トリテルペン組成物の製造方法
本発明は、バナバ、ビワ、シソ又はグアバから誘導されるカルスを、インドール酢酸及びこれ以外の植物ホルモンとともに培養し、培養した前記カルスから、コロソリン酸、トルメンティック酸、２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸及びマスリン酸からなる群より選ばれる少なくとも一種を含むトリテルペン組成物を得るトリテルペン組成物の製造方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリテルペン組成物の製造方法、トリテルペン組成物及びトリテルペン組成物の生産に用いるためのカルスに関する。
【背景技術】
【０００２】
コロソリン酸、トルメンティック酸及びマスリン酸といったトリテルペンは、それぞれ血糖値低下作用などの薬理活性を示す有用な物質であることが知られており、天然の植物から抽出される成分として、これらトリテルペンが得られた例がこれまでにも報告されている。
【０００３】
コロソリン酸を含有する植物としては、例えば、バナバ（Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｅｍｉａ ｓｐｅｃｉｏｓａ）が知られており（例えば、非特許文献１）、トルメンティック酸を含有する植物としては、例えば、ズダヤクシュ（Ｔｉａｒｅｌｌａ ｐｏｌｙｐｈｙｌａ）が知られており（例えば、非特許文献２）、マスリン酸を含有する植物としては、例えば、オリーブ（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｓｅａ）が知られている（例えば、特許文献１）。
【特許文献１】国際公報０３／０５７２２４号パンフレット
【非特許文献１】「薬理と治療」、１９９９年、２７巻、６号、ｐ．１０７５〜ｐ．１０７７
【非特許文献２】アーカイブズ オブ ファーマカル リサーチ（Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃａｌ Ｒｅｓｅｒｃｈ）、韓国、２００２年、２５巻、１号、ｐ．５７〜ｐ．６０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、植物中のトリテルペンの含有量は必ずしも多いものではなく、トリテルペンが効率的に得られるとはいえなかった。さらに、人工的に栽培する場合にもその生育には少なくとも数週間以上の期間を要し、トリテルペンの含有量は天候や栽培地の土壌の影響を受けやすいため、供給の安定性の点でも問題があった。
【０００５】
また、コロソリン酸、トルメンティック酸、２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸及びマスリン酸といったトリテルペンを安価に化学合成できる手法も知られていない。
【０００６】
そこで本発明の目的は、コロソリン酸、トルメンティック酸、２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸及びマスリン酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のトリテルペンを含むトリテルペン組成物を、安定して高効率で供給できる手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
カルス培養は、植物から切り出した葉、茎、根などの部位を培地上で培養することによって誘導されるカルスを培養する技術であり、代謝産物の生合成の基礎研究などに用いられることがある。
【０００８】
本発明者らは、このカルス培養において、カルスを誘導する原植物としてバナバ、ビワ、シソ又はグアバを用い、誘導されたカルスを特定の植物ホルモンとともに培養することにより、培養されたカルス中に特定のトリテルペンが高効率に産生されることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明のトリテルペン組成物の製造方法は、バナバ、ビワ、シソ又はグアバから誘導されるカルスを、インドール酢酸及びこれ以外の植物ホルモンとともに培養し、培養したカルスから、コロソリン酸、トルメンティック酸、２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸及びマスリン酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のトリテルペンを含むトリテルペン組成物を得る製造方法である。
【００１０】
本発明のトリテルペン組成物の製造方法では、カルスを継代培養することが好ましい。カルスを継代培養することで、バナバ等から誘導したカルスから、新たに別のカルスを誘導することなく継続的にトリテルペン組成物を得ることができる。
【００１１】
カルスは、葉、種子、茎、茎頂、根又は胚細胞から誘導することができる。これらの部位からカルスを誘導することで、より短期間で効率よくトリテルペン組成物を得ることが可能になる。
【００１２】
培養したカルスには、マスリン酸と、マスリン酸の重量に対して４〜１０倍量のコロソリン酸と、マスリン酸の重量に対して２〜８倍量のトルメンティック酸と、１．５〜４倍量の２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸とを含んでいることが好ましい。特に、血糖値低下作用などの点で有用性の高いコロソリン酸を高純度で得ることを容易にするため、マスリン酸に対するコロソリン酸の比率が高いことが重要である。
【００１３】
