ダブルノックアウト非ヒト動物
【課題】動脈硬化治療薬のスクリーニングに用いることができるノックアウト非ヒト動物などが求められていた。
【解決手段】ＬＤＬＲ遺伝子の全部又は一部、並びにＥＢＩ３遺伝子、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子及びＷＳＸ−１遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の全部又は一部の機能が失われた、ノックアウト非ヒト動物又はその一部。
【解決手段】ＬＤＬＲ遺伝子の全部又は一部、並びにＥＢＩ３遺伝子、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子及びＷＳＸ−１遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の全部又は一部の機能が失われた、ノックアウト非ヒト動物又はその一部。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ノックアウト非ヒト動物、その疾患モデル動物として使用、それを用いた治療薬のスクリーニング方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
動脈硬化は、動脈壁の肥厚、動脈壁の弾性の低下等を示す動脈病変の総称である。動脈硬化が進行すると、血管内腔が極度に狭窄し、或いは閉塞することによって、臓器や組織に循環障害が生じる。このような動脈硬化は、病理学的に、アテローム性動脈硬化、メンケベルグ動脈硬化、及び細動脈硬化の３つに分類することができる。
【０００３】
アテローム性動脈硬化は、大型又は中型動脈に生じる硬化病変であり、肥厚した血管内膜層へのコレステロールエステルを主とする脂質の蓄積などが見られる。このアテローム性動脈硬化は次のように生じると考えられている。すなわち、先ず、血液中の単球が血管内膜へ接着する。内膜に接着した単球がマクロファージへと分化する。このマクロファージが、スカベンジャー受容体を介して、酸化低密度リポタンパク質（酸化ＬＤＬ）などの変性ＬＤＬを多量に取り込み、泡沫細胞となる。この泡沫細胞が血管内膜に蓄積される。血管内膜に蓄積された泡沫細胞は、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ−９等）や、炎症性サイトカイン（インターロイキン６（ＩＬ６）、ＩＬ１２等）を分泌する。また、中膜平滑筋細胞が内膜へ遊走し、内膜で増殖する。そして、これら血管内膜での泡沫細胞の蓄積と血管内膜での中膜平滑筋細胞の増殖が、アテローム性動脈硬化を生じさせる。
【０００４】
上記のようにＬＤＬは、動脈硬化の発生に重要な役割を果たす。ＬＤＬは、ほとんどがコレステロールから構成されるリポタンパク質である。ＬＤＬは、通常は、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）を介して細胞に取り込まれる。そして、ＬＤＬのコレステロールは、胆汁酸や、ステロイドホルモン、細胞膜成分などとして利用される。ところが、血漿ＬＤＬの量が過剰になると、ＬＤＬは、動脈壁内へ透過し、変性（酸化など）する。変性したＬＤＬはＬＤＬＲへの親和性を失う。その場合、変性ＬＤＬは、スカベンジャー受容体を介してマクロファージに取り込まれるようになる。マクロファージは、変性ＬＤＬを過剰に取り込んで、泡沫細胞となり、上記のように動脈硬化を引き起こす。
【０００５】
ところで、インターロイキン２７（ＩＬ２７）は、ＩＬ２７−ｐ２８とＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ（ＥＢＶ）−ｉｎｄｕｃｅｄ ｇｅｎｅ ３（ＥＢＩ３）の２つの異なるサブユニットを含むサイトカインである。一方、ＩＬ２７受容体（ＩＬ２７Ｒ）は、ＷＳＸ−１とｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ １３０とのヘテロダイマーで構成される。ＩＬ２７は、例えば、単球、マクロファージ及び樹状細胞のような抗原提示細胞で発現する。抗原提示細胞で発現したＩＬ２７は、ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞の増殖を促す。また、ＩＬ２７は、ＩＬ１２と共にＣＤ４＋ナイーブＴ細胞に作用し、ＴＨ１型サイトカインであるインターフェロン−γ（ＩＦＮγ）の産生を促す。さらに、ＩＬ２７は、ＴＨ１型免疫応答に特異的な転写因子であるＴ−ｂｅｔをアップレギュレートさせ、これにより、ＴＨ２型免疫応答に特異的な転写因子であるＧＡＴＡ−３をダウンレギュレートさせる。ＩＬ２７は、免疫細胞の増殖に必要なＩＬ２の産生を抑制し、また炎症が関わる疾患の病態形成に重要な役割を果たすＴＨ１７型細胞の分化を抑制する。また、ＩＬ２７は、様々な炎症性サイトカインの産生を抑制する作用を有している。したがって、ＩＬ２７は、様々な免疫・炎症反応を抑制する作用を有する。
【０００６】
ここで、特許文献１：特表２００７−５２３１６９号公報には、ＩＬ２７Ｒノックアウトマウスは、ＴＨ１型免疫応答が失われており、例えば、（ａ）ＩＦＮγの産生量が減少する、（ｂ）Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、及びＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａのような細胞内病原体に対して過敏になる、（ｃ）ＴＨ１型Ｔ細胞依存性抗体（ＩｇＧ２ａサブタイプ）の産生量が少なくなる、（ｄ）Ｂａｃｉｌｌｕｓに応答して異常な肉芽腫を形成する、などの症状が見られることが記載されている。さらに、ＩＬ２７Ｒに対するアンタゴニストを投与することにより、皮膚の炎症状態、関節炎、クローン病、気道過敏性、気道の炎症、アテローム性動脈硬化症などが改善できることも記載されている。
【０００７】
特許文献２：特表２００７−５２５４１５号公報には、ＩＬ２７Ｒに対するリガンドを使用することにより、免疫疾患又はヘルパーＴ細胞媒介性疾患を治療できることが記載されている。また、免疫疾患又はヘルパーＴ細胞媒介性疾患の一つとして、アテローム性動脈硬化症が挙げられている。
【０００８】
特許文献３：特開２００８−２２８７２６号公報には、ＬＤＬＲ欠損マウスに高脂肪食を摂取させることによりアテローム性動脈硬化症の発生を促すことが記載されている。
【０００９】
非特許文献１：Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １５， ５６９−７８には、ＩＬ−２７の作用が失われたマウスにおいて、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ感染後のＴｈ１型免疫反応の低下が記載されている。
【００１０】
非特許文献２：Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １９， ６５７−６６７には、ＩＬ２７の作用が失われたマウスにおいて、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ感染後に炎症性サイトカインの過剰生産が生じることが記載されており、非特許文献３：Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７７， ５３７７−８５には、ＩＬ２７がリンパ球に作用して、様々なサイトカインの産生を抑制することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特表２００７−５２３１６９号公報
【特許文献２】特表２００７−５２５４１５号公報
【特許文献３】特開２００８−２２８７２６号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｙｏｓｈｉｄａ， Ｈ．， Ｈａｍａｎｏ， Ｓ．， Ｓｅｎａｌｄｉ， Ｇ．， Ｃｏｖｅｙ， Ｔ．， Ｆａｇｇｉｏｎｉ， Ｒ．， Ｍｕ， Ｓ．， Ｘｉａ， Ｍ．， Ｗａｋｅｈａｍ， Ａ．Ｃ．， Ｎｉｓｈｉｎａ， Ｈ．， Ｐｏｔｔｅｒ， Ｊ．， Ｓａｒｉｓ， Ｃ．Ｊ．， Ｍａｋ， Ｔ．Ｗ． （２００１） ＷＳＸ−１ Ｉｓ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈ１ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｌ． ｍａｊｏｒ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １５， ５６９−７８．
【非特許文献２】Ｈａｍａｎｏ， Ｓ．， Ｈｉｍｅｎｏ， Ｋ．， Ｍｉｙａｚａｋｉ， Ｙ．， Ｉｓｈｉｉ， Ｋ．， Ｙａｍａｎａｋａ， Ａ．， Ｔａｋｅｄａ， Ａ．， Ｚｈａｎｇ， Ｍ．， Ｈｉｓａｅｄａ， Ｈ．， Ｍａｋ， Ｔ．Ｗ．， Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ， Ａ．， Ｙｏｓｈｉｄａ， Ｈ． （２００３） ＷＳＸ−１ Ｉｓ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １９， ６５７−６６７．
【非特許文献３】Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ， Ｔ．， Ｔａｋｅｄａ， Ａ．， Ｈａｍａｎｏ， Ｓ．， Ｍｉｙａｚａｋｉ， Ｙ．， Ｋｉｎｊｙｏ， Ｉ．， Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ， Ｔ．， Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ， Ａ．， Ｙｏｓｈｉｄａ， Ｈ． （２００６） Ｔｗｏ−Ｓｉｄｅｄ Ｒｏｌｅｓ ｏｆ ＩＬ−２７： Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈ１ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｎ Ｎａｉｖｅ ＣＤ４＋ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｖｅｒｓｕｓ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ＩＬ−２３−Ｉｎｄｕｃｅｄ ＩＬ−１７ ｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＣＤ４＋ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｐａｒｔｉａｌｌｙ Ｔｈｒｏｕｇｈ ＳＴＡＴ３−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７７， ５３７７−８５．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上記状況において、ヒト動脈硬化症の病態により類似し、なおかつ動脈硬化治療薬のスクリーニングに用いることができるノックアウト非ヒト動物などが求められていた。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）遺伝子の全部又は一部、並びにＩＬ２７又はＩＬ２７受容体の遺伝子の全部又は一部の機能が失われた、ノックアウト非ヒト動物が、動脈硬化治療薬のスクリーニングに有用であることなどを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち、本発明は、以下に示す、ノックアウト非ヒト動物、ノックダウン非ヒト動物、それらを用いた動脈硬化治療薬のスクリーニング方法などを提供する。
（１） ＬＤＬＲ遺伝子の全部又は一部、並びにＥＢＩ３遺伝子、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子及びＷＳＸ−１遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の全部又は一部の機能が失われた、ノックアウト非ヒト動物又はその一部。
（２） ＬＤＬＲ遺伝子、並びにＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子の発現量が、野生型と比較して低下している、ノックダウン非ヒト動物又はその一部。
（３） 上記（１）若しくは（２）記載の動物又はその一部からなる、動脈硬化若しくは動脈硬化性疾患モデル動物又はその一部。
（４） ＬＤＬＲ遺伝子の全部又は一部、並びにＥＢＩ３遺伝子、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子及びＷＳＸ−１遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の全部又は一部の機能が失われた、ノックアウト細胞。
（５） ＬＤＬＲ遺伝子、並びにＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子の発現量が、野生型と比較して低下している、ノックダウン細胞。
（６） 動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬のスクリーニング方法であって、
（ａ）上記（１）〜（３）のいずれか１項記載の動物若しくはその一部又は上記（４）若しくは（５）記載の細胞に被検物質を接触させ、
（ｂ）被検物質を接触させた動物若しくはその一部又は細胞における動脈硬化又は動脈硬化性疾患の状態と、対照の動脈硬化又は動脈硬化性疾患の状態とを比較し、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づき、被検物質の動脈硬化改善効果又は動脈硬化性疾患改善効果を評価し、
（ｄ）動脈硬化改善効果又は動脈硬化性疾患改善効果を有すると評価された被検物質を選択する
ことを含む、前記方法。
（７） 対照が、被検物質を接触させない、ＬＤＬＲ遺伝子の全部又は一部の機能が失われているが、ＥＢＩ３遺伝子、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子及びＷＳＸ−１遺伝子の機能が失われていないノックアウト非ヒト動物若しくはその一部又はノックアウト細胞である、上記（６）記載の方法。
（８） ＩＬ２７シグナル活性化剤のスクリーニング方法であって、
（ａ）上記（１）〜（３）のいずれか１項記載の動物の一部又は上記（４）若しくは（５）記載の細胞に被検物質を接触させ、
（ｂ）被検物質を接触させた動物の一部又は細胞におけるＩＬ２７シグナルの活性化の状態と、対照のＩＬ２７シグナルの活性化の状態とを比較し、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づき、被検物質のＩＬ２７シグナル活性化亢進作用を評価し、
（ｄ）ＩＬ２７シグナル活性化亢進作用を有すると評価された被検物質を選択する
ことを含む、前記方法。
（９） 対照が、被検物質を接触させない、ＬＤＬＲ遺伝子の全部又は一部の機能が失われているが、ＥＢＩ３遺伝子、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子及びＷＳＸ−１遺伝子の機能が失われていないノックアウト非ヒト動物の一部又はノックアウト細胞である、上記（８）記載の方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は、ＬＤＬＲ遺伝子の全部又は一部、並びにＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒの遺伝子の全部又は一部の機能が失われたノックアウト非ヒト動物を提供する。該動物は、野生型非ヒト動物や、ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子の全部又は一部の機能が失われているが、ＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒの遺伝子の全部又は一部の機能が失われていないノックアウト非ヒト動物と比較して、動脈硬化病変の形成量が増加していることから、動脈硬化モデル動物などとして使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、高コレステロール食を１２週間（ａ）１６週間（ｂ）投与した各群マウスの大動脈内膜側の代表例を示す写真である。オレンジ色にオイルレッドＯで染色された部分が動脈硬化巣である。
【図２】図２は、動脈硬化巣の大動脈に占める割合を定量評価したグラフである（実施例５）。図２に示したように、動脈硬化巣の大動脈に占める割合がＬＤＬＲノックアウトマウス（ＬＤＬＲ−／−）に比してＬＤＬＲ／ＥＢＩ−３遺伝子ダブルノックアウトマウス（ＬＤＬＲ−／−ＥＢＩ３−／−）及びＬＤＬＲ／ＷＳＸ−１遺伝子ダブルノックアウトマウス（ＬＤＬＲ−／−ＷＳＸ−１−／−）において増加していることを示す。
【図３】図３は、各群マウスの腹腔内マクロファージによるＤｉＩラベルアセチルのＬＤＬ取り込みの様子を示すコンフォーカル顕微鏡像（代表例）である。マクロファージに取り込まれたアセチルＬＤＬが赤色で、マクロファージの核が青色で染色されている。
【図４】図４は、各群マウスの腹腔内マクロファージに取り込まれたＤｉＩラベルアセチルＬＤＬの量を比較したグラフである。グラフの縦軸は、蛍光強度（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）（単位：ａｕｂｉｔｏｒｙ ｕｎｉｔ）を示す。マクロファージに取り込まれたアセチルＬＤＬの量は、ＤｉＩの蛍光強度と比例しており、蛍光強度が高ければ高いほど、マクロファージに取り込まれたアセチルＬＤＬの量が多いことを示す。図４に示したように、マクロファージに取り込まれたアセチルＬＤＬの量は、ＬＤＬＲノックアウトマウス（ＬＤＬＲ−／−）に比してＬＤＬＲ／ＥＢＩ−３遺伝子ダブルノックアウトマウス（ＬＤＬＲ−／−ＥＢＩ３−／−）及びＬＤＬＲ／ＷＳＸ−１遺伝子ダブルノックアウトマウス（ＬＤＬＲ−／−ＷＳＸ−１−／−）において増加していた。
【図５】図５は、各群マウスの腹腔内マクロファージが培養上清中に産生したサイトカインの濃度を示すグラフである。図５（ａ）は、マウスＩＬ１β（Ｍｓ ＩＬ−１ｂｅｔａ）の濃度を、図５（ｂ）は、マウスＩＬ６（Ｍｓ ＩＬ−６）の濃度を、図５（ｃ）は、マウスＩＬ１２（Ｍｓ ＩＬ−１２）の濃度を、図５（ｄ）は、マウスＩＬ１０（Ｍｓ ＩＬ−１０）の濃度を、それぞれ測定した結果を示すグラフである。グラフの横軸において、「Ｌ」は、ＬＤＬＲノックアウトマウス（ＬＤＬＲ−／−）を、「ＬＥ」は、ＬＤＬＲ／ＥＢＩ−３遺伝子ダブルノックアウトマウス（ＬＤＬＲ−／−ＥＢＩ３−／−）を、「ＬＷ」は、ＬＤＬＲ／ＷＳＸ−１遺伝子ダブルノックアウトマウス（ＬＤＬＲ−／−ＷＳＸ−１−／−）をそれぞれ表す。また「ＬＰＳ ０」及び「ＬＰＳ １０」は、それぞれ、対照溶媒投与群と、リポポリサッカライド投与群を示す。グラフの縦軸の数値は、サイトカインの濃度（ｐｇ／ｍｌ）を示す。図５に示したように、ＬＤＬＲ／ＥＢＩ−３遺伝子ダブルノックアウトマウス及びＬＤＬＲ／ＷＳＸ−１遺伝子ダブルノックアウトマウスにおいて、ＬＤＬＲノックアウトマウスに比して、リポポリサッカライド刺激による炎症性サイトカイン（ＩＬ１β、ＩＬ６、ＩＬ１２）の産生増加と抗炎症性サイトカイン（ＩＬ１０）の産生低下がより大きかった。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明について詳細に説明する。
なお、本明細書に記載した全ての文献及び刊行物は、その目的にかかわらず参照によりその全体を本明細書に組み込むものとする。
【００１９】
本発明のノックアウト非ヒト動物は、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）遺伝子の全部又は一部、並びにＩＬ２７及び／又はＩＬ２７受容体（ＩＬ２７Ｒ）遺伝子の全部又は一部の機能が喪失するように作出されたものである。
【００２０】
ＬＤＬＲノックアウト非ヒト動物に高脂肪食餌を摂取させることにより、動脈硬化症の発生を促すことができることが知られている。一方、ＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒノックアウト非ヒト動物では、野生型非ヒト動物と比較して、動脈硬化病変の形成量に有意な差は無いことが広く知られている。ところが、本発明において、ＬＤＬＲ遺伝子、並びにＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子をノックアウトさせた非ヒト動物を作製したところ、該動物は、ＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子をノックアウトせず、ＬＤＬＲ遺伝子のみをノックアウトさせた動物と比較して、動脈硬化病変の形成量がさらに増加することが分かった。このことから、本発明の動物は、ヒトの動脈硬化に類した病態を表すモデル動物として使用できる。
【００２１】
１．本発明のノックアウト若しくはノックダウン非ヒト動物又はその一部
本発明のノックアウト非ヒト動物とは、該動物のＬＤＬＲ遺伝子の全部又は一部、並びにＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子の全部又は一部がその本来の機能を発揮しないように、破壊されているか、又は組み換えがなされている動物を意味する。これらの遺伝子は、ゲノム上の一方のアリルが機能しないように破壊又は変異されたヘテロノックアウト（ヘテロ接合体）でもよく、両方のアリルが破壊又は変異されたホモノックアウト（ホモ接合体）でもよい。本発明のノックアウト非ヒト動物には、このような動物の子孫も含まれる。
【００２２】
「遺伝子の全部の機能が失われた」とは、遺伝子が完全に失われることを意味し、「遺伝子の一部の機能が失われた」とは、遺伝子の一部が欠如することにより遺伝子の機能が野生型と比較して低下している状態にあることを意味する。従って、「その本来の機能を発揮しない」とは、ＬＤＬＲ、並びにＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒの発現自体が行なわれないようにするか、或いは発現してもタンパク質の活性が低下又は喪失していることを意味する。
【００２３】
「ノックダウン」とは、特定の遺伝子の発現量を抑制することを意味する。遺伝子の発現量の抑制は、例えば、遺伝子の転写量を減少させること、翻訳を阻害することなどにより、達成することができる。本発明のノックダウン非ヒト動物とは、該動物のＬＤＬＲ遺伝子、並びにＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子の発現量が、野生型と比較して低下している動物をいう。
【００２４】
ＬＤＬＲ遺伝子は、ＬＤＬＲをコードする遺伝子である。ＬＤＬＲは、血中主要コレステロール運搬体であるＬＤＬと結合し、ＬＤＬを細胞内に取り込む機能を有する。
【００２５】
ＩＬ２７遺伝子は、ＩＬ２７をコードする遺伝子であり、ＩＬ２７Ｒ遺伝子は、ＩＬ２７Ｒをコードする遺伝子である。ＩＬ２７は、ＩＬ２７−ｐ２８とＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ（ＥＢＶ）−ｉｎｄｕｃｅｄ ｇｅｎｅ ３（ＥＢＩ３）の２つの異なるサブユニットを含むサイトカインである。一方、ＩＬ２７受容体（ＩＬ２７Ｒ）は、ＷＳＸ−１とｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ １３０とのヘテロダイマーで構成される。ＩＬ２７は、例えば、単球、マクロファージ及び樹状細胞のような抗原提示細胞で発現する。
【００２６】
本発明においてノックアウト又はノックダウンの対象となるＩＬ２７遺伝子は、例えば、ＥＢＩ３遺伝子、及び／又はＩＬ２７−ｐ２８遺伝子である。また、本発明においてノックアウト又はノックダウンの対象となるＩＬ２７Ｒ遺伝子は、ＷＳＸ−１遺伝子である。したがって、本発明においてノックアウト又はノックダウンの対象となる「ＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子」とは、ＥＢＩ３遺伝子、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子及びＷＳＸ−１遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を意味する。本発明においてノックアウト又はノックダウンの対象となる「ＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子」は、好ましくは、ＥＢＩ３遺伝子、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子、又はＷＳＸ−１遺伝子である。
【００２７】
本発明においてノックアウト又はノックダウンの対象となるＬＤＬＲ遺伝子、ＥＢＩ３遺伝子、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子及びＷＳＸ−１遺伝子は公知であり、その塩基配列情報及びアミノ酸配列情報は、ＧｅｎＢａｎｋ等のアクセッション番号から知ることができる。以下に、ＬＤＬＲ遺伝子、ＥＢＩ３遺伝子、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子及びＷＳＸ−１遺伝子の塩基配列情報及びアミノ酸配列情報を示すアクセッション番号を例示する。
【００２８】
・マウスＥＢＩ３遺伝子のＤＮＡ配列：ＮＭ＿０１５７６６（配列番号：１）、
・マウスＥＢＩ３のアミノ酸配列：ＮＰ＿０５６５８１（配列番号：２）、
・ラットＥＢＩ３遺伝子のＤＮＡ配列：ＮＭ＿００１１０９４２１（配列番号：３）、
・ラットＥＢＩ３のアミノ酸配列：ＮＰ＿００１１０２８９１（配列番号：４）、
【００２９】
・マウスＩＬ２７−ｐ２８遺伝子のＤＮＡ配列：ＮＭ＿１４５６３６（配列番号：５）、
・マウスＩＬ２７−ｐ２８のアミノ酸配列：ＮＰ＿６６３６１１（配列番号：６）、
【００３０】
・マウスＷＳＸ−１遺伝子のＤＮＡ配列：ＮＭ＿０１６６７１（配列番号：７）、
・マウスＷＳＸ−１のアミノ酸配列：ＮＰ＿０５７８８０（配列番号：８）。
【００３１】
本発明においてノックアウト又はノックダウンの対象となる非ヒト動物は、ＬＤＬＲ遺伝子、ＩＬ２７遺伝子及びＩＬ２７Ｒ遺伝子を有するヒト以外の動物ならば、いかなる動物でもよいが、非ヒト哺乳動物が好ましい。非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ミニブタ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラット、サル等が用いられる。非ヒト哺乳動物のなかでも、病態動物モデル系の作製の面から個体発生及び生物サイクルが比較的短く、また繁殖が容易なげっ歯動物、とりわけマウス又はラット等が特に好ましい。
【００３２】
本発明において動物の一部とは、当該動物由来の組織、細胞、これらの破砕物又は抽出物、及び体液を意味し、特に限定されるものではない。非ヒト動物由来の組織としては、例えば、心臓、肺、腎臓、胆嚢、肝臓、膵臓、脾臓、腸、精巣（睾丸）、卵巣、子宮、胎盤、筋肉、血管、脳、骨髄、甲状腺、胸腺、乳腺、リンパ節、血液等が挙げられる。
【００３３】
本発明において動物由来の細胞としては、上記組織、臓器又は体液に含まれる細胞を意味し、単離及び培養して得られる培養細胞も含まれる。細胞は、例えば、マクロファージ、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、心筋細胞、骨髄細胞、リンパ球等の各種の細胞が挙げられる。培養細胞としては、初代培養細胞及びその株化細胞の両者を含む。発生段階（胎生期）における組織、各器官、細胞、破砕物又は抽出物及び体液も非ヒト動物の一部に含まれる。
【００３４】
さらに、動物由来の血液、リンパ液、尿等の体液も本発明において動物の一部に含まれる。
【００３５】
本発明のノックアウト非ヒト動物は、例えば高脂肪食を摂取させた時などに動脈硬化病変を多数形成し、その動脈硬化の形成量が、野生型非ヒト動物やＬＤＬＲノックアウト非ヒト動物と比較して、有意に増加していた。したがって、本発明のノックアウト又はノックダウン非ヒト動物は、動脈硬化若しくは動脈硬化性疾患モデル動物又はその一部として使用することができる。
【００３６】
動脈硬化性疾患としては、脳動脈疾患（例、脳梗塞、脳出血など）、冠動脈疾患（例、心筋梗塞、狭心症などの虚血性心疾患など）、大動脈疾患（例、大動脈瘤、大動脈解離など）、腎動脈疾患（例、腎硬化症、腎硬化症などに起因する腎不全など）、末梢動脈疾患（例、閉塞性動脈硬化症など）等を挙げることができる。大動脈疾患は、好ましくは、大動脈瘤である。
【００３７】
２．ノックアウト非ヒト動物又はノックダウン非ヒト動物の作製
２．１．ノックアウト非ヒト動物の作製
本発明のノックアウト非ヒト動物は、定法に従って作製することができる。例えば、（１）ＬＤＬＲ遺伝子と、ＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子とを不活性化させたＥＳ細胞を作製することによる方法、又は（２）ＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物と、ＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子ノックアウト非ヒト動物との交配による方法を用いて、本発明のノックアウト非ヒト動物を作製することができる。
【００３８】
２．１．１．ＬＤＬＲ遺伝子と、ＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子とを不活性化させたＥＳ細胞を作製することによる方法
当該方法は、
（ａ）遺伝子のターゲティングによりＬＤＬＲ遺伝子、並びにＩＬ２７遺伝子及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子の全部又は一部の機能を欠損させたＥＳ細胞を作製すること、
（ｂ）ＥＳ細胞を用いて、キメラ非ヒト動物を作製すること、
（ｃ）キメラ非ヒト動物を野生型マウスと交配してヘテロノックアウト非ヒト動物を作製すること、
（ｄ）ヘテロノックアウト非ヒト動物同士を交配して、ホモノックアウト非ヒト動物を作製すること、を含む。
以下、上記各工程について詳細に説明する。
【００３９】
工程（ａ）：遺伝子ターゲティング
遺伝子ターゲティングでは、先ず、目的遺伝子（ＬＤＬＲ遺伝子、並びにＩＬ２７遺伝子及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子）の機能を喪失させ、或いはその機能が低下するように破壊又は組換えたＤＮＡ断片を作製する。目的遺伝子のターゲティングベクターは、目的遺伝子を破壊することにより当該遺伝子の全部又は一部を喪失させ、機能を全く失わせるか、或いは機能を低下させるものである。「遺伝子の全部を喪失させ」とは、遺伝子が完全に失われることを意味し、「遺伝子の一部を喪失させ」とは、遺伝子の一部が欠如することにより遺伝子の機能が野生型と比較して低下している状態にあることを意味する。従って、「遺伝子の全部又は一部を喪失させ」とは、目的遺伝子がコードするタンパク質の発現自体が行なわれないようにするか、或いは発現してもタンパク質の活性が失われているか、又は野生型と比較して低下していることを意味する。
【００４０】
ターゲティングベクターは、相同組換えを起こさせた後の組換え体のスクリーニングが容易となるように構築することが好ましい。例えば、ポジティブ−ネガティブ選択をするために、ベクターに薬剤耐性遺伝子又は毒素遺伝子などの選択マーカーを連結することができる。ポジティブ−ネガティブ選別法は、当分野において周知である。すなわち、ポジティブ選別は、選択マーカー遺伝子が組み込まれなかった細胞は、薬剤を含む培養液で培養すると、耐性遺伝子を含まないために死ぬことを利用するものであり、ネガティブ選別法は、組み込みがランダムに起こった細胞では、ネガティブ選別用遺伝子が発現するために、細胞が死ぬことを利用するものである。その結果、相同組換えを起こした細胞のみが生き残り、選別される。
【００４１】
選択マーカー遺伝子は、ポジティブ選択用として例えばネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子などを使用することができ、ネガティブ選択用として例えばヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋ）、ジフテリア毒素Ａ遺伝子などを使用することができる。
【００４２】
上記の方法により作製したターゲティングベクターを用いて、相同組換えを行う。現在確立されている遺伝子ターゲティング法では、ノックアウト非ヒト動物を作製する場合には、ＥＳ細胞を使用することが望ましい。ＥＳ細胞として、ＴＴ２細胞、ＡＢ−１細胞、Ｊ１細胞、Ｒ１細胞などを適宜選択して使用することができる。
【００４３】
相同組換えを起こさせるために、目的遺伝子の機能を喪失させたターゲティングベクターを細胞中に導入する。ターゲティングベクターを細胞に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リポソーム法などを使用することができる。効率、作業の容易性などを考慮して、エレクトロポレーション法を用いることが好ましい。そして細胞中の目的とするゲノムＤＮＡ配列を、ターゲティングベクターの相同組換えによって置換する。
【００４４】
