タンパク質足場
本発明は、タンパク質足場ならびにそのようなタンパク質足場を調製、スクリーニング、操作および使用する方法を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えポリペプチド足場であって、
I. A、B、C、D、E、FおよびGと命名された7個のβ鎖ドメイン；
II. 前記7個のβ鎖ドメインが6個のループ領域に連結され、該ループ領域がそれぞれのβ鎖を接続し、AB、BC、CD、DE、EF、およびFGループと命名された、前記6個のループ領域、
を含み、
III. 少なくとも1個のループ領域が配列番号1〜32もしくは68〜88のいずれかにおける同族ループ領域の非天然変異体であり、および、
IV. 少なくとも1個のβ鎖ドメインが配列番号1〜32もしくは68〜88のいずれかにおける同族β鎖ドメインに対して少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、または少なくとも90％、少なくとも95％もしくは少なくとも99％の相同性を有する、
前記足場。
【請求項２】
前記β鎖ドメインが、配列番号1〜32もしくは68〜88のいずれかによりコードされるポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の足場。
【請求項３】
前記β鎖ドメインが、
a. Aβ鎖(配列番号228)、Bβ鎖(配列番号229)、Cβ鎖(配列番号230)、Dβ鎖(配列番号231)、Eβ鎖(配列番号232)、Fβ鎖(配列番号233)およびGβ鎖(配列番号234)のアミノ酸配列；または
b. Aβ鎖(配列番号235)、Bβ鎖(配列番号229)、Cβ鎖(配列番号230)、Dβ鎖(配列番号236)、Eβ鎖(配列番号232)、Fβ鎖(配列番号237)およびGβ鎖(配列番号234)のアミノ酸配列、
を含む、請求項１に記載の足場。
【請求項４】
前記BCループが、S-X-a-X-b-X-X-X-G(式中、Xは任意のアミノ酸であり、(a)はプロリンまたはアラニンであり、(b)はアラニンまたはグリシンである)の配列を有する9個のアミノ酸を含む、請求項３に記載の足場。
【請求項５】
前記BCループが、S-P-c-X-X-X-X-X-X-T-G(式中、Xは任意のアミノ酸であり、(c)はプロリン、セリンまたはグリシンである)の配列を有する11個のアミノ酸を含む、請求項３に記載の足場。
【請求項６】
前記BCループが、A-d-P-X-X-X-e-f-X-I-X-G(式中、Xは任意のアミノ酸であり、(d)はプロリン、グルタミン酸またはリジンであり、(e)はアスパラギンまたはグリシンであり、(f)はセリンまたはグリシンである)の配列を有する12個のアミノ酸を含む、請求項３に記載の足場。
【請求項７】
前記FGループが、X-a-X-X-G-X-X-X-S(式中、Xは任意のアミノ酸であり、(a)はアスパラギン、トレオニンまたはリジンである)の配列を有する9個のアミノ酸を含む、請求項３に記載の足場。
【請求項８】
前記FGループが、X-a-X-X-X-X-b-N-P-A(式中、Xは任意のアミノ酸であり、(a)はアスパラギン、トレオニンまたはリジンであり、(b)はセリンまたはグリシンである)の配列を有する10個のアミノ酸を含む、請求項３に記載の足場。
【請求項９】
前記FGループが、X-a-X-X-G-X-X-S-N-P-A(式中、Xは任意のアミノ酸であり、(a)はアスパラギン、トレオニンまたはリジンである)の配列を有する11個のアミノ酸を含む、請求項３に記載の足場。
【請求項１０】
前記DEループが、X-X-X-X-X-X(式中、Xは任意のアミノ酸である)の配列を有する6個のアミノ酸を含む、請求項３に記載の足場。
【請求項１１】
前記ABループが、配列：K-X-X-X-X-X-a(式中、Xはアスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンであり、(a)はセリン、トレオニン、アラニン、またはグリシンである)を有する7個の残基を含む、請求項３に記載の足場。
【請求項１２】
前記ABループが、配列：K-X-X-X-X-X-X-X-a(式中、Xはアスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンであり、(a)はセリン、トレオニン、アラニン、またはグリシンである)を有する9個の残基を含む、請求項３に記載の足場。
【請求項１３】
前記CDループが、CDループ中のそれぞれの残基が無作為化され、それぞれの残基がアスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンであってよい7、8または9個の残基を含む、請求項３に記載の足場。
【請求項１４】
前記EFループが、配列：X-b-L-X-P-X-c-X(式中、Xはアスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンであり、(b)はアスパラギン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはグリシンであり、(c)はイソロイシン、トレオニン、セリン、バリン、アラニン、またはグリシンである)を有する8個の残基を含む、請求項３に記載の足場。
【請求項１５】
前記足場が、前記7個のβ鎖ドメインのいずれか2個を連結するための少なくとも1個のジスルフィド結合をさらに含む、請求項１に記載の足場。
【請求項１６】
前記ジスルフィド結合が、
a. Aβ鎖とBβ鎖；
b. Dβ鎖とEβ鎖；
c. Fβ鎖とGβ鎖；または
d. Cβ鎖とFβ鎖、
の間の連結を形成する、請求項１５に記載の足場。
【請求項１７】
前記足場が、前記7個のβ鎖ドメインのいずれかを連結するための少なくとも2個のジスルフィド結合をさらに含む、請求項１５に記載の足場。
【請求項１８】
前記ジスルフィド結合が、Fβ鎖とGβ鎖との間の第1の連結、およびCβ鎖とFβ鎖との間の第2の連結を形成する、請求項１７に記載の足場。
【請求項１９】
前記足場が、ループ領域中に少なくとも1個のジスルフィド結合をさらに含む、請求項１に記載の足場。
【請求項２０】
前記足場が、Tn3SS1(配列番号64)、Tn3SS2(配列番号210)、Tn3SS3(配列番号65)、またはTn3SS4(配列番号66)に対応する配列を含む、請求項１５に記載の足場。