本発明はまた、バナバ、ビワ、シソ又はグアバから誘導され、上記製造方法に用いるためのカルスを提供する。バナバ、ビワ、シソ又はグアバから誘導される本発明のカルスは、コロソリン酸、トルメンティック酸、２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸及びマスリン酸といったトリテルペンを多く含有する。
【００１４】
従って、上記製造方法によって得られ、コロソリン酸、トルメンティック酸、２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸及びマスリン酸からなる群より選ばれる少なくとも一種を含むトリテルペン組成物が提供可能となる。このトリテルペン組成物は健康食品、医薬、化粧品などの原料として用いることができる。
【００１５】
本発明はさらに、このトリテルペン組成物から、コロソリン酸、トルメンティック酸、２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸又はマスリン酸それぞれのトリテルペンを単離、精製して得る製造方法を提供する。この製造方法を適用することで、医薬品等に用いることの可能な高純度のトリテルペンを高効率で得ることができる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のトリテルペン組成物の製造方法によれば、コロソリン酸、トルメンティック酸、２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸及びマスリン酸からなる群より選ばれる少なくとも一種を含むトリテルペン組成物を、安定して高効率で供給できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下に、本発明を実施するための形態について、詳細に説明する。
【００１８】
本発明のトリテルペン組成物の製造方法においては、バナバ、ビワ、シソ又はグアバからカルス（植物細胞から誘導された未分化の細胞塊）を誘導する。
【００１９】
これらの中でも、バナバからカルスを誘導することが好ましい。バナバ（学名：Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｅｍｉａ ｓｐｅｃｉｏｓａ、Ｌｉｎｎ．又はＰｅｒｓ．）は、ミソハギ科に属する植物であり、街路樹として用いられる他、その葉はフィリピンで伝承生薬として使用されている。
【００２０】
カルスの誘導には、天然に自生しているか、或いは人工的に栽培したバナバ、ビワ、シソ又はグアバを用いることができる。短期間の培養で効率よくトリテルペン組成物を得るために、葉、種子、茎、茎頂、根又は胚細胞からカルスを誘導することが好ましく、葉又は種子から誘導することがより好ましい。また、これら部位から調製したプロトプラストからカルスを誘導してもよい。
【００２１】
カルスの誘導は、例えば、バナバ等から切り出した葉などの部位を、次亜塩素酸ナトリウムなどで滅菌処理後、メスで適当な大きさに切るなどしてから培地に移植して培養する方法を採用できる。
【００２２】
カルスは固体培地又は液体培地中で誘導できるが、リンスマイアー−スクーグ（Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ−Ｓｋｏｏｇ）寒天培地（以下、「ＬＳ寒天培地」という。）などの固体培地で誘導することが好ましい。
【００２３】
誘導されたカルスを、インドール酢酸及びこれ以外の植物ホルモンを添加した培地で培養して増殖させることで、カルス中にトリテルペンが多く産生される。バナバ、ビワ、シソ又はグアバから誘導されるカルスの培養においては、植物ホルモンとしてインドール酢酸及びこれ以外の植物ホルモンを組み合わせて用いることが特に重要であり、これら以外の植物ホルモンのみを用いた場合と比較して、カルス増殖及び該カルス中でトリテルペン産生の効率が著しく向上する。
【００２４】
インドール酢酸と組み合わせて用いられる、インドール酢酸以外の植物ホルモンとしては、カイネチン、１−ナフタレン酢酸、６−ベンジルアデニン等が挙げられ、特にカイネチンが好適に採用できる。
【００２５】
また、カルスの培養は、ＬＳ寒天培地等の固体培地において、無菌下、２０〜３０℃、暗所で行うことが好ましい。
【００２６】
培養したカルスから直接トリテルペン組成物を得ることもできるし、培養したカルスの一部を別の新しい固体培地又は液体培地に移植して再度培養する、すなわち継代培養を行ったカルスからトリテルペン組成物を得ることもできる。継代培養を繰り返し行うことで、長期的に安定してトリテルペン組成物を得ることができる。
【００２７】
継代培養は、先に培養したカルスの一部をそのまま用いて培養してもよいし、培養したカルスの一部からマイクロプラストを調製し、そのマイクロプラストを液体培地中で懸濁培養させるなどしてもよい。継代培養を行う条件は、カルスを誘導する場合の、上記した条件と同様であることが好ましい。また、継代培養における一代の培養期間は５〜３０日間が好ましい。継代培養は、目的とするトリテルペンのカルス中における産生量が著しく減少しない限り、世代を更新させながら継続することができる。
【００２８】
上記のように培養されたカルス中に産生するトリテルペンの中でも、コロソリン酸及びトルメンティック酸が薬理活性等の点で有用性が大きく、カルス中のコロソリン酸及びトルメンティック酸の含有率が大きいことが好ましい。具体的には、マスリン酸と、マスリン酸の重量に対して４〜１０倍量のコロソリン酸と、２〜６倍量のトルメンティック酸と、１．５〜４倍量の２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸とを含むことが好ましい。
【００２９】
