からなる群より選択される実施形態３に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【００１５】
５．ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素をコードする遺伝子において変異をさらに含み、前記変異が、前記ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素の発現または機能の低減をもたらす実施形態１〜４のいずれかに記載のタバコ植物またはその植物部分。
【００１６】
６．前記ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素が、配列番号１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０に示す配列から選択される実施形態５に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【００１７】
７．前記変異が、アミノ酸残基３２９、３６４、３７６、３８２および４５８からなる群より選択される位置にて生じる前記ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素の改変をもたらし、前記番号付けが配列番号１４に従う実施形態５または６に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【００１８】
８．前記変異が、
ａ）３２９位のトリプトファン残基の停止コドンによる置換、
ｂ）３６４位のリシン残基のアスパラギンによる置換、
ｃ）３７６位のバリン残基のメチオニンによる置換、
ｄ）３８２位のプロリン残基のセリンによる置換、
ｄ）４５８位のプロリン残基のセリンによる置換、および
ｅ）それらの任意の組合せ
からなる群より選択される実施形態７に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【００１９】
９．ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素をコードする遺伝子において変異をさらに含み、前記変異が、前記ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素の発現または機能の低減をもたらす実施形態１〜８のいずれかに記載のタバコ植物またはその植物部分。
【００２０】
１０．前記ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素が、配列番号２６、２７、２８、２９、３０、３１および３２に示す配列から選択される実施形態９に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【００２１】
１１．前記変異が、アミノ酸残基４２２および４４９からなる群より選択される位置にて生じる前記ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素の改変をもたらし、前記番号付けが配列番号２６に従う実施形態９または１０に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【００２２】
１２．前記変異が、
ａ）４２２位でトリプトファン残基と置換した停止コドン、
ｂ）４４９位でプロリン残基と置換したロイシン、および
ｃ）それらの任意の組合せ
からなる群より選択される実施形態１１に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【００２３】
１３．前記ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素遺伝子および前記ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素遺伝子において変異を含む実施形態９〜１２のいずれかに記載のタバコ植物またはその植物部分。
【００２４】
１４．前記変異についてホモ接合型である実施形態１〜１３のいずれかに記載のタバコ植物またはその植物部分。
【００２５】
１５．前記ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素が３８２位に変異を含み、前記ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素が３２９位に変異を含み、前記ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素が４２２位に変異を含み、前記番号付けがそれぞれ配列番号２、１４および２６に従う実施形態１４に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【００２６】
１６．前記変異が、
ａ）３８２位のプロリン残基のセリンによる置換、
ｂ）３２９位のトリプトファン残基の停止コドンによる置換、
ｃ）４２２位のトリプトファン残基の停止コドンによる置換、および
ｄ）それらの任意の組合せ
からなる群より選択される実施形態１５に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【００２７】
１７．前記植物またはその部分が、１．５％未満の、ニコチンからノルニコチンへの変換を有する実施形態１３〜１６のいずれかに記載のタバコ植物またはその植物部分。
【００２８】
１８．前記植物またはその部分が、０．５％以下の、ニコチンからノルニコチンへの変換を有する実施形態１７に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【００２９】
１９．実施形態１〜１８のいずれかに記載のタバコ植物の種子またはその子孫。
【００３０】
２０．実施形態１〜１９のいずれかに記載のタバコ植物またはその植物部分もしくは子孫から調製されるタバコ製品。
【００３１】
２１．タバコ製品の発癌可能性を低減する方法であって、前記タバコ製品を、実施形態１〜１８のいずれかに記載のタバコ植物またはその植物部分もしくは子孫から調製するステップを含む方法。
【００３２】
２２．タバコ植物またはその植物部分におけるノルニコチンのレベルを低減するかまたはニコチンからノルニコチンへの変換率を低減する方法であって、前記植物のゲノムに、少なくとも３つのニコチン脱メチル化酵素遺伝子の各々の少なくとも１つの対立遺伝子内の変異を導入するステップを含み、前記変異が、前記ニコチン脱メチル化酵素遺伝子の発現を低減し、前記ニコチン脱メチル化酵素遺伝子の第１のものが、タバコ植物またはその植物部分におけるニコチンからノルニコチンへの代謝変換に関与する根特異的ニコチン脱メチル化酵素をコードする方法。
【００３３】
２３．前記根特異的ニコチン脱メチル化酵素が、
ａ）配列番号２、５、６、７、８、９または１０に示すアミノ酸配列、および
ｂ）配列番号２、５、６、７、８、９または１０に示すアミノ酸配列と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素である実施形態２２に記載の方法。
【００３４】
２４．前記ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素についての前記アミノ酸配列が、残基７９、１０７、３８２、４１９およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される位置のアミノ酸残基での置換を有し、前記番号付けが配列番号２に従う実施形態２３に記載の方法。
【００３５】
２５．７９位、１０７位、３８２位または４１９位での前記置換が、セリン残基である実施形態２４に記載の方法。
【００３６】
２６．前記ニコチン脱メチル化酵素遺伝子の第２のものが、ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素をコードする実施形態２２〜２５のいずれか１つに記載の方法。
【００３７】
２７．前記ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素が、
ａ）配列番号１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１に示すアミノ酸配列、および
ｂ）配列番号１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１に示す配列と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む実施形態２６に記載の方法。
【００３８】
２８．前記ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素についての前記アミノ酸配列が、残基３２９、３６４、３８２、４５８およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される位置のアミノ酸残基での置換を有し、前記番号付けが配列番号１４に従う実施形態２７に記載の方法。
【００３９】
２９．３２９位での前記置換が停止コドンであるか、３６４位での前記置換がアスパラギン残基であるか、３８２位での前記置換がセリン残基であるか、４５８位での前記置換がセリン残基であるか、またはそれらの任意の組合せである実施形態２８に記載の方法。
【００４０】
３０．前記ニコチン脱メチル化酵素遺伝子の第３のものが、ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素をコードする実施形態２２〜２９のいずれか１つに記載の方法。
【００４１】
３１．前記ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素が、
ａ）配列番号２６、２７、２８、２９、３０、３１または３２に示すアミノ酸配列、および
ｂ）配列番号２６、２７、２８、２９、３０、３１または３２に示す配列と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態３０に記載の方法。
【００４２】
３２．前記ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素についての前記アミノ酸配列が、残基４２２および４４９ならびにそれらの任意の組合せからなる群より選択される位置のアミノ酸残基での置換を有し、番号付けが配列番号２６に従う実施形態３１に記載の方法。
【００４３】
３３．４２２位での前記置換が停止コドンであるか、４４９位での前記置換がロイシン残基であるか、またはそれらの任意の組合せである実施形態３２に記載の方法。
【００４４】
３４．前記植物またはその植物部分が、前記変異についてホモ接合型である実施形態２２〜３３のいずれか１つに記載の方法。
【００４５】
３５．前記導入するステップが、育種手順を含む実施形態２２〜３４のいずれか１つに記載の方法。
【００４６】
３６．前記植物が、バーレー（Ｂｕｒｌｅｙ）タバコ植物、バージニア（Ｖｉｒｇｉｎｉａ）タバコ植物、熱風乾燥（ｆｌｕｅ−ｃｕｒｅｄ）タバコ植物、空気乾燥（ａｉｒ−ｃｕｒｅｄ）タバコ植物、火力乾燥（ｆｉｒｅ−ｃｕｒｅｄ）タバコ植物、オリエンタル（Ｏｒｉｅｎｔａｌ）タバコ植物またはダーク（ｄａｒｋ）タバコ植物である実施形態２２〜３５のいずれか１つに記載の方法。
【００４７】
３７．前記タバコ植物が、バーレータバコ植物、バージニアタバコ植物、熱風乾燥タバコ植物、空気乾燥タバコ植物、火力乾燥タバコ植物、オリエンタルタバコ植物またはダークタバコ植物である実施形態１〜１８のいずれかに記載のタバコ植物またはその植物部分。
【００４８】
３８．ノルニコチンのレベルが低いタバコ植物を同定する方法であって、配列番号１または３中の変異の存在について、対象のタバコ植物からのＤＮＡ試料をスクリーニングするステップを含む方法。
【００４９】
３９．前記タバコ植物が、非コンバータである実施形態３８に記載の方法。
【００５０】
４０．前記スクリーニングが、配列番号１、３、３５、３６、３７および３８からなる群より選択される配列を用いて行われる実施形態３８または３９に記載の方法。
【００５１】
４１．配列番号１４中の変異の存在、配列番号２６中の変異の存在または配列番号１４および配列番号２６中の変異の存在について、前記ＤＮＡ試料または前記対象のタバコ植物からの別のＤＮＡ試料をスクリーニングするステップをさらに含む実施形態３８〜４０のいずれか１つに記載の方法。
【００５２】
４２．ａ）配列番号１、３または４を含むヌクレオチド配列、
ｂ）配列番号１、３または４の少なくとも２０の連続するヌクレオチドの断片を含むヌクレオチド配列、
ｃ）配列番号１に示す配列全体と少なくとも９７％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、前記ポリヌクレオチドが、植物におけるニコチンからノルニコチンへの前記代謝変換に関与するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｄ）配列番号２および５〜１３からなる群より選択されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列または少なくとも１１５の連続する残基を含むその断片、
ｅ）配列番号２、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３に示す配列と少なくとも９８％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ならびに
ｆ）前記項目（ａ）から（ｅ）のいずれかによる前記配列と相補的なヌクレオチド配列
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド。
【００５３】
４３．ａ）配列番号２、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３に示すアミノ酸配列、
ｂ）配列番号２、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３に示すアミノ酸配列と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列、および
ｃ）配列番号２、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３に示すアミノ酸配列の断片であるアミノ酸配列であって、前記断片が、配列番号２、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３のアミノ酸配列の少なくとも１１５の連続する残基を含むアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
【００５４】
４４．ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素をコードする遺伝子、ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素をコードする遺伝子、およびＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素をコードする遺伝子における変異についてホモ接合型であるタバコ植物またはその植物部分であって、前記変異が、前記ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素、ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素およびＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素の発現または機能の低減をもたらし、前記ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素が３８２位に変異を含み、前記ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素が３２９位に変異を含み、前記ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素が４２２位に変異を含み、前記番号付けがそれぞれ配列番号２、１４および２６に従うタバコ植物またはその植物部分。
【００５５】
４５．ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素をコードする遺伝子における変異であって、前記ＣＹＰｅ２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素の発現または機能の低減をもたらす変異。
【００５６】
４６．根におけるニコチン脱メチル化酵素活性を阻害するＣＹＰ８２Ｅ１０遺伝子における変異、老化した葉におけるニコチン脱メチル化酵素活性を阻害するＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２遺伝子における変異、および緑葉におけるニコチン脱メチル化酵素活性を阻害するＣＹＰ８３Ｅ５遺伝子における変異を有する植物。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１Ａ−Ｃ】ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素遺伝子のＤＮＡ（配列番号４）および予測タンパク質配列を示す図である。タンパク質コード配列は大文字であり、５’および３’フランキング配列は小文字である。イントロン配列（配列番号３）は、小文字の斜体である。ヌクレオチド配列についての番号は左に示し、タンパク質配列についての番号は右に表示する。変異スクリーニングのためにエキソン１を特異的に増幅するために用いたＰＣＲプライマーに相当するヌクレオチド配列に下線を付し（太字で示さない）、一方、太字で下線を付した配列は、エキソン２特異的プライマー部位を表す。変異スクリーニングにおいて変更されていることが見出された個別のヌクレオチドおよびアミノ酸残基（表２）は、太字で下線を付す。
【図２Ａ−Ｃ】ＣＹＰ８２Ｅ１０（配列番号４）、ＣＹＰ８２Ｅ５ｖ２（配列番号３８）およびＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２（配列番号３７）についてのゲノム配列のアラインメントを示す図である。タンパク質コード配列は、大文字のタイプであり、５’および３’非翻訳領域は、小文字のタイプで示し、イントロン配列は、小文字の斜体のタイプで示す。配列同一性を共有する位置は、影のついた箱で囲む。
【図３】ＣＹＰ８２Ｅ１０、および植物１０４１由来のＳｅｒ３８２Ｐｒｏ（Ｓ３８２Ｐ）変異を有するＣＹＰ８２Ｅ１０を発現する酵母由来のミクロソーム膜のニコチン脱メチル化酵素活性の薄層クロマトグラフィーデータを示す図である。ＣＰＭ、カウント毎分。
【図４】図４および図４Ｂは、ＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２、ＣＹＰ８２Ｅ５ｖ２およびＣＹＰ８２Ｅ１０遺伝子座での様々な変異組合せを有するバーレータバコ植物についての平均ニコチン変換率を示す図である。異なる文字を有する平均は、Ｐ＜０．０５レベルで有意に異なる。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
［配列表の配列についての記載］
以下の列挙は、配列表についての配列情報を示す。アミノ酸置換についての標準的な表記を用いる。つまり、例えば、ＣＹＰ８２Ｅ１０ Ｐ４１９Ｓは、バリアントタンパク質が、４１９位でのプロリン残基のセリンによる置換を有する（番号付けは、野生型配列、この場合は配列番号２に示すＣＹＰ８２Ｅ１０配列に関する）ことを示す。別の例として、ＣＹＰ８２Ｅ４ Ｐ３８Ｌは、バリアントタンパク質が、３８位のプロリン残基のロイシンによる置換を有する（番号付けは、野生型配列、この場合は配列番号１４に示すＣＹＰ８２Ｅ４配列に関する）ことを示す。なお別の例として、ＣＹＰ８２Ｅ５ Ｐ７２Ｌは、バリアントタンパク質が、７２位のプロリン残基のロイシンによる置換を有する（番号付けは、野生型配列、この場合は配列番号２６に示すＣＹＰ８２Ｅ５配列に関する）ことを示す。
【００５９】
配列番号１は、ＣＹＰ８２Ｅ１０についてのコード配列を示す。
配列番号２は、ＣＹＰ８２Ｅ１０についてのアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、ＣＹＰ８２Ｅ１０遺伝子のイントロンのヌクレオチド配列を示す。
配列番号４は、ＣＹＰ８２Ｅ１０についてのゲノム配列を示す。
配列番号５は、ＣＹＰ８２Ｅ１０ Ｌ１４８Ｆについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号６は、ＣＹＰ８２Ｅ１０ Ｇ１７２Ｒについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号７は、ＣＹＰ８２Ｅ１０ Ａ３４４Ｔについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号８は、ＣＹＰ８２Ｅ１０ Ａ４１０Ｔについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号９は、ＣＹＰ８２Ｅ１０ Ｒ４１７Ｈについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０は、ＣＹＰ８２Ｅ１０ Ｐ４１９Ｓについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１は、ＣＹＰ８２Ｅ１０ Ｇ７９Ｓについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２は、ＣＹＰ８２Ｅ１０ Ｐ１０７Ｓについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号１３は、ＣＹＰ８２Ｅ１０ Ｐ３８２Ｓについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号１４は、ＣＹＰ８２Ｅ４についてのアミノ酸配列を示す。
配列番号１５は、ＣＹＰ８２Ｅ４ Ｐ３８Ｌについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号１６は、ＣＹＰ８２Ｅ４ Ｄ１７１Ｎについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号１７は、ＣＹＰ８２Ｅ４ Ｅ２０１Ｋについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号１８は、ＣＹＰ８２Ｅ４ Ｒ１６９Ｑについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号１９は、ＣＹＰ８２Ｅ４ Ｇ４５９Ｒについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号２０は、ＣＹＰ８２Ｅ４ Ｔ４２７Ｉについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号２１は、ＣＹＰ８２Ｅ４ Ｖ３７６Ｍについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号２２は、ＣＹＰ８２Ｅ４ Ｗ３２９Ｓｔｏｐについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号２３は、ＣＹＰ８２Ｅ４ Ｋ３６４Ｎについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号２４は、ＣＹＰ８２Ｅ４ Ｐ３８２Ｓについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号２５は、ＣＹＰ８２Ｅ４ Ｐ４５８Ｓについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号２６は、ＣＹＰ８２Ｅ５についてのアミノ酸配列を示す。
配列番号２７は、ＣＹＰ８２Ｅ５ Ｐ７２Ｌについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号２８は、ＣＹＰ８２Ｅ５ Ｌ１４３Ｆについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号２９は、ＣＹＰ８２Ｅ５ Ｓ１７４Ｌについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号３０は、ＣＹＰ８２Ｅ５ Ｍ２２４Ｉについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号３１は、ＣＹＰ８２Ｅ５ Ｐ２３５Ｓについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号３２は、ＣＹＰ８２Ｅ５ Ａ４１０Ｖについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号３３は、ＣＹＰ８２Ｅ５ Ｗ４２２Ｓｔｏｐについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号３４は、ＣＹＰ８２Ｅ５ Ｐ４４９Ｌについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号３５は、ＣＹＰ８２Ｅ１０のエキソン１についてのフォワードプライマー配列を示す。
配列番号３６は、ＣＹＰ８２Ｅ１０のエキソン１についてのリバースプライマー配列を示す。
配列番号３７は、ＣＹＰ８２Ｅ１０のエキソン２についてのフォワードプライマー配列を示す。
配列番号３７は、ＣＹＰ８２Ｅ１０のエキソン２についてのリバースプライマー配列を示す。
配列番号３８は、ＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２についてのゲノム配列を示す。
配列番号３９は、ＣＹＰ８２Ｅ５ｖ２についてのゲノム配列を示す。
【００６０】
［定義］
本発明は、植物、特に様々な商業的な品種のタバコ植物を含むタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）属の植物の根におけるニコチンからノルニコチンへの代謝変換に関与する根特異的ニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドの発現または機能を阻害するための組成物および方法を含む。
【００６１】
本明細書で用いる場合、「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」、「阻害」および「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）」は、対象の遺伝子産物（すなわち標的遺伝子産物）、この場合は本発明の根特異的ニコチン脱メチル化酵素のようなニコチン脱メチル化酵素の発現または機能を減少させる、当技術分野において既知のまたは本明細書に記載される任意の方法として定義される。ニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドは、センスおよびアンチセンス抑制、ＲＮＡｉ抑制、突然変異誘発のようなノックアウトアプローチなどを含む当技術分野において既知の任意の適切な方法により阻害できることが認識される。特に興味があるものは、これらの根特異的ニコチン脱メチル化酵素の発現および／もしくは機能をノックアウトまたはノックダウンする方法、特にＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素遺伝子における好ましい変異を選択することを可能にする突然変異誘発アプローチである。
【００６２】
「好ましい変異」により意図されるのは、そのニコチン脱メチル化酵素活性が阻害されるようにＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドの置換、挿入、欠失または切断をもたらす変異である。いくつかの実施形態では、ニコチン脱メチル化酵素活性は、同じ試験条件下で野生型ＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドの活性と比較した場合に、少なくとも２５％、３０％、３５、４０％、４５、５０％、５５％または６０％阻害される。他の実施形態では、ニコチン脱メチル化酵素活性は、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％阻害される。好ましい実施形態では、好ましい変異は、完全阻害（すなわち１００％阻害）をもたらし、ニコチン脱メチル化酵素活性は、ノックアウトされる（すなわちその活性を測定できない）。
【００６３】
「阻害する」は、２つの植物の間、例えば遺伝子改変植物および野生型植物の比較との関連であり得る。比較は、植物の間、例えば野生型植物と、ニコチンをノルニコチンに変換する根特異的ニコチン脱メチル化酵素を生成できるＤＮＡ配列を欠くものの１つとの間であり得る。標的遺伝子産物の発現または機能の阻害も、同じ植物のうちもしくは異なる植物間の植物細胞、オルガネラ、器官、組織または植物部分の間の比較との関連であり得、同じ植物もしくは植物部分のうちの発達段階または経時的段階の間の比較あるいは植物もしくは植物部分の間の比較を含む。
【００６４】
「阻害する」は、その遺伝子産物の機能または生成の完全な消去までまたはそれを含む、対象の遺伝子産物、この場合は根特異的ニコチン脱メチル化酵素の機能または生成の任意の相対的な減少を含み得る。遺伝子産物のレベルを比較する場合に、そのような比較は、好ましくは、類似の遺伝子背景を有する生物間で行われる。好ましくは、類似の遺伝子背景は、比較される生物が、核酸遺伝物質の５０％以上、より好ましくは７５％以上、さらにより好ましくは９０％以上の配列同一性を共有する背景である。類似の遺伝子背景は、比較される生物が植物であり、これらの植物が、植物形質転換技術を用いて元来導入された任意の遺伝物質または人間の介在により作製された変異以外は同質遺伝子的である背景である。遺伝子産物のレベルまたは量の測定は、任意の適切な方法により行ってよく、非限定的なその例は、ｍＲＮＡ転写産物レベル、タンパク質もしくはペプチドレベルおよび／または表現型、特にニコチンからノルニコチンへの変換の比較を含むが、それらに限定されない。本明細書で用いる場合、ｍＲＮＡ転写産物は、プロセシングされたおよびプロセシングされていないｍＲＮＡ転写産物を含むことができ、ポリペプチドまたはペプチドは、任意の翻訳後修飾が行われたかもしくは行われていないポリペプチドまたはペプチドを含み得る。
【００６５】
本明細書で用いる場合、「バリアント」は、実質的に同様の配列を意味する。バリアントは、対象の野生型ポリペプチドと異なる機能または実質的に同様の機能を有し得る。ニコチン脱メチル化酵素について、実質的に同様の機能は、同じ条件下でまたは近同質遺伝子系統においてニコチンをノルニコチンに変換する野生型酵素機能の少なくとも９９％、９８％、９７％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、６０％、５０％、２５％または１５％である。野生型ＣＹＰ８２Ｅ１０を、配列番号２に示す。野生型ＣＹＰ８２Ｅ４を、配列番号１４に示す。野生型ＣＹＰ８２Ｅ５を、配列番号２６に示す。本発明の野生型ＣＹＰ８２Ｅ１０の例示的なバリアントは、配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３に示す配列を含むポリペプチドを含む。配列番号１０に示すバリアント（ＣＹＰ８２Ｅ１０ Ｐ４１９Ｓ）は、野生型ＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドのニコチン脱メチル化酵素活性の約２５％だけを有する酵素をもたらす好ましい変異を有利に有する。配列番号１１（ＣＹＰ８２Ｅ１０ Ｇ７９Ｓ）、配列番号１２（Ｐ１０７Ｓを有するＣＹＰ８２Ｅ１０）および配列番号１３（Ｐ３８２Ｓを有するＣＹＰ８２Ｅ１０）に示すバリアントは、それらのニコチン脱メチル化酵素活性のノックアウト（すなわち１００％阻害、よって非機能的ポリペプチド）をもたらす好ましい変異を有利に有する。同様に、野生型ＣＹＰ８２Ｅ４の例示的なバリアントは、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５に示す配列を含むポリペプチドを含む。配列番号２１に示すバリアント（ＣＹＰ８２Ｅ４ Ｖ３７６Ｍ）は、野生型ＣＹＰ８２Ｅ４ポリペプチドのニコチン脱メチル化酵素活性の約５０％だけを有する酵素をもたらす好ましい変異を有利に有する。配列番号２２（ＣＹＰ８２Ｅ４ Ｗ３２９Ｓｔｏｐ）、配列番号２３（ＣＹＰ８２Ｅ４ Ｋ３６４Ｎ）、配列番号２４（ＣＹＰ８２Ｅ４ Ｐ３８２Ｓ）および配列番号２５（ＣＹＰ８２Ｅ４ Ｐ４５８Ｓ）に示すバリアントは、それらのニコチン脱メチル化酵素活性のノックアウト（すなわち１００％阻害）をもたらす好ましい変異を有利に有する。同様に、野生型ＣＹＰ８２Ｅ４の例示的なバリアントは、配列番号２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３または３４に示す配列を含むポリペプチドを含む。配列番号３４に示すバリアント（ＣＹＰ８２Ｅ５ Ｐ４４９Ｌ）は、そのニコチン脱メチル化酵素活性の阻害をもたらす好ましい変異を有利に有し、配列番号３３に示すバリアントは、そのニコチン脱メチル化酵素活性のノックアウト（すなわち１００％阻害）をもたらす好ましい変異を有利に有する。
【００６６】
本明細書で用いる場合、「バリアントポリヌクレオチド」または「バリアントポリペプチド」は、野生型でない核酸またはアミノ酸配列を意味する。
【００６７】
バリアントは、１つの付加、欠失もしくは置換、２つ以下の付加、欠失もしくは置換、３つ以下の付加、欠失もしくは置換、４つ以下の付加、欠失もしくは置換、または５つ以下の付加、欠失もしくは置換を有することができる。変異は、付加、欠失および置換を含む。このような欠失または付加は、Ｃ末端、Ｎ末端、またはＣ末端およびＮ末端の両方であり得る。融合ポリペプチドまたはエピトープタグ付加ポリペプチドも、本発明に含まれる。「サイレント」ヌクレオチド変異は、所定の位置でのコードされるアミノ酸を変化させない。アミノ酸置換は、保存的であり得る。保存置換は、変化が、元のアミノ酸と同じファミリー内のアミノ酸へのものであるアミノ酸の変化である。ファミリーは、個別のアミノ酸の側鎖により定義される。アミノ酸のファミリーは、塩基性、酸性、非荷電極性または非極性側鎖を有することができる。参照することによりその全体が示されるかの如く本明細書の一部をなすものとするＡｌｂｅｒｔｓら、（１９９４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌ（第３版、５６〜５７頁、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。欠失、置換または付加は、その同じ位置での別のＣＹＰ８２Ｅファミリーメンバーのアミノ酸へのものであり得る。本明細書で用いる場合、「断片」は、ポリヌクレオチドの一部分またはそれによりコードされるポリペプチド、よってタンパク質の一部分を意味する。
【００６８】
本明細書で用いる場合、「植物部分」は、植物細胞、植物プロトプラスト、それから植物全体を再生できる植物細胞組織培養物、植物カルス、植物凝集塊、および胚、花粉、葯、胚珠、種子、葉、花、茎、枝、果実、根、根尖などのような植物または植物部分においてインタクトな植物細胞を意味する。再生された植物の子孫、バリアントおよび変異体も、それらが本発明の導入されたポリヌクレオチドを含むことを条件として、本発明の範囲に含まれる。本明細書で用いる場合、「タバコ植物材料」は、植物部分の任意の一部分または植物部分の任意の組合せを意味する。
【００６９】
［発明の詳細な説明］
本発明は、タバコ植物の根におけるニコチンからノルニコチンへの根特異的変換に関与する新規なニコチン脱メチル化酵素遺伝子、ＣＹＰ８２Ｅ１０（ゲノム配列は配列番号４に示す）、およびそれによりコードされるＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素（配列番号２）、ならびにニコチンからノルニコチンへの変換を低減または最小限にすること、すなわちタバコ植物およびその植物部分においてノルニコチンのレベルを低減することにおけるその使用を対象とする。「根特異的」により、それが、葉または種子のようなその他の植物器官に反して、タバコ植物の根の中で優先的に発現されることを意図する。選択された好ましい変異を、緑葉ニコチン脱メチル化酵素（例えば配列番号２６に示すＣＹＰ８２Ｅ５）もしくはニコチン脱メチル化酵素活性を有するそのバリアントをコードする遺伝子内の１つ以上の選択された好ましい変異と組み合わせて、そしてさらに老化誘導性ニコチン脱メチル化酵素（例えば配列番号１４に示すＣＹＰ８２Ｅ４）もしくはニコチン脱メチル化酵素活性を有するそのバリアントをコードする遺伝子内の１つ以上の選択された好ましい変異と組み合わせて、この根特異的ニコチン脱メチル化酵素またはニコチン脱メチル化酵素活性を有するそのバリアントに導入することにより、変換率が約１．５％未満、好ましくは約１％未満である最小限のニコチンからノルニコチンへの変換を有する非トランスジェニックタバコ植物を生成できる。
【００７０】
タバコにおけるノルニコチンのレベルを低下することは、このアルカロイドが、十分に立証されている発癌物質であるＮ’−ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ）の前駆体として働くので、非常に望ましい。タバコにおけるニコチン脱メチル化酵素活性を有するタンパク質をコードする２つの遺伝子は、以前に同定され、ＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２およびＣＹＰ８２Ｅ５ｖ２と称する。ＣＹＰ８２Ｅ４ポリペプチド（配列番号１４）は、老化誘導性ニコチン脱メチル化酵素である。ＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２遺伝子（コードおよびイントロン領域を含む）、タバコ植物中のノルニコチン生成におけるその役割、ならびにその発現および機能を阻害するための方法は、米国特許出願第１１／５８０，７６５号（米国特許出願公開第２００８／０２０２５４１Ａ１として公開された）に記載されている。ＣＹＰ８２Ｅ５ポリペプチド（配列番号２６）は、緑葉ニコチン脱メチル化酵素である（すなわち、その主な発現は緑葉におけるものである）。ＣＹＰ８２Ｅ４遺伝子（コード領域およびイントロン領域を含む）、タバコ植物中のノルニコチン生成におけるその役割、ならびにその発現および機能を阻害するための方法は、米国特許出願第１２／２６９，５３１号（米国特許出願公開第２００９／０２０５０７２Ａ１号として公開された）に記載されている。これらの２つの米国特許出願およびそれらのそれぞれの公報の内容は、それらの全体が参照することにより本明細書の一部をなすものとする。
【００７１】
好ましい変異ｃｙｐ８２ｅ４ｖ２およびｃｙｐ８２ｅ５ｖ２対立遺伝子（すなわちこれらのそれぞれのニコチン脱メチル化酵素遺伝子の発現がノックダウンまたはノックアウトされた変異対立遺伝子）についてホモ接合型の植物は、しかし、それらのニコチンの２％より多くをノルニコチンに代謝でき、これは、実質的なＮＮＮ形成を依然として導くことができるノルニコチンのレベルを表す。ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素遺伝子の発見は、タバコ植物におけるニコチンからノルニコチンへの変換率を最小限にし、よって、タバコ植物およびそれに由来する植物物質中のノルニコチンのレベル、よってＮＮＮのレベルをさらに低減するためのさらなる道を開く。好ましい変異ｃｙｐ８２ｅ１０対立遺伝子を、好ましい変異ｃｙｐ８２ｅ４ｖ２およびｃｙｐ８２ｅ５ｖ２対立遺伝子と組み合わせることにより、ｃｙｐ８２ｅ４ｖ２変異を単独で有するかまたはｃｙｐ８２ｅ５ｖ２変異を一緒に有するタバコ植物について観察されるものと比較した場合に、ノルニコチンが３倍を超えて低減したタバコ植物が得られる。一実施形態では、本発明は、米国特許出願公開第２００８／０２０２５４１Ａ１号および第２００９／０２０５０７２Ａ１号に記載されるもののようなトランスジェニック遺伝子抑制アプローチによってのみ以前に達成されたものに匹敵する非常に低レベルのノルニコチンを生成する非トランスジェニックタバコ植物をもたらすニコチン脱メチル化酵素遺伝子ｃｙｐ８２ｅ４ｖ２、ｃｙｐ８２ｅ５ｖ２およびｃｙｐ８２ｅ１０のホモ接合型三重変異体の組合せを提供する。
【００７２】
＜ニコチン脱メチル化酵素ポリヌクレオチドおよびポリペプチド、ならびにそれらのバリアントおよび断片＞
本発明の組成物は、ＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドならびにそれらのバリアントおよび断片を含む。このようなニコチン脱メチル化酵素ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、タバコ植物の商業的な品種を含む植物におけるニコチンからノルニコチンへの代謝変換に関与する。特に、本発明の組成物は、配列番号２、および５〜１３に示すアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、配列番号１、３および４に示すヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド、ならびに配列番号２および５〜１３のアミノ酸配列をコードする単離ポリヌクレオチドを含む。本発明のポリヌクレオチドは、植物、特にタバコ植物におけるニコチンからノルニコチンへの代謝変換に関与するニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドまたはそのバリアントの発現の阻害において用いることができる。本発明のポリヌクレオチドのいくつかは、野生型ニコチン脱メチル化酵素のニコチン脱メチル化酵素活性の阻害をもたらす変異を有する。本発明のポリペプチドの阻害は、熱風乾燥タバコのような、集団の３０％、５０％、７０％、９０％未満で遺伝子変換が発生するタバコ系統におけるノルニコチンレベルの低下において効果的である。本発明のポリペプチドの阻害は、植物集団の少なくとも９０％、８０％、７０％、６０％、５０％において遺伝子変換が発生するタバコ集団におけるノルニコチンレベルの低下において効果的である。集団は、好ましくは、約２５、５０、１００、５００、１，０００、５，０００または２５，０００植物より多くを含有し、ここで、より好ましくは、植物の少なくとも約１０％、２５％、５０％、７５％、９５％または１００％が、本発明のポリペプチドを含む。