【請求項２１】
前記足場が、Tn3SS3+4 (配列番号67)に対応する配列を含む、請求項１７に記載の足場。
【請求項２２】
前記足場が標的に結合する、請求項１または１５に記載の足場。
【請求項２３】
前記標的が、細胞表面抗原、可溶性抗原、固定化抗原、免疫サイレント抗原、細胞内抗原、核内抗原、自己抗原、非自己抗原、癌抗原、細菌抗原、またはウイルス抗原である、請求項２２に記載の足場。
【請求項２４】
前記足場が、示差走査熱量測定法(DSC)による測定で少なくとも40℃の融点(Tm)を示す、請求項１または１５に記載の足場。
【請求項２５】
前記足場が、同様の実験条件下で、ジスルフィド操作の前の同じ足場と比較して、
a. 尿素変性実験における測定で、Cmにおける少なくとも10％；
b. グアニジン変性実験における測定で、Cmにおける少なくとも10％；または
c. プロテアーゼ感度における少なくとも10％；
の安定性の増加を示す、請求項１５に記載の足場。
【請求項２６】
前記足場が異種薬剤にコンジュゲートされたものであり、該薬剤が別の足場、ポリエチレングリコール(PEG)、ヒト血清アルブミン(HSA)、抗体のFc領域、IgG分子、結合ペプチド、細胞傷害剤、放射性標識、画像化剤、His-タグ、ビオチン、Flag-タグ、核酸、またはサイトカインからなる群より選択される、請求項１に記載の足場。
【請求項２７】
請求項１に記載の少なくとも2個の足場を含む多量体足場。
【請求項２８】
前記多量体足場がエピトープ結合ドメインをさらに含む、請求項２７に記載の多量体足場。
【請求項２９】
前記エピトープ結合ドメインが前記足場とは異なる標的に特異的である、請求項２７に記載の多量体足場。
【請求項３０】
前記エピトープ結合ドメインが前記足場のものと同じ標的に特異的である、請求項２７に記載の多量体足場。
【請求項３１】
前記足場が、別の足場、IgG分子もしくはその断片、Fc領域、二量体化ドメイン、化学的架橋、ジスルフィド結合、またはアミノ酸リンカーにより連結される、請求項２７に記載の多量体足場。
【請求項３２】
請求項１に記載の足場をコードする単離された核酸分子。
【請求項３３】
請求項２７に記載の足場をコードする単離された核酸分子。
【請求項３４】
請求項３２に記載の核酸に機能し得る形で連結された発現ベクター。
【請求項３５】
請求項３３に記載の核酸に機能し得る形で連結された発現ベクター。
【請求項３６】
請求項３４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３７】
請求項３５に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３８】
請求項１に記載の足場を含むポリペプチドディスプレイライブラリー。
【請求項３９】
前記足場が、天然タンパク質配列中の対応するループ配列からの少なくとも1個のアミノ酸の欠失、置換または付加により変化する少なくとも2個のループ領域配列を含む、請求項３８に記載のライブラリー。
【請求項４０】
前記2個のループ領域配列が、BC/DE、BC/FG、DE/FG、AB/CD、AB/EF、およびCD/EDループからなる群より選択される、請求項３９に記載のライブラリー。
【請求項４１】
前記足場が、天然タンパク質配列中の対応するループ配列からの少なくとも1個のアミノ酸の欠失、置換または付加により変化する少なくとも3個のループ領域配列を含む、請求項３８に記載のライブラリー。
【請求項４２】
前記ループ領域配列が、AB、BC、CD、DE、EF、およびFGループからなる群より選択される任意の3個のループを含む、請求項３８に記載のライブラリー。
【請求項４３】
前記足場がリボソーム、バクテリオファージ、ウイルス、細菌、または酵母の表面上にディスプレイされる、請求項３８に記載のポリペプチドディスプレイライブラリー。
【請求項４４】
前記ライブラリーが少なくとも106の配列多様性を有する、請求項３８に記載のライブラリー。
【請求項４５】
請求項３８に記載のライブラリーをコードする単離された核酸分子の集団。
【請求項４６】
請求項４５に記載の核酸分子に機能し得る形で連結された発現ベクター。
【請求項４７】
(a)足場：標的リガンド複合体を形成させる条件下で、標的リガンドと請求項３８に記載のライブラリーとを接触させること、および(b)該複合体から、標的リガンドに結合する足場を取得することを含む、標的に結合するポリペプチド足場を取得する方法。
【請求項４８】
工程(b)で得られたタンパク質の足場の少なくとも1個のループを無作為化して、さらに無作為化された足場を作製すること、ならびにさらに無作為化された足場を用いて、工程(a)および(b)を反復することをさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記方法が少なくとも2個のループを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記方法が少なくとも3個のループを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
工程(b)で得られたタンパク質の足場の少なくとも1個のループを無作為化して、さらに無作為化された足場を作製すること、ならびにさらに無作為化された足場を用いて工程(a)および(b)を反復することをさらに含み、工程(a)および(b)の反復が、工程(a)および(b)の第1の操作の標的とは異なる標的を接触させることをさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
工程(b)で得られたタンパク質の足場の少なくとも1個のループであって、前記ライブラリー中で無作為化されなかった前記ループを無作為化して、さらに無作為化された足場を作製すること、ならびにさらに無作為化された足場を用いて、工程(a)および(b)を反復することをさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５３】
工程(b)で得られたタンパク質の足場の少なくとも1個のループであって、前記ライブラリー中で無作為化されなかった前記ループを無作為化して、さらに無作為化された足場を作製すること、ならびにさらに無作為化された足場を用いて、工程(a)および(b)を反復することをさらに含み、工程(a)および(b)の前記反復が、工程(a)および(b)の第1の操作の標的とは異なる標的を接触させることをさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５４】
