トルクテノウイルス（ＴｏｒｑｕｅＴｅｎｏＶｉｒｕｓｕ：ＴＴＶ）単離株および組成物
本発明は、トルクテノウイルス（「ＴＴＶ」）の新規な遺伝子型を含む、トルクテノウイルスの新規なヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を対象とするものであり、その全ては、ブタおよび他の動物における疾患を治療および予防するためのワクチンの調製において有用である。本発明の実施に従って提供されるワクチンは、複数のブタＴＴＶの遺伝子型および単離株に対して効果的である。診断用および治療用のポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体もまた、ウイルスの増殖およびワクチンの調製において有用な感染性クローンであるため、本発明の特徴である。本発明の特に重要な態様には、ＴＴＶ ＯＲＦ１タンパク質またはそのペプチド断片を抗原として提供するワクチンが含まれる。
【図７】
【図７】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００８年１０月１６日に出願された米国仮特許出願第６１／１９６４６８号に対する米国特許法第１１９条に基づく利益および優先権を主張するものである。本明細書において、米国国内段階の目的上、米国仮特許出願第６１／１９６４６８号の出願の全内容が、参照により、完全に説明されるのと同程度に、完全な形で本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、トルクテノウイルス（「ＴＴＶ」）の新規な遺伝子型を含む、トルクテノウイルスの新規なヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を対象とするものであり、その全ては、ブタおよび他の動物における疾患を治療および予防するためのワクチンの調製において有用である。本発明の実施に従って提供されるワクチンは、複数のブタＴＴＶの遺伝子型および単離株に対して効果的である。診断用および治療用のポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体もまた、ウイルスの増殖およびワクチンの調製において有用な感染性クローンであるため、本発明の特徴である。特に重要なものとして、単一のＴＴＶオープンリーディングフレームの、とりわけＯＲＦ１またはＯＲＦ２からの発現タンパク質、ならびにＯＲＦ１およびＯＲＦ２にコードされた完全長タンパク質の断片を抗原として包含するワクチンが開示される。
【背景技術】
【０００３】
輸血伝染性ウイルスとも呼ばれるトルクテノウイルス（「ＴＴＶ」）は、通常、サーコウイルス科（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）に属している。ＴＴＶがヒトの輸血患者から最初に単離されたことは、広く認識されている（例えば、Ｎｉｓｈｉｚａｗａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．ｖｏｌ．２４１、１９９７、ｐｐ．９２〜９７を参照されたい）。その後、ＴＴＶまたはＴＴＶ様ウイルスは、ブタを含む他の哺乳動物から同定されており、多くの株または単離株が公表されている（例えば、ＭｃＫｅｏｗｎら、Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ｖｏｌ．１０４、２００４、ｐｐ １１３〜１１７を参照されたい）。
【０００４】
その後の研究は、ＴＴＶおよびＴＴＶ様ウイルスが非常に一般的であることを示しているが、ＴＴＶの発生機序、およびそれが他の病状（例えば、他のウイルスおよび細菌によって生じるもの）に及ぼし得る寄与は、依然として明らかではない。例えば、ＴＴＶ感染は、ヒトにおいて、さらには健康な個体も含めて一般的であると考えられ、このような感染は、無症候性であることが多く、それが数年にわたることもあり得る。さらに、細胞培養物においてウイルスを増殖させることが一般的に不可能であること、および明らかな機構的疾患モデルが全く存在しないことが、ＴＴＶの生態のあらゆる全体的特徴付けを困難にしている。ＴＴＶウイルス血症が、他のウイルス疾患（例えば、肝炎またはＨＩＶ／ＡＩＤＳ）に罹患しているヒト患者において増大しているにもかかわらず、ＴＴＶが実際は非病原性であり、既知の病状との何らかの明らかな実際の関連が待たれているということを示唆する、多数の医学的文献も存在する。例えば、Ｂｉａｇｉｎｉら、Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ｖｏｌ．９８、２００４、ｐｐ．９５〜１０１を参照されたい。
【０００５】
ブタに関して、状況は同様である。ＴＴＶ感染が、豚サーコウイルス疾患（およびその様々な臨床的兆候、例えば、離乳後多臓器性発育不良症候群、および肺病変を合併する呼吸器疾患）、およびＰＲＲＳＶに関連する疾患（豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス）などの、多くの疾患と関連していること、および多くの疾患の一因となることを示唆する、多数の研究が存在する。例えば、公開された国際特許出願ＷＯ２００８／１５０２７５およびＷＯ２００８／１２７２７９を参照されたい。Ｋｒａｋｏｗｋａらはまた、ＰＤＮＳ（豚皮膚炎腎症症候群）と呼ばれる、豚におけるしばしば致命的な疾患について報告しており、ＰＤＮＳは、播種性血管内凝固症候群の兆候として記載されており、また、ＰＤＮＳに、血清型１ ＴＴＶとＰＲＲＳＶウイルスによる混合感染が関与する可能性があった（Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ Ｒｅｓ、ｖｏｌ ６９（１２）、２００８、ｐｐ．１６１５〜１６２２）。ＰＤＮＳ疾患はまた、豚サーコウイルス疾患（特に、ＰＣＶ−２）と関連しており、細菌感染とも関連していた。したがって、多数の研究が成し遂げられているが、依然として、豚のＴＴＶ感染を具体的な病理と決定的に関連付ける研究はほとんどない。とはいえ、ＴＴＶ感染が多くの病状を強化し得るということは、かなり明らかになってきている。したがって、全体的なＴＴＶの生態についての本発明者らの理解を進めるため、かつ、ＴＴＶが一因となり得る多くの病状に対して、直接的または間接的にワクチン接種するための、高親和性抗体などの、例えば、高度に免疫化する、ＴＴＶのペプチド断片または全ウイルス粒子などの、様々なクラスのＴＴＶ試薬が必要とされている。
【０００６】
したがって、ＴＴＶがブタにおける疾患の主な原因因子であるという可能性は存在するが、多くのブタ疾患が、２つ以上のウイルスの存在を必要とする、または特定の「第１の」病原体の第１の効果がＴＴＶ感染によって強化されるという可能性がより高いと考えられる。前述したように、ブタの多くの疾患が、罹患しているまたは罹患している可能性のある動物に抗ＴＴＶ薬を投与することにより、治療され得るまたは減少し得る可能性がある。ＴＴＶへの関心が十分に高まっているにもかかわらず、効果的なワクチンは、いまだ存在しない。
【０００７】
ＴＴＶは、負極性の一本鎖環状ＤＮＡからなる、小さな、エンベロープを有さないウイルスである。ゲノムには、３つの主要なオープンリーディングフレームである、ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、およびＯＲＦ３が含まれ、これらはオーバーラップし、ＯＲＦ１は、カプシドタンパク質をコードする。（上記、Ｂｉａｇｉｎｉら）。その詳細な議論については、参照することにより組み込まれる以下の参照文献、Ｋａｋｋｏｌａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．３８２（２００８）、ｐｐ．１８２〜１８９；Ｍｕｓｈａｈｗａｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、ＵＳＡ、ｖｏｌ ９６、（１９９９）ｐｐ．３１７７〜３１８２；ならびに、２００７年１２月１３日に２００８年のために受理された、Ｔ．ＫｅｋａｒａｉｎｅｎおよびＪ．Ｓｅｇａｌｅｓ、「Ｔｏｒｑｕｅ ｔｅｎｏ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｐｉｇ ａｎｄ ｉｔｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ａｓ ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」、Ｔｈｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｊｏｕｒｎａｌを参照されたい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
比較的単純なゲノムにもかかわらず、細胞培養物において、または他のインビトロでの方法によって、このウイルスを増殖させることは、一般的に非常に困難である。本発明は、感染性クローンを介するものを含む、ＴＴＶのインビトロでの増殖を可能にする、組換え構築物を対象とする。より具体的には、本発明は、効果的なワクチンがＴＴＶから実は作製することができるという発見を対象とし、最も具体的には、ＴＴＶ抗原が、単一のＯＲＦの発現産物またはその断片である場合である。好ましい実施形態において、本発明は、ＯＲＦ１タンパク質ワクチンを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ＴＴＶにより直接的に生じる病状、およびＴＴＶが一因となるまたはＴＴＶにより強化される病状が含まれる、トルクテノウイルス（ＴＴＶ）の感染により生じる動物における疾患または障害を、治療または予防する方法を提供する。好ましい実施例において、治療される動物はブタである。ＴＴＶにより強化され得る、また、本発明の実施に従って治療または予防され得る、ブタにおける病状には、豚サーコウイルス（ＰＣＶ）、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）により生じる、または前記ウイルスに関連する病状が含まれる。
【００１０】
本発明にはまた、混合ワクチン、すなわち、抗原の二価または多価の組合せを投与する選択肢が含まれ、前記組合せには、非ＴＴＶ病原体に対する、生抗原、修飾生抗原、または不活化抗原と、アジュバントの適切な選択とが含まれ得る。
【００１１】
本明細書において開示される固有のＴＴＶアミノ酸配列に一部基づいて、本発明はまた、上記のＴＴＶワクチンでワクチン接種された豚動物と、ＴＴＶの野外株に感染した豚動物とを区別するための診断キットを提供する。
【００１２】
本発明の代表的な実施形態には、
（ａ）-（ａ１）遺伝子型２配列ＴＴＶ１３（配列番号１）のＤＮＡ、遺伝子型２配列ＴＴＶ１０（配列番号２）のＤＮＡ、またはＴＴＶカプシドタンパク質もしくは前記タンパク質の断片をコードする、前記ＤＮＡの断片、
（ａ）-（ａ２）ｔｔｖｇ１−７（配列番号４）、ｔｔｖＧＴ１−１７（配列番号５）、ｔｔｖＧＴ１−２１（配列番号６）、ｔｔｖｇｔ１−２７（配列番号３）、ｔｔｖｇｔ１−１７８（配列番号７）からなる群から選択される遺伝子型１配列のＤＮＡ、またはＴＴＶカプシドタンパク質もしくは前記タンパク質の断片をコードする、前記ＤＮＡの断片、
（ｂ）（ａ）における任意の配列の相補体、
（ｃ）６５℃の、０．５ＭのＮａＨＰＯ４、７％ＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡにおける、フィルターに結合したＤＮＡとのハイブリダイゼーション、および６８℃の、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での洗浄として定義される、ストリンジェントな条件下で、（ａ）または（ｂ）の配列とハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（ｄ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドと少なくとも７０％同一のポリヌクレオチド、
（ｅ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドと少なくとも８０％同一のポリヌクレオチド、
（ｆ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドと少なくとも９０％同一のポリヌクレオチド、
および
（ｇ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドと少なくとも９５％同一のポリヌクレオチド
からなる群から選択されるポリヌクレオチドを包含する、単離されたポリヌクレオチド配列が含まれる。
【００１３】
本発明はさらに、任意のこのようなＤＮＡポリヌクレオチド配列の相補体であるＲＮＡポリヌクレオチド分子、ならびに、任意のこのようなＲＮＡまたはＤＮＡポリヌクレオチドの発現のためのベクターおよびプラスミド、ならびに、このようなヌクレオチド配列から発現されるＴＴＶウイルスのためのベクターおよびプラスミドを提供するものであり、前記ウイルスは、生ウイルスであるか、または完全にもしくは部分的に弱毒化されている。
【００１４】
本発明はまた、前述のポリヌクレオチド配列、および感染性クローンとして機能する対応するヌクレオチド配列を包含する、ＤＮＡワクチンを提供する。
【００１５】
本発明は、遺伝子型２ＴＴＶ１３（配列番号１）もしくは遺伝子型２ＴＴＶ１０（配列番号２）のポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームのいずれかによってコードされるポリペプチド、または前記ポリペプチドもしくはその断片と少なくとも９０％同一のポリペプチドを提供するものであり、これには、さらなる他の同一のアミノ酸が、保存的な置換によって置き換えられるという選択肢が含まれる。
【００１６】
本発明はまた、（全て血清型１の）ｔｔｖｇ１−７（配列番号１０）、ｔｔｖＧＴ１−１７（配列番号１１）、ｔｔｖＧＴ１−２１（配列番号１２）、ｔｔｖｇｔ１−２７（配列番号１３）、およびｔｔｖｇｔ１−１７８（配列番号９）のＯＲＦ１ポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームのいずれかによってコードされるポリペプチド、または前記ポリペプチドもしくはその断片と少なくとも９０％同一のポリペプチドを提供するものであり、これには、さらなる他の同一のアミノ酸が、保存的な置換によって置き換えられるという選択肢が含まれる。
【００１７】
当技術分野において報告されている、ＴＴＶに対する効果的なワクチンの提供に対する（または他の疾患を強化するＴＴＶの能力の制限に対する）継続的な失敗にもかかわらず、本発明は、単一のＴＴＶオープンリーディングフレームの発現の結果生じるポリペプチドまたはその混合物を好ましくは包含する、このような効果的なワクチンを提供する。好ましい実施形態において、ポリペプチドはＯＲＦ１から発現し、好ましい混合物には、ＯＲＦ１およびＯＲＦ２、ならびにＯＲＦ１およびＯＲＦ３のポリペプチドの組合せが含まれる。
【００１８】
さらに好ましい実施形態において、また、本明細書において開示される十分なポリペプチド配列情報を利用して、（ａ）ＴＴＶ１３（配列番号１）もしくはＴＴＶ１０（配列番号２）のカプシドタンパク質の最初の１００個のＮ末端アミノ酸、または（ｂ）それと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、または（ｃ）そのアルギニンに富んだ領域、によって定義される抗原を有するポリペプチドワクチンがさらに提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】（パネルＡおよびＢ）免疫学的方法によるＯＲＦ１タンパク質の検出を示す写真である。
【図２】アフィニティー精製に６×Ｈｉｓタグを用いた、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における、コドンを最適化されたＴＴＶｇ１ＯＲＦ１タンパク質の発現の成功を証明する写真である。
【図３】ワクチン接種ＯＲＦ１タンパク質が（ＣＨＯ細胞内の人工染色体への組み込みの後に）発現される、Ｃｈｒｏｍｏｓ構築物ｐｃＴＶ−ＴＴＶ１−７ ＯＲＦ１（酵母インベルターゼを加えたもの）発現プラスミドについてのベクターマップを示す図である。
【図４】同一性パーセントを編集したものを含む、様々なＴＴＶ株についての系統樹を示す図である。
【図５】（パネルＡ、Ｂ、およびＣ）様々なＴＴＶ単離株から発現されるＯＲＦ１タンパク質の、共通のアルギニンに富んだ領域の同定を示す図である。
【図６】アセンブルされたＴＴＶｇ１−１７８についてのベクターマップを示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００８年１０月１６日に出願された米国仮特許出願第６１／１９６４６８号に対する米国特許法第１１９条に基づく利益および優先権を主張するものである。本明細書において、米国国内段階の目的上、米国仮特許出願第６１／１９６４６８号の出願の全内容が、参照により、完全に説明されるのと同程度に、完全な形で本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、トルクテノウイルス（「ＴＴＶ」）の新規な遺伝子型を含む、トルクテノウイルスの新規なヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を対象とするものであり、その全ては、ブタおよび他の動物における疾患を治療および予防するためのワクチンの調製において有用である。本発明の実施に従って提供されるワクチンは、複数のブタＴＴＶの遺伝子型および単離株に対して効果的である。診断用および治療用のポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体もまた、ウイルスの増殖およびワクチンの調製において有用な感染性クローンであるため、本発明の特徴である。特に重要なものとして、単一のＴＴＶオープンリーディングフレームの、とりわけＯＲＦ１またはＯＲＦ２からの発現タンパク質、ならびにＯＲＦ１およびＯＲＦ２にコードされた完全長タンパク質の断片を抗原として包含するワクチンが開示される。
【背景技術】
【０００３】
輸血伝染性ウイルスとも呼ばれるトルクテノウイルス（「ＴＴＶ」）は、通常、サーコウイルス科（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）に属している。ＴＴＶがヒトの輸血患者から最初に単離されたことは、広く認識されている（例えば、Ｎｉｓｈｉｚａｗａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．ｖｏｌ．２４１、１９９７、ｐｐ．９２〜９７を参照されたい）。その後、ＴＴＶまたはＴＴＶ様ウイルスは、ブタを含む他の哺乳動物から同定されており、多くの株または単離株が公表されている（例えば、ＭｃＫｅｏｗｎら、Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ｖｏｌ．１０４、２００４、ｐｐ １１３〜１１７を参照されたい）。
【０００４】
その後の研究は、ＴＴＶおよびＴＴＶ様ウイルスが非常に一般的であることを示しているが、ＴＴＶの発生機序、およびそれが他の病状（例えば、他のウイルスおよび細菌によって生じるもの）に及ぼし得る寄与は、依然として明らかではない。例えば、ＴＴＶ感染は、ヒトにおいて、さらには健康な個体も含めて一般的であると考えられ、このような感染は、無症候性であることが多く、それが数年にわたることもあり得る。さらに、細胞培養物においてウイルスを増殖させることが一般的に不可能であること、および明らかな機構的疾患モデルが全く存在しないことが、ＴＴＶの生態のあらゆる全体的特徴付けを困難にしている。ＴＴＶウイルス血症が、他のウイルス疾患（例えば、肝炎またはＨＩＶ／ＡＩＤＳ）に罹患しているヒト患者において増大しているにもかかわらず、ＴＴＶが実際は非病原性であり、既知の病状との何らかの明らかな実際の関連が待たれているということを示唆する、多数の医学的文献も存在する。例えば、Ｂｉａｇｉｎｉら、Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ｖｏｌ．９８、２００４、ｐｐ．９５〜１０１を参照されたい。
【０００５】
ブタに関して、状況は同様である。ＴＴＶ感染が、豚サーコウイルス疾患（およびその様々な臨床的兆候、例えば、離乳後多臓器性発育不良症候群、および肺病変を合併する呼吸器疾患）、およびＰＲＲＳＶに関連する疾患（豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス）などの、多くの疾患と関連していること、および多くの疾患の一因となることを示唆する、多数の研究が存在する。例えば、公開された国際特許出願ＷＯ２００８／１５０２７５およびＷＯ２００８／１２７２７９を参照されたい。Ｋｒａｋｏｗｋａらはまた、ＰＤＮＳ（豚皮膚炎腎症症候群）と呼ばれる、豚におけるしばしば致命的な疾患について報告しており、ＰＤＮＳは、播種性血管内凝固症候群の兆候として記載されており、また、ＰＤＮＳに、血清型１ ＴＴＶとＰＲＲＳＶウイルスによる混合感染が関与する可能性があった（Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ Ｒｅｓ、ｖｏｌ ６９（１２）、２００８、ｐｐ．１６１５〜１６２２）。ＰＤＮＳ疾患はまた、豚サーコウイルス疾患（特に、ＰＣＶ−２）と関連しており、細菌感染とも関連していた。したがって、多数の研究が成し遂げられているが、依然として、豚のＴＴＶ感染を具体的な病理と決定的に関連付ける研究はほとんどない。とはいえ、ＴＴＶ感染が多くの病状を強化し得るということは、かなり明らかになってきている。したがって、全体的なＴＴＶの生態についての本発明者らの理解を進めるため、かつ、ＴＴＶが一因となり得る多くの病状に対して、直接的または間接的にワクチン接種するための、高親和性抗体などの、例えば、高度に免疫化する、ＴＴＶのペプチド断片または全ウイルス粒子などの、様々なクラスのＴＴＶ試薬が必要とされている。
【０００６】
したがって、ＴＴＶがブタにおける疾患の主な原因因子であるという可能性は存在するが、多くのブタ疾患が、２つ以上のウイルスの存在を必要とする、または特定の「第１の」病原体の第１の効果がＴＴＶ感染によって強化されるという可能性がより高いと考えられる。前述したように、ブタの多くの疾患が、罹患しているまたは罹患している可能性のある動物に抗ＴＴＶ薬を投与することにより、治療され得るまたは減少し得る可能性がある。ＴＴＶへの関心が十分に高まっているにもかかわらず、効果的なワクチンは、いまだ存在しない。
【０００７】
ＴＴＶは、負極性の一本鎖環状ＤＮＡからなる、小さな、エンベロープを有さないウイルスである。ゲノムには、３つの主要なオープンリーディングフレームである、ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、およびＯＲＦ３が含まれ、これらはオーバーラップし、ＯＲＦ１は、カプシドタンパク質をコードする。（上記、Ｂｉａｇｉｎｉら）。その詳細な議論については、参照することにより組み込まれる以下の参照文献、Ｋａｋｋｏｌａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．３８２（２００８）、ｐｐ．１８２〜１８９；Ｍｕｓｈａｈｗａｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、ＵＳＡ、ｖｏｌ ９６、（１９９９）ｐｐ．３１７７〜３１８２；ならびに、２００７年１２月１３日に２００８年のために受理された、Ｔ．ＫｅｋａｒａｉｎｅｎおよびＪ．Ｓｅｇａｌｅｓ、「Ｔｏｒｑｕｅ ｔｅｎｏ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｐｉｇ ａｎｄ ｉｔｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ａｓ ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」、Ｔｈｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｊｏｕｒｎａｌを参照されたい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
比較的単純なゲノムにもかかわらず、細胞培養物において、または他のインビトロでの方法によって、このウイルスを増殖させることは、一般的に非常に困難である。本発明は、感染性クローンを介するものを含む、ＴＴＶのインビトロでの増殖を可能にする、組換え構築物を対象とする。より具体的には、本発明は、効果的なワクチンがＴＴＶから実は作製することができるという発見を対象とし、最も具体的には、ＴＴＶ抗原が、単一のＯＲＦの発現産物またはその断片である場合である。好ましい実施形態において、本発明は、ＯＲＦ１タンパク質ワクチンを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ＴＴＶにより直接的に生じる病状、およびＴＴＶが一因となるまたはＴＴＶにより強化される病状が含まれる、トルクテノウイルス（ＴＴＶ）の感染により生じる動物における疾患または障害を、治療または予防する方法を提供する。好ましい実施例において、治療される動物はブタである。ＴＴＶにより強化され得る、また、本発明の実施に従って治療または予防され得る、ブタにおける病状には、豚サーコウイルス（ＰＣＶ）、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）により生じる、または前記ウイルスに関連する病状が含まれる。
【００１０】
本発明にはまた、混合ワクチン、すなわち、抗原の二価または多価の組合せを投与する選択肢が含まれ、前記組合せには、非ＴＴＶ病原体に対する、生抗原、修飾生抗原、または不活化抗原と、アジュバントの適切な選択とが含まれ得る。
【００１１】
本明細書において開示される固有のＴＴＶアミノ酸配列に一部基づいて、本発明はまた、上記のＴＴＶワクチンでワクチン接種された豚動物と、ＴＴＶの野外株に感染した豚動物とを区別するための診断キットを提供する。
【００１２】
本発明の代表的な実施形態には、
（ａ）-（ａ１）遺伝子型２配列ＴＴＶ１３（配列番号１）のＤＮＡ、遺伝子型２配列ＴＴＶ１０（配列番号２）のＤＮＡ、またはＴＴＶカプシドタンパク質もしくは前記タンパク質の断片をコードする、前記ＤＮＡの断片、
（ａ）-（ａ２）ｔｔｖｇ１−７（配列番号４）、ｔｔｖＧＴ１−１７（配列番号５）、ｔｔｖＧＴ１−２１（配列番号６）、ｔｔｖｇｔ１−２７（配列番号３）、ｔｔｖｇｔ１−１７８（配列番号７）からなる群から選択される遺伝子型１配列のＤＮＡ、またはＴＴＶカプシドタンパク質もしくは前記タンパク質の断片をコードする、前記ＤＮＡの断片、
（ｂ）（ａ）における任意の配列の相補体、
（ｃ）６５℃の、０．５ＭのＮａＨＰＯ４、７％ＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡにおける、フィルターに結合したＤＮＡとのハイブリダイゼーション、および６８℃の、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での洗浄として定義される、ストリンジェントな条件下で、（ａ）または（ｂ）の配列とハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（ｄ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドと少なくとも７０％同一のポリヌクレオチド、
（ｅ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドと少なくとも８０％同一のポリヌクレオチド、
（ｆ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドと少なくとも９０％同一のポリヌクレオチド、
