タンパク質間相互作用の検出方法
【課題】タンパク質間相互作用を検出する新しい方法を提供すること。
【解決手段】特定な配列からなるアミノ酸配列のＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを、第１のタンパク質に融合させる工程と、特定な配列からなるアミノ酸配列のＧｌｕｃＮドメイン、特定な配列からなるアミノ酸配列のＦｌｕｃＮドメイン、または、特定な配列からなるアミノ酸配列のＴｌｕｃＮドメインを第２のタンパク質に融合させる工程と、融合した第１のタンパク質と融合した第２のタンパク質とを相互作用させる工程と、融合した第１のタンパク質と融合した第２のタンパク質との複合体から放出される光を検出する工程とを含む。
【解決手段】特定な配列からなるアミノ酸配列のＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを、第１のタンパク質に融合させる工程と、特定な配列からなるアミノ酸配列のＧｌｕｃＮドメイン、特定な配列からなるアミノ酸配列のＦｌｕｃＮドメイン、または、特定な配列からなるアミノ酸配列のＴｌｕｃＮドメインを第２のタンパク質に融合させる工程と、融合した第１のタンパク質と融合した第２のタンパク質とを相互作用させる工程と、融合した第１のタンパク質と融合した第２のタンパク質との複合体から放出される光を検出する工程とを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質間相互作用を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、スプリットルシフェラーゼのフラグメントの相補性を利用して、目的とする２つのタンパク質の相互作用を検出する系が開発された。タンパク質間相互作用を検出するため、相補性を利用する方法としては、一般に、スプリットしたリポータータンパク質の各フラグメントを、目的とするタンパク質と融合するが、その際、そのどちらのフラグメントも自らは有意な活性を保持しないようにしておく。目的とするタンパク質同士が相互作用すると、２つの不活性なリポータータンパク質フラグメントは、活性を復活するように互いに相補し、そのタンパク質間相互作用を間接的に追跡するための読み出しシグナルを出す。
【０００３】
ジヒドロ葉酸還元酵素、β‐ラクタマーゼ緑色蛍光タンパク質をはじめとする様々なレポータータンパク質に関して、このような相補性を利用する方法が用いられてきた。また、ウミシイタケルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、赤色発光コメツキムシルシフェラーゼ、緑色発光コメツキムシルシフェラーゼなど、数種類のルシフェラーゼも用いられてきた。このようなルシフェラーゼのスプリットフラグメントはそれぞれに特異性を持ち、同じ種のルシフェラーゼ由来の別のフラグメントに隣接して配置されたときのみ、強い発光能を回復することができる。
【非特許文献１】Kim, S. B., Ozawa, T., Watanabe, S., Umezawa, Y., 2004.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 11542-11547
【発明の開示】
【０００４】
本発明者は、同じルシフェリン基質を使用して、赤色発光コメツキムシルシフェラーゼ（ＴｌｕｃＮ； 配列番号４）のＮ末端フラグメントのみならず、野生型ホタルルシフェラーゼ（ＦｌｕｃＮ； 配列番号３）および緑色発光コメツキムシルシフェラーゼ（ＧｌｕｃＮ； 配列番号２）などの別の種のルシフェラーゼ由来のＮ末端フラグメントを相補することができる赤色発光コメツキムシルシフェラーゼ（ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）； 配列番号１）の変異体Ｃ末端フラグメントを開発した。
【０００５】
本発明の１つの実施形態はＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを含むことを特徴とするタンパク質である。ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインはアミノ酸配列番号１を有する。
【０００６】
別の実施形態は、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有するタンパク質と、アミノ酸配列番号２を有するＧｌｕｃＮドメイン、アミノ酸配列番号３を有するＦｌｕｃＮドメイン、またはアミノ酸配列番号４を有するＴｌｕｃＮドメインを有するタンパク質を含む複合体である。これらのタンパク質は相互に結合能を有する。
【０００７】
別の実施形態は、ＧｌｕｃＮドメイン、ＦｌｕｃＮドメイン、またはＴｌｕｃＮドメインを有するタンパク質を検出する方法である。この方法は、該タンパク質を、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを含むタンパク質と相互作用させ、複合体を形成させることを特徴とする。この複合体において、前記ドメインが互いに相補して、特異的な光を放出することができるようになる。この放出される光を検出することにより、ＧｌｕｃＮドメイン、ＦｌｕｃＮドメイン、またはＴｌｕｃＮドメインを含むタンパク質を検出することができる。
【０００８】
別の実施形態はＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを含むタンパク質を検出する方法である。この方法は、該タンパク質を、ＧｌｕｃＮドメイン、ＦｌｕｃＮドメイン、またはＴｌｕｃＮドメインを含むタンパク質と相互作用させて複合体を形成させることを特徴とする。この複合体において、前記ドメインは互いに相補し、特異的な光を放出することができるようになる。この放出される光を検出することにより、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを含むタンパク質を検出することができる。
【０００９】
別の実施形態は、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを含む第１のタンパク質と、アミノ酸配列番号２を有するＧｌｕｃＮドメイン、アミノ酸配列番号３を有するＦｌｕｃＮドメイン、またはアミノ酸配列番号４を有するＴｌｕｃＮドメインを有する第２のタンパクとの複合体を検出する方法である。この方法はこの複合体から放出される光を検出することを特徴とする。
【００１０】
別の実施形態は、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを含む第１のタンパク質と、ＧｌｕｃＮドメイン、ＦｌｕｃＮドメイン、またはＴｌｕｃＮを含む第２のタンパク質との結合を検出する方法である。この方法は、これらのタンパク質を相互作用させ、複合体を形成させる工程と、この複合体から放出される光を検出する工程とを含むことを特徴とする。
【００１１】
また別の実施形態は、相互に結合能を有する第１のタンパク質と第２のタンパク質との結合を検出する方法である。この方法は、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを第１のタンパク質に融合させる工程と、ＧｌｕｃＮドメイン、ＦｌｕｃＮドメイン、またはＴｌｕｃＮを第２のタンパク質と融合させる工程と、融合した第１のタンパク質と融合した第２のタンパク質とを相互作用させ、複合体を形成させる工程と、この複合体から放出される光を検出することを特徴とする。
【００１２】
別の実施形態は、第２のタンパク質と第３のタンパク質から、第１のタンパク質の結合タンパク質を選択する方法である。 第１のタンパク質はＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインに融合し、第２のタンパク質と、第３のタンパク質のそれぞれが、アミノ酸配列番号２を有するＧｌｕｃＮドメイン、アミノ酸配列番号３を有するＦｌｕｃＮドメイン、またはアミノ酸配列番号４を有するＴｌｕｃＮドメインからなる群から選ばれる異なるドメインに融合する。この方法は、第１のタンパク質を第２のタンパク質および第３のタンパク質と相互作用させ、放出される光を検出して、前記光を前記タンパク質のどの複合体が放出しているかを判断することを特徴とする。
【００１３】
別の実施形態は、第２のタンパク質と第３のタンパク質から、第１のタンパク質の結合タンパク質を選択する方法である。この方法は、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを第１のタンパク質に融合させる工程と、アミノ酸配列番号２を有するＧｌｕｃＮドメイン、アミノ酸配列番号３を有するＦｌｕｃＮドメイン、またはアミノ酸配列番号４を有するＴｌｕｃＮドメインからなる群から選ばれる２つのドメインのそれぞれを、第２のタンパク質および第３のタンパク質に融合させる工程をさらに含むことを特徴とする。
【００１４】
なお、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを含有するタンパク質が、アミノ酸配列番号２を有するＧｌｕｃＮドメイン、アミノ酸配列番号３を有するＦｌｕｃＮドメイン、またはアミノ酸配列番号４を有するＴｌｕｃＮドメインを含有するタンパク質と複合体を形成することができれば、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインは、配列番号１において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列を有していても構わない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、赤色発光コメツキムシルシフェラーゼのＣ末端変異体（ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ））を用いることによる、タンパク質間相互作用を検出するための、改変された相補性利用方法を提供する。
【００１６】
赤色発光コメツキムシルシフェラーゼの野生型Ｃ末端フラグメント（ｗｔＴｌｕｃＣ）は、赤色発光コメツキムシルシフェラーゼ（ＴｌｕｃＮ）由来のＮ末端フラグメントのみと相補することができ、その他の種由来のＮ末端フラグメントとは相補しない。しかし、実施例で示すように、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）は、同じルシフェリン基質を用いて、赤色発光コメツキムシルシフェラーゼ（ＴｌｕｃＮ）のＮ末端フラグメントだけでなく、野生型ホタルルシフェラーゼ（ＦｌｕｃＮ）および緑色発光コメツキムシルシフェラーゼ（ＧｌｕｃＮ）など、他の種類由来のＮ末端フラグメントにも相補することができる。これらの３つのドメイン、ＧｌｕｃＮドメイン、ＦｌｕｃＮドメインおよびＴｌｕｃＮドメインは、本明細書中では、抗ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインと呼ぶこととする。
【００１７】
また、実施例４に示すように、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインと抗ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインとの組み合わせにより、それらを有するタンパク質同士の複合体は、特異的なパターンの波長の光、即ち、ＴｌｕｃＮとの組み合わせの場合は約６００ｎｍ、ＧｌｕｃＮとの組み合わせの場合は約５３０ｎｍ、ＦｌｕｃＮとの組み合わせの場合は約５６０ｎｍにピークを有する光を放出する。従って、検出する光の波長によって、どの複合体からの放出光であるかが識別できる。例えば、ＴｌｕｃＮとの組み合わせの場合は６００ｎｍ、ＧｌｕｃＮとの組み合わせの場合は５３０ｎｍ、ＦｌｕｃＮとの組み合わせの場合は５６０ｎｍの波長の光を検出することにより、複合体を特定することができる。さらに、この特性を利用すれば、同時に複数の複合体が発光していても、どの複合体が発光しているか、識別可能になる。
【００１８】
複合体から放出される光は、細胞破砕液、細胞抽出液、あるいは培養細胞における発光だけでなく、実施例５に示すように、生体における発光でも検出可能であるが、皮内、皮下など、体表近くの位置にある細胞での発光は、より検出が容易である。
【００１９】
ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）のこの特性を利用すると、例えば、次のような応用が可能である。
（１）ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有するタンパク質を用いて、抗ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有し、そのタンパク質に結合するタンパク質を検出すること。
（２）抗ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有するタンパク質を用いて、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有し、そのタンパク質に結合するタンパク質を検出すること。
（３）ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有するタンパク質と抗ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有し、そのタンパク質に結合するタンパク質との複合体を検出すること。
