タンパク質凝集を減少させるための方法
製剤中のタンパク質またはタンパク質（複数）の凝集を減少させる方法、および凝集特性が低いタンパク質製剤が提供される。本明細書中に記載されている方法および製剤は、タンパク質の生物活性を維持し、タンパク質製剤の貯蔵寿命を増大させる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその内容全体が本明細書に援用される、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ」という名称の、２００６年３月２０日に出願した米国仮出願第６０／７８４１３０号の利益を主張するものである。
【０００２】
その分野は、タンパク質の凝集を減少させる方法および凝集が低レベルであるタンパク質製剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒトゲノムプロジェクトの完了は、タンパク質単離および精製の改良法の開発と相まって、タンパク質製剤の大規模生産を実現した。実際、第Ｉ相臨床試験、またはそれを超える試験中の、１００を超える組換えタンパク質があり、数十のものは食品医薬品局の承認を得ている。生物活性形態でのタンパク質またはペプチドの効率的で安全な送達を確実に行う製剤は、現在および将来のバイオテクノロジー製品の商業的成功の手掛かりである。
【０００４】
不運なことに、タンパク質は、独特の物理的および化学的特性を有し、これらによって製剤化および開発が困難になる。タンパク質の物理的および化学的不安定性は、適したタンパク質製剤の開発に相当な難題をもたらす。タンパク質の最も一般的な物理的不安定性は、タンパク質凝集、およびその巨視的同等物である沈殿である。タンパク質が凝集する傾向は、タンパク質を可能な限り高い濃度で長期間にわたって合成、加工、および保存することが所望されるバイオテクノロジーおよび製薬産業における、特に困難な課題である。
【０００５】
タンパク質凝集を駆動する機序は完全には理解されていないが、それでもなお、最終結果は望ましくない。医薬組成物中のポリペプチドによる凝集物形成は、そのポリペプチドの生物活性に有害に影響を及ぼして、医薬組成物の治療有効性の喪失を生じる場合がある。また、凝集状態のタンパク質は免疫原性である場合があり、ｉｎ ｖｉｖｏで急性毒性効果も有する場合がある。さらに、凝集物形成は、注射器、管系、膜、またはポンプの妨害等、タンパク質製剤の投与の間に他の問題を引き起こす場合がある。したがって、当該分野には、タンパク質凝集を減少させる方法の、および低レベルの凝集を示すタンパク質製剤を開発する必要性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本出願は、低い凝集特性を示すタンパク質製剤、およびそのような製剤を作製する方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様において、本出願は、約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭの濃度までメチオニンを製剤に添加することによって製剤中のタンパク質またはタンパク質（複数）の凝集を減少させるための方法に関する。方法は、メチオニンを欠くこと以外同一の製剤化において製剤化された同じタンパク質またはタンパク質（複数）の凝集のレベルと比較して、製剤中のタンパク質またはタンパク質（複数）の凝集を減少させる。特定の実施形態において、約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭの濃度までメチオニンを製剤に添加する方法は、製剤が、タンパク質凝集を促進または容易にする条件に供された場合に、メチオニンを欠くこと以外同一の製剤化において製剤化され、タンパク質凝集を促進する同じ条件に供された同じタンパク質またはタンパク質（複数）の凝集のレベルと比較して、製剤中のタンパク質またはタンパク質（複数）の凝集を減少させる。
【０００８】
ある実施形態において、約０．５ｍＭ〜約５０ｍＭの間の終濃度まで、メチオニンが製剤に添加される。特定の実施形態において、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２．５ｍＭ、５ｍＭ、７．５ｍＭ、１０ｍＭ、１２．５ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、および４５ｍＭの終濃度まで、メチオニンが製剤に添加される。ある実施形態において、タンパク質製剤がタンパク質凝集をもたらす条件に供される、約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭの濃度までメチオニンをタンパク質製剤に添加する方法は、タンパク質凝集を促進する条件に製剤が供された後、サイズ排除クロマトグラフィー−高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）によって測定すると、最大限でも約５％、最大限でも約４％、最大限でも約３％、最大限でも約２％、最大限でも約１％、または最大限でも約０．５％の高分子量（ＨＭＷ）種を有する製剤を生じる。
【０００９】
いくつかの実施形態において、約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭの濃度までメチオニンをタンパク質製剤に添加する方法は、メチオニンを欠く製剤と比較して、タンパク質製剤の貯蔵寿命を増大させる。他の実施形態において、約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭの濃度までメチオニンをタンパク質製剤に添加する方法は、メチオニンを欠く製剤と比較して、タンパク質製剤の効力を維持する。ある実施形態において、約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭの濃度（例えば、約１ｍＭ〜約１４５ｍＭ）までメチオニンをタンパク質製剤に添加する方法は、メチオニンを欠く製剤と比較して、タンパク質製剤の免疫原性を減少させる。
【００１０】
その方法は、凝集するタンパク質に対する相同性に基づいて、または凝集する可能性を示唆する実験データに基づいて、凝集することが公知である、または凝集しそうであると考えられるタンパク質に、最も有用である。一実施形態において、製剤内のタンパク質は、保存の間に凝集する。いくつかの実施形態において、製剤内のタンパク質は、せん断力の結果として凝集する。他の実施形態において、製剤内のタンパク質は、高い温度の結果として凝集する。他の実施形態において、製剤内のタンパク質は、光への曝露の結果として凝集する。さらに他の実施形態において、製剤内のタンパク質は、製剤中のある種の糖、または界面活性物質の存在の結果として凝集する。そのような条件に供される、または供されそうである製剤へのメチオニンの添加は、凝集物形成の減少に有効であり、それによって、製剤内のタンパク質またはタンパク質（複数）の生物活性および効力を維持する。
【００１１】
いくつかの実施形態において、製剤中のタンパク質またはタンパク質（複数）の凝集は、メチオニンを製剤に添加する前に判定される。他の実施形態において、製剤中のタンパク質またはタンパク質（複数）の凝集は、メチオニンを製剤に添加した後に判定される。さらなる実施形態において、製剤のタンパク質またはタンパク質（複数）の凝集は、メチオニンを製剤に添加する前後に判定される。製剤のタンパク質またはタンパク質（複数）の凝集は、限定されないが、サイズ排除クロマトグラフィー−高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）、逆相−高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、ＵＶ吸光度、沈降速度測定、およびそれらの組合せを含む、当業者に公知の任意の方法によって判定することができる。特定の実施形態において、約１ｍＭ〜約１４５ｍＭメチオニンを含む製剤中のパーセンテージ高分子量（％ＨＭＷ）種は、メチオニンを欠くこと以外同一の製剤における％ＨＭＷ種と比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または７５％減少する。他の特定の実施形態において、約１ｍＭ〜約１４５ｍＭメチオニンを含む製剤は、最大限でも約５％、最大限でも約４％、最大限でも約３％、最大限でも約２％、最大限でも約１％、または最大限でも約０．５％の高分子量（ＨＭＷ）種を有する。製剤中のタンパク質またはタンパク質（複数）の凝集は、メチオニンありまたはなしのいずれかで、製剤が調製された後の任意のときに測定することができる。ある実施形態において、凝集は、タンパク質を製剤化した翌日、目的のタンパク質を製剤化してから１週間〜１２週間後、または１カ月〜３６カ月後に測定される。
【００１２】
いくつかの実施形態において、製剤のタンパク質は、抗体、免疫グロブリン（Ｉｇ）融合タンパク質、凝固因子、受容体、リガンド、酵素、転写因子、またはこれらのタンパク質のいずれかの生物活性断片である。特定の実施形態において、タンパク質は、抗Ｂ７．１抗体、抗Ｂ７．２抗体、抗ＣＤ２２抗体、ＰＳＧＬ−Ｉｇ融合タンパク質、活性化第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、またはこれらのタンパク質のいずれかの生物活性断片である。いくつかの実施形態において、タンパク質は、製剤中約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２５０ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤化される。いくつかの実施形態において、タンパク質は、製剤中約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤化される。他の実施形態において、タンパク質は、製剤中約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤化される。いくつかの実施形態において、タンパク質は、製剤中約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤化される。ある実施形態において、タンパク質は、液体または凍結乾燥粉末として製剤化される。
【００１３】
ある実施形態において、タンパク質製剤は、界面活性物質を含む。特定の実施形態において、界面活性物質は、ポリソルベート−２０またはポリソルベート−８０である。ある他の実施形態において、タンパク質製剤は、界面活性物質を欠く。ある実施形態において、タンパク質製剤は、張性調節物質を含む。特定の実施形態において、張性調節物質は、塩化ナトリウム、マンニトール、またはソルビトールである。ある他の実施形態において、タンパク質製剤は、糖を含む。特定の実施形態において、糖は、ショ糖、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、またはキシリトールである。ある他の実施形態において、タンパク質製剤は、糖を欠く。いくつかの実施形態において、製剤のｐＨは、約５．０〜８．０の間である。いくつかの他の実施形態において、製剤のｐＨは、約５．８〜６．６の間である。
【００１４】
他の実施形態において、タンパク質製剤は、製剤のタンパク質の凝集を減少させる１つまたは複数の作用物質をさらに含む。いくつかの実施形態において、製剤のタンパク質の凝集を減少させる作用物質は、アミノ酸である。特定の実施形態において、アミノ酸は、アルギニン、リシン、グリシン、グルタミン酸、またはアスパラギン酸である。いくつかの実施形態において、アミノ酸は、約１ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度まで、タンパク質製剤に添加される。いくつかの他の実施形態において、アミノ酸は、約５ｍＭ〜約１５０ｍＭの濃度まで、タンパク質製剤に添加される。他の実施形態において、製剤のタンパク質の凝集を減少させる作用物質は、金属キレート剤の組合せである。特定の実施形態において、金属キレート剤は、ＤＴＰＡ、ＥＧＴＡ、およびＤＥＦである。いくつかの実施形態において、タンパク質製剤中のＤＴＰＡまたはＥＧＴＡの濃度は、約１μＭ〜約５ｍＭである。いくつかの実施形態において、タンパク質製剤中のＤＥＦの濃度は、約１μＭ〜約１０ｍＭである。他の実施形態において、製剤のタンパク質の凝集を減少させる作用物質は、フリーラジカルスカベンジャー、特に酸素ラジカルのスカベンジャーである。特定の実施形態において、フリーラジカルスカベンジャーは、マンニトールまたはヒスチジンである。いくつかの実施形態において、タンパク質製剤中のマンニトールの濃度は、約０．０１％〜約２５％である。いくつかの実施形態において、タンパク質製剤中のヒスチジンの濃度は、約１００μＭ〜約２００ｍＭである。他の実施形態において、製剤のタンパク質の凝集を減少させる作用物質は、金属キレート剤およびフリーラジカルスカベンジャーの組合せである。ある他の実施形態において、凝集を減少させる作用物質はクエン酸塩である。ある実施形態において、タンパク質製剤中のクエン酸塩の濃度は、約０．５ｍＭ〜約２５ｍＭである。
【００１５】
別の態様において、本出願は、約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭの濃度までメチオニンを製剤に添加することによる、タンパク質がメチオニン残基を含まないか、または１０、９、８、７、６、５、４、３、もしくは２個より少ないメチオニン残基を含む、タンパク質製剤中のタンパク質の凝集を減少させるための方法を提供する。方法は、メチオニンを欠くこと以外同一の製剤中の同じタンパク質と比較して、製剤中のタンパク質の凝集が減少する。ある実施形態において、メチオニンは、約０．５ｍＭ〜約５０ｍＭの間の終濃度まで、製剤に添加される。特定の実施形態において、メチオニンは、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２．５ｍＭ、５ｍＭ、７．５ｍＭ、１０ｍＭ、１２．５ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、および４５ｍＭの終濃度まで、製剤に添加される。他の実施形態において、タンパク質がメチオニン残基を含まないか、または１０、９、８、７、６、５、４、３、もしくは２個より少ないメチオニン残基を含む、約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭのメチオニンをタンパク質製剤に添加する方法は、最大限でも約５％、最大限でも約４％、最大限でも約３％、最大限でも約２％、最大限でも約１％、または最大限でも約０．５％の高分子量（ＨＭＷ）種を有する製剤を生じる。
【００１６】
別の態様において、本出願は、凝集がメチオニン酸化によって引き起こされない、タンパク質製剤中のタンパク質の凝集を減少させるための方法を提供する。方法は、約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭの濃度までメチオニンを製剤に添加することを含む。方法は、メチオニンを欠くこと以外同一の製剤中の同じタンパク質と比較して、製剤中のタンパク質の凝集が減少する。ある実施形態において、メチオニンは、約０．５ｍＭ〜約５０ｍＭの間の終濃度まで、製剤に添加される。特定の実施形態において、メチオニンは、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２．５ｍＭ、５ｍＭ、７．５ｍＭ、１０ｍＭ、１２．５ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、および４５ｍＭの終濃度まで、製剤に添加される。他の実施形態において、約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭのメチオニンを製剤に添加する方法は、最大限でも約５％、最大限でも約４％、最大限でも約３％、最大限でも約２％、最大限でも約１％、または最大限でも約０．５％の高分子量（ＨＭＷ）種を有する製剤を生じる。
【００１７】
さらに別の実施形態において、界面活性物質とともに製剤化されたタンパク質の凝集を減少させるための方法が提供される。ある実施形態において、界面活性物質は、タンパク質を凝集させる。方法は、約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭの濃度までメチオニンを製剤に添加することを含む。方法は、メチオニンを欠くこと以外同一の製剤中の同じタンパク質と比較して、製剤中のタンパク質の凝集が減少する。ある実施形態において、メチオニンは、約０．５ｍＭ〜約５０ｍＭの間の終濃度まで、製剤に添加される。他の実施形態において、メチオニンは、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２．５ｍＭ、５ｍＭ、７．５ｍＭ、１０ｍＭ、１２．５ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、および４５ｍＭの終濃度まで、製剤に添加される。特定の実施形態において、約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭのメチオニンを、界面活性物質とともに製剤化された製剤に添加する方法は、最大限でも約５％、最大限でも約４％、最大限でも約３％、最大限でも約２％、最大限でも約１％、または最大限でも約０．５％の高分子量（ＨＭＷ）種を有する製剤を生じる。
【００１８】
さらなる態様において、約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭの濃度までメチオニンを製剤に添加する方法は、せん断力に供されたタンパク質の凝集を減少させる。方法は、製剤がせん断力に供される前、それと同時、またはその後に、メチオニンを添加することを含む。方法は、メチオニンを欠くこと以外同一の製剤中の同じタンパク質と比較して、製剤中のタンパク質の凝集を減少させることを生じる。ある実施形態において、メチオニンは、約０．５ｍＭ〜約５０ｍＭの間の終濃度まで、製剤に添加される。特定の実施形態において、メチオニンは、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２．５ｍＭ、５ｍＭ、７．５ｍＭ、１０ｍＭ、１２．５ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、および４５ｍＭの終濃度まで製剤に添加される。いくつかの実施形態において、せん断力は、撹拌、振とう、凍結解凍、輸送、注射器への引き込み、または精製手順によって引き起こされる。特定の実施形態において、約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭのメチオニンを、せん断力に供された製剤に添加する方法は、最大限でも約５％、最大限でも約４％、最大限でも約３％、最大限でも約２％、最大限でも約１％、または最大限でも約０．５％の高分子量（ＨＭＷ）種を有する製剤を生じる。
【００１９】
さらなる実施形態において、約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭの濃度までメチオニンを製剤に添加する方法は、光に曝露されたタンパク質の凝集を減少させる。ある実施形態において、メチオニンは、約０．５ｍＭ〜約５０ｍＭの間の終濃度まで、製剤に添加される。特定の実施形態において、メチオニンは、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２．５ｍＭ、５ｍＭ、７．５ｍＭ、１０ｍＭ、１２．５ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、および４５ｍＭの終濃度まで、製剤に添加される。いくつかの実施形態において、光は蛍光である。他の実施形態において、光は日光である。さらなる実施形態において、光はＵＶ光である。方法は、製剤が光に曝露される前、それと同時、またはその後に、メチオニンを添加することを含む。ある実施形態において、メチオニンは、光への製剤の曝露の前およびそれと同時、またはその後に添加される。約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭの濃度までメチオニンを製剤に添加する方法は、メチオニンを欠くこと以外同一の製剤中の同じタンパク質と比較して、製剤中のタンパク質の凝集を減少させることを生じる。特定の実施形態において、約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭのメチオニンを、光に曝露された製剤に添加する方法は、最大限でも約５％、最大限でも約４％、最大限でも約３％、最大限でも約２％、最大限でも約１％、または最大限でも約０．５％の高分子量（ＨＭＷ）種を有する製剤生じる。
【００２０】
別の態様において、約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭの濃度までメチオニンを製剤に添加する方法は、タンパク質製剤中のタンパク質の効力または生物活性の喪失を低下させる。この方法は、製剤中のタンパク質の凝集を減少させることを生じ、それによって、タンパク質の効力または機能的活性を維持する。ある実施形態において、メチオニンは、約０．５ｍＭ〜約５０ｍＭの間の終濃度まで、製剤に添加される。特定の実施形態において、メチオニンは、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２．５ｍＭ、５ｍＭ、７．５ｍＭ、１０ｍＭ、１２．５ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、および４５ｍＭの終濃度まで、製剤に添加される。特定の実施形態において、約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭのメチオニンを製剤に添加する方法は、最大限でも約５％、最大限でも約４％、最大限でも約３％、最大限でも約２％、最大限でも約１％、または最大限でも約０．５％の高分子量（ＨＭＷ）種を有する製剤を生じる。
【００２１】
異なる態様において、本出願は、ペプチド／ペプチド（複数）、タンパク質／タンパク質（複数）、またはペプチド／ペプチド（複数）およびタンパク質／タンパク質（複数）、ならびに約０．５ｍＭ〜約５０ｍＭメチオニンを含む、タンパク質製剤を提供する。特定の実施形態において、メチオニンは、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２．５ｍＭ、５ｍＭ、７．５ｍＭ、１０ｍＭ、１２．５ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、および４５ｍＭの終濃度まで、製剤に添加される。この態様のある実施形態において、製剤のタンパク質は、抗体、Ｉｇ融合タンパク質、凝固因子、受容体、リガンド、酵素、転写因子、またはこれらのタンパク質の生物活性断片である。特定の実施形態において、タンパク質は、抗Ｂ７．１抗体、抗Ｂ７．２抗体、抗ＣＤ２２抗体、ＰＳＧＬ−Ｉｇ融合タンパク質、活性化第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、またはこれらのタンパク質の生物活性断片である。他の実施形態において、タンパク質は、抗Ｂ７．１抗体、抗Ｂ７．２抗体、抗ＣＤ２２抗体、ＰＳＧＬ−Ｉｇ融合タンパク質、活性化第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、または第ＸＩＩＩに対する、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％のアミノ酸配列相同性を有する。いくつかの実施形態において、製剤は、バッファーを含む。特定の実施形態において、バッファーは、ヒスチジンバッファー、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、またはＴｒｉｓバッファーである。ある実施形態において、製剤は、約５．０〜約８．０のｐＨを有する。他の実施形態において、製剤は、約６．０〜約７．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、製剤は、タンパク質の凝集を減少させることができる別の作用物質を含む。製剤は、糖、界面活性物質、増量剤、凍結保護物質、安定化剤、抗酸化剤、またはこれらの組合せをさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、製剤のペプチド（複数可）／タンパク質（複数可）は、製剤中約０．１ｍｇ／ｍｌおよび約３００ｍｇ／ｍｌの濃度である。他の実施形態において、製剤のペプチド（複数可）／タンパク質（複数可）は、製剤中約０．１ｍｇ／ｍｌおよび約１０ｍｇ／ｍｌの濃度である。ある実施形態において、タンパク質は、液体、または凍結乾燥粉末として製剤化される。ある実施形態において、タンパク質製剤は、キットとして提供される。そのようなキットは、バッファー、賦形剤、およびタンパク質製剤の使用のための説明書を含んでもよい。
【００２２】
別の態様において、本出願は、本明細書中に記載されているタンパク質製剤を用いた、治療、予防、および／または診断の方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
バイオテクノロジーにおける最近の進歩によって、診断および療法における使用のための、多種多様な生物活性タンパク質製剤が提供されている。しかしながら、そのようなタンパク質製剤の開発、生成、送達、安全性、および安定性は、相当な難題をもたらす。タンパク質製剤の１つの主な課題は、それらが、可溶性または不溶性凝集物の形成の結果として、それらの生物活性を失う場合があることである。凝集は劣化したタンパク質状態であり、したがって、それを最小限にすることによって、タンパク質製剤の、増大した貯蔵寿命、効力、または活性が生じる。
【００２４】
本出願は、一般に、約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭの間の終濃度までのアミノ酸メチオニンのタンパク質製剤への添加によって、製剤中のタンパク質またはタンパク質（複数）の凝集が減少し、それによって、メチオニンなしで調製されたタンパク質製剤と比較して、製剤の貯蔵寿命が増大し、生物活性が維持されるという発見に関する。
【００２５】
タンパク質凝集に影響を及ぼす要因
タンパク質は、多種多様な医薬、バイオテクノロジー、および調査の使用を有する。これらの使用のいずれかにおける種々の段階で、タンパク質は凝集する場合がある。「凝集する」によって、可溶性であり続けるか溶液から凝結する不溶性の凝集物を形成する、共有結合性または非共有結合性二量体またはオリゴマーの形成を生じるタンパク質分子の間の物理的相互作用が意味される。用語「タンパク質」は、本明細書中で使用される場合、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、および融合タンパク質を包含する。タンパク質は、組換えまたは合成方法によって生成されてもよい。
【００２６】
多くの異なる要因が、タンパク質製剤中のタンパク質の凝集を引き起こす場合がある。典型的な精製および保存手順は、タンパク質製剤を、タンパク質を凝集させる条件および成分に曝露する場合がある。例えば、タンパク質製剤中のタンパク質は、以下のもののいずれか１つまたは複数の結果として凝集する場合がある。保存、上昇した温度への曝露、製剤のｐＨ、製剤のイオン強度、ならびにある種の界面活性物質（例えば、ポリソルベート−２０およびポリソルベート−８０）および乳化剤の存在。用語「保存の間に」は、本明細書中で使用される場合、一旦調製された製剤が、即座に使用されず、むしろその調製の後に、液体形態、凍結状態、またはその後の液体形態もしくは他の形態への復元のための乾燥形態のいずれかで、保存のために包装されることを意味する。「上昇した温度」によって、タンパク質が通常保存される温度よりも高い任意の温度が意味される。
【００２７】
同様に、タンパク質は、凍結乾燥されたタンパク質塊を溶液中で復元すること、タンパク質試料をろ過精製すること、凍結解凍、振とう、またはタンパク質溶液を注射器によって移すこと等のせん断力に曝露された場合に、凝集する場合がある。凝集はまた、保存バイアル内の溶液中および液気界面のポリペプチド分子の相互作用の結果として、起こる場合がある。輸送の間の振とうに起因する界面の圧縮または拡張の間に、構造変化が、気液および固液界面に吸着したポリペプチド中で起こる場合がある。そのような振とうは、製剤のタンパク質を凝集させ、最終的には他の吸着したタンパク質とともに沈殿させる場合がある。