および
（ｇ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドと少なくとも９５％同一のポリヌクレオチド
からなる群から選択されるポリヌクレオチドを包含する、単離されたポリヌクレオチド配列が含まれる。
【００１３】
本発明はさらに、任意のこのようなＤＮＡポリヌクレオチド配列の相補体であるＲＮＡポリヌクレオチド分子、ならびに、任意のこのようなＲＮＡまたはＤＮＡポリヌクレオチドの発現のためのベクターおよびプラスミド、ならびに、このようなヌクレオチド配列から発現されるＴＴＶウイルスのためのベクターおよびプラスミドを提供するものであり、前記ウイルスは、生ウイルスであるか、または完全にもしくは部分的に弱毒化されている。
【００１４】
本発明はまた、前述のポリヌクレオチド配列、および感染性クローンとして機能する対応するヌクレオチド配列を包含する、ＤＮＡワクチンを提供する。
【００１５】
本発明は、遺伝子型２ＴＴＶ１３（配列番号１）もしくは遺伝子型２ＴＴＶ１０（配列番号２）のポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームのいずれかによってコードされるポリペプチド、または前記ポリペプチドもしくはその断片と少なくとも９０％同一のポリペプチドを提供するものであり、これには、さらなる他の同一のアミノ酸が、保存的な置換によって置き換えられるという選択肢が含まれる。
【００１６】
本発明はまた、（全て血清型１の）ｔｔｖｇ１−７（配列番号１０）、ｔｔｖＧＴ１−１７（配列番号１１）、ｔｔｖＧＴ１−２１（配列番号１２）、ｔｔｖｇｔ１−２７（配列番号１３）、およびｔｔｖｇｔ１−１７８（配列番号９）のＯＲＦ１ポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームのいずれかによってコードされるポリペプチド、または前記ポリペプチドもしくはその断片と少なくとも９０％同一のポリペプチドを提供するものであり、これには、さらなる他の同一のアミノ酸が、保存的な置換によって置き換えられるという選択肢が含まれる。
【００１７】
当技術分野において報告されている、ＴＴＶに対する効果的なワクチンの提供に対する（または他の疾患を強化するＴＴＶの能力の制限に対する）継続的な失敗にもかかわらず、本発明は、単一のＴＴＶオープンリーディングフレームの発現の結果生じるポリペプチドまたはその混合物を好ましくは包含する、このような効果的なワクチンを提供する。好ましい実施形態において、ポリペプチドはＯＲＦ１から発現し、好ましい混合物には、ＯＲＦ１およびＯＲＦ２、ならびにＯＲＦ１およびＯＲＦ３のポリペプチドの組合せが含まれる。
【００１８】
さらに好ましい実施形態において、また、本明細書において開示される十分なポリペプチド配列情報を利用して、（ａ）ＴＴＶ１３（配列番号１）もしくはＴＴＶ１０（配列番号２）のカプシドタンパク質の最初の１００個のＮ末端アミノ酸、または（ｂ）それと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、または（ｃ）そのアルギニンに富んだ領域、によって定義される抗原を有するポリペプチドワクチンがさらに提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】（パネルＡおよびＢ）免疫学的方法によるＯＲＦ１タンパク質の検出を示す写真である。
【図２】アフィニティー精製に６×Ｈｉｓタグを用いた、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における、コドンを最適化されたＴＴＶｇ１ＯＲＦ１タンパク質の発現の成功を証明する写真である。
【図３】ワクチン接種ＯＲＦ１タンパク質が（ＣＨＯ細胞内の人工染色体への組み込みの後に）発現される、Ｃｈｒｏｍｏｓ構築物ｐｃＴＶ−ＴＴＶ１−７ ＯＲＦ１（酵母インベルターゼを加えたもの）発現プラスミドについてのベクターマップを示す図である。
【図４】同一性パーセントを編集したものを含む、様々なＴＴＶ株についての系統樹を示す図である。
【図５】（パネルＡ、Ｂ、およびＣ）様々なＴＴＶ単離株から発現されるＯＲＦ１タンパク質の、共通のアルギニンに富んだ領域の同定を示す図である。
【図６】アセンブルされたＴＴＶｇ１−１７８についてのベクターマップを示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）-（ａ１）遺伝子型２配列ＴＴＶ１３（配列番号１）のＤＮＡ、遺伝子型２配列ＴＴＶ１０（配列番号２）のＤＮＡ、またはＴＴＶカプシドタンパク質もしくは前記タンパク質の断片をコードする、前記ＤＮＡの断片、
（ａ）-（ａ２）ｔｔｖｇ１−７（配列番号４）、ｔｔｖＧＴ１−１７（配列番号５）、ｔｔｖＧＴ１−２１（配列番号６）、ｔｔｖｇｔ１−２７（配列番号３）、およびｔｔｖｇｔ１−１７８（配列番号７）からなる群から選択される遺伝子型１配列のＤＮＡ、またはＴＴＶカプシドタンパク質もしくは前記タンパク質の断片をコードする、前記ＤＮＡの断片、
（ｂ）（ａ）における配列の相補体、
（ｃ）６５℃の、０．５ＭのＮａＨＰＯ４、７％ＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡにおける、フィルターに結合したＤＮＡとのハイブリダイゼーション、および６８℃の、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での洗浄として定義される、ストリンジェントな条件下で、（ａ）または（ｂ）の配列とハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（ｄ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドと少なくとも７０％同一のポリヌクレオチド、
（ｅ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドと少なくとも８０％同一のポリヌクレオチド、
（ｆ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドと少なくとも９０％同一のポリヌクレオチド、
および
（ｇ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドと少なくとも９５％同一のポリヌクレオチド
からなる群から選択されるポリヌクレオチドを包含する、単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡポリヌクレオチド配列の相補体であるＲＮＡポリヌクレオチド分子。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載のポリヌクレオチドを包含するベクターまたはプラスミド。
【請求項４】
請求項３に記載のベクターまたはプラスミドを包含する宿主細胞。
【請求項５】
請求項１に記載のヌクレオチド配列から発現されるウイルスであって、生ウイルスであるか、または完全にもしくは部分的に弱毒化されているウイルス。
【請求項６】
請求項５に記載のウイルスを包含するワクチン。
【請求項７】
請求項１に記載のポリヌクレオチド配列を包含するＤＮＡワクチン。
【請求項８】
ＴＴＶ１３（配列番号１）もしくはＴＴＶ１０（配列番号２）のポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームのいずれかによってコードされるポリペプチド、または前記ポリペプチドもしくはその断片と少なくとも９０％同一のポリペプチド。
【請求項９】
ｔｔｖｇ１−７（配列番号１０）、ｔｔｖＧＴ１−１７（配列番号１１）、ｔｔｖＧＴ１−２１（配列番号１２）、およびｔｔｖｇｔ１−２７（配列番号１３）のポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームのいずれかによってコードされるポリペプチド、または前記ポリペプチドもしくはその断片と少なくとも９０％同一のポリペプチド。
【請求項１０】
請求項８または請求項９に記載のポリペプチドを包含するワクチン。
【請求項１１】
（ａ）ＴＴＶ１３（配列番号１）もしくはＴＴＶ１０（配列番号２）のカプシドタンパク質の最初の１００個のＮ末端アミノ酸、（ｂ）それと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、または（ｃ）そのアルギニンに富んだ領域、を包含するペプチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載のペプチドを包含するワクチン組成物。
【請求項１３】
請求項８、９、または１１に記載のタンパク質またはペプチドに特異的に結合する、モノクローナル抗体組成物またはポリクローナル抗体組成物。
【請求項１４】
ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、またはＯＲＦ３からなる群から選択されるオープンリーディングフレームによってコードされる１つまたは複数のポリペプチドを包含するワクチン。
【請求項１】
（ａ）-（ａ１）遺伝子型２配列ＴＴＶ１３（配列番号１）のＤＮＡ、遺伝子型２配列ＴＴＶ１０（配列番号２）のＤＮＡ、またはＴＴＶカプシドタンパク質もしくは前記タンパク質の断片をコードする、前記ＤＮＡの断片、
（ａ）-（ａ２）ｔｔｖｇ１−７（配列番号４）、ｔｔｖＧＴ１−１７（配列番号５）、ｔｔｖＧＴ１−２１（配列番号６）、ｔｔｖｇｔ１−２７（配列番号３）、およびｔｔｖｇｔ１−１７８（配列番号７）からなる群から選択される遺伝子型１配列のＤＮＡ、またはＴＴＶカプシドタンパク質もしくは前記タンパク質の断片をコードする、前記ＤＮＡの断片、
（ｂ）（ａ）における配列の相補体、
（ｃ）６５℃の、０．５ＭのＮａＨＰＯ４、７％ＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡにおける、フィルターに結合したＤＮＡとのハイブリダイゼーション、および６８℃の、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での洗浄として定義される、ストリンジェントな条件下で、（ａ）または（ｂ）の配列とハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（ｄ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドと少なくとも７０％同一のポリヌクレオチド、
（ｅ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドと少なくとも８０％同一のポリヌクレオチド、
（ｆ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドと少なくとも９０％同一のポリヌクレオチド、
および
（ｇ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドと少なくとも９５％同一のポリヌクレオチド
からなる群から選択されるポリヌクレオチドを包含する、単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡポリヌクレオチド配列の相補体であるＲＮＡポリヌクレオチド分子。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載のポリヌクレオチドを包含するベクターまたはプラスミド。
【請求項４】
請求項３に記載のベクターまたはプラスミドを包含する宿主細胞。
【請求項５】
請求項１に記載のヌクレオチド配列から発現されるウイルスであって、生ウイルスであるか、または完全にもしくは部分的に弱毒化されているウイルス。
【請求項６】
請求項５に記載のウイルスを包含するワクチン。
【請求項７】
請求項１に記載のポリヌクレオチド配列を包含するＤＮＡワクチン。
【請求項８】
ＴＴＶ１３（配列番号１）もしくはＴＴＶ１０（配列番号２）のポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームのいずれかによってコードされるポリペプチド、または前記ポリペプチドもしくはその断片と少なくとも９０％同一のポリペプチド。
【請求項９】
ｔｔｖｇ１−７（配列番号１０）、ｔｔｖＧＴ１−１７（配列番号１１）、ｔｔｖＧＴ１−２１（配列番号１２）、およびｔｔｖｇｔ１−２７（配列番号１３）のポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームのいずれかによってコードされるポリペプチド、または前記ポリペプチドもしくはその断片と少なくとも９０％同一のポリペプチド。
【請求項１０】
請求項８または請求項９に記載のポリペプチドを包含するワクチン。
【請求項１１】
（ａ）ＴＴＶ１３（配列番号１）もしくはＴＴＶ１０（配列番号２）のカプシドタンパク質の最初の１００個のＮ末端アミノ酸、（ｂ）それと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、または（ｃ）そのアルギニンに富んだ領域、を包含するペプチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載のペプチドを包含するワクチン組成物。
【請求項１３】
請求項８、９、または１１に記載のタンパク質またはペプチドに特異的に結合する、モノクローナル抗体組成物またはポリクローナル抗体組成物。
【請求項１４】
ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、またはＯＲＦ３からなる群から選択されるオープンリーディングフレームによってコードされる１つまたは複数のポリペプチドを包含するワクチン。
【図７】Ｃｈｒｏｍｏｓ発現ｇ１ＴＴＶ ＯＲＦ１が、チャレンジ対照と比較して、肺病変を有意に低減させたこと、ならびに、同様にチャレンジ対照と比較して、ｇ１ＴＴＶウイルス血症の程度および期間を低減させることを実証する図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
配列表の簡単な説明
配列番号１は、遺伝子型ｇｔ２ ＴＴＶ１０ ＤＮＡ配列を示す。
【００２１】
配列番号２は、遺伝子型２ｇｔ２ ＴＴＶ１３ ＤＮＡ配列を示す。
【００２２】
配列番号３は、遺伝子型１ ｔｔｖｇｔ１−２７ ＤＮＡ配列を示す。
【００２３】
配列番号４は、遺伝子型１ ｔｔｖｇｔ１−７ ＤＮＡ配列を示す。
【００２４】
配列番号５は、遺伝子型１ ｔｔｖｇｔ１−１７ ＤＮＡ配列を示す。
【００２５】
配列番号６は、遺伝子型１ ｔｔｖｇｔ１−２１ ＤＮＡ配列を示す。
【００２６】
配列番号７は、遺伝子型１ ｔｔｖｇｔ１−１７８ ＤＮＡ配列を示す。
【００２７】
配列番号８は、ＴＴＶ株ＡＹ８２３９９１ ＯＲＦ１のアミノ酸配列を示す。
【００２８】
配列番号９は、ＴＴＶ株ｔｔｖｇｔ１−１７８ ＯＲＦ１（ＴＴＶ遺伝子型１）のアミノ酸配列を示す。
【００２９】
配列番号１０は、ＴＴＶ株ｔｔｖｇｔ１−７ ＯＲＦ１のアミノ酸配列を示す。
【００３０】
配列番号１１は、ＴＴＶ株ｔｔｖｇｔ１−１７ ＯＲＦ１のアミノ酸配列を示す。
【００３１】
配列番号１２は、ＴＴＶ株ｔｔｖｇｔ１−２１ ＯＲＦ１のアミノ酸配列を示す。
【００３２】
配列番号１３は、ＴＴＶ株ｔｔｖｇｔ１−２７ ＯＲＦ１のアミノ酸配列を示す。
【００３３】
配列番号１４は、ＴＴＶ株ｇｔ２ ＴＴＶ１０ ＯＲＦ１（遺伝子型２）のアミノ酸配列を示す。
【００３４】
配列番号１５は、ＴＴＶ株ｇｔ２ ＴＴＶ１３ ＯＲＦ１のアミノ酸配列を示す。
【００３５】
配列番号１６は、既知の株ＡＹ８２３９９１、遺伝子型２のＤＮＡ配列を示す。
【００３６】
配列番号１７は、既知の株ＡＹ８２３９９０、遺伝子型１のＤＮＡ配列を示す。
【００３７】
配列番号１８は、ｐＵＣ５７ ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ベクター中にクローニングされた、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）についてコドンを最適化された、７６０５７−３ ＴＴＶカプシドコード配列を示す。
【００３８】
配列番号１９は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）発現プラスミド中にクローニングされた、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）についてコドンを最適化された、７６０５７−４ ＴＴＶカプシドコード配列を示す。
【００３９】
配列番号２０は、ｐＵＣ５７ ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ベクター中にクローニングされた、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）にコドンを最適化された、７６０５７−５ ＴＴＶカプシドコード配列を示す。
【００４０】
配列番号２１は、酵母インベルターゼ発現タグ（ＹＩ）を有する、ｔｔｖｇｔ１−７ ＯＲＦ１をコードする構築物についてのＤＮＡ配列を示す。
【００４１】
配列番号２２は、アミド化された形態のＣ末端のＡＡと共に用いられる、残基１６７〜１８５に対応するＯＲＦ１カプシドタンパク質から得られるｔｔｖｇｔ１ペプチド配列（対応するＡＹ８２３９９０配列に基づいた番号付け）を示す。
【００４２】
配列番号２３は、残基４５９〜４７９に対応するＯＲＦ１カプシドタンパク質から得られるｔｔｖｇｔ１ペプチド配列（対応するＡＹ８２３９９０配列に基づいた番号付け）を示す。
【００４３】
配列番号２４は、残基６１２〜６３７に対応するＯＲＦ１カプシドタンパク質から得られるｔｔｖｇｔ１ペプチド配列（対応するＡＹ８２３９９０配列に基づいた番号付け）を示す。
【００４４】
配列番号２５は、ＴＴＶ株ＡＹ８２３９９０ ＯＲＦ１のアミノ酸配列を示す。
【００４５】
配列番号２６〜２９は、プライマー配列を定義する。
【００４６】
配列についての記載に関連して、当業者であれば、多くのわずかに異なる省略形、例えば、ｇ１ＴＴＶ、ＴＴＶｇ１、遺伝子型１ ＴＴＶ、血清型１ ＴＴＶ、ｇｔ１ＴＴＶなどが、特定の血清型についてほぼ同じ意味で一般に用いられることが認識されよう。同様の状況が遺伝子型２にも当てはまる。
【００４７】
以下の定義および導入事項は、明細書内で適用可能である。
【００４８】
「豚（ｐｏｒｃｉｎｅ）」および「ブタ（ｓｗｉｎｅ）」という用語は、本明細書においてほぼ同じ意味で用いられ、イノシシ科の構成要員である任意の動物、例えば豚（ｐｉｇ）を言う。「哺乳動物」には、ヒトを含む、哺乳綱の任意の温血脊椎動物が含まれる。
【００４９】
本発明のための「感染性ＤＮＡ分子」は、適切な宿主細胞における、機能的ウイルス粒子への、ウイルスの複製、転写、および翻訳に必要なエレメントをコードするＤＮＡ分子である。
【００５０】
同様に、「単離されたポリヌクレオチド分子」は、存在する場合は、自然に生じる状態からある程度検出可能な程度に精製された、本発明のポリヌクレオチド分子を包含する物質の組成物を言う。
【００５１】
本発明の目的では、第２のポリヌクレオチド分子（ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか）のヌクレオチド配列は、第１のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列に「相同」であるか、または前記第１のポリヌクレオチド分子に対する「同一性」を有しており、第２のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列は、遺伝暗号の縮重に基づいて、第１のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列と同一のポリアミノ酸をコードするか、または本発明の実施において有用となるように、第１のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列によってコードされるポリアミノ酸に十分に類似したポリアミノ酸をコードする。相同なポリヌクレオチド配列はまた、センス鎖およびアンチセンス鎖のことを言い、全ての場合において、任意のこのような鎖の相補体を言う。本発明の目的では、ポリヌクレオチド分子は、本発明の実施において有用であり、したがって、相同であるかまたは同一性を有しており、これは、例えば標準的なハイブリダイゼーション技術または増幅技術によって、感染した豚の体液試料または組織試料におけるＴＴＶウイルスまたはウイルスポリヌクレオチドの存在を検出するための、診断用プローブとして用いることができる。通常、第２のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列は、それが、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズム（米国国立衛生研究所の、ＮＣＢＩとしても知られている国立バイオテクノロジー情報センター（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵＳＡ））に基づいて、第１のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％のヌクレオチド配列同一性を有する場合、第１のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列に相同である。本発明の実施に従った計算についての具体的な実施例において、ＢＬＡＳＴＰ ２．２．６［Ｔａｔｕｓｏｖａ ＴＡおよびＴＬ Ｍａｄｄｅｎ、「ＢＬＡＳＴ ２ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ− ａ ｎｅｗ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」（１９９９）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．１７４：２４７〜２５０］が参照される。簡潔に述べると、２つのアミノ酸配列が、ギャップオープニングペナルティー１０、ギャップ伸長ペナルティー０．１、ならびに、ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆの「ｂｌｏｓｕｍ６２」スコアリングマトリクス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５〜１０９１９．１９９２）を用いて、アラインメントスコアを最適化するためにアラインされる。次に、同一性パーセントが、同一マッチの総数×１００を、長い方の配列の長さ＋２つの配列をアラインするために長い方の配列中に導入されたギャップの数で割ったものとして計算される。
【００５２】
好ましくは、相同なヌクレオチド配列は、少なくとも約７５％のヌクレオチド配列同一性を有し、さらに好ましくは、少なくとも約８０％、８５％、９０％、および９５％のヌクレオチド配列同一性を有する。遺伝暗号は縮重するため、相同なヌクレオチド配列は、任意の数の「サイレント」な塩基変化、すなわち、それでもなお同一のアミノ酸をコードする、ヌクレオチド置換を含み得る
【００５３】
相同なヌクレオチド配列はさらに、サイレントではない突然変異、すなわち、コードされるポリアミノ酸においてアミノ酸の違いをもたらす、塩基の置換、欠失、または付加を含有し得るが、それは、配列が、第１のヌクレオチド配列によってコードされるポリアミノ酸と少なくとも約７０％同一性を維持しているか、または他の形で本発明の実施に有用である場合に限る。これに関して、全体的なタンパク質機能を不活化しないと通常は認識される、特定の保存的なアミノ酸置換がなされてもよく、例えば、正に荷電したアミノ酸（また逆も同様である）である、リジン、アルギニン、およびヒスチジンに関するもの、負に荷電したアミノ酸（またその逆も同様である）である、アスパラギン酸およびグルタミン酸に関するもの、ならびに、中性に荷電したアミノ酸（全ての場合において、ここでも、また逆も同様である）の特定の群である、（１）アラニンおよびセリン、（２）アスパラギン、グルタミン、およびヒスチジン、（３）システインおよびセリン、（４）グリシンおよびプロリン、（５）イソロイシン、ロイシン、およびバリン、（５）メチオニン、ロイシン、およびイソロイシン、（６）フェニルアラニン、メチオニン、ロイシン、およびチロシン、（６）セリンおよびスレオニン、（７）トリプトファンおよびチロシン、（８）そして例えばチロシン、トリプトファン、およびフェニルアラニンに関するものである。
【００５４】
相同なヌクレオチド配列は、例えば上記のＢＬＡＳＴＮを用いることによる、ヌクレオチド配列の比較によって決定することができる。あるいは、相同なヌクレオチド配列は、選択された条件下でのハイブリダイゼーションによって決定することができる。例えば、第２のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列は、中程度にストリンジェントな条件下で、例えば、６５℃の、０．５ＭのＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭのＥＤＴＡにおける、フィルターに結合したＤＮＡとのハイブリダイゼーション、および４２℃の、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９４、ｐｐ．６．０．３〜６．４．１０を参照されたい）で、または以下に定義されるＴＴＶウイルスをコードする配列のハイブリダイゼーションを他の形でもたらす条件下で、配列番号１の相補体にハイブリダイズする場合、配列番号１（または任意の他の特定のポリヌクレオチド配列）に相同である。ハイブリダイゼーション条件における変更は、経験的に決定することができるか、またはプローブのグアノシン／シトシン（ＧＣ）塩基対の長さおよびパーセンテージに基づいて、正確に計算することができる。ハイブリダイゼーション条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）、ｐｐ．９．４７〜９．５１において記載されている通り計算することができる。
【００５５】
別の実施形態において、第２のヌクレオチド配列は、高度にストリンジェントな条件下で、例えば、当技術分野において知られているような、６５℃の、０．５ＭのＮａＨＰＯ４、７％ＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡにおける、フィルターに結合したＤＮＡとのハイブリダイゼーション、および６８℃の、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での洗浄で、配列番号１の相補体にハイブリダイズする場合、配列番号１（または本発明の任意の他の配列）に相同である。
【００５６】
本発明の単離されたポリヌクレオチド分子および単離されたＲＮＡ分子に、合成分子と、インビトロでのクローニングおよび転写などの組換え技術を介して得られた分子との両方が含まれることが、さらに理解される。
【００５７】
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチド
本発明の代表的な実施形態には、
（ａ）-（ａ１）遺伝子型２配列ＴＴＶ１３（配列番号１）のＤＮＡ、遺伝子型２配列ＴＴＶ１０（配列番号２）のＤＮＡ、またはＴＴＶカプシドタンパク質（Capsid protein）もしくは前記タンパク質の断片をコードする、前記ＤＮＡの断片、
（ａ）-（ａ２）ｔｔｖｇ１−７（配列番号４）、ｔｔｖＧＴ１−１７（配列番号５）、ｔｔｖＧＴ１−２１（配列番号６）、ｔｔｖｇｔ１−２７（配列番号３）、ｔｔｖｇｔ１−１７８（配列番号７）からなる群から選択される遺伝子型１配列のＤＮＡ、またはＴＴＶカプシドタンパク質もしくは前記タンパク質の断片をコードする、前記ＤＮＡの断片、
（ｂ）（ａ）における任意の配列の相補体、
