ツマジロクサヨトウ（ｆａｌｌａｒｍｙｗｏｒｍ）およびユーロピアンコーンボーラー（Ｅｕｒｏｐｅａｎｃｏｒｎｂｏｒｅｒ）を防除するための殺虫性タンパク質の組み合わせならびに害虫抵抗性管理のための方法
本発明は、一部には、特定のＣｒｙ遺伝子をＣｒｙ１Ｆａと共にスタッキング（stacking）して、より耐久的で、昆虫がいずれかの毒素（Ｃｒｙ１Ｆａ等）単独の活性に対する抵抗性を発達させる傾向がより少ない産物を得ることに関する。Ｃｒｙ１Ｆスタッキングパートナーの実施形態は、Ｃｒｙ２Ａａ、Ｃｒｙ１ＩおよびＣｒｙ１Ｅを含む。これらのスタックは、本明細書に記載されている通り、ＦＡＷおよび／またはＥＣＢの防除に用いることができる。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
人間は、トウモロコシを食料およびエネルギー用途のために栽培する。昆虫は、トウモロコシ植物を食害することによりこのような人間の努力を台無しにする。トウモロコシの主要な破壊原因となる農業上の害虫は、ツマジロクサヨトウ（ＦＡＷ；スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda））およびユーロピアンコーンボーラー（ＥＣＢ；オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis））である。
【０００２】
バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）由来のＣｒｙ１Ｆａタンパク質をコードする結晶（Ｃｒｙ）デルタエンドトキシン遺伝子の植物における発現により、現在、これら有害生物の植物内（in-plant）トランスジェニック防除が達成された。Ｃｒｙ１Ｆａは、現在、ＦＡＷおよびＥＣＢ害虫に対し抵抗性の、Ｄｏｗ ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓトランスジェニックトウモロコシ種子であるＨｅｒｃｕｌｅｘ（商標）ブランド（Ｈｅｒｃｕｌｅｘ、Ｈｅｒｃｕｌｅｘ−ＥｘｔｒａおよびＨｅｒｃｕｌｅｘ−ＲＷ）に含まれているタンパク質毒素である。このタンパク質は、昆虫の中腸に位置する特異的な受容体（複数可）と結合することによって機能し、腸細胞内にポアを形成する。このようなポア形成は、昆虫の浸透圧バランス調節を妨げ、その結果昆虫に死をもたらす。
【０００３】
しかし、昆虫が、Ｃｒｙ１Ｆａと結合するその腸内受容体の遺伝子変異により、Ｃｒｙ１Ｆａの作用に対する抵抗性を発達できるようになる可能性があると懸念する者もいる。Ｃｒｙ１Ｆａ結合能が低い受容体を産生する昆虫は、Ｃｒｙ１Ｆａの活性に対し抵抗性となり、従ってこのタンパク質を発現する植物において生存し得る。
【０００４】
成長条件の植物内に持続的に存在する単一のＣｒｙ毒素を用いると、昆虫が、昆虫腸内でＣｒｙ１Ｆａ毒素と結合する受容体の遺伝子変異により、このタンパク質の活性に対する抵抗性を発達させ得るとの懸念がある。受容体のこのような変化に起因する毒素結合の減少は、Ｃｒｙ１Ｆａの毒性の低下をもたらしかねず、これは最終的には作物において発現した際のタンパク質の有効性の低下をもたらす可能性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、一部には、特定のＣｒｙ遺伝子をＣｒｙ１Ｆａと共にスタッキングして、より耐久的で、昆虫がいずれかの毒素（Ｃｒｙ１Ｆａ等）単独の活性に対する抵抗性を発達させる傾向のより少ない産物を得ることに関する。Ｃｒｙ１Ｆスタッキングパートナーの実施形態は、ツマジロクサヨトウ（ＦＡＷ；スポドプテラ・フルギペルダ）標的化のためのＣｒｙ２Ａａおよび／またはＣｒｙ１Ｉならびにユーロピアンコーンボーラー（ＥＣＢ；オストリニア・ヌビラリス）標的化のためのＣｒｙ１Ｅを含む。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
本発明は、Ｃｒｙ１Ｆａ毒素と少なくとも１種類のスタッキングパートナー毒素とのペアとしての使用を含む。ＦＡＷ（ツマジロクサヨトウ；スポドプテラ・フルギペルダ）標的化のための一部の好ましいペアは、Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質とＣｒｙ１Ｅａタンパク質である。ＥＣＢ（ユーロピアンコーンボーラー；オストリニア・ヌビラリス）標的化のための一部の好ましいペアは、Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質と、Ｃｒｙ１Ｉおよび／またはＣｒｙ２Ａａタンパク質とを含む。
【０００７】
本発明はまた、一部には、Ｃｒｙ１Ｆａおよびスタッキングパートナー毒素を基本のペアとする３種（以上）の毒素の三重スタックまたは「ピラミッド（pyramid）」に関する。好ましいピラミッドの一型は、２種の有害生物、ＦＡＷおよびＥＣＢに対し２種の作用機序を提供する。この種の「２ＭＯＡ」ピラミッドは、Ｃｒｙ１ＦａとＣｒｙ２ＡａとＣｒｙ１Ａｂ（ＥＣＢを防除するための好ましい一実施形態）およびＣｒｙ１ＦａとＣｒｙ１Ｅａ（ＦＡＷを防除するための好ましい一実施形態）を含む。「別個の作用機序」とは、タンパク質が互いに交差抵抗性を生じないことを意味する。
【０００８】
一部の好ましいピラミッド実施形態において、選択された毒素は、ＥＣＢに対する３種の別個の作用機序（交差抵抗性を生じない有効成分）を提供する。好ましいピラミッドの組み合わせは、Ｃｒｙ１Ｆａと第二のＩＲＭ毒素と第三のＩＲＭ毒素である。この具体例は次の通りである。
【０００９】
本発明のＥＣＢピラミッドは、Ｃｒｙ１Ｆａ毒素と、第二のＩＲＭ毒素としてＣｒｙ２Ａａ毒素と、Ｃｒｙ１Ｂｅ、Ｃｒｙ１Ａｂ、ＤＩＧ−３およびＣｒｙ１Ｉ毒素からなる群から選択される第三のＩＲＭ毒素とを含む。
【００１０】
本発明のＥＣＢピラミッドは、Ｃｒｙ１Ｆａ毒素と、第二のＩＲＭ毒素としてＣｒｙ１Ｉ毒素と、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ｂｅ、ＤＩＧ−３およびＣｒｙ２Ａａ毒素からなる群から選択される第三のＩＲＭ毒素とを含む。
【００１１】
これらの様々な毒素（およびそれ以外）は、添付の付録Ａに列挙されている。これらのＧＥＮＢＡＮＫ番号を用いて、本明細書に開示または言及されている遺伝子およびタンパク質のいずれかの配列を得ることもできる。
【００１２】
特許を用いて関連配列を得ることもできる。例えば、米国特許第５，１８８，９６０号明細書および米国特許第５，８２７，５１４号明細書は、本発明の実施における使用に適したＣｒｙ１Ｆａコア毒素含有タンパク質について記載する。米国特許第６，２１８，１８８号明細書は、本発明における使用に適したＣｒｙ１Ｆａコア毒素含有タンパク質をコードする植物最適化ＤＮＡ配列について記載する。米国特許出願公開第２０１０−００２６９２２３号明細書は、ＤＩＧ−３タンパク質に関する。
【００１３】
本発明はまた、一般に、互いに競合しない／交差抵抗性を生じないが、単一の標的有害生物に対し活性を有する３種の殺虫性タンパク質（一部の好ましい実施形態においてＣｒｙタンパク質）の使用に関する。
【００１４】
対象ペアのいずれかまたは３種（以上）の毒素を産生する植物（およびこのような植物が植え付けられた地所）は、本発明の範囲内に含まれる。追加的な毒素／遺伝子を付け加えてもよいが、これら特定の三重スタックは、本発明において、ＦＡＷおよび／またはＥＣＢに対する３種の作用機序（非交差抵抗性活性）を有利にかつ驚くほどに提供するであろう。これは、緩衝帯（refuge）地所の要件の縮小または除外（例えば、４０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満またはいっそ０％の緩衝帯）に役立つ可能性がある。よって、１０エーカーを超えてこのように植え付けられた圃場は、本発明の範囲内に含まれる。