【００２８】
また、光へのタンパク質製剤の曝露は、タンパク質を凝集させる場合がある。光への曝露は、凝集を容易にする反応種を生じる場合がある。いくつかの実施形態において、光は蛍光である。他の実施形態において、光は日光である。さらなる実施形態において、光はＵＶ光である。
【００２９】
さらに、タンパク質製剤の包装は、タンパク質凝集に影響を及ぼす場合がある。痕跡レベルの金属（ｐｐｍレベルの銅、鉄、コバルト、マンガン）は、容器包装から浸出して、アミド結合の加水分解を促進し、最終的にはタンパク質凝集を生じる場合がある。
【００３０】
本出願は、上述の凝集機序の１つまたは複数を制御することによってタンパク質の凝集を減少させる、方法および組成物を提供する。これは、例えば、向上した製品安定性、ならびに製造プロセスおよび保存条件におけるより大きい柔軟性を生じることができる。
【００３１】
タンパク質製剤中のタンパク質の凝集を減少させる方法
本出願は、一般に、アミノ酸メチオニンを製剤に添加することによって製剤中のタンパク質またはタンパク質（複数）の凝集を減少させることができるという発見に関する。凝集の減少は、メチオニンを欠くこと以外同一の製剤と比例する。凝集を減少させるために、メチオニンは、約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭの間の終濃度まで、製剤に添加される。本出願において使用される場合、「約」は、引用される値の±２５％の範囲を有する数値を意味する。いくつかの実施形態において、メチオニンは、約０．５ｍＭ〜約１０ｍＭの間の終濃度まで添加される。他の実施形態において、メチオニンは、約０．５ｍＭ〜約１５ｍＭの間の終濃度まで添加される。いくつかの実施形態において、メチオニンは、約２．５ｍＭ〜約１０ｍＭの間の終濃度まで添加される。いくつかの実施形態において、メチオニンは、約２．５ｍＭ〜約１５ｍＭの間の終濃度まで添加される。他の実施形態において、メチオニンは、約５ｍＭ〜約１５ｍＭの間の終濃度まで添加される。いくつかの実施形態において、メチオニンは、約５ｍＭ〜約２５ｍＭの間の終濃度まで添加される。いくつかの他の実施形態において、メチオニンは、約０．５ｍＭ〜約２５ｍＭの間の終濃度まで添加される。ある実施形態において、メチオニンは、約０．５ｍＭ〜約５０ｍＭの間の終濃度まで添加される。他の実施形態において、メチオニンは、約５０ｍＭ〜約１００ｍＭの間の終濃度まで添加される。ある他の実施形態において、メチオニンは、約１００ｍＭ〜約１４５ｍＭの間の終濃度まで添加される。さらに他の実施形態において、メチオニンは、約１００ｍＭ〜約１４０ｍＭの間の終濃度まで添加される。さらに他の実施形態において、メチオニンは、約１００ｍＭ〜約１３５ｍＭの間の終濃度まで添加される。さらなる実施形態において、メチオニンは、約１００ｍＭ〜約１２５ｍＭの間の終濃度まで添加される。他の実施形態において、メチオニンは、約５ｍＭ〜約５０ｍＭの間の終濃度まで添加される。いくつかの実施形態において、メチオニンは、約５ｍＭ〜約２５ｍＭの間の終濃度まで添加される。特定の実施形態において、メチオニンは、約０．５ｍＭ、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、約２０ｍＭ、約２１ｍＭ、約２２ｍＭ、約２３ｍＭ、約２４ｍＭ、約２５ｍＭ、約２６ｍＭ、約２７ｍＭ、約２８ｍＭ、約２９ｍＭ、約３０ｍＭ、約３１ｍＭ、約３２ｍＭ、約３３ｍＭ、約３４ｍＭ、約３５ｍＭ、約３６ｍＭ、約３７ｍＭ、約３８ｍＭ、約３９ｍＭ、約４０ｍＭ、約４１ｍＭ、約４２ｍＭ、約４３ｍＭ、約４４ｍＭ、約４５ｍＭ、約４６ｍＭ、約４７ｍＭ、約４８ｍＭ、約４９ｍＭ、または約５０ｍＭの終濃度まで、タンパク質製剤に添加される。
【００３２】
何によって製剤のタンパク質が凝集させられるかにかかわらず、メチオニンの添加によって、製剤中のタンパク質またはタンパク質（複数）の凝集が減少する。ある実施形態において、メチオニンの添加によって、保存、上昇した温度への曝露、光への曝露、せん断力への曝露、界面活性物質の存在、ｐＨおよびイオン条件、ならびにそれらの任意の組合せによって引き起こされる、製剤中の凝集が減少する。
【００３３】
上述の方法を用いて、液体または乾燥形態で製剤化されたタンパク質の凝集を低下させることができる。凝集の減少は、後の使用のためにそのままの形態で直接保存されていても、凍結状態で保存されて使用の前に解凍されても、または使用の前に液体形態もしくは他の形態への後の復元のために凍結乾燥、風乾、もしくは噴霧乾燥形態等の乾燥形態で調製されても、液体製剤中で観察される。
【００３４】
製剤中のタンパク質凝集のレベルは、製剤へのメチオニンの添加の前、実質的にそれと同時、またはその後に測定してもよい。ある実施形態において、凝集のレベルは、製剤へのメチオニンの添加の約１日〜約１２週間の間の後に少なくとも１回測定される。他の実施形態において、凝集のレベルは、製剤へのメチオニンの添加の約１カ月〜３６カ月の間の後に少なくとも１回測定される。ある実施形態において、本明細書中に記載されている方法は、メチオニンを欠く製剤と比較して、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、または約９０％の％ＨＭＷ種の減少を生じる。特定の実施形態において、約１ｍＭ〜約１４５ｍＭの間のメチオニンをタンパク質製剤に添加する方法は、最大限でも約５％、最大限でも約４％、最大限でも約３％、最大限でも約２％、最大限でも約１％、または最大限でも約０．５％のＨＭＷ種を有する製剤を生じる。他の特定の実施形態において、約１ｍＭ〜約１４５ｍＭの間のメチオニンをタンパク質製剤に添加する方法は、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％、または約０．５％のＨＭＷ種を有する製剤を生じる。他の実施形態において、約１ｍＭ〜約１４５ｍＭの間のメチオニンをタンパク質製剤に添加する方法は、約０．５％〜約５％の間のＨＭＷ種を有する製剤を生じる。
【００３５】
タンパク質製剤は、製剤のタンパク質の凝集を減少させる１つまたは複数の作用物質をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、製剤のタンパク質の凝集を減少させる作用物質は、アミノ酸である。特定の実施形態において、アミノ酸は、アルギニン、リシン、グリシン、グルタミン酸、またはアスパラギン酸である。いくつかの実施形態において、アミノ酸は、約０．５ｍＭ〜約２００ｍＭの濃度まで、タンパク質製剤に添加される。いくつかの実施形態において、アミノ酸は、約５ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度まで、タンパク質製剤に添加される。いくつかの他の実施形態において、アミノ酸は、約５ｍＭ〜約１２５ｍＭの濃度まで、タンパク質製剤に添加される。ある他の実施形態において、アミノ酸は、約０．５ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度まで、タンパク質製剤に添加される。さらに他の実施形態において、アミノ酸は、約０．５ｍＭ〜約２５ｍＭの濃度まで、タンパク質製剤に添加される。製剤のタンパク質の凝集を減少させる作用物質はまた、金属キレート剤の組合せであってもよい。特定の実施形態において、金属キレート剤は、ＤＴＰＡ、ＥＧＴＡおよびＤＥＦである。いくつかの実施形態において、タンパク質製剤中のＤＴＰＡまたはＥＧＴＡの濃度は、約１μＭ〜約１０ｍＭ、約１μＭ〜約５ｍＭ、約１０μＭ〜約１０ｍＭ、５０μＭ〜約５ｍＭ、または約７５μＭ〜約２．５ｍＭである。いくつかの実施形態において、タンパク質製剤中のＤＥＦの濃度は、約１μＭ〜約１０ｍＭ、約１μＭ〜約５ｍＭ、約１０μＭ〜約１ｍＭ、または約２０μＭ〜約２５０μＭである。製剤のタンパク質の凝集を減少させる作用物質はまた、フリーラジカルスカベンジャー、特に酸素ラジカルのスカベンジャーであってもよい。特定の実施形態において、フリーラジカルスカベンジャーは、マンニトールまたはヒスチジンである。いくつかの実施形態において、タンパク質製剤中のマンニトールの濃度は、約０．０１％〜約２５％、約０．１％〜約２５％、約０．５％〜約１５％、または約１％〜約５％である。いくつかの実施形態において、タンパク質製剤中のヒスチジンの濃度は、約１０μＭ〜約２００ｍＭ、約１００μＭ〜約２００ｍＭ、約５００μＭ〜約１００ｍＭ、または約１５ｍＭ〜約３５ｍＭである。他の実施形態において、製剤のタンパク質の凝集を減少させる作用物質は、金属キレート剤およびフリーラジカルスカベンジャーの組合せである。いくつかの実施形態において、製剤中のタンパク質またはタンパク質（複数）の凝集を減少させる作用物質は、クエン酸塩である。ある実施形態において、タンパク質製剤中のクエン酸塩の濃度は、約０．５ｍＭ〜約５０ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約２５ｍＭ、約１ｍＭ〜約３５ｍＭ、約５ｍＭ〜約２５ｍＭ、または約５ｍＭ〜約１０ｍＭである。
【００３６】
タンパク質凝集のレベルを評価するための方法
多数の異なる分析方法を用いて、タンパク質製剤中の凝集物の存在およびレベルを検出することができる。これらのものとしては、限定されないが、天然のポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、キャピラリーゲル電気泳動法（ＣＧＥ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、分析超遠心（ＡＵＣ）、場流動分画（ＦＦＦ）、光散乱検出、沈降速度、ＵＶ分光法、示差走査熱量測定法、比濁法、ネフェロメトリー、顕微鏡法、サイズ排除クロマトグラフィー−高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）、およびタンデムＲＰ−ＨＰＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳが挙げられる。これらの方法は、単独で、または組み合わせてのいずれで使用してもよい。
【００３７】
タンパク質製剤の一般的な課題は、時間、熱、またはせん断力での凝集物の不可逆的な蓄積である。典型的には、凝集物が沈殿するとき、それらは、検出するのが容易な大きな粒子を形成する。しかしながら、より小さい、非共有結合性可溶性凝集物は、しばしば、沈殿する大きな粒子の前駆体であり、検出および定量するのがより困難である。したがって、タンパク質製剤中のタンパク質凝集を検出および定量する方法は、評価される凝集物の種類に基づく必要がある。
【００３８】
上述の方法の間で、タンパク質製剤中の可溶性で共有結合性の凝集物の存在および／または量を判定する、示唆される方法は、ＳＥＣ／光散乱、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＣＧＥ、ＲＰ−ＨＰＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ、ＦＦＦおよびＡＵＣである。タンパク質製剤中の可溶性で非共有結合性の凝集物の存在および／または量を判定する、示唆される方法は、ＳＥＣ、ＰＡＧＥ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＣＧＥ、ＦＦＦ、ＡＵＣ、および動的光散乱である。タンパク質製剤中の不溶性で非共有結合性の凝集物の存在および／または量を判定する、示唆される方法は、ＵＶ分光法、比濁法、ネフェロメトリー、顕微鏡法、ＡＵＣ、および動的光散乱である。
【００３９】
タンパク質
抗体、免疫グロブリン融合タンパク質、凝固因子、受容体、リガンド、酵素、転写因子、またはそれらの生物活性断片を含む、凝集の影響を受けやすい任意のタンパク質は、本出願の方法および組成物によって保護することができる。タンパク質が得られる、または生成される、供給源または様式（例えば、適切な精製スキームによって細胞もしくは組織供給源から単離されるか、組換えＤＮＡ技術によって生成されるか、または標準的なペプチド合成技術を用いて化学的に合成されるか）は、本出願によって教示される方法に重要でない。したがって、キメラおよび／または融合タンパク質を含む、多種多様な、天然、合成、および／または組換えタンパク質は、本出願の方法および組成物によって、凝集から保護することができる。
【００４０】
製剤化される目的のタンパク質としては、限定されないが、ＰＳＧＬ−Ｉｇ、ＧＰＩｂ−Ｉｇ、ＧＰＩＩｂＩＩＩａ−Ｉｇ、ＩＬ−１３Ｒ−Ｉｇ、ＩＬ−２１Ｒ−Ｉｇ、活性化第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、組織因子、フォンウィルブランド因子、プロテインＣ等の抗凝固因子、心房性ナトリウム利尿因子、ミオスタチン／ＧＤＦ−８、インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ−１〜ＩＬ−１５、ヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモン、成長ホルモン放出因子、副甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、ウリカーゼ、ビクニン、ビリルビン酸化酵素、サブチリシン、リポタンパク質、α−１アンチトリプシン、インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、プロインスリン、卵胞刺激ホルモン、カルシトニン、黄体ホルモン、グルカゴン、肺サーファクタント、ウロキナーゼまたは組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）等のプラスミノーゲン活性化因子、ボンバジン、トロンビン、プラスミン、ミニプラスミン、マイクロプラスミン、腫瘍壊死因子−αおよび−β、エンケファリナーゼ、ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｎｏｒｍａｌｌｙ Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）、ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−α）、ヒト血清アルブミン等の血清アルブミン、ミュラー管抑制因子、リラキシンＡ鎖、リラキシンＢ鎖、プロリラキシン、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、デオキシリボヌクレアーゼ、インヒビン、アクチビン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）、ホルモンまたは増殖因子の受容体、インテグリン、プロテインＡまたはＤ、リウマトイド因子、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５、もしくは−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、もしくはＮＴ−６）等の神経栄養因子、またはＮＧＦ−β等の神経成長因子、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ａＦＧＦおよびｂＦＧＦ等の線維芽細胞増殖因子、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＴＧＦ−α、およびＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、またはＴＧＦ−β５を含むＴＧＦ−β等の、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、インスリン様増殖因子−Ｉおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ３４、およびＣＤ４５等のＣＤタンパク質、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、骨誘導因子、免疫毒素、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、インターフェロン−α、−β、および−γ等のインターフェロン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦ、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｔ細胞受容体、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４受容体等の、ＨＥＲ受容体ファミリーのメンバー、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、およびＶＣＡＭ等の細胞接着分子、ＩｇＥ、血液型抗原、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体、肥満（ＯＢ）受容体、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＨＩＶ ｇａｇ、ｅｎｖ、ｐｏｌ、ｔａｔ、またはｒｅｖタンパク質等のウイルス抗原、ホーミング受容体、アドレシン、イムノアドヘシン等のタンパク質、ならびに上記で一覧にしたポリペプチドのいずれかの生物活性断片または変異体が挙げられる。
【００４１】
用語「生物活性断片」は、それが由来するタンパク質の機能の少なくとも１つを保持するタンパク質の断片を意味する。抗体の生物活性断片としては、抗体の抗原結合断片が挙げられ、受容体の生物活性断片としては、そのリガンドに依然として結合することができる受容体の断片が挙げられ、リガンドの生物活性断片としては、その受容体に依然として結合することができるリガンドの部分が挙げられ、酵素の生物活性断片としては、全長酵素によって触媒される反応を依然として触媒することができる酵素の部分が挙げられる。ある実施形態において、生物活性断片は、それが由来するタンパク質の機能の少なくとも約２５％、５０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％を保持する。タンパク質の機能は、周知の方法（例えば、抗体抗原相互作用を試験すること、リガンド−受容体相互作用を試験すること、酵素活性を測定すること、転写活性を測定すること、またはＤＮＡ−タンパク質相互作用を測定すること）によってアッセイすることができる。
【００４２】
ある実施形態において、製剤化されるタンパク質は、抗体である。抗体は、上述のタンパク質のいずれかに対して引き起こされ、結合してもよい。ある特定の実施形態において、抗体としては、抗Ｂ７．１抗体、抗Ｂ７．２抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ミオスタチン抗体（例えば、米国出願第６０／７５２６６０号）、抗ＩＬ−１１抗体、抗ＩＬ−１２抗体（例えば、米国出願第６０／７５２６６０号）、および抗ＩＬ−１３抗体（例えば、米国出願第６０／７５２６６０号）が挙げられる。他の特定の実施形態において、抗体としては、抗Ｂ７．１抗体、抗Ｂ７．２抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ミオスタチン抗体（例えば米国出願第６０／７５２６６０号）、抗ＩＬ−１１抗体、抗ＩＬ−１２抗体（例えば、米国出願第６０／７５２６６０号）、および抗ＩＬ−１３抗体（例えば、米国出願第６０／７５２６６０号）に対する、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列相同性を有する抗体が挙げられ、それらの、それぞれの抗原に結合する能力を保持している。２つのタンパク質の間のアミノ酸配列相同性は、標準的な方法に従って測定することができる（例えば、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４〜２４４８頁、１９９８年、Ｇｅｏｒｇｅ，Ｄ．Ｇ．ら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ中、１２７〜１４９頁、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８８年、ＦｅｎｇおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ２５：３５１〜３６０頁、１９８７年、ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１〜１５３頁、１９８９年、ならびにＮＣＢＩ、ＮＬＭ、メリーランド州ベテスダの種々のＢＬＡＳＴプログラム参照）。
【００４３】
用語「抗体」は、本明細書中で使用される場合、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ポリペプチド特異性を有する抗体組成物、二重特異性抗体、ダイアボディー、または他の、抗体および組換え抗体の精製された調製物を含む。抗体は、例えば任意のアイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ等）の、全抗体、または、目的の抗原に結合する、その断片であってもよい。ある実施形態において、製剤化される抗体は、ＩｇＧアイソタイプを有する抗体である。
【００４４】
組換え抗体としては、限定されないが、ヒトおよび非ヒト部分、単鎖抗体および多特異的抗体の両方を含む、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体が挙げられる。キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するもの等の、異なる部分が異なる動物種に由来する、分子である。単鎖抗体は、抗原結合部位を有し、単一のポリペプチドからなる。多特異的抗体は、異なる抗原に特異的に結合する少なくとも２つの抗原結合部位を有する、抗体分子である。抗体は、従来の技術を用いて断片化してもよく、断片を目的の抗原に対する結合についてスクリーニングしてもよい。好ましくは、抗体断片は、インタクトな抗体の抗原結合および／または可変領域を含む。したがって、用語、抗体断片は、ある種のタンパク質に選択的に結合することができる、抗体分子の、タンパク質分解的に切断された、または組換えによって調製された部分のセグメントを含む。そのようなタンパク質分解的および／または組換え断片の非限定的な例としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、単離されたＣＤＲ、ならびにペプチドリンカーによって連結されたＶＬおよび／またはＶＨドメインを含む単鎖抗体（ｓｃＦｖ）が挙げられる。ｓｃＦｖ’は、共有結合または非共有結合によって連結されて、２つ以上の結合部位を有する抗体を形成してもよい。
【００４５】
いくつかの実施形態において、抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。用語「ヒト化モノクローナル抗体」は、本明細書中で使用される場合、同等なヒトモノクローナル抗体（ドナー）に見出されるアミノ酸残基の少なくとも１つまたは複数を含むよう改変されている、非ヒト供給源（レシピエント）由来のモノクローナル抗体である。ある実施形態において、ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する。「完全ヒト化モノクローナル抗体」は、同等なヒトモノクローナル抗体の抗原結合領域に見出されるアミノ酸残基の全てを含むよう改変されている、非ヒト供給源由来のモノクローナル抗体である。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体またはドナー抗体のいずれにも見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体機能性をさらに改良および最適化するよう行われてもよい。ヒト化抗体はまた、所望により、ヒト免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含んでもよい。
【００４６】
いくつかの実施形態において、製剤化されるタンパク質は、融合タンパク質である。一実施形態において、融合タンパク質は、免疫グロブリン（Ｉｇ）融合タンパク質である。Ｉｇ融合タンパク質は、免疫グロブリンの定常領域に由来するＩｇ部分に連結された非Ｉｇ部分を含むタンパク質である。特定の実施形態において、融合タンパク質は、ＩｇＧ重鎖定常領域を含む。別の実施形態において、融合タンパク質は、ヒト免疫グロブリンＣγ１のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域に対応するアミノ酸配列を含む。Ｉｇ融合タンパク質の非限定的な例としては、ＰＳＧＬ−Ｉｇ（米国特許第５８２７８１７号参照）、ＧＰＩｂ−Ｉｇ（国際公開第０２／０６３００３号参照）、ＧＰＩＩｂＩＩＩａ−Ｉｇ、ＩＬ−１３Ｒ−Ｉｇ（米国特許第６２６８４８０号参照）、ＴＮＦＲ−Ｉｇ（国際公開第０４／００８１００号参照）、ＩＬ−２１Ｒ−Ｉｇ、ＣＴＬＡ４−ＩｇおよびＶＣＡＭ２Ｄ−ＩｇＧが挙げられる。融合タンパク質を生成する方法は当該分野で周知である（例えば、米国特許第５５１６９６４号、第５２２５５３８号、第５４２８１３０号、第５５１４５８２号、第５７１４１４７号、第６１３６３１０号、第６８８７４７１号、および第６４８２４０９号）。いくつかの実施形態において、製剤のタンパク質としては、ＰＳＧＬ−Ｉｇ（米国特許第５８２７８１７号参照）、ＧＰＩｂ−Ｉｇ（国際公開第０２／０６３００３号参照）、ＧＰＩＩｂＩＩＩａ−Ｉｇ、ＩＬ−１３Ｒ−Ｉｇ（米国特許第６２６８４８０号参照）、ＴＮＦＲ−Ｉｇ（国際公開第０４／００８１００号参照）、ＩＬ−２１Ｒ−Ｉｇ、ＣＴＬＡ４−ＩｇおよびＶＣＡＭ２Ｄ−ＩｇＧ、に対する、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列相同性を有し、それらが、それらのそれぞれのリガンドに結合する能力を保持している、融合タンパク質が挙げられる。
【００４７】
製剤は、特定の疾患または障害の、治療、または診断の必要に応じて、１つより多いタンパク質を含んでもよい。さらなるタンパク質（複数可）は、それらは製剤中の他のタンパク質（複数可）に対する相補活性を有するので、選択され、製剤中の他のタンパク質（複数可）に有害に影響を及ぼさない。また、タンパク質製剤はまた、タンパク質製剤の最終的な有用性において有用な非タンパク質物質を含んでもよい。例えば、ショ糖を添加して、溶液中のタンパク質の安定性および可溶性を増強してもよく、ヒスチジンを添加して適切な緩衝能を提供してもよい。
【００４８】
ある実施形態において、製剤化されるタンパク質は、本質的に純粋および／または本質的に均質である（すなわち、実質的に、混入するタンパク質等を含まない）。用語「本質的に純粋な」タンパク質は、少なくとも約９０重量％のタンパク質画分、好ましくは少なくとも約９５重量％のタンパク質画分を含む組成物を意味する。用語「本質的に均質な」タンパク質は、溶液中の種々の安定化剤および水の質量を除いて、少なくとも約９９重量％のタンパク質画分を含む組成物を意味する。
【００４９】
製剤化されるタンパク質はまた、細胞毒、治療剤、または放射性金属イオンとコンジュゲートしてもよい。一実施形態において、コンジュゲートされるタンパク質は、抗体またはその断片である。細胞毒または細胞毒性物質としては、細胞にとって有害な任意の作用物質が挙げられる。非限定的な例としては、カリチアマイシン、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、およびそれらの類似体、またはホモログが挙げられる。治療剤としては、限定されないが、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、および５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）、シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシンおよびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン）、および有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられる。そのような部分をタンパク質にコンジュゲートさせる技術は、当該分野で周知である。