（ｃ）６５℃の、０．５ＭのＮａＨＰＯ４、７％ＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡにおける、フィルターに結合したＤＮＡとのハイブリダイゼーション、および６８℃の、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での洗浄として定義される、ストリンジェントな条件下で、（ａ）または（ｂ）の配列とハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（ｄ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドと少なくとも７０％同一のポリヌクレオチド、
（ｅ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドと少なくとも８０％同一のポリヌクレオチド、
（ｆ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドと少なくとも９０％同一のポリヌクレオチド、
および
（ｇ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドと少なくとも９５％同一のポリヌクレオチド
からなる群から選択されるポリヌクレオチドを包含する、単離されたポリヌクレオチド配列が含まれる。
【００５８】
本発明はまた、遺伝子型２ＴＴＶ１３（配列番号１）もしくは遺伝子型２ＴＴＶ１０（配列番号２）のポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームのいずれかによってコードされるポリペプチド、または前記ポリペプチドもしくはその断片と少なくとも９０％同一のポリペプチドを提供するものであり、これには、さらなる他の同一のアミノ酸が、保存的な置換によって置き換えられるという選択肢が含まれる。
【００５９】
本発明はまた、（全て血清型１の）ｔｔｖｇ１−７（配列番号１０）、ｔｔｖＧＴ１−１７（配列番号１１）、ｔｔｖＧＴ１−２１（配列番号１２）、ｔｔｖｇｔ１−２７（配列番号１３）、およびｔｔｖｇｔ１−１７８（配列番号９）のＯＲＦ１ポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームのいずれかによってコードされるポリペプチド、または前記ポリペプチドもしくはその断片と少なくとも９０％同一のポリペプチドを提供するものであり、これには、さらなる他の同一のアミノ酸が、保存的な置換によって置き換えられるという選択肢が含まれる。
【００６０】
好ましい実施形態において、ポリペプチドはＯＲＦ１から発現し、好ましい混合物には、ＯＲＦ１およびＯＲＦ２、ならびにＯＲＦ１およびＯＲＦ３のポリペプチドの組合せが含まれる。
【００６１】
さらに好ましい実施形態において、ＴＴＶポリペプチドに基づいたワクチンがさらに提供され、前記ワクチンにおいて、抗原は、
（ａ）ＴＴＶ１３（配列番号１）もしくはＴＴＶ１０（配列番号２）のＯＲＦ１カプシドタンパク質の最初の３００個のＮ末端アミノ酸、または（ｂ）それと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｂ）ＴＴＶ１３（配列番号１）もしくはＴＴＶ１０（配列番号２）のＯＲＦ１カプシドタンパク質の最初の２００個のＮ末端アミノ酸、または（ｂ）それと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｃ）ＴＴＶ１３（配列番号１）もしくはＴＴＶ１０（配列番号２）のＯＲＦ１カプシドタンパク質の最初の１００個のＮ末端アミノ酸、または（ｂ）それと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｄ）（全て血清型１の）ｔｔｖｇ１−７（配列番号１０）、ｔｔｖＧＴ１−１７（配列番号１１）、ｔｔｖＧＴ１−２１（配列番号１２）、ｔｔｖｇｔ１−２７（配列番号１３）、およびｔｔｖｇｔ１−１７８（配列番号９）のいずれかのＯＲＦ１カプシドタンパク質の最初の３００個のＮ末端アミノ酸、またはそれと少なくとも９０％同一のポリペプチド、
（ｅ）（全て血清型１の）ｔｔｖｇ１−７（配列番号１０）、ｔｔｖＧＴ１−１７（配列番号１１）、ｔｔｖＧＴ１−２１（配列番号１２）、ｔｔｖｇｔ１−２７（配列番号１３）、およびｔｔｖｇｔ１−１７８（配列番号９）のいずれかのＯＲＦ１カプシドタンパク質の最初の２００個のＮ末端アミノ酸、またはそれと少なくとも９０％同一のポリペプチド、
（ｆ）（全て血清型１の）ｔｔｖｇ１−７（配列番号１０）、ｔｔｖＧＴ１−１７（配列番号１１）、ｔｔｖＧＴ１−２１（配列番号１２）、ｔｔｖｇｔ１−２７（配列番号１３）、およびｔｔｖｇｔ１−１７８（配列番号９）のいずれかのＯＲＦ１カプシドタンパク質の最初の１００個のＮ末端アミノ酸、またはそれと少なくとも９０％同一のポリペプチド
によって定義される。
【００６２】
さらなる遺伝子操作
本発明により提供されるＤＮＡ配列およびアミノ酸配列の情報はまた、ウイルス遺伝子およびそれらがコードする遺伝子産物の構造および機能の系統的分析も可能にする。本発明のウイルス遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドについての知識もまた、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを認識しそれにハイブリダイズする、アンチセンスポリヌクレオチド、またはその断片を利用可能にする。完全長の、および断片状のアンチセンスポリヌクレオチドが、この態様において有用である。当業者であれば、本発明の断片状のアンチセンス分子に、（ｉ）特定のＲＮＡを特異的に認識しそれにハイブリダイズするもの（本発明のウイルスポリペプチドをコードするＤＮＡの配列比較によって決定される）、および（ｉｉ）コードされるタンパク質の変異体をコードするＲＮＡを認識しそれにハイブリダイズするもの、が含まれることが理解されよう。他のＴＴＶペプチドをコードするＲＮＡ／ＤＮＡにハイブリダイズするアンチセンスポリヌクレオチドもまた、分子群についての特徴的配列または特性配列を同定するための配列比較によって、同定可能である。このような技術（実施例８を参照されたい）はさらに、ＴＴＶポリペプチドにおける抗原性ドメインの研究において有用であり、サーコウイルス科（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）の、ＴＴＶ以外の関係の薄い構成要員への宿主動物の感染と区別するためにも用いることができる。
【００６３】
実施例４は、本発明の構築物のための、酵母および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現の増強のための、効果的なコドンの最適化に関するガイダンスを提供する。
【００６４】
ワクチン製剤
本発明のワクチンは、標準的な緩衝液、安定剤、希釈剤、保存剤、および／または可溶化剤などの、ヒトを含む（適用可能である場合）動物に許容可能な担体を含めるための、一般に認められている常法に従って製剤することができ、また、持続放出を容易にするために製剤することができる。希釈剤には、水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロールなどが含まれる。等張性のための添加剤には、とりわけ、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースが含まれる。安定剤には、とりわけ、アルブミンが含まれる。修飾生ワクチンの製剤において特に有用なものを含む、他の適切なワクチン賦形剤および添加剤は、当業者に知られているか、または明らかであろう。例えば、参照することにより本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１８版、１９９０、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇを参照されたい。
【００６５】
本発明のワクチンはさらに、例えばとりわけアジュバントまたはサイトカインなどの、１つまたは複数のさらなる免疫調節成分を包含し得る。本発明のワクチンにおいて用いることができるアジュバントの非限定的な例には、ＲＩＢＩアジュバント系（Ｒｉｂｉ Ｉｎｃ．、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）、ミョウバン、水酸化アルミニウムゲルなどの無機物ゲル、水中油型エマルジョン、例えばフロイント完全アジュバントおよび不完全アジュバントなどの油中水型エマルジョン、ブロックコポリマー（ＣｙｔＲｘ、Ａｔｌａｎｔａ ＧＡ）、ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ）、ＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ ＣＡ）、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）アジュバント、サポニン、Ｑｕｉｌ Ａ、または他のサポニン画分、モノホスホリル脂質Ａ、イオン性多糖、およびアブリジン脂質アミンアジュバントが含まれる。本発明のワクチンにおいて有用な水中油型エマルジョンの非限定的な例には、修飾ＳＥＡＭ６２製剤およびＳＥＡＭ１／２製剤が含まれる。修飾ＳＥＡＭ６２は、５％（ｖ／ｖ）のスクアレン（Ｓｉｇｍａ）、１％（ｖ／ｖ）のＳＰＡＮ（登録商標）８５洗浄剤（ＩＣＩ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ）、０．７％（ｖ／ｖ）のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０洗浄剤（ＩＣＩ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ）、２．５％（ｖ／ｖ）のエタノール、２００μｇ／ｍｌのＱｕｉｌ Ａ、１００μｇ／ｍｌのコレステロール、および０．５％（ｖ／ｖ）のレシチンを含有する、水中油型エマルジョンである。修飾ＳＥＡＭ１／２は、５％（ｖ／ｖ）のスクアレン、１％（ｖ／ｖ）のＳＰＡＮ（登録商標）８５洗浄剤、０．７％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ８０洗浄剤、２．５％（ｖ／ｖ）のエタノール、１００μｇ／ｍｌのＱｕｉｌ Ａ、および５０μｇ／ｍｌのコレステロールを含有する、水中油型エマルジョンである。ワクチンに含めることのできる、他の免疫調節物質には、例えば、１つまたは複数のインターロイキン、インターフェロン、または他の既知のサイトカインが含まれる。
【００６６】
さらなるアジュバント系により、ヘルパーＴ細胞のエピトープとＢ細胞のエピトープとの両方の組合せが可能になり、それにより、１つまたは複数のタイプの、共有結合したＴ−Ｂエピトープ構造がもたらされ、それは、ＷＯ２００６／０８４３１９、ＷＯ２００４／０１４９５７、およびＷＯ２００４／０１４９５６において記載されているように、さらに脂質付加され得る。
【００６７】
本発明の好ましい実施形態において、ＯＲＦＩ ＴＴＶタンパク質もしくは他のＴＴＶタンパク質、またはその断片は、５％のＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）と共に製剤される。
【００６８】
本発明のワクチンは、本発明のウイルス、感染性ＤＮＡ分子、プラスミド、またはウイルスベクターの持続放出のために製剤されていてもよい。このような持続放出製剤の例には、生体適合性ポリマーの複合物、例えばポリ乳酸、乳酸グリコール酸共重合体、メチルセルロース、ヒアルロン酸、コラーゲンなどと組み合わされた、ウイルス、感染性ＤＮＡ分子、プラスミド、またはウイルスベクターが含まれる。薬剤送達賦形剤における分解性ポリマーの構造、選択、および使用は、参照することにより本明細書に組み込まれる、Ａ．Ｄｏｍｂら、１９９２、Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ３：２７９〜２９２を含む、いくつかの刊行物において概説されている。医薬品製剤におけるポリマーの選択および使用におけるさらなるガイダンスは、当技術分野において知られている文書において、例えば、参照することにより同様に本明細書に組み込まれる、Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｖｏｌ．４５、Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹにおける、Ｍ．ＣｈａｓｉｎおよびＲ．Ｌａｎｇｅｒ（編）、１９９０、「Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｓ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ」において見ることができる。別法として、またはさらに、ウイルス、プラスミド、またはウイルスベクターを、投与および有効性を向上させるために、マイクロカプセル化することができる。抗原をマイクロカプセル化するための方法は、当技術分野において周知であり、例えば、参照することにより全て本明細書に組み込まれる、米国特許第３，１３７，６３１号、米国特許第３，９５９，４５７号、米国特許第４，２０５，０６０号、米国特許第４，６０６，９４０号、米国特許第４，７４４，９３３号、米国特許第５，１３２，１１７号、および国際特許公開ＷＯ９５/２８２２７において記載されている技術を含む。
【００６９】
リポソームもまた、ウイルス、プラスミド、ウイルスタンパク質、またはウイルスベクターの持続放出をもたらすために用いることができる。リポソーム製剤の作製方法および使用方法に関する詳細は、とりわけ、参照することにより本明細書に組み込まれる、米国特許第４，０１６，１００号、米国特許第４，４５２，７４７号、米国特許第４，９２１，７０６号、米国特許第４，９２７，６３７号、米国特許第４，９４４，９４８号、米国特許第５，００８，０５０号、および米国特許第５，００９，９５６号において見ることができる。
【００７０】
上記のワクチンのいずれかの効果的な量は、低用量のウイルス、ウイルスタンパク質、プラスミド、またはウイルスベクターから開始し、その後、効果をモニタリングしながら投与量を増大させる、従来の手段によって決定することができる。効果的な量は、ワクチンを単回投与した後、またはワクチンを複数回投与した後に、得ることができる。動物当たりの最適な用量を決定する際、既知の因子を考慮に入れることができる。これらには、動物の種、サイズ、年齢、および全身状態、動物における他の薬剤の存在などが含まれる。実際の投与量は、好ましくは、他の動物研究から得られる結果の考察の後に選択される（例えば、以下の実施例２および３を参照されたい）。
【００７１】
適切な免疫応答が達成されているかどうかを検出する１つの方法は、ワクチン接種後の動物におけるセロコンバージョンおよび抗体力価を決定することである。ワクチン接種のタイミング、およびブースター投与がもしある場合、その数は、好ましくは、全ての関連する因子の分析に基づいて医師または獣医師によって決定され、前記因子の一部は、上記に記載している。
【００７２】
本発明のウイルス、タンパク質、感染性ＤＮＡ分子、プラスミド、またはウイルスベクターの効果的な用量は、ワクチン接種される動物の体重などの、当業者によって決定され得る因子を考慮して、既知の技術を用いて決定することができる。本発明のワクチンにおける、本発明のウイルスの用量は、好ましくは、約１０１から約１０９ｐｆｕ（プラーク形成単位）の範囲であり、より好ましくは、約１０２から約１０８ｐｆｕの範囲であり、最も好ましくは、約１０３から約１０７ｐｆｕの範囲である。本発明のワクチンにおける、本発明のプラスミドの用量は、好ましくは、約０．１μｇから約１００ｍｇの範囲であり、より好ましくは、約１μｇから約１０ｍｇの範囲であり、さらに好ましくは、約１０μｇから約１ｍｇの範囲である。本発明のワクチンにおける、本発明の感染性ＤＮＡ分子の用量は、好ましくは、約０．１μｇから約１００ｍｇの範囲であり、より好ましくは、約１μｇから約１０ｍｇの範囲であり、さらに好ましくは、約１０μｇから約１ｍｇの範囲である。本発明のワクチンにおける、本発明のウイルスベクターの用量は、好ましくは、約１０１ｐｆｕから約１０９ｐｆｕの範囲であり、より好ましくは、約１０２ｐｆｕから約１０８ｐｆｕの範囲であり、さらに好ましくは、約１０３から約１０７ｐｆｕの範囲である。適切な投与量は、約０．５ｍｌから約１０ｍｌの範囲であり、さらに好ましくは、約１ｍｌから約５ｍｌの範囲である。
【００７３】
本発明の実施に従う、ウイルスタンパク質ワクチンまたはウイルスペプチドワクチンのための適切な用量は、通常は、用量当たり１から５０マイクログラムの範囲であるか、または標準的な方法によって決定され得る、それより多い量であり、アジュバントの量はそれぞれのこのような物質に関して認められた方法によって決定される。ブタのワクチンに関連する、本発明の好ましい実施例において、動物についての最適な年齢標的は、約１日から２１日であり、これは、離乳前の時点で、マイコプラズマハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）などの他の計画的なワクチン接種にも対応し得る。さらに、雌の種豚のためのワクチン接種の好ましいスケジュールには、年に１回の再ワクチン接種スケジュールでの、同様の用量が含まれる。
【００７４】
抗体
本発明によってまた意図されるものは、抗ＴＴＶ抗体（例えば、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、豚抗体、および本発明のＴＴＶポリペプチドを特異的に認識するＣＤＲ配列を含む化合物を含む、ＣＤＲ移植抗体）である。「特異的な」という用語は、本発明の抗体の可変領域が、ＴＴＶポリペプチドのみを認識し、結合する（すなわち、ポリペプチド群において見られる配列の同一性、相同性、または類似性にもかかわらず、関連するポリペプチドから単一のＴＴＶポリペプチドを区別することができる）ことを示し、またこれは、抗体の可変領域の外側の配列、特にＡｂ分子の定常領域における配列との相互作用を介して、他のタンパク質（例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のタンパク質Ａ、またはＥＬＩＳＡ技術における他の抗体）と相互作用することが（場合により）可能である。本発明の抗体の結合特異性を決定するためのスクリーニングアッセイは周知であり、当技術分野において日常的に実施されている。このようなアッセイの包括的な議論については、Ｈａｒｌｏｗら（編）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８８）、Ｃｈａｐｔｅｒ ６を参照されたい。本発明のＴＴＶポリペプチドの断片を認識し、結合する抗体が、上記に定義したように、前記断片が由来する本発明のＴＴＶポリペプチドに対して第一に、かつ最も特異的であるならば、これらの抗体もまた意図される。
【００７５】
明確にするために、「抗体」は、特異的抗原に対する免疫応答の結果生じる、前記特異的抗原に結合し得る免疫グロブリン分子を言う。免疫グロブリンは、「定常」領域および「可変」領域を有する、「軽鎖」ポリペプチド鎖および「重鎖」ポリペプチド鎖からなる、血清タンパク質であり、定常領域の組成に基づいて、いくつかのクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）に分けられる。抗体は、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、などを含む様々な形態で、また、一本鎖で存在し得、１つまたは複数の抗体一本鎖ポリペプチド配列の全てまたは一部を含有する、合成ポリペプチドを含む。
【００７６】
診断キット
本発明はまた、診断キットを提供する。キットは、ＴＴＶウイルスの野外株に自然に感染した豚動物と、本明細書において記載されるＴＴＶワクチンのいずれかでワクチン接種された豚動物とを区別するために有益であり得る。また、ＴＴＶウイルスの野外株に感染している可能性のある動物を、臨床症候が現れる前に検出することができ、群れから排除することができる、またはナイーブなもしくはワクチン接種された動物から分離して置いておくことができるという理由からも、キットは有益であり得る。キットには、特定されたＴＴＶウイルスの特定の成分に対する抗体の存在について、豚動物から得られる試料を分析するための試薬が含まれる。本発明の診断キットには、成分として、野外株には存在するが目的のワクチンには存在しない、またはその逆である、ＯＲＦ１、２、または３から得られる１つまたは複数のペプチドが含まれ得、このような適切なペプチドドメインの選択は、明細書の実施例１および２において提供される広範なアミノ酸配列決定によって可能となる。当技術分野において知られているように、本発明のキットは、成分として、融合タンパク質を介して提供されるペプチドを代わりに含み得る。本発明のための「融合ペプチド」または「融合タンパク質」という用語は、ＴＴＶウイルスタンパク質の少なくとも一部、好ましくはＯＲＦ１と、異種ペプチドまたはタンパク質とからなる、一本鎖ポリペプチドを意味する。
【実施例】
【００７７】
（実施例１）
ブタＴＴＶ完全ゲノムのクローニング
Ａ．ＴＴＶ遺伝子型２
製造者のプロトコルに従って、ＤＮＡ血液ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、豚の血清からＤＮＡを精製した。ＤＮＡは、カラムから、５０μＬのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液において溶出した。次に、ＤＮＡを、ランダムプライムローリングサークル増幅によって増幅した。簡潔に述べると、５μＬの精製ＤＮＡおよび１００ｎｇのランダムヘキサマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、７１μｌの水に添加し、９５℃で３分間にわたり加熱し、氷上で冷却した。次に、１ｍＭのｄＮＴＰ、１００ｎｇのランダムヘキサマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１×ｐｈｉ２９ポリメラーゼ緩衝液、および１μＬのｐｈｉ２９ポリメラーゼを添加し、反応物を３０℃で一晩インキュベートした。
【００７８】
全容積の５分の１を、ＥｃｏＲＩで消化し、０．８％Ｅゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で電気泳動して、２．７ｋＢの断片の存在を検出した。ＥｃｏＲＩ消化された材料を、製造者のプロトコルに従って、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットを用いて精製し、ＥｃｏＲＩで消化された／シュリンプアルカリホスファターゼ処理された、ｐＧｅｍ３ｚｆ（＋）ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）中にライゲーションした。ライゲーションされたＤＮＡを用いて、化学的にコンピテントな大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αを形質転換した。形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を、ＬＢ／ａｍｐ寒天プレート上で選択した。
【００７９】
プラスミドＤＮＡを、形質転換したコロニーから単離し、ＥｃｏＲＩで消化して、およそ２．７ｋＢのインサートの存在を確認した。４つのクローン（４、７、１０、および１３）を選択し、配列決定のためにＡＣＧＴ，Ｉｎｃ．に提出した。配列データのアラインメントは、クローン１０および１３がＴＴＶの公表されている配列に対する相同性を示し、ＴＴＶ遺伝子型１よりも遺伝子型２に、より近くアラインされたことを示した。これらのクローンは、それ以降、ＴＴＶ１０およびＴＴＶ１３と名付けた。
【００８０】
ＰＡＨ ＴＴＶ遺伝子型２についての配列決定データの分析
公開されているＴＴＶ遺伝子型２ ＡＹ８２３９９１ ＤＮＡ配列（配列番号１６）に対するＴＴＶ１３（配列番号２）およびＴＴＶ１０（配列番号１）のヌクレオチドアラインメント
【００８１】
【表１】
【００８２】
ＴＴＶ１３は、これまでに公開されているＡＹ８２３９９１の配列と比較すると、９２％の同一性を示す。しかし、ＴＴＶ１０は、ＡＹ８２３９９１またはＴＴＶ１３のいずれかとの間でわずかに７６％の類似性を示し、関連のない遺伝子型であると考えられ得る。
【００８３】
ＡＹ８２３９９１ ＯＲＦ１（配列番号８）との、ＴＴＶ１０（配列番号１４）およびＴＴＶ１３（配列番号１５）についての、ＰＡＨ ＴＴＶ遺伝子型ＯＲＦ１のアミノ酸アラインメント
【００８４】
公開されている配列とのＴＴＶ１０ ＴＴＶ１３ ＯＲＦのアミノ酸アラインメント
【００８５】
【表２】
【００８６】
アミノ酸レベルでは、ＴＴＶ１０ ＯＲＦは、公開されている配列に対してわずか６５％の相同性を示し、ＴＴＶの固有の表現型を表し得る。
【００８７】
バキュロウイルスの発現のためのＴＴＶ遺伝子型２ ＯＲＦ１のクローニング
上記に得られた配列データに基づいて、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）システムを用いて、バキュロウイルスにおける発現のためにＴＴＶ１０およびＴＴＶ１３からのＯＲＦをクローニングするために、プライマーを設計した。
【００８８】
ＴＴＶ１３ ＯＲＦについて：Ｔｔｖ１３Ｒｅｖ１２１１：５’ｃｇｔ ａｃｔ ｃｇａ ｇｔｃ ａｃａ ｇｔｇ ｔｔｔ ｔｃａ ｔｃｃ（配列番号２６）、ＴＴＶ１３Ｆｏｒ１２１１：５’ｃｔａ ｇｇｔ ａｃｃ ａｔｇ ｃｃｔ ｔａｃ ａｇａ ｃｇｃ ｔａｔ（配列番号２７）
【００８９】
ＴＴＶ１０ ＯＲＦについて：ｔｔ１０ｆｏｒ１２０７：５’ｃｔａ ｇｇｔ ａｃｃ ａｔｇ ｃｃｔ ｔｔｃ ｃａｃ ｃｇｃ ｔａｔ（配列番号２８）、およびｔｔｖｒｅｖ１２０７：ｃｇｔ ａｃｔ ｃｇａ ｇｃｔ ａｔａ ｇｇｇ ｔｃｃ ｔｇａ ａｔ（配列番号２９）
【００９０】
ｐＧｅｍ中にＥｃｏＲＩをクローニングすると、ＯＲＦ１のリーディングフレームが中断されるため、ｐＧｅｍ内のＴＴＶインサートを、ＥｃｏＲＩ消化によって単離し、ゲル精製し、標準的なライゲーション条件を用いて再環状化した。４℃で一晩ライゲーションした後、６５℃でリガーゼを不活化し、反応物を、製造者のプロトコルに従って、ＱｕｉＱｕｉｃｋ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。
【００９１】
ＴＴＶＯＲＦ１３を、上記のＴＴＶ１３フォワードプライマーおよびリバースプライマー（それぞれ０．１５μＭ）、１×Ｈｉ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ酵素緩衝液中の０．２ｍＭのｄＮＴＰを用いて、再環状化したＴＴＶ１３ゲノムＤＮＡとＥｘｐａｎｄ Ｈｉ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（登録商標）酵素（Ｒｏｃｈｅ）とを用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ条件は、９５℃で４分間を１サイクル、９４℃で１５秒間の変性と、５５℃で３０秒間のアニーリングと、６８℃で１．５分間の伸長とを３５サイクル、および７２℃で７分間の伸長を１サイクルであった。
【００９２】
同様に、ＴＴＶＯＲＦ１０を、上記のＴＴＶ１０フォワードプライマーおよびリバースプライマー（それぞれ０．１５μＭ）、１×Ｈｉ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ酵素緩衝液中の０．２ｍＭのｄＮＴＰを用いて、再環状化したＴＴＶ１０ゲノムＤＮＡとＥｘｐａｎｄ Ｈｉ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（登録商標）酵素（Ｒｏｃｈｅ）とを用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ条件は、９５℃で４分間を１サイクル、９４℃で１５秒間の変性と、５６℃で３０秒間のアニーリングと、６８℃で１．５分間の伸長とを３５サイクル、および７２℃で７分間の伸長を１サイクルであった。