【００７３】
本発明のニコチン脱メチル化酵素ポリヌクレオチドおよびコードされるポリペプチドは、タバコ植物の根におけるニコチンからノルニコチンへの代謝変換における役割を有するとして新しく同定された、ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素遺伝子と称する新規なシトクロムＰ４５０遺伝子を含む。センス、アンチセンスおよびＲＮＡｉ抑制のようなトランスジェニックアプローチを用いて、米国特許出願公開第２００８／０２０２５４１Ａ１号および第２００９／０２０５０７２Ａ１号（これらの開示は、それらの全体が参照することにより本明細書の一部をなすものとする）に記載されるようなＣＹＰ８２Ｅ４およびＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素について記載したのと同様に、このニコチン脱メチル化酵素の発現をノックダウンすることができる。好ましいアプローチは、この遺伝子において１つ以上の好ましい変異を導入するものである。なぜなら、このアプローチは、ニコチンからノルニコチンへの変換率が低減され、よってノルニコチンおよびＮＮＮのレベルが低減された非トランスジェニックタバコ植物を有利にもたらすからである。このようなアプローチは、本明細書において以下の他の箇所で記載するような突然変異誘発などを含むが、それらに限定されない。
【００７４】
本発明は、本発明の単離または実質的に精製されたポリヌクレオチドまたはタンパク質の組成物を包含する。「単離」もしくは「精製」ポリヌクレオチドまたはタンパク質あるいはその生物学的に活性な部分は、その天然に存在する環境において見出される、ポリヌクレオチドまたはタンパク質と通常付随しているかまたは相互作用している成分を実質的または本質的に含まない。つまり、単離もしくは精製ポリヌクレオチドまたはタンパク質は、組換え技術により生成される場合に、他の細胞性物質もしくは培養培地を実質的に含まないか、または化学的に合成される場合に、化学的前駆体もしくはその他の化学物質を実質的に含まない。最適には、「単離」ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが由来する生物のゲノムＤＮＡにおいて天然にポリヌクレオチドを挟む（すなわちポリヌクレオチドの５’ 端および３’端にある）配列（最適にはタンパク質をコードする配列）を含まない。例えば、様々な実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが由来する細胞のゲノムＤＮＡにおいて天然にポリヌクレオチドを挟むヌクレオチド配列の約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ未満を含有できる。細胞性物質を実質的に含まないタンパク質は、約３０％、２０％、１０％、５％または１％（乾燥重量）未満の混入タンパク質を有するタンパク質の調製物を含む。本発明のタンパク質またはその生物学的に活性な部分が組換え生成される場合、最適には、培養培地は、約３０％、２０％、１０％、５％または１％（乾燥重量）未満の化学的前駆体、または対象タンパク質ではない化学物質を表す。
【００７５】
開示するポリヌクレオチドおよびそれによりコードされるポリペプチドの断片も、本発明に包含される。ポリヌクレオチドの断片は、天然タンパク質の生物活性を保持するタンパク質断片をコードし、よって、植物におけるニコチンからノルニコチンへの代謝変換に関与する。代わりに、ハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプライマーとして有用なポリヌクレオチドの断片は、全般的に、生物活性を保持する断片タンパク質をコードしない。さらに、開示されるヌクレオチド配列の断片は、それらに限定されないが、当技術分野においておよび本明細書で以下に記載するようなセンス抑制／同時抑制、アンチセンス抑制、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）干渉、ヘアピンＲＮＡ干渉およびイントロン含有ヘアピンＲＮＡ干渉、アンプリコン媒介干渉、リボザイムならびに小型干渉ＲＮＡまたはマイクロＲＮＡを含む、当技術分野において既知の任意の方法を用いる遺伝子サイレンシング用の組換え構築物内で組み立てることができるものを含む。つまり、ヌクレオチド配列の断片は、所望の結果に依存して、少なくとも約２０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約１５０ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、２５０ヌクレオチド、３００ヌクレオチドから、本発明のタンパク質をコードする全長ポリヌクレオチドまでの範囲であってよい。一態様では、ヌクレオチド配列の断片は、１００から約３５０の間のヌクレオチド、１００から約３２５の間のヌクレオチド、１００から約３００の間のヌクレオチド、約１２５から約３００の間のヌクレオチド、約１２５から約２７５の間のヌクレオチドの長さ、約２００から約３２０の間の連続ヌクレオチド、約２００から約４２０の間の連続ヌクレオチドの長さ、約２５０から約４５０の間の連続ヌクレオチドの長さの断片であり得る。別の実施形態は、約３００から約４５０の間の連続ヌクレオチドの長さを有する組換え核酸分子を含む。
【００７６】
本発明のＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドの生物活性部分をコードする本発明のニコチン脱メチル化酵素ポリヌクレオチドの断片は、少なくとも１５、２５、３０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０もしくは５００連続アミノ酸、または本発明の全長ニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドに存在するアミノ酸の総数（例えば配列番号２および５〜１３について５１７アミノ酸）までをコードする。ニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドの生物活性部分は、本発明のＣＹＰ８２Ｅ１０ポリヌクレオチドの１つの一部分を単離し、ＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドのコードされる一部分を発現し（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ組換え発現により）、ＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドのコードされる一部分の活性、すなわちニコチンからノルニコチンへの変換を促進する能力を、当技術分野において既知の、本明細書で以下に示すアッセイを用いて評価することにより調製できる。
【００７７】
本発明のＣＹＰ８２Ｅ１０ヌクレオチド配列の断片であるポリヌクレオチドは、少なくとも１６、２０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、８００、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６００、１６５０もしくは１７００の連続するヌクレオチド、または本明細書で開示する全長ＣＹＰ８２Ｅ１０ポリヌクレオチドに存在するヌクレオチドの数（例えば配列番号１について１５５１；配列番号４について２６３６）までを含む。本発明のＣＹＰ８２Ｅ１０ヌクレオチド配列の断片であるポリヌクレオチドは、本明細書で開示するＣＹＰ８２Ｅ１０ポリヌクレオチドからの約２０から約１７００までの連続ヌクレオチド、約５０から約１６００までの連続ヌクレオチド、約７５から約１５００までの連続ヌクレオチド、約１００から約１４００までのヌクレオチド、約１５０から約１３００までの連続ヌクレオチド、約１５０から約１２００までの連続ヌクレオチド、約１７５から約１１００までの連続ヌクレオチド、約２００から約１０００までの連続ヌクレオチド、約２２５から約９００までの連続ヌクレオチド、約５００から約１６００までの連続ヌクレオチド、約７７５から約１７００までの連続ヌクレオチド、約１０００から約１７００までの連続ヌクレオチド、または約３００から約８００までの連続ヌクレオチドを含む。一態様では、断片ポリヌクレオチドは、ＣＹＰ８２Ｅ１０コード配列の約７００位〜約１２５０位、ＣＹＰ８２Ｅ１０ゲノム配列の約７００位〜約１２５０位、ＣＹＰ８２Ｅ１０イントロン配列の約１０位〜約９００位、またはＣＹＰ８２Ｅ１０イントロン配列の約１００位〜約８００位のヌクレオチドからのポリヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド配列を含む。
【００７８】
開示するポリヌクレオチドおよびそれによりコードされるポリペプチドのバリアントも、本発明に包含される。天然に存在するバリアントは、本明細書で以下に定義するように本明細書で開示するＣＹＰ８２Ｅ１０ポリヌクレオチドおよびポリペプチドと実質的な配列同一性を共有するバリアントを含む。別の実施形態では、天然に存在するバリアントは、本明細書で開示するＣＹＰ８２Ｅ１０ポリヌクレオチドと実質的な機能的同一性も共有する。本発明の組成物および方法は、開示するＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドと実質的な配列同一性を共有する任意の天然に存在するＣＹＰ８２Ｅ１０の発現または機能を標的にするために用いることができる。このようなＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドは、関連するニコチン脱メチル化酵素活性、すなわち植物におけるニコチンからノルニコチンへの代謝変換への関与を有するか、または有さないことができる。このようなバリアントは、例えば、遺伝子多形または突然変異誘発アプローチを含む育種および選択を用いて発生するようなヒト操作に起因してよい。本発明のＣＹＰ８２Ｅ１０タンパク質の生物活性バリアント、例えば配列番号２および５〜１３に示すポリペプチドのバリアントは、本明細書の他の箇所で記載する配列アラインメントプログラムおよびパラメータにより決定されるように、野生型タンパク質についてのアミノ酸配列と少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれら以上の配列同一性を有し、植物におけるニコチンからノルニコチンへの代謝変換におけるそれらの機能的関与またはその欠如を特徴とすることができる。本発明のあるタンパク質の生物活性バリアントは、そのタンパク質から１〜１５ほど少ないアミノ酸残基、１０ほど少なく、９ほど少なく、８ほど少なく、７ほど少なく、６ほど少なく、５ほど少なく、４ほど少なく、３ほど少なく、２ほど少なく、または１ほど少ないアミノ酸残基が異なってよい。本発明のあるタンパク質の生物学的に不活性なバリアントは、そのタンパク質から１〜１５ほど少ないアミノ酸残基、１０ほど少ないアミノ酸残基、９ほど少ないアミノ酸残基、８ほど少ないアミノ酸残基、７ほど少ないアミノ酸残基、６ほど少ないアミノ酸残基、５ほど少ないアミノ酸残基、４ほど少ないアミノ酸残基、３ほど少ないアミノ酸残基、２ほど少ないアミノ酸残基、または１ほど少ないアミノ酸残基が異なってよい。
【００７９】
本発明の特定のポリヌクレオチドのバリアントは、植物の根におけるニコチンからノルニコチンへの代謝変換に関与するＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドをコードする天然に存在するポリヌクレオチドを含む。このようなポリヌクレオチドバリアントは、１つ以上のヌクレオチドの欠失および／または付加を、本明細書で開示する天然ポリヌクレオチド内の１つ以上の部位にて含み、かつ／あるいは天然ポリヌクレオチド中の１つ以上の部位にて１つ以上のヌクレオチドの置換を含み得る。遺伝子コードの縮重性により、ポリヌクレオチドの保存バリアントは、本発明のＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドの１つのアミノ酸配列をコードする配列を含む。これらのような天然に存在するバリアントは、当技術分野において既知であり本明細書で開示する例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびハイブリダイゼーション技術のような公知の分子生物学的技術を用いて同定できる。バリアントポリヌクレオチドは、例えば、部位特異的突然変異誘発により作製されるが、本明細書で開示する天然に存在する配列と実質的な配列同一性を依然として共有し、よって、本発明の方法において、配列番号２、５、６、７、８、９および１０に示すニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドを含むニコチンからノルニコチンへの代謝変換に関与するニコチン脱メチル化酵素の発現または機能を阻害するために用いることができるもののような合成により導かれるポリヌクレオチドも含む。一般的に、本発明の特定のポリヌクレオチドのバリアント、例えば配列番号３のポリヌクレオチド配列または配列番号２および５〜１３に示すアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列は、本明細書の他の箇所で記載する配列アラインメントプログラムおよびパラメータにより決定して、その特定のポリヌクレオチドと少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有する。
【００８０】
本発明の特定のポリヌクレオチド（参照ポリヌクレオチドともいう）のバリアントは、参照ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと、バリアントポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドとの間のパーセント配列同一性を比較することによっても評価できる。任意の２つのポリペプチド間のパーセント配列同一性は、本明細書の他の箇所で記載する配列アラインメントプログラムおよびパラメータを用いて計算できる。本発明のポリヌクレオチドの任意の所定の対を、それらがコードする２つのポリペプチドが共有するパーセント配列同一性の比較により評価する場合、２つのコードされるポリペプチド間のパーセント配列同一性は、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性である。
【００８１】
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、対応する根特異的ニコチン脱メチル化酵素配列、特にＣＹＰ８２Ｅ１０配列を、タバコ属の他のメンバーから単離するために用いることができる。ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションおよびその他の同様の方法を用いて、このような配列を、本明細書で示す配列とのそれらの配列相同性に基づいて同定できる。本明細書に示すヌクレオチド配列またはそのバリアントおよび断片に対するそれらの配列同一性に基づいて単離される配列は、本発明に包含される。このような配列は、開示する配列のオルソログである配列を含む。
【００８２】
本発明によると、「オルソログ」は、共通の祖先の遺伝子に由来し、種分化の結果として異なる種において見出される遺伝子である。異なる種で見出される遺伝子は、それらのヌクレオチド配列および／またはそれらがコードするタンパク質配列が、少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を共有する場合に、オルソログであるとみなされる。オルソログの機能は、頻繁に、種のうちで高く保存される。つまり、ニコチンからノルニコチンへの代謝変換に関与するニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドをコードし、本明細書で開示するＣＹＰ８２Ｅ１０配列またはそのバリアントもしくは断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする単離ポリヌクレオチドは、本発明に包含される。このような配列は、本発明の方法において、植物においてニコチンからノルニコチンへの代謝変換に関与するニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドの発現を阻害するために用いることができる。
【００８３】
ＰＣＲを用いて、オリゴヌクレオチドプライマーを、任意の対象の植物から抽出したｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから対応するＤＮＡ配列を増幅するためのＰＣＲ反応において用いるために設計できる。ＰＣＲプライマーを設計するためおよびＰＣＲクローニングの方法は、全般的に当技術分野において既知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、Ｉｎｎｉｓら編（１９９０）ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；ＩｎｎｉｓおよびＧｅｌｆａｎｄ編（１９９５）ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；ならびにＩｎｎｉｓおよびＧｅｌｆａｎｄ編（１９９９）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に開示されている。ＰＣＲの既知の方法は、対プライマー、ネステッドプライマー、単一特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分的ミスマッチプライマーなどを用いる方法を含むが、それらに限定されない。
【００８４】
ハイブリダイゼーション技術は、既知のポリヌクレオチドの全部または一部分を、選択した生物からのクローニングしたゲノムＤＮＡ断片またはｃＤＮＡ断片の集団（すなわちゲノムまたはｃＤＮＡライブラリー）中に存在する他の対応するポリヌクレオチドと選択的にハイブリダイズするためのプローブとして用いることを含む。
【００８５】
ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で行ってよい。「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」により、プローブが、他の配列に対するよりも検出可能に大きい程度（例えばバックグラウンドより少なくとも２倍大きい）でその標的配列とハイブリダイズする条件を意図する。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況の下で異なる。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件のストリンジェンシーを制御することにより、プローブと１００％相補的な標的配列を同定できる（相同的探索）。代わりに、ストリンジェンシー条件は、より低い程度の類似性を検出するように、配列中にいくらかのミスマッチを許容するように調整できる（異種的探索）。一般的に、プローブは、約１０００ヌクレオチド未満の長さ、最適には５００ヌクレオチド未満の長さである。
【００８６】
典型的に、ストリンジェントな条件は、塩濃度がｐＨ７．０〜８．３にて約１．５Ｍ未満のＮａイオン、典型的に約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン濃度（またはその他の塩）、かつ温度が少なくとも約３０℃のものである。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によって達成してもよい。例示的な低ストリンジェンシー条件は、３０〜３５％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝液を３７℃にて用いるハイブリダイゼーションと、１×〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）中で５０〜５５℃での洗浄を含む。例示的な中程度のストリンジェンシー条件は、４０〜４５％ホルムアミド、１．０ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中で３７℃でのハイブリダイゼーションと、０．５×〜１×ＳＳＣ中で５５〜６０℃での洗浄を含む。例示的な高ストリンジェンシー条件は、５０％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中で３７℃でのハイブリダイゼーションと、０．１×ＳＳＣ中で６０〜６５℃での洗浄を含む。場合によって、洗浄緩衝液は、約０．１％〜約１％のＳＤＳを含んでよい。ハイブリダイゼーションの期間は、一般的に約２４時間未満、通常、約４〜約１２時間である。洗浄時間の期間は、少なくとも、平衡に達するために十分な長さの時間である。
【００８７】
具体的な実施形態では、ストリンジェンシー条件は、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト、０．４５ｕｇ／ｕｌポリＡ ＲＮＡ、０．４５ｕｇ／ｕｌウシ胸腺ＤＮＡおよび５０％ホルムアミドを含有する溶液中で４２℃でのハイブリダイゼーションと、約０．０１×ＳＳＣから約１×ＳＳＣまでを含む溶液中での少なくとも１回のハイブリダイゼーション後の洗浄とを含む。ハイブリダイゼーションの期間は、約１４時間から約１６時間までである。
【００８８】
特異性は、典型的に、ハイブリダイゼーション後の洗浄の関数であり、重要な因子は、最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについて、Ｔｍは、ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７〜２８４頁の等式：Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌ（式中、Ｍは、１価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣは、ＤＮＡ中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドのパーセンテージであり、％ｆｏｒｍは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージであり、Ｌは、ハイブリッドの長さ（塩基対）である）から見積もることができる。Ｔｍは、５０％の相補的標的配列が、完全にマッチするプローブとハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度およびｐＨの下で）である。Ｔｍは、１％のミスマッチごとについて約１℃下がる。よって、Ｔｍ、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件は、所望の同一性の配列とハイブリダイズするように調整できる。例えば、９０％以上の同一性を有する配列を探す場合、Ｔｍは、１０℃低くできる。全般的に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨにて特定の配列とその相補体とについての熱的融点よりも約５℃低いように選択される。しかし、厳しいストリンジェント条件は、熱的融点（Ｔｍ）より１、２、３または４℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用できる。中程度にストリンジェントな条件は、熱的融点（Ｔｍ）より６、７、８、９または１０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用できる。低ストリンジェンシー条件は、熱的融点（Ｔｍ）より１１、１２、１３、１４、１５または２０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用できる。この等式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成、ならびに所望のＴｍを用いて、当業者は、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄溶液のストリンジェンシーの変動が固有に記載されることを理解する。所望の程度のミスマッチが４５℃（水性溶液）または３２℃（ホルムアミド）未満のＴｍをもたらすならば、より高い温度を用いることができるようにＳＳＣ濃度を増加することが最適である。核酸のハイブリダイゼーションについての網羅的な手引きは、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ、第Ｉ部、第２章（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；およびＡｕｓｕｂｅｌら編（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２章（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）で見出される。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。
【００８９】
ハイブリダイゼーションプローブは、ゲノムＤＮＡ断片、ｃＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片またはその他のオリゴヌクレオチドであってよく、３２Ｐのような検出可能な基または任意のその他の検出可能なマーカーで標識されてよい。例えば、ハイブリダイゼーション用のプローブは、本発明のＣＹＰ８２Ｅ１０ポリヌクレオチド配列に基づく合成オリゴヌクレオチドを標識することにより作製できる。ハイブリダイゼーション用ならびにｃＤＮＡおよびゲノムライブラリーの構築用のプローブの調製方法は、当技術分野において一般的に既知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に開示されている。
【００９０】
例えば、本明細書で開示するＣＹＰ８２Ｅ１０ポリヌクレオチド配列または１つ以上のその部分は、対応する根特異的ニコチン脱メチル化酵素ポリヌクレオチドおよびメッセンジャーＲＮＡと特異的にハイブリダイズできるプローブとして用いてよい。様々な条件下で特異的ハイブリダイゼーションを達成するために、このようなプローブは、コード配列に対して５’の上流領域およびコード配列に対して３’の下流領域およびイントロン領域（例えば、配列番号３）を含むＣＹＰ８２Ｅ１０ポリヌクレオチド配列のうちでユニークなまたはＣＹＰ８２Ｅ１０ポリヌクレオチド配列の１つにユニークな配列を含み、最適には、少なくとも約１０連続ヌクレオチドの長さ、より最適には少なくとも約２０連続ヌクレオチドの長さ、より最適には少なくとも約５０連続ヌクレオチドの長さ、より最適には少なくとも約７５連続ヌクレオチドの長さ、およびより最適には少なくとも約１００連続ヌクレオチドの長さである。このようなプローブは、対応するＣＹＰ８２Ｅ１０ポリヌクレオチドを増幅するために用いてよい。この技術は、追加のコード配列または所望の植物からの変異を単離するため、または植物におけるコード配列の存在を決定するための診断アッセイとして用いてよい。ハイブリダイゼーション技術は、プレーティングしたＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングを含む（プラークまたはコロニーのいずれか；例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい）。
【００９１】
本明細書で用いる場合、２以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列の関係に関して、「参照配列」という用語は、配列比較のための基礎として用いる規定された配列である。参照配列は、例えば全長ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列のセグメント、または完全ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列のような、特定の配列のサブセットまたは全体であってよい。
【００９２】
本明細書で用いる場合、「比較ウィンドウ」という用語は、ポリヌクレオチド配列の連続する特定のセグメントに言及し、ここで、比較ウィンドウ中のこのポリヌクレオチド配列は、２つのポリヌクレオチドの最適アラインメントのための服従（ｄｅｆｅｒｅｎｃｅ）配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して付加または欠失（すなわちギャップ）を含むことがある。全般的に、比較ウィンドウは、少なくとも２０の連続するヌクレオチドの長さであり、場合によって３０、４０、５０、１００以上であり得る。当業者は、ポリヌクレオチド配列中にギャップを含めることによる参照配列に対する高い類似性を回避するために、ギャップペナルティを典型的に導入し、マッチの数から減じることを理解している。
【００９３】
比較のための配列のアラインメントの方法は、当技術分野において公知である。よって、任意の２つの配列間のパーセント配列同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成できる。このような数学的アルゴリズムの非限定的な例は、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ４：１１〜１７頁のアルゴリズム；Ｓｍｉｔｈら（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２頁の局所アラインメントアルゴリズム；ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３〜４５３頁のグローバルアラインメントアルゴリズム；ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４〜２４４８頁の局所検索アラインメント法；ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７２２６４頁のアルゴリズム（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３〜５８７７頁において改変）である。
【００９４】
Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３頁のＢＬＡＳＴプログラムは、既出のＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）のアルゴリズムに基づく。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列に相同なヌクレオチド配列を得るために、ＢＬＡＳＴＮプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質またはポリペプチドに相同なアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴＸプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行うことができる。比較の目的のためにギャップを有するアラインメントを得るために、ギャップドＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２．０中）を、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９頁に記載されるように利用できる。代わりに、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２．０中）を用いて、分子間の離れた関係を検出するための反復検索を行うことができる。既出のＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）を参照されたい。ＢＬＡＳＴ、ギャップドＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ（例えば、ヌクレオチド配列についてＢＬＡＳＴＮ、タンパク質についてＢＬＡＳＴＸ）を用いることができる（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｎａ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい）。アラインメントは、観察により手動で行ってもよい。
【００９５】
いくつかの実施形態では、本明細書で示す配列同一性／類似性の値は、デフォルトパラメータを用いるＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）、既出）、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｈｉｇｇｉｎｓら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３〜４６８０頁）およびＧＡＰ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐソフトウェアパッケージ）アルゴリズムを用いて計算する。本発明は、核酸およびタンパク質の配列の分析および比較のためにそれらの任意の等価なプログラムを用いることも包含する。「等価なプログラム」により、問題の任意の２つの配列について、ＢＬＡＳＴＸ、Ｃｌｕｓｔａｌ ＷまたはＧＡＰにより得られた対応するアラインメントと比較した場合に、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基のマッチおよび同一のパーセント配列同一性を有するアラインメントが得られる任意の配列比較プログラムを意図する。
【００９６】
本発明に包含されるバリアントヌクレオチドおよびポリペプチド配列の上記の議論の目的のために、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の関係における「配列同一性」または「同一性」という用語は、特定の比較ウィンドウにわたって最大限に対応するようにアラインメントした場合に同じである２つの配列中の残基について言及する。配列同一性のパーセンテージがタンパク質について言及する場合に用いられる場合、同一でない残基の位置は、保存アミノ酸置換により頻繁に異なることが認識され、ここでは、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば電荷または疎水性）を有する別のアミノ酸残基で置換され、よって、分子の機能的特性を変化させない。配列が保存置換により異なる場合、パーセント配列同一性は、置換の保存的性質を修正するために上方に調整してよい。このような保存置換により異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有するという。この調整をモルトする（ｍａｌｔｉｎｇ）ための手段は、当業者に公知である。典型的に、これは、保存置換を、完全ミスマッチよりもむしろ部分的ミスマッチとして評点し、そのことによりパーセンテージ配列同一性を増加することを含む。よって、例えば、同一アミノ酸が１のスコアを与えられ、非保存置換がゼロのスコアを与えられる場合、保存置換は、ゼロと１の間のスコアを与えられる。保存置換の評点は、例えばプログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）中に実装されるようにして計算される。
【００９７】
「配列同一性のパーセンテージ」という用語は、本明細書で用いる場合、比較ウィンドウにわたって２つの最適にアラインメントされた配列を比較することにより決定される値を意味し、ここで、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適なアラインメントのための参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して付加または欠失（すなわちギャップ）を含むことがある。パーセンテージは、両方の配列中で同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定してマッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を、比較ウィンドウ中の位置の総数で除し、解に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることにより計算される。
【００９８】
よって、ＣＹＰ８２Ｅ１０ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、本明細書で示す配列を用いて同定できる。このような方法は、配列番号１、３もしくは４のポリヌクレオチド配列またはその相補体もしくは断片、あるいは配列番号２もしくは５〜１３のポリペプチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の配列同一性のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を得ることを含む。好ましい実施形態は、ＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドの７９位、１０７位または３８２位（番号付けは、配列番号２に対応する）にてセリンを有する配列番号２に対応するポリペプチドを含む。
【００９９】
＜ニコチン脱メチル化酵素の発現または機能を阻害する方法＞
タバコ属植物もしくは植物部分、特に根の組織において本発明のＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドの濃度、含量および／または活性を低減する方法が提供される。本発明のＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチド（配列番号２）およびニコチン脱メチル化酵素活性を保持するそのバリアント（例えば配列番号７、８、９および１０）の活性を低減または消去するために多くの方法を単独または組み合わせて用いてよい。さらに、２以上の異なるニコチン脱メチル化酵素、より具体的には根特異的ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素と、緑葉ＣＹＰ８２Ｅ５および老化誘導性ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素の一方または両方との活性を低減または消去するために方法の組合せを採用してよい。ある特定の実施形態では、ＣＹＰ８２Ｅ５は、緑葉における変換に対して負に影響する配列番号２６の配列中の少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチドであり、ＣＹＰ８２Ｅ４は、老化した葉における変換に対して負に影響する少なくとも１つのアミノ酸変異を有する配列番号１４に示す配列を有する。
【０１００】
本発明によると、本発明のＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素の発現は、ＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドのタンパク質レベルが、そのＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドの発現を阻害するために遺伝子改変または突然変異誘発されていない植物における同じＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドのタンパク質レベルよりも統計学的に低いならば、阻害されている（ここで、これらの植物は、同じ手順を用いて栽培および採集されている）。本発明のある特定の実施形態では、本発明による改変植物におけるＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドのタンパク質レベルは、変異体ではないかまたはＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドの発現を阻害するために遺伝子改変されておらず、同じ手順を用いて栽培および採集された植物における同じＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドのタンパク質レベルの９５％未満、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、または５％未満である。ＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドの発現レベルは、例えば、タバコ植物もしくは植物部分において発現されたＣＹＰ８２Ｅ１０転写産物またはＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドのレベルをアッセイすることにより直接的に、あるいは例えばタバコ植物もしくは植物部分におけるニコチンからノルニコチンへの変換を測定することにより間接的に測定してよい。タンパク質の発現レベルをモニタリングするための方法は、当技術分野において既知であり、それらに限定されないが、ノザンブロット分析およびＲＮＡ識別アッセイを含む。ニコチンからノルニコチンへの変換における標的にしたＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドの活性を決定する方法は、当技術分野において既知であり、本明細書において以下に他の場所で記載し、それらに限定されないが、ガスクロマトグラフィーを用いるアルカロイド分析を含む。
【０１０１】
本発明は、タバコ植物またはその植物部分におけるノルニコチンのレベルを低減するかまたはニコチンからノルニコチンへの変換率を低減する方法を提供する。これらの方法は、タバコ植物のゲノムに、少なくとも３つのニコチン脱メチル化酵素遺伝子のそれぞれの少なくとも１つの対立遺伝子内の変異を導入することを含み、ここで、この変異は、ニコチン脱メチル化酵素遺伝子の発現を低減し、これらのニコチン脱メチル化酵素遺伝子の第１のものは、タバコ植物またはその植物部分におけるニコチンからノルニコチンへの代謝変換に関与する根特異的ニコチン脱メチル化酵素をコードする。いくつかの実施形態では、根特異的ニコチン脱メチル化酵素は、ＣＹＰ８２Ｅ１０またはそのバリアントである。他の実施形態では、これらの方法は、タバコ植物のゲノムに、ＣＹＰ８２Ｅ１０もしくはそのバリアントをコードするニコチン脱メチル化酵素遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子内の変異と、ＣＹＰ８２Ｅ４もしくはそのバリアントをコードするニコチン脱メチル化酵素および／またはＣＹＰ８２Ｅ５もしくはそのバリアントをコードするニコチン脱メチル化酵素の少なくとも１つの対立遺伝子内の変異とを導入することを含む。