【００１５】
対象ポリヌクレオチド（複数可）は、好ましくは、非バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）プロモーター制御下の（プロモーターに作動可能に連結した／を含む）遺伝的構築物に置かれる。対象ポリヌクレオチドは、植物における発現を増強するための植物コドン使用を含むことができる。
【００１６】
Ｃｒｙ１Ｆａに対する抵抗性を発達させる昆虫の能力に対抗するため、本出願人らは、（Ｃｒｙ１Ｆａと）非競合的にＦＡＷおよび／またはＥＣＢ腸細胞標本と結合するＣｒｙ毒素を同定した。Ｃｒｙ１Ｆａは、ＦＡＷおよびＥＣＢ幼虫の昆虫腸において、本明細書において同定されたＣｒｙタンパク質の結合を置き換えない。Ｃｒｙタンパク質は、Ｃｒｙ２Ａａ等である。ＦＡＷおよび／またはＥＣＢ幼虫に対し毒性となるこれらＣｒｙ毒素の能力は、Ｃｒｙ１Ｆａと同じ部位と完全には相互作用せず、Ｃｒｙ毒素の毒性が、Ｃｒｙ１Ｆａの毒性に対し抵抗性となるメカニズムとしてＣｒｙ１Ｆａ受容体に遺伝子変異を発生させた昆虫による影響を受けないであろうことを示す。
【００１７】
よって、その腸受容体のＣｒｙ１Ｆａ結合能の低下によりＣｒｙ１Ｆａに対する抵抗性を発達させた昆虫は、例えば、別の部位と結合するＣｒｙ２Ａａタンパク質の毒性に対し依然として感受性であろう。本出願人らは、この説を支持する生化学的データを得た。トランスジェニック植物において発現したこれらタンパク質の組み合わせを有すると、圃場における昆虫抵抗性発達の確率を低下させる有用で価値のあるメカニズムをもたらし、退避地（refugia）要件の減少をもたらす。他のＣｒｙタンパク質は、Ｃｒｙ１Ｆａに対し感受性および抵抗性（ｒＦＡＷおよびｒＥＣＢ）両方の他の主要な害虫に対するその活性を試験されてきた。表１に示す通り、Ｃｒｙ１ＩおよびＣｒｙ２Ａａは、抵抗性および感受性両方のＥＣＢ幼虫に対し活性を有する。Ｃｒｙ１Ｅａは、抵抗性および感受性両方のＦＡＷに対し活性を有する。これら害虫に対するこれらＣｒｙ毒素の結合データを得ることができる。いずれの場合においても、本明細書における後述のデータは、昆虫腸内のＣｒｙ１Ｆａとは別の標的部位（複数可）において相互作用する毒素を示すため、優れたスタッキングパートナーを得ることができるであろう。
【００１８】
Ｃｒｙ１Ｆａ発現作物に、本明細書に記載されている遺伝子等、１または複数の追加的なＣｒｙ遺伝子をスタッキングすると、これらのタンパク質毒素を発現するトランスジェニック植物の活性に対する耐性を発達させる昆虫の能力を抑制するための、効果的な管理戦略をもたらす。本出願人らは、これらのＣｒｙタンパク質が、Ｃｒｙ１Ｆａと比べて異なるおよび／または重複する部位と相互作用することを示す。このため、Ｃｒｙ毒素と結合する昆虫腸受容体の親和性の変化によって抵抗性が生じた場合、複数のタンパク質を発現する植物において昆虫が生存可能となるには、少なくとも２種の異なる受容体で同時に変化が生じる必要がある。これが起こる確率は非常に低く、従ってタンパク質に対する耐性を発達させ得る昆虫の区画（ward）に対するトランスジェニック産物の耐久性を増加させる。
【００１９】
本出願人らは、トリプシン切断型のＣｒｙタンパク質毒素を放射性ヨウ素化し、放射性受容体結合アッセイ技法に用いて、その昆虫腸膜内に位置する推定受容体タンパク質との結合相互作用を測定した。Ｗｏｌｆｅｒｓｂｅｒｇｅｒの方法により、腸膜を刷子縁膜小胞（ＢＢＭＶ）として調製した。Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ製のヨードビーズ（iodo beads）かヨードゲン（iodogen）処理したチューブのいずれかを用いて毒素のヨウ素化を行った。放射標識した毒素の特異活性は、およそ１〜４μＣｉ／μｇタンパク質であった。結合試験は、基本的にＬｉａｎｇの手順によって行った。
【００２０】
本明細書に提示するデータは、昆虫腸内のＣｒｙ１Ｆａとは別の標的部位で相互作用する毒素を示すため、優れたスタッキングパートナーを得ることができるであろう。
【００２１】
本発明は、様々な植物に用いることができる。具体例として、トウモロコシ（メイズ）、ダイズおよびワタが挙げられる。
【００２２】
本発明において有用な遺伝子および毒素は、開示されている全長配列のみならず、本明細書において特に例示されている毒素の特徴的な殺有害生物活性を保持するこれら配列の断片、変種、変異体および融合タンパク質も含む。本明細書において、用語、遺伝子の「変種」または「変異種」は、同一毒素をコードする、あるいは殺有害生物活性を有する均等な毒素をコードするヌクレオチド配列を意味する。本明細書において、用語「均等な毒素」は、標的有害生物に対し、請求されている毒素と同一または本質的に同一の生物活性を有する毒素を意味する。
【００２３】
本明細書において、境界は、「Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins」N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, and D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) 62巻：807〜813により、およそ９５％（例えば、Ｃｒｙ１Ｆａ）、７８％（例えばＣｒｙ１Ｆ）ならびに４５％（Ｃｒｙ１）の配列同一性を表す。これらカットオフは、コアタンパク質のみ（例えば、Ｃｒｙ１ＦおよびＣｒｙ１Ｆａコアタンパク質のため）に適用することもできる。Crickmoreらの関連したウェブサイトlifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/を参照されたい。
【００２４】
例示した毒素の殺有害生物活性を保持する断片および均等物は、本発明の範囲内のものである。また、遺伝暗号の重複性のため、様々な異なるＤＮＡ配列が、本明細書に開示されているアミノ酸配列をコードし得る。同一または本質的に同一の毒素をコードするこのような代替的ＤＮＡ配列の作製は、十分に当業者の技能範囲内である。このような変種ＤＮＡ配列は、本発明の範囲内のものである。本明細書において、「本質的に同一」な配列の言及は、殺有害生物活性に実質的な影響を及ぼさないアミノ酸置換、欠失、付加または挿入を有する配列を意味する。殺有害生物活性を保持するタンパク質をコードする遺伝子の断片もまた、この定義に含まれる。
【００２５】
本発明において有用な毒素をコードする遺伝子および遺伝子部分を同定するためのさらに別の方法は、オリゴヌクレオチドプローブの使用による。このようなプローブは、検出可能なヌクレオチド配列である。このような配列は、適切な標識に基づいて検出され得る、あるいは国際公開第９３／１６０９４号パンフレットに記載されている通り、蛍光が内在するように作製することができる。本技術分野でよく知られていることに、２分子間に強固な結合を形成することによってプローブ分子と核酸試料がハイブリダイズする場合、プローブと試料が実質的な相同性を有すると合理的に仮定することができる。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、例えば、Keller, G. H., M. M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press、ニューヨーク州ニューヨーク、169〜170頁に記載されている通り、本技術分野でよく知られた技法によりストリンジェントな条件下で行われる。塩濃度および温度の組み合わせを数例次に示す（ストリンジェンシー増加順）。２×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、室温；１×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、４２℃；０．１×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、４２℃；０．１×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、６５℃。プローブの検出は、ハイブリダイゼーションが生じたか公知の様式において決定するための手段を提供する。このようなプローブ解析は、本発明の毒素コード遺伝子を同定するための迅速な方法を提供する。本発明に係るプローブとして用いられるヌクレオチドセグメントは、ＤＮＡ合成装置および標準的手順を用いて合成することができる。このようなヌクレオチド配列は、本発明の遺伝子を増幅するためのＰＣＲプライマーとして用いることもできる。