【００９３】
ＰＣＲ産物を、製造者のプロトコルに従って、ＱｉａＱｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。ＰＣＲ ＴＴＶ１０Ｏｒｆ１生成物とＴＴＶ１３Ｏｒｆ１生成物との両方、およびＧａｔｅｗａｙエントリープラスミドであるｐＥＮＴＲ３Ｃを、Ｋｐｎｌで消化した。消化されたＤＮＡを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ増幅キットを用いて精製し、その後、ＸｈｏＩで消化した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ精製の後、ＴＴＶ１０ ＯＲＦ１またはＴＴＶ１３ＯＲＦ１のＤＮＡを、標準的なライゲーション手順を用いて、ｐＥＮＴＲ３Ｃ中にライゲーションした。室温で２時間ライゲーションした後、ライゲーションされたＤＮＡを用いて、化学的にコンピテントな大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αを形質転換した。形質転換されたコロニーを、カナマイシンを用いて選択した。形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からプラスミドを精製し、ＯＲＦ１ ＤＮＡの挿入を、制限断片分析によって検証した。
【００９４】
次に、ＴＴＶ１０ ＯＲＦ１またはＴＴＶ１３ ＯＲＦ１を含有するｐＥＮＴＲ３Ｃプラスミドを、Ｈｉｓ６×またはＧＳＴタンパク質のＮ末端からＴＴＶ Ｏｒｆ１リーディングフレームまでをコードする、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのデスティネーションベクターであるｐＤＥＳＴ１０またはｐＤＥＳＴ２０中に挿入した。ＴＴＶ Ｏｒｆ１のオープンリーディングフレームを含有する組換えｐＤＥＳＴベクターを用いて、ＤＨ１０Ｂａｃ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を形質転換した。組換えバクミドＤＮＡを単離し、標準的なプロトコルに従って、ＳＦ９細胞のトランスフェクションに用いた。ネイティブなＯｒｆ１を含有する組換えバキュロウイルスを、プラーク精製によって単離した。組換えバキュロウイルスの確認を、ＰＣＲを用いて行った。
【００９５】
バキュロウイルスの発現のための、ネイティブなＴＴＶＯｒｆ１の構築
標準的なＰＣＲを用いて、ＢａｍＨ１制限部位を、ＴＴＶ１０ Ｏｒｆ１における開始コドンから上流に、またはＸｂａＩ制限部位を、ＴＴＶ Ｏｒｆ１３における開始コドンから上流に組み込んだ。これらの構築物を、ｐＦａｓｔＢａｃ導入ベクター中にクローニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂａｃを形質転換するために用いた。得られた組換えバクミドを次に、ＳＦ９細胞をトランスフェクトするために用いた。ネイティブなＯｒｆ１を含有する組換えバキュロウイルスを、プラーク精製によって単離した。組換えバキュロウイルスの確認を、ＰＣＲを用いて行った。
【００９６】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の発現のためのＴＴＶ遺伝子型２ ＯＲＦ１のクローニング
細菌系におけるＧＳＴ融合タンパク質の発現のために、完全長ＴＴＶＯｒｆ１０もまた、ＰＧｅｘ−６ｐ−１ベクター中にクローニングした。ＴＴＶ ＯＲＦは、アルギニンに富んだアミノ末端を含有する。タンパク質産生が細菌発現系において増大し得たかどうかを判定するために、アルギニンに富んだセグメントを、Ｏｒｆ１のオープンリーディングフレームのヌクレオチド３６８に位置し、ｐＧｅｘ−６ｐ−１のＧＳＴコード領域とインフレームの、都合の良い制限部位（ＥｃｏＲ１）で、ＴＴＶＯｒｆ１３から除去した。このクローンにより、高度にアルギニンに富んだセグメントを含有する、アミノ末端の１００個のアミノ酸が除去された。
【００９７】
Ｂ．ＴＴＶ遺伝子型１
豚の骨髄から得られる細胞ＤＮＡ全体を、増幅反応の有効性を向上させるために一本鎖結合タンパク質を添加したことを除いて、上記の手順に従って、ローリングサークル増幅によって増幅した。増幅産物は、ＥｃｏＲ１での消化、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ増幅キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いた精製、およびシュリンプアルカリホスファターゼで事前に処理されたｐＧｅｍ３ｚｆ（＋）ベクター中へのライゲーションであった。推定ＴＴＶゲノムＤＮＡを含有する組換えベクターを、ＥｃｏＲ１および／またはＢａｍＨ１での制限消化に基づいて選択した。およそ２．７ｋＢのインサートを含有するプラスミドを精製し、ＯＲＦ１配列の配列決定のためにＡＣＧＴ，Ｉｎｃ．に提出して、遺伝子型を確認した。完全なゲノム、すなわち、高度にＧ／Ｃに富んだ領域を含有する領域は、完全には配列決定されなかった。
【００９８】
ＰＡＨ ＴＴＶ遺伝子型１のための配列決定データの分析
ＰＡＨ ＴＴＶ７（配列番号４）、ＴＴＶ１７（配列番号５）、ＴＴＶ２１（配列番号６）、およびＴＴＶ２７（配列番号３）と、公開されている配列であるＡＹ８２３９９０（配列番号１７）とのヌクレオチドアラインメント。
【００９９】
ＰＡＨ ＴＴＶ配列と公開されている配列の間のヌクレオチド同一性
【０１００】
【表３】
ＴＴＶｇｔ１−２７は、公開されている配列であるＡＹ８２３９９０との最大の相同性を示し、９１％の同一性を示す。ＴＴＶｇｔ１−７、１７、および２１は、８５〜８７％の同一性を示す。ＴＴＶｇｔ１−７およびＴＴＶｇｔ１−２１は、９９％のヌクレオチド同一性を共有する。
【０１０１】
Ｏｒｆ１アミノ酸のアラインメント
以下に、公開されているＡＹ８２３９９０配列（配列番号２５）と、ＴＴＶ７（配列番号１０）、ＴＴＶ１７（配列番号１１）、ＴＴＶ２１（配列番号１２）、およびＴＴＶ２７（配列番号１３）についての対応するアミノ酸配列との比較を提供する。
【０１０２】
【表４】
【０１０３】
タンパク質の疎水性プロットは、親水性の５つの領域を示し、これは、潜在的に抗原性である、表面が露出した領域を示し得る。これらの領域の２つは、アミノ末端およびカルボキシ末端にあり、また、アルギニンに富んでおり、かつ高度に保存されている。アミノ酸１９０とアミノ酸２３２との間の、高度に保存された親水性領域が観察され、これは、抗原性部位として作用し得る可能性がある。アミノ酸２９５とアミノ酸３１６との間の、およびアミノ酸４１５とアミノ酸４７０との間の、残りの親水性領域もまた、抗原性である。
【０１０４】
さらに、ＯＲＦ１についての推定開始コドンおよびコード領域が、ｔｔｖｇｔ１−２７ ヌクレオチド５１７〜２４３５、ｔｔｖｇ１−７ ヌクレオチド５１７〜２４３５、ｔｔｖｇｔ１−１７ ヌクレオチド５１７〜２４３６、ｔｔｖｇｔ１−２１ ヌクレオチド５１７〜２４３９、ｔｔｖ１０ ヌクレオチド４８７〜２３４６、およびｔｔｖ１３ ヌクレオチド４７７〜２３６３であることが決定されている。ＯＲＦ２についての推定開始コドンおよびコード領域は、ｔｔｖｇｔ１−２７ ヌクレオチド４２８〜６４６、ｔｔｖｇ１−７ ヌクレオチド４２８〜６４３、ｔｔｖｇｔ１−１７ ヌクレオチド４２８〜６４３、ｔｔｖｇｔ１−２１ ヌクレオチド４２８〜６４６、ｔｔｖ１０ ヌクレオチド４０４〜６１０、およびｔｔｖ１３ ヌクレオチド３９４〜５９７である。
【０１０５】
組換えバキュロウイルスを用いた、ＴＴＶ ＯＲＦ１タンパク質の発現
次に、昆虫細胞および組換えバキュロウイルスを用いて遺伝子型２ＴＴＶ ＯＲＦ１タンパク質を発現させるために、一連の実験に着手した。タンパク質発現の最適化を、３つの細胞系（ＳＦ９、ＳＦ２１、およびＨｉ Ｆｉｖｅ）、複数の媒質構成（ＥｘＣｅｌｌ ４２０、ＳＦ９００ ＩＩＩ ＳＦＭ、Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｆｉｖｅ ＳＦＭ）、様々な細胞密度（５ｅ５、１ｅ６、２ｅ６、および４ｅ６細胞／ｍｌ）、ならびに様々な感染多重度（０．００５、０．１、０．５、２．０）を用いて行い、得られた培養物を、感染後７日間にわたり、毎日モニタリングした。
【０１０６】
細胞の密度および生存能力について経過をモニタリングし、細胞のサイズおよびウイルス力価のモニタリングによって、感染をモニタリングした。タンパク質発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クマシーゲル分析、およびウェスタンブロッティングによってモニタリングした。適切な対照を確実にするため、陰性対照および陽性対照を、全ての実験の間にわたり維持した。全ての実験により、標的タンパク質の発現を確認することができたが、最適な条件は、２×１０６細胞／ｍｌの細胞密度および０．１のＭＯＩで、ＥｘＣｅｌｌ ４２０媒質（Ｓｉｇｍａ、ＳＡＦＣ）中で維持されたＳＦ９細胞を用い、プロセスを３日間の感染の後に終わらせたときに見られた。組換え発現したタンパク質のいくつかは、得られた上清中に存在するが、ほとんどは、細胞ペレット中に位置していた可能性がある。
【０１０７】
ウェスタンブロッティング（ＧＳＴタグ）を用いたタンパク質発現の確認
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎデスティネーションベクター（ｐＤＥＳＴ１０）は、ＧＳＴタンパク質のＮ末端からＴＴＶ Ｏｒｆ１リーディングフレームまでを含有していたため、結果として得られる、およそ９５ｋＤのＧＳＴ−ＯＲＦ１融合タンパク質が生成し、これは、市販されているウサギ抗ＧＳＴ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）抗体を用いて検出された。９５ｋＤの融合タンパク質のうち、およそ６８ｋＤはＯＲＦ１であると考えられ、２５ｋＤはＧＳＴタンパク質であると考えられる。市販されている抗体は、ＴＴＶ ＯＲＦ１タンパク質の標準化された検出には利用不可能であり、抗ＧＳＴ抗体の使用が必要となった。
【０１０８】
ウサギ抗ＴＴＶ ＯＲＦ１抗体の生産
既知のＴＴＶ試薬が最初は使用不可能であったため、抗ＴＴＶ ＯＲＦ１抗体を生産するための試みに着手した。ＴＴＶ ＯＲＦ１組換えタンパク質を調製するための、最適化された発現プロトコルに従って、市販されているＢａｃｕｌｏｇｏｌｄ ＧＳＴ精製キットを用いて、得られた材料をさらに精製した。次に、精製されたＴＴＶ１０およびＴＴＶ１３ ＯＲＦ１タンパク質を用いてウサギを超免疫化し、それによって、その後、ＯＲＦ１組換えタンパク質に対する抗体を産生させた。
【０１０９】
タンパク質の検出に関して、図１Ａの試料レーンは以下の通りであった（右から左）。
【０１１０】
【表５】
【０１１１】
レーン２、４、および６は、後にウサギの免疫化に用いられる、精製された９５ｋＤのＴＴＶ１３ ＯＲＦ１融合タンパク質を示し、図１Ａを参照されたい。
【０１１２】
ウサギ抗ＯＲＦ１タンパク質を用いた、ネイティブなＴＴＶ ＯＲＦ１の検出
さらなる発現実験を、ネイティブなＴＴＶ ＯＲＦ１組換えバキュロウイルスを用いて行った。この組換えバキュロウイルスは、６×ＨｉｓタグまたはＧＳＴ融合タグを用いることなく構築し、したがって、特異的な抗ＴＴＶ ＯＲＦ１抗体を必要とする。したがって、ネイティブなタンパク質の発現を確認するため、および試薬の反応性を確認するために、発現後のウェスタンブロット分析を、ウサギ抗ＴＴＶ ＯＲＦ１抗体を用いて行った。ウェスタンブロット分析は、ほぼＴＴＶ ＯＲＦ１の予測されたサイズである、およそ６９ｋＤでのかすかな反応、およびおよそ４９ｋＤでのさらなるバンドに対する反応を示した（図１Ｂを参照されたい）。４９ｋＤのタンパク質バンドは知られていない。６９ｋＤでのかすかなバンド発生は、ネイティブなＴＴＶ ＯＲＦ１構築物におけるタンパク質発現が低いこと、またはウサギの免疫化から得られる抗体が少ないことのいずれかに関連すると仮定される。この特定の分析において、抗原または抗体の精製が行われなかったことに注意されたい。レーン５（図１Ｂにおける矢印を参照されたい）は、抗ＴＴＶ ＯＲＦ１ウサギポリクローナル抗体を用いた、ネイティブなＴＴＶ ＯＲＦ１の発現における、約６９ｋＤおよび４９ｋＤのタンパク質に対する固有の反応を示す。
【０１１３】
したがって、抗原としてのカプシドタンパク質に対する抗体の結合が示され、ここで、抗原は、ＴＴＶ配列のみを提供し、タグ付けはされていなかった。
【０１１４】
図６Ｂの試料レーンは以下の通りであった（右から左）。
【０１１５】
【表６】
【０１１６】
（実施例２）
戻し継代（backpassaging）
肝臓を、帝王切開で産まれた初乳無摂取（ＣＤＣＤ）豚から、無菌状態で回収した。肝組織を、固有のｑＰＣＲアッセイにおいてｇ１ＴＴＶおよびｇ２ＴＴＶについて試験し、ｇ１ＴＴＶのみについて陽性であることを確認した。次に、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）の肝臓ホモジネートを、抗生物質および抗真菌剤を含有する媒質において調製した。最後に、ホモジネートを、遠心分離によって澄明化し、ｇ１ＴＴＶｐ０と称し、−７０℃で凍結した。得られたｇ１ＴＴＶホモジネートを、通常の試験によって、外来ウイルス、細菌、およびマイコプラズマが存在しないように試験した。十分な試験の後、２ミリリットルの新たに解凍されたｇ１ＴＴＶｐ０を、６頭の１１日齢のノトバイオートの子豚のそれぞれにＩＰ接種した。接種後およそ１２日目に、豚を安楽死させ、骨髄、脾臓、および肝臓を無菌状態で回収した。得られた肝臓のそれぞれを、ｑＰＣＲによって、ｇ１ＴＴＶに富んでいること、およびｇ２ＴＴＶについて陰性であることを確認した。次に、肝臓ホモジネートを、上記の得られた肝臓のそれぞれから調製し、標識し、ｇ１ＴＴＶｐ１としてアリコート化し、−７０℃に置いた。さらなる２継代目（ｇ１ＴＴＶｐ２）を、ｇ１ＴＴＶｐ１から生じさせた。
【０１１７】
（実施例３）
若豚における３つのトルクテノウイルス（ＴＴＶ）ワクチンの有効性の評価
本研究は、約７日齢で、また再び離乳時（約２１日齢）に投与し、その後約５週齢でチャレンジを行った、３つのＴＴＶワクチン候補の有効性を評価するために行われた。
【０１１８】
この研究は、ＴＴＶの製剤を筋肉内注入された豚における、予備的な免疫原性の評価を提供した。先に述べたように、ＴＴＶは、負極性の一本鎖環状ＤＮＡゲノムを有する、小さな、エンベロープを有さないウイルスである。ゲノムには、非翻訳領域および少なくとも３つの主要なオーバーラップするオープンリーディングフレームが含まれる。豚ＴＴＶは遍在的であり、様々な地理的領域から回収される血清試料におけるウイルスのＰＣＲ検出は、３３〜１００％の豚における有病率を示す。ＭｃＫｅｏｗｎら、Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００４）１０４：１１３〜１１７。Ｋｒａｋｏｗｋａら、ＡＪＶＲ（２００８）６９：１６２３〜１６２９は、ｇ１−ＴＴＶを接種された豚が、臨床兆候は有さなかったが、接種後に、間質性肺炎、一過性の胸腺委縮、膜性子宮体腎症、および肝臓におけるリンパ球性から組織球性の軽度の浸潤を発症したことを報告した。本研究は、ＴＴＶワクチンの３つの異なる製剤の比較を提供し、これらの試作製剤のいずれかが、チャレンジ対照群と比較したときに、数値的にまたは統計的に区別され得るかどうかを評価した。
【０１１９】
材料および方法
動物：６頭の、臨床的に健康な、異種交配で妊娠した、ＰＲＲＳＶまたはマイコプラズマハイオニューモニエ（Ｍ ｈｙｏ）により生じる疾患（または同一の生物に対するワクチン接種）の経験がない、ＰＲＲＳＶおよびマイコプラズマハイオニューモニエ（Ｍ ｈｙｏ）に血清反応陰性のメスが、Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｔｒａｉｌ／Ｐｕｒｅｇｅｎｉｃ Ｐｏｒｋ、Ａｌｔｏｎ、ＩＬから供給され、出産のおよそ３週間前に、Ｐｆｉｚｅｒ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆａｒｍ ｉｎ Ｒｉｃｈｌａｎｄ、ＭＩに送られた。必要であれば、雌豚を、注入可能なプロスタグランジン（Ｌｕｔａｌｙｓｅ（登録商標））を用いて、２日間または３日間以内に出産するように誘導した。これらの雌豚から産まれた正常な子豚を、割り当ての設計に従って、研究に割り当てた。豚を、同腹子ごとに処理に対してランダム化し、各同腹子は、各処理に割り当てられた少なくとも１頭の子豚を有していた。
【０１２０】
飼育：ワクチン接種段階の間、豚を、ＢＬ−２分離設備内で、交叉哺育を行うことなく、それらの母親と共に飼育した。豚は、二次ワクチン接種のときまで、同腹子ごとに飼育したままとした。二次ワクチン接種後の豚を、さらなる施設に移し、２つの部屋で飼育し（１つの部屋はＮＴＸ（ワクチン接種されておらず、かつ、チャレンジもされていない対照）動物を含有し、第２の部屋はワクチン接種動物を含有する）、各部屋は、檻当たり４から８頭の豚を含有する。
【０１２１】
飼料：出産の後、雌豚には、必要に応じて、泌乳中の雌豚のための餌を与えた。子豚には、離乳の前には、餌付け飼料および代用乳を摂取させた。離乳すると、子豚には、選択が自由な、年齢に適した餌を与えた。水は、全ての動物に対して自由に摂取可能であった。
【０１２２】
割り当て／ランダム化：豚を、同腹子ごとに、処理に対してランダム化した。各同腹子は、各処理に割り当てられた少なくとも１頭の子豚を有していた。
【０１２３】
研究設計
【０１２４】
【表７】
【０１２５】
マスキング：ワクチンは、ワクチン接種の前に数値コードを用いてマスキングした。調査員、ワクチン投与者、および研究員は、処理についてマスキングされており、動物の福祉のために処理情報が必要とされない限り、マスキングコードを知る機会を有さなかった。
【０１２６】
動物用治験薬
【０１２７】
【表８】
【０１２８】
チャレンジ材料の調製：ｇ１ＴＴＶ継代１を、ｑＰＣＲによって、ｇ１ＴＴＶについて陽性であり（７．６×１０ｅ８から１．６×１０ｅ９個のＤＮＡコピー／２ｍＬ）、ｇ２ＴＴＶについて陰性である、試験した肝臓ホモジネートから誘導した。適切な数のボトルを冷凍室から取り出し、チャレンジの直前に解凍した。次に、アリコートをボトルの１つから取り出し、その後の再滴定のために保持した。チャレンジストックを氷上に載せて調査設備まで移し、チャレンジ手順の間、氷上に維持した。チャレンジ用量は、２．０ｍＬのストック溶液（２．０ｍＬ、腹腔内）に等しい。したがって、各豚に送達された用量は、７．６×１０ｅ８から１．６×１０ｅ９個のＤＮＡコピー／２ｍＬであると予想される。チャレンジの後、チャレンジストックのアリコートを、チャレンジ用量を確認するための滴定のために保った。
【０１２９】
全身的な健康の所見：動物は、有資格者によって毎日観察され、全身的な健康の所見が記録された。
【０１３０】
体重：全ての豚は、０日目、チャレンジ日（２８日目）、および剖検時に体重測定した。全ての体重を記録した。
【０１３１】
ワクチン接種：およそ７日齢（０日目）で、処理群（Ｔ０１からＴ０４群）当たりおよそ１０頭のランダムに割り当てられた豚を、表１において記載したようにワクチン接種した。豚の右頸部に、割り当てに従って、単回用量シリンジ分（２．０ｍＬの筋肉内（ＩＭ）用量）のＩＶＰ、または２ｍＬのＩＭ用量の対照を注入した。同一のＩＶＰまたは対照の二次用量を、離乳時（およそ２１日齢）に左頸部に投与した。
【０１３２】
血液試料採取：０日目、１４日目（ワクチン接種の前）、およびチャレンジ前の２８日目（同様に、３１日目、３４日目、３７日目、および４０日目）の前に、ｇ１ＴＴＶの状態のために、血液試料を、５ｍＬまたは９ｍＬの血清分離管（体重に依存する）を用いて、全ての豚から回収した（ｑＰＣＲ−Ｐｆｉｚｅｒ−ＶＭＲＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）。血清試料は、現場職員が少なくとも３つの個別の試験管にアリコート化し、−８０℃で保存した。
【０１３３】
【表９】
【０１３４】
チャレンジ：およそ５週齢で、子豚に、割り当てに従って、２．０ｍＬ（ＩＰまたはＩＮ）の用量のＴＴＶ単離株を接種した。チャレンジ材料を、マスキングの目的で、処理コードによって特定される設備に輸送した。
【０１３５】
チャレンジ後の直腸温度を、チャレンジ前の２８日目、ならびに３１日目、３４日目、３７日目、および４０日目に、１日１回記録した。
【０１３６】
剖検：４０日目に、全ての動物を安楽死させ、剖検した。剖検の際に、肺病変を、以下の方法を用いてスコア付けした：１）数値スコア（０、１、２、３）、ならびに２）各肺葉（左肺上葉、左肺中葉、左肺下葉、右肺上葉、右肺中葉、右肺下葉、および副葉）についての硬化のパーセンテージをスコア付けし、病変を伴って観察された肺葉のパーセンテージとして記録した。肝臓、腎臓、胸腺、およびリンパ節もまたスコア付けした。血液試料もまた、安楽死の前に採取した。組織を、以下の表において示すように回収した。
【０１３７】
【表１０】
【０１３８】
安全性および／または有効性の評価に関して、交絡する二次的な疾患状態は検出されなかった。動物は、プロトコルに従ってワクチン接種およびチャレンジを行った。予後の基準に関して、肉眼による病変または顕微鏡による病変の減少、ｑＰＣＲによるウイルス血症の減少、および熱、体重減少、または死亡の発生の減少のいずれかまたは全てにおける低減を用いた。両側検定。
【０１３９】
分析の方法
剖検の際、肺病変を、以下の方法を用いてスコア付けした：１）数値スコア（０＝病変なし、１＝軽度の病変、２＝中度の病変、３＝重度の病変）、ならびに２）各肺葉（左肺上葉、左肺中葉、左肺下葉、右肺上葉、右肺中葉、右肺下葉、および副葉）についての硬化のパーセンテージをスコア付けし、病変を伴って観察された肺葉のパーセンテージとして記録した。
【０１４０】
病変を有する肺全体のパーセンテージを、固定効果、処理、および変量効果の同腹子を有する一般線形混合モデルを用いて、変換および分析した。パラメータ推定値の線形結合を、有意な（Ｐ≦０．１０）処理効果について試験した後に先験的対比（priori contrast）において用いた。１０％レベルの有意性（Ｐ≦０．１０）を用いて、統計的な差を評価した。
【０１４１】
ｑＰＣＲデータは、分析の前に、適切なｌｏｇ変換を用いて変換される。変換された力価は、一般線形反復測定混合モデル分析を用いて分析される。処理または時点相互作用効果による処理が有意である場合（Ｐ≦０．１０）、一対処理比較を、各時点で行う。各時点について、処理の最小二乗平均、９０％信頼区間、極小および極大を計算し、逆変換する。記述統計学、平均、標準偏差、および範囲を、チャレンジ前の各処理および研究日について計算する。
【０１４２】
研究結果および考察
肺の病変
観察される肺病変の全体的なパーセンテージは、全ての処理群を通して低かったが、有意な差が見られた。Ｔ０１（Ｃｈｒｏｍｏｓ発現ｇ１ＴＴＶ ＯＲＦ１）は、Ｔ０２（バキュロウイルス発現ｇ２ＴＴＶ ＯＲＦ１）およびＴ０４（チャレンジ対照）の両方と比較して、有意に少ない肺病変を生じた。チャレンジウイルスは感染性ｇ１ＴＴＶからなるものであったため、バキュロウイルスから得られる遺伝子型２ＯＲＦ１がもたらした肺病変が、チャレンジ対照と比較して極めて少なかったわけではないことは、驚くべきことではないかもしれない。しかし、興味深いことに、それは、十分ではないものの、チャレンジ対照と比較して数値的に低い肺病変スコアをもたらし、それは、用量およびアジュバントの選択の最適化の際に、ある程度のレベルの交差防御が、異なるＴＴＶ遺伝子型の間で可能であることを示す。不活化チャレンジウイルス（Ｔ０３、ｇ１ＴＴＶｐ１死滅ウイルス）が生ｇ１ＴＴＶチャレンジウイルスに対する交差防御をもたらさないことは驚くべきことであり、これは、Ｔ０３とＴ０４との間で統計的な差が全くないことにより証明された。交差防御のこの驚くべき喪失はさらに、ｇ１ＴＴＶ ＯＲＦ１（Ｔ０１ Ｃｈｒｏｍｏｓ）などの本発明の新規なワクチンの獣医学的重要性を増すものである。
【０１４３】
【表１１】
【０１４４】
【表１２】
【０１４５】
ｇ１ＴＴＶ ｑＰＣＲ
ＴＴＶ ｑＰＣＲウイルス血症データの分析（図７）により、Ｔ０１（Ｃｈｒｏｍｏｓ ｇ１ＴＴＶ ＯＲＦ１）が、Ｔ０４（チャレンジ対照）と比較して、数値的に低いＴＴＶ ｑＰＣＲ値を有することが明らかにされる。ウイルス血症の程度および期間の減少が見られ、これは、肺病変の低減と共に、有効性の指標である。さらに、Ｔ０２（バキュロウイルスｇ２ＴＴＶ ＯＲＦ１）は、Ｔ０４（チャレンジ対照）と比較して、ウイルス血症の程度および期間の数値的低減を示すが、それは短い期間である。このことは、数値的に低い肺病変と組み合わせて、いくつかの遺伝子型の交差防御（ｇ２ＴＴＶ ＯＲＦ１ワクチン対ｇ１ＴＴＶ チャレンジウイルス）が観察されたことを示す。最適化された用量およびアジュバントを用いて、広範な遺伝子型の交差防御が実現可能であることが示唆され得る。興味深いことに、（Ｔ０３）ｇ１ＴＴＶｐ１ ＫＶは、チャレンジ対照と比較して、ＴＴＶ ｑＰＣＲウイルス血症における低減をもたらさない。この所見は、肺病変データと併せて、組換え発現したｇ１ＴＴＶ ＯＲＦ１（Ｔ０１）がワクチンとしての有効性をもたらすという新規な発見を、さらに例証するものである。
【０１４６】
（実施例４）
６Ｈｉｓタグを有する完全長タンパク質としてのｇ１ＴＴＶ ＯＲＦ１の、コドンの最適化および組換え発現、ならびに抗体によるその検出。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の両方についてのコドンの最適化および遺伝子合成のために、ＴＴＶｇ１ヌクレオチド配列を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）に提出した。両方のケースにおいて、コドンを最適化された遺伝子を、製品としてのＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ｐＵＣ５７ベクター中にクローニングした。ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅ（商標）コドン最適化分析は、コドンの使用の偏り、ＧＣ含有量、ＣｐＧジヌクレオチド含有量、ｍＲＮＡの二次構造、可能性のある潜在的スプライシング部位の同定、早期のポリＡ部位の存在、内部のｃｈｉ部位およびリボソーム結合部位、陰性ＣｐＧアイランド、ＲＮＡ不安定モチーフ（ＡＲＥ）、阻害部位（ＩＮＳ）、様々な種類の反復配列（直接反復配列、逆反復配列、および二分染色体を含む）、ならびにクローニングに干渉し得る制限部位を含む、多くのパラメータの分析を伴う。翻訳の性能もまた、翻訳開始Ｋｏｚａｋ配列、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列によって向上し得、またその結果、停止コドンによる翻訳の終結の有効性が増大する。
【０１４７】
配列番号１８〜２０は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（配列番号１８〜１９）およびサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（配列番号２０）の両方についてコドンを最適化された、ＴＴＶカプシド遺伝子を提供する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の配列は非常に類似しているが、市販されているｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に遺伝子をクローニングして７６０５７−４（配列番号１９）を生じさせるためには、さらなるＣＡヌクレオチドがＮ末端に付加されなくてはならない。ｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯ発現ベクターはまた、精製のために、Ｃ末端のＶ５タグおよび６×Ｈｉｓを有しているが、７６０５７−３（配列番号１８）および７６０５７−４についての配列は、それ以外は同一である。発現した、コドンを最適化されたＴＴＶｇ１タンパク質は、６３ｋＤのタンパク質に対して、アミノ末端に１０アミノ酸防御ペプチド、ならびにカルボキシ末端にＶ５エピトープおよび６×Ｈｉｓタグに対応する３２個のアミノ酸が付加されていることにより、およそ６８ｋＤのサイズである（図２）。