（４）ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有するタンパク質の、抗ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有する結合タンパク質に対する結合を検出すること。
（５）それぞれに異なる抗ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有する第２のタンパク質と第３のタンパク質から、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有するタンパク質の結合タンパク質を選択すること。
【００２０】
実施形態（１）では、抗ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有するタンパク質が存在するかどうかは、そのタンパク質を、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有し、かつ抗ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有するタンパク質に結合するタンパク質と相互作用させ、これらのタンパク質が結合して両者のドメインが相互作用するように近接する時放出される光を検出することにより、調べることができる。
【００２１】
実施形態（２）では、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有するタンパク質が存在するかどうかは、そのタンパク質を、抗ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有し、かつＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有するタンパク質に結合するタンパク質と相互作用させ、これらのタンパク質が結合して両者のドメインが相互作用するように近接する時放出される光を検出することにより、調べることができる。
【００２２】
例えば、細胞内で、抗ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインが融合した目的とするタンパク質をコードする遺伝子が発現している場合、その発現は、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインが融合し、その目的とするタンパク質と結合することができるタンパク質をコードした別の遺伝子を、その細胞の中で共に発現させることにより、検出することができる。すなわち、その細胞の中で、これら２つの融合タンパク質がどちらも結合し、各ドメインが相互作用するほど近接すると、ドメインは相互に相補し、そのドメインの組み合わせに特異的な光を放出する。この放出光を検出することによって、目的とするタンパク質の存在を検出することが可能となる。
【００２３】
このような系の応用例としては、タンパク質の発現やプロモータの特異性を調べるために利用することなどが挙げられる。
【００２４】
実施形態（３）では、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有するタンパク質と抗ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有するタンパク質との複合体は特異的な波長の光を放出することから、アッセイ系の中で放出される光を調べることにより、その複合体の存在を検出することができる。
【００２５】
実施形態（４）では、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有するタンパク質が抗ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有するタンパク質と結合する場合、これらのタンパク質は複合体を形成するため、この得られた複合体を実施形態（３）で記載したように調べることによって、その結合を検出することができる。
【００２６】
実施形態（５）では、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有するタンパク質の結合タンパク質を、それぞれ異なる抗ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有する２つまたは３つのタンパク質から選択することができる。すなわち、抗ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインの種類により、異なる波長の光が放出されるため、放出される光とその波長を検出することにより、どの複合体が形成されたかがわかり、さらにＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有するタンパク質に対する結合タンパク質を同定し、選択することができる。
【００２７】
この実施形態は広範囲に応用することができる。例えば、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有するタンパク質の特性が、細胞内における状態によって変わり、この特性によって、タンパク質の結合パートナーが変わる場合、この細胞の状態は、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有するタンパク質と、抗ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有するその他のタンパク質とを、細胞に導入してＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有するタンパク質の結合パートナーを調べることにより、検知することができる。複合体が発光などによってリアルタイムで検出される場合、タンパク質の特性の変化もリアルタイムで検出することができる。
【００２８】
以上のすべての実施形態において、融合タンパク質を作製する方法は限定されないが、化学合成または分子生物学的合成による作製が好ましく、分子生物学的合成が最も好ましい。例えば、融合タンパク質をコードする遺伝子を発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを細胞に導入すると、この融合タンパク質を細胞中で発現させることができる。
【００２９】
融合タンパク質の複合体から放出された光を検出する方法は、特に限定されず、基質と放出される光に対して最も好適な方法を用いることができる。
【実施例】
【００３０】
＜実施例１＞ ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）による、ＴｌｕｃＮ、ＧｌｕｃＮまたはＦｌｕｃＮの相補
ラパマイシンの存在下で結合能をもつ相互作用タンパク質であるＦＫＢＰおよびＦＲＢを利用し、ＴｌｕｃＮ、ＧｌｕｃＮ、またはＦｌｕｃＮが、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）を相補することができることを、確認した。
【００３１】
ｐＴｌｕｃＮ−ＦＫＢＰ、ｐＧｌｕｃＮ−ＦＫＢＰ、ｐＦｌｕｃＮ−ＦＫＢＰ、およびｐＦＲＢ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）を構築するため、ＴｌｕｃＮ、ＧｌｕｃＮ、ＦｌｕｃＮ、ＦＫＢＰ、ＦＲＢ、およびＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）のｃＤＮＡを標準的なＰＣＲにより合成して、コザック配列および制限酵素部位を付加した。これらのｃＤＮＡを生成するために用いたプライマーの配列は次の通りである。
(TlucN-1) 5’AAGCTTGCCATGGTAAAGCGTGAGAAAAATGTC3’（配列番号５）
(TlucN-2) 5’GGATCCTCCGCCTCCTCCGCCGTCGTCGATGGCCTC3’（配列番号６）
(GlucN-1) 5’AAGCTTGCCATGGAGAGAGAGAAGAAC3’（配列番号７）
(GlucN-2) 5’GGATCCTCCGCCTCCTCCTACCATAGGTCCCCAGAT3’（配列番号８）
(FlucN-1) 5’AAGCTTGCCATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAGGC3’（配列番号９）
(FlucN-2) 5’GGATCCTCCGCCTCCTCCATCCTTGTCAATCAAGGCGTTGGT3’（配列番号１０）
(FKBP-1) 5’GGATCCATGGGCGTGCAGGTGGAG3’（配列番号１１）
(FKBP-2) 5’CTCGAGCGTTCCAGTTTTAGAAGCTC3’（配列番号１２）
(FRB-1) 5’GGATCCATGGTAGCCATCCTCTGG3’（配列番号１３）
(FRB-2) 5’CTCGAGCGTGATATCCGTCTGAACAC3’（配列番号１４）
(TlucC-1) 5’CTCGAGTGGAGGCGGCGGAAGCAAGGGTTATGTCAAT3’ （配列番号１５）
(TlucC-2) 5’CCGCGGGCCCACACCGCCGGCCTTCACCAA3’（配列番号１６）
(TlucC(mut)-1) 5’CTCGAGTGGAGGCGGCGGAAGCAAGGGTTATGTCAAT3’（配列番号１７）
(TlucC(mut)-2) 5’CCGCGGGCCCACACCGCCGGCCTTCACCAA3'（配列番号１８）
【００３２】
これらのｃＤＮＡの配列を確認後、ＴｌｕｃＮ、ＧｌｕｃＮ、およびＦｌｕｃＮのｃＤＮＡをそれぞれ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨ１で切断し、同じ制限酵素で切断したｐｃＤＮＡ４／Ｖ５−Ｈｉｓベクターと結合させ、それぞれ、ｐＴｌｕｃＮ、ｐＧｌｕｃＮ、およびｐＦｌｕｃＮベクターを構築した。その後、ＦＫＢＰのｃＤＮＡをＢａｍＨ１とＸｈｏ１で切断し、同じ制限酵素で切断したｐＴｌｕｃＮベクター、ｐＧｌｕｃＮベクター、またはｐＦｌｕｃＮベクターと結合させ、ｐＴｌｕｃＮ−ＦＫＢＰ、ｐＧｌｕｃＮ−ＦＫＢＰ、およびｐＦｌｕｃＮ−ＦＫＢのコンストラクトを完成させた。
【００３３】
同様に、ＴｌｕｃＣおよびＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）のｃＤＮＡをＸｈｏ１およびＡｐａ１で切断し、同じ制限酵素で切断したｐｃＤＮＡ４／Ｖ５−Ｈｉｓベクターと結合させ、それぞれｐＴｌｕｃＣおよびｐＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ベクターのコンストラクトを完成させた。その後、 ＦＲＢのｃＤＮＡをＢａｍＨ１とＸｈｏ１で切断し、同じ制限酵素で切断したｐＴｌｕｃＮおよびｐＦＲＢ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ベクターと結合させ、それぞれ、ｐＦＲＢ−ＴｌｕｃＣおよびｐＦＲＢ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）のコンストラクトを完成させた。
【００３４】
トランスフェクションの効率を標準化するために、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）を発現するｐＴＫ−Ｒｌｕｃ（プロメガ社）を内部コントロールとして用いた。
【００３５】
ＣＯＳ−７細胞を１２穴プレートに播種し、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ２０００（ギブコＢＲＬ社）を用いて、<ｐＴｌｕｃＮ−ＦＫＢＰ、ｐＦＲＢ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）、およびｐＴＫ−Ｒｌｕｃ>と、<ｐＧｌｕｃＮ−ＦＫＢＰ、ｐＦＲＢ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）、およびｐＴＫ−Ｒｌｕｃ>と、<ｐＦｌｕｃＮ−ＦＫＢＰ、ｐＦＲＢ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）、およびｐＴＫ−Ｒｌｕｃ>とを、それぞれトランスフェクトして、一過的に発現させた。各々の対照実験として、ｐＦＲＢ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）の代わりにｐＦＲＢ−ＴｌｕｃＣを用いた。トランスフェクション後１２〜１６時間目に、細胞をラパマイシン（最終濃度：１００ｎＭ）で３０分間刺激し、その後ＰＢＳで１回洗浄した。ネガティブコントロールとして用いた細胞は、ラパマイシンによる刺激は行わなかったが、それ以外のすべての実験手順を行った。
【００３６】
Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｋｉｔ （プロメガ社）の基質溶液８０μＬをプレートの各ウェルに加えた。３７℃で３分間インキュベート後、細胞溶解液からの発光強度をルミノメーター（Ｌｕｍａｔ ＬＢ９５０７）で３０秒間記録した。測定波長は、ＴｌｕｃＮでは６００ｎｍ、ＧｌｕｃＮでは５３０ｎｍ、ＦｌｕｃＮでは５６０ｎｍとした（この波長については、実施例４の結果を参照）。コメツキムシ・ルシフェラーゼまたはホタル・ルシフェラーゼの活性（ＬＴ）を測定した後に、ウミシイタケルシフェラーゼに特異的な基質を加えて３分間インキュベートし、その活性（ＬＲ）を３０秒間測定した。ＴｌｕｃＮ、ＧｌｕｃＮまたはＦｌｕｃＮと、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）が相補することにより得られたルシフェラーゼ活性値を、ウミシイタケルシフェラーゼにより得られた値で正規化し、「ＲＬＵ率（Ｄｕａｌ）」（すなわち、（ＬＴ）／（ＬＲ））と名づけた。
