ニューロン再生の活性調節因子
本発明は、ＣＮＳ機能および疾患に関連した方法および組成物を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に神経発達および神経学的疾患に関する。本発明は特に、ミエリン関連阻害システムの新しい活性調節因子およびそのように同定された活性調節因子の様々な使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミエリンおよびミエリン関連タンパク質
成人哺乳類のＣＮＳニューロンの軸索が有する損傷後の再生能力は非常に限られているが、末梢神経系(ＰＮＳ)の軸索は急速に再生することは知られている。ＣＮＳニューロンの限られた再生能は、ある程度ＣＮＳ軸索の本質的な性質であるが、許容できない環境によるものでもある。神経突起成長の阻害の原因となるの唯一の源ではないが、ＣＮＳミエリンは、活発に軸索成長をブロックすることによって再生を有意に障害する多数の阻害性分子を含む。このような３つのミエリン関連タンパク質(ＭＡＰ)が同定された。Ｎｏｇｏ(別名ＮｏｇｏＡ)は、２つの膜貫通領域を有するＲｅｔｉｃｕｌｏｎファミリのタンパク質のメンバーであり、ミエリン関連糖タンパク質(ＭＡＧ)は、Ｉｇスーパーファミリの膜貫通タンパク質であり、そして、ＯＭｇｐは、グリコシルホスファチジルイノシトール(ＧＰＩ)アンカーを有するロイシン豊富な繰り返し(ＬＲＲ)タンパク質である。Chen et al., Nature 403:434-39 (2000)；GrandPre et al., Nature 417:439-444 (2000)；Prinjha et al., Nature 403:383-384 (2000)；McKerracher et al, Neuron 13:805-11 (1994)；Wang et al, Nature 417:941-4 (20020：Kottis et al J. Neurochem 82:1566-9 (2002)。ＮｏｇｏＡの一部であるＮｏｇｏ６６は、Ｎｏｇｏの３つすべてのアイソフォームに見られる６６-アミノ酸細胞外ポリペプチドとして記載されている。
それらの構造的相違にもかかわらず、３つすべての阻害性タンパク質(Ｎｏｇｏ６６も)は、Ｎｏｇｏレセプター(ＮｇＲ；別名Ｎｏｇｏレセプター-１又はＮｇＲ1)と称する同じＧＰＩアンカーレセプターを結合することが示されており、ＮｇＲがＮｏｇｏ、ＭＡＧおよびＯＭｇｐの阻害性作用を媒介するために必要かもしれないことが提唱されている。Fournier et al., Nature 409:34`-346 (2001)。２つのＮｇＲ１ホモログ(ＮｇＲ２およびＮｇＲ３)も同定されている。２００５年３月３日に公開の米国公開２００５／００４８５２０Ａ１(Strittmatter et al.)。ＮｇＲがＧＰＩアンカー細胞表面タンパク質であるとすると、ＮｇＲは直接のシグナル伝達因子ではなさそうである(Zheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:1205-1210 (2005))。ニューロトロフィンレセプターｐ７５ＮＴＲがＮｇＲのコレセプターとして作用し、レセプター複合体のシグナル変換成分を提供することが示唆された(Wang et al., Nature 420:74-78 (2002)；Wong et al., Nat. Neurosci. 5:1302-1308 (2002))。
【０００３】
しかしながら、ＮｇＲ／ｐ７５ＮＴＲレセプター複合体の近年の研究では、ミエリン関連阻害性システムでのＮｇＲの役割についての疑問が持ち上がっている。Zheng等は、ＮｇＲの遺伝子欠損によりインビトロの神経突起阻害が低減されない、又はインビボの皮質脊髄路(ＣＳＴ)再生が促されることを示した。上掲のZheng et al. (2005)。これらの結果と一致して、他の研究でも、ＮｇＲ変異マウスにおけるＣＳＴの再生の任意の亢進も検出されなかった。Kim et al., Neuron 44:439-451 (2004)。これらの所見は、ＮｇＲ／ｐ７５ＮＴＲレセプター複合体が複数の阻害性シグナルの重要なポイントであるという仮説と矛盾する。ＮｇＲ変異マウスにおいてＣＳＴ再生が欠失していることは、Ｎｏｇｏ６６／ＮｇＲ相互作用のペプチドアンタゴにするによって処置された野生型動物で観察されるＣＳＴ再生と対照的である(GrandPre et al. Nature 417:5470551 (2002)、及びLi and Strittmatter, Nature 23:4219-4227 (2002))。他の研究では、ＮｇＲのドミナントネガティブな断片が発現されると、限定的な損傷とあわせて視覚神経軸索の再生が亢進されることが示されている。両拮抗性ペプチドが他の阻害性リガンド／レセプターを干渉する能力を有するので、両実験はＮｇＲの関与を直接試験することができなかった。
これらの実験結果との不一致は、ＮｇＲ又はＮｇＲ／ｐ７５ＮＴＲレセプター複合体がＣＮＳ再生のミエリン関連阻害において限られた役割を果たすかもしれないこと、そして更なるレセプターないしは結合パートナーなどの他の構成成分が阻害性シグナルの伝達に関与するかもしれないことを強く示唆する。
【０００４】
ＰｉｒＢおよびヒトのオルソログ
主要組織適合性複合体(ＭＨＣ)クラスＩは、最初は、免疫系に重要である分子のファミリをコードする領域として同定された。近年の所見では、ＭＨＣクラスＩ分子が発生および成体ＣＮＳにおいて更なる機能を有することが示されている。Boulanger and Shatz, Nature Rev Neurosci. 5:521-531 (2004)；２００３年９月１１日に公開の米国公開２００３／０１７０６９０(Shatz and Syken)。ＭＨＣクラスＩメンバーおよびそれらの結合パートナーの多くは、ＣＮＳニューロンにおいて発現されることが明らかとされている。近年の遺伝的及び分子的研究は、ＣＮＳ ＭＨＣクラスＩの生理学的機能に注目したものであり、最初の結果では、ＭＨＣクラスＩ分子が、既存のシナプス関係の強度がニューロン活性に応答して増加又は減少して回路に長期間の構造的変更が生じるプロセスである、活性依存性のシナプス可塑性に関与しているかもしれないことが示唆された。さらに、ＭＨＣクラスＩコード領域はまた、神経学的症状を有する多種多様な疾患と遺伝的に関連しており、ＭＨＣクラスＩ分子の異常な機能は正常な脳発達および可塑性の破壊につながると考えられる。
【０００５】
免疫環境の公知のＭＨＣクラスＩレセプターのうちの１つは、Kubagawa et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 94:5261-6 (1997)によって最初に記述されたマウスのポリペプチドであるＰｉｒＢである。マウスＰｉｒＢはいくつかのヒトのオルトログを有し、これらのオルトログは白血球免疫グロブリン様レセプター、サブファミリＢ(ＬＩＬＲＢ)のメンバーであって、また、「免疫グロブリン様転写産物」(ＩＬＴ)とも称される。ヒトのオルトログは、以下の順でマウスの配列に有意な相同性を示す。(高い方から順に挙げる)ＬＩＬＲＢ３／ＩＬＴ５、ＬＩＬＲＢ１／ＩＬＴ２、ＬＩＬＲＢ５／ＩＬＴ３、ＬＩＬＲＢ２／ＩＬＴ４、そして、ＰｉｒＢがすべての阻害性レセプターである。ＬＩＬＲＢ３／ＩＬＴ５(ＮＰ＿００６８５５)およびＬＩＬＲＢ１／ＩＬＴ２(ＮＰ＿００６６６０)は、Samaridis and Colonna, Eur. J. Immunol. 27(3): 660-665 (1997)によって最初に記載された。ＬＩＬＲＢ５／ＩＬＴ３(ＮＰ＿００６８３１)は、Borges et al., J. Immunol. 159(11): 5192-5196 (1997)によって同定された。ＬＩＬＲＢ２／ＩＬＴ４(別名ＭＩＲ１０)は、Colonna et al., J. Exp. Med. 186: 1809-18 (1997)によって同定された。ＰｉｒＢおよびそのヒトのオルトログは、大きな構造的多様性を示す。様々なオルターナティブスプライス型の配列はＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋから入手可能であり、例えば、ヒトＩＬＴ４ ｃＤＮＡのための以下の受託番号を含む。ＩＬＴ４−ｃ１１ ＡＦ００９６３４；ＩＬＴ４−ｃ１１７ ＡＦ１１５６６；ＩＬＴ４−ｃ１２６ ＡＦ１１５６５。上記したように、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢポリペプチドはＭＨＣクラスＩ(ＭＨＣＩ)阻害性レセプターであり、免疫細胞活性化を制御する際の役割が知られている(Kubagawa et al., supra; Hayami et al., J. Biol. Chem. 272:7320 (1997)；Takai et al., Immunology 115:433 (2005)；Takai et al., Immunol. Rev. 181: 215 (2001)；Nakamura et al. Nat. Immunol. 5:623 (2004)；Liang et al., Eur. J. Immunol. 32:2418 (2002))。
【０００６】
Syken等(Science 313:1795-800 (2006))による近年の研究では、ＰｉｒＢが脳の全体にわたってニューロンのサブセットにおいて発現されていると報告した。機能的ＰｉｒＢを欠いている変異マウスにおいて、皮質の眼優位(ＯＤ)可塑性はすべての年齢で有意に亢進されており、これは、視覚皮質の活性依存的な可塑性の制限におけるＰｉｒＢの機能を示唆する。
本発明は、少なくとも一部が、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢがＮｏｇｏ(Ｎｏｇｏ６６)及びＭＡＧの結合パートナーであること、そしてＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストとＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ活性の低減によりミエリン関連の阻害系経路が効果的に破壊され、これによってニューロンの再生が促されるという驚くべき発見に基づく。
【発明の概要】
【０００７】
ある態様では、本発明は、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢとミエリンないしはミエリン関連タンパク質又はその断片とを含むレセプター複合体に候補薬剤を接触させ、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢとミエリン関連タンパク質又はその断片との相互作用を阻害する該候補薬剤の能力を検出することを含み、このとき相互作用が阻害される場合に該候補薬剤がアンタゴニストとして同定される、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストを同定するための方法に関する。
一実施態様では、検出される相互作用は結合である。
他の実施態様では、検出される相互作用は細胞性シグナル伝達である。
更なる実施態様では、細胞性シグナル伝達により軸索の成長又はニューロンの再生が阻害される。
なお更なる実施態様では、ミエリン関連タンパク質は、Ｎｏｇｏ、ＭＡＧ、ＯＭｇｐおよびこれらの断片からなる群から選択される。
他の実施態様では、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢは、ヒトのＬＩＬＲＢタンパク質、例えばＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ３又はＬＩＬＲＢ５である。
ある具体的に実施態様では、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢは、ＬＩＬＲＢ２、転写産物変異体１(配列番号：２)、ＬＩＬＲＢ２、転写産物変異体２(配列番号：１４)、ＬＩＬＲＢ１、転写産物変異体１(配列番号：１０)、ＬＩＬＲＢ１、転写産物変異体２(配列番号：１１)、ＬＩＬＲＢ１、転写産物変異体３(配列番号：１２)、ＬＩＬＲＢ１、転写産物変異体４(配列番号：１３)、ＬＩＬＲＢ３、転写産物変異体１(配列番号：１５)、ＬＩＬＲＢ３、転写産物変異体２(配列番号：１６)、ＬＩＬＲＢ５、転写産物変異体１(配列番号：１７)、ＬＩＬＲＢ５、転写産物変異体２(配列番号：１８)およびＬＩＬＲＢ５、転写産物変異体３(配列番号：１９)からなる群から選択される。
更なる実施態様では、複合体はさらにＮｇＲを含む。
【０００８】
異なる実施態様では、候補薬剤は、抗体、ポリペプチド、ペプチド、核酸、小有機分子、多糖およびポリヌクレオチドからなる群から選択され、好ましくは抗体又は短い干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)である。抗体は、ＬＩＲＢ２などのＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢを特異的に結合するのが好ましく、キメラ、ヒト化、ヒトの抗体および抗体断片が含まれるが、これに限定されるものではない。
特定の実施態様では、抗体断片は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'およびＦ(ａｂ')２断片からなる群から選択される。
更なる実施態様では、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢおよびミエリンないしはミエリン関連タンパク質又はその断片の少なくとも一は固定されている。
【０００９】
なお更なる実施態様では、アッセイは細胞に基づくアッセイである。
具体的な実施態様では、細胞に基づくアッセイは、ミエリンないしはミエリン関連タンパク質又はその断片と神経細胞とを候補薬剤の存在下及び非存在下にて培養し、神経突起長の変化を決定することを含み、このとき神経突起長が該候補薬剤の存在下において長い場合に、該候補薬剤がアンタゴニストとして同定される。
上記の細胞に基づくアッセイでは、神経細胞は、原発性ニューロンであってもよいし、例えば、胎仔の幹(ＥＳ)細胞などの幹細胞を含む細胞又は細胞株から得てもよい。他の実施態様では、ニューロンは、例えば、小脳顆粒ニューロン、後根神経節ニューロンおよび皮質ニューロンからなる群から選択される。
一実施態様では、上記の方法はさらに、神経突起の成長を亢進し、および／またはニューロンの成長、修復及び／又は再生を促すために、同定されたアンタゴニストを使用する工程を含む。
他の実施態様では、上記の方法はさらに、神経突起成長の亢進、ニューロンの成長、修復又は再生の促進から利益を得る疾患又は症状を有する被検体に、同定されたアンタゴニストが投与される工程を含む。前記の疾患又は症状は、例えば、物理的に損傷された神経に特徴がある神経学的疾患であってもよいし、又は、物理的な損傷によって生じる末梢神経損傷、糖尿病；中枢神経系への物理的な損傷；脳卒中に関連した脳損傷、三叉神経痛、舌咽神経痛、ベルの麻痺、重症筋無力症、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)、進行性筋萎縮、進行性延髄の遺伝性筋萎縮、ヘルニア状態、破裂性及び脱出性無脊椎ディスク症候群、頸部脊椎症、叢疾患、胸郭出口破壊症候群、末梢性神経障害、ｐｒｏｐｈｙｒｉａ(prophyria)、ギラン-バレー症候群、アルツハイマー病、ハンチントン病およびパーキンソン病からなる群から選択されてもよい。
【００１０】
他の態様では、本発明は、本明細書中の方法のいずれかによって同定された薬剤に関する。
ある実施態様では、薬剤は、抗体、ポリペプチド、ペプチド、核酸、小有機分子、多糖およびポリヌクレオチドからなる群から選択され、好ましくは抗体又は短い干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)である。
更なる態様では、本発明は、ニューロン再生の刺激のための、本明細書中の方法によって同定された薬剤を含有してなる組成物に関する。
なお更なる態様では、本発明は、本明細書中の方法によって同定された薬剤とニューロンの再生のための指示とを具備するキットに関する。
更に他の態様では、本発明は、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストを同定するための、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢおよびミエリンないしはミエリン関連タンパク質又はその断片の複合体の使用に関する。
【００１１】
異なる態様では、本発明は、神経突起成長の亢進、ニューロンの成長、修復又は再生の促進から利益を得る疾患又は症状の治療ための医薬の調製におけるＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストの使用に関する。
他の態様では、本発明は、神経学的疾患の治療のための医薬の調製におけるＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストの使用に関し、該神経学的疾患は、物理的に損傷された神経に特徴があってもよいし、又は、物理的な損傷によって生じる末梢神経損傷、糖尿病；中枢神経系への物理的な損傷；脳卒中に関連した脳損傷、三叉神経痛、舌咽神経痛、ベルの麻痺、重症筋無力症、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)、進行性筋萎縮、進行性延髄の遺伝性筋萎縮、ヘルニア状態、破裂性及び脱出性無脊椎ディスク症候群、頸部脊椎症、叢疾患、胸郭出口破壊症候群、末梢性神経障害、ｐｒｏｐｈｙｒｉａ(prophyria)、ギラン-バレー症候群、アルツハイマー病、ハンチントン病およびパーキンソン病からなる群から選択されてもよい。
更なる態様では、本発明は、神経突起成長の亢進、ニューロンの成長、修復又は再生の促進から利益を得る疾患又は症状の治療に使用するためのＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストに関する。
なお更なる態様では、本発明は、神経学的疾患の治療に使用するためのＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストであって、該神経学的疾患が上記のものである、アンタゴニストに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６と共にインキュベートした後の形質移入ＣＯＳ細胞に対するアルカリホスファターゼを示す。ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６はＰｉｒＢ及びＬＩＬＲＢ２を結合する。
【図２】ＭＡＧ−Ｆｃと共にインキュベートした後の形質移入ＣＯＳ細胞に対する免疫反応を示す。ＭＡＧはＰｉｒＢおよびＬＩＬＲＢ２を結合する。
【図３】神経系の様々な部位におけるＳＭＡＧＰ、ＰＡＮ−ＰｉｒＡ及びＰｉｒＢの発現を示すＲＴ−ＰＣＲ結果を示す。
【図４】成体前脳(Ａ)、成体小脳(Ｂ)およびＰ１０後根神経節(Ｃ)におけるＰｉｒＢの発現をインサイツハイブリダイゼーションによって確認する。
【図５】マウスＰｉｒＢアミノ酸配列(配列番号：１)およびヒトＬＩＬＲＢ２、転写産物変異体１アミノ酸配列(配列番号：２)を示す。