相同組換え効率を高めるために、例えば、バクテリオファージＰ１由来の組換えシステムであるＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムを使用することができる。Ｃｒｅは組換え酵素であり、ｌｏｘＰと呼ばれる３４塩基の配列を認識して、この部位で組換えを起こさせることが可能となる。従って、ターゲティングしたい遺伝子（目的遺伝子）をｌｏｘＰ配列とｌｏｘＰ配列との間にはさみ、Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子を特異的プロモーター下流に組み込むことにより、部位特異的及び時期特異的にＣｒｅが産生されてｌｏｘＰで挟んだ遺伝子を切り取る（すなわち、目的遺伝子の機能を喪失させる）ことができる。
【００４５】
その後、ＰＣＲ法、サザンブロット法等により、目的遺伝子がターゲティングされているか否かを確認する。
【００４６】
ＰＣＲにおいて、プライマーは、例えばターゲティングベクターの外側のゲノムＤＮＡ領域上、及びターゲティングベクターの配列のうち薬剤耐性遺伝子上から設計することができる。
【００４７】
サザンブロット解析は、例えば以下の通り行うことができる。ターゲティングベクターに含まれないゲノム領域を認識する１又は２種類のプローブを設計する。目的遺伝子ゲノムを含むクローンを適当な制限酵素で処理することにより得られるＤＮＡ断片と、上記プローブとのハイブリダイゼーションを行なうことにより、目的遺伝子の破壊の有無を確認することができる。
【００４８】
工程（ｂ）：キメラ非ヒト動物の作製
相同組換えの結果得られた組換えＥＳ細胞を、８細胞期又は胚盤胞の胚内に移植する。このＥＳ細胞移植胚を偽妊娠仮親の子宮内に移植して出産させることによりキメラ動物を作製する。
【００４９】
ＥＳ細胞を胚内に移植する方法として、マイクロインジェクション法、凝集法などの公知手法を用いることができる。
【００５０】
マウスの場合、まず、ホルモン剤により過排卵処理を施した雌マウスを、雄マウスと交配させる。その後、８細胞期胚を用いる場合には受精から２．５日目に、胚盤胞を用いる場合には受精から３．５日目に、それぞれ卵管又は子宮から初期発生胚を回収する。回収した胚に、相同組換えを行ったＥＳ細胞を注入し、キメラ胚を作製する。
【００５１】
一方、仮親にするための偽妊娠雌マウスは、正常性周期の雌マウスを、精管結紮などにより去勢した雄マウスと交配することにより得ることができる。作出した偽妊娠マウスに対して、上述の方法により作製したキメラ胚を子宮内移植し、その後出産させることによりキメラマウスを作製することができる。
【００５２】
マウス以外の非ヒト動物についても、上記と同様にして、キメラ非ヒト動物を作製することができる。
【００５３】
工程（ｃ）：ヘテロノックアウト非ヒト動物の作製
上記のようにして得たキメラ非ヒト動物の中から、ＥＳ細胞移植胚由来の雄キメラ非ヒト動物を選択する。マウスの場合、選択したＥＳ細胞移植胚由来の雄マウスが成熟した後、このマウスを純系マウス系統の雌マウスと交配させる。そして、誕生した子マウスに、ＥＳ細胞に由来するマウス（ＥＳ細胞に組み込まれたゲノムを有していたマウス）の被毛色が現れることにより、ＥＳ細胞がキメラマウスの生殖系列へ導入されたことを確認することができる。そして、胚内に移植された組換えＥＳ細胞が生殖系列に導入された目的遺伝子欠損ヘテロノックアウト非ヒト動物を繁殖する。
【００５４】
工程（ｄ）：ホモノックアウト非ヒト動物の作製
上記のようにして得た目的遺伝子ヘテロノックアウト非ヒト動物同士を交配させて、遺伝子欠損ホモノックアウト非ヒト動物を得ることができる。
【００５５】
工程（ｃ）又は（ｄ）においてノックアウト非ヒト動物が得られたことの確認については、組織から染色体ＤＮＡを抽出しサザンブロット法やＰＣＲ法で行うことができる。さらに、組織からＲＮＡを抽出し、ノーザンブロット解析により遺伝子の発現パターンを解析することもできる。目的遺伝子がコードするタンパク質に対する抗体を用いてウエスタンブロッティングを行なってもよい。
【００５６】
また、樹立した動物系統について、ヘテロノックアウト非ヒト動物及びホモノックアウト非ヒト動物の表現型を解析することもできる。表現型の解析は、肉眼的観察、解剖による内部の観察、各臓器の組織切片、Ｘ線撮影による観察、行動や記憶の観察、血液検査や血清生化学検査行う。解析時期は、胎生期から成体までの任意の時期であってよく、特に限定されるものではない。
【００５７】
２．１．２．ＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物と、ＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子ノックアウト非ヒト動物との交配による方法
上記（１）ＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物と、ＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子ノックアウト非ヒト動物との交配による方法は、具体的には、次のように行うことができる。
【００５８】
ＬＤＬＲ遺伝子ホモノックアウト非ヒト動物（ＬＤＬＲ−／−）とＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子ホモノックアウト非ヒト動物（ＩＬ２７（Ｒ）−／−）とを交配させて、Ｆ１ヘテロノックアウト非ヒト動物（ＬＤＬＲ＋／−／ＩＬ２７（Ｒ）＋／−）を作出することができる。ホモノックアウト非ヒト動物を作出する場合には、このＦ１ヘテロノックアウト非ヒト動物同士をかけ合わせることで、Ｆ２ホモノックアウト非ヒト動物（ＬＤＬ−／−／ＩＬ２７（Ｒ）−／−）を得ることができる。
【００５９】
ノックアウト非ヒト動物が得られたことの確認は、前記と同様に行うことができる。
【００６０】
本発明のノックアウト非ヒト動物を作製するために使用するＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物や、ＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子ノックアウト非ヒト動物は、市販のものを入手しても良いし、或いは、標準的な方法で作製して入手しても良い。
【００６１】
マウスの場合、市販のものについては、例えば、ＬＤＬＲ遺伝子ホモノックアウトマウスはジャクソンラボラトリー社（カタログ番号００７０６８）より入手することができる。
【００６２】
標準的な作製方法については、例えば、
（ａ）遺伝子のターゲティングによりＬＤＬＲ遺伝子、ＩＬ２７遺伝子、又はＩＬ２７Ｒ遺伝子の全部又は一部の機能を欠損させたＥＳ細胞を作製すること、
（ｂ）ＥＳ細胞を用いて、キメラ非ヒト動物を作製すること、
（ｃ）キメラ非ヒト動物を野生型マウスと交配してヘテロノックアウト非ヒト動物を作製すること、
（ｄ）ヘテロノックアウト非ヒト動物同士を交配して、ホモノックアウト非ヒト動物を作製すること、などを含む方法により、ノックアウト非ヒト動物を作製することができる。
【００６３】
上記（ａ）〜（ｄ）の各工程の詳細は、目的遺伝子がＬＤＬＲ遺伝子、ＩＬ２７遺伝子、又はＩＬ２７Ｒ遺伝子であることを除き、前述した方法と同様である。
【００６４】
尚、ＥＢＩ３遺伝子ノックアウトマウスの作製方法は、例えば、Ｉｇａｗａ， Ｔ．， Ｎａｋａｓｈｉｍａ， Ｈ．， Ｓａｄａｎａｇａ， Ａ．， Ｍａｓｕｔａｎｉ， Ｋ．， Ｍｉｙａｋｅ， Ｋ．， Ｓｈｉｍｉｚｕ， Ｓ．， Ｔａｋｅｄａ， Ａ．， Ｈａｍａｎｏ， Ｓ．， Ｙｏｓｈｉｄａ， Ｈ． （２００９） Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ＥＢＶ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｇｅｎｅ ３ （ＥＢＩ３） ｉｎ ＭＲＬ／ｌｐｒ ｍｉｃｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ ｓｉａｌａｄｅｎｉｔｉｓ． Ｍｏｄ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ １９， ３３−４１．などにも記載されている。また、ＷＳＸ−１遺伝子ノックアウトマウスの作製方法は、例えば、Ｙｏｓｈｉｄａ， Ｈ．， Ｈａｍａｎｏ， Ｓ．， Ｓｅｎａｌｄｉ， Ｇ．， Ｃｏｖｅｙ， Ｔ．， Ｆａｇｇｉｏｎｉ， Ｒ．， Ｍｕ， Ｓ．， Ｘｉａ， Ｍ．， Ｗａｋｅｈａｍ， Ａ．Ｃ．， Ｎｉｓｈｉｎａ， Ｈ．， Ｐｏｔｔｅｒ， Ｊ．， Ｓａｒｉｓ， Ｃ．Ｊ．， Ｍａｋ， Ｔ．Ｗ． （２００１） ＷＳＸ−１ Ｉｓ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈ１ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｌ． ｍａｊｏｒ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １５， ５６９−７８．などにも記載されている。
【００６５】
２．２．ノックダウン非ヒト動物の作製
本発明のノックダウン非ヒト動物は、公知の方法に従って、非ヒト動物のＬＤＬＲ遺伝子、並びにＩＬ２７遺伝子及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子（以下、「ＬＤＬＲ遺伝子等」とする。）の発現を抑制することにより、作製することができる。
【００６６】
ＬＤＬＲ遺伝子等の発現抑制には、例えばＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用することができるが、特にこれに限定されるものではない。例えば、ＬＤＬＲ遺伝子等に対するｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）を設計及び合成し、これを、レトロウイルスベクターやアデノウイルスベクターに組み込んで非ヒト動物に導入することによりＲＮＡｉを引き起こすことができる。
【００６７】
ＲＮＡｉとは、ｄｓＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ）が標的遺伝子に特異的かつ選択的に結合し、当該標的遺伝子を切断することによりその発現を効率よく阻害する現象である。例えば、ｄｓＲＮＡを非ヒト動物に導入すると、そのＲＮＡと相同配列の遺伝子の発現が抑制（ノックダウン）される。
【００６８】
（１）ｓｉＲＮＡ
ｓｉＲＮＡの設計は、以下の通り行なうことができる。
（ａ） ＬＤＬＲ、ＩＬ２７、又はＩＬ２７Ｒをコードする遺伝子であれば特に限定されるものではなく、任意の領域を全て候補にすることが可能である。
（ｂ） 選択した領域から、ＡＡで始まる配列であって長さが１８〜３０塩基のもの、あるいは、ＡＡを５’側に加えたときの長さが１８〜３０塩基、好ましくは１９〜２３塩基の配列を選択する。その配列のＧＣ含量は、例えば３０〜７０％となるものを選択すればよく、５０％前後が好ましい。また、そのＧＣ分布に偏りがないものを選択するとよい。
（ｃ） 選択した配列の３’側にｄＴ又はＵの２残基のオーバーハングを加えるとよい。
（ｄ） ＢＬＡＳＴサーチをおこない、選択した配列に類似した配列を有するタンパク質が存在しないことを確認することが好ましい。
【００６９】
さらに、数種類のｓｉＲＮＡを同時に非ヒト動物に導入することにより、遺伝子の発現をより効果的に抑制できることがある。
【００７０】
ｓｉＲＮＡ合成の別法としてＤｉｃｅｒ法がある。Ｄｉｃｅｒ法の概要とは以下の通りである。まず、ＬＤＬＲ、ＩＬ２７、又はＩＬ２７Ｒをコードする遺伝子の配列のスタートコドンから５００ ｂｐ〜１ ｋｂｐの遺伝子配列をベクター等に組み込み、その遺伝子配列のセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡを転写させた後、アニーリングしてｄｓＲＮＡを作製する。次に、ＲＮａｓｅ ＩＩＩファミリーに属するＤｉｃｅｒ Ｅｎｚｙｍｅにより、このｄｓ−ＲＮＡを３’末端側に２塩基の突出末端をもつ２１−２３塩基のｓｉＲＮＡにプロセッシングさせる。
【００７１】
（２）ｓｈＲＮＡ
また、本発明は、ＲＮＡｉ効果をもたらすためにｓｈＲＮＡを使用することもできる。ｓｈＲＮＡ とは、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）と呼ばれ、一本鎖の一部の領域が他の領域と相補鎖を形成するためにステムループ構造を有するＲＮＡ分子である。このステムループ構造を有するＲＮＡ分子は生体内のＤｉｃｅｒ等によりプロセッシングを受け、ｓｉＲＮＡが産生される。
ｓｈＲＮＡは、その一部がステムループ構造を形成するように設計することができる。例えば、ある領域の配列を「配列Ａ」とし、配列Ａに対する相補鎖を「配列Ｂ」とすると、配列Ａ、スペーサー、配列Ｂの順になるようにこれらの配列が一本のＲＮＡ鎖に存在するようにし、全体で４２〜１２０塩基の長さとなるように設計する。配列Ａは、標的となるＬＤＬＲ、ＩＬ２７、又はＩＬ２７Ｒをコードする遺伝子の一部の領域の配列であり、標的領域は特に限定されるものではなく、任意の領域を候補にすることが可能である。そして配列Ａの長さは１８〜５０塩基、好ましくは２１〜３０塩基である。
【００７２】
また、ＬＤＬＲ遺伝子等の発現抑制には、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を利用することもできる。ｍｉＲＮＡは小分子ＲＮＡであり、自身と相補的な配列をもつｍＲＮＡからのタンパク質への翻訳を阻害することなどにより、特定の遺伝子の発現を抑制することができる。
【００７３】
ｍｉＲＮＡは、特定の遺伝子のｍＲＮＡを認識するように設計することができる。そのように設計するｍｉＲＮＡの塩基配列の長さは、例えば、１８〜２５塩基（例、約２２塩基）である。
【００７４】
３．ノックアウト細胞又はノックダウン細胞
本発明のノックアウト細胞とは、該細胞のＬＤＬＲ遺伝子の全部又は一部、並びにＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子の全部又は一部がその本来の機能を発揮しないように、破壊されているか、又は組み換えがなされている細胞を意味する。ＬＤＬＲ遺伝子は、ゲノム上の一方のアリルが機能しないように破壊又は変異されたヘテロノックアウト（ヘテロ接合体）でもよく、両方のアリルが破壊又は変異されたホモノックアウト（ホモ接合体）でもよい。
【００７５】
「遺伝子の全部」とは、遺伝子が完全に失われることを意味し、「遺伝子の一部」とは、遺伝子の一部が欠如することにより遺伝子の機能が野生型と比較して低下している状態にあることを意味する。従って、「その本来の機能を発揮しない」とは、ＬＤＬＲ、並びにＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒの発現自体が行なわれないようにするか、或いは発現してもタンパク質の活性が低下又は喪失していることを意味する。
【００７６】
また、本発明のノックダウン細胞とは、該細胞のＬＤＬＲ遺伝子、並びにＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子の発現量が、野生型と比較して低下している細胞をいう。
【００７７】
本発明においてノックアウト又はノックダウンの対象となるＬＤＬＲ遺伝子、ＥＢＩ３遺伝子、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子及びＷＳＸ−１遺伝子は公知であり、その塩基配列情報及びアミノ酸配列情報は、ＧｅｎＢａｎｋ等のアクセッション番号から知ることができる。以下に、ヒトのＬＤＬＲ遺伝子、ＥＢＩ３遺伝子、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子及びＷＳＸ−１遺伝子の塩基配列情報及びアミノ酸配列情報を示すアクセッション番号を例示する。ヒト以外の遺伝子についての塩基配列情報及びアミノ酸配列情報を示すアクセッション番号は、前記例示した通りである。
【００７８】
・ヒトＬＤＬＲ遺伝子のＤＮＡ配列：ＮＭ＿０００５２７（配列番号：９）、
・ヒトＬＤＬＲのアミノ酸配列：ＮＰ＿０００５１８（配列番号：１０）、
【００７９】
・ヒトＥＢＩ３遺伝子のＤＮＡ配列：ＮＭ＿００５７５５（配列番号：１１）、
・ヒトＥＢＩ３のアミノ酸配列：ＮＰ＿００５７４６（配列番号：１２）、
【００８０】
・ヒトＩＬ２７−ｐ２８遺伝子のＤＮＡ配列：ＮＭ＿１４５６５９（配列番号：１３）、
・ヒトＩＬ２７−ｐ２８のアミノ酸配列：ＮＰ＿６６３６３４（配列番号：１４）、
【００８１】
・ヒトＷＳＸ−１遺伝子のＤＮＡ配列：ＮＭ＿００４８４３（配列番号：１５）、
・ヒトＷＳＸ−１のアミノ酸配列：ＮＰ＿００４８３４（配列番号：１６）。
【００８２】
本発明のノックアウト又はノックダウン細胞は、単離された培養細胞であり、ＬＤＬＲ遺伝子、ＩＬ２７遺伝子及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子を発現する細胞由来であるならば、特に限定されない。ノックアウト又はノックダウン細胞としては、動物由来細胞がより好ましい。動物由来細胞としては、ヒト由来細胞であっても非ヒト動物由来細胞であってもよい。ＬＤＬＲ遺伝子、ＩＬ２７遺伝子及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子を発現する細胞は、例えば、単球、マクロファージ、樹状細胞、ヒト線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞、中枢神経系細胞、末梢神経系細胞、神経芽細胞、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞等の各種の細胞が挙げられる。本発明のいくつかの態様では、ノックアウト又はノックダウン細胞は、ＬＤＬＲ遺伝子、ＩＬ２７遺伝子及びＩＬ２７Ｒ遺伝子を発現する動物細胞由来の単離細胞である。ＬＤＬＲ遺伝子、ＩＬ２７遺伝子及びＩＬ２７Ｒ遺伝子を発現する細胞としては、例えば、単球、マクロファージ、樹状細胞、Ｔリンパ球、ヒト線維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、血管内皮細胞、膵臓ランゲルハンス島細胞等が挙げられる。培養細胞としては、初代培養細胞及びその株化細胞の両者を含む。
【００８３】
本発明のノックアウト細胞は、本発明のノックアウト非ヒト動物と同様、ＬＤＬＲ遺伝子の全部又は一部、並びにＥＢＩ３遺伝子、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子及びＷＳＸ−１遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の全部又は一部の機能が失われている。また、本発明のノックダウン細胞は、ＬＤＬＲ遺伝子、並びにＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子の発現量が、野生型と比較して低下している。したがって、本発明のノックアウト又はノックダウン細胞は、動脈硬化若しくは動脈硬化性疾患モデル細胞として使用することもできる。
動脈硬化性疾患としては、脳動脈疾患（例、脳梗塞、脳出血など）、冠動脈疾患（例、心筋梗塞、狭心症などの虚血性心疾患など）、大動脈疾患（例、大動脈瘤、大動脈解離など）、腎動脈疾患（例、腎硬化症、腎硬化症などに起因する腎不全など）、末梢動脈疾患（例、閉塞性動脈硬化症など）等を挙げることができる。
【００８４】
４．ノックアウト又はノックダウン細胞の作製
４．１．ノックアウト細胞の作製
本発明のノックアウト細胞は、遺伝子のターゲティングによりＬＤＬＲ遺伝子、並びにＩＬ２７遺伝子及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子の全部又は一部の機能を欠損させることにより得ることができる。
【００８５】
遺伝子ターゲティングは、前記「ＬＤＬＲ遺伝子と、ＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子とを不活性化させたＥＳ細胞を作製することによる方法」の項で説明した、遺伝子ターゲティングの方法に準じて行うことができる。
【００８６】
４．２．ノックダウン細胞の作製
本発明のノックダウン細胞は、公知の方法に従って、ＬＤＬＲ遺伝子、並びにＩＬ２７遺伝子及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子（以下、「ＬＤＬＲ遺伝子等」とする。）の発現を抑制させることにより、作製することができる。
【００８７】
ＬＤＬＲ遺伝子等の発現抑制には、例えばＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用することができるが、特にこれに限定されるものではない。ＬＤＬＲ遺伝子等に対するｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを設計及び合成し、これを細胞内に導入させることによって、ＲＮＡｉを引き起こすことができる。
【００８８】
ＲＮＡｉとは、ｄｓＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ）が標的遺伝子に特異的かつ選択的に結合し、当該標的遺伝子を切断することによりその発現を効率よく阻害する現象である。例えば、ｄｓＲＮＡを細胞内に導入すると、そのＲＮＡと相同配列の遺伝子の発現が抑制（ノックダウン）される。
【００８９】
ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡの設計法は、前記と同様である。
【００９０】
ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを細胞に導入するには、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成したｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡをプラスミドＤＮＡに連結してこれを細胞に導入する方法などを採用することができる。
【００９１】
また、ＬＤＬＲ遺伝子等の発現抑制には、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を利用することもできる。ｍｉＲＮＡは小分子ＲＮＡであり、自身と相補的な配列をもつｍＲＮＡからのタンパク質への翻訳を阻害することなどにより、特定の遺伝子の発現を抑制することができる。
【００９２】
ｍｉＲＮＡの設計方法は、前記と同様である。
【００９３】
５．動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬のスクリーニング方法
本発明は、動脈硬化又は動脈硬化性疾患を発症した本発明のノックアウト若しくはノックダウン非ヒト動物若しくはその一部又は本発明のノックアウト若しくはノックダウン細胞（以下、「本発明のノックアウト非ヒト動物等」という場合がある。）に、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療のための薬物の候補物質（被験物質）を接触させることにより、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬をスクリーニングすることができる。例えば、動脈硬化又は動脈硬化性疾患を発症した本発明のノックアウト非ヒト動物等に薬物候補物質を接触させ、前記候補物質を接触させた本発明のノックアウト非ヒト動物等において標的とする疾患と相関関係を有する指標（例えば、動脈硬化の形成量、動脈硬化病変の組織像、動脈硬化を生じている臓器・組織の機能障害の程度、血液中の代用マーカー、内皮細胞における接着分子（ＶＣＡＭ１等）の発現、培養心筋細胞においてアンジオテンシンＩＩやβアドレナリン作動薬で誘導されるアミノ酸取り込み（例、３Ｈロイシンの取り込み）や細胞肥大（例、位相差顕微鏡で観察される細胞面積）、マクロファージのサイトカイン産生・蛋白分解酵素産生・変性脂質取り込み、Ｔリンパ球のサイトカイン（例、ＩＬ６、ＩＬ１２等の炎症性サイトカイン）の産生や遊走、筋細胞の生理活性物質産生（例、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ等の成長因子・ペプチド産生）等）を測定し、対照と比較し、この比較結果に基づいて、動脈硬化又は動脈硬化性疾患の症状を軽減又は消滅させるか否かを確認することで、候補物質をスクリーニングすることができる。
【００９４】
本発明のノックアウト若しくはノックダウン非ヒト動物を候補物質で接触させる方法としては、例えば、経口投与、静脈注射、塗布、皮下投与、皮内投与、腹腔投与などが用いられ、試験動物の症状、候補物質の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、候補物質の投与量は、投与方法、候補物質の性質などにあわせて適宜選択することができる。
【００９５】
本発明のノックアウト若しくはノックダウン非ヒト動物の一部又は本発明のノックアウト若しくはノックダウン細胞（以下、「本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等」とする。）を候補物質で接触させる方法としては、例えば、本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等と候補物質とを同一の反応系又は培養系に存在させる方法を用いることができる。より具体的には、本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等の培養容器に候補物質を添加すること、本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等と候補物質とを混合すること、本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等を候補物質の存在下で培養すること等が挙げられる。また、接触させる候補物質量は、投与方法、候補物質の性質などにあわせて適宜選択することができる。
【００９６】
動脈硬化は、例えば、高脂肪食を摂取させることにより本発明のノックアウト非ヒト動物等に誘発させることができる。また、動脈硬化性疾患の一つである大動脈瘤は、例えば、アンジオテンシンＩＩを投与することにより本発明のノックアウト非ヒト動物等に誘発させることができる。
【００９７】
比較のための対照は、例えば、被験物質を接触させない野生型非ヒト動物若しくはその一部又は野生型細胞（以下、「野生型非ヒト動物等」とする。）、被験物質を接触させた野生型非ヒト動物等、動脈硬化改善作用を有することが分かっている物質（既知の動脈硬化治療薬等）を接触させた野生型非ヒト動物等、被験物質を接触させないＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト若しくはノックダウン非ヒト動物若しくはその一部又はＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト若しくはノックダウン細胞（以下、「ＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物等」とする。）、被験物質を接触させたＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物等、既知の動脈硬化治療薬等を接触させたＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物等、被験物質を接触させない本発明のノックアウト非ヒト動物等、既知の動脈硬化治療薬等を接触させた本発明のノックアウト非ヒト動物等のいずれをも意味し、目的に応じて少なくとも１つの対照を適宜選択することができる。
【００９８】
ここで、「野生型非ヒト動物若しくはその一部」とは、ＬＤＬＲ遺伝子、ＩＬ２７遺伝子及びＩＬ２７Ｒ遺伝子のいずれもが正常に発現し、機能している非ヒト動物又はその一部を意味する。「野生型細胞」とは、ＬＤＬＲ遺伝子、ＩＬ２７遺伝子及びＩＬ２７Ｒ遺伝子のいずれもが正常に発現し、機能している細胞を意味する。「ＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物」とは、ＬＤＬＲ遺伝子の全部又は一部の機能が失われているが、ＥＢＩ３遺伝子、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子及びＷＳＸ−１遺伝子の機能が失われていない非ヒト動物を意味する。「ＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト細胞」とは、ＬＤＬＲ受容体遺伝子の全部又は一部の機能が失われているが、ＥＢＩ３遺伝子、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子及びＷＳＸ−１遺伝子の機能が失われていない細胞を意味する。ＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト細胞は、前記「ノックアウト細胞の作製」に記載の方法と同様にして作製したものを使用することができる。「ＬＤＬＲ遺伝子ノックダウン細胞」とは、該細胞のＬＤＬＲ遺伝子の発現量が野生型と比較して低下しているが、ＩＬ２７及びＩＬ２７Ｒ遺伝子は正常に発現し、機能している細胞をいう。ＬＤＬＲ遺伝子ノックダウン細胞は、前記「ノックダウン細胞の作製」の項に記載の方法と同様にして作製したものを使用することができる。
【００９９】
上記に「対照」として例示したＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物は、本発明のノックアウト非ヒト動物と比較して、動脈硬化又は動脈硬化性疾患（以下、「動脈硬化等」とする。）が軽度である。これは、ＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物では、ＩＬ２７シグナルが不活性な本発明のノックアウト非ヒト動物と異なり、ＩＬ２７シグナルが正常であるためと考えられる。このＩＬ２７シグナルが正常なＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物と同程度又はそれよりも軽度になるように、本発明のノックアウト非ヒト動物の動脈硬化等を治療することができる物質は、ＩＬ２７シグナルに選択的に働く動脈硬化等治療薬となり得る。したがって、例えば、対照が候補物質を接触させないＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物の場合には、候補物質を接触させた本発明のノックアウト非ヒト動物の動脈硬化の形成量を測定し、当該測定された動脈硬化の形成量が、対照における動脈硬化の形成量と同等になったとき又はそれよりも低下したときは、前記候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択することができる。また、対照が候補物質を接触させないＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物の場合に、候補物質を接触させた本発明のノックアウト非ヒト動物の大動脈瘤の発生頻度を測定し、当該測定された大動脈瘤の発生頻度が、対照における大動脈瘤の発生頻度と同等になったとき又はそれよりも低下したときは、前記候補物質を、動脈硬化性疾患治療薬（特には、大動脈瘤治療薬）として選択することもできる。そして、本発明のノックアウト非ヒト動物の動脈硬化の形成量又は動脈瘤の発生頻度が、対照における動脈硬化の形成量又は動脈瘤の発生頻度と同等となるような候補物質は、ＩＬ２７シグナルに選択的に作用する動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬となり得る。
【０１００】
候補物質としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、細胞培養上清、植物抽出液、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど）の組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。これら候補物質は塩を形成していてもよく、候補物質の塩としては、生理学的に許容される酸（例えば、有機酸又は無機酸など）や塩基（例えば、金属酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、或いは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
【０１０１】
例えば、ある候補物質を投与した場合に、動脈硬化又は動脈硬化性疾患の症状が緩和若しくは消失したことが確認できる結果が得られれば、用いた候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択することが可能である。
【０１０２】
より具体的には、動脈硬化の形成量を指標とする場合には、次のようにスクリーニングを行う。動脈硬化の形成量は、例えば、後述の実施例に示したように、大動脈を摘出し、摘出した大動脈の内膜側総面積と動脈硬化巣の総面積を測定し、動脈硬化巣の総面積を大動脈の内膜側総面積で除し、動脈硬化巣の大動脈の内膜に占める割合を算出することにより求めることができる。そして、対照との比較結果に基づいて、本発明のノックアウト非ヒト動物等の動脈硬化の形成量を減少又は消滅させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。例えば、対照が上記「被験物質を接触させたＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物等」である場合には、本発明のノックアウト非ヒト動物等の動脈硬化の形成量を、対照における動脈硬化の形成量と同等とする又はそれよりも低下（例えば、５％以上、１０％以上、１５％以上又は２０％以上低下）させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。また、対照が上記「被験物質を接触させない本発明のノックアウト非ヒト動物等」である場合には、本発明のノックアウト非ヒト動物等の動脈硬化の形成量を、対照における動脈硬化の形成量よりも低下（例えば、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、７０％以上、９０％以上又は１００％以上低下）させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。