【０１４８】
７６０５７−５についての配列（配列番号２０）は、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）についてコドンを最適化されており、したがって、これは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の配列とわずかに異なる。さらに、この配列は、Ｎ末端の１０個のアミノ酸からなる防御ペプチドを欠いており（これは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）配列には付加されていた）、これはまた、酵母ベクター中への遺伝子のサブクローニングのために、Ｎ末端にフランキング制限エンドヌクレアーゼ部位であるＮｏｔＩを、Ｃ末端にＡａｔＩＩを有している。
【０１４９】
さらに、１０アミノ酸防御ペプチドは、アミノ末端に融合されるとタンパク質の安定性を増大させることが示されているため、前記ペプチドが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の発現のために、ＴＴＶｇ１配列のＮ末端に付加されたことに注意されたい。制限部位は、完全長タンパク質の評価のためにペプチドを取り出すことができるように、遺伝子操作されている。コドンを最適化されたＴＴＶｇ１の発現を、防御ペプチドのＮ末端の融合を有するおよび有さない、ｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯベクターにおいて評価した。サッカロマイセスセレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）についてコドンを最適化されたＴＴＶｇ１配列も、インビボでの抗体応答を引き起こすために用いられ得る、酵母において表面発現タンパク質を産生する可能性を有するｐＥＳＣ−Ｔｒｐベクター中にサブクローニングした。
【０１５０】
（実施例５）
ＴＴＶペプチドの結合および抗体生産（ポリクローナルおよびモノクローナル）
ウサギポリクローナル抗体を、実施例２において調製した、バキュロウイルス発現ｇ２ＴＴＶ ＧＳＴ−ＯＲＦ１タンパク質に対して作製した。２頭のウサギを超免疫化したが、１頭のウサギのみが応答した。ウサギ抗血清は、ブタにおいて増殖させたｇ１ＴＴＶ全ウイルスの様々な調製物に対して交差反応し、また、免疫化抗原である、バキュロウイルス発現ｇ２ＴＴＶ ＯＲＦ１に対しても反応する。しかし、ウサギ抗体は、実施例２において記載した、アミノ末端から取り出された１００アミノ酸Ｎ末端アルギニンリッチ領域を有する、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ｇ２ＴＴＶ ＯＲＦ１に対して応答しなかった。これは、主要抗原エピトープが、切断されたｇ２ＴＴＶ ＯＲＦ１においては存在しない、１００アミノ酸領域内にあり得ること、およびこの領域において、ｇ１ＴＴＶとｇ２ＴＴＶとの間に相同性があることを示唆し得る。
【０１５１】
モノクローナル抗体は、完全長ｇ１ＴＴＶ ＯＲＦ１、または他のｇ１ＴＴＶ抗原に対して生成することができる。他の可能性のある免疫化抗原には、ｇ１ＴＴＶ全ウイルス、ｇ２ＴＴＶ ＧＳＴ−ＯＲＦ１（バキュロウイルス）、ｇ１ＴＴＶ ＧＳＴ切断ＯＲＦ１（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、およびｇ２ＴＴＶ ＧＳＴ切断ＯＲＦ１（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））が含まれる。ペプチドライブラリーを、抗原性の線状エピトープを同定するために生成することができる。例えば、１０アミノ酸のオーバーラップを有する１８ｍｅｒのペプチドを用いて、ＴＴＶゲノムをカバーすることができる。そして、ペプチドは、ｇ１ＴＴＶ ＯＲＦ１またはｇ２ＴＴＶ ＯＲＦ１モノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体に対するそれらの全体的な反応性を決定するために、ウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡにおいて用いることができ、それにより、免疫原性ドメインをさらに同定することができる。
【０１５２】
ウサギポリクローナル抗体もまた、ＫＬＨに架橋した３つのｇ１ＴＴＶ ＯＲＦ１ペプチドに対して作製することができ、その後、ペプチド−オボアルブミン結合体を用いてスクリーニングすることができる。ペプチド−ＫＬＨ結合体もまた、モノクローナル抗体を産生するために用いることができる。この点において、１つの実施形態において、異なる株に由来するものを含む、ｇ１ＴＴＶ ＯＲＦ１ペプチドの複数のコピーが、共に結合し得る。
【０１５３】
特定の実施例において、ペプチドが生成されると（ＣＰＣ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、これらは次にＫＬＨまたはオボアルブミン（Ｐｒｏｔｅｏｓ Ｃｏによる）に結合する。ＫＬＨに結合したペプチドは、ウサギの免疫化に用いたが、一方、オボアルブミンに結合したペプチドは、血清をスクリーニングするために用いる（すなわち、キャリアータンパク質ではなく、ペプチドに対する抗体を検出するため）。
【０１５４】
（実施例６）
ポリクローナル抗体の生成のためのペプチド配列
以下のペプチド配列を、ポリクローナル抗体の生成のために、ＴＴＶｇ１（ＡＹ８２３９９０に基づく番号付け）から選択し、それぞれ配列番号２２〜２４と表す。
１．［Ｌ１６７Ｃ］ＴＴＶ（１６７〜１８５）−ＮＨ２：ＣＫＤＱＤＹＷＦＷＷＤＴＤＦＫＥＬＹＡ−ＮＨ２（１９ａａ、ｐＩ ４）
２．ＴＴＶ（４５９〜４７９）：ＤＦＧＨＨＳＲＦＧＰＦＣＶＫＮＥＰＬＥＦＱ（２１ａａ、ｐＩ ６．９）
３．［Ｃｙｓ６１２］−ＴＴＶ（６１２〜６３７）：ＣＴＷＫＲＬＲＲＭＶＲＥＱＬＤＲＲＭＤＨＫＲＱＲＬＨ（２６ａａ、ｐＩ １３）
【０１５５】
３つのペプチドのそれぞれは、キャリアータンパク質への選択的なペプチド結合を可能にするための、配列中に存在する単一のシステイン残基を有する。［Ｌ１６７Ｃ］ＴＴＶ（１６７〜１８５）−ＮＨ２および［Ｃｙｓ６１２］−ＴＴＶ（６１２〜６３７）において、追加のシステイン残基をＮ末端に付加したが、一方、ＴＴＶ（４５９〜４７９）においては、４７０位に存在する天然のｃｙｓがある。さらに、［Ｌ１６７Ｃ］ＴＴＶ（１６７〜１８５）−ＮＨ２は、アミド化されたＣ末端を有し、酸性度の低いペプチドをもたらす。ペプチドは、様々なＴＴＶ単離株についての配列同一性に基づいて選択した。さらに、Ｃ末端断片［Ｃｙｓ６１２］−ＴＴＶ（６１２〜６３７）は、表面露出していると考えられる。ペプチドは、ＣＰＣ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃでの固相ペプチド合成による注文生産であり、９５％を超える純度で得られた。
【０１５６】
（実施例７）
Ｃｈｒｏｍｏｓ系を用いた、ＴＴＶｇ１ＯＲＦ１タンパク質の発現
Ｃｈｒｏｍｏｓ ＡＣＥ系は、３つの主要な成分からなるタンパク質発現プラットフォームである。第１の成分は、Ｐｌａｔｆｏｒｍ ＡＣＥと呼ばれる、中性の、機能的な哺乳動物人工染色体であり、これは、修飾されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系の遺伝物質中に存在する。第２の成分は、ＡＣＥ標的化ベクターであり、これは、Ｐｌａｔｆｏｒｍ ＡＣＥ上に標的遺伝子をロードするために用いられるプラスミドである。第３の要素は、部位特異的な、一方向のインテグラーゼであり、これは、Ｐｌａｔｆｏｒｍ ＡＣＥ上への標的遺伝子の直接的なおよび特異的なロードを触媒する。ＡＣＥ系に関するさらなる情報は、カナダのＣｈｒｏｍｏｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．のウェブサイトで知ることができるか、または６０４−４１５−７１００で当該企業に直接連絡することによって知ることができ、ここで、技術のライセンスが入手可能である。
【０１５７】
Ｃｈｒｏｍｏｓ ＡＣＥ系は、従来のタンパク質生産プラットフォームを上回る、多くの顕著な利点を有する。その第１は、速度である。Ｃｈｒｏｍｏｓ ＡＣＥ系は、選択された遺伝子の、迅速な、効率的な、かつ再現可能な挿入を可能にする。第２の利点は、発現である。高レベルのタンパク質が達成可能であり、長時間、構成的に発現される。第３の利点は、安定性である。Ｃｈｒｏｍｏｓ ＡＣＥ系は、選択的な制御されたタンパク質発現を可能にする。簡潔に述べると、ＰＣＲを用いて、ＴＴＶ７ ＯＲＦ１ ｇ１ ＤＮＡの両端に制限部位を付加した。さらに、酵母インベルターゼの配列を、別のＰＣＲ調製物の５’末端に付加した。次に、増幅配列を制限酵素で処理し、プラスミドｐＣＴＶ９２７中にサブクローニングした。ＤＮＡ配列は、ＡＣＴＧ Ｉｎｃ．によって検証された。次に、ＣＨｋ２（チャイニーズハムスター卵巣）細胞を、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、プラスミドでトランスフェクトし、ハイグロマイシンＢを用いて、選択圧を加えた。１０個の単一細胞クローンを、ＳＤＳ ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングを用いて、ＴＴＶタンパク質の産生について分析した。
【０１５８】
より具体的には、ＡＣＥ標的化ベクターｐＣＴＶ−ＴＴＶ７ＯＲＦ１＋ＹＩを、以下のようにして生成した（図３を参照されたい）。遺伝子ＴＴＶ７ＯＲＦ１を、ＰＣＲ産物として得た。プライマーを、酵母インベルターゼ分泌シグナル、および遺伝子の５’末端の制限部位ＥｃｏＲＶを含有するように設計した。第２のプライマーを、遺伝子の３’末端の制限部位Ｋｐｎｌを含有するように設計した。これらの配列を、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、遺伝子ＴＴＶ７ＯＲＦ１に付加した。次に、修飾された遺伝子を、ＡＣＥ標的化ベクターＡＴＶＣＨＳ４Ｈｙｇ中にサブクローニングし、このベクターは、下流の抗生物質選択に適したハイグロマイシン耐性マーカーを含有していた。新たなプラスミドを、ｐＣＴＶ−ＴＴＶ７ＯＲＦ１＋ＹＩと名付けた。
【０１５９】
ＴＴＶ７ＯＲＦ１／酵母インベルターゼおよび一方向のラムダインテグラーゼをそれぞれコードする、プラスミドｐＣＴＶ−ＴＴＶ７ＯＲＦ１＋ＹＩおよびｐＳＩＯ３４３を、Ｐｌａｔｆｏｒｍ ＡＣＥを含有するＣｈｋ２細胞系中にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞は、Ｃｈｋ２−ＴＴＶ７ＯＲＦ１＋ＹＩと名付けた。これらの細胞を、９６ウェルプレート中に播種し、単一細胞クローンの形成についてモニタリングした。ハイグロマイシンを含有する媒質を各９６ウェルプレートに添加し、ＡＣＥ標的化ベクターを含有する細胞クローンを選択した。単一細胞クローンを同定すると、そのうちの１２個を２４ウェルプレート中に拡大増殖させ、次に６ウェルプレートに広げた。最後に、クローンを、懸濁細胞培養物中に拡大増殖させた。培養物Ｃｈｋ２−ＴＴＶ７ＯＲＦ１＋ＹＩ ＃７５を用いて、その後の実験用ワクチンの調製のために、細胞を有さない上清を生成した。
【０１６０】
図７は、Ｃｈｒｏｍｏｓ発現ｇ１ＴＴＶ ＯＲＦ１が、チャレンジ対照と比較して、肺病変を有意に低減させたこと、ならびに、同様にチャレンジ対照と比較して、ｇ１ＴＴＶウイルス血症の数値的程度および期間を低減させたことを示す。ワクチン接種は、０日目および１４日目であり、チャレンジは２８日目であった。検出されたｇ１ＴＴＶコピーの幾何平均は、指数関数的であると報告され、すなわち、１．００Ｅ＋００は１であり、４．２５Ｅ＋００は４．２５であり、４．４２Ｅ＋０１は４４．２であると報告された。
【０１６１】
（実施例８）
核局在シグナル
図４および５は、本発明の５つのＴＴＶ ｇｔ１ウイルスおよび本発明の２つのＴＴＶ ｇｔ２（またはｇｔ２様）ウイルスからのＯＲＦ１（カプシドタンパク質）のアミノ酸アラインメントの７つの方法を提供する。ｇｔ１カプシドは、ｇｔ２カプシドに約２２．３から２３．２％しか同一ではないため、当然のことながら、多くのギャップおよびミスマッチが存在する。しかし、５つのｇｔ１カプシドは、互いに８５．６から９９．７％同一である。２つのｇｔ２カプシド（ＴＴＶ１０およびＴＴＶ１３）は、同様に６６．８％同一である。
【０１６２】
２つの既知のタイプのＮＬＳシグナル（Ｐａｔ７およびＰａｔ４、例えば米国特許第７，５４４，３６２号を参照されたい）を、検査によって同定した。図５において、ＮＬＳシグナルに下線が引かれている。全ての７個のカプシドが、ｐａｔ７タイプおよびｐａｔ４タイプの両方の、複数のＮＬＳを含有することに注意されたい。遺伝子型間で保存されているものもあり、遺伝子型内で保存されているものもあり、そして保存されていないものもある。ほとんどはＮ末端の近くにあり、そこで、オーバーラップするポリＮＬＳ領域を形成する傾向がある。これらのアルギニンに富んだモチーフの多くは、哺乳動物において実質的に免疫原性であり、これらを含有するペプチドは、抗ＴＴＶ抗体の生成において有用である。
【０１６３】
（実施例９）
感染性クローンの構築のためのクローン断片
以下に、オーバーラップするクローンから、アミノ酸配列が配列番号９で示されるＴＴＶ遺伝子型１株ｔｔｖｇ１−１７８（配列番号７を参照されたい）を構築するための基礎を提供する。
【０１６４】
要約すると、共にＴＴＶ環状ゲノムの全体にわたる、２つのＴＴＶ断片（１９００ｂｐおよび２２００ｂｐ）を、個別のｐＣＲ２．１ＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）クローニングベクター中に個別にクローニングした。クローン断片は、クローン１：６８０ｓから２６０８ａ＝およそ１９００ｂｐ、およびクローン２：１３４０ｓから７６４ａ＝およそ２２００ｂｐであった。
【０１６５】
これを達成するために、本発明の株（ｔｔｖｇｔ１−２７、−７、−１７、および−２１）ならびに公開されている配列（ＡＹ８２３９９０（ｇ１）およびＡＢ０７６００１−（Ｓｄ−ＴＴＶ３１））から生成したコンセンサス配列を用いて、ＰＣＲプライマーを設計した。６８０ｓおよび２６０８ａ、または１３４０ｓおよび７６４ａの配列に対応するプライマー対を用いて、ＴＴＶチャレンジ株に感染した豚の肝臓ホモジネート試料から抽出したＤＮＡからＰＣＲ産物を増幅した。これらのＰＣＲ断片を、キットに同梱されていた指示書を用いて、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ ＴＡベクター中にクローニングした。クローンを次に、２８８０塩基のゲノム全体にわたりＤＮＡ配列を生成するために用い、配列は、公開されている配列ＧＱ１２０６６４．１およびＡＹ８２３９９０．１に８６％相同であることが明らかになった。
【０１６６】
完全に正確な配列を、以後、完全長の感染性クローンの構築のために組み合わせる。
【０１６７】
（実施例１０）
ｇ１ＴＴＶについての感染性クローン
ｇ１ＴＴＶ ｄｓＤＮＡ断片のクローニング。ｇ１ＴＴＶは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ウイルスである。ｇ１ＴＴＶの断片は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に変換される。ｇ１ＴＴＶのｄｓＤＮＡ断片は次に、ｐＵＣに基づいたプラスミドクローニングベクター中にクローニングされ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中に形質転換される。ｇ１ＴＴＶの断片は、ｇ１ＴＴＶゲノムの１つの完全長ｄｓＤＮＡ同等物より小さい。
【０１６８】
ｇ１ＴＴＶ ｄｓＤＮＡコンカテマーの増幅。完全長ｇ１ＴＴＶ ｄｓＤＮＡゲノム同等物のコンカテマーを、φ２９のポリメラーゼ増幅キット（例えば、ｉｌｌｕｓｔｒａ ＴｅｍｐｌｉＰｈｉ）を用いて生成する。完全長ｇ１ＴＴＶ ｄｓＤＮＡ断片を、適切な制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）部位でコンカテマーを消化することにより生成する。これらの完全長ｇ１ＴＴＶ ｄｓＤＮＡ断片は、プラスミドベクター中にクローニングすることができる。あるいは、コンカテマーまたはクローニングされていない断片（ＲＥの消化から得られる）は、その後の分子生物学的構築における即時のクローニングを伴うことなく、用いることができる（以下を参照されたい）。
【０１６９】
ｇ１ＴＴＶゲノムの縦列重複。ｇ１ＴＴＶゲノムの縦列重複をコードするプラスミド構築物を次に生成する。構築物内の縦列重複は、およそ、ｇ１ＴＴＶゲノムの完全長ｄｓＤＮＡ同等物の１．２コピーよりも大きい。プラスミドにおける縦列重複は、（１）適切なＲＥ部位を採用するサブクローニング、（２）縦列重複のＰＣＲアセンブリー、または（３）他の分子生物学的方法を用いて生成される。縦列重複の生成のための鋳型は、ｇ１ＴＴＶ ｄｓＤＮＡ断片および／または完全長ｇ１ＴＴＶ ｄｓＤＮＡクローン（φ２９のポリメラーゼ増幅によって得られる）である。
【０１７０】
インビボでの組換えおよびｇ１ＴＴＶウイルスの生成。縦列重複プラスミド構築物は、ｇ１ＴＴＶウイルスと同一ではない。縦列重複構築物はｄｓＤＮＡであるが、ウイルスはｓｓＤＮＡであり、この構築物は、ｇ１ＴＴＶゲノムの１．２個を超える完全長ｄｓＤＮＡ同等物をコードするが、ウイルスは１つの完全長同等物のみを有し、この構築物は遮断プラスミド配列を含有するが、ウイルスはウイルス配列のみを有する。真正のｇ１ＴＴＶウイルスを生成するために、縦列重複プラスミド構築物をブタに導入するか（接種、注入、エレクトロポレーション、または他の導入方法によって）、または組織培養細胞中に導入し（トランスフェクション、エレクトロポレーション、または他の導入方法によって）、ここで、プラスミド構築物を、相同配列で組換えして、ｇ１ＴＴＶゲノムの単位長さのｄｓＤＮＡ同等物を再生する。ｇ１ＴＴＶゲノムのｄｓＤＮＡ同等物は、ｇ１ＴＴＶウイルスの生活環の、推定される複製中間体である。この推定されるｄｓＤＮＡの複製中間体の存在は、真正のｓｓＤＮＡ ｇ１ＴＴＶの産生をもたらす。
【０１７１】
ｇ１ＴＴＶ ＯＲＦ発現構築物のコトランスフェクションにより、ｇ１ＴＴＶウイルスのインビボでの生成が可能になる。環状ｄｓＤＮＡ ｇ１ＴＴＶゲノムが、ウイルス生産をもたらし得ることが予想される。ｇ１ＴＴＶのｄｓＤＮＡ形態が複製可能ではないという予想外の事実において、ｄｓＤＮＡの複製中間体からのｇ１ＴＴＶの複製の開始のためには、ｇ１ＴＴＶ ＯＲＦの即時の発現が必要となり得る。ｇ１ＴＴＶ ＯＲＦへの転写プロモーター（例えば、ＣＭＶ）の融合体などの、ｇ１ＴＴＶ ＯＲＦをインビボで転写させるプラスミド構築物を作製することができる。あるいは、ｇ１ＴＴＶ ＯＲＦへの転写プロモーター（例えば、Ｔ７）の融合体などの、ｇ１ＴＴＶ ＯＲＦ転写産物をインビトロで生成させる、プラスミド構築物を作製することができ、その後、インビトロ転写キットが使用される。ｇ１ＴＴＶ ＯＲＦ発現プラスミドまたはｇ１ＴＴＶ ＯＲＦ発現ＲＮＡ転写産物のいずれかを、縦列重複プラスミド構築物と共に、豚に共注入するか、または細胞中にコトランスフェクトして、ｇ１ＴＴＶウイルスを得ることができる。
【０１７２】
ｇ１ＴＴＶウイルス産生の検出。これまでのところ、全ｇ１ＴＴＶウイルスは、組織培養細胞においては増殖させることができない。ｇ１ＴＴＶウイルスの生成は、免疫試薬（例えば、α−ｇ１ＴＴＶ抗体）によって、または分子的方法（例えば、ｑＰＣＲ）によって検出される。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５−１】
【図５−２】
【図５−３】
【図６】
【図７】
【発明を実施するための形態】
【００２０】
配列表の簡単な説明
配列番号１は、遺伝子型ｇｔ２ ＴＴＶ１０ ＤＮＡ配列を示す。
【００２１】
配列番号２は、遺伝子型２ｇｔ２ ＴＴＶ１３ ＤＮＡ配列を示す。
【００２２】
配列番号３は、遺伝子型１ ｔｔｖｇｔ１−２７ ＤＮＡ配列を示す。
【００２３】
配列番号４は、遺伝子型１ ｔｔｖｇｔ１−７ ＤＮＡ配列を示す。
【００２４】
配列番号５は、遺伝子型１ ｔｔｖｇｔ１−１７ ＤＮＡ配列を示す。
【００２５】
配列番号６は、遺伝子型１ ｔｔｖｇｔ１−２１ ＤＮＡ配列を示す。
【００２６】
配列番号７は、遺伝子型１ ｔｔｖｇｔ１−１７８ ＤＮＡ配列を示す。
【００２７】
配列番号８は、ＴＴＶ株ＡＹ８２３９９１ ＯＲＦ１のアミノ酸配列を示す。
【００２８】
配列番号９は、ＴＴＶ株ｔｔｖｇｔ１−１７８ ＯＲＦ１（ＴＴＶ遺伝子型１）のアミノ酸配列を示す。
【００２９】
配列番号１０は、ＴＴＶ株ｔｔｖｇｔ１−７ ＯＲＦ１のアミノ酸配列を示す。
【００３０】
配列番号１１は、ＴＴＶ株ｔｔｖｇｔ１−１７ ＯＲＦ１のアミノ酸配列を示す。
【００３１】
配列番号１２は、ＴＴＶ株ｔｔｖｇｔ１−２１ ＯＲＦ１のアミノ酸配列を示す。
【００３２】
配列番号１３は、ＴＴＶ株ｔｔｖｇｔ１−２７ ＯＲＦ１のアミノ酸配列を示す。
【００３３】
配列番号１４は、ＴＴＶ株ｇｔ２ ＴＴＶ１０ ＯＲＦ１（遺伝子型２）のアミノ酸配列を示す。
【００３４】
配列番号１５は、ＴＴＶ株ｇｔ２ ＴＴＶ１３ ＯＲＦ１のアミノ酸配列を示す。
【００３５】
配列番号１６は、既知の株ＡＹ８２３９９１、遺伝子型２のＤＮＡ配列を示す。
【００３６】
配列番号１７は、既知の株ＡＹ８２３９９０、遺伝子型１のＤＮＡ配列を示す。
【００３７】
配列番号１８は、ｐＵＣ５７ ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ベクター中にクローニングされた、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）についてコドンを最適化された、７６０５７−３ ＴＴＶカプシドコード配列を示す。
【００３８】
配列番号１９は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）発現プラスミド中にクローニングされた、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）についてコドンを最適化された、７６０５７−４ ＴＴＶカプシドコード配列を示す。
【００３９】
配列番号２０は、ｐＵＣ５７ ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ベクター中にクローニングされた、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）にコドンを最適化された、７６０５７−５ ＴＴＶカプシドコード配列を示す。
【００４０】
配列番号２１は、酵母インベルターゼ発現タグ（ＹＩ）を有する、ｔｔｖｇｔ１−７ ＯＲＦ１をコードする構築物についてのＤＮＡ配列を示す。
【００４１】
配列番号２２は、アミド化された形態のＣ末端のＡＡと共に用いられる、残基１６７〜１８５に対応するＯＲＦ１カプシドタンパク質から得られるｔｔｖｇｔ１ペプチド配列（対応するＡＹ８２３９９０配列に基づいた番号付け）を示す。
【００４２】
配列番号２３は、残基４５９〜４７９に対応するＯＲＦ１カプシドタンパク質から得られるｔｔｖｇｔ１ペプチド配列（対応するＡＹ８２３９９０配列に基づいた番号付け）を示す。
【００４３】
配列番号２４は、残基６１２〜６３７に対応するＯＲＦ１カプシドタンパク質から得られるｔｔｖｇｔ１ペプチド配列（対応するＡＹ８２３９９０配列に基づいた番号付け）を示す。
【００４４】
配列番号２５は、ＴＴＶ株ＡＹ８２３９９０ ＯＲＦ１のアミノ酸配列を示す。
【００４５】
配列番号２６〜２９は、プライマー配列を定義する。
【００４６】
配列についての記載に関連して、当業者であれば、多くのわずかに異なる省略形、例えば、ｇ１ＴＴＶ、ＴＴＶｇ１、遺伝子型１ ＴＴＶ、血清型１ ＴＴＶ、ｇｔ１ＴＴＶなどが、特定の血清型についてほぼ同じ意味で一般に用いられることが認識されよう。同様の状況が遺伝子型２にも当てはまる。
【００４７】
以下の定義および導入事項は、明細書内で適用可能である。
【００４８】
「豚（ｐｏｒｃｉｎｅ）」および「ブタ（ｓｗｉｎｅ）」という用語は、本明細書においてほぼ同じ意味で用いられ、イノシシ科の構成要員である任意の動物、例えば豚（ｐｉｇ）を言う。「哺乳動物」には、ヒトを含む、哺乳綱の任意の温血脊椎動物が含まれる。
【００４９】
本発明のための「感染性ＤＮＡ分子」は、適切な宿主細胞における、機能的ウイルス粒子への、ウイルスの複製、転写、および翻訳に必要なエレメントをコードするＤＮＡ分子である。
【００５０】
同様に、「単離されたポリヌクレオチド分子」は、存在する場合は、自然に生じる状態からある程度検出可能な程度に精製された、本発明のポリヌクレオチド分子を包含する物質の組成物を言う。
【００５１】
本発明の目的では、第２のポリヌクレオチド分子（ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか）のヌクレオチド配列は、第１のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列に「相同」であるか、または前記第１のポリヌクレオチド分子に対する「同一性」を有しており、第２のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列は、遺伝暗号の縮重に基づいて、第１のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列と同一のポリアミノ酸をコードするか、または本発明の実施において有用となるように、第１のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列によってコードされるポリアミノ酸に十分に類似したポリアミノ酸をコードする。相同なポリヌクレオチド配列はまた、センス鎖およびアンチセンス鎖のことを言い、全ての場合において、任意のこのような鎖の相補体を言う。本発明の目的では、ポリヌクレオチド分子は、本発明の実施において有用であり、したがって、相同であるかまたは同一性を有しており、これは、例えば標準的なハイブリダイゼーション技術または増幅技術によって、感染した豚の体液試料または組織試料におけるＴＴＶウイルスまたはウイルスポリヌクレオチドの存在を検出するための、診断用プローブとして用いることができる。通常、第２のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列は、それが、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズム（米国国立衛生研究所の、ＮＣＢＩとしても知られている国立バイオテクノロジー情報センター（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵＳＡ））に基づいて、第１のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％のヌクレオチド配列同一性を有する場合、第１のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列に相同である。本発明の実施に従った計算についての具体的な実施例において、ＢＬＡＳＴＰ ２．２．６［Ｔａｔｕｓｏｖａ ＴＡおよびＴＬ Ｍａｄｄｅｎ、「ＢＬＡＳＴ ２ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ− ａ ｎｅｗ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」（１９９９）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．１７４：２４７〜２５０］が参照される。簡潔に述べると、２つのアミノ酸配列が、ギャップオープニングペナルティー１０、ギャップ伸長ペナルティー０．１、ならびに、ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆの「ｂｌｏｓｕｍ６２」スコアリングマトリクス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５〜１０９１９．１９９２）を用いて、アラインメントスコアを最適化するためにアラインされる。次に、同一性パーセントが、同一マッチの総数×１００を、長い方の配列の長さ＋２つの配列をアラインするために長い方の配列中に導入されたギャップの数で割ったものとして計算される。