【００３７】
図２に示すように、ｐＴｌｕｃＮ−ＦＫＢＰおよびｐＦＲＢ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）を用いると、ラパマイシン存在下で得られたシグナルは、ラパマイシンを使用しないコントロールの１３倍であった。ｐＧｌｕｃＮ−ＦＫＢＰおよびｐＦＲＢ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）を用いると、ラパマイシン存在下で得られたシグナルは、ラパマイシンを使用しないコントロールの約２０倍であった。また、ｐＦｌｕｃＮ−ＦＫＢＰおよびｐＦＲＢ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）を用いると、ラパマイシン存在下で得られたシグナルは、ラパマイシンを使用しないコントロールの約３８００倍であった。
このように、ＴｌｕｃＣ（ｗｔ）は、ＴｌｕｃＮ以外の、ＧｌｕｃＮやＦｌｕｃＮとほとんど結合しないにもかかわらず、本実施例によって、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）は、タンパク質間相互作用を評価するための、ＴｌｕｃＮ、ＧｌｕｃＮ、またはＦｌｕｃＮに対する優れた相補パートナーとなり得ることが示された。
【００３８】
＜実施例２＞ ＢＡＤと１４−３−３との相互作用
本実施例では、ＢＡＤタンパク質またはＢＡＤ誘導体と１４−３−３タンパク質との相互作用を、ＧｌｕｃＮとＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）の相補ペア（図３）を用いて調べた。
【００３９】
ｐＢＡＤ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）およびｐＧｌｕｃＮ−１４−３−３を構築するため、ＢＡＤおよび１４−３−３のｃＤＮＡを標準的なＰＣＲにより合成して、コザック配列および図３に示した制限酵素部位を付加した。
【００４０】
(BAD-1) 5’GGATCCGCCACCATGGGAACCCAAAG 3’（配列番号１９）
(BAD-2) 5’GAATCCCCCTGGGAGGGGGTGGAGCCTC 3’（配列番号２０）
(14-3-3-1) 5’GGATCCGCCACCATGGATAAAAATGAG 3’（配列番号２１）
(14-3-3-2) 5’GAATTCCCATTTTCCCCTCCTTCTCCTGC 3’（配列番号２２）
【００４１】
これらのｃＤＮＡの配列を確認後、ＢＡＤｃＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨ１で切断し、同じ制限酵素で切断したｐＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ベクターと結合させ、ＢＡＤ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）コンストラクトを完成させた。同様に、１４−３−３ｃＤＮＡをＢａｍＨ１およびＥｃｏＲ１によって切断し、同じ制限酵素で切断したｐＧｌｕｃＮと結合させて、ｐＧｌｕｃＮ−１４−３−３コンストラクトを完成させた。
【００４２】
ＣＯＳ−７細胞を１２穴プレートに播種し、実施例１と同様に、ｐ１４−３−３−ＧｌｕｃＮ、ｐＢＡＤ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）、またはｐＢＣＬ−ＸＬ−ＧｌｕｃＮをトランスフェクトし、一過的に発現させた。トランスフェクション後１６〜２４時間目に、サンプルバッファー（１２５ ｎＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ６．８， １０％ グリセロール， ４％ ＳＤＳ， ０．００６％ ブロモフェノールブルー， １．８％ β‐メルカプトエタノール）で細胞を溶解し、抗Ｖ５抗体［５０００倍希釈１％スキムミルク／ＴＢＳＴ（５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８．０， １５０ ｍＭ ＮａＣｌ， ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）］およびアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（４０００倍希釈１％スキムミルク／ＴＢＳＴ）を用いて、溶解液に対しウエスタンブロットを行った。タンパク質の発現は、ＥＣＬ（商標）キット（アマシャム・バイオサイエンシーズ、英国）（図４）を使用して、イメージ・アナライザー（ＬＡＳ−１０００ｐｌｕｓ、富士フイルム社、東京、日本）により解析した。その結果、これらのコンストラクトからの発現が確認された。
【００４３】
次に、リン酸化部位Ｓ１１２、Ｓ１３６、またはＳ１５５のセリンをアラニンに変異させた、ＢＡＤ（Ｓ１１２Ａ）、ＢＡＤ（Ｓ１３６Ａ）、ＢＡＤ（Ｓ１５５Ａ）のｃＤＮＡをもつコンストラクトを作製した（図３）。
【００４４】
ＢＡＤ（Ｓ１１２Ａ）、ＢＡＤ（Ｓ１３６Ａ）、ＢＡＤ（Ｓ１５５Ａ）、およびＢＡＤ（ＳｔｒｉｐｐｌｅＡ）のｃＤＮＡを、標準的なＰＣＲにより合成し、コザック配列および制限酵素部位を付加した。これらのｃＤＮＡの配列を確認後、ＢＡＤ（Ｓ１１２Ａ）、ＢＡＤ（Ｓ１３６Ａ）、ＢＡＤ（Ｓ１５５Ａ）、およびＢＡＤ（ＳｔｒｉｐｐｌｅＡ）をＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲ１で切断し、同じ制限酵素で切断したｐＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ベクターに結合させ、それぞれｐＢＡＤ（Ｓ１１２Ａ）−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）、ｐＢＡＤ（Ｓ１３６Ａ）−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）、ｐＢＡＤ（Ｓ１５５Ａ）−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）， およびｐＢＡＤ（ＳｔｒｉｐｐｌｅＡ）−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）コンストラクトを完成させた。
【００４５】
ＢＡＤ（Ｓ１１２Ａ）、ＢＡＤ（Ｓ１３６Ａ）、およびＢＡＤ（Ｓ１５５Ａ）を合成するためにＰＣＲで使用したオリゴヌクレオチドペアの配列は、次の通りである。
(BAD(S112A)-1) 5' GAGACTCGGAGTCGCCACAGTGCGTACCCAGCGGGGACCGAG 3'（配列番号２３）
(BAD(S112A)-2) 5' CTCGGTCCCCGCTGGGTACGCACTGTGGCGACTCCGAGTCTC 3'（配列番号２４）
(BAD(S136A)-1) 5' CGAGGACGCTCGCGTGCGGCTCCCCCCAATCTCTGGGCAGCG 3'（配列番号２５）
(BAD(S136A)-2) 5' CGCTGCCCAGAGATTGGGGGGAGCCGCACGCGAGCGTCCTCG 3'（配列番号２６）
(BAD(S155A)-1) 5' GAGCTCCGAAGGATGGCCGATGAGTTTGAGGGTTCCTTC 3'（配列番号２７）
(BAD(S155A)-2) 5' GAAGGAACCCTCAAACTCATCGGCCATCCTTCGGAGCTC 3'（配列番号２８）
【００４６】
発現ベクター、ｐ１４−３−３−ＴｌｕｃＮ、およびｐＢＡＤ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）、ｐＢＡＤ（Ｓ１１２Ａ）−ＴｌｕｃＣ、ｐＢＡＤ（Ｓ１３６Ａ）（ｍｕｔ）−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）、ｐＢＡＤ（Ｓ１５５Ａ）−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）、またはｐＢＡＤ（ＳｔｒｉｐｐｌｅＡ）−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）のいずれか１つを、上記の通りＣＯＳ−７細胞に共導入した。トランスフェクション後１２〜１６時間目に、細胞を溶解し、発光をルミノメーターで測定した。結果を図５に示す。
【００４７】
ｐ１４−３−３−ＧｌｕｃＮとｐＢＡＤ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）との野生型ペアを用いた場合、非常に強い発光強度が観察された。このことは、１４−３−３タンパク質とＢＡＤタンパク質とが内因的に強く相互作用しているという事実を反映していた。しかし、１４−３−３と、ＢＡＤ（Ｓ１１２Ａ）またはＢＡＤ（Ｓ１３６Ａ）ＢＡＤとのペアの発光強度は、野生型ペアの２分の１であった。ＢＡＤ（Ｓ１５５Ａ）は、強度が５分の１まで減少し、Ｓ１３６、Ｓ１１２、Ｓ１５５の全てをアラニンに変異させたＢＡＤ（ＳｔｒｉｐｐｌｅＡ）は、ＢＡＤ（ＳｔｒｉｐｐｌｅＡ）と１４−３−３との相互作用はごくわずかであった。
【００４８】
次に、リン酸化ＢＡＤ（Ｓｅｒ１１２）、リン酸化ＢＡＤ（Ｓｅｒ１３６）、またはリン酸化ＢＡＤ（Ｓｅｒ１５５）に対する抗リン酸化ＢＡＤ抗体を用いて、ＣＯＳ−７細胞でウエスタンブロットを行ったところ、ＢＡＤ（Ｓ１１２Ａ）， ＢＡＤ（Ｓ１３６Ａ）， ＢＡＤ（Ｓ１５５Ａ）では、それぞれ １１２番目、１３６番目、１５５番目のアミノ酸のリン酸化を確認しなかったが、 ＢＡＤ（ｗｔ）では、これら３つのアミノ酸のすべてのリン酸化を確認した。図６に示すように、ＢＡＤ（ｗｔ）-ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ではシグナルが観察されたが、ＢＡＤ（Ｓ１１２Ａ）−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）、ＢＡＤ（Ｓ１３６Ａ）−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）、および ＢＡＤ（Ｓ１５５Ａ）−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）では、発現量はＢＡＤ（ｗｔ）-ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）と同じであったものの、シグナルは検出されなかった。別の細胞株、ＨｅＬａ細胞を使用した場合も同じ結果が得られた（データは示さず）。
【００４９】
さらに、ＢＡＤ／１４−３−３間相互作用に対する様々な化合物の影響を調べた。ホルスコリン(Forskolin)およびＩＢＭＸ(3-Isobutyl-1-methylxanthine)はリン酸化刺激物質として知られている。また、ＤＡＴＳ(Dialyl trisulfide)およびオレイン酸(Oliec acid)は脱リン酸化物質として知られている。実ここでは、ＣＯＳ−７細胞を培養し、上記のように、ｐＢＡＤ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）およびｐＧｌｕｃＮ−１４−３−３を細胞に導入した後、発光アッセイを行う前に、ホルスコリン、ＩＢＭＸ、ＤＡＴＳ、またはオレイン酸（各１００μＭ）を加えた培地中で６０分間細胞をインキュベートした。図７に示すように、ホルスコリンおよびＩＢＭＸでは、発光シグナルが増強したが、ＤＡＴＳおよびオレイン酸では減少した。この結果は、発光シグナルがタンパク質の結合強度を反映することを示している。
【００５０】
＜実施例３＞ ＢＡＤとＢＣＬ−ＸＬとの相互作用
本実施例においては、相互作用タンパク質としてＢＡＤとＢＣＬ−ＸＬを用いた。
【００５１】
ｐＧｌｕｃＮ−ＢＣＬ−ＸＬを構築するために、ＢＣＬ−ＸＬのｃＤＮＡを標準的なＰＣＲによって合成し、コザック配列と制限酵素部位を付加した。このｃＤＮＡの配列を確認後、ＢＣＬ−ＸＬｃＤＮＡをＥｃｏＲ１およびＸｈｏ１で切断し、同じ制限酵素で切断したｐＧｌｕｃＮベクターと結合させて、ｐＧｌｕｃＮ‐ＢＣＬ−ＸＬコンストラクトを完成させた。
【００５２】
発現ベクターであるｐＢＡＤ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）およびｐＧｌｕｃＮ−ＢＣＬ−ＸＬをＣＯＳ−７細胞に共導入し、実施例１と同様に、それらの発光シグナルを測定したところ、リガンドが何も存在しなくとも、強い発光シグナルが観察された（図８）。
【００５３】
次に、ＢＣＬ−ＸＬ阻害剤であるアンチマイシン(Antimycin)およびＨＡ １４−１の能力を評価した。ここでは、ＢＡＤ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）およびＧｌｕｃＮ−ＢＣＬ−ＸＬを含む細胞を、発光アッセイの前に３０〜６０分間アンチマイシンまたはＨＡ １４−１（各１００μＭ）と共にインキュベートした。図８に示すように、どちらの化合物を用いた場合も、発光シグナルが顕著に減少した。よって、ここでもやはり、ＢＡＤ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）およびＧｌｕｃＮ−ＢＣＬ−ＸＬによる発光シグナルが、これらの結合強度を反映することが示された。
【００５４】
＜実施例４＞放出される光のスペクトル
本実施例においては、ＧｌｕｃＮ、ＦｌｕｃＮ、あるいはＴｌｕｃＮとＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）との組み合わせにより放出される光のスペクトルを示す。
【００５５】