【図６】軸索成長のＮｏｇｏ６６阻害と、ＰｉｒＢ ＥＣＤ(ＰｉｒＢＦｃ及びＰｉｒＢＨｉｓの両方)によるこの阻害の逆転を示す。小脳顆粒ニューロンをこのアッセイに用いた。
【図７】ＰｉｒＢ及びＮｇＲの同時免疫沈降を示す。ＮｇＲはＰｉｒＢと同時に完全に沈降される(左のパネル)。右のパネルは、抗ＮｇＲによりイムノブロットした総細胞可溶化液からの総タンパク質を示す。複数のバンド(矢印)は、グリコシル化により様々な程度に処理されたＮｇＲを表す。
【図８】軸索成長のＮｏｇｏ６６阻害は、小脳顆粒ニューロンにおいて抗ＰｉｒＢ抗体によって部分的に戻ることを示す。
【図９】ＬＩＬＲＢ１、転写産物変異体１(配列番号：１０)のアミノ酸配列を示す。
【図１０】ＬＩＬＲＢ１、転写産物変異体２(配列番号：１１)のアミノ酸配列を示す。
【図１１】ＬＩＬＲＢ１、転写産物変異体３(配列番号：１２)のアミノ酸配列を示す。
【図１２】ＬＩＬＲＢ１、転写産物変異体４(配列番号：１３)のアミノ酸配列を示す。
【図１３】ＬＩＬＲＢ２、転写産物変異体２(配列番号：１４)のアミノ酸配列を示す。
【図１４】ＬＩＬＲＢ３、転写産物変異体１(配列番号：１５)のアミノ酸配列を示す。
【図１５】ＬＩＬＲＢ３、転写産物変異体２(配列番号：１６)のアミノ酸配列を示す。
【図１６】ＬＩＬＲＢ５、転写産物変異体１(配列番号：１７)のアミノ酸配列を示す。
【図１７】ＬＩＬＲＢ５、転写産物変異体２(配列番号：１８)のアミノ酸配列を示す。
【図１８】ＬＩＬＲＢ５、転写産物変異体３(配列番号：１９)のアミノ酸配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（発明のの詳細な説明）
Ａ．定義
「対免疫グロブリン様レセプターＢ(paired-immunoglobulin-like receptor B)」及び「ＰｉｒＢ」なる用語は本明細書において交換可能に用いられ、配列番号：１(図５)(ＮＰ＿０３５２２５)の天然配列８４１アミノ酸マウス阻害性タンパク質、及びラット及び他の非ヒト動物のその天然配列のホモログを指し、オルタナティブスプライス転写変異体及び対立変異体及びアイソフォーム、並びにその可溶性形態などのすべての天然に生じる変異体を含む。
「ＬＩＬＲＢ」、「ＩＬＴ」および「ＭＩＲ」なる用語は本明細書において交換可能に用いられ、ヒトの「白血球免疫グロブリン様レセプター、サブファミリＢ」のすべてのメンバーを指し、オルタナティブスプライス転写変異体及び対立変異体及びアイソフォーム、並びにその可溶性形態などのすべての天然に生じる変異体を含む。このファミリー内の個々のメンバーは、例えばＬＩＬＲＢ３／ＩＬＴ５、ＬＩＬＲＢ１／ＩＬＴ２、ＬＩＬＲＢ５／ＩＬＴ３及びＬＩＲＢ２／ＩＬＴ４など、頭字語の後に数を付して表し、特に断らない限り、任意の個々のメンバーを指す称号には、オルタナティブスプライス転写変異体及び対立変異体及びアイソフォーム、並びにその可溶性形態などのすべての天然に生じる変異体も含まれる。したがって、例えば「ＬＩＬＲＢ１」は、転写変異体１−４(図９−１２に示す、配列番号：１０、１１、１２及び１３)、並びに他のオルタナティブスプライス転写変異体、対立変異体及びアイソフォーム、及びその可溶性形態などのすべての他の天然に生じる変異体を特に包含するために本明細書において用いられる。「ＬＩＬＲＢ２」なる用語は、ＬＩＬＲＢ２、転写変異体１(図５に示す配列番号：２)及び転写変異体２(図１３に示す配列番号：１４)、並びに他のオルタナティブスプライス転写変異体、対立変異体及びアイソフォーム、及びその可溶性形態などのすべての他の天然に生じる変異体を特に包含するために本明細書において用いられる。「ＬＩＬＲＢ３」なる用語は、ＬＩＬＲＢ３、転写変異体１(図１４に示す配列番号：１５)及び転写変異体２(図１５に示す配列番号：１６)、並びに他のオルタナティブスプライス転写変異体、対立変異体及びアイソフォーム、及びその可溶性形態などのすべての他の天然に生じる変異体を特に包含するために本明細書において用いられる。「ＬＩＬＲＢ５」なる用語は、転写変異体１−３(図１６−１８に示す配列番号：１７−１９)、並びに他のオルタナティブスプライス転写変異体、対立変異体及びアイソフォーム、及びその可溶性形態などのすべての他の天然に生じる変異体を特に包含する。
【００１４】
「ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ」なる用語は、簡素化した記載として本明細書において用い、個々のマウスＰｉｒＢ及びヒトＬＩＬＲＢタンパク質及び他の非ヒト哺乳動物の天然配列ホモログのいずれかを指し、オルタナティブスプライス転写物及び対立変異体及びアイソフォーム、並びにその可溶性形態などのすべての天然に生じる変異体を包含する。
「ミエリン関連タンパク質」なる用語は最も広義に用いられ、Ｎｏｇｏ、ＭＡＧおよびＯＭｇｐを含むニューロンの再生を阻害するＣＮＳミエリンに存在するすべてのタンパク質を含む。
【００１５】
「単離された」とは、ここで開示された種々のタンパク質を記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたタンパク質を意味する。その自然環境の汚染成分とは、タンパク質の診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、タンパク質は、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、Ｎ末端あるいは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性が得られるように十分なほど、あるいは、(３)質量分光分析又はペプチドマッピング技術による均一性が得られるように十分なほど精製される。タンパク質の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、単離されたタンパク質には、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたタンパク質は少なくとも１つの精製工程により調製される。
「単離された」核酸分子は、同定され、対象の核酸の天然源に通常付随している少なくとも１つの汚染核酸分子から分離される核酸分子である。単離された核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離された核酸分子は、天然の細胞中に存在する核酸分子とは区別される。しかし、単離された核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にある核酸を通常発現する細胞に含まれる核酸分子を含む。
【００１６】
本明細書中で用いる「ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニスト」なる用語は、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ活性をブロックする、中和する、阻害する、無効にする、低減する、又は干渉することができる薬剤を指す。特に、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストは、ミエリン関連阻害活性を干渉することによって、神経突起の成長を亢進する、および／またはニューロンの成長、修復および／または再生を促進する。好適な実施態様では、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストは、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢに結合することによってＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢのＮｏｇｏ６６及び／又はＭＡＧ及び／又はＯＭｇｐへの結合を阻害する。ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストには、例えば、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢおよびその抗原結合断片に対する抗体、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢとＮｏｇｏ６６との間、又はＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢとＭＡＧとの間、又はＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢとＯＭｇｐの間の結合を隔離することができるＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ、Ｎｏｇｏ６６、ＭＡＧ又はＯＭｇｐの切断型ないしは可溶性断片、及びＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ関連の阻害経路の小分子インヒビターが含まれる。また、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストにも、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ ｍＲＮＡの発現を阻害するかまたは低減することが可能な短い干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)分子が含まれる。
【００１７】
「抗体」という用語は最も広義に使用され、インタクト抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つのインタクト抗体から形成される多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、及びそれらが所望の生物活性を示す限り抗体断片を具体的に包含する。
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が、少量で存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原性部位に対している。さらに、典型的に異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物と比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。これらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体と混ざらないで合成されうる点で有利である。「モノクローナル」なる修飾は、抗体が実質的に均一な集団から得たものである抗体の特徴を指すものであって、ある特定の方法によって抗体が作製されることを必要とすると解釈されるものではない。例えば、本発明において有用なモノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature, 256;495 (1975)によって初めて記載されるハイブリドーマ方法論によって調製されてもよいし、組み換えＤＮＡ法を用いて作製されてもよい(例として米国特許第４８１６５６７号を参照)。また、「モノクローナル抗体」は、例としてClackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)及びMarks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)に記載の技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離されうる。
【００１８】
抗体は、特に「キメラ」抗体を含み、それは特定の種由来又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列に相同な又は同一な重鎖及び／又は軽鎖の一部を含むものであり、残りの鎖は、所望の生物学的活性を表す限り、他の種由来又は他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、並びにその抗体の断片の対応する配列に相同な又は同一なものである(米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。ここで対象とするキメラ抗体には、非ヒト霊長類(例えば、旧世界サル、サルなど)由来の可変ドメイン抗原結合配列とヒト定常領域配列を含む霊長類化抗体を含む。
「抗体断片」は、インタクト抗体の一部、好ましくはインタクト抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ')２、及びＦｖ断片；ダイアボディ(diabodies)；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
「インタクトな」抗体は、抗原-結合可変領域、並びに軽鎖定常ドメイン(ＣＬ)及び重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含むものである。定常ドメインは天然配列定常ドメイン(例えば、ヒト天然配列定常ドメイン)又はそれらのアミノ酸配列変異体であってよい。好ましくは、インタクト抗体は一又は複数のエフェクター機能を有する。
【００１９】
非ヒト(例えば齧歯類)の抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。多くの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種(ドナー抗体)からの高頻度可変領域の残基によって置換されているヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。例として、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいは実質的に全てのＦＲが、ヒト免疫グロブリン配列のものである少なくとも一又は典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう(Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２、Ｆａｂｃ、Ｆｖ)。また、ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含む。さらなる詳細については、Jones等, Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等, Nature 332:323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)を参照のこと。
【００２０】
ここで使用されるところの「高頻度可変領域」なる用語は、配列内で高度に可変性である、及び／又は構造的に定義されるループを形成する抗体の可変ドメインの領域を指す。高頻度可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基(すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２４−３４、５０−５６及び８９−９７、及び重鎖可変ドメインの３１−３５、５０−６５及び９５−１０２；Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest,５版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991))及び／又は「高頻度可変ループ」からの残基(すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２６−３２、５０−５２及び９１−９６、及び重鎖可変ドメインの２６−３２、５３−５５及び９６−１０１；Chothia及びLesk J.Mol.Biol. 196:901-917 (1987))を含む。いずれの場合でも、可変ドメイン残基は以降に詳細に検討するように、上掲のKabat等に従って番号付けする。「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基はここで定義するように高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
「親抗体」又は「野生型」抗体は、本明細書中で開示する抗体変異体と比較して一又は複数のアミノ酸配列の変更が無いアミノ酸配列を含む抗体である。ゆえに、一般に親抗体は、本明細書中で開示する抗体変異体の対応する高頻度可変領域のアミノ酸配列とはアミノ酸配列が異なる少なくとも一の高頻度可変領域を有する。親抗体は、天然の配列(すなわち、天然に生じる)抗体(天然に生じる対立変異体を含む)、又は天然に生じる配列の既存のアミノ酸配列修飾(例えば挿入、欠失及び／又は他の変更)を有してもよい。開示内容全体を通して、「野生型」、「ＷＴ」、「ｗｔ」、及び「親」ないしは「親の」抗体は交換可能に用いられる。
【００２１】
ここで用いる「抗体変異体」又は「変異抗体」は、親抗体のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する抗体を指す。好ましくは、抗体変異体は、天然に見られないアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメインを含む。このような変異体は、必然的に親抗体と１００％未満の配列同一性又は類似性がある。好適な実施態様では、抗体変異体は、親抗体の重鎖又は軽鎖の可変ドメインの何れかのアミノ酸配列と、およそ７５％から１００％未満、より好ましくはおよそ８０％から１００％未満、より好ましくはおよそ８５％から１００％未満、より好ましくはおよそ９０％から１００％未満、最も好ましくはおよそ９５％から１００％未満のアミノ酸配列同一性又は類似性があるアミノ酸配列を有するであろう。抗体変異体は一般に、一又は複数の高頻度可変領域内又は該領域に隣接して一又は複数のアミノ酸変更を有するものである。
「アミノ酸変更」は、既定のアミノ酸配列のアミノ酸配列内の変化を指す。例示的な変更には、挿入、置換及び欠失が含まれる。「アミノ酸置換」とは、既定のアミノ酸配列内の既存のアミノ酸残基の他の異なるアミノ酸残基への置換を指す。
「置換」アミノ酸残基は、アミノ酸配列内の他のアミノ酸残基を置き換える、又は置換するアミノ酸残基を指す。置換残基は天然に生じるアミノ酸残基でも天然に生じないアミノ酸残基であってもよい。
【００２２】
「アミノ酸挿入」とは、既定のアミノ酸配列の中に一又は複数のアミノ酸を取り込ませることを指す。アミノ酸挿入は、ペプチド結合によって結合された２以上のアミノ酸残基を含むペプチドが既定のアミノ酸配列内に導入される場合に「ペプチド挿入」を含みうる。アミノ酸挿入がペプチドの挿入を伴う場合、挿入されたペプチドは、天然に存在しないアミノ酸配列を有するようにランダム突然変異誘発によって生成されてもよい。「高頻度可変領域に隣接する」アミノ酸変更とは、高頻度可変領域のＮ末端及び／又はＣ末端での一又は複数のアミノ酸残基の導入ないしは置換を指し、この挿入ないしは置換アミノ酸残基(一又は複数)の少なくとも一により、対象の高頻度可変領域のＮ末端又はＣ末端のアミノ酸残基とペプチド結合が形成される。