【００５２】
好ましくは、相同なヌクレオチド配列は、少なくとも約７５％のヌクレオチド配列同一性を有し、さらに好ましくは、少なくとも約８０％、８５％、９０％、および９５％のヌクレオチド配列同一性を有する。遺伝暗号は縮重するため、相同なヌクレオチド配列は、任意の数の「サイレント」な塩基変化、すなわち、それでもなお同一のアミノ酸をコードする、ヌクレオチド置換を含み得る
【００５３】
相同なヌクレオチド配列はさらに、サイレントではない突然変異、すなわち、コードされるポリアミノ酸においてアミノ酸の違いをもたらす、塩基の置換、欠失、または付加を含有し得るが、それは、配列が、第１のヌクレオチド配列によってコードされるポリアミノ酸と少なくとも約７０％同一性を維持しているか、または他の形で本発明の実施に有用である場合に限る。これに関して、全体的なタンパク質機能を不活化しないと通常は認識される、特定の保存的なアミノ酸置換がなされてもよく、例えば、正に荷電したアミノ酸（また逆も同様である）である、リジン、アルギニン、およびヒスチジンに関するもの、負に荷電したアミノ酸（またその逆も同様である）である、アスパラギン酸およびグルタミン酸に関するもの、ならびに、中性に荷電したアミノ酸（全ての場合において、ここでも、また逆も同様である）の特定の群である、（１）アラニンおよびセリン、（２）アスパラギン、グルタミン、およびヒスチジン、（３）システインおよびセリン、（４）グリシンおよびプロリン、（５）イソロイシン、ロイシン、およびバリン、（５）メチオニン、ロイシン、およびイソロイシン、（６）フェニルアラニン、メチオニン、ロイシン、およびチロシン、（６）セリンおよびスレオニン、（７）トリプトファンおよびチロシン、（８）そして例えばチロシン、トリプトファン、およびフェニルアラニンに関するものである。
【００５４】
相同なヌクレオチド配列は、例えば上記のＢＬＡＳＴＮを用いることによる、ヌクレオチド配列の比較によって決定することができる。あるいは、相同なヌクレオチド配列は、選択された条件下でのハイブリダイゼーションによって決定することができる。例えば、第２のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列は、中程度にストリンジェントな条件下で、例えば、６５℃の、０．５ＭのＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭのＥＤＴＡにおける、フィルターに結合したＤＮＡとのハイブリダイゼーション、および４２℃の、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９４、ｐｐ．６．０．３〜６．４．１０を参照されたい）で、または以下に定義されるＴＴＶウイルスをコードする配列のハイブリダイゼーションを他の形でもたらす条件下で、配列番号１の相補体にハイブリダイズする場合、配列番号１（または任意の他の特定のポリヌクレオチド配列）に相同である。ハイブリダイゼーション条件における変更は、経験的に決定することができるか、またはプローブのグアノシン／シトシン（ＧＣ）塩基対の長さおよびパーセンテージに基づいて、正確に計算することができる。ハイブリダイゼーション条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）、ｐｐ．９．４７〜９．５１において記載されている通り計算することができる。
【００５５】
別の実施形態において、第２のヌクレオチド配列は、高度にストリンジェントな条件下で、例えば、当技術分野において知られているような、６５℃の、０．５ＭのＮａＨＰＯ４、７％ＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡにおける、フィルターに結合したＤＮＡとのハイブリダイゼーション、および６８℃の、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での洗浄で、配列番号１の相補体にハイブリダイズする場合、配列番号１（または本発明の任意の他の配列）に相同である。
【００５６】
本発明の単離されたポリヌクレオチド分子および単離されたＲＮＡ分子に、合成分子と、インビトロでのクローニングおよび転写などの組換え技術を介して得られた分子との両方が含まれることが、さらに理解される。
【００５７】
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチド
本発明の代表的な実施形態には、
（ａ）-（ａ１）遺伝子型２配列ＴＴＶ１３（配列番号１）のＤＮＡ、遺伝子型２配列ＴＴＶ１０（配列番号２）のＤＮＡ、またはＴＴＶカプシドタンパク質（Capsid protein）もしくは前記タンパク質の断片をコードする、前記ＤＮＡの断片、
（ａ）-（ａ２）ｔｔｖｇ１−７（配列番号４）、ｔｔｖＧＴ１−１７（配列番号５）、ｔｔｖＧＴ１−２１（配列番号６）、ｔｔｖｇｔ１−２７（配列番号３）、ｔｔｖｇｔ１−１７８（配列番号７）からなる群から選択される遺伝子型１配列のＤＮＡ、またはＴＴＶカプシドタンパク質もしくは前記タンパク質の断片をコードする、前記ＤＮＡの断片、
（ｂ）（ａ）における任意の配列の相補体、
（ｃ）６５℃の、０．５ＭのＮａＨＰＯ４、７％ＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡにおける、フィルターに結合したＤＮＡとのハイブリダイゼーション、および６８℃の、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での洗浄として定義される、ストリンジェントな条件下で、（ａ）または（ｂ）の配列とハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（ｄ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドと少なくとも７０％同一のポリヌクレオチド、
（ｅ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドと少なくとも８０％同一のポリヌクレオチド、
（ｆ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドと少なくとも９０％同一のポリヌクレオチド、
および
（ｇ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドと少なくとも９５％同一のポリヌクレオチド
からなる群から選択されるポリヌクレオチドを包含する、単離されたポリヌクレオチド配列が含まれる。
【００５８】
本発明はまた、遺伝子型２ＴＴＶ１３（配列番号１）もしくは遺伝子型２ＴＴＶ１０（配列番号２）のポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームのいずれかによってコードされるポリペプチド、または前記ポリペプチドもしくはその断片と少なくとも９０％同一のポリペプチドを提供するものであり、これには、さらなる他の同一のアミノ酸が、保存的な置換によって置き換えられるという選択肢が含まれる。
【００５９】
本発明はまた、（全て血清型１の）ｔｔｖｇ１−７（配列番号１０）、ｔｔｖＧＴ１−１７（配列番号１１）、ｔｔｖＧＴ１−２１（配列番号１２）、ｔｔｖｇｔ１−２７（配列番号１３）、およびｔｔｖｇｔ１−１７８（配列番号９）のＯＲＦ１ポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームのいずれかによってコードされるポリペプチド、または前記ポリペプチドもしくはその断片と少なくとも９０％同一のポリペプチドを提供するものであり、これには、さらなる他の同一のアミノ酸が、保存的な置換によって置き換えられるという選択肢が含まれる。
【００６０】
好ましい実施形態において、ポリペプチドはＯＲＦ１から発現し、好ましい混合物には、ＯＲＦ１およびＯＲＦ２、ならびにＯＲＦ１およびＯＲＦ３のポリペプチドの組合せが含まれる。
【００６１】
さらに好ましい実施形態において、ＴＴＶポリペプチドに基づいたワクチンがさらに提供され、前記ワクチンにおいて、抗原は、
（ａ）ＴＴＶ１３（配列番号１）もしくはＴＴＶ１０（配列番号２）のＯＲＦ１カプシドタンパク質の最初の３００個のＮ末端アミノ酸、または（ｂ）それと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｂ）ＴＴＶ１３（配列番号１）もしくはＴＴＶ１０（配列番号２）のＯＲＦ１カプシドタンパク質の最初の２００個のＮ末端アミノ酸、または（ｂ）それと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｃ）ＴＴＶ１３（配列番号１）もしくはＴＴＶ１０（配列番号２）のＯＲＦ１カプシドタンパク質の最初の１００個のＮ末端アミノ酸、または（ｂ）それと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｄ）（全て血清型１の）ｔｔｖｇ１−７（配列番号１０）、ｔｔｖＧＴ１−１７（配列番号１１）、ｔｔｖＧＴ１−２１（配列番号１２）、ｔｔｖｇｔ１−２７（配列番号１３）、およびｔｔｖｇｔ１−１７８（配列番号９）のいずれかのＯＲＦ１カプシドタンパク質の最初の３００個のＮ末端アミノ酸、またはそれと少なくとも９０％同一のポリペプチド、
（ｅ）（全て血清型１の）ｔｔｖｇ１−７（配列番号１０）、ｔｔｖＧＴ１−１７（配列番号１１）、ｔｔｖＧＴ１−２１（配列番号１２）、ｔｔｖｇｔ１−２７（配列番号１３）、およびｔｔｖｇｔ１−１７８（配列番号９）のいずれかのＯＲＦ１カプシドタンパク質の最初の２００個のＮ末端アミノ酸、またはそれと少なくとも９０％同一のポリペプチド、
（ｆ）（全て血清型１の）ｔｔｖｇ１−７（配列番号１０）、ｔｔｖＧＴ１−１７（配列番号１１）、ｔｔｖＧＴ１−２１（配列番号１２）、ｔｔｖｇｔ１−２７（配列番号１３）、およびｔｔｖｇｔ１−１７８（配列番号９）のいずれかのＯＲＦ１カプシドタンパク質の最初の１００個のＮ末端アミノ酸、またはそれと少なくとも９０％同一のポリペプチド
によって定義される。
【００６２】
さらなる遺伝子操作
本発明により提供されるＤＮＡ配列およびアミノ酸配列の情報はまた、ウイルス遺伝子およびそれらがコードする遺伝子産物の構造および機能の系統的分析も可能にする。本発明のウイルス遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドについての知識もまた、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを認識しそれにハイブリダイズする、アンチセンスポリヌクレオチド、またはその断片を利用可能にする。完全長の、および断片状のアンチセンスポリヌクレオチドが、この態様において有用である。当業者であれば、本発明の断片状のアンチセンス分子に、（ｉ）特定のＲＮＡを特異的に認識しそれにハイブリダイズするもの（本発明のウイルスポリペプチドをコードするＤＮＡの配列比較によって決定される）、および（ｉｉ）コードされるタンパク質の変異体をコードするＲＮＡを認識しそれにハイブリダイズするもの、が含まれることが理解されよう。他のＴＴＶペプチドをコードするＲＮＡ／ＤＮＡにハイブリダイズするアンチセンスポリヌクレオチドもまた、分子群についての特徴的配列または特性配列を同定するための配列比較によって、同定可能である。このような技術（実施例８を参照されたい）はさらに、ＴＴＶポリペプチドにおける抗原性ドメインの研究において有用であり、サーコウイルス科（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）の、ＴＴＶ以外の関係の薄い構成要員への宿主動物の感染と区別するためにも用いることができる。
【００６３】
実施例４は、本発明の構築物のための、酵母および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現の増強のための、効果的なコドンの最適化に関するガイダンスを提供する。
【００６４】
ワクチン製剤
本発明のワクチンは、標準的な緩衝液、安定剤、希釈剤、保存剤、および／または可溶化剤などの、ヒトを含む（適用可能である場合）動物に許容可能な担体を含めるための、一般に認められている常法に従って製剤することができ、また、持続放出を容易にするために製剤することができる。希釈剤には、水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロールなどが含まれる。等張性のための添加剤には、とりわけ、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースが含まれる。安定剤には、とりわけ、アルブミンが含まれる。修飾生ワクチンの製剤において特に有用なものを含む、他の適切なワクチン賦形剤および添加剤は、当業者に知られているか、または明らかであろう。例えば、参照することにより本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１８版、１９９０、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇを参照されたい。
【００６５】
本発明のワクチンはさらに、例えばとりわけアジュバントまたはサイトカインなどの、１つまたは複数のさらなる免疫調節成分を包含し得る。本発明のワクチンにおいて用いることができるアジュバントの非限定的な例には、ＲＩＢＩアジュバント系（Ｒｉｂｉ Ｉｎｃ．、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）、ミョウバン、水酸化アルミニウムゲルなどの無機物ゲル、水中油型エマルジョン、例えばフロイント完全アジュバントおよび不完全アジュバントなどの油中水型エマルジョン、ブロックコポリマー（ＣｙｔＲｘ、Ａｔｌａｎｔａ ＧＡ）、ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ）、ＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ ＣＡ）、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）アジュバント、サポニン、Ｑｕｉｌ Ａ、または他のサポニン画分、モノホスホリル脂質Ａ、イオン性多糖、およびアブリジン脂質アミンアジュバントが含まれる。本発明のワクチンにおいて有用な水中油型エマルジョンの非限定的な例には、修飾ＳＥＡＭ６２製剤およびＳＥＡＭ１／２製剤が含まれる。修飾ＳＥＡＭ６２は、５％（ｖ／ｖ）のスクアレン（Ｓｉｇｍａ）、１％（ｖ／ｖ）のＳＰＡＮ（登録商標）８５洗浄剤（ＩＣＩ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ）、０．７％（ｖ／ｖ）のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０洗浄剤（ＩＣＩ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ）、２．５％（ｖ／ｖ）のエタノール、２００μｇ／ｍｌのＱｕｉｌ Ａ、１００μｇ／ｍｌのコレステロール、および０．５％（ｖ／ｖ）のレシチンを含有する、水中油型エマルジョンである。修飾ＳＥＡＭ１／２は、５％（ｖ／ｖ）のスクアレン、１％（ｖ／ｖ）のＳＰＡＮ（登録商標）８５洗浄剤、０．７％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ８０洗浄剤、２．５％（ｖ／ｖ）のエタノール、１００μｇ／ｍｌのＱｕｉｌ Ａ、および５０μｇ／ｍｌのコレステロールを含有する、水中油型エマルジョンである。ワクチンに含めることのできる、他の免疫調節物質には、例えば、１つまたは複数のインターロイキン、インターフェロン、または他の既知のサイトカインが含まれる。
【００６６】
さらなるアジュバント系により、ヘルパーＴ細胞のエピトープとＢ細胞のエピトープとの両方の組合せが可能になり、それにより、１つまたは複数のタイプの、共有結合したＴ−Ｂエピトープ構造がもたらされ、それは、ＷＯ２００６／０８４３１９、ＷＯ２００４／０１４９５７、およびＷＯ２００４／０１４９５６において記載されているように、さらに脂質付加され得る。
【００６７】
本発明の好ましい実施形態において、ＯＲＦＩ ＴＴＶタンパク質もしくは他のＴＴＶタンパク質、またはその断片は、５％のＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）と共に製剤される。
【００６８】
本発明のワクチンは、本発明のウイルス、感染性ＤＮＡ分子、プラスミド、またはウイルスベクターの持続放出のために製剤されていてもよい。このような持続放出製剤の例には、生体適合性ポリマーの複合物、例えばポリ乳酸、乳酸グリコール酸共重合体、メチルセルロース、ヒアルロン酸、コラーゲンなどと組み合わされた、ウイルス、感染性ＤＮＡ分子、プラスミド、またはウイルスベクターが含まれる。薬剤送達賦形剤における分解性ポリマーの構造、選択、および使用は、参照することにより本明細書に組み込まれる、Ａ．Ｄｏｍｂら、１９９２、Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ３：２７９〜２９２を含む、いくつかの刊行物において概説されている。医薬品製剤におけるポリマーの選択および使用におけるさらなるガイダンスは、当技術分野において知られている文書において、例えば、参照することにより同様に本明細書に組み込まれる、Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｖｏｌ．４５、Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹにおける、Ｍ．ＣｈａｓｉｎおよびＲ．Ｌａｎｇｅｒ（編）、１９９０、「Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｓ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ」において見ることができる。別法として、またはさらに、ウイルス、プラスミド、またはウイルスベクターを、投与および有効性を向上させるために、マイクロカプセル化することができる。抗原をマイクロカプセル化するための方法は、当技術分野において周知であり、例えば、参照することにより全て本明細書に組み込まれる、米国特許第３，１３７，６３１号、米国特許第３，９５９，４５７号、米国特許第４，２０５，０６０号、米国特許第４，６０６，９４０号、米国特許第４，７４４，９３３号、米国特許第５，１３２，１１７号、および国際特許公開ＷＯ９５/２８２２７において記載されている技術を含む。
【００６９】
リポソームもまた、ウイルス、プラスミド、ウイルスタンパク質、またはウイルスベクターの持続放出をもたらすために用いることができる。リポソーム製剤の作製方法および使用方法に関する詳細は、とりわけ、参照することにより本明細書に組み込まれる、米国特許第４，０１６，１００号、米国特許第４，４５２，７４７号、米国特許第４，９２１，７０６号、米国特許第４，９２７，６３７号、米国特許第４，９４４，９４８号、米国特許第５，００８，０５０号、および米国特許第５，００９，９５６号において見ることができる。
【００７０】
上記のワクチンのいずれかの効果的な量は、低用量のウイルス、ウイルスタンパク質、プラスミド、またはウイルスベクターから開始し、その後、効果をモニタリングしながら投与量を増大させる、従来の手段によって決定することができる。効果的な量は、ワクチンを単回投与した後、またはワクチンを複数回投与した後に、得ることができる。動物当たりの最適な用量を決定する際、既知の因子を考慮に入れることができる。これらには、動物の種、サイズ、年齢、および全身状態、動物における他の薬剤の存在などが含まれる。実際の投与量は、好ましくは、他の動物研究から得られる結果の考察の後に選択される（例えば、以下の実施例２および３を参照されたい）。
【００７１】
適切な免疫応答が達成されているかどうかを検出する１つの方法は、ワクチン接種後の動物におけるセロコンバージョンおよび抗体力価を決定することである。ワクチン接種のタイミング、およびブースター投与がもしある場合、その数は、好ましくは、全ての関連する因子の分析に基づいて医師または獣医師によって決定され、前記因子の一部は、上記に記載している。
【００７２】
本発明のウイルス、タンパク質、感染性ＤＮＡ分子、プラスミド、またはウイルスベクターの効果的な用量は、ワクチン接種される動物の体重などの、当業者によって決定され得る因子を考慮して、既知の技術を用いて決定することができる。本発明のワクチンにおける、本発明のウイルスの用量は、好ましくは、約１０１から約１０９ｐｆｕ（プラーク形成単位）の範囲であり、より好ましくは、約１０２から約１０８ｐｆｕの範囲であり、最も好ましくは、約１０３から約１０７ｐｆｕの範囲である。本発明のワクチンにおける、本発明のプラスミドの用量は、好ましくは、約０．１μｇから約１００ｍｇの範囲であり、より好ましくは、約１μｇから約１０ｍｇの範囲であり、さらに好ましくは、約１０μｇから約１ｍｇの範囲である。本発明のワクチンにおける、本発明の感染性ＤＮＡ分子の用量は、好ましくは、約０．１μｇから約１００ｍｇの範囲であり、より好ましくは、約１μｇから約１０ｍｇの範囲であり、さらに好ましくは、約１０μｇから約１ｍｇの範囲である。本発明のワクチンにおける、本発明のウイルスベクターの用量は、好ましくは、約１０１ｐｆｕから約１０９ｐｆｕの範囲であり、より好ましくは、約１０２ｐｆｕから約１０８ｐｆｕの範囲であり、さらに好ましくは、約１０３から約１０７ｐｆｕの範囲である。適切な投与量は、約０．５ｍｌから約１０ｍｌの範囲であり、さらに好ましくは、約１ｍｌから約５ｍｌの範囲である。
【００７３】
本発明の実施に従う、ウイルスタンパク質ワクチンまたはウイルスペプチドワクチンのための適切な用量は、通常は、用量当たり１から５０マイクログラムの範囲であるか、または標準的な方法によって決定され得る、それより多い量であり、アジュバントの量はそれぞれのこのような物質に関して認められた方法によって決定される。ブタのワクチンに関連する、本発明の好ましい実施例において、動物についての最適な年齢標的は、約１日から２１日であり、これは、離乳前の時点で、マイコプラズマハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）などの他の計画的なワクチン接種にも対応し得る。さらに、雌の種豚のためのワクチン接種の好ましいスケジュールには、年に１回の再ワクチン接種スケジュールでの、同様の用量が含まれる。
【００７４】
抗体
本発明によってまた意図されるものは、抗ＴＴＶ抗体（例えば、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、豚抗体、および本発明のＴＴＶポリペプチドを特異的に認識するＣＤＲ配列を含む化合物を含む、ＣＤＲ移植抗体）である。「特異的な」という用語は、本発明の抗体の可変領域が、ＴＴＶポリペプチドのみを認識し、結合する（すなわち、ポリペプチド群において見られる配列の同一性、相同性、または類似性にもかかわらず、関連するポリペプチドから単一のＴＴＶポリペプチドを区別することができる）ことを示し、またこれは、抗体の可変領域の外側の配列、特にＡｂ分子の定常領域における配列との相互作用を介して、他のタンパク質（例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のタンパク質Ａ、またはＥＬＩＳＡ技術における他の抗体）と相互作用することが（場合により）可能である。本発明の抗体の結合特異性を決定するためのスクリーニングアッセイは周知であり、当技術分野において日常的に実施されている。このようなアッセイの包括的な議論については、Ｈａｒｌｏｗら（編）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８８）、Ｃｈａｐｔｅｒ ６を参照されたい。本発明のＴＴＶポリペプチドの断片を認識し、結合する抗体が、上記に定義したように、前記断片が由来する本発明のＴＴＶポリペプチドに対して第一に、かつ最も特異的であるならば、これらの抗体もまた意図される。
【００７５】
明確にするために、「抗体」は、特異的抗原に対する免疫応答の結果生じる、前記特異的抗原に結合し得る免疫グロブリン分子を言う。免疫グロブリンは、「定常」領域および「可変」領域を有する、「軽鎖」ポリペプチド鎖および「重鎖」ポリペプチド鎖からなる、血清タンパク質であり、定常領域の組成に基づいて、いくつかのクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）に分けられる。抗体は、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、などを含む様々な形態で、また、一本鎖で存在し得、１つまたは複数の抗体一本鎖ポリペプチド配列の全てまたは一部を含有する、合成ポリペプチドを含む。
【００７６】
診断キット
本発明はまた、診断キットを提供する。キットは、ＴＴＶウイルスの野外株に自然に感染した豚動物と、本明細書において記載されるＴＴＶワクチンのいずれかでワクチン接種された豚動物とを区別するために有益であり得る。また、ＴＴＶウイルスの野外株に感染している可能性のある動物を、臨床症候が現れる前に検出することができ、群れから排除することができる、またはナイーブなもしくはワクチン接種された動物から分離して置いておくことができるという理由からも、キットは有益であり得る。キットには、特定されたＴＴＶウイルスの特定の成分に対する抗体の存在について、豚動物から得られる試料を分析するための試薬が含まれる。本発明の診断キットには、成分として、野外株には存在するが目的のワクチンには存在しない、またはその逆である、ＯＲＦ１、２、または３から得られる１つまたは複数のペプチドが含まれ得、このような適切なペプチドドメインの選択は、明細書の実施例１および２において提供される広範なアミノ酸配列決定によって可能となる。当技術分野において知られているように、本発明のキットは、成分として、融合タンパク質を介して提供されるペプチドを代わりに含み得る。本発明のための「融合ペプチド」または「融合タンパク質」という用語は、ＴＴＶウイルスタンパク質の少なくとも一部、好ましくはＯＲＦ１と、異種ペプチドまたはタンパク質とからなる、一本鎖ポリペプチドを意味する。
【実施例】
【００７７】
（実施例１）
ブタＴＴＶ完全ゲノムのクローニング
Ａ．ＴＴＶ遺伝子型２
製造者のプロトコルに従って、ＤＮＡ血液ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、豚の血清からＤＮＡを精製した。ＤＮＡは、カラムから、５０μＬのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液において溶出した。次に、ＤＮＡを、ランダムプライムローリングサークル増幅によって増幅した。簡潔に述べると、５μＬの精製ＤＮＡおよび１００ｎｇのランダムヘキサマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、７１μｌの水に添加し、９５℃で３分間にわたり加熱し、氷上で冷却した。次に、１ｍＭのｄＮＴＰ、１００ｎｇのランダムヘキサマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１×ｐｈｉ２９ポリメラーゼ緩衝液、および１μＬのｐｈｉ２９ポリメラーゼを添加し、反応物を３０℃で一晩インキュベートした。