特に、大きな血糖値低下作用を示すコロソリン酸を高純度で得ることを容易にするために、カルス中におけるマスリン酸に対するコロソリン酸の比率が高いことが重要である。コロソリン酸とマスリン酸とは化学構造が極めて近いために、両者を分離することが困難だからである。
【００３０】
カルス中に含まれるトリテルペンの含有量を定量する方法としては、培養したカルスからメタノール等を用いて抽出した成分を液体クロマトグラフィーで分析し、得られたクロマトグラムの面積から定量する方法を好適に採用できる。
【００３１】
培養したカルスから、公知の方法を採用して抽出して得たエキスは、コロソリン酸、トルメンティック酸、２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸及びマスリン酸を多く含有するトリテルペン組成物である。このトリテルペン組成物を健康食品等の原料として用いることもできるし、さらに精製して不要成分を除去してもよい。
【００３２】
培養したカルスからの抽出は、培養後の生のカルスを用いて行ってもよいし、乾燥させてから粉砕するなどしたカルスを用いて行ってもよい。
【００３３】
抽出溶媒としては、水又はメタノール、エタノール等のアルコール等の親水性溶媒を用いることが好ましく、加温した水／アルコール混合溶媒を用いることがより好ましい。具体的には、乾燥したカルスの粉砕化物（原料）にエタノール又はエタノール水溶液（エタノール含量５０〜８０重量％）を原料に対して５〜２０重量倍、好ましくは８〜１０重量倍加えて、常温〜９０℃好ましくは約５０〜８５℃の温度で３０分〜２時間加熱還流し、この抽出を２〜３回繰り返す方法を好適に採用できる。
【００３４】
上記のようにして得られるトリテルペン組成物から、コロソリン酸、トルメンティック酸、２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸又はマスリン酸を単離、精製してそれぞれのトリテルペンを得ることもできる。これらトリテルペンの単離と精製は、シリカゲルカラムクロマトグラフィーや、再結晶等の方法によって行うことができる。
【００３５】
トリテルペン組成物の量が多い場合には、トリテルペン組成物を水に懸濁し、エーテルやヘキサン等に分配して低極性成分を除いてから、水層をダイアイオンHP-20カラムクロマトグラフィー等を用いて水、メタノール及びアセトンにて順次溶出し、メタノール溶出画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィー等で分離、精製を行うことが好ましい。
【００３６】
また、単離、精製して得られるトリテルペンの純度を高めるために、トリテルペン組成物中のトリテルペンの水酸基をアセチル化したり、カルボキシル基をメチルエステル化したりした状態でカラムクロマトグラフィーや再結晶等による精製を行った後、加水分解して所望のトリテルペンを得る方法も好適に採用できる。
【００３７】
上記のように単離、精製して得られるコロソリン酸、トルメンティック酸、２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸又はマスリン酸は、それぞれの一種のトリテルペンを少なくとも９０．０重量％以上含むものであり、
９８．０重量％以上含むことがより好ましく、９９．９重量％以上含むことがさらに好ましい。
【００３８】
本発明のトリテルペン組成物は、上述した方法によって得られ、下記化学式（１）で示されるコロソリン酸、下記化学式（２）で示されるトルメンティック酸、下記化学式（３）で示される２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸及び下記化学式（４）で示されるマスリン酸からなる群より選ばれる少なくとも一種を含むトリテルペン組成物である。
【００３９】
【化１】
【００４０】
【化２】
【００４１】
【化３】
【００４２】
【化４】
【００４３】
これらのトリテルペンを含むトリテルペン組成物は、それぞれ血糖値低下作用や抗腫瘍活性等の薬理活性を有することが知られており、健康食品や医薬などの原料として用いることができる。また、これらのトリテルペンの中でも、薬理活性の強いコロソリン酸及びトルメンティック酸を含んでいるトリテルペン組成物が特に有用性が高い。
【実施例】
【００４４】
以下に、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４５】
（カルスの誘導）
バナバから切り取った葉を次亜塩素酸ナトリウムに１５分間浸漬して滅菌処理した。植物ホルモンとしてインドール酢酸１０μＭ及びカイネチン１０μＭを加え、ｐＨを５．８としたＬＳ寒天培地を三角フラスコ中に調製しておき、そこへ滅菌処理したバナバの葉を置床し、２５℃、暗所下にて培養することにより、カルスが誘導された。
また、誘導されたカルスを３０日間培養した後、カルスの一部を別のＬＳ寒天培地に移植して培養したところ、移植したカルスが再び増殖するのが確認された。すなわち、バナバから誘導したカルスの継代培養を行うことができた。
【００４６】
（カルスの培養及びカルス中のトリテルペン含有量）
誘導されたカルスを、インドール酢酸１０μＭ及びカイネチン１０μＭを加えたＬＳ寒天培地にて３週間培養して増殖させ、増殖したカルスをメタノールに冷浸して抽出した成分について、高速液体クロマトグラフィー分析を行うことによって得たクロマトグラム（紫外吸光光度計、検出波長：２２０ｎｍ）における、各トリテルペンに対応するピークの面積から、培養したカルスのトリテルペン含有量を求めた。また、カルス誘導前の原植物（バナバ葉）中のトリテルペン含有量も同様の方法で求めた。結果を表１に示す。
【００４７】
【表１】
【００４８】