ＣＯＳ−７培養細胞にｐＧｌｕｃＮ−ＦＫＢＰおよびｐＦＲＢ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）をトランスフェクトし、３７℃で２４時間インキュベートした。その後、ラパマイシン（１.０μＭ）で細胞を刺激し、３７℃でさらに１０〜１２時間インキュベートした。その後、培地を除去し、ルシフェリン基質溶液を加えた。３から５分後、細胞を溶解し、蛍光分光光度計を用いてスペクトルを観察した。図９に示すように、およそ５３０ｎｍ付近でピーク（ｌｍａｘ）を示した。同様にしてｐＦｌｕｃＮ−ＦＫＢＰおよびｐＦＲＢ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）の組み合わせにおいては、検出された波長はおよそ５６０ｎｍ付近でピーク（ｌｍａｘ）を示し、ｐＴｌｕｃＮ−ＦＫＢＰおよびｐＦＲＢ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）の組み合わせにおいては、検出された波長はおよそ６００ｎｍ付近でピーク（ｌｍａｘ）を示した。
【００５６】
＜実施例５＞マウス皮下に存在させた細胞中の発光検出
本実施例においては、ＴｌｕｃＮとＴｌｕｃ（ｍｕｔ）との組み合わせにより放出される光が、in vivoで発光した場合にも検出可能であることを示す。
【００５７】
ここで、発現ベクターであるｐＧｌｕｃ（ｗｔ）、ｐ１４−３−３−ＧｌｕｃＮ、ｐＢＡＤ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ） または ｐＢＡＤ（ＳｔｒｉｐｐｌｅＡ）−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）を以下のようにしてマウスに導入した。
【００５８】
ｐ１４−３−３−ＧｌｕｃＮ、ｐＢＡＤ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ） または ｐＢＡＤ（ＳｔｒｉｐｐｌｅＡ）−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）は、実施例２で作製した物を用いた。ｐＧｌｕｃ（ｗｔ）は、以下のように作製した。
【００５９】
まず、Ｇｌｕｃ（ｗｔ）のｃＤＮＡを、標準的なＰＣＲにより合成し、制限酵素部位を付加した。これらのｃＤＮＡの配列を確認後、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで切断し、同じ制限酵素で切断したｐｃＤＮＡ４／Ｖ５−Ｈｉｓベクターと結合させ、ｐＧｌｕｃ（ｗｔ）を構築した。ここで用いたＰＣＲプライマーを以下に示す。
(Gluc(wt)-1) 5´AAGCTTATGGAGAGAGAGAAGAACGTGTACGGC 3´（配列番号２９）
(Gluc(wt)-2) 5´CTCGAGCGCAGCTTAGAAGCCTTCTCCATCAG 3´（配列番号３０）
【００６０】
ＣＯＳ７細胞の培養には、４つの１０ｃｍ培養皿を用いた。それぞれの培養細胞に対し、（１）ｐＧｌｕｃ（ｗｔ）単独、（２）ｐＢＡＤ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）およびｐ１４−３−３−ＴｌｕｃＮ、（３）ｐＢＡＤ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）、 ｐ１４−３−３−ＴｌｕｃＮおよびＧｌｕｃ（ｗｔ）（４）ｐＢＡＤ（ＳｔｒｉｐｐｌｅＡ）−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）、 ｐ１４−３−３−ＴｌｕｃＮおよびｐＧｌｕｃ（ｗｔ）をトランスフェクトし、３７℃で１８-２４時間培養した後に、細胞を回収し、リン酸緩衝液に懸濁した。1×106個の細胞を、麻酔したBALB/Cヌードマウス（４週令の雌マウス、体重約１５ｇ）に、それぞれ図１０に示した場所に移植し、１５分後、ルシフェリン（3mg/100μl PBS）を腹腔に注射した。１０分後、CCDカメラ(Versarray: 1300B, Prinston Instruments)を用いて、マウスのイメージングが行われた。
【００６１】
その結果、図１０に示すように、Ｇｌｕｃ（ｗｔ）から５３０ｎｍの光が（１）、（３）及び（４）で検出され、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）とＴｌｕｃＮの結合によって、６００ｎｍの光が（２）及び（３）で検出された。（４）では、ＢＡＤ（ＳｔｒｉｐｐｌｅＡ）タンパク質と１４−３−３タンパク質は結合しないため、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）とＴｌｕｃＮも結合せず、光は検出されなかった。
【００６２】
このように、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有するタンパク質と、抗ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有するタンパク質との複合体が生体内で発光しても、体外からその光を検出できるだけでなく、各複合体特異的な波長の光を検出することによって、各複合体を識別できる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】タンパク質の相補性に基づく、生物発光プローブの原理を模式的に示したものである。
【図２】一実施例において、（ａ）ＦｌｕｎＮとＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）、（ｂ）ＧｌｕｃＮとＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）、（ｃ）ＴｌｕｃＣとＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）の相補性を示したものである。
【図３】一実施例において、使用した各発光プローブコンストラクトを示したものである。
【図４】一実施例において、ＣＯＳ−７細胞での、ｐＢＡＤ（ｗｔ）−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）、ｐＢＡＤ（Ｓ１１２Ａ）−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）、ｐＢＡＤ（Ｓ１３６Ａ）−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）、ｐＢＡＤ（Ｓ１５５Ａ）−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）、ｐＢＡＤ（ＳｔｒｉｐｐｌｅＡ）−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）、ｐＧｌｕｃＮ−１４−３−３、およびｐＧｌｕｃＮ−ＢＣＬ−ＸＬからの発現を示したものである。
【図５】一実施例において、ＢＡＤまたはＢＡＤの変異体と１４−３−３との相互作用を示したものである。
【図６】一実施例において、ＢＡＤ（Ｓ１１２Ａ）、ＢＡＤ（Ｓ１３６Ａ）、ＢＡＤ（Ｓ１５５Ａ）における、１１２番目のアミノ酸、１３６番目のアミノ酸、１５５番目のアミノ酸が、それぞれリン酸化しないこと、また、これら３つのアミノ酸が全て、ＢＡＤ（ｗｔ）においてリン酸化することを示したものである。
【図７】一実施例において、ＢＡＤ／１４−３−３相互作用に対する様々なリン酸化刺激物質およびリン酸化阻害物質の影響を示す。
【図８】一実施例において、ＢＡＤとＢＣＬ−ＸＬとの相互作用、およびこのＢＡＤ／ＢＣＬ−ＸＬ相互作用に対するＢＣＬ−ＸＬ阻害物質の影響を示す図である。
【図９】一実施例において、ＧｌｕｃＮとＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）との組み合わせ、ＦｌｕｃＮとＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）、およびＴｌｕｃＮとＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）がそれぞれ放出する光のスペクトルシフトを示す図である。
【図１０】一実施例において、ヌードマウスの皮下細胞中における発光の検出を示す図である。Em530nm、Em600nmは、検出した光の波長を表す。OPENは、波長を絞らずに検出した場合の結果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質間相互作用を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、スプリットルシフェラーゼのフラグメントの相補性を利用して、目的とする２つのタンパク質の相互作用を検出する系が開発された。タンパク質間相互作用を検出するため、相補性を利用する方法としては、一般に、スプリットしたリポータータンパク質の各フラグメントを、目的とするタンパク質と融合するが、その際、そのどちらのフラグメントも自らは有意な活性を保持しないようにしておく。目的とするタンパク質同士が相互作用すると、２つの不活性なリポータータンパク質フラグメントは、活性を復活するように互いに相補し、そのタンパク質間相互作用を間接的に追跡するための読み出しシグナルを出す。
【０００３】
ジヒドロ葉酸還元酵素、β‐ラクタマーゼ緑色蛍光タンパク質をはじめとする様々なレポータータンパク質に関して、このような相補性を利用する方法が用いられてきた。また、ウミシイタケルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、赤色発光コメツキムシルシフェラーゼ、緑色発光コメツキムシルシフェラーゼなど、数種類のルシフェラーゼも用いられてきた。このようなルシフェラーゼのスプリットフラグメントはそれぞれに特異性を持ち、同じ種のルシフェラーゼ由来の別のフラグメントに隣接して配置されたときのみ、強い発光能を回復することができる。
【非特許文献１】Kim, S. B., Ozawa, T., Watanabe, S., Umezawa, Y., 2004.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 11542-11547
【発明の開示】
【０００４】
本発明者は、同じルシフェリン基質を使用して、赤色発光コメツキムシルシフェラーゼ（ＴｌｕｃＮ； 配列番号４）のＮ末端フラグメントのみならず、野生型ホタルルシフェラーゼ（ＦｌｕｃＮ； 配列番号３）および緑色発光コメツキムシルシフェラーゼ（ＧｌｕｃＮ； 配列番号２）などの別の種のルシフェラーゼ由来のＮ末端フラグメントを相補することができる赤色発光コメツキムシルシフェラーゼ（ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）； 配列番号１）の変異体Ｃ末端フラグメントを開発した。
【０００５】
本発明の１つの実施形態はＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを含むことを特徴とするタンパク質である。ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインはアミノ酸配列番号１を有する。
【０００６】
別の実施形態は、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有するタンパク質と、アミノ酸配列番号２を有するＧｌｕｃＮドメイン、アミノ酸配列番号３を有するＦｌｕｃＮドメイン、またはアミノ酸配列番号４を有するＴｌｕｃＮドメインを有するタンパク質を含む複合体である。これらのタンパク質は相互に結合能を有する。
【０００７】
別の実施形態は、ＧｌｕｃＮドメイン、ＦｌｕｃＮドメイン、またはＴｌｕｃＮドメインを有するタンパク質を検出する方法である。この方法は、該タンパク質を、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを含むタンパク質と相互作用させ、複合体を形成させることを特徴とする。この複合体において、前記ドメインが互いに相補して、特異的な光を放出することができるようになる。この放出される光を検出することにより、ＧｌｕｃＮドメイン、ＦｌｕｃＮドメイン、またはＴｌｕｃＮドメインを含むタンパク質を検出することができる。
【０００８】
別の実施形態はＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを含むタンパク質を検出する方法である。この方法は、該タンパク質を、ＧｌｕｃＮドメイン、ＦｌｕｃＮドメイン、またはＴｌｕｃＮドメインを含むタンパク質と相互作用させて複合体を形成させることを特徴とする。この複合体において、前記ドメインは互いに相補し、特異的な光を放出することができるようになる。この放出される光を検出することにより、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを含むタンパク質を検出することができる。
【０００９】
別の実施形態は、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを含む第１のタンパク質と、アミノ酸配列番号２を有するＧｌｕｃＮドメイン、アミノ酸配列番号３を有するＦｌｕｃＮドメイン、またはアミノ酸配列番号４を有するＴｌｕｃＮドメインを有する第２のタンパクとの複合体を検出する方法である。この方法はこの複合体から放出される光を検出することを特徴とする。
【００１０】