【０１０３】
動脈硬化病変の組織像を指標とする場合には、次のようにスクリーニングを行う。動脈硬化病変の組織像は、マウスから摘出した大動脈組織標本において内皮細胞接着分子、マクロファージ・血管平滑筋マーカーによる染色を行う。そして、対照との比較結果に基づいて、各染色を減弱させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。例えば、対照が上記「被験物質を接触させたＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物等」である場合には、本発明のノックアウト非ヒト動物等の上記染色の程度を対照における染色の程度と同等とする又はそれよりも減衰（例えば、５％以上、１０％以上、１５％以上又は２０％以上減衰）させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。また、対照が上記「被験物質を接触させない本発明のノックアウト非ヒト動物等」である場合には、本発明のノックアウト非ヒト動物等の染色の程度を、対照における染色の程度よりも減衰（例えば、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、７０％以上、９０％以上又は１００％以上減衰）させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。上記「染色の程度」は、ＣＣＤカメラで病理組織像を撮像後、画像解析ソフトで数値化し定量評価することにより数値化することができる。
【０１０４】
動脈硬化を生じている臓器・組織の機能障害の程度を指標とする場合には、次のようにスクリーニングを行う。臓器・組織の機能障害としては、心臓ポンプ機能低下、腎機能低下、摘出血管弛緩能の低下、下肢血流低下と壊疽、大動脈瘤形成、脳障害による神経機能障害等が挙げられる。機能障害の程度は、例えば、心臓超音波と心臓圧・容積関係の測定；血液検査・尿検査・腎組織像による腎障害の評価；摘出血管の等尺収縮・弛緩；レーザードップラーによる下肢血流測定；生体におけるＣＴや摘出大動脈観察による大動脈携帯の評価；又は神経機能スコアによる神経機能評価やＣＴによる脳画像により求めることができる。そして、対照との比較結果に基づいて、心臓ポンプ機能低下を抑制、腎機能低下を抑制、摘出血管弛緩能の低下を抑制、下肢血流低下と壊疽を抑制、大動脈瘤形成を抑制又は脳障害による神経機能障害を抑制する候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。例えば、対照が上記「被験物質を接触させたＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物等」である場合には、本発明のノックアウト非ヒト動物等における、心臓ポンプ機能低下の程度、腎機能低下の程度、摘出血管弛緩能低下の程度、下肢血流低下と壊疽の程度、大動脈瘤形成の程度又は脳障害による神経機能障害の程度を、対照におけるものと同等とする又はそれよりも抑制（例えば、５％以上、１０％以上、１５％以上又は２０％以上抑制）させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。また、対照が上記「被験物質を接触させない本発明のノックアウト非ヒト動物等」である場合には、本発明のノックアウト非ヒト動物等における、心臓ポンプ機能低下の程度、腎機能低下の程度、摘出血管弛緩能低下の程度、下肢血流低下と壊疽の程度、大動脈瘤形成の程度又は脳障害による神経機能障害の程度を、対照におけるものよりも抑制（例えば、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、７０％以上、９０％以上又は１００％以上抑制）させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。上記「心臓ポンプ機能低下の程度」、「腎機能低下の程度」、「摘出血管弛緩能低下の程度」、「下肢血流低下と壊疽の程度」、「大動脈瘤形成の程度」及び「脳障害による神経機能障害の程度」は、それぞれ、次のようにして数値化することができる。すなわち、心臓ポンプ機能低下の程度としては心臓超音波法で計測される％ＦＳ又はＬＶＥＦ；腎機能低下の程度としては尿蛋白量、血中尿素窒素値又は血中クレアチニン値；摘出血管弛緩能低下の程度としては一酸化窒素供給体による血管弛緩；下肢血流低下と壊疽の程度としてはレーザードップラー血流計による血流測定又は壊疽発生頻度；大動脈瘤形成の程度としては摘出大動脈の肉眼的観察・測定による大動脈瘤の発生頻度又は大動脈径；及び脳障害による神経機能障害の程度については歩容（歩き方）を含むスコアの点数で、それぞれ定量評価できる。
【０１０５】
血液中の代用マーカーを指標とする場合には、次のようにスクリーニングを行う。血液中の代用マーカーとしては、高感度ＣＲＰ、ＰＴＸなどの炎症マーカー、ＩＬ６などの炎症性サイトカイン等が挙げられる。血液中の代用マーカーの量は、ＥＬＩＳＡやＬｕｍｉｎｅｘ ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ法により求めることができる。そして、対照との比較結果に基づいて、炎症マーカー量又は炎症性サイトカイン量を減少させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。例えば、対照が上記「被験物質を接触させたＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物等」である場合には、本発明のノックアウト非ヒト動物等の炎症マーカー量又は炎症性サイトカイン量を対照におけるものと同等とする又はそれよりも低下（例えば、５％以上、１０％以上、１５％以上又は２０％以上低下）させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。また、対照が上記「被験物質を接触させない本発明のノックアウト非ヒト動物等」である場合には、本発明のノックアウト非ヒト動物等の炎症マーカー量又は炎症性サイトカイン量を、対照におけるものよりも低下（例えば、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、７０％以上、９０％以上又は１００％以上低下）させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。
【０１０６】
内皮細胞における接着分子の発現を指標とする場合には、次のようにスクリーニングを行う。内皮細胞における接着分子としては、ＶＣＡＭ１、ＩＣＡＭ１等が挙げられる。内皮細胞における接着分子の発現は、培養内皮細胞をＴＮＦαの存在下で培養後、細胞表面に発現するＶＣＡＭ１をフローサイトメータ等で測定する。培養の際、培養液に対照あるいは候補物質を同時添加する。そして、対照との比較結果に基づいて、接着分子の発現を減少させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。例えば、対照が上記「被験物質を接触させたＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物等」である場合には、本発明のノックアウト非ヒト動物等の内皮細胞における接着分子の発現量を対照におけるものと同等とする又はそれよりも低下（例えば、５％以上、１０％以上、１５％以上又は２０％以上低下）させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。また、対照が上記「被験物質を接触させない本発明のノックアウト非ヒト動物等」である場合には、本発明のノックアウト非ヒト動物等の接着分子の発現量を、対照におけるものよりも低下（例えば、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、７０％以上、９０％以上又は１００％以上低下）させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。
【０１０７】
培養心筋細胞においてアンジオテンシンＩＩやβアドレナリン作動薬で誘導されるアミノ酸取り込み（例、３Ｈロイシンの取り込み）や細胞肥大（例、位相差顕微鏡で観察される細胞面積）を指標とする場合には、次のようにスクリーニングを行う。培養心筋細胞においてアンジオテンシンＩＩやβアドレナリン作動薬で誘導されて取り込まれるアミノ酸としては、ロイシン等が挙げられる。培養心筋細胞においてアンジオテンシンＩＩやβアドレナリン作動薬で誘導されるアミノ酸取り込みや細胞肥大は、それぞれ、３Ｈロイシンを添加した培養液で心筋細胞を培養し、一定時間後に心筋細胞中の３Ｈロイシンを液体シンチレーションカウンターで計測することで、細胞肥大にともなうアミノ酸取り込みを評価する。心筋細胞サイズは、培養心筋細胞を位相差顕微鏡で観察・撮像後、画像解析ソフトで細胞面積を測定する。心筋細胞肥大により、アミノ酸取り込みと心筋細胞面積は増加することにより求めることができる。そして、対照との比較結果に基づいて、アミノ酸取り込みと心筋細胞面積を減少させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。例えば、対照が上記「被験物質を接触させたＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物等」である場合には、本発明のノックアウト非ヒト動物等の上記アミノ酸取り込み量又は上記細胞肥大の程度を対照におけるものと同等とする又はそれよりも低下（例えば、５％以上、１０％以上、１５％以上又は２０％以上低下）させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。また、対照が上記「被験物質を接触させない本発明のノックアウト非ヒト動物等」である場合には、本発明のノックアウト非ヒト動物等の上記アミノ酸取り込み量又は上記細胞肥大の程度を、対照におけるものよりも低下（例えば、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、７０％以上、９０％以上又は１００％以上低下）させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。
【０１０８】
マクロファージのサイトカイン産生・蛋白分解酵素産生・変性脂質取り込みを指標とする場合には、次のようにスクリーニングを行う。マクロファージのサイトカインとしては、インターフェロンガンマ、ＩＬ６、ＩＬ１２、ＩＬ１β、ＴＮＦα等が挙げられる。マクロファージの蛋白分解酵素としては、マトリックスメタロプロテアーゼ等が挙げられる。マクロファージに取り込まれる変性脂質としては、酸化ＬＤＬ、アセチルＬＤＬ等が挙げられる。マクロファージのサイトカイン産生量・蛋白分解酵素産生量・変性脂質取り込み量は、それぞれ、次のようにして求めることができる。すなわち、サイトカイン産生量は、培養マクロファージで、一定時間培養した後の培地中のサイトカイン濃度をＥＬＩＳＡやルミネックスマイクロビーズ法で測定することにより求めることができる。蛋白分解酵素産生量は、培養マクロファージからＲＮＡを抽出し、マトリックスメタロプロテアーゼの遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲ法で定量化することにより求めることができる。アセチルＬＤＬの取り込み量は、後述の実施例に記載の方法により求めることができる。そして、対照との比較結果に基づいて、サイトカイン産生、マトリックスメタロプロテアーゼ発現又はアセチルＬＤＬ取り込みを減少させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。例えば、対照が上記「被験物質を接触させたＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物等」である場合には、本発明のノックアウト非ヒト動物等の上記サイトカイン産生量、上記蛋白分解酵素産生量又は変性脂質取り込み量を対照におけるものと同等とする又はそれよりも低下（例えば、５％以上、１０％以上、１５％以上又は２０％以上低下）させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。また、対照が上記「被験物質を接触させない本発明のノックアウト非ヒト動物等」である場合には、本発明のノックアウト非ヒト動物等の上記サイトカイン産生量、上記蛋白分解酵素産生量又は変性脂質取り込み量を、対照におけるものよりも低下（例えば、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、７０％以上、９０％以上又は１００％以上低下）させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。
【０１０９】
Ｔリンパ球のサイトカイン（例、ＩＬ６、ＩＬ１２等の炎症性サイトカイン）の産生や遊走を指標とする場合には、次のようにスクリーニングを行う。Ｔリンパ球のサイトカインとしては、ＩＬ６、ＩＬ１２、インターフェロンガンマ、ＴＮＦα等の炎症性サイトカイン等が挙げられる。Ｔリンパ球のサイトカインの産生や遊走の程度は、それぞれ、次のようにして求めることができる。すなわち、サイトカインの産生量は、Ｔリンパ球を培養し一定時間後の培養上清中のサイトカイン濃度をＥＬＩＳＡやルミネックスマイクロビーズ法で測定することにより求めることができる。遊走の程度は、トランスウエルを用い、ケモカインで誘導されるチャンバー間の移動細胞数を計測することにより求めることができる。そして、対照との比較結果に基づいて、サイトカイン産生量と遊走の程度を抑制する候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。例えば、対照が上記「被験物質を接触させたＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物等」である場合には、本発明のノックアウト非ヒト動物等の上記サイトカイン産生量又は上記遊走の程度を、対照におけるものと同等とする又はそれよりも低下（例えば、５％以上、１０％以上、１５％以上又は２０％以上低下）させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。また、対照が上記「被験物質を接触させない本発明のノックアウト非ヒト動物等」である場合には、本発明のノックアウト非ヒト動物等の上記サイトカイン産生量又は上記遊走の程度を、対照におけるものよりも低下（例えば、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、７０％以上、９０％以上又は１００％以上低下）させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。
【０１１０】
筋細胞の生理活性物質産生（例、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ等の成長因子・ペプチド産生）を指標とする場合には、次のようにスクリーニングを行う。筋細胞の生理活性物質としては、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ等の成長因子・ペプチド等が挙げられる。筋細胞の生理活性物質産生の程度は、それぞれ、一定時間培養した後、培養上清中の生理活性物質をＥＬＩＳＡで測定すること、細胞から抽出したＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲ法で遺伝子発現を検討することにより求めることができる。そして、対照との比較結果に基づいて、生理活性物質の遺伝子発現や産生を減少させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。例えば、対照が上記「被験物質を接触させたＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物等」である場合には、本発明のノックアウト非ヒト動物等の上記生理活性物質産生量を、対照におけるものと同等とする又はそれよりも低下（例えば、５％以上、１０％以上、１５％以上又は２０％以上低下）させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。また、対照が上記「被験物質を接触させない本発明のノックアウト非ヒト動物等」である場合には、本発明のノックアウト非ヒト動物等の上記生理活性物質産生量を、対照におけるものよりも低下（例えば、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、７０％以上、９０％以上又は１００％以上低下）させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。
【０１１１】
６．ＩＬ２７シグナル活性化剤のスクリーニング方法
本発明は、本発明のノックアウト若しくはノックダウン非ヒト動物の一部、又は本発明のノックアウト若しくはノックダウン細胞（以下、「本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等」という場合がある。）に、ＩＬ２７シグナル活性化剤の候補物質（被験物質）を接触することにより、ＩＬ２７シグナル活性化剤をスクリーニングすることができる。
【０１１２】
本スクリーニング方法においては、より具体的には、本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等に薬物候補物質を接触させ、前記候補物質を接触させた本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等において標的とするＩＬ２７シグナル活性化状態と相関関係を有する指標を測定し、対照と比較し、この比較結果に基づいて、ＩＬ２７シグナル活性化を亢進させるか否かを確認することで、候補物質をスクリーニングすることができる。
【０１１３】
本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等を候補物質で接触させる方法として、例えば、本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等と候補物質とを同一の反応系又は培養系に存在させる方法を用いることができる。より具体的には、本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等の培養容器に候補物質を添加すること、本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等と候補物質とを混合すること、本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等を候補物質の存在下で培養すること等が挙げられる。また、接触させる候補物質量は、投与方法、候補物質の性質などにあわせて適宜選択することができる。
【０１１４】
ＩＬ２７シグナル活性化状態と相関関係を有する指標としては、本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等がマクロファージ又はマクロファージ由来細胞である場合には、変性脂質の取り込み量、サイトカイン（例、ＩＬ６、ＩＬ１２等の炎症性サイトカイン）の産生量、マトリックスプロテアーゼ（ＭＭＰ）（例、ＭＭＰ９等）遺伝子発現量、接着分子の発現量等を挙げることができる。本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等が血管内細胞又は血管内細胞由来細胞である場合には、生存細胞数、細胞の増殖量、遊走の程度、白血球との接着量等を挙げることができる。本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等が骨髄由来細胞である場合にはサイトカイン・ケモカインの産生量等を、脂肪組織由来細胞である場合には細胞形態、分化マーカー（アディポネクチン、ＰＰＡＲγ、Ｃ／ＥＢＰαおよびａＰ２等）の発現量等を、リンパ球の場合はサイトカイン産生量を挙げることができる。
【０１１５】
ここで、上記各指標は、公知の方法又はそれに準ずる方法で行うことができる。以下に、各指標の測定方法を具体的に示すが、これらに限定されない。
変性脂質の取り込み量の測定は、Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ＪＮＫ２ ｆｏｒ ｓｃａｖｅｎｇｅｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｆｏａｍ ｃｅｌｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ａｔｈｅｒｏｇｅｎｅｓｉｓ． Ｒｉｃｃｉ Ｒ， Ｓｕｍａｒａ Ｇ， Ｓｕｍａｒａ Ｉ， Ｒｏｚｅｎｂｅｒｇ Ｉ， Ｋｕｒｒｅｒ Ｍ， Ａｋｈｍｅｄｏｖ Ａ， Ｈｅｒｓｂｅｒｇｅｒ Ｍ， Ｅｒｉｋｓｓｏｎ Ｕ， Ｅｂｅｒｌｉ ＦＲ， Ｂｅｃｈｅｒ Ｂ， Ｂｏｒｅｎ Ｊ， Ｃｈｅｎ Ｍ， Ｃｙｂｕｌｓｋｙ ＭＩ， Ｍｏｏｒｅ ＫＪ， Ｆｒｅｅｍａｎ ＭＷ， Ｗａｇｎｅｒ ＥＦ， Ｍａｔｔｅｒ ＣＭ， Ｌｕｓｃｈｅｒ ＴＦ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２００４；３０６：１５５８−１５５６１．に記載の方法又はそれに準ずる方法で行うことができる。サイトカイン・ケモカインの産生量の測定は、Ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｕｍｏｒ ｍｏｄｅｌ： ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｋｅｙｅｓ Ｋ， Ｃｏｘ Ｋ， Ｔｒｅａｄｗａｙ Ｐ， Ｍａｎｎ Ｌ， Ｓｈｉｈ Ｃ， Ｆａｕｌ ＭＭ， Ｔｅｉｃｈｅｒ ＢＡ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００２；６２：５５９７−５６０２．に記載の方法又はそれに準ずる方法で行うことができる。ＭＭＰ遺伝子発現量の測定は、Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ２ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｓ ａｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｔｏ ｂｌｏｃｋ ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ． Ｐａｖｌｏｖｉｃ Ｓ， Ｄｕ Ｂ， Ｓａｋａｍｏｔｏ Ｋ， Ｋｈａｎ ＫＭ， Ｎａｔａｒａｊａｎ Ｃ， Ｂｒｅｙｅｒ ＲＭ， Ｄａｎｎｅｎｂｅｒｇ ＡＪ， Ｆａｌｃｏｎｅ ＤＪ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２００６ Ｆｅｂ １０；２８１（６）：３３２１−３３２８．に記載の方法又はそれに準ずる方法で行うことができる。接着分子の発現量の測定は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ ａｎｄ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅａｓ ａｌｐｈａ−ｔｏｘｉｎ ｐｏｔｅｎｔｌｙ ｉｎｄｕｃｅ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｔｏ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ． Ｋｒｕｌｌ Ｍ， Ｄｏｌｄ Ｃ， Ｈｉｐｐｅｎｓｔｉｅｌ Ｓ， Ｒｏｓｓｅａｕ Ｓ， Ｌｏｈｍｅｙｅｒ Ｊ， Ｓｕｔｔｏｒｐ Ｎ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９６ ；１５７：４１３３−４１４０．に記載の方法又はそれに準ずる方法で行うことができる。生存細胞数及び細胞の増殖量の測定は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｐｉｆａｎｏｉ ａｍａｓｔｉｇｏｔｅｓ ａｖｏｉｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｂｙ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｈｅｍｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ． Ｐｈａｍ ＮＫ， Ｍｏｕｒｉｚ Ｊ， Ｋｉｍａ ＰＥ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ． ２００５；７３：８３２２−８３３３．に記載の方法又はそれに準ずる方法で行うことができる。細胞の遊走の程度の測定は、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ ｏｒ ｉｒｏｎ ｏｘｉｄｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｕｐｔａｋｅ ｂｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｆｒｏｍ ｌａｂｅｌｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ： ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｐａｗｅｌｃｚｙｋ Ｅ， Ａｒｂａｂ ＡＳ， Ｃｈａｕｄｈｒｙ Ａ， Ｂａｌａｋｕｍａｒａｎ Ａ， Ｒｏｂｅｙ ＰＧ， Ｆｒａｎｋ ＪＡ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ． ２００８；２６：１３６６−１３７５．に記載の方法又はそれに準ずる方法で行うことができる。白血球との接着量の測定は、Ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｒｅｄｕｃｅｓ ｍｏｎｏｃｙｔｅ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｔｏ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｉｎｏｕｅ Ｋ， Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｍ， Ｙａｎｏ Ｋ， Ｍｉｕｒａ Ｍ， Ｉｚｕｍｉ Ａ， Ｍａｔａｋｉ Ｃ， Ｄｏｉ Ｔ， Ｈａｍａｋｕｂｏ Ｔ， Ｒｅｉｄ ＰＣ， Ｈｕｍｅ ＤＡ， Ｙｏｓｈｉｄａ Ｍ， Ａｉｒｄ ＷＣ， Ｋｏｄａｍａ Ｔ， Ｍｉｎａｍｉ Ｔ． Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ． ２００６；２６：２６５２−２６５９．に記載の方法又はそれに準ずる方法で行うことができる。細胞形態の測定は、Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−１ ｉｎ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅｓ ｃａｕｓｅｓ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ａｎｄ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ． Ｋａｍｅｉ Ｎ， Ｔｏｂｅ Ｋ， Ｓｕｚｕｋｉ Ｒ， Ｏｈｓｕｇｉ Ｍ， Ｗａｔａｎａｂｅ Ｔ， Ｋｕｂｏｔａ Ｎ， Ｏｈｔｓｕｋａ−Ｋｏｗａｔａｒｉ Ｎ， Ｋｕｍａｇａｉ Ｋ， Ｓａｋａｍｏｔｏ Ｋ， Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｍ， Ｙａｍａｕｃｈｉ Ｔ， Ｕｅｋｉ Ｋ， Ｏｉｓｈｉ Ｙ， Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ Ｓ， Ｍａｎａｂｅ Ｉ， Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ Ｈ， Ｏｈｎｉｓｈｉ Ｙ， Ｏｇａｔａ Ｈ， Ｔｏｋｕｙａｍａ Ｋ， Ｔｓｕｎｏｄａ Ｍ， Ｉｄｅ Ｔ， Ｍｕｒａｋａｍｉ Ｋ， Ｎａｇａｉ Ｒ， Ｋａｄｏｗａｋｉ Ｔ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２００６；２８１：２６６０２−２６６１４．に記載の方法又はそれに準ずる方法で行うことができる。分化マーカーの発現量は、Ｗｈｉｔｅ ｆａｔ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｒｅｓｉｄｅ ｉｎ ｔｈｅ ａｄｉｐｏｓｅ ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ． Ｔａｎｇ Ｗ， Ｚｅｖｅ Ｄ， Ｓｕｈ ＪＭ， Ｂｏｓｎａｋｏｖｓｋｉ Ｄ， Ｋｙｂａ Ｍ， Ｈａｍｍｅｒ ＲＥ， Ｔａｌｌｑｕｉｓｔ ＭＤ， Ｇｒａｆｆ ＪＭ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２００８；３２２：５８３−５８６．に記載の方法又はそれに準ずる方法で行うことができる。
【０１１６】
比較のための対照は、被験物質を接触させない野生型非ヒト動物の一部又は野生型細胞（以下、「野生型非ヒト動物の一部等」とする。）、被験物質を接触させた野生型非ヒト動物の一部等、ＩＬ２７シグナル活性化作用を有することが分かっている物質（既知のＩＬ２７シグナル活性化剤等）を接触させた野生型非ヒト動物の一部等、被験物質を接触させないＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物の一部又はＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト細胞（以下、「ＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物の一部等」とする。）、被験物質を接触させたＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物の一部等、既知のＩＬ２７シグナル活性化剤等を接触させたＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物の一部等、被験物質を接触させない本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等、既知のＩＬ２７シグナル活性化剤等を接触させた本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等のいずれをも意味し、目的に応じて少なくとも１つの対照を適宜選択することができる。
【０１１７】
上記に「対照」として例示したＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物の一部等は、本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等と異なり、ＩＬ２７シグナルが正常である。このＩＬ２７シグナルが正常なＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物の一部等と同程度又はそれよりも亢進するように、ＩＬ２７シグナルが不活性な本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等のＩＬ２７シグナルを活性化することができる物質は、ＩＬ２７シグナルに選択的に働くＩＬ２７シグナル活性化剤となり得る。したがって、例えば、対照がＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物の一部等の場合には、候補物質を接触させた本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等における変性脂質の取り込み量、サイトカインの産生量及びマトリックスプロテアーゼ（ＭＭＰ）遺伝子発現量（以下、「変性脂質の取り込み量等」という。）を測定し、当該測定された変性脂質の取り込み量等が、対照における変性脂質の取り込み量等と同等になったとき、又はそれよりも改善したときは、前記候補物質を、ＩＬ２７シグナル活性化剤として選択することができる。ここで「改善」とは、対照と比較して、例えば、本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等における変性脂質の取り込み量が低下すること、サイトカインの産生量が低下すること、又はＭＭＰ遺伝子発現量が低下することを意味する。そして、このように選択したＩＬ２７シグナル活性化剤は、ＩＬ２７シグナルに選択的に作用するＩＬ２７シグナル活性化剤であり得る。
【０１１８】
候補物質としては、前記「動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬のスクリーニング方法」の項で説明したものと同様のものを挙げることができる。
【０１１９】