カルス中のコロソリン酸の含有量は、原植物に対して約１０倍に増加した。また、原植物中には検出されなかったトルメンティック酸及び２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸は、カルスを誘導することによって初めて産生することがわかった。
【００４９】
一方、植物ホルモンとしてインドール酢酸のみ、又はカイネチンのみをそれぞれ加えたＬＳ寒天培地や、植物ホルモンを加えないＬＳ寒天培地でのカルスの培養を試みたが、これらの場合にはカルスの実質的な増殖は少なかった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリテルペン組成物の製造方法、トリテルペン組成物及びトリテルペン組成物の生産に用いるためのカルスに関する。
【背景技術】
【０００２】
コロソリン酸、トルメンティック酸及びマスリン酸といったトリテルペンは、それぞれ血糖値低下作用などの薬理活性を示す有用な物質であることが知られており、天然の植物から抽出される成分として、これらトリテルペンが得られた例がこれまでにも報告されている。
【０００３】
コロソリン酸を含有する植物としては、例えば、バナバ（Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｅｍｉａ ｓｐｅｃｉｏｓａ）が知られており（例えば、非特許文献１）、トルメンティック酸を含有する植物としては、例えば、ズダヤクシュ（Ｔｉａｒｅｌｌａ ｐｏｌｙｐｈｙｌａ）が知られており（例えば、非特許文献２）、マスリン酸を含有する植物としては、例えば、オリーブ（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｓｅａ）が知られている（例えば、特許文献１）。
【特許文献１】国際公報０３／０５７２２４号パンフレット
【非特許文献１】「薬理と治療」、１９９９年、２７巻、６号、ｐ．１０７５〜ｐ．１０７７
【非特許文献２】アーカイブズ オブ ファーマカル リサーチ（Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃａｌ Ｒｅｓｅｒｃｈ）、韓国、２００２年、２５巻、１号、ｐ．５７〜ｐ．６０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、植物中のトリテルペンの含有量は必ずしも多いものではなく、トリテルペンが効率的に得られるとはいえなかった。さらに、人工的に栽培する場合にもその生育には少なくとも数週間以上の期間を要し、トリテルペンの含有量は天候や栽培地の土壌の影響を受けやすいため、供給の安定性の点でも問題があった。
【０００５】
また、コロソリン酸、トルメンティック酸、２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸及びマスリン酸といったトリテルペンを安価に化学合成できる手法も知られていない。
【０００６】
そこで本発明の目的は、コロソリン酸、トルメンティック酸、２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸及びマスリン酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のトリテルペンを含むトリテルペン組成物を、安定して高効率で供給できる手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
カルス培養は、植物から切り出した葉、茎、根などの部位を培地上で培養することによって誘導されるカルスを培養する技術であり、代謝産物の生合成の基礎研究などに用いられることがある。
【０００８】
本発明者らは、このカルス培養において、カルスを誘導する原植物としてバナバ、ビワ、シソ又はグアバを用い、誘導されたカルスを特定の植物ホルモンとともに培養することにより、培養されたカルス中に特定のトリテルペンが高効率に産生されることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明のトリテルペン組成物の製造方法は、バナバ、ビワ、シソ又はグアバから誘導されるカルスを、インドール酢酸及びこれ以外の植物ホルモンとともに培養し、培養したカルスから、コロソリン酸、トルメンティック酸、２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸及びマスリン酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のトリテルペンを含むトリテルペン組成物を得る製造方法である。
【００１０】
本発明のトリテルペン組成物の製造方法では、カルスを継代培養することが好ましい。カルスを継代培養することで、バナバ等から誘導したカルスから、新たに別のカルスを誘導することなく継続的にトリテルペン組成物を得ることができる。
【００１１】
カルスは、葉、種子、茎、茎頂、根又は胚細胞から誘導することができる。これらの部位からカルスを誘導することで、より短期間で効率よくトリテルペン組成物を得ることが可能になる。
【００１２】
培養したカルスには、マスリン酸と、マスリン酸の重量に対して４〜１０倍量のコロソリン酸と、マスリン酸の重量に対して２〜８倍量のトルメンティック酸と、１．５〜４倍量の２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸とを含んでいることが好ましい。特に、血糖値低下作用などの点で有用性の高いコロソリン酸を高純度で得ることを容易にするため、マスリン酸に対するコロソリン酸の比率が高いことが重要である。
【００１３】