別の実施形態は、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを含む第１のタンパク質と、ＧｌｕｃＮドメイン、ＦｌｕｃＮドメイン、またはＴｌｕｃＮを含む第２のタンパク質との結合を検出する方法である。この方法は、これらのタンパク質を相互作用させ、複合体を形成させる工程と、この複合体から放出される光を検出する工程とを含むことを特徴とする。
【００１１】
また別の実施形態は、相互に結合能を有する第１のタンパク質と第２のタンパク質との結合を検出する方法である。この方法は、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを第１のタンパク質に融合させる工程と、ＧｌｕｃＮドメイン、ＦｌｕｃＮドメイン、またはＴｌｕｃＮを第２のタンパク質と融合させる工程と、融合した第１のタンパク質と融合した第２のタンパク質とを相互作用させ、複合体を形成させる工程と、この複合体から放出される光を検出することを特徴とする。
【００１２】
別の実施形態は、第２のタンパク質と第３のタンパク質から、第１のタンパク質の結合タンパク質を選択する方法である。 第１のタンパク質はＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインに融合し、第２のタンパク質と、第３のタンパク質のそれぞれが、アミノ酸配列番号２を有するＧｌｕｃＮドメイン、アミノ酸配列番号３を有するＦｌｕｃＮドメイン、またはアミノ酸配列番号４を有するＴｌｕｃＮドメインからなる群から選ばれる異なるドメインに融合する。この方法は、第１のタンパク質を第２のタンパク質および第３のタンパク質と相互作用させ、放出される光を検出して、前記光を前記タンパク質のどの複合体が放出しているかを判断することを特徴とする。
【００１３】
別の実施形態は、第２のタンパク質と第３のタンパク質から、第１のタンパク質の結合タンパク質を選択する方法である。この方法は、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを第１のタンパク質に融合させる工程と、アミノ酸配列番号２を有するＧｌｕｃＮドメイン、アミノ酸配列番号３を有するＦｌｕｃＮドメイン、またはアミノ酸配列番号４を有するＴｌｕｃＮドメインからなる群から選ばれる２つのドメインのそれぞれを、第２のタンパク質および第３のタンパク質に融合させる工程をさらに含むことを特徴とする。
【００１４】
なお、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを含有するタンパク質が、アミノ酸配列番号２を有するＧｌｕｃＮドメイン、アミノ酸配列番号３を有するＦｌｕｃＮドメイン、またはアミノ酸配列番号４を有するＴｌｕｃＮドメインを含有するタンパク質と複合体を形成することができれば、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインは、配列番号１において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列を有していても構わない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、赤色発光コメツキムシルシフェラーゼのＣ末端変異体（ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ））を用いることによる、タンパク質間相互作用を検出するための、改変された相補性利用方法を提供する。
【００１６】
赤色発光コメツキムシルシフェラーゼの野生型Ｃ末端フラグメント（ｗｔＴｌｕｃＣ）は、赤色発光コメツキムシルシフェラーゼ（ＴｌｕｃＮ）由来のＮ末端フラグメントのみと相補することができ、その他の種由来のＮ末端フラグメントとは相補しない。しかし、実施例で示すように、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）は、同じルシフェリン基質を用いて、赤色発光コメツキムシルシフェラーゼ（ＴｌｕｃＮ）のＮ末端フラグメントだけでなく、野生型ホタルルシフェラーゼ（ＦｌｕｃＮ）および緑色発光コメツキムシルシフェラーゼ（ＧｌｕｃＮ）など、他の種類由来のＮ末端フラグメントにも相補することができる。これらの３つのドメイン、ＧｌｕｃＮドメイン、ＦｌｕｃＮドメインおよびＴｌｕｃＮドメインは、本明細書中では、抗ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインと呼ぶこととする。
【００１７】
また、実施例４に示すように、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインと抗ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインとの組み合わせにより、それらを有するタンパク質同士の複合体は、特異的なパターンの波長の光、即ち、ＴｌｕｃＮとの組み合わせの場合は約６００ｎｍ、ＧｌｕｃＮとの組み合わせの場合は約５３０ｎｍ、ＦｌｕｃＮとの組み合わせの場合は約５６０ｎｍにピークを有する光を放出する。従って、検出する光の波長によって、どの複合体からの放出光であるかが識別できる。例えば、ＴｌｕｃＮとの組み合わせの場合は６００ｎｍ、ＧｌｕｃＮとの組み合わせの場合は５３０ｎｍ、ＦｌｕｃＮとの組み合わせの場合は５６０ｎｍの波長の光を検出することにより、複合体を特定することができる。さらに、この特性を利用すれば、同時に複数の複合体が発光していても、どの複合体が発光しているか、識別可能になる。
【００１８】
複合体から放出される光は、細胞破砕液、細胞抽出液、あるいは培養細胞における発光だけでなく、実施例５に示すように、生体における発光でも検出可能であるが、皮内、皮下など、体表近くの位置にある細胞での発光は、より検出が容易である。
【００１９】
ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）のこの特性を利用すると、例えば、次のような応用が可能である。
（１）ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有するタンパク質を用いて、抗ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有し、そのタンパク質に結合するタンパク質を検出すること。
（２）抗ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有するタンパク質を用いて、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有し、そのタンパク質に結合するタンパク質を検出すること。
（３）ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有するタンパク質と抗ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有し、そのタンパク質に結合するタンパク質との複合体を検出すること。
（４）ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有するタンパク質の、抗ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有する結合タンパク質に対する結合を検出すること。
（５）それぞれに異なる抗ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有する第２のタンパク質と第３のタンパク質から、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有するタンパク質の結合タンパク質を選択すること。
【００２０】
実施形態（１）では、抗ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有するタンパク質が存在するかどうかは、そのタンパク質を、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有し、かつ抗ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有するタンパク質に結合するタンパク質と相互作用させ、これらのタンパク質が結合して両者のドメインが相互作用するように近接する時放出される光を検出することにより、調べることができる。
【００２１】
実施形態（２）では、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有するタンパク質が存在するかどうかは、そのタンパク質を、抗ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有し、かつＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有するタンパク質に結合するタンパク質と相互作用させ、これらのタンパク質が結合して両者のドメインが相互作用するように近接する時放出される光を検出することにより、調べることができる。
【００２２】
例えば、細胞内で、抗ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインが融合した目的とするタンパク質をコードする遺伝子が発現している場合、その発現は、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインが融合し、その目的とするタンパク質と結合することができるタンパク質をコードした別の遺伝子を、その細胞の中で共に発現させることにより、検出することができる。すなわち、その細胞の中で、これら２つの融合タンパク質がどちらも結合し、各ドメインが相互作用するほど近接すると、ドメインは相互に相補し、そのドメインの組み合わせに特異的な光を放出する。この放出光を検出することによって、目的とするタンパク質の存在を検出することが可能となる。
【００２３】
このような系の応用例としては、タンパク質の発現やプロモータの特異性を調べるために利用することなどが挙げられる。
【００２４】
実施形態（３）では、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有するタンパク質と抗ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有するタンパク質との複合体は特異的な波長の光を放出することから、アッセイ系の中で放出される光を調べることにより、その複合体の存在を検出することができる。
【００２５】
実施形態（４）では、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有するタンパク質が抗ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有するタンパク質と結合する場合、これらのタンパク質は複合体を形成するため、この得られた複合体を実施形態（３）で記載したように調べることによって、その結合を検出することができる。
【００２６】
実施形態（５）では、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有するタンパク質の結合タンパク質を、それぞれ異なる抗ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有する２つまたは３つのタンパク質から選択することができる。すなわち、抗ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインの種類により、異なる波長の光が放出されるため、放出される光とその波長を検出することにより、どの複合体が形成されたかがわかり、さらにＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有するタンパク質に対する結合タンパク質を同定し、選択することができる。
【００２７】
この実施形態は広範囲に応用することができる。例えば、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有するタンパク質の特性が、細胞内における状態によって変わり、この特性によって、タンパク質の結合パートナーが変わる場合、この細胞の状態は、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有するタンパク質と、抗ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有するその他のタンパク質とを、細胞に導入してＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有するタンパク質の結合パートナーを調べることにより、検知することができる。複合体が発光などによってリアルタイムで検出される場合、タンパク質の特性の変化もリアルタイムで検出することができる。
【００２８】
以上のすべての実施形態において、融合タンパク質を作製する方法は限定されないが、化学合成または分子生物学的合成による作製が好ましく、分子生物学的合成が最も好ましい。例えば、融合タンパク質をコードする遺伝子を発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを細胞に導入すると、この融合タンパク質を細胞中で発現させることができる。
【００２９】
融合タンパク質の複合体から放出された光を検出する方法は、特に限定されず、基質と放出される光に対して最も好適な方法を用いることができる。
【実施例】
【００３０】
＜実施例１＞ ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）による、ＴｌｕｃＮ、ＧｌｕｃＮまたはＦｌｕｃＮの相補