例えば、ある候補物質を投与した場合に、ＩＬ２７シグナル活性化の状態が亢進されたことが確認できる結果が得られれば、用いた候補物質を、ＩＬ２７シグナル活性化剤として選択することが可能である。より、具体的には、対照が上記「被験物質を接触させたＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物の一部等」である場合には、本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等における、マクロファージ又はマクロファージ由来細胞（以下、「マクロファージ等」とする）の変性脂質の取り込み量、マクロファージ等のサイトカイン産生量、マクロファージ等のＭＭＰ遺伝子発現量、マクロファージ等の接着分子の発現量、血管内細胞又は血管内細胞由来細胞（以下、「血管内細胞等」とする。）の生存細胞数、血管内細胞等の細胞の増殖量、血管内細胞等の遊走の程度、血管内細胞等の白血球との接着量、骨髄由来細胞のサイトカイン・ケモカインの産生量、脂肪組織由来細胞の細胞形態の程度、脂肪組織由来細胞の分化マーカーの発現量、又はリンパ球のサイトカイン産生量を、対照におけるものと同等とする又はそれよりも低下（例えば、５％以上、１０％以上、１５％以上又は２０％以上低下）させる候補物質を、ＩＬ２７シグナル活性化剤として選択する。また、対照が上記「被験物質を接触させない本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等」である場合には、本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等における、上記マクロファージ又はマクロファージ由来細胞（以下、「マクロファージ等」とする）の変性脂質の取り込み量、マクロファージ等のサイトカイン産生量、マクロファージ等のＭＭＰ遺伝子発現量、マクロファージ等の接着分子の発現量、血管内細胞又は血管内細胞由来細胞（以下、「血管内細胞等」とする。）の生存細胞数、血管内細胞等の細胞の増殖量、血管内細胞等の遊走の程度、血管内細胞等の白血球との接着量、骨髄由来細胞のサイトカイン・ケモカインの産生量、脂肪組織由来細胞の細胞形態の程度、脂肪組織由来細胞の分化マーカーの発現量、又はリンパ球のサイトカイン産生量を、対照におけるものよりも低下（例えば、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、７０％以上、９０％以上又は１００％以上低下）させる候補物質を、ＩＬ２７シグナル活性化剤として選択する。
【０１２０】
発明を実施するための最良の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【実施例】
【０１２１】
実施例１：ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子ノックアウトマウスの作製
（１）ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子ノックアウトＥＳ細胞の作製
Ｙｏｓｈｉｄａ， Ｈ．， Ｈａｍａｎｏ， Ｓ．， Ｓｅｎａｌｄｉ， Ｇ．， Ｃｏｖｅｙ， Ｔ．， Ｆａｇｇｉｏｎｉ， Ｒ．， Ｍｕ， Ｓ．， Ｘｉａ， Ｍ．， Ｗａｋｅｈａｍ， Ａ．Ｃ．， Ｎｉｓｈｉｎａ， Ｈ．， Ｐｏｔｔｅｒ， Ｊ．， Ｓａｒｉｓ， Ｃ．Ｊ．， Ｍａｋ， Ｔ．Ｗ． （２００１） ＷＳＸ−１ Ｉｓ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈ１ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｌ． ｍａｊｏｒ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １５， ５６９−７８．に記載の方法に準じて、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子ノックアウトＥＳ細胞を作製した。
すなわち、マウスＩＬ２７−ｐ２８遺伝子の第１〜第４エクソンをｐｇｋプロモーター配列に接続されたネオマイシン耐性遺伝子で置換できる構造を持つターゲティングベクターを作成し、このターゲティングベクターをエレクトロポレーション法により、ＥＳ細胞であるＥ１４細胞に導入した。遺伝子導入細胞の選別のため、ネオマイシン存在下で培養することにより耐性を獲得した細胞クローンを得た後、ＰＣＲ法により、正しく相同組み換えが生じＩＬ２７−ｐ２８遺伝子第１〜第４エクソンがネオマイシン耐性遺伝子で置換された細胞クローンを選別し、さらに、サザンブロット法により相同組み換えの確認を行った。
【０１２２】
（２）ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子欠損キメラマウスの作製
ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子欠損キメラマウスを次のように作製した。すなわち、実施例１（１）により得られたＩＬ２７−ｐ２８遺伝子の片側アリール（片側遺伝子）が破壊されたＥＳ細胞をＣ５７ＢＬ６マウス由来の杯盤胞に注入、これを偽妊娠マウスに移植することにより、ＥＳ細胞及びＣ５７ＢＬ６マウス由来の細胞からなるキメラマウスを得た。毛色及びサザンブロット法によりＩＬ２７−ｐ２８遺伝子に変異を持つＥＳ細胞の寄与が多いと推測される雄個体を選別した。
【０１２３】
（３）ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子ヘテロノックアウトマウスの作製
ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子ヘテロノックアウトマウスを次のように作製した。すなわち、実施例１（２）により得られたキメラマウスをＣ５７ＢＬ６雌マウスと交配することにより仔を得て、毛色によりＩＬ２７−ｐ２８遺伝子に変異を持つＥＳ細胞由来の仔を選別した。さらにこれらの仔の体組織からゲノムＤＮＡを抽出しＰＣＲ法及びサザンブロット法によりＩＬ２７−ｐ２８遺伝子の片側アリルに変異を持つマウスを選別しヘテロノックアウトマウスを得た。
【０１２４】
（４）ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子ホモノックアウトマウスの作製
ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子ホモノックアウトマウスを次のように作製した。すなわち、実施例１（３）により得られたヘテロノックアウトマウスを野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスと交配し、その仔からヘテロノックアウトマウスを選別、この過程を６回繰り返し、Ｃ５７ＢＬ／６の遺伝子背景を持つＩＬ２７−ｐ２８遺伝子ヘテロノックアウトマウスを作成した。この雄雌を交配することにより仔を得て、これらの仔の体組織からゲノムＤＮＡを抽出しＰＣＲ法及びサザンブロット法によりＩＬ２７−ｐ２８遺伝子の両側アリルに変異を持つマウスを選別しホモノックアウトマウスを得た。
【０１２５】
実施例２：ＬＤＬＲ／ＥＢＩ−３遺伝子ダブルノックアウトマウスの作出
本ダブルノックアウトマウスの作出にあたり、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）遺伝子欠損雄ホモ接合体マウスは、ジャクソンラボラトリー社より入手した（カタログ番号００７０６８などに記載）。また、ＥＢＩ−３遺伝子欠損雌ホモ接合体マウスは、本発明者らの研究室で以前作製したものを用いた（Ｉｇａｗａ， Ｔ．， Ｎａｋａｓｈｉｍａ， Ｈ．， Ｓａｄａｎａｇａ， Ａ．， Ｍａｓｕｔａｎｉ， Ｋ．， Ｍｉｙａｋｅ， Ｋ．， Ｓｈｉｍｉｚｕ， Ｓ．， Ｔａｋｅｄａ， Ａ．， Ｈａｍａｎｏ， Ｓ．， Ｙｏｓｈｉｄａ， Ｈ． （２００９） Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ＥＢＶ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｇｅｎｅ ３ （ＥＢＩ３） ｉｎ ＭＲＬ／ｌｐｒ ｍｉｃｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ ｓｉａｌａｄｅｎｉｔｉｓ． Ｍｏｄ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ １９， ３３−４１．）。
【０１２６】
これらＬＤＬＲ遺伝子欠損雄ホモ接合体マウス（ＬＤＬＲ−／−）とＥＢＩ−３遺伝子欠損雌ホモ接合体マウス（ＥＢＩ−３−／−）のかけ合わせで、Ｆ１ヘテロ接合体欠損マウス（ＬＤＬＲ＋／−／ＥＢＩ−３＋／−）を作出した。次にこのＦ１ヘテロ欠損マウスどうしのかけ合わせを行い、得られたＦ２マウスのＰＣＲ判定において、ＬＤＬＲ／ＥＢＩ−３遺伝子ダブルノックアウトマウス（ＬＤＬＲ−／−／ＥＢＩ−３−／−）を選抜した。以後は、このダブルノックアウトマウスの各個体どうしのかけ合わせで、ＬＤＬＲ／ＥＢＩ−３遺伝子ダブルノックアウトマウスの生産を行った。
【０１２７】
実施例３：ＬＤＬＲ／ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子ダブルノックアウトマウスの作出
本ダブルノックアウトマウスの作出にあたり、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）遺伝子欠損雄ホモ接合体マウスは、ジャクソンラボラトリー社より入手した（カタログ番号００７０６８などに記載）。また、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子欠損雌ホモ接合体マウスは、実施例１に記載の方法により作製したものを利用した。
【０１２８】
ＬＤＬＲ遺伝子欠損雄ホモ接合体マウス（ＬＤＬＲ−／−）とＩＬ２７−ｐ２８遺伝子欠損雌ホモ接合体マウス（ＩＬ２７−ｐ２８−／−）のかけ合わせで、Ｆ１ヘテロ接合体欠損マウス（ＬＤＬＲ＋／−／ＩＬ２７−ｐ２８＋／−）を作出した。次にこのＦ１ヘテロ欠損マウスどうしのかけ合わせを行い、得られたＦ２マウスのＰＣＲ判定において、ＬＤＬＲ／ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子ダブルノックアウトマウス（ＬＤＬＲ−／−／ＩＬ２７−ｐ２８−／−）を選抜した。以後は、このダブルノックアウトマウスの各個体どうしのかけ合わせで、ＬＤＬＲ／ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子ダブルノックアウトマウスの生産を行った。
【０１２９】
実施例４：ＬＤＬＲ／ＷＳＸ−１遺伝子ダブルノックアウトマウスの作出
本ダブルノックアウトマウスの作出にあたり、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）遺伝子欠損雄ホモ接合体マウスは、ジャクソンラボラトリー社より入手した（カタログ番号００７０６８などに記載）。また、ＷＳＸ−１遺伝子欠損雌ホモ接合体マウスは、アムジェン社より分与された（Ｙｏｓｈｉｄａ， Ｈ．， Ｈａｍａｎｏ， Ｓ．， Ｓｅｎａｌｄｉ， Ｇ．， Ｃｏｖｅｙ， Ｔ．， Ｆａｇｇｉｏｎｉ， Ｒ．， Ｍｕ， Ｓ．， Ｘｉａ， Ｍ．， Ｗａｋｅｈａｍ， Ａ．Ｃ．， Ｎｉｓｈｉｎａ， Ｈ．， Ｐｏｔｔｅｒ， Ｊ．， Ｓａｒｉｓ， Ｃ．Ｊ．， Ｍａｋ， Ｔ．Ｗ． （２００１） ＷＳＸ−１ Ｉｓ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈ１ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｌ． ｍａｊｏｒ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １５， ５６９−７８．）。
【０１３０】
ＬＤＬＲ遺伝子欠損雄ホモ接合体マウス（ＬＤＬＲ−／−）とＷＳＸ−１遺伝子欠損雌ホモ接合体マウス（ＷＳＸ−１−／−）のかけ合わせで、Ｆ１ヘテロ接合体欠損マウス（ＬＤＬＲ＋／−／ＷＳＸ−１＋／−）を作出した。次にこのＦ１ヘテロ欠損マウスどうしのかけ合わせを行い、得られたＦ２マウスのＰＣＲ判定において、ＬＤＬＲ／ＷＳＸ−１遺伝子ダブルノックアウトマウス（ＬＤＬＲ−／−／ＷＳＸ−１−／−）を選抜した。以後は、このダブルノックアウトマウスの各個体どうしのかけ合わせで、ＬＤＬＲ／ＷＳＸ−１遺伝子ダブルノックアウトマウスの生産を行った。
【０１３１】
実施例５：動脈硬化病変の形成の定量・比較
実施例２及び４に記載の方法で作出した各ダブルノックアウトマウスに高脂肪食を負荷した後、動脈硬化性病変の形成を、病理組織学的かつ定量的に比較検討した。具体的には、ＬＤＬＲノックアウトマウス（ジャクソンラボラトリー社）及び各ダブルノックアウトマウス（各１０匹）について、８週齢から１６週間高コレステロール食を投与した後に大動脈を摘出した。ここで、高コレステロール食として、１５．８％ 脂肪・１．２５％ コレステロール含有高コレステロール食（ハーラン社）を用い、８週齢から２４週齢まで投与した。また、大動脈の摘出は、常法に従い、起始部から腸骨動脈分岐部まで大動脈を、約５ｃｍの長さで切り出すことにより行った。そして、摘出した大動脈の内膜側を上に展開し、オイルレッドＯで染色した。ＣＣＤカメラ（Ｚｅｉｓｓ社）で撮像後、オイルレッドＯで染色される動脈硬化巣の面積の総和と、大動脈の内膜側総面積を定量した。動脈硬化巣の面積の総和を大動脈の内膜側面積で除し、動脈硬化巣の大動脈の内膜に占める割合を算出した。
【０１３２】
その結果を、図１及び図２に示す。
図１は、高コレステロール食を１２週間（ａ）１６週間（ｂ）投与した各群マウスの大動脈内膜側の代表例を示す写真である。図１では、ＬＤＬＲ−／−に比して、ＬＤＬＲ−／−ＥＢＩ３−／−及びＬＤＬＲ−／−ＷＳＸ−１−／−の大動脈内側はオレンジ色に染色された範囲が広い。このことは、ＬＤＬＲ−／−に比してＬＤＬＲ−／−ＥＢＩ３−／−及びＬＤＬＲ−／−ＷＳＸ−１−／−において動脈硬化病変の形成量が増加する傾向にあることを示す。
【０１３３】
図２は、動脈硬化巣の大動脈に占める割合を定量評価したものである。図２に示されているように、ＬＤＬＲ／ＥＢＩ−３遺伝子ダブルノックアウトマウス及びＬＤＬＲ／ＷＳＸ−１遺伝子ダブルノックアウトマウスにおいて、ＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトマウスと比較して動脈硬化病変の形成が有意に増加していることが分かった。
【０１３４】
実施例６：大動脈瘤の発生頻度の比較
ＬＤＬＲノックアウトマウス及び、実施例２〜４に記載の方法で作出した各ダブルノックアウトマウスに高脂肪食投与下、浸透圧ポンプによるアンジオテンシンＩＩ投与で誘発される大動脈瘤の発生頻度を、測定した。具体的には、実施例５と同様に８週齢から１６週間高コレステロール食を投与した後に、高コレステロール食投与下に浸透圧ポンプでアンジオテンシンＩＩあるいは対照溶媒を４週間投与した。ここで、１５．８％ 脂肪・１．２５％ コレステロール含有高コレステロール食（ハーラン社）を用い、８週齢から２４週齢まで投与した。また、アンジオテンシンＩＩ（シグマ社）は、浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｔ社）を用い、２０週齢から２４週齢まで投与した。そして、大動脈を摘出し、肉眼的に大動脈の瘤状拡張を腎動脈分岐部に認めるものを大動脈瘤と認定した。そして、各群マウス１０頭中大動脈瘤を形成した頭数を算出して、各群マウスの大動脈瘤の発生頻度とした。
【０１３５】
その結果を以下の表１に示す。
【０１３６】
【表１】
【０１３７】
表１に示されているように、ＬＤＬＲ／ＥＢＩ−３遺伝子ダブルノックアウトマウス、及びＬＤＬＲ／ＷＳＸ−１遺伝子ダブルノックアウトマウスにおいて、ＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトマウスと比較して大動脈瘤の発生頻度が高い傾向になることが分かった。
【０１３８】
実施例７：培養マクロファージ活性化評価
（１）腹腔内マクロファージの培養
実施例２及び４に記載の方法で作出した各ダブルノックアウトマウスから、腹腔内マクロファージを得て、培養した。具体的には、ＬＤＬＲノックアウトマウス（ジャクソンラボラトリー社）及び各ダブルノックアウトマウス（各１０匹）について、１００ｍｇのペプトン（インビトロゲン社製）を腹腔内に投与した。へプトン投与から２日後に各マウスについて脱血し、腹腔内をＰＢＳ（シグマ社製）で洗浄し、注射器で吸引することにより腹腔内マクロファージを採取した。腹腔内からの採取物を遠心分離器にかけ、採取物からマクロファージを回収した後、その細胞を培養皿内で３７℃、５％ＣＯ２存在下にて培養した。この時の培地の組成は、次の通りである。ＤＭＥＭ培地に最終濃度１０％となるよう牛胎児血清を加えた。
【０１３９】
（２）アセチルＬＤＬの取り込みの評価
上記実施例７（１）にて得たＬＤＬＲノックアウトマウス及び各ダブルノックアウトマウス由来のマクロファージについて、蛍光ラベルした変性脂質（アセチルＬＤＬ）の取り込みを、コンフォーカル顕微鏡画像を用いて定量化した。具体的には、各マウスの腹腔内マクロファージを前記培養条件にて培養皿で１６時間培養した。その後、ＤｉＩでラベルしたアセチルＬＤＬ（バイオメデイカルテクノロジー社製）を培養皿に添加し、４時間後にＴＯＰＲＯ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にて核染色を行った。その後、ホルマリンにより細胞を固定し、固定した細胞をコンフォーカル顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ社製）で観察・撮像した。一定視野内の細胞に取り込まれたＤｉＩ蛍光強度を、ＮＩＨイメージ（米国ＮＩＨが配布している無料ソフト）により定量した。
【０１４０】
その結果を図３及び図４に示す。
図３は、各群マウスの腹腔内マクロファージによるＤｉＩラベルアセチルＬＤＬの取り込みの様子を示すコンフォーカル顕微鏡像（代表例）である。図３では、ＬＤＬＲ−／−に比して、ＬＤＬＲ−／−ＥＢＩ３−／−及びＬＤＬＲ−／−ＷＳＸ−１−／−の腹腔内マクロファージはＤｉＩ（赤色）で強く染色されている。このことは、ＬＤＬＲ−／−に比してＬＤＬＲ−／−ＥＢＩ３−／−及びＬＤＬＲ−／−ＷＳＸ−１−／−の腹腔内マクロファージに取り込まれたアセチルＬＤＬの量が多い傾向にあることを示す。
【０１４１】
図４は、腹腔内マクロファージに取り込まれたアセチルＬＤＬの量を定量評価したものである。図４に示されているように、ダブルノックアウトマウス由来マクロファージによるアセチルＬＤＬの取り込みは、ＬＤＬＲノックアウトマウス由来の腹腔内マクロファージと比較して、有意に増加した。
【０１４２】
次に、ＬＤＬＲ／ＥＢＩ−３遺伝子ダブルノックアウトマウス由来マクロファージ及びＬＤＬ／ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子ダブルノックアウトマウス由来マクロファージについて、リコンビナントＩＬ２７を投与した場合のアセチルＬＤＬの取り込み量を評価する。具体的には、各マウスの腹腔マクロファージを前記培養条件にて培養皿中で１６時間培養する。その後、培地中にＤｉＩラベルしたアセチルＬＤＬを添加し４時間培養し、培地を除去した後にホルマリンで細胞を固定し、コンフォーカル顕微鏡で細胞像を取得し、細胞内に取り込まれたＤｉＩ色素量をＮＩＨイメージ（米国ＮＩＨが配布している無料ソフト）により定量する。
ここで、リコンビナントＩＬ２７は、Ｐｆｌａｎｚ， Ｓ．， Ｊ． Ｃ． Ｔｉｍａｎｓ， Ｊ． Ｃｈｅｕｎｇ， Ｒ． Ｒｏｓａｌｅｓ， Ｈ． Ｋａｎｚｌｅｒ， Ｊ． Ｇｉｌｂｅｒｔ， Ｌ． Ｈｉｂｂｅｒｔ， Ｔ． Ｃｈｕｒａｋｏｖａ， Ｍ． Ｔｒａｖｉｓ， Ｅ． Ｖａｉｓｂｅｒｇ， Ｗ． Ｍ． Ｂｌｕｍｅｎｓｃｈｅｉｎ， Ｊ． Ｄ． Ｍａｔｔｓｏｎ， Ｊ． Ｌ． Ｗａｇｎｅｒ， Ｗ． Ｔｏ， Ｓ． Ｚｕｒａｗｓｋｉ， Ｔ． Ｋ． ＭｃＣｌａｎａｈａｎ， Ｄ． Ｍ． Ｇｏｒｍａｎ， Ｊ． Ｆ． Ｂａｚａｎ， Ｒ． ｄｅ Ｗａａｌ Ｍａｌｅｆｙｔ， Ｄ． Ｒｅｎｎｉｃｋ， ａｎｄ Ｒ． Ａ． Ｋａｓｔｅｌｅｉｎ． ２００２． ＩＬ−２７， ａ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ ＥＢＩ３ ａｎｄ ｐ２８ ｐｒｏｔｅｉｎ， ｉｎｄｕｃｅｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｉｖｅ ＣＤ４（＋） Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １６：７７９−７９０．に記載の方法に従って作製する。具体的には、CHO細胞においてFLAGタグ付マウスＩＬ２７発現ベクターを発現させ、培養上清中に分泌されたリコンビナントマウスＩＬ２７を、抗FLAGタグ抗体付ビーズ（シグマ社製）を用いてカラム法で精製する。そして、このリコンビナントＩＬ２７を、次のようにして投与する。すなわち、前記のように培地中にＤｉＩラベルしたアセチルＬＤＬを添加し４時間培養する際に、培地に同時にリコンビナントＩＬ２７を５０ ｎｇ／ｍｌの濃度で、またはリコンビナントＩＬ２７の対照溶媒である純水をリコンビナントＩＬ２７と同容量で同時添加する。
【０１４３】
その結果、ＬＤＬＲ／ＥＢＩ−３遺伝子ダブルノックアウトマウス由来マクロファージ及びＬＤＬＲ／ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子ダブルノックアウトマウス由来マクロファージによるアセチルＬＤＬの取り込みは、リコンビナントＩＬ２７を投与することにより抑制される。
【０１４４】
（３） 炎症性サイトカイン産生量の評価
上記実施例７（１）にて得たＬＤＬＲノックアウトマウス及び各ダブルノックアウトマウス由来のマクロファージについて、炎症性サイトカイン（ＩＬ６、ＩＬ１２等）の産生量を、ルミネックスマイクロビーズ法により評価した。具体的には、各マウスの腹腔マクロファージを前記培養条件にて培養皿中で２時間培養した。その後、リポポリッサカライドあるいは対照溶媒存在下、通常培地においてマクロファージを培養し、１６時間後に培養上清を回収した。ここで、リポポリサッカライド（シグマ社）は、１０ ｎｇ／ｍｌの濃度で培地中に添加した。また、対照溶媒は純水である。その後、回収した培養上清中のＩＬ１β、ＩＬ６、ＩＬ１２及びＩＬ１０の量をバイオソース社製マウス１０プレックスキットで測定した。
【０１４５】
その結果を図５に示す。図５に示したように、ダブルノックアウトマウス由来マクロファージによる炎症性サイトカイン（ＩＬ１β、ＩＬ６及びＩＬ１２）の産生量は、ＬＤＬＲノックアウトマウス由来の腹腔内マクロファージと比較して、増加した。一方、ダブルノックアウトマウス由来マクロファージによる抗炎症性サイトカイン（ＩＬ１０）の産生量は、ＬＤＬＲノックアウトマウス由来の腹腔内マクロファージと比較して、減少した。
【０１４６】
次に、ＬＤＬＲ／ＥＢＩ−３遺伝子ダブルノックアウトマウス由来マクロファージ及びＬＤＬ／ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子ダブルノックアウトマウス由来マクロファージについて、リコンビナントＩＬ２７を投与した場合の炎症性サイトカイン（ＩＬ６、ＩＬ１２等）の産生量を評価する。具体的には、各マウスの腹腔マクロファージを前記培養条件にて培養皿中で２時間培養する。その後、リポポリッサカライドあるいは対照溶媒存在下、通常培地においてマクロファージを培養し、１６時間後に培養上清を回収する。ここで、リポポリサッカライド（シグマ社）は、１０ ｎｇ／ｍｌの濃度で培地中に添加する。一方、対照溶媒として純水をリポポリサッカライドと同容量添加する。また同時にリコンビナントＩＬ２７を５０ ｎｇ／ｍｌの濃度で、またはリコンビナントＩＬ２７の対照溶媒である純水リコンビナントＩＬ２７と同容量を同時添加する。その後、回収した培養上清中のＩＬ１β、ＩＬ６、ＩＬ１２及びＩＬ１０の量をバイオソース社製マウス１０プレックスキットで測定する。
【０１４７】
その結果、ＬＤＬＲ／ＥＢＩ−３遺伝子ダブルノックアウトマウス由来マクロファージ及びＬＤＬＲ／ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子ダブルノックアウトマウス由来マクロファージによる炎症性サイトカインの産生量は、リコンビナントＩＬ２７を投与することにより抑制される。
【０１４８】
（４）マトリックスメタロプロテアーゼの遺伝子発現量の評価
上記実施例７（１）にて得たＬＤＬＲノックアウトマウス及び各ダブルノックアウトマウス由来のマクロファージについて、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ９等）の遺伝子発現量を評価する。具体的には、各マウスの腹腔内マクロファージを前記培養条件にて培養皿中で２時間培養した。その後、リポポリッサカライド存在下又は非存在下、通常培地で培養する。１６時間後に細胞からＲＮＡを抽出しｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ法にてＭＭＰ９等の遺伝子発現を定量する。
【０１４９】
その結果、ダブルノックアウトマウス由来マクロファージにおけるマトリックスメタロプロテアーゼ遺伝子発現量は、ＬＤＬＲノックアウトマウス由来の腹腔内マクロファージと比較して、増加すると考えられる。また、ＬＤＬＲ／ＥＢＩ−３遺伝子ダブルノックアウトマウス由来マクロファージ及びＬＤＬＲ／ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子ダブルノックアウトマウス由来マクロファージにおけるマトリックスメタロプロテアーゼ遺伝子発現量は、リコンビナントＩＬ２７を投与することにより抑制されると考えられる。
【０１５０】
実施例５および６に示したように、ＬＤＬＲ−／−ＥＢＩ３−／−及びＬＤＬＲ−／−ＷＳＸ−１−／−等の本発明のノックアウト非ヒト動物では、ＬＤＬＲ−／−に比して、動脈硬化病変の形成量及び大動脈瘤の発生頻度等を含む動脈硬化又は動脈硬化性疾患の状態がさらに悪化している。このため、本発明のノックアウト非ヒト動物等の動脈硬化又は動脈硬化性疾患の状態を指標として、候補物質の中から、動脈硬化又は動脈硬化性疾患の治療薬をスクリーニングすることができることが分かる。
また、実施例７に示したように、ＬＤＬＲ−／−ＥＢＩ３−／−及びＬＤＬＲ−／−ＷＳＸ−１−／−等の本発明のノックアウト非ヒト動物では、ＬＤＬＲ−／−に比して、アセチルＬＤＬの取り込みの増加及び炎症性サイトカイン産生量の増加等が見られた。これは、本発明のノックアウト非ヒト動物ではＩＬ２７の活性が抑制されていることを意味する。このため、これらのＩＬ２７の活性状態を指標として、候補物質の中から、ＩＬ２７シグナルの活性化剤をスクリーニングすることができることがわかる。また、ＩＬ２７シグナルの活性化剤は、動脈硬化又は動脈硬化性疾患の治療薬と成り得るので、ＩＬ２７の活性状態を指標として、候補物質の中から、動脈硬化又は動脈硬化性疾患の治療薬もスクリーニングすることもできることが分かる。
【配列表フリーテキスト】
【０１５１】
［配列番号：１］マウスＥＢＩ３遺伝子のＤＮＡ配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＭ＿０１５７６６）。
［配列番号：２］マウスＥＢＩ３のアミノ酸配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＰ＿０５６５８１）。
［配列番号：３］ラットＥＢＩ３遺伝子のＤＮＡ配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＭ＿００１１０９４２１）。
［配列番号：４］ラットＥＢＩ３のアミノ酸配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＰ＿００１１０２８９１）。
［配列番号：５］マウスＩＬ２７−ｐ２８遺伝子のＤＮＡ配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＭ＿１４５６３６）。
［配列番号：６］マウスＩＬ２７−ｐ２８のアミノ酸配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＰ＿６６３６１１）。［配列番号：７］マウスＷＳＸ−１遺伝子のＤＮＡ配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＭ＿０１６６７１）。
［配列番号：８］マウスＷＳＸ−１のアミノ酸配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＰ＿０５７８８０）。［配列番号：９］ヒトＬＤＬＲ遺伝子のＤＮＡ配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＭ＿０００５２７）。
［配列番号：１０］ヒトＬＤＬＲのアミノ酸配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＰ＿０００５１８）。
［配列番号：１１］ヒトＥＢＩ３遺伝子のＤＮＡ配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＭ＿００５７５５）。
［配列番号：１２］ヒトＥＢＩ３のアミノ酸配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＰ＿００５７４６）。
［配列番号：１３］ヒトＩＬ２７−ｐ２８遺伝子のＤＮＡ配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＭ＿１４５６５９）。
［配列番号：１４］ヒトＩＬ２７−ｐ２８のアミノ酸配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＰ＿６６３６３４）。
［配列番号：１５］ヒトＷＳＸ−１遺伝子のＤＮＡ配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＭ＿００４８４３）。
［配列番号：１６］ヒトＷＳＸ−１のアミノ酸配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＰ＿００４８３４）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ノックアウト非ヒト動物、その疾患モデル動物として使用、それを用いた治療薬のスクリーニング方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
動脈硬化は、動脈壁の肥厚、動脈壁の弾性の低下等を示す動脈病変の総称である。動脈硬化が進行すると、血管内腔が極度に狭窄し、或いは閉塞することによって、臓器や組織に循環障害が生じる。このような動脈硬化は、病理学的に、アテローム性動脈硬化、メンケベルグ動脈硬化、及び細動脈硬化の３つに分類することができる。
【０００３】
アテローム性動脈硬化は、大型又は中型動脈に生じる硬化病変であり、肥厚した血管内膜層へのコレステロールエステルを主とする脂質の蓄積などが見られる。このアテローム性動脈硬化は次のように生じると考えられている。すなわち、先ず、血液中の単球が血管内膜へ接着する。内膜に接着した単球がマクロファージへと分化する。このマクロファージが、スカベンジャー受容体を介して、酸化低密度リポタンパク質（酸化ＬＤＬ）などの変性ＬＤＬを多量に取り込み、泡沫細胞となる。この泡沫細胞が血管内膜に蓄積される。血管内膜に蓄積された泡沫細胞は、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ−９等）や、炎症性サイトカイン（インターロイキン６（ＩＬ６）、ＩＬ１２等）を分泌する。また、中膜平滑筋細胞が内膜へ遊走し、内膜で増殖する。そして、これら血管内膜での泡沫細胞の蓄積と血管内膜での中膜平滑筋細胞の増殖が、アテローム性動脈硬化を生じさせる。
【０００４】
上記のようにＬＤＬは、動脈硬化の発生に重要な役割を果たす。ＬＤＬは、ほとんどがコレステロールから構成されるリポタンパク質である。ＬＤＬは、通常は、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）を介して細胞に取り込まれる。そして、ＬＤＬのコレステロールは、胆汁酸や、ステロイドホルモン、細胞膜成分などとして利用される。ところが、血漿ＬＤＬの量が過剰になると、ＬＤＬは、動脈壁内へ透過し、変性（酸化など）する。変性したＬＤＬはＬＤＬＲへの親和性を失う。その場合、変性ＬＤＬは、スカベンジャー受容体を介してマクロファージに取り込まれるようになる。マクロファージは、変性ＬＤＬを過剰に取り込んで、泡沫細胞となり、上記のように動脈硬化を引き起こす。
【０００５】
ところで、インターロイキン２７（ＩＬ２７）は、ＩＬ２７−ｐ２８とＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ（ＥＢＶ）−ｉｎｄｕｃｅｄ ｇｅｎｅ ３（ＥＢＩ３）の２つの異なるサブユニットを含むサイトカインである。一方、ＩＬ２７受容体（ＩＬ２７Ｒ）は、ＷＳＸ−１とｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ １３０とのヘテロダイマーで構成される。ＩＬ２７は、例えば、単球、マクロファージ及び樹状細胞のような抗原提示細胞で発現する。抗原提示細胞で発現したＩＬ２７は、ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞の増殖を促す。また、ＩＬ２７は、ＩＬ１２と共にＣＤ４＋ナイーブＴ細胞に作用し、ＴＨ１型サイトカインであるインターフェロン−γ（ＩＦＮγ）の産生を促す。さらに、ＩＬ２７は、ＴＨ１型免疫応答に特異的な転写因子であるＴ−ｂｅｔをアップレギュレートさせ、これにより、ＴＨ２型免疫応答に特異的な転写因子であるＧＡＴＡ−３をダウンレギュレートさせる。ＩＬ２７は、免疫細胞の増殖に必要なＩＬ２の産生を抑制し、また炎症が関わる疾患の病態形成に重要な役割を果たすＴＨ１７型細胞の分化を抑制する。また、ＩＬ２７は、様々な炎症性サイトカインの産生を抑制する作用を有している。したがって、ＩＬ２７は、様々な免疫・炎症反応を抑制する作用を有する。