【００７８】
全容積の５分の１を、ＥｃｏＲＩで消化し、０．８％Ｅゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で電気泳動して、２．７ｋＢの断片の存在を検出した。ＥｃｏＲＩ消化された材料を、製造者のプロトコルに従って、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットを用いて精製し、ＥｃｏＲＩで消化された／シュリンプアルカリホスファターゼ処理された、ｐＧｅｍ３ｚｆ（＋）ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）中にライゲーションした。ライゲーションされたＤＮＡを用いて、化学的にコンピテントな大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αを形質転換した。形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を、ＬＢ／ａｍｐ寒天プレート上で選択した。
【００７９】
プラスミドＤＮＡを、形質転換したコロニーから単離し、ＥｃｏＲＩで消化して、およそ２．７ｋＢのインサートの存在を確認した。４つのクローン（４、７、１０、および１３）を選択し、配列決定のためにＡＣＧＴ，Ｉｎｃ．に提出した。配列データのアラインメントは、クローン１０および１３がＴＴＶの公表されている配列に対する相同性を示し、ＴＴＶ遺伝子型１よりも遺伝子型２に、より近くアラインされたことを示した。これらのクローンは、それ以降、ＴＴＶ１０およびＴＴＶ１３と名付けた。
【００８０】
ＰＡＨ ＴＴＶ遺伝子型２についての配列決定データの分析
公開されているＴＴＶ遺伝子型２ ＡＹ８２３９９１ ＤＮＡ配列（配列番号１６）に対するＴＴＶ１３（配列番号２）およびＴＴＶ１０（配列番号１）のヌクレオチドアラインメント
【００８１】
【表１】
【００８２】
ＴＴＶ１３は、これまでに公開されているＡＹ８２３９９１の配列と比較すると、９２％の同一性を示す。しかし、ＴＴＶ１０は、ＡＹ８２３９９１またはＴＴＶ１３のいずれかとの間でわずかに７６％の類似性を示し、関連のない遺伝子型であると考えられ得る。
【００８３】
ＡＹ８２３９９１ ＯＲＦ１（配列番号８）との、ＴＴＶ１０（配列番号１４）およびＴＴＶ１３（配列番号１５）についての、ＰＡＨ ＴＴＶ遺伝子型ＯＲＦ１のアミノ酸アラインメント
【００８４】
公開されている配列とのＴＴＶ１０ ＴＴＶ１３ ＯＲＦのアミノ酸アラインメント
【００８５】
【表２】
【００８６】
アミノ酸レベルでは、ＴＴＶ１０ ＯＲＦは、公開されている配列に対してわずか６５％の相同性を示し、ＴＴＶの固有の表現型を表し得る。
【００８７】
バキュロウイルスの発現のためのＴＴＶ遺伝子型２ ＯＲＦ１のクローニング
上記に得られた配列データに基づいて、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）システムを用いて、バキュロウイルスにおける発現のためにＴＴＶ１０およびＴＴＶ１３からのＯＲＦをクローニングするために、プライマーを設計した。
【００８８】
ＴＴＶ１３ ＯＲＦについて：Ｔｔｖ１３Ｒｅｖ１２１１：５’ｃｇｔ ａｃｔ ｃｇａ ｇｔｃ ａｃａ ｇｔｇ ｔｔｔ ｔｃａ ｔｃｃ（配列番号２６）、ＴＴＶ１３Ｆｏｒ１２１１：５’ｃｔａ ｇｇｔ ａｃｃ ａｔｇ ｃｃｔ ｔａｃ ａｇａ ｃｇｃ ｔａｔ（配列番号２７）
【００８９】
ＴＴＶ１０ ＯＲＦについて：ｔｔ１０ｆｏｒ１２０７：５’ｃｔａ ｇｇｔ ａｃｃ ａｔｇ ｃｃｔ ｔｔｃ ｃａｃ ｃｇｃ ｔａｔ（配列番号２８）、およびｔｔｖｒｅｖ１２０７：ｃｇｔ ａｃｔ ｃｇａ ｇｃｔ ａｔａ ｇｇｇ ｔｃｃ ｔｇａ ａｔ（配列番号２９）
【００９０】
ｐＧｅｍ中にＥｃｏＲＩをクローニングすると、ＯＲＦ１のリーディングフレームが中断されるため、ｐＧｅｍ内のＴＴＶインサートを、ＥｃｏＲＩ消化によって単離し、ゲル精製し、標準的なライゲーション条件を用いて再環状化した。４℃で一晩ライゲーションした後、６５℃でリガーゼを不活化し、反応物を、製造者のプロトコルに従って、ＱｕｉＱｕｉｃｋ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。
【００９１】
ＴＴＶＯＲＦ１３を、上記のＴＴＶ１３フォワードプライマーおよびリバースプライマー（それぞれ０．１５μＭ）、１×Ｈｉ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ酵素緩衝液中の０．２ｍＭのｄＮＴＰを用いて、再環状化したＴＴＶ１３ゲノムＤＮＡとＥｘｐａｎｄ Ｈｉ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（登録商標）酵素（Ｒｏｃｈｅ）とを用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ条件は、９５℃で４分間を１サイクル、９４℃で１５秒間の変性と、５５℃で３０秒間のアニーリングと、６８℃で１．５分間の伸長とを３５サイクル、および７２℃で７分間の伸長を１サイクルであった。
【００９２】
同様に、ＴＴＶＯＲＦ１０を、上記のＴＴＶ１０フォワードプライマーおよびリバースプライマー（それぞれ０．１５μＭ）、１×Ｈｉ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ酵素緩衝液中の０．２ｍＭのｄＮＴＰを用いて、再環状化したＴＴＶ１０ゲノムＤＮＡとＥｘｐａｎｄ Ｈｉ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（登録商標）酵素（Ｒｏｃｈｅ）とを用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ条件は、９５℃で４分間を１サイクル、９４℃で１５秒間の変性と、５６℃で３０秒間のアニーリングと、６８℃で１．５分間の伸長とを３５サイクル、および７２℃で７分間の伸長を１サイクルであった。
【００９３】
ＰＣＲ産物を、製造者のプロトコルに従って、ＱｉａＱｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。ＰＣＲ ＴＴＶ１０Ｏｒｆ１生成物とＴＴＶ１３Ｏｒｆ１生成物との両方、およびＧａｔｅｗａｙエントリープラスミドであるｐＥＮＴＲ３Ｃを、Ｋｐｎｌで消化した。消化されたＤＮＡを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ増幅キットを用いて精製し、その後、ＸｈｏＩで消化した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ精製の後、ＴＴＶ１０ ＯＲＦ１またはＴＴＶ１３ＯＲＦ１のＤＮＡを、標準的なライゲーション手順を用いて、ｐＥＮＴＲ３Ｃ中にライゲーションした。室温で２時間ライゲーションした後、ライゲーションされたＤＮＡを用いて、化学的にコンピテントな大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αを形質転換した。形質転換されたコロニーを、カナマイシンを用いて選択した。形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からプラスミドを精製し、ＯＲＦ１ ＤＮＡの挿入を、制限断片分析によって検証した。
【００９４】
次に、ＴＴＶ１０ ＯＲＦ１またはＴＴＶ１３ ＯＲＦ１を含有するｐＥＮＴＲ３Ｃプラスミドを、Ｈｉｓ６×またはＧＳＴタンパク質のＮ末端からＴＴＶ Ｏｒｆ１リーディングフレームまでをコードする、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのデスティネーションベクターであるｐＤＥＳＴ１０またはｐＤＥＳＴ２０中に挿入した。ＴＴＶ Ｏｒｆ１のオープンリーディングフレームを含有する組換えｐＤＥＳＴベクターを用いて、ＤＨ１０Ｂａｃ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を形質転換した。組換えバクミドＤＮＡを単離し、標準的なプロトコルに従って、ＳＦ９細胞のトランスフェクションに用いた。ネイティブなＯｒｆ１を含有する組換えバキュロウイルスを、プラーク精製によって単離した。組換えバキュロウイルスの確認を、ＰＣＲを用いて行った。
【００９５】
バキュロウイルスの発現のための、ネイティブなＴＴＶＯｒｆ１の構築
標準的なＰＣＲを用いて、ＢａｍＨ１制限部位を、ＴＴＶ１０ Ｏｒｆ１における開始コドンから上流に、またはＸｂａＩ制限部位を、ＴＴＶ Ｏｒｆ１３における開始コドンから上流に組み込んだ。これらの構築物を、ｐＦａｓｔＢａｃ導入ベクター中にクローニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂａｃを形質転換するために用いた。得られた組換えバクミドを次に、ＳＦ９細胞をトランスフェクトするために用いた。ネイティブなＯｒｆ１を含有する組換えバキュロウイルスを、プラーク精製によって単離した。組換えバキュロウイルスの確認を、ＰＣＲを用いて行った。
【００９６】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の発現のためのＴＴＶ遺伝子型２ ＯＲＦ１のクローニング
細菌系におけるＧＳＴ融合タンパク質の発現のために、完全長ＴＴＶＯｒｆ１０もまた、ＰＧｅｘ−６ｐ−１ベクター中にクローニングした。ＴＴＶ ＯＲＦは、アルギニンに富んだアミノ末端を含有する。タンパク質産生が細菌発現系において増大し得たかどうかを判定するために、アルギニンに富んだセグメントを、Ｏｒｆ１のオープンリーディングフレームのヌクレオチド３６８に位置し、ｐＧｅｘ−６ｐ−１のＧＳＴコード領域とインフレームの、都合の良い制限部位（ＥｃｏＲ１）で、ＴＴＶＯｒｆ１３から除去した。このクローンにより、高度にアルギニンに富んだセグメントを含有する、アミノ末端の１００個のアミノ酸が除去された。
【００９７】
Ｂ．ＴＴＶ遺伝子型１
豚の骨髄から得られる細胞ＤＮＡ全体を、増幅反応の有効性を向上させるために一本鎖結合タンパク質を添加したことを除いて、上記の手順に従って、ローリングサークル増幅によって増幅した。増幅産物は、ＥｃｏＲ１での消化、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ増幅キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いた精製、およびシュリンプアルカリホスファターゼで事前に処理されたｐＧｅｍ３ｚｆ（＋）ベクター中へのライゲーションであった。推定ＴＴＶゲノムＤＮＡを含有する組換えベクターを、ＥｃｏＲ１および／またはＢａｍＨ１での制限消化に基づいて選択した。およそ２．７ｋＢのインサートを含有するプラスミドを精製し、ＯＲＦ１配列の配列決定のためにＡＣＧＴ，Ｉｎｃ．に提出して、遺伝子型を確認した。完全なゲノム、すなわち、高度にＧ／Ｃに富んだ領域を含有する領域は、完全には配列決定されなかった。
【００９８】
ＰＡＨ ＴＴＶ遺伝子型１のための配列決定データの分析
ＰＡＨ ＴＴＶ７（配列番号４）、ＴＴＶ１７（配列番号５）、ＴＴＶ２１（配列番号６）、およびＴＴＶ２７（配列番号３）と、公開されている配列であるＡＹ８２３９９０（配列番号１７）とのヌクレオチドアラインメント。
【００９９】
ＰＡＨ ＴＴＶ配列と公開されている配列の間のヌクレオチド同一性
【０１００】
【表３】
ＴＴＶｇｔ１−２７は、公開されている配列であるＡＹ８２３９９０との最大の相同性を示し、９１％の同一性を示す。ＴＴＶｇｔ１−７、１７、および２１は、８５〜８７％の同一性を示す。ＴＴＶｇｔ１−７およびＴＴＶｇｔ１−２１は、９９％のヌクレオチド同一性を共有する。
【０１０１】
Ｏｒｆ１アミノ酸のアラインメント
以下に、公開されているＡＹ８２３９９０配列（配列番号２５）と、ＴＴＶ７（配列番号１０）、ＴＴＶ１７（配列番号１１）、ＴＴＶ２１（配列番号１２）、およびＴＴＶ２７（配列番号１３）についての対応するアミノ酸配列との比較を提供する。
【０１０２】
【表４】
【０１０３】
タンパク質の疎水性プロットは、親水性の５つの領域を示し、これは、潜在的に抗原性である、表面が露出した領域を示し得る。これらの領域の２つは、アミノ末端およびカルボキシ末端にあり、また、アルギニンに富んでおり、かつ高度に保存されている。アミノ酸１９０とアミノ酸２３２との間の、高度に保存された親水性領域が観察され、これは、抗原性部位として作用し得る可能性がある。アミノ酸２９５とアミノ酸３１６との間の、およびアミノ酸４１５とアミノ酸４７０との間の、残りの親水性領域もまた、抗原性である。
【０１０４】
さらに、ＯＲＦ１についての推定開始コドンおよびコード領域が、ｔｔｖｇｔ１−２７ ヌクレオチド５１７〜２４３５、ｔｔｖｇ１−７ ヌクレオチド５１７〜２４３５、ｔｔｖｇｔ１−１７ ヌクレオチド５１７〜２４３６、ｔｔｖｇｔ１−２１ ヌクレオチド５１７〜２４３９、ｔｔｖ１０ ヌクレオチド４８７〜２３４６、およびｔｔｖ１３ ヌクレオチド４７７〜２３６３であることが決定されている。ＯＲＦ２についての推定開始コドンおよびコード領域は、ｔｔｖｇｔ１−２７ ヌクレオチド４２８〜６４６、ｔｔｖｇ１−７ ヌクレオチド４２８〜６４３、ｔｔｖｇｔ１−１７ ヌクレオチド４２８〜６４３、ｔｔｖｇｔ１−２１ ヌクレオチド４２８〜６４６、ｔｔｖ１０ ヌクレオチド４０４〜６１０、およびｔｔｖ１３ ヌクレオチド３９４〜５９７である。
【０１０５】
組換えバキュロウイルスを用いた、ＴＴＶ ＯＲＦ１タンパク質の発現
次に、昆虫細胞および組換えバキュロウイルスを用いて遺伝子型２ＴＴＶ ＯＲＦ１タンパク質を発現させるために、一連の実験に着手した。タンパク質発現の最適化を、３つの細胞系（ＳＦ９、ＳＦ２１、およびＨｉ Ｆｉｖｅ）、複数の媒質構成（ＥｘＣｅｌｌ ４２０、ＳＦ９００ ＩＩＩ ＳＦＭ、Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｆｉｖｅ ＳＦＭ）、様々な細胞密度（５ｅ５、１ｅ６、２ｅ６、および４ｅ６細胞／ｍｌ）、ならびに様々な感染多重度（０．００５、０．１、０．５、２．０）を用いて行い、得られた培養物を、感染後７日間にわたり、毎日モニタリングした。
【０１０６】
細胞の密度および生存能力について経過をモニタリングし、細胞のサイズおよびウイルス力価のモニタリングによって、感染をモニタリングした。タンパク質発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クマシーゲル分析、およびウェスタンブロッティングによってモニタリングした。適切な対照を確実にするため、陰性対照および陽性対照を、全ての実験の間にわたり維持した。全ての実験により、標的タンパク質の発現を確認することができたが、最適な条件は、２×１０６細胞／ｍｌの細胞密度および０．１のＭＯＩで、ＥｘＣｅｌｌ ４２０媒質（Ｓｉｇｍａ、ＳＡＦＣ）中で維持されたＳＦ９細胞を用い、プロセスを３日間の感染の後に終わらせたときに見られた。組換え発現したタンパク質のいくつかは、得られた上清中に存在するが、ほとんどは、細胞ペレット中に位置していた可能性がある。
【０１０７】
ウェスタンブロッティング（ＧＳＴタグ）を用いたタンパク質発現の確認
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎデスティネーションベクター（ｐＤＥＳＴ１０）は、ＧＳＴタンパク質のＮ末端からＴＴＶ Ｏｒｆ１リーディングフレームまでを含有していたため、結果として得られる、およそ９５ｋＤのＧＳＴ−ＯＲＦ１融合タンパク質が生成し、これは、市販されているウサギ抗ＧＳＴ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）抗体を用いて検出された。９５ｋＤの融合タンパク質のうち、およそ６８ｋＤはＯＲＦ１であると考えられ、２５ｋＤはＧＳＴタンパク質であると考えられる。市販されている抗体は、ＴＴＶ ＯＲＦ１タンパク質の標準化された検出には利用不可能であり、抗ＧＳＴ抗体の使用が必要となった。
【０１０８】
ウサギ抗ＴＴＶ ＯＲＦ１抗体の生産
既知のＴＴＶ試薬が最初は使用不可能であったため、抗ＴＴＶ ＯＲＦ１抗体を生産するための試みに着手した。ＴＴＶ ＯＲＦ１組換えタンパク質を調製するための、最適化された発現プロトコルに従って、市販されているＢａｃｕｌｏｇｏｌｄ ＧＳＴ精製キットを用いて、得られた材料をさらに精製した。次に、精製されたＴＴＶ１０およびＴＴＶ１３ ＯＲＦ１タンパク質を用いてウサギを超免疫化し、それによって、その後、ＯＲＦ１組換えタンパク質に対する抗体を産生させた。
【０１０９】
タンパク質の検出に関して、図１Ａの試料レーンは以下の通りであった（右から左）。
【０１１０】
【表５】
【０１１１】
レーン２、４、および６は、後にウサギの免疫化に用いられる、精製された９５ｋＤのＴＴＶ１３ ＯＲＦ１融合タンパク質を示し、図１Ａを参照されたい。
【０１１２】
ウサギ抗ＯＲＦ１タンパク質を用いた、ネイティブなＴＴＶ ＯＲＦ１の検出
さらなる発現実験を、ネイティブなＴＴＶ ＯＲＦ１組換えバキュロウイルスを用いて行った。この組換えバキュロウイルスは、６×ＨｉｓタグまたはＧＳＴ融合タグを用いることなく構築し、したがって、特異的な抗ＴＴＶ ＯＲＦ１抗体を必要とする。したがって、ネイティブなタンパク質の発現を確認するため、および試薬の反応性を確認するために、発現後のウェスタンブロット分析を、ウサギ抗ＴＴＶ ＯＲＦ１抗体を用いて行った。ウェスタンブロット分析は、ほぼＴＴＶ ＯＲＦ１の予測されたサイズである、およそ６９ｋＤでのかすかな反応、およびおよそ４９ｋＤでのさらなるバンドに対する反応を示した（図１Ｂを参照されたい）。４９ｋＤのタンパク質バンドは知られていない。６９ｋＤでのかすかなバンド発生は、ネイティブなＴＴＶ ＯＲＦ１構築物におけるタンパク質発現が低いこと、またはウサギの免疫化から得られる抗体が少ないことのいずれかに関連すると仮定される。この特定の分析において、抗原または抗体の精製が行われなかったことに注意されたい。レーン５（図１Ｂにおける矢印を参照されたい）は、抗ＴＴＶ ＯＲＦ１ウサギポリクローナル抗体を用いた、ネイティブなＴＴＶ ＯＲＦ１の発現における、約６９ｋＤおよび４９ｋＤのタンパク質に対する固有の反応を示す。
【０１１３】
したがって、抗原としてのカプシドタンパク質に対する抗体の結合が示され、ここで、抗原は、ＴＴＶ配列のみを提供し、タグ付けはされていなかった。
【０１１４】
図６Ｂの試料レーンは以下の通りであった（右から左）。
【０１１５】
【表６】
【０１１６】
（実施例２）
戻し継代（backpassaging）
肝臓を、帝王切開で産まれた初乳無摂取（ＣＤＣＤ）豚から、無菌状態で回収した。肝組織を、固有のｑＰＣＲアッセイにおいてｇ１ＴＴＶおよびｇ２ＴＴＶについて試験し、ｇ１ＴＴＶのみについて陽性であることを確認した。次に、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）の肝臓ホモジネートを、抗生物質および抗真菌剤を含有する媒質において調製した。最後に、ホモジネートを、遠心分離によって澄明化し、ｇ１ＴＴＶｐ０と称し、−７０℃で凍結した。得られたｇ１ＴＴＶホモジネートを、通常の試験によって、外来ウイルス、細菌、およびマイコプラズマが存在しないように試験した。十分な試験の後、２ミリリットルの新たに解凍されたｇ１ＴＴＶｐ０を、６頭の１１日齢のノトバイオートの子豚のそれぞれにＩＰ接種した。接種後およそ１２日目に、豚を安楽死させ、骨髄、脾臓、および肝臓を無菌状態で回収した。得られた肝臓のそれぞれを、ｑＰＣＲによって、ｇ１ＴＴＶに富んでいること、およびｇ２ＴＴＶについて陰性であることを確認した。次に、肝臓ホモジネートを、上記の得られた肝臓のそれぞれから調製し、標識し、ｇ１ＴＴＶｐ１としてアリコート化し、−７０℃に置いた。さらなる２継代目（ｇ１ＴＴＶｐ２）を、ｇ１ＴＴＶｐ１から生じさせた。
【０１１７】
（実施例３）
若豚における３つのトルクテノウイルス（ＴＴＶ）ワクチンの有効性の評価
本研究は、約７日齢で、また再び離乳時（約２１日齢）に投与し、その後約５週齢でチャレンジを行った、３つのＴＴＶワクチン候補の有効性を評価するために行われた。
【０１１８】
この研究は、ＴＴＶの製剤を筋肉内注入された豚における、予備的な免疫原性の評価を提供した。先に述べたように、ＴＴＶは、負極性の一本鎖環状ＤＮＡゲノムを有する、小さな、エンベロープを有さないウイルスである。ゲノムには、非翻訳領域および少なくとも３つの主要なオーバーラップするオープンリーディングフレームが含まれる。豚ＴＴＶは遍在的であり、様々な地理的領域から回収される血清試料におけるウイルスのＰＣＲ検出は、３３〜１００％の豚における有病率を示す。ＭｃＫｅｏｗｎら、Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００４）１０４：１１３〜１１７。Ｋｒａｋｏｗｋａら、ＡＪＶＲ（２００８）６９：１６２３〜１６２９は、ｇ１−ＴＴＶを接種された豚が、臨床兆候は有さなかったが、接種後に、間質性肺炎、一過性の胸腺委縮、膜性子宮体腎症、および肝臓におけるリンパ球性から組織球性の軽度の浸潤を発症したことを報告した。本研究は、ＴＴＶワクチンの３つの異なる製剤の比較を提供し、これらの試作製剤のいずれかが、チャレンジ対照群と比較したときに、数値的にまたは統計的に区別され得るかどうかを評価した。
【０１１９】
材料および方法
動物：６頭の、臨床的に健康な、異種交配で妊娠した、ＰＲＲＳＶまたはマイコプラズマハイオニューモニエ（Ｍ ｈｙｏ）により生じる疾患（または同一の生物に対するワクチン接種）の経験がない、ＰＲＲＳＶおよびマイコプラズマハイオニューモニエ（Ｍ ｈｙｏ）に血清反応陰性のメスが、Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｔｒａｉｌ／Ｐｕｒｅｇｅｎｉｃ Ｐｏｒｋ、Ａｌｔｏｎ、ＩＬから供給され、出産のおよそ３週間前に、Ｐｆｉｚｅｒ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆａｒｍ ｉｎ Ｒｉｃｈｌａｎｄ、ＭＩに送られた。必要であれば、雌豚を、注入可能なプロスタグランジン（Ｌｕｔａｌｙｓｅ（登録商標））を用いて、２日間または３日間以内に出産するように誘導した。これらの雌豚から産まれた正常な子豚を、割り当ての設計に従って、研究に割り当てた。豚を、同腹子ごとに処理に対してランダム化し、各同腹子は、各処理に割り当てられた少なくとも１頭の子豚を有していた。
【０１２０】
飼育：ワクチン接種段階の間、豚を、ＢＬ−２分離設備内で、交叉哺育を行うことなく、それらの母親と共に飼育した。豚は、二次ワクチン接種のときまで、同腹子ごとに飼育したままとした。二次ワクチン接種後の豚を、さらなる施設に移し、２つの部屋で飼育し（１つの部屋はＮＴＸ（ワクチン接種されておらず、かつ、チャレンジもされていない対照）動物を含有し、第２の部屋はワクチン接種動物を含有する）、各部屋は、檻当たり４から８頭の豚を含有する。
【０１２１】
飼料：出産の後、雌豚には、必要に応じて、泌乳中の雌豚のための餌を与えた。子豚には、離乳の前には、餌付け飼料および代用乳を摂取させた。離乳すると、子豚には、選択が自由な、年齢に適した餌を与えた。水は、全ての動物に対して自由に摂取可能であった。
【０１２２】
割り当て／ランダム化：豚を、同腹子ごとに、処理に対してランダム化した。各同腹子は、各処理に割り当てられた少なくとも１頭の子豚を有していた。
【０１２３】
研究設計
【０１２４】
【表７】
【０１２５】
マスキング：ワクチンは、ワクチン接種の前に数値コードを用いてマスキングした。調査員、ワクチン投与者、および研究員は、処理についてマスキングされており、動物の福祉のために処理情報が必要とされない限り、マスキングコードを知る機会を有さなかった。
【０１２６】
動物用治験薬
【０１２７】
【表８】
【０１２８】
チャレンジ材料の調製：ｇ１ＴＴＶ継代１を、ｑＰＣＲによって、ｇ１ＴＴＶについて陽性であり（７．６×１０ｅ８から１．６×１０ｅ９個のＤＮＡコピー／２ｍＬ）、ｇ２ＴＴＶについて陰性である、試験した肝臓ホモジネートから誘導した。適切な数のボトルを冷凍室から取り出し、チャレンジの直前に解凍した。次に、アリコートをボトルの１つから取り出し、その後の再滴定のために保持した。チャレンジストックを氷上に載せて調査設備まで移し、チャレンジ手順の間、氷上に維持した。チャレンジ用量は、２．０ｍＬのストック溶液（２．０ｍＬ、腹腔内）に等しい。したがって、各豚に送達された用量は、７．６×１０ｅ８から１．６×１０ｅ９個のＤＮＡコピー／２ｍＬであると予想される。チャレンジの後、チャレンジストックのアリコートを、チャレンジ用量を確認するための滴定のために保った。
【０１２９】
全身的な健康の所見：動物は、有資格者によって毎日観察され、全身的な健康の所見が記録された。
【０１３０】
体重：全ての豚は、０日目、チャレンジ日（２８日目）、および剖検時に体重測定した。全ての体重を記録した。
【０１３１】
ワクチン接種：およそ７日齢（０日目）で、処理群（Ｔ０１からＴ０４群）当たりおよそ１０頭のランダムに割り当てられた豚を、表１において記載したようにワクチン接種した。豚の右頸部に、割り当てに従って、単回用量シリンジ分（２．０ｍＬの筋肉内（ＩＭ）用量）のＩＶＰ、または２ｍＬのＩＭ用量の対照を注入した。同一のＩＶＰまたは対照の二次用量を、離乳時（およそ２１日齢）に左頸部に投与した。
【０１３２】
血液試料採取：０日目、１４日目（ワクチン接種の前）、およびチャレンジ前の２８日目（同様に、３１日目、３４日目、３７日目、および４０日目）の前に、ｇ１ＴＴＶの状態のために、血液試料を、５ｍＬまたは９ｍＬの血清分離管（体重に依存する）を用いて、全ての豚から回収した（ｑＰＣＲ−Ｐｆｉｚｅｒ−ＶＭＲＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）。血清試料は、現場職員が少なくとも３つの個別の試験管にアリコート化し、−８０℃で保存した。
【０１３３】
【表９】
【０１３４】
チャレンジ：およそ５週齢で、子豚に、割り当てに従って、２．０ｍＬ（ＩＰまたはＩＮ）の用量のＴＴＶ単離株を接種した。チャレンジ材料を、マスキングの目的で、処理コードによって特定される設備に輸送した。
【０１３５】
チャレンジ後の直腸温度を、チャレンジ前の２８日目、ならびに３１日目、３４日目、３７日目、および４０日目に、１日１回記録した。
【０１３６】
剖検：４０日目に、全ての動物を安楽死させ、剖検した。剖検の際に、肺病変を、以下の方法を用いてスコア付けした：１）数値スコア（０、１、２、３）、ならびに２）各肺葉（左肺上葉、左肺中葉、左肺下葉、右肺上葉、右肺中葉、右肺下葉、および副葉）についての硬化のパーセンテージをスコア付けし、病変を伴って観察された肺葉のパーセンテージとして記録した。肝臓、腎臓、胸腺、およびリンパ節もまたスコア付けした。血液試料もまた、安楽死の前に採取した。組織を、以下の表において示すように回収した。
【０１３７】
【表１０】
【０１３８】
安全性および／または有効性の評価に関して、交絡する二次的な疾患状態は検出されなかった。動物は、プロトコルに従ってワクチン接種およびチャレンジを行った。予後の基準に関して、肉眼による病変または顕微鏡による病変の減少、ｑＰＣＲによるウイルス血症の減少、および熱、体重減少、または死亡の発生の減少のいずれかまたは全てにおける低減を用いた。両側検定。
【０１３９】
分析の方法
剖検の際、肺病変を、以下の方法を用いてスコア付けした：１）数値スコア（０＝病変なし、１＝軽度の病変、２＝中度の病変、３＝重度の病変）、ならびに２）各肺葉（左肺上葉、左肺中葉、左肺下葉、右肺上葉、右肺中葉、右肺下葉、および副葉）についての硬化のパーセンテージをスコア付けし、病変を伴って観察された肺葉のパーセンテージとして記録した。
【０１４０】