ラパマイシンの存在下で結合能をもつ相互作用タンパク質であるＦＫＢＰおよびＦＲＢを利用し、ＴｌｕｃＮ、ＧｌｕｃＮ、またはＦｌｕｃＮが、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）を相補することができることを、確認した。
【００３１】
ｐＴｌｕｃＮ−ＦＫＢＰ、ｐＧｌｕｃＮ−ＦＫＢＰ、ｐＦｌｕｃＮ−ＦＫＢＰ、およびｐＦＲＢ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）を構築するため、ＴｌｕｃＮ、ＧｌｕｃＮ、ＦｌｕｃＮ、ＦＫＢＰ、ＦＲＢ、およびＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）のｃＤＮＡを標準的なＰＣＲにより合成して、コザック配列および制限酵素部位を付加した。これらのｃＤＮＡを生成するために用いたプライマーの配列は次の通りである。
(TlucN-1) 5’AAGCTTGCCATGGTAAAGCGTGAGAAAAATGTC3’（配列番号５）
(TlucN-2) 5’GGATCCTCCGCCTCCTCCGCCGTCGTCGATGGCCTC3’（配列番号６）
(GlucN-1) 5’AAGCTTGCCATGGAGAGAGAGAAGAAC3’（配列番号７）
(GlucN-2) 5’GGATCCTCCGCCTCCTCCTACCATAGGTCCCCAGAT3’（配列番号８）
(FlucN-1) 5’AAGCTTGCCATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAGGC3’（配列番号９）
(FlucN-2) 5’GGATCCTCCGCCTCCTCCATCCTTGTCAATCAAGGCGTTGGT3’（配列番号１０）
(FKBP-1) 5’GGATCCATGGGCGTGCAGGTGGAG3’（配列番号１１）
(FKBP-2) 5’CTCGAGCGTTCCAGTTTTAGAAGCTC3’（配列番号１２）
(FRB-1) 5’GGATCCATGGTAGCCATCCTCTGG3’（配列番号１３）
(FRB-2) 5’CTCGAGCGTGATATCCGTCTGAACAC3’（配列番号１４）
(TlucC-1) 5’CTCGAGTGGAGGCGGCGGAAGCAAGGGTTATGTCAAT3’ （配列番号１５）
(TlucC-2) 5’CCGCGGGCCCACACCGCCGGCCTTCACCAA3’（配列番号１６）
(TlucC(mut)-1) 5’CTCGAGTGGAGGCGGCGGAAGCAAGGGTTATGTCAAT3’（配列番号１７）
(TlucC(mut)-2) 5’CCGCGGGCCCACACCGCCGGCCTTCACCAA3'（配列番号１８）
【００３２】
これらのｃＤＮＡの配列を確認後、ＴｌｕｃＮ、ＧｌｕｃＮ、およびＦｌｕｃＮのｃＤＮＡをそれぞれ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨ１で切断し、同じ制限酵素で切断したｐｃＤＮＡ４／Ｖ５−Ｈｉｓベクターと結合させ、それぞれ、ｐＴｌｕｃＮ、ｐＧｌｕｃＮ、およびｐＦｌｕｃＮベクターを構築した。その後、ＦＫＢＰのｃＤＮＡをＢａｍＨ１とＸｈｏ１で切断し、同じ制限酵素で切断したｐＴｌｕｃＮベクター、ｐＧｌｕｃＮベクター、またはｐＦｌｕｃＮベクターと結合させ、ｐＴｌｕｃＮ−ＦＫＢＰ、ｐＧｌｕｃＮ−ＦＫＢＰ、およびｐＦｌｕｃＮ−ＦＫＢのコンストラクトを完成させた。
【００３３】
同様に、ＴｌｕｃＣおよびＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）のｃＤＮＡをＸｈｏ１およびＡｐａ１で切断し、同じ制限酵素で切断したｐｃＤＮＡ４／Ｖ５−Ｈｉｓベクターと結合させ、それぞれｐＴｌｕｃＣおよびｐＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ベクターのコンストラクトを完成させた。その後、 ＦＲＢのｃＤＮＡをＢａｍＨ１とＸｈｏ１で切断し、同じ制限酵素で切断したｐＴｌｕｃＮおよびｐＦＲＢ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ベクターと結合させ、それぞれ、ｐＦＲＢ−ＴｌｕｃＣおよびｐＦＲＢ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）のコンストラクトを完成させた。
【００３４】
トランスフェクションの効率を標準化するために、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）を発現するｐＴＫ−Ｒｌｕｃ（プロメガ社）を内部コントロールとして用いた。
【００３５】
ＣＯＳ−７細胞を１２穴プレートに播種し、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ２０００（ギブコＢＲＬ社）を用いて、<ｐＴｌｕｃＮ−ＦＫＢＰ、ｐＦＲＢ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）、およびｐＴＫ−Ｒｌｕｃ>と、<ｐＧｌｕｃＮ−ＦＫＢＰ、ｐＦＲＢ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）、およびｐＴＫ−Ｒｌｕｃ>と、<ｐＦｌｕｃＮ−ＦＫＢＰ、ｐＦＲＢ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）、およびｐＴＫ−Ｒｌｕｃ>とを、それぞれトランスフェクトして、一過的に発現させた。各々の対照実験として、ｐＦＲＢ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）の代わりにｐＦＲＢ−ＴｌｕｃＣを用いた。トランスフェクション後１２〜１６時間目に、細胞をラパマイシン（最終濃度：１００ｎＭ）で３０分間刺激し、その後ＰＢＳで１回洗浄した。ネガティブコントロールとして用いた細胞は、ラパマイシンによる刺激は行わなかったが、それ以外のすべての実験手順を行った。
【００３６】
Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｋｉｔ （プロメガ社）の基質溶液８０μＬをプレートの各ウェルに加えた。３７℃で３分間インキュベート後、細胞溶解液からの発光強度をルミノメーター（Ｌｕｍａｔ ＬＢ９５０７）で３０秒間記録した。測定波長は、ＴｌｕｃＮでは６００ｎｍ、ＧｌｕｃＮでは５３０ｎｍ、ＦｌｕｃＮでは５６０ｎｍとした（この波長については、実施例４の結果を参照）。コメツキムシ・ルシフェラーゼまたはホタル・ルシフェラーゼの活性（ＬＴ）を測定した後に、ウミシイタケルシフェラーゼに特異的な基質を加えて３分間インキュベートし、その活性（ＬＲ）を３０秒間測定した。ＴｌｕｃＮ、ＧｌｕｃＮまたはＦｌｕｃＮと、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）が相補することにより得られたルシフェラーゼ活性値を、ウミシイタケルシフェラーゼにより得られた値で正規化し、「ＲＬＵ率（Ｄｕａｌ）」（すなわち、（ＬＴ）／（ＬＲ））と名づけた。
【００３７】
図２に示すように、ｐＴｌｕｃＮ−ＦＫＢＰおよびｐＦＲＢ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）を用いると、ラパマイシン存在下で得られたシグナルは、ラパマイシンを使用しないコントロールの１３倍であった。ｐＧｌｕｃＮ−ＦＫＢＰおよびｐＦＲＢ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）を用いると、ラパマイシン存在下で得られたシグナルは、ラパマイシンを使用しないコントロールの約２０倍であった。また、ｐＦｌｕｃＮ−ＦＫＢＰおよびｐＦＲＢ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）を用いると、ラパマイシン存在下で得られたシグナルは、ラパマイシンを使用しないコントロールの約３８００倍であった。
このように、ＴｌｕｃＣ（ｗｔ）は、ＴｌｕｃＮ以外の、ＧｌｕｃＮやＦｌｕｃＮとほとんど結合しないにもかかわらず、本実施例によって、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）は、タンパク質間相互作用を評価するための、ＴｌｕｃＮ、ＧｌｕｃＮ、またはＦｌｕｃＮに対する優れた相補パートナーとなり得ることが示された。
【００３８】
＜実施例２＞ ＢＡＤと１４−３−３との相互作用
本実施例では、ＢＡＤタンパク質またはＢＡＤ誘導体と１４−３−３タンパク質との相互作用を、ＧｌｕｃＮとＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）の相補ペア（図３）を用いて調べた。
【００３９】
ｐＢＡＤ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）およびｐＧｌｕｃＮ−１４−３−３を構築するため、ＢＡＤおよび１４−３−３のｃＤＮＡを標準的なＰＣＲにより合成して、コザック配列および図３に示した制限酵素部位を付加した。
【００４０】
(BAD-1) 5’GGATCCGCCACCATGGGAACCCAAAG 3’（配列番号１９）
(BAD-2) 5’GAATCCCCCTGGGAGGGGGTGGAGCCTC 3’（配列番号２０）
(14-3-3-1) 5’GGATCCGCCACCATGGATAAAAATGAG 3’（配列番号２１）
(14-3-3-2) 5’GAATTCCCATTTTCCCCTCCTTCTCCTGC 3’（配列番号２２）
【００４１】
これらのｃＤＮＡの配列を確認後、ＢＡＤｃＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨ１で切断し、同じ制限酵素で切断したｐＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ベクターと結合させ、ＢＡＤ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）コンストラクトを完成させた。同様に、１４−３−３ｃＤＮＡをＢａｍＨ１およびＥｃｏＲ１によって切断し、同じ制限酵素で切断したｐＧｌｕｃＮと結合させて、ｐＧｌｕｃＮ−１４−３−３コンストラクトを完成させた。
【００４２】
ＣＯＳ−７細胞を１２穴プレートに播種し、実施例１と同様に、ｐ１４−３−３−ＧｌｕｃＮ、ｐＢＡＤ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）、またはｐＢＣＬ−ＸＬ−ＧｌｕｃＮをトランスフェクトし、一過的に発現させた。トランスフェクション後１６〜２４時間目に、サンプルバッファー（１２５ ｎＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ６．８， １０％ グリセロール， ４％ ＳＤＳ， ０．００６％ ブロモフェノールブルー， １．８％ β‐メルカプトエタノール）で細胞を溶解し、抗Ｖ５抗体［５０００倍希釈１％スキムミルク／ＴＢＳＴ（５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８．０， １５０ ｍＭ ＮａＣｌ， ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）］およびアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（４０００倍希釈１％スキムミルク／ＴＢＳＴ）を用いて、溶解液に対しウエスタンブロットを行った。タンパク質の発現は、ＥＣＬ（商標）キット（アマシャム・バイオサイエンシーズ、英国）（図４）を使用して、イメージ・アナライザー（ＬＡＳ−１０００ｐｌｕｓ、富士フイルム社、東京、日本）により解析した。その結果、これらのコンストラクトからの発現が確認された。
【００４３】
次に、リン酸化部位Ｓ１１２、Ｓ１３６、またはＳ１５５のセリンをアラニンに変異させた、ＢＡＤ（Ｓ１１２Ａ）、ＢＡＤ（Ｓ１３６Ａ）、ＢＡＤ（Ｓ１５５Ａ）のｃＤＮＡをもつコンストラクトを作製した（図３）。
【００４４】
ＢＡＤ（Ｓ１１２Ａ）、ＢＡＤ（Ｓ１３６Ａ）、ＢＡＤ（Ｓ１５５Ａ）、およびＢＡＤ（ＳｔｒｉｐｐｌｅＡ）のｃＤＮＡを、標準的なＰＣＲにより合成し、コザック配列および制限酵素部位を付加した。これらのｃＤＮＡの配列を確認後、ＢＡＤ（Ｓ１１２Ａ）、ＢＡＤ（Ｓ１３６Ａ）、ＢＡＤ（Ｓ１５５Ａ）、およびＢＡＤ（ＳｔｒｉｐｐｌｅＡ）をＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲ１で切断し、同じ制限酵素で切断したｐＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ベクターに結合させ、それぞれｐＢＡＤ（Ｓ１１２Ａ）−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）、ｐＢＡＤ（Ｓ１３６Ａ）−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）、ｐＢＡＤ（Ｓ１５５Ａ）−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）， およびｐＢＡＤ（ＳｔｒｉｐｐｌｅＡ）−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）コンストラクトを完成させた。
【００４５】
ＢＡＤ（Ｓ１１２Ａ）、ＢＡＤ（Ｓ１３６Ａ）、およびＢＡＤ（Ｓ１５５Ａ）を合成するためにＰＣＲで使用したオリゴヌクレオチドペアの配列は、次の通りである。