【００２６】
本発明の特定のタンパク質は、本明細書において特に例示されている。これらのタンパク質は、本発明のタンパク質の単なる具体例であるため、本発明が、例示のタンパク質と同一または同様の殺有害生物活性を有する変種または均等なタンパク質（および均等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列）を含むことが容易に明らかであろう。均等なタンパク質は、例示のタンパク質とアミノ酸相同性を有するであろう。このアミノ酸相同性は通常、７５％を超え、好ましくは９０％を超え、最も好ましくは９５％を超えるであろう。アミノ酸相同性は、生物活性の原因となる、あるいは生物活性に最終的に関与する三次元配置の決定に関係するタンパク質の決定的領域において最も高くなるであろう。この点において、これらの置換が、活性に決定的ではない領域に存在する場合、あるいは分子の三次元配置に影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換である場合、特定のアミノ酸置換が許容され、これを予想することができる。例えば、アミノ酸は、次のクラス、非極性、無電荷極性、塩基性および酸性に分類することができる。あるクラスのアミノ酸が同じ種類の別のアミノ酸に交換された保存的置換は、置換が化合物の生物活性を実質的に変化させない限り、本発明の範囲内に収まる。次に、各クラスに属するアミノ酸の具体例のリストを示す。場合によっては、非保存的置換が行われてもよい。重要な要素としては、これらの置換が、タンパク質の生物活性を顕著に損なってはならないことである。
【００２７】
【表１】
【００２８】
害虫抵抗性管理（ＩＲＭ）戦略。例えば、Ｒｏｕｓｈらは、殺虫性トランスジェニック作物の管理のための、「ピラミッド化（pyramiding）」または「スタッキング」とも称される２毒素戦略について概要を述べる（The Royal Society、Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353、1777〜1786）。
【００２９】
米国環境保護局（the United States Environmental Protection Agency）は、そのウェブサイト（epa.gov/oppbppd1/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm）において、標的有害生物に対し活性を有する単一のＢｔタンパク質を産生するトランスジェニック作物と共に用いるための、非トランスジェニック（すなわち、非Ｂ．ｔ．）緩衝帯（非Ｂｔ作物／トウモロコシの区画）を設置するための次の要件を公開する。
【００３０】
「コーンボーラーから保護されたＢｔ（Ｃｒｙ１ＡｂまたはＣｒｙ１Ｆ）トウモロコシ製品のための特定の構造化された要件は次の通りである。
構造化された緩衝帯：コーンベルトにおける非鱗翅目（lepidopteran）Ｂｔトウモロコシ緩衝帯、２０％
コットンベルトにおける非鱗翅目（lepidopteran）Ｂｔ緩衝帯、５０％
ブロック
内部（すなわち、Ｂｔ圃場内）
外部（すなわち、任意交配を最大限に高めるための、Ｂｔ圃場の１／２マイル（可能であれば１／４マイル）以内にある別の圃場）
圃場内帯状地（strip）
帯状地は、幼生移動の効果を低減するために少なくとも４列幅（好ましくは６列）である必要がある」
【００３１】
さらに、全米トウモロコシ生産者協会（National Corn Growers Association）も、そのウェブサイト（ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn）において、緩衝帯要件に関する同様の指針、例えば次の事項を提示する。
「コーンボーラーＩＲＭの要件：
− 緩衝帯雑種をトウモロコシ畑の少なくとも２０％に植えること
− ワタ生産区域において、緩衝帯は５０％でなければならない
− 緩衝帯雑種の１／２マイル以内に植えなければならない
− 緩衝帯はＢｔ圃場内に帯状地として設置することができる；緩衝帯は、少なくとも４列幅でなければならない
− 標的昆虫に対して経済的許容限界に達した場合のみ、緩衝帯を従来の殺有害生物剤で処理してよい
− Ｂｔベースの噴霧可能な殺虫剤は、緩衝帯トウモロコシに用いることができない
− Ｂｔトウモロコシの農場毎に適切な緩衝帯を設置しなければならない」
【００３２】
Ｒｏｕｓｈらによって記述された通り（例えば、１７８０および１７８４頁右段）、それぞれ標的有害生物に対して有効であり、交差抵抗性がほとんどないまたは全くない２種の異なるタンパク質のスタッキングまたはピラミッド化は、より小規模の緩衝帯の使用を可能にする。Ｒｏｕｓｈは、成功したスタックにおける１０％未満の緩衝帯の緩衝帯サイズは、単一（非ピラミッド化）形質における約５０％の緩衝帯に匹敵する抵抗性管理をもたらし得ることを示唆する。現在利用できるピラミッド化したＢｔトウモロコシ製品に対し、米国環境保護局は、単一形質の製品（概して２０％）よりも有意に少ない（概して５％）非Ｂｔトウモロコシの構造化された緩衝帯の植え付けを要求する。
【００３３】
Ｒｏｕｓｈら（上記参照）および米国特許第６，５５１，９６２号明細書にさらに記載されている通り、圃場における様々な幾何級数的栽植パターン（上述）や種子同梱袋（in-bag seed mixture）等、緩衝帯のＩＲＭ効果を提供する様々な仕方が存在する。
【００３４】
上述のパーセンテージまたは類似の緩衝帯比率は、対象の二重もしくは三重スタックまたはピラミッドに用いることができる。単一の標的有害生物に対し３種の作用機序を備える三重スタックに関して、目標はゼロ緩衝帯（または例えば５％未満の緩衝帯）である。これは、商業的地所、例えば１０エーカーを超えるものに特に当てはまる。
【００３５】
本明細書に参照または引用されているあらゆる特許、特許出願、仮出願および刊行物は、本明細書に明示されている教示と不一致とならない範囲まで、ここに本明細書の一部を構成するものとしてそれらの全体を援用する。
【００３６】
特に示唆または暗示されていなければ、単数形の用語は、本明細書において「少なくとも１個」を示す。
【００３７】
次に、本発明の実施のための手順を説明する実施例を示す。これらの実施例は、限定的なものとして解釈するべきではない。他に断りがなければ、あらゆるパーセンテージは重量で表し、あらゆる溶媒混合物の割合は容量で表す。あらゆる温度はセ氏で表す。
（参考文献）
Wolfersberger, M.G., (1993), Preparation and Partial Characterization of Amino Acid Transporting Brush Border Membrane Vesicles from the Larval Midgut of the Gypsy Moth (Lymantria Dispar). Arch. Insect Biochem. Physiol. 24: 139-147.
