デノボシーケンス解析方法，解析ソフト，解析ソフトを記憶した記憶媒体，試薬キット

【課題】衝突誘起解裂を備えた液体クロマトグラフ質量分析計より得られたマススペクトルからデノボシーケンス解析を行う場合、Ｎ末端を含むｂ系列とＣ末端を含むｙ系列の値を区別ができないため、正確なアミノ酸配列が困難である。
【解決手段】酵素消化するさいに、縮合効率の高いリジルエンドペプチダーゼ（Ｌｙｓ−Ｃ）酵素などを用いてＣ末端側に質量数の大きな官能基を導入する。導入後、質量分析計で測定するとｙ系列（官能基の導入されていない）と官能基が導入されているｂ系列を質量分析計の質量数から簡単に判別できるにする。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生化学分野におけるプロテオミックスの中でデータベースが存在しないたんぱく質，ペプチドについてアミノ酸配列解析を行うデノボシーケンスにおいて正確にアミノ酸配列解析できるツールに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の同定やアミノ酸配列解析は、目的のタンパク質を酵素消化して数から数十アミノ酸残基のペプチドフラグメントにしてから、衝突誘起解裂を備えた液体クロマトグラフ質量分析装置により、得られたペプチドフラグメントのマススペクトルの質量数情報と遺伝子情報をもとに作成させたデータベースから合致している数学的値を基に行われてきた。遺伝子的によく研究されているヒトやマウスなどの生物種は、データベースが充実しているが、他の大部分の生物種はデータ登録数が少なくデータベースとして機能していない。もしくはまったくデータベースとして存在していない。データベースが存在しないと衝突誘起解裂を備えた液体クロマトグラフ質量分析装置において得られたマススペクトルだけでは、ペプチドを衝突誘起解裂した後、Ｎ末端を有するｂ系列とＣ末端を有するｙ系列の判別が困難になり正確にアミノ酸配列解析は行えない。
【０００３】
【非特許文献１】蛋白質核酸酵素Ｖol２９Ｎo.１（１９８４）ｐ４９−５６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
一般的にデノボシーケンス解析は、衝突誘起解裂を備えた液体クロマトグラフ質量分析計より得られたマススペクトルの質量数情報を基にＮ末端を含むｂ系列とＣ末端を含むｙ系列の値を区別することなくアミノ酸配列を当てはめていく。このためアミノ酸配列の可能性が多くなり、正確なアミノ酸配列を決定できない。本発明では、タンパク質を酵素消化するさいに縮合反応を優先する酵素選択と反応条件を設定することにより、Ｃ末端側に選択的に別の官能基を導入することにより、普通の酵素消化した脱水反応と比較して質量数的に明らかに違いが分かるようになる。この反応を用いることでｙ系列とｂ系列を明確に識別することを可能にし、プログラムされたソフトウェアを使って簡単にデノボシーケンスを行うための手法である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
測定すべきタンパク質を酵素消化するさいに、すでに知られている縮合効率の高いリジルエンドペプチダーゼ（Ｌｙｓ−Ｃ）酵素を選択し、反応条件は、有機溶媒（ジメチルホルムアミド）高存在下で、酵素反応の至適ｐＨを縮合反応に有利となるようにすこし酸性側にシフトし、基質の１０倍以上の導入物質を添加することで、酵素消化するとき縮合反応をさせる。これによりＣ末端側に質量数の大きな官能基を導入する。導入後、質量分析計で測定するとｙ系列（官能基の導入されていない）と官能基が導入されているｂ系列を質量分析計の質量数から簡単に判別できる。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、データベースに依存しないデノボシーケンス解析が正確にかつ短時間に行えるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の一実施例を図面を用いて説明する。
【０００８】
図１はデノボシーケンス解析反応手順と縮合反応試薬キットの構成図である。タンパク質の入ったチューブ５に試薬キットの有機溶媒（ジメチルホルムアミド）１を２５〜７５％の範囲で加える、次に試薬キットトリス緩衝液２を７５〜２５％の範囲で加える。次に試薬キット導入物質（フェニルヒドラジン）３をタンパク質量の約１０〜１００倍加える。よく攪拌した後試薬キット酵素（Ｌｙｓ−Ｃ）４を２〜２０μｇ加え３７℃に保ち酵素反応を４時間から１６時間行う。この反応キットおよび反応条件により図２のように