(BAD(S112A)-1) 5' GAGACTCGGAGTCGCCACAGTGCGTACCCAGCGGGGACCGAG 3'（配列番号２３）
(BAD(S112A)-2) 5' CTCGGTCCCCGCTGGGTACGCACTGTGGCGACTCCGAGTCTC 3'（配列番号２４）
(BAD(S136A)-1) 5' CGAGGACGCTCGCGTGCGGCTCCCCCCAATCTCTGGGCAGCG 3'（配列番号２５）
(BAD(S136A)-2) 5' CGCTGCCCAGAGATTGGGGGGAGCCGCACGCGAGCGTCCTCG 3'（配列番号２６）
(BAD(S155A)-1) 5' GAGCTCCGAAGGATGGCCGATGAGTTTGAGGGTTCCTTC 3'（配列番号２７）
(BAD(S155A)-2) 5' GAAGGAACCCTCAAACTCATCGGCCATCCTTCGGAGCTC 3'（配列番号２８）
【００４６】
発現ベクター、ｐ１４−３−３−ＴｌｕｃＮ、およびｐＢＡＤ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）、ｐＢＡＤ（Ｓ１１２Ａ）−ＴｌｕｃＣ、ｐＢＡＤ（Ｓ１３６Ａ）（ｍｕｔ）−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）、ｐＢＡＤ（Ｓ１５５Ａ）−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）、またはｐＢＡＤ（ＳｔｒｉｐｐｌｅＡ）−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）のいずれか１つを、上記の通りＣＯＳ−７細胞に共導入した。トランスフェクション後１２〜１６時間目に、細胞を溶解し、発光をルミノメーターで測定した。結果を図５に示す。
【００４７】
ｐ１４−３−３−ＧｌｕｃＮとｐＢＡＤ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）との野生型ペアを用いた場合、非常に強い発光強度が観察された。このことは、１４−３−３タンパク質とＢＡＤタンパク質とが内因的に強く相互作用しているという事実を反映していた。しかし、１４−３−３と、ＢＡＤ（Ｓ１１２Ａ）またはＢＡＤ（Ｓ１３６Ａ）ＢＡＤとのペアの発光強度は、野生型ペアの２分の１であった。ＢＡＤ（Ｓ１５５Ａ）は、強度が５分の１まで減少し、Ｓ１３６、Ｓ１１２、Ｓ１５５の全てをアラニンに変異させたＢＡＤ（ＳｔｒｉｐｐｌｅＡ）は、ＢＡＤ（ＳｔｒｉｐｐｌｅＡ）と１４−３−３との相互作用はごくわずかであった。
【００４８】
次に、リン酸化ＢＡＤ（Ｓｅｒ１１２）、リン酸化ＢＡＤ（Ｓｅｒ１３６）、またはリン酸化ＢＡＤ（Ｓｅｒ１５５）に対する抗リン酸化ＢＡＤ抗体を用いて、ＣＯＳ−７細胞でウエスタンブロットを行ったところ、ＢＡＤ（Ｓ１１２Ａ）， ＢＡＤ（Ｓ１３６Ａ）， ＢＡＤ（Ｓ１５５Ａ）では、それぞれ １１２番目、１３６番目、１５５番目のアミノ酸のリン酸化を確認しなかったが、 ＢＡＤ（ｗｔ）では、これら３つのアミノ酸のすべてのリン酸化を確認した。図６に示すように、ＢＡＤ（ｗｔ）-ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ではシグナルが観察されたが、ＢＡＤ（Ｓ１１２Ａ）−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）、ＢＡＤ（Ｓ１３６Ａ）−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）、および ＢＡＤ（Ｓ１５５Ａ）−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）では、発現量はＢＡＤ（ｗｔ）-ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）と同じであったものの、シグナルは検出されなかった。別の細胞株、ＨｅＬａ細胞を使用した場合も同じ結果が得られた（データは示さず）。
【００４９】
さらに、ＢＡＤ／１４−３−３間相互作用に対する様々な化合物の影響を調べた。ホルスコリン(Forskolin)およびＩＢＭＸ(3-Isobutyl-1-methylxanthine)はリン酸化刺激物質として知られている。また、ＤＡＴＳ(Dialyl trisulfide)およびオレイン酸(Oliec acid)は脱リン酸化物質として知られている。実ここでは、ＣＯＳ−７細胞を培養し、上記のように、ｐＢＡＤ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）およびｐＧｌｕｃＮ−１４−３−３を細胞に導入した後、発光アッセイを行う前に、ホルスコリン、ＩＢＭＸ、ＤＡＴＳ、またはオレイン酸（各１００μＭ）を加えた培地中で６０分間細胞をインキュベートした。図７に示すように、ホルスコリンおよびＩＢＭＸでは、発光シグナルが増強したが、ＤＡＴＳおよびオレイン酸では減少した。この結果は、発光シグナルがタンパク質の結合強度を反映することを示している。
【００５０】
＜実施例３＞ ＢＡＤとＢＣＬ−ＸＬとの相互作用
本実施例においては、相互作用タンパク質としてＢＡＤとＢＣＬ−ＸＬを用いた。
【００５１】
ｐＧｌｕｃＮ−ＢＣＬ−ＸＬを構築するために、ＢＣＬ−ＸＬのｃＤＮＡを標準的なＰＣＲによって合成し、コザック配列と制限酵素部位を付加した。このｃＤＮＡの配列を確認後、ＢＣＬ−ＸＬｃＤＮＡをＥｃｏＲ１およびＸｈｏ１で切断し、同じ制限酵素で切断したｐＧｌｕｃＮベクターと結合させて、ｐＧｌｕｃＮ‐ＢＣＬ−ＸＬコンストラクトを完成させた。
【００５２】
発現ベクターであるｐＢＡＤ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）およびｐＧｌｕｃＮ−ＢＣＬ−ＸＬをＣＯＳ−７細胞に共導入し、実施例１と同様に、それらの発光シグナルを測定したところ、リガンドが何も存在しなくとも、強い発光シグナルが観察された（図８）。
【００５３】
次に、ＢＣＬ−ＸＬ阻害剤であるアンチマイシン(Antimycin)およびＨＡ １４−１の能力を評価した。ここでは、ＢＡＤ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）およびＧｌｕｃＮ−ＢＣＬ−ＸＬを含む細胞を、発光アッセイの前に３０〜６０分間アンチマイシンまたはＨＡ １４−１（各１００μＭ）と共にインキュベートした。図８に示すように、どちらの化合物を用いた場合も、発光シグナルが顕著に減少した。よって、ここでもやはり、ＢＡＤ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）およびＧｌｕｃＮ−ＢＣＬ−ＸＬによる発光シグナルが、これらの結合強度を反映することが示された。
【００５４】
＜実施例４＞放出される光のスペクトル
本実施例においては、ＧｌｕｃＮ、ＦｌｕｃＮ、あるいはＴｌｕｃＮとＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）との組み合わせにより放出される光のスペクトルを示す。
【００５５】
ＣＯＳ−７培養細胞にｐＧｌｕｃＮ−ＦＫＢＰおよびｐＦＲＢ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）をトランスフェクトし、３７℃で２４時間インキュベートした。その後、ラパマイシン（１.０μＭ）で細胞を刺激し、３７℃でさらに１０〜１２時間インキュベートした。その後、培地を除去し、ルシフェリン基質溶液を加えた。３から５分後、細胞を溶解し、蛍光分光光度計を用いてスペクトルを観察した。図９に示すように、およそ５３０ｎｍ付近でピーク（ｌｍａｘ）を示した。同様にしてｐＦｌｕｃＮ−ＦＫＢＰおよびｐＦＲＢ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）の組み合わせにおいては、検出された波長はおよそ５６０ｎｍ付近でピーク（ｌｍａｘ）を示し、ｐＴｌｕｃＮ−ＦＫＢＰおよびｐＦＲＢ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）の組み合わせにおいては、検出された波長はおよそ６００ｎｍ付近でピーク（ｌｍａｘ）を示した。
【００５６】
＜実施例５＞マウス皮下に存在させた細胞中の発光検出
本実施例においては、ＴｌｕｃＮとＴｌｕｃ（ｍｕｔ）との組み合わせにより放出される光が、in vivoで発光した場合にも検出可能であることを示す。
【００５７】
ここで、発現ベクターであるｐＧｌｕｃ（ｗｔ）、ｐ１４−３−３−ＧｌｕｃＮ、ｐＢＡＤ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ） または ｐＢＡＤ（ＳｔｒｉｐｐｌｅＡ）−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）を以下のようにしてマウスに導入した。
【００５８】
ｐ１４−３−３−ＧｌｕｃＮ、ｐＢＡＤ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ） または ｐＢＡＤ（ＳｔｒｉｐｐｌｅＡ）−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）は、実施例２で作製した物を用いた。ｐＧｌｕｃ（ｗｔ）は、以下のように作製した。
【００５９】
まず、Ｇｌｕｃ（ｗｔ）のｃＤＮＡを、標準的なＰＣＲにより合成し、制限酵素部位を付加した。これらのｃＤＮＡの配列を確認後、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで切断し、同じ制限酵素で切断したｐｃＤＮＡ４／Ｖ５−Ｈｉｓベクターと結合させ、ｐＧｌｕｃ（ｗｔ）を構築した。ここで用いたＰＣＲプライマーを以下に示す。
(Gluc(wt)-1) 5´AAGCTTATGGAGAGAGAGAAGAACGTGTACGGC 3´（配列番号２９）
(Gluc(wt)-2) 5´CTCGAGCGCAGCTTAGAAGCCTTCTCCATCAG 3´（配列番号３０）
【００６０】
ＣＯＳ７細胞の培養には、４つの１０ｃｍ培養皿を用いた。それぞれの培養細胞に対し、（１）ｐＧｌｕｃ（ｗｔ）単独、（２）ｐＢＡＤ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）およびｐ１４−３−３−ＴｌｕｃＮ、（３）ｐＢＡＤ−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）、 ｐ１４−３−３−ＴｌｕｃＮおよびＧｌｕｃ（ｗｔ）（４）ｐＢＡＤ（ＳｔｒｉｐｐｌｅＡ）−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）、 ｐ１４−３−３−ＴｌｕｃＮおよびｐＧｌｕｃ（ｗｔ）をトランスフェクトし、３７℃で１８-２４時間培養した後に、細胞を回収し、リン酸緩衝液に懸濁した。1×106個の細胞を、麻酔したBALB/Cヌードマウス（４週令の雌マウス、体重約１５ｇ）に、それぞれ図１０に示した場所に移植し、１５分後、ルシフェリン（3mg/100μl PBS）を腹腔に注射した。１０分後、CCDカメラ(Versarray: 1300B, Prinston Instruments)を用いて、マウスのイメージングが行われた。
【００６１】
その結果、図１０に示すように、Ｇｌｕｃ（ｗｔ）から５３０ｎｍの光が（１）、（３）及び（４）で検出され、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）とＴｌｕｃＮの結合によって、６００ｎｍの光が（２）及び（３）で検出された。（４）では、ＢＡＤ（ＳｔｒｉｐｐｌｅＡ）タンパク質と１４−３−３タンパク質は結合しないため、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）とＴｌｕｃＮも結合せず、光は検出されなかった。
【００６２】
このように、ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有するタンパク質と、抗ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを有するタンパク質との複合体が生体内で発光しても、体外からその光を検出できるだけでなく、各複合体特異的な波長の光を検出することによって、各複合体を識別できる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】タンパク質の相補性に基づく、生物発光プローブの原理を模式的に示したものである。
【図２】一実施例において、（ａ）ＦｌｕｎＮとＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）、（ｂ）ＧｌｕｃＮとＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）、（ｃ）ＴｌｕｃＣとＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）の相補性を示したものである。
【図３】一実施例において、使用した各発光プローブコンストラクトを示したものである。
【図４】一実施例において、ＣＯＳ−７細胞での、ｐＢＡＤ（ｗｔ）−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）、ｐＢＡＤ（Ｓ１１２Ａ）−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）、ｐＢＡＤ（Ｓ１３６Ａ）−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）、ｐＢＡＤ（Ｓ１５５Ａ）−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）、ｐＢＡＤ（ＳｔｒｉｐｐｌｅＡ）−ＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）、ｐＧｌｕｃＮ−１４−３−３、およびｐＧｌｕｃＮ−ＢＣＬ−ＸＬからの発現を示したものである。