前記方法が、BC、DE、およびFGループからなる群より選択される第1の無作為化されたループならびにAB、CD、およびEFループからなる群より選択される前記ライブラリー中で無作為化されなかった第2のループを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記方法が、AB、CD、EFループからなる群より選択される第1の無作為化されたループならびにBC、DE、およびFGループからなる群より選択される前記ライブラリー中で無作為化されなかった第2のループを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記方法が、工程(b)で得られたタンパク質の足場の少なくとも1個のβ鎖を無作為化して、さらに無作為化された足場を作製すること、ならびにさらに無作為化された足場を用いて、工程(a)および(b)を反復することをさらに含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記方法が、工程(b)で得られたタンパク質の足場の少なくとも2個、3個、4個、5個、6個または7個のβ鎖を無作為化して、さらに無作為化された足場を作製すること、ならびにさらに無作為化された足場を用いて、工程(a)および(b)を反復することをさらに含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
(a)足場：標的リガンド複合体を形成させる条件下で、標的リガンドと請求項３８に記載のライブラリーとを接触させること、(b)該足場を、該足場の架橋が検出可能な応答を引き出す架橋剤と接触させること、ならびに(c)該複合体から、標的に結合する足場を取得することを含む、標的に結合する少なくとも2個の足場を取得する方法。
【請求項５９】
前記足場が同じエピトープを認識する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記足場が異なるエピトープを認識する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記架橋剤が、抗体、抗体フラグメント、二量体化モチーフ、化学的架橋剤、結合ペプチド、またはエピトープタグからなる群より選択される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
化合物：足場複合体の形成を可能にする条件下で、サンプルと請求項１に記載の足場とを接触させること、該複合体を検出すること、それによって、サンプル中の化合物を検出することを含む、サンプル中の化合物を検出する方法。
【請求項６３】
化合物：足場複合体の形成を可能にする条件下で、サンプルと請求項１に記載の固定された足場とを接触させること、および固定された足場を除去すること、それによって、サンプル中の化合物を捕捉することを含む、サンプル中の化合物を捕捉する方法。
【請求項６４】
請求項１に記載の足場を含む、滅菌された、発熱物質を含まない組成物。
【請求項６５】
請求項１に記載の足場を含む医薬組成物。
【請求項６６】
有効量の請求項６４または６５に記載の組成物を患者に投与することを含む、それを必要とする患者における疾患を予防、治療、管理または改善する方法。
【請求項６７】
請求項６４または６５に記載の組成物を用いてそれを必要とする患者における疾患を診断または画像化する方法。
【請求項６８】
前記方法が、免疫療法、生物療法、化学療法、放射線療法、または小分子薬剤療法である追加療法をさらに含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記疾患が、自己免疫疾患、炎症性疾患、増殖性疾患、感染症、呼吸器疾患、胃腸疾患、糖尿病、狼瘡、または肥満である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
請求項１または１５のいずれかに記載の足場を精製する方法であって、
a. 少なくとも15分間、最大で70℃まで前記足場を含む組成物を加熱すること；または
b. 前記足場を含む組成物をpH 3.0もしくはpH 3.5もしくはpH 4.0、もしくはpH 4.5、もしくはpH 5.0に調整すること；得られる組成物を、1〜30分間、50℃、もしくは55℃、もしくは60℃、もしくは65℃、もしくは70℃で加熱すること；
ならびに続いて、遠心分離により凝集した化合物を除去することを含む、前記方法。
【請求項７１】
請求項１または１５のいずれかに由来する足場の少なくとも1 g/Lの生産効率をもたらす、測定可能な方法。
【請求項７２】
前記方法が、該方法において用いられた培養培地から精製される足場を含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記足場が培養培地中に産生および分泌される、請求項１または１５のいずれかに由来する足場を製造する方法。
【請求項７４】
前記方法が、oppAシグナルペプチド(配列番号227)を含む発現ベクターを用いることを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
請求項７３に記載の方法から得られた無細胞材料を用いて、標的への足場の結合をアッセイまたは検出する方法。
【請求項７６】
請求項７４に記載の方法により製造された足場を精製する方法。
【請求項７７】
前記足場がTRAIL-R2に特異的に結合する、請求項１または１５のいずれかに記載の足場。
【請求項７８】
前記TRAIL-R2がヒトである、請求項７７に記載の足場。
【請求項７９】
前記足場が、前記7個のβ鎖ドメインのいずれか2個を連結するための少なくとも1個のジスルフィド結合をさらに含む、請求項７７に記載の足場。
【請求項８０】
前記足場が、少なくとも2個の足場ドメインを含む多量体足場である、請求項７７に記載の足場。
【請求項８１】
前記少なくとも2個の足場ドメインが、TRAIL-R2上の同じエピトープに結合する、請求項８０に記載の足場。
【請求項８２】
前記少なくとも2個の足場ドメインが、TRAIL-R2上の異なるエピトープに結合する、請求項８０に記載の足場。