【００５０】
製剤
製剤の組成は、限定されないが、タンパク質（複数可）（例えば、受容体、抗体、Ｉｇ融合タンパク質、酵素等）の性質、タンパク質の濃度、所望されるｐＨ範囲、どのようにしてタンパク質製剤が保存されるか、タンパク質製剤が保存される期間、ならびにタンパク質製剤が患者に投与されるかどうか、およびどのようにして投与されるかを含む、いくつかの要因の考慮によって判定される。
【００５１】
製剤中のタンパク質の濃度
製剤中のタンパク質の濃度は、タンパク質製剤の最終的な使用による。本明細書中に記載されている製剤中のタンパク質濃度は、一般に、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約３００ｍｇ／ｍｌの間、例えば約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌの間、約５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌの間、約１０ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌの間、約２５ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌの間、約５０ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌの間、約７５ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌの間、約１００ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌの間、約１２５ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌの間、約１５０ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌの間、約２００ｍｇ／ｍｌ〜約３００ｍｇ／ｍｌの間、および約２５０ｍｇ／ｍｌ〜約３００ｍｇ／ｍｌの間である。
【００５２】
タンパク質製剤は、治療目的のために使用してもよい。したがって、製剤中のタンパク質の濃度は、患者が耐えられ、患者に治療上の価値がある投薬および容量でタンパク質を提供することに基づいて、判定される。タンパク質製剤が少容量の注射によって投与される場合、タンパク質濃度は、注射容量による（通常１．０〜１．２ｍＬ）。タンパク質ベースの療法は、通常、１週間あたり、１カ月あたり、または数カ月あたり、数ｍｇ／ｋｇの投薬を必要とする。したがって、タンパク質が２〜３ｍｇ／患者の体重のｋｇで提供され、平均患者体重が７５ｋｇである場合、１５０〜２２５ｍｇのタンパク質が１．０〜１．２ｍＬ注射容量で送達されることが必要になるか、または、容量を増大させて、より低いタンパク質濃度を提供する必要がある。
【００５３】
バッファー
用語「バッファー」は、本明細書中で使用される場合、溶液ｐＨを所望の範囲に維持する作用物質を含む。本明細書中に記載されているような製剤のｐＨは、一般に、ｐＨ約５．０〜約９．０の間、例えば、約ｐＨ５．５〜約６．５、約ｐＨ５．５〜約６．０、約ｐＨ６．０〜約６．５、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、またはｐＨ６．５である。一般に、溶液をｐＨ５．５〜６．５に維持することができるバッファーが使用される。本明細書中に記載されている製剤において使用することができるバッファーの非限定的な例としては、ヒスチジン、コハク酸塩、グルコン酸塩、ｔｒｉｓ（トロメタモール）、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＭＯＰＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＥＰＰＳ、エチレンジアミン、リン酸、マレイン酸、リン酸塩、クエン酸塩、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、およびカコジル酸塩が挙げられる。ヒスチジンは、皮下、筋肉内、または腹腔内注射によって投与される製剤において好ましいバッファーである。バッファーの濃度は、約５ｍＭ〜３０ｍＭの間である。一実施形態において、製剤のバッファーは、約５ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度のヒスチジンである。
【００５４】
賦形剤
タンパク質、メチオニン、およびバッファーに加えて、本明細書中に記載されている製剤はまた、他の物質を含んでもよい。これらの物質としては、限定されないが、凍結保護物質、溶解保護物質、界面活性物質、増量剤、抗酸化剤、および安定化剤が挙げられる。一実施形態において、本明細書中に記載されているタンパク質製剤は、凍結保護物質、溶解保護物質、界面活性物質、増量剤、抗酸化剤、安定化剤、およびそれらの組合せからなる群から選択される賦形剤を含む。
【００５５】
用語「凍結保護物質」は、本明細書中で使用される場合、タンパク質表面から選択的に排除されることによって、タンパク質に凍結誘導性ストレスに対する安定性を提供する作用物質を含む。凍結保護物質はまた、一次および二次乾燥ならびに長期間の生成物保存の間の保護を提供することができる。凍結保護物質の非限定的な例としては、ショ糖、グルコース、トレハロース、マンニトール、マンノース、およびラクトースなどの糖、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプンおよびポリエチレングリコール等のポリマー、ポリソルベート（例えば、ＰＳ−２０またはＰＳ−８０）等の界面活性物質、グリシン、アルギニン、ロイシン、およびセリン等のアミノ酸が挙げられる。生物系において低毒性を示す凍結保護物質が、一般に使用される。凍結保護物質は、製剤中に含まれる場合、約１％〜約１０％（重量／容量）の間の終濃度まで添加される。一実施形態において、凍結保護物質は、約０．５％〜約１０％（重量／容量）の間の濃度のショ糖である。
【００５６】
一実施形態において、溶解保護物質が、本明細書中に記載されている製剤に添加される。用語「溶解保護物質」は、本明細書中で使用される場合、無定形のガラス状マトリクスを提供すること、および水素結合によってタンパク質と結合して、乾燥プロセスの間に除去される水分子を置換することによって、凍結乾燥または脱水プロセス（一次および二次凍結乾燥サイクル）の間にタンパク質に安定性を提供する作用物質を含む。これは、タンパク質構造を維持すること、凍結乾燥サイクルの間にタンパク質分解を最小限にすること、および長期間の生成物安定性を向上させることを助ける。溶解保護物質の非限定的な例としては、ショ糖またはトレハロース等の糖、グルタミン酸１ナトリウム、非結晶性グリシンまたはヒスチジン等のアミノ酸、ベタイン等のメチルアミン、硫酸マグネシウム等のリオトロピック塩、三価以上の糖アルコール等のポリオール、例えばグリセリン、エリスリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、およびマンニトール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、プルロニック、ならびにそれらの組合せが挙げられる。製剤に添加される溶解保護物質の量は、一般に、タンパク質製剤が凍結乾燥された場合に、許容されない量の、タンパク質の分解／凝集をもたらさない、量である。溶解保護物質が糖（ショ糖またはトレハロース等）であり、タンパク質が抗体である場合、タンパク質製剤中の溶解保護物質濃度の非限定的な例は、約１０ｍＭ〜約４００ｍＭ、好ましくは約３０ｍＭ〜約３００ｍＭ、最も好ましくは約５０ｍＭ〜約１００ｍＭである。
【００５７】
ある実施形態において、界面活性物質が、製剤中に含まれてもよい。用語「界面活性物質」は、本明細書中で使用される場合、気液界面での吸着によって液体の表面張力を減少させる作用物質を含む。界面活性物質の例としては、限定されないが、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０またはポリソルベート２０）等の非イオン性界面活性物質、ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸ナトリウム、オクチルグリコシドナトリウム、ラウリル−スルホベタイン、ミリスチル−スルホベタイン、リノレイル−スルホベタイン、ステアリル−スルホベタイン、ラウリル−サルコシン、ミリスチル−サルコシン、リノレイル−サルコシン、ステアリル−サルコシン、リノレイル−ベタイン、ミリスチル−ベタイン、セチル−ベタイン、ラウロアミドプロピル−ベタイン、コカミドプロピル−ベタイン、リノールアミドプロピル−ベタイン、ミリスタミドプロピル−ベタイン、パルミドプロピル−ベタイン、イソステアラミドプロピル−ベタイン（例えば、ラウロアミドプロピル）、ミリスタミドプロピル−、パルミドプロピル−、またはイソステアラミドプロピル−ジメチルアミン、メチルココイルタウリンナトリウムまたはメチルオレイルタウレート二ナトリウム、およびＭｏｎａｑｕａｔ（商標）シリーズ（Ｍｏｎａ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ニュージャージー州パターソン）、ポリエチルグリコール、ポリプロピルグリコール、ならびにエチレンおよびプロピレングリコールのコポリマー（例えば、プルロニック、ＰＦ６８）が挙げられる。添加される界面活性物質の量は、例えばＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いてアッセイしてＨＭＷ種またはＬＭＷ種のパーセンテージを判定すると、復元されたタンパク質の凝集を許容され得るレベルに維持し、本明細書中に記載されているタンパク質製剤の凍結乾燥物の復元の後の微粒子の形成を最小限にするものである。例えば、界面活性物質は、約０．００１〜約０．５％、例えば約０．０５〜約０．３％の量で、製剤（液体、または凍結乾燥物の復元の前に）中に存在してもよい。
【００５８】
いくつかの実施形態において、増量剤が製剤中に含まれる。用語「増量剤」は、本明細書中で使用される場合、医薬生成物と直接相互作用することなしに凍結乾燥生成物の構造を提供する作用物質を含む。薬学的に洗練された塊を提供することに加えて、増量剤はまた、崩壊温度を改変すること、凍結解凍保護を提供すること、および長期間の保存にわたるタンパク質安定性を増強することに関して、有用な質を与えることができる。増量剤の非限定的な例としては、マンニトール、グリシン、ラクトース、およびショ糖が挙げられる。増量剤は、結晶性（グリシン、マンニトール、または塩化ナトリウム等）または無定形（デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン等）であってもよく、一般に、０．５％〜１０％の量で、タンパク質製剤中で使用される。
【００５９】
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０年）に記載されているもの等の、他の薬学的に許容され得る支持体、賦形剤、または安定化剤もまた、それらが製剤の所望の特徴に有害に影響を及ぼさなければ、本明細書中に記載されているタンパク質製剤中に含まれてもよい。本明細書中で使用される場合、「薬学的に許容され得る支持体」は、医薬投与に適合する、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤を意味する。薬学的に活性のある物質のためのそのような媒体および作用物質の使用は、当該分野で周知である。許容され得る支持体、賦形剤、または安定化剤は、採用される投薬量および濃度で受容者にとって無毒であり、さらなる緩衝剤、保存剤、共溶媒、アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤、ＥＤＴＡ等のキレート剤、金属錯体（例えば、Ｚｎタンパク質錯体）、ポリエステル等の生分解性ポリマー、ナトリウム、多価糖アルコール等の塩形成対イオン、アラニン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リシン、オルニチン、ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、およびスレオニン等のアミノ酸、ラクチトール、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、リビトール、ミオイニシトース、ミオイニシトール、ガラクトース、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール（例えば、イノシトール）、ポリエチレングリコール等の、有機糖または糖アルコール、尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロール、およびチオ硫酸ナトリウム等の硫黄含有還元剤、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、または他の免疫グロブリン等の低分子量タンパク質、ならびにポリビニルピロリドン等の親水性ポリマーが挙げられる。
【００６０】
保存方法
本明細書中に記載されているタンパク質製剤は、当業者に公知の任意の方法によって保存してもよい。非限定的な例としては、タンパク質製剤を、凍結、凍結乾燥、および噴霧乾燥することが挙げられる。
【００６１】
いくつかの場合において、タンパク質製剤は、保存のために凍結される。したがって、凍結解凍サイクルを含むそのような条件下で、製剤が比較的安定であることが望ましい。製剤の適合性を判定する１つの方法は、試料製剤を、少なくとも２回、例えば３〜１０回の凍結（例えば−２０℃または−８０℃）および解凍（例えば、室温での速い解凍または氷上での遅い解凍）のサイクルに供し、凍結解凍サイクルの後に蓄積する低分子量（ＬＭＷ）種および／またはＨＭＷ種の量を判定し、それを凍結解凍手順の前に試料中に存在するＬＭＷ種またはＨＭＷ種の量と比較することである。ＬＭＷまたはＨＭＷ種の増大は、製剤の一部として保存されたタンパク質の安定性の低下を示す。サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）を用いて、ＬＭＷおよびＨＭＷ種の存在を判定することができる。
【００６２】
いくつかの場合において、タンパク質製剤は、液体として保存してもよい。したがって、種々の温度を含むそのような条件下で、液体製剤が比較的安定であることが望ましい。製剤の安定性を判定する１つの方法は、試料製剤をいくつかの温度（２〜８、１５、２０、２５、３０、３５、４０、および５０℃等）で保存し、経時的に蓄積するＨＭＷおよび／またはＬＭＷ種の量をモニタリングすることである。経時的に蓄積するＨＭＷおよび／またはＬＭＷ種の量が少ないほど、製剤の保存条件はよりよい。したがって、タンパク質の電荷プロフィールを、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ）によってモニタリングしてもよい。
【００６３】
あるいは、製剤は、凍結乾燥の後に保存してもよい。用語「凍結乾燥」は、本明細書中で使用される場合、乾燥される物質をまず凍結させ、その後に真空環境での昇華による氷または凍結した溶媒の除去が続くプロセスをいう。保存の際に凍結乾燥生成物の安定性を増強するように、賦形剤（例えば、溶解保護物質）が、凍結乾燥される製剤中に含まれてもよい。用語「復元された製剤」は、本明細書中で使用される場合、タンパク質が希釈液中で分散するように凍結乾燥タンパク質製剤を希釈液中に溶解させることによって調製された製剤をいう。用語「希釈液」は、本明細書中で使用される場合、薬学的に許容され得る物質（ヒトへの投与のために安全で無毒）であり、凍結乾燥の後に復元された製剤等の液体製剤の調製に有用である。希釈液の非限定的な例としては、滅菌水、注射のための静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、無菌生理食塩溶液、リンガー液、デキストロース溶液、または塩および／もしくはバッファーの水溶液が挙げられる。
【００６４】
凍結乾燥の後に製剤のタンパク質成分の安定性について製剤を試験することは、製剤の適合性を判定するために有用である。方法は、試料製剤が凍結される代わりに凍結乾燥され、希釈液を用いて復元されること以外、凍結について上述されたものと同様であり、復元された製剤がＬＭＷ種および／またはＨＭＷ種の存在について試験される。凍結乾燥されていない対応する試料製剤と比較した、凍結乾燥試料中のＬＭＷまたはＨＭＷ種の増大は、凍結乾燥試料における安定性の低下を示す。
【００６５】
いくつかの場合において、製剤は、噴霧乾燥され、次いで保存される。噴霧乾燥のために、液体製剤は、乾燥ガス流の存在下でエアロゾル化される。製剤液滴からガス流に水が除去され、薬物製剤の乾燥粒子を生じる。（ｉ）噴霧乾燥脱水の間にタンパク質を保護するため、（ｉｉ）噴霧乾燥の後の保存の間にタンパク質を保護するため、および／または（ｉｉｉ）エアロゾル化に適した溶液特性を与えるために、賦形剤が製剤中に含まれてもよい。方法は、試料製剤が凍結される代わりに噴霧乾燥され、希釈液で復元される以外、凍結について上述されたものと同様であり、復元された製剤が、ＬＭＷ種および／またはＨＭＷ種の存在について試験される。凍結されていない対応する試料製剤と比較した、噴霧乾燥試料におけるＬＭＷまたはＨＭＷ種の増大は、噴霧乾燥試料における安定性の低下を示す。
【００６６】
治療の方法
本明細書中に記載されている製剤は、それを必要とする患者における疾患または障害の治療および／または予防における医薬組成物として有用である。用語「治療」は、治療的処置および予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または防止（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段の両方をいう。治療は、疾患、疾患の症状、または疾患に対する素因に治癒（ｃｕｒｅ、ｈｅａｌ）、改善、軽減、変化、治療、寛解、改良する、または影響を及ぼす目的で、疾患／障害、疾患／障害の症状、疾患／障害に対する素因を有する患者由来の体、単離された組織、または細胞への、タンパク質製剤の適用または投与を含む。「治療を必要とする」ものは、すでに障害を有するもの、ならびに障害が予防されるべきものを含む。用語「障害」は、本明細書中に記載されているタンパク質製剤での治療の利益を受ける任意の状態である。これは、哺乳動物を問題になっている障害にかかりやすくする病的状態を含む、慢性および急性障害または疾患を含む。本明細書中で治療される障害の非限定的な例としては、出血性障害、血栓症、白血病、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、自己免疫障害、血液凝固障害、血友病、移植片拒絶、炎症性障害、心疾患、筋消耗障害、アレルギー、癌、筋ジストロフィー、筋肉減少症、悪液質、ＩＩ型糖尿病、関節リウマチ、クローン病、乾癬、乾癬性関節炎、喘息、皮膚炎、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患、好酸球増加症、線維症、および過剰な粘液産生が挙げられる。
【００６７】
投与
本明細書中に記載されているタンパク質製剤は、適した様式、例えば皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、病巣内もしくは関節内経路による注射もしく輸液での、単回もしくは複数ボーラスまたは長期間にわたる輸液、局所投与、経粘膜、経皮直腸、吸入、または徐放もしくは持続放出手段による等の当業者に公知の方法を用いて、治療を必要とする被験体に投与することができる。タンパク質製剤が凍結乾燥されている場合、凍結乾燥された物質は、投与の前に、まず適切な液体中で復元される。凍結乾燥された物質は、例えば、注射のための静菌水（ＢＷＦＩ）、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、または凍結乾燥の前にタンパク質があった同じ製剤中で、復元してもよい。
【００６８】
非経口組成物は、投与の簡便性および投薬量の均一性のために、投薬単位形態で調製してもよい。「投薬単位形態」は、本明細書中で使用される場合、治療される被験体のための単位投薬として適した物理的に別々の単位をいい、各単位は、選択された薬学的支持体と関連して所望の治療効果を生じるよう計算された、予め決定された量の活性化合物を含む。
【００６９】
定量吸入器等の吸入方法の場合、装置は、適切な量の製剤を送達するよう設計される。吸入による投与のために、化合物は、適した噴霧剤、例えば二酸化炭素等の気体を含む加圧された容器もしくはディスペンサー、または噴霧器からの、エアロゾルスプレーの形態で送達される。あるいは、吸入される剤形は、ドライパウダー吸入器を用いて乾燥粉末として提供してもよい。
【００７０】
タンパク質製剤はまた、例えばコアセルベーション技術または界面重合によって調製されるマイクロカプセル、例えばコロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、およびナノカプセル）中またはマクロエマルション中で、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に封入してもよい。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ第１８版に開示されている。
【００７１】
本明細書中に記載されているタンパク質製剤の持続放出調製物もまた、調製してもよい。持続放出調製物の適した例としては、タンパク質製剤を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスが挙げられる。持続放出マトリクスの例としては、ポリエステル、ハイドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。本明細書中に記載されているタンパク質の持続放出製剤は、その生体適合性および広範な生分解性特性のために、ポリ乳酸−コグリコール酸（ＰＬＧＡ）ポリマーを用いて開発することができる。ＰＬＧＡの分解生成物である乳酸およびグリコール酸は、人体内で迅速に除去することができる。さらに、このポリマーの分解性は、その分子量および組成によって、数カ月〜数年に調節することができる。リポソーム組成物を用いて、本明細書中に記載されているタンパク質または抗体を製剤化することもできる。
【００７２】
投薬
製剤の毒性および治療有効性は、例えばＬＤ５０（集団の５０％にとって致死の用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）を判定するために、例えば細胞培養物または実験動物を用いて、当該分野で公知の薬学的手順によって判定することができる。毒性と治療効果との間の用量比は治療指数であり、これは、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。
【００７３】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータを、ヒトにおける使用のための様々な投薬量の製剤化において使用することができる。そのような製剤の投薬量は、一般に、毒性がほとんどないか、または毒性がないＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内にある。投薬量は、採用される剤形および利用される投与の経路によって、この範囲内で変化してもよい。本発明の方法において使用される任意の製剤について、治療有効用量は、最初に、細胞培養アッセイから評価される。用量を、動物モデルにおいて製剤化して、細胞培養物中で判定するとＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半分が達成される試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成してもよい。そのような情報を用いて、ヒトにおける有用な用量を、より正確に判定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって、測定してもよい。
【００７４】
製剤のタンパク質の適切な投薬量は、治療される疾患の型、疾患の重症度および経過、作用物質が予防目的で投与されるのか治療目的で投与されるのか、以前の療法、患者の病歴および作用物質への応答、ならびに主治医の裁量による。製剤は、一般に、投薬量が約０．１ｍｇタンパク質／体重のｋｇ〜１００ｍｇタンパク質／体重のｋｇの間であるように送達される。
【００７５】
製剤がｉｎ ｖｉｖｏ投与のために使用されるために、それらは無菌でなければならない。製剤は、液体の製剤化または凍結乾燥および復元の前、または後に、無菌ろ過膜によるろ過によって無菌にしてもよい。本明細書中の治療組成物は、一般に、無菌の投与口を有する容器、例えば静脈内溶液バッグ、または皮下注射針によって穴を開けることができる栓を有するバイアルに入れる。
【００７６】
製造品
別の実施形態において、本明細書中に記載されている製剤を含み、好ましくはその使用のための説明書を提供する、製造品が提供される。製造品は、製剤を含むのに適した容器を含む。適した容器としては、限定されないが、瓶、バイアル（例えば、デュアルチャンバーバイアル）、注射器（例えば、シングルまたはデュアルチャンバー注射器）、試験管、噴霧器、吸入器（例えば、定量吸入器またはドライパウダー吸入器）、またはデポーが挙げられる。容器は、ガラス、金属またはプラスチック（例えば、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリプロピレン）等の種々の物質から形成してもよい。容器は製剤を保持し、容器上または容器と関連したラベルは、復元および／または使用のための使用法を示す。ラベルは、製剤が皮下投与に有用または意図されることをさらに示してもよい。製剤を保持している容器は、製剤の繰り返し投与（例えば、２〜６回の投与）を可能にするマルチユースバイアルであってもよい。製造品は、適した希釈液（例えば、ＷＦＩ、０．９％ ＮａＣｌ、ＢＷＦＩ、リン酸緩衝生理食塩水）を含む第二の容器をさらに含んでもよい。製造品が、凍結乾燥された種類のタンパク質製剤を含む場合、希釈液を凍結乾燥製剤と混合することによって、一般に少なくとも２０ｍｇ／ｍｌの、復元された製剤中の最終タンパク質濃度が提供される。製造品は、他のバッファー、希釈液、フィルター、針、注射器、および使用のための説明書を有する添付文書を含む、商業的および使用者の観点から望ましい他の物質をさらに含んでもよい。
【００７７】
本出願において参照された全ての雑誌記事、特許、特許出願、および他の刊行物は、それらの全体が、参照によって援用される。本出願の内容と参照によって援用されるもののいずれかとの間に何らかの不一致がある場合、本出願が適用されると理解されるべきである。
【００７８】
本発明は、以下の実施例の参照によって、より完全に理解される。しかしながら、これらは、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【００７９】
実施例１
上昇した温度での保存に供された抗Ｂ７．２抗体製剤におけるタンパク質凝集に対するメチオニンの効果
この実施例は、メチオニンがタンパク質製剤中のタンパク質の凝集を減少させることができるかどうかを説明する。具体的には、下記の実験は、４０℃での保存に供された抗Ｂ７．２抗体製剤中の抗Ｂ７．２抗体（ＩｇＧ２、κ軽鎖、図９参照）の凝集に対するメチオニンの効果を試験することを対象とする。Ｂ７．２は、Ｂ細胞上で発現される共刺激リガンドであり、Ｔ細胞表面分子、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４と相互作用することができる。
【００８０】
種々のｐＨレベルで液体として製剤化された抗Ｂ７．２抗体の凝集に対する、メチオニンを添加することの効果を、１２週間の期間にわたって調査し、この間、製剤は４０℃で保存した。抗Ｂ７．２抗体を、１０ｍＭメチオニンおよび０．０１％ポリソルベート−８０の存在下および非存在下で、種々のｐＨレベルで、１ｍｇ／ｍｌで製剤化した。最初、６週間後、および１２週間後に、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによってこれらの時点での製剤中の高分子量（％ＨＭＷ）種のパーセンテージを測定することによって、凝集レベルを測定した。％ＨＭＷの増大は、凝集の指標である。