【図５】一実施例において、ＢＡＤまたはＢＡＤの変異体と１４−３−３との相互作用を示したものである。
【図６】一実施例において、ＢＡＤ（Ｓ１１２Ａ）、ＢＡＤ（Ｓ１３６Ａ）、ＢＡＤ（Ｓ１５５Ａ）における、１１２番目のアミノ酸、１３６番目のアミノ酸、１５５番目のアミノ酸が、それぞれリン酸化しないこと、また、これら３つのアミノ酸が全て、ＢＡＤ（ｗｔ）においてリン酸化することを示したものである。
【図７】一実施例において、ＢＡＤ／１４−３−３相互作用に対する様々なリン酸化刺激物質およびリン酸化阻害物質の影響を示す。
【図８】一実施例において、ＢＡＤとＢＣＬ−ＸＬとの相互作用、およびこのＢＡＤ／ＢＣＬ−ＸＬ相互作用に対するＢＣＬ−ＸＬ阻害物質の影響を示す図である。
【図９】一実施例において、ＧｌｕｃＮとＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）との組み合わせ、ＦｌｕｃＮとＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）、およびＴｌｕｃＮとＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）がそれぞれ放出する光のスペクトルシフトを示す図である。
【図１０】一実施例において、ヌードマウスの皮下細胞中における発光の検出を示す図である。Em530nm、Em600nmは、検出した光の波長を表す。OPENは、波長を絞らずに検出した場合の結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列番号１を有するＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを含有するタンパク質。
【請求項２】
配列番号１において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列を有するＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを含有するタンパク質であって、
アミノ酸配列番号２を有するＧｌｕｃＮドメイン、アミノ酸配列番号３を有するＦｌｕｃＮドメイン、またはアミノ酸配列番号４を有するＴｌｕｃＮドメインを含有するタンパク質と複合体を形成することができるタンパク質。
【請求項３】
請求項１または２に記載のタンパク質と、アミノ酸配列番号２を有するＧｌｕｃＮドメイン、アミノ酸配列番号３を有するＦｌｕｃＮドメイン、またはアミノ酸配列番号４を有するＴｌｕｃＮドメインを含有するタンパク質とを含む複合体。
【請求項４】
アミノ酸配列番号２を有するＧｌｕｃＮドメイン、アミノ酸配列番号３を有するＦｌｕｃＮドメイン、またはアミノ酸配列番号４を有するＴｌｕｃＮドメインを有するタンパク質を検出する方法であって、
当該タンパク質を、当該タンパク質が結合能をもつ請求項１または２に記載のタンパク質と相互作用させ、複合体を形成させる工程と
前記複合体から放出される光を検出する工程と、を含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４に記載のタンパク質検出方法であって、
アミノ酸配列番号２を有するＧｌｕｃＮドメイン、アミノ酸配列番号３を有するＦｌｕｃＮドメイン、またはアミノ酸配列番号４を有するＴｌｕｃＮドメインを有するタンパク質を、請求項１または２のタンパク質と相互作用させ、複合体を形成させる工程と、
前記複合体から放出される光を検出する工程と、を含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項５に記載の複合体の検出方法であって、前記複合体から放出される光を検出する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１または２に記載の第１のタンパク質と、アミノ酸配列番号２を有するＧｌｕｃＮドメイン、アミノ酸配列番号３を有するＦｌｕｃＮドメイン、またはアミノ酸配列番号４を有するＴｌｕｃＮドメインを有する第２のタンパク質との結合を検出する方法であって、
第１のタンパク質と第２のタンパク質を相互作用させ、複合体を形成させる工程と、
前記複合体から放出される光を検出する工程と、を含むことを特徴とする方法。
【請求項８】
相互に結合能を有する第１のタンパク質と第２のタンパク質との結合を検出する方法であって、
アミノ酸配列番号１を有するＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを、第１のタンパク質に融合させる工程と、
アミノ酸配列番号２を有するＧｌｕｃＮドメイン、アミノ酸配列番号３を有するＦｌｕｃＮドメイン、またはアミノ酸配列番号４を有するＴｌｕｃＮドメインを第２のタンパク質に融合させる工程と、
前記融合した第１のタンパク質と前記融合した第２のタンパク質とを相互作用させ、複合体を形成させる工程と、
前記複合体から放出される光を検出する工程と、
を含むことをと特徴とする方法。
【請求項９】
第２のタンパク質と第３のタンパク質から、第１のタンパク質の結合タンパク質を選択する方法であって、
前記第１のタンパク質はアミノ酸配列番号１を有するＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインに融合しており、前記第２のタンパク質と、前記第３のタンパク質のそれぞれは、アミノ酸配列番号２を有するＧｌｕｃＮドメイン、アミノ酸配列番号３を有するＦｌｕｃＮドメイン、またはアミノ酸配列番号４を有するＴｌｕｃＮドメインからなる群から選ばれる異なるドメインに融合しており、
前記第１のタンパク質を前記第２のタンパク質および前記第３のタンパク質と相互作用させる工程と、
放出される光を検出して、前記光を前記タンパク質のどの複合体が放出しているかを判断する工程と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の方法であって、さらに、
アミノ酸配列番号１を有するＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを前記第１のタンパク質に融合させる工程と、
アミノ酸配列番号２を有するＧｌｕｃＮドメイン、アミノ酸配列番号３を有するＦｌｕｃＮドメイン、またはアミノ酸配列番号４を有するＴｌｕｃＮドメインからなる群から選ばれる２つのドメインのそれぞれを、前記第２のタンパク質および前記第３のタンパク質に融合させる工程と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
アミノ酸配列番号１を有するＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインをコードする配列を含むことを特徴とする、ベクター。
【請求項１】
アミノ酸配列番号１を有するＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを含有するタンパク質。
【請求項２】
配列番号１において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列を有するＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを含有するタンパク質であって、
アミノ酸配列番号２を有するＧｌｕｃＮドメイン、アミノ酸配列番号３を有するＦｌｕｃＮドメイン、またはアミノ酸配列番号４を有するＴｌｕｃＮドメインを含有するタンパク質と複合体を形成することができるタンパク質。
【請求項３】
請求項１または２に記載のタンパク質と、アミノ酸配列番号２を有するＧｌｕｃＮドメイン、アミノ酸配列番号３を有するＦｌｕｃＮドメイン、またはアミノ酸配列番号４を有するＴｌｕｃＮドメインを含有するタンパク質とを含む複合体。
【請求項４】
アミノ酸配列番号２を有するＧｌｕｃＮドメイン、アミノ酸配列番号３を有するＦｌｕｃＮドメイン、またはアミノ酸配列番号４を有するＴｌｕｃＮドメインを有するタンパク質を検出する方法であって、
当該タンパク質を、当該タンパク質が結合能をもつ請求項１または２に記載のタンパク質と相互作用させ、複合体を形成させる工程と
前記複合体から放出される光を検出する工程と、を含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４に記載のタンパク質検出方法であって、
アミノ酸配列番号２を有するＧｌｕｃＮドメイン、アミノ酸配列番号３を有するＦｌｕｃＮドメイン、またはアミノ酸配列番号４を有するＴｌｕｃＮドメインを有するタンパク質を、請求項１または２のタンパク質と相互作用させ、複合体を形成させる工程と、
前記複合体から放出される光を検出する工程と、を含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項５に記載の複合体の検出方法であって、前記複合体から放出される光を検出する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１または２に記載の第１のタンパク質と、アミノ酸配列番号２を有するＧｌｕｃＮドメイン、アミノ酸配列番号３を有するＦｌｕｃＮドメイン、またはアミノ酸配列番号４を有するＴｌｕｃＮドメインを有する第２のタンパク質との結合を検出する方法であって、
第１のタンパク質と第２のタンパク質を相互作用させ、複合体を形成させる工程と、
前記複合体から放出される光を検出する工程と、を含むことを特徴とする方法。
【請求項８】
相互に結合能を有する第１のタンパク質と第２のタンパク質との結合を検出する方法であって、
アミノ酸配列番号１を有するＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを、第１のタンパク質に融合させる工程と、
アミノ酸配列番号２を有するＧｌｕｃＮドメイン、アミノ酸配列番号３を有するＦｌｕｃＮドメイン、またはアミノ酸配列番号４を有するＴｌｕｃＮドメインを第２のタンパク質に融合させる工程と、
前記融合した第１のタンパク質と前記融合した第２のタンパク質とを相互作用させ、複合体を形成させる工程と、
前記複合体から放出される光を検出する工程と、
を含むことをと特徴とする方法。
【請求項９】
第２のタンパク質と第３のタンパク質から、第１のタンパク質の結合タンパク質を選択する方法であって、
前記第１のタンパク質はアミノ酸配列番号１を有するＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインに融合しており、前記第２のタンパク質と、前記第３のタンパク質のそれぞれは、アミノ酸配列番号２を有するＧｌｕｃＮドメイン、アミノ酸配列番号３を有するＦｌｕｃＮドメイン、またはアミノ酸配列番号４を有するＴｌｕｃＮドメインからなる群から選ばれる異なるドメインに融合しており、
前記第１のタンパク質を前記第２のタンパク質および前記第３のタンパク質と相互作用させる工程と、
放出される光を検出して、前記光を前記タンパク質のどの複合体が放出しているかを判断する工程と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の方法であって、さらに、
アミノ酸配列番号１を有するＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインを前記第１のタンパク質に融合させる工程と、
アミノ酸配列番号２を有するＧｌｕｃＮドメイン、アミノ酸配列番号３を有するＦｌｕｃＮドメイン、またはアミノ酸配列番号４を有するＴｌｕｃＮドメインからなる群から選ばれる２つのドメインのそれぞれを、前記第２のタンパク質および前記第３のタンパク質に融合させる工程と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
アミノ酸配列番号１を有するＴｌｕｃＣ（ｍｕｔ）ドメインをコードする配列を含むことを特徴とする、ベクター。
【図２】
【図３】
【図５】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１】
【図４】
【図６】
【図１０】
【図３】
【図５】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１】
【図４】
【図６】
【図１０】
【公開番号】特開２００９−１５９８８９（Ｐ２００９−１５９８８９Ａ）
【公開日】平成２１年７月２３日（２００９．７．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−７８９（Ｐ２００８−７８９）
【出願日】平成２０年１月７日（２００８．１．７）
【出願人】（５０８００７０７５）株式会社ＰｒｏｂｅＸ (3)
【出願人】（５０４２６１０７７）大学共同利用機関法人自然科学研究機構 (156)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年７月２３日（２００９．７．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１月７日（２００８．１．７）
【出願人】（５０８００７０７５）株式会社ＰｒｏｂｅＸ (3)
【出願人】（５０４２６１０７７）大学共同利用機関法人自然科学研究機構 (156)
【Ｆターム（参考）】
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