Ｈ₃Ｏ⁺(ＯＨ)の代わりに導入基フェニルヒドラジンがペプチド結合（Ｎ−Ｃ）切断後Ｃ末端側に導入される。酵素消化されたペプチドフラグメントは、衝突誘起解裂を備えた液体クロマトグラフ質量分析計でアミノ酸配列解析を行う。図３は、アミノ酸８残基で構成されたペプチドフラグメントのマススペクトルの例を示す。質量分析の衝突誘起気解裂でペプチドフラグメントを解析すると無作為にペプチド結合が切れてマススペクトルのパターンからはＮ末端を有するｂ系列とＣ末端を有するｙ系列を明確に判別することは困難であるが、導入基フェニルヒドラジンを導入した反応では、Ｃ末端側でフェニルヒドラジンの質量数１０６だけシフトしたマススペクトルが確認される。図４は、質量分析計によって同じ測定試料から酵素消化法を変えて得られた質量数リストである。図５は、図４の２つの質量数リストからデノボシーケンス解析する方法のフローチャートである。図４の酵素消化の質量数リストの最初の値からデノボ酵素消化の質量数リストの値と比較して元の値より質量数で導入基の１０６シフトしている値を探し出す。それを最後の値まで行い抽出された値がｙ系列の候補となる。同様に２つのリストから同一の質量数を抽出することでｂ系列の候補を探しだす。また上記の条件に合わない値は、溶媒やインターナルフラグメントに由来しているイオンとして分類できる。図６はｂ系列の候補として抽出されたリストとｂ系列の候補として抽出されたリストである。大きな値から近接した小さな値を引くことでその差がアミノ酸に対応している。この結果からＳＦＬ（Ｉ）ＤＳＧＹＲのアミノ酸配列解析が可能となる。
【０００９】
上記において、縮合効果を有する酵素としては、リジルエンドペプチターゼ，トリプシン，キモトリプシン，サーモライシンの中から選ばれた少なくとも１種であっても同様の効果を得ることができる。
【００１０】
また、導入物質は、アミド，アニリン，ヒドラジン，フェニルヒドラジンの中から選ばれた少なくとも１種を有する物質であっても良い。
【００１１】
また、有機溶媒はジメチルホルムアミド，酢酸エチル，アセトニトリルであっても良い。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】デノボシーケンス解析手順および縮合反応試薬キット。
【図２】縮合反応の化学式。
【図３】ペプチドフラグメントのマススペクトル。
【図４】質量分析計より得られた質量数リスト。
【図５】デノボシーケンス解析のフローチャート。
【図６】解析結果例。
【符号の説明】
【００１３】
１…有機溶媒（ジメチルホルムアミド）、２…ｐＨ緩衝液（トリスバファー）、３…導入基用溶液（フェニルヒドラジン）、４…酵素（Ｌｙｓ−Ｃ）、５…反応用チューブ。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象のタンパク質を酵素消化する際に、縮合効果を有する酵素を用い、有機溶媒存在下で、基質の１０倍以上の導入物質を添加して、酵素消化を行うデノボ酵素消化ステップと、
該デノボ酵素消化を行った試料を衝突誘起解裂機能を備えた質量分析装置を用いてマススペクトルを取得するステップと、
該ステップで得られたマススペクトルと、通常の酵素消化を行った試料を衝突誘起解裂機能を備えた質量分析装置を用いて得られたマススペクトルと比較し、前記導入物質の質量数だけシフトしているマススペクトルを抽出し、抽出された値をｙ系列の候補とするステップと、
を含むことを特徴とするデノボシーケンス解析方法。
【請求項２】
請求項１において、
前記縮合効果を有する酵素が、リジルエンドペプチターゼ，トリプシン，キモトリプシン，サーモライシンの中から選ばれた少なくとも１種であることを特徴とするデノボシーケンス解析方法。
【請求項３】
請求項１または２において、
前記導入物質が、アミド，アニリン，ヒドラジン，フェニルヒドラジンの中から選ばれた少なくとも１種を有する物質であることを特徴とするデノボシーケンス解析方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかにおいて、
前記有機溶媒がジメチルホルムアミド，酢酸エチル，アセトニトリルのいずれかであることを特徴とするデノボシーケンス解析方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のデノボシーケンス解析方法を実行するための、少なくとも前記導入物質を含むことを特徴とするデノボシーケンス用試薬キット。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載のデノボシーケンス解析方法を実行するためのプログラムを含むことを特徴とするデノボシーケンス解析ソフト。
【請求項７】
請求項６記載のデノボシーケンス解析ソフトを記憶した記憶媒体。

【図１】