本発明は、生体分子サンプル中の個別標的分子の検出および定量のための組成物および方法に関する。特定的には、本発明は、標的分子に結合可能でありかつプローブの標識コードに基づいて標的分子を同定可能であるコード化標識化プローブに関する。そのようなプローブの作製方法および使用方法をも提供する。プローブは、診断、予後判定、品質管理、およびスクリーニングの用途で使用可能である。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のプローブおよび第２のプローブを含むプローブペアであって、該第１のプローブが、
（ａ）（ｉ）第１のシグナルを構成する光を放出する１つ以上の標識モノマーが結合される第１の標識結合領域；（ｉｉ）第２のシグナルを構成する光を放出する１つ以上の標識モノマーが結合される第２の標識結合領域（該第１の標識結合領域とオーバーラップしない）；を含む第１の分子と、
（ｂ）該第１の分子に結合された第１の標的特異的配列と、
を含む複合体であり、
該第２のプローブが、（ｉ）第２の標的特異的配列；（ｉｉ）場合により、第３のシグナルを構成する光を放出する１つ以上の標識モノマーが結合される第３の標識結合領域；および（ｉｉｉ）場合により、第２の分子に結合されたアフィニティータグ；を含む第２の分子であり、
該第１の標的特異的配列および該第２の標的特異的配列が、同一の標的分子の異なる領域に結合し、
該標的分子が、天然に存在する分子または天然に存在する分子のｃＤＮＡまたは該ｃＤＮＡの相補体であり、
該プローブペアがその標的分子に結合された時、該第１および該第２のシグナルの同一性ならびにそれらの互いの相対位置が、該標的分子を同定するコードの少なくとも一部を構成する、上記プローブペア。
【請求項２】
第１のプローブおよび第２のプローブを含むプローブペアであって、該第１のプローブが、
（ａ）（ｉ）第１のシグナルを構成する光を放出する１つ以上の標識モノマーが結合される第１の標識結合領域；（ｉｉ）第２のシグナルを構成する光を放出する１つ以上の標識モノマーが結合される第２の標識結合領域；を含む第１の分子と、
（ｂ）該第１の分子に結合された第１の標的特異的配列と、
を含む複合体であり、
該第２のプローブが、（ｉ）第２の標的特異的配列；（ｉｉ）場合により、第３のシグナルを構成する光を放出する１つ以上の標識モノマーが結合される第３の標識結合領域；および（ｉｉｉ）場合により、第２の分子に結合されたアフィニティータグ；を含む第２の分子であり、
該第１の標的特異的配列および該第２の標的特異的配列が、同一の標的分子の異なる領域に結合し、
該第１のシグナルおよび該第２のシグナルが、空間的もしくは分光的に識別可能であり、
該標的分子が、天然に存在する分子または天然に存在する分子のｃＤＮＡまたは該ｃＤＮＡの相補体であり、
該プローブペアがその標的分子に結合された時、該第１および該第２のシグナルの同一性ならびにそれらの互いの相対位置が、該標的分子を同定するコードの少なくとも一部を構成する、上記プローブペア。
【請求項３】
前記第１および前記第２の標識結合領域が所定のヌクレオチド配列である、請求項１または２に記載のプローブペア。
【請求項４】
第１のＤＮＡ分子が前記第１の標識結合領域にハイブリダイズされ、この第１のＤＮＡ分子に、前記第１のシグナルを構成する光を放出する前記１つ以上の標識モノマーが結合され；かつ第２のＤＮＡ分子が前記第２の標識結合領域にハイブリダイズされ、この第２のＤＮＡ分子に、前記第２のシグナルを構成する光を放出する前記１つ以上の標識モノマーが結合される、請求項３に記載のプローブペア。
【請求項５】
第１のＲＮＡ分子が前記第１の標識結合領域にハイブリダイズされ、この第１のＲＮＡ分子に、前記第１のシグナルを構成する光を放出する前記１つ以上の標識モノマーが結合され；かつ第２のＲＮＡ分子が前記第２の標識結合領域にハイブリダイズされ、この第２のＲＮＡ分子に、前記第２のシグナルを構成する光を放出する前記１つ以上の標識モノマーが結合される、請求項３に記載のプローブペア。
【請求項６】
複数の第１のＤＮＡ分子が前記第１の標識結合領域にハイブリダイズされ、これらのＤＮＡ分子に、前記第１のシグナルを構成する光を放出する前記１つ以上の標識モノマーが結合され；かつ複数の第２のＤＮＡ分子が前記第２の標識結合領域にハイブリダイズされ、これらの第２のＤＮＡ分子に、前記第２のシグナルを構成する光を放出する前記１つ以上の標識モノマーが結合される、請求項３に記載のプローブペア。
【請求項７】
複数の第１のＲＮＡ分子が前記第１の標識結合領域にハイブリダイズされ、これらのＲＮＡ分子に、前記第１のシグナルを構成する光を放出する前記１つ以上の標識モノマーが結合され；かつ複数の第２のＲＮＡ分子が前記第２の標識結合領域にハイブリダイズされ、これらの第２のＲＮＡ分子に、前記第２のシグナルを構成する光を放出する前記１つ以上の標識モノマーが結合される、請求項３に記載のプローブペア。
【請求項８】
前記第１のプローブがアフィニティータグをさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のプローブペア。
【請求項９】
前記第２のプローブがアフィニティータグを含む、請求項１〜７に記載のプローブペア。
【請求項１０】
前記第２のプローブが、第３のシグナルを構成する光を放出する１つ以上の標識モノマーが結合される第３の標識結合領域を含む、請求項１〜７に記載のプローブペア。
【請求項１１】
前記第３の標識結合領域が所定のヌクレオチド配列であり、かつ第３のＲＮＡ分子が前記第３の標識結合領域にハイブリダイズされ、この第３のＲＮＡ分子に、前記第３のシグナルを構成する光を放出する前記１つ以上の標識モノマーが結合される、請求項１０に記載のプローブペア。
【請求項１２】
前記プローブペアがその標的分子に結合された時、前記コードが、前記第１のシグナル、前記第２のシグナル、および前記第３のシグナルの同一性とそれらの互いの相対位置とを含む、請求項１１に記載のプローブペア。
【請求項１３】
前記コードが、前記第１および前記第２のシグナルの同一性と、それらの互いの相対位置と、前記シグナルの少なくとも１つから生じるスポットのサイズと、を含む、請求項１または２に記載のプローブペア。
【請求項１４】
前記第１および前記第２の分子が核酸分子である、請求項９に記載のプローブペア。
【請求項１５】
前記標識結合領域および前記標的特異的配列が所定のヌクレオチド配列である、請求項１４に記載のプローブペア。
【請求項１６】
前記１つ以上の標識モノマーが、それらのそれぞれの結合領域にハイブリダイズされた核酸に共有結合される、請求項１５に記載のプローブペア。
【請求項１７】
前記核酸が、１つ以上の非共有結合架橋核酸を介してそれぞれの結合領域にハイブリダイズされる、請求項１６に記載のプローブペア。
【請求項１８】
前記第１および前記第２の標的特異的配列が、１つ以上の前記標識モノマーのいずれによっても標識されない、請求項１または２に記載のプローブペア。
【請求項１９】
前記第２の分子が、第４のシグナルを構成する光を放出する１つ以上の標識モノマーが結合される第４の標識結合領域（前記第３の標識結合領域とオーバーラップしない）をさらに含む、請求項９に記載のプローブペア。
【請求項２０】
前記プローブペアがその標的分子に結合された時、前記コードが、前記第１のシグナル、前記第２のシグナル、前記第３のシグナル、および前記第４のシグナルの同一性とそれらの互いの相対位置とを含む、請求項１９に記載のプローブペア。
【請求項２１】
前記第２のプローブがアフィニティータグをさらに含む、請求項８に記載のプローブペア。
【請求項２２】
第１のＲＮＡ分子が前記第１の標識結合領域にハイブリダイズされ、この第１のＲＮＡ分子に、前記第１のシグナルを構成する光を放出する前記１つ以上の標識モノマーが結合され；かつ第２のＲＮＡ分子が前記第２の標識結合領域にハイブリダイズされ、この第２のＲＮＡ分子に、前記第２のシグナルを構成する光を放出する前記１つ以上の標識モノマーが結合され；かつ前記第１のプローブおよび／または前記第２のプローブがアフィニティータグをさらに含む、請求項８に記載のプローブペア。
【請求項２３】
前記アフィニティータグが前記第１の分子または前記第２の分子に共有結合される、請求項８に記載のプローブペア。
【請求項２４】
前記第１の標識結合領域に結合された標識モノマーが同一の波長の光を放出し、この光が前記第１のシグナルを構成し、かつ前記第２の標識結合領域に結合された標識モノマーが同一の波長の光を放出し、この光が前記第２のシグナルを構成する、請求項１に記載のプローブペア。
【請求項２５】
前記第１のシグナルおよび前記第２のシグナルの少なくとも一方が、複数の異なる波長の光を含む、請求項１に記載のプローブペア。
【請求項２６】
前記第１および前記第２のシグナルが分光的に識別可能である、請求項１に記載のプローブペア。
【請求項２７】
前記第１および前記第２のＲＮＡ分子が、それぞれ、１００〜３，０００ヌクレオチドの長さである、請求項５に記載のプローブペア。
【請求項２８】
前記第１および前記第２のＲＮＡ分子が、それぞれ、５００〜１，５００ヌクレオチドの長さである、請求項５に記載のプローブペア。
【請求項２９】
前記第２のプローブが、
（ａ）前記第２の分子と、ただし、この第２の分子は、第３のＲＮＡ分子がハイブリダイズされる第３の標識結合領域を含み、この第３のＲＮＡ分子に、第３のシグナルを構成する光を放出する１つ以上の標識モノマーが結合される；
（ｂ）前記第２の分子に結合された前記第２の標的特異的配列と；
を含む核酸複合体であり、
前記コードが、前記第１、前記第２、および該第３のシグナルの同一性とそれらの互いの相対位置とを含む、請求項５に記載のプローブペア。
【請求項３０】
前記第１の標識結合領域に結合された標識モノマーが同一の波長の光を放出し、この光が前記第１のシグナルを構成し；前記第２の標識結合領域に結合された標識モノマーが同一の波長の光を放出し、この光が前記第２のシグナルを構成し；かつ前記第３の標識結合領域に結合された標識モノマーが同一の波長の光を放出し、この光が前記第３のシグナルを構成する、請求項２９に記載のプローブペア。