病変を有する肺全体のパーセンテージを、固定効果、処理、および変量効果の同腹子を有する一般線形混合モデルを用いて、変換および分析した。パラメータ推定値の線形結合を、有意な（Ｐ≦０．１０）処理効果について試験した後に先験的対比（priori contrast）において用いた。１０％レベルの有意性（Ｐ≦０．１０）を用いて、統計的な差を評価した。
【０１４１】
ｑＰＣＲデータは、分析の前に、適切なｌｏｇ変換を用いて変換される。変換された力価は、一般線形反復測定混合モデル分析を用いて分析される。処理または時点相互作用効果による処理が有意である場合（Ｐ≦０．１０）、一対処理比較を、各時点で行う。各時点について、処理の最小二乗平均、９０％信頼区間、極小および極大を計算し、逆変換する。記述統計学、平均、標準偏差、および範囲を、チャレンジ前の各処理および研究日について計算する。
【０１４２】
研究結果および考察
肺の病変
観察される肺病変の全体的なパーセンテージは、全ての処理群を通して低かったが、有意な差が見られた。Ｔ０１（Ｃｈｒｏｍｏｓ発現ｇ１ＴＴＶ ＯＲＦ１）は、Ｔ０２（バキュロウイルス発現ｇ２ＴＴＶ ＯＲＦ１）およびＴ０４（チャレンジ対照）の両方と比較して、有意に少ない肺病変を生じた。チャレンジウイルスは感染性ｇ１ＴＴＶからなるものであったため、バキュロウイルスから得られる遺伝子型２ＯＲＦ１がもたらした肺病変が、チャレンジ対照と比較して極めて少なかったわけではないことは、驚くべきことではないかもしれない。しかし、興味深いことに、それは、十分ではないものの、チャレンジ対照と比較して数値的に低い肺病変スコアをもたらし、それは、用量およびアジュバントの選択の最適化の際に、ある程度のレベルの交差防御が、異なるＴＴＶ遺伝子型の間で可能であることを示す。不活化チャレンジウイルス（Ｔ０３、ｇ１ＴＴＶｐ１死滅ウイルス）が生ｇ１ＴＴＶチャレンジウイルスに対する交差防御をもたらさないことは驚くべきことであり、これは、Ｔ０３とＴ０４との間で統計的な差が全くないことにより証明された。交差防御のこの驚くべき喪失はさらに、ｇ１ＴＴＶ ＯＲＦ１（Ｔ０１ Ｃｈｒｏｍｏｓ）などの本発明の新規なワクチンの獣医学的重要性を増すものである。
【０１４３】
【表１１】
【０１４４】
【表１２】
【０１４５】
ｇ１ＴＴＶ ｑＰＣＲ
ＴＴＶ ｑＰＣＲウイルス血症データの分析（図７）により、Ｔ０１（Ｃｈｒｏｍｏｓ ｇ１ＴＴＶ ＯＲＦ１）が、Ｔ０４（チャレンジ対照）と比較して、数値的に低いＴＴＶ ｑＰＣＲ値を有することが明らかにされる。ウイルス血症の程度および期間の減少が見られ、これは、肺病変の低減と共に、有効性の指標である。さらに、Ｔ０２（バキュロウイルスｇ２ＴＴＶ ＯＲＦ１）は、Ｔ０４（チャレンジ対照）と比較して、ウイルス血症の程度および期間の数値的低減を示すが、それは短い期間である。このことは、数値的に低い肺病変と組み合わせて、いくつかの遺伝子型の交差防御（ｇ２ＴＴＶ ＯＲＦ１ワクチン対ｇ１ＴＴＶ チャレンジウイルス）が観察されたことを示す。最適化された用量およびアジュバントを用いて、広範な遺伝子型の交差防御が実現可能であることが示唆され得る。興味深いことに、（Ｔ０３）ｇ１ＴＴＶｐ１ ＫＶは、チャレンジ対照と比較して、ＴＴＶ ｑＰＣＲウイルス血症における低減をもたらさない。この所見は、肺病変データと併せて、組換え発現したｇ１ＴＴＶ ＯＲＦ１（Ｔ０１）がワクチンとしての有効性をもたらすという新規な発見を、さらに例証するものである。
【０１４６】
（実施例４）
６Ｈｉｓタグを有する完全長タンパク質としてのｇ１ＴＴＶ ＯＲＦ１の、コドンの最適化および組換え発現、ならびに抗体によるその検出。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の両方についてのコドンの最適化および遺伝子合成のために、ＴＴＶｇ１ヌクレオチド配列を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）に提出した。両方のケースにおいて、コドンを最適化された遺伝子を、製品としてのＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ｐＵＣ５７ベクター中にクローニングした。ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅ（商標）コドン最適化分析は、コドンの使用の偏り、ＧＣ含有量、ＣｐＧジヌクレオチド含有量、ｍＲＮＡの二次構造、可能性のある潜在的スプライシング部位の同定、早期のポリＡ部位の存在、内部のｃｈｉ部位およびリボソーム結合部位、陰性ＣｐＧアイランド、ＲＮＡ不安定モチーフ（ＡＲＥ）、阻害部位（ＩＮＳ）、様々な種類の反復配列（直接反復配列、逆反復配列、および二分染色体を含む）、ならびにクローニングに干渉し得る制限部位を含む、多くのパラメータの分析を伴う。翻訳の性能もまた、翻訳開始Ｋｏｚａｋ配列、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列によって向上し得、またその結果、停止コドンによる翻訳の終結の有効性が増大する。
【０１４７】
配列番号１８〜２０は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（配列番号１８〜１９）およびサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（配列番号２０）の両方についてコドンを最適化された、ＴＴＶカプシド遺伝子を提供する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の配列は非常に類似しているが、市販されているｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に遺伝子をクローニングして７６０５７−４（配列番号１９）を生じさせるためには、さらなるＣＡヌクレオチドがＮ末端に付加されなくてはならない。ｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯ発現ベクターはまた、精製のために、Ｃ末端のＶ５タグおよび６×Ｈｉｓを有しているが、７６０５７−３（配列番号１８）および７６０５７−４についての配列は、それ以外は同一である。発現した、コドンを最適化されたＴＴＶｇ１タンパク質は、６３ｋＤのタンパク質に対して、アミノ末端に１０アミノ酸防御ペプチド、ならびにカルボキシ末端にＶ５エピトープおよび６×Ｈｉｓタグに対応する３２個のアミノ酸が付加されていることにより、およそ６８ｋＤのサイズである（図２）。
【０１４８】
７６０５７−５についての配列（配列番号２０）は、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）についてコドンを最適化されており、したがって、これは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の配列とわずかに異なる。さらに、この配列は、Ｎ末端の１０個のアミノ酸からなる防御ペプチドを欠いており（これは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）配列には付加されていた）、これはまた、酵母ベクター中への遺伝子のサブクローニングのために、Ｎ末端にフランキング制限エンドヌクレアーゼ部位であるＮｏｔＩを、Ｃ末端にＡａｔＩＩを有している。
【０１４９】
さらに、１０アミノ酸防御ペプチドは、アミノ末端に融合されるとタンパク質の安定性を増大させることが示されているため、前記ペプチドが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の発現のために、ＴＴＶｇ１配列のＮ末端に付加されたことに注意されたい。制限部位は、完全長タンパク質の評価のためにペプチドを取り出すことができるように、遺伝子操作されている。コドンを最適化されたＴＴＶｇ１の発現を、防御ペプチドのＮ末端の融合を有するおよび有さない、ｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯベクターにおいて評価した。サッカロマイセスセレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）についてコドンを最適化されたＴＴＶｇ１配列も、インビボでの抗体応答を引き起こすために用いられ得る、酵母において表面発現タンパク質を産生する可能性を有するｐＥＳＣ−Ｔｒｐベクター中にサブクローニングした。
【０１５０】
（実施例５）
ＴＴＶペプチドの結合および抗体生産（ポリクローナルおよびモノクローナル）
ウサギポリクローナル抗体を、実施例２において調製した、バキュロウイルス発現ｇ２ＴＴＶ ＧＳＴ−ＯＲＦ１タンパク質に対して作製した。２頭のウサギを超免疫化したが、１頭のウサギのみが応答した。ウサギ抗血清は、ブタにおいて増殖させたｇ１ＴＴＶ全ウイルスの様々な調製物に対して交差反応し、また、免疫化抗原である、バキュロウイルス発現ｇ２ＴＴＶ ＯＲＦ１に対しても反応する。しかし、ウサギ抗体は、実施例２において記載した、アミノ末端から取り出された１００アミノ酸Ｎ末端アルギニンリッチ領域を有する、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ｇ２ＴＴＶ ＯＲＦ１に対して応答しなかった。これは、主要抗原エピトープが、切断されたｇ２ＴＴＶ ＯＲＦ１においては存在しない、１００アミノ酸領域内にあり得ること、およびこの領域において、ｇ１ＴＴＶとｇ２ＴＴＶとの間に相同性があることを示唆し得る。
【０１５１】
モノクローナル抗体は、完全長ｇ１ＴＴＶ ＯＲＦ１、または他のｇ１ＴＴＶ抗原に対して生成することができる。他の可能性のある免疫化抗原には、ｇ１ＴＴＶ全ウイルス、ｇ２ＴＴＶ ＧＳＴ−ＯＲＦ１（バキュロウイルス）、ｇ１ＴＴＶ ＧＳＴ切断ＯＲＦ１（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、およびｇ２ＴＴＶ ＧＳＴ切断ＯＲＦ１（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））が含まれる。ペプチドライブラリーを、抗原性の線状エピトープを同定するために生成することができる。例えば、１０アミノ酸のオーバーラップを有する１８ｍｅｒのペプチドを用いて、ＴＴＶゲノムをカバーすることができる。そして、ペプチドは、ｇ１ＴＴＶ ＯＲＦ１またはｇ２ＴＴＶ ＯＲＦ１モノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体に対するそれらの全体的な反応性を決定するために、ウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡにおいて用いることができ、それにより、免疫原性ドメインをさらに同定することができる。
【０１５２】
ウサギポリクローナル抗体もまた、ＫＬＨに架橋した３つのｇ１ＴＴＶ ＯＲＦ１ペプチドに対して作製することができ、その後、ペプチド−オボアルブミン結合体を用いてスクリーニングすることができる。ペプチド−ＫＬＨ結合体もまた、モノクローナル抗体を産生するために用いることができる。この点において、１つの実施形態において、異なる株に由来するものを含む、ｇ１ＴＴＶ ＯＲＦ１ペプチドの複数のコピーが、共に結合し得る。
【０１５３】
特定の実施例において、ペプチドが生成されると（ＣＰＣ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、これらは次にＫＬＨまたはオボアルブミン（Ｐｒｏｔｅｏｓ Ｃｏによる）に結合する。ＫＬＨに結合したペプチドは、ウサギの免疫化に用いたが、一方、オボアルブミンに結合したペプチドは、血清をスクリーニングするために用いる（すなわち、キャリアータンパク質ではなく、ペプチドに対する抗体を検出するため）。
【０１５４】
（実施例６）
ポリクローナル抗体の生成のためのペプチド配列
以下のペプチド配列を、ポリクローナル抗体の生成のために、ＴＴＶｇ１（ＡＹ８２３９９０に基づく番号付け）から選択し、それぞれ配列番号２２〜２４と表す。
１．［Ｌ１６７Ｃ］ＴＴＶ（１６７〜１８５）−ＮＨ２：ＣＫＤＱＤＹＷＦＷＷＤＴＤＦＫＥＬＹＡ−ＮＨ２（１９ａａ、ｐＩ ４）
２．ＴＴＶ（４５９〜４７９）：ＤＦＧＨＨＳＲＦＧＰＦＣＶＫＮＥＰＬＥＦＱ（２１ａａ、ｐＩ ６．９）
３．［Ｃｙｓ６１２］−ＴＴＶ（６１２〜６３７）：ＣＴＷＫＲＬＲＲＭＶＲＥＱＬＤＲＲＭＤＨＫＲＱＲＬＨ（２６ａａ、ｐＩ １３）
【０１５５】
３つのペプチドのそれぞれは、キャリアータンパク質への選択的なペプチド結合を可能にするための、配列中に存在する単一のシステイン残基を有する。［Ｌ１６７Ｃ］ＴＴＶ（１６７〜１８５）−ＮＨ２および［Ｃｙｓ６１２］−ＴＴＶ（６１２〜６３７）において、追加のシステイン残基をＮ末端に付加したが、一方、ＴＴＶ（４５９〜４７９）においては、４７０位に存在する天然のｃｙｓがある。さらに、［Ｌ１６７Ｃ］ＴＴＶ（１６７〜１８５）−ＮＨ２は、アミド化されたＣ末端を有し、酸性度の低いペプチドをもたらす。ペプチドは、様々なＴＴＶ単離株についての配列同一性に基づいて選択した。さらに、Ｃ末端断片［Ｃｙｓ６１２］−ＴＴＶ（６１２〜６３７）は、表面露出していると考えられる。ペプチドは、ＣＰＣ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃでの固相ペプチド合成による注文生産であり、９５％を超える純度で得られた。
【０１５６】
（実施例７）
Ｃｈｒｏｍｏｓ系を用いた、ＴＴＶｇ１ＯＲＦ１タンパク質の発現
Ｃｈｒｏｍｏｓ ＡＣＥ系は、３つの主要な成分からなるタンパク質発現プラットフォームである。第１の成分は、Ｐｌａｔｆｏｒｍ ＡＣＥと呼ばれる、中性の、機能的な哺乳動物人工染色体であり、これは、修飾されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系の遺伝物質中に存在する。第２の成分は、ＡＣＥ標的化ベクターであり、これは、Ｐｌａｔｆｏｒｍ ＡＣＥ上に標的遺伝子をロードするために用いられるプラスミドである。第３の要素は、部位特異的な、一方向のインテグラーゼであり、これは、Ｐｌａｔｆｏｒｍ ＡＣＥ上への標的遺伝子の直接的なおよび特異的なロードを触媒する。ＡＣＥ系に関するさらなる情報は、カナダのＣｈｒｏｍｏｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．のウェブサイトで知ることができるか、または６０４−４１５−７１００で当該企業に直接連絡することによって知ることができ、ここで、技術のライセンスが入手可能である。
【０１５７】
Ｃｈｒｏｍｏｓ ＡＣＥ系は、従来のタンパク質生産プラットフォームを上回る、多くの顕著な利点を有する。その第１は、速度である。Ｃｈｒｏｍｏｓ ＡＣＥ系は、選択された遺伝子の、迅速な、効率的な、かつ再現可能な挿入を可能にする。第２の利点は、発現である。高レベルのタンパク質が達成可能であり、長時間、構成的に発現される。第３の利点は、安定性である。Ｃｈｒｏｍｏｓ ＡＣＥ系は、選択的な制御されたタンパク質発現を可能にする。簡潔に述べると、ＰＣＲを用いて、ＴＴＶ７ ＯＲＦ１ ｇ１ ＤＮＡの両端に制限部位を付加した。さらに、酵母インベルターゼの配列を、別のＰＣＲ調製物の５’末端に付加した。次に、増幅配列を制限酵素で処理し、プラスミドｐＣＴＶ９２７中にサブクローニングした。ＤＮＡ配列は、ＡＣＴＧ Ｉｎｃ．によって検証された。次に、ＣＨｋ２（チャイニーズハムスター卵巣）細胞を、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、プラスミドでトランスフェクトし、ハイグロマイシンＢを用いて、選択圧を加えた。１０個の単一細胞クローンを、ＳＤＳ ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングを用いて、ＴＴＶタンパク質の産生について分析した。
【０１５８】
より具体的には、ＡＣＥ標的化ベクターｐＣＴＶ−ＴＴＶ７ＯＲＦ１＋ＹＩを、以下のようにして生成した（図３を参照されたい）。遺伝子ＴＴＶ７ＯＲＦ１を、ＰＣＲ産物として得た。プライマーを、酵母インベルターゼ分泌シグナル、および遺伝子の５’末端の制限部位ＥｃｏＲＶを含有するように設計した。第２のプライマーを、遺伝子の３’末端の制限部位Ｋｐｎｌを含有するように設計した。これらの配列を、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、遺伝子ＴＴＶ７ＯＲＦ１に付加した。次に、修飾された遺伝子を、ＡＣＥ標的化ベクターＡＴＶＣＨＳ４Ｈｙｇ中にサブクローニングし、このベクターは、下流の抗生物質選択に適したハイグロマイシン耐性マーカーを含有していた。新たなプラスミドを、ｐＣＴＶ−ＴＴＶ７ＯＲＦ１＋ＹＩと名付けた。
【０１５９】
ＴＴＶ７ＯＲＦ１／酵母インベルターゼおよび一方向のラムダインテグラーゼをそれぞれコードする、プラスミドｐＣＴＶ−ＴＴＶ７ＯＲＦ１＋ＹＩおよびｐＳＩＯ３４３を、Ｐｌａｔｆｏｒｍ ＡＣＥを含有するＣｈｋ２細胞系中にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞は、Ｃｈｋ２−ＴＴＶ７ＯＲＦ１＋ＹＩと名付けた。これらの細胞を、９６ウェルプレート中に播種し、単一細胞クローンの形成についてモニタリングした。ハイグロマイシンを含有する媒質を各９６ウェルプレートに添加し、ＡＣＥ標的化ベクターを含有する細胞クローンを選択した。単一細胞クローンを同定すると、そのうちの１２個を２４ウェルプレート中に拡大増殖させ、次に６ウェルプレートに広げた。最後に、クローンを、懸濁細胞培養物中に拡大増殖させた。培養物Ｃｈｋ２−ＴＴＶ７ＯＲＦ１＋ＹＩ ＃７５を用いて、その後の実験用ワクチンの調製のために、細胞を有さない上清を生成した。
【０１６０】
図７は、Ｃｈｒｏｍｏｓ発現ｇ１ＴＴＶ ＯＲＦ１が、チャレンジ対照と比較して、肺病変を有意に低減させたこと、ならびに、同様にチャレンジ対照と比較して、ｇ１ＴＴＶウイルス血症の数値的程度および期間を低減させたことを示す。ワクチン接種は、０日目および１４日目であり、チャレンジは２８日目であった。検出されたｇ１ＴＴＶコピーの幾何平均は、指数関数的であると報告され、すなわち、１．００Ｅ＋００は１であり、４．２５Ｅ＋００は４．２５であり、４．４２Ｅ＋０１は４４．２であると報告された。
【０１６１】
（実施例８）
核局在シグナル
図４および５は、本発明の５つのＴＴＶ ｇｔ１ウイルスおよび本発明の２つのＴＴＶ ｇｔ２（またはｇｔ２様）ウイルスからのＯＲＦ１（カプシドタンパク質）のアミノ酸アラインメントの７つの方法を提供する。ｇｔ１カプシドは、ｇｔ２カプシドに約２２．３から２３．２％しか同一ではないため、当然のことながら、多くのギャップおよびミスマッチが存在する。しかし、５つのｇｔ１カプシドは、互いに８５．６から９９．７％同一である。２つのｇｔ２カプシド（ＴＴＶ１０およびＴＴＶ１３）は、同様に６６．８％同一である。
【０１６２】
２つの既知のタイプのＮＬＳシグナル（Ｐａｔ７およびＰａｔ４、例えば米国特許第７，５４４，３６２号を参照されたい）を、検査によって同定した。図５において、ＮＬＳシグナルに下線が引かれている。全ての７個のカプシドが、ｐａｔ７タイプおよびｐａｔ４タイプの両方の、複数のＮＬＳを含有することに注意されたい。遺伝子型間で保存されているものもあり、遺伝子型内で保存されているものもあり、そして保存されていないものもある。ほとんどはＮ末端の近くにあり、そこで、オーバーラップするポリＮＬＳ領域を形成する傾向がある。これらのアルギニンに富んだモチーフの多くは、哺乳動物において実質的に免疫原性であり、これらを含有するペプチドは、抗ＴＴＶ抗体の生成において有用である。
【０１６３】
（実施例９）
感染性クローンの構築のためのクローン断片
以下に、オーバーラップするクローンから、アミノ酸配列が配列番号９で示されるＴＴＶ遺伝子型１株ｔｔｖｇ１−１７８（配列番号７を参照されたい）を構築するための基礎を提供する。
【０１６４】
要約すると、共にＴＴＶ環状ゲノムの全体にわたる、２つのＴＴＶ断片（１９００ｂｐおよび２２００ｂｐ）を、個別のｐＣＲ２．１ＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）クローニングベクター中に個別にクローニングした。クローン断片は、クローン１：６８０ｓから２６０８ａ＝およそ１９００ｂｐ、およびクローン２：１３４０ｓから７６４ａ＝およそ２２００ｂｐであった。
【０１６５】
これを達成するために、本発明の株（ｔｔｖｇｔ１−２７、−７、−１７、および−２１）ならびに公開されている配列（ＡＹ８２３９９０（ｇ１）およびＡＢ０７６００１−（Ｓｄ−ＴＴＶ３１））から生成したコンセンサス配列を用いて、ＰＣＲプライマーを設計した。６８０ｓおよび２６０８ａ、または１３４０ｓおよび７６４ａの配列に対応するプライマー対を用いて、ＴＴＶチャレンジ株に感染した豚の肝臓ホモジネート試料から抽出したＤＮＡからＰＣＲ産物を増幅した。これらのＰＣＲ断片を、キットに同梱されていた指示書を用いて、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ ＴＡベクター中にクローニングした。クローンを次に、２８８０塩基のゲノム全体にわたりＤＮＡ配列を生成するために用い、配列は、公開されている配列ＧＱ１２０６６４．１およびＡＹ８２３９９０．１に８６％相同であることが明らかになった。
【０１６６】
完全に正確な配列を、以後、完全長の感染性クローンの構築のために組み合わせる。
【０１６７】
（実施例１０）
ｇ１ＴＴＶについての感染性クローン
ｇ１ＴＴＶ ｄｓＤＮＡ断片のクローニング。ｇ１ＴＴＶは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ウイルスである。ｇ１ＴＴＶの断片は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に変換される。ｇ１ＴＴＶのｄｓＤＮＡ断片は次に、ｐＵＣに基づいたプラスミドクローニングベクター中にクローニングされ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中に形質転換される。ｇ１ＴＴＶの断片は、ｇ１ＴＴＶゲノムの１つの完全長ｄｓＤＮＡ同等物より小さい。
【０１６８】
ｇ１ＴＴＶ ｄｓＤＮＡコンカテマーの増幅。完全長ｇ１ＴＴＶ ｄｓＤＮＡゲノム同等物のコンカテマーを、φ２９のポリメラーゼ増幅キット（例えば、ｉｌｌｕｓｔｒａ ＴｅｍｐｌｉＰｈｉ）を用いて生成する。完全長ｇ１ＴＴＶ ｄｓＤＮＡ断片を、適切な制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）部位でコンカテマーを消化することにより生成する。これらの完全長ｇ１ＴＴＶ ｄｓＤＮＡ断片は、プラスミドベクター中にクローニングすることができる。あるいは、コンカテマーまたはクローニングされていない断片（ＲＥの消化から得られる）は、その後の分子生物学的構築における即時のクローニングを伴うことなく、用いることができる（以下を参照されたい）。
【０１６９】
ｇ１ＴＴＶゲノムの縦列重複。ｇ１ＴＴＶゲノムの縦列重複をコードするプラスミド構築物を次に生成する。構築物内の縦列重複は、およそ、ｇ１ＴＴＶゲノムの完全長ｄｓＤＮＡ同等物の１．２コピーよりも大きい。プラスミドにおける縦列重複は、（１）適切なＲＥ部位を採用するサブクローニング、（２）縦列重複のＰＣＲアセンブリー、または（３）他の分子生物学的方法を用いて生成される。縦列重複の生成のための鋳型は、ｇ１ＴＴＶ ｄｓＤＮＡ断片および／または完全長ｇ１ＴＴＶ ｄｓＤＮＡクローン（φ２９のポリメラーゼ増幅によって得られる）である。
【０１７０】
インビボでの組換えおよびｇ１ＴＴＶウイルスの生成。縦列重複プラスミド構築物は、ｇ１ＴＴＶウイルスと同一ではない。縦列重複構築物はｄｓＤＮＡであるが、ウイルスはｓｓＤＮＡであり、この構築物は、ｇ１ＴＴＶゲノムの１．２個を超える完全長ｄｓＤＮＡ同等物をコードするが、ウイルスは１つの完全長同等物のみを有し、この構築物は遮断プラスミド配列を含有するが、ウイルスはウイルス配列のみを有する。真正のｇ１ＴＴＶウイルスを生成するために、縦列重複プラスミド構築物をブタに導入するか（接種、注入、エレクトロポレーション、または他の導入方法によって）、または組織培養細胞中に導入し（トランスフェクション、エレクトロポレーション、または他の導入方法によって）、ここで、プラスミド構築物を、相同配列で組換えして、ｇ１ＴＴＶゲノムの単位長さのｄｓＤＮＡ同等物を再生する。ｇ１ＴＴＶゲノムのｄｓＤＮＡ同等物は、ｇ１ＴＴＶウイルスの生活環の、推定される複製中間体である。この推定されるｄｓＤＮＡの複製中間体の存在は、真正のｓｓＤＮＡ ｇ１ＴＴＶの産生をもたらす。
【０１７１】
ｇ１ＴＴＶ ＯＲＦ発現構築物のコトランスフェクションにより、ｇ１ＴＴＶウイルスのインビボでの生成が可能になる。環状ｄｓＤＮＡ ｇ１ＴＴＶゲノムが、ウイルス生産をもたらし得ることが予想される。ｇ１ＴＴＶのｄｓＤＮＡ形態が複製可能ではないという予想外の事実において、ｄｓＤＮＡの複製中間体からのｇ１ＴＴＶの複製の開始のためには、ｇ１ＴＴＶ ＯＲＦの即時の発現が必要となり得る。ｇ１ＴＴＶ ＯＲＦへの転写プロモーター（例えば、ＣＭＶ）の融合体などの、ｇ１ＴＴＶ ＯＲＦをインビボで転写させるプラスミド構築物を作製することができる。あるいは、ｇ１ＴＴＶ ＯＲＦへの転写プロモーター（例えば、Ｔ７）の融合体などの、ｇ１ＴＴＶ ＯＲＦ転写産物をインビトロで生成させる、プラスミド構築物を作製することができ、その後、インビトロ転写キットが使用される。ｇ１ＴＴＶ ＯＲＦ発現プラスミドまたはｇ１ＴＴＶ ＯＲＦ発現ＲＮＡ転写産物のいずれかを、縦列重複プラスミド構築物と共に、豚に共注入するか、または細胞中にコトランスフェクトして、ｇ１ＴＴＶウイルスを得ることができる。
【０１７２】
ｇ１ＴＴＶウイルス産生の検出。これまでのところ、全ｇ１ＴＴＶウイルスは、組織培養細胞においては増殖させることができない。ｇ１ＴＴＶウイルスの生成は、免疫試薬（例えば、α−ｇ１ＴＴＶ抗体）によって、または分子的方法（例えば、ｑＰＣＲ）によって検出される。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５−１】
【図５−２】
【図５−３】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１２−５０５６５３（Ｐ２０１２−５０５６５３Ａ）
【公表日】平成２４年３月８日（２０１２．３．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３２０９１（Ｐ２０１１−５３２０９１）
【出願日】平成２１年１０月１６日（２００９．１０．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００５６６２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０４４８８９
【国際公開日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【出願人】（５９３１４１９５３）ファイザー・インク (302)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年３月８日（２０１２．３．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月１６日（２００９．１０．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００５６６２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０４４８８９
【国際公開日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【出願人】（５９３１４１９５３）ファイザー・インク (302)
【Ｆターム（参考）】
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