【０１０２】
１つの植物において変異を組み合わせるために、有性交雑を含むいくつかのアプローチが用いられている。根におけるニコチン脱メチル化酵素活性を阻害するＣＹＰ８２Ｅ１０遺伝子における好ましい変異を有する植物を、老化した葉におけるニコチン脱メチル化酵素活性を阻害するＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２遺伝子における好ましい変異を有する植物と交雑させるか、または緑葉におけるニコチン脱メチル化酵素活性を阻害するＣＹＰ８３Ｅ５ｖ２遺伝子における好ましい変異を有する植物と交雑させて、ニコチンからノルニコチンへの変換が低減された植物を生成できる。好ましい実施形態では、同じ植物内でＣＹＰ８２Ｅ１０、ＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２およびＣＹＰ８２Ｅ５ｖ２遺伝子内に好ましい変異を導入するために、交雑種を作製する。この様式では、根におけるニコチン脱メチル化酵素活性を阻害するＣＹＰ８２Ｅ１０遺伝子における好ましい変異を有する植物を、老化した葉におけるニコチン脱メチル化酵素活性を阻害するＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２遺伝子における好ましい変異と、緑葉におけるニコチン脱メチル化酵素活性を阻害するＣＹＰ８３Ｅ５ｖ２遺伝子における好ましい変異とを有する植物と交雑させる。代わりに、老化した葉におけるニコチン脱メチル化酵素活性を阻害するＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２遺伝子における好ましい変異を有する植物を、根におけるニコチン脱メチル化酵素活性を阻害するＣＹＰ８２Ｅ１０遺伝子における好ましい変異と、緑葉におけるニコチン脱メチル化酵素活性を阻害するＣＹＰ８３Ｅ５ｖ２遺伝子における好ましい変異とを有する植物と交雑させる。なお別の実施形態では、緑葉におけるニコチン脱メチル化酵素活性を阻害するＣＹＰ８２Ｅ５ｖ２遺伝子における好ましい変異を有する植物を、根におけるニコチン脱メチル化酵素活性を阻害するＣＹＰ８２Ｅ１０遺伝子における好ましい変異と、老化した葉におけるニコチン脱メチル化酵素活性を阻害するＣＹＰ８３Ｅ４ｖ２遺伝子における好ましい変異とを有する植物と交雑させる。これらのニコチン脱メチル化酵素遺伝子のそれぞれに好ましい変異を導入することにより、約０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％または０．７％未満の変換レベルでニコチンからノルニコチンへの変換率が低減された植物を生成することができる。
【０１０３】
より好ましい実施形態では、７９位、１０７位、３８２位または４１９位（番号付けは、配列番号２に従う）でのＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドの改変をもたらす１つ以上の好ましい変異を有する植物を、３２９位、３６４位、３７６位、３８２位もしくは４５８位でのＣＹＰ８２Ｅ４ポリペプチドの改変をもたらす１つ以上の好ましい変異および／あるいは４２２位もしくは４４９位でのＣＹＰ８２Ｅ５ポリペプチドの改変をもたらす１つ以上の好ましい変異を有する植物と交雑させて、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％または０．７％未満の変換レベルを有する植物を生成できる。ニコチンからノルニコチンへの特に好ましい変換レベルは、０．０５％〜０．４％の間、０．１〜０．６％の間、０．１％〜０．３％の間、０．１％〜０．５％の間、０．１％〜０．４％の間、０．１％〜０．７％の間、０．１％〜１．０％の間、０．１％〜１．１％の間、０．１％〜１．２％の間、０．１％〜１．３％の間、０．１％〜１．４％の間または０．１％〜１．５％の間であり得る。保存ヘム結合モチーフの前のＣＹＰ８２Ｅ１０、ＣＹＰ８３Ｅ４またはＣＹＰ８３Ｅ５ポリペプチドの切断をもたらす本発明のポリヌクレオチドの任意の変異は、酵素を阻害し、上記の交雑種において用いることができる。シトクロムＰ４５０タンパク質のドメインは、当技術分野において既知である。例えば、Ｘｕら（２００７）Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ Ｐｌａｎｔａｒｕｍ１２９：３０７〜３１９頁（参照することにより本明細書の一部をなすものとする）を参照されたい。非機能的または阻害されたＣＹＰ８２Ｅ１０遺伝子を有する植物を、非機能的もしくは阻害されたＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２遺伝子、非機能的もしくは阻害されたＣＹＰ８２Ｅ５ｖ２遺伝子、または非機能的もしくは阻害されたＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２およびＣＹＰ８２Ｅ５ｖ２遺伝子を有する植物と交雑させることにより、ノルニコチンレベルをタバコ植物において低減できる。
【０１０４】
タバコ植物または植物部分におけるニコチンからノルニコチンへの変換におけるＣＹＰ８２Ｅ１０、ＣＹＰ８２Ｅ４またはＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドの活性は、その変換活性が、そのニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドの変換活性を阻害するために遺伝子改変されておらず、同じ手順を用いて栽培および採集されたタバコ植物または植物部分における同じニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドの変換活性よりも統計学的に低いならば、本発明に従って阻害されている。特定の実施形態では、本発明による改変タバコ植物または植物部分におけるニコチンからノルニコチンへの変換におけるニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドの活性は、その活性が、そのニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドの発現を阻害するために遺伝子改変されておらず、同じ手順を用いて栽培および採集されたタバコ植物における同じニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドの変換活性の９５％未満、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、２％未満または１％未満であるならば、阻害されている。タバコ植物または植物部分におけるニコチンからノルニコチンへの変換におけるニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドの活性は、本明細書の他の箇所で記載するアッセイ方法により検出可能でない場合に、本発明に従って消去されている。ガスクロマトグラフィーを用いて、タバコ植物におけるニコチンからノルニコチンへの変換におけるニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドの活性を決定する方法を、本明細書の以下において実施例で開示する。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、好ましい変異は、タバコ植物または植物部分に突然変異誘発アプローチを用いて導入され、導入された変異は、それらに限定されないが、サザンブロット分析、ＤＮＡ配列決定、ＰＣＲ分析または表現型分析のような当業者に既知の方法を用いて選択される。上記の実施形態により変更または改変された植物または植物部分は、植物形成条件下で、植物中の本発明のポリペプチドの濃度および／または活性を調節するのに十分な時間生育させる。植物形成条件は当技術分野において公知であり、本明細書の他の箇所で簡単に論じる。
【０１０６】
本明細書で記載するニコチン脱メチル化酵素中に好ましい変異を含有する改変タバコ植物は、ニコチンからノルニコチンへの変換レベルが低減されている。特定の実施形態では、本発明による改変タバコ植物または植物部分におけるニコチンからノルニコチンへの変換は、そのニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドの発現を阻害するために遺伝子改変されておらず、同じ手順を用いて栽培および採集されたタバコ植物における変換の９５％未満、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、２％未満または１％未満である。いくつかの実施形態では、改変タバコ植物は、コンバータタバコ植物である。他の実施形態では、改変タバコ植物は、非コンバータタバコ植物である。いくつかの実施形態では、改変タバコ植物は、商業的な非コンバータタバコ植物において観察される率よりも低い変換率を有する。
【０１０７】
本発明によると、本発明のＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドのレベル、比、活性もしくは分布の変化、またはタバコ植物もしくは植物部分の表現型の変化、特にノルニコチンおよびその発癌性代謝産物であるＮＮＮの蓄積の低減は、対象植物または対象植物部分を、対照植物または対照植物部分と比較することにより測定でき、ここで、対象植物または対象植物部分および対照植物または対照植物部分は、同じ手順を用いて栽培および／または採集されている。本明細書で用いる場合、対象植物または対象植物部分は、例えば突然変異誘発による遺伝子変更が、対象のニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドについて影響しているものであるか、あるいはそのように変更されたタバコ植物もしくは植物部分の子孫であり、その変更を含むタバコ植物または植物部分である。対照植物または対照植物部分は、対象植物または対象植物部分の表現型の変化を測定するための参照点を提供する。表現型の変化の測定は、植物の発達、老化の間または乾燥後を含む、植物または植物部分において任意の時間に測定できる。他の実施形態では、表現型の変化の測定は、生育チャンバ、温室または野外で生育した植物からを含む任意の条件下で生育した植物で測定できる。一実施形態では、表現型の変化は、ニコチンからノルニコチンへの変換率を決定することにより測定できる。ある好ましい実施形態では、変換は、ノルニコチンのパーセンテージ（全組織重量のパーセンテージとして）を、パーセンテージニコチンおよびノルニコチンの合計（全組織重量のパーセンテージとして）で除し、１００を乗じることにより測定できる。
【０１０８】
本発明によると、対照植物または対照植物部分は、野生型、すなわち対象植物または対象植物部分をもたらした遺伝子変更のための出発材料と同じ遺伝子型のタバコ植物または植物部分を含んでよい。対照植物または対照植物部分は、出発材料と同じ遺伝子型のタバコ植物または植物部分であるが、ヌル構築物（すなわち、選択可能なマーカー遺伝子を含む構築物のような、対象の形質に対して既知の影響を有さない構築物）で形質転換されたものも含んでよい。このような全ての場合では、対象植物または対象植物部分および対照植物または対照植物部分は、同じ手順を用いて栽培および採集される。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、本発明のニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドの活性は、ニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドをコードする遺伝子を破壊することにより低減または消去してよい。本発明は、ニコチン脱メチル化酵素遺伝子における変異を有する突然変異誘発植物を包含し、この変異は、ニコチン脱メチル化酵素遺伝子の発現を低減するか、または本発明のコードされるニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドの活性を阻害する。
【０１１０】
他の実施形態では、本発明のニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドの活性は、ニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドをコードする遺伝子を破壊することにより低減または消去される。ニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドをコードする遺伝子は、当技術分野において既知の任意の方法により、例えば、トランスポゾンタギングにより、あるいはランダムもしくは標的突然変異誘発を用いて植物に突然変異を誘発し、ニコチン脱メチル化酵素活性が低減されているかあるいはＣＹＰ８２Ｅ１０中の変異を単独でまたはＣＹＰ８２Ｅ４もしくはＣＹＰ８２Ｅ５中の変異との組合せで有する植物について選択することにより破壊してよい。
【０１１１】
トランスポゾンタギングは、本発明の１つ以上のＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドの活性を低減または消去するために用いてよい。トランスポゾンタギングは、トランスポゾンを、内因性ニコチン脱メチル化酵素遺伝子内に導入して、ニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドの発現を低減または消去することを含む。
【０１１２】
植物における特定の遺伝子のトランスポゾンタギングの方法は、当技術分野において公知である。例えばＭａｅｓら（１９９９）Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．４：９０〜９６頁；ＤｈａｒｍａｐｕｒｉおよびＳｏｎｔｉ（１９９９）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｅｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１７９：５３〜５９頁；Ｍｅｉｓｓｎｅｒら（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｊ．２２：２６５〜２７４頁；Ｐｈｏｇａｔら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．２５：５７〜６３頁；Ｗａｌｂｏｔ（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．２：１０３〜１０７頁；Ｇａｉら（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：９４〜９ｂ頁；Ｆｉｔｚｍａｕｒｉｃｅら（１９９９）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５３：１９１９〜１９２８頁を参照されたい。
【０１１３】
植物における内因性遺伝子の発現を低減または消去するためのさらなる方法も、当技術分野において既知であり、本発明に同様に用いることができる。これらの方法は、エチルメタンスルホネート誘導性突然変異誘発、欠失突然変異誘発および内因性遺伝子が欠失された植物系統を同定するために逆遺伝学の意味において（ＰＣＲを用いて）用いられる高速中性子欠失突然変異誘発を含む突然変異誘発性または発癌性化合物を用いるその他の形態の突然変異誘発を含む。これらの方法の例について、Ｏｈｓｈｉｍａら（１９９８）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２１３：４７２〜４８１頁；Ｏｋｕｂａｒａら（１９９４）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １３７：８６７〜８７４頁；およびＱｕｅｓａｄａら（２０００）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５４：４２１〜４３１５頁（これらのそれぞれは、参照することにより本明細書の一部をなすものとする）を参照されたい。さらに、変性ＨＰＬＣまたは選択されたＰＣＲ産物の選択的エンドヌクレアーゼ消化を用いる、化学誘発変異をスクリーニングするための迅速で自動化できる方法であるＴＩＬＬＩＮＧ（ゲノム中の標的化誘発局所損傷）も、本発明に用いることができる。ＭｃＣａｌｌｕｍら（２０００）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：４５５〜４５７（参照することにより本明細書の一部をなすものとする）を参照されたい。
【０１１４】
遺伝子発現に影響するかまたはコードされるニコチン脱メチル化酵素タンパク質の機能に干渉する変異は、当技術分野において公知である方法を用いて決定できる。遺伝子エキソン中の挿入変異は、通常、ヌル変異体をもたらす。保存残基中の変異は、コードされるタンパク質の代謝機能の阻害において特に効果的であり得る。タバコ植物または植物部分におけるニコチンからノルニコチンへの変換におけるニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドの活性を消去するという目標を有する突然変異誘発のために適切な植物ニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドの保存残基は、記載されている。他のＰ４５０ポリペプチドから異なる残基に灰色で影がつけてある米国特許出願公開第２００９／０２０５０７２Ａ１号（参照することによりその全体が本明細書の一部をなすものとする）の図１Ａ〜Ｃを参照されたい。保存残基は、それぞれの位置にて灰色で影が付いていないものである。このような変異体は、公知の手順に従って単離できる。
【０１１５】
本発明の別の実施形態では、ドミナント変異体を用いて、重複遺伝子座の遺伝子逆位および組換えによるＲＮＡサイレンシングを誘引できる。例えば、Ｋｕｓａｂａら（２００３）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １５：１４５５〜１４６７頁を参照されたい。
【０１１６】
本発明の別の実施形態では、本発明の組成物は、育種プログラムで用いるための非コンバータ植物を同定するためのスクリーニング方法において用いられる。この様式で、本発明のヌクレオチド配列を用いて、本明細書で同定されるＣＹＰ８２Ｅ１０遺伝子において適切な変異を有する非コンバータ植物について、天然の生殖質をスクリーニングできる。本発明の方法により同定されるこれらの非コンバータ植物を用いて、育種系統を開発できる。
【０１１７】
本明細書で記載するＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に加えて、本発明の組成物は、スクリーニング方法で用いることができるＣＹＰ８２Ｅ１０遺伝子配列中のイントロン配列を含む。いずれの作用機序にも結び付けられることはないが、ＣＹＰ８２Ｅ１０遺伝子（複数可）は、タバコの根におけるニコチンからノルニコチンへの代謝変換に関与するシトクロムＰ４５０ファミリーの唯一のメンバー（複数可）であり得る。ある応用のために、シトクロムＰ４５０遺伝子ファミリーのこの特定のメンバーを、このファミリー内の残りの密接に関係する配列から診断的に区別するための手段を有することが有用である。例えば、天然に存在するタバコ生殖質内で（または突然変異を誘発した集団において）、この遺伝子が天然に機能不全であり、よって永続的に非コンバータである資源として価値を有し得るものが存在することがある。このような機能不全配列は、配列番号１１、１２または１３に示すポリペプチドをコードするものを含んでよい。このような遺伝子型（例えば欠失変異、再編成など）について特異的にアッセイする方法は、強力なツールとして働くことができる。本発明は、ＣＹＰ８２Ｅ１０のエキソン１およびエキソン２を特異的に増幅するように設計されたプライマーを含み、これらの２つのプライマー対のうちの一方は、エキソン間のイントロンに対応する。ＣＹＰ８２Ｅ１０のエキソンを増幅するために有用なプライマーの例は、配列番号３５と配列番号３６および配列番号３７と配列番号３８を含む。これらの同じプライマーは、生成物の配列分析のために用いることができる。
【０１１８】
遺伝子のイントロン領域は、典型的に、エキソンよりも保存されていないので、イントロン特異的プローブを使用することにより、ＣＹＰ８２Ｅ１０遺伝子に相当する遺伝子（複数可）を、ＣＹＰ８２Ｅファミリーのその他のメンバーから区別しやすくなると予測される。生成物を作製するために用いたＣＹＰ８２Ｅ１０イントロン特異的プローブおよび／またはＰＣＲプライマーの使用により、任意の天然に存在するかまたは突然変異誘発されたタバコ植物が、遺伝子を不活性化させ得る欠失または再編成を有するかを決定するアッセイにおける強力なツールが提供される。このような植物は、次いで、育種プログラムにおいて用いて、変換できないタバコ系統を創出できる。
【０１１９】
＜ノルニコチンおよびＮＮＮの含量が低減したタバコ植物、植物部分および生成物＞
本発明のＣＹＰ８２Ｅ１０ポリヌクレオチド、ならびにそれらのバリアントおよび断片は、本発明の方法において用いて、植物におけるニコチンからノルニコチンへの代謝変換に関与するＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素の発現または機能を阻害することができる。この様式で、好ましい変異を対象のＣＹＰ８２Ｅ１０遺伝子に導入できる。本発明の方法は、好ましい変異をＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素遺伝子に導入するための特定の方法に依存しない。
【０１２０】
本発明の組成物および方法は、それらに限定されないが、以下の種を含むタバコ属の任意の植物の、特に葉および茎におけるノルニコチン含量を低減するために用いることができる。ａｃｕｍｉｎａｔａ、ａｆｆｉｎｉｓ、ａｌａｔａ、ａｔｔｅｎｕａｔｅ、ｂｉｇｅｌｏｖｉｉ、ｃｌｅｖｅｌａｎｄｉｉ、ｅｘｃｅｌｓｉｏｒ、ｆｏｒｇｅｔｉａｎａ、ｇｌａｕｃａ、ｇｌｕｔｉｎｏｓａ、ｌａｎｇｓｄｏｒｆｆｉｉ、ｌｏｎｇｉｆｌｏｒａ、ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａ、ｐａｌｍｅｒｉ、ｐａｎｉｃｕｌａｔａ、ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ、ｑｕｄｒｉｖａｌｖｉｓ、ｒｅｐａｎｄａ、ｒｕｓｔｉｃａ、ｓｕａｖｅｏｌｅｎｓ、ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ、ｔａｂａｃｕｍ、ｔｏｍｅｎｔｏｓａ、ｔｒｉｇｏｎｏｐｈｙｌｌａおよびｘ ｓａｎｄｅｒａｅ。本発明は、それらに限定されないが、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ａｃｕｍｉｎａｔａ ｍｕｌｔｉｆｌｏｒａ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ａｌａｔａ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｉｇｅｌｏｖｉｉ ｑｕａｄｒｉｖａｌｖｉｓ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｉｇｅｌｏｖｉｉ ｗａｌｌａｃｅｉ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａ ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａ ｐｌａｍｅｒｉ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｑｕａｄｒｉｖａｌｖｉｓ ｂｉｇｅｌｏｖｉｉ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｑｕａｄｒｉｖａｌｖｉｓ ｑｕａｄｒｉｖａｌｖｉｓ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｑｕａｄｒｉｖａｌｖｉｓ ｗａｌｌａｃｅｉおよびＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔｒｉｇｏｎｏｐｈｙｌｌａ ｐａｌｍｅｒｉを含むタバコ属の植物の任意の品種、ならびに煙管またはブライト品種、バーレー品種、ダーク品種およびオリエンタル／トルコ（Ｔｕｒｋｉｓｈ）品種として一般的に既知の品種を用いても行うことができる。いくつかの実施形態では、対象のタバコ植物は、バーレー、バージニア、熱風乾燥、空気乾燥、火力乾燥、オリエンタルまたはダークタバコ植物である。
【０１２１】
本明細書で記載するタバコ植物および品種は、肥料が豊富な土壌もしくは肥料なしの土壌での栽培、花への袋掛けもしくは袋掛けなし、または摘心ありもしくは摘心なしのような従来の生育および採集技術に適切である。採集された葉および茎は、それらに限定されないが、キセル、葉巻および巻きタバコ、ならびに葉タバコ、刻み（ｓｈｒｅｄｄｅｄ）タバコまたは刻み（ｃｕｔ）タバコを含む任意の形態の噛みタバコを含む任意の伝統的なタバコ製品で用いてよい。
【０１２２】
よって、本発明は、ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素をコードする遺伝子において変異を含むタバコ植物またはその植物部分であって、前記変異が、前記ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素の発現または機能の低減、ならびにノルニコチンおよびＮ’−ニトロソノルニコチンの量の低減をもたらすタバコ植物またはその植物部分を提供する。本明細書で用いる場合、「量の低減」または「レベルの低減」の用語は、ノルニコチンおよび／またはＮ’−ニトロソノルニコチンを低減するために遺伝子改変されていない、同じ様式で加工した（すなわち栽培して採集した）タバコ属の植物または同じ品種のタバコからの植物部分もしくはタバコ製品で見出されるものよりも少ない、本発明の植物またはその植物部分もしくはタバコ製品中のノルニコチンおよび／またはＮ’−ニトロソノルニコチンの量に言及することを意図する。ノルニコチンの量は、約１０％から約９０％より多く、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％および約８０％より多くなど、低減されることがある。ニコチンからノルニコチンへの変換は、本発明の植物、植物部分および製品において、より具体的にはＣＹＰ８２Ｅ１０、ＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２およびＣＹＰ８２５ｖ２に変異を有する植物、植物部分において、０．３％未満、０．５％未満、０．７％未満、０．１％〜０．５％の間、０．１％〜０．４％の間、０．１％〜０．７％の間または０．１％〜１．０％の間であり得る。
【０１２３】
「タバコ製品」という用語は、本明細書で用いる場合、それらに限定されないが、発煙材料（例えばシガリロ、非換気または排気凹型フィルタ巻きタバコを含む任意の巻きタバコ、葉巻、キセルタバコ）、無煙製品（例えばかぎタバコ、噛みタバコ、生分解性インサート（例えばガム、ロゼンジ、溶解ストリップ））を含む。例えば米国特許第２００５／００１９４４８号（参照することにより本明細書の一部をなすものとする）を参照されたい。本発明は、従来のタバコを、異なる量の本明細書で記載する低ノルニコチンおよび／またはＮ’−ニトロソノルニコチンタバコと組み合わせることにより作製できる、一連のタバコ製品ブレンドも包含する。さらなる実施形態では、上記のタバコ属の植物または植物部分は、乾燥タバコである。
【０１２４】
本発明のいくつかの実施形態では、タバコ製品は、葉巻、巻きタバコもしくはキセルタバコのようなタバコ製品を消費することにより直接吸入されるか、または二次的な煙として吸入される（すなわち、葉巻、巻きタバコもしくはキセルタバコのようなタバコ製品を消費している個体から発生するタバコの煙を吸入する個体による）タバコの煙の発癌可能性を低減する。本明細書で記載する乾燥タバコは、タバコ製品、特に、直接吸入されるかまたは二次的な煙として吸入される煙流中のノルニコチンおよび／またはＮ’−ニトロソノルニコチンの量の低減を含む、熱による化学変化を受けたものを調製するために用いることができる。同じ様式で、本発明のタバコ製品は、噛みタバコ、かぎタバコなどのような無煙タバコ製品の調製において有用であり得る。
【０１２５】
本発明のタバコ植物に由来するタバコ製品は、よって、これらのタバコ製品の発癌可能性を低減し、発癌性ニトロソアミンＮＮＮへの人、特にこれらのタバコ製品の使用者である個体の曝露を低減するための方法で用いられる。以下の実施例は、例示のために示され、限定するためではない。
【実施例】
【０１２６】
［実験］
以下の議論で述べる引用は、実験部の終わりに示す。
【０１２７】
［背景］
ＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２が、コンバータ植物において観察される高いノルニコチン蓄積を担うニコチン脱メチル化酵素遺伝子座を表すという知見（Ｓｉｍｉｎｓｚｋｙら、２００５）は、変換の問題を克服し、老化しかつ乾燥させた葉のノルニコチン含量を低下させることに向けての非トランスジェニックおよびトランスジェニックのアプローチへの扉を開いた。具体的に、研究者は、化学変異原に曝露されたタバコ集団を作製し、ＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２遺伝子座にて非機能的対立遺伝子を有する個体を選択することが可能になった。実際に、３つの独立したグループが、この方策に基づいて非変換タバコ系統を既に作製している（Ｄｅｗｅｙら、２００７；Ｘｕら、２００７ｂ；Ｊｕｌｉｏら、２００８）。
【０１２８】
以前に報告されたように、７７５と称するタバコ植物が、バーレー系統ＤＨ９８−３２５−６のＥＭＳ突然変異誘発集団から同定され、ＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２遺伝子においてノックアウト変異を有することが示された（Ｄｅｗｅｙら、２００７）。２００８年の夏に、７７５変異についてホモ接合型の植物を、Ｒｏｃｋｙ Ｍｏｕｎｔ、ＮＣのＵｐｐｅｒ Ｃｏａｓｔａｌ Ｐｌａｉｎｓ研究所で生育させ、標準的な産業的手続に従って空気乾燥させた。これらの物質のアルカロイド分析を、Ｊａｃｋら（２００７）により記載される「ＬＣ手順」を用いて行った。表１に示すように、７７５変異を有する植物は、平均で２．６％のニコチンからノルニコチンへの変換を示した。これとは対照的に、６０％超の変換が、強いコンバータ遺伝子型である親の系統ＤＨ９８−３２５−６で観察された。ほぼ同一の結果がＪｕｌｉｏら（２００８）により報告され、彼らは、強いコンバータバーレー遺伝子型ＢＢ１６ＮＮ内のｃｙｐ８２ｅ４ｖ２ノックアウト変異体についてホモ接合型の植物について２．８２から３．３７までの範囲の変換パーセンテージを記録した（親の変換率は、６８〜９８％の間の範囲であった）。よって、ＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２単独における衰弱性変異は、コンバータ植物の作製と関連する不安定な遺伝的現象から生じる問題を消去することにおいて効果的であるとみられる。
【０１２９】
【表１】
【０１３０】
７７５または匹敵する変異をＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２中に有するタバコ植物の利用は、タバコ集団中へのコンバータ植物の導入を消去するために有効な手段であり得るが、これらの植物において、低いが著しい量のノルニコチンが残存する。０．４５％ほど低いニコチンからノルニコチンへの変換率がＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２を対象とするＲＮＡｉに基づく構築物を発現するトランスジェニック植物で観察されたことに鑑みて（Ｌｅｗｉｓら、２００８）、ＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２に対する高いＤＮＡ配列相同性を有する少なくとも１つの他の遺伝子が、非コンバータ植物および不活性化されたＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２遺伝子を有するコンバータ植物の両方で観察されるノルニコチン合成の大部分を担うはずであることが明らかであった。この可能性は、これもまた機能的ニコチン脱メチル化酵素をコードすることが示されたＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２と９２．７％のＤＮＡ配列同一性を共有する遺伝子であるＣＹＰ８２Ｅ５ｖ２の発見によりさらに支持された（Ｄｅｗｅｙら、２００７；ＧａｖｉｌａｎｏおよびＳｉｍｉｎｓｚｋｙ、２００７）。ＣＹＰ８２Ｅ５ｖ２ニコチン脱メチル化酵素遺伝子は、コンバータ植物および非コンバータ植物において一様にタバコの緑葉において低レベルで発現されるが（非常に高いレベルで発現されるＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２とは対照的に）、老化および空気乾燥の間にはコンバータ植物の葉においてのみ発現される。
【０１３１】
Ｄｅｗｅｙら（２００７）に概説されるように、ＥＭＳ突然変異誘発ＤＨ９８−３２５−６タバコ集団のスクリーニングにより、ＣＹＰ８２Ｅ５ｖ２中にノックアウト変異を有する個体（植物１０１３）が同定される。ノルニコチン蓄積に対する非機能的ｃｙｐ８２ｅ５ｖ２対立遺伝子の影響を決定するために、植物７７５および１０１３からの変異を組み合わせた交雑種を作製した。最初の交雑種のＦ１子孫に由来する多数のＦ２個体の分子的遺伝子型決定により、両方の変異についてホモ接合型（ｅ４ｅ４／ｅ５ｅ５）の９つの個体が同定された。これらの９つの植物も、２００８年野外試験に含めた。ＣＹＰ８２Ｅ５ｖ２は機能的ニコチン脱メチル化酵素をコードすることが示されているという事実にもかかわらず（Ｄｅｗｅｙら、２００７；ＧａｖｉｌａｎｏおよびＳｉｍｉｎｓｚｋｙ、２００７）、機能不全ｃｙｐ８２ｅ５ｖ２変異をノックアウトｃｙｐ８２ｅ４ｖ２変異と組み合わせることは、葉のノルニコチンレベルに著しくほとんど影響しなかった。表１に示すように、二重変異についてホモ接合型の植物（ｅ４ｅ４／ｅ５ｅ５）は、ｃｙｐ８２ｅ４ｖ２変異だけを有する植物（ｅ４ｅ４）についての平均２．６％の変換と比較して、平均で２．３％のニコチン変換を示した。２つの遺伝子型の間での平均変換の控えめな違いは、統計学的に有意でなかった（Ｐ＝０．１１８）。これとは対照的に、本研究に含めたＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２をＲＮＡｉでサイレンシングしたトランスジェニック系統の１つは、平均で０．７％の変換を示し、この量は、ｅ４ｅ４またはｅ４ｅ４／ｅ５ｅ５遺伝子型のいずれから得られたものよりも有意に低かった（Ｐ＜０．００１）。よって、植物におけるノルニコチン生成に貢献する、ＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２に対する高い相同性を有する別の遺伝子が、タバコゲノム内に存在するはずである。
【０１３２】
［実施例１： ｃｙｐ８２ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素遺伝子の単離および特徴決定］
ニコチン脱メチル化酵素をコードする可能性があるタバコゲノム中のその他の遺伝子を同定するために、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、１９９７）を用いる相同性検索を、ＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２のＤＮＡおよびタンパク質配列をそれぞれのクエリ配列として用いて、ＧｅｎＢａｎｋ中のＮ．ｔａｂａｃｕｍ発現遺伝子配列断片（ＥＳＴ）データベースに対して行った。ＣＹＰ８２Ｅスーパーファミリーの以前の特徴決定したメンバー（例えばＣＹＰ８２Ｅ２、ＣＹＰ８２Ｅ３およびＣＹＰ８２Ｅ５ｖ２）に対応するｃＤＮＡ配列を同定することに加えて、この遺伝子ファミリーの以前に特徴決定されたいずれのメンバーとも完全にアラインメントされない７つのＥＳＴを発見した。興味深いことに、７つのＥＳＴは全て、根特異的ｃＤＮＡライブラリーまたは根を含む混合組織で構成されるｃＤＮＡライブラリーのいずれかを起源とした。この観察結果は、新しいＣＹＰ８２Ｅ遺伝子が、根組織に特異的に発現されることを示唆し、これは、ＣＹＰ８２Ｅ Ｐ４５０スーパーファミリーのこの特定のメンバーが、なぜ以前に検出から逃れたかを説明する特性である（以前の努力は、葉組織で発現されたＣＹＰ８２Ｅ遺伝子の特徴決定に焦点を当てていたからである）。いずれの個別のＥＳＴ配列も、この新規な遺伝子の全体のコード領域をカバーするのに十分長くなかったので、ＰＣＲプライマーを設計し、これは、タバコの根組織から単離したＲＮＡから作製された第１鎖ｃＤＮＡからのｃＤＮＡ配列全体の増幅を可能にした。さらに、プライマーを用いて、中央の大きいイントロンを含む遺伝子の対応するゲノム領域を増幅した。この新規なＣＹＰ８２Ｅ ｃＤＮＡは、タバコＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２ ｃＤＮＡと９２．４％のヌクレオチド同一性およびアミノ酸レベルでの９１．１％の予測される同一性を共有する。Ｐ４５０遺伝子命名法についての手引きを守って、この新しい遺伝子は、ＣＹＰ８２Ｅ１０と命名された。ＣＹＰ８２Ｅスーパーファミリーの特徴決定された全てのメンバーのうち、ＣＹＰ８２Ｅ１０は、ＣＹＰ８２Ｅ５ｖ２と最高の配列類似性を示し、ｃＤＮＡレベルで９６．５％のヌクレオチド同一性、および９５．７％の予測アミノ酸配列同一性を共有する。ＣＹＰ８２Ｅ１０のＤＮＡ配列およびその予測タンパク質配列を、図１に示す。
【０１３３】
様々なＣＹＰ８２ＥファミリーメンバーのｃＤＮＡは高度に保存される傾向にあるが、これらの遺伝子のゲノムバージョンは、より大きい配列多様性を示す。これは、主に、大きい中央のイントロン内で観察される実質的な配列の相違による。ＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２、ＣＹＰ８２Ｅ５ｖ２およびＣＹＰ８２Ｅ１０ゲノム配列のアラインメントを、図２に示す。ＥＭＢＯＳＳペアワイズアラインメントアルゴリズム（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｅｍｂｏｓｓ／ａｌｉｇｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を用いて計算されるように、ＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２およびＣＹＰ８２Ｅ１０遺伝子は、７８．３％のヌクレオチド同一性を共有し、ＣＹＰ８２Ｅ１０は、ＣＹＰ８２Ｅ５ｖ２遺伝子と、タバコゲノム内に存在する場合に、８４．９％同一である（ＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２およびＣＹＰ８２Ｅ５ｖ２ゲノム配列は、７５％の同一性を共有する）。
【０１３４】
いくつかの出版物において詳述されるように、タバコゲノムで見出されるＣＹＰ８２Ｅスーパーファミリーの遺伝子のほとんどは、機能的ニコチン脱メチル化酵素をコードしない（Ｓｉｍｉｎｓｚｋｙら、２００５；Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉら、２００７；Ｄｅｗｅｙら、２００７；Ｇａｖｉｌａｎｏら、２００７；Ｘｕら、２００７ａ）。よって、配列相同性単独は、ＣＹＰ８２Ｅファミリーについての遺伝子機能の非常に正確な指標ではない。代わりに、トランスジェニック植物（Ｓｉｍｉｎｓｚｋｙら、２００５）または酵母（ＧａｖｉｌａｎｏおよびＳｉｍｉｎｓｚｋｙ、２００７；Ｘｕら、２００７ａ）のいずれかにおける発現解析が、この遺伝子ファミリーの個別のメンバーがニコチン脱メチル化酵素活性をコードするかを決定するための確立された手段になっている。
【０１３５】
ＣＹＰ８２Ｅ１０がニコチン脱メチル化酵素遺伝子として機能するかを決定するために、そのｃＤＮＡを、酵母発現ベクターｐＹｅＤＰ６０にクローニングして、酵母株Ｗ（Ｒ）を形質転換した。株Ｗ（Ｒ）は、Ｐ４５０への直接の電子供与体として働く酵素である酵母ＮＡＤＰＨ依存性Ｐ４５０還元酵素を過剰発現するように工学的に改変された酵母細胞株である。この系は、酵母で発現される外来Ｐ４５０酵素活性の検出を大きく増進する（Ｐｏｍｐｏｎら、１９９５）。ニコチン脱メチル化酵素アッセイを、酵母ミクロソーム膜調製物を［１４Ｃ］−ニコチンとインキュベートし、Ｓｉｍｉｎｓｚｋｙら（２００５）に記載されるようにして生成物を薄層クロマトグラフィーで分割することにより行った。
【０１３６】
図３に示すように、ｐＹｅＤＰ６０ベクターのみを発現するＷ（Ｒ）株からの酵母ミクロソームを用いて、ニコチン脱メチル化酵素活性は検出できなかった。これとは対照的に、非常に堅固なニコチン脱メチル化酵素活性が、ＣＹＰ８２Ｅ１０ ｃＤＮＡを発現する酵母細胞に由来するミクロソームから測定できた。ＣＹＰ８２Ｅ１０酵素活性を広範囲の［１４Ｃ］−ニコチン濃度にわたって測定することにより、基質飽和曲線を確立し、３．９μＭのニコチンの見かけのＫｍを、ミクロソームアッセイを用いて計算した。ＣＹＰ８２Ｅ１０についてのこの動力学的パラメータは、同様に酵母で発現させた場合にＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２およびＣＹＰ８２Ｅ５ｖ２酵素について報告されたＫｍと非常に類似する（Ｇａｖｉｌａｎｏら、２００７；ＧａｖｉｌａｎｏおよびＳｉｍｉｎｓｚｋｙ、２００７；Ｘｕら、２００７ａ）。
【０１３７】
［実施例２： ＣＹＰ８２Ｅ１０の変異対立遺伝子を有する植物の同定］