【請求項８３】
前記少なくとも1個の足場ドメインが、
a. IgG分子に由来するFc領域；
b. IgG分子に由来するCH1領域；
c. IgG分子に由来するCH2領域；
d. IgG分子に由来するヒンジ領域；または
e. IgG分子に由来するCκもしくはCλ領域、
に機能し得る形で連結される、請求項８０に記載の足場。
【請求項８４】
前記少なくとも1個の足場ドメインが、2D3または1C12である、請求項８０に記載の足場。
【請求項８５】
前記足場が、
a. IgG分子に由来するFc領域；
b. IgG分子に由来するCH1領域；
c. IgG分子に由来するCH2領域；
d. IgG分子に由来するヒンジ領域；または
e. IgG分子に由来するCκもしくはCλ領域、
に機能し得る形で連結された1C12を含む、請求項８４に記載の足場。
【請求項８６】
前記足場が、
a. IgG分子に由来するFc領域；
b. IgG分子に由来するCH1領域；
c. IgG分子に由来するCH2領域；
d. IgG分子に由来するヒンジ領域；または
e. IgG分子に由来するCκもしくはCλ領域、
に機能し得る形で連結された2D3を含む、請求項８４に記載の足場。
【請求項８７】
前記足場が、配列番号126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、147、150、153、156、159、162、165、168、171、174、177、180、183、186、189、192、195、および198からなる群より選択されるBCループ配列を含む、請求項７７に記載の足場。
【請求項８８】
前記足場が、配列番号145、148、151、154、157、160、163、166、169、172、175、178、181、184、187、190、193、196、および199からなる群より選択されるDEループ配列を含む、請求項７７に記載の足場。
【請求項８９】
前記足場が、配列番号127、129、131、133、135、137、139、141、143、146、149、152、155、158、161、164、167、170、173、176、179、182、185、188、191、194、197、および200からなる群より選択されるFGループ配列を含む、請求項７７に記載の足場。
【請求項９０】
前記足場が、2F4、5B10、10D9、6F11、8B3、5E5、2H6、7G11、6C7、1E03、2B04、1C12、1A03、1C10、1B12、2G03、2D3、1C06、2F08、1B04、3B11、1D8、2A12、1E05、2F02、1H05、2A11、または1G11から選択されるTRAIL-R2結合足場から誘導される配列を含む、請求項７７に記載の足場。
【請求項９１】
前記足場が、TRAIL-R2受容体に結合し、
a. TRAIL-R2受容体を作動させ；
b. TRAILのTRAIL-R2受容体への結合を模倣し；
c. TRAIL-R2受容体の二量体化もしくはオリゴマー化を容易にし；
d. アポトーシスを誘導し；または
e. 細胞生存能力を低下させるか、もしくは阻害する、
請求項７７に記載の足場。
【請求項９２】
請求項７７に記載の足場を含む、滅菌された、発熱物質を含まない組成物。
【請求項９３】
請求項７７に記載の足場を含む医薬組成物。
【請求項９４】
TRAIL-R2に結合し、
a. TRAIL-R2受容体を作動させ；
b. TRAILのTRAIL-R2への結合を模倣し；
c. TRAIL-R2受容体の二量体化もしくはオリゴマー化を容易にし；
d. アポトーシスを誘導し；または
e. 細胞生存能力を低下させるか、もしくは阻害する、
請求項７７に記載の足場を使用する方法。
【請求項９５】
請求項９２または９３に記載の組成物の有効量を投与することにより、それを必要とする患者における癌を予防、治療、軽減、または管理する方法。
【請求項９６】
前記癌が、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、非ホジキンリンパ腫、芽細胞腫、胃腸癌、腎癌、卵巣癌、肝臓癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、頭部および頸部癌、肺癌、腺癌、腎細胞癌、または肝細胞癌から選択される、請求項９５に記載の方法。
【請求項１】
組換えポリペプチド足場であって、
I. A、B、C、D、E、FおよびGと命名された7個のβ鎖ドメイン；
II. 前記7個のβ鎖ドメインが6個のループ領域に連結され、該ループ領域がそれぞれのβ鎖を接続し、AB、BC、CD、DE、EF、およびFGループと命名された、前記6個のループ領域、
を含み、
III. 少なくとも1個のループ領域が配列番号1〜32もしくは68〜88のいずれかにおける同族ループ領域の非天然変異体であり、および、
IV. 少なくとも1個のβ鎖ドメインが配列番号1〜32もしくは68〜88のいずれかにおける同族β鎖ドメインに対して少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、または少なくとも90％、少なくとも95％もしくは少なくとも99％の相同性を有する、
前記足場。
【請求項２】
前記β鎖ドメインが、配列番号1〜32もしくは68〜88のいずれかによりコードされるポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の足場。
【請求項３】
前記β鎖ドメインが、
a. Aβ鎖(配列番号228)、Bβ鎖(配列番号229)、Cβ鎖(配列番号230)、Dβ鎖(配列番号231)、Eβ鎖(配列番号232)、Fβ鎖(配列番号233)およびGβ鎖(配列番号234)のアミノ酸配列；または
b. Aβ鎖(配列番号235)、Bβ鎖(配列番号229)、Cβ鎖(配列番号230)、Dβ鎖(配列番号236)、Eβ鎖(配列番号232)、Fβ鎖(配列番号237)およびGβ鎖(配列番号234)のアミノ酸配列、
を含む、請求項１に記載の足場。
【請求項４】
前記BCループが、S-X-a-X-b-X-X-X-G(式中、Xは任意のアミノ酸であり、(a)はプロリンまたはアラニンであり、(b)はアラニンまたはグリシンである)の配列を有する9個のアミノ酸を含む、請求項３に記載の足場。
【請求項５】