「天然に生じるアミノ酸残基」は遺伝コードによってコードされるものであり、一般に、アラニン(Ａｌａ)；アルギニン(Ａｒｇ)；アスパラギン(Ａｓｎ)；アスパラギン酸(Ａｓｐ)；システイン(Ｃｙｓ)；グルタミン(Ｇｌｎ)；グルタミン酸(Ｇｌｕ)；グリシン(Ｇｌｙ)；ヒスチジン(Ｈｉｓ)；イソロイシン(Ｉｌｅ)：ロイシン(Ｌｅｕ)；リジン(Ｌｙｓ)；メチオニン(Ｍｅｔ)；フェニルアラニン(Ｐｈｅ)；プロリン(Ｐｒｏ)；セリン(Ｓｅｒ)；スレオニン(Ｔｈｒ)；トリプトファン(Ｔｒｐ)；チロシン(Ｔｙｒ)；及び、バリン(Ｖａｌ)からなる群から選択されうる。
【００２３】
「非天然に生じる(天然に生じない)アミノ酸残基」は、上記に挙げる天然に生じるアミノ酸残基以外の、ポリペプチド鎖内の隣接したアミノ酸残基(一又は複数)を共有結合することができるアミノ酸残基を指す。非天然に生じるアミノ酸残基の例には、例えば、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン及び、例えば、Ellman等 Meth. Enzym. 202:301-336 (1991)に記載のものなどの他のアミノ酸残基アナログが含まれる。非天然のアミノ酸残基を産生するためには、Noren 等 Science 244:182 (1989)および上掲のEllman 等の方法を利用することができる。要するに、これらの方法はインビトロにおけるＲＮＡの転写及び翻訳に先立って非天然に生じるアミノ酸残基にてサプレッサーｔＲＮＡを化学的に活性化することを伴う。
【００２４】
この開示内容の全体にわたって、Kabat, E. A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) and (1991)の番号付けシステムを参照のこと。これらの概略では、Kabatは、各サブクラスの抗体について多くのアミノ酸配列を挙げており、そのサブクラス内の各々の残基位置について最も共通して生じるアミノ酸を挙げている。Kabatは列挙した配列の各アミノ酸に残基番号を割り当てるための方法を用い、残基に数を割り当てるこの方法は当分野において標準となっている。カバット番号付けスキームはこの記載に従う。本発明の目的を達成するために、カバット概略に含まれない候補抗体アミノ酸配列に残基番号を割り当てるために、一方法として以下の工程を用いる。通常、候補配列は、任意の免疫グロブリン配列又はカバットの任意のコンセンサス配列と整列配置する。整列配置(アラインメント)は、手動で行うか、一般に是認されたコンピュータプログラムを用いてコンピュータによって行ってもよい。このようなプログラムの例はＡｌｉｇｎ２プログラムである。整列配置は、ほとんどのＦａｂ配列に共通するいくつかのアミノ酸残基を用いて促されうる。例えば、軽鎖および重鎖は、各々典型的に、同じ残基番号を有する２つのシステインを有する。ＶＬドメインでは、２つのシステインは典型的に残基番号２３および８８であり、ＶＨドメインでは、２つのシステイン残基は典型的に番号２２および９２である。必ずではないが、フレームワーク残基は一般に、およそ同じ数の残基を有するが、ＣＤＲの大きさは変化しうる。例えば、整列配置されるカバットの配列のＣＤＲより長い候補配列からのＣＤＲの場合、典型的に、助数詞を残基番号に加えて、更なる残基の挿入を表す(例えば図１Ｂの残基100ａｂｃを参照)。例えば、残基３４及び３６についてカバット配列と整列配置するが残基３５と整列配置させるための残基をこれらの間に持たない候補配列では、番号３５は単に残基を割り当てない。
【００２５】
本明細書中で用いる、「高い親和性」を有する抗体とは、ナノモル(ｎＭ)の範囲かそれより良好なＫＤ又は解離定数を有する抗体である。「ナノモル範囲かそれより良好な」ＫＤは、ＸｎＭで表してもよく、このＸはおよそ１０未満の数である。
「繊維状ファージ」なる用語は、その表面上に異種性のポリペプチドをディスプレイすることが可能なウイルス粒子を指し、ｆ1、ｆｄ、Ｐｆ1およびＭ13が挙げられるが、これらに限定されるものではない。繊維状ファージは、テトラサイクリン(例えば「ｆｄ ｔｅｔ」)などの選択可能なマーカーを含みうる。様々な繊維状ファージディスプレイシステムは当業者に周知である(例えば、Zacher et al. Gene 9: 127-140 (1980)（Smith et al. Science 228: 1315-1317 (1985)；及びParmley and Smith Gene 73: 305-318 (1988)を参照)。
「パニング」なる用語は、標的に対して高親和性および特異性を有する、抗体などの化合物保持するファージの同定および単離におけるスクリーニング工程の複数のラウンドを指すために用いる。
【００２６】
「短い干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)」なる用語は、遺伝子発現を干渉する小さい二本鎖ＲＮＡを指す。ｓｉＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡが相同遺伝子を沈黙(サイレンシング)させる工程であるＲＮＡ干渉の中間生成物である。ｓｉＲＮＡは典型的に、二本鎖を形成するおよそ１５−２５長のヌクレオチドの２つの一本鎖ＲＮＡからなり、一本鎖オーバーハングを含みうる。酵素複合体、例えばポリメラーゼによる二本鎖ＲＮＡのプロセシングにより、二本鎖ＲＮＡの切断が生じ、ｓｉＲＮＡが生成される。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖はＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)サイレンシング複合体に用いられ、ｍＲＮＡ切断が導かれ、これによってｍＲＮＡ分解が促される。例えば哺乳動物細胞において特定の遺伝子をｓｉＲＮＡを用いて沈黙させるために、塩基対領域を、無関係なｍＲＮＡに偶然に相補性を持たないように選択する。例えばFire et al., Nature 391:806-811 (1998)およびMcManus et al., Nat. Rev. Genet. 3(10): 737-47 (2002)にあるように、ＲＮＡｉサイレンシング複合体は、当分野において同定されている。
「干渉ＲＮＡ(ＲＮＡｉ)」なる用語は、特定のｍＲＮＡの触媒的分解をもたらす二本鎖ＲＮＡを指すために本明細書において用い、したがって特定の遺伝子の発現を阻害／低減するために用いられうる。
【００２７】
「多型性」なる用語は、遺伝子ないしはその一部(例えば対立遺伝子変異体)の複数の形態を指すために本明細書において用いる。少なくとも２つの異なる形態があるものの遺伝子一部は遺伝子の「多型性領域」と呼ばれる。遺伝子の多型性領域のある遺伝子配列は「対立遺伝子」である。多型性領域は、異なる対立遺伝子において異なる単一のヌクレオチドであってもよいし、又は長くいくつかのヌクレオチドであってもよい。
【００２８】
本明細書中で用いる「疾患」なる用語は、通常は、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢのアンタゴニストの有効量によって治療されうる任意の疾患又は疾病を含む、本発明の化合物による治療により利益を得る任意の症状を指す。本明細書において治療される疾患の非限定的例には、限定するものではないが、神経突起成長の亢進、ニューロンの成長、修復又は再生の促進から利益を得る疾患及び症状、例えば物理的に損傷を受けた神経および神経変性疾患などの神経学的疾患が含まれる。このような疾患は具体的には、糖尿病などの疾患状態又は物理的損傷に起因する末梢神経損傷；中枢神経系(脊髄索および脳)への物理的な損傷；脳卒中に関連した脳損傷；及び神経変性に関連する神経学的疾患、例えば、三叉神経痛、舌咽神経痛、ベルの麻痺、重症筋無力症、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)、進行性筋萎縮、進行性延髄の遺伝性筋萎縮、ヘルニア状態、破裂性又は脱出性無脊椎ディスク症候群、頸部脊椎症、叢疾患、胸郭出口破壊症候群、鉛によるものなどの末梢性神経障害、ダプソン(dapsone)、チック、ｐｒｏｐｈｙｒｉａ(prophyria)、ギラン-バレー症候群、アルツハイマー病、ハンチントン病又はパーキンソン病が含まれる。
本明細書中で用いる「治療する」、「治療」及び「療法」なる用語は、治癒的な療法、予防的な療法および防止的な療法を指す。連続的な治療又は投与は、治療を中断することなく一又は複数の日による、少なくとも１日を基準とした治療を指す。間欠的な治療ないしは投与、又は間欠的な様式の治療ないしは投与は、連続的でなく、むしろ実際上周期的である治療を指す。
【００２９】
本明細書中で用いる「神経変性を予防する」なる用語には、(1) 新規に神経変性疾患を有すると診断された患者又は新たに神経変性疾患を発症するリスクにある患者の神経変性を阻害するないしは予防する能力、及び(2) 神経変性疾患を既に患っている患者又は神経変性疾患の症状を有する患者の更なる神経変性を阻害する又は予防する能力が含まれる。
本明細書中で用いる「哺乳動物」なる用語は、ヒト、高次非ヒト霊長類、齧歯類、ウシ、ウマ、イヌ及びネコなどの愛玩動物及び家畜動物を含む、哺乳動物として分類される任意の哺乳動物を指す。本発明の好適な実施態様では、哺乳動物はヒトである。
【００３０】
一又は複数の更なる治療剤「と併用した」投与には、同時(並列)及びいずれかの順序での連続的な投与が含まれる。
「有効量」は、有益な又は所望の治療的(防止的なものを含む)結果を生じさせるために十分な量である。有効量は、一又は複数の投与で投与されてもよい。
【００３１】
本明細書中で用いる「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」なる表現は相互に交換可能に用いられ、かかる標記は子孫を含む。よって、「形質転換体」や「形質転換細胞」のような用語には、初代対象細胞と何世代移行したかを問わずそれから由来した培養物とを含む。全ての子孫が、意図的な突然変異あるいは意図せざる突然変異のため、正確に同一のＤＮＡ内容であるわけではないことも理解される。「子孫」なる用語は、最初に形質転換された細胞又は細胞株に続くすべての世代のいずれか及びすべての子孫を指す。最初に形質転換された細胞に対してスクリーニングされたものと同じ機能あるいは生物的活性を有する突然変異子孫も含まれる。区別しての標記を意図している場合は、文脈から明らかなはずである。
【００３２】
本明細書中で同定された配列に対する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないで、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要であれば間隙(ギャップ)を導入して、参照配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法により達成可能であり、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な指定のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。ここでの目的のためには、％アミノ酸同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を用いて得られる。ＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、そのソースコードは米国著作権庁, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ-２プログラムはジェネンテク社、South San Francisco, Californiaを通して公的に入手可能である。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ-２プログラムによって設定され変動しない。
【００３３】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングに必要な温度が高くなり、プローブが短くなるとそれに必要な温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは、一般的に、相補鎖がその融点より低い環境に存在する場合に、変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイゼーション配列の間で所望される同一性の程度が高くなればなるほど、用いることができる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をよりストリンジェントにすることになり、低い温度はストリンジェントを低下させることになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの更なる詳細及び説明については、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology(Wiley Interscience Publishers, 1995)を参照のこと。
【００３４】
ここで定義される「高度なストリンジェンシー条件」は、(１)洗浄に低イオン強度及び高温度を用いる、５０℃で、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウム；(２)ハイブリダイゼーション中に変性剤を用いる、４２℃で、５０％(ｖ／ｖ)ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム；又は(３)４２℃で、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ(０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム)、５０ｍＭのリン酸ナトリウム(ｐＨ６．８)、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハード液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ(５０μｇ／ｍｌ)、０．１％ＳＤＳ、及び１０％の硫酸デキストラン溶液を用いて、４２℃の０．２×ＳＳＣ(塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム)中と５５℃の５０％ホルムアミドにて洗浄し、ついで５５℃で、ＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄を行うものによって同定される。
【００３５】
「中程度のストリンジェント条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Press, 1989)に記載されているように同定され、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ(１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム)、５０ｍＭリン酸ナトリウム(ｐＨ７．６)、５×デンハード液、１０％硫酸デキストラン、及び２０ｍｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中にて３７℃で終夜インキュベーションし、次いで１×ＳＳＣ中にて約３７−５０℃でフィルターを洗浄することを含む。当業者であれば、プローブ長などの因子に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかは理解されるであろう。
【００３６】
「コントロール配列」という用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列と、リボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
「小分子」とは、ここでは、約１０００ダルトン未満、好ましくは約５００ダルトン未満の分子量を持つと定義される。
【００３７】
Ｂ．ニューロン(神経細胞)の再生の刺激因子を同定するためのスクリーニングアッセイ
本発明の一次アッセイは、少なくとも一部は、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢがミエリンタンパク質Ｎｏｇｏ(Ｎｏｇｏ６６)及びＭＡＧののレセプターであるという認識と、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢの結合に干渉するＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストが神経突起成長を亢進する、及び／又は神経細胞の成長、修復及び／又は再生を促すことができるという認識に基づく。簡単に言えば、このような薬剤は、本明細書において、ニューロン再生の刺激因子と称される。
アンタゴニスト薬剤候補のためのスクリーニングアッセイは、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢを結合するか又は複合体化する化合物、又はＮｏｇｏ、ＭＡＧないしはミエリン結合阻害システムの他のメンバーとのＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢの相互作用に干渉する化合物を同定するために設定されてもよい。本明細書中に示すスクリーニングアッセイには、それらを小分子薬剤候補を同定するために適する、化学的ライブラリのハイスループットスクリーニングに従うアッセイが含まれる。通常、結合アッセイおよび活性アッセイが提供される。
【００３８】
アッセイは、種々の形式で実施でき、この分野で良く特徴付けられたタンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ及び細胞ベースのアッセイを含む。
アンタゴニストのためのすべてのアッセイは、それらが候補薬をＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢポリペプチドと、それら２成分が相互作用するのに十分な時間と条件で接触させる点において共通している。
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、又は反応混合物中で検出される。特別な実施態様では、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢポリペプチド又は薬剤候補のいずれかが、共有又は非共有結合により固相、例えばマイクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般的に、固体表面をＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢポリペプチドの溶液でコーティングし乾燥させることにより達成される。あるいは、固定化すべきＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢポリペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を、そのペプチドを固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは、検出可能な標識によってラベル化される非固定化成分を、固定化成分、例えば、固着成分を含むコーティング表面などに添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体によって検出できる。
【００３９】