【００８１】
各製剤の最初の％ＨＭＷレベルは、およそ同じ（約１〜２％、図１ａ参照）であった。しかしながら、４０℃での６週間および１２週間の保存の後、メチオニンを欠く製剤中、特にポリソルベート−８０を含んでメチオニンを欠き、６．０〜６．６の範囲のｐＨレベルで調製された試料中で、％ＨＭＷは増大した（図１ｂおよび１ｃ参照）。製剤中のメチオニンの存在によって、ポリソルベート−８０のない試料中で、％ＨＭＷが最初のレベルの近くで維持された。メチオニンを含むがポリソルベート−８０を欠く試料と比較して、ポリソルベート−８０およびメチオニンの両方を含む試料中でタンパク質凝集の増大があったが、タンパク質凝集のレベルは、ポリソルベート−８０を含むがメチオニンを欠く試料中よりも有意に低かった（図１ｂおよび１ｃ参照）。
【００８２】
要約すると、これらの実験から、メチオニンによって、ポリソルベート−８０の存在下および非存在下の両方で、上昇した温度に供された製剤中の抗Ｂ７．２抗体の凝集が減少したことが示される。
【００８３】
実施例２
上昇した温度に供された抗Ｂ７．１抗体製剤におけるタンパク質凝集に対するメチオニンの効果
この実施例は、メチオニンがタンパク質製剤中のタンパク質の凝集を減少させることができるかどうかをさらに説明する。下記の実験は、４０℃での保存に供された抗Ｂ７．１抗体製剤中の抗Ｂ７．１抗体（ＩｇＧ２、κ軽鎖、図８参照）の凝集に対するメチオニンの効果を試験することを対象とする。Ｂ７．１は、Ｂ細胞上で発現される共刺激リガンドであり、Ｔ細胞表面分子、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４と相互作用することができる。
【００８４】
種々のｐＨレベルで液体として製剤化された抗Ｂ７．１抗体の凝集に対する、メチオニンを添加することの効果を、１２週間の期間にわたって調査し、この間、製剤は４０℃で保存した。抗Ｂ７．１抗体を、１０ｍＭメチオニンおよび０．０１％ポリソルベート−８０の存在下および非存在下で、種々のｐＨレベルで、１ｍｇ／ｍｌで製剤化した。最初、および１２週間後に、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによってこれらの時点での製剤中の高分子量（％ＨＭＷ）種のパーセンテージを測定することによって、凝集レベルを測定した。
【００８５】
各製剤の最初の％ＨＭＷレベルは、およそ同じ（約１％、図２ａ参照）であった。ポリソルベート−８０の存在下でメチオニンを欠く、４０℃で１２週間の抗Ｂ７．１抗体製剤の保存は、クエン酸およびコハク酸バッファー中４．７〜６．３のｐＨ範囲で％ＨＭＷの小さな増大を生じた（図２ｂ参照）。％ＨＭＷの、より有意な増大は、ヒスチジンバッファー中６〜６．６のｐＨ範囲で生じた（図２ｂ参照）。タンパク質製剤へのメチオニンの添加によって、％ＨＭＷレベルが低下した。これは、ヒスチジンバッファーおよびポリソルベート−８０中で製剤化された抗Ｂ７．１抗体の場合に最も明確に見られ、メチオニンによって、％ＨＭＷレベルが、４０℃で１２週間の後、最少の１．２％に維持された。
【００８６】
要約すると、これらの実験から、メチオニンによって、ポリソルベート−８０の存在下および非存在下の両方で、４０℃で保存された製剤中の抗Ｂ７．１抗体の凝集が減少したことが示される。
【００８７】
実施例３
長期間の保存に供された抗ＣＤ２２抗体製剤におけるタンパク質凝集に対するメチオニンの効果
この実験は、抗ＣＤ２２抗体製剤中のタンパク質凝集に対する、メチオニンを添加することの効果を試験することを対象とする（図１０参照）。ＣＤ２２は、２−６−連結シアル酸残基を含むオリゴ糖に結合し、分化の後期の間にＢ細胞の表面で発現される、１３５ｋＤのＢ細胞制限シアロ糖タンパク質である。これは、Ｂ細胞活性化において役割を果たし、接着分子として作用するようである。ＣＤ２２および抗ＣＤ２２は、白血病、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、およびある種の自己免疫状態の治療において有用であると考えられている。
【００８８】
２５〜２６ｍｇ／ｍｌの抗ＣＤ２２（ＩｇＧ４、κ軽鎖）を、１０ｍＭコハク酸バッファー、ｐＨ６中で液体として製剤化した。これらの製剤はまた、１０ｍＭメチオニンおよび０．０１％ポリソルベート−８０の一方または両方のいずれかを含んでいた。得られた抗ＣＤ２２製剤を、２５℃および−８０℃で、１カ月〜３６カ月の間保存し、製剤中の％ＨＭＷレベルをＳＥＣ−ＨＰＬＣによって評価した。
【００８９】
−８０℃で保存された全ての製剤の％ＨＭＷレベルは、およそ同じ（約０．５％）であった（図３ａ参照）。対照的に、２５℃で長期の保存は、％ＨＭＷレベルの増大を生じた（図３ｂ参照）。この増大は、メチオニンが製剤中に存在する場合、実質的に低下した。注目すべきことに、ポリソルベート−８０およびメチオニンとともに製剤化された抗ＣＤ２２製剤は、メチオニンを含むがポリソルベート−８０を欠いて製剤化された試料とおよそ同じ％ＨＭＷ種を生じた。
【００９０】
これらのデータから、メチオニンによって、ポリソルベート−８０の存在下または非存在下の両方で、長期間の保存における抗ＣＤ２２抗体製剤のタンパク質凝集が低下することが示される。
【００９１】
実施例４
高温での保存に供されたＰＳＧＬ−Ｉｇ製剤におけるタンパク質凝集に対するメチオニンの効果
この実施例は、メチオニンがタンパク質、特に融合タンパク質における凝集を防ぐことができるかどうかの別の説明を提供する。この実験は、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１−免疫グロブリン（ＰＳＧＬ−Ｉｇ）融合タンパク質製剤におけるタンパク質凝集に対する、メチオニンを添加することの効果を試験することを対象とした。ＰＳＧＬ−１は、全ての白血球上で構成的に発現される、２つの１２０ｋＤａのポリペプチド鎖からなる２４０ｋＤａのホモ二量体である。ＰＳＧＬ−１は、微柔毛の先端上で主に見出される。ＰＳＧＬ−１は、適切な糖で装飾された場合、内皮上でＰ−セレクチンに結合することができる。
【００９２】
融合タンパク質Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−Ｉｇ（ＰＳＧＬ−Ｉｇ）の凝集に対するメチオニンの効果を、種々の温度で調査した。ＰＳＧＬ−Ｉｇを、１０ｍＭメチオニンの存在下および非存在下で、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％ポリソルベート−８０、ｐＨ７．５中で液体製剤として製剤化した。試料を、−８０℃、２５℃、および４０℃で保存し、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって、４週間の期間にわたって％ＨＭＷについて評価した。
【００９３】
全ての試料中の最初の％ＨＭＷレベルは同様であり、メチオニンの存在または非存在にかかわらず、−８０℃で保存された試料中で変化しないままであった（図４参照）。２５℃および４０℃での保存は、経時的に増大した凝集を生じた。しかしながら、その凝集は、メチオニンとともに製剤化された試料中で減少した。
【００９４】
実施例５
せん断力に供されたＰＳＧＬ−Ｉｇ製剤におけるタンパク質凝集に対するメチオニンの効果
この実施例は、メチオニンによって、せん断力に供されたタンパク質の凝集が減少することを説明する。
【００９５】
ＰＳＧＬ−Ｉｇ融合タンパク質を、１０ｍＭメチオニンの存在下および非存在下で、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％ポリソルベート−８０、ｐＨ７．５中で液体として製剤化した。得られた製剤を、振とうせずにおくか、または２５０ｒｐｍで９６時間の振とうに供した。
【００９６】
メチオニンを含むか、または欠いている、振とうされていない試料は、非常に類似した％ＨＭＷレベル（０．６および０．７％）を有した（図５参照）。対照的に、メチオニンを欠く、振とうされた試料は、上昇した％ＨＭＷを含んでいた（４．２％および４．４％）。振とうに供された製剤へのメチオニンの添加によって、１．０および２．２％への％ＨＭＷレベルの低下が生じた。
【００９７】
これらのデータから、メチオニンによって、せん断力に供されたタンパク質の凝集が減少することが示される。
【００９８】
実施例６
暗所中で保存されたＲＥＦＡＣＴＯ（商標）タンパク質製剤のタンパク質凝集に対するメチオニンの効果
この実験は、メチオニンがタンパク質における、具体的には組換えタンパク質における凝集を防ぐことができるかどうかのさらに別の実施例を提供する。さらに説明するために、第ＶＩＩＩ因子欠損を矯正するために使用される組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質であるＲＥＦＡＣＴＯ（商標）（図１１参照）をこの実験において使用した。
【００９９】
ＲＥＦＡＣＴＯ（商標）の安定性に対するメチオニンの効果を、１カ月の安定性試験にわたって調査した。ＲＥＦＡＣＴＯ（商標）を、２０ｍＭヒスチジンバッファー中約２５０ＩＵ／ｍｌで、液体として製剤化した。これらの製剤のいくつかはまた、１０ｍＭメチオニンおよび１０ｍＭクエン酸塩を含んでいた。製剤の全ては、４ｍＭ塩化カルシウムおよび３１０ｍＭ塩化ナトリウム、および０．０２％ Ｔｗｅｅｎ−８０を含んでいた。製剤のｐＨは６．５であった。試料を室温で暗所中に、およそ１カ月間保存した。上述のように対照試料を製剤化し、−８０℃で保存した。凝集物形成をＳＥＣ−ＨＰＬＣによって評価した。
【０１００】
対照試料において、メチオニンおよびクエン酸塩の存在にかかわらず、％ＨＭＷレベルは同じのままであった（表１参照）。メチオニンおよびクエン酸塩のないヒスチジンバッファー製剤において、％ＨＭＷは、暗所中で１カ月間の保存の後に２６〜２７％であり、高レベルの凝集が示された。しかしながら、メチオニンおよびクエン酸塩を含むヒスチジンバッファー製剤において、凝集は、７〜８％のみの％ＨＭＷで、同じ期間にわたって減少した。
【０１０１】
【表１】
【０１０２】
実施例７
蛍光下で保存されたＲＥＦＡＣＴＯ（商標）タンパク質製剤のタンパク質凝集に対するメチオニンの効果
この一連の実験において、蛍光に曝露されたＲＥＦＡＣＴＯ（商標）の断片化に対するメチオニンの効果を、１カ月の期間にわたって調査した。
【０１０３】
ＲＥＦＡＣＴＯ（商標）を、２０ｍＭヒスチジンまたは２０ｍＭコハク酸塩バッファー中約２５０ＩＵ／ｍｌで、液体として製剤化した。これらの製剤のいくつかはまた、１０ｍＭメチオニンおよび１０ｍＭクエン酸塩を含んでいた。製剤の全ては、４ｍＭ塩化カルシウムおよび３１０ｍＭ塩化ナトリウム、および０．０２％ Ｔｗｅｅｎ−８０を含んでいた。製剤のｐＨは６．５であった。試料を、蛍光下、室温でおよそ１カ月間保存し、凝集物形成をＳＥＣ−ＨＰＬＣによって評価した。対照試料を上述のように製剤化し、−８０℃で保存した。
【０１０４】
対照試料において、メチオニンおよびクエン酸塩の存在にかかわらず、％ＨＭＷレベルは０％ＨＭＷで変化しないままであった（表２参照）。メチオニンおよびクエン酸塩のないＵＳＰグレードヒスチジン緩衝製剤において、蛍光下で１カ月の保存の後、％ＨＭＷは２１％であり、高レベルの凝集が示された。しかしながら、メチオニンおよびクエン酸塩を含むＵＳＰグレードヒスチジン緩衝製剤において、凝集は、約２％のみの％ＨＭＷで、同じ期間にわたって減少した（表３参照）。
【０１０５】
同様に、メチオニンおよびクエン酸塩を欠くコハク酸塩緩衝製剤において、％ＨＭＷは２５％であったが、メチオニンおよびクエン酸塩を含むコハク酸塩緩衝製剤は、９％ＨＭＷしか有さなかった（表３参照）。
【０１０６】
したがって、メチオニンおよびクエン酸塩によって、メチオニンおよびクエン酸塩なしで製剤化されたＲＥＦＡＣＴＯ（商標）と比較して、ヒスチジンまたはコハク酸バッファー中で製剤化され、蛍光下で保存されたＲＥＦＡＣＴＯ（商標）の凝集が低下した。
【０１０７】
【表２】
【０１０８】
【表３】
【０１０９】
実施例８
ＲＥＦＡＣＴＯ（商標）の効力に対するメチオニンの効果
暗所中に維持されたか蛍光に曝露されたかのいずれかのＲＥＦＡＣＴＯ（商標）の効力に対するメチオニンの効果を、１カ月の期間にわたって調査した。ＲＥＦＡＣＴＯ（商標）を、２０ｍＭヒスチジンまたは２０ｍＭコハク酸塩バッファー中約２５０ＩＵ／ｍｌで、液体として製剤化した。これらの製剤のいくつかはまた、１０ｍＭメチオニンまたは１０ｍＭクエン酸塩を含んでいた。試料を蛍光または暗所状態に、室温で１カ月間曝露した。
【０１１０】
ＲＥＦＡＣＴＯ（商標）は、蛍光に曝露されたいずれかの試料において、室温で１カ月間の保存の後、メチオニンおよびクエン酸塩なしで製剤化された緩衝溶液において、効力の大きな喪失を被った（図６参照）。メチオニンの存在下、暗所中で保存されたＲＥＦＡＣＴＯ（商標）は、効力に対する有害な影響を被らなかったが、メチオニンの存在下で、蛍光下で保存されたＲＥＦＡＣＴＯ（商標）は、効力のいくらかの喪失を被ったが、効力の完全な喪失を生じたメチオニンを欠いて保存された試料よりも高い効力を依然として保持していた。
【０１１１】
実施例９
酸化によってｒｈＩＬ−１１の多量体化が低下する
この実験は、ＩＬ−１１多量体化に対するメチオニン添加の効果を試験することを対象とした。
【０１１２】
４００個のバイアルに０．１ｍｇ／ｍｌで組換えヒトＩＬ−１１（ｒｈＩＬ−１１）薬物物質（５ｍｌ管系バイアルを充填する１．０ｍｌ）を手作業で充填し、ｒｈＩＬ−１１のための標準的な凍結乾燥サイクルを用いて凍結乾燥した。２００個のバイアルは、１０ｍＭ ＮａＰＯ４、３００ｍＭグリシン、ｐＨ７．０とともに製剤化されたｒｈＩＬ−１１を含み、残りは１０ｍＭ ＮａＰＯ４、３００ｍＭグリシン、１０ｍＭメチオニン、ｐＨ７．０とともに製剤化した。４つの異なる１３ｍｍ栓を容器閉鎖として使用した。各型の栓を１００個のバイアル上で使用した。栓をすすぎ、煮沸し、次いでオートクレーブした。次いで、栓の半分を１００℃で１６時間乾燥させた。バイアルを、４℃、４０℃、および５０℃で２週間および４週間の、短期間の促進された安定性に置いた。バイアルをＴ＝０ならびに２週間および４週間に、Ｍｅｔ５８酸化および多量体形成についてアッセイした。ＲＰ−ＨＰＬＣ（低負荷）を用いてｒｈＩＬ−１１中のＭｅｔ５８の酸化度を判定したが、ＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いてｒｈＩＬ−１１多量体の発生をモニタリングした。
【０１１３】
最初のプロットを構築して、酸化と多量体化との間の任意の直接相関について試験した（図７参照）。これらのデータから、酸化のレベルが高い場合、多量体レベルが低く、酸化のレベルが低い場合、多量体レベルが高いことが示された。
【０１１４】
これらのデータから、ｒｈＩＬ−１１の酸化および多量体化が反対の環境下で生じるようであることが示される。パラメーターを最適化してｒｈＩＬ−１１の酸化を最小限にする場合、多量体化は増大する。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１Ａ】図１Ａは、示されたｐＨレベルで１０ｍＭメチオニン（Ｍｅｔ）および０．０１％ポリソルベート−８０（ＰＳ）の存在下および非存在下で製剤化された抗Ｂ７．２製剤中の高分子量（％ＨＭＷ）種の最初のパーセンテージを示す棒グラフである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、４０℃での６週間の保存の後の、示されたｐＨレベルで１０ｍＭメチオニン（Ｍｅｔ）および０．０１％ポリソルベート−８０（ＰＳ）の存在下および非存在下で製剤化された抗Ｂ７．２製剤中の％ＨＭＷ種を示す棒グラフである。
【図１Ｃ】図１Ｃは、４０℃での１２週間の保存の後の、示されたｐＨレベルで１０ｍＭメチオニン（Ｍｅｔ）および０．０１％ポリソルベート−８０（ＰＳ）の存在下および非存在下で製剤化された抗Ｂ７．２製剤中の％ＨＭＷ種を示す棒グラフである。
【図２Ａ】図２Ａは、１０ｍＭメチオニン（Ｍｅｔ）および０．０１％ポリソルベート−８０（ＰＳ）の存在下および非存在下でクエン酸、コハク酸、およびヒスチジンバッファー（種々のｐＨ範囲にわたる）中で製剤化された抗Ｂ７．１抗体製剤中の最初の％ＨＭＷ種を示す棒グラフである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、４０℃での１２週間の保存の後の、示されたｐＨレベルで１０ｍＭメチオニン（Ｍｅｔ）および０．０１％ポリソルベート−８０（ＰＳ）の存在下および非存在下でクエン酸、コハク酸、およびヒスチジンバッファー（種々のｐＨ範囲にわたる）中で製剤化された抗Ｂ７．１抗体製剤中の％ＨＭＷ種を示す棒グラフである。
【図３Ａ】図３Ａは、−８０℃で１カ月〜３６カ月の保存の後の、抗ＣＤ２２抗体製剤中に存在する％ＨＭＷ種を示す棒グラフである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、２５℃で１カ月〜３６カ月の保存の後の、抗ＣＤ２２抗体製剤中に存在する％ＨＭＷ種を示す棒グラフである。
【図４】図４は、−８０℃、２５℃、および４０℃で４週間までの保存の後の、メチオニンありまたはなしで製剤化されたＰＳＧＬ−Ｉｇタンパク質製剤中に存在する％ＨＭＷ種を示すグラフである。
【図５】図５は、メチオニンの存在下（Ｓ−１およびＳ−２）または非存在（Ｃ）でせん断力に供されたＰＳＧＬ−Ｉｇタンパク質製剤中の％ＨＭＷ種を示す棒グラフである。
【図６】図６は、１カ月の期間にわたって明および暗状態に曝露された後の、メチオニンありまたはなしでヒスチジンまたはコハク酸バッファー中で製剤化されたＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標）の効力を示す棒グラフである。
【図７】図７は、ｒｈＩＬ−１１酸化と多量体化との間の相関を示す略図である。
【図８】図８は、抗Ｂ７．１抗体の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列を示す図である。予測される分子内ジスルフィド結合を、関与するシステイン残基の連結によって図解する。分子内ジスルフィド結合を形成すると予想されるシステインに下線を引き、連結性を示す。エフェクター機能を減少させるＦｃ部分中の２つの変化した残基を囲む。Ｎ結合型糖鎖合成コンセンサス部位は太字のイタリック体である。
【図９】図９は、抗Ｂ７．２抗体の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列を示す図である。予測される分子内ジスルフィド結合を、関与するシステイン残基の連結によって図解する。分子内ジスルフィド結合を形成すると予想されるシステインに下線を引き、連結性を示す。エフェクター機能を減少させるＦｃ部分中の２つの変化した残基を囲む。Ｎ結合型糖鎖合成コンセンサス部位は太字のイタリック体である。
【図１０】図１０は、抗ＣＤ２２抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を示す図である。下線を引かれた配列はシグナル配列であり、相補性決定領域は太字のイタリック体で示す。Ｎ結合型糖鎖合成の可能性のある部位に下線を引く。
【図１１】図１１は、ＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標）のアミノ酸配列を示す図である（Ｓａｎｄｂｅｒｇ Ｈ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂ−Ｄｏｍａｉｎ Ｄｅｌｅｔｅｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ、Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、第３８巻第２号、補足４、４〜１２頁、２００１年４月参照）。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその内容全体が本明細書に援用される、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ」という名称の、２００６年３月２０日に出願した米国仮出願第６０／７８４１３０号の利益を主張するものである。
【０００２】
その分野は、タンパク質の凝集を減少させる方法および凝集が低レベルであるタンパク質製剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒトゲノムプロジェクトの完了は、タンパク質単離および精製の改良法の開発と相まって、タンパク質製剤の大規模生産を実現した。実際、第Ｉ相臨床試験、またはそれを超える試験中の、１００を超える組換えタンパク質があり、数十のものは食品医薬品局の承認を得ている。生物活性形態でのタンパク質またはペプチドの効率的で安全な送達を確実に行う製剤は、現在および将来のバイオテクノロジー製品の商業的成功の手掛かりである。
【０００４】
不運なことに、タンパク質は、独特の物理的および化学的特性を有し、これらによって製剤化および開発が困難になる。タンパク質の物理的および化学的不安定性は、適したタンパク質製剤の開発に相当な難題をもたらす。タンパク質の最も一般的な物理的不安定性は、タンパク質凝集、およびその巨視的同等物である沈殿である。タンパク質が凝集する傾向は、タンパク質を可能な限り高い濃度で長期間にわたって合成、加工、および保存することが所望されるバイオテクノロジーおよび製薬産業における、特に困難な課題である。
【０００５】
タンパク質凝集を駆動する機序は完全には理解されていないが、それでもなお、最終結果は望ましくない。医薬組成物中のポリペプチドによる凝集物形成は、そのポリペプチドの生物活性に有害に影響を及ぼして、医薬組成物の治療有効性の喪失を生じる場合がある。また、凝集状態のタンパク質は免疫原性である場合があり、ｉｎ ｖｉｖｏで急性毒性効果も有する場合がある。さらに、凝集物形成は、注射器、管系、膜、またはポンプの妨害等、タンパク質製剤の投与の間に他の問題を引き起こす場合がある。したがって、当該分野には、タンパク質凝集を減少させる方法の、および低レベルの凝集を示すタンパク質製剤を開発する必要性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本出願は、低い凝集特性を示すタンパク質製剤、およびそのような製剤を作製する方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様において、本出願は、約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭの濃度までメチオニンを製剤に添加することによって製剤中のタンパク質またはタンパク質（複数）の凝集を減少させるための方法に関する。方法は、メチオニンを欠くこと以外同一の製剤化において製剤化された同じタンパク質またはタンパク質（複数）の凝集のレベルと比較して、製剤中のタンパク質またはタンパク質（複数）の凝集を減少させる。特定の実施形態において、約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭの濃度までメチオニンを製剤に添加する方法は、製剤が、タンパク質凝集を促進または容易にする条件に供された場合に、メチオニンを欠くこと以外同一の製剤化において製剤化され、タンパク質凝集を促進する同じ条件に供された同じタンパク質またはタンパク質（複数）の凝集のレベルと比較して、製剤中のタンパク質またはタンパク質（複数）の凝集を減少させる。
【０００８】
ある実施形態において、約０．５ｍＭ〜約５０ｍＭの間の終濃度まで、メチオニンが製剤に添加される。特定の実施形態において、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２．５ｍＭ、５ｍＭ、７．５ｍＭ、１０ｍＭ、１２．５ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、および４５ｍＭの終濃度まで、メチオニンが製剤に添加される。ある実施形態において、タンパク質製剤がタンパク質凝集をもたらす条件に供される、約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭの濃度までメチオニンをタンパク質製剤に添加する方法は、タンパク質凝集を促進する条件に製剤が供された後、サイズ排除クロマトグラフィー−高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）によって測定すると、最大限でも約５％、最大限でも約４％、最大限でも約３％、最大限でも約２％、最大限でも約１％、または最大限でも約０．５％の高分子量（ＨＭＷ）種を有する製剤を生じる。
【０００９】
いくつかの実施形態において、約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭの濃度までメチオニンをタンパク質製剤に添加する方法は、メチオニンを欠く製剤と比較して、タンパク質製剤の貯蔵寿命を増大させる。他の実施形態において、約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭの濃度までメチオニンをタンパク質製剤に添加する方法は、メチオニンを欠く製剤と比較して、タンパク質製剤の効力を維持する。ある実施形態において、約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭの濃度（例えば、約１ｍＭ〜約１４５ｍＭ）までメチオニンをタンパク質製剤に添加する方法は、メチオニンを欠く製剤と比較して、タンパク質製剤の免疫原性を減少させる。
【００１０】
その方法は、凝集するタンパク質に対する相同性に基づいて、または凝集する可能性を示唆する実験データに基づいて、凝集することが公知である、または凝集しそうであると考えられるタンパク質に、最も有用である。一実施形態において、製剤内のタンパク質は、保存の間に凝集する。いくつかの実施形態において、製剤内のタンパク質は、せん断力の結果として凝集する。他の実施形態において、製剤内のタンパク質は、高い温度の結果として凝集する。他の実施形態において、製剤内のタンパク質は、光への曝露の結果として凝集する。さらに他の実施形態において、製剤内のタンパク質は、製剤中のある種の糖、または界面活性物質の存在の結果として凝集する。そのような条件に供される、または供されそうである製剤へのメチオニンの添加は、凝集物形成の減少に有効であり、それによって、製剤内のタンパク質またはタンパク質（複数）の生物活性および効力を維持する。
【００１１】
いくつかの実施形態において、製剤中のタンパク質またはタンパク質（複数）の凝集は、メチオニンを製剤に添加する前に判定される。他の実施形態において、製剤中のタンパク質またはタンパク質（複数）の凝集は、メチオニンを製剤に添加した後に判定される。さらなる実施形態において、製剤のタンパク質またはタンパク質（複数）の凝集は、メチオニンを製剤に添加する前後に判定される。製剤のタンパク質またはタンパク質（複数）の凝集は、限定されないが、サイズ排除クロマトグラフィー−高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）、逆相−高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、ＵＶ吸光度、沈降速度測定、およびそれらの組合せを含む、当業者に公知の任意の方法によって判定することができる。特定の実施形態において、約１ｍＭ〜約１４５ｍＭメチオニンを含む製剤中のパーセンテージ高分子量（％ＨＭＷ）種は、メチオニンを欠くこと以外同一の製剤における％ＨＭＷ種と比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または７５％減少する。他の特定の実施形態において、約１ｍＭ〜約１４５ｍＭメチオニンを含む製剤は、最大限でも約５％、最大限でも約４％、最大限でも約３％、最大限でも約２％、最大限でも約１％、または最大限でも約０．５％の高分子量（ＨＭＷ）種を有する。製剤中のタンパク質またはタンパク質（複数）の凝集は、メチオニンありまたはなしのいずれかで、製剤が調製された後の任意のときに測定することができる。ある実施形態において、凝集は、タンパク質を製剤化した翌日、目的のタンパク質を製剤化してから１週間〜１２週間後、または１カ月〜３６カ月後に測定される。