前記BCループが、S-P-c-X-X-X-X-X-X-T-G(式中、Xは任意のアミノ酸であり、(c)はプロリン、セリンまたはグリシンである)の配列を有する11個のアミノ酸を含む、請求項３に記載の足場。
【請求項６】
前記BCループが、A-d-P-X-X-X-e-f-X-I-X-G(式中、Xは任意のアミノ酸であり、(d)はプロリン、グルタミン酸またはリジンであり、(e)はアスパラギンまたはグリシンであり、(f)はセリンまたはグリシンである)の配列を有する12個のアミノ酸を含む、請求項３に記載の足場。
【請求項７】
前記FGループが、X-a-X-X-G-X-X-X-S(式中、Xは任意のアミノ酸であり、(a)はアスパラギン、トレオニンまたはリジンである)の配列を有する9個のアミノ酸を含む、請求項３に記載の足場。
【請求項８】
前記FGループが、X-a-X-X-X-X-b-N-P-A(式中、Xは任意のアミノ酸であり、(a)はアスパラギン、トレオニンまたはリジンであり、(b)はセリンまたはグリシンである)の配列を有する10個のアミノ酸を含む、請求項３に記載の足場。
【請求項９】
前記FGループが、X-a-X-X-G-X-X-S-N-P-A(式中、Xは任意のアミノ酸であり、(a)はアスパラギン、トレオニンまたはリジンである)の配列を有する11個のアミノ酸を含む、請求項３に記載の足場。
【請求項１０】
前記DEループが、X-X-X-X-X-X(式中、Xは任意のアミノ酸である)の配列を有する6個のアミノ酸を含む、請求項３に記載の足場。
【請求項１１】
前記ABループが、配列：K-X-X-X-X-X-a(式中、Xはアスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンであり、(a)はセリン、トレオニン、アラニン、またはグリシンである)を有する7個の残基を含む、請求項３に記載の足場。
【請求項１２】
前記ABループが、配列：K-X-X-X-X-X-X-X-a(式中、Xはアスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンであり、(a)はセリン、トレオニン、アラニン、またはグリシンである)を有する9個の残基を含む、請求項３に記載の足場。
【請求項１３】
前記CDループが、CDループ中のそれぞれの残基が無作為化され、それぞれの残基がアスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンであってよい7、8または9個の残基を含む、請求項３に記載の足場。
【請求項１４】
前記EFループが、配列：X-b-L-X-P-X-c-X(式中、Xはアスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンであり、(b)はアスパラギン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはグリシンであり、(c)はイソロイシン、トレオニン、セリン、バリン、アラニン、またはグリシンである)を有する8個の残基を含む、請求項３に記載の足場。
【請求項１５】
前記足場が、前記7個のβ鎖ドメインのいずれか2個を連結するための少なくとも1個のジスルフィド結合をさらに含む、請求項１に記載の足場。
【請求項１６】
前記ジスルフィド結合が、
a. Aβ鎖とBβ鎖；
b. Dβ鎖とEβ鎖；
c. Fβ鎖とGβ鎖；または
d. Cβ鎖とFβ鎖、
の間の連結を形成する、請求項１５に記載の足場。
【請求項１７】
前記足場が、前記7個のβ鎖ドメインのいずれかを連結するための少なくとも2個のジスルフィド結合をさらに含む、請求項１５に記載の足場。
【請求項１８】
前記ジスルフィド結合が、Fβ鎖とGβ鎖との間の第1の連結、およびCβ鎖とFβ鎖との間の第2の連結を形成する、請求項１７に記載の足場。
【請求項１９】
前記足場が、ループ領域中に少なくとも1個のジスルフィド結合をさらに含む、請求項１に記載の足場。
【請求項２０】
前記足場が、Tn3SS1(配列番号64)、Tn3SS2(配列番号210)、Tn3SS3(配列番号65)、またはTn3SS4(配列番号66)に対応する配列を含む、請求項１５に記載の足場。
【請求項２１】
前記足場が、Tn3SS3+4 (配列番号67)に対応する配列を含む、請求項１７に記載の足場。
【請求項２２】
前記足場が標的に結合する、請求項１または１５に記載の足場。
【請求項２３】
前記標的が、細胞表面抗原、可溶性抗原、固定化抗原、免疫サイレント抗原、細胞内抗原、核内抗原、自己抗原、非自己抗原、癌抗原、細菌抗原、またはウイルス抗原である、請求項２２に記載の足場。
【請求項２４】
前記足場が、示差走査熱量測定法(DSC)による測定で少なくとも40℃の融点(Tm)を示す、請求項１または１５に記載の足場。
【請求項２５】
前記足場が、同様の実験条件下で、ジスルフィド操作の前の同じ足場と比較して、
a. 尿素変性実験における測定で、Cmにおける少なくとも10％；
b. グアニジン変性実験における測定で、Cmにおける少なくとも10％；または
c. プロテアーゼ感度における少なくとも10％；
の安定性の増加を示す、請求項１５に記載の足場。
【請求項２６】
前記足場が異種薬剤にコンジュゲートされたものであり、該薬剤が別の足場、ポリエチレングリコール(PEG)、ヒト血清アルブミン(HSA)、抗体のFc領域、IgG分子、結合ペプチド、細胞傷害剤、放射性標識、画像化剤、His-タグ、ビオチン、Flag-タグ、核酸、またはサイトカインからなる群より選択される、請求項１に記載の足場。
【請求項２７】
請求項１に記載の少なくとも2個の足場を含む多量体足場。
【請求項２８】
前記多量体足場がエピトープ結合ドメインをさらに含む、請求項２７に記載の多量体足場。
【請求項２９】
前記エピトープ結合ドメインが前記足場とは異なる標的に特異的である、請求項２７に記載の多量体足場。
【請求項３０】
前記エピトープ結合ドメインが前記足場のものと同じ標的に特異的である、請求項２７に記載の多量体足場。
【請求項３１】
前記足場が、別の足場、IgG分子もしくはその断片、Fc領域、二量体化ドメイン、化学的架橋、ジスルフィド結合、またはアミノ酸リンカーにより連結される、請求項２７に記載の多量体足場。
【請求項３２】
請求項１に記載の足場をコードする単離された核酸分子。
【請求項３３】
請求項２７に記載の足場をコードする単離された核酸分子。
【請求項３４】
請求項３２に記載の核酸に機能し得る形で連結された発現ベクター。