【０００６】
ここで、特許文献１：特表２００７−５２３１６９号公報には、ＩＬ２７Ｒノックアウトマウスは、ＴＨ１型免疫応答が失われており、例えば、（ａ）ＩＦＮγの産生量が減少する、（ｂ）Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、及びＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａのような細胞内病原体に対して過敏になる、（ｃ）ＴＨ１型Ｔ細胞依存性抗体（ＩｇＧ２ａサブタイプ）の産生量が少なくなる、（ｄ）Ｂａｃｉｌｌｕｓに応答して異常な肉芽腫を形成する、などの症状が見られることが記載されている。さらに、ＩＬ２７Ｒに対するアンタゴニストを投与することにより、皮膚の炎症状態、関節炎、クローン病、気道過敏性、気道の炎症、アテローム性動脈硬化症などが改善できることも記載されている。
【０００７】
特許文献２：特表２００７−５２５４１５号公報には、ＩＬ２７Ｒに対するリガンドを使用することにより、免疫疾患又はヘルパーＴ細胞媒介性疾患を治療できることが記載されている。また、免疫疾患又はヘルパーＴ細胞媒介性疾患の一つとして、アテローム性動脈硬化症が挙げられている。
【０００８】
特許文献３：特開２００８−２２８７２６号公報には、ＬＤＬＲ欠損マウスに高脂肪食を摂取させることによりアテローム性動脈硬化症の発生を促すことが記載されている。
【０００９】
非特許文献１：Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １５， ５６９−７８には、ＩＬ−２７の作用が失われたマウスにおいて、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ感染後のＴｈ１型免疫反応の低下が記載されている。
【００１０】
非特許文献２：Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １９， ６５７−６６７には、ＩＬ２７の作用が失われたマウスにおいて、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ感染後に炎症性サイトカインの過剰生産が生じることが記載されており、非特許文献３：Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７７， ５３７７−８５には、ＩＬ２７がリンパ球に作用して、様々なサイトカインの産生を抑制することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特表２００７−５２３１６９号公報
【特許文献２】特表２００７−５２５４１５号公報
【特許文献３】特開２００８−２２８７２６号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｙｏｓｈｉｄａ， Ｈ．， Ｈａｍａｎｏ， Ｓ．， Ｓｅｎａｌｄｉ， Ｇ．， Ｃｏｖｅｙ， Ｔ．， Ｆａｇｇｉｏｎｉ， Ｒ．， Ｍｕ， Ｓ．， Ｘｉａ， Ｍ．， Ｗａｋｅｈａｍ， Ａ．Ｃ．， Ｎｉｓｈｉｎａ， Ｈ．， Ｐｏｔｔｅｒ， Ｊ．， Ｓａｒｉｓ， Ｃ．Ｊ．， Ｍａｋ， Ｔ．Ｗ． （２００１） ＷＳＸ−１ Ｉｓ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈ１ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｌ． ｍａｊｏｒ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １５， ５６９−７８．
【非特許文献２】Ｈａｍａｎｏ， Ｓ．， Ｈｉｍｅｎｏ， Ｋ．， Ｍｉｙａｚａｋｉ， Ｙ．， Ｉｓｈｉｉ， Ｋ．， Ｙａｍａｎａｋａ， Ａ．， Ｔａｋｅｄａ， Ａ．， Ｚｈａｎｇ， Ｍ．， Ｈｉｓａｅｄａ， Ｈ．， Ｍａｋ， Ｔ．Ｗ．， Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ， Ａ．， Ｙｏｓｈｉｄａ， Ｈ． （２００３） ＷＳＸ−１ Ｉｓ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １９， ６５７−６６７．
【非特許文献３】Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ， Ｔ．， Ｔａｋｅｄａ， Ａ．， Ｈａｍａｎｏ， Ｓ．， Ｍｉｙａｚａｋｉ， Ｙ．， Ｋｉｎｊｙｏ， Ｉ．， Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ， Ｔ．， Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ， Ａ．， Ｙｏｓｈｉｄａ， Ｈ． （２００６） Ｔｗｏ−Ｓｉｄｅｄ Ｒｏｌｅｓ ｏｆ ＩＬ−２７： Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈ１ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｎ Ｎａｉｖｅ ＣＤ４＋ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｖｅｒｓｕｓ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ＩＬ−２３−Ｉｎｄｕｃｅｄ ＩＬ−１７ ｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＣＤ４＋ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｐａｒｔｉａｌｌｙ Ｔｈｒｏｕｇｈ ＳＴＡＴ３−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７７， ５３７７−８５．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上記状況において、ヒト動脈硬化症の病態により類似し、なおかつ動脈硬化治療薬のスクリーニングに用いることができるノックアウト非ヒト動物などが求められていた。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）遺伝子の全部又は一部、並びにＩＬ２７又はＩＬ２７受容体の遺伝子の全部又は一部の機能が失われた、ノックアウト非ヒト動物が、動脈硬化治療薬のスクリーニングに有用であることなどを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち、本発明は、以下に示す、ノックアウト非ヒト動物、ノックダウン非ヒト動物、それらを用いた動脈硬化治療薬のスクリーニング方法などを提供する。
（１） ＬＤＬＲ遺伝子の全部又は一部、並びにＥＢＩ３遺伝子、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子及びＷＳＸ−１遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の全部又は一部の機能が失われた、ノックアウト非ヒト動物又はその一部。
（２） ＬＤＬＲ遺伝子、並びにＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子の発現量が、野生型と比較して低下している、ノックダウン非ヒト動物又はその一部。
（３） 上記（１）若しくは（２）記載の動物又はその一部からなる、動脈硬化若しくは動脈硬化性疾患モデル動物又はその一部。
（４） ＬＤＬＲ遺伝子の全部又は一部、並びにＥＢＩ３遺伝子、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子及びＷＳＸ−１遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の全部又は一部の機能が失われた、ノックアウト細胞。
（５） ＬＤＬＲ遺伝子、並びにＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子の発現量が、野生型と比較して低下している、ノックダウン細胞。
（６） 動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬のスクリーニング方法であって、
（ａ）上記（１）〜（３）のいずれか１項記載の動物若しくはその一部又は上記（４）若しくは（５）記載の細胞に被検物質を接触させ、
（ｂ）被検物質を接触させた動物若しくはその一部又は細胞における動脈硬化又は動脈硬化性疾患の状態と、対照の動脈硬化又は動脈硬化性疾患の状態とを比較し、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づき、被検物質の動脈硬化改善効果又は動脈硬化性疾患改善効果を評価し、
（ｄ）動脈硬化改善効果又は動脈硬化性疾患改善効果を有すると評価された被検物質を選択する
ことを含む、前記方法。
（７） 対照が、被検物質を接触させない、ＬＤＬＲ遺伝子の全部又は一部の機能が失われているが、ＥＢＩ３遺伝子、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子及びＷＳＸ−１遺伝子の機能が失われていないノックアウト非ヒト動物若しくはその一部又はノックアウト細胞である、上記（６）記載の方法。
（８） ＩＬ２７シグナル活性化剤のスクリーニング方法であって、
（ａ）上記（１）〜（３）のいずれか１項記載の動物の一部又は上記（４）若しくは（５）記載の細胞に被検物質を接触させ、
（ｂ）被検物質を接触させた動物の一部又は細胞におけるＩＬ２７シグナルの活性化の状態と、対照のＩＬ２７シグナルの活性化の状態とを比較し、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づき、被検物質のＩＬ２７シグナル活性化亢進作用を評価し、
（ｄ）ＩＬ２７シグナル活性化亢進作用を有すると評価された被検物質を選択する
ことを含む、前記方法。
（９） 対照が、被検物質を接触させない、ＬＤＬＲ遺伝子の全部又は一部の機能が失われているが、ＥＢＩ３遺伝子、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子及びＷＳＸ−１遺伝子の機能が失われていないノックアウト非ヒト動物の一部又はノックアウト細胞である、上記（８）記載の方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は、ＬＤＬＲ遺伝子の全部又は一部、並びにＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒの遺伝子の全部又は一部の機能が失われたノックアウト非ヒト動物を提供する。該動物は、野生型非ヒト動物や、ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子の全部又は一部の機能が失われているが、ＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒの遺伝子の全部又は一部の機能が失われていないノックアウト非ヒト動物と比較して、動脈硬化病変の形成量が増加していることから、動脈硬化モデル動物などとして使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、高コレステロール食を１２週間（ａ）１６週間（ｂ）投与した各群マウスの大動脈内膜側の代表例を示す写真である。オレンジ色にオイルレッドＯで染色された部分が動脈硬化巣である。
【図２】図２は、動脈硬化巣の大動脈に占める割合を定量評価したグラフである（実施例５）。図２に示したように、動脈硬化巣の大動脈に占める割合がＬＤＬＲノックアウトマウス（ＬＤＬＲ−／−）に比してＬＤＬＲ／ＥＢＩ−３遺伝子ダブルノックアウトマウス（ＬＤＬＲ−／−ＥＢＩ３−／−）及びＬＤＬＲ／ＷＳＸ−１遺伝子ダブルノックアウトマウス（ＬＤＬＲ−／−ＷＳＸ−１−／−）において増加していることを示す。
【図３】図３は、各群マウスの腹腔内マクロファージによるＤｉＩラベルアセチルのＬＤＬ取り込みの様子を示すコンフォーカル顕微鏡像（代表例）である。マクロファージに取り込まれたアセチルＬＤＬが赤色で、マクロファージの核が青色で染色されている。
【図４】図４は、各群マウスの腹腔内マクロファージに取り込まれたＤｉＩラベルアセチルＬＤＬの量を比較したグラフである。グラフの縦軸は、蛍光強度（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）（単位：ａｕｂｉｔｏｒｙ ｕｎｉｔ）を示す。マクロファージに取り込まれたアセチルＬＤＬの量は、ＤｉＩの蛍光強度と比例しており、蛍光強度が高ければ高いほど、マクロファージに取り込まれたアセチルＬＤＬの量が多いことを示す。図４に示したように、マクロファージに取り込まれたアセチルＬＤＬの量は、ＬＤＬＲノックアウトマウス（ＬＤＬＲ−／−）に比してＬＤＬＲ／ＥＢＩ−３遺伝子ダブルノックアウトマウス（ＬＤＬＲ−／−ＥＢＩ３−／−）及びＬＤＬＲ／ＷＳＸ−１遺伝子ダブルノックアウトマウス（ＬＤＬＲ−／−ＷＳＸ−１−／−）において増加していた。
【図５】図５は、各群マウスの腹腔内マクロファージが培養上清中に産生したサイトカインの濃度を示すグラフである。図５（ａ）は、マウスＩＬ１β（Ｍｓ ＩＬ−１ｂｅｔａ）の濃度を、図５（ｂ）は、マウスＩＬ６（Ｍｓ ＩＬ−６）の濃度を、図５（ｃ）は、マウスＩＬ１２（Ｍｓ ＩＬ−１２）の濃度を、図５（ｄ）は、マウスＩＬ１０（Ｍｓ ＩＬ−１０）の濃度を、それぞれ測定した結果を示すグラフである。グラフの横軸において、「Ｌ」は、ＬＤＬＲノックアウトマウス（ＬＤＬＲ−／−）を、「ＬＥ」は、ＬＤＬＲ／ＥＢＩ−３遺伝子ダブルノックアウトマウス（ＬＤＬＲ−／−ＥＢＩ３−／−）を、「ＬＷ」は、ＬＤＬＲ／ＷＳＸ−１遺伝子ダブルノックアウトマウス（ＬＤＬＲ−／−ＷＳＸ−１−／−）をそれぞれ表す。また「ＬＰＳ ０」及び「ＬＰＳ １０」は、それぞれ、対照溶媒投与群と、リポポリサッカライド投与群を示す。グラフの縦軸の数値は、サイトカインの濃度（ｐｇ／ｍｌ）を示す。図５に示したように、ＬＤＬＲ／ＥＢＩ−３遺伝子ダブルノックアウトマウス及びＬＤＬＲ／ＷＳＸ−１遺伝子ダブルノックアウトマウスにおいて、ＬＤＬＲノックアウトマウスに比して、リポポリサッカライド刺激による炎症性サイトカイン（ＩＬ１β、ＩＬ６、ＩＬ１２）の産生増加と抗炎症性サイトカイン（ＩＬ１０）の産生低下がより大きかった。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明について詳細に説明する。
なお、本明細書に記載した全ての文献及び刊行物は、その目的にかかわらず参照によりその全体を本明細書に組み込むものとする。
【００１９】
本発明のノックアウト非ヒト動物は、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）遺伝子の全部又は一部、並びにＩＬ２７及び／又はＩＬ２７受容体（ＩＬ２７Ｒ）遺伝子の全部又は一部の機能が喪失するように作出されたものである。
【００２０】
ＬＤＬＲノックアウト非ヒト動物に高脂肪食餌を摂取させることにより、動脈硬化症の発生を促すことができることが知られている。一方、ＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒノックアウト非ヒト動物では、野生型非ヒト動物と比較して、動脈硬化病変の形成量に有意な差は無いことが広く知られている。ところが、本発明において、ＬＤＬＲ遺伝子、並びにＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子をノックアウトさせた非ヒト動物を作製したところ、該動物は、ＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子をノックアウトせず、ＬＤＬＲ遺伝子のみをノックアウトさせた動物と比較して、動脈硬化病変の形成量がさらに増加することが分かった。このことから、本発明の動物は、ヒトの動脈硬化に類した病態を表すモデル動物として使用できる。
【００２１】
１．本発明のノックアウト若しくはノックダウン非ヒト動物又はその一部
本発明のノックアウト非ヒト動物とは、該動物のＬＤＬＲ遺伝子の全部又は一部、並びにＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子の全部又は一部がその本来の機能を発揮しないように、破壊されているか、又は組み換えがなされている動物を意味する。これらの遺伝子は、ゲノム上の一方のアリルが機能しないように破壊又は変異されたヘテロノックアウト（ヘテロ接合体）でもよく、両方のアリルが破壊又は変異されたホモノックアウト（ホモ接合体）でもよい。本発明のノックアウト非ヒト動物には、このような動物の子孫も含まれる。
【００２２】
「遺伝子の全部の機能が失われた」とは、遺伝子が完全に失われることを意味し、「遺伝子の一部の機能が失われた」とは、遺伝子の一部が欠如することにより遺伝子の機能が野生型と比較して低下している状態にあることを意味する。従って、「その本来の機能を発揮しない」とは、ＬＤＬＲ、並びにＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒの発現自体が行なわれないようにするか、或いは発現してもタンパク質の活性が低下又は喪失していることを意味する。
【００２３】
「ノックダウン」とは、特定の遺伝子の発現量を抑制することを意味する。遺伝子の発現量の抑制は、例えば、遺伝子の転写量を減少させること、翻訳を阻害することなどにより、達成することができる。本発明のノックダウン非ヒト動物とは、該動物のＬＤＬＲ遺伝子、並びにＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子の発現量が、野生型と比較して低下している動物をいう。
【００２４】
ＬＤＬＲ遺伝子は、ＬＤＬＲをコードする遺伝子である。ＬＤＬＲは、血中主要コレステロール運搬体であるＬＤＬと結合し、ＬＤＬを細胞内に取り込む機能を有する。
【００２５】
ＩＬ２７遺伝子は、ＩＬ２７をコードする遺伝子であり、ＩＬ２７Ｒ遺伝子は、ＩＬ２７Ｒをコードする遺伝子である。ＩＬ２７は、ＩＬ２７−ｐ２８とＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ（ＥＢＶ）−ｉｎｄｕｃｅｄ ｇｅｎｅ ３（ＥＢＩ３）の２つの異なるサブユニットを含むサイトカインである。一方、ＩＬ２７受容体（ＩＬ２７Ｒ）は、ＷＳＸ−１とｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ １３０とのヘテロダイマーで構成される。ＩＬ２７は、例えば、単球、マクロファージ及び樹状細胞のような抗原提示細胞で発現する。
【００２６】
本発明においてノックアウト又はノックダウンの対象となるＩＬ２７遺伝子は、例えば、ＥＢＩ３遺伝子、及び／又はＩＬ２７−ｐ２８遺伝子である。また、本発明においてノックアウト又はノックダウンの対象となるＩＬ２７Ｒ遺伝子は、ＷＳＸ−１遺伝子である。したがって、本発明においてノックアウト又はノックダウンの対象となる「ＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子」とは、ＥＢＩ３遺伝子、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子及びＷＳＸ−１遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を意味する。本発明においてノックアウト又はノックダウンの対象となる「ＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子」は、好ましくは、ＥＢＩ３遺伝子、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子、又はＷＳＸ−１遺伝子である。
【００２７】
本発明においてノックアウト又はノックダウンの対象となるＬＤＬＲ遺伝子、ＥＢＩ３遺伝子、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子及びＷＳＸ−１遺伝子は公知であり、その塩基配列情報及びアミノ酸配列情報は、ＧｅｎＢａｎｋ等のアクセッション番号から知ることができる。以下に、ＬＤＬＲ遺伝子、ＥＢＩ３遺伝子、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子及びＷＳＸ−１遺伝子の塩基配列情報及びアミノ酸配列情報を示すアクセッション番号を例示する。
【００２８】
・マウスＥＢＩ３遺伝子のＤＮＡ配列：ＮＭ＿０１５７６６（配列番号：１）、
・マウスＥＢＩ３のアミノ酸配列：ＮＰ＿０５６５８１（配列番号：２）、
・ラットＥＢＩ３遺伝子のＤＮＡ配列：ＮＭ＿００１１０９４２１（配列番号：３）、
・ラットＥＢＩ３のアミノ酸配列：ＮＰ＿００１１０２８９１（配列番号：４）、
【００２９】
・マウスＩＬ２７−ｐ２８遺伝子のＤＮＡ配列：ＮＭ＿１４５６３６（配列番号：５）、
・マウスＩＬ２７−ｐ２８のアミノ酸配列：ＮＰ＿６６３６１１（配列番号：６）、
【００３０】
・マウスＷＳＸ−１遺伝子のＤＮＡ配列：ＮＭ＿０１６６７１（配列番号：７）、
・マウスＷＳＸ−１のアミノ酸配列：ＮＰ＿０５７８８０（配列番号：８）。
【００３１】
本発明においてノックアウト又はノックダウンの対象となる非ヒト動物は、ＬＤＬＲ遺伝子、ＩＬ２７遺伝子及びＩＬ２７Ｒ遺伝子を有するヒト以外の動物ならば、いかなる動物でもよいが、非ヒト哺乳動物が好ましい。非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ミニブタ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラット、サル等が用いられる。非ヒト哺乳動物のなかでも、病態動物モデル系の作製の面から個体発生及び生物サイクルが比較的短く、また繁殖が容易なげっ歯動物、とりわけマウス又はラット等が特に好ましい。
【００３２】
本発明において動物の一部とは、当該動物由来の組織、細胞、これらの破砕物又は抽出物、及び体液を意味し、特に限定されるものではない。非ヒト動物由来の組織としては、例えば、心臓、肺、腎臓、胆嚢、肝臓、膵臓、脾臓、腸、精巣（睾丸）、卵巣、子宮、胎盤、筋肉、血管、脳、骨髄、甲状腺、胸腺、乳腺、リンパ節、血液等が挙げられる。
【００３３】
本発明において動物由来の細胞としては、上記組織、臓器又は体液に含まれる細胞を意味し、単離及び培養して得られる培養細胞も含まれる。細胞は、例えば、マクロファージ、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、心筋細胞、骨髄細胞、リンパ球等の各種の細胞が挙げられる。培養細胞としては、初代培養細胞及びその株化細胞の両者を含む。発生段階（胎生期）における組織、各器官、細胞、破砕物又は抽出物及び体液も非ヒト動物の一部に含まれる。
【００３４】
さらに、動物由来の血液、リンパ液、尿等の体液も本発明において動物の一部に含まれる。
【００３５】
本発明のノックアウト非ヒト動物は、例えば高脂肪食を摂取させた時などに動脈硬化病変を多数形成し、その動脈硬化の形成量が、野生型非ヒト動物やＬＤＬＲノックアウト非ヒト動物と比較して、有意に増加していた。したがって、本発明のノックアウト又はノックダウン非ヒト動物は、動脈硬化若しくは動脈硬化性疾患モデル動物又はその一部として使用することができる。
【００３６】
動脈硬化性疾患としては、脳動脈疾患（例、脳梗塞、脳出血など）、冠動脈疾患（例、心筋梗塞、狭心症などの虚血性心疾患など）、大動脈疾患（例、大動脈瘤、大動脈解離など）、腎動脈疾患（例、腎硬化症、腎硬化症などに起因する腎不全など）、末梢動脈疾患（例、閉塞性動脈硬化症など）等を挙げることができる。大動脈疾患は、好ましくは、大動脈瘤である。
【００３７】
２．ノックアウト非ヒト動物又はノックダウン非ヒト動物の作製
２．１．ノックアウト非ヒト動物の作製
本発明のノックアウト非ヒト動物は、定法に従って作製することができる。例えば、（１）ＬＤＬＲ遺伝子と、ＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子とを不活性化させたＥＳ細胞を作製することによる方法、又は（２）ＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物と、ＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子ノックアウト非ヒト動物との交配による方法を用いて、本発明のノックアウト非ヒト動物を作製することができる。
【００３８】
２．１．１．ＬＤＬＲ遺伝子と、ＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子とを不活性化させたＥＳ細胞を作製することによる方法
当該方法は、
（ａ）遺伝子のターゲティングによりＬＤＬＲ遺伝子、並びにＩＬ２７遺伝子及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子の全部又は一部の機能を欠損させたＥＳ細胞を作製すること、
（ｂ）ＥＳ細胞を用いて、キメラ非ヒト動物を作製すること、
（ｃ）キメラ非ヒト動物を野生型マウスと交配してヘテロノックアウト非ヒト動物を作製すること、
（ｄ）ヘテロノックアウト非ヒト動物同士を交配して、ホモノックアウト非ヒト動物を作製すること、を含む。
以下、上記各工程について詳細に説明する。
【００３９】
工程（ａ）：遺伝子ターゲティング
遺伝子ターゲティングでは、先ず、目的遺伝子（ＬＤＬＲ遺伝子、並びにＩＬ２７遺伝子及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子）の機能を喪失させ、或いはその機能が低下するように破壊又は組換えたＤＮＡ断片を作製する。目的遺伝子のターゲティングベクターは、目的遺伝子を破壊することにより当該遺伝子の全部又は一部を喪失させ、機能を全く失わせるか、或いは機能を低下させるものである。「遺伝子の全部を喪失させ」とは、遺伝子が完全に失われることを意味し、「遺伝子の一部を喪失させ」とは、遺伝子の一部が欠如することにより遺伝子の機能が野生型と比較して低下している状態にあることを意味する。従って、「遺伝子の全部又は一部を喪失させ」とは、目的遺伝子がコードするタンパク質の発現自体が行なわれないようにするか、或いは発現してもタンパク質の活性が失われているか、又は野生型と比較して低下していることを意味する。
【００４０】
ターゲティングベクターは、相同組換えを起こさせた後の組換え体のスクリーニングが容易となるように構築することが好ましい。例えば、ポジティブ−ネガティブ選択をするために、ベクターに薬剤耐性遺伝子又は毒素遺伝子などの選択マーカーを連結することができる。ポジティブ−ネガティブ選別法は、当分野において周知である。すなわち、ポジティブ選別は、選択マーカー遺伝子が組み込まれなかった細胞は、薬剤を含む培養液で培養すると、耐性遺伝子を含まないために死ぬことを利用するものであり、ネガティブ選別法は、組み込みがランダムに起こった細胞では、ネガティブ選別用遺伝子が発現するために、細胞が死ぬことを利用するものである。その結果、相同組換えを起こした細胞のみが生き残り、選別される。
【００４１】
選択マーカー遺伝子は、ポジティブ選択用として例えばネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子などを使用することができ、ネガティブ選択用として例えばヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋ）、ジフテリア毒素Ａ遺伝子などを使用することができる。
【００４２】
上記の方法により作製したターゲティングベクターを用いて、相同組換えを行う。現在確立されている遺伝子ターゲティング法では、ノックアウト非ヒト動物を作製する場合には、ＥＳ細胞を使用することが望ましい。ＥＳ細胞として、ＴＴ２細胞、ＡＢ−１細胞、Ｊ１細胞、Ｒ１細胞などを適宜選択して使用することができる。
【００４３】
相同組換えを起こさせるために、目的遺伝子の機能を喪失させたターゲティングベクターを細胞中に導入する。ターゲティングベクターを細胞に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リポソーム法などを使用することができる。効率、作業の容易性などを考慮して、エレクトロポレーション法を用いることが好ましい。そして細胞中の目的とするゲノムＤＮＡ配列を、ターゲティングベクターの相同組換えによって置換する。
【００４４】
相同組換え効率を高めるために、例えば、バクテリオファージＰ１由来の組換えシステムであるＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムを使用することができる。Ｃｒｅは組換え酵素であり、ｌｏｘＰと呼ばれる３４塩基の配列を認識して、この部位で組換えを起こさせることが可能となる。従って、ターゲティングしたい遺伝子（目的遺伝子）をｌｏｘＰ配列とｌｏｘＰ配列との間にはさみ、Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子を特異的プロモーター下流に組み込むことにより、部位特異的及び時期特異的にＣｒｅが産生されてｌｏｘＰで挟んだ遺伝子を切り取る（すなわち、目的遺伝子の機能を喪失させる）ことができる。
【００４５】
その後、ＰＣＲ法、サザンブロット法等により、目的遺伝子がターゲティングされているか否かを確認する。
【００４６】
ＰＣＲにおいて、プライマーは、例えばターゲティングベクターの外側のゲノムＤＮＡ領域上、及びターゲティングベクターの配列のうち薬剤耐性遺伝子上から設計することができる。
【００４７】
サザンブロット解析は、例えば以下の通り行うことができる。ターゲティングベクターに含まれないゲノム領域を認識する１又は２種類のプローブを設計する。目的遺伝子ゲノムを含むクローンを適当な制限酵素で処理することにより得られるＤＮＡ断片と、上記プローブとのハイブリダイゼーションを行なうことにより、目的遺伝子の破壊の有無を確認することができる。
【００４８】
工程（ｂ）：キメラ非ヒト動物の作製
相同組換えの結果得られた組換えＥＳ細胞を、８細胞期又は胚盤胞の胚内に移植する。このＥＳ細胞移植胚を偽妊娠仮親の子宮内に移植して出産させることによりキメラ動物を作製する。
【００４９】
ＥＳ細胞を胚内に移植する方法として、マイクロインジェクション法、凝集法などの公知手法を用いることができる。
【００５０】
マウスの場合、まず、ホルモン剤により過排卵処理を施した雌マウスを、雄マウスと交配させる。その後、８細胞期胚を用いる場合には受精から２．５日目に、胚盤胞を用いる場合には受精から３．５日目に、それぞれ卵管又は子宮から初期発生胚を回収する。回収した胚に、相同組換えを行ったＥＳ細胞を注入し、キメラ胚を作製する。
【００５１】
一方、仮親にするための偽妊娠雌マウスは、正常性周期の雌マウスを、精管結紮などにより去勢した雄マウスと交配することにより得ることができる。作出した偽妊娠マウスに対して、上述の方法により作製したキメラ胚を子宮内移植し、その後出産させることによりキメラマウスを作製することができる。
【００５２】
マウス以外の非ヒト動物についても、上記と同様にして、キメラ非ヒト動物を作製することができる。
【００５３】
工程（ｃ）：ヘテロノックアウト非ヒト動物の作製
上記のようにして得たキメラ非ヒト動物の中から、ＥＳ細胞移植胚由来の雄キメラ非ヒト動物を選択する。マウスの場合、選択したＥＳ細胞移植胚由来の雄マウスが成熟した後、このマウスを純系マウス系統の雌マウスと交配させる。そして、誕生した子マウスに、ＥＳ細胞に由来するマウス（ＥＳ細胞に組み込まれたゲノムを有していたマウス）の被毛色が現れることにより、ＥＳ細胞がキメラマウスの生殖系列へ導入されたことを確認することができる。そして、胚内に移植された組換えＥＳ細胞が生殖系列に導入された目的遺伝子欠損ヘテロノックアウト非ヒト動物を繁殖する。
【００５４】
工程（ｄ）：ホモノックアウト非ヒト動物の作製
上記のようにして得た目的遺伝子ヘテロノックアウト非ヒト動物同士を交配させて、遺伝子欠損ホモノックアウト非ヒト動物を得ることができる。
【００５５】
工程（ｃ）又は（ｄ）においてノックアウト非ヒト動物が得られたことの確認については、組織から染色体ＤＮＡを抽出しサザンブロット法やＰＣＲ法で行うことができる。さらに、組織からＲＮＡを抽出し、ノーザンブロット解析により遺伝子の発現パターンを解析することもできる。目的遺伝子がコードするタンパク質に対する抗体を用いてウエスタンブロッティングを行なってもよい。
【００５６】
また、樹立した動物系統について、ヘテロノックアウト非ヒト動物及びホモノックアウト非ヒト動物の表現型を解析することもできる。表現型の解析は、肉眼的観察、解剖による内部の観察、各臓器の組織切片、Ｘ線撮影による観察、行動や記憶の観察、血液検査や血清生化学検査行う。解析時期は、胎生期から成体までの任意の時期であってよく、特に限定されるものではない。
【００５７】
２．１．２．ＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物と、ＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子ノックアウト非ヒト動物との交配による方法