候補化合物がＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢと相互に作用するがＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢに結合しないポリペプチドである場合、それぞれのポリペプチドとＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢとの相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するための周知の方法によって検定されてもよい。このようなアッセイには、従来の手法、例えば、架橋結合、同時免疫沈降法、及び勾配ないしはクロマトカラムによる同時精製が含まれる。更に、Chevray and Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5789-5793 (1991)によって開示されるように、タンパク質−タンパク質相互作用は、Fieldsと共同研究者によって記述される酵母に基づく遺伝システムを用いてモニターすることもできる(Fields and Song, Nature (London), 340:245-246 (1989)；Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582 (1991))。酵母菌ＧＡＬ４などの多くの転写活性化因子は、２つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。以前の文献に記載された酵母発現系(一般に「２−ハイブリッドシステム」と呼ばれる)は、この特性の長所を利用して、２つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合し、他方では、候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。ＧＡＬ１−ｌａｃＺリポーター遺伝子のＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質-タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β-ガラクトシダーゼに対する色素生産性基質で検出される。２−ハイブリッド技術を用いた２つの特定のタンパク質間のタンパク質-タンパク質相互作用を同定するための完全なキット(ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲＴＭ)は、Clontechから購入できる。この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、並びにこの相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定にも拡張することができる。
【００４０】
ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢと他の細胞内ないしは細胞外成分、特にＮｏｇｏ又はＭＡＧとの相互作用を干渉する化合物は以下のように試験することができる。通常、２つの生成物の相互作用を可能にする条件及び時間の下で、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢおよび細胞内ないし細胞外成分を含む反応混合物を調製する。ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ及びＮｏｇｏ又はＭＡＧの相互作用を阻害する候補化合物の能力を試験するために、試験化合物の存在下及び非存在下にて反応を行った。さらに、第３の反応混合物にプラセボを加え、ポジティブコントロールとする。
本明細書において具体的に述べるスクリーニングアッセイは例示のみのためにであることを強調する。スクリーニングしたアンタゴニスト候補(例えば、ポリペプチド、ペプチド、非ペプチド小有機分子、核酸など)の種類に応じて選択されうる、当業者に周知な他のアッセイが多く存在し、本発明の目的に等しく適する。
【００４１】
本明細書中のアッセイを用いて、限定するものではないが、化学ライブラリ、天然の生成物ライブラリ(例えば、微生物、動物、植物などの集積)、及びランダムペプチド、オリゴヌクレオチドないしは小有機分子を含む組み合わせライブラリなどの化合物のライブラリをスクリーニングしてもよい。特定の実施態様では、本明細書中のアッセイを用いて、限定するものではないが、ナイーブヒト抗体、組み換え抗体、合成抗体及び半合成抗体のライブラリをスクリーニングする。抗体ライブラリは、例えば、ウイルス粒子当たり平均１の単鎖抗体ないしは抗体断片をディスプレイする一価ライブラリ、及びウイルス粒子当たり平均２以上の抗体ないしは抗体断片をディスプレイする多価ライブラリを含むファージディスプレイライブラリであってもよい。しかしながら、本発明によってスクリーニングされる抗体ライブラリは、ファージディスプレイライブラリに限らない。他のディスプレイ技術には、例えば、リボソーム又はｍＲＮＡディスプレイ(Mattheakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022-9026 (1994)；Hanes and Pluckthun, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4937-4942 (1997))、微生物細胞ディスプレイ（例えば細菌ディスプレイ(Georgiou et al., Nature Biotech. 15:29-34 (1997))又は酵母菌ディスプレイ(Kieke et al., Protein Eng. 10: 1303-1310 (1997))、哺乳動物細胞上のディスプレイ、胞子ディスプレイ、レトロウイルスディスプレイなどのウイルスディスプレイ(Urban et al., Nucleic Acids Res. 33: e35 (2005)、タンパク質−ＤＮＡ結合に基づくディスプレイ(Odegrip et al., Proc. Acad. Natl. Sci. USA 101:2806-2810 (2004)；Reiersen et al., Nucleic Acids Res. 33: e10 (2005))、及びミクロビーズディスプレイ(Sepp et al., FEBS Lett. 532:455-458 (2002))が含まれる。
【００４２】
本明細書中の一次結合／相互作用アッセイにおいて得られた結果は、ニューロン再生のインビトロおよび／またはインビボのアッセイにおいて確認されうる。あるいは、ニューロン再生のインビトロおよび／またはインビボのアッセイを、本明細書中のＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストを同定するために一次アッセイとして用いてもよい。
【００４３】
神経突起成長のインビトロアッセイは当分野で周知であり、例えばJin and Strittmatter, J Neurosci 17:6256-6263 (1997)；Fournier et al., Methods Enzymol. 325:473-482 (2000)；Zheng et al., Neuron 38:213-224 (2003)；Wang et al., Nature 417:941-944 (2002)、及びNeumann et al., Neuron 34:885-893 (2002)に記載されている。神経突起成長を測定し定量化するためのキットが市販されている。したがって、例えば、ＣＨＥＭＩＣＯＮの神経突起成長アッセイキット(Catalog number NS200)は、神経突起形成及び反発作用に影響する化合物の定量的な試験のために細孔フィルター技術を用いる。このシステムについては、生物学的及び薬理学的な薬剤を同時にスクリーニングし、神経突起伸長及び反発作用に寄与する接着及び誘導レセプター機能を直接評価し、形質移入した細胞における遺伝子機能を分析することができる。細孔フィルターにより、タンパク質発現、シグナル伝達過程及び神経突起成長ないしは退縮過程を調節する薬剤標的の同定の詳細な分子的分析のための、神経突起と細胞体の生化学的な分離と精製が可能である。
【００４４】
代表的なプロトコールでは、齧歯類の神経組織(小脳顆粒ニューロン、後根神経節ニューロンおよび皮質ニューロンを含む)から単離された一次ニューロンを、固定した総ミエリンないしはミエリン関連タンパク質(例えばＮｏｇｏ６６、ＭＡＧ及び／又はＯＭｇｐ)にてコートした９６ウェル組織培養ディッシュ上で培養する。一定期間、一般的に２４〜４８時間培養した後、ニューロンを、４％パラホルムアルデヒドにて固定し、ニューロンマーカー(抗クラスＩＩＩ ｂ-チューブリン、Covance)にて染色する。次いで、画像取込および分析を、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ自動化撮像システム(Molecular Devices)を使用して実行する。データは、ニューロン当たりの最大ないしは総神経突起長の変化について分析する。
インビボアッセイには、様々な神経変性疾患の動物モデル、例として、脊髄損傷モデル、視覚領皮質可塑性モデルの動物モデル、当分野で公知の他のモデルが含まれる。ゆえに、再生および可塑性は、片側の錐体路切断術後の可塑性のモデルおよび外傷性脳損傷のモデルにおいて調べられてもよい。他の神経変性のモデルには、実験的自己免疫性脳炎(ＥＡＥ)などの多発性硬化症のマウスモデル、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)のモデル、例えばＳＯＤＩ変異マウス、アルツハイマー病のトランスジェニック動物モデル、およびパーキンソン病の動物モデルが含まれる。
【００４５】
Ｃ．ニューロン再生の刺激因子として作用する抗体の作製
本発明の結合および活性のアッセイによって同定される抗体は、組換えＤＮＡ技術の技術を含む公知の方法によって製造されうる。
(i) 抗原調製
場合によって他の分子にコンジュゲートした可溶性抗原ないしはその断片は、抗体を生成するための免疫原として用いられうる。レセプターなどの膜貫通分子のために、その断片(例えばレセプターの細胞外ドメイン)が免疫原として用いられうる。あるいは、膜貫通分子を発現する細胞を免疫源として用いてもよい。このような細胞は、天然の供与源(例えば癌細胞株)から得られてもよいし、膜貫通分子を発現するように組換え体技術によって形質転換されている細胞であってもよい。抗体を調製するために有用な他の抗原及びその形態は当分野の技術者に明らかであろう。
【００４６】
(ii) ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、関連する抗原とアジュバントを複数回の皮下(sc)又は腹腔内(ip)注射することにより、動物に産生されることが好ましい。それは、免疫化されるべき種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターへ、二重官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介する抱合)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基を介する抱合)、グルタルアルデヒド、及び無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲ及びＲ１が異なるアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲへ、関連する抗原をコンジュゲートさせるために有用である。
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ(それぞれウサギ又はマウスの場合)を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫する。１ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。好ましくは、動物を、同じ抗原であるが異なるタンパク質にコンジュゲートさせた、及び／又は異なる架橋剤によってコンジュゲートさせたコンジュゲートにより追加免疫する。コンジュゲートはまた、タンパク融合として組換え細胞培養中で調製することができる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。
【００４７】
(iii) モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第４８１６５６７号)によって作成することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスター又はマカクザルを上記のように免疫し、免疫化に用いられたタンパク質と特異的に結合する抗体を産生する、又は産生することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次いで、リンパ球をポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ−欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含有するであろう(ＨＡＴ培地)。
【００４８】
好適な骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの発現を支援し、ＨＡＴ培地などの培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫株化細胞は、マウス骨髄腫ライン、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、ＵＳＡより入手し得るＭＯＰＣ-２１及びＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及び、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビル、メリーランド、ＵＳＡより入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞から誘導されるものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている(Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51-63頁、(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について検定する。好ましくはハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定する。
【００４９】
所望の特異性、親和性、及び／又は活性な抗体を産生するハイブリドーマ細胞が確定された後、そのクローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地は、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地を包含する。また、このハイブリドーマ細胞は、動物の腹水症腫瘍として、インビボで増殖させることができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティクロマトグラフィーのような常套的なイムノグロブリン精製法によって、培地、腹水、又は血清から上手く分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常法を用いて(例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)即座に分離されて、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好適な供給源となる。ひとたび分離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、この状況以外ではイムノグロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入し、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を獲得することができる。抗体の組み換え産生を以下に詳細に記載する。
【００５０】
更なる実施態様では、抗体又は抗体断片は、McCafferty等, Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリから分離することができる。Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)及び Marks等, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリを使用したマウス及びヒト抗体の分離を記述している。続く刊行物は、鎖シャフリングによる高親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の生成(Marks等, Bio/Technology, 10:779-783[1992])、並びに非常に大きなファージライブラリを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouse等, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266[1993])を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の分離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。
また、ＤＮＡは、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメイン(ＣＨ及びＣＬ)のコード配列を、相同的マウス配列に代えて置換することによって(米国特許第４８１６５６７号；Morrison等, Proc.Nat.Acad.Sci., USA, 81:6851(1984))、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部又は一部を共有結合させることによって修飾することができる。
典型的には、前記の非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインと置き代わることができるか、又は抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインが置換されて、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
【００５１】
(iv) ヒト及びヒト化抗体
ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的にウィンター(Winter)及び共同研究者［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第４８１６５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方のヒト可変ドメインの選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のヒトフレームワーク(ＦＲ)として受け入れる(Sims等, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothia等, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta等, J. Immunol., 151:2623(1993))。