タバコ植物のノルニコチン総含量に対するＣＹＰ８２Ｅ１０の特異的な貢献を正確に評価するために、（１）この遺伝子内にノックアウト変異を有するタバコ植物を同定し、（２）この変異を、それぞれ植物７７５および１０１３を起源とするｃｙｐ８２ｅ４ｖ２およびｃｙｐ８２ｅ５ｖ２変異と組み合わせることが必要であった。ＣＹＰ８２Ｅ１０中の潜在的な衰弱性変異を同定するために、ＥＭＳ突然変異誘発ＤＨ９８−３２５−６集団を、ＣＹＰ８２Ｅ１０の部分を特異的に増幅する（ＣＹＰ８２Ｅスーパーファミリーのその他のメンバーを同時に増幅することなく）プライマーを用いるハイスループットＤＮＡ配列分析によりスクリーニングした。ＣＹＰ８２Ｅ１０のエキソン１を特異的に増幅するために、以下のＰＣＲプライマーを用いた：５’−ＧＴＧＡＴＡＧＴＴＴＧＡＴＴＣＣＣＡＡＧＴＧＣ−３’（フォワード）および５’−ＣＴＣＣＣＡＡＡＧＴＴＡＧＡＴＴＡＧＴＣＣＧ−３’（リバース）。エキソン２の特異的増幅は、プライマー５’−ＡＧＧＴＣＧＣＧＣＴＧＡＴＴＣＴＴＧ−３’（フォワード）および５’−ＡＧＡＴＧＡＡＴＡＣＣＣＡＴＣＴＡＴＣＴＡＧＧＡＧＴ−３’（リバース）を用いて達成した。最大限の特異性を確実にするために、エキソン１についてのリバースプライマーおよびエキソン２についてのフォワードプライマーは、ＣＹＰ８２Ｅ１０イントロン内の配列に対応する（図１）。突然変異誘発植物のＰＣＲ増幅および配列分析は、Ｄｅｗｅｙら（２００７）に記載されるようにして９６ウェルフォーマットを用いて行った。
【０１３８】
突然変異誘発タバコ集団からの１，２００を超える個体のハイスループット配列分析は、ＣＹＰ８２Ｅ１０中に変異を有する１５の個体の同定をもたらした。これらのうちの最も著しいものを、表２に示す。これらの植物において変異されたヌクレオチドおよびアミノ酸残基も、図１に強調する。これらの個体のうちで切断変異は観察されなかったが、いくつかの場合において、酵素の高度に保存された領域内のアミノ酸残基が変更された変異が同定された。ＣＹＰ８２Ｅ１０酵素活性に対する特定の変異の影響を決定するために、部位特異的突然変異誘発を用いて、表２に示す９つの変異のうちの７つに相当する特定の変異を、ｐＹｅＤＰ６０酵母発現ベクター内のＣＹＰ８２Ｅ１０ ｃＤＮＡ中に導入した。７つのＣＹＰ８２Ｅ１０バリアントのそれぞれを発現する酵母株からのミクロソーム調製物を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにてニコチン脱メチル化酵素活性について、非飽和（２．４５μＭ）および飽和（５０μＭ）濃度の両方の［１４Ｃ］−ニコチンを用いてアッセイした。酵母発現アッセイからの結果は、植物６９３、８１７および１０３５で見出された変異は酵素活性を変更しなかったが、植物１０４１、１５１２および２４７６で見出された変異は完全な酵素不活性化を導いたことを示した。植物１４４２において観察された変異は、野生型ＣＹＰ８２Ｅ１０酵素と比較して、７５％の活性の低減をもたらした。
【０１３９】
植物１０４１変異に相当するｉｎ ｖｉｔｒｏ酵母発現アッセイについての薄層クロマトグラフィーデータを、図３に示す。この特定の変異を、より網羅的な調査のために選択した。植物１０４１変異を規定するアミノ酸３８２位でのＰｒｏからＳｅｒへの置換がニコチン脱メチル化機能と両立しないことについてさらに確認するために、この同じ変異を、同様にｐＹｅＤＰ６０ベクターにクローニングされたＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２ ｃＤＮＡに導入した。これらの酵母アッセイの結果を、表３に表示する。ＣＹＰ８２Ｅ１０またはＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２酵素のいずれに導入されても、３８２位でのＰｒｏについてのＳｅｒ置換は、このアッセイにおいてニコチン脱メチル化酵素活性の完全な除去を導く。興味深いことに、野生型ＣＹＰ８２Ｅ１０およびＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２酵素の活性は、非飽和［１４Ｃ］−ニコチン濃度（２．４５μＭ）にて２５μＭの基質レベルで同等であったが、［１４Ｃ］−ノルニコチン合成の率は、ＣＹＰ８２Ｅ１０酵素を有するミクロソーム調製物において、ＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２を含有する調製物よりも３倍近く大きかった。
【０１４０】
【表２】
【０１４１】
【表３】
【０１４２】
野生型および１０４１変異ＣＹＰ８２Ｅ１０発現酵母細胞のニコチン脱メチル化酵素活性も、ｉｎ ｖｉｖｏでアッセイした。酵母培養物を一晩、５５μＭの［１４Ｃ］−ニコチンの存在下で振とうし、メタノールで抽出し、薄層クロマトグラフィーにより分析した。［１４Ｃ］−ノルニコチンは、野生型ＣＹＰ８２Ｅ１０を発現する酵母の抽出物において検出できたが、遺伝子の１０４１変異バーションでは検出できなかった（データは示さず）。累積的に、酵母発現アッセイは、ＣＹＰ８２Ｅ１０酵素機能が１０４１変異の導入により完全に消失することを強く示唆する。
【０１４３】
［実施例３： ｃｙｐ８２ｅ１０、ｃｙｐ８２ｅ４ｖ２およびｃｙｐ８２ｅ５ｖ２の変異対立遺伝子の組合せ］
元の１０４１変異は、強いコンバータＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２対立遺伝子と、野生型ＣＹＰ８２Ｅ５ｖ２遺伝子との両方を含有する遺伝子背景（ＤＨ９８−３２５−６）にあることに鑑みて、植物ノルニコチン総含量に向かうＣＹＰ８２Ｅ１０の特異的貢献を正確に評価するための唯一の方法は、１０４１変異を、ノックアウトＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２およびＣＹＰ８２Ｅ５ｖ２変異も有するタバコ植物に導入することである。このことを遂行するために、１０４１変異についてヘテロ接合型の植物（ｅ１０Ｅ１０）を、上記の７７５および１０１３変異の両方についてヘテロ接合型の植物（ｅ４Ｅ４／ｅ５Ｅ５）と交雑させた。後者の植物は、交雑種７７５／１０１３／／ＴＮ９０／３／ＴＮ９０／４／ＴＮ９０からの子孫である。３つ全てのニコチン脱メチル化酵素変異についてヘテロ接合型のＦ１植物（ｅ４Ｅ４／ｅ５Ｅ５／ｅ１０Ｅ１０）を、分子的遺伝子型決定により同定し、自家受粉させた。分子的遺伝子型決定は、４００を超えるＦ２子孫をスクリーニングし、その後、それらを以下の遺伝子型クラスに分類するためにも用いた。Ｅ４Ｅ４／Ｅ５Ｅ５／ｅ１０ｅ１０（合計３つの植物）、ｅ４ｅ４／Ｅ５Ｅ５／ｅ１０ｅ１０（合計４つの植物）、Ｅ４Ｅ４／ｅ５ｅ５／ｅ１０ｅ１０（合計５つの植物）、およびｅ４ｅ４／ｅ５ｅ５／ｅ１０ｅ１０（合計５つの植物）。
【０１４４】
上記の全ての植物を、移植して、２００９年の夏にＲｏｃｋｙ Ｍｏｕｎｔ、ＮＣのＵｐｐｅｒ Ｃｏａｓｔａｌ Ｐｌａｉｎｓ研究所にて野外で生育させた。この研究には、表１に示す２００８年の野外試験で試験した２つの遺伝子型も含めた。具体的に、ｃｙｐ８２ｅ４ｖ２変異についてのみホモ接合型（ｅ４ｅ４／Ｅ５Ｅ５／Ｅ１０Ｅ１０）の１０のＤＨ９８−３２５−６植物、および二重ホモ接合型ｅ４ｅ４／ｅ５ｅ５／Ｅ１０Ｅ１０遺伝子型を有する１１のＤＨ９８−３２５−６植物を、比較のために含めた。対照として、商業的な「低コンバータ」種子ロット（ＴＮ９０ＬＣ）から無作為に選択した個別の植物、野生型ＤＨ９８−３２５−６個体および最良のＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２ ＲＮＡｉ抑制トランスジェニック系統の１つからの植物も、研究に含めた。植物が平均で約３０ｃｍの高さになった後に（移植の３５日後）、類似の茎の位置から葉を回収し、エテホンで処理し、Ｊａｃｋら（２００７）により確立された手順に従って空気乾燥させた。乾燥させた葉材料のアルカロイド含量を、同じ手順に記載されるようにしてガスクロマトグラフィーにより決定した。
【０１４５】
表４および図４は、２００９年野外試験についてのアルカロイド分析の結果を示す。以前の観察と一貫して、ｃｙｐ８２ｅ４ｖ２ノックアウト変異単独は、系統ＤＨ９８−３２５−６の強いコンバータ表現型を打ち消し、商業的なＴＮ９０ＬＣ種子からの植物よりも実質的に低いノルニコチン蓄積表現型も授けた（それぞれ２．２％の変換対７．１％）。２００８年野外試験で観察されたように（表１）、ｃｙｐ８２ｅ５ｖ２変異をｃｙｐ８２ｅ４ｖ２と組み合わせることにより、ノルニコチン含量はさらに低減されなかった。実際に、ｅ４ｅ４／Ｅ５Ｅ５／Ｅ１０Ｅ１０植物についての平均ニコチン変換は、ｅ４ｅ４／ｅ５ｅ５／Ｅ１０Ｅ１０個体について観察されたものより実際に低かった（２．２％対２．３％）が、このわずかな差は統計学的に有意でなかった。予期されたように、ｃｙｐ８２ｅ１０変異は、単独（Ｅ４Ｅ４／Ｅ５Ｅ５／ｅ１０ｅ１０遺伝子型）または変異ｃｙｐ８２ｅ５ｖ２対立遺伝子と組み合わせた場合（Ｅ４Ｅ４／ｅ５ｅ５／ｅ１０ｅ１０遺伝子型）のいずれでも、活性ＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２遺伝子により授けられた高いノルニコチンレベルに影響しなかった（図４Ａ）。ｃｙｐ８２ｅ４ｖ２およびｃｙｐ８２ｅ５ｖ２二重変異体の結果と同様に（表１および４）、ｃｙｐ８２ｅ１０をｃｙｐ８２ｅ４ｖ２背景に導入することは、ｃｙｐ８２ｅ４ｖ２変異単独により達成できるレベル未満にノルニコチンレベルを低減させることにおいて効果的でなかった（図４Ｂ）。ｅ４ｅ４／Ｅ５Ｅ５／ｅ１０ｅ１０遺伝子型は、平均で１．８５％の変換を示し、これは、ｅ４ｅ４／Ｅ５Ｅ５／Ｅ１０Ｅ１０個体について観察された２．２％の平均変換レベルと有意な差がなかった（Ｐ＝０．２３５）。
【０１４６】
【表４】
【０１４７】
ｃｙｐ８２ｅ５ｖ２およびｃｙｐ８２ｅ１０変異は、個別に組み合わせた場合にｃｙｐ８２ｅ４ｖ２植物のノルニコチン含量を著しく減少するために働かなかったが、３つ全てのニコチン脱メチル化酵素変異をピラミッド状にすることは、非常に著しい効果があった。三重変異植物（ｅ４ｅ４／ｅ５ｅ５／ｅ１０ｅ１０）におけるニコチンからノルニコチンへの変換は、ＲＮＡｉ抑制トランスジェニック系統で観察された０．５４％と実質的に同一のパーセンテージである、平均で０．５５％だけであった（Ｐ＝０．８９３；図４Ｂ）。このことは、ｃｙｐ８２ｅ４ｖ２変異単独により媒介されたものを超えてニコチン変換の３倍を超える低減を表す。統計学的に、ｅ４ｅ４／Ｅ５Ｅ５／Ｅ１０Ｅ１０遺伝子型とｅ４ｅ４／ｅ５ｅ５／ｅ１０ｅ１０遺伝子型との間のパーセントニコチン変換（および全乾燥重量のパーセンテージとしてのノルニコチン蓄積）における差は、高度に有意であった（Ｐ＜０．０００１）。ニコチン変換のＲＮＡｉ媒介抑制の調査と同様に（Ｌｅｗｉｓら、２００８）、タバコ植物におけるニコチン脱メチル化酵素活性のこの非トランスジェニック変更は、マイナーなアルカロイド種であるアナタビンおよびアナバシンの含量を著しく変更しないとみられた。
【０１４８】
３つの独立したニコチン脱メチル化酵素遺伝子変異をピラミッド状にすることの効果を、２０１０年の生育時季の間に行った野外試験においても試験した。この研究のために、交雑を、完全にＤＨ９８−３２５−６遺伝子背景内で行った（ＴＮ９０親も用いた２００９年研究とは対照的に）。分子的遺伝子型決定を再び用いて、ノルニコチン表現型に対するそれぞれのＣＹＰ８２Ｅ遺伝子座のそれぞれの貢献を決定するために必要な全ての可能な組合せを創出した。アルカロイドデータを、成熟まで生育させ、標準的な産業的手続に従って乾燥させたタバコ植物について収集した。表５に示すように、高いレベルのニコチン変換（５２．４〜６５．５９％の範囲）が、野生型ＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２遺伝子についてホモ接合型の全ての遺伝子型（遺伝子型Ｅ４Ｅ４／Ｅ５Ｅ５／Ｅ１０Ｅ１０、Ｅ４Ｅ４／ｅ５ｅ５／Ｅ１０Ｅ１０、Ｅ４Ｅ４／Ｅ５Ｅ５／ｅ１０ｅ１０およびＥ４Ｅ４／ｅ５ｅ５／ｅ１０ｅ１０）において観察された。ｃｙｐ８２ｅ４ｖ２変異についてのみホモ接合型の植物（ｅ４ｅ４／Ｅ５Ｅ５／Ｅ１０Ｅ１０）は、平均で２．９１％のニコチンからノルニコチンへの変換を示した。２００９年の結果と同様に、ｃｙｐ８２Ｅ５ｖ２およびｃｙｐ８２Ｅ１０変異の効果は相加的でなく、３つ全ての変異遺伝子座が一緒にピラミッド状になった場合にのみ現れた。ＤＨ９８−３２５−６（ｅ４ｅ４／Ｅ５Ｅ５／ｅ１０ｅ１０）植物は、平均で２．８９％の変換を示し、ＤＨ９８−３２５−６（ｅ４ｅ４／ｅ５ｅ５／Ｅ１０Ｅ１０）個体は、平均で２．５２％であり、これらの値は、ｃｙｐ８２ｅ４ｖ２変異単独で観察されたものと統計学的に差がなかった。これとは対照的に、三重変異ＤＨ９８−３２５−６（ｅ４ｅ４／ｅ５ｅ５／ｅ１０ｅ１０）遺伝子型で観察されたノルニコチンの低減（１．１１％ニコチン変換）は、ｃｙｐ８２ｅ４ｖ２変異単独により到達されたものより２．６倍低かった。三重変異組合せに帰することができるニコチン変換の低減は、ｃｙｐ８２ｅ４ｖ２単独またはいずれの二重変異組合せのいずれと比較しても、高度に有意であった（Ｐ＜０．００１）。
【０１４９】
【表５】
【０１５０】
［結論］
今回の発見および新しいニコチン脱メチル化酵素遺伝子ＣＹＰ８２Ｅ１０の特徴決定により、商用グレードの空気乾燥タバコ植物におけるニコチン変換率（およびそれによりノルニコチンレベル）を、トランスジェニックアプローチを用いることによってのみ以前は可能であったレベルまで低減するための方策を開発することができた。この非ＧＭＯベースの技術は、ノルニコチンのレベルを、トランスジェニック方策を用いて達成されていたものと同様の程度まで低減でき、それでもなお、（１）トランスジェニック植物を作製するために要求されるいくつかの機能付加技術について交渉し、ライセンス料を支払うこと、（２）トランスジェニック事象の規制緩和に関連する冗長な時間および面倒な費用を回避すること、ならびに（３）ＧＭＯに対して哲学的に反対する最終使用者により製品が拒絶される可能性に遭遇することのようなトランスジェニック作物の商業化に関連する実質的な障害を迂回しながら、超少量ノルニコチンタバコ品種を開発するための手段として働くおびただしい利点を提供する。本明細書で報告する発見は、ＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２ニコチン脱メチル化酵素遺伝子における変異だけ（Ｊｕｌｉｏら、２００８；Ｘｕら、２００７ｂ）、またはＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２変異とＣＹＰ８２Ｅ５ｖ２変異との組合せ（Ｄｅｗｅｙら、２００７）を標的にした以前に記載された非ＧＭＯ方策と比較して、タバコ製品において見出される、文書で最も十分に立証されている強い発癌物質の１つのレベルを低下させる我々の能力の主要な前進である。トランスジェニック技術を用いて、乾燥させた葉において約２．６％から約０．５％までニコチン変換レベルを低下させることが、葉のＮＮＮ含量における相応の低減も導くことが以前に証明された（Ｌｅｗｉｓら、２００８）。本報告で記載する三重変異組合せ（ｅ４ｅ４／ｅ５ｅ５／ｅ１０ｅ１０）を含有するタバコの葉からのＮＮＮ含量の同様の低減が観察されることが予期される。空気乾燥タバコを元来は標的にしたが、この技術は、熱風乾燥品種にも利益を与える。熱交換器は老化するので、熱風乾燥中にＮＯｘガスを除去するそれらの能力は減少し得る。さらに、最近の研究は、かなりの量のＴＳＮＡ形成が乾燥させた葉の貯蔵の間に発生し得ることを示している。熱風乾燥品種に三重変異組合せを導入することによりノルニコチンレベルを最小限にすることは、貯蔵の間または乾燥プロセス中の非効率な熱交換の結果としてのいずれかのＮＮＮ形成に対する防衛手段として作用できる。
【０１５１】
［参考文献］
【表６Ａ】
【表６Ｂ】
【表６Ｃ】
【０１５２】
本明細書で示す本発明の多くの改変およびその他の実施形態は、上記の記載および付随する図面に示した教示の利益を享受した、これらの発明が属する当技術分野における当業者が思い浮かべられる。よって、本発明は、開示される特定の実施形態に限定されず、改変およびその他の実施形態は、実施形態のリストおよび添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることを意図することが理解される。特定の用語を本明細書で採用したが、これらは、包括的および説明のための意味でのみ用い、限定する目的のために用いていない。
【０１５３】
本明細書で述べる全ての出版物および特許出願は、本発明が属する当技術分野における当業者のレベルを示す。全ての出版物および特許出願は、それぞれ個別の出版物および特許出願が参照することにより本明細書の一部をなすように具体的かつ個別に示されているのと同じ程度に、参照することにより本明細書の一部をなすものとする。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【技術分野】
【０００１】
［配列表の組込み］
配列表の正式な写しを、２０１１年１月１２日に作成した１４９ＫＢのサイズの「４００７１２ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」というファイル名を有するＡＳＣＩＩフォーマットされた配列表として、ＥＦＳ−Ｗｅｂを通じて電子的に提出し、本明細書と同時に出願する。このＡＳＣＩＩフォーマットされた文書に含まれる配列表は、明細書の一部分であり、参照することによりその全体が本明細書の一部をなすものとする。
【０００２】
［発明の分野］
本発明は、タバコ植物およびその植物部分におけるノルニコチン合成、よって、その代謝産物であるＮ’−ニトロソノルニコチンを最小限にするための組成物および方法、特に根特異的ニコチン脱メチル化酵素と緑葉および老化誘導性ニコチン脱メチル化酵素との組合せの発現または機能を阻害するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
商業的なタバコ品種で見出される主なアルカロイドはニコチンであり、典型的に、全アルカロイドプールの９０〜９５％を占める。残りのアルカロイド画分は、３つのさらなるピリジンアルカロイド、すなわちノルニコチン、アナバシンおよびアナタビンで主に構成される。ノルニコチンは、ニコチンＮ脱メチル化酵素の酵素活性により、ニコチンから直接産生される。ノルニコチンは、通常、全ピリジンアルカロイドプールの５％未満であるが、「変換」と呼ばれるプロセスにより、最初は非常に少量のノルニコチンを生成するタバコ植物が、大きいパーセンテージの葉ニコチンをノルニコチンに代謝的に「変換」する子孫を生じさせる。遺伝的に変換されたタバコ植物（「コンバータ」と称する）において、ノルニコチン生成の大部分は、成熟葉の老化および乾燥の間に起こる（ＷｅｒｎｓｍａｎおよびＭａｔｚｉｎｇｅｒ（１９６８）Ｔｏｂ．Ｓｃｉ．１２：２２６〜２２８頁）。バーレータバコ（Ｂｕｒｌｅｙ ｔｏｂａｃｃｏ）は、特に遺伝子変換を受けやすく、いくつかの栽培変種では世代あたり２０％という高い割合である。
【０００４】
タバコの葉の乾燥および加工の間に、ノルニコチンの一部は、実験動物において発癌性が主張されているタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）であるＮ−ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ）という化合物に代謝される（ＨｅｃｈｔおよびＨｏｆｆｍａｎｎ（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｒｖｅｙｓ ８：２７３〜２９４頁；Ｈｏｆｆｍａｎｎら（１９９４）Ｊ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｈｅａｌｔｈ ４１：１〜５２頁；Ｈｅｃｈｔ（１９９８）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１１：５５９〜６０３頁）。熱風乾燥タバコでは、ＴＳＮＡは、伝統的な乾燥小屋で見られる直火加熱システムにより形成される燃焼ガス中に存在する微量の窒素酸化物とのアルカロイドの反応により主に形成されることが見出されている（ＰｅｅｌｅおよびＧｅｎｔｒｙ（１９９９）「Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｏｂａｃｃｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｎｉｔｒｏｓａｍｉｎｅｓ ｉｎ Ｆｌｕｅ−ｃｕｒｅｄ Ｔｏｂａｃｃｏ」、ＣＯＲＥＳＴＡ Ｍｅｅｔｉｎｇ、Ａｇｒｏ−Ｐｈｙｔｏ Ｇｒｏｕｐｓ、Ｓｕｚｈｏｕ、Ｃｈｉｎａ）。これらの乾燥小屋を改造して熱交換器を設置することにより、燃焼ガスと乾燥空気との混合を実質的に排除し、この様式で乾燥させたタバコ中のＴＳＮＡの形成を劇的に低減させた（ＢｏｙｅｔｔｅおよびＨａｍｍ（２００１）Ｒｅｃ．Ａｄｖ．Ｔｏｂ．Ｓｃｉ．２７：１７〜２２頁）。これとは対照的に、空気乾燥バーレータバコでは、ＴＳＮＡ形成は、葉媒介微生物により触媒されるプロセスであるタバコアルカロイドと亜硝酸塩との反応により主に進行する（Ｂｕｓｈら（２００１）Ｒｅｃ．Ａｄｖ．Ｔｏｂ．Ｓｃｉ．２７：２３〜４６頁）。これまで、許容できる品質基準を維持しながら乾燥条件を改変することによりＴＳＮＡを低減するための試みは、空気乾燥タバコについて成功していない。
【０００５】
ＮＮＮの前駆体として機能することに加え、最近の研究は、タバコ製品で見られるノルニコチンが、さらなる望ましくない健康上の結果を有し得ることを示唆している。ＤｉｃｋｅｒｓｏｎおよびＪａｎｄａ（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１５０８４〜１５０８８頁は、ノルニコチンが、細胞内の異常なタンパク質グリケーションの原因となることを証明した。ノルニコチンで修飾されたタンパク質の濃度は、非喫煙者と比較して、喫煙者の血漿中でより高いことが見出された。また、これと同じ研究により、ノルニコチンが、プレドニゾンのような一般的なステロイド処方薬を共有結合的に修飾し得ることが示された。このような修飾は、これらの薬物の効力および毒性の両方を変更する可能性を有する。さらに、タバコ製品で見られるノルニコチンと、加齢黄斑変性、先天異常および歯周疾患との関連が、研究で報告されている（Ｂｒｏｇａｎら（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：１０４３３〜１０４３８頁；Ｋａｔｚら（２００５）Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．７６：１１７１〜１１７４頁）。
【０００６】
バーレータバコでは、葉のノルニコチン含量と、乾燥させた生成物中に蓄積されるＮＮＮの量との間に正の相関が見出されている（Ｂｕｓｈら（２００１）Ｒｅｃ．Ａｄｖ．Ｔｏｂ．Ｓｃｉ、２７：２３〜４６頁；Ｓｈｉら（２０００）Ｔｏｂ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｃｏｎｆ．５４：要約２７）。よって、葉のノルニコチン含量を効果的に低減できる方策は、上記のようなノルニコチン自体の潜在的な負の健康上の結果を改善するのに役立つだけでなく、ＮＮＮレベルも付随して低減させるはずである。この相関は、Ｌｅｗｉｓら（２００８）Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｊ．６：３４６〜３５４頁による最近の研究でさらに強固にされ、彼らは、老化誘導性ニコチン脱メチル化酵素をコードするＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２遺伝子を対象とするＲＮＡｉ導入遺伝子構築物を用いてノルニコチンのレベルを低下することにより、乾燥させた葉のＮＮＮ含量が付随して低減されたことを証明した。この研究は、トランスジェニック技術を用いて、タバコのノルニコチンおよびＮＮＮの含量を大きく低減できることを証明したが、公共認識と知的財産の問題との組合せにより、トランスジェニック植物から得られる製品を商業化することが非常に困難になっている。
【０００７】
よって、トランスジェニックの使用に依存しない、タバコ中のノルニコチン蓄積を効果的に最小限にするための手段への大きな必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００８】
タバコ植物およびその植物部分におけるノルニコチン含量を最小限にするための組成物および方法が提供される。組成物は、配列番号１に示すＣＹＰ８２Ｅ１０ポリヌクレオチドと称する単離根特異的シトクロムＰ４５０ポリヌクレオチド、および、それによりコードされる、配列番号２に示すＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素ポリペプチド、ならびに配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３に示す配列を含むポリペプチド、および配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３に示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むがこれらに限定されないそれらのバリアントおよび断片を含む。本発明のＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドは、タバコ植物の根におけるニコチンからノルニコチンへの代謝変換に関与するニコチン脱メチル化酵素である。本発明の単離ポリヌクレオチドは、配列番号３または４に示す配列を含むポリヌクレオチド、ならびにそれらのバリアントおよび断片も含む。本発明の組成物は、ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素をコードする遺伝子において変異を含むタバコ植物またはその植物部分も含み、該変異は、ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素の発現または機能の低減をもたらす。いくつかの実施形態では、本発明のタバコ植物は、ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素をコードする遺伝子における変異および／またはＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素をコードする遺伝子における変異をさらに含み、これらの遺伝子における変異は、ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素またはＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素の発現または機能の低減をもたらす。これらのタバコ植物の種子またはその子孫、および、本発明のタバコ植物またはその植物部分もしくは子孫から調製されたタバコ製品も提供される。
【０００９】
タバコ植物またはその植物部分におけるノルニコチンのレベルを低減するかまたはニコチンからノルニコチンへの変換率を低減するための方法も提供される。これらの方法は、タバコ植物のゲノムに、少なくとも３つのニコチン脱メチル化酵素遺伝子の各々の少なくとも１つの対立遺伝子内の変異を導入するステップを含み、該変異は、ニコチン脱メチル化酵素遺伝子の発現を低減させ、これらのニコチン脱メチル化酵素遺伝子の第１のものは、タバコ植物またはその植物部分におけるニコチンからノルニコチンへの代謝変換に関与する根特異的ニコチン脱メチル化酵素をコードする。いくつかの実施形態では、根特異的ニコチン脱メチル化酵素は、ＣＹＰ８２Ｅ１０またはそのバリアントである。他の実施形態では、これらの方法は、タバコ植物のゲノムに、ＣＹＰ８２Ｅ１０またはそのバリアントをコードするニコチン脱メチル化酵素遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子内の変異と、ＣＹＰ８２Ｅ４もしくはそのバリアントをコードするニコチン脱メチル化酵素および／またはＣＹＰ８２Ｅ５もしくはそのバリアントをコードするニコチン脱メチル化酵素の少なくとも１つの対立遺伝子内の変異とを導入するステップを含む。ノルニコチンのレベルが低いタバコ植物を同定する方法も提供され、植物またはその植物部分を、ＣＹＰ８２Ｅ１０もしくはそのバリアントをコードする遺伝子における変異の存在について単独でスクリーニングするか、あるいはＣＹＰ８２Ｅ４もしくはそのバリアントをコードする遺伝子における変異の存在、および／またはＣＹＰ８２Ｅ５もしくはそのバリアントをコードする遺伝子における変異の存在についてスクリーニングすることと組み合わせる。
【００１０】
以下の実施形態は、本発明に包含される。
【００１１】
１．ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素をコードする遺伝子において変異を含むタバコ植物またはその植物部分であって、前記変異が、前記ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素の発現または機能の低減をもたらすタバコ植物またはその植物部分。
【００１２】
２．前記ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素が、配列番号２、５、６、７、８および９に示す配列からなる群より選択される実施形態１に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【００１３】
３．前記変異が、アミノ酸残基７９、１０７、３８２、４１９およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される位置にて生じる前記ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素の改変をもたらし、前記番号付けが配列番号２に従う実施形態１または２に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【００１４】
４．前記変異が、
ａ）７９位のグリシン残基のセリンによる置換、
ｂ）１０７位のプロリン残基のセリンによる置換、
ｃ）３８２位のプロリン残基のセリンによる置換、
ｄ）４１９位のプロリン残基のセリンによる置換、および
ｅ）それらの任意の組合せ
からなる群より選択される実施形態３に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【００１５】
５．ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素をコードする遺伝子において変異をさらに含み、前記変異が、前記ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素の発現または機能の低減をもたらす実施形態１〜４のいずれかに記載のタバコ植物またはその植物部分。
【００１６】
６．前記ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素が、配列番号１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０に示す配列から選択される実施形態５に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【００１７】
７．前記変異が、アミノ酸残基３２９、３６４、３７６、３８２および４５８からなる群より選択される位置にて生じる前記ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素の改変をもたらし、前記番号付けが配列番号１４に従う実施形態５または６に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【００１８】
８．前記変異が、
ａ）３２９位のトリプトファン残基の停止コドンによる置換、
ｂ）３６４位のリシン残基のアスパラギンによる置換、
ｃ）３７６位のバリン残基のメチオニンによる置換、
ｄ）３８２位のプロリン残基のセリンによる置換、
ｄ）４５８位のプロリン残基のセリンによる置換、および
ｅ）それらの任意の組合せ
からなる群より選択される実施形態７に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【００１９】
９．ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素をコードする遺伝子において変異をさらに含み、前記変異が、前記ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素の発現または機能の低減をもたらす実施形態１〜８のいずれかに記載のタバコ植物またはその植物部分。
【００２０】
１０．前記ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素が、配列番号２６、２７、２８、２９、３０、３１および３２に示す配列から選択される実施形態９に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【００２１】
１１．前記変異が、アミノ酸残基４２２および４４９からなる群より選択される位置にて生じる前記ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素の改変をもたらし、前記番号付けが配列番号２６に従う実施形態９または１０に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【００２２】
１２．前記変異が、
ａ）４２２位でトリプトファン残基と置換した停止コドン、
ｂ）４４９位でプロリン残基と置換したロイシン、および
ｃ）それらの任意の組合せ
からなる群より選択される実施形態１１に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【００２３】
１３．前記ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素遺伝子および前記ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素遺伝子において変異を含む実施形態９〜１２のいずれかに記載のタバコ植物またはその植物部分。
【００２４】
１４．前記変異についてホモ接合型である実施形態１〜１３のいずれかに記載のタバコ植物またはその植物部分。
【００２５】
１５．前記ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素が３８２位に変異を含み、前記ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素が３２９位に変異を含み、前記ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素が４２２位に変異を含み、前記番号付けがそれぞれ配列番号２、１４および２６に従う実施形態１４に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【００２６】
１６．前記変異が、
ａ）３８２位のプロリン残基のセリンによる置換、
ｂ）３２９位のトリプトファン残基の停止コドンによる置換、
ｃ）４２２位のトリプトファン残基の停止コドンによる置換、および
ｄ）それらの任意の組合せ
からなる群より選択される実施形態１５に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【００２７】
１７．前記植物またはその部分が、１．５％未満の、ニコチンからノルニコチンへの変換を有する実施形態１３〜１６のいずれかに記載のタバコ植物またはその植物部分。
【００２８】
１８．前記植物またはその部分が、０．５％以下の、ニコチンからノルニコチンへの変換を有する実施形態１７に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【００２９】
１９．実施形態１〜１８のいずれかに記載のタバコ植物の種子またはその子孫。
【００３０】
２０．実施形態１〜１９のいずれかに記載のタバコ植物またはその植物部分もしくは子孫から調製されるタバコ製品。
【００３１】
２１．タバコ製品の発癌可能性を低減する方法であって、前記タバコ製品を、実施形態１〜１８のいずれかに記載のタバコ植物またはその植物部分もしくは子孫から調製するステップを含む方法。
【００３２】
２２．タバコ植物またはその植物部分におけるノルニコチンのレベルを低減するかまたはニコチンからノルニコチンへの変換率を低減する方法であって、前記植物のゲノムに、少なくとも３つのニコチン脱メチル化酵素遺伝子の各々の少なくとも１つの対立遺伝子内の変異を導入するステップを含み、前記変異が、前記ニコチン脱メチル化酵素遺伝子の発現を低減し、前記ニコチン脱メチル化酵素遺伝子の第１のものが、タバコ植物またはその植物部分におけるニコチンからノルニコチンへの代謝変換に関与する根特異的ニコチン脱メチル化酵素をコードする方法。
【００３３】
２３．前記根特異的ニコチン脱メチル化酵素が、
ａ）配列番号２、５、６、７、８、９または１０に示すアミノ酸配列、および
ｂ）配列番号２、５、６、７、８、９または１０に示すアミノ酸配列と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素である実施形態２２に記載の方法。
【００３４】
２４．前記ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素についての前記アミノ酸配列が、残基７９、１０７、３８２、４１９およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される位置のアミノ酸残基での置換を有し、前記番号付けが配列番号２に従う実施形態２３に記載の方法。
【００３５】
２５．７９位、１０７位、３８２位または４１９位での前記置換が、セリン残基である実施形態２４に記載の方法。
【００３６】
２６．前記ニコチン脱メチル化酵素遺伝子の第２のものが、ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素をコードする実施形態２２〜２５のいずれか１つに記載の方法。
【００３７】
２７．前記ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素が、
ａ）配列番号１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１に示すアミノ酸配列、および
ｂ）配列番号１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１に示す配列と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む実施形態２６に記載の方法。
【００３８】
２８．前記ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素についての前記アミノ酸配列が、残基３２９、３６４、３８２、４５８およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される位置のアミノ酸残基での置換を有し、前記番号付けが配列番号１４に従う実施形態２７に記載の方法。
【００３９】
２９．３２９位での前記置換が停止コドンであるか、３６４位での前記置換がアスパラギン残基であるか、３８２位での前記置換がセリン残基であるか、４５８位での前記置換がセリン残基であるか、またはそれらの任意の組合せである実施形態２８に記載の方法。
【００４０】
３０．前記ニコチン脱メチル化酵素遺伝子の第３のものが、ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素をコードする実施形態２２〜２９のいずれか１つに記載の方法。
【００４１】
３１．前記ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素が、
ａ）配列番号２６、２７、２８、２９、３０、３１または３２に示すアミノ酸配列、および
ｂ）配列番号２６、２７、２８、２９、３０、３１または３２に示す配列と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態３０に記載の方法。
【００４２】
３２．前記ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素についての前記アミノ酸配列が、残基４２２および４４９ならびにそれらの任意の組合せからなる群より選択される位置のアミノ酸残基での置換を有し、番号付けが配列番号２６に従う実施形態３１に記載の方法。
【００４３】
３３．４２２位での前記置換が停止コドンであるか、４４９位での前記置換がロイシン残基であるか、またはそれらの任意の組合せである実施形態３２に記載の方法。
【００４４】
３４．前記植物またはその植物部分が、前記変異についてホモ接合型である実施形態２２〜３３のいずれか１つに記載の方法。
【００４５】
３５．前記導入するステップが、育種手順を含む実施形態２２〜３４のいずれか１つに記載の方法。
【００４６】
３６．前記植物が、バーレー（Ｂｕｒｌｅｙ）タバコ植物、バージニア（Ｖｉｒｇｉｎｉａ）タバコ植物、熱風乾燥（ｆｌｕｅ−ｃｕｒｅｄ）タバコ植物、空気乾燥（ａｉｒ−ｃｕｒｅｄ）タバコ植物、火力乾燥（ｆｉｒｅ−ｃｕｒｅｄ）タバコ植物、オリエンタル（Ｏｒｉｅｎｔａｌ）タバコ植物またはダーク（ｄａｒｋ）タバコ植物である実施形態２２〜３５のいずれか１つに記載の方法。
【００４７】
３７．前記タバコ植物が、バーレータバコ植物、バージニアタバコ植物、熱風乾燥タバコ植物、空気乾燥タバコ植物、火力乾燥タバコ植物、オリエンタルタバコ植物またはダークタバコ植物である実施形態１〜１８のいずれかに記載のタバコ植物またはその植物部分。
【００４８】
３８．ノルニコチンのレベルが低いタバコ植物を同定する方法であって、配列番号１または３中の変異の存在について、対象のタバコ植物からのＤＮＡ試料をスクリーニングするステップを含む方法。
【００４９】
３９．前記タバコ植物が、非コンバータである実施形態３８に記載の方法。
【００５０】
４０．前記スクリーニングが、配列番号１、３、３５、３６、３７および３８からなる群より選択される配列を用いて行われる実施形態３８または３９に記載の方法。
【００５１】
４１．配列番号１４中の変異の存在、配列番号２６中の変異の存在または配列番号１４および配列番号２６中の変異の存在について、前記ＤＮＡ試料または前記対象のタバコ植物からの別のＤＮＡ試料をスクリーニングするステップをさらに含む実施形態３８〜４０のいずれか１つに記載の方法。
【００５２】
４２．ａ）配列番号１、３または４を含むヌクレオチド配列、