【請求項３５】
請求項３３に記載の核酸に機能し得る形で連結された発現ベクター。
【請求項３６】
請求項３４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３７】
請求項３５に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３８】
請求項１に記載の足場を含むポリペプチドディスプレイライブラリー。
【請求項３９】
前記足場が、天然タンパク質配列中の対応するループ配列からの少なくとも1個のアミノ酸の欠失、置換または付加により変化する少なくとも2個のループ領域配列を含む、請求項３８に記載のライブラリー。
【請求項４０】
前記2個のループ領域配列が、BC/DE、BC/FG、DE/FG、AB/CD、AB/EF、およびCD/EDループからなる群より選択される、請求項３９に記載のライブラリー。
【請求項４１】
前記足場が、天然タンパク質配列中の対応するループ配列からの少なくとも1個のアミノ酸の欠失、置換または付加により変化する少なくとも3個のループ領域配列を含む、請求項３８に記載のライブラリー。
【請求項４２】
前記ループ領域配列が、AB、BC、CD、DE、EF、およびFGループからなる群より選択される任意の3個のループを含む、請求項３８に記載のライブラリー。
【請求項４３】
前記足場がリボソーム、バクテリオファージ、ウイルス、細菌、または酵母の表面上にディスプレイされる、請求項３８に記載のポリペプチドディスプレイライブラリー。
【請求項４４】
前記ライブラリーが少なくとも106の配列多様性を有する、請求項３８に記載のライブラリー。
【請求項４５】
請求項３８に記載のライブラリーをコードする単離された核酸分子の集団。
【請求項４６】
請求項４５に記載の核酸分子に機能し得る形で連結された発現ベクター。
【請求項４７】
(a)足場：標的リガンド複合体を形成させる条件下で、標的リガンドと請求項３８に記載のライブラリーとを接触させること、および(b)該複合体から、標的リガンドに結合する足場を取得することを含む、標的に結合するポリペプチド足場を取得する方法。
【請求項４８】
工程(b)で得られたタンパク質の足場の少なくとも1個のループを無作為化して、さらに無作為化された足場を作製すること、ならびにさらに無作為化された足場を用いて、工程(a)および(b)を反復することをさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記方法が少なくとも2個のループを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記方法が少なくとも3個のループを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
工程(b)で得られたタンパク質の足場の少なくとも1個のループを無作為化して、さらに無作為化された足場を作製すること、ならびにさらに無作為化された足場を用いて工程(a)および(b)を反復することをさらに含み、工程(a)および(b)の反復が、工程(a)および(b)の第1の操作の標的とは異なる標的を接触させることをさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
工程(b)で得られたタンパク質の足場の少なくとも1個のループであって、前記ライブラリー中で無作為化されなかった前記ループを無作為化して、さらに無作為化された足場を作製すること、ならびにさらに無作為化された足場を用いて、工程(a)および(b)を反復することをさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５３】
工程(b)で得られたタンパク質の足場の少なくとも1個のループであって、前記ライブラリー中で無作為化されなかった前記ループを無作為化して、さらに無作為化された足場を作製すること、ならびにさらに無作為化された足場を用いて、工程(a)および(b)を反復することをさらに含み、工程(a)および(b)の前記反復が、工程(a)および(b)の第1の操作の標的とは異なる標的を接触させることをさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５４】
前記方法が、BC、DE、およびFGループからなる群より選択される第1の無作為化されたループならびにAB、CD、およびEFループからなる群より選択される前記ライブラリー中で無作為化されなかった第2のループを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記方法が、AB、CD、EFループからなる群より選択される第1の無作為化されたループならびにBC、DE、およびFGループからなる群より選択される前記ライブラリー中で無作為化されなかった第2のループを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記方法が、工程(b)で得られたタンパク質の足場の少なくとも1個のβ鎖を無作為化して、さらに無作為化された足場を作製すること、ならびにさらに無作為化された足場を用いて、工程(a)および(b)を反復することをさらに含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記方法が、工程(b)で得られたタンパク質の足場の少なくとも2個、3個、4個、5個、6個または7個のβ鎖を無作為化して、さらに無作為化された足場を作製すること、ならびにさらに無作為化された足場を用いて、工程(a)および(b)を反復することをさらに含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
(a)足場：標的リガンド複合体を形成させる条件下で、標的リガンドと請求項３８に記載のライブラリーとを接触させること、(b)該足場を、該足場の架橋が検出可能な応答を引き出す架橋剤と接触させること、ならびに(c)該複合体から、標的に結合する足場を取得することを含む、標的に結合する少なくとも2個の足場を取得する方法。
【請求項５９】