本発明はまた、バナバ、ビワ、シソ又はグアバから誘導され、上記製造方法に用いるためのカルスを提供する。バナバ、ビワ、シソ又はグアバから誘導される本発明のカルスは、コロソリン酸、トルメンティック酸、２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸及びマスリン酸といったトリテルペンを多く含有する。
【００１４】
従って、上記製造方法によって得られ、コロソリン酸、トルメンティック酸、２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸及びマスリン酸からなる群より選ばれる少なくとも一種を含むトリテルペン組成物が提供可能となる。このトリテルペン組成物は健康食品、医薬、化粧品などの原料として用いることができる。
【００１５】
本発明はさらに、このトリテルペン組成物から、コロソリン酸、トルメンティック酸、２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸又はマスリン酸それぞれのトリテルペンを単離、精製して得る製造方法を提供する。この製造方法を適用することで、医薬品等に用いることの可能な高純度のトリテルペンを高効率で得ることができる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のトリテルペン組成物の製造方法によれば、コロソリン酸、トルメンティック酸、２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸及びマスリン酸からなる群より選ばれる少なくとも一種を含むトリテルペン組成物を、安定して高効率で供給できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下に、本発明を実施するための形態について、詳細に説明する。
【００１８】
本発明のトリテルペン組成物の製造方法においては、バナバ、ビワ、シソ又はグアバからカルス（植物細胞から誘導された未分化の細胞塊）を誘導する。
【００１９】
これらの中でも、バナバからカルスを誘導することが好ましい。バナバ（学名：Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｅｍｉａ ｓｐｅｃｉｏｓａ、Ｌｉｎｎ．又はＰｅｒｓ．）は、ミソハギ科に属する植物であり、街路樹として用いられる他、その葉はフィリピンで伝承生薬として使用されている。
【００２０】
カルスの誘導には、天然に自生しているか、或いは人工的に栽培したバナバ、ビワ、シソ又はグアバを用いることができる。短期間の培養で効率よくトリテルペン組成物を得るために、葉、種子、茎、茎頂、根又は胚細胞からカルスを誘導することが好ましく、葉又は種子から誘導することがより好ましい。また、これら部位から調製したプロトプラストからカルスを誘導してもよい。
【００２１】
カルスの誘導は、例えば、バナバ等から切り出した葉などの部位を、次亜塩素酸ナトリウムなどで滅菌処理後、メスで適当な大きさに切るなどしてから培地に移植して培養する方法を採用できる。
【００２２】
カルスは固体培地又は液体培地中で誘導できるが、リンスマイアー−スクーグ（Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ−Ｓｋｏｏｇ）寒天培地（以下、「ＬＳ寒天培地」という。）などの固体培地で誘導することが好ましい。
【００２３】
誘導されたカルスを、インドール酢酸及びこれ以外の植物ホルモンを添加した培地で培養して増殖させることで、カルス中にトリテルペンが多く産生される。バナバ、ビワ、シソ又はグアバから誘導されるカルスの培養においては、植物ホルモンとしてインドール酢酸及びこれ以外の植物ホルモンを組み合わせて用いることが特に重要であり、これら以外の植物ホルモンのみを用いた場合と比較して、カルス増殖及び該カルス中でトリテルペン産生の効率が著しく向上する。
【００２４】
インドール酢酸と組み合わせて用いられる、インドール酢酸以外の植物ホルモンとしては、カイネチン、１−ナフタレン酢酸、６−ベンジルアデニン等が挙げられ、特にカイネチンが好適に採用できる。
【００２５】
また、カルスの培養は、ＬＳ寒天培地等の固体培地において、無菌下、２０〜３０℃、暗所で行うことが好ましい。
【００２６】
培養したカルスから直接トリテルペン組成物を得ることもできるし、培養したカルスの一部を別の新しい固体培地又は液体培地に移植して再度培養する、すなわち継代培養を行ったカルスからトリテルペン組成物を得ることもできる。継代培養を繰り返し行うことで、長期的に安定してトリテルペン組成物を得ることができる。
【００２７】
継代培養は、先に培養したカルスの一部をそのまま用いて培養してもよいし、培養したカルスの一部からマイクロプラストを調製し、そのマイクロプラストを液体培地中で懸濁培養させるなどしてもよい。継代培養を行う条件は、カルスを誘導する場合の、上記した条件と同様であることが好ましい。また、継代培養における一代の培養期間は５〜３０日間が好ましい。継代培養は、目的とするトリテルペンのカルス中における産生量が著しく減少しない限り、世代を更新させながら継続することができる。
【００２８】
上記のように培養されたカルス中に産生するトリテルペンの中でも、コロソリン酸及びトルメンティック酸が薬理活性等の点で有用性が大きく、カルス中のコロソリン酸及びトルメンティック酸の含有率が大きいことが好ましい。具体的には、マスリン酸と、マスリン酸の重量に対して４〜１０倍量のコロソリン酸と、２〜６倍量のトルメンティック酸と、１．５〜４倍量の２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸とを含むことが好ましい。
【００２９】