上記（１）ＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物と、ＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子ノックアウト非ヒト動物との交配による方法は、具体的には、次のように行うことができる。
【００５８】
ＬＤＬＲ遺伝子ホモノックアウト非ヒト動物（ＬＤＬＲ−／−）とＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子ホモノックアウト非ヒト動物（ＩＬ２７（Ｒ）−／−）とを交配させて、Ｆ１ヘテロノックアウト非ヒト動物（ＬＤＬＲ＋／−／ＩＬ２７（Ｒ）＋／−）を作出することができる。ホモノックアウト非ヒト動物を作出する場合には、このＦ１ヘテロノックアウト非ヒト動物同士をかけ合わせることで、Ｆ２ホモノックアウト非ヒト動物（ＬＤＬ−／−／ＩＬ２７（Ｒ）−／−）を得ることができる。
【００５９】
ノックアウト非ヒト動物が得られたことの確認は、前記と同様に行うことができる。
【００６０】
本発明のノックアウト非ヒト動物を作製するために使用するＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物や、ＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子ノックアウト非ヒト動物は、市販のものを入手しても良いし、或いは、標準的な方法で作製して入手しても良い。
【００６１】
マウスの場合、市販のものについては、例えば、ＬＤＬＲ遺伝子ホモノックアウトマウスはジャクソンラボラトリー社（カタログ番号００７０６８）より入手することができる。
【００６２】
標準的な作製方法については、例えば、
（ａ）遺伝子のターゲティングによりＬＤＬＲ遺伝子、ＩＬ２７遺伝子、又はＩＬ２７Ｒ遺伝子の全部又は一部の機能を欠損させたＥＳ細胞を作製すること、
（ｂ）ＥＳ細胞を用いて、キメラ非ヒト動物を作製すること、
（ｃ）キメラ非ヒト動物を野生型マウスと交配してヘテロノックアウト非ヒト動物を作製すること、
（ｄ）ヘテロノックアウト非ヒト動物同士を交配して、ホモノックアウト非ヒト動物を作製すること、などを含む方法により、ノックアウト非ヒト動物を作製することができる。
【００６３】
上記（ａ）〜（ｄ）の各工程の詳細は、目的遺伝子がＬＤＬＲ遺伝子、ＩＬ２７遺伝子、又はＩＬ２７Ｒ遺伝子であることを除き、前述した方法と同様である。
【００６４】
尚、ＥＢＩ３遺伝子ノックアウトマウスの作製方法は、例えば、Ｉｇａｗａ， Ｔ．， Ｎａｋａｓｈｉｍａ， Ｈ．， Ｓａｄａｎａｇａ， Ａ．， Ｍａｓｕｔａｎｉ， Ｋ．， Ｍｉｙａｋｅ， Ｋ．， Ｓｈｉｍｉｚｕ， Ｓ．， Ｔａｋｅｄａ， Ａ．， Ｈａｍａｎｏ， Ｓ．， Ｙｏｓｈｉｄａ， Ｈ． （２００９） Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ＥＢＶ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｇｅｎｅ ３ （ＥＢＩ３） ｉｎ ＭＲＬ／ｌｐｒ ｍｉｃｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ ｓｉａｌａｄｅｎｉｔｉｓ． Ｍｏｄ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ １９， ３３−４１．などにも記載されている。また、ＷＳＸ−１遺伝子ノックアウトマウスの作製方法は、例えば、Ｙｏｓｈｉｄａ， Ｈ．， Ｈａｍａｎｏ， Ｓ．， Ｓｅｎａｌｄｉ， Ｇ．， Ｃｏｖｅｙ， Ｔ．， Ｆａｇｇｉｏｎｉ， Ｒ．， Ｍｕ， Ｓ．， Ｘｉａ， Ｍ．， Ｗａｋｅｈａｍ， Ａ．Ｃ．， Ｎｉｓｈｉｎａ， Ｈ．， Ｐｏｔｔｅｒ， Ｊ．， Ｓａｒｉｓ， Ｃ．Ｊ．， Ｍａｋ， Ｔ．Ｗ． （２００１） ＷＳＸ−１ Ｉｓ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈ１ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｌ． ｍａｊｏｒ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １５， ５６９−７８．などにも記載されている。
【００６５】
２．２．ノックダウン非ヒト動物の作製
本発明のノックダウン非ヒト動物は、公知の方法に従って、非ヒト動物のＬＤＬＲ遺伝子、並びにＩＬ２７遺伝子及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子（以下、「ＬＤＬＲ遺伝子等」とする。）の発現を抑制することにより、作製することができる。
【００６６】
ＬＤＬＲ遺伝子等の発現抑制には、例えばＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用することができるが、特にこれに限定されるものではない。例えば、ＬＤＬＲ遺伝子等に対するｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）を設計及び合成し、これを、レトロウイルスベクターやアデノウイルスベクターに組み込んで非ヒト動物に導入することによりＲＮＡｉを引き起こすことができる。
【００６７】
ＲＮＡｉとは、ｄｓＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ）が標的遺伝子に特異的かつ選択的に結合し、当該標的遺伝子を切断することによりその発現を効率よく阻害する現象である。例えば、ｄｓＲＮＡを非ヒト動物に導入すると、そのＲＮＡと相同配列の遺伝子の発現が抑制（ノックダウン）される。
【００６８】
（１）ｓｉＲＮＡ
ｓｉＲＮＡの設計は、以下の通り行なうことができる。
（ａ） ＬＤＬＲ、ＩＬ２７、又はＩＬ２７Ｒをコードする遺伝子であれば特に限定されるものではなく、任意の領域を全て候補にすることが可能である。
（ｂ） 選択した領域から、ＡＡで始まる配列であって長さが１８〜３０塩基のもの、あるいは、ＡＡを５’側に加えたときの長さが１８〜３０塩基、好ましくは１９〜２３塩基の配列を選択する。その配列のＧＣ含量は、例えば３０〜７０％となるものを選択すればよく、５０％前後が好ましい。また、そのＧＣ分布に偏りがないものを選択するとよい。
（ｃ） 選択した配列の３’側にｄＴ又はＵの２残基のオーバーハングを加えるとよい。
（ｄ） ＢＬＡＳＴサーチをおこない、選択した配列に類似した配列を有するタンパク質が存在しないことを確認することが好ましい。
【００６９】
さらに、数種類のｓｉＲＮＡを同時に非ヒト動物に導入することにより、遺伝子の発現をより効果的に抑制できることがある。
【００７０】
ｓｉＲＮＡ合成の別法としてＤｉｃｅｒ法がある。Ｄｉｃｅｒ法の概要とは以下の通りである。まず、ＬＤＬＲ、ＩＬ２７、又はＩＬ２７Ｒをコードする遺伝子の配列のスタートコドンから５００ ｂｐ〜１ ｋｂｐの遺伝子配列をベクター等に組み込み、その遺伝子配列のセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡを転写させた後、アニーリングしてｄｓＲＮＡを作製する。次に、ＲＮａｓｅ ＩＩＩファミリーに属するＤｉｃｅｒ Ｅｎｚｙｍｅにより、このｄｓ−ＲＮＡを３’末端側に２塩基の突出末端をもつ２１−２３塩基のｓｉＲＮＡにプロセッシングさせる。
【００７１】
（２）ｓｈＲＮＡ
また、本発明は、ＲＮＡｉ効果をもたらすためにｓｈＲＮＡを使用することもできる。ｓｈＲＮＡ とは、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）と呼ばれ、一本鎖の一部の領域が他の領域と相補鎖を形成するためにステムループ構造を有するＲＮＡ分子である。このステムループ構造を有するＲＮＡ分子は生体内のＤｉｃｅｒ等によりプロセッシングを受け、ｓｉＲＮＡが産生される。
ｓｈＲＮＡは、その一部がステムループ構造を形成するように設計することができる。例えば、ある領域の配列を「配列Ａ」とし、配列Ａに対する相補鎖を「配列Ｂ」とすると、配列Ａ、スペーサー、配列Ｂの順になるようにこれらの配列が一本のＲＮＡ鎖に存在するようにし、全体で４２〜１２０塩基の長さとなるように設計する。配列Ａは、標的となるＬＤＬＲ、ＩＬ２７、又はＩＬ２７Ｒをコードする遺伝子の一部の領域の配列であり、標的領域は特に限定されるものではなく、任意の領域を候補にすることが可能である。そして配列Ａの長さは１８〜５０塩基、好ましくは２１〜３０塩基である。
【００７２】
また、ＬＤＬＲ遺伝子等の発現抑制には、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を利用することもできる。ｍｉＲＮＡは小分子ＲＮＡであり、自身と相補的な配列をもつｍＲＮＡからのタンパク質への翻訳を阻害することなどにより、特定の遺伝子の発現を抑制することができる。
【００７３】
ｍｉＲＮＡは、特定の遺伝子のｍＲＮＡを認識するように設計することができる。そのように設計するｍｉＲＮＡの塩基配列の長さは、例えば、１８〜２５塩基（例、約２２塩基）である。
【００７４】
３．ノックアウト細胞又はノックダウン細胞
本発明のノックアウト細胞とは、該細胞のＬＤＬＲ遺伝子の全部又は一部、並びにＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子の全部又は一部がその本来の機能を発揮しないように、破壊されているか、又は組み換えがなされている細胞を意味する。ＬＤＬＲ遺伝子は、ゲノム上の一方のアリルが機能しないように破壊又は変異されたヘテロノックアウト（ヘテロ接合体）でもよく、両方のアリルが破壊又は変異されたホモノックアウト（ホモ接合体）でもよい。
【００７５】
「遺伝子の全部」とは、遺伝子が完全に失われることを意味し、「遺伝子の一部」とは、遺伝子の一部が欠如することにより遺伝子の機能が野生型と比較して低下している状態にあることを意味する。従って、「その本来の機能を発揮しない」とは、ＬＤＬＲ、並びにＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒの発現自体が行なわれないようにするか、或いは発現してもタンパク質の活性が低下又は喪失していることを意味する。
【００７６】
また、本発明のノックダウン細胞とは、該細胞のＬＤＬＲ遺伝子、並びにＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子の発現量が、野生型と比較して低下している細胞をいう。
【００７７】
本発明においてノックアウト又はノックダウンの対象となるＬＤＬＲ遺伝子、ＥＢＩ３遺伝子、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子及びＷＳＸ−１遺伝子は公知であり、その塩基配列情報及びアミノ酸配列情報は、ＧｅｎＢａｎｋ等のアクセッション番号から知ることができる。以下に、ヒトのＬＤＬＲ遺伝子、ＥＢＩ３遺伝子、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子及びＷＳＸ−１遺伝子の塩基配列情報及びアミノ酸配列情報を示すアクセッション番号を例示する。ヒト以外の遺伝子についての塩基配列情報及びアミノ酸配列情報を示すアクセッション番号は、前記例示した通りである。
【００７８】
・ヒトＬＤＬＲ遺伝子のＤＮＡ配列：ＮＭ＿０００５２７（配列番号：９）、
・ヒトＬＤＬＲのアミノ酸配列：ＮＰ＿０００５１８（配列番号：１０）、
【００７９】
・ヒトＥＢＩ３遺伝子のＤＮＡ配列：ＮＭ＿００５７５５（配列番号：１１）、
・ヒトＥＢＩ３のアミノ酸配列：ＮＰ＿００５７４６（配列番号：１２）、
【００８０】
・ヒトＩＬ２７−ｐ２８遺伝子のＤＮＡ配列：ＮＭ＿１４５６５９（配列番号：１３）、
・ヒトＩＬ２７−ｐ２８のアミノ酸配列：ＮＰ＿６６３６３４（配列番号：１４）、
【００８１】
・ヒトＷＳＸ−１遺伝子のＤＮＡ配列：ＮＭ＿００４８４３（配列番号：１５）、
・ヒトＷＳＸ−１のアミノ酸配列：ＮＰ＿００４８３４（配列番号：１６）。
【００８２】
本発明のノックアウト又はノックダウン細胞は、単離された培養細胞であり、ＬＤＬＲ遺伝子、ＩＬ２７遺伝子及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子を発現する細胞由来であるならば、特に限定されない。ノックアウト又はノックダウン細胞としては、動物由来細胞がより好ましい。動物由来細胞としては、ヒト由来細胞であっても非ヒト動物由来細胞であってもよい。ＬＤＬＲ遺伝子、ＩＬ２７遺伝子及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子を発現する細胞は、例えば、単球、マクロファージ、樹状細胞、ヒト線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞、中枢神経系細胞、末梢神経系細胞、神経芽細胞、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞等の各種の細胞が挙げられる。本発明のいくつかの態様では、ノックアウト又はノックダウン細胞は、ＬＤＬＲ遺伝子、ＩＬ２７遺伝子及びＩＬ２７Ｒ遺伝子を発現する動物細胞由来の単離細胞である。ＬＤＬＲ遺伝子、ＩＬ２７遺伝子及びＩＬ２７Ｒ遺伝子を発現する細胞としては、例えば、単球、マクロファージ、樹状細胞、Ｔリンパ球、ヒト線維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、血管内皮細胞、膵臓ランゲルハンス島細胞等が挙げられる。培養細胞としては、初代培養細胞及びその株化細胞の両者を含む。
【００８３】
本発明のノックアウト細胞は、本発明のノックアウト非ヒト動物と同様、ＬＤＬＲ遺伝子の全部又は一部、並びにＥＢＩ３遺伝子、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子及びＷＳＸ−１遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の全部又は一部の機能が失われている。また、本発明のノックダウン細胞は、ＬＤＬＲ遺伝子、並びにＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子の発現量が、野生型と比較して低下している。したがって、本発明のノックアウト又はノックダウン細胞は、動脈硬化若しくは動脈硬化性疾患モデル細胞として使用することもできる。
動脈硬化性疾患としては、脳動脈疾患（例、脳梗塞、脳出血など）、冠動脈疾患（例、心筋梗塞、狭心症などの虚血性心疾患など）、大動脈疾患（例、大動脈瘤、大動脈解離など）、腎動脈疾患（例、腎硬化症、腎硬化症などに起因する腎不全など）、末梢動脈疾患（例、閉塞性動脈硬化症など）等を挙げることができる。
【００８４】
４．ノックアウト又はノックダウン細胞の作製
４．１．ノックアウト細胞の作製
本発明のノックアウト細胞は、遺伝子のターゲティングによりＬＤＬＲ遺伝子、並びにＩＬ２７遺伝子及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子の全部又は一部の機能を欠損させることにより得ることができる。
【００８５】
遺伝子ターゲティングは、前記「ＬＤＬＲ遺伝子と、ＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子とを不活性化させたＥＳ細胞を作製することによる方法」の項で説明した、遺伝子ターゲティングの方法に準じて行うことができる。
【００８６】
４．２．ノックダウン細胞の作製
本発明のノックダウン細胞は、公知の方法に従って、ＬＤＬＲ遺伝子、並びにＩＬ２７遺伝子及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子（以下、「ＬＤＬＲ遺伝子等」とする。）の発現を抑制させることにより、作製することができる。
【００８７】
ＬＤＬＲ遺伝子等の発現抑制には、例えばＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用することができるが、特にこれに限定されるものではない。ＬＤＬＲ遺伝子等に対するｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを設計及び合成し、これを細胞内に導入させることによって、ＲＮＡｉを引き起こすことができる。
【００８８】
ＲＮＡｉとは、ｄｓＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ）が標的遺伝子に特異的かつ選択的に結合し、当該標的遺伝子を切断することによりその発現を効率よく阻害する現象である。例えば、ｄｓＲＮＡを細胞内に導入すると、そのＲＮＡと相同配列の遺伝子の発現が抑制（ノックダウン）される。
【００８９】
ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡの設計法は、前記と同様である。
【００９０】
ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを細胞に導入するには、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成したｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡをプラスミドＤＮＡに連結してこれを細胞に導入する方法などを採用することができる。
【００９１】
また、ＬＤＬＲ遺伝子等の発現抑制には、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を利用することもできる。ｍｉＲＮＡは小分子ＲＮＡであり、自身と相補的な配列をもつｍＲＮＡからのタンパク質への翻訳を阻害することなどにより、特定の遺伝子の発現を抑制することができる。
【００９２】
ｍｉＲＮＡの設計方法は、前記と同様である。
【００９３】
５．動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬のスクリーニング方法
本発明は、動脈硬化又は動脈硬化性疾患を発症した本発明のノックアウト若しくはノックダウン非ヒト動物若しくはその一部又は本発明のノックアウト若しくはノックダウン細胞（以下、「本発明のノックアウト非ヒト動物等」という場合がある。）に、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療のための薬物の候補物質（被験物質）を接触させることにより、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬をスクリーニングすることができる。例えば、動脈硬化又は動脈硬化性疾患を発症した本発明のノックアウト非ヒト動物等に薬物候補物質を接触させ、前記候補物質を接触させた本発明のノックアウト非ヒト動物等において標的とする疾患と相関関係を有する指標（例えば、動脈硬化の形成量、動脈硬化病変の組織像、動脈硬化を生じている臓器・組織の機能障害の程度、血液中の代用マーカー、内皮細胞における接着分子（ＶＣＡＭ１等）の発現、培養心筋細胞においてアンジオテンシンＩＩやβアドレナリン作動薬で誘導されるアミノ酸取り込み（例、３Ｈロイシンの取り込み）や細胞肥大（例、位相差顕微鏡で観察される細胞面積）、マクロファージのサイトカイン産生・蛋白分解酵素産生・変性脂質取り込み、Ｔリンパ球のサイトカイン（例、ＩＬ６、ＩＬ１２等の炎症性サイトカイン）の産生や遊走、筋細胞の生理活性物質産生（例、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ等の成長因子・ペプチド産生）等）を測定し、対照と比較し、この比較結果に基づいて、動脈硬化又は動脈硬化性疾患の症状を軽減又は消滅させるか否かを確認することで、候補物質をスクリーニングすることができる。
【００９４】
本発明のノックアウト若しくはノックダウン非ヒト動物を候補物質で接触させる方法としては、例えば、経口投与、静脈注射、塗布、皮下投与、皮内投与、腹腔投与などが用いられ、試験動物の症状、候補物質の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、候補物質の投与量は、投与方法、候補物質の性質などにあわせて適宜選択することができる。
【００９５】
本発明のノックアウト若しくはノックダウン非ヒト動物の一部又は本発明のノックアウト若しくはノックダウン細胞（以下、「本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等」とする。）を候補物質で接触させる方法としては、例えば、本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等と候補物質とを同一の反応系又は培養系に存在させる方法を用いることができる。より具体的には、本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等の培養容器に候補物質を添加すること、本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等と候補物質とを混合すること、本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等を候補物質の存在下で培養すること等が挙げられる。また、接触させる候補物質量は、投与方法、候補物質の性質などにあわせて適宜選択することができる。
【００９６】
動脈硬化は、例えば、高脂肪食を摂取させることにより本発明のノックアウト非ヒト動物等に誘発させることができる。また、動脈硬化性疾患の一つである大動脈瘤は、例えば、アンジオテンシンＩＩを投与することにより本発明のノックアウト非ヒト動物等に誘発させることができる。
【００９７】
比較のための対照は、例えば、被験物質を接触させない野生型非ヒト動物若しくはその一部又は野生型細胞（以下、「野生型非ヒト動物等」とする。）、被験物質を接触させた野生型非ヒト動物等、動脈硬化改善作用を有することが分かっている物質（既知の動脈硬化治療薬等）を接触させた野生型非ヒト動物等、被験物質を接触させないＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト若しくはノックダウン非ヒト動物若しくはその一部又はＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト若しくはノックダウン細胞（以下、「ＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物等」とする。）、被験物質を接触させたＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物等、既知の動脈硬化治療薬等を接触させたＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物等、被験物質を接触させない本発明のノックアウト非ヒト動物等、既知の動脈硬化治療薬等を接触させた本発明のノックアウト非ヒト動物等のいずれをも意味し、目的に応じて少なくとも１つの対照を適宜選択することができる。
【００９８】
ここで、「野生型非ヒト動物若しくはその一部」とは、ＬＤＬＲ遺伝子、ＩＬ２７遺伝子及びＩＬ２７Ｒ遺伝子のいずれもが正常に発現し、機能している非ヒト動物又はその一部を意味する。「野生型細胞」とは、ＬＤＬＲ遺伝子、ＩＬ２７遺伝子及びＩＬ２７Ｒ遺伝子のいずれもが正常に発現し、機能している細胞を意味する。「ＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物」とは、ＬＤＬＲ遺伝子の全部又は一部の機能が失われているが、ＥＢＩ３遺伝子、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子及びＷＳＸ−１遺伝子の機能が失われていない非ヒト動物を意味する。「ＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト細胞」とは、ＬＤＬＲ受容体遺伝子の全部又は一部の機能が失われているが、ＥＢＩ３遺伝子、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子及びＷＳＸ−１遺伝子の機能が失われていない細胞を意味する。ＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト細胞は、前記「ノックアウト細胞の作製」に記載の方法と同様にして作製したものを使用することができる。「ＬＤＬＲ遺伝子ノックダウン細胞」とは、該細胞のＬＤＬＲ遺伝子の発現量が野生型と比較して低下しているが、ＩＬ２７及びＩＬ２７Ｒ遺伝子は正常に発現し、機能している細胞をいう。ＬＤＬＲ遺伝子ノックダウン細胞は、前記「ノックダウン細胞の作製」の項に記載の方法と同様にして作製したものを使用することができる。
【００９９】
上記に「対照」として例示したＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物は、本発明のノックアウト非ヒト動物と比較して、動脈硬化又は動脈硬化性疾患（以下、「動脈硬化等」とする。）が軽度である。これは、ＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物では、ＩＬ２７シグナルが不活性な本発明のノックアウト非ヒト動物と異なり、ＩＬ２７シグナルが正常であるためと考えられる。このＩＬ２７シグナルが正常なＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物と同程度又はそれよりも軽度になるように、本発明のノックアウト非ヒト動物の動脈硬化等を治療することができる物質は、ＩＬ２７シグナルに選択的に働く動脈硬化等治療薬となり得る。したがって、例えば、対照が候補物質を接触させないＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物の場合には、候補物質を接触させた本発明のノックアウト非ヒト動物の動脈硬化の形成量を測定し、当該測定された動脈硬化の形成量が、対照における動脈硬化の形成量と同等になったとき又はそれよりも低下したときは、前記候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択することができる。また、対照が候補物質を接触させないＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物の場合に、候補物質を接触させた本発明のノックアウト非ヒト動物の大動脈瘤の発生頻度を測定し、当該測定された大動脈瘤の発生頻度が、対照における大動脈瘤の発生頻度と同等になったとき又はそれよりも低下したときは、前記候補物質を、動脈硬化性疾患治療薬（特には、大動脈瘤治療薬）として選択することもできる。そして、本発明のノックアウト非ヒト動物の動脈硬化の形成量又は動脈瘤の発生頻度が、対照における動脈硬化の形成量又は動脈瘤の発生頻度と同等となるような候補物質は、ＩＬ２７シグナルに選択的に作用する動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬となり得る。
【０１００】
候補物質としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、細胞培養上清、植物抽出液、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど）の組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。これら候補物質は塩を形成していてもよく、候補物質の塩としては、生理学的に許容される酸（例えば、有機酸又は無機酸など）や塩基（例えば、金属酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、或いは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
【０１０１】
例えば、ある候補物質を投与した場合に、動脈硬化又は動脈硬化性疾患の症状が緩和若しくは消失したことが確認できる結果が得られれば、用いた候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択することが可能である。
【０１０２】
より具体的には、動脈硬化の形成量を指標とする場合には、次のようにスクリーニングを行う。動脈硬化の形成量は、例えば、後述の実施例に示したように、大動脈を摘出し、摘出した大動脈の内膜側総面積と動脈硬化巣の総面積を測定し、動脈硬化巣の総面積を大動脈の内膜側総面積で除し、動脈硬化巣の大動脈の内膜に占める割合を算出することにより求めることができる。そして、対照との比較結果に基づいて、本発明のノックアウト非ヒト動物等の動脈硬化の形成量を減少又は消滅させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。例えば、対照が上記「被験物質を接触させたＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物等」である場合には、本発明のノックアウト非ヒト動物等の動脈硬化の形成量を、対照における動脈硬化の形成量と同等とする又はそれよりも低下（例えば、５％以上、１０％以上、１５％以上又は２０％以上低下）させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。また、対照が上記「被験物質を接触させない本発明のノックアウト非ヒト動物等」である場合には、本発明のノックアウト非ヒト動物等の動脈硬化の形成量を、対照における動脈硬化の形成量よりも低下（例えば、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、７０％以上、９０％以上又は１００％以上低下）させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。
【０１０３】
動脈硬化病変の組織像を指標とする場合には、次のようにスクリーニングを行う。動脈硬化病変の組織像は、マウスから摘出した大動脈組織標本において内皮細胞接着分子、マクロファージ・血管平滑筋マーカーによる染色を行う。そして、対照との比較結果に基づいて、各染色を減弱させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。例えば、対照が上記「被験物質を接触させたＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物等」である場合には、本発明のノックアウト非ヒト動物等の上記染色の程度を対照における染色の程度と同等とする又はそれよりも減衰（例えば、５％以上、１０％以上、１５％以上又は２０％以上減衰）させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。また、対照が上記「被験物質を接触させない本発明のノックアウト非ヒト動物等」である場合には、本発明のノックアウト非ヒト動物等の染色の程度を、対照における染色の程度よりも減衰（例えば、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、７０％以上、９０％以上又は１００％以上減衰）させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。上記「染色の程度」は、ＣＣＤカメラで病理組織像を撮像後、画像解析ソフトで数値化し定量評価することにより数値化することができる。
【０１０４】
動脈硬化を生じている臓器・組織の機能障害の程度を指標とする場合には、次のようにスクリーニングを行う。臓器・組織の機能障害としては、心臓ポンプ機能低下、腎機能低下、摘出血管弛緩能の低下、下肢血流低下と壊疽、大動脈瘤形成、脳障害による神経機能障害等が挙げられる。機能障害の程度は、例えば、心臓超音波と心臓圧・容積関係の測定；血液検査・尿検査・腎組織像による腎障害の評価；摘出血管の等尺収縮・弛緩；レーザードップラーによる下肢血流測定；生体におけるＣＴや摘出大動脈観察による大動脈携帯の評価；又は神経機能スコアによる神経機能評価やＣＴによる脳画像により求めることができる。そして、対照との比較結果に基づいて、心臓ポンプ機能低下を抑制、腎機能低下を抑制、摘出血管弛緩能の低下を抑制、下肢血流低下と壊疽を抑制、大動脈瘤形成を抑制又は脳障害による神経機能障害を抑制する候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。例えば、対照が上記「被験物質を接触させたＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物等」である場合には、本発明のノックアウト非ヒト動物等における、心臓ポンプ機能低下の程度、腎機能低下の程度、摘出血管弛緩能低下の程度、下肢血流低下と壊疽の程度、大動脈瘤形成の程度又は脳障害による神経機能障害の程度を、対照におけるものと同等とする又はそれよりも抑制（例えば、５％以上、１０％以上、１５％以上又は２０％以上抑制）させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。また、対照が上記「被験物質を接触させない本発明のノックアウト非ヒト動物等」である場合には、本発明のノックアウト非ヒト動物等における、心臓ポンプ機能低下の程度、腎機能低下の程度、摘出血管弛緩能低下の程度、下肢血流低下と壊疽の程度、大動脈瘤形成の程度又は脳障害による神経機能障害の程度を、対照におけるものよりも抑制（例えば、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、７０％以上、９０％以上又は１００％以上抑制）させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。上記「心臓ポンプ機能低下の程度」、「腎機能低下の程度」、「摘出血管弛緩能低下の程度」、「下肢血流低下と壊疽の程度」、「大動脈瘤形成の程度」及び「脳障害による神経機能障害の程度」は、それぞれ、次のようにして数値化することができる。すなわち、心臓ポンプ機能低下の程度としては心臓超音波法で計測される％ＦＳ又はＬＶＥＦ；腎機能低下の程度としては尿蛋白量、血中尿素窒素値又は血中クレアチニン値；摘出血管弛緩能低下の程度としては一酸化窒素供給体による血管弛緩；下肢血流低下と壊疽の程度としてはレーザードップラー血流計による血流測定又は壊疽発生頻度；大動脈瘤形成の程度としては摘出大動脈の肉眼的観察・測定による大動脈瘤の発生頻度又は大動脈径；及び脳障害による神経機能障害の程度については歩容（歩き方）を含むスコアの点数で、それぞれ定量評価できる。