【００１２】
いくつかの実施形態において、製剤のタンパク質は、抗体、免疫グロブリン（Ｉｇ）融合タンパク質、凝固因子、受容体、リガンド、酵素、転写因子、またはこれらのタンパク質のいずれかの生物活性断片である。特定の実施形態において、タンパク質は、抗Ｂ７．１抗体、抗Ｂ７．２抗体、抗ＣＤ２２抗体、ＰＳＧＬ−Ｉｇ融合タンパク質、活性化第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、またはこれらのタンパク質のいずれかの生物活性断片である。いくつかの実施形態において、タンパク質は、製剤中約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２５０ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤化される。いくつかの実施形態において、タンパク質は、製剤中約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤化される。他の実施形態において、タンパク質は、製剤中約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤化される。いくつかの実施形態において、タンパク質は、製剤中約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤化される。ある実施形態において、タンパク質は、液体または凍結乾燥粉末として製剤化される。
【００１３】
ある実施形態において、タンパク質製剤は、界面活性物質を含む。特定の実施形態において、界面活性物質は、ポリソルベート−２０またはポリソルベート−８０である。ある他の実施形態において、タンパク質製剤は、界面活性物質を欠く。ある実施形態において、タンパク質製剤は、張性調節物質を含む。特定の実施形態において、張性調節物質は、塩化ナトリウム、マンニトール、またはソルビトールである。ある他の実施形態において、タンパク質製剤は、糖を含む。特定の実施形態において、糖は、ショ糖、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、またはキシリトールである。ある他の実施形態において、タンパク質製剤は、糖を欠く。いくつかの実施形態において、製剤のｐＨは、約５．０〜８．０の間である。いくつかの他の実施形態において、製剤のｐＨは、約５．８〜６．６の間である。
【００１４】
他の実施形態において、タンパク質製剤は、製剤のタンパク質の凝集を減少させる１つまたは複数の作用物質をさらに含む。いくつかの実施形態において、製剤のタンパク質の凝集を減少させる作用物質は、アミノ酸である。特定の実施形態において、アミノ酸は、アルギニン、リシン、グリシン、グルタミン酸、またはアスパラギン酸である。いくつかの実施形態において、アミノ酸は、約１ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度まで、タンパク質製剤に添加される。いくつかの他の実施形態において、アミノ酸は、約５ｍＭ〜約１５０ｍＭの濃度まで、タンパク質製剤に添加される。他の実施形態において、製剤のタンパク質の凝集を減少させる作用物質は、金属キレート剤の組合せである。特定の実施形態において、金属キレート剤は、ＤＴＰＡ、ＥＧＴＡ、およびＤＥＦである。いくつかの実施形態において、タンパク質製剤中のＤＴＰＡまたはＥＧＴＡの濃度は、約１μＭ〜約５ｍＭである。いくつかの実施形態において、タンパク質製剤中のＤＥＦの濃度は、約１μＭ〜約１０ｍＭである。他の実施形態において、製剤のタンパク質の凝集を減少させる作用物質は、フリーラジカルスカベンジャー、特に酸素ラジカルのスカベンジャーである。特定の実施形態において、フリーラジカルスカベンジャーは、マンニトールまたはヒスチジンである。いくつかの実施形態において、タンパク質製剤中のマンニトールの濃度は、約０．０１％〜約２５％である。いくつかの実施形態において、タンパク質製剤中のヒスチジンの濃度は、約１００μＭ〜約２００ｍＭである。他の実施形態において、製剤のタンパク質の凝集を減少させる作用物質は、金属キレート剤およびフリーラジカルスカベンジャーの組合せである。ある他の実施形態において、凝集を減少させる作用物質はクエン酸塩である。ある実施形態において、タンパク質製剤中のクエン酸塩の濃度は、約０．５ｍＭ〜約２５ｍＭである。
【００１５】
別の態様において、本出願は、約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭの濃度までメチオニンを製剤に添加することによる、タンパク質がメチオニン残基を含まないか、または１０、９、８、７、６、５、４、３、もしくは２個より少ないメチオニン残基を含む、タンパク質製剤中のタンパク質の凝集を減少させるための方法を提供する。方法は、メチオニンを欠くこと以外同一の製剤中の同じタンパク質と比較して、製剤中のタンパク質の凝集が減少する。ある実施形態において、メチオニンは、約０．５ｍＭ〜約５０ｍＭの間の終濃度まで、製剤に添加される。特定の実施形態において、メチオニンは、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２．５ｍＭ、５ｍＭ、７．５ｍＭ、１０ｍＭ、１２．５ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、および４５ｍＭの終濃度まで、製剤に添加される。他の実施形態において、タンパク質がメチオニン残基を含まないか、または１０、９、８、７、６、５、４、３、もしくは２個より少ないメチオニン残基を含む、約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭのメチオニンをタンパク質製剤に添加する方法は、最大限でも約５％、最大限でも約４％、最大限でも約３％、最大限でも約２％、最大限でも約１％、または最大限でも約０．５％の高分子量（ＨＭＷ）種を有する製剤を生じる。
【００１６】
別の態様において、本出願は、凝集がメチオニン酸化によって引き起こされない、タンパク質製剤中のタンパク質の凝集を減少させるための方法を提供する。方法は、約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭの濃度までメチオニンを製剤に添加することを含む。方法は、メチオニンを欠くこと以外同一の製剤中の同じタンパク質と比較して、製剤中のタンパク質の凝集が減少する。ある実施形態において、メチオニンは、約０．５ｍＭ〜約５０ｍＭの間の終濃度まで、製剤に添加される。特定の実施形態において、メチオニンは、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２．５ｍＭ、５ｍＭ、７．５ｍＭ、１０ｍＭ、１２．５ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、および４５ｍＭの終濃度まで、製剤に添加される。他の実施形態において、約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭのメチオニンを製剤に添加する方法は、最大限でも約５％、最大限でも約４％、最大限でも約３％、最大限でも約２％、最大限でも約１％、または最大限でも約０．５％の高分子量（ＨＭＷ）種を有する製剤を生じる。
【００１７】
さらに別の実施形態において、界面活性物質とともに製剤化されたタンパク質の凝集を減少させるための方法が提供される。ある実施形態において、界面活性物質は、タンパク質を凝集させる。方法は、約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭの濃度までメチオニンを製剤に添加することを含む。方法は、メチオニンを欠くこと以外同一の製剤中の同じタンパク質と比較して、製剤中のタンパク質の凝集が減少する。ある実施形態において、メチオニンは、約０．５ｍＭ〜約５０ｍＭの間の終濃度まで、製剤に添加される。他の実施形態において、メチオニンは、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２．５ｍＭ、５ｍＭ、７．５ｍＭ、１０ｍＭ、１２．５ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、および４５ｍＭの終濃度まで、製剤に添加される。特定の実施形態において、約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭのメチオニンを、界面活性物質とともに製剤化された製剤に添加する方法は、最大限でも約５％、最大限でも約４％、最大限でも約３％、最大限でも約２％、最大限でも約１％、または最大限でも約０．５％の高分子量（ＨＭＷ）種を有する製剤を生じる。
【００１８】
さらなる態様において、約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭの濃度までメチオニンを製剤に添加する方法は、せん断力に供されたタンパク質の凝集を減少させる。方法は、製剤がせん断力に供される前、それと同時、またはその後に、メチオニンを添加することを含む。方法は、メチオニンを欠くこと以外同一の製剤中の同じタンパク質と比較して、製剤中のタンパク質の凝集を減少させることを生じる。ある実施形態において、メチオニンは、約０．５ｍＭ〜約５０ｍＭの間の終濃度まで、製剤に添加される。特定の実施形態において、メチオニンは、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２．５ｍＭ、５ｍＭ、７．５ｍＭ、１０ｍＭ、１２．５ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、および４５ｍＭの終濃度まで製剤に添加される。いくつかの実施形態において、せん断力は、撹拌、振とう、凍結解凍、輸送、注射器への引き込み、または精製手順によって引き起こされる。特定の実施形態において、約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭのメチオニンを、せん断力に供された製剤に添加する方法は、最大限でも約５％、最大限でも約４％、最大限でも約３％、最大限でも約２％、最大限でも約１％、または最大限でも約０．５％の高分子量（ＨＭＷ）種を有する製剤を生じる。
【００１９】
さらなる実施形態において、約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭの濃度までメチオニンを製剤に添加する方法は、光に曝露されたタンパク質の凝集を減少させる。ある実施形態において、メチオニンは、約０．５ｍＭ〜約５０ｍＭの間の終濃度まで、製剤に添加される。特定の実施形態において、メチオニンは、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２．５ｍＭ、５ｍＭ、７．５ｍＭ、１０ｍＭ、１２．５ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、および４５ｍＭの終濃度まで、製剤に添加される。いくつかの実施形態において、光は蛍光である。他の実施形態において、光は日光である。さらなる実施形態において、光はＵＶ光である。方法は、製剤が光に曝露される前、それと同時、またはその後に、メチオニンを添加することを含む。ある実施形態において、メチオニンは、光への製剤の曝露の前およびそれと同時、またはその後に添加される。約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭの濃度までメチオニンを製剤に添加する方法は、メチオニンを欠くこと以外同一の製剤中の同じタンパク質と比較して、製剤中のタンパク質の凝集を減少させることを生じる。特定の実施形態において、約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭのメチオニンを、光に曝露された製剤に添加する方法は、最大限でも約５％、最大限でも約４％、最大限でも約３％、最大限でも約２％、最大限でも約１％、または最大限でも約０．５％の高分子量（ＨＭＷ）種を有する製剤生じる。
【００２０】
別の態様において、約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭの濃度までメチオニンを製剤に添加する方法は、タンパク質製剤中のタンパク質の効力または生物活性の喪失を低下させる。この方法は、製剤中のタンパク質の凝集を減少させることを生じ、それによって、タンパク質の効力または機能的活性を維持する。ある実施形態において、メチオニンは、約０．５ｍＭ〜約５０ｍＭの間の終濃度まで、製剤に添加される。特定の実施形態において、メチオニンは、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２．５ｍＭ、５ｍＭ、７．５ｍＭ、１０ｍＭ、１２．５ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、および４５ｍＭの終濃度まで、製剤に添加される。特定の実施形態において、約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭのメチオニンを製剤に添加する方法は、最大限でも約５％、最大限でも約４％、最大限でも約３％、最大限でも約２％、最大限でも約１％、または最大限でも約０．５％の高分子量（ＨＭＷ）種を有する製剤を生じる。
【００２１】
異なる態様において、本出願は、ペプチド／ペプチド（複数）、タンパク質／タンパク質（複数）、またはペプチド／ペプチド（複数）およびタンパク質／タンパク質（複数）、ならびに約０．５ｍＭ〜約５０ｍＭメチオニンを含む、タンパク質製剤を提供する。特定の実施形態において、メチオニンは、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２．５ｍＭ、５ｍＭ、７．５ｍＭ、１０ｍＭ、１２．５ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、および４５ｍＭの終濃度まで、製剤に添加される。この態様のある実施形態において、製剤のタンパク質は、抗体、Ｉｇ融合タンパク質、凝固因子、受容体、リガンド、酵素、転写因子、またはこれらのタンパク質の生物活性断片である。特定の実施形態において、タンパク質は、抗Ｂ７．１抗体、抗Ｂ７．２抗体、抗ＣＤ２２抗体、ＰＳＧＬ−Ｉｇ融合タンパク質、活性化第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、またはこれらのタンパク質の生物活性断片である。他の実施形態において、タンパク質は、抗Ｂ７．１抗体、抗Ｂ７．２抗体、抗ＣＤ２２抗体、ＰＳＧＬ−Ｉｇ融合タンパク質、活性化第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、または第ＸＩＩＩに対する、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％のアミノ酸配列相同性を有する。いくつかの実施形態において、製剤は、バッファーを含む。特定の実施形態において、バッファーは、ヒスチジンバッファー、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、またはＴｒｉｓバッファーである。ある実施形態において、製剤は、約５．０〜約８．０のｐＨを有する。他の実施形態において、製剤は、約６．０〜約７．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、製剤は、タンパク質の凝集を減少させることができる別の作用物質を含む。製剤は、糖、界面活性物質、増量剤、凍結保護物質、安定化剤、抗酸化剤、またはこれらの組合せをさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、製剤のペプチド（複数可）／タンパク質（複数可）は、製剤中約０．１ｍｇ／ｍｌおよび約３００ｍｇ／ｍｌの濃度である。他の実施形態において、製剤のペプチド（複数可）／タンパク質（複数可）は、製剤中約０．１ｍｇ／ｍｌおよび約１０ｍｇ／ｍｌの濃度である。ある実施形態において、タンパク質は、液体、または凍結乾燥粉末として製剤化される。ある実施形態において、タンパク質製剤は、キットとして提供される。そのようなキットは、バッファー、賦形剤、およびタンパク質製剤の使用のための説明書を含んでもよい。
【００２２】
別の態様において、本出願は、本明細書中に記載されているタンパク質製剤を用いた、治療、予防、および／または診断の方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
バイオテクノロジーにおける最近の進歩によって、診断および療法における使用のための、多種多様な生物活性タンパク質製剤が提供されている。しかしながら、そのようなタンパク質製剤の開発、生成、送達、安全性、および安定性は、相当な難題をもたらす。タンパク質製剤の１つの主な課題は、それらが、可溶性または不溶性凝集物の形成の結果として、それらの生物活性を失う場合があることである。凝集は劣化したタンパク質状態であり、したがって、それを最小限にすることによって、タンパク質製剤の、増大した貯蔵寿命、効力、または活性が生じる。
【００２４】
本出願は、一般に、約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭの間の終濃度までのアミノ酸メチオニンのタンパク質製剤への添加によって、製剤中のタンパク質またはタンパク質（複数）の凝集が減少し、それによって、メチオニンなしで調製されたタンパク質製剤と比較して、製剤の貯蔵寿命が増大し、生物活性が維持されるという発見に関する。
【００２５】
タンパク質凝集に影響を及ぼす要因
タンパク質は、多種多様な医薬、バイオテクノロジー、および調査の使用を有する。これらの使用のいずれかにおける種々の段階で、タンパク質は凝集する場合がある。「凝集する」によって、可溶性であり続けるか溶液から凝結する不溶性の凝集物を形成する、共有結合性または非共有結合性二量体またはオリゴマーの形成を生じるタンパク質分子の間の物理的相互作用が意味される。用語「タンパク質」は、本明細書中で使用される場合、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、および融合タンパク質を包含する。タンパク質は、組換えまたは合成方法によって生成されてもよい。
【００２６】
多くの異なる要因が、タンパク質製剤中のタンパク質の凝集を引き起こす場合がある。典型的な精製および保存手順は、タンパク質製剤を、タンパク質を凝集させる条件および成分に曝露する場合がある。例えば、タンパク質製剤中のタンパク質は、以下のもののいずれか１つまたは複数の結果として凝集する場合がある。保存、上昇した温度への曝露、製剤のｐＨ、製剤のイオン強度、ならびにある種の界面活性物質（例えば、ポリソルベート−２０およびポリソルベート−８０）および乳化剤の存在。用語「保存の間に」は、本明細書中で使用される場合、一旦調製された製剤が、即座に使用されず、むしろその調製の後に、液体形態、凍結状態、またはその後の液体形態もしくは他の形態への復元のための乾燥形態のいずれかで、保存のために包装されることを意味する。「上昇した温度」によって、タンパク質が通常保存される温度よりも高い任意の温度が意味される。
【００２７】
同様に、タンパク質は、凍結乾燥されたタンパク質塊を溶液中で復元すること、タンパク質試料をろ過精製すること、凍結解凍、振とう、またはタンパク質溶液を注射器によって移すこと等のせん断力に曝露された場合に、凝集する場合がある。凝集はまた、保存バイアル内の溶液中および液気界面のポリペプチド分子の相互作用の結果として、起こる場合がある。輸送の間の振とうに起因する界面の圧縮または拡張の間に、構造変化が、気液および固液界面に吸着したポリペプチド中で起こる場合がある。そのような振とうは、製剤のタンパク質を凝集させ、最終的には他の吸着したタンパク質とともに沈殿させる場合がある。
【００２８】
また、光へのタンパク質製剤の曝露は、タンパク質を凝集させる場合がある。光への曝露は、凝集を容易にする反応種を生じる場合がある。いくつかの実施形態において、光は蛍光である。他の実施形態において、光は日光である。さらなる実施形態において、光はＵＶ光である。
【００２９】
さらに、タンパク質製剤の包装は、タンパク質凝集に影響を及ぼす場合がある。痕跡レベルの金属（ｐｐｍレベルの銅、鉄、コバルト、マンガン）は、容器包装から浸出して、アミド結合の加水分解を促進し、最終的にはタンパク質凝集を生じる場合がある。
【００３０】
本出願は、上述の凝集機序の１つまたは複数を制御することによってタンパク質の凝集を減少させる、方法および組成物を提供する。これは、例えば、向上した製品安定性、ならびに製造プロセスおよび保存条件におけるより大きい柔軟性を生じることができる。
【００３１】
タンパク質製剤中のタンパク質の凝集を減少させる方法
本出願は、一般に、アミノ酸メチオニンを製剤に添加することによって製剤中のタンパク質またはタンパク質（複数）の凝集を減少させることができるという発見に関する。凝集の減少は、メチオニンを欠くこと以外同一の製剤と比例する。凝集を減少させるために、メチオニンは、約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭの間の終濃度まで、製剤に添加される。本出願において使用される場合、「約」は、引用される値の±２５％の範囲を有する数値を意味する。いくつかの実施形態において、メチオニンは、約０．５ｍＭ〜約１０ｍＭの間の終濃度まで添加される。他の実施形態において、メチオニンは、約０．５ｍＭ〜約１５ｍＭの間の終濃度まで添加される。いくつかの実施形態において、メチオニンは、約２．５ｍＭ〜約１０ｍＭの間の終濃度まで添加される。いくつかの実施形態において、メチオニンは、約２．５ｍＭ〜約１５ｍＭの間の終濃度まで添加される。他の実施形態において、メチオニンは、約５ｍＭ〜約１５ｍＭの間の終濃度まで添加される。いくつかの実施形態において、メチオニンは、約５ｍＭ〜約２５ｍＭの間の終濃度まで添加される。いくつかの他の実施形態において、メチオニンは、約０．５ｍＭ〜約２５ｍＭの間の終濃度まで添加される。ある実施形態において、メチオニンは、約０．５ｍＭ〜約５０ｍＭの間の終濃度まで添加される。他の実施形態において、メチオニンは、約５０ｍＭ〜約１００ｍＭの間の終濃度まで添加される。ある他の実施形態において、メチオニンは、約１００ｍＭ〜約１４５ｍＭの間の終濃度まで添加される。さらに他の実施形態において、メチオニンは、約１００ｍＭ〜約１４０ｍＭの間の終濃度まで添加される。さらに他の実施形態において、メチオニンは、約１００ｍＭ〜約１３５ｍＭの間の終濃度まで添加される。さらなる実施形態において、メチオニンは、約１００ｍＭ〜約１２５ｍＭの間の終濃度まで添加される。他の実施形態において、メチオニンは、約５ｍＭ〜約５０ｍＭの間の終濃度まで添加される。いくつかの実施形態において、メチオニンは、約５ｍＭ〜約２５ｍＭの間の終濃度まで添加される。特定の実施形態において、メチオニンは、約０．５ｍＭ、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、約２０ｍＭ、約２１ｍＭ、約２２ｍＭ、約２３ｍＭ、約２４ｍＭ、約２５ｍＭ、約２６ｍＭ、約２７ｍＭ、約２８ｍＭ、約２９ｍＭ、約３０ｍＭ、約３１ｍＭ、約３２ｍＭ、約３３ｍＭ、約３４ｍＭ、約３５ｍＭ、約３６ｍＭ、約３７ｍＭ、約３８ｍＭ、約３９ｍＭ、約４０ｍＭ、約４１ｍＭ、約４２ｍＭ、約４３ｍＭ、約４４ｍＭ、約４５ｍＭ、約４６ｍＭ、約４７ｍＭ、約４８ｍＭ、約４９ｍＭ、または約５０ｍＭの終濃度まで、タンパク質製剤に添加される。
【００３２】
何によって製剤のタンパク質が凝集させられるかにかかわらず、メチオニンの添加によって、製剤中のタンパク質またはタンパク質（複数）の凝集が減少する。ある実施形態において、メチオニンの添加によって、保存、上昇した温度への曝露、光への曝露、せん断力への曝露、界面活性物質の存在、ｐＨおよびイオン条件、ならびにそれらの任意の組合せによって引き起こされる、製剤中の凝集が減少する。
【００３３】
上述の方法を用いて、液体または乾燥形態で製剤化されたタンパク質の凝集を低下させることができる。凝集の減少は、後の使用のためにそのままの形態で直接保存されていても、凍結状態で保存されて使用の前に解凍されても、または使用の前に液体形態もしくは他の形態への後の復元のために凍結乾燥、風乾、もしくは噴霧乾燥形態等の乾燥形態で調製されても、液体製剤中で観察される。
【００３４】
製剤中のタンパク質凝集のレベルは、製剤へのメチオニンの添加の前、実質的にそれと同時、またはその後に測定してもよい。ある実施形態において、凝集のレベルは、製剤へのメチオニンの添加の約１日〜約１２週間の間の後に少なくとも１回測定される。他の実施形態において、凝集のレベルは、製剤へのメチオニンの添加の約１カ月〜３６カ月の間の後に少なくとも１回測定される。ある実施形態において、本明細書中に記載されている方法は、メチオニンを欠く製剤と比較して、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、または約９０％の％ＨＭＷ種の減少を生じる。特定の実施形態において、約１ｍＭ〜約１４５ｍＭの間のメチオニンをタンパク質製剤に添加する方法は、最大限でも約５％、最大限でも約４％、最大限でも約３％、最大限でも約２％、最大限でも約１％、または最大限でも約０．５％のＨＭＷ種を有する製剤を生じる。他の特定の実施形態において、約１ｍＭ〜約１４５ｍＭの間のメチオニンをタンパク質製剤に添加する方法は、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％、または約０．５％のＨＭＷ種を有する製剤を生じる。他の実施形態において、約１ｍＭ〜約１４５ｍＭの間のメチオニンをタンパク質製剤に添加する方法は、約０．５％〜約５％の間のＨＭＷ種を有する製剤を生じる。
【００３５】
タンパク質製剤は、製剤のタンパク質の凝集を減少させる１つまたは複数の作用物質をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、製剤のタンパク質の凝集を減少させる作用物質は、アミノ酸である。特定の実施形態において、アミノ酸は、アルギニン、リシン、グリシン、グルタミン酸、またはアスパラギン酸である。いくつかの実施形態において、アミノ酸は、約０．５ｍＭ〜約２００ｍＭの濃度まで、タンパク質製剤に添加される。いくつかの実施形態において、アミノ酸は、約５ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度まで、タンパク質製剤に添加される。いくつかの他の実施形態において、アミノ酸は、約５ｍＭ〜約１２５ｍＭの濃度まで、タンパク質製剤に添加される。ある他の実施形態において、アミノ酸は、約０．５ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度まで、タンパク質製剤に添加される。さらに他の実施形態において、アミノ酸は、約０．５ｍＭ〜約２５ｍＭの濃度まで、タンパク質製剤に添加される。製剤のタンパク質の凝集を減少させる作用物質はまた、金属キレート剤の組合せであってもよい。特定の実施形態において、金属キレート剤は、ＤＴＰＡ、ＥＧＴＡおよびＤＥＦである。いくつかの実施形態において、タンパク質製剤中のＤＴＰＡまたはＥＧＴＡの濃度は、約１μＭ〜約１０ｍＭ、約１μＭ〜約５ｍＭ、約１０μＭ〜約１０ｍＭ、５０μＭ〜約５ｍＭ、または約７５μＭ〜約２．５ｍＭである。いくつかの実施形態において、タンパク質製剤中のＤＥＦの濃度は、約１μＭ〜約１０ｍＭ、約１μＭ〜約５ｍＭ、約１０μＭ〜約１ｍＭ、または約２０μＭ〜約２５０μＭである。製剤のタンパク質の凝集を減少させる作用物質はまた、フリーラジカルスカベンジャー、特に酸素ラジカルのスカベンジャーであってもよい。特定の実施形態において、フリーラジカルスカベンジャーは、マンニトールまたはヒスチジンである。いくつかの実施形態において、タンパク質製剤中のマンニトールの濃度は、約０．０１％〜約２５％、約０．１％〜約２５％、約０．５％〜約１５％、または約１％〜約５％である。いくつかの実施形態において、タンパク質製剤中のヒスチジンの濃度は、約１０μＭ〜約２００ｍＭ、約１００μＭ〜約２００ｍＭ、約５００μＭ〜約１００ｍＭ、または約１５ｍＭ〜約３５ｍＭである。他の実施形態において、製剤のタンパク質の凝集を減少させる作用物質は、金属キレート剤およびフリーラジカルスカベンジャーの組合せである。いくつかの実施形態において、製剤中のタンパク質またはタンパク質（複数）の凝集を減少させる作用物質は、クエン酸塩である。ある実施形態において、タンパク質製剤中のクエン酸塩の濃度は、約０．５ｍＭ〜約５０ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約２５ｍＭ、約１ｍＭ〜約３５ｍＭ、約５ｍＭ〜約２５ｍＭ、または約５ｍＭ〜約１０ｍＭである。