Liang, Y., Patel, S.S., and Dean, D.H., (1995), Irreversible Binding Kinetics of Bacillus thuringiensis Cry1A Delta-Endotoxins to Gypsy Moth Brush Border Membrane Vesicles is Directly Correlated to Toxicity. J. Bioi. Chern., 270, 24719-24724
【実施例】
【００３８】
〔実施例１〕
バイオアッセイ
Ｃｒｙ１Ｆａに対し感受性および抵抗性（ｒＦＡＷおよびｒＥＣＢ）両方の他の主要な害虫に対するその活性に関し、対象Ｃｒｙタンパク質を試験した。表１に示す通り、Ｃｒｙ１ＩおよびＣｒｙ２Ａａは、抵抗性および感受性両方のＥＣＢ幼虫に対し活性を有する。Ｃｒｙ１Ｅａは、抵抗性および感受性両方のＦＡＷに対し活性を有する（この有害生物の概略的な考察に関し、例えば、Tabashnik、PNAS (2008)、105巻49号、19029〜19030を参照されたし）。
【００３９】
【表２】
【００４０】
【表３−１】
【表３−２】
【表３−３】
【表３−４】
【表３−５】
【表３−６】
【表３−７】
【表３−８】
【表３−９】
【表４−１】
【表４−２】
【背景技術】
【０００１】
人間は、トウモロコシを食料およびエネルギー用途のために栽培する。昆虫は、トウモロコシ植物を食害することによりこのような人間の努力を台無しにする。トウモロコシの主要な破壊原因となる農業上の害虫は、ツマジロクサヨトウ（ＦＡＷ；スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda））およびユーロピアンコーンボーラー（ＥＣＢ；オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis））である。
【０００２】
バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）由来のＣｒｙ１Ｆａタンパク質をコードする結晶（Ｃｒｙ）デルタエンドトキシン遺伝子の植物における発現により、現在、これら有害生物の植物内（in-plant）トランスジェニック防除が達成された。Ｃｒｙ１Ｆａは、現在、ＦＡＷおよびＥＣＢ害虫に対し抵抗性の、Ｄｏｗ ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓトランスジェニックトウモロコシ種子であるＨｅｒｃｕｌｅｘ（商標）ブランド（Ｈｅｒｃｕｌｅｘ、Ｈｅｒｃｕｌｅｘ−ＥｘｔｒａおよびＨｅｒｃｕｌｅｘ−ＲＷ）に含まれているタンパク質毒素である。このタンパク質は、昆虫の中腸に位置する特異的な受容体（複数可）と結合することによって機能し、腸細胞内にポアを形成する。このようなポア形成は、昆虫の浸透圧バランス調節を妨げ、その結果昆虫に死をもたらす。
【０００３】
しかし、昆虫が、Ｃｒｙ１Ｆａと結合するその腸内受容体の遺伝子変異により、Ｃｒｙ１Ｆａの作用に対する抵抗性を発達できるようになる可能性があると懸念する者もいる。Ｃｒｙ１Ｆａ結合能が低い受容体を産生する昆虫は、Ｃｒｙ１Ｆａの活性に対し抵抗性となり、従ってこのタンパク質を発現する植物において生存し得る。
【０００４】
成長条件の植物内に持続的に存在する単一のＣｒｙ毒素を用いると、昆虫が、昆虫腸内でＣｒｙ１Ｆａ毒素と結合する受容体の遺伝子変異により、このタンパク質の活性に対する抵抗性を発達させ得るとの懸念がある。受容体のこのような変化に起因する毒素結合の減少は、Ｃｒｙ１Ｆａの毒性の低下をもたらしかねず、これは最終的には作物において発現した際のタンパク質の有効性の低下をもたらす可能性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、一部には、特定のＣｒｙ遺伝子をＣｒｙ１Ｆａと共にスタッキングして、より耐久的で、昆虫がいずれかの毒素（Ｃｒｙ１Ｆａ等）単独の活性に対する抵抗性を発達させる傾向のより少ない産物を得ることに関する。Ｃｒｙ１Ｆスタッキングパートナーの実施形態は、ツマジロクサヨトウ（ＦＡＷ；スポドプテラ・フルギペルダ）標的化のためのＣｒｙ２Ａａおよび／またはＣｒｙ１Ｉならびにユーロピアンコーンボーラー（ＥＣＢ；オストリニア・ヌビラリス）標的化のためのＣｒｙ１Ｅを含む。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
本発明は、Ｃｒｙ１Ｆａ毒素と少なくとも１種類のスタッキングパートナー毒素とのペアとしての使用を含む。ＦＡＷ（ツマジロクサヨトウ；スポドプテラ・フルギペルダ）標的化のための一部の好ましいペアは、Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質とＣｒｙ１Ｅａタンパク質である。ＥＣＢ（ユーロピアンコーンボーラー；オストリニア・ヌビラリス）標的化のための一部の好ましいペアは、Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質と、Ｃｒｙ１Ｉおよび／またはＣｒｙ２Ａａタンパク質とを含む。
【０００７】
本発明はまた、一部には、Ｃｒｙ１Ｆａおよびスタッキングパートナー毒素を基本のペアとする３種（以上）の毒素の三重スタックまたは「ピラミッド（pyramid）」に関する。好ましいピラミッドの一型は、２種の有害生物、ＦＡＷおよびＥＣＢに対し２種の作用機序を提供する。この種の「２ＭＯＡ」ピラミッドは、Ｃｒｙ１ＦａとＣｒｙ２ＡａとＣｒｙ１Ａｂ（ＥＣＢを防除するための好ましい一実施形態）およびＣｒｙ１ＦａとＣｒｙ１Ｅａ（ＦＡＷを防除するための好ましい一実施形態）を含む。「別個の作用機序」とは、タンパク質が互いに交差抵抗性を生じないことを意味する。
【０００８】
一部の好ましいピラミッド実施形態において、選択された毒素は、ＥＣＢに対する３種の別個の作用機序（交差抵抗性を生じない有効成分）を提供する。好ましいピラミッドの組み合わせは、Ｃｒｙ１Ｆａと第二のＩＲＭ毒素と第三のＩＲＭ毒素である。この具体例は次の通りである。
【０００９】
本発明のＥＣＢピラミッドは、Ｃｒｙ１Ｆａ毒素と、第二のＩＲＭ毒素としてＣｒｙ２Ａａ毒素と、Ｃｒｙ１Ｂｅ、Ｃｒｙ１Ａｂ、ＤＩＧ−３およびＣｒｙ１Ｉ毒素からなる群から選択される第三のＩＲＭ毒素とを含む。
【００１０】
本発明のＥＣＢピラミッドは、Ｃｒｙ１Ｆａ毒素と、第二のＩＲＭ毒素としてＣｒｙ１Ｉ毒素と、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ｂｅ、ＤＩＧ−３およびＣｒｙ２Ａａ毒素からなる群から選択される第三のＩＲＭ毒素とを含む。
【００１１】
これらの様々な毒素（およびそれ以外）は、添付の付録Ａに列挙されている。これらのＧＥＮＢＡＮＫ番号を用いて、本明細書に開示または言及されている遺伝子およびタンパク質のいずれかの配列を得ることもできる。
【００１２】
特許を用いて関連配列を得ることもできる。例えば、米国特許第５，１８８，９６０号明細書および米国特許第５，８２７，５１４号明細書は、本発明の実施における使用に適したＣｒｙ１Ｆａコア毒素含有タンパク質について記載する。米国特許第６，２１８，１８８号明細書は、本発明における使用に適したＣｒｙ１Ｆａコア毒素含有タンパク質をコードする植物最適化ＤＮＡ配列について記載する。米国特許出願公開第２０１０−００２６９２２３号明細書は、ＤＩＧ−３タンパク質に関する。
【００１３】
本発明はまた、一般に、互いに競合しない／交差抵抗性を生じないが、単一の標的有害生物に対し活性を有する３種の殺虫性タンパク質（一部の好ましい実施形態においてＣｒｙタンパク質）の使用に関する。
【００１４】