特に、大きな血糖値低下作用を示すコロソリン酸を高純度で得ることを容易にするために、カルス中におけるマスリン酸に対するコロソリン酸の比率が高いことが重要である。コロソリン酸とマスリン酸とは化学構造が極めて近いために、両者を分離することが困難だからである。
【００３０】
カルス中に含まれるトリテルペンの含有量を定量する方法としては、培養したカルスからメタノール等を用いて抽出した成分を液体クロマトグラフィーで分析し、得られたクロマトグラムの面積から定量する方法を好適に採用できる。
【００３１】
培養したカルスから、公知の方法を採用して抽出して得たエキスは、コロソリン酸、トルメンティック酸、２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸及びマスリン酸を多く含有するトリテルペン組成物である。このトリテルペン組成物を健康食品等の原料として用いることもできるし、さらに精製して不要成分を除去してもよい。
【００３２】
培養したカルスからの抽出は、培養後の生のカルスを用いて行ってもよいし、乾燥させてから粉砕するなどしたカルスを用いて行ってもよい。
【００３３】
抽出溶媒としては、水又はメタノール、エタノール等のアルコール等の親水性溶媒を用いることが好ましく、加温した水／アルコール混合溶媒を用いることがより好ましい。具体的には、乾燥したカルスの粉砕化物（原料）にエタノール又はエタノール水溶液（エタノール含量５０〜８０重量％）を原料に対して５〜２０重量倍、好ましくは８〜１０重量倍加えて、常温〜９０℃好ましくは約５０〜８５℃の温度で３０分〜２時間加熱還流し、この抽出を２〜３回繰り返す方法を好適に採用できる。
【００３４】
上記のようにして得られるトリテルペン組成物から、コロソリン酸、トルメンティック酸、２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸又はマスリン酸を単離、精製してそれぞれのトリテルペンを得ることもできる。これらトリテルペンの単離と精製は、シリカゲルカラムクロマトグラフィーや、再結晶等の方法によって行うことができる。
【００３５】
トリテルペン組成物の量が多い場合には、トリテルペン組成物を水に懸濁し、エーテルやヘキサン等に分配して低極性成分を除いてから、水層をダイアイオンHP-20カラムクロマトグラフィー等を用いて水、メタノール及びアセトンにて順次溶出し、メタノール溶出画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィー等で分離、精製を行うことが好ましい。
【００３６】
また、単離、精製して得られるトリテルペンの純度を高めるために、トリテルペン組成物中のトリテルペンの水酸基をアセチル化したり、カルボキシル基をメチルエステル化したりした状態でカラムクロマトグラフィーや再結晶等による精製を行った後、加水分解して所望のトリテルペンを得る方法も好適に採用できる。
【００３７】
上記のように単離、精製して得られるコロソリン酸、トルメンティック酸、２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸又はマスリン酸は、それぞれの一種のトリテルペンを少なくとも９０．０重量％以上含むものであり、
９８．０重量％以上含むことがより好ましく、９９．９重量％以上含むことがさらに好ましい。
【００３８】
本発明のトリテルペン組成物は、上述した方法によって得られ、下記化学式（１）で示されるコロソリン酸、下記化学式（２）で示されるトルメンティック酸、下記化学式（３）で示される２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸及び下記化学式（４）で示されるマスリン酸からなる群より選ばれる少なくとも一種を含むトリテルペン組成物である。
【００３９】
【化１】
【００４０】
【化２】
【００４１】
【化３】
【００４２】
【化４】
【００４３】
これらのトリテルペンを含むトリテルペン組成物は、それぞれ血糖値低下作用や抗腫瘍活性等の薬理活性を有することが知られており、健康食品や医薬などの原料として用いることができる。また、これらのトリテルペンの中でも、薬理活性の強いコロソリン酸及びトルメンティック酸を含んでいるトリテルペン組成物が特に有用性が高い。
【実施例】
【００４４】
以下に、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４５】
（カルスの誘導）
バナバから切り取った葉を次亜塩素酸ナトリウムに１５分間浸漬して滅菌処理した。植物ホルモンとしてインドール酢酸１０μＭ及びカイネチン１０μＭを加え、ｐＨを５．８としたＬＳ寒天培地を三角フラスコ中に調製しておき、そこへ滅菌処理したバナバの葉を置床し、２５℃、暗所下にて培養することにより、カルスが誘導された。
また、誘導されたカルスを３０日間培養した後、カルスの一部を別のＬＳ寒天培地に移植して培養したところ、移植したカルスが再び増殖するのが確認された。すなわち、バナバから誘導したカルスの継代培養を行うことができた。
【００４６】
（カルスの培養及びカルス中のトリテルペン含有量）
誘導されたカルスを、インドール酢酸１０μＭ及びカイネチン１０μＭを加えたＬＳ寒天培地にて３週間培養して増殖させ、増殖したカルスをメタノールに冷浸して抽出した成分について、高速液体クロマトグラフィー分析を行うことによって得たクロマトグラム（紫外吸光光度計、検出波長：２２０ｎｍ）における、各トリテルペンに対応するピークの面積から、培養したカルスのトリテルペン含有量を求めた。また、カルス誘導前の原植物（バナバ葉）中のトリテルペン含有量も同様の方法で求めた。結果を表１に示す。
【００４７】
【表１】
【００４８】