ｂ）配列番号１、３または４の少なくとも２０の連続するヌクレオチドの断片を含むヌクレオチド配列、
ｃ）配列番号１に示す配列全体と少なくとも９７％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、前記ポリヌクレオチドが、植物におけるニコチンからノルニコチンへの前記代謝変換に関与するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｄ）配列番号２および５〜１３からなる群より選択されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列または少なくとも１１５の連続する残基を含むその断片、
ｅ）配列番号２、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３に示す配列と少なくとも９８％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ならびに
ｆ）前記項目（ａ）から（ｅ）のいずれかによる前記配列と相補的なヌクレオチド配列
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド。
【００５３】
４３．ａ）配列番号２、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３に示すアミノ酸配列、
ｂ）配列番号２、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３に示すアミノ酸配列と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列、および
ｃ）配列番号２、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３に示すアミノ酸配列の断片であるアミノ酸配列であって、前記断片が、配列番号２、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３のアミノ酸配列の少なくとも１１５の連続する残基を含むアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
【００５４】
４４．ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素をコードする遺伝子、ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素をコードする遺伝子、およびＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素をコードする遺伝子における変異についてホモ接合型であるタバコ植物またはその植物部分であって、前記変異が、前記ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素、ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素およびＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素の発現または機能の低減をもたらし、前記ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素が３８２位に変異を含み、前記ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素が３２９位に変異を含み、前記ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素が４２２位に変異を含み、前記番号付けがそれぞれ配列番号２、１４および２６に従うタバコ植物またはその植物部分。
【００５５】
４５．ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素をコードする遺伝子における変異であって、前記ＣＹＰｅ２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素の発現または機能の低減をもたらす変異。
【００５６】
４６．根におけるニコチン脱メチル化酵素活性を阻害するＣＹＰ８２Ｅ１０遺伝子における変異、老化した葉におけるニコチン脱メチル化酵素活性を阻害するＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２遺伝子における変異、および緑葉におけるニコチン脱メチル化酵素活性を阻害するＣＹＰ８３Ｅ５遺伝子における変異を有する植物。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１Ａ−Ｃ】ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素遺伝子のＤＮＡ（配列番号４）および予測タンパク質配列を示す図である。タンパク質コード配列は大文字であり、５’および３’フランキング配列は小文字である。イントロン配列（配列番号３）は、小文字の斜体である。ヌクレオチド配列についての番号は左に示し、タンパク質配列についての番号は右に表示する。変異スクリーニングのためにエキソン１を特異的に増幅するために用いたＰＣＲプライマーに相当するヌクレオチド配列に下線を付し（太字で示さない）、一方、太字で下線を付した配列は、エキソン２特異的プライマー部位を表す。変異スクリーニングにおいて変更されていることが見出された個別のヌクレオチドおよびアミノ酸残基（表２）は、太字で下線を付す。
【図２Ａ−Ｃ】ＣＹＰ８２Ｅ１０（配列番号４）、ＣＹＰ８２Ｅ５ｖ２（配列番号３８）およびＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２（配列番号３７）についてのゲノム配列のアラインメントを示す図である。タンパク質コード配列は、大文字のタイプであり、５’および３’非翻訳領域は、小文字のタイプで示し、イントロン配列は、小文字の斜体のタイプで示す。配列同一性を共有する位置は、影のついた箱で囲む。
【図３】ＣＹＰ８２Ｅ１０、および植物１０４１由来のＳｅｒ３８２Ｐｒｏ（Ｓ３８２Ｐ）変異を有するＣＹＰ８２Ｅ１０を発現する酵母由来のミクロソーム膜のニコチン脱メチル化酵素活性の薄層クロマトグラフィーデータを示す図である。ＣＰＭ、カウント毎分。
【図４】図４および図４Ｂは、ＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２、ＣＹＰ８２Ｅ５ｖ２およびＣＹＰ８２Ｅ１０遺伝子座での様々な変異組合せを有するバーレータバコ植物についての平均ニコチン変換率を示す図である。異なる文字を有する平均は、Ｐ＜０．０５レベルで有意に異なる。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
［配列表の配列についての記載］
以下の列挙は、配列表についての配列情報を示す。アミノ酸置換についての標準的な表記を用いる。つまり、例えば、ＣＹＰ８２Ｅ１０ Ｐ４１９Ｓは、バリアントタンパク質が、４１９位でのプロリン残基のセリンによる置換を有する（番号付けは、野生型配列、この場合は配列番号２に示すＣＹＰ８２Ｅ１０配列に関する）ことを示す。別の例として、ＣＹＰ８２Ｅ４ Ｐ３８Ｌは、バリアントタンパク質が、３８位のプロリン残基のロイシンによる置換を有する（番号付けは、野生型配列、この場合は配列番号１４に示すＣＹＰ８２Ｅ４配列に関する）ことを示す。なお別の例として、ＣＹＰ８２Ｅ５ Ｐ７２Ｌは、バリアントタンパク質が、７２位のプロリン残基のロイシンによる置換を有する（番号付けは、野生型配列、この場合は配列番号２６に示すＣＹＰ８２Ｅ５配列に関する）ことを示す。
【００５９】
配列番号１は、ＣＹＰ８２Ｅ１０についてのコード配列を示す。
配列番号２は、ＣＹＰ８２Ｅ１０についてのアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、ＣＹＰ８２Ｅ１０遺伝子のイントロンのヌクレオチド配列を示す。
配列番号４は、ＣＹＰ８２Ｅ１０についてのゲノム配列を示す。
配列番号５は、ＣＹＰ８２Ｅ１０ Ｌ１４８Ｆについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号６は、ＣＹＰ８２Ｅ１０ Ｇ１７２Ｒについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号７は、ＣＹＰ８２Ｅ１０ Ａ３４４Ｔについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号８は、ＣＹＰ８２Ｅ１０ Ａ４１０Ｔについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号９は、ＣＹＰ８２Ｅ１０ Ｒ４１７Ｈについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０は、ＣＹＰ８２Ｅ１０ Ｐ４１９Ｓについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１は、ＣＹＰ８２Ｅ１０ Ｇ７９Ｓについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２は、ＣＹＰ８２Ｅ１０ Ｐ１０７Ｓについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号１３は、ＣＹＰ８２Ｅ１０ Ｐ３８２Ｓについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号１４は、ＣＹＰ８２Ｅ４についてのアミノ酸配列を示す。
配列番号１５は、ＣＹＰ８２Ｅ４ Ｐ３８Ｌについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号１６は、ＣＹＰ８２Ｅ４ Ｄ１７１Ｎについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号１７は、ＣＹＰ８２Ｅ４ Ｅ２０１Ｋについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号１８は、ＣＹＰ８２Ｅ４ Ｒ１６９Ｑについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号１９は、ＣＹＰ８２Ｅ４ Ｇ４５９Ｒについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号２０は、ＣＹＰ８２Ｅ４ Ｔ４２７Ｉについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号２１は、ＣＹＰ８２Ｅ４ Ｖ３７６Ｍについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号２２は、ＣＹＰ８２Ｅ４ Ｗ３２９Ｓｔｏｐについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号２３は、ＣＹＰ８２Ｅ４ Ｋ３６４Ｎについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号２４は、ＣＹＰ８２Ｅ４ Ｐ３８２Ｓについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号２５は、ＣＹＰ８２Ｅ４ Ｐ４５８Ｓについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号２６は、ＣＹＰ８２Ｅ５についてのアミノ酸配列を示す。
配列番号２７は、ＣＹＰ８２Ｅ５ Ｐ７２Ｌについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号２８は、ＣＹＰ８２Ｅ５ Ｌ１４３Ｆについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号２９は、ＣＹＰ８２Ｅ５ Ｓ１７４Ｌについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号３０は、ＣＹＰ８２Ｅ５ Ｍ２２４Ｉについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号３１は、ＣＹＰ８２Ｅ５ Ｐ２３５Ｓについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号３２は、ＣＹＰ８２Ｅ５ Ａ４１０Ｖについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号３３は、ＣＹＰ８２Ｅ５ Ｗ４２２Ｓｔｏｐについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号３４は、ＣＹＰ８２Ｅ５ Ｐ４４９Ｌについてのアミノ酸配列を示す。
配列番号３５は、ＣＹＰ８２Ｅ１０のエキソン１についてのフォワードプライマー配列を示す。
配列番号３６は、ＣＹＰ８２Ｅ１０のエキソン１についてのリバースプライマー配列を示す。
配列番号３７は、ＣＹＰ８２Ｅ１０のエキソン２についてのフォワードプライマー配列を示す。
配列番号３７は、ＣＹＰ８２Ｅ１０のエキソン２についてのリバースプライマー配列を示す。
配列番号３８は、ＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２についてのゲノム配列を示す。
配列番号３９は、ＣＹＰ８２Ｅ５ｖ２についてのゲノム配列を示す。
【００６０】
［定義］
本発明は、植物、特に様々な商業的な品種のタバコ植物を含むタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）属の植物の根におけるニコチンからノルニコチンへの代謝変換に関与する根特異的ニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドの発現または機能を阻害するための組成物および方法を含む。
【００６１】
本明細書で用いる場合、「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」、「阻害」および「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）」は、対象の遺伝子産物（すなわち標的遺伝子産物）、この場合は本発明の根特異的ニコチン脱メチル化酵素のようなニコチン脱メチル化酵素の発現または機能を減少させる、当技術分野において既知のまたは本明細書に記載される任意の方法として定義される。ニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドは、センスおよびアンチセンス抑制、ＲＮＡｉ抑制、突然変異誘発のようなノックアウトアプローチなどを含む当技術分野において既知の任意の適切な方法により阻害できることが認識される。特に興味があるものは、これらの根特異的ニコチン脱メチル化酵素の発現および／もしくは機能をノックアウトまたはノックダウンする方法、特にＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素遺伝子における好ましい変異を選択することを可能にする突然変異誘発アプローチである。
【００６２】
「好ましい変異」により意図されるのは、そのニコチン脱メチル化酵素活性が阻害されるようにＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドの置換、挿入、欠失または切断をもたらす変異である。いくつかの実施形態では、ニコチン脱メチル化酵素活性は、同じ試験条件下で野生型ＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドの活性と比較した場合に、少なくとも２５％、３０％、３５、４０％、４５、５０％、５５％または６０％阻害される。他の実施形態では、ニコチン脱メチル化酵素活性は、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％阻害される。好ましい実施形態では、好ましい変異は、完全阻害（すなわち１００％阻害）をもたらし、ニコチン脱メチル化酵素活性は、ノックアウトされる（すなわちその活性を測定できない）。
【００６３】
「阻害する」は、２つの植物の間、例えば遺伝子改変植物および野生型植物の比較との関連であり得る。比較は、植物の間、例えば野生型植物と、ニコチンをノルニコチンに変換する根特異的ニコチン脱メチル化酵素を生成できるＤＮＡ配列を欠くものの１つとの間であり得る。標的遺伝子産物の発現または機能の阻害も、同じ植物のうちもしくは異なる植物間の植物細胞、オルガネラ、器官、組織または植物部分の間の比較との関連であり得、同じ植物もしくは植物部分のうちの発達段階または経時的段階の間の比較あるいは植物もしくは植物部分の間の比較を含む。
【００６４】
「阻害する」は、その遺伝子産物の機能または生成の完全な消去までまたはそれを含む、対象の遺伝子産物、この場合は根特異的ニコチン脱メチル化酵素の機能または生成の任意の相対的な減少を含み得る。遺伝子産物のレベルを比較する場合に、そのような比較は、好ましくは、類似の遺伝子背景を有する生物間で行われる。好ましくは、類似の遺伝子背景は、比較される生物が、核酸遺伝物質の５０％以上、より好ましくは７５％以上、さらにより好ましくは９０％以上の配列同一性を共有する背景である。類似の遺伝子背景は、比較される生物が植物であり、これらの植物が、植物形質転換技術を用いて元来導入された任意の遺伝物質または人間の介在により作製された変異以外は同質遺伝子的である背景である。遺伝子産物のレベルまたは量の測定は、任意の適切な方法により行ってよく、非限定的なその例は、ｍＲＮＡ転写産物レベル、タンパク質もしくはペプチドレベルおよび／または表現型、特にニコチンからノルニコチンへの変換の比較を含むが、それらに限定されない。本明細書で用いる場合、ｍＲＮＡ転写産物は、プロセシングされたおよびプロセシングされていないｍＲＮＡ転写産物を含むことができ、ポリペプチドまたはペプチドは、任意の翻訳後修飾が行われたかもしくは行われていないポリペプチドまたはペプチドを含み得る。
【００６５】
本明細書で用いる場合、「バリアント」は、実質的に同様の配列を意味する。バリアントは、対象の野生型ポリペプチドと異なる機能または実質的に同様の機能を有し得る。ニコチン脱メチル化酵素について、実質的に同様の機能は、同じ条件下でまたは近同質遺伝子系統においてニコチンをノルニコチンに変換する野生型酵素機能の少なくとも９９％、９８％、９７％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、６０％、５０％、２５％または１５％である。野生型ＣＹＰ８２Ｅ１０を、配列番号２に示す。野生型ＣＹＰ８２Ｅ４を、配列番号１４に示す。野生型ＣＹＰ８２Ｅ５を、配列番号２６に示す。本発明の野生型ＣＹＰ８２Ｅ１０の例示的なバリアントは、配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３に示す配列を含むポリペプチドを含む。配列番号１０に示すバリアント（ＣＹＰ８２Ｅ１０ Ｐ４１９Ｓ）は、野生型ＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドのニコチン脱メチル化酵素活性の約２５％だけを有する酵素をもたらす好ましい変異を有利に有する。配列番号１１（ＣＹＰ８２Ｅ１０ Ｇ７９Ｓ）、配列番号１２（Ｐ１０７Ｓを有するＣＹＰ８２Ｅ１０）および配列番号１３（Ｐ３８２Ｓを有するＣＹＰ８２Ｅ１０）に示すバリアントは、それらのニコチン脱メチル化酵素活性のノックアウト（すなわち１００％阻害、よって非機能的ポリペプチド）をもたらす好ましい変異を有利に有する。同様に、野生型ＣＹＰ８２Ｅ４の例示的なバリアントは、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５に示す配列を含むポリペプチドを含む。配列番号２１に示すバリアント（ＣＹＰ８２Ｅ４ Ｖ３７６Ｍ）は、野生型ＣＹＰ８２Ｅ４ポリペプチドのニコチン脱メチル化酵素活性の約５０％だけを有する酵素をもたらす好ましい変異を有利に有する。配列番号２２（ＣＹＰ８２Ｅ４ Ｗ３２９Ｓｔｏｐ）、配列番号２３（ＣＹＰ８２Ｅ４ Ｋ３６４Ｎ）、配列番号２４（ＣＹＰ８２Ｅ４ Ｐ３８２Ｓ）および配列番号２５（ＣＹＰ８２Ｅ４ Ｐ４５８Ｓ）に示すバリアントは、それらのニコチン脱メチル化酵素活性のノックアウト（すなわち１００％阻害）をもたらす好ましい変異を有利に有する。同様に、野生型ＣＹＰ８２Ｅ４の例示的なバリアントは、配列番号２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３または３４に示す配列を含むポリペプチドを含む。配列番号３４に示すバリアント（ＣＹＰ８２Ｅ５ Ｐ４４９Ｌ）は、そのニコチン脱メチル化酵素活性の阻害をもたらす好ましい変異を有利に有し、配列番号３３に示すバリアントは、そのニコチン脱メチル化酵素活性のノックアウト（すなわち１００％阻害）をもたらす好ましい変異を有利に有する。
【００６６】
本明細書で用いる場合、「バリアントポリヌクレオチド」または「バリアントポリペプチド」は、野生型でない核酸またはアミノ酸配列を意味する。
【００６７】
バリアントは、１つの付加、欠失もしくは置換、２つ以下の付加、欠失もしくは置換、３つ以下の付加、欠失もしくは置換、４つ以下の付加、欠失もしくは置換、または５つ以下の付加、欠失もしくは置換を有することができる。変異は、付加、欠失および置換を含む。このような欠失または付加は、Ｃ末端、Ｎ末端、またはＣ末端およびＮ末端の両方であり得る。融合ポリペプチドまたはエピトープタグ付加ポリペプチドも、本発明に含まれる。「サイレント」ヌクレオチド変異は、所定の位置でのコードされるアミノ酸を変化させない。アミノ酸置換は、保存的であり得る。保存置換は、変化が、元のアミノ酸と同じファミリー内のアミノ酸へのものであるアミノ酸の変化である。ファミリーは、個別のアミノ酸の側鎖により定義される。アミノ酸のファミリーは、塩基性、酸性、非荷電極性または非極性側鎖を有することができる。参照することによりその全体が示されるかの如く本明細書の一部をなすものとするＡｌｂｅｒｔｓら、（１９９４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌ（第３版、５６〜５７頁、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。欠失、置換または付加は、その同じ位置での別のＣＹＰ８２Ｅファミリーメンバーのアミノ酸へのものであり得る。本明細書で用いる場合、「断片」は、ポリヌクレオチドの一部分またはそれによりコードされるポリペプチド、よってタンパク質の一部分を意味する。
【００６８】
本明細書で用いる場合、「植物部分」は、植物細胞、植物プロトプラスト、それから植物全体を再生できる植物細胞組織培養物、植物カルス、植物凝集塊、および胚、花粉、葯、胚珠、種子、葉、花、茎、枝、果実、根、根尖などのような植物または植物部分においてインタクトな植物細胞を意味する。再生された植物の子孫、バリアントおよび変異体も、それらが本発明の導入されたポリヌクレオチドを含むことを条件として、本発明の範囲に含まれる。本明細書で用いる場合、「タバコ植物材料」は、植物部分の任意の一部分または植物部分の任意の組合せを意味する。
【００６９】
［発明の詳細な説明］
本発明は、タバコ植物の根におけるニコチンからノルニコチンへの根特異的変換に関与する新規なニコチン脱メチル化酵素遺伝子、ＣＹＰ８２Ｅ１０（ゲノム配列は配列番号４に示す）、およびそれによりコードされるＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素（配列番号２）、ならびにニコチンからノルニコチンへの変換を低減または最小限にすること、すなわちタバコ植物およびその植物部分においてノルニコチンのレベルを低減することにおけるその使用を対象とする。「根特異的」により、それが、葉または種子のようなその他の植物器官に反して、タバコ植物の根の中で優先的に発現されることを意図する。選択された好ましい変異を、緑葉ニコチン脱メチル化酵素（例えば配列番号２６に示すＣＹＰ８２Ｅ５）もしくはニコチン脱メチル化酵素活性を有するそのバリアントをコードする遺伝子内の１つ以上の選択された好ましい変異と組み合わせて、そしてさらに老化誘導性ニコチン脱メチル化酵素（例えば配列番号１４に示すＣＹＰ８２Ｅ４）もしくはニコチン脱メチル化酵素活性を有するそのバリアントをコードする遺伝子内の１つ以上の選択された好ましい変異と組み合わせて、この根特異的ニコチン脱メチル化酵素またはニコチン脱メチル化酵素活性を有するそのバリアントに導入することにより、変換率が約１．５％未満、好ましくは約１％未満である最小限のニコチンからノルニコチンへの変換を有する非トランスジェニックタバコ植物を生成できる。
【００７０】
タバコにおけるノルニコチンのレベルを低下することは、このアルカロイドが、十分に立証されている発癌物質であるＮ’−ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ）の前駆体として働くので、非常に望ましい。タバコにおけるニコチン脱メチル化酵素活性を有するタンパク質をコードする２つの遺伝子は、以前に同定され、ＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２およびＣＹＰ８２Ｅ５ｖ２と称する。ＣＹＰ８２Ｅ４ポリペプチド（配列番号１４）は、老化誘導性ニコチン脱メチル化酵素である。ＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２遺伝子（コードおよびイントロン領域を含む）、タバコ植物中のノルニコチン生成におけるその役割、ならびにその発現および機能を阻害するための方法は、米国特許出願第１１／５８０，７６５号（米国特許出願公開第２００８／０２０２５４１Ａ１として公開された）に記載されている。ＣＹＰ８２Ｅ５ポリペプチド（配列番号２６）は、緑葉ニコチン脱メチル化酵素である（すなわち、その主な発現は緑葉におけるものである）。ＣＹＰ８２Ｅ４遺伝子（コード領域およびイントロン領域を含む）、タバコ植物中のノルニコチン生成におけるその役割、ならびにその発現および機能を阻害するための方法は、米国特許出願第１２／２６９，５３１号（米国特許出願公開第２００９／０２０５０７２Ａ１号として公開された）に記載されている。これらの２つの米国特許出願およびそれらのそれぞれの公報の内容は、それらの全体が参照することにより本明細書の一部をなすものとする。
【００７１】
好ましい変異ｃｙｐ８２ｅ４ｖ２およびｃｙｐ８２ｅ５ｖ２対立遺伝子（すなわちこれらのそれぞれのニコチン脱メチル化酵素遺伝子の発現がノックダウンまたはノックアウトされた変異対立遺伝子）についてホモ接合型の植物は、しかし、それらのニコチンの２％より多くをノルニコチンに代謝でき、これは、実質的なＮＮＮ形成を依然として導くことができるノルニコチンのレベルを表す。ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素遺伝子の発見は、タバコ植物におけるニコチンからノルニコチンへの変換率を最小限にし、よって、タバコ植物およびそれに由来する植物物質中のノルニコチンのレベル、よってＮＮＮのレベルをさらに低減するためのさらなる道を開く。好ましい変異ｃｙｐ８２ｅ１０対立遺伝子を、好ましい変異ｃｙｐ８２ｅ４ｖ２およびｃｙｐ８２ｅ５ｖ２対立遺伝子と組み合わせることにより、ｃｙｐ８２ｅ４ｖ２変異を単独で有するかまたはｃｙｐ８２ｅ５ｖ２変異を一緒に有するタバコ植物について観察されるものと比較した場合に、ノルニコチンが３倍を超えて低減したタバコ植物が得られる。一実施形態では、本発明は、米国特許出願公開第２００８／０２０２５４１Ａ１号および第２００９／０２０５０７２Ａ１号に記載されるもののようなトランスジェニック遺伝子抑制アプローチによってのみ以前に達成されたものに匹敵する非常に低レベルのノルニコチンを生成する非トランスジェニックタバコ植物をもたらすニコチン脱メチル化酵素遺伝子ｃｙｐ８２ｅ４ｖ２、ｃｙｐ８２ｅ５ｖ２およびｃｙｐ８２ｅ１０のホモ接合型三重変異体の組合せを提供する。
【００７２】
＜ニコチン脱メチル化酵素ポリヌクレオチドおよびポリペプチド、ならびにそれらのバリアントおよび断片＞
本発明の組成物は、ＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドならびにそれらのバリアントおよび断片を含む。このようなニコチン脱メチル化酵素ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、タバコ植物の商業的な品種を含む植物におけるニコチンからノルニコチンへの代謝変換に関与する。特に、本発明の組成物は、配列番号２、および５〜１３に示すアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、配列番号１、３および４に示すヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド、ならびに配列番号２および５〜１３のアミノ酸配列をコードする単離ポリヌクレオチドを含む。本発明のポリヌクレオチドは、植物、特にタバコ植物におけるニコチンからノルニコチンへの代謝変換に関与するニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドまたはそのバリアントの発現の阻害において用いることができる。本発明のポリヌクレオチドのいくつかは、野生型ニコチン脱メチル化酵素のニコチン脱メチル化酵素活性の阻害をもたらす変異を有する。本発明のポリペプチドの阻害は、熱風乾燥タバコのような、集団の３０％、５０％、７０％、９０％未満で遺伝子変換が発生するタバコ系統におけるノルニコチンレベルの低下において効果的である。本発明のポリペプチドの阻害は、植物集団の少なくとも９０％、８０％、７０％、６０％、５０％において遺伝子変換が発生するタバコ集団におけるノルニコチンレベルの低下において効果的である。集団は、好ましくは、約２５、５０、１００、５００、１，０００、５，０００または２５，０００植物より多くを含有し、ここで、より好ましくは、植物の少なくとも約１０％、２５％、５０％、７５％、９５％または１００％が、本発明のポリペプチドを含む。
【００７３】
本発明のニコチン脱メチル化酵素ポリヌクレオチドおよびコードされるポリペプチドは、タバコ植物の根におけるニコチンからノルニコチンへの代謝変換における役割を有するとして新しく同定された、ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素遺伝子と称する新規なシトクロムＰ４５０遺伝子を含む。センス、アンチセンスおよびＲＮＡｉ抑制のようなトランスジェニックアプローチを用いて、米国特許出願公開第２００８／０２０２５４１Ａ１号および第２００９／０２０５０７２Ａ１号（これらの開示は、それらの全体が参照することにより本明細書の一部をなすものとする）に記載されるようなＣＹＰ８２Ｅ４およびＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素について記載したのと同様に、このニコチン脱メチル化酵素の発現をノックダウンすることができる。好ましいアプローチは、この遺伝子において１つ以上の好ましい変異を導入するものである。なぜなら、このアプローチは、ニコチンからノルニコチンへの変換率が低減され、よってノルニコチンおよびＮＮＮのレベルが低減された非トランスジェニックタバコ植物を有利にもたらすからである。このようなアプローチは、本明細書において以下の他の箇所で記載するような突然変異誘発などを含むが、それらに限定されない。
【００７４】
本発明は、本発明の単離または実質的に精製されたポリヌクレオチドまたはタンパク質の組成物を包含する。「単離」もしくは「精製」ポリヌクレオチドまたはタンパク質あるいはその生物学的に活性な部分は、その天然に存在する環境において見出される、ポリヌクレオチドまたはタンパク質と通常付随しているかまたは相互作用している成分を実質的または本質的に含まない。つまり、単離もしくは精製ポリヌクレオチドまたはタンパク質は、組換え技術により生成される場合に、他の細胞性物質もしくは培養培地を実質的に含まないか、または化学的に合成される場合に、化学的前駆体もしくはその他の化学物質を実質的に含まない。最適には、「単離」ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが由来する生物のゲノムＤＮＡにおいて天然にポリヌクレオチドを挟む（すなわちポリヌクレオチドの５’ 端および３’端にある）配列（最適にはタンパク質をコードする配列）を含まない。例えば、様々な実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが由来する細胞のゲノムＤＮＡにおいて天然にポリヌクレオチドを挟むヌクレオチド配列の約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ未満を含有できる。細胞性物質を実質的に含まないタンパク質は、約３０％、２０％、１０％、５％または１％（乾燥重量）未満の混入タンパク質を有するタンパク質の調製物を含む。本発明のタンパク質またはその生物学的に活性な部分が組換え生成される場合、最適には、培養培地は、約３０％、２０％、１０％、５％または１％（乾燥重量）未満の化学的前駆体、または対象タンパク質ではない化学物質を表す。
【００７５】
開示するポリヌクレオチドおよびそれによりコードされるポリペプチドの断片も、本発明に包含される。ポリヌクレオチドの断片は、天然タンパク質の生物活性を保持するタンパク質断片をコードし、よって、植物におけるニコチンからノルニコチンへの代謝変換に関与する。代わりに、ハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプライマーとして有用なポリヌクレオチドの断片は、全般的に、生物活性を保持する断片タンパク質をコードしない。さらに、開示されるヌクレオチド配列の断片は、それらに限定されないが、当技術分野においておよび本明細書で以下に記載するようなセンス抑制／同時抑制、アンチセンス抑制、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）干渉、ヘアピンＲＮＡ干渉およびイントロン含有ヘアピンＲＮＡ干渉、アンプリコン媒介干渉、リボザイムならびに小型干渉ＲＮＡまたはマイクロＲＮＡを含む、当技術分野において既知の任意の方法を用いる遺伝子サイレンシング用の組換え構築物内で組み立てることができるものを含む。つまり、ヌクレオチド配列の断片は、所望の結果に依存して、少なくとも約２０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約１５０ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、２５０ヌクレオチド、３００ヌクレオチドから、本発明のタンパク質をコードする全長ポリヌクレオチドまでの範囲であってよい。一態様では、ヌクレオチド配列の断片は、１００から約３５０の間のヌクレオチド、１００から約３２５の間のヌクレオチド、１００から約３００の間のヌクレオチド、約１２５から約３００の間のヌクレオチド、約１２５から約２７５の間のヌクレオチドの長さ、約２００から約３２０の間の連続ヌクレオチド、約２００から約４２０の間の連続ヌクレオチドの長さ、約２５０から約４５０の間の連続ヌクレオチドの長さの断片であり得る。別の実施形態は、約３００から約４５０の間の連続ヌクレオチドの長さを有する組換え核酸分子を含む。
【００７６】
本発明のＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドの生物活性部分をコードする本発明のニコチン脱メチル化酵素ポリヌクレオチドの断片は、少なくとも１５、２５、３０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０もしくは５００連続アミノ酸、または本発明の全長ニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドに存在するアミノ酸の総数（例えば配列番号２および５〜１３について５１７アミノ酸）までをコードする。ニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドの生物活性部分は、本発明のＣＹＰ８２Ｅ１０ポリヌクレオチドの１つの一部分を単離し、ＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドのコードされる一部分を発現し（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ組換え発現により）、ＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドのコードされる一部分の活性、すなわちニコチンからノルニコチンへの変換を促進する能力を、当技術分野において既知の、本明細書で以下に示すアッセイを用いて評価することにより調製できる。
【００７７】
本発明のＣＹＰ８２Ｅ１０ヌクレオチド配列の断片であるポリヌクレオチドは、少なくとも１６、２０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、８００、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６００、１６５０もしくは１７００の連続するヌクレオチド、または本明細書で開示する全長ＣＹＰ８２Ｅ１０ポリヌクレオチドに存在するヌクレオチドの数（例えば配列番号１について１５５１；配列番号４について２６３６）までを含む。本発明のＣＹＰ８２Ｅ１０ヌクレオチド配列の断片であるポリヌクレオチドは、本明細書で開示するＣＹＰ８２Ｅ１０ポリヌクレオチドからの約２０から約１７００までの連続ヌクレオチド、約５０から約１６００までの連続ヌクレオチド、約７５から約１５００までの連続ヌクレオチド、約１００から約１４００までのヌクレオチド、約１５０から約１３００までの連続ヌクレオチド、約１５０から約１２００までの連続ヌクレオチド、約１７５から約１１００までの連続ヌクレオチド、約２００から約１０００までの連続ヌクレオチド、約２２５から約９００までの連続ヌクレオチド、約５００から約１６００までの連続ヌクレオチド、約７７５から約１７００までの連続ヌクレオチド、約１０００から約１７００までの連続ヌクレオチド、または約３００から約８００までの連続ヌクレオチドを含む。一態様では、断片ポリヌクレオチドは、ＣＹＰ８２Ｅ１０コード配列の約７００位〜約１２５０位、ＣＹＰ８２Ｅ１０ゲノム配列の約７００位〜約１２５０位、ＣＹＰ８２Ｅ１０イントロン配列の約１０位〜約９００位、またはＣＹＰ８２Ｅ１０イントロン配列の約１００位〜約８００位のヌクレオチドからのポリヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド配列を含む。
【００７８】
開示するポリヌクレオチドおよびそれによりコードされるポリペプチドのバリアントも、本発明に包含される。天然に存在するバリアントは、本明細書で以下に定義するように本明細書で開示するＣＹＰ８２Ｅ１０ポリヌクレオチドおよびポリペプチドと実質的な配列同一性を共有するバリアントを含む。別の実施形態では、天然に存在するバリアントは、本明細書で開示するＣＹＰ８２Ｅ１０ポリヌクレオチドと実質的な機能的同一性も共有する。本発明の組成物および方法は、開示するＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドと実質的な配列同一性を共有する任意の天然に存在するＣＹＰ８２Ｅ１０の発現または機能を標的にするために用いることができる。このようなＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドは、関連するニコチン脱メチル化酵素活性、すなわち植物におけるニコチンからノルニコチンへの代謝変換への関与を有するか、または有さないことができる。このようなバリアントは、例えば、遺伝子多形または突然変異誘発アプローチを含む育種および選択を用いて発生するようなヒト操作に起因してよい。本発明のＣＹＰ８２Ｅ１０タンパク質の生物活性バリアント、例えば配列番号２および５〜１３に示すポリペプチドのバリアントは、本明細書の他の箇所で記載する配列アラインメントプログラムおよびパラメータにより決定されるように、野生型タンパク質についてのアミノ酸配列と少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれら以上の配列同一性を有し、植物におけるニコチンからノルニコチンへの代謝変換におけるそれらの機能的関与またはその欠如を特徴とすることができる。本発明のあるタンパク質の生物活性バリアントは、そのタンパク質から１〜１５ほど少ないアミノ酸残基、１０ほど少なく、９ほど少なく、８ほど少なく、７ほど少なく、６ほど少なく、５ほど少なく、４ほど少なく、３ほど少なく、２ほど少なく、または１ほど少ないアミノ酸残基が異なってよい。本発明のあるタンパク質の生物学的に不活性なバリアントは、そのタンパク質から１〜１５ほど少ないアミノ酸残基、１０ほど少ないアミノ酸残基、９ほど少ないアミノ酸残基、８ほど少ないアミノ酸残基、７ほど少ないアミノ酸残基、６ほど少ないアミノ酸残基、５ほど少ないアミノ酸残基、４ほど少ないアミノ酸残基、３ほど少ないアミノ酸残基、２ほど少ないアミノ酸残基、または１ほど少ないアミノ酸残基が異なってよい。
【００７９】
本発明の特定のポリヌクレオチドのバリアントは、植物の根におけるニコチンからノルニコチンへの代謝変換に関与するＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドをコードする天然に存在するポリヌクレオチドを含む。このようなポリヌクレオチドバリアントは、１つ以上のヌクレオチドの欠失および／または付加を、本明細書で開示する天然ポリヌクレオチド内の１つ以上の部位にて含み、かつ／あるいは天然ポリヌクレオチド中の１つ以上の部位にて１つ以上のヌクレオチドの置換を含み得る。遺伝子コードの縮重性により、ポリヌクレオチドの保存バリアントは、本発明のＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドの１つのアミノ酸配列をコードする配列を含む。これらのような天然に存在するバリアントは、当技術分野において既知であり本明細書で開示する例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびハイブリダイゼーション技術のような公知の分子生物学的技術を用いて同定できる。バリアントポリヌクレオチドは、例えば、部位特異的突然変異誘発により作製されるが、本明細書で開示する天然に存在する配列と実質的な配列同一性を依然として共有し、よって、本発明の方法において、配列番号２、５、６、７、８、９および１０に示すニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドを含むニコチンからノルニコチンへの代謝変換に関与するニコチン脱メチル化酵素の発現または機能を阻害するために用いることができるもののような合成により導かれるポリヌクレオチドも含む。一般的に、本発明の特定のポリヌクレオチドのバリアント、例えば配列番号３のポリヌクレオチド配列または配列番号２および５〜１３に示すアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列は、本明細書の他の箇所で記載する配列アラインメントプログラムおよびパラメータにより決定して、その特定のポリヌクレオチドと少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有する。