【００３６】
タンパク質凝集のレベルを評価するための方法
多数の異なる分析方法を用いて、タンパク質製剤中の凝集物の存在およびレベルを検出することができる。これらのものとしては、限定されないが、天然のポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、キャピラリーゲル電気泳動法（ＣＧＥ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、分析超遠心（ＡＵＣ）、場流動分画（ＦＦＦ）、光散乱検出、沈降速度、ＵＶ分光法、示差走査熱量測定法、比濁法、ネフェロメトリー、顕微鏡法、サイズ排除クロマトグラフィー−高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）、およびタンデムＲＰ−ＨＰＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳが挙げられる。これらの方法は、単独で、または組み合わせてのいずれで使用してもよい。
【００３７】
タンパク質製剤の一般的な課題は、時間、熱、またはせん断力での凝集物の不可逆的な蓄積である。典型的には、凝集物が沈殿するとき、それらは、検出するのが容易な大きな粒子を形成する。しかしながら、より小さい、非共有結合性可溶性凝集物は、しばしば、沈殿する大きな粒子の前駆体であり、検出および定量するのがより困難である。したがって、タンパク質製剤中のタンパク質凝集を検出および定量する方法は、評価される凝集物の種類に基づく必要がある。
【００３８】
上述の方法の間で、タンパク質製剤中の可溶性で共有結合性の凝集物の存在および／または量を判定する、示唆される方法は、ＳＥＣ／光散乱、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＣＧＥ、ＲＰ−ＨＰＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ、ＦＦＦおよびＡＵＣである。タンパク質製剤中の可溶性で非共有結合性の凝集物の存在および／または量を判定する、示唆される方法は、ＳＥＣ、ＰＡＧＥ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＣＧＥ、ＦＦＦ、ＡＵＣ、および動的光散乱である。タンパク質製剤中の不溶性で非共有結合性の凝集物の存在および／または量を判定する、示唆される方法は、ＵＶ分光法、比濁法、ネフェロメトリー、顕微鏡法、ＡＵＣ、および動的光散乱である。
【００３９】
タンパク質
抗体、免疫グロブリン融合タンパク質、凝固因子、受容体、リガンド、酵素、転写因子、またはそれらの生物活性断片を含む、凝集の影響を受けやすい任意のタンパク質は、本出願の方法および組成物によって保護することができる。タンパク質が得られる、または生成される、供給源または様式（例えば、適切な精製スキームによって細胞もしくは組織供給源から単離されるか、組換えＤＮＡ技術によって生成されるか、または標準的なペプチド合成技術を用いて化学的に合成されるか）は、本出願によって教示される方法に重要でない。したがって、キメラおよび／または融合タンパク質を含む、多種多様な、天然、合成、および／または組換えタンパク質は、本出願の方法および組成物によって、凝集から保護することができる。
【００４０】
製剤化される目的のタンパク質としては、限定されないが、ＰＳＧＬ−Ｉｇ、ＧＰＩｂ−Ｉｇ、ＧＰＩＩｂＩＩＩａ−Ｉｇ、ＩＬ−１３Ｒ−Ｉｇ、ＩＬ−２１Ｒ−Ｉｇ、活性化第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、組織因子、フォンウィルブランド因子、プロテインＣ等の抗凝固因子、心房性ナトリウム利尿因子、ミオスタチン／ＧＤＦ−８、インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ−１〜ＩＬ−１５、ヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモン、成長ホルモン放出因子、副甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、ウリカーゼ、ビクニン、ビリルビン酸化酵素、サブチリシン、リポタンパク質、α−１アンチトリプシン、インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、プロインスリン、卵胞刺激ホルモン、カルシトニン、黄体ホルモン、グルカゴン、肺サーファクタント、ウロキナーゼまたは組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）等のプラスミノーゲン活性化因子、ボンバジン、トロンビン、プラスミン、ミニプラスミン、マイクロプラスミン、腫瘍壊死因子−αおよび−β、エンケファリナーゼ、ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｎｏｒｍａｌｌｙ Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）、ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−α）、ヒト血清アルブミン等の血清アルブミン、ミュラー管抑制因子、リラキシンＡ鎖、リラキシンＢ鎖、プロリラキシン、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、デオキシリボヌクレアーゼ、インヒビン、アクチビン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）、ホルモンまたは増殖因子の受容体、インテグリン、プロテインＡまたはＤ、リウマトイド因子、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５、もしくは−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、もしくはＮＴ−６）等の神経栄養因子、またはＮＧＦ−β等の神経成長因子、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ａＦＧＦおよびｂＦＧＦ等の線維芽細胞増殖因子、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＴＧＦ−α、およびＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、またはＴＧＦ−β５を含むＴＧＦ−β等の、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、インスリン様増殖因子−Ｉおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ３４、およびＣＤ４５等のＣＤタンパク質、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、骨誘導因子、免疫毒素、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、インターフェロン−α、−β、および−γ等のインターフェロン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦ、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｔ細胞受容体、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４受容体等の、ＨＥＲ受容体ファミリーのメンバー、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、およびＶＣＡＭ等の細胞接着分子、ＩｇＥ、血液型抗原、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体、肥満（ＯＢ）受容体、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＨＩＶ ｇａｇ、ｅｎｖ、ｐｏｌ、ｔａｔ、またはｒｅｖタンパク質等のウイルス抗原、ホーミング受容体、アドレシン、イムノアドヘシン等のタンパク質、ならびに上記で一覧にしたポリペプチドのいずれかの生物活性断片または変異体が挙げられる。
【００４１】
用語「生物活性断片」は、それが由来するタンパク質の機能の少なくとも１つを保持するタンパク質の断片を意味する。抗体の生物活性断片としては、抗体の抗原結合断片が挙げられ、受容体の生物活性断片としては、そのリガンドに依然として結合することができる受容体の断片が挙げられ、リガンドの生物活性断片としては、その受容体に依然として結合することができるリガンドの部分が挙げられ、酵素の生物活性断片としては、全長酵素によって触媒される反応を依然として触媒することができる酵素の部分が挙げられる。ある実施形態において、生物活性断片は、それが由来するタンパク質の機能の少なくとも約２５％、５０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％を保持する。タンパク質の機能は、周知の方法（例えば、抗体抗原相互作用を試験すること、リガンド−受容体相互作用を試験すること、酵素活性を測定すること、転写活性を測定すること、またはＤＮＡ−タンパク質相互作用を測定すること）によってアッセイすることができる。
【００４２】
ある実施形態において、製剤化されるタンパク質は、抗体である。抗体は、上述のタンパク質のいずれかに対して引き起こされ、結合してもよい。ある特定の実施形態において、抗体としては、抗Ｂ７．１抗体、抗Ｂ７．２抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ミオスタチン抗体（例えば、米国出願第６０／７５２６６０号）、抗ＩＬ−１１抗体、抗ＩＬ−１２抗体（例えば、米国出願第６０／７５２６６０号）、および抗ＩＬ−１３抗体（例えば、米国出願第６０／７５２６６０号）が挙げられる。他の特定の実施形態において、抗体としては、抗Ｂ７．１抗体、抗Ｂ７．２抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ミオスタチン抗体（例えば米国出願第６０／７５２６６０号）、抗ＩＬ−１１抗体、抗ＩＬ−１２抗体（例えば、米国出願第６０／７５２６６０号）、および抗ＩＬ−１３抗体（例えば、米国出願第６０／７５２６６０号）に対する、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列相同性を有する抗体が挙げられ、それらの、それぞれの抗原に結合する能力を保持している。２つのタンパク質の間のアミノ酸配列相同性は、標準的な方法に従って測定することができる（例えば、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４〜２４４８頁、１９９８年、Ｇｅｏｒｇｅ，Ｄ．Ｇ．ら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ中、１２７〜１４９頁、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８８年、ＦｅｎｇおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ２５：３５１〜３６０頁、１９８７年、ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１〜１５３頁、１９８９年、ならびにＮＣＢＩ、ＮＬＭ、メリーランド州ベテスダの種々のＢＬＡＳＴプログラム参照）。
【００４３】
用語「抗体」は、本明細書中で使用される場合、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ポリペプチド特異性を有する抗体組成物、二重特異性抗体、ダイアボディー、または他の、抗体および組換え抗体の精製された調製物を含む。抗体は、例えば任意のアイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ等）の、全抗体、または、目的の抗原に結合する、その断片であってもよい。ある実施形態において、製剤化される抗体は、ＩｇＧアイソタイプを有する抗体である。
【００４４】
組換え抗体としては、限定されないが、ヒトおよび非ヒト部分、単鎖抗体および多特異的抗体の両方を含む、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体が挙げられる。キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するもの等の、異なる部分が異なる動物種に由来する、分子である。単鎖抗体は、抗原結合部位を有し、単一のポリペプチドからなる。多特異的抗体は、異なる抗原に特異的に結合する少なくとも２つの抗原結合部位を有する、抗体分子である。抗体は、従来の技術を用いて断片化してもよく、断片を目的の抗原に対する結合についてスクリーニングしてもよい。好ましくは、抗体断片は、インタクトな抗体の抗原結合および／または可変領域を含む。したがって、用語、抗体断片は、ある種のタンパク質に選択的に結合することができる、抗体分子の、タンパク質分解的に切断された、または組換えによって調製された部分のセグメントを含む。そのようなタンパク質分解的および／または組換え断片の非限定的な例としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、単離されたＣＤＲ、ならびにペプチドリンカーによって連結されたＶＬおよび／またはＶＨドメインを含む単鎖抗体（ｓｃＦｖ）が挙げられる。ｓｃＦｖ’は、共有結合または非共有結合によって連結されて、２つ以上の結合部位を有する抗体を形成してもよい。
【００４５】
いくつかの実施形態において、抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。用語「ヒト化モノクローナル抗体」は、本明細書中で使用される場合、同等なヒトモノクローナル抗体（ドナー）に見出されるアミノ酸残基の少なくとも１つまたは複数を含むよう改変されている、非ヒト供給源（レシピエント）由来のモノクローナル抗体である。ある実施形態において、ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する。「完全ヒト化モノクローナル抗体」は、同等なヒトモノクローナル抗体の抗原結合領域に見出されるアミノ酸残基の全てを含むよう改変されている、非ヒト供給源由来のモノクローナル抗体である。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体またはドナー抗体のいずれにも見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体機能性をさらに改良および最適化するよう行われてもよい。ヒト化抗体はまた、所望により、ヒト免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含んでもよい。
【００４６】
いくつかの実施形態において、製剤化されるタンパク質は、融合タンパク質である。一実施形態において、融合タンパク質は、免疫グロブリン（Ｉｇ）融合タンパク質である。Ｉｇ融合タンパク質は、免疫グロブリンの定常領域に由来するＩｇ部分に連結された非Ｉｇ部分を含むタンパク質である。特定の実施形態において、融合タンパク質は、ＩｇＧ重鎖定常領域を含む。別の実施形態において、融合タンパク質は、ヒト免疫グロブリンＣγ１のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域に対応するアミノ酸配列を含む。Ｉｇ融合タンパク質の非限定的な例としては、ＰＳＧＬ−Ｉｇ（米国特許第５８２７８１７号参照）、ＧＰＩｂ−Ｉｇ（国際公開第０２／０６３００３号参照）、ＧＰＩＩｂＩＩＩａ−Ｉｇ、ＩＬ−１３Ｒ−Ｉｇ（米国特許第６２６８４８０号参照）、ＴＮＦＲ−Ｉｇ（国際公開第０４／００８１００号参照）、ＩＬ−２１Ｒ−Ｉｇ、ＣＴＬＡ４−ＩｇおよびＶＣＡＭ２Ｄ−ＩｇＧが挙げられる。融合タンパク質を生成する方法は当該分野で周知である（例えば、米国特許第５５１６９６４号、第５２２５５３８号、第５４２８１３０号、第５５１４５８２号、第５７１４１４７号、第６１３６３１０号、第６８８７４７１号、および第６４８２４０９号）。いくつかの実施形態において、製剤のタンパク質としては、ＰＳＧＬ−Ｉｇ（米国特許第５８２７８１７号参照）、ＧＰＩｂ−Ｉｇ（国際公開第０２／０６３００３号参照）、ＧＰＩＩｂＩＩＩａ−Ｉｇ、ＩＬ−１３Ｒ−Ｉｇ（米国特許第６２６８４８０号参照）、ＴＮＦＲ−Ｉｇ（国際公開第０４／００８１００号参照）、ＩＬ−２１Ｒ−Ｉｇ、ＣＴＬＡ４−ＩｇおよびＶＣＡＭ２Ｄ−ＩｇＧ、に対する、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列相同性を有し、それらが、それらのそれぞれのリガンドに結合する能力を保持している、融合タンパク質が挙げられる。
【００４７】
製剤は、特定の疾患または障害の、治療、または診断の必要に応じて、１つより多いタンパク質を含んでもよい。さらなるタンパク質（複数可）は、それらは製剤中の他のタンパク質（複数可）に対する相補活性を有するので、選択され、製剤中の他のタンパク質（複数可）に有害に影響を及ぼさない。また、タンパク質製剤はまた、タンパク質製剤の最終的な有用性において有用な非タンパク質物質を含んでもよい。例えば、ショ糖を添加して、溶液中のタンパク質の安定性および可溶性を増強してもよく、ヒスチジンを添加して適切な緩衝能を提供してもよい。
【００４８】
ある実施形態において、製剤化されるタンパク質は、本質的に純粋および／または本質的に均質である（すなわち、実質的に、混入するタンパク質等を含まない）。用語「本質的に純粋な」タンパク質は、少なくとも約９０重量％のタンパク質画分、好ましくは少なくとも約９５重量％のタンパク質画分を含む組成物を意味する。用語「本質的に均質な」タンパク質は、溶液中の種々の安定化剤および水の質量を除いて、少なくとも約９９重量％のタンパク質画分を含む組成物を意味する。
【００４９】
製剤化されるタンパク質はまた、細胞毒、治療剤、または放射性金属イオンとコンジュゲートしてもよい。一実施形態において、コンジュゲートされるタンパク質は、抗体またはその断片である。細胞毒または細胞毒性物質としては、細胞にとって有害な任意の作用物質が挙げられる。非限定的な例としては、カリチアマイシン、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、およびそれらの類似体、またはホモログが挙げられる。治療剤としては、限定されないが、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、および５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）、シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシンおよびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン）、および有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられる。そのような部分をタンパク質にコンジュゲートさせる技術は、当該分野で周知である。
【００５０】
製剤
製剤の組成は、限定されないが、タンパク質（複数可）（例えば、受容体、抗体、Ｉｇ融合タンパク質、酵素等）の性質、タンパク質の濃度、所望されるｐＨ範囲、どのようにしてタンパク質製剤が保存されるか、タンパク質製剤が保存される期間、ならびにタンパク質製剤が患者に投与されるかどうか、およびどのようにして投与されるかを含む、いくつかの要因の考慮によって判定される。
【００５１】
製剤中のタンパク質の濃度
製剤中のタンパク質の濃度は、タンパク質製剤の最終的な使用による。本明細書中に記載されている製剤中のタンパク質濃度は、一般に、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約３００ｍｇ／ｍｌの間、例えば約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌの間、約５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌの間、約１０ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌの間、約２５ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌの間、約５０ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌの間、約７５ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌの間、約１００ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌの間、約１２５ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌの間、約１５０ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌの間、約２００ｍｇ／ｍｌ〜約３００ｍｇ／ｍｌの間、および約２５０ｍｇ／ｍｌ〜約３００ｍｇ／ｍｌの間である。
【００５２】
タンパク質製剤は、治療目的のために使用してもよい。したがって、製剤中のタンパク質の濃度は、患者が耐えられ、患者に治療上の価値がある投薬および容量でタンパク質を提供することに基づいて、判定される。タンパク質製剤が少容量の注射によって投与される場合、タンパク質濃度は、注射容量による（通常１．０〜１．２ｍＬ）。タンパク質ベースの療法は、通常、１週間あたり、１カ月あたり、または数カ月あたり、数ｍｇ／ｋｇの投薬を必要とする。したがって、タンパク質が２〜３ｍｇ／患者の体重のｋｇで提供され、平均患者体重が７５ｋｇである場合、１５０〜２２５ｍｇのタンパク質が１．０〜１．２ｍＬ注射容量で送達されることが必要になるか、または、容量を増大させて、より低いタンパク質濃度を提供する必要がある。
【００５３】
バッファー
用語「バッファー」は、本明細書中で使用される場合、溶液ｐＨを所望の範囲に維持する作用物質を含む。本明細書中に記載されているような製剤のｐＨは、一般に、ｐＨ約５．０〜約９．０の間、例えば、約ｐＨ５．５〜約６．５、約ｐＨ５．５〜約６．０、約ｐＨ６．０〜約６．５、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、またはｐＨ６．５である。一般に、溶液をｐＨ５．５〜６．５に維持することができるバッファーが使用される。本明細書中に記載されている製剤において使用することができるバッファーの非限定的な例としては、ヒスチジン、コハク酸塩、グルコン酸塩、ｔｒｉｓ（トロメタモール）、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＭＯＰＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＥＰＰＳ、エチレンジアミン、リン酸、マレイン酸、リン酸塩、クエン酸塩、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、およびカコジル酸塩が挙げられる。ヒスチジンは、皮下、筋肉内、または腹腔内注射によって投与される製剤において好ましいバッファーである。バッファーの濃度は、約５ｍＭ〜３０ｍＭの間である。一実施形態において、製剤のバッファーは、約５ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度のヒスチジンである。
【００５４】
賦形剤
タンパク質、メチオニン、およびバッファーに加えて、本明細書中に記載されている製剤はまた、他の物質を含んでもよい。これらの物質としては、限定されないが、凍結保護物質、溶解保護物質、界面活性物質、増量剤、抗酸化剤、および安定化剤が挙げられる。一実施形態において、本明細書中に記載されているタンパク質製剤は、凍結保護物質、溶解保護物質、界面活性物質、増量剤、抗酸化剤、安定化剤、およびそれらの組合せからなる群から選択される賦形剤を含む。
【００５５】
用語「凍結保護物質」は、本明細書中で使用される場合、タンパク質表面から選択的に排除されることによって、タンパク質に凍結誘導性ストレスに対する安定性を提供する作用物質を含む。凍結保護物質はまた、一次および二次乾燥ならびに長期間の生成物保存の間の保護を提供することができる。凍結保護物質の非限定的な例としては、ショ糖、グルコース、トレハロース、マンニトール、マンノース、およびラクトースなどの糖、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプンおよびポリエチレングリコール等のポリマー、ポリソルベート（例えば、ＰＳ−２０またはＰＳ−８０）等の界面活性物質、グリシン、アルギニン、ロイシン、およびセリン等のアミノ酸が挙げられる。生物系において低毒性を示す凍結保護物質が、一般に使用される。凍結保護物質は、製剤中に含まれる場合、約１％〜約１０％（重量／容量）の間の終濃度まで添加される。一実施形態において、凍結保護物質は、約０．５％〜約１０％（重量／容量）の間の濃度のショ糖である。
【００５６】
一実施形態において、溶解保護物質が、本明細書中に記載されている製剤に添加される。用語「溶解保護物質」は、本明細書中で使用される場合、無定形のガラス状マトリクスを提供すること、および水素結合によってタンパク質と結合して、乾燥プロセスの間に除去される水分子を置換することによって、凍結乾燥または脱水プロセス（一次および二次凍結乾燥サイクル）の間にタンパク質に安定性を提供する作用物質を含む。これは、タンパク質構造を維持すること、凍結乾燥サイクルの間にタンパク質分解を最小限にすること、および長期間の生成物安定性を向上させることを助ける。溶解保護物質の非限定的な例としては、ショ糖またはトレハロース等の糖、グルタミン酸１ナトリウム、非結晶性グリシンまたはヒスチジン等のアミノ酸、ベタイン等のメチルアミン、硫酸マグネシウム等のリオトロピック塩、三価以上の糖アルコール等のポリオール、例えばグリセリン、エリスリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、およびマンニトール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、プルロニック、ならびにそれらの組合せが挙げられる。製剤に添加される溶解保護物質の量は、一般に、タンパク質製剤が凍結乾燥された場合に、許容されない量の、タンパク質の分解／凝集をもたらさない、量である。溶解保護物質が糖（ショ糖またはトレハロース等）であり、タンパク質が抗体である場合、タンパク質製剤中の溶解保護物質濃度の非限定的な例は、約１０ｍＭ〜約４００ｍＭ、好ましくは約３０ｍＭ〜約３００ｍＭ、最も好ましくは約５０ｍＭ〜約１００ｍＭである。
【００５７】