【０１０５】
血液中の代用マーカーを指標とする場合には、次のようにスクリーニングを行う。血液中の代用マーカーとしては、高感度ＣＲＰ、ＰＴＸなどの炎症マーカー、ＩＬ６などの炎症性サイトカイン等が挙げられる。血液中の代用マーカーの量は、ＥＬＩＳＡやＬｕｍｉｎｅｘ ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ法により求めることができる。そして、対照との比較結果に基づいて、炎症マーカー量又は炎症性サイトカイン量を減少させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。例えば、対照が上記「被験物質を接触させたＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物等」である場合には、本発明のノックアウト非ヒト動物等の炎症マーカー量又は炎症性サイトカイン量を対照におけるものと同等とする又はそれよりも低下（例えば、５％以上、１０％以上、１５％以上又は２０％以上低下）させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。また、対照が上記「被験物質を接触させない本発明のノックアウト非ヒト動物等」である場合には、本発明のノックアウト非ヒト動物等の炎症マーカー量又は炎症性サイトカイン量を、対照におけるものよりも低下（例えば、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、７０％以上、９０％以上又は１００％以上低下）させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。
【０１０６】
内皮細胞における接着分子の発現を指標とする場合には、次のようにスクリーニングを行う。内皮細胞における接着分子としては、ＶＣＡＭ１、ＩＣＡＭ１等が挙げられる。内皮細胞における接着分子の発現は、培養内皮細胞をＴＮＦαの存在下で培養後、細胞表面に発現するＶＣＡＭ１をフローサイトメータ等で測定する。培養の際、培養液に対照あるいは候補物質を同時添加する。そして、対照との比較結果に基づいて、接着分子の発現を減少させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。例えば、対照が上記「被験物質を接触させたＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物等」である場合には、本発明のノックアウト非ヒト動物等の内皮細胞における接着分子の発現量を対照におけるものと同等とする又はそれよりも低下（例えば、５％以上、１０％以上、１５％以上又は２０％以上低下）させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。また、対照が上記「被験物質を接触させない本発明のノックアウト非ヒト動物等」である場合には、本発明のノックアウト非ヒト動物等の接着分子の発現量を、対照におけるものよりも低下（例えば、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、７０％以上、９０％以上又は１００％以上低下）させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。
【０１０７】
培養心筋細胞においてアンジオテンシンＩＩやβアドレナリン作動薬で誘導されるアミノ酸取り込み（例、３Ｈロイシンの取り込み）や細胞肥大（例、位相差顕微鏡で観察される細胞面積）を指標とする場合には、次のようにスクリーニングを行う。培養心筋細胞においてアンジオテンシンＩＩやβアドレナリン作動薬で誘導されて取り込まれるアミノ酸としては、ロイシン等が挙げられる。培養心筋細胞においてアンジオテンシンＩＩやβアドレナリン作動薬で誘導されるアミノ酸取り込みや細胞肥大は、それぞれ、３Ｈロイシンを添加した培養液で心筋細胞を培養し、一定時間後に心筋細胞中の３Ｈロイシンを液体シンチレーションカウンターで計測することで、細胞肥大にともなうアミノ酸取り込みを評価する。心筋細胞サイズは、培養心筋細胞を位相差顕微鏡で観察・撮像後、画像解析ソフトで細胞面積を測定する。心筋細胞肥大により、アミノ酸取り込みと心筋細胞面積は増加することにより求めることができる。そして、対照との比較結果に基づいて、アミノ酸取り込みと心筋細胞面積を減少させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。例えば、対照が上記「被験物質を接触させたＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物等」である場合には、本発明のノックアウト非ヒト動物等の上記アミノ酸取り込み量又は上記細胞肥大の程度を対照におけるものと同等とする又はそれよりも低下（例えば、５％以上、１０％以上、１５％以上又は２０％以上低下）させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。また、対照が上記「被験物質を接触させない本発明のノックアウト非ヒト動物等」である場合には、本発明のノックアウト非ヒト動物等の上記アミノ酸取り込み量又は上記細胞肥大の程度を、対照におけるものよりも低下（例えば、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、７０％以上、９０％以上又は１００％以上低下）させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。
【０１０８】
マクロファージのサイトカイン産生・蛋白分解酵素産生・変性脂質取り込みを指標とする場合には、次のようにスクリーニングを行う。マクロファージのサイトカインとしては、インターフェロンガンマ、ＩＬ６、ＩＬ１２、ＩＬ１β、ＴＮＦα等が挙げられる。マクロファージの蛋白分解酵素としては、マトリックスメタロプロテアーゼ等が挙げられる。マクロファージに取り込まれる変性脂質としては、酸化ＬＤＬ、アセチルＬＤＬ等が挙げられる。マクロファージのサイトカイン産生量・蛋白分解酵素産生量・変性脂質取り込み量は、それぞれ、次のようにして求めることができる。すなわち、サイトカイン産生量は、培養マクロファージで、一定時間培養した後の培地中のサイトカイン濃度をＥＬＩＳＡやルミネックスマイクロビーズ法で測定することにより求めることができる。蛋白分解酵素産生量は、培養マクロファージからＲＮＡを抽出し、マトリックスメタロプロテアーゼの遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲ法で定量化することにより求めることができる。アセチルＬＤＬの取り込み量は、後述の実施例に記載の方法により求めることができる。そして、対照との比較結果に基づいて、サイトカイン産生、マトリックスメタロプロテアーゼ発現又はアセチルＬＤＬ取り込みを減少させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。例えば、対照が上記「被験物質を接触させたＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物等」である場合には、本発明のノックアウト非ヒト動物等の上記サイトカイン産生量、上記蛋白分解酵素産生量又は変性脂質取り込み量を対照におけるものと同等とする又はそれよりも低下（例えば、５％以上、１０％以上、１５％以上又は２０％以上低下）させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。また、対照が上記「被験物質を接触させない本発明のノックアウト非ヒト動物等」である場合には、本発明のノックアウト非ヒト動物等の上記サイトカイン産生量、上記蛋白分解酵素産生量又は変性脂質取り込み量を、対照におけるものよりも低下（例えば、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、７０％以上、９０％以上又は１００％以上低下）させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。
【０１０９】
Ｔリンパ球のサイトカイン（例、ＩＬ６、ＩＬ１２等の炎症性サイトカイン）の産生や遊走を指標とする場合には、次のようにスクリーニングを行う。Ｔリンパ球のサイトカインとしては、ＩＬ６、ＩＬ１２、インターフェロンガンマ、ＴＮＦα等の炎症性サイトカイン等が挙げられる。Ｔリンパ球のサイトカインの産生や遊走の程度は、それぞれ、次のようにして求めることができる。すなわち、サイトカインの産生量は、Ｔリンパ球を培養し一定時間後の培養上清中のサイトカイン濃度をＥＬＩＳＡやルミネックスマイクロビーズ法で測定することにより求めることができる。遊走の程度は、トランスウエルを用い、ケモカインで誘導されるチャンバー間の移動細胞数を計測することにより求めることができる。そして、対照との比較結果に基づいて、サイトカイン産生量と遊走の程度を抑制する候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。例えば、対照が上記「被験物質を接触させたＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物等」である場合には、本発明のノックアウト非ヒト動物等の上記サイトカイン産生量又は上記遊走の程度を、対照におけるものと同等とする又はそれよりも低下（例えば、５％以上、１０％以上、１５％以上又は２０％以上低下）させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。また、対照が上記「被験物質を接触させない本発明のノックアウト非ヒト動物等」である場合には、本発明のノックアウト非ヒト動物等の上記サイトカイン産生量又は上記遊走の程度を、対照におけるものよりも低下（例えば、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、７０％以上、９０％以上又は１００％以上低下）させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。
【０１１０】
筋細胞の生理活性物質産生（例、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ等の成長因子・ペプチド産生）を指標とする場合には、次のようにスクリーニングを行う。筋細胞の生理活性物質としては、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ等の成長因子・ペプチド等が挙げられる。筋細胞の生理活性物質産生の程度は、それぞれ、一定時間培養した後、培養上清中の生理活性物質をＥＬＩＳＡで測定すること、細胞から抽出したＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲ法で遺伝子発現を検討することにより求めることができる。そして、対照との比較結果に基づいて、生理活性物質の遺伝子発現や産生を減少させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。例えば、対照が上記「被験物質を接触させたＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物等」である場合には、本発明のノックアウト非ヒト動物等の上記生理活性物質産生量を、対照におけるものと同等とする又はそれよりも低下（例えば、５％以上、１０％以上、１５％以上又は２０％以上低下）させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。また、対照が上記「被験物質を接触させない本発明のノックアウト非ヒト動物等」である場合には、本発明のノックアウト非ヒト動物等の上記生理活性物質産生量を、対照におけるものよりも低下（例えば、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、７０％以上、９０％以上又は１００％以上低下）させる候補物質を、動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬として選択する。
【０１１１】
６．ＩＬ２７シグナル活性化剤のスクリーニング方法
本発明は、本発明のノックアウト若しくはノックダウン非ヒト動物の一部、又は本発明のノックアウト若しくはノックダウン細胞（以下、「本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等」という場合がある。）に、ＩＬ２７シグナル活性化剤の候補物質（被験物質）を接触することにより、ＩＬ２７シグナル活性化剤をスクリーニングすることができる。
【０１１２】
本スクリーニング方法においては、より具体的には、本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等に薬物候補物質を接触させ、前記候補物質を接触させた本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等において標的とするＩＬ２７シグナル活性化状態と相関関係を有する指標を測定し、対照と比較し、この比較結果に基づいて、ＩＬ２７シグナル活性化を亢進させるか否かを確認することで、候補物質をスクリーニングすることができる。
【０１１３】
本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等を候補物質で接触させる方法として、例えば、本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等と候補物質とを同一の反応系又は培養系に存在させる方法を用いることができる。より具体的には、本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等の培養容器に候補物質を添加すること、本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等と候補物質とを混合すること、本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等を候補物質の存在下で培養すること等が挙げられる。また、接触させる候補物質量は、投与方法、候補物質の性質などにあわせて適宜選択することができる。
【０１１４】
ＩＬ２７シグナル活性化状態と相関関係を有する指標としては、本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等がマクロファージ又はマクロファージ由来細胞である場合には、変性脂質の取り込み量、サイトカイン（例、ＩＬ６、ＩＬ１２等の炎症性サイトカイン）の産生量、マトリックスプロテアーゼ（ＭＭＰ）（例、ＭＭＰ９等）遺伝子発現量、接着分子の発現量等を挙げることができる。本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等が血管内細胞又は血管内細胞由来細胞である場合には、生存細胞数、細胞の増殖量、遊走の程度、白血球との接着量等を挙げることができる。本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等が骨髄由来細胞である場合にはサイトカイン・ケモカインの産生量等を、脂肪組織由来細胞である場合には細胞形態、分化マーカー（アディポネクチン、ＰＰＡＲγ、Ｃ／ＥＢＰαおよびａＰ２等）の発現量等を、リンパ球の場合はサイトカイン産生量を挙げることができる。
【０１１５】
ここで、上記各指標は、公知の方法又はそれに準ずる方法で行うことができる。以下に、各指標の測定方法を具体的に示すが、これらに限定されない。
変性脂質の取り込み量の測定は、Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ＪＮＫ２ ｆｏｒ ｓｃａｖｅｎｇｅｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｆｏａｍ ｃｅｌｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ａｔｈｅｒｏｇｅｎｅｓｉｓ． Ｒｉｃｃｉ Ｒ， Ｓｕｍａｒａ Ｇ， Ｓｕｍａｒａ Ｉ， Ｒｏｚｅｎｂｅｒｇ Ｉ， Ｋｕｒｒｅｒ Ｍ， Ａｋｈｍｅｄｏｖ Ａ， Ｈｅｒｓｂｅｒｇｅｒ Ｍ， Ｅｒｉｋｓｓｏｎ Ｕ， Ｅｂｅｒｌｉ ＦＲ， Ｂｅｃｈｅｒ Ｂ， Ｂｏｒｅｎ Ｊ， Ｃｈｅｎ Ｍ， Ｃｙｂｕｌｓｋｙ ＭＩ， Ｍｏｏｒｅ ＫＪ， Ｆｒｅｅｍａｎ ＭＷ， Ｗａｇｎｅｒ ＥＦ， Ｍａｔｔｅｒ ＣＭ， Ｌｕｓｃｈｅｒ ＴＦ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２００４；３０６：１５５８−１５５６１．に記載の方法又はそれに準ずる方法で行うことができる。サイトカイン・ケモカインの産生量の測定は、Ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｕｍｏｒ ｍｏｄｅｌ： ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｋｅｙｅｓ Ｋ， Ｃｏｘ Ｋ， Ｔｒｅａｄｗａｙ Ｐ， Ｍａｎｎ Ｌ， Ｓｈｉｈ Ｃ， Ｆａｕｌ ＭＭ， Ｔｅｉｃｈｅｒ ＢＡ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００２；６２：５５９７−５６０２．に記載の方法又はそれに準ずる方法で行うことができる。ＭＭＰ遺伝子発現量の測定は、Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ２ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｓ ａｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｔｏ ｂｌｏｃｋ ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ． Ｐａｖｌｏｖｉｃ Ｓ， Ｄｕ Ｂ， Ｓａｋａｍｏｔｏ Ｋ， Ｋｈａｎ ＫＭ， Ｎａｔａｒａｊａｎ Ｃ， Ｂｒｅｙｅｒ ＲＭ， Ｄａｎｎｅｎｂｅｒｇ ＡＪ， Ｆａｌｃｏｎｅ ＤＪ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２００６ Ｆｅｂ １０；２８１（６）：３３２１−３３２８．に記載の方法又はそれに準ずる方法で行うことができる。接着分子の発現量の測定は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ ａｎｄ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅａｓ ａｌｐｈａ−ｔｏｘｉｎ ｐｏｔｅｎｔｌｙ ｉｎｄｕｃｅ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｔｏ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ． Ｋｒｕｌｌ Ｍ， Ｄｏｌｄ Ｃ， Ｈｉｐｐｅｎｓｔｉｅｌ Ｓ， Ｒｏｓｓｅａｕ Ｓ， Ｌｏｈｍｅｙｅｒ Ｊ， Ｓｕｔｔｏｒｐ Ｎ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９６ ；１５７：４１３３−４１４０．に記載の方法又はそれに準ずる方法で行うことができる。生存細胞数及び細胞の増殖量の測定は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｐｉｆａｎｏｉ ａｍａｓｔｉｇｏｔｅｓ ａｖｏｉｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｂｙ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｈｅｍｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ． Ｐｈａｍ ＮＫ， Ｍｏｕｒｉｚ Ｊ， Ｋｉｍａ ＰＥ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ． ２００５；７３：８３２２−８３３３．に記載の方法又はそれに準ずる方法で行うことができる。細胞の遊走の程度の測定は、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ ｏｒ ｉｒｏｎ ｏｘｉｄｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｕｐｔａｋｅ ｂｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｆｒｏｍ ｌａｂｅｌｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ： ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｐａｗｅｌｃｚｙｋ Ｅ， Ａｒｂａｂ ＡＳ， Ｃｈａｕｄｈｒｙ Ａ， Ｂａｌａｋｕｍａｒａｎ Ａ， Ｒｏｂｅｙ ＰＧ， Ｆｒａｎｋ ＪＡ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ． ２００８；２６：１３６６−１３７５．に記載の方法又はそれに準ずる方法で行うことができる。白血球との接着量の測定は、Ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｒｅｄｕｃｅｓ ｍｏｎｏｃｙｔｅ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｔｏ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｉｎｏｕｅ Ｋ， Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｍ， Ｙａｎｏ Ｋ， Ｍｉｕｒａ Ｍ， Ｉｚｕｍｉ Ａ， Ｍａｔａｋｉ Ｃ， Ｄｏｉ Ｔ， Ｈａｍａｋｕｂｏ Ｔ， Ｒｅｉｄ ＰＣ， Ｈｕｍｅ ＤＡ， Ｙｏｓｈｉｄａ Ｍ， Ａｉｒｄ ＷＣ， Ｋｏｄａｍａ Ｔ， Ｍｉｎａｍｉ Ｔ． Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ． ２００６；２６：２６５２−２６５９．に記載の方法又はそれに準ずる方法で行うことができる。細胞形態の測定は、Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−１ ｉｎ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅｓ ｃａｕｓｅｓ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ａｎｄ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ． Ｋａｍｅｉ Ｎ， Ｔｏｂｅ Ｋ， Ｓｕｚｕｋｉ Ｒ， Ｏｈｓｕｇｉ Ｍ， Ｗａｔａｎａｂｅ Ｔ， Ｋｕｂｏｔａ Ｎ， Ｏｈｔｓｕｋａ−Ｋｏｗａｔａｒｉ Ｎ， Ｋｕｍａｇａｉ Ｋ， Ｓａｋａｍｏｔｏ Ｋ， Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｍ， Ｙａｍａｕｃｈｉ Ｔ， Ｕｅｋｉ Ｋ， Ｏｉｓｈｉ Ｙ， Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ Ｓ， Ｍａｎａｂｅ Ｉ， Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ Ｈ， Ｏｈｎｉｓｈｉ Ｙ， Ｏｇａｔａ Ｈ， Ｔｏｋｕｙａｍａ Ｋ， Ｔｓｕｎｏｄａ Ｍ， Ｉｄｅ Ｔ， Ｍｕｒａｋａｍｉ Ｋ， Ｎａｇａｉ Ｒ， Ｋａｄｏｗａｋｉ Ｔ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２００６；２８１：２６６０２−２６６１４．に記載の方法又はそれに準ずる方法で行うことができる。分化マーカーの発現量は、Ｗｈｉｔｅ ｆａｔ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｒｅｓｉｄｅ ｉｎ ｔｈｅ ａｄｉｐｏｓｅ ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ． Ｔａｎｇ Ｗ， Ｚｅｖｅ Ｄ， Ｓｕｈ ＪＭ， Ｂｏｓｎａｋｏｖｓｋｉ Ｄ， Ｋｙｂａ Ｍ， Ｈａｍｍｅｒ ＲＥ， Ｔａｌｌｑｕｉｓｔ ＭＤ， Ｇｒａｆｆ ＪＭ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２００８；３２２：５８３−５８６．に記載の方法又はそれに準ずる方法で行うことができる。
【０１１６】
比較のための対照は、被験物質を接触させない野生型非ヒト動物の一部又は野生型細胞（以下、「野生型非ヒト動物の一部等」とする。）、被験物質を接触させた野生型非ヒト動物の一部等、ＩＬ２７シグナル活性化作用を有することが分かっている物質（既知のＩＬ２７シグナル活性化剤等）を接触させた野生型非ヒト動物の一部等、被験物質を接触させないＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物の一部又はＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト細胞（以下、「ＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物の一部等」とする。）、被験物質を接触させたＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物の一部等、既知のＩＬ２７シグナル活性化剤等を接触させたＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物の一部等、被験物質を接触させない本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等、既知のＩＬ２７シグナル活性化剤等を接触させた本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等のいずれをも意味し、目的に応じて少なくとも１つの対照を適宜選択することができる。
【０１１７】
上記に「対照」として例示したＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物の一部等は、本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等と異なり、ＩＬ２７シグナルが正常である。このＩＬ２７シグナルが正常なＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物の一部等と同程度又はそれよりも亢進するように、ＩＬ２７シグナルが不活性な本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等のＩＬ２７シグナルを活性化することができる物質は、ＩＬ２７シグナルに選択的に働くＩＬ２７シグナル活性化剤となり得る。したがって、例えば、対照がＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物の一部等の場合には、候補物質を接触させた本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等における変性脂質の取り込み量、サイトカインの産生量及びマトリックスプロテアーゼ（ＭＭＰ）遺伝子発現量（以下、「変性脂質の取り込み量等」という。）を測定し、当該測定された変性脂質の取り込み量等が、対照における変性脂質の取り込み量等と同等になったとき、又はそれよりも改善したときは、前記候補物質を、ＩＬ２７シグナル活性化剤として選択することができる。ここで「改善」とは、対照と比較して、例えば、本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等における変性脂質の取り込み量が低下すること、サイトカインの産生量が低下すること、又はＭＭＰ遺伝子発現量が低下することを意味する。そして、このように選択したＩＬ２７シグナル活性化剤は、ＩＬ２７シグナルに選択的に作用するＩＬ２７シグナル活性化剤であり得る。
【０１１８】
候補物質としては、前記「動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬のスクリーニング方法」の項で説明したものと同様のものを挙げることができる。
【０１１９】
例えば、ある候補物質を投与した場合に、ＩＬ２７シグナル活性化の状態が亢進されたことが確認できる結果が得られれば、用いた候補物質を、ＩＬ２７シグナル活性化剤として選択することが可能である。より、具体的には、対照が上記「被験物質を接触させたＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト非ヒト動物の一部等」である場合には、本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等における、マクロファージ又はマクロファージ由来細胞（以下、「マクロファージ等」とする）の変性脂質の取り込み量、マクロファージ等のサイトカイン産生量、マクロファージ等のＭＭＰ遺伝子発現量、マクロファージ等の接着分子の発現量、血管内細胞又は血管内細胞由来細胞（以下、「血管内細胞等」とする。）の生存細胞数、血管内細胞等の細胞の増殖量、血管内細胞等の遊走の程度、血管内細胞等の白血球との接着量、骨髄由来細胞のサイトカイン・ケモカインの産生量、脂肪組織由来細胞の細胞形態の程度、脂肪組織由来細胞の分化マーカーの発現量、又はリンパ球のサイトカイン産生量を、対照におけるものと同等とする又はそれよりも低下（例えば、５％以上、１０％以上、１５％以上又は２０％以上低下）させる候補物質を、ＩＬ２７シグナル活性化剤として選択する。また、対照が上記「被験物質を接触させない本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等」である場合には、本発明のノックアウト非ヒト動物の一部等における、上記マクロファージ又はマクロファージ由来細胞（以下、「マクロファージ等」とする）の変性脂質の取り込み量、マクロファージ等のサイトカイン産生量、マクロファージ等のＭＭＰ遺伝子発現量、マクロファージ等の接着分子の発現量、血管内細胞又は血管内細胞由来細胞（以下、「血管内細胞等」とする。）の生存細胞数、血管内細胞等の細胞の増殖量、血管内細胞等の遊走の程度、血管内細胞等の白血球との接着量、骨髄由来細胞のサイトカイン・ケモカインの産生量、脂肪組織由来細胞の細胞形態の程度、脂肪組織由来細胞の分化マーカーの発現量、又はリンパ球のサイトカイン産生量を、対照におけるものよりも低下（例えば、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、７０％以上、９０％以上又は１００％以上低下）させる候補物質を、ＩＬ２７シグナル活性化剤として選択する。
【０１２０】
発明を実施するための最良の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【実施例】
【０１２１】
実施例１：ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子ノックアウトマウスの作製
（１）ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子ノックアウトＥＳ細胞の作製
Ｙｏｓｈｉｄａ， Ｈ．， Ｈａｍａｎｏ， Ｓ．， Ｓｅｎａｌｄｉ， Ｇ．， Ｃｏｖｅｙ， Ｔ．， Ｆａｇｇｉｏｎｉ， Ｒ．， Ｍｕ， Ｓ．， Ｘｉａ， Ｍ．， Ｗａｋｅｈａｍ， Ａ．Ｃ．， Ｎｉｓｈｉｎａ， Ｈ．， Ｐｏｔｔｅｒ， Ｊ．， Ｓａｒｉｓ， Ｃ．Ｊ．， Ｍａｋ， Ｔ．Ｗ． （２００１） ＷＳＸ−１ Ｉｓ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈ１ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｌ． ｍａｊｏｒ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １５， ５６９−７８．に記載の方法に準じて、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子ノックアウトＥＳ細胞を作製した。
すなわち、マウスＩＬ２７−ｐ２８遺伝子の第１〜第４エクソンをｐｇｋプロモーター配列に接続されたネオマイシン耐性遺伝子で置換できる構造を持つターゲティングベクターを作成し、このターゲティングベクターをエレクトロポレーション法により、ＥＳ細胞であるＥ１４細胞に導入した。遺伝子導入細胞の選別のため、ネオマイシン存在下で培養することにより耐性を獲得した細胞クローンを得た後、ＰＣＲ法により、正しく相同組み換えが生じＩＬ２７−ｐ２８遺伝子第１〜第４エクソンがネオマイシン耐性遺伝子で置換された細胞クローンを選別し、さらに、サザンブロット法により相同組み換えの確認を行った。