【００８０】
本発明の特定のポリヌクレオチド（参照ポリヌクレオチドともいう）のバリアントは、参照ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと、バリアントポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドとの間のパーセント配列同一性を比較することによっても評価できる。任意の２つのポリペプチド間のパーセント配列同一性は、本明細書の他の箇所で記載する配列アラインメントプログラムおよびパラメータを用いて計算できる。本発明のポリヌクレオチドの任意の所定の対を、それらがコードする２つのポリペプチドが共有するパーセント配列同一性の比較により評価する場合、２つのコードされるポリペプチド間のパーセント配列同一性は、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性である。
【００８１】
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、対応する根特異的ニコチン脱メチル化酵素配列、特にＣＹＰ８２Ｅ１０配列を、タバコ属の他のメンバーから単離するために用いることができる。ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションおよびその他の同様の方法を用いて、このような配列を、本明細書で示す配列とのそれらの配列相同性に基づいて同定できる。本明細書に示すヌクレオチド配列またはそのバリアントおよび断片に対するそれらの配列同一性に基づいて単離される配列は、本発明に包含される。このような配列は、開示する配列のオルソログである配列を含む。
【００８２】
本発明によると、「オルソログ」は、共通の祖先の遺伝子に由来し、種分化の結果として異なる種において見出される遺伝子である。異なる種で見出される遺伝子は、それらのヌクレオチド配列および／またはそれらがコードするタンパク質配列が、少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を共有する場合に、オルソログであるとみなされる。オルソログの機能は、頻繁に、種のうちで高く保存される。つまり、ニコチンからノルニコチンへの代謝変換に関与するニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドをコードし、本明細書で開示するＣＹＰ８２Ｅ１０配列またはそのバリアントもしくは断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする単離ポリヌクレオチドは、本発明に包含される。このような配列は、本発明の方法において、植物においてニコチンからノルニコチンへの代謝変換に関与するニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドの発現を阻害するために用いることができる。
【００８３】
ＰＣＲを用いて、オリゴヌクレオチドプライマーを、任意の対象の植物から抽出したｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから対応するＤＮＡ配列を増幅するためのＰＣＲ反応において用いるために設計できる。ＰＣＲプライマーを設計するためおよびＰＣＲクローニングの方法は、全般的に当技術分野において既知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、Ｉｎｎｉｓら編（１９９０）ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；ＩｎｎｉｓおよびＧｅｌｆａｎｄ編（１９９５）ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；ならびにＩｎｎｉｓおよびＧｅｌｆａｎｄ編（１９９９）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に開示されている。ＰＣＲの既知の方法は、対プライマー、ネステッドプライマー、単一特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分的ミスマッチプライマーなどを用いる方法を含むが、それらに限定されない。
【００８４】
ハイブリダイゼーション技術は、既知のポリヌクレオチドの全部または一部分を、選択した生物からのクローニングしたゲノムＤＮＡ断片またはｃＤＮＡ断片の集団（すなわちゲノムまたはｃＤＮＡライブラリー）中に存在する他の対応するポリヌクレオチドと選択的にハイブリダイズするためのプローブとして用いることを含む。
【００８５】
ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で行ってよい。「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」により、プローブが、他の配列に対するよりも検出可能に大きい程度（例えばバックグラウンドより少なくとも２倍大きい）でその標的配列とハイブリダイズする条件を意図する。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況の下で異なる。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件のストリンジェンシーを制御することにより、プローブと１００％相補的な標的配列を同定できる（相同的探索）。代わりに、ストリンジェンシー条件は、より低い程度の類似性を検出するように、配列中にいくらかのミスマッチを許容するように調整できる（異種的探索）。一般的に、プローブは、約１０００ヌクレオチド未満の長さ、最適には５００ヌクレオチド未満の長さである。
【００８６】
典型的に、ストリンジェントな条件は、塩濃度がｐＨ７．０〜８．３にて約１．５Ｍ未満のＮａイオン、典型的に約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン濃度（またはその他の塩）、かつ温度が少なくとも約３０℃のものである。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によって達成してもよい。例示的な低ストリンジェンシー条件は、３０〜３５％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝液を３７℃にて用いるハイブリダイゼーションと、１×〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）中で５０〜５５℃での洗浄を含む。例示的な中程度のストリンジェンシー条件は、４０〜４５％ホルムアミド、１．０ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中で３７℃でのハイブリダイゼーションと、０．５×〜１×ＳＳＣ中で５５〜６０℃での洗浄を含む。例示的な高ストリンジェンシー条件は、５０％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中で３７℃でのハイブリダイゼーションと、０．１×ＳＳＣ中で６０〜６５℃での洗浄を含む。場合によって、洗浄緩衝液は、約０．１％〜約１％のＳＤＳを含んでよい。ハイブリダイゼーションの期間は、一般的に約２４時間未満、通常、約４〜約１２時間である。洗浄時間の期間は、少なくとも、平衡に達するために十分な長さの時間である。
【００８７】
具体的な実施形態では、ストリンジェンシー条件は、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト、０．４５ｕｇ／ｕｌポリＡ ＲＮＡ、０．４５ｕｇ／ｕｌウシ胸腺ＤＮＡおよび５０％ホルムアミドを含有する溶液中で４２℃でのハイブリダイゼーションと、約０．０１×ＳＳＣから約１×ＳＳＣまでを含む溶液中での少なくとも１回のハイブリダイゼーション後の洗浄とを含む。ハイブリダイゼーションの期間は、約１４時間から約１６時間までである。
【００８８】
特異性は、典型的に、ハイブリダイゼーション後の洗浄の関数であり、重要な因子は、最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについて、Ｔｍは、ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７〜２８４頁の等式：Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌ（式中、Ｍは、１価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣは、ＤＮＡ中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドのパーセンテージであり、％ｆｏｒｍは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージであり、Ｌは、ハイブリッドの長さ（塩基対）である）から見積もることができる。Ｔｍは、５０％の相補的標的配列が、完全にマッチするプローブとハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度およびｐＨの下で）である。Ｔｍは、１％のミスマッチごとについて約１℃下がる。よって、Ｔｍ、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件は、所望の同一性の配列とハイブリダイズするように調整できる。例えば、９０％以上の同一性を有する配列を探す場合、Ｔｍは、１０℃低くできる。全般的に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨにて特定の配列とその相補体とについての熱的融点よりも約５℃低いように選択される。しかし、厳しいストリンジェント条件は、熱的融点（Ｔｍ）より１、２、３または４℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用できる。中程度にストリンジェントな条件は、熱的融点（Ｔｍ）より６、７、８、９または１０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用できる。低ストリンジェンシー条件は、熱的融点（Ｔｍ）より１１、１２、１３、１４、１５または２０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用できる。この等式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成、ならびに所望のＴｍを用いて、当業者は、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄溶液のストリンジェンシーの変動が固有に記載されることを理解する。所望の程度のミスマッチが４５℃（水性溶液）または３２℃（ホルムアミド）未満のＴｍをもたらすならば、より高い温度を用いることができるようにＳＳＣ濃度を増加することが最適である。核酸のハイブリダイゼーションについての網羅的な手引きは、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ、第Ｉ部、第２章（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；およびＡｕｓｕｂｅｌら編（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２章（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）で見出される。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。
【００８９】
ハイブリダイゼーションプローブは、ゲノムＤＮＡ断片、ｃＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片またはその他のオリゴヌクレオチドであってよく、３２Ｐのような検出可能な基または任意のその他の検出可能なマーカーで標識されてよい。例えば、ハイブリダイゼーション用のプローブは、本発明のＣＹＰ８２Ｅ１０ポリヌクレオチド配列に基づく合成オリゴヌクレオチドを標識することにより作製できる。ハイブリダイゼーション用ならびにｃＤＮＡおよびゲノムライブラリーの構築用のプローブの調製方法は、当技術分野において一般的に既知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に開示されている。
【００９０】
例えば、本明細書で開示するＣＹＰ８２Ｅ１０ポリヌクレオチド配列または１つ以上のその部分は、対応する根特異的ニコチン脱メチル化酵素ポリヌクレオチドおよびメッセンジャーＲＮＡと特異的にハイブリダイズできるプローブとして用いてよい。様々な条件下で特異的ハイブリダイゼーションを達成するために、このようなプローブは、コード配列に対して５’の上流領域およびコード配列に対して３’の下流領域およびイントロン領域（例えば、配列番号３）を含むＣＹＰ８２Ｅ１０ポリヌクレオチド配列のうちでユニークなまたはＣＹＰ８２Ｅ１０ポリヌクレオチド配列の１つにユニークな配列を含み、最適には、少なくとも約１０連続ヌクレオチドの長さ、より最適には少なくとも約２０連続ヌクレオチドの長さ、より最適には少なくとも約５０連続ヌクレオチドの長さ、より最適には少なくとも約７５連続ヌクレオチドの長さ、およびより最適には少なくとも約１００連続ヌクレオチドの長さである。このようなプローブは、対応するＣＹＰ８２Ｅ１０ポリヌクレオチドを増幅するために用いてよい。この技術は、追加のコード配列または所望の植物からの変異を単離するため、または植物におけるコード配列の存在を決定するための診断アッセイとして用いてよい。ハイブリダイゼーション技術は、プレーティングしたＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングを含む（プラークまたはコロニーのいずれか；例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい）。
【００９１】
本明細書で用いる場合、２以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列の関係に関して、「参照配列」という用語は、配列比較のための基礎として用いる規定された配列である。参照配列は、例えば全長ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列のセグメント、または完全ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列のような、特定の配列のサブセットまたは全体であってよい。
【００９２】
本明細書で用いる場合、「比較ウィンドウ」という用語は、ポリヌクレオチド配列の連続する特定のセグメントに言及し、ここで、比較ウィンドウ中のこのポリヌクレオチド配列は、２つのポリヌクレオチドの最適アラインメントのための服従（ｄｅｆｅｒｅｎｃｅ）配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して付加または欠失（すなわちギャップ）を含むことがある。全般的に、比較ウィンドウは、少なくとも２０の連続するヌクレオチドの長さであり、場合によって３０、４０、５０、１００以上であり得る。当業者は、ポリヌクレオチド配列中にギャップを含めることによる参照配列に対する高い類似性を回避するために、ギャップペナルティを典型的に導入し、マッチの数から減じることを理解している。
【００９３】
比較のための配列のアラインメントの方法は、当技術分野において公知である。よって、任意の２つの配列間のパーセント配列同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成できる。このような数学的アルゴリズムの非限定的な例は、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ４：１１〜１７頁のアルゴリズム；Ｓｍｉｔｈら（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２頁の局所アラインメントアルゴリズム；ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３〜４５３頁のグローバルアラインメントアルゴリズム；ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４〜２４４８頁の局所検索アラインメント法；ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７２２６４頁のアルゴリズム（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３〜５８７７頁において改変）である。
【００９４】
Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３頁のＢＬＡＳＴプログラムは、既出のＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）のアルゴリズムに基づく。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列に相同なヌクレオチド配列を得るために、ＢＬＡＳＴＮプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質またはポリペプチドに相同なアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴＸプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行うことができる。比較の目的のためにギャップを有するアラインメントを得るために、ギャップドＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２．０中）を、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９頁に記載されるように利用できる。代わりに、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２．０中）を用いて、分子間の離れた関係を検出するための反復検索を行うことができる。既出のＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）を参照されたい。ＢＬＡＳＴ、ギャップドＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ（例えば、ヌクレオチド配列についてＢＬＡＳＴＮ、タンパク質についてＢＬＡＳＴＸ）を用いることができる（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｎａ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい）。アラインメントは、観察により手動で行ってもよい。
【００９５】
いくつかの実施形態では、本明細書で示す配列同一性／類似性の値は、デフォルトパラメータを用いるＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）、既出）、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｈｉｇｇｉｎｓら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３〜４６８０頁）およびＧＡＰ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐソフトウェアパッケージ）アルゴリズムを用いて計算する。本発明は、核酸およびタンパク質の配列の分析および比較のためにそれらの任意の等価なプログラムを用いることも包含する。「等価なプログラム」により、問題の任意の２つの配列について、ＢＬＡＳＴＸ、Ｃｌｕｓｔａｌ ＷまたはＧＡＰにより得られた対応するアラインメントと比較した場合に、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基のマッチおよび同一のパーセント配列同一性を有するアラインメントが得られる任意の配列比較プログラムを意図する。
【００９６】
本発明に包含されるバリアントヌクレオチドおよびポリペプチド配列の上記の議論の目的のために、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の関係における「配列同一性」または「同一性」という用語は、特定の比較ウィンドウにわたって最大限に対応するようにアラインメントした場合に同じである２つの配列中の残基について言及する。配列同一性のパーセンテージがタンパク質について言及する場合に用いられる場合、同一でない残基の位置は、保存アミノ酸置換により頻繁に異なることが認識され、ここでは、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば電荷または疎水性）を有する別のアミノ酸残基で置換され、よって、分子の機能的特性を変化させない。配列が保存置換により異なる場合、パーセント配列同一性は、置換の保存的性質を修正するために上方に調整してよい。このような保存置換により異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有するという。この調整をモルトする（ｍａｌｔｉｎｇ）ための手段は、当業者に公知である。典型的に、これは、保存置換を、完全ミスマッチよりもむしろ部分的ミスマッチとして評点し、そのことによりパーセンテージ配列同一性を増加することを含む。よって、例えば、同一アミノ酸が１のスコアを与えられ、非保存置換がゼロのスコアを与えられる場合、保存置換は、ゼロと１の間のスコアを与えられる。保存置換の評点は、例えばプログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）中に実装されるようにして計算される。
【００９７】
「配列同一性のパーセンテージ」という用語は、本明細書で用いる場合、比較ウィンドウにわたって２つの最適にアラインメントされた配列を比較することにより決定される値を意味し、ここで、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適なアラインメントのための参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して付加または欠失（すなわちギャップ）を含むことがある。パーセンテージは、両方の配列中で同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定してマッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を、比較ウィンドウ中の位置の総数で除し、解に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることにより計算される。
【００９８】
よって、ＣＹＰ８２Ｅ１０ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、本明細書で示す配列を用いて同定できる。このような方法は、配列番号１、３もしくは４のポリヌクレオチド配列またはその相補体もしくは断片、あるいは配列番号２もしくは５〜１３のポリペプチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の配列同一性のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を得ることを含む。好ましい実施形態は、ＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドの７９位、１０７位または３８２位（番号付けは、配列番号２に対応する）にてセリンを有する配列番号２に対応するポリペプチドを含む。
【００９９】
＜ニコチン脱メチル化酵素の発現または機能を阻害する方法＞
タバコ属植物もしくは植物部分、特に根の組織において本発明のＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドの濃度、含量および／または活性を低減する方法が提供される。本発明のＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチド（配列番号２）およびニコチン脱メチル化酵素活性を保持するそのバリアント（例えば配列番号７、８、９および１０）の活性を低減または消去するために多くの方法を単独または組み合わせて用いてよい。さらに、２以上の異なるニコチン脱メチル化酵素、より具体的には根特異的ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素と、緑葉ＣＹＰ８２Ｅ５および老化誘導性ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素の一方または両方との活性を低減または消去するために方法の組合せを採用してよい。ある特定の実施形態では、ＣＹＰ８２Ｅ５は、緑葉における変換に対して負に影響する配列番号２６の配列中の少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチドであり、ＣＹＰ８２Ｅ４は、老化した葉における変換に対して負に影響する少なくとも１つのアミノ酸変異を有する配列番号１４に示す配列を有する。
【０１００】
本発明によると、本発明のＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素の発現は、ＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドのタンパク質レベルが、そのＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドの発現を阻害するために遺伝子改変または突然変異誘発されていない植物における同じＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドのタンパク質レベルよりも統計学的に低いならば、阻害されている（ここで、これらの植物は、同じ手順を用いて栽培および採集されている）。本発明のある特定の実施形態では、本発明による改変植物におけるＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドのタンパク質レベルは、変異体ではないかまたはＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドの発現を阻害するために遺伝子改変されておらず、同じ手順を用いて栽培および採集された植物における同じＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドのタンパク質レベルの９５％未満、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、または５％未満である。ＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドの発現レベルは、例えば、タバコ植物もしくは植物部分において発現されたＣＹＰ８２Ｅ１０転写産物またはＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドのレベルをアッセイすることにより直接的に、あるいは例えばタバコ植物もしくは植物部分におけるニコチンからノルニコチンへの変換を測定することにより間接的に測定してよい。タンパク質の発現レベルをモニタリングするための方法は、当技術分野において既知であり、それらに限定されないが、ノザンブロット分析およびＲＮＡ識別アッセイを含む。ニコチンからノルニコチンへの変換における標的にしたＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドの活性を決定する方法は、当技術分野において既知であり、本明細書において以下に他の場所で記載し、それらに限定されないが、ガスクロマトグラフィーを用いるアルカロイド分析を含む。
【０１０１】
本発明は、タバコ植物またはその植物部分におけるノルニコチンのレベルを低減するかまたはニコチンからノルニコチンへの変換率を低減する方法を提供する。これらの方法は、タバコ植物のゲノムに、少なくとも３つのニコチン脱メチル化酵素遺伝子のそれぞれの少なくとも１つの対立遺伝子内の変異を導入することを含み、ここで、この変異は、ニコチン脱メチル化酵素遺伝子の発現を低減し、これらのニコチン脱メチル化酵素遺伝子の第１のものは、タバコ植物またはその植物部分におけるニコチンからノルニコチンへの代謝変換に関与する根特異的ニコチン脱メチル化酵素をコードする。いくつかの実施形態では、根特異的ニコチン脱メチル化酵素は、ＣＹＰ８２Ｅ１０またはそのバリアントである。他の実施形態では、これらの方法は、タバコ植物のゲノムに、ＣＹＰ８２Ｅ１０もしくはそのバリアントをコードするニコチン脱メチル化酵素遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子内の変異と、ＣＹＰ８２Ｅ４もしくはそのバリアントをコードするニコチン脱メチル化酵素および／またはＣＹＰ８２Ｅ５もしくはそのバリアントをコードするニコチン脱メチル化酵素の少なくとも１つの対立遺伝子内の変異とを導入することを含む。
【０１０２】
１つの植物において変異を組み合わせるために、有性交雑を含むいくつかのアプローチが用いられている。根におけるニコチン脱メチル化酵素活性を阻害するＣＹＰ８２Ｅ１０遺伝子における好ましい変異を有する植物を、老化した葉におけるニコチン脱メチル化酵素活性を阻害するＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２遺伝子における好ましい変異を有する植物と交雑させるか、または緑葉におけるニコチン脱メチル化酵素活性を阻害するＣＹＰ８３Ｅ５ｖ２遺伝子における好ましい変異を有する植物と交雑させて、ニコチンからノルニコチンへの変換が低減された植物を生成できる。好ましい実施形態では、同じ植物内でＣＹＰ８２Ｅ１０、ＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２およびＣＹＰ８２Ｅ５ｖ２遺伝子内に好ましい変異を導入するために、交雑種を作製する。この様式では、根におけるニコチン脱メチル化酵素活性を阻害するＣＹＰ８２Ｅ１０遺伝子における好ましい変異を有する植物を、老化した葉におけるニコチン脱メチル化酵素活性を阻害するＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２遺伝子における好ましい変異と、緑葉におけるニコチン脱メチル化酵素活性を阻害するＣＹＰ８３Ｅ５ｖ２遺伝子における好ましい変異とを有する植物と交雑させる。代わりに、老化した葉におけるニコチン脱メチル化酵素活性を阻害するＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２遺伝子における好ましい変異を有する植物を、根におけるニコチン脱メチル化酵素活性を阻害するＣＹＰ８２Ｅ１０遺伝子における好ましい変異と、緑葉におけるニコチン脱メチル化酵素活性を阻害するＣＹＰ８３Ｅ５ｖ２遺伝子における好ましい変異とを有する植物と交雑させる。なお別の実施形態では、緑葉におけるニコチン脱メチル化酵素活性を阻害するＣＹＰ８２Ｅ５ｖ２遺伝子における好ましい変異を有する植物を、根におけるニコチン脱メチル化酵素活性を阻害するＣＹＰ８２Ｅ１０遺伝子における好ましい変異と、老化した葉におけるニコチン脱メチル化酵素活性を阻害するＣＹＰ８３Ｅ４ｖ２遺伝子における好ましい変異とを有する植物と交雑させる。これらのニコチン脱メチル化酵素遺伝子のそれぞれに好ましい変異を導入することにより、約０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％または０．７％未満の変換レベルでニコチンからノルニコチンへの変換率が低減された植物を生成することができる。
【０１０３】
より好ましい実施形態では、７９位、１０７位、３８２位または４１９位（番号付けは、配列番号２に従う）でのＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドの改変をもたらす１つ以上の好ましい変異を有する植物を、３２９位、３６４位、３７６位、３８２位もしくは４５８位でのＣＹＰ８２Ｅ４ポリペプチドの改変をもたらす１つ以上の好ましい変異および／あるいは４２２位もしくは４４９位でのＣＹＰ８２Ｅ５ポリペプチドの改変をもたらす１つ以上の好ましい変異を有する植物と交雑させて、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％または０．７％未満の変換レベルを有する植物を生成できる。ニコチンからノルニコチンへの特に好ましい変換レベルは、０．０５％〜０．４％の間、０．１〜０．６％の間、０．１％〜０．３％の間、０．１％〜０．５％の間、０．１％〜０．４％の間、０．１％〜０．７％の間、０．１％〜１．０％の間、０．１％〜１．１％の間、０．１％〜１．２％の間、０．１％〜１．３％の間、０．１％〜１．４％の間または０．１％〜１．５％の間であり得る。保存ヘム結合モチーフの前のＣＹＰ８２Ｅ１０、ＣＹＰ８３Ｅ４またはＣＹＰ８３Ｅ５ポリペプチドの切断をもたらす本発明のポリヌクレオチドの任意の変異は、酵素を阻害し、上記の交雑種において用いることができる。シトクロムＰ４５０タンパク質のドメインは、当技術分野において既知である。例えば、Ｘｕら（２００７）Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ Ｐｌａｎｔａｒｕｍ１２９：３０７〜３１９頁（参照することにより本明細書の一部をなすものとする）を参照されたい。非機能的または阻害されたＣＹＰ８２Ｅ１０遺伝子を有する植物を、非機能的もしくは阻害されたＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２遺伝子、非機能的もしくは阻害されたＣＹＰ８２Ｅ５ｖ２遺伝子、または非機能的もしくは阻害されたＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２およびＣＹＰ８２Ｅ５ｖ２遺伝子を有する植物と交雑させることにより、ノルニコチンレベルをタバコ植物において低減できる。
【０１０４】
タバコ植物または植物部分におけるニコチンからノルニコチンへの変換におけるＣＹＰ８２Ｅ１０、ＣＹＰ８２Ｅ４またはＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドの活性は、その変換活性が、そのニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドの変換活性を阻害するために遺伝子改変されておらず、同じ手順を用いて栽培および採集されたタバコ植物または植物部分における同じニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドの変換活性よりも統計学的に低いならば、本発明に従って阻害されている。特定の実施形態では、本発明による改変タバコ植物または植物部分におけるニコチンからノルニコチンへの変換におけるニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドの活性は、その活性が、そのニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドの発現を阻害するために遺伝子改変されておらず、同じ手順を用いて栽培および採集されたタバコ植物における同じニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドの変換活性の９５％未満、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、２％未満または１％未満であるならば、阻害されている。タバコ植物または植物部分におけるニコチンからノルニコチンへの変換におけるニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドの活性は、本明細書の他の箇所で記載するアッセイ方法により検出可能でない場合に、本発明に従って消去されている。ガスクロマトグラフィーを用いて、タバコ植物におけるニコチンからノルニコチンへの変換におけるニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドの活性を決定する方法を、本明細書の以下において実施例で開示する。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、好ましい変異は、タバコ植物または植物部分に突然変異誘発アプローチを用いて導入され、導入された変異は、それらに限定されないが、サザンブロット分析、ＤＮＡ配列決定、ＰＣＲ分析または表現型分析のような当業者に既知の方法を用いて選択される。上記の実施形態により変更または改変された植物または植物部分は、植物形成条件下で、植物中の本発明のポリペプチドの濃度および／または活性を調節するのに十分な時間生育させる。植物形成条件は当技術分野において公知であり、本明細書の他の箇所で簡単に論じる。
【０１０６】
本明細書で記載するニコチン脱メチル化酵素中に好ましい変異を含有する改変タバコ植物は、ニコチンからノルニコチンへの変換レベルが低減されている。特定の実施形態では、本発明による改変タバコ植物または植物部分におけるニコチンからノルニコチンへの変換は、そのニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドの発現を阻害するために遺伝子改変されておらず、同じ手順を用いて栽培および採集されたタバコ植物における変換の９５％未満、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、２％未満または１％未満である。いくつかの実施形態では、改変タバコ植物は、コンバータタバコ植物である。他の実施形態では、改変タバコ植物は、非コンバータタバコ植物である。いくつかの実施形態では、改変タバコ植物は、商業的な非コンバータタバコ植物において観察される率よりも低い変換率を有する。
【０１０７】
本発明によると、本発明のＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドのレベル、比、活性もしくは分布の変化、またはタバコ植物もしくは植物部分の表現型の変化、特にノルニコチンおよびその発癌性代謝産物であるＮＮＮの蓄積の低減は、対象植物または対象植物部分を、対照植物または対照植物部分と比較することにより測定でき、ここで、対象植物または対象植物部分および対照植物または対照植物部分は、同じ手順を用いて栽培および／または採集されている。本明細書で用いる場合、対象植物または対象植物部分は、例えば突然変異誘発による遺伝子変更が、対象のニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドについて影響しているものであるか、あるいはそのように変更されたタバコ植物もしくは植物部分の子孫であり、その変更を含むタバコ植物または植物部分である。対照植物または対照植物部分は、対象植物または対象植物部分の表現型の変化を測定するための参照点を提供する。表現型の変化の測定は、植物の発達、老化の間または乾燥後を含む、植物または植物部分において任意の時間に測定できる。他の実施形態では、表現型の変化の測定は、生育チャンバ、温室または野外で生育した植物からを含む任意の条件下で生育した植物で測定できる。一実施形態では、表現型の変化は、ニコチンからノルニコチンへの変換率を決定することにより測定できる。ある好ましい実施形態では、変換は、ノルニコチンのパーセンテージ（全組織重量のパーセンテージとして）を、パーセンテージニコチンおよびノルニコチンの合計（全組織重量のパーセンテージとして）で除し、１００を乗じることにより測定できる。
【０１０８】
本発明によると、対照植物または対照植物部分は、野生型、すなわち対象植物または対象植物部分をもたらした遺伝子変更のための出発材料と同じ遺伝子型のタバコ植物または植物部分を含んでよい。対照植物または対照植物部分は、出発材料と同じ遺伝子型のタバコ植物または植物部分であるが、ヌル構築物（すなわち、選択可能なマーカー遺伝子を含む構築物のような、対象の形質に対して既知の影響を有さない構築物）で形質転換されたものも含んでよい。このような全ての場合では、対象植物または対象植物部分および対照植物または対照植物部分は、同じ手順を用いて栽培および採集される。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、本発明のニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドの活性は、ニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドをコードする遺伝子を破壊することにより低減または消去してよい。本発明は、ニコチン脱メチル化酵素遺伝子における変異を有する突然変異誘発植物を包含し、この変異は、ニコチン脱メチル化酵素遺伝子の発現を低減するか、または本発明のコードされるニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドの活性を阻害する。
【０１１０】
