トランスフェリンの三次元構造に基づいて、発明者らは、遊離チオール基を持った1又は複数個のシステイン残基を持つ変異ポリペプチド（突然変異タンパク質）を設計した（以降、チオトランスフェリンとも呼ばれる）。前記変異ポリペプチドは、システイン残基の硫黄原子を通じて生理活性化合物に結合されてもよい。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドであって：
鉄結合能を有し、
受容体に結合し、そして
配列番号1の第1〜679残基若しくは第339〜679残基、配列番号11の第1〜691残基、又は配列番号15の第1〜738残基と少なくとも60%同一であるアミノ酸配列を持ち、且つ、遊離チオール基を持つ少なくとも1つのシステイン残基を含んでなる前記ポリペプチド。
【請求項２】
特に脊椎動物、哺乳動物、又はヒトに由来する血清トランスフェリンと少なくとも95%の配列同一性を有する、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号1のV1〜T5、E13〜H25、M26〜S36、K42〜S44、Y85〜T93、K103〜Q108、L112〜K115、T120〜W128、L139〜P145、F154〜G156、A159〜F167、P168〜L170；P175〜C177、G178〜F186、G187〜K196、D197〜D201、I210〜N213、L214〜N216、K217〜R220、D221〜Q222、L226〜P234、S255〜K259、E260〜H273、F274〜H300、V305〜D310、Y317〜E328、G329〜P341、C402〜N417、C418〜D420、K434〜T440、W441〜N443、L444〜G446、Y468〜K470、I471〜R475、A485〜S501、G502〜N504、L505〜Y515、G516〜V526、T537〜Q540、N541〜D548、P549〜A551、K552〜N555、D558〜Y559、C563〜T567、R568〜P570、E572〜N576、E594〜F608、G609〜V636、L641〜T646、R663〜S668、又はS669〜R677のいずれかに相当する位置におけるアミノ酸のシステインによる置換、システインの挿入又は欠失を含んでなる、請求項1又は2に記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号1のV1〜K4、M26〜P35、K42〜S44、Y85〜T93、K103〜Q108、L112〜K115、T120〜W128、L139〜P145、F154〜S155、A159〜F167、G178〜F186、D197〜D201、L214〜N216、D221〜Q222、L226〜P234、S255〜K259、F274〜H300、V305〜D310、G329〜P341、C402〜N417、K434〜T440、L444〜G446、I471〜R475、A485〜S501、L505〜Y515、N541〜D548、K552〜N555、D558、C563〜T567、G609〜V636、L641〜T646、R663〜S668のいずれかに相当する位置におけるアミノ酸のシステインによる置換、挿入、又は欠失を含んでなる、請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号1のV1〜K4、K103〜Q108、L112〜K115、L139〜P145、A159〜F167、G178〜F186、F274〜H300、V305〜D310、G329〜P341、K434〜T440、L444〜G446、I471〜R475、A485〜S501、L505〜Y515、G609〜V636、L641〜T646のいずれかに相当する位置におけるアミノ酸のシステインによる置換、挿入、又は欠失を含んでなる、請求項1〜4のいずれか1項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
配列番号1のV1、P2、D3、K4、T5、H14、Q20、S21、D24、K27、S28、V29、P31、S32、D33、A43、E89、D104、G106、G114、L122、G123、P145、S155、D163、T165、D166、P168、P175、G176、G178、C179、S180、T181、L182、Q184、F187、S189、D197、G198、E212、A215、N216、A218、D221、D229、G257、N268、D277、K278、K280、E281、S287、P288、H289、K291、S298、P307、L326、T330、P335、T336、N413、S415、D416、D420、K434、S435、A436、S437、D438、D442、N443、G446、N469、N472、G487、K489、D491、S501、G502、L503、N510、T518、P539、Q540、G543、G544、K545、P547、D548、P549、K552、N553、N555、D558、D565、T567、P570、N576、A595、S610、N611、V612、T613、D614、S616、G617、T626、D634、D643、S666、T667、又はS669のいずれかに相当する位置においてアミノ酸のシステインによる置換、挿入、又は欠失を含んでなる、請求項1〜5のいずれか1項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
少なくとも1つのシステイン残基を、別のアミノ酸残基、特にSer、Thr、Val、又はAlaで置換した、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項８】
配列番号1の第1〜679残基又は第339〜679残基と少なくとも95%の配列同一性を有し、且つ、前記の少なくとも1つのシステイン残基が、C19、C158、C161、C177、C179、C194、C227、C331、C339、C402、C418、C474、C495、C448、C506、C523、C563、C596、C615、C620、C665の中から選択される、請求項7に記載のポリペプチド。
【請求項９】
N-又はO-結合型グリコシル化を減少させる少なくとも1つの突然変異をさらに含んでなる、請求項1〜8のいずれか1項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号1と比較して、S32、N413、又はN611に相当する位置においてグリコシル化しないようにするアミノ酸への、S32、N413、S415、N611、又はT613に相当する位置におけるアミノ酸の置換を含んでなる、請求項9に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号1と少なくとも99%の配列同一性を有し、且つ、V1C、S28C、S32C、D104C、T165C、P175C、A215C、P288C、T336C、S415C、D146C、C171A、S415C＋D416の欠失、S415A＋D416の前にCの挿入、S501C、N553C、N611C、T613C、D643C、及びS28C＋S415Cの中から選択される1又は複数の突然変異を含んでなる、請求項1〜10のいずれか1項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号11と少なくとも95%の配列同一性を有し、且つ、突然変異S421Cを含んでなる、請求項1〜8のいずれか1項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
請求項1〜12のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項13に記載のポリヌクレオチドを含んでなるプラスミド。
【請求項１５】
請求項13に記載のポリヌクレオチド又は請求項14に記載のプラスミドを含んでなる宿主細胞。
【請求項１６】
酵母細胞である、請求項15に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
生理活性化合物と、請求項1〜12のいずれか1項に記載のポリペプチドを含んでなる複合体であって、ここで、上記生理活性化合物が、上記ポリペプチドのシステイン残基の遊離チオール基を通じて連結される前記複合体。
【請求項１８】
請求項1〜12のいずれか1項に記載のポリペプチドの製造方法であって、上記ポリペプチドの発現を可能にする条件下で請求項15又は16に記載の宿主細胞を培養し、そして上記ポリペプチドを回収することを含んでなる前記方法。
【請求項１９】
請求項1〜12のいずれか1項に記載のポリペプチドと、上記ポリペプチド内のシステイン残基の硫黄原子を通じて連結される生理活性化合物とを連結することを含んでなる、請求項17に記載の複合体の製造方法。
【請求項２０】
請求項17に記載の複合体と、少なくとも1の医薬的に許容し得る担体又は希釈剤とを含んでなる組成物。
【請求項２１】
疾患、病気、及び診断の処置のための請求項17に記載の複合体の使用。
【請求項２２】
ポリペプチドの調製方法であって、以下のステップ：
トランスフェリン配列、鉄原子、及び受容体の例を少なくとも1つ含んでなる三次元モデルを提供し、
配列番号1のV1、P2、若しくはD3に相当するか、又はトランスフェリン配列のそれぞれの例の中で、以下の条件：
i）0.14を超えたRMFS
ii）100%を超える溶媒‐表面接近可能性
を満たすトランスフェリン配列内のアミノ酸残基を選択し、
上記の選択された残基をシステインで置換するか、又は上記の選択された残基のN側又はC側にシステインを挿入し、
任意に、上記トランスフェリン配列に対して追加の変更を加え、ここで、それぞれの変更は、アミノ酸の欠失、置換、又は挿入であり、そして
得られたアミノ酸配列を持つポリペプチドを調製する、
を含んでなる前記方法。
【請求項２３】
前記ポリペプチドのFe結合能、受容体結合能、及び／又は結合適性を測定し、そしてFe結合能、受容体結合能、及び／又は結合適性を有するポリペプチドを選択することをさらに含んでなる、請求項22に記載の方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５−１】