ある実施形態において、界面活性物質が、製剤中に含まれてもよい。用語「界面活性物質」は、本明細書中で使用される場合、気液界面での吸着によって液体の表面張力を減少させる作用物質を含む。界面活性物質の例としては、限定されないが、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０またはポリソルベート２０）等の非イオン性界面活性物質、ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸ナトリウム、オクチルグリコシドナトリウム、ラウリル−スルホベタイン、ミリスチル−スルホベタイン、リノレイル−スルホベタイン、ステアリル−スルホベタイン、ラウリル−サルコシン、ミリスチル−サルコシン、リノレイル−サルコシン、ステアリル−サルコシン、リノレイル−ベタイン、ミリスチル−ベタイン、セチル−ベタイン、ラウロアミドプロピル−ベタイン、コカミドプロピル−ベタイン、リノールアミドプロピル−ベタイン、ミリスタミドプロピル−ベタイン、パルミドプロピル−ベタイン、イソステアラミドプロピル−ベタイン（例えば、ラウロアミドプロピル）、ミリスタミドプロピル−、パルミドプロピル−、またはイソステアラミドプロピル−ジメチルアミン、メチルココイルタウリンナトリウムまたはメチルオレイルタウレート二ナトリウム、およびＭｏｎａｑｕａｔ（商標）シリーズ（Ｍｏｎａ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ニュージャージー州パターソン）、ポリエチルグリコール、ポリプロピルグリコール、ならびにエチレンおよびプロピレングリコールのコポリマー（例えば、プルロニック、ＰＦ６８）が挙げられる。添加される界面活性物質の量は、例えばＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いてアッセイしてＨＭＷ種またはＬＭＷ種のパーセンテージを判定すると、復元されたタンパク質の凝集を許容され得るレベルに維持し、本明細書中に記載されているタンパク質製剤の凍結乾燥物の復元の後の微粒子の形成を最小限にするものである。例えば、界面活性物質は、約０．００１〜約０．５％、例えば約０．０５〜約０．３％の量で、製剤（液体、または凍結乾燥物の復元の前に）中に存在してもよい。
【００５８】
いくつかの実施形態において、増量剤が製剤中に含まれる。用語「増量剤」は、本明細書中で使用される場合、医薬生成物と直接相互作用することなしに凍結乾燥生成物の構造を提供する作用物質を含む。薬学的に洗練された塊を提供することに加えて、増量剤はまた、崩壊温度を改変すること、凍結解凍保護を提供すること、および長期間の保存にわたるタンパク質安定性を増強することに関して、有用な質を与えることができる。増量剤の非限定的な例としては、マンニトール、グリシン、ラクトース、およびショ糖が挙げられる。増量剤は、結晶性（グリシン、マンニトール、または塩化ナトリウム等）または無定形（デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン等）であってもよく、一般に、０．５％〜１０％の量で、タンパク質製剤中で使用される。
【００５９】
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０年）に記載されているもの等の、他の薬学的に許容され得る支持体、賦形剤、または安定化剤もまた、それらが製剤の所望の特徴に有害に影響を及ぼさなければ、本明細書中に記載されているタンパク質製剤中に含まれてもよい。本明細書中で使用される場合、「薬学的に許容され得る支持体」は、医薬投与に適合する、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤を意味する。薬学的に活性のある物質のためのそのような媒体および作用物質の使用は、当該分野で周知である。許容され得る支持体、賦形剤、または安定化剤は、採用される投薬量および濃度で受容者にとって無毒であり、さらなる緩衝剤、保存剤、共溶媒、アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤、ＥＤＴＡ等のキレート剤、金属錯体（例えば、Ｚｎタンパク質錯体）、ポリエステル等の生分解性ポリマー、ナトリウム、多価糖アルコール等の塩形成対イオン、アラニン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リシン、オルニチン、ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、およびスレオニン等のアミノ酸、ラクチトール、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、リビトール、ミオイニシトース、ミオイニシトール、ガラクトース、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール（例えば、イノシトール）、ポリエチレングリコール等の、有機糖または糖アルコール、尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロール、およびチオ硫酸ナトリウム等の硫黄含有還元剤、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、または他の免疫グロブリン等の低分子量タンパク質、ならびにポリビニルピロリドン等の親水性ポリマーが挙げられる。
【００６０】
保存方法
本明細書中に記載されているタンパク質製剤は、当業者に公知の任意の方法によって保存してもよい。非限定的な例としては、タンパク質製剤を、凍結、凍結乾燥、および噴霧乾燥することが挙げられる。
【００６１】
いくつかの場合において、タンパク質製剤は、保存のために凍結される。したがって、凍結解凍サイクルを含むそのような条件下で、製剤が比較的安定であることが望ましい。製剤の適合性を判定する１つの方法は、試料製剤を、少なくとも２回、例えば３〜１０回の凍結（例えば−２０℃または−８０℃）および解凍（例えば、室温での速い解凍または氷上での遅い解凍）のサイクルに供し、凍結解凍サイクルの後に蓄積する低分子量（ＬＭＷ）種および／またはＨＭＷ種の量を判定し、それを凍結解凍手順の前に試料中に存在するＬＭＷ種またはＨＭＷ種の量と比較することである。ＬＭＷまたはＨＭＷ種の増大は、製剤の一部として保存されたタンパク質の安定性の低下を示す。サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）を用いて、ＬＭＷおよびＨＭＷ種の存在を判定することができる。
【００６２】
いくつかの場合において、タンパク質製剤は、液体として保存してもよい。したがって、種々の温度を含むそのような条件下で、液体製剤が比較的安定であることが望ましい。製剤の安定性を判定する１つの方法は、試料製剤をいくつかの温度（２〜８、１５、２０、２５、３０、３５、４０、および５０℃等）で保存し、経時的に蓄積するＨＭＷおよび／またはＬＭＷ種の量をモニタリングすることである。経時的に蓄積するＨＭＷおよび／またはＬＭＷ種の量が少ないほど、製剤の保存条件はよりよい。したがって、タンパク質の電荷プロフィールを、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ）によってモニタリングしてもよい。
【００６３】
あるいは、製剤は、凍結乾燥の後に保存してもよい。用語「凍結乾燥」は、本明細書中で使用される場合、乾燥される物質をまず凍結させ、その後に真空環境での昇華による氷または凍結した溶媒の除去が続くプロセスをいう。保存の際に凍結乾燥生成物の安定性を増強するように、賦形剤（例えば、溶解保護物質）が、凍結乾燥される製剤中に含まれてもよい。用語「復元された製剤」は、本明細書中で使用される場合、タンパク質が希釈液中で分散するように凍結乾燥タンパク質製剤を希釈液中に溶解させることによって調製された製剤をいう。用語「希釈液」は、本明細書中で使用される場合、薬学的に許容され得る物質（ヒトへの投与のために安全で無毒）であり、凍結乾燥の後に復元された製剤等の液体製剤の調製に有用である。希釈液の非限定的な例としては、滅菌水、注射のための静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、無菌生理食塩溶液、リンガー液、デキストロース溶液、または塩および／もしくはバッファーの水溶液が挙げられる。
【００６４】
凍結乾燥の後に製剤のタンパク質成分の安定性について製剤を試験することは、製剤の適合性を判定するために有用である。方法は、試料製剤が凍結される代わりに凍結乾燥され、希釈液を用いて復元されること以外、凍結について上述されたものと同様であり、復元された製剤がＬＭＷ種および／またはＨＭＷ種の存在について試験される。凍結乾燥されていない対応する試料製剤と比較した、凍結乾燥試料中のＬＭＷまたはＨＭＷ種の増大は、凍結乾燥試料における安定性の低下を示す。
【００６５】
いくつかの場合において、製剤は、噴霧乾燥され、次いで保存される。噴霧乾燥のために、液体製剤は、乾燥ガス流の存在下でエアロゾル化される。製剤液滴からガス流に水が除去され、薬物製剤の乾燥粒子を生じる。（ｉ）噴霧乾燥脱水の間にタンパク質を保護するため、（ｉｉ）噴霧乾燥の後の保存の間にタンパク質を保護するため、および／または（ｉｉｉ）エアロゾル化に適した溶液特性を与えるために、賦形剤が製剤中に含まれてもよい。方法は、試料製剤が凍結される代わりに噴霧乾燥され、希釈液で復元される以外、凍結について上述されたものと同様であり、復元された製剤が、ＬＭＷ種および／またはＨＭＷ種の存在について試験される。凍結されていない対応する試料製剤と比較した、噴霧乾燥試料におけるＬＭＷまたはＨＭＷ種の増大は、噴霧乾燥試料における安定性の低下を示す。
【００６６】
治療の方法
本明細書中に記載されている製剤は、それを必要とする患者における疾患または障害の治療および／または予防における医薬組成物として有用である。用語「治療」は、治療的処置および予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または防止（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段の両方をいう。治療は、疾患、疾患の症状、または疾患に対する素因に治癒（ｃｕｒｅ、ｈｅａｌ）、改善、軽減、変化、治療、寛解、改良する、または影響を及ぼす目的で、疾患／障害、疾患／障害の症状、疾患／障害に対する素因を有する患者由来の体、単離された組織、または細胞への、タンパク質製剤の適用または投与を含む。「治療を必要とする」ものは、すでに障害を有するもの、ならびに障害が予防されるべきものを含む。用語「障害」は、本明細書中に記載されているタンパク質製剤での治療の利益を受ける任意の状態である。これは、哺乳動物を問題になっている障害にかかりやすくする病的状態を含む、慢性および急性障害または疾患を含む。本明細書中で治療される障害の非限定的な例としては、出血性障害、血栓症、白血病、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、自己免疫障害、血液凝固障害、血友病、移植片拒絶、炎症性障害、心疾患、筋消耗障害、アレルギー、癌、筋ジストロフィー、筋肉減少症、悪液質、ＩＩ型糖尿病、関節リウマチ、クローン病、乾癬、乾癬性関節炎、喘息、皮膚炎、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患、好酸球増加症、線維症、および過剰な粘液産生が挙げられる。
【００６７】
投与
本明細書中に記載されているタンパク質製剤は、適した様式、例えば皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、病巣内もしくは関節内経路による注射もしく輸液での、単回もしくは複数ボーラスまたは長期間にわたる輸液、局所投与、経粘膜、経皮直腸、吸入、または徐放もしくは持続放出手段による等の当業者に公知の方法を用いて、治療を必要とする被験体に投与することができる。タンパク質製剤が凍結乾燥されている場合、凍結乾燥された物質は、投与の前に、まず適切な液体中で復元される。凍結乾燥された物質は、例えば、注射のための静菌水（ＢＷＦＩ）、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、または凍結乾燥の前にタンパク質があった同じ製剤中で、復元してもよい。
【００６８】
非経口組成物は、投与の簡便性および投薬量の均一性のために、投薬単位形態で調製してもよい。「投薬単位形態」は、本明細書中で使用される場合、治療される被験体のための単位投薬として適した物理的に別々の単位をいい、各単位は、選択された薬学的支持体と関連して所望の治療効果を生じるよう計算された、予め決定された量の活性化合物を含む。
【００６９】
定量吸入器等の吸入方法の場合、装置は、適切な量の製剤を送達するよう設計される。吸入による投与のために、化合物は、適した噴霧剤、例えば二酸化炭素等の気体を含む加圧された容器もしくはディスペンサー、または噴霧器からの、エアロゾルスプレーの形態で送達される。あるいは、吸入される剤形は、ドライパウダー吸入器を用いて乾燥粉末として提供してもよい。
【００７０】
タンパク質製剤はまた、例えばコアセルベーション技術または界面重合によって調製されるマイクロカプセル、例えばコロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、およびナノカプセル）中またはマクロエマルション中で、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に封入してもよい。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ第１８版に開示されている。
【００７１】
本明細書中に記載されているタンパク質製剤の持続放出調製物もまた、調製してもよい。持続放出調製物の適した例としては、タンパク質製剤を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスが挙げられる。持続放出マトリクスの例としては、ポリエステル、ハイドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。本明細書中に記載されているタンパク質の持続放出製剤は、その生体適合性および広範な生分解性特性のために、ポリ乳酸−コグリコール酸（ＰＬＧＡ）ポリマーを用いて開発することができる。ＰＬＧＡの分解生成物である乳酸およびグリコール酸は、人体内で迅速に除去することができる。さらに、このポリマーの分解性は、その分子量および組成によって、数カ月〜数年に調節することができる。リポソーム組成物を用いて、本明細書中に記載されているタンパク質または抗体を製剤化することもできる。
【００７２】
投薬
製剤の毒性および治療有効性は、例えばＬＤ５０（集団の５０％にとって致死の用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）を判定するために、例えば細胞培養物または実験動物を用いて、当該分野で公知の薬学的手順によって判定することができる。毒性と治療効果との間の用量比は治療指数であり、これは、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。
【００７３】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータを、ヒトにおける使用のための様々な投薬量の製剤化において使用することができる。そのような製剤の投薬量は、一般に、毒性がほとんどないか、または毒性がないＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内にある。投薬量は、採用される剤形および利用される投与の経路によって、この範囲内で変化してもよい。本発明の方法において使用される任意の製剤について、治療有効用量は、最初に、細胞培養アッセイから評価される。用量を、動物モデルにおいて製剤化して、細胞培養物中で判定するとＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半分が達成される試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成してもよい。そのような情報を用いて、ヒトにおける有用な用量を、より正確に判定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって、測定してもよい。
【００７４】
製剤のタンパク質の適切な投薬量は、治療される疾患の型、疾患の重症度および経過、作用物質が予防目的で投与されるのか治療目的で投与されるのか、以前の療法、患者の病歴および作用物質への応答、ならびに主治医の裁量による。製剤は、一般に、投薬量が約０．１ｍｇタンパク質／体重のｋｇ〜１００ｍｇタンパク質／体重のｋｇの間であるように送達される。
【００７５】
製剤がｉｎ ｖｉｖｏ投与のために使用されるために、それらは無菌でなければならない。製剤は、液体の製剤化または凍結乾燥および復元の前、または後に、無菌ろ過膜によるろ過によって無菌にしてもよい。本明細書中の治療組成物は、一般に、無菌の投与口を有する容器、例えば静脈内溶液バッグ、または皮下注射針によって穴を開けることができる栓を有するバイアルに入れる。
【００７６】
製造品
別の実施形態において、本明細書中に記載されている製剤を含み、好ましくはその使用のための説明書を提供する、製造品が提供される。製造品は、製剤を含むのに適した容器を含む。適した容器としては、限定されないが、瓶、バイアル（例えば、デュアルチャンバーバイアル）、注射器（例えば、シングルまたはデュアルチャンバー注射器）、試験管、噴霧器、吸入器（例えば、定量吸入器またはドライパウダー吸入器）、またはデポーが挙げられる。容器は、ガラス、金属またはプラスチック（例えば、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリプロピレン）等の種々の物質から形成してもよい。容器は製剤を保持し、容器上または容器と関連したラベルは、復元および／または使用のための使用法を示す。ラベルは、製剤が皮下投与に有用または意図されることをさらに示してもよい。製剤を保持している容器は、製剤の繰り返し投与（例えば、２〜６回の投与）を可能にするマルチユースバイアルであってもよい。製造品は、適した希釈液（例えば、ＷＦＩ、０．９％ ＮａＣｌ、ＢＷＦＩ、リン酸緩衝生理食塩水）を含む第二の容器をさらに含んでもよい。製造品が、凍結乾燥された種類のタンパク質製剤を含む場合、希釈液を凍結乾燥製剤と混合することによって、一般に少なくとも２０ｍｇ／ｍｌの、復元された製剤中の最終タンパク質濃度が提供される。製造品は、他のバッファー、希釈液、フィルター、針、注射器、および使用のための説明書を有する添付文書を含む、商業的および使用者の観点から望ましい他の物質をさらに含んでもよい。
【００７７】
本出願において参照された全ての雑誌記事、特許、特許出願、および他の刊行物は、それらの全体が、参照によって援用される。本出願の内容と参照によって援用されるもののいずれかとの間に何らかの不一致がある場合、本出願が適用されると理解されるべきである。
【００７８】
本発明は、以下の実施例の参照によって、より完全に理解される。しかしながら、これらは、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【００７９】
実施例１
上昇した温度での保存に供された抗Ｂ７．２抗体製剤におけるタンパク質凝集に対するメチオニンの効果
この実施例は、メチオニンがタンパク質製剤中のタンパク質の凝集を減少させることができるかどうかを説明する。具体的には、下記の実験は、４０℃での保存に供された抗Ｂ７．２抗体製剤中の抗Ｂ７．２抗体（ＩｇＧ２、κ軽鎖、図９参照）の凝集に対するメチオニンの効果を試験することを対象とする。Ｂ７．２は、Ｂ細胞上で発現される共刺激リガンドであり、Ｔ細胞表面分子、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４と相互作用することができる。
【００８０】
種々のｐＨレベルで液体として製剤化された抗Ｂ７．２抗体の凝集に対する、メチオニンを添加することの効果を、１２週間の期間にわたって調査し、この間、製剤は４０℃で保存した。抗Ｂ７．２抗体を、１０ｍＭメチオニンおよび０．０１％ポリソルベート−８０の存在下および非存在下で、種々のｐＨレベルで、１ｍｇ／ｍｌで製剤化した。最初、６週間後、および１２週間後に、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによってこれらの時点での製剤中の高分子量（％ＨＭＷ）種のパーセンテージを測定することによって、凝集レベルを測定した。％ＨＭＷの増大は、凝集の指標である。
【００８１】
各製剤の最初の％ＨＭＷレベルは、およそ同じ（約１〜２％、図１ａ参照）であった。しかしながら、４０℃での６週間および１２週間の保存の後、メチオニンを欠く製剤中、特にポリソルベート−８０を含んでメチオニンを欠き、６．０〜６．６の範囲のｐＨレベルで調製された試料中で、％ＨＭＷは増大した（図１ｂおよび１ｃ参照）。製剤中のメチオニンの存在によって、ポリソルベート−８０のない試料中で、％ＨＭＷが最初のレベルの近くで維持された。メチオニンを含むがポリソルベート−８０を欠く試料と比較して、ポリソルベート−８０およびメチオニンの両方を含む試料中でタンパク質凝集の増大があったが、タンパク質凝集のレベルは、ポリソルベート−８０を含むがメチオニンを欠く試料中よりも有意に低かった（図１ｂおよび１ｃ参照）。
【００８２】
要約すると、これらの実験から、メチオニンによって、ポリソルベート−８０の存在下および非存在下の両方で、上昇した温度に供された製剤中の抗Ｂ７．２抗体の凝集が減少したことが示される。
【００８３】
実施例２
上昇した温度に供された抗Ｂ７．１抗体製剤におけるタンパク質凝集に対するメチオニンの効果
この実施例は、メチオニンがタンパク質製剤中のタンパク質の凝集を減少させることができるかどうかをさらに説明する。下記の実験は、４０℃での保存に供された抗Ｂ７．１抗体製剤中の抗Ｂ７．１抗体（ＩｇＧ２、κ軽鎖、図８参照）の凝集に対するメチオニンの効果を試験することを対象とする。Ｂ７．１は、Ｂ細胞上で発現される共刺激リガンドであり、Ｔ細胞表面分子、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４と相互作用することができる。
【００８４】
種々のｐＨレベルで液体として製剤化された抗Ｂ７．１抗体の凝集に対する、メチオニンを添加することの効果を、１２週間の期間にわたって調査し、この間、製剤は４０℃で保存した。抗Ｂ７．１抗体を、１０ｍＭメチオニンおよび０．０１％ポリソルベート−８０の存在下および非存在下で、種々のｐＨレベルで、１ｍｇ／ｍｌで製剤化した。最初、および１２週間後に、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによってこれらの時点での製剤中の高分子量（％ＨＭＷ）種のパーセンテージを測定することによって、凝集レベルを測定した。
【００８５】
各製剤の最初の％ＨＭＷレベルは、およそ同じ（約１％、図２ａ参照）であった。ポリソルベート−８０の存在下でメチオニンを欠く、４０℃で１２週間の抗Ｂ７．１抗体製剤の保存は、クエン酸およびコハク酸バッファー中４．７〜６．３のｐＨ範囲で％ＨＭＷの小さな増大を生じた（図２ｂ参照）。％ＨＭＷの、より有意な増大は、ヒスチジンバッファー中６〜６．６のｐＨ範囲で生じた（図２ｂ参照）。タンパク質製剤へのメチオニンの添加によって、％ＨＭＷレベルが低下した。これは、ヒスチジンバッファーおよびポリソルベート−８０中で製剤化された抗Ｂ７．１抗体の場合に最も明確に見られ、メチオニンによって、％ＨＭＷレベルが、４０℃で１２週間の後、最少の１．２％に維持された。
【００８６】
要約すると、これらの実験から、メチオニンによって、ポリソルベート−８０の存在下および非存在下の両方で、４０℃で保存された製剤中の抗Ｂ７．１抗体の凝集が減少したことが示される。
【００８７】
実施例３
長期間の保存に供された抗ＣＤ２２抗体製剤におけるタンパク質凝集に対するメチオニンの効果
この実験は、抗ＣＤ２２抗体製剤中のタンパク質凝集に対する、メチオニンを添加することの効果を試験することを対象とする（図１０参照）。ＣＤ２２は、２−６−連結シアル酸残基を含むオリゴ糖に結合し、分化の後期の間にＢ細胞の表面で発現される、１３５ｋＤのＢ細胞制限シアロ糖タンパク質である。これは、Ｂ細胞活性化において役割を果たし、接着分子として作用するようである。ＣＤ２２および抗ＣＤ２２は、白血病、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、およびある種の自己免疫状態の治療において有用であると考えられている。
【００８８】
２５〜２６ｍｇ／ｍｌの抗ＣＤ２２（ＩｇＧ４、κ軽鎖）を、１０ｍＭコハク酸バッファー、ｐＨ６中で液体として製剤化した。これらの製剤はまた、１０ｍＭメチオニンおよび０．０１％ポリソルベート−８０の一方または両方のいずれかを含んでいた。得られた抗ＣＤ２２製剤を、２５℃および−８０℃で、１カ月〜３６カ月の間保存し、製剤中の％ＨＭＷレベルをＳＥＣ−ＨＰＬＣによって評価した。
【００８９】
−８０℃で保存された全ての製剤の％ＨＭＷレベルは、およそ同じ（約０．５％）であった（図３ａ参照）。対照的に、２５℃で長期の保存は、％ＨＭＷレベルの増大を生じた（図３ｂ参照）。この増大は、メチオニンが製剤中に存在する場合、実質的に低下した。注目すべきことに、ポリソルベート−８０およびメチオニンとともに製剤化された抗ＣＤ２２製剤は、メチオニンを含むがポリソルベート−８０を欠いて製剤化された試料とおよそ同じ％ＨＭＷ種を生じた。
【００９０】
これらのデータから、メチオニンによって、ポリソルベート−８０の存在下または非存在下の両方で、長期間の保存における抗ＣＤ２２抗体製剤のタンパク質凝集が低下することが示される。
【００９１】
実施例４
高温での保存に供されたＰＳＧＬ−Ｉｇ製剤におけるタンパク質凝集に対するメチオニンの効果
この実施例は、メチオニンがタンパク質、特に融合タンパク質における凝集を防ぐことができるかどうかの別の説明を提供する。この実験は、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１−免疫グロブリン（ＰＳＧＬ−Ｉｇ）融合タンパク質製剤におけるタンパク質凝集に対する、メチオニンを添加することの効果を試験することを対象とした。ＰＳＧＬ−１は、全ての白血球上で構成的に発現される、２つの１２０ｋＤａのポリペプチド鎖からなる２４０ｋＤａのホモ二量体である。ＰＳＧＬ−１は、微柔毛の先端上で主に見出される。ＰＳＧＬ−１は、適切な糖で装飾された場合、内皮上でＰ−セレクチンに結合することができる。
【００９２】
融合タンパク質Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−Ｉｇ（ＰＳＧＬ−Ｉｇ）の凝集に対するメチオニンの効果を、種々の温度で調査した。ＰＳＧＬ−Ｉｇを、１０ｍＭメチオニンの存在下および非存在下で、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％ポリソルベート−８０、ｐＨ７．５中で液体製剤として製剤化した。試料を、−８０℃、２５℃、および４０℃で保存し、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって、４週間の期間にわたって％ＨＭＷについて評価した。
【００９３】
全ての試料中の最初の％ＨＭＷレベルは同様であり、メチオニンの存在または非存在にかかわらず、−８０℃で保存された試料中で変化しないままであった（図４参照）。２５℃および４０℃での保存は、経時的に増大した凝集を生じた。しかしながら、その凝集は、メチオニンとともに製剤化された試料中で減少した。
【００９４】
実施例５
せん断力に供されたＰＳＧＬ−Ｉｇ製剤におけるタンパク質凝集に対するメチオニンの効果
この実施例は、メチオニンによって、せん断力に供されたタンパク質の凝集が減少することを説明する。
【００９５】
ＰＳＧＬ−Ｉｇ融合タンパク質を、１０ｍＭメチオニンの存在下および非存在下で、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％ポリソルベート−８０、ｐＨ７．５中で液体として製剤化した。得られた製剤を、振とうせずにおくか、または２５０ｒｐｍで９６時間の振とうに供した。
【００９６】
メチオニンを含むか、または欠いている、振とうされていない試料は、非常に類似した％ＨＭＷレベル（０．６および０．７％）を有した（図５参照）。対照的に、メチオニンを欠く、振とうされた試料は、上昇した％ＨＭＷを含んでいた（４．２％および４．４％）。振とうに供された製剤へのメチオニンの添加によって、１．０および２．２％への％ＨＭＷレベルの低下が生じた。
【００９７】
これらのデータから、メチオニンによって、せん断力に供されたタンパク質の凝集が減少することが示される。
【００９８】
実施例６
暗所中で保存されたＲＥＦＡＣＴＯ（商標）タンパク質製剤のタンパク質凝集に対するメチオニンの効果