対象ペアのいずれかまたは３種（以上）の毒素を産生する植物（およびこのような植物が植え付けられた地所）は、本発明の範囲内に含まれる。追加的な毒素／遺伝子を付け加えてもよいが、これら特定の三重スタックは、本発明において、ＦＡＷおよび／またはＥＣＢに対する３種の作用機序（非交差抵抗性活性）を有利にかつ驚くほどに提供するであろう。これは、緩衝帯（refuge）地所の要件の縮小または除外（例えば、４０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満またはいっそ０％の緩衝帯）に役立つ可能性がある。よって、１０エーカーを超えてこのように植え付けられた圃場は、本発明の範囲内に含まれる。
【００１５】
対象ポリヌクレオチド（複数可）は、好ましくは、非バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）プロモーター制御下の（プロモーターに作動可能に連結した／を含む）遺伝的構築物に置かれる。対象ポリヌクレオチドは、植物における発現を増強するための植物コドン使用を含むことができる。
【００１６】
Ｃｒｙ１Ｆａに対する抵抗性を発達させる昆虫の能力に対抗するため、本出願人らは、（Ｃｒｙ１Ｆａと）非競合的にＦＡＷおよび／またはＥＣＢ腸細胞標本と結合するＣｒｙ毒素を同定した。Ｃｒｙ１Ｆａは、ＦＡＷおよびＥＣＢ幼虫の昆虫腸において、本明細書において同定されたＣｒｙタンパク質の結合を置き換えない。Ｃｒｙタンパク質は、Ｃｒｙ２Ａａ等である。ＦＡＷおよび／またはＥＣＢ幼虫に対し毒性となるこれらＣｒｙ毒素の能力は、Ｃｒｙ１Ｆａと同じ部位と完全には相互作用せず、Ｃｒｙ毒素の毒性が、Ｃｒｙ１Ｆａの毒性に対し抵抗性となるメカニズムとしてＣｒｙ１Ｆａ受容体に遺伝子変異を発生させた昆虫による影響を受けないであろうことを示す。
【００１７】
よって、その腸受容体のＣｒｙ１Ｆａ結合能の低下によりＣｒｙ１Ｆａに対する抵抗性を発達させた昆虫は、例えば、別の部位と結合するＣｒｙ２Ａａタンパク質の毒性に対し依然として感受性であろう。本出願人らは、この説を支持する生化学的データを得た。トランスジェニック植物において発現したこれらタンパク質の組み合わせを有すると、圃場における昆虫抵抗性発達の確率を低下させる有用で価値のあるメカニズムをもたらし、退避地（refugia）要件の減少をもたらす。他のＣｒｙタンパク質は、Ｃｒｙ１Ｆａに対し感受性および抵抗性（ｒＦＡＷおよびｒＥＣＢ）両方の他の主要な害虫に対するその活性を試験されてきた。表１に示す通り、Ｃｒｙ１ＩおよびＣｒｙ２Ａａは、抵抗性および感受性両方のＥＣＢ幼虫に対し活性を有する。Ｃｒｙ１Ｅａは、抵抗性および感受性両方のＦＡＷに対し活性を有する。これら害虫に対するこれらＣｒｙ毒素の結合データを得ることができる。いずれの場合においても、本明細書における後述のデータは、昆虫腸内のＣｒｙ１Ｆａとは別の標的部位（複数可）において相互作用する毒素を示すため、優れたスタッキングパートナーを得ることができるであろう。
【００１８】
Ｃｒｙ１Ｆａ発現作物に、本明細書に記載されている遺伝子等、１または複数の追加的なＣｒｙ遺伝子をスタッキングすると、これらのタンパク質毒素を発現するトランスジェニック植物の活性に対する耐性を発達させる昆虫の能力を抑制するための、効果的な管理戦略をもたらす。本出願人らは、これらのＣｒｙタンパク質が、Ｃｒｙ１Ｆａと比べて異なるおよび／または重複する部位と相互作用することを示す。このため、Ｃｒｙ毒素と結合する昆虫腸受容体の親和性の変化によって抵抗性が生じた場合、複数のタンパク質を発現する植物において昆虫が生存可能となるには、少なくとも２種の異なる受容体で同時に変化が生じる必要がある。これが起こる確率は非常に低く、従ってタンパク質に対する耐性を発達させ得る昆虫の区画（ward）に対するトランスジェニック産物の耐久性を増加させる。
【００１９】
本出願人らは、トリプシン切断型のＣｒｙタンパク質毒素を放射性ヨウ素化し、放射性受容体結合アッセイ技法に用いて、その昆虫腸膜内に位置する推定受容体タンパク質との結合相互作用を測定した。Ｗｏｌｆｅｒｓｂｅｒｇｅｒの方法により、腸膜を刷子縁膜小胞（ＢＢＭＶ）として調製した。Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ製のヨードビーズ（iodo beads）かヨードゲン（iodogen）処理したチューブのいずれかを用いて毒素のヨウ素化を行った。放射標識した毒素の特異活性は、およそ１〜４μＣｉ／μｇタンパク質であった。結合試験は、基本的にＬｉａｎｇの手順によって行った。
【００２０】
本明細書に提示するデータは、昆虫腸内のＣｒｙ１Ｆａとは別の標的部位で相互作用する毒素を示すため、優れたスタッキングパートナーを得ることができるであろう。
【００２１】
本発明は、様々な植物に用いることができる。具体例として、トウモロコシ（メイズ）、ダイズおよびワタが挙げられる。
【００２２】
本発明において有用な遺伝子および毒素は、開示されている全長配列のみならず、本明細書において特に例示されている毒素の特徴的な殺有害生物活性を保持するこれら配列の断片、変種、変異体および融合タンパク質も含む。本明細書において、用語、遺伝子の「変種」または「変異種」は、同一毒素をコードする、あるいは殺有害生物活性を有する均等な毒素をコードするヌクレオチド配列を意味する。本明細書において、用語「均等な毒素」は、標的有害生物に対し、請求されている毒素と同一または本質的に同一の生物活性を有する毒素を意味する。
【００２３】
本明細書において、境界は、「Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins」N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, and D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) 62巻：807〜813により、およそ９５％（例えば、Ｃｒｙ１Ｆａ）、７８％（例えばＣｒｙ１Ｆ）ならびに４５％（Ｃｒｙ１）の配列同一性を表す。これらカットオフは、コアタンパク質のみ（例えば、Ｃｒｙ１ＦおよびＣｒｙ１Ｆａコアタンパク質のため）に適用することもできる。Crickmoreらの関連したウェブサイトlifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/を参照されたい。
【００２４】
例示した毒素の殺有害生物活性を保持する断片および均等物は、本発明の範囲内のものである。また、遺伝暗号の重複性のため、様々な異なるＤＮＡ配列が、本明細書に開示されているアミノ酸配列をコードし得る。同一または本質的に同一の毒素をコードするこのような代替的ＤＮＡ配列の作製は、十分に当業者の技能範囲内である。このような変種ＤＮＡ配列は、本発明の範囲内のものである。本明細書において、「本質的に同一」な配列の言及は、殺有害生物活性に実質的な影響を及ぼさないアミノ酸置換、欠失、付加または挿入を有する配列を意味する。殺有害生物活性を保持するタンパク質をコードする遺伝子の断片もまた、この定義に含まれる。
【００２５】
本発明において有用な毒素をコードする遺伝子および遺伝子部分を同定するためのさらに別の方法は、オリゴヌクレオチドプローブの使用による。このようなプローブは、検出可能なヌクレオチド配列である。このような配列は、適切な標識に基づいて検出され得る、あるいは国際公開第９３／１６０９４号パンフレットに記載されている通り、蛍光が内在するように作製することができる。本技術分野でよく知られていることに、２分子間に強固な結合を形成することによってプローブ分子と核酸試料がハイブリダイズする場合、プローブと試料が実質的な相同性を有すると合理的に仮定することができる。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、例えば、Keller, G. H., M. M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press、ニューヨーク州ニューヨーク、169〜170頁に記載されている通り、本技術分野でよく知られた技法によりストリンジェントな条件下で行われる。塩濃度および温度の組み合わせを数例次に示す（ストリンジェンシー増加順）。２×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、室温；１×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、４２℃；０．１×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、４２℃；０．１×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、６５℃。プローブの検出は、ハイブリダイゼーションが生じたか公知の様式において決定するための手段を提供する。このようなプローブ解析は、本発明の毒素コード遺伝子を同定するための迅速な方法を提供する。本発明に係るプローブとして用いられるヌクレオチドセグメントは、ＤＮＡ合成装置および標準的手順を用いて合成することができる。このようなヌクレオチド配列は、本発明の遺伝子を増幅するためのＰＣＲプライマーとして用いることもできる。