【図５−２】

【図５−３】

【図５−４】

【図５−５】

【図５−６】

【図５−７】

【図５−８】

【図５−９】

【図５−１０】

【図５−１１】

【図５−１２】

【図５−１３】

【図６−１】

【図６−２】

【図６−３】

【図６−４】

【図６−５】

【図６−６】

【図６−７】

【図６−８】

【図６−９】

【図６−１０】

【図７−１】

【図７−２】

【図７−３】

【図７−４】

【図７−５】

【図７−６】

【図７−７】

【図７−８】

【図７−９】

【図８−１】

【図８−２】

【図８−３】

【図９−１】

【図９−２】

【図９−３】

【図９−４】

【図９−５】

【図９−６】

【図９−７】

【図９−８】

【図９−９】

【図９−１０】

【図９−１１】

【図９−１２】

【図９−１３】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３−１】

【図２３−２】

【図２３−３】

【図２４−１】

【図２４−２】

【図２４−３】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【公表番号】特表２０１０−５３５４８４（Ｐ２０１０−５３５４８４Ａ）
【公表日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１９４７５（Ｐ２０１０−５１９４７５）
【出願日】平成２０年８月８日（２００８．８．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６０４８２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１９３１４
【国際公開日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【出願人】（５０９１９８３４３）ノボザイムス　バイオファーマ　デーコー　アクティーゼルスカブ (11)
【Ｆターム（参考）】