【００５２】
更に、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好適な方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、ＣＤＲ残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
あるいは、現在では、免疫化することで、内因性免疫グロブリンの産生がなく、ヒト抗体の全レパートリーを産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子のホモ接合体欠失によって、結果として内因性抗体産生の完全な阻害が起こることが説明されてきた。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子配列の、このような生殖細胞系突然変異体マウスへの転移によって、結果として抗原投与時にヒト抗体の産生がおこる。Jakobovits等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature 362:255-258 (1993); Bruggeman等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；及びDuchosal等 Nature 355:258 (1992)を参照されたい。また、ヒト抗体はファージディスプレイライブラリからも得られる(Hoogenboom等, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)；Vaughan等 Nature Biotech 14:309 (1996))。抗体ファージディスプレイライブラリからのヒト抗体の生成は以下に更に記載する。
【００５３】
(v) 抗体断片
抗体断片を産生するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化によって誘導された(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は、現在は組換え宿主細胞により直接産生することができる。例えば、抗体断片は、上で論じた抗体ファージライブラリから単離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合させてＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。以下の実施例に記載のような他の実施態様では、Ｆ(ａｂ')２は、Ｆ(ａｂ')２分子のアセンブリを促すように、ロイシンジッパーＧＣＮ４を用いて形成される。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。抗体断片を生成するのための他の方法は、当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択する抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦｖ)である。国際公開９３／１６１８５号を参照のこと。
【００５４】
(vi) 多重特異性抗体
多重特異性抗体は、通常異なる抗原に由来する少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する。このような分子は通常２つの異なるエピトープを結合するだけであるが(すなわち二重特異性抗体、ＢｓＡｂ)、本明細書中で用いられる場合には三重特異性抗体などの更なる特異性を有する抗体がこの表現に包含される。ＢｓＡｂの例には、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢに対する一アームと、Ｎｏｇｏ又はＭＡＧ又はＯＭｇｐに対する他のアームとを有するものが含まれる。ＢｓＡＢの更なる例には、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢに対する一アームとＮｇＲに対する他のアームを有するものが含まれる。
二重特異性抗体を作成する方法は当該分野において既知である。完全長二重特異性抗体の伝統的な産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの鎖は異なる特異性を持っている(Millstein等, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公開第９３／０８８２９号及びTraunecker等, EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原-抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むイムノグロブリン重鎖定常ドメインである。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時トランスフェクトする。これにより、組立に使用される３つのポリペプチド鎖の等しくない比率が抗体の最適な収率をもたらす態様において、３つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな(フレキシビリティ)が与えられる。しかし、少なくとも２つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率があまり影響がないときは、２又は３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【００５５】
この手法の好適な実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公開第９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
国際公開第９６／２７０１１号に記載された他の手法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体の定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【００５６】
二重特異性抗体には、交差結合又は「ヘテロコンジュゲート」抗体が含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲートの一抗体はアビジンにカップリングし、他方の抗体はビオチンにカップリングしていてもよい。例えば、このような抗体は、望ましくない細胞へ免疫系細胞を標的化するため(米国特許第４６７６９８０号)、そしてＨＩＶ感染の治療のため(国際公開９１／００３６０、国際公開９２／２００３７３)に提唱されている。ヘテロコンジュゲート抗体は従来のいずれかの交差結合法を用いて作製されてもよい。好適な交差結合剤は当分野で周知であり、多くの交差結合技術と共に米国特許第４６７６９８０号に開示されている。
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤、亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に変換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再変換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
【００５７】
Ｆａｂ'-ＳＨ断片は、大腸菌から直接回収することもできるし、化学的に結合して二重特異性抗体を形成させることもできる。Shalaby等,J.Exp.Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な技術もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生成されている。Kostelny等, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生成に対して使用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、よって２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruber等, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等 J.Immunol. 147:60(1991)。
【００５８】
(vii) エフェクター機能の加工
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、抗体の有効性を向上させることは望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成するようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上したインターナリゼーション能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体−依存細胞性細胞障害性(ＡＤＣＣ)を有する可能性がある。Caron等, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。また、向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体は、Wolff等, Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)に記載されている異種二官能性架橋を用いて調製することができる。あるいは、抗体は、２つのＦｃ領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させることもできる。Stevenson等, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照。
【００５９】
(viii) 抗体−サルベージレセプター結合エピトープ融合
本発明のある実施態様では、例えば腫瘍浸透性を増大させるためにインタクト抗体よりも抗体断片を使用することが望ましい。この場合、その血清半減期を増大させるために抗体断片を改変することが望ましい。これは、例えば、抗体断片にサルベージレセプター結合エピトープを組み込むことにより(例えば、抗体断片中の適当な領域の突然変異により、あるいはついで抗体断片の何れかの末端又は中央に、例えばＤＮＡ又はペプチド合成により融合されるペプチドタグ内にエピトープを組み込むことにより)、達成しうる。
サルベージレセプター結合エピトープは、好ましくは、Ｆｃドメインの一又は二のループ由来の一又は複数の任意のアミノ酸残基が抗体断片の類似位置に転移している領域を構成する。更により好ましくは、Ｆｃドメインの一又は二のループ由来の３以上の残基が転移する。またより好ましくは、エピトープはＦｃ領域の(例えばＩｇＧの)ＣＨ２ドメインから得られ、抗体のＣＨ１、ＣＨ３、又はＶＨ領域、又はそのような領域の一より多くに転移する。あるいは、エピトープは、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインから得られ、抗体断片のＣＬ領域又はＶＬ領域、又はその両方に転移する。
【００６０】
(ix) 抗体の他の共有的修飾
抗体の共有的修飾は本発明の範囲内にある。それらは、適当であれば、化学合成により、又は抗体の酵素的又は化学的切断によりなされうる。抗体の共有的修飾の他のタイプは、選択される側鎖又はＮないしＣ末端の残基と反応できる有機誘導体化剤と抗体の標的とするアミノ酸領域を反応させることにより分子中に導入される。共有的修飾は米国特許第５５３４６１５号に記載されており、出典明記によって特別に本明細書中に援用される。抗体の共有結合的修飾の好適なタイプは、ポリペプチドを、種々の非タンパク質様ポリマーの一つ、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンへ、米国特許第４６４０８３５号；第４４９６６８９号；第４３０１１４４号；第４６７０４１７号；第４７９１１９２号又は第４１７９３３７号に記載された方法で結合させることを含む。
【００６１】
(x) 合成抗体ファージライブラリからの抗体の産生
ある好適な実施態様では、本発明は特有のファージディスプレイアプローチ法を使用して新規な抗体を産生し選択する方法を提供する。該アプローチ法は、単一フレームワーク鋳型に基づく合成抗体ファージライブラリの産生、可変ドメイン内の十分な多様性の設計、多様化した可変ドメインを有するポリペプチドのディスプレイ、抗原を標的とする高親和性を持つ候補抗体の選択、及び選択された抗体の単離を含む。
ファージディスプレイ法の詳細は例えば２００３年１２月１１日公開の国際公開第０３／１０２１５７号に見出すことができ、この開示内容の全体は出典明記によって特別に本明細書中に援用される。
【００６２】
一態様では、本発明において使用される抗体ライブラリは抗体可変ドメインの少なくとも一のＣＤＲにおいて溶媒接近可能な及び／又は高度に多様性の位置を変異させることによってつくることができる。ＣＤＲの幾らか又は全てをここに提供した方法を使用して変異させることができる。ある実施態様では、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３中の位置に変異を施して単一のライブラリを形成するか、又はＣＤＲＬ３及びＣＤＲＨ３中の位置に変異を施して単一のライブラリを形成するか、又はＣＤＲＬ３及びＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３中の位置に変異を施して単一のライブラリを形成することにより、多様な抗体ライブラリをつくることが好ましい。
例えばＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３の溶媒接近可能な及び／又は高度に多様性の位置に変異を有する抗体可変ドメインのライブラリをつくることができる。ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３に変異を有する他のライブラリをつくることができる。これらのライブラリは所望の親和性の結合体をつくるために互いに関連させて使用することもできる。例えば、標的抗原への結合についての重鎖ライブラリの一又は複数回の選択後に、軽鎖ライブラリを結合体の親和性を増加させるために更なる選択回数に対して重鎖結合体の集団中に置き換えることができる。
【００６３】
好ましくは、ライブラリは重鎖配列の可変領域のＣＤＲＨ３領域における変異アミノ酸での元のアミノ酸の置換によりつくられる。得られたライブラリは複数の抗体配列を含み得、ここで配列多様性は主として重鎖配列のＣＤＲＨ３領域にある。
一態様では、ライブラリはヒト化抗体４Ｄ５配列、又はヒト化抗体４Ｄ５配列のフレームワークアミノ酸の配列の態様でつくり出す。好ましくは、ライブラリはＤＶＫコドンセットによってコードされるアミノ酸で重鎖の少なくとも残基９５−１００ａを置換することによりつくられ、ここでＤＶＫコドンセットはこれらの位置の各一に対して変異アミノ酸セットをコードするために使用される。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの一例は配列(ＤＶＫ)７を含む。ある実施態様では、ライブラリはＤＶＫとＮＮＫの双方のコドンセットによってコードされるアミノ酸で残基９５−１００ａを置換することによりつくられる。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの例は配列(ＤＶＫ)６(ＮＮＫ)を含む。他の実施態様では、ライブラリはＤＶＫとＮＮＫの双方のコドンセットによってコードされるアミノ酸で少なくとも残基９５−１００ａを置換することによりつくられる。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの例は配列(ＤＶＫ)５(ＮＮＫ)を含む。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの他の例は配列(ＮＮＫ)６を含む。好適なオリゴヌクレオチド配列の他の例はここに記載された基準に従って当業者によって決定することができる。
【００６４】
他の実施態様では、異なったＣＤＲＨ３設計を使用して高親和性結合体を単離し様々なエピトープに対して結合体を単離する。このライブラリにおいて産生されたＣＤＲＨ３の長さの範囲は１１から１３アミノ酸であるが、これとは異なった長さも産生することができる。Ｈ３多様性はＮＮＫ、ＤＶＫ及びＮＶＫコドンセットを使用し、並びにＮ及び／又はＣ末端での多様性をより制限して、拡張することができる。
多様性をＣＤＲＨ１及びＣＤＲＨ２においてまた生じさせることができる。ＣＤＲ-Ｈ１及びＨ２多様性の設計は、過去の設計よりも天然の多様性により密に適合する多様性に焦点を当てる変更をした上で、上述の天然抗体レパートリーを模倣するターゲティング方策に従う。
【００６５】
ＣＤＲＨ３での多様性に対しては、複数のライブラリを、異なった長さのＨ３と別個に構築し、ついで、標的抗原に対する結合体を選択するために組み合わせる。複数のライブラリをプールし、過去に記載され以下に記載されたような固体支持体選別及び溶液選別方法を使用して選別することができる。複数の選別方策を用いることができる。例えば、一つの変異は固体に結合した標的での選別を含み、融合ポリペプチド上に存在しうるタグ(例えば抗ｇＤタグ)の選別が続く。別法として、ライブラリは固体表面に結合した標的で先ず選別することができ、溶出した結合体がついで標的抗原の濃度を減少させた溶液相結合を使用して選別される。異なった選別法を併用することにより高度に発現した配列のみの選択の最小化がもたらされ、多くの異なった高親和性クローンの選択をもたらす。
標的抗原に対する高親和性結合体はライブラリから単離することができる。Ｈ１／Ｈ２領域における多様性の制限は約１０４から１０５倍縮重を減少させ、より多くのＨ３多様性を許容することによりより多くの高親和性結合体をもたらす。ＣＤＲＨ３において異なったタイプの多様性を持つライブラリを利用することにより(例えばＤＶＫ又はＮＶＴを利用して)標的抗原の異なったエピトープに結合しうる結合体の単離をもたらす。
【００６６】
上述のプールされたライブラリから単離された結合体において、軽鎖において制限された多様性を提供することによって親和性を更に改善することができることが発見された。軽鎖多様性はこの実施態様では以下のように生成される。ＣＤＲＬ１においては：アミノ酸位置２８がＲＤＴによってコードされる；アミノ酸位置２９がＲＫＴによってコードされる；アミノ酸位置３０がＲＶＷによってコードされる；アミノ酸位置３１がＡＮＷによってコードされる；アミノ酸位置３２がＴＨＴによってコードされる；場合によっては、アミノ酸位置３３がＣＴＧによってコードされる；ＣＤＲＬ２においては：アミノ酸位置５０がＫＢＧによってコードされる；アミノ酸位置５３がＡＶＣによってコードされる；場合によっては、アミノ酸位置５５がＧＭＡによってコードされる；ＣＤＲＬ３においては：アミノ酸位置９１がＴＭＴ又はＳＲＴ又はその両方によってコードされる；アミノ酸位置９２がＤＭＣによってコードされる；アミノ酸位置９３がＲＶＴによってコードされる；アミノ酸位置９４がＮＨＴによってコードされる；アミノ酸位置９６がＴＷＴ又はＹＫＧ又は両方によってコードされる。