【請求項３１】
前記第１のシグナル、前記第２のシグナル、および前記第３のシグナルの少なくとも１つが、複数の異なる波長の光を含む、請求項２９に記載のプローブペア。
【請求項３２】
前記第１の標的特異的配列および前記第２の標的特異的配列が、１つ以上の前記標識モノマーのいずれによっても標識されない、請求項２９に記載のプローブペア。
【請求項３３】
第１、第２、および第３のシグナルが分光的に識別可能である、請求項２９に記載のプローブペア。
【請求項３４】
第１および第３のシグナルが、同一の１つもしくは複数の波長で発光する、請求項２９に記載のプローブペア。
【請求項３５】
前記第１のプローブがアフィニティータグをさらに含む、請求項２９に記載のプローブペア。
【請求項３６】
前記第２のプローブがアフィニティータグをさらに含む、請求項２９に記載のプローブペア。
【請求項３７】
前記第２のプローブがアフィニティータグをさらに含む、請求項３５に記載のプローブペア。
【請求項３８】
前記アフィニティータグが前記第１の分子に共有結合される、請求項３５に記載のプローブペア。
【請求項３９】
前記アフィニティータグが前記第２の分子に共有結合される、請求項３６に記載のプローブペア。
【請求項４０】
前記第１、前記第２、および前記第３のＲＮＡ分子が、それぞれ、１００〜３，０００ヌクレオチドである、請求項２９に記載のプローブペア。
【請求項４１】
前記第１、前記第２、および前記第３のＲＮＡ分子が、それぞれ、５００〜１，５００ヌクレオチドである、請求項２９に記載のプローブペア。
【請求項４２】
生体分子サンプル中の標的分子を検出する方法であって、（ｉ）該サンプルを、該標的分子への前記第１の標的特異的配列および前記第２の標的特異的配列の結合を可能にする条件下で請求項１〜４１のいずれか１項に記載のプローブペアに、接触させることと、（ｉｉ）該標的分子を同定するコードを検出することと、を含む、上記方法。
【請求項４３】
前記生体分子サンプル中の前記標的分子の量を定量することをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記第１および前記第２の標的特異的配列のそれぞれの濃度が、前記標的分子の濃度を超える、請求項４２または４３に記載の方法。
【請求項４５】
生体分子サンプル中の複数の標的分子を検出する方法であって、（ｉ）該サンプルを、請求項１〜４１のいずれか１項に記載のプローブペアの集団に、それらの標的分子のそれぞれへの各プローブペアの第１の標的特異的配列および第２の標的特異的配列の結合を可能にする条件下で接触させることと、ただし、該集団中の各プローブペアは、その標的分子のそれぞれに結合された時、識別可能なコードに関連付けられる、（ｉｉ）該複数の標的分子を同定するコードを検出することと、を含む、上記方法。
【請求項４６】
前記生体分子サンプル中の前記複数の標的分子のそれぞれの量を定量することをさらに含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記集団の各プローブペアの第１および第２の標的特異的配列のそれぞれの濃度が、その標的分子のそれぞれの濃度を超える、請求項４５または４６に記載の方法。

【図１Ａ−１Ｃ】

【図１Ｄ−１Ｆ】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７Ａ−Ｄ】

【図７Ｅ−Ｇ】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２Ａ−１２Ｂ】

【図１３Ａ−１３Ｃ】

【図１４Ａ−１４Ｂ】

【図１４Ｃ−１４Ｄ】

【図１５Ａ】

【図１５Ｂ】

【図１５Ｃ】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【公表番号】特表２００９−５２１２３０（Ｐ２００９−５２１２３０Ａ）
【公表日】平成２１年６月４日（２００９．６．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４７６６２（Ｐ２００８−５４７６６２）
【出願日】平成１８年１２月２２日（２００６．１２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４９２７４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０７６１２８
【国際公開日】平成１９年７月５日（２００７．７．５）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．Ｌｉｎｕｘ
【出願人】（５０８１８８７０９）ナノストリング　テクノロジーズ，インコーポレーテッド (2)
【出願人】（５０３４０９６７６）インスティチュート　フォー　システムズ　バイオロジー (3)
【Ｆターム（参考）】