この実験は、メチオニンがタンパク質における、具体的には組換えタンパク質における凝集を防ぐことができるかどうかのさらに別の実施例を提供する。さらに説明するために、第ＶＩＩＩ因子欠損を矯正するために使用される組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質であるＲＥＦＡＣＴＯ（商標）（図１１参照）をこの実験において使用した。
【００９９】
ＲＥＦＡＣＴＯ（商標）の安定性に対するメチオニンの効果を、１カ月の安定性試験にわたって調査した。ＲＥＦＡＣＴＯ（商標）を、２０ｍＭヒスチジンバッファー中約２５０ＩＵ／ｍｌで、液体として製剤化した。これらの製剤のいくつかはまた、１０ｍＭメチオニンおよび１０ｍＭクエン酸塩を含んでいた。製剤の全ては、４ｍＭ塩化カルシウムおよび３１０ｍＭ塩化ナトリウム、および０．０２％ Ｔｗｅｅｎ−８０を含んでいた。製剤のｐＨは６．５であった。試料を室温で暗所中に、およそ１カ月間保存した。上述のように対照試料を製剤化し、−８０℃で保存した。凝集物形成をＳＥＣ−ＨＰＬＣによって評価した。
【０１００】
対照試料において、メチオニンおよびクエン酸塩の存在にかかわらず、％ＨＭＷレベルは同じのままであった（表１参照）。メチオニンおよびクエン酸塩のないヒスチジンバッファー製剤において、％ＨＭＷは、暗所中で１カ月間の保存の後に２６〜２７％であり、高レベルの凝集が示された。しかしながら、メチオニンおよびクエン酸塩を含むヒスチジンバッファー製剤において、凝集は、７〜８％のみの％ＨＭＷで、同じ期間にわたって減少した。
【０１０１】
【表１】
【０１０２】
実施例７
蛍光下で保存されたＲＥＦＡＣＴＯ（商標）タンパク質製剤のタンパク質凝集に対するメチオニンの効果
この一連の実験において、蛍光に曝露されたＲＥＦＡＣＴＯ（商標）の断片化に対するメチオニンの効果を、１カ月の期間にわたって調査した。
【０１０３】
ＲＥＦＡＣＴＯ（商標）を、２０ｍＭヒスチジンまたは２０ｍＭコハク酸塩バッファー中約２５０ＩＵ／ｍｌで、液体として製剤化した。これらの製剤のいくつかはまた、１０ｍＭメチオニンおよび１０ｍＭクエン酸塩を含んでいた。製剤の全ては、４ｍＭ塩化カルシウムおよび３１０ｍＭ塩化ナトリウム、および０．０２％ Ｔｗｅｅｎ−８０を含んでいた。製剤のｐＨは６．５であった。試料を、蛍光下、室温でおよそ１カ月間保存し、凝集物形成をＳＥＣ−ＨＰＬＣによって評価した。対照試料を上述のように製剤化し、−８０℃で保存した。
【０１０４】
対照試料において、メチオニンおよびクエン酸塩の存在にかかわらず、％ＨＭＷレベルは０％ＨＭＷで変化しないままであった（表２参照）。メチオニンおよびクエン酸塩のないＵＳＰグレードヒスチジン緩衝製剤において、蛍光下で１カ月の保存の後、％ＨＭＷは２１％であり、高レベルの凝集が示された。しかしながら、メチオニンおよびクエン酸塩を含むＵＳＰグレードヒスチジン緩衝製剤において、凝集は、約２％のみの％ＨＭＷで、同じ期間にわたって減少した（表３参照）。
【０１０５】
同様に、メチオニンおよびクエン酸塩を欠くコハク酸塩緩衝製剤において、％ＨＭＷは２５％であったが、メチオニンおよびクエン酸塩を含むコハク酸塩緩衝製剤は、９％ＨＭＷしか有さなかった（表３参照）。
【０１０６】
したがって、メチオニンおよびクエン酸塩によって、メチオニンおよびクエン酸塩なしで製剤化されたＲＥＦＡＣＴＯ（商標）と比較して、ヒスチジンまたはコハク酸バッファー中で製剤化され、蛍光下で保存されたＲＥＦＡＣＴＯ（商標）の凝集が低下した。
【０１０７】
【表２】
【０１０８】
【表３】
【０１０９】
実施例８
ＲＥＦＡＣＴＯ（商標）の効力に対するメチオニンの効果
暗所中に維持されたか蛍光に曝露されたかのいずれかのＲＥＦＡＣＴＯ（商標）の効力に対するメチオニンの効果を、１カ月の期間にわたって調査した。ＲＥＦＡＣＴＯ（商標）を、２０ｍＭヒスチジンまたは２０ｍＭコハク酸塩バッファー中約２５０ＩＵ／ｍｌで、液体として製剤化した。これらの製剤のいくつかはまた、１０ｍＭメチオニンまたは１０ｍＭクエン酸塩を含んでいた。試料を蛍光または暗所状態に、室温で１カ月間曝露した。
【０１１０】
ＲＥＦＡＣＴＯ（商標）は、蛍光に曝露されたいずれかの試料において、室温で１カ月間の保存の後、メチオニンおよびクエン酸塩なしで製剤化された緩衝溶液において、効力の大きな喪失を被った（図６参照）。メチオニンの存在下、暗所中で保存されたＲＥＦＡＣＴＯ（商標）は、効力に対する有害な影響を被らなかったが、メチオニンの存在下で、蛍光下で保存されたＲＥＦＡＣＴＯ（商標）は、効力のいくらかの喪失を被ったが、効力の完全な喪失を生じたメチオニンを欠いて保存された試料よりも高い効力を依然として保持していた。
【０１１１】
実施例９
酸化によってｒｈＩＬ−１１の多量体化が低下する
この実験は、ＩＬ−１１多量体化に対するメチオニン添加の効果を試験することを対象とした。
【０１１２】
４００個のバイアルに０．１ｍｇ／ｍｌで組換えヒトＩＬ−１１（ｒｈＩＬ−１１）薬物物質（５ｍｌ管系バイアルを充填する１．０ｍｌ）を手作業で充填し、ｒｈＩＬ−１１のための標準的な凍結乾燥サイクルを用いて凍結乾燥した。２００個のバイアルは、１０ｍＭ ＮａＰＯ４、３００ｍＭグリシン、ｐＨ７．０とともに製剤化されたｒｈＩＬ−１１を含み、残りは１０ｍＭ ＮａＰＯ４、３００ｍＭグリシン、１０ｍＭメチオニン、ｐＨ７．０とともに製剤化した。４つの異なる１３ｍｍ栓を容器閉鎖として使用した。各型の栓を１００個のバイアル上で使用した。栓をすすぎ、煮沸し、次いでオートクレーブした。次いで、栓の半分を１００℃で１６時間乾燥させた。バイアルを、４℃、４０℃、および５０℃で２週間および４週間の、短期間の促進された安定性に置いた。バイアルをＴ＝０ならびに２週間および４週間に、Ｍｅｔ５８酸化および多量体形成についてアッセイした。ＲＰ−ＨＰＬＣ（低負荷）を用いてｒｈＩＬ−１１中のＭｅｔ５８の酸化度を判定したが、ＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いてｒｈＩＬ−１１多量体の発生をモニタリングした。
【０１１３】
最初のプロットを構築して、酸化と多量体化との間の任意の直接相関について試験した（図７参照）。これらのデータから、酸化のレベルが高い場合、多量体レベルが低く、酸化のレベルが低い場合、多量体レベルが高いことが示された。
【０１１４】
これらのデータから、ｒｈＩＬ−１１の酸化および多量体化が反対の環境下で生じるようであることが示される。パラメーターを最適化してｒｈＩＬ−１１の酸化を最小限にする場合、多量体化は増大する。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１Ａ】図１Ａは、示されたｐＨレベルで１０ｍＭメチオニン（Ｍｅｔ）および０．０１％ポリソルベート−８０（ＰＳ）の存在下および非存在下で製剤化された抗Ｂ７．２製剤中の高分子量（％ＨＭＷ）種の最初のパーセンテージを示す棒グラフである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、４０℃での６週間の保存の後の、示されたｐＨレベルで１０ｍＭメチオニン（Ｍｅｔ）および０．０１％ポリソルベート−８０（ＰＳ）の存在下および非存在下で製剤化された抗Ｂ７．２製剤中の％ＨＭＷ種を示す棒グラフである。
【図１Ｃ】図１Ｃは、４０℃での１２週間の保存の後の、示されたｐＨレベルで１０ｍＭメチオニン（Ｍｅｔ）および０．０１％ポリソルベート−８０（ＰＳ）の存在下および非存在下で製剤化された抗Ｂ７．２製剤中の％ＨＭＷ種を示す棒グラフである。
【図２Ａ】図２Ａは、１０ｍＭメチオニン（Ｍｅｔ）および０．０１％ポリソルベート−８０（ＰＳ）の存在下および非存在下でクエン酸、コハク酸、およびヒスチジンバッファー（種々のｐＨ範囲にわたる）中で製剤化された抗Ｂ７．１抗体製剤中の最初の％ＨＭＷ種を示す棒グラフである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、４０℃での１２週間の保存の後の、示されたｐＨレベルで１０ｍＭメチオニン（Ｍｅｔ）および０．０１％ポリソルベート−８０（ＰＳ）の存在下および非存在下でクエン酸、コハク酸、およびヒスチジンバッファー（種々のｐＨ範囲にわたる）中で製剤化された抗Ｂ７．１抗体製剤中の％ＨＭＷ種を示す棒グラフである。
【図３Ａ】図３Ａは、−８０℃で１カ月〜３６カ月の保存の後の、抗ＣＤ２２抗体製剤中に存在する％ＨＭＷ種を示す棒グラフである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、２５℃で１カ月〜３６カ月の保存の後の、抗ＣＤ２２抗体製剤中に存在する％ＨＭＷ種を示す棒グラフである。
【図４】図４は、−８０℃、２５℃、および４０℃で４週間までの保存の後の、メチオニンありまたはなしで製剤化されたＰＳＧＬ−Ｉｇタンパク質製剤中に存在する％ＨＭＷ種を示すグラフである。
【図５】図５は、メチオニンの存在下（Ｓ−１およびＳ−２）または非存在（Ｃ）でせん断力に供されたＰＳＧＬ−Ｉｇタンパク質製剤中の％ＨＭＷ種を示す棒グラフである。
【図６】図６は、１カ月の期間にわたって明および暗状態に曝露された後の、メチオニンありまたはなしでヒスチジンまたはコハク酸バッファー中で製剤化されたＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標）の効力を示す棒グラフである。
【図７】図７は、ｒｈＩＬ−１１酸化と多量体化との間の相関を示す略図である。
【図８】図８は、抗Ｂ７．１抗体の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列を示す図である。予測される分子内ジスルフィド結合を、関与するシステイン残基の連結によって図解する。分子内ジスルフィド結合を形成すると予想されるシステインに下線を引き、連結性を示す。エフェクター機能を減少させるＦｃ部分中の２つの変化した残基を囲む。Ｎ結合型糖鎖合成コンセンサス部位は太字のイタリック体である。
【図９】図９は、抗Ｂ７．２抗体の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列を示す図である。予測される分子内ジスルフィド結合を、関与するシステイン残基の連結によって図解する。分子内ジスルフィド結合を形成すると予想されるシステインに下線を引き、連結性を示す。エフェクター機能を減少させるＦｃ部分中の２つの変化した残基を囲む。Ｎ結合型糖鎖合成コンセンサス部位は太字のイタリック体である。
【図１０】図１０は、抗ＣＤ２２抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を示す図である。下線を引かれた配列はシグナル配列であり、相補性決定領域は太字のイタリック体で示す。Ｎ結合型糖鎖合成の可能性のある部位に下線を引く。
【図１１】図１１は、ＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標）のアミノ酸配列を示す図である（Ｓａｎｄｂｅｒｇ Ｈ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂ−Ｄｏｍａｉｎ Ｄｅｌｅｔｅｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ、Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、第３８巻第２号、補足４、４〜１２頁、２００１年４月参照）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質製剤中のタンパク質の凝集を減少させるための方法であって、約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭの濃度までメチオニンを製剤に添加することを含み、メチオニンを欠く製剤中のタンパク質と比較して、製剤中のタンパク質の凝集が減少する方法。
【請求項２】
タンパク質製剤が液体製剤または凍結乾燥粉末である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
タンパク質が、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３００ｍｇ／ｍｌの濃度である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
タンパク質製剤が界面活性物質を含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
タンパク質製剤が、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、グリシン、およびグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸を含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
タンパク質製剤が張性調節物質を含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
タンパク質製剤が糖を含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
タンパク質製剤が、製剤のタンパク質の凝集を減少させる作用物質をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
タンパク質凝集がメチオニン酸化の結果でない、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
製剤のタンパク質の凝集が、メチオニンを製剤に添加する前および／または添加した後に評価される、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
凝集が、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、ＡＵＣ、光散乱、およびＵＶ吸光度によって評価される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
凝集が％ＨＭＷ種によって評価され、メチオニンを欠く製剤中の％ＨＭＷ種と比較して％ＨＭＷ種が約３０％減少する、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
製剤のタンパク質の凝集が、タンパク質製剤にメチオニンを添加してから１週間〜１２週間後、またはタンパク質製剤にメチオニンを添加してから１カ月〜３６カ月後に評価される、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
製剤のタンパク質の凝集が、メチオニンとともにタンパク質製剤を製剤化した後タンパク質製剤を４℃〜５０℃の温度で約１週間〜約１２週間保存した後に評価される、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
製剤のタンパク質の凝集が、メチオニンとともにタンパク質製剤を製剤化した後タンパク質製剤を４℃〜３０℃の温度で約１カ月〜約３６カ月間保存した後に評価される、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
製剤のタンパク質の凝集が、せん断力、保存、高い温度での保存、光への曝露、ｐＨ、界面活性物質の存在、およびそれらの組合せの結果である、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
約１ｍＭ〜２５ｍＭの終濃度までメチオニンが製剤に添加される、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
製剤が約５．０〜７．０のｐＨを有する、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
タンパク質製剤が、クエン酸、コハク酸、ヒスチジン、Ｔｒｉｓ、およびそれらの組合せからなる群から選択されるバッファーを含む、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
製剤の貯蔵寿命を増大させるか、または製剤の効力を維持する、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
タンパク質がメチオニン残基を欠くか、または５個未満のメチオニン残基を含む、請求項１記載の方法。
【請求項２２】
せん断力に供されたタンパク質製剤中のタンパク質の凝集を減少させるための方法であって、約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭの濃度までメチオニンを製剤に添加することを含み、メチオニンを欠く製剤中のタンパク質と比較して、製剤中のタンパク質の凝集が減少する方法。
【請求項２３】
せん断力が、振とう、注射器への引き込みおよび精製手順、ならびにそれらの組合せの結果である、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
室温で１日を超える製剤の保存後のタンパク質製剤中のタンパク質の効力または生物活性の喪失を減少させる方法であって、約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭの濃度までメチオニンを製剤に添加し、それによって、メチオニンを欠く製剤中のタンパク質と比較して、製剤中のタンパク質の効力または生物活性の喪失を減少させることを含む方法。
【請求項２５】
タンパク質製剤が蛍光下で保存される、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
タンパク質製剤が暗所中で約１カ月間保存される、請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
タンパク質製剤中のタンパク質の凝集を減少させるための方法であって、
（ｉ）約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭの濃度までメチオニンを製剤に添加することと、
（ｉｉ）ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって製剤のタンパク質の％ＨＭＷレベルを判定することと
を含み、メチオニンを欠く製剤中のタンパク質と比較して、製剤中のタンパク質の凝集が減少する方法。
【請求項２８】
ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって判定すると約５％未満のＨＭＷ種を有するタンパク質製剤を生じる、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
抗Ｂ７．１抗体、抗Ｂ７．２抗体、抗ＣＤ２２抗体、ＰＳＧＬ−Ｉｇおよび第ＶＩＩＩ因子、またはそれらの生物活性断片の１つ、ならびに約０．５ｍＭ〜５０ｍＭメチオニンを含むタンパク質製剤。
【請求項３０】
１〜１５０ｍＭの、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸をさらに含む、請求項２９記載の製剤。
【請求項１】
タンパク質製剤中のタンパク質の凝集を減少させるための方法であって、約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭの濃度までメチオニンを製剤に添加することを含み、メチオニンを欠く製剤中のタンパク質と比較して、製剤中のタンパク質の凝集が減少する方法。
【請求項２】
タンパク質製剤が液体製剤または凍結乾燥粉末である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
タンパク質が、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３００ｍｇ／ｍｌの濃度である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
タンパク質製剤が界面活性物質を含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
タンパク質製剤が、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、グリシン、およびグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸を含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
タンパク質製剤が張性調節物質を含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
タンパク質製剤が糖を含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
タンパク質製剤が、製剤のタンパク質の凝集を減少させる作用物質をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
タンパク質凝集がメチオニン酸化の結果でない、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
製剤のタンパク質の凝集が、メチオニンを製剤に添加する前および／または添加した後に評価される、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
凝集が、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、ＡＵＣ、光散乱、およびＵＶ吸光度によって評価される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
凝集が％ＨＭＷ種によって評価され、メチオニンを欠く製剤中の％ＨＭＷ種と比較して％ＨＭＷ種が約３０％減少する、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
製剤のタンパク質の凝集が、タンパク質製剤にメチオニンを添加してから１週間〜１２週間後、またはタンパク質製剤にメチオニンを添加してから１カ月〜３６カ月後に評価される、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
製剤のタンパク質の凝集が、メチオニンとともにタンパク質製剤を製剤化した後タンパク質製剤を４℃〜５０℃の温度で約１週間〜約１２週間保存した後に評価される、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
製剤のタンパク質の凝集が、メチオニンとともにタンパク質製剤を製剤化した後タンパク質製剤を４℃〜３０℃の温度で約１カ月〜約３６カ月間保存した後に評価される、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
製剤のタンパク質の凝集が、せん断力、保存、高い温度での保存、光への曝露、ｐＨ、界面活性物質の存在、およびそれらの組合せの結果である、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
約１ｍＭ〜２５ｍＭの終濃度までメチオニンが製剤に添加される、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
製剤が約５．０〜７．０のｐＨを有する、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
タンパク質製剤が、クエン酸、コハク酸、ヒスチジン、Ｔｒｉｓ、およびそれらの組合せからなる群から選択されるバッファーを含む、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
製剤の貯蔵寿命を増大させるか、または製剤の効力を維持する、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
タンパク質がメチオニン残基を欠くか、または５個未満のメチオニン残基を含む、請求項１記載の方法。
【請求項２２】
せん断力に供されたタンパク質製剤中のタンパク質の凝集を減少させるための方法であって、約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭの濃度までメチオニンを製剤に添加することを含み、メチオニンを欠く製剤中のタンパク質と比較して、製剤中のタンパク質の凝集が減少する方法。
【請求項２３】
せん断力が、振とう、注射器への引き込みおよび精製手順、ならびにそれらの組合せの結果である、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
室温で１日を超える製剤の保存後のタンパク質製剤中のタンパク質の効力または生物活性の喪失を減少させる方法であって、約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭの濃度までメチオニンを製剤に添加し、それによって、メチオニンを欠く製剤中のタンパク質と比較して、製剤中のタンパク質の効力または生物活性の喪失を減少させることを含む方法。
【請求項２５】
タンパク質製剤が蛍光下で保存される、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
タンパク質製剤が暗所中で約１カ月間保存される、請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
タンパク質製剤中のタンパク質の凝集を減少させるための方法であって、
（ｉ）約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭの濃度までメチオニンを製剤に添加することと、
（ｉｉ）ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって製剤のタンパク質の％ＨＭＷレベルを判定することと
を含み、メチオニンを欠く製剤中のタンパク質と比較して、製剤中のタンパク質の凝集が減少する方法。
【請求項２８】
ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって判定すると約５％未満のＨＭＷ種を有するタンパク質製剤を生じる、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
抗Ｂ７．１抗体、抗Ｂ７．２抗体、抗ＣＤ２２抗体、ＰＳＧＬ−Ｉｇおよび第ＶＩＩＩ因子、またはそれらの生物活性断片の１つ、ならびに約０．５ｍＭ〜５０ｍＭメチオニンを含むタンパク質製剤。
【請求項３０】
１〜１５０ｍＭの、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸をさらに含む、請求項２９記載の製剤。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【公表番号】特表２００９−５３０３８０（Ｐ２００９−５３０３８０Ａ）
【公表日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５０１４８７（Ｐ２００９−５０１４８７）
【出願日】平成１９年３月１９日（２００７．３．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００６７８７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０９２２１
【国際公開日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【出願人】（５９１０１１５０２）ワイス (573)
【氏名又は名称原語表記】Ｗｙｅｔｈ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月１９日（２００７．３．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００６７８７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０９２２１
【国際公開日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【出願人】（５９１０１１５０２）ワイス (573)
【氏名又は名称原語表記】Ｗｙｅｔｈ
【Ｆターム（参考）】
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