【００６７】
他の実施態様では、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３領域に多様性を持つライブラリ又はライブラリ群が作製される。この実施態様では、ＣＤＲＨ３における多様性は様々な長さのＨ３領域を用い、主にコドンセットＸＹＺ及びＮＮＫ又はＮＮＳを用いてつくり出される。ライブラリは個々のオリゴヌクレオチドを使用して形成しプールすることができ、又はオリゴヌクレオチドをプールしてライブラリのサブセットを形成することができる。この実施態様のライブラリは固体に結合した標的に対して選別することができる。多重選別から単離されたクローンをＥＬＩＳＡアッセイを使用して特異性及び親和性についてスクリーニングすることができる。特異性については、クローンを所望の標的抗原並びに他の非標的抗原に対してスクリーニングすることができる。標的ＮＲＰ１抗原に対する結合体をついで溶液結合競合ＥＬＩＳＡアッセイ又はスポット競合アッセイでの親和性についてスクリーニングすることができる。高親和性結合体は上に記載したようにして調製されたＸＹＺコドンセットを使用してライブラリから単離することができる。これらの結合体は抗体又は抗原結合断片として細胞培養物中に高収量で直ぐに産生されうる。
ある実施態様では、ＣＤＲＨ３領域の長さに大なる多様性を持つライブラリを作成することが望まれる場合がある。例えば、約７から１９アミノ酸の範囲のＣＤＲＨ３領域を持つライブラリを作成することが望ましい場合がある。
【００６８】
これらの実施態様のライブラリから単離された高親和性結合体は細菌及び真核生物細胞培養で高収量で直ぐに産生される。ベクターはｇＤタグ、ウイルスコートタンパク質成分配列のような配列を直ぐに除去し、及び／又は定常領域配列に加えて完全長抗体又は抗原結合断片を高収量で生産するように設計することができる。
ＣＤＲＨ３での変異を持つライブラリを、例えばＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１及び／又はＣＤＲＨ２のような他のＣＤＲの変異型を含むライブラリと組み合わせることができる。よって、例えば、一実施態様では、ＣＤＲＨ３ライブラリは予め定まったコドンセットを使用して位置２８、２９、３０、３１、及び／又は３２に変異アミノ酸を持つヒト化４Ｄ５抗体配列の形態において作りだしたＣＤＲＬ３ライブラリと組み合わせられる。他の実施態様では、ＣＤＲＨ３に対する変異のライブラリは変異ＣＤＲＨ１及び／又はＣＤＲＨ２重鎖可変ドメインを含むライブラリと組み合わせることができる。一実施態様では、ＣＤＲＨ１ライブラリは位置２８、３０、３１、３２及び３３に変異アミノ酸を持つヒト化抗体４Ｄ５配列を用いてつくり出される。ＣＤＲＨ２ライブラリは予め定まったコドンセットを使用して位置５０、５２、５３、５４、５６及び５８に変異アミノ酸を持つヒト化抗体４Ｄ５の配列を用いてつくり出すことができる。
【００６９】
(xi) 抗体変異体
ファージライブラリから生成される新規の抗体は、さらに修飾して、親抗体よりも改善した物理学的、化学的及び／又は生物学的特性を有する抗体変異体を生成することができる。使用するアッセイが生物学的活性アッセイである場合、抗体変異体は、選択したアッセイにおいて、該アッセイにおける親抗体の生物学的活性よりも少なくともおよそ１０倍良好な、好ましくは少なくともおよそ２０倍良好な、より好ましくは少なくともおよそ５０倍良好な、時には少なくともおよそ１００倍又は２００倍良好な生物学的活性を有する。例えば、抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体変異体は、親抗体の結合親和性より、少なくともおよそ１０倍強力な、好ましくは少なくともおよそ２０倍強力な、より好ましくは少なくともおよそ５０倍強力な、時には少なくともおよそ１００倍又は２００倍強力な、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢに対する結合親和性を有することが好ましい。
【００７０】
抗体変異体を産生するためには、親抗体の高頻度可変領域の一又は複数中に一又は複数のアミノ酸修飾(例えば置換)が導入される。別法として、又は加えて、フレームワーク領域残基の一又は複数の修飾(例えば置換)を親抗体に導入することができ、これらにより第二の哺乳動物種由来の抗原に対する抗体変異体の結合親和性が改善される。修飾するためのフレームワーク領域残基の例には、抗原に非共有的に結合するもの(Amit等, Science 233:747-753 (1986))；ＣＤＲと相互作用し／そのコンホメーションに影響を及ぼすもの(Chothia等 J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))；及び／又はＶＬ−ＶＨ界面に関与するもの(欧州特許第２３９４００号Ｂ１)が含まれる。ある実施態様では、そのようなフレームワーク領域残基の一又は複数の修飾により第二の哺乳動物種由来の抗原に対する抗原の結合親和性が向上する。例えば、約１から約５のフレームワーク残基を本発明のこの実施態様において修飾することができる。しばしば、これは、高頻度可変領域が何ら改変されていない場合でさえ、前臨床試験に使用するのに適した抗体変異体を生じるのに十分でありうる。しかしながら、通常は、抗体は更なる高頻度可変領域の改変を含む。
【００７１】
改変される高頻度可変領域残基は、特に親抗体の出発結合親和性が、無作為に生産された抗体変異体を直ぐにスクリーニングすることができるものである場合には、無作為に変化させることができる。
そのような抗体変異体を産生するための一つの有用な方法は、「アラニンスキャンニング突然変異誘発法」(Cunningham及びWells Science 244:1081-1085 (1989))と呼ばれる。ここで、高頻度可変領域残基の一又は複数が、第二の哺乳動物種由来の抗原とのアミノ酸の相互作用に影響を及ぼすためにアラニン又はポリアラニンによって置換される。ついで置換に対する機能的感受性を示す高頻度可変領域残基は、置換部位において又はそれに対して更なる又は他の置換を導入することにより洗練される。従って、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、変異の種類自体は予め決める必要はない。このようにして産生されるａｌａ変異体をここに記載したその生物活性についてスクリーニングされる。
通常は、「好ましい置換」の項目名で以下に示されているもののような保存的置換で始める。そのような置換が生物活性(例えば結合親和性)の変化を生じるならば、次の表において「例示的置換」と命名され、又はアミノ酸クラスを参照して以下に更に記載されるより実質的な変化が導入され、産物がスクリーニングされる。
【００７２】
好適な置換：
【００７３】
抗体の生物学的性質の更により実質的な修飾は、(ａ)置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋コンホメーション、(ｂ)標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は(ｃ)側鎖の嵩を維持して、それらの効果において有意に異なる置換基を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいてグループ分けすることができる：
(１)疎水性：ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile；
(２)中性の親水性：cys, ser, thr；
(３)酸性：asp, glu；
(４)塩基性：his, lys, arg；
(５)鎖配向に影響する残基：gly, pro；及び
(６)芳香族：trp, tyr, phe。
【００７４】
非保存的置換は、これらのクラスの一つのメンバーを他のクラスと交換することを必要とする。
他の実施態様では、修飾のために選択された部位がファージディスプレイを使用して亜親和性成熟される(上を参照)。
【００７５】
アミノ酸配列変異体をコードしている核酸分子は当該分野で知られている様々な方法により調製される。これらの方法は、限定されるものではないが、親抗体の先に調製された変異体又は非変異体型のオリゴヌクレオチド媒介(又は部位特異的)突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発を含む。変異体を作製するための好ましい方法は部位特異的突然変異誘発(例えばKunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488 (1985)を参照)である。
ある実施態様では、抗体変異体は単一の高頻度可変領域残基が置換されたものである。他の実施態様では、親抗体の高頻度可変領域残基の２又はそれ以上が置換され、例えば約２から約１０の高頻度可変領域置換である。
【００７６】
通常、改善された生物学的性質を有する抗体変異体は親抗体の重鎖又は軽鎖の何れかの可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を有する。この配列に対する同一性又は類似性は、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入し最大の配列同一性パーセントを達成した後に親抗体残基と同一(つまり同じ残基)又は類似(つまり共通の側鎖特性に基づく同じグループのアミノ酸残基、上を参照)である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセントとしてここで定義される。可変ドメインの外側の抗体配列中へのＮ末端、Ｃ末端、又は内部の伸展、欠失、又は挿入は何れも配列同一性又は類似性に影響を及ぼすものとはみなされない。
抗体変異体の産生後に、親抗体に対するその分子の生物活性が決定される。上に述べたように、これは抗体の結合親和性及び／又は他の生物活性を決定することを含みうる。本発明の好適な実施態様では、抗体変異体のパネルを調製し、抗原ないしその断片に対する結合親和性についてスクリーニングする。この最初のスクリーニングから選択される抗体変異体の一又は複数は場合によっては一又は複数の更なる生物活性アッセイにかけて、結合親和性が向上した抗体変異体が例えば前臨床研究に確かに有用であることが確認される。
【００７７】
このように選択された抗体変異体は、しばしば抗体の意図される用途に応じて更なる修飾を受けることができる。そのような修飾は以下に詳細を記載したもののようなアミノ酸配列の更なる改変、異種ポリペプチドに対する融合及び／又は共有的修飾を含む。アミノ酸配列改変については例示的な修飾を上に詳細に説明した。例えば、抗体変異体の正しいコンホメーションを維持することに関与しない任意のシステイン残基はまた一般にはセリンで置換して、分子の酸化安定性を改善し異常な架橋を防止することができる。逆に、システイン結合を抗体に加えてその安定性をかいぜんすることができる(特に抗体がＦｖ断片のような抗体断片である場合)。他のタイプのアミノ酸変異体は改変されたグリコシル化パターンを有する。これは抗体に見出される一又は複数の糖鎖部分を欠失させ、及び／又は抗体中に存在していない一又は複数のグリコシル化部位を加えることによって達成することができる。抗体のグリコシル化は典型的にはＮ結合又はＯ結合の何れかである。Ｎ結合とはアスパラギン残基の側鎖への糖鎖部分の付着を意味する。トリペプチド配列アスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニン(ここで、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である)がアスパラギン側鎖への糖鎖部分の酵素的付着に対する認識配列である。よって、ポリペプチドにおいてこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると潜在的なグリコシル化部位をつくる。Ｏ結合グリコシル化はヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニン(但し５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンもまた使用できる)への糖Ｎ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つの付着を意味する。抗体へのグリコシル化部位の付加は、それが上述のトリペプチド配列(Ｎ結合グリコシル化部位に対する)の一又は複数を含むようにアミノ酸配列を改変することにより簡便に達成される。改変はまた元の抗体の配列への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加又は置換によって行うこともできる(Ｏ結合グリコシル化部位の場合)。
【００７８】
(xii) 抗体の組換え製造
抗体の組換え製造のために、それをコードする核酸が単離され、さらなるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために、複製可能なベクター中に挿入される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは直ぐに単離され、従来の手法を用いて(例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドを使用することによって)配列決定される。多くのベクターが公的に入手可能である。ベクター成分には、一般に、これらに制限されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる：シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列である(例えば米国特許第５５３４６１５号に記載されており、出典明記によって特別に本明細書中に援用される)。
【００７９】
ここに記載のベクター中のＤＮＡをクローニングあるいは発現させるために適切な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びに桿菌、例えば枯草菌及びバシリ・リチェフォルミス(licheniformis)(例えば、１９８９年４月１２日に公開された ＤＤ２６６７１０に開示されたバシリ・リチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。一つの好適な大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４(ＡＴＣＣ３１４４６)であるが、他の大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ３１５３７)及び大腸菌Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ２７３２５)のような株も好適である。これらの例は限定するものではなく例示的なものである。
【００８０】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア、又は一般的なパン酵母は下等真核生物宿主微生物のなかで最も一般的に用いられる。しかしながら、多数の他の属、種及び菌株も、一般的に入手可能でここで使用できる、例えば、シゾサッカロマイセスポンベ；クルイベロマイセス宿主、例えばＫ.ラクティス、Ｋ．フラギリス(ＡＴＣＣ１２４２４)、Ｋ.ブルガリカス(ＡＴＣＣ１６０４５)、Ｋ．ウィッケラミイ(ＡＴＣＣ２４１７８)、Ｋ.ワルチイ(ＡＴＣＣ５６５００)、Ｋ．ドロソフィラルム(ＡＴＣＣ３６９０６)、Ｋ．サーモトレランス、及びＫ．マルキシアナス；ヤローウィア(ＥＰ４０２２２６)；ピチアパストリス(ＥＰ１８３０７０)；カンジダ；トリコデルマ・リーシア(ＥＰ２４４２３４)；アカパンカビ；シュワニオマイセス、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス；及び糸状真菌、例えばパンカビ属、アオカビ属、トリポクラジウム、及びコウジカビ属宿主、例えば偽巣性コウジ菌及びクロカビが使用できる。
【００８１】
グリコシル化抗体の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウィルス株及び変異体及び対応する許容可能な昆虫宿主細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ(毛虫)、アエデス・アエジプティ(蚊)、アエデス・アルボピクトゥス(蚊)、ドゥロソフィラ・メラノガスター(ショウジョウバエ)、及びボンビクス・モリが同定されている。トランスフェクションのための種々のウィルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ-１変異体とボンビクス・モリ ＮＰＶのＢｍ-５株が公に利用でき、そのようなウィルスは本発明においてここに記載したウィルスとして使用でき、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞の形質転換に使用できる。綿花、コーン、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコのような植物細胞培養を宿主として利用することができる。
【００８２】
しかしながら、脊椎動物細胞におけるものが最も興味深く、培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (ＣＯＳ-７, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１)；ヒト胚腎臓株(２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977))；ハムスター乳児腎細胞(ＢＨＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ, Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980))；マウスのセルトリ細胞(ＴＭ４, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980))；サルの腎細胞 (ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０)；アフリカミドリザルの腎細胞(ＶＥＲＯ-７６, ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７)；ヒト子宮頸癌細胞 (ＨＥＬＡ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ２)；イヌ腎細胞 (ＭＤＣＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４)；バッファローラット肝細胞 (ＢＲＬ３Ａ, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２)；ヒト肺細胞 (Ｗ１３８, ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５)；ヒト肝細胞 (Ｈｅｐ Ｇ２, ＨＢ８０６５)；マウス乳房腫瘍細胞 (ＭＭＴ０６０５６２, ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞(Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982))；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株(ＨｅｐＧ２)である。