他の実施形態では、本発明のニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドの活性は、ニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドをコードする遺伝子を破壊することにより低減または消去される。ニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドをコードする遺伝子は、当技術分野において既知の任意の方法により、例えば、トランスポゾンタギングにより、あるいはランダムもしくは標的突然変異誘発を用いて植物に突然変異を誘発し、ニコチン脱メチル化酵素活性が低減されているかあるいはＣＹＰ８２Ｅ１０中の変異を単独でまたはＣＹＰ８２Ｅ４もしくはＣＹＰ８２Ｅ５中の変異との組合せで有する植物について選択することにより破壊してよい。
【０１１１】
トランスポゾンタギングは、本発明の１つ以上のＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドの活性を低減または消去するために用いてよい。トランスポゾンタギングは、トランスポゾンを、内因性ニコチン脱メチル化酵素遺伝子内に導入して、ニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドの発現を低減または消去することを含む。
【０１１２】
植物における特定の遺伝子のトランスポゾンタギングの方法は、当技術分野において公知である。例えばＭａｅｓら（１９９９）Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．４：９０〜９６頁；ＤｈａｒｍａｐｕｒｉおよびＳｏｎｔｉ（１９９９）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｅｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１７９：５３〜５９頁；Ｍｅｉｓｓｎｅｒら（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｊ．２２：２６５〜２７４頁；Ｐｈｏｇａｔら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．２５：５７〜６３頁；Ｗａｌｂｏｔ（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．２：１０３〜１０７頁；Ｇａｉら（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：９４〜９ｂ頁；Ｆｉｔｚｍａｕｒｉｃｅら（１９９９）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５３：１９１９〜１９２８頁を参照されたい。
【０１１３】
植物における内因性遺伝子の発現を低減または消去するためのさらなる方法も、当技術分野において既知であり、本発明に同様に用いることができる。これらの方法は、エチルメタンスルホネート誘導性突然変異誘発、欠失突然変異誘発および内因性遺伝子が欠失された植物系統を同定するために逆遺伝学の意味において（ＰＣＲを用いて）用いられる高速中性子欠失突然変異誘発を含む突然変異誘発性または発癌性化合物を用いるその他の形態の突然変異誘発を含む。これらの方法の例について、Ｏｈｓｈｉｍａら（１９９８）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２１３：４７２〜４８１頁；Ｏｋｕｂａｒａら（１９９４）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １３７：８６７〜８７４頁；およびＱｕｅｓａｄａら（２０００）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５４：４２１〜４３１５頁（これらのそれぞれは、参照することにより本明細書の一部をなすものとする）を参照されたい。さらに、変性ＨＰＬＣまたは選択されたＰＣＲ産物の選択的エンドヌクレアーゼ消化を用いる、化学誘発変異をスクリーニングするための迅速で自動化できる方法であるＴＩＬＬＩＮＧ（ゲノム中の標的化誘発局所損傷）も、本発明に用いることができる。ＭｃＣａｌｌｕｍら（２０００）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：４５５〜４５７（参照することにより本明細書の一部をなすものとする）を参照されたい。
【０１１４】
遺伝子発現に影響するかまたはコードされるニコチン脱メチル化酵素タンパク質の機能に干渉する変異は、当技術分野において公知である方法を用いて決定できる。遺伝子エキソン中の挿入変異は、通常、ヌル変異体をもたらす。保存残基中の変異は、コードされるタンパク質の代謝機能の阻害において特に効果的であり得る。タバコ植物または植物部分におけるニコチンからノルニコチンへの変換におけるニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドの活性を消去するという目標を有する突然変異誘発のために適切な植物ニコチン脱メチル化酵素ポリペプチドの保存残基は、記載されている。他のＰ４５０ポリペプチドから異なる残基に灰色で影がつけてある米国特許出願公開第２００９／０２０５０７２Ａ１号（参照することによりその全体が本明細書の一部をなすものとする）の図１Ａ〜Ｃを参照されたい。保存残基は、それぞれの位置にて灰色で影が付いていないものである。このような変異体は、公知の手順に従って単離できる。
【０１１５】
本発明の別の実施形態では、ドミナント変異体を用いて、重複遺伝子座の遺伝子逆位および組換えによるＲＮＡサイレンシングを誘引できる。例えば、Ｋｕｓａｂａら（２００３）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １５：１４５５〜１４６７頁を参照されたい。
【０１１６】
本発明の別の実施形態では、本発明の組成物は、育種プログラムで用いるための非コンバータ植物を同定するためのスクリーニング方法において用いられる。この様式で、本発明のヌクレオチド配列を用いて、本明細書で同定されるＣＹＰ８２Ｅ１０遺伝子において適切な変異を有する非コンバータ植物について、天然の生殖質をスクリーニングできる。本発明の方法により同定されるこれらの非コンバータ植物を用いて、育種系統を開発できる。
【０１１７】
本明細書で記載するＣＹＰ８２Ｅ１０ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に加えて、本発明の組成物は、スクリーニング方法で用いることができるＣＹＰ８２Ｅ１０遺伝子配列中のイントロン配列を含む。いずれの作用機序にも結び付けられることはないが、ＣＹＰ８２Ｅ１０遺伝子（複数可）は、タバコの根におけるニコチンからノルニコチンへの代謝変換に関与するシトクロムＰ４５０ファミリーの唯一のメンバー（複数可）であり得る。ある応用のために、シトクロムＰ４５０遺伝子ファミリーのこの特定のメンバーを、このファミリー内の残りの密接に関係する配列から診断的に区別するための手段を有することが有用である。例えば、天然に存在するタバコ生殖質内で（または突然変異を誘発した集団において）、この遺伝子が天然に機能不全であり、よって永続的に非コンバータである資源として価値を有し得るものが存在することがある。このような機能不全配列は、配列番号１１、１２または１３に示すポリペプチドをコードするものを含んでよい。このような遺伝子型（例えば欠失変異、再編成など）について特異的にアッセイする方法は、強力なツールとして働くことができる。本発明は、ＣＹＰ８２Ｅ１０のエキソン１およびエキソン２を特異的に増幅するように設計されたプライマーを含み、これらの２つのプライマー対のうちの一方は、エキソン間のイントロンに対応する。ＣＹＰ８２Ｅ１０のエキソンを増幅するために有用なプライマーの例は、配列番号３５と配列番号３６および配列番号３７と配列番号３８を含む。これらの同じプライマーは、生成物の配列分析のために用いることができる。
【０１１８】
遺伝子のイントロン領域は、典型的に、エキソンよりも保存されていないので、イントロン特異的プローブを使用することにより、ＣＹＰ８２Ｅ１０遺伝子に相当する遺伝子（複数可）を、ＣＹＰ８２Ｅファミリーのその他のメンバーから区別しやすくなると予測される。生成物を作製するために用いたＣＹＰ８２Ｅ１０イントロン特異的プローブおよび／またはＰＣＲプライマーの使用により、任意の天然に存在するかまたは突然変異誘発されたタバコ植物が、遺伝子を不活性化させ得る欠失または再編成を有するかを決定するアッセイにおける強力なツールが提供される。このような植物は、次いで、育種プログラムにおいて用いて、変換できないタバコ系統を創出できる。
【０１１９】
＜ノルニコチンおよびＮＮＮの含量が低減したタバコ植物、植物部分および生成物＞
本発明のＣＹＰ８２Ｅ１０ポリヌクレオチド、ならびにそれらのバリアントおよび断片は、本発明の方法において用いて、植物におけるニコチンからノルニコチンへの代謝変換に関与するＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素の発現または機能を阻害することができる。この様式で、好ましい変異を対象のＣＹＰ８２Ｅ１０遺伝子に導入できる。本発明の方法は、好ましい変異をＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素遺伝子に導入するための特定の方法に依存しない。
【０１２０】
本発明の組成物および方法は、それらに限定されないが、以下の種を含むタバコ属の任意の植物の、特に葉および茎におけるノルニコチン含量を低減するために用いることができる。ａｃｕｍｉｎａｔａ、ａｆｆｉｎｉｓ、ａｌａｔａ、ａｔｔｅｎｕａｔｅ、ｂｉｇｅｌｏｖｉｉ、ｃｌｅｖｅｌａｎｄｉｉ、ｅｘｃｅｌｓｉｏｒ、ｆｏｒｇｅｔｉａｎａ、ｇｌａｕｃａ、ｇｌｕｔｉｎｏｓａ、ｌａｎｇｓｄｏｒｆｆｉｉ、ｌｏｎｇｉｆｌｏｒａ、ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａ、ｐａｌｍｅｒｉ、ｐａｎｉｃｕｌａｔａ、ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ、ｑｕｄｒｉｖａｌｖｉｓ、ｒｅｐａｎｄａ、ｒｕｓｔｉｃａ、ｓｕａｖｅｏｌｅｎｓ、ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ、ｔａｂａｃｕｍ、ｔｏｍｅｎｔｏｓａ、ｔｒｉｇｏｎｏｐｈｙｌｌａおよびｘ ｓａｎｄｅｒａｅ。本発明は、それらに限定されないが、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ａｃｕｍｉｎａｔａ ｍｕｌｔｉｆｌｏｒａ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ａｌａｔａ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｉｇｅｌｏｖｉｉ ｑｕａｄｒｉｖａｌｖｉｓ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｉｇｅｌｏｖｉｉ ｗａｌｌａｃｅｉ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａ ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａ ｐｌａｍｅｒｉ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｑｕａｄｒｉｖａｌｖｉｓ ｂｉｇｅｌｏｖｉｉ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｑｕａｄｒｉｖａｌｖｉｓ ｑｕａｄｒｉｖａｌｖｉｓ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｑｕａｄｒｉｖａｌｖｉｓ ｗａｌｌａｃｅｉおよびＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔｒｉｇｏｎｏｐｈｙｌｌａ ｐａｌｍｅｒｉを含むタバコ属の植物の任意の品種、ならびに煙管またはブライト品種、バーレー品種、ダーク品種およびオリエンタル／トルコ（Ｔｕｒｋｉｓｈ）品種として一般的に既知の品種を用いても行うことができる。いくつかの実施形態では、対象のタバコ植物は、バーレー、バージニア、熱風乾燥、空気乾燥、火力乾燥、オリエンタルまたはダークタバコ植物である。
【０１２１】
本明細書で記載するタバコ植物および品種は、肥料が豊富な土壌もしくは肥料なしの土壌での栽培、花への袋掛けもしくは袋掛けなし、または摘心ありもしくは摘心なしのような従来の生育および採集技術に適切である。採集された葉および茎は、それらに限定されないが、キセル、葉巻および巻きタバコ、ならびに葉タバコ、刻み（ｓｈｒｅｄｄｅｄ）タバコまたは刻み（ｃｕｔ）タバコを含む任意の形態の噛みタバコを含む任意の伝統的なタバコ製品で用いてよい。
【０１２２】
よって、本発明は、ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素をコードする遺伝子において変異を含むタバコ植物またはその植物部分であって、前記変異が、前記ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素の発現または機能の低減、ならびにノルニコチンおよびＮ’−ニトロソノルニコチンの量の低減をもたらすタバコ植物またはその植物部分を提供する。本明細書で用いる場合、「量の低減」または「レベルの低減」の用語は、ノルニコチンおよび／またはＮ’−ニトロソノルニコチンを低減するために遺伝子改変されていない、同じ様式で加工した（すなわち栽培して採集した）タバコ属の植物または同じ品種のタバコからの植物部分もしくはタバコ製品で見出されるものよりも少ない、本発明の植物またはその植物部分もしくはタバコ製品中のノルニコチンおよび／またはＮ’−ニトロソノルニコチンの量に言及することを意図する。ノルニコチンの量は、約１０％から約９０％より多く、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％および約８０％より多くなど、低減されることがある。ニコチンからノルニコチンへの変換は、本発明の植物、植物部分および製品において、より具体的にはＣＹＰ８２Ｅ１０、ＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２およびＣＹＰ８２５ｖ２に変異を有する植物、植物部分において、０．３％未満、０．５％未満、０．７％未満、０．１％〜０．５％の間、０．１％〜０．４％の間、０．１％〜０．７％の間または０．１％〜１．０％の間であり得る。
【０１２３】
「タバコ製品」という用語は、本明細書で用いる場合、それらに限定されないが、発煙材料（例えばシガリロ、非換気または排気凹型フィルタ巻きタバコを含む任意の巻きタバコ、葉巻、キセルタバコ）、無煙製品（例えばかぎタバコ、噛みタバコ、生分解性インサート（例えばガム、ロゼンジ、溶解ストリップ））を含む。例えば米国特許第２００５／００１９４４８号（参照することにより本明細書の一部をなすものとする）を参照されたい。本発明は、従来のタバコを、異なる量の本明細書で記載する低ノルニコチンおよび／またはＮ’−ニトロソノルニコチンタバコと組み合わせることにより作製できる、一連のタバコ製品ブレンドも包含する。さらなる実施形態では、上記のタバコ属の植物または植物部分は、乾燥タバコである。
【０１２４】
本発明のいくつかの実施形態では、タバコ製品は、葉巻、巻きタバコもしくはキセルタバコのようなタバコ製品を消費することにより直接吸入されるか、または二次的な煙として吸入される（すなわち、葉巻、巻きタバコもしくはキセルタバコのようなタバコ製品を消費している個体から発生するタバコの煙を吸入する個体による）タバコの煙の発癌可能性を低減する。本明細書で記載する乾燥タバコは、タバコ製品、特に、直接吸入されるかまたは二次的な煙として吸入される煙流中のノルニコチンおよび／またはＮ’−ニトロソノルニコチンの量の低減を含む、熱による化学変化を受けたものを調製するために用いることができる。同じ様式で、本発明のタバコ製品は、噛みタバコ、かぎタバコなどのような無煙タバコ製品の調製において有用であり得る。
【０１２５】
本発明のタバコ植物に由来するタバコ製品は、よって、これらのタバコ製品の発癌可能性を低減し、発癌性ニトロソアミンＮＮＮへの人、特にこれらのタバコ製品の使用者である個体の曝露を低減するための方法で用いられる。以下の実施例は、例示のために示され、限定するためではない。
【実施例】
【０１２６】
［実験］
以下の議論で述べる引用は、実験部の終わりに示す。
【０１２７】
［背景］
ＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２が、コンバータ植物において観察される高いノルニコチン蓄積を担うニコチン脱メチル化酵素遺伝子座を表すという知見（Ｓｉｍｉｎｓｚｋｙら、２００５）は、変換の問題を克服し、老化しかつ乾燥させた葉のノルニコチン含量を低下させることに向けての非トランスジェニックおよびトランスジェニックのアプローチへの扉を開いた。具体的に、研究者は、化学変異原に曝露されたタバコ集団を作製し、ＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２遺伝子座にて非機能的対立遺伝子を有する個体を選択することが可能になった。実際に、３つの独立したグループが、この方策に基づいて非変換タバコ系統を既に作製している（Ｄｅｗｅｙら、２００７；Ｘｕら、２００７ｂ；Ｊｕｌｉｏら、２００８）。
【０１２８】
以前に報告されたように、７７５と称するタバコ植物が、バーレー系統ＤＨ９８−３２５−６のＥＭＳ突然変異誘発集団から同定され、ＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２遺伝子においてノックアウト変異を有することが示された（Ｄｅｗｅｙら、２００７）。２００８年の夏に、７７５変異についてホモ接合型の植物を、Ｒｏｃｋｙ Ｍｏｕｎｔ、ＮＣのＵｐｐｅｒ Ｃｏａｓｔａｌ Ｐｌａｉｎｓ研究所で生育させ、標準的な産業的手続に従って空気乾燥させた。これらの物質のアルカロイド分析を、Ｊａｃｋら（２００７）により記載される「ＬＣ手順」を用いて行った。表１に示すように、７７５変異を有する植物は、平均で２．６％のニコチンからノルニコチンへの変換を示した。これとは対照的に、６０％超の変換が、強いコンバータ遺伝子型である親の系統ＤＨ９８−３２５−６で観察された。ほぼ同一の結果がＪｕｌｉｏら（２００８）により報告され、彼らは、強いコンバータバーレー遺伝子型ＢＢ１６ＮＮ内のｃｙｐ８２ｅ４ｖ２ノックアウト変異体についてホモ接合型の植物について２．８２から３．３７までの範囲の変換パーセンテージを記録した（親の変換率は、６８〜９８％の間の範囲であった）。よって、ＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２単独における衰弱性変異は、コンバータ植物の作製と関連する不安定な遺伝的現象から生じる問題を消去することにおいて効果的であるとみられる。
【０１２９】
【表１】
【０１３０】
７７５または匹敵する変異をＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２中に有するタバコ植物の利用は、タバコ集団中へのコンバータ植物の導入を消去するために有効な手段であり得るが、これらの植物において、低いが著しい量のノルニコチンが残存する。０．４５％ほど低いニコチンからノルニコチンへの変換率がＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２を対象とするＲＮＡｉに基づく構築物を発現するトランスジェニック植物で観察されたことに鑑みて（Ｌｅｗｉｓら、２００８）、ＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２に対する高いＤＮＡ配列相同性を有する少なくとも１つの他の遺伝子が、非コンバータ植物および不活性化されたＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２遺伝子を有するコンバータ植物の両方で観察されるノルニコチン合成の大部分を担うはずであることが明らかであった。この可能性は、これもまた機能的ニコチン脱メチル化酵素をコードすることが示されたＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２と９２．７％のＤＮＡ配列同一性を共有する遺伝子であるＣＹＰ８２Ｅ５ｖ２の発見によりさらに支持された（Ｄｅｗｅｙら、２００７；ＧａｖｉｌａｎｏおよびＳｉｍｉｎｓｚｋｙ、２００７）。ＣＹＰ８２Ｅ５ｖ２ニコチン脱メチル化酵素遺伝子は、コンバータ植物および非コンバータ植物において一様にタバコの緑葉において低レベルで発現されるが（非常に高いレベルで発現されるＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２とは対照的に）、老化および空気乾燥の間にはコンバータ植物の葉においてのみ発現される。
【０１３１】
Ｄｅｗｅｙら（２００７）に概説されるように、ＥＭＳ突然変異誘発ＤＨ９８−３２５−６タバコ集団のスクリーニングにより、ＣＹＰ８２Ｅ５ｖ２中にノックアウト変異を有する個体（植物１０１３）が同定される。ノルニコチン蓄積に対する非機能的ｃｙｐ８２ｅ５ｖ２対立遺伝子の影響を決定するために、植物７７５および１０１３からの変異を組み合わせた交雑種を作製した。最初の交雑種のＦ１子孫に由来する多数のＦ２個体の分子的遺伝子型決定により、両方の変異についてホモ接合型（ｅ４ｅ４／ｅ５ｅ５）の９つの個体が同定された。これらの９つの植物も、２００８年野外試験に含めた。ＣＹＰ８２Ｅ５ｖ２は機能的ニコチン脱メチル化酵素をコードすることが示されているという事実にもかかわらず（Ｄｅｗｅｙら、２００７；ＧａｖｉｌａｎｏおよびＳｉｍｉｎｓｚｋｙ、２００７）、機能不全ｃｙｐ８２ｅ５ｖ２変異をノックアウトｃｙｐ８２ｅ４ｖ２変異と組み合わせることは、葉のノルニコチンレベルに著しくほとんど影響しなかった。表１に示すように、二重変異についてホモ接合型の植物（ｅ４ｅ４／ｅ５ｅ５）は、ｃｙｐ８２ｅ４ｖ２変異だけを有する植物（ｅ４ｅ４）についての平均２．６％の変換と比較して、平均で２．３％のニコチン変換を示した。２つの遺伝子型の間での平均変換の控えめな違いは、統計学的に有意でなかった（Ｐ＝０．１１８）。これとは対照的に、本研究に含めたＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２をＲＮＡｉでサイレンシングしたトランスジェニック系統の１つは、平均で０．７％の変換を示し、この量は、ｅ４ｅ４またはｅ４ｅ４／ｅ５ｅ５遺伝子型のいずれから得られたものよりも有意に低かった（Ｐ＜０．００１）。よって、植物におけるノルニコチン生成に貢献する、ＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２に対する高い相同性を有する別の遺伝子が、タバコゲノム内に存在するはずである。
【０１３２】
［実施例１： ｃｙｐ８２ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素遺伝子の単離および特徴決定］
ニコチン脱メチル化酵素をコードする可能性があるタバコゲノム中のその他の遺伝子を同定するために、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、１９９７）を用いる相同性検索を、ＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２のＤＮＡおよびタンパク質配列をそれぞれのクエリ配列として用いて、ＧｅｎＢａｎｋ中のＮ．ｔａｂａｃｕｍ発現遺伝子配列断片（ＥＳＴ）データベースに対して行った。ＣＹＰ８２Ｅスーパーファミリーの以前の特徴決定したメンバー（例えばＣＹＰ８２Ｅ２、ＣＹＰ８２Ｅ３およびＣＹＰ８２Ｅ５ｖ２）に対応するｃＤＮＡ配列を同定することに加えて、この遺伝子ファミリーの以前に特徴決定されたいずれのメンバーとも完全にアラインメントされない７つのＥＳＴを発見した。興味深いことに、７つのＥＳＴは全て、根特異的ｃＤＮＡライブラリーまたは根を含む混合組織で構成されるｃＤＮＡライブラリーのいずれかを起源とした。この観察結果は、新しいＣＹＰ８２Ｅ遺伝子が、根組織に特異的に発現されることを示唆し、これは、ＣＹＰ８２Ｅ Ｐ４５０スーパーファミリーのこの特定のメンバーが、なぜ以前に検出から逃れたかを説明する特性である（以前の努力は、葉組織で発現されたＣＹＰ８２Ｅ遺伝子の特徴決定に焦点を当てていたからである）。いずれの個別のＥＳＴ配列も、この新規な遺伝子の全体のコード領域をカバーするのに十分長くなかったので、ＰＣＲプライマーを設計し、これは、タバコの根組織から単離したＲＮＡから作製された第１鎖ｃＤＮＡからのｃＤＮＡ配列全体の増幅を可能にした。さらに、プライマーを用いて、中央の大きいイントロンを含む遺伝子の対応するゲノム領域を増幅した。この新規なＣＹＰ８２Ｅ ｃＤＮＡは、タバコＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２ ｃＤＮＡと９２．４％のヌクレオチド同一性およびアミノ酸レベルでの９１．１％の予測される同一性を共有する。Ｐ４５０遺伝子命名法についての手引きを守って、この新しい遺伝子は、ＣＹＰ８２Ｅ１０と命名された。ＣＹＰ８２Ｅスーパーファミリーの特徴決定された全てのメンバーのうち、ＣＹＰ８２Ｅ１０は、ＣＹＰ８２Ｅ５ｖ２と最高の配列類似性を示し、ｃＤＮＡレベルで９６．５％のヌクレオチド同一性、および９５．７％の予測アミノ酸配列同一性を共有する。ＣＹＰ８２Ｅ１０のＤＮＡ配列およびその予測タンパク質配列を、図１に示す。
【０１３３】
様々なＣＹＰ８２ＥファミリーメンバーのｃＤＮＡは高度に保存される傾向にあるが、これらの遺伝子のゲノムバージョンは、より大きい配列多様性を示す。これは、主に、大きい中央のイントロン内で観察される実質的な配列の相違による。ＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２、ＣＹＰ８２Ｅ５ｖ２およびＣＹＰ８２Ｅ１０ゲノム配列のアラインメントを、図２に示す。ＥＭＢＯＳＳペアワイズアラインメントアルゴリズム（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｅｍｂｏｓｓ／ａｌｉｇｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を用いて計算されるように、ＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２およびＣＹＰ８２Ｅ１０遺伝子は、７８．３％のヌクレオチド同一性を共有し、ＣＹＰ８２Ｅ１０は、ＣＹＰ８２Ｅ５ｖ２遺伝子と、タバコゲノム内に存在する場合に、８４．９％同一である（ＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２およびＣＹＰ８２Ｅ５ｖ２ゲノム配列は、７５％の同一性を共有する）。
【０１３４】
いくつかの出版物において詳述されるように、タバコゲノムで見出されるＣＹＰ８２Ｅスーパーファミリーの遺伝子のほとんどは、機能的ニコチン脱メチル化酵素をコードしない（Ｓｉｍｉｎｓｚｋｙら、２００５；Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉら、２００７；Ｄｅｗｅｙら、２００７；Ｇａｖｉｌａｎｏら、２００７；Ｘｕら、２００７ａ）。よって、配列相同性単独は、ＣＹＰ８２Ｅファミリーについての遺伝子機能の非常に正確な指標ではない。代わりに、トランスジェニック植物（Ｓｉｍｉｎｓｚｋｙら、２００５）または酵母（ＧａｖｉｌａｎｏおよびＳｉｍｉｎｓｚｋｙ、２００７；Ｘｕら、２００７ａ）のいずれかにおける発現解析が、この遺伝子ファミリーの個別のメンバーがニコチン脱メチル化酵素活性をコードするかを決定するための確立された手段になっている。
【０１３５】
ＣＹＰ８２Ｅ１０がニコチン脱メチル化酵素遺伝子として機能するかを決定するために、そのｃＤＮＡを、酵母発現ベクターｐＹｅＤＰ６０にクローニングして、酵母株Ｗ（Ｒ）を形質転換した。株Ｗ（Ｒ）は、Ｐ４５０への直接の電子供与体として働く酵素である酵母ＮＡＤＰＨ依存性Ｐ４５０還元酵素を過剰発現するように工学的に改変された酵母細胞株である。この系は、酵母で発現される外来Ｐ４５０酵素活性の検出を大きく増進する（Ｐｏｍｐｏｎら、１９９５）。ニコチン脱メチル化酵素アッセイを、酵母ミクロソーム膜調製物を［１４Ｃ］−ニコチンとインキュベートし、Ｓｉｍｉｎｓｚｋｙら（２００５）に記載されるようにして生成物を薄層クロマトグラフィーで分割することにより行った。
【０１３６】
図３に示すように、ｐＹｅＤＰ６０ベクターのみを発現するＷ（Ｒ）株からの酵母ミクロソームを用いて、ニコチン脱メチル化酵素活性は検出できなかった。これとは対照的に、非常に堅固なニコチン脱メチル化酵素活性が、ＣＹＰ８２Ｅ１０ ｃＤＮＡを発現する酵母細胞に由来するミクロソームから測定できた。ＣＹＰ８２Ｅ１０酵素活性を広範囲の［１４Ｃ］−ニコチン濃度にわたって測定することにより、基質飽和曲線を確立し、３．９μＭのニコチンの見かけのＫｍを、ミクロソームアッセイを用いて計算した。ＣＹＰ８２Ｅ１０についてのこの動力学的パラメータは、同様に酵母で発現させた場合にＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２およびＣＹＰ８２Ｅ５ｖ２酵素について報告されたＫｍと非常に類似する（Ｇａｖｉｌａｎｏら、２００７；ＧａｖｉｌａｎｏおよびＳｉｍｉｎｓｚｋｙ、２００７；Ｘｕら、２００７ａ）。
【０１３７】
［実施例２： ＣＹＰ８２Ｅ１０の変異対立遺伝子を有する植物の同定］
タバコ植物のノルニコチン総含量に対するＣＹＰ８２Ｅ１０の特異的な貢献を正確に評価するために、（１）この遺伝子内にノックアウト変異を有するタバコ植物を同定し、（２）この変異を、それぞれ植物７７５および１０１３を起源とするｃｙｐ８２ｅ４ｖ２およびｃｙｐ８２ｅ５ｖ２変異と組み合わせることが必要であった。ＣＹＰ８２Ｅ１０中の潜在的な衰弱性変異を同定するために、ＥＭＳ突然変異誘発ＤＨ９８−３２５−６集団を、ＣＹＰ８２Ｅ１０の部分を特異的に増幅する（ＣＹＰ８２Ｅスーパーファミリーのその他のメンバーを同時に増幅することなく）プライマーを用いるハイスループットＤＮＡ配列分析によりスクリーニングした。ＣＹＰ８２Ｅ１０のエキソン１を特異的に増幅するために、以下のＰＣＲプライマーを用いた：５’−ＧＴＧＡＴＡＧＴＴＴＧＡＴＴＣＣＣＡＡＧＴＧＣ−３’（フォワード）および５’−ＣＴＣＣＣＡＡＡＧＴＴＡＧＡＴＴＡＧＴＣＣＧ−３’（リバース）。エキソン２の特異的増幅は、プライマー５’−ＡＧＧＴＣＧＣＧＣＴＧＡＴＴＣＴＴＧ−３’（フォワード）および５’−ＡＧＡＴＧＡＡＴＡＣＣＣＡＴＣＴＡＴＣＴＡＧＧＡＧＴ−３’（リバース）を用いて達成した。最大限の特異性を確実にするために、エキソン１についてのリバースプライマーおよびエキソン２についてのフォワードプライマーは、ＣＹＰ８２Ｅ１０イントロン内の配列に対応する（図１）。突然変異誘発植物のＰＣＲ増幅および配列分析は、Ｄｅｗｅｙら（２００７）に記載されるようにして９６ウェルフォーマットを用いて行った。
【０１３８】
突然変異誘発タバコ集団からの１，２００を超える個体のハイスループット配列分析は、ＣＹＰ８２Ｅ１０中に変異を有する１５の個体の同定をもたらした。これらのうちの最も著しいものを、表２に示す。これらの植物において変異されたヌクレオチドおよびアミノ酸残基も、図１に強調する。これらの個体のうちで切断変異は観察されなかったが、いくつかの場合において、酵素の高度に保存された領域内のアミノ酸残基が変更された変異が同定された。ＣＹＰ８２Ｅ１０酵素活性に対する特定の変異の影響を決定するために、部位特異的突然変異誘発を用いて、表２に示す９つの変異のうちの７つに相当する特定の変異を、ｐＹｅＤＰ６０酵母発現ベクター内のＣＹＰ８２Ｅ１０ ｃＤＮＡ中に導入した。７つのＣＹＰ８２Ｅ１０バリアントのそれぞれを発現する酵母株からのミクロソーム調製物を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにてニコチン脱メチル化酵素活性について、非飽和（２．４５μＭ）および飽和（５０μＭ）濃度の両方の［１４Ｃ］−ニコチンを用いてアッセイした。酵母発現アッセイからの結果は、植物６９３、８１７および１０３５で見出された変異は酵素活性を変更しなかったが、植物１０４１、１５１２および２４７６で見出された変異は完全な酵素不活性化を導いたことを示した。植物１４４２において観察された変異は、野生型ＣＹＰ８２Ｅ１０酵素と比較して、７５％の活性の低減をもたらした。
【０１３９】
植物１０４１変異に相当するｉｎ ｖｉｔｒｏ酵母発現アッセイについての薄層クロマトグラフィーデータを、図３に示す。この特定の変異を、より網羅的な調査のために選択した。植物１０４１変異を規定するアミノ酸３８２位でのＰｒｏからＳｅｒへの置換がニコチン脱メチル化機能と両立しないことについてさらに確認するために、この同じ変異を、同様にｐＹｅＤＰ６０ベクターにクローニングされたＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２ ｃＤＮＡに導入した。これらの酵母アッセイの結果を、表３に表示する。ＣＹＰ８２Ｅ１０またはＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２酵素のいずれに導入されても、３８２位でのＰｒｏについてのＳｅｒ置換は、このアッセイにおいてニコチン脱メチル化酵素活性の完全な除去を導く。興味深いことに、野生型ＣＹＰ８２Ｅ１０およびＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２酵素の活性は、非飽和［１４Ｃ］−ニコチン濃度（２．４５μＭ）にて２５μＭの基質レベルで同等であったが、［１４Ｃ］−ノルニコチン合成の率は、ＣＹＰ８２Ｅ１０酵素を有するミクロソーム調製物において、ＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２を含有する調製物よりも３倍近く大きかった。
【０１４０】
【表２】
【０１４１】
【表３】
【０１４２】
野生型および１０４１変異ＣＹＰ８２Ｅ１０発現酵母細胞のニコチン脱メチル化酵素活性も、ｉｎ ｖｉｖｏでアッセイした。酵母培養物を一晩、５５μＭの［１４Ｃ］−ニコチンの存在下で振とうし、メタノールで抽出し、薄層クロマトグラフィーにより分析した。［１４Ｃ］−ノルニコチンは、野生型ＣＹＰ８２Ｅ１０を発現する酵母の抽出物において検出できたが、遺伝子の１０４１変異バーションでは検出できなかった（データは示さず）。累積的に、酵母発現アッセイは、ＣＹＰ８２Ｅ１０酵素機能が１０４１変異の導入により完全に消失することを強く示唆する。
【０１４３】
［実施例３： ｃｙｐ８２ｅ１０、ｃｙｐ８２ｅ４ｖ２およびｃｙｐ８２ｅ５ｖ２の変異対立遺伝子の組合せ］
元の１０４１変異は、強いコンバータＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２対立遺伝子と、野生型ＣＹＰ８２Ｅ５ｖ２遺伝子との両方を含有する遺伝子背景（ＤＨ９８−３２５−６）にあることに鑑みて、植物ノルニコチン総含量に向かうＣＹＰ８２Ｅ１０の特異的貢献を正確に評価するための唯一の方法は、１０４１変異を、ノックアウトＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２およびＣＹＰ８２Ｅ５ｖ２変異も有するタバコ植物に導入することである。このことを遂行するために、１０４１変異についてヘテロ接合型の植物（ｅ１０Ｅ１０）を、上記の７７５および１０１３変異の両方についてヘテロ接合型の植物（ｅ４Ｅ４／ｅ５Ｅ５）と交雑させた。後者の植物は、交雑種７７５／１０１３／／ＴＮ９０／３／ＴＮ９０／４／ＴＮ９０からの子孫である。３つ全てのニコチン脱メチル化酵素変異についてヘテロ接合型のＦ１植物（ｅ４Ｅ４／ｅ５Ｅ５／ｅ１０Ｅ１０）を、分子的遺伝子型決定により同定し、自家受粉させた。分子的遺伝子型決定は、４００を超えるＦ２子孫をスクリーニングし、その後、それらを以下の遺伝子型クラスに分類するためにも用いた。Ｅ４Ｅ４／Ｅ５Ｅ５／ｅ１０ｅ１０（合計３つの植物）、ｅ４ｅ４／Ｅ５Ｅ５／ｅ１０ｅ１０（合計４つの植物）、Ｅ４Ｅ４／ｅ５ｅ５／ｅ１０ｅ１０（合計５つの植物）、およびｅ４ｅ４／ｅ５ｅ５／ｅ１０ｅ１０（合計５つの植物）。
【０１４４】
上記の全ての植物を、移植して、２００９年の夏にＲｏｃｋｙ Ｍｏｕｎｔ、ＮＣのＵｐｐｅｒ Ｃｏａｓｔａｌ Ｐｌａｉｎｓ研究所にて野外で生育させた。この研究には、表１に示す２００８年の野外試験で試験した２つの遺伝子型も含めた。具体的に、ｃｙｐ８２ｅ４ｖ２変異についてのみホモ接合型（ｅ４ｅ４／Ｅ５Ｅ５／Ｅ１０Ｅ１０）の１０のＤＨ９８−３２５−６植物、および二重ホモ接合型ｅ４ｅ４／ｅ５ｅ５／Ｅ１０Ｅ１０遺伝子型を有する１１のＤＨ９８−３２５−６植物を、比較のために含めた。対照として、商業的な「低コンバータ」種子ロット（ＴＮ９０ＬＣ）から無作為に選択した個別の植物、野生型ＤＨ９８−３２５−６個体および最良のＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２ ＲＮＡｉ抑制トランスジェニック系統の１つからの植物も、研究に含めた。植物が平均で約３０ｃｍの高さになった後に（移植の３５日後）、類似の茎の位置から葉を回収し、エテホンで処理し、Ｊａｃｋら（２００７）により確立された手順に従って空気乾燥させた。乾燥させた葉材料のアルカロイド含量を、同じ手順に記載されるようにしてガスクロマトグラフィーにより決定した。
【０１４５】
表４および図４は、２００９年野外試験についてのアルカロイド分析の結果を示す。以前の観察と一貫して、ｃｙｐ８２ｅ４ｖ２ノックアウト変異単独は、系統ＤＨ９８−３２５−６の強いコンバータ表現型を打ち消し、商業的なＴＮ９０ＬＣ種子からの植物よりも実質的に低いノルニコチン蓄積表現型も授けた（それぞれ２．２％の変換対７．１％）。２００８年野外試験で観察されたように（表１）、ｃｙｐ８２ｅ５ｖ２変異をｃｙｐ８２ｅ４ｖ２と組み合わせることにより、ノルニコチン含量はさらに低減されなかった。実際に、ｅ４ｅ４／Ｅ５Ｅ５／Ｅ１０Ｅ１０植物についての平均ニコチン変換は、ｅ４ｅ４／ｅ５ｅ５／Ｅ１０Ｅ１０個体について観察されたものより実際に低かった（２．２％対２．３％）が、このわずかな差は統計学的に有意でなかった。予期されたように、ｃｙｐ８２ｅ１０変異は、単独（Ｅ４Ｅ４／Ｅ５Ｅ５／ｅ１０ｅ１０遺伝子型）または変異ｃｙｐ８２ｅ５ｖ２対立遺伝子と組み合わせた場合（Ｅ４Ｅ４／ｅ５ｅ５／ｅ１０ｅ１０遺伝子型）のいずれでも、活性ＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２遺伝子により授けられた高いノルニコチンレベルに影響しなかった（図４Ａ）。ｃｙｐ８２ｅ４ｖ２およびｃｙｐ８２ｅ５ｖ２二重変異体の結果と同様に（表１および４）、ｃｙｐ８２ｅ１０をｃｙｐ８２ｅ４ｖ２背景に導入することは、ｃｙｐ８２ｅ４ｖ２変異単独により達成できるレベル未満にノルニコチンレベルを低減させることにおいて効果的でなかった（図４Ｂ）。ｅ４ｅ４／Ｅ５Ｅ５／ｅ１０ｅ１０遺伝子型は、平均で１．８５％の変換を示し、これは、ｅ４ｅ４／Ｅ５Ｅ５／Ｅ１０Ｅ１０個体について観察された２．２％の平均変換レベルと有意な差がなかった（Ｐ＝０．２３５）。
【０１４６】
【表４】
【０１４７】
ｃｙｐ８２ｅ５ｖ２およびｃｙｐ８２ｅ１０変異は、個別に組み合わせた場合にｃｙｐ８２ｅ４ｖ２植物のノルニコチン含量を著しく減少するために働かなかったが、３つ全てのニコチン脱メチル化酵素変異をピラミッド状にすることは、非常に著しい効果があった。三重変異植物（ｅ４ｅ４／ｅ５ｅ５／ｅ１０ｅ１０）におけるニコチンからノルニコチンへの変換は、ＲＮＡｉ抑制トランスジェニック系統で観察された０．５４％と実質的に同一のパーセンテージである、平均で０．５５％だけであった（Ｐ＝０．８９３；図４Ｂ）。このことは、ｃｙｐ８２ｅ４ｖ２変異単独により媒介されたものを超えてニコチン変換の３倍を超える低減を表す。統計学的に、ｅ４ｅ４／Ｅ５Ｅ５／Ｅ１０Ｅ１０遺伝子型とｅ４ｅ４／ｅ５ｅ５／ｅ１０ｅ１０遺伝子型との間のパーセントニコチン変換（および全乾燥重量のパーセンテージとしてのノルニコチン蓄積）における差は、高度に有意であった（Ｐ＜０．０００１）。ニコチン変換のＲＮＡｉ媒介抑制の調査と同様に（Ｌｅｗｉｓら、２００８）、タバコ植物におけるニコチン脱メチル化酵素活性のこの非トランスジェニック変更は、マイナーなアルカロイド種であるアナタビンおよびアナバシンの含量を著しく変更しないとみられた。
【０１４８】
３つの独立したニコチン脱メチル化酵素遺伝子変異をピラミッド状にすることの効果を、２０１０年の生育時季の間に行った野外試験においても試験した。この研究のために、交雑を、完全にＤＨ９８−３２５−６遺伝子背景内で行った（ＴＮ９０親も用いた２００９年研究とは対照的に）。分子的遺伝子型決定を再び用いて、ノルニコチン表現型に対するそれぞれのＣＹＰ８２Ｅ遺伝子座のそれぞれの貢献を決定するために必要な全ての可能な組合せを創出した。アルカロイドデータを、成熟まで生育させ、標準的な産業的手続に従って乾燥させたタバコ植物について収集した。表５に示すように、高いレベルのニコチン変換（５２．４〜６５．５９％の範囲）が、野生型ＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２遺伝子についてホモ接合型の全ての遺伝子型（遺伝子型Ｅ４Ｅ４／Ｅ５Ｅ５／Ｅ１０Ｅ１０、Ｅ４Ｅ４／ｅ５ｅ５／Ｅ１０Ｅ１０、Ｅ４Ｅ４／Ｅ５Ｅ５／ｅ１０ｅ１０およびＥ４Ｅ４／ｅ５ｅ５／ｅ１０ｅ１０）において観察された。ｃｙｐ８２ｅ４ｖ２変異についてのみホモ接合型の植物（ｅ４ｅ４／Ｅ５Ｅ５／Ｅ１０Ｅ１０）は、平均で２．９１％のニコチンからノルニコチンへの変換を示した。２００９年の結果と同様に、ｃｙｐ８２Ｅ５ｖ２およびｃｙｐ８２Ｅ１０変異の効果は相加的でなく、３つ全ての変異遺伝子座が一緒にピラミッド状になった場合にのみ現れた。ＤＨ９８−３２５−６（ｅ４ｅ４／Ｅ５Ｅ５／ｅ１０ｅ１０）植物は、平均で２．８９％の変換を示し、ＤＨ９８−３２５−６（ｅ４ｅ４／ｅ５ｅ５／Ｅ１０Ｅ１０）個体は、平均で２．５２％であり、これらの値は、ｃｙｐ８２ｅ４ｖ２変異単独で観察されたものと統計学的に差がなかった。これとは対照的に、三重変異ＤＨ９８−３２５−６（ｅ４ｅ４／ｅ５ｅ５／ｅ１０ｅ１０）遺伝子型で観察されたノルニコチンの低減（１．１１％ニコチン変換）は、ｃｙｐ８２ｅ４ｖ２変異単独により到達されたものより２．６倍低かった。三重変異組合せに帰することができるニコチン変換の低減は、ｃｙｐ８２ｅ４ｖ２単独またはいずれの二重変異組合せのいずれと比較しても、高度に有意であった（Ｐ＜０．００１）。