カルス中のコロソリン酸の含有量は、原植物に対して約１０倍に増加した。また、原植物中には検出されなかったトルメンティック酸及び２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸は、カルスを誘導することによって初めて産生することがわかった。
【００４９】
一方、植物ホルモンとしてインドール酢酸のみ、又はカイネチンのみをそれぞれ加えたＬＳ寒天培地や、植物ホルモンを加えないＬＳ寒天培地でのカルスの培養を試みたが、これらの場合にはカルスの実質的な増殖は少なかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バナバ、ビワ、シソ又はグアバから誘導されるカルスを、インドール酢酸及びこれ以外の植物ホルモンとともに培養し、培養した前記カルスから、コロソリン酸、トルメンティック酸、２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸及びマスリン酸からなる群より選ばれる少なくとも一種を含むトリテルペン組成物を得るトリテルペン組成物の製造方法。
【請求項２】
前記培養が前記カルスの継代培養である、請求項１に記載のトリテルペン組成物の製造方法。
【請求項３】
前記カルスが、バナバ、ビワ、シソ又はグアバの、葉、種子、茎、茎頂、根又は胚細胞から誘導されるカルスである、請求項１又は２に記載のトリテルペン組成物の製造方法。
【請求項４】
培養した前記カルスが、マスリン酸と、マスリン酸の重量に対して４〜１０倍量のコロソリン酸と、２〜６倍量のトルメンティック酸と、１．５〜４倍量の２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸とを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のトリテルペン組成物の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のトリテルペン組成物の製造方法によって得られ、コロソリン酸、トルメンティック酸、２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸及びマスリン酸からなる群より選ばれる少なくとも一種を含むトリテルペン組成物。
【請求項６】
バナバ、ビワ、シソ又はグアバから誘導され、請求項１〜４のいずれか一項に記載のトリテルペン組成物の製造方法に用いるためのカルス。
【請求項７】
バナバ、ビワ、シソ又はグアバから誘導されるカルスを、インドール酢酸及びこれ以外の植物ホルモンとともに培養し、培養した前記カルスから、コロソリン酸を含むトリテルペン組成物を得、当該トリテルペン組成物からコロソリン酸を得るコロソリン酸の製造方法。
【請求項８】
前記培養がカルスの継代培養である、請求項７に記載のコロソリン酸の製造方法。
【請求項９】
前記カルスが、バナバ、ビワ、シソ又はグアバの、葉、種子、茎、茎頂、根又は胚細胞から誘導されるカルスである、請求項７又は８に記載のコロソリン酸の製造方法。
【請求項１０】
バナバ、ビワ、シソ又はグアバから誘導されるカルスを、インドール酢酸及びこれ以外の植物ホルモンとともに培養し、培養した前記カルスから、トルメンティック酸を含むトリテルペン組成物を得、当該トリテルペン組成物からトルメンティック酸を得るトルメンティック酸の製造方法。
【請求項１１】
前記培養がカルスの継代培養である、請求項１０に記載のトルメンティック酸の製造方法。
【請求項１２】
前記カルスが、バナバ、ビワ、シソ又はグアバの、葉、種子、茎、茎頂、根又は胚細胞から誘導されるカルスである、請求項１０又は１１に記載のトルメンティック酸の製造方法。
【請求項１３】
バナバ、ビワ、シソ又はグアバから誘導されるカルスを、インドール酢酸及びこれ以外の植物ホルモンとともに培養し、培養した前記カルスから、２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸を含むトリテルペン組成物を得、当該トリテルペン組成物から２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸を得る２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸の製造方法。
【請求項１４】
前記培養がカルスの継代培養である、請求項１３に記載の２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸の製造方法。
【請求項１５】
前記カルスが、バナバ、ビワ、シソ又はグアバの、葉、種子、茎、茎頂、根又は胚細胞から誘導されるカルスである、請求項１３又は１４に記載の２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸の製造方法。
【請求項１６】
バナバ、ビワ、シソ又はグアバから誘導されるカルスを、インドール酢酸及びこれ以外の植物ホルモンとともに培養し、培養した前記カルスから、マスリン酸を含むトリテルペン組成物を得、当該トリテルペン組成物からマスリン酸を得るマスリン酸の製造方法。
【請求項１７】
前記培養がカルスの継代培養である、請求項１６に記載のマスリン酸の製造方法。
【請求項１８】
前記カルスが、バナバ、ビワ、シソ又はグアバの、葉、種子、茎、茎頂、根又は胚細胞から誘導されるカルスである、請求項１６又は１７に記載のマスリン酸の製造方法。
【請求項１】
バナバ、ビワ、シソ又はグアバから誘導されるカルスを、インドール酢酸及びこれ以外の植物ホルモンとともに培養し、培養した前記カルスから、コロソリン酸、トルメンティック酸、２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸及びマスリン酸からなる群より選ばれる少なくとも一種を含むトリテルペン組成物を得るトリテルペン組成物の製造方法。