宿主細胞は、抗体生産のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された常套的栄養培地で培養される。
【００８３】
本発明の抗体を産生するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ｈａｍ)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地((ＭＥＭ),(シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((ＤＭＥＭ),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979)、Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980)、米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国再発行特許第３０９８５号に記載された何れの培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地には何れもホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【００８４】
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内、細胞膜周辺腔に生成され、又は培地内に直接分泌される。抗体が細胞内に生成された場合、第１の工程として、宿主細胞か溶解された細胞の何れにしても、粒子状の細片が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。抗体が培地に分泌された場合は、そのような発現系からの上清を、一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＰｅｌｌｉｃｏｎの限外濾過装置を用いて濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めて、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製でき、アフィニティクロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる(Lindmark等, J. immunol. Meth. 62: 1-13 (1983))。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている(Guss等, EMBO J. 5: 16571575 (1986))。アフィニティーリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸＴＭ樹脂(J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂上でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭクロマトグラフィー(ポリアスパラギン酸カラム)、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿法も、回収される多価抗体に応じて利用可能である。
【００８５】
Ｄ．ニューロン再生の刺激因子の使用
本発明のスクリーニングアッセイにおいて同定される分子は、神経細胞の生存を亢進するか又は成長を誘導するための薬剤としての使用を発見したと考えられる。したがって、神経系の変性疾患(「神経変性疾患」)、例えば、物理的な損傷(例えば熱傷、損傷)や糖尿病、腎臓機能不全のような疾患状態によって生じる末梢神経損傷、ないしは癌およびエイズを治療するために用いられる化学療法剤の毒作用によって生じる末梢神経損傷；中枢神経系(脊髄索および脳)への物理的な損傷；脳卒中と関係する脳損傷；及び神経変性に関連する神経学的疾患、例えば、三叉神経痛、舌咽神経痛、ベルの麻痺、重症筋無力症、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)、進行性筋萎縮、進行性延髄の遺伝性筋萎縮、ヘルニア状態、破裂性又は脱出性無脊椎ディスク症候群、頸部脊椎症、叢疾患、胸郭出口破壊症候群、鉛によるものなどの末梢性神経障害、ダプソン(dapsone)、チック、ｐｒｏｐｈｙｒｉａ(prophyria)、ギラン-バレー症候群、アルツハイマー病、ハンチントン病又はパーキンソン病の治療に有用である。
本明細書において同定される化合物は、インビトロで神経細胞を培養するための培養液の構成成分としても有用である。
【００８６】
最後に、放射性ヨード、酵素、蛍光体、スピン標識などによって標識される場合、本明細書中のアッセイによって同定される化合物を含む調製物は、競合結合アッセイの標準物質として有用である。
本明細書中の化合物の治療用製剤は、所望の純度を有する同定された化合物(抗体など)を、任意の生理的に許容される担体、賦形剤又は安定剤(上掲のRemington's Pharmaceutical Sciences)と混合することによって、凍結乾燥されたケーキ又は水溶液の形で保存するために調製される。許容範囲内の担体、賦形剤又は安定剤は、使用する用量及び濃度においてレシピエントに非中毒性であり、これらには、バッファ、例えばリン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量(およそ１０未満の残基)のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン、アミノ酸、例として、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン；単糖、二糖および他の炭水化物、例としてグルコース、マンノース又はデキストリン；ＥＤＴＡなどのキレート剤；糖アルコール、例えばマンニトール又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；および／または非イオン性界面活性剤、例えばツイーン、プルロニック又はＰＥＧが含まれる。
【００８７】
インビボ投与のために使用される化合物は、無菌でなければならない。これは、凍結乾燥および還元の前又は後に、濾過滅菌メンブランによる濾過によって容易に達成される。
治療組成物は、無菌のアクセスポートを有する容器、例えば皮下注射針によって突き刺し可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルに入れられてもよい。
【００８８】
本発明のアッセイによって同定される化合物は、場合によって、ＮＧＦ、ＮＴ−３及び／又はＢＤＮＦを含む神経栄養因子と組み合わされてもよいし、共に投与されてもよく、変性神経疾患のための他の従来の治療法と共に用いられうる。
投与経路は既知の方法、例えば静脈内、腹腔内、大脳内、筋肉内、眼球内、動脈内又は病巣内経路による注射又は注入、局所投与、又は後述する徐放系による。
脳内使用では、ボーラス注入が許容されるが、化合物はＣＮＳの流体リザーバへの注入によって連続的に投与されてもよい。化合物は、脳の室に投与されるか、そうでなければＣＮＳ又は髄液内に導入されるのが好ましい。ポンプのような連続投与手段を用いた留置カテーテルによって投与されてもよいし、徐放性媒介物の移植、例えば脳内移植によって投与されてもよい。より詳しくは、化合物は、慢性的に植設されたカニューレにより注入されてもよいし、浸透圧性ミニポンプを活用して慢性的に注入されてもよい。小さい管を介してタンパク質を脳室に供給する皮下ポンプは有用である。非常に高性能のポンプが皮膚により補充されてもよく、それらの運搬速度は外科的介入なしで設置されうる。全体的に移植されたドラッグデリバリーシステムを介する皮下ポンプ装置又は連続的な脳室内注入を伴う好適な投与プロトコール又はデリバリーシステムの例は、ドーパミン、ドーパミンアゴニストおよびコリン作動性アゴニストのアルツハイマー患者及びパーキンソン病の動物モデルへの投与のために用いられるものである。これはHarbaugh, J. Neural Transm. Suppl., 24:271 (1987)；及びDeYebenes, et al., Mov. Disord. 2:143 (1987)に記載されている。
【００８９】
徐放性調製物の適切な例には、マイクロカプセル又はフィルム等の、成形品の形態である半透性ポリマーマトリックスが含まれる。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド(米国特許第３７７３９１９号、欧州特許第５８４８１号)、Ｌ-グルタミン酸とγエチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー(Sidman等, Biopolymers 22:547 (1983))、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート(Langer, et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167；Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98)、エチレン酢酸ビニル（上掲のLanger等）又はポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシ酪酸(欧州特許第１３３９８８号Ａ)が含まれる。また、徐放性組成物には、当然知られている方法によって調製されうるリポソーマルに取り込まれた組成物が含まれる(Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 3688 (1985)；Hwang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980)；米国特許第４４８５０４５号および同第４５４４５４５号；及び欧州特許第１０２３２４号Ａ)。通常、リポソームは、小さい(およそ２００〜８００オングストローム)単層タイプであり、その中の脂質内容物は最適な治療法のために調製された選択割合であるおよそ３０ｍｏｌ％コレステロールより大きい。
【００９０】
治療に使用される活性化合物の有効量は、例えば、治療の目的、投与の手段および患者の状態に依存するであろう。したがって、用量の力価を測定し、最適な治療効果を得るために必要とされるように投与経路を修飾することが治療者に必要であろう。代表的な１日の用量は、前述の因子に応じて、およそ１ｇ／ｋｇから最高１００ｍｇ／ｋｇ以上まででありうる。典型的には、臨床医は、ニューロンの機能が修復、維持、場合によっては再構築される用量に達するまで、活性化合物を投与するであろう。この治療の進行は従来のアッセイによって容易にモニターされる。
本発明の更なる詳細を以下の非限定的実施例によって例示する。
【実施例】
【００９１】
実施例１ 発現クローニングＬＩＬＲＢ２
阻害性ミエリンタンパク質の新規のレセプターを同定するために、発現クローニング法を行った。バイトとして、以下の特徴付けられたミエリンインヒビター(ヒトｃＤＮＡを用いる)のＮ及び／又はＣ末端にアルカリンホスファターゼ(ＡＰ)を融合させたコンストラクトを生成した。Ｎｏｇｏ６６、ＮｏｇｏＡの２つの付加的阻害ドメイン(ＮｉＲ<ｄｅｌｔａ>Ｄ２及びＮｉＧ<ｄｅｌｔａ>２０)(Oertle T, J Neurosci. 2003, 23(13): 5393-406)、ＭＡＧ及びＯＭｇｐ。バイトタンパク質を含む条件培地(ＤＭＥＭ／２％ＦＢＳ中)を生産するために、２９３細胞にこれらのコンストラクトを形質移入した。スクリーニングに用いるｃＤＮＡライブラリは、完全長ヒトｃＤＮＡクローンを含む、Origeneによって生成される発現容易(expression-ready)ベクターを含む。これらのｃＤＮＡを収集し、配列し、プールした。およそ１００のｃＤＮＡのプールは、ＣＯＳ７細胞に過渡的に形質移入した。
【００９２】
具体的には、１日目に、ＣＯＳ７細胞を、１２ウェルプレートの１ウェル当たり８５０００細胞の密度でプレートに播いた。２日目に、１ウェル当たり１ｍｇのプールされたｃＤＮＡを、脂質ベースの形質移入試薬ＦｕＧＥＮＥ６(Roche)を用いて形質移入した。４日目に、スクリーニングを行った。簡単に言うと、細胞から培養液を取り除き、ＡＰ融合バイトタンパク質(２０〜５０ｎＭ)を含む０．５ｍｌの２９３細胞条件培地に置き換えた。細胞を９０分間、室温でインキュベートした。次いで、リン酸塩緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)にて細胞を３回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドにて７分間固定し、ＨＥＰＥＳ-緩衝生理食塩水(ＨＢＳ)にて３回洗浄し、９０分間、６５℃で熱不活性化して内在性ＡＰ活性を破壊した。ＡＰバッファ(１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ トリスｐＨ９．５)にて細胞を１℃洗浄し、色素生産性基質(Western Blue, Promega)中でインキュベートし、インキュベートの１時間後と終夜インキュベートした後に再度、反応生成物の存在について分析した。膜の表面にかけて濃い青の沈殿物があることによってポジティブ細胞を同定した。ポジティブプールを更に破壊して、後のラウンドのスクリーニングによって個々のポジティブクローンを同定した。
【００９３】
スクリーニングから、以下のポジティブクローンが同定された。
ＭＡＧ−ＡＰバイトにより４つのポジティブクローンを得た。１つは既に特徴付けられているＮｏｇｏレセプターであった(Fournier et al., Nature 409, 342-346 (2001)。これらのヒットクローンのうちの２つは、糖分解処理酵素であって、関連しそうにないと考えられた。４つ目を「クローン６４３(ＬＯＣ57228)、ｍＲＮＡからのホモサピエンス推定タンパク質」と注記した。ｃＤＮＡの更なる分析により、既に記載されているタンパク質ＳＭＡＧに相同なオルターナティブＯＲＦが明らかとなった。
ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６バイトにより２つのポジティブクローンが得られた。１つは既に特徴付けられているＮｏｇｏレセプターであった。他方は「ホモサピエンス白血球免疫グロブリン様レセプター、サブファミリＢ(ＴＭおよびＩＴＩＭドメインを有する)、メンバー２(ＬＩＬＲＢ２)、ｍＲＮＡ」(配列番号：２)であった。この遺伝子もまた、ＭＩＧ１０、ＩＬＴ４及びＬＩＲ２などの複数の代替的な命名法で知られている(Kubagawa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:5261-6 (1997)；Colonna et al., J. Exp. Med. 186: 1809-18 (1997))。
【００９４】
実施例２ ＰｉｒＢ及びＬＩＬＲＢ２を結合するＡＰ−Ｎｏｇｏ６６
Ｎｏｇｏ６６のＬＩＬＲＢ２(配列番号：２)への結合を確認するために、そして、Ｎｏｇｏ６６がマウスオルソログＰｉｒＢ(配列番号：１)に結合するか否かを試験するために、実施例１に記載のものと類似の結合アッセイを行った。簡単に言うと、ＣＯＳ７細胞にＰｉｒＢ、ＬＩＬＲＢ２又はポジティブコントロールとしてＮｇＲをコードするｃＤＮＡを形質移入した。形質移入の４８時間後に、細胞をＡＰ−Ｎｏｇｏ６６を含む２９３細胞条件培地と共に９０分間、室温でインキュベートした。細胞を広範囲に洗浄し、固定して、内在性ＡＰ活性を熱失活によって中和した。次いで、細胞を色素生産性基質(Western Blue, Promega)と反応させた。
図１に示すように、ＰｉｒＢ−発現細胞及びＬＩＬＲＢ２−発現細胞の両方において強力なポジティブシグナルが検出された。
【００９５】
実施例３ ＰｉｒＢおよびＬＩＬＲＢ２を結合するＭＡＧ
ＭＡＧもＰｉｒＢおよびＬＩＬＲＢ２を結合するか否かを試験するために、ＭＡＧ−ＡＰより生理活性があると考えられるＭＡＧ−Ｆｃを用いて結合アッセイを行った。ＣＯＳ７細胞にＰｉｒＢ、ＬＩＬＲＢ２又はポジティブコントロールとしてｍＳＭＡＧＰをコードするｃＤＮＡを形質移入した。形質移入の４８時間後に、細胞をＭＡＧ−Ｆｃを含む２９３細胞条件培地と共に９０分間、室温でインキュベートした。ハンクの緩衝生理食塩水溶液(ＨＢＳＳ)にて細胞を４回洗浄し、２％パラホルムアルデヒドにて５分間固定し、ＨＢＳＳにて４回洗浄して、１０％熱不活性化ヤギ血清(ＨＩＧＳ)を含むＨＢＳＳにて１５分間かけてブロックした。次いで、細胞を抗ヒトＦｃ抗体(１:５００、Jackson Immunochemicals)と共に１時間インキュベートし、１０％ＨＩＧＳを含むＰＢＳにて洗浄し、そして、二次抗体(ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５６８−コンジュゲートヤギ抗マウス、Molecular Probes)と共にインキュベートした。細胞をＰＢＳにて洗浄し、カバーガラスで覆い、逆蛍光顕微鏡を用いて免疫蛍光を検出した。
結果を図２に示す。コントロール細胞と比較して、ＰｉｒＢ−発現細胞およびＬＩＬＲＢ２−発現細胞は、ＭＡＧ−Ｆｃへの結合を示す。この実施例において、ｍＳＭＡＧＰ発現細胞は結合のためのポジティブコントロールとした。
【００９６】
実施例４ 神経系において発現されるＰｉｒｂＢ
ＰｉｒＢが神経系において発現されるか否かを試験するために、異なる神経組織から単離されたｍＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。Ｐ７小脳、Ｐ１０後根神経節(ＤＲＧ)、成体脳および成体脾臓(ポジティブコントロール)を、ＣＤ１マウスから解剖し、ＲＮＡｌａｔｅｒ(Ambion)に直ちに配置した。ｍＲＮＡは、ＲＮＥａｓｙ単離キット(Qiagen)を用いて抽出した。InvitrogenのスーパースクリプトＩＩＩファーストストランド合成システムを用いてｍＲＮＡからｃＤＮＡを生成した。次いで、ＰｉｒＢに特異的なプライマー5'TGAAGGCTCTCATTGGAGTGTCTG3'(配列番号：２０)及び5'GGCATAGGTCACATCCTGGGAC3'(配列番号：３)、ＰｉｒＡサブファミリの異なるメンバーと交差反応するプライマー(5'GTCTCAGAAACCATTGAATCC3'(配列番号：４)及び5'GACAGAAAACTTTGGGTCATCAG3'(配列番号：５))、又はマウスＳＭＡＧＰに特異的なプライマー(5'CCCTCAGCAACGATGAACAACC3'(配列番号：６)及び5'TGGACCCTGGAGTCAGTGATTC3'(配列番号：７))と用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行った。