前記足場が同じエピトープを認識する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記足場が異なるエピトープを認識する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記架橋剤が、抗体、抗体フラグメント、二量体化モチーフ、化学的架橋剤、結合ペプチド、またはエピトープタグからなる群より選択される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
化合物：足場複合体の形成を可能にする条件下で、サンプルと請求項１に記載の足場とを接触させること、該複合体を検出すること、それによって、サンプル中の化合物を検出することを含む、サンプル中の化合物を検出する方法。
【請求項６３】
化合物：足場複合体の形成を可能にする条件下で、サンプルと請求項１に記載の固定された足場とを接触させること、および固定された足場を除去すること、それによって、サンプル中の化合物を捕捉することを含む、サンプル中の化合物を捕捉する方法。
【請求項６４】
請求項１に記載の足場を含む、滅菌された、発熱物質を含まない組成物。
【請求項６５】
請求項１に記載の足場を含む医薬組成物。
【請求項６６】
有効量の請求項６４または６５に記載の組成物を患者に投与することを含む、それを必要とする患者における疾患を予防、治療、管理または改善する方法。
【請求項６７】
請求項６４または６５に記載の組成物を用いてそれを必要とする患者における疾患を診断または画像化する方法。
【請求項６８】
前記方法が、免疫療法、生物療法、化学療法、放射線療法、または小分子薬剤療法である追加療法をさらに含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記疾患が、自己免疫疾患、炎症性疾患、増殖性疾患、感染症、呼吸器疾患、胃腸疾患、糖尿病、狼瘡、または肥満である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
請求項１または１５のいずれかに記載の足場を精製する方法であって、
a. 少なくとも15分間、最大で70℃まで前記足場を含む組成物を加熱すること；または
b. 前記足場を含む組成物をpH 3.0もしくはpH 3.5もしくはpH 4.0、もしくはpH 4.5、もしくはpH 5.0に調整すること；得られる組成物を、1〜30分間、50℃、もしくは55℃、もしくは60℃、もしくは65℃、もしくは70℃で加熱すること；
ならびに続いて、遠心分離により凝集した化合物を除去することを含む、前記方法。
【請求項７１】
請求項１または１５のいずれかに由来する足場の少なくとも1 g/Lの生産効率をもたらす、測定可能な方法。
【請求項７２】
前記方法が、該方法において用いられた培養培地から精製される足場を含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記足場が培養培地中に産生および分泌される、請求項１または１５のいずれかに由来する足場を製造する方法。
【請求項７４】
前記方法が、oppAシグナルペプチド(配列番号227)を含む発現ベクターを用いることを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
請求項７３に記載の方法から得られた無細胞材料を用いて、標的への足場の結合をアッセイまたは検出する方法。
【請求項７６】
請求項７４に記載の方法により製造された足場を精製する方法。
【請求項７７】
前記足場がTRAIL-R2に特異的に結合する、請求項１または１５のいずれかに記載の足場。
【請求項７８】
前記TRAIL-R2がヒトである、請求項７７に記載の足場。
【請求項７９】
前記足場が、前記7個のβ鎖ドメインのいずれか2個を連結するための少なくとも1個のジスルフィド結合をさらに含む、請求項７７に記載の足場。
【請求項８０】
前記足場が、少なくとも2個の足場ドメインを含む多量体足場である、請求項７７に記載の足場。
【請求項８１】
前記少なくとも2個の足場ドメインが、TRAIL-R2上の同じエピトープに結合する、請求項８０に記載の足場。
【請求項８２】
前記少なくとも2個の足場ドメインが、TRAIL-R2上の異なるエピトープに結合する、請求項８０に記載の足場。
【請求項８３】
前記少なくとも1個の足場ドメインが、
a. IgG分子に由来するFc領域；
b. IgG分子に由来するCH1領域；
c. IgG分子に由来するCH2領域；
d. IgG分子に由来するヒンジ領域；または
e. IgG分子に由来するCκもしくはCλ領域、
に機能し得る形で連結される、請求項８０に記載の足場。
【請求項８４】
前記少なくとも1個の足場ドメインが、2D3または1C12である、請求項８０に記載の足場。
【請求項８５】
前記足場が、
a. IgG分子に由来するFc領域；
b. IgG分子に由来するCH1領域；
c. IgG分子に由来するCH2領域；
d. IgG分子に由来するヒンジ領域；または
e. IgG分子に由来するCκもしくはCλ領域、
に機能し得る形で連結された1C12を含む、請求項８４に記載の足場。
【請求項８６】
前記足場が、
a. IgG分子に由来するFc領域；
b. IgG分子に由来するCH1領域；
c. IgG分子に由来するCH2領域；
d. IgG分子に由来するヒンジ領域；または
e. IgG分子に由来するCκもしくはCλ領域、
に機能し得る形で連結された2D3を含む、請求項８４に記載の足場。
【請求項８７】
前記足場が、配列番号126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、147、150、153、156、159、162、165、168、171、174、177、180、183、186、189、192、195、および198からなる群より選択されるBCループ配列を含む、請求項７７に記載の足場。
【請求項８８】
前記足場が、配列番号145、148、151、154、157、160、163、166、169、172、175、178、181、184、187、190、193、196、および199からなる群より選択されるDEループ配列を含む、請求項７７に記載の足場。
【請求項８９】
前記足場が、配列番号127、129、131、133、135、137、139、141、143、146、149、152、155、158、161、164、167、170、173、176、179、182、185、188、191、194、197、および200からなる群より選択されるFGループ配列を含む、請求項７７に記載の足場。