【００２６】
本発明の特定のタンパク質は、本明細書において特に例示されている。これらのタンパク質は、本発明のタンパク質の単なる具体例であるため、本発明が、例示のタンパク質と同一または同様の殺有害生物活性を有する変種または均等なタンパク質（および均等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列）を含むことが容易に明らかであろう。均等なタンパク質は、例示のタンパク質とアミノ酸相同性を有するであろう。このアミノ酸相同性は通常、７５％を超え、好ましくは９０％を超え、最も好ましくは９５％を超えるであろう。アミノ酸相同性は、生物活性の原因となる、あるいは生物活性に最終的に関与する三次元配置の決定に関係するタンパク質の決定的領域において最も高くなるであろう。この点において、これらの置換が、活性に決定的ではない領域に存在する場合、あるいは分子の三次元配置に影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換である場合、特定のアミノ酸置換が許容され、これを予想することができる。例えば、アミノ酸は、次のクラス、非極性、無電荷極性、塩基性および酸性に分類することができる。あるクラスのアミノ酸が同じ種類の別のアミノ酸に交換された保存的置換は、置換が化合物の生物活性を実質的に変化させない限り、本発明の範囲内に収まる。次に、各クラスに属するアミノ酸の具体例のリストを示す。場合によっては、非保存的置換が行われてもよい。重要な要素としては、これらの置換が、タンパク質の生物活性を顕著に損なってはならないことである。
【００２７】
【表１】
【００２８】
害虫抵抗性管理（ＩＲＭ）戦略。例えば、Ｒｏｕｓｈらは、殺虫性トランスジェニック作物の管理のための、「ピラミッド化（pyramiding）」または「スタッキング」とも称される２毒素戦略について概要を述べる（The Royal Society、Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353、1777〜1786）。
【００２９】
米国環境保護局（the United States Environmental Protection Agency）は、そのウェブサイト（epa.gov/oppbppd1/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm）において、標的有害生物に対し活性を有する単一のＢｔタンパク質を産生するトランスジェニック作物と共に用いるための、非トランスジェニック（すなわち、非Ｂ．ｔ．）緩衝帯（非Ｂｔ作物／トウモロコシの区画）を設置するための次の要件を公開する。
【００３０】
「コーンボーラーから保護されたＢｔ（Ｃｒｙ１ＡｂまたはＣｒｙ１Ｆ）トウモロコシ製品のための特定の構造化された要件は次の通りである。
構造化された緩衝帯：コーンベルトにおける非鱗翅目（lepidopteran）Ｂｔトウモロコシ緩衝帯、２０％
コットンベルトにおける非鱗翅目（lepidopteran）Ｂｔ緩衝帯、５０％
ブロック
内部（すなわち、Ｂｔ圃場内）
外部（すなわち、任意交配を最大限に高めるための、Ｂｔ圃場の１／２マイル（可能であれば１／４マイル）以内にある別の圃場）
圃場内帯状地（strip）
帯状地は、幼生移動の効果を低減するために少なくとも４列幅（好ましくは６列）である必要がある」
【００３１】
さらに、全米トウモロコシ生産者協会（National Corn Growers Association）も、そのウェブサイト（ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn）において、緩衝帯要件に関する同様の指針、例えば次の事項を提示する。
「コーンボーラーＩＲＭの要件：
− 緩衝帯雑種をトウモロコシ畑の少なくとも２０％に植えること
− ワタ生産区域において、緩衝帯は５０％でなければならない
− 緩衝帯雑種の１／２マイル以内に植えなければならない
− 緩衝帯はＢｔ圃場内に帯状地として設置することができる；緩衝帯は、少なくとも４列幅でなければならない
− 標的昆虫に対して経済的許容限界に達した場合のみ、緩衝帯を従来の殺有害生物剤で処理してよい
− Ｂｔベースの噴霧可能な殺虫剤は、緩衝帯トウモロコシに用いることができない
− Ｂｔトウモロコシの農場毎に適切な緩衝帯を設置しなければならない」
【００３２】
Ｒｏｕｓｈらによって記述された通り（例えば、１７８０および１７８４頁右段）、それぞれ標的有害生物に対して有効であり、交差抵抗性がほとんどないまたは全くない２種の異なるタンパク質のスタッキングまたはピラミッド化は、より小規模の緩衝帯の使用を可能にする。Ｒｏｕｓｈは、成功したスタックにおける１０％未満の緩衝帯の緩衝帯サイズは、単一（非ピラミッド化）形質における約５０％の緩衝帯に匹敵する抵抗性管理をもたらし得ることを示唆する。現在利用できるピラミッド化したＢｔトウモロコシ製品に対し、米国環境保護局は、単一形質の製品（概して２０％）よりも有意に少ない（概して５％）非Ｂｔトウモロコシの構造化された緩衝帯の植え付けを要求する。
【００３３】
Ｒｏｕｓｈら（上記参照）および米国特許第６，５５１，９６２号明細書にさらに記載されている通り、圃場における様々な幾何級数的栽植パターン（上述）や種子同梱袋（in-bag seed mixture）等、緩衝帯のＩＲＭ効果を提供する様々な仕方が存在する。
【００３４】
上述のパーセンテージまたは類似の緩衝帯比率は、対象の二重もしくは三重スタックまたはピラミッドに用いることができる。単一の標的有害生物に対し３種の作用機序を備える三重スタックに関して、目標はゼロ緩衝帯（または例えば５％未満の緩衝帯）である。これは、商業的地所、例えば１０エーカーを超えるものに特に当てはまる。
【００３５】
本明細書に参照または引用されているあらゆる特許、特許出願、仮出願および刊行物は、本明細書に明示されている教示と不一致とならない範囲まで、ここに本明細書の一部を構成するものとしてそれらの全体を援用する。
【００３６】
特に示唆または暗示されていなければ、単数形の用語は、本明細書において「少なくとも１個」を示す。
【００３７】
次に、本発明の実施のための手順を説明する実施例を示す。これらの実施例は、限定的なものとして解釈するべきではない。他に断りがなければ、あらゆるパーセンテージは重量で表し、あらゆる溶媒混合物の割合は容量で表す。あらゆる温度はセ氏で表す。
（参考文献）
Wolfersberger, M.G., (1993), Preparation and Partial Characterization of Amino Acid Transporting Brush Border Membrane Vesicles from the Larval Midgut of the Gypsy Moth (Lymantria Dispar). Arch. Insect Biochem. Physiol. 24: 139-147.