【請求項２】
前記培養が前記カルスの継代培養である、請求項１に記載のトリテルペン組成物の製造方法。
【請求項３】
前記カルスが、バナバ、ビワ、シソ又はグアバの、葉、種子、茎、茎頂、根又は胚細胞から誘導されるカルスである、請求項１又は２に記載のトリテルペン組成物の製造方法。
【請求項４】
培養した前記カルスが、マスリン酸と、マスリン酸の重量に対して４〜１０倍量のコロソリン酸と、２〜６倍量のトルメンティック酸と、１．５〜４倍量の２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸とを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のトリテルペン組成物の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のトリテルペン組成物の製造方法によって得られ、コロソリン酸、トルメンティック酸、２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸及びマスリン酸からなる群より選ばれる少なくとも一種を含むトリテルペン組成物。
【請求項６】
バナバ、ビワ、シソ又はグアバから誘導され、請求項１〜４のいずれか一項に記載のトリテルペン組成物の製造方法に用いるためのカルス。
【請求項７】
バナバ、ビワ、シソ又はグアバから誘導されるカルスを、インドール酢酸及びこれ以外の植物ホルモンとともに培養し、培養した前記カルスから、コロソリン酸を含むトリテルペン組成物を得、当該トリテルペン組成物からコロソリン酸を得るコロソリン酸の製造方法。
【請求項８】
前記培養がカルスの継代培養である、請求項７に記載のコロソリン酸の製造方法。
【請求項９】
前記カルスが、バナバ、ビワ、シソ又はグアバの、葉、種子、茎、茎頂、根又は胚細胞から誘導されるカルスである、請求項７又は８に記載のコロソリン酸の製造方法。
【請求項１０】
バナバ、ビワ、シソ又はグアバから誘導されるカルスを、インドール酢酸及びこれ以外の植物ホルモンとともに培養し、培養した前記カルスから、トルメンティック酸を含むトリテルペン組成物を得、当該トリテルペン組成物からトルメンティック酸を得るトルメンティック酸の製造方法。
【請求項１１】
前記培養がカルスの継代培養である、請求項１０に記載のトルメンティック酸の製造方法。
【請求項１２】
前記カルスが、バナバ、ビワ、シソ又はグアバの、葉、種子、茎、茎頂、根又は胚細胞から誘導されるカルスである、請求項１０又は１１に記載のトルメンティック酸の製造方法。
【請求項１３】
バナバ、ビワ、シソ又はグアバから誘導されるカルスを、インドール酢酸及びこれ以外の植物ホルモンとともに培養し、培養した前記カルスから、２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸を含むトリテルペン組成物を得、当該トリテルペン組成物から２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸を得る２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸の製造方法。
【請求項１４】
前記培養がカルスの継代培養である、請求項１３に記載の２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸の製造方法。
【請求項１５】
前記カルスが、バナバ、ビワ、シソ又はグアバの、葉、種子、茎、茎頂、根又は胚細胞から誘導されるカルスである、請求項１３又は１４に記載の２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸の製造方法。
【請求項１６】
バナバ、ビワ、シソ又はグアバから誘導されるカルスを、インドール酢酸及びこれ以外の植物ホルモンとともに培養し、培養した前記カルスから、マスリン酸を含むトリテルペン組成物を得、当該トリテルペン組成物からマスリン酸を得るマスリン酸の製造方法。
【請求項１７】
前記培養がカルスの継代培養である、請求項１６に記載のマスリン酸の製造方法。
【請求項１８】
前記カルスが、バナバ、ビワ、シソ又はグアバの、葉、種子、茎、茎頂、根又は胚細胞から誘導されるカルスである、請求項１６又は１７に記載のマスリン酸の製造方法。
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０６３２２７
【国際公開日】平成１７年７月１４日（２００５．７．１４）
【発行日】平成１９年７月１９日（２００７．７．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１６６６９（Ｐ２００５−５１６６６９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１９４２８
【国際出願日】平成１６年１２月２４日（２００４．１２．２４）
【出願人】（５９８１６９４９１）株式会社ユース・テクノコーポレーション (9)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年７月１４日（２００５．７．１４）
【発行日】平成１９年７月１９日（２００７．７．１９）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１９４２８
【国際出願日】平成１６年１２月２４日（２００４．１２．２４）
【出願人】（５９８１６９４９１）株式会社ユース・テクノコーポレーション (9)
【Ｆターム（参考）】
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