【０１２２】
（２）ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子欠損キメラマウスの作製
ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子欠損キメラマウスを次のように作製した。すなわち、実施例１（１）により得られたＩＬ２７−ｐ２８遺伝子の片側アリール（片側遺伝子）が破壊されたＥＳ細胞をＣ５７ＢＬ６マウス由来の杯盤胞に注入、これを偽妊娠マウスに移植することにより、ＥＳ細胞及びＣ５７ＢＬ６マウス由来の細胞からなるキメラマウスを得た。毛色及びサザンブロット法によりＩＬ２７−ｐ２８遺伝子に変異を持つＥＳ細胞の寄与が多いと推測される雄個体を選別した。
【０１２３】
（３）ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子ヘテロノックアウトマウスの作製
ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子ヘテロノックアウトマウスを次のように作製した。すなわち、実施例１（２）により得られたキメラマウスをＣ５７ＢＬ６雌マウスと交配することにより仔を得て、毛色によりＩＬ２７−ｐ２８遺伝子に変異を持つＥＳ細胞由来の仔を選別した。さらにこれらの仔の体組織からゲノムＤＮＡを抽出しＰＣＲ法及びサザンブロット法によりＩＬ２７−ｐ２８遺伝子の片側アリルに変異を持つマウスを選別しヘテロノックアウトマウスを得た。
【０１２４】
（４）ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子ホモノックアウトマウスの作製
ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子ホモノックアウトマウスを次のように作製した。すなわち、実施例１（３）により得られたヘテロノックアウトマウスを野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスと交配し、その仔からヘテロノックアウトマウスを選別、この過程を６回繰り返し、Ｃ５７ＢＬ／６の遺伝子背景を持つＩＬ２７−ｐ２８遺伝子ヘテロノックアウトマウスを作成した。この雄雌を交配することにより仔を得て、これらの仔の体組織からゲノムＤＮＡを抽出しＰＣＲ法及びサザンブロット法によりＩＬ２７−ｐ２８遺伝子の両側アリルに変異を持つマウスを選別しホモノックアウトマウスを得た。
【０１２５】
実施例２：ＬＤＬＲ／ＥＢＩ−３遺伝子ダブルノックアウトマウスの作出
本ダブルノックアウトマウスの作出にあたり、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）遺伝子欠損雄ホモ接合体マウスは、ジャクソンラボラトリー社より入手した（カタログ番号００７０６８などに記載）。また、ＥＢＩ−３遺伝子欠損雌ホモ接合体マウスは、本発明者らの研究室で以前作製したものを用いた（Ｉｇａｗａ， Ｔ．， Ｎａｋａｓｈｉｍａ， Ｈ．， Ｓａｄａｎａｇａ， Ａ．， Ｍａｓｕｔａｎｉ， Ｋ．， Ｍｉｙａｋｅ， Ｋ．， Ｓｈｉｍｉｚｕ， Ｓ．， Ｔａｋｅｄａ， Ａ．， Ｈａｍａｎｏ， Ｓ．， Ｙｏｓｈｉｄａ， Ｈ． （２００９） Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ＥＢＶ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｇｅｎｅ ３ （ＥＢＩ３） ｉｎ ＭＲＬ／ｌｐｒ ｍｉｃｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ ｓｉａｌａｄｅｎｉｔｉｓ． Ｍｏｄ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ １９， ３３−４１．）。
【０１２６】
これらＬＤＬＲ遺伝子欠損雄ホモ接合体マウス（ＬＤＬＲ−／−）とＥＢＩ−３遺伝子欠損雌ホモ接合体マウス（ＥＢＩ−３−／−）のかけ合わせで、Ｆ１ヘテロ接合体欠損マウス（ＬＤＬＲ＋／−／ＥＢＩ−３＋／−）を作出した。次にこのＦ１ヘテロ欠損マウスどうしのかけ合わせを行い、得られたＦ２マウスのＰＣＲ判定において、ＬＤＬＲ／ＥＢＩ−３遺伝子ダブルノックアウトマウス（ＬＤＬＲ−／−／ＥＢＩ−３−／−）を選抜した。以後は、このダブルノックアウトマウスの各個体どうしのかけ合わせで、ＬＤＬＲ／ＥＢＩ−３遺伝子ダブルノックアウトマウスの生産を行った。
【０１２７】
実施例３：ＬＤＬＲ／ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子ダブルノックアウトマウスの作出
本ダブルノックアウトマウスの作出にあたり、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）遺伝子欠損雄ホモ接合体マウスは、ジャクソンラボラトリー社より入手した（カタログ番号００７０６８などに記載）。また、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子欠損雌ホモ接合体マウスは、実施例１に記載の方法により作製したものを利用した。
【０１２８】
ＬＤＬＲ遺伝子欠損雄ホモ接合体マウス（ＬＤＬＲ−／−）とＩＬ２７−ｐ２８遺伝子欠損雌ホモ接合体マウス（ＩＬ２７−ｐ２８−／−）のかけ合わせで、Ｆ１ヘテロ接合体欠損マウス（ＬＤＬＲ＋／−／ＩＬ２７−ｐ２８＋／−）を作出した。次にこのＦ１ヘテロ欠損マウスどうしのかけ合わせを行い、得られたＦ２マウスのＰＣＲ判定において、ＬＤＬＲ／ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子ダブルノックアウトマウス（ＬＤＬＲ−／−／ＩＬ２７−ｐ２８−／−）を選抜した。以後は、このダブルノックアウトマウスの各個体どうしのかけ合わせで、ＬＤＬＲ／ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子ダブルノックアウトマウスの生産を行った。
【０１２９】
実施例４：ＬＤＬＲ／ＷＳＸ−１遺伝子ダブルノックアウトマウスの作出
本ダブルノックアウトマウスの作出にあたり、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）遺伝子欠損雄ホモ接合体マウスは、ジャクソンラボラトリー社より入手した（カタログ番号００７０６８などに記載）。また、ＷＳＸ−１遺伝子欠損雌ホモ接合体マウスは、アムジェン社より分与された（Ｙｏｓｈｉｄａ， Ｈ．， Ｈａｍａｎｏ， Ｓ．， Ｓｅｎａｌｄｉ， Ｇ．， Ｃｏｖｅｙ， Ｔ．， Ｆａｇｇｉｏｎｉ， Ｒ．， Ｍｕ， Ｓ．， Ｘｉａ， Ｍ．， Ｗａｋｅｈａｍ， Ａ．Ｃ．， Ｎｉｓｈｉｎａ， Ｈ．， Ｐｏｔｔｅｒ， Ｊ．， Ｓａｒｉｓ， Ｃ．Ｊ．， Ｍａｋ， Ｔ．Ｗ． （２００１） ＷＳＸ−１ Ｉｓ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈ１ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｌ． ｍａｊｏｒ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １５， ５６９−７８．）。
【０１３０】
ＬＤＬＲ遺伝子欠損雄ホモ接合体マウス（ＬＤＬＲ−／−）とＷＳＸ−１遺伝子欠損雌ホモ接合体マウス（ＷＳＸ−１−／−）のかけ合わせで、Ｆ１ヘテロ接合体欠損マウス（ＬＤＬＲ＋／−／ＷＳＸ−１＋／−）を作出した。次にこのＦ１ヘテロ欠損マウスどうしのかけ合わせを行い、得られたＦ２マウスのＰＣＲ判定において、ＬＤＬＲ／ＷＳＸ−１遺伝子ダブルノックアウトマウス（ＬＤＬＲ−／−／ＷＳＸ−１−／−）を選抜した。以後は、このダブルノックアウトマウスの各個体どうしのかけ合わせで、ＬＤＬＲ／ＷＳＸ−１遺伝子ダブルノックアウトマウスの生産を行った。
【０１３１】
実施例５：動脈硬化病変の形成の定量・比較
実施例２及び４に記載の方法で作出した各ダブルノックアウトマウスに高脂肪食を負荷した後、動脈硬化性病変の形成を、病理組織学的かつ定量的に比較検討した。具体的には、ＬＤＬＲノックアウトマウス（ジャクソンラボラトリー社）及び各ダブルノックアウトマウス（各１０匹）について、８週齢から１６週間高コレステロール食を投与した後に大動脈を摘出した。ここで、高コレステロール食として、１５．８％ 脂肪・１．２５％ コレステロール含有高コレステロール食（ハーラン社）を用い、８週齢から２４週齢まで投与した。また、大動脈の摘出は、常法に従い、起始部から腸骨動脈分岐部まで大動脈を、約５ｃｍの長さで切り出すことにより行った。そして、摘出した大動脈の内膜側を上に展開し、オイルレッドＯで染色した。ＣＣＤカメラ（Ｚｅｉｓｓ社）で撮像後、オイルレッドＯで染色される動脈硬化巣の面積の総和と、大動脈の内膜側総面積を定量した。動脈硬化巣の面積の総和を大動脈の内膜側面積で除し、動脈硬化巣の大動脈の内膜に占める割合を算出した。
【０１３２】
その結果を、図１及び図２に示す。
図１は、高コレステロール食を１２週間（ａ）１６週間（ｂ）投与した各群マウスの大動脈内膜側の代表例を示す写真である。図１では、ＬＤＬＲ−／−に比して、ＬＤＬＲ−／−ＥＢＩ３−／−及びＬＤＬＲ−／−ＷＳＸ−１−／−の大動脈内側はオレンジ色に染色された範囲が広い。このことは、ＬＤＬＲ−／−に比してＬＤＬＲ−／−ＥＢＩ３−／−及びＬＤＬＲ−／−ＷＳＸ−１−／−において動脈硬化病変の形成量が増加する傾向にあることを示す。
【０１３３】
図２は、動脈硬化巣の大動脈に占める割合を定量評価したものである。図２に示されているように、ＬＤＬＲ／ＥＢＩ−３遺伝子ダブルノックアウトマウス及びＬＤＬＲ／ＷＳＸ−１遺伝子ダブルノックアウトマウスにおいて、ＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトマウスと比較して動脈硬化病変の形成が有意に増加していることが分かった。
【０１３４】
実施例６：大動脈瘤の発生頻度の比較
ＬＤＬＲノックアウトマウス及び、実施例２〜４に記載の方法で作出した各ダブルノックアウトマウスに高脂肪食投与下、浸透圧ポンプによるアンジオテンシンＩＩ投与で誘発される大動脈瘤の発生頻度を、測定した。具体的には、実施例５と同様に８週齢から１６週間高コレステロール食を投与した後に、高コレステロール食投与下に浸透圧ポンプでアンジオテンシンＩＩあるいは対照溶媒を４週間投与した。ここで、１５．８％ 脂肪・１．２５％ コレステロール含有高コレステロール食（ハーラン社）を用い、８週齢から２４週齢まで投与した。また、アンジオテンシンＩＩ（シグマ社）は、浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｔ社）を用い、２０週齢から２４週齢まで投与した。そして、大動脈を摘出し、肉眼的に大動脈の瘤状拡張を腎動脈分岐部に認めるものを大動脈瘤と認定した。そして、各群マウス１０頭中大動脈瘤を形成した頭数を算出して、各群マウスの大動脈瘤の発生頻度とした。
【０１３５】
その結果を以下の表１に示す。
【０１３６】
【表１】
【０１３７】
表１に示されているように、ＬＤＬＲ／ＥＢＩ−３遺伝子ダブルノックアウトマウス、及びＬＤＬＲ／ＷＳＸ−１遺伝子ダブルノックアウトマウスにおいて、ＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトマウスと比較して大動脈瘤の発生頻度が高い傾向になることが分かった。
【０１３８】
実施例７：培養マクロファージ活性化評価
（１）腹腔内マクロファージの培養
実施例２及び４に記載の方法で作出した各ダブルノックアウトマウスから、腹腔内マクロファージを得て、培養した。具体的には、ＬＤＬＲノックアウトマウス（ジャクソンラボラトリー社）及び各ダブルノックアウトマウス（各１０匹）について、１００ｍｇのペプトン（インビトロゲン社製）を腹腔内に投与した。へプトン投与から２日後に各マウスについて脱血し、腹腔内をＰＢＳ（シグマ社製）で洗浄し、注射器で吸引することにより腹腔内マクロファージを採取した。腹腔内からの採取物を遠心分離器にかけ、採取物からマクロファージを回収した後、その細胞を培養皿内で３７℃、５％ＣＯ２存在下にて培養した。この時の培地の組成は、次の通りである。ＤＭＥＭ培地に最終濃度１０％となるよう牛胎児血清を加えた。
【０１３９】
（２）アセチルＬＤＬの取り込みの評価
上記実施例７（１）にて得たＬＤＬＲノックアウトマウス及び各ダブルノックアウトマウス由来のマクロファージについて、蛍光ラベルした変性脂質（アセチルＬＤＬ）の取り込みを、コンフォーカル顕微鏡画像を用いて定量化した。具体的には、各マウスの腹腔内マクロファージを前記培養条件にて培養皿で１６時間培養した。その後、ＤｉＩでラベルしたアセチルＬＤＬ（バイオメデイカルテクノロジー社製）を培養皿に添加し、４時間後にＴＯＰＲＯ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にて核染色を行った。その後、ホルマリンにより細胞を固定し、固定した細胞をコンフォーカル顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ社製）で観察・撮像した。一定視野内の細胞に取り込まれたＤｉＩ蛍光強度を、ＮＩＨイメージ（米国ＮＩＨが配布している無料ソフト）により定量した。
【０１４０】
その結果を図３及び図４に示す。
図３は、各群マウスの腹腔内マクロファージによるＤｉＩラベルアセチルＬＤＬの取り込みの様子を示すコンフォーカル顕微鏡像（代表例）である。図３では、ＬＤＬＲ−／−に比して、ＬＤＬＲ−／−ＥＢＩ３−／−及びＬＤＬＲ−／−ＷＳＸ−１−／−の腹腔内マクロファージはＤｉＩ（赤色）で強く染色されている。このことは、ＬＤＬＲ−／−に比してＬＤＬＲ−／−ＥＢＩ３−／−及びＬＤＬＲ−／−ＷＳＸ−１−／−の腹腔内マクロファージに取り込まれたアセチルＬＤＬの量が多い傾向にあることを示す。
【０１４１】
図４は、腹腔内マクロファージに取り込まれたアセチルＬＤＬの量を定量評価したものである。図４に示されているように、ダブルノックアウトマウス由来マクロファージによるアセチルＬＤＬの取り込みは、ＬＤＬＲノックアウトマウス由来の腹腔内マクロファージと比較して、有意に増加した。
【０１４２】
次に、ＬＤＬＲ／ＥＢＩ−３遺伝子ダブルノックアウトマウス由来マクロファージ及びＬＤＬ／ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子ダブルノックアウトマウス由来マクロファージについて、リコンビナントＩＬ２７を投与した場合のアセチルＬＤＬの取り込み量を評価する。具体的には、各マウスの腹腔マクロファージを前記培養条件にて培養皿中で１６時間培養する。その後、培地中にＤｉＩラベルしたアセチルＬＤＬを添加し４時間培養し、培地を除去した後にホルマリンで細胞を固定し、コンフォーカル顕微鏡で細胞像を取得し、細胞内に取り込まれたＤｉＩ色素量をＮＩＨイメージ（米国ＮＩＨが配布している無料ソフト）により定量する。
ここで、リコンビナントＩＬ２７は、Ｐｆｌａｎｚ， Ｓ．， Ｊ． Ｃ． Ｔｉｍａｎｓ， Ｊ． Ｃｈｅｕｎｇ， Ｒ． Ｒｏｓａｌｅｓ， Ｈ． Ｋａｎｚｌｅｒ， Ｊ． Ｇｉｌｂｅｒｔ， Ｌ． Ｈｉｂｂｅｒｔ， Ｔ． Ｃｈｕｒａｋｏｖａ， Ｍ． Ｔｒａｖｉｓ， Ｅ． Ｖａｉｓｂｅｒｇ， Ｗ． Ｍ． Ｂｌｕｍｅｎｓｃｈｅｉｎ， Ｊ． Ｄ． Ｍａｔｔｓｏｎ， Ｊ． Ｌ． Ｗａｇｎｅｒ， Ｗ． Ｔｏ， Ｓ． Ｚｕｒａｗｓｋｉ， Ｔ． Ｋ． ＭｃＣｌａｎａｈａｎ， Ｄ． Ｍ． Ｇｏｒｍａｎ， Ｊ． Ｆ． Ｂａｚａｎ， Ｒ． ｄｅ Ｗａａｌ Ｍａｌｅｆｙｔ， Ｄ． Ｒｅｎｎｉｃｋ， ａｎｄ Ｒ． Ａ． Ｋａｓｔｅｌｅｉｎ． ２００２． ＩＬ−２７， ａ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ ＥＢＩ３ ａｎｄ ｐ２８ ｐｒｏｔｅｉｎ， ｉｎｄｕｃｅｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｉｖｅ ＣＤ４（＋） Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １６：７７９−７９０．に記載の方法に従って作製する。具体的には、CHO細胞においてFLAGタグ付マウスＩＬ２７発現ベクターを発現させ、培養上清中に分泌されたリコンビナントマウスＩＬ２７を、抗FLAGタグ抗体付ビーズ（シグマ社製）を用いてカラム法で精製する。そして、このリコンビナントＩＬ２７を、次のようにして投与する。すなわち、前記のように培地中にＤｉＩラベルしたアセチルＬＤＬを添加し４時間培養する際に、培地に同時にリコンビナントＩＬ２７を５０ ｎｇ／ｍｌの濃度で、またはリコンビナントＩＬ２７の対照溶媒である純水をリコンビナントＩＬ２７と同容量で同時添加する。
【０１４３】
その結果、ＬＤＬＲ／ＥＢＩ−３遺伝子ダブルノックアウトマウス由来マクロファージ及びＬＤＬＲ／ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子ダブルノックアウトマウス由来マクロファージによるアセチルＬＤＬの取り込みは、リコンビナントＩＬ２７を投与することにより抑制される。
【０１４４】
（３） 炎症性サイトカイン産生量の評価
上記実施例７（１）にて得たＬＤＬＲノックアウトマウス及び各ダブルノックアウトマウス由来のマクロファージについて、炎症性サイトカイン（ＩＬ６、ＩＬ１２等）の産生量を、ルミネックスマイクロビーズ法により評価した。具体的には、各マウスの腹腔マクロファージを前記培養条件にて培養皿中で２時間培養した。その後、リポポリッサカライドあるいは対照溶媒存在下、通常培地においてマクロファージを培養し、１６時間後に培養上清を回収した。ここで、リポポリサッカライド（シグマ社）は、１０ ｎｇ／ｍｌの濃度で培地中に添加した。また、対照溶媒は純水である。その後、回収した培養上清中のＩＬ１β、ＩＬ６、ＩＬ１２及びＩＬ１０の量をバイオソース社製マウス１０プレックスキットで測定した。
【０１４５】
その結果を図５に示す。図５に示したように、ダブルノックアウトマウス由来マクロファージによる炎症性サイトカイン（ＩＬ１β、ＩＬ６及びＩＬ１２）の産生量は、ＬＤＬＲノックアウトマウス由来の腹腔内マクロファージと比較して、増加した。一方、ダブルノックアウトマウス由来マクロファージによる抗炎症性サイトカイン（ＩＬ１０）の産生量は、ＬＤＬＲノックアウトマウス由来の腹腔内マクロファージと比較して、減少した。
【０１４６】
次に、ＬＤＬＲ／ＥＢＩ−３遺伝子ダブルノックアウトマウス由来マクロファージ及びＬＤＬ／ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子ダブルノックアウトマウス由来マクロファージについて、リコンビナントＩＬ２７を投与した場合の炎症性サイトカイン（ＩＬ６、ＩＬ１２等）の産生量を評価する。具体的には、各マウスの腹腔マクロファージを前記培養条件にて培養皿中で２時間培養する。その後、リポポリッサカライドあるいは対照溶媒存在下、通常培地においてマクロファージを培養し、１６時間後に培養上清を回収する。ここで、リポポリサッカライド（シグマ社）は、１０ ｎｇ／ｍｌの濃度で培地中に添加する。一方、対照溶媒として純水をリポポリサッカライドと同容量添加する。また同時にリコンビナントＩＬ２７を５０ ｎｇ／ｍｌの濃度で、またはリコンビナントＩＬ２７の対照溶媒である純水リコンビナントＩＬ２７と同容量を同時添加する。その後、回収した培養上清中のＩＬ１β、ＩＬ６、ＩＬ１２及びＩＬ１０の量をバイオソース社製マウス１０プレックスキットで測定する。
【０１４７】
その結果、ＬＤＬＲ／ＥＢＩ−３遺伝子ダブルノックアウトマウス由来マクロファージ及びＬＤＬＲ／ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子ダブルノックアウトマウス由来マクロファージによる炎症性サイトカインの産生量は、リコンビナントＩＬ２７を投与することにより抑制される。
【０１４８】
（４）マトリックスメタロプロテアーゼの遺伝子発現量の評価
上記実施例７（１）にて得たＬＤＬＲノックアウトマウス及び各ダブルノックアウトマウス由来のマクロファージについて、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ９等）の遺伝子発現量を評価する。具体的には、各マウスの腹腔内マクロファージを前記培養条件にて培養皿中で２時間培養した。その後、リポポリッサカライド存在下又は非存在下、通常培地で培養する。１６時間後に細胞からＲＮＡを抽出しｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ法にてＭＭＰ９等の遺伝子発現を定量する。
【０１４９】
その結果、ダブルノックアウトマウス由来マクロファージにおけるマトリックスメタロプロテアーゼ遺伝子発現量は、ＬＤＬＲノックアウトマウス由来の腹腔内マクロファージと比較して、増加すると考えられる。また、ＬＤＬＲ／ＥＢＩ−３遺伝子ダブルノックアウトマウス由来マクロファージ及びＬＤＬＲ／ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子ダブルノックアウトマウス由来マクロファージにおけるマトリックスメタロプロテアーゼ遺伝子発現量は、リコンビナントＩＬ２７を投与することにより抑制されると考えられる。
【０１５０】
実施例５および６に示したように、ＬＤＬＲ−／−ＥＢＩ３−／−及びＬＤＬＲ−／−ＷＳＸ−１−／−等の本発明のノックアウト非ヒト動物では、ＬＤＬＲ−／−に比して、動脈硬化病変の形成量及び大動脈瘤の発生頻度等を含む動脈硬化又は動脈硬化性疾患の状態がさらに悪化している。このため、本発明のノックアウト非ヒト動物等の動脈硬化又は動脈硬化性疾患の状態を指標として、候補物質の中から、動脈硬化又は動脈硬化性疾患の治療薬をスクリーニングすることができることが分かる。
また、実施例７に示したように、ＬＤＬＲ−／−ＥＢＩ３−／−及びＬＤＬＲ−／−ＷＳＸ−１−／−等の本発明のノックアウト非ヒト動物では、ＬＤＬＲ−／−に比して、アセチルＬＤＬの取り込みの増加及び炎症性サイトカイン産生量の増加等が見られた。これは、本発明のノックアウト非ヒト動物ではＩＬ２７の活性が抑制されていることを意味する。このため、これらのＩＬ２７の活性状態を指標として、候補物質の中から、ＩＬ２７シグナルの活性化剤をスクリーニングすることができることがわかる。また、ＩＬ２７シグナルの活性化剤は、動脈硬化又は動脈硬化性疾患の治療薬と成り得るので、ＩＬ２７の活性状態を指標として、候補物質の中から、動脈硬化又は動脈硬化性疾患の治療薬もスクリーニングすることもできることが分かる。
【配列表フリーテキスト】
【０１５１】
［配列番号：１］マウスＥＢＩ３遺伝子のＤＮＡ配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＭ＿０１５７６６）。
［配列番号：２］マウスＥＢＩ３のアミノ酸配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＰ＿０５６５８１）。
［配列番号：３］ラットＥＢＩ３遺伝子のＤＮＡ配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＭ＿００１１０９４２１）。
［配列番号：４］ラットＥＢＩ３のアミノ酸配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＰ＿００１１０２８９１）。
［配列番号：５］マウスＩＬ２７−ｐ２８遺伝子のＤＮＡ配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＭ＿１４５６３６）。
［配列番号：６］マウスＩＬ２７−ｐ２８のアミノ酸配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＰ＿６６３６１１）。［配列番号：７］マウスＷＳＸ−１遺伝子のＤＮＡ配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＭ＿０１６６７１）。
［配列番号：８］マウスＷＳＸ−１のアミノ酸配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＰ＿０５７８８０）。［配列番号：９］ヒトＬＤＬＲ遺伝子のＤＮＡ配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＭ＿０００５２７）。
［配列番号：１０］ヒトＬＤＬＲのアミノ酸配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＰ＿０００５１８）。
［配列番号：１１］ヒトＥＢＩ３遺伝子のＤＮＡ配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＭ＿００５７５５）。
［配列番号：１２］ヒトＥＢＩ３のアミノ酸配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＰ＿００５７４６）。
［配列番号：１３］ヒトＩＬ２７−ｐ２８遺伝子のＤＮＡ配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＭ＿１４５６５９）。
［配列番号：１４］ヒトＩＬ２７−ｐ２８のアミノ酸配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＰ＿６６３６３４）。
［配列番号：１５］ヒトＷＳＸ−１遺伝子のＤＮＡ配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＭ＿００４８４３）。
［配列番号：１６］ヒトＷＳＸ−１のアミノ酸配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＰ＿００４８３４）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＤＬＲ遺伝子の全部又は一部、並びにＥＢＩ３遺伝子、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子及びＷＳＸ−１遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の全部又は一部の機能が失われた、ノックアウト非ヒト動物又はその一部。
【請求項２】
ＬＤＬＲ遺伝子、並びにＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子の発現量が、野生型と比較して低下している、ノックダウン非ヒト動物又はその一部。
【請求項３】
請求項１若しくは２記載の動物又はその一部からなる、動脈硬化若しくは動脈硬化性疾患モデル動物又はその一部。
【請求項４】
ＬＤＬＲ遺伝子の全部又は一部、並びにＥＢＩ３遺伝子、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子及びＷＳＸ−１遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の全部又は一部の機能が失われた、ノックアウト細胞。
【請求項５】
ＬＤＬＲ遺伝子、並びにＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子の発現量が、野生型と比較して低下している、ノックダウン細胞。
【請求項６】
動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬のスクリーニング方法であって、
（ａ）請求項１〜３のいずれか１項記載の動物若しくはその一部又は請求項４若しくは５記載の細胞に被検物質を接触させ、
（ｂ）被検物質を接触させた動物若しくはその一部又は細胞における動脈硬化又は動脈硬化性疾患の状態と、対照の動脈硬化又は動脈硬化性疾患の状態とを比較し、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づき、被検物質の動脈硬化改善効果又は動脈硬化性疾患改善効果を評価し、
（ｄ）動脈硬化改善効果又は動脈硬化性疾患改善効果を有すると評価された被検物質を選択する
ことを含む、前記方法。
【請求項７】
対照が、被検物質を接触させない、ＬＤＬＲ遺伝子の全部又は一部の機能が失われているが、ＥＢＩ３遺伝子、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子及びＷＳＸ−１遺伝子の機能が失われていないノックアウト非ヒト動物若しくはその一部又はノックアウト細胞である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
ＩＬ２７シグナル活性化剤のスクリーニング方法であって、
（ａ）請求項１〜３のいずれか１項記載の動物の一部又は請求項４若しくは５記載の細胞に被検物質を接触させ、
（ｂ）被検物質を接触させた動物の一部又は細胞におけるＩＬ２７シグナルの活性化の状態と、対照のＩＬ２７シグナルの活性化の状態とを比較し、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づき、被検物質のＩＬ２７シグナル活性化亢進作用を評価し、
（ｄ）ＩＬ２７シグナル活性化亢進作用を有すると評価された被検物質を選択する
ことを含む、前記方法。
【請求項９】
対照が、被検物質を接触させない、ＬＤＬＲ遺伝子の全部又は一部の機能が失われているが、ＥＢＩ３遺伝子、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子及びＷＳＸ−１遺伝子の機能が失われていないノックアウト非ヒト動物の一部又はノックアウト細胞である、請求項８記載の方法。
【請求項１】
ＬＤＬＲ遺伝子の全部又は一部、並びにＥＢＩ３遺伝子、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子及びＷＳＸ−１遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の全部又は一部の機能が失われた、ノックアウト非ヒト動物又はその一部。
【請求項２】
ＬＤＬＲ遺伝子、並びにＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子の発現量が、野生型と比較して低下している、ノックダウン非ヒト動物又はその一部。
【請求項３】
請求項１若しくは２記載の動物又はその一部からなる、動脈硬化若しくは動脈硬化性疾患モデル動物又はその一部。
【請求項４】
ＬＤＬＲ遺伝子の全部又は一部、並びにＥＢＩ３遺伝子、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子及びＷＳＸ−１遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の全部又は一部の機能が失われた、ノックアウト細胞。
【請求項５】
ＬＤＬＲ遺伝子、並びにＩＬ２７及び／又はＩＬ２７Ｒ遺伝子の発現量が、野生型と比較して低下している、ノックダウン細胞。
【請求項６】
動脈硬化又は動脈硬化性疾患治療薬のスクリーニング方法であって、
（ａ）請求項１〜３のいずれか１項記載の動物若しくはその一部又は請求項４若しくは５記載の細胞に被検物質を接触させ、
（ｂ）被検物質を接触させた動物若しくはその一部又は細胞における動脈硬化又は動脈硬化性疾患の状態と、対照の動脈硬化又は動脈硬化性疾患の状態とを比較し、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づき、被検物質の動脈硬化改善効果又は動脈硬化性疾患改善効果を評価し、
（ｄ）動脈硬化改善効果又は動脈硬化性疾患改善効果を有すると評価された被検物質を選択する
ことを含む、前記方法。
【請求項７】
対照が、被検物質を接触させない、ＬＤＬＲ遺伝子の全部又は一部の機能が失われているが、ＥＢＩ３遺伝子、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子及びＷＳＸ−１遺伝子の機能が失われていないノックアウト非ヒト動物若しくはその一部又はノックアウト細胞である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
ＩＬ２７シグナル活性化剤のスクリーニング方法であって、
（ａ）請求項１〜３のいずれか１項記載の動物の一部又は請求項４若しくは５記載の細胞に被検物質を接触させ、
（ｂ）被検物質を接触させた動物の一部又は細胞におけるＩＬ２７シグナルの活性化の状態と、対照のＩＬ２７シグナルの活性化の状態とを比較し、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づき、被検物質のＩＬ２７シグナル活性化亢進作用を評価し、
（ｄ）ＩＬ２７シグナル活性化亢進作用を有すると評価された被検物質を選択する
ことを含む、前記方法。
【請求項９】
対照が、被検物質を接触させない、ＬＤＬＲ遺伝子の全部又は一部の機能が失われているが、ＥＢＩ３遺伝子、ＩＬ２７−ｐ２８遺伝子及びＷＳＸ−１遺伝子の機能が失われていないノックアウト非ヒト動物の一部又はノックアウト細胞である、請求項８記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１１−９２０２５（Ｐ２０１１−９２０２５Ａ）
【公開日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２４６５４２（Ｐ２００９−２４６５４２）
【出願日】平成２１年１０月２７日（２００９．１０．２７）
【出願人】（５０４２０９６５５）国立大学法人佐賀大学 (176)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月２７日（２００９．１０．２７）
【出願人】（５０４２０９６５５）国立大学法人佐賀大学 (176)
【Ｆターム（参考）】
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