Liang, Y., Patel, S.S., and Dean, D.H., (1995), Irreversible Binding Kinetics of Bacillus thuringiensis Cry1A Delta-Endotoxins to Gypsy Moth Brush Border Membrane Vesicles is Directly Correlated to Toxicity. J. Bioi. Chern., 270, 24719-24724
【実施例】
【００３８】
〔実施例１〕
バイオアッセイ
Ｃｒｙ１Ｆａに対し感受性および抵抗性（ｒＦＡＷおよびｒＥＣＢ）両方の他の主要な害虫に対するその活性に関し、対象Ｃｒｙタンパク質を試験した。表１に示す通り、Ｃｒｙ１ＩおよびＣｒｙ２Ａａは、抵抗性および感受性両方のＥＣＢ幼虫に対し活性を有する。Ｃｒｙ１Ｅａは、抵抗性および感受性両方のＦＡＷに対し活性を有する（この有害生物の概略的な考察に関し、例えば、Tabashnik、PNAS (2008)、105巻49号、19029〜19030を参照されたし）。
【００３９】
【表２】
【００４０】
【表３−１】
【表３−２】
【表３−３】
【表３−４】
【表３−５】
【表３−６】
【表３−７】
【表３−８】
【表３−９】
【表４−１】
【表４−２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃｒｙ１Ｆａ殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡと、Ｃｒｙ２Ａａ殺虫性タンパク質およびＣｒｙ１Ｉ殺虫性タンパク質からなる群から選択される第二の殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡとを含むトランスジェニック植物。
【請求項２】
Ｃｒｙ１Ｆａ殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡと、Ｃｒｙ１Ｅ殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡとを含むトランスジェニック植物。
【請求項３】
Ｃｒｙ１Ｂｅ、Ｃｒｙ１ＡｂおよびＤＩＧ−３からなる群から選択される第三の殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡをさらに含む、請求項１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４】
前記第三のタンパク質が、Ｃｒｙ１Ｂｅからなる群から選択され、前記植物が、Ｃｒｙ１Ｃａ、Ｃｒｙ１ＤａおよびＶｉｐ３Ａｂからなる群から選択される第四の殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡをさらに含む、請求項３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５】
Ｃｒｙ１Ｂｅ、Ｃｒｙ１Ｃａ、Ｃｒｙ１ＤａおよびＶｉｐ３Ａｂからなる群から選択される第三の殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡをさらに含む、請求項２に記載のトランスジェニック植物。
【請求項６】
前記第三のタンパク質が、Ｃｒｙ１Ｂｅからなる群から選択され、前記植物が、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ｉ、Ｃｒｙ２ＡおよびＤＩＧ−３からなる群から選択される第四の殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡをさらに含む、請求項５に記載のトランスジェニック植物。
【請求項７】
前記ＤＮＡを含む、請求項１〜６のいずれかに記載の植物の種子。
【請求項８】
非Ｂｔ緩衝帯植物および請求項１〜６のいずれかに記載の複数の植物を含む植物の圃場であって、前記緩衝帯植物は前記圃場の全ての作物植物の４０％未満を構成する、圃場。
【請求項９】
前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の３０％未満を構成する、請求項８に記載の植物の圃場。
【請求項１０】
前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の２０％未満を構成する、請求項８に記載の植物の圃場。
【請求項１１】
前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の１０％未満を構成する、請求項８に記載の植物の圃場。
【請求項１２】
前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の５％未満を構成する、請求項８に記載の植物の圃場。
【請求項１３】
前記緩衝帯植物がブロックまたは帯状地にある、請求項８に記載の植物の圃場。
【請求項１４】
非Ｂｔ緩衝帯植物からの緩衝帯種子および請求項７に記載の複数の種子を含む種子混合物であって、前記緩衝帯種子は混合物の全ての種子の４０％未満を構成する、種子混合物。
【請求項１５】
前記緩衝帯種子が混合物の全ての種子の３０％未満を構成する、請求項１４に記載の種子混合物。
【請求項１６】
前記緩衝帯種子が混合物の全ての種子の２０％未満を構成する、請求項１４に記載の種子混合物。
【請求項１７】
前記緩衝帯種子が混合物の全ての種子の１０％未満を構成する、請求項１４に記載の種子混合物。
【請求項１８】
前記緩衝帯種子が混合物の全ての種子の５％未満を構成する、請求項１４に記載の種子混合物。
【請求項１９】
種子を播いて請求項８に記載の植物の圃場を作製するステップを含む、昆虫によるＣｒｙ毒素への抵抗性の発達を管理する方法。
【請求項２０】
前記植物が１０エーカーよりも多くを占める、請求項８〜１３のいずれかに記載の圃場。
【請求項２１】
前記植物がトウモロコシ、ダイズおよびワタからなる群から選択される、請求項１〜６のいずれかに記載の植物。
【請求項２２】
前記植物がトウモロコシ植物である、請求項２１に記載の植物。
【請求項２３】
ユーロピアンコーンボーラー昆虫をＣｒｙ１Ｆ殺虫性タンパク質ならびにＣｒｙ２Ａａ殺虫性タンパク質およびＣｒｙ１Ｉ殺虫性タンパク質からなる群から選択される第二の殺虫性タンパク質と接触させることにより、ユーロピアンコーンボーラー昆虫を防除する方法。
【請求項２４】
Ｃｒｙ２Ａａ殺虫性タンパク質およびＣｒｙ１Ｉ殺虫性タンパク質からなる群から選択される第二の殺虫性タンパク質と組み合わせたＣｒｙ１Ｆ殺虫性タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２５】
Ｃｒｙ２Ａａ殺虫性タンパク質およびＣｒｙ１Ｉ殺虫性タンパク質からなる群から選択される第二の殺虫性タンパク質と組み合わせたＣｒｙ１Ｆ殺虫性タンパク質を作製する方法。
【請求項２６】
ツマジロクサヨトウ昆虫をＣｒｙ１Ｆ殺虫性タンパク質およびＣｒｙ１Ｅ殺虫性タンパク質と接触させることにより、ツマジロクサヨトウ昆虫を防除する方法。
【請求項２７】
Ｃｒｙ１Ｅ殺虫性タンパク質と組み合わせたＣｒｙ１Ｆ殺虫性タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２８】
Ｃｒｙ１Ｅ殺虫性タンパク質と組み合わせたＣｒｙ１Ｆ殺虫性タンパク質を作製する方法。
【請求項２９】
請求項１に記載の植物の植物細胞であって、前記Ｃｒｙ１Ｆａ殺虫性タンパク質が、配列番号１と少なくとも９９％同一であり、前記Ｃｒｙ２Ａａ殺虫性タンパク質が、配列番号２と少なくとも９９％同一であり、前記Ｃｒｙ１Ｉ殺虫性タンパク質が、配列番号３と少なくとも９９％同一である、植物細胞。
【請求項３０】
請求項２に記載の植物の植物細胞であって、前記Ｃｒｙ１Ｆａ殺虫性タンパク質が、配列番号１と少なくとも９９％同一であり、前記Ｃｒｙ１Ｅ殺虫性タンパク質が、配列番号４と少なくとも９９％同一である、植物細胞。
【請求項１】