【０１４９】
【表５】
【０１５０】
［結論］
今回の発見および新しいニコチン脱メチル化酵素遺伝子ＣＹＰ８２Ｅ１０の特徴決定により、商用グレードの空気乾燥タバコ植物におけるニコチン変換率（およびそれによりノルニコチンレベル）を、トランスジェニックアプローチを用いることによってのみ以前は可能であったレベルまで低減するための方策を開発することができた。この非ＧＭＯベースの技術は、ノルニコチンのレベルを、トランスジェニック方策を用いて達成されていたものと同様の程度まで低減でき、それでもなお、（１）トランスジェニック植物を作製するために要求されるいくつかの機能付加技術について交渉し、ライセンス料を支払うこと、（２）トランスジェニック事象の規制緩和に関連する冗長な時間および面倒な費用を回避すること、ならびに（３）ＧＭＯに対して哲学的に反対する最終使用者により製品が拒絶される可能性に遭遇することのようなトランスジェニック作物の商業化に関連する実質的な障害を迂回しながら、超少量ノルニコチンタバコ品種を開発するための手段として働くおびただしい利点を提供する。本明細書で報告する発見は、ＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２ニコチン脱メチル化酵素遺伝子における変異だけ（Ｊｕｌｉｏら、２００８；Ｘｕら、２００７ｂ）、またはＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２変異とＣＹＰ８２Ｅ５ｖ２変異との組合せ（Ｄｅｗｅｙら、２００７）を標的にした以前に記載された非ＧＭＯ方策と比較して、タバコ製品において見出される、文書で最も十分に立証されている強い発癌物質の１つのレベルを低下させる我々の能力の主要な前進である。トランスジェニック技術を用いて、乾燥させた葉において約２．６％から約０．５％までニコチン変換レベルを低下させることが、葉のＮＮＮ含量における相応の低減も導くことが以前に証明された（Ｌｅｗｉｓら、２００８）。本報告で記載する三重変異組合せ（ｅ４ｅ４／ｅ５ｅ５／ｅ１０ｅ１０）を含有するタバコの葉からのＮＮＮ含量の同様の低減が観察されることが予期される。空気乾燥タバコを元来は標的にしたが、この技術は、熱風乾燥品種にも利益を与える。熱交換器は老化するので、熱風乾燥中にＮＯｘガスを除去するそれらの能力は減少し得る。さらに、最近の研究は、かなりの量のＴＳＮＡ形成が乾燥させた葉の貯蔵の間に発生し得ることを示している。熱風乾燥品種に三重変異組合せを導入することによりノルニコチンレベルを最小限にすることは、貯蔵の間または乾燥プロセス中の非効率な熱交換の結果としてのいずれかのＮＮＮ形成に対する防衛手段として作用できる。
【０１５１】
［参考文献］
【表６Ａ】
【表６Ｂ】
【表６Ｃ】
【０１５２】
本明細書で示す本発明の多くの改変およびその他の実施形態は、上記の記載および付随する図面に示した教示の利益を享受した、これらの発明が属する当技術分野における当業者が思い浮かべられる。よって、本発明は、開示される特定の実施形態に限定されず、改変およびその他の実施形態は、実施形態のリストおよび添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることを意図することが理解される。特定の用語を本明細書で採用したが、これらは、包括的および説明のための意味でのみ用い、限定する目的のために用いていない。
【０１５３】
本明細書で述べる全ての出版物および特許出願は、本発明が属する当技術分野における当業者のレベルを示す。全ての出版物および特許出願は、それぞれ個別の出版物および特許出願が参照することにより本明細書の一部をなすように具体的かつ個別に示されているのと同じ程度に、参照することにより本明細書の一部をなすものとする。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素をコードする遺伝子において変異を含むタバコ植物またはその植物部分であって、前記変異が、前記ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素の発現または機能の低減をもたらすタバコ植物またはその植物部分。
【請求項２】
前記ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素が、配列番号２、５、６、７、８および９に示す配列からなる群より選択される請求項１に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【請求項３】
前記変異が、アミノ酸残基７９、１０７、３８２、４１９およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される位置にて生じる前記ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素の改変をもたらし、前記番号付けが配列番号２に従う請求項１または２に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【請求項４】
前記変異が、
ａ）７９位のグリシン残基のセリンによる置換、
ｂ）１０７位のプロリン残基のセリンによる置換、
ｃ）３８２位のプロリン残基のセリンによる置換、
ｄ）４１９位のプロリン残基のセリンによる置換、および
ｅ）それらの任意の組合せ
からなる群より選択される請求項３に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【請求項５】
ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素をコードする遺伝子において変異をさらに含み、前記変異が、前記ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素の発現または機能の低減をもたらす請求項１〜４のいずれかに記載のタバコ植物またはその植物部分。
【請求項６】
前記ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素が、配列番号１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０に示す配列から選択される請求項５に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【請求項７】
前記変異が、アミノ酸残基３２９、３６４、３７６、３８２および４５８からなる群より選択される位置にて生じる前記ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素の改変をもたらし、前記番号付けが配列番号１４に従う請求項５または６に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【請求項８】
前記変異が、
ａ）３２９位のトリプトファン残基の停止コドンによる置換、
ｂ）３６４位のリシン残基のアスパラギンによる置換、
ｃ）３７６位のバリン残基のメチオニンによる置換、
ｄ）３８２位のプロリン残基のセリンによる置換、
ｄ）４５８位のプロリン残基のセリンによる置換、および
ｅ）それらの任意の組合せ
からなる群より選択される請求項７に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【請求項９】
ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素をコードする遺伝子における変異をさらに含み、前記変異が、前記ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素の発現または機能の低減をもたらす請求項１〜８のいずれかに記載のタバコ植物またはその植物部分。
【請求項１０】
前記ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素が、配列番号２６、２７、２８、２９、３０、３１および３２に示す配列から選択される請求項９に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【請求項１１】
前記変異が、アミノ酸残基４２２および４４９からなる群より選択される位置にて生じる前記ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素の改変をもたらし、前記番号付けが配列番号２６に従う請求項９または１０に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【請求項１２】
前記変異が、
ａ）４２２位でトリプトファン残基と置換された停止コドン、
ｂ）４４９位でプロリン残基と置換されたロイシン、および
ｃ）それらの任意の組合せ
からなる群より選択される請求項１１に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【請求項１３】
前記ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素遺伝子および前記ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素遺伝子において変異を含む請求項９〜１２のいずれかに記載のタバコ植物またはその植物部分。
【請求項１４】
前記タバコ植物またはその植物部分が、前記変異についてホモ接合型である請求項１〜１３のいずれかに記載のタバコ植物またはその植物部分。
【請求項１５】
前記ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素が３８２位に変異を含み、前記ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素が３２９位に変異を含み、前記ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素が４２２位に変異を含み、前記番号付けがそれぞれ配列番号２、１４および２６に従う請求項１４に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【請求項１６】
前記変異が、
ａ）３８２位のプロリン残基のセリンによる置換、
ｂ）３２９位のトリプトファン残基の停止コドンによる置換、
ｃ）４２２位のトリプトファン残基の停止コドンによる置換、および
ｄ）それらの任意の組合せ
からなる群より選択される請求項１５に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【請求項１７】
前記植物またはその部分が、１．５％未満の、ニコチンからノルニコチンへの変換を有する請求項１３〜１６のいずれかに記載のタバコ植物またはその植物部分。
【請求項１８】
前記植物またはその部分が、０．５％以下の、ニコチンからノルニコチンへの変換を有する請求項１７に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれかに記載のタバコ植物の種子またはその子孫。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれかに記載のタバコ植物またはその植物部分もしくは子孫から調製されるタバコ製品。
【請求項２１】
タバコ製品の発癌可能性を低減する方法であって、前記タバコ製品を、請求項１〜１８のいずれかに記載のタバコ植物またはその植物部分もしくは子孫から調製することを含む方法。
【請求項２２】
タバコ植物またはその植物部分におけるノルニコチンのレベルを低減するかまたはニコチンからノルニコチンへの変換率を低減する方法であって、少なくとも３つのニコチン脱メチル化酵素遺伝子の各々の少なくとも１つの対立遺伝子内の変異を、前記植物のゲノムに導入するステップを含み、前記変異が、前記ニコチン脱メチル化酵素遺伝子の発現を低減させ、前記ニコチン脱メチル化酵素遺伝子の第１のものが、タバコ植物またはその植物部分におけるニコチンからノルニコチンへの前記代謝変換に関与する根特異的ニコチン脱メチル化酵素をコードする方法。
【請求項２３】
前記根特異的ニコチン脱メチル化酵素が、
ａ）配列番号２、５、６、７、８、９または１０に示すアミノ酸配列、および
ｂ）配列番号２、５、６、７、８、９または１０に示すアミノ酸配列と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素である請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素についての前記アミノ酸配列が、残基７９、１０７、３８２、４１９およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される位置でのアミノ酸残基の置換を有し、前記番号付けが配列番号２に従う請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
７９位、１０７位、３８２位または４１９位での前記置換がセリン残基である請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ニコチン脱メチル化酵素遺伝子の第２のものが、ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素をコードする請求項２２〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素が、
ａ）配列番号１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１に示すアミノ酸配列、および
ｂ）配列番号１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１に示す配列と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素についての前記アミノ酸配列が、残基３２９、３６４、３８２、４５８およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される位置のアミノ酸残基での置換を有し、前記番号付けが配列番号１４に従う請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
３２９位での前記置換が停止コドンであるか、３６４位での前記置換がアスパラギン残基であるか、３８２位での前記置換がセリン残基であるか、４５８位での前記置換がセリン残基であるか、またはそれらの任意の組合せである請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ニコチン脱メチル化酵素遺伝子の第３のものが、ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素をコードする請求項２２〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素が、
ａ）配列番号２６、２７、２８、２９、３０、３１または３２に示すアミノ酸配列、および
ｂ）配列番号２６、２７、２８、２９、３０、３１または３２に示す配列と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素についての前記アミノ酸配列が、残基４２２および４４９ならびにそれらの任意の組合せからなる群より選択される位置のアミノ酸残基での置換を有し、前記番号付けが配列番号２６に従う請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
４２２位での前記置換が停止コドンであるか、４４９位での前記置換がロイシン残基であるか、またはそれらの任意の組合せである請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記植物またはその植物部分が、前記変異についてホモ接合型である請求項２２〜３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
前記導入するステップが、育種手順を含む請求項２２〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記植物が、バーレータバコ植物、バージニアタバコ植物、熱風乾燥タバコ植物、空気乾燥タバコ植物、火力乾燥タバコ植物、オリエンタルタバコ植物またはダークタバコ植物である、請求項２２〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記タバコ植物が、バーレータバコ植物、バージニアタバコ植物、熱風乾燥タバコ植物、空気乾燥タバコ植物、火力乾燥タバコ植物、オリエンタルタバコ植物またはダークタバコ植物である請求項１〜１９のいずれかに記載のタバコ植物またはその植物部分。
【請求項３８】
ノルニコチンのレベルが低いタバコ植物を同定する方法であって、配列番号１または３における変異の存在について、対象のタバコ植物からのＤＮＡ試料をスクリーニングするステップを含む方法。
【請求項３９】
前記タバコ植物が、非コンバータである請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記スクリーニングが、配列番号１、３、３５、３６、３７および３８からなる群より選択される配列を用いて行われる請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４１】
配列番号１４中の変異の存在、配列番号２６中の変異の存在または配列番号１４および配列番号２６中の変異の存在について、前記ＤＮＡ試料または前記対象のタバコ植物からの別のＤＮＡ試料をスクリーニングするステップをさらに含む請求項３８〜４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
ａ）配列番号１、３または４を含むヌクレオチド配列、
ｂ）配列番号１、３または４の少なくとも２０の連続するヌクレオチドの断片を含むヌクレオチド配列、
ｃ）配列番号１に示す配列全体と少なくとも９７％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、前記ポリヌクレオチドが、植物におけるニコチンからノルニコチンへの前記代謝変換に関与するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｄ）配列番号２および５〜１３からなる群より選択されるポリペプチドまたは少なくとも１１５の連続する残基を含むそれらの断片をコードするヌクレオチド配列、
ｅ）配列番号２、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３に示す配列と少なくとも９８％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ならびに
ｆ）前記項目（ａ）から（ｅ）のいずれかによる前記配列と相補的なヌクレオチド配列
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項４３】
ａ）配列番号２、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３に示すアミノ酸配列、
ｂ）配列番号２、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３に示すアミノ酸配列と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列、および
ｃ）配列番号２、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３に示すアミノ酸配列の断片であるアミノ酸配列であって、前記断片が、配列番号２、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３のアミノ酸配列の少なくとも１１５の連続する残基を含むアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
【請求項４４】
ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素をコードする遺伝子、ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素をコードする遺伝子およびＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素をコードする遺伝子における変異についてホモ接合型であるタバコ植物またはその植物部分であって、前記変異が、前記ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素、ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素およびＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素の発現または機能の低減をもたらし、前記ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素が３８２位における変異を含み、前記ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素が３２９位における変異を含み、前記ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素が４２２位における変異を含み、前記番号付けが、それぞれ配列番号２、１４および２６に従うタバコ植物またはその植物部分。
【請求項４５】
ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素をコードする遺伝子における変異であって、前記ＣＹＰｅ２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素の発現または機能の低減をもたらす変異。
【請求項４６】
根におけるニコチン脱メチル化酵素活性を阻害するＣＹＰ８２Ｅ１０遺伝子における変異、老化した葉におけるニコチン脱メチル化酵素活性を阻害するＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２遺伝子における変異、および緑葉におけるニコチン脱メチル化酵素活性を阻害するＣＹＰ８３Ｅ５ｖ２遺伝子における変異を有する植物。
【請求項１】
ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素をコードする遺伝子において変異を含むタバコ植物またはその植物部分であって、前記変異が、前記ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素の発現または機能の低減をもたらすタバコ植物またはその植物部分。
【請求項２】
前記ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素が、配列番号２、５、６、７、８および９に示す配列からなる群より選択される請求項１に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【請求項３】
前記変異が、アミノ酸残基７９、１０７、３８２、４１９およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される位置にて生じる前記ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素の改変をもたらし、前記番号付けが配列番号２に従う請求項１または２に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【請求項４】
前記変異が、
ａ）７９位のグリシン残基のセリンによる置換、
ｂ）１０７位のプロリン残基のセリンによる置換、
ｃ）３８２位のプロリン残基のセリンによる置換、
ｄ）４１９位のプロリン残基のセリンによる置換、および
ｅ）それらの任意の組合せ
からなる群より選択される請求項３に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【請求項５】
ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素をコードする遺伝子において変異をさらに含み、前記変異が、前記ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素の発現または機能の低減をもたらす請求項１〜４のいずれかに記載のタバコ植物またはその植物部分。
【請求項６】
前記ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素が、配列番号１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０に示す配列から選択される請求項５に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【請求項７】
前記変異が、アミノ酸残基３２９、３６４、３７６、３８２および４５８からなる群より選択される位置にて生じる前記ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素の改変をもたらし、前記番号付けが配列番号１４に従う請求項５または６に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【請求項８】
前記変異が、
ａ）３２９位のトリプトファン残基の停止コドンによる置換、
ｂ）３６４位のリシン残基のアスパラギンによる置換、
ｃ）３７６位のバリン残基のメチオニンによる置換、
ｄ）３８２位のプロリン残基のセリンによる置換、
ｄ）４５８位のプロリン残基のセリンによる置換、および
ｅ）それらの任意の組合せ
からなる群より選択される請求項７に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【請求項９】
ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素をコードする遺伝子における変異をさらに含み、前記変異が、前記ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素の発現または機能の低減をもたらす請求項１〜８のいずれかに記載のタバコ植物またはその植物部分。
【請求項１０】
前記ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素が、配列番号２６、２７、２８、２９、３０、３１および３２に示す配列から選択される請求項９に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【請求項１１】
前記変異が、アミノ酸残基４２２および４４９からなる群より選択される位置にて生じる前記ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素の改変をもたらし、前記番号付けが配列番号２６に従う請求項９または１０に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【請求項１２】
前記変異が、
ａ）４２２位でトリプトファン残基と置換された停止コドン、
ｂ）４４９位でプロリン残基と置換されたロイシン、および
ｃ）それらの任意の組合せ
からなる群より選択される請求項１１に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【請求項１３】
前記ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素遺伝子および前記ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素遺伝子において変異を含む請求項９〜１２のいずれかに記載のタバコ植物またはその植物部分。
【請求項１４】
前記タバコ植物またはその植物部分が、前記変異についてホモ接合型である請求項１〜１３のいずれかに記載のタバコ植物またはその植物部分。
【請求項１５】
前記ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素が３８２位に変異を含み、前記ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素が３２９位に変異を含み、前記ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素が４２２位に変異を含み、前記番号付けがそれぞれ配列番号２、１４および２６に従う請求項１４に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【請求項１６】
前記変異が、
ａ）３８２位のプロリン残基のセリンによる置換、
ｂ）３２９位のトリプトファン残基の停止コドンによる置換、
ｃ）４２２位のトリプトファン残基の停止コドンによる置換、および
ｄ）それらの任意の組合せ
からなる群より選択される請求項１５に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【請求項１７】
前記植物またはその部分が、１．５％未満の、ニコチンからノルニコチンへの変換を有する請求項１３〜１６のいずれかに記載のタバコ植物またはその植物部分。
【請求項１８】
前記植物またはその部分が、０．５％以下の、ニコチンからノルニコチンへの変換を有する請求項１７に記載のタバコ植物またはその植物部分。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれかに記載のタバコ植物の種子またはその子孫。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれかに記載のタバコ植物またはその植物部分もしくは子孫から調製されるタバコ製品。
【請求項２１】
タバコ製品の発癌可能性を低減する方法であって、前記タバコ製品を、請求項１〜１８のいずれかに記載のタバコ植物またはその植物部分もしくは子孫から調製することを含む方法。
【請求項２２】
タバコ植物またはその植物部分におけるノルニコチンのレベルを低減するかまたはニコチンからノルニコチンへの変換率を低減する方法であって、少なくとも３つのニコチン脱メチル化酵素遺伝子の各々の少なくとも１つの対立遺伝子内の変異を、前記植物のゲノムに導入するステップを含み、前記変異が、前記ニコチン脱メチル化酵素遺伝子の発現を低減させ、前記ニコチン脱メチル化酵素遺伝子の第１のものが、タバコ植物またはその植物部分におけるニコチンからノルニコチンへの前記代謝変換に関与する根特異的ニコチン脱メチル化酵素をコードする方法。
【請求項２３】
前記根特異的ニコチン脱メチル化酵素が、
ａ）配列番号２、５、６、７、８、９または１０に示すアミノ酸配列、および
ｂ）配列番号２、５、６、７、８、９または１０に示すアミノ酸配列と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素である請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素についての前記アミノ酸配列が、残基７９、１０７、３８２、４１９およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される位置でのアミノ酸残基の置換を有し、前記番号付けが配列番号２に従う請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
７９位、１０７位、３８２位または４１９位での前記置換がセリン残基である請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ニコチン脱メチル化酵素遺伝子の第２のものが、ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素をコードする請求項２２〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素が、
ａ）配列番号１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１に示すアミノ酸配列、および
ｂ）配列番号１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１に示す配列と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素についての前記アミノ酸配列が、残基３２９、３６４、３８２、４５８およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される位置のアミノ酸残基での置換を有し、前記番号付けが配列番号１４に従う請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
３２９位での前記置換が停止コドンであるか、３６４位での前記置換がアスパラギン残基であるか、３８２位での前記置換がセリン残基であるか、４５８位での前記置換がセリン残基であるか、またはそれらの任意の組合せである請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ニコチン脱メチル化酵素遺伝子の第３のものが、ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素をコードする請求項２２〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素が、
ａ）配列番号２６、２７、２８、２９、３０、３１または３２に示すアミノ酸配列、および
ｂ）配列番号２６、２７、２８、２９、３０、３１または３２に示す配列と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素についての前記アミノ酸配列が、残基４２２および４４９ならびにそれらの任意の組合せからなる群より選択される位置のアミノ酸残基での置換を有し、前記番号付けが配列番号２６に従う請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
４２２位での前記置換が停止コドンであるか、４４９位での前記置換がロイシン残基であるか、またはそれらの任意の組合せである請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記植物またはその植物部分が、前記変異についてホモ接合型である請求項２２〜３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
前記導入するステップが、育種手順を含む請求項２２〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記植物が、バーレータバコ植物、バージニアタバコ植物、熱風乾燥タバコ植物、空気乾燥タバコ植物、火力乾燥タバコ植物、オリエンタルタバコ植物またはダークタバコ植物である、請求項２２〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記タバコ植物が、バーレータバコ植物、バージニアタバコ植物、熱風乾燥タバコ植物、空気乾燥タバコ植物、火力乾燥タバコ植物、オリエンタルタバコ植物またはダークタバコ植物である請求項１〜１９のいずれかに記載のタバコ植物またはその植物部分。
【請求項３８】
ノルニコチンのレベルが低いタバコ植物を同定する方法であって、配列番号１または３における変異の存在について、対象のタバコ植物からのＤＮＡ試料をスクリーニングするステップを含む方法。
【請求項３９】
前記タバコ植物が、非コンバータである請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記スクリーニングが、配列番号１、３、３５、３６、３７および３８からなる群より選択される配列を用いて行われる請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４１】
配列番号１４中の変異の存在、配列番号２６中の変異の存在または配列番号１４および配列番号２６中の変異の存在について、前記ＤＮＡ試料または前記対象のタバコ植物からの別のＤＮＡ試料をスクリーニングするステップをさらに含む請求項３８〜４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
ａ）配列番号１、３または４を含むヌクレオチド配列、
ｂ）配列番号１、３または４の少なくとも２０の連続するヌクレオチドの断片を含むヌクレオチド配列、
ｃ）配列番号１に示す配列全体と少なくとも９７％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、前記ポリヌクレオチドが、植物におけるニコチンからノルニコチンへの前記代謝変換に関与するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｄ）配列番号２および５〜１３からなる群より選択されるポリペプチドまたは少なくとも１１５の連続する残基を含むそれらの断片をコードするヌクレオチド配列、
ｅ）配列番号２、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３に示す配列と少なくとも９８％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ならびに
ｆ）前記項目（ａ）から（ｅ）のいずれかによる前記配列と相補的なヌクレオチド配列
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項４３】
ａ）配列番号２、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３に示すアミノ酸配列、
ｂ）配列番号２、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３に示すアミノ酸配列と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列、および
ｃ）配列番号２、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３に示すアミノ酸配列の断片であるアミノ酸配列であって、前記断片が、配列番号２、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３のアミノ酸配列の少なくとも１１５の連続する残基を含むアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
【請求項４４】
ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素をコードする遺伝子、ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素をコードする遺伝子およびＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素をコードする遺伝子における変異についてホモ接合型であるタバコ植物またはその植物部分であって、前記変異が、前記ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素、ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素およびＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素の発現または機能の低減をもたらし、前記ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素が３８２位における変異を含み、前記ＣＹＰ８２Ｅ４ニコチン脱メチル化酵素が３２９位における変異を含み、前記ＣＹＰ８２Ｅ５ニコチン脱メチル化酵素が４２２位における変異を含み、前記番号付けが、それぞれ配列番号２、１４および２６に従うタバコ植物またはその植物部分。
【請求項４５】
ＣＹＰ８２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素をコードする遺伝子における変異であって、前記ＣＹＰｅ２Ｅ１０ニコチン脱メチル化酵素の発現または機能の低減をもたらす変異。
【請求項４６】
根におけるニコチン脱メチル化酵素活性を阻害するＣＹＰ８２Ｅ１０遺伝子における変異、老化した葉におけるニコチン脱メチル化酵素活性を阻害するＣＹＰ８２Ｅ４ｖ２遺伝子における変異、および緑葉におけるニコチン脱メチル化酵素活性を阻害するＣＹＰ８３Ｅ５ｖ２遺伝子における変異を有する植物。
【図３】
【図４】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図４】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【公表番号】特表２０１３−５１６９９０（Ｐ２０１３−５１６９９０Ａ）
【公表日】平成２５年５月１６日（２０１３．５．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４９０６３（Ｐ２０１２−５４９０６３）
【出願日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２１０８８
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８８１８０
【国際公開日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【出願人】（５０７３３４３８１）ノース・キャロライナ・ステイト・ユニヴァーシティ (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月１６日（２０１３．５．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２１０８８
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８８１８０
【国際公開日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【出願人】（５０７３３４３８１）ノース・キャロライナ・ステイト・ユニヴァーシティ (5)
【Ｆターム（参考）】
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