【請求項９０】
前記足場が、2F4、5B10、10D9、6F11、8B3、5E5、2H6、7G11、6C7、1E03、2B04、1C12、1A03、1C10、1B12、2G03、2D3、1C06、2F08、1B04、3B11、1D8、2A12、1E05、2F02、1H05、2A11、または1G11から選択されるTRAIL-R2結合足場から誘導される配列を含む、請求項７７に記載の足場。
【請求項９１】
前記足場が、TRAIL-R2受容体に結合し、
a. TRAIL-R2受容体を作動させ；
b. TRAILのTRAIL-R2受容体への結合を模倣し；
c. TRAIL-R2受容体の二量体化もしくはオリゴマー化を容易にし；
d. アポトーシスを誘導し；または
e. 細胞生存能力を低下させるか、もしくは阻害する、
請求項７７に記載の足場。
【請求項９２】
請求項７７に記載の足場を含む、滅菌された、発熱物質を含まない組成物。
【請求項９３】
請求項７７に記載の足場を含む医薬組成物。
【請求項９４】
TRAIL-R2に結合し、
a. TRAIL-R2受容体を作動させ；
b. TRAILのTRAIL-R2への結合を模倣し；
c. TRAIL-R2受容体の二量体化もしくはオリゴマー化を容易にし；
d. アポトーシスを誘導し；または
e. 細胞生存能力を低下させるか、もしくは阻害する、
請求項７７に記載の足場を使用する方法。
【請求項９５】
請求項９２または９３に記載の組成物の有効量を投与することにより、それを必要とする患者における癌を予防、治療、軽減、または管理する方法。
【請求項９６】
前記癌が、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、非ホジキンリンパ腫、芽細胞腫、胃腸癌、腎癌、卵巣癌、肝臓癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、頭部および頸部癌、肺癌、腺癌、腎細胞癌、または肝細胞癌から選択される、請求項９５に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４−１】
【図４−２】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図１０Ａ−１】
【図１０Ａ−２】
【図１０Ａ−３】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１０Ｅ】
【図１０Ｆ】
【図１０Ｇ】
【図１０Ｈ】
【図１０Ｉ】
【図１０Ｊ】
【図１０Ｋ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１１Ｄ】
【図１１Ｅ】
【図１１Ｆ】
【図１１Ｇ】
【図１１Ｈ】
【図１１Ｉ】
【図１１Ｊ】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５−１】
【図１５−２】
【図１５−３】
【図１６】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４−１】
【図２４−２】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０Ａ】
【図３０Ｂ】
【図３１Ａ】
【図３１Ｂ】
【図３２】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４−１】
【図４−２】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図１０Ａ−１】
【図１０Ａ−２】
【図１０Ａ−３】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１０Ｅ】
【図１０Ｆ】
【図１０Ｇ】
【図１０Ｈ】
【図１０Ｉ】
【図１０Ｊ】
【図１０Ｋ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１１Ｄ】
【図１１Ｅ】
【図１１Ｆ】
【図１１Ｇ】
【図１１Ｈ】
【図１１Ｉ】
【図１１Ｊ】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５−１】
【図１５−２】
【図１５−３】
【図１６】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４−１】
【図２４−２】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０Ａ】
【図３０Ｂ】
【図３１Ａ】
【図３１Ｂ】
【図３２】
【公表番号】特表２０１１−５０１９５１（Ｐ２０１１−５０１９５１Ａ）
【公表日】平成２３年１月２０日（２０１１．１．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３１０７６（Ｐ２０１０−５３１０７６）
【出願日】平成２０年１０月３１日（２００８．１０．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１２３９８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５８３７９
【国際公開日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【出願人】（５０４３３３９７２）メディミューン，エルエルシー (108)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１月２０日（２０１１．１．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月３１日（２００８．１０．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１２３９８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５８３７９
【国際公開日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【出願人】（５０４３３３９７２）メディミューン，エルエルシー (108)
【Ｆターム（参考）】
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