Ｃｒｙ１Ｆａ殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡと、Ｃｒｙ２Ａａ殺虫性タンパク質およびＣｒｙ１Ｉ殺虫性タンパク質からなる群から選択される第二の殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡとを含むトランスジェニック植物。
【請求項２】
Ｃｒｙ１Ｆａ殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡと、Ｃｒｙ１Ｅ殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡとを含むトランスジェニック植物。
【請求項３】
Ｃｒｙ１Ｂｅ、Ｃｒｙ１ＡｂおよびＤＩＧ−３からなる群から選択される第三の殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡをさらに含む、請求項１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４】
前記第三のタンパク質が、Ｃｒｙ１Ｂｅからなる群から選択され、前記植物が、Ｃｒｙ１Ｃａ、Ｃｒｙ１ＤａおよびＶｉｐ３Ａｂからなる群から選択される第四の殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡをさらに含む、請求項３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５】
Ｃｒｙ１Ｂｅ、Ｃｒｙ１Ｃａ、Ｃｒｙ１ＤａおよびＶｉｐ３Ａｂからなる群から選択される第三の殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡをさらに含む、請求項２に記載のトランスジェニック植物。
【請求項６】
前記第三のタンパク質が、Ｃｒｙ１Ｂｅからなる群から選択され、前記植物が、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ｉ、Ｃｒｙ２ＡおよびＤＩＧ−３からなる群から選択される第四の殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡをさらに含む、請求項５に記載のトランスジェニック植物。
【請求項７】
前記ＤＮＡを含む、請求項１〜６のいずれかに記載の植物の種子。
【請求項８】
非Ｂｔ緩衝帯植物および請求項１〜６のいずれかに記載の複数の植物を含む植物の圃場であって、前記緩衝帯植物は前記圃場の全ての作物植物の４０％未満を構成する、圃場。
【請求項９】
前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の３０％未満を構成する、請求項８に記載の植物の圃場。
【請求項１０】
前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の２０％未満を構成する、請求項８に記載の植物の圃場。
【請求項１１】
前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の１０％未満を構成する、請求項８に記載の植物の圃場。
【請求項１２】
前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の５％未満を構成する、請求項８に記載の植物の圃場。
【請求項１３】
前記緩衝帯植物がブロックまたは帯状地にある、請求項８に記載の植物の圃場。
【請求項１４】
非Ｂｔ緩衝帯植物からの緩衝帯種子および請求項７に記載の複数の種子を含む種子混合物であって、前記緩衝帯種子は混合物の全ての種子の４０％未満を構成する、種子混合物。
【請求項１５】
前記緩衝帯種子が混合物の全ての種子の３０％未満を構成する、請求項１４に記載の種子混合物。
【請求項１６】
前記緩衝帯種子が混合物の全ての種子の２０％未満を構成する、請求項１４に記載の種子混合物。
【請求項１７】
前記緩衝帯種子が混合物の全ての種子の１０％未満を構成する、請求項１４に記載の種子混合物。
【請求項１８】
前記緩衝帯種子が混合物の全ての種子の５％未満を構成する、請求項１４に記載の種子混合物。
【請求項１９】
種子を播いて請求項８に記載の植物の圃場を作製するステップを含む、昆虫によるＣｒｙ毒素への抵抗性の発達を管理する方法。
【請求項２０】
前記植物が１０エーカーよりも多くを占める、請求項８〜１３のいずれかに記載の圃場。
【請求項２１】
前記植物がトウモロコシ、ダイズおよびワタからなる群から選択される、請求項１〜６のいずれかに記載の植物。
【請求項２２】
前記植物がトウモロコシ植物である、請求項２１に記載の植物。
【請求項２３】
ユーロピアンコーンボーラー昆虫をＣｒｙ１Ｆ殺虫性タンパク質ならびにＣｒｙ２Ａａ殺虫性タンパク質およびＣｒｙ１Ｉ殺虫性タンパク質からなる群から選択される第二の殺虫性タンパク質と接触させることにより、ユーロピアンコーンボーラー昆虫を防除する方法。
【請求項２４】
Ｃｒｙ２Ａａ殺虫性タンパク質およびＣｒｙ１Ｉ殺虫性タンパク質からなる群から選択される第二の殺虫性タンパク質と組み合わせたＣｒｙ１Ｆ殺虫性タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２５】
Ｃｒｙ２Ａａ殺虫性タンパク質およびＣｒｙ１Ｉ殺虫性タンパク質からなる群から選択される第二の殺虫性タンパク質と組み合わせたＣｒｙ１Ｆ殺虫性タンパク質を作製する方法。
【請求項２６】
ツマジロクサヨトウ昆虫をＣｒｙ１Ｆ殺虫性タンパク質およびＣｒｙ１Ｅ殺虫性タンパク質と接触させることにより、ツマジロクサヨトウ昆虫を防除する方法。
【請求項２７】
Ｃｒｙ１Ｅ殺虫性タンパク質と組み合わせたＣｒｙ１Ｆ殺虫性タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２８】
Ｃｒｙ１Ｅ殺虫性タンパク質と組み合わせたＣｒｙ１Ｆ殺虫性タンパク質を作製する方法。
【請求項２９】
請求項１に記載の植物の植物細胞であって、前記Ｃｒｙ１Ｆａ殺虫性タンパク質が、配列番号１と少なくとも９９％同一であり、前記Ｃｒｙ２Ａａ殺虫性タンパク質が、配列番号２と少なくとも９９％同一であり、前記Ｃｒｙ１Ｉ殺虫性タンパク質が、配列番号３と少なくとも９９％同一である、植物細胞。
【請求項３０】
請求項２に記載の植物の植物細胞であって、前記Ｃｒｙ１Ｆａ殺虫性タンパク質が、配列番号１と少なくとも９９％同一であり、前記Ｃｒｙ１Ｅ殺虫性タンパク質が、配列番号４と少なくとも９９％同一である、植物細胞。
【公表番号】特表２０１３−５１４７６７（Ｐ２０１３−５１４７６７Ａ）
【公表日】平成２５年５月２日（２０１３．５．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４４８３７（Ｐ２０１２−５４４８３７）
【出願日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０６０８１２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７５５８６
【国際公開日】平成２３年６月２３日（２０１１．６．２３）
【出願人】（５０１０３５３０９）ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー (197)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月２日（２０１３．５．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０６０８１２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７５５８６
【国際公開日】平成２３年６月２３日（２０１１．６．２３）
【出願人】（５０１０３５３０９）ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー (197)
【Ｆターム（参考）】
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