図３に示すように、ＲＴ−ＰＣＲ分析により、ＰｉｒＢ及びＰｉｒＡアイソフォームの両方は小脳、ＤＲＧおよび脳において検出されることが明らかとなった。
【００９７】
実施例５ インサイツハイブリダイゼーション結果
より詳細にＰｉｒＢの神経系発現を分析するために、インサイツハイブリダイゼーションを行った。成体又は出生後のマウスを灌流し、その後脳およびＤＲＧを取り出し、終夜固定した。その後、組織を３０％スクロースにおいて低温保護し、包埋して、Ｏ.Ｃ.Ｔ化合物(Tissue-Tek)にて凍結させた。凍結組織を１２ミクロン厚に切断した。製造業者のプロトコールに従って、ＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔインビトロ転写キット(Ambion)を使用して放射性プローブを調製した。製造業者のプロトコールに従って、mRNAlocator ISHキット(Ambion)を用いてインサイツハイブリダイゼーションを行った。
ＰｉｒＢプローブは、ＰｉｒＢに特有の膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインに存在する、ヌクレオチド＃１９２２−２３８５にハイブリダイズするように設定した。この領域を増幅するために使用するプライマーは、5'TGAAGGCTCTCATTGGAGTGTCTG3'(配列番号：８)および5'GGCATAGGTCACATCCTGGGAC3'(配列番号：９)とした。４６４ｂｐの断片を、ｐＣＲＩＩ-ＴＯＰＯ(Invitrogen)にクローニングした。
インサイツハイブリダイゼーションの結果を図４Ａ−４Ｃに示す。ポジティブハイブリダイゼーションシグナルは、皮質の全体、海馬、小脳、及びＤＲＧの細胞において観察される。
【００９８】
実施例６ 軸索成長のＮｏｇｏ６６阻害と小脳顆粒ニューロンのＰｉｒＢ ＥＣＤによるそのレスキュー
この実施例では、Ｎｏｇｏ６６の軸索成長を阻害する能力を確認した。さらに、ＰｉｒＢ細胞外ドメインコンストラクトを、Ｎｏｇｏ６６阻害活性干渉能について試験した。
ヒト胎盤アルカリホスファターゼ(ＡＰ)遺伝子の下流のＮｏｇｏＡの６６アミノ酸阻害性ループをクローニングしてＡＰ−Ｎｏｇｏ６６を生成した。コンストラクトのＮ末端をＦＬＡＧタグ化して精製可能にし、ｐＲＫベクター主鎖(Genentech)に挿入した。ＰｉｒＢ細胞外ドメイン(ＥＣＤ)タンパク質を生成するために、ＰｉｒＢのアミノ酸＃１−６３８を、ｐＲＫ発現ベクター内の、８-Ｈｉｓタグ(ＰｉｒＢＨｉｓ)又はヒトＦｃ(ＰｉｒＢＦｃ)の上流にクローニングした。これらの発現コンストラクトを、ＣＨＯ細胞に過渡的に形質移入し、分泌されたタンパク質を親和性クロマトグラフィによって条件培地から精製した。
【００９９】
小脳顆粒ニューロン(ＣＧＮ)をＰ７ ＣＤ１マウスから単離し、阻害アッセイのために、固定したＡＰ−Ｎｏｇｏ６６タンパク質上で培養した。簡単に言うと、ポリ−Ｄ−リジン(Biocoat, Becton Dickinson)にて予めコートした９６ウェルプレートを、組み換えＡＰ−Ｎｏｇｏ６６(１８０又は３００ｎｇ／３ｕｌスポット)にてスポットした。ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６単独でコートし、過剰量のＰｉｒＢＦｃ(８５０ｎｇ／３ｕｌスポット)又はＰｉｒＢＨｉｓ(１０００ｎｇ／３ｕｌスポット)のいずれかと混合した。これにより、２〜４倍モル過剰量のＰｉｒＢ ＥＣＤを含むスポットとなった。スポットしたタンパク質を２時間かけて付着させ、その後、プレートを１０ｕｇ／ｍｌのラミニン(Invitrogen)にて処理した。Zheng et al., 2005に記載されているように、マウスＰ７小脳細胞を調製し、２×１０４細胞／ウェルの濃度でプレートに播いた。培養物を３７℃で２２時間インキュベートし、４％パラホルムアルデヒド／４％スクロースにて固定し、抗チューブリン抗体(ＴｕＪ1、Covance)にて染色した。画像は、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ撮像システム(Molecular Devices)にて撮影した。
図６に示すように、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６はＰ７小脳ニューロンからの軸索成長を強力に阻害する。ＰｉｒＢＦｃ又はＰｉｒＢＨｉｓのいずれであっても、過剰量のＰｉｒＢ ＥＣＤの存在により、この阻害は有意に低減された。他のコントロールタンパク質(Ｆｃ又はＲｏｂｏ４Ｆｃ)とＡＰ−Ｎｏｇｏ６６の混合では阻害は低減しなかった。
【０１００】
実施例７ ＰｉｒＢ及びＮｇＲの同時免疫沈降
この実験は、インビトロで宿主細胞中で同時に発現した場合の、ＰｉｒＢとＮｇＲの関係及び潜在的相互作用を調べるものである。
コントロールベクター、完全長ＰｉｒＢ又は完全長ＰｉｒＢと完全長ＮｇＲとの混合をＣＯＳ７細胞に過渡的に形質移入した。形質移入の４８時間後に、細胞溶解バッファ(Cell Signaling Technology)にて細胞を溶解し、可溶化液を抗ＰｉｒＡ／Ｂ(6C1, Pharmingen)を用いて免疫沈降した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて試料を分離し、ニトロセルロースに転写させ、抗ＮｇＲ(Alpha Diagnostics International)にて検索した。
図７に示すように、ＮｇＲはＰｉｒＢと完全に同時に沈降した(左のパネル)。右のパネルは、抗ＮｇＲにてイムノブロットした総細胞可溶化液からの総タンパク質を示す。異なる程度にグリコシル化されてプロセシングされたＮｇＲを表す複数のバンド(矢印)が観察される。
【０１０１】
実施例８ Ｎｏｇｏ６６軸索成長阻害活性を干渉するためのＰｉｒＢ抗体とその使用
この実験では、ＰｉｒＢに対する抗体を、軸索成長のＮｏｇｏ６６誘導性阻害を干渉する能力について試験した。
小脳顆粒ニューロン(ＣＧＮ)をＰ７ ＣＤ１マウスから単離し、前記の実施例に記載したように、阻害アッセイのために固定したＡＰ−Ｎｏｇｏ６６タンパク質上で培養した。基本的にLiang et al., J. Mol. Biol. 366(3): 815-819 (2006)(出典明記によって本明細書中に援用される)に記載されるように、機能−遮断抗体は、ヒト合成抗体ファージライブラリに対してＰｉｒＢ ＥＣＤをスクリーニングすることによって生成した。ＰｉｒＢへのＡＰ−Ｎｏｇｏ６６の結合との競合能についてクローンを選択した。この実験では、抗ＰｉｒＢ又はコントロール抗体をＡＰ−Ｎｏｇｏ６６にて生育させたニューロンと共にインキュベートした。図８に示すように、抗ＰｉｒＢ抗体によりＡＰ−Ｎｏｇｏ６６による阻害が有意に減少した。
【０１０２】
開示内容の全体にわたってすべての参考文献は、その全体が出典明記によって特別に援用される。
本発明は、特定の実施態様であるために考慮されることに関して記載されているが、本発明がこのような実施態様に限定されると解されるものではない。反対に、本発明は、添付の特許請求の範囲と精神に包含される多くの変更と等価物を包含することを意図する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に神経発達および神経学的疾患に関する。本発明は特に、ミエリン関連阻害システムの新しい活性調節因子およびそのように同定された活性調節因子の様々な使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミエリンおよびミエリン関連タンパク質
成人哺乳類のＣＮＳニューロンの軸索が有する損傷後の再生能力は非常に限られているが、末梢神経系(ＰＮＳ)の軸索は急速に再生することは知られている。ＣＮＳニューロンの限られた再生能は、ある程度ＣＮＳ軸索の本質的な性質であるが、許容できない環境によるものでもある。神経突起成長の阻害の原因となるの唯一の源ではないが、ＣＮＳミエリンは、活発に軸索成長をブロックすることによって再生を有意に障害する多数の阻害性分子を含む。このような３つのミエリン関連タンパク質(ＭＡＰ)が同定された。Ｎｏｇｏ(別名ＮｏｇｏＡ)は、２つの膜貫通領域を有するＲｅｔｉｃｕｌｏｎファミリのタンパク質のメンバーであり、ミエリン関連糖タンパク質(ＭＡＧ)は、Ｉｇスーパーファミリの膜貫通タンパク質であり、そして、ＯＭｇｐは、グリコシルホスファチジルイノシトール(ＧＰＩ)アンカーを有するロイシン豊富な繰り返し(ＬＲＲ)タンパク質である。Chen et al., Nature 403:434-39 (2000)；GrandPre et al., Nature 417:439-444 (2000)；Prinjha et al., Nature 403:383-384 (2000)；McKerracher et al, Neuron 13:805-11 (1994)；Wang et al, Nature 417:941-4 (20020：Kottis et al J. Neurochem 82:1566-9 (2002)。ＮｏｇｏＡの一部であるＮｏｇｏ６６は、Ｎｏｇｏの３つすべてのアイソフォームに見られる６６-アミノ酸細胞外ポリペプチドとして記載されている。
それらの構造的相違にもかかわらず、３つすべての阻害性タンパク質(Ｎｏｇｏ６６も)は、Ｎｏｇｏレセプター(ＮｇＲ；別名Ｎｏｇｏレセプター-１又はＮｇＲ1)と称する同じＧＰＩアンカーレセプターを結合することが示されており、ＮｇＲがＮｏｇｏ、ＭＡＧおよびＯＭｇｐの阻害性作用を媒介するために必要かもしれないことが提唱されている。Fournier et al., Nature 409:34`-346 (2001)。２つのＮｇＲ１ホモログ(ＮｇＲ２およびＮｇＲ３)も同定されている。２００５年３月３日に公開の米国公開２００５／００４８５２０Ａ１(Strittmatter et al.)。ＮｇＲがＧＰＩアンカー細胞表面タンパク質であるとすると、ＮｇＲは直接のシグナル伝達因子ではなさそうである(Zheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:1205-1210 (2005))。ニューロトロフィンレセプターｐ７５ＮＴＲがＮｇＲのコレセプターとして作用し、レセプター複合体のシグナル変換成分を提供することが示唆された(Wang et al., Nature 420:74-78 (2002)；Wong et al., Nat. Neurosci. 5:1302-1308 (2002))。
【０００３】
しかしながら、ＮｇＲ／ｐ７５ＮＴＲレセプター複合体の近年の研究では、ミエリン関連阻害性システムでのＮｇＲの役割についての疑問が持ち上がっている。Zheng等は、ＮｇＲの遺伝子欠損によりインビトロの神経突起阻害が低減されない、又はインビボの皮質脊髄路(ＣＳＴ)再生が促されることを示した。上掲のZheng et al. (2005)。これらの結果と一致して、他の研究でも、ＮｇＲ変異マウスにおけるＣＳＴの再生の任意の亢進も検出されなかった。Kim et al., Neuron 44:439-451 (2004)。これらの所見は、ＮｇＲ／ｐ７５ＮＴＲレセプター複合体が複数の阻害性シグナルの重要なポイントであるという仮説と矛盾する。ＮｇＲ変異マウスにおいてＣＳＴ再生が欠失していることは、Ｎｏｇｏ６６／ＮｇＲ相互作用のペプチドアンタゴにするによって処置された野生型動物で観察されるＣＳＴ再生と対照的である(GrandPre et al. Nature 417:5470551 (2002)、及びLi and Strittmatter, Nature 23:4219-4227 (2002))。他の研究では、ＮｇＲのドミナントネガティブな断片が発現されると、限定的な損傷とあわせて視覚神経軸索の再生が亢進されることが示されている。両拮抗性ペプチドが他の阻害性リガンド／レセプターを干渉する能力を有するので、両実験はＮｇＲの関与を直接試験することができなかった。
これらの実験結果との不一致は、ＮｇＲ又はＮｇＲ／ｐ７５ＮＴＲレセプター複合体がＣＮＳ再生のミエリン関連阻害において限られた役割を果たすかもしれないこと、そして更なるレセプターないしは結合パートナーなどの他の構成成分が阻害性シグナルの伝達に関与するかもしれないことを強く示唆する。
【０００４】
ＰｉｒＢおよびヒトのオルソログ
主要組織適合性複合体(ＭＨＣ)クラスＩは、最初は、免疫系に重要である分子のファミリをコードする領域として同定された。近年の所見では、ＭＨＣクラスＩ分子が発生および成体ＣＮＳにおいて更なる機能を有することが示されている。Boulanger and Shatz, Nature Rev Neurosci. 5:521-531 (2004)；２００３年９月１１日に公開の米国公開２００３／０１７０６９０(Shatz and Syken)。ＭＨＣクラスＩメンバーおよびそれらの結合パートナーの多くは、ＣＮＳニューロンにおいて発現されることが明らかとされている。近年の遺伝的及び分子的研究は、ＣＮＳ ＭＨＣクラスＩの生理学的機能に注目したものであり、最初の結果では、ＭＨＣクラスＩ分子が、既存のシナプス関係の強度がニューロン活性に応答して増加又は減少して回路に長期間の構造的変更が生じるプロセスである、活性依存性のシナプス可塑性に関与しているかもしれないことが示唆された。さらに、ＭＨＣクラスＩコード領域はまた、神経学的症状を有する多種多様な疾患と遺伝的に関連しており、ＭＨＣクラスＩ分子の異常な機能は正常な脳発達および可塑性の破壊につながると考えられる。
【０００５】
免疫環境の公知のＭＨＣクラスＩレセプターのうちの１つは、Kubagawa et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 94:5261-6 (1997)によって最初に記述されたマウスのポリペプチドであるＰｉｒＢである。マウスＰｉｒＢはいくつかのヒトのオルトログを有し、これらのオルトログは白血球免疫グロブリン様レセプター、サブファミリＢ(ＬＩＬＲＢ)のメンバーであって、また、「免疫グロブリン様転写産物」(ＩＬＴ)とも称される。ヒトのオルトログは、以下の順でマウスの配列に有意な相同性を示す。(高い方から順に挙げる)ＬＩＬＲＢ３／ＩＬＴ５、ＬＩＬＲＢ１／ＩＬＴ２、ＬＩＬＲＢ５／ＩＬＴ３、ＬＩＬＲＢ２／ＩＬＴ４、そして、ＰｉｒＢがすべての阻害性レセプターである。ＬＩＬＲＢ３／ＩＬＴ５(ＮＰ＿００６８５５)およびＬＩＬＲＢ１／ＩＬＴ２(ＮＰ＿００６６６０)は、Samaridis and Colonna, Eur. J. Immunol. 27(3): 660-665 (1997)によって最初に記載された。ＬＩＬＲＢ５／ＩＬＴ３(ＮＰ＿００６８３１)は、Borges et al., J. Immunol. 159(11): 5192-5196 (1997)によって同定された。ＬＩＬＲＢ２／ＩＬＴ４(別名ＭＩＲ１０)は、Colonna et al., J. Exp. Med. 186: 1809-18 (1997)によって同定された。ＰｉｒＢおよびそのヒトのオルトログは、大きな構造的多様性を示す。様々なオルターナティブスプライス型の配列はＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋから入手可能であり、例えば、ヒトＩＬＴ４ ｃＤＮＡのための以下の受託番号を含む。ＩＬＴ４−ｃ１１ ＡＦ００９６３４；ＩＬＴ４−ｃ１１７ ＡＦ１１５６６；ＩＬＴ４−ｃ１２６ ＡＦ１１５６５。上記したように、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢポリペプチドはＭＨＣクラスＩ(ＭＨＣＩ)阻害性レセプターであり、免疫細胞活性化を制御する際の役割が知られている(Kubagawa et al., supra; Hayami et al., J. Biol. Chem. 272:7320 (1997)；Takai et al., Immunology 115:433 (2005)；Takai et al., Immunol. Rev. 181: 215 (2001)；Nakamura et al. Nat. Immunol. 5:623 (2004)；Liang et al., Eur. J. Immunol. 32:2418 (2002))。
【０００６】
Syken等(Science 313:1795-800 (2006))による近年の研究では、ＰｉｒＢが脳の全体にわたってニューロンのサブセットにおいて発現されていると報告した。機能的ＰｉｒＢを欠いている変異マウスにおいて、皮質の眼優位(ＯＤ)可塑性はすべての年齢で有意に亢進されており、これは、視覚皮質の活性依存的な可塑性の制限におけるＰｉｒＢの機能を示唆する。
本発明は、少なくとも一部が、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢがＮｏｇｏ(Ｎｏｇｏ６６)及びＭＡＧの結合パートナーであること、そしてＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストとＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ活性の低減によりミエリン関連の阻害系経路が効果的に破壊され、これによってニューロンの再生が促されるという驚くべき発見に基づく。
【発明の概要】
【０００７】
ある態様では、本発明は、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢとミエリンないしはミエリン関連タンパク質又はその断片とを含むレセプター複合体に候補薬剤を接触させ、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢとミエリン関連タンパク質又はその断片との相互作用を阻害する該候補薬剤の能力を検出することを含み、このとき相互作用が阻害される場合に該候補薬剤がアンタゴニストとして同定される、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストを同定するための方法に関する。
一実施態様では、検出される相互作用は結合である。
他の実施態様では、検出される相互作用は細胞性シグナル伝達である。
更なる実施態様では、細胞性シグナル伝達により軸索の成長又はニューロンの再生が阻害される。
なお更なる実施態様では、ミエリン関連タンパク質は、Ｎｏｇｏ、ＭＡＧ、ＯＭｇｐおよびこれらの断片からなる群から選択される。
他の実施態様では、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢは、ヒトのＬＩＬＲＢタンパク質、例えばＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ３又はＬＩＬＲＢ５である。
ある具体的に実施態様では、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢは、ＬＩＬＲＢ２、転写産物変異体１(配列番号：２)、ＬＩＬＲＢ２、転写産物変異体２(配列番号：１４)、ＬＩＬＲＢ１、転写産物変異体１(配列番号：１０)、ＬＩＬＲＢ１、転写産物変異体２(配列番号：１１)、ＬＩＬＲＢ１、転写産物変異体３(配列番号：１２)、ＬＩＬＲＢ１、転写産物変異体４(配列番号：１３)、ＬＩＬＲＢ３、転写産物変異体１(配列番号：１５)、ＬＩＬＲＢ３、転写産物変異体２(配列番号：１６)、ＬＩＬＲＢ５、転写産物変異体１(配列番号：１７)、ＬＩＬＲＢ５、転写産物変異体２(配列番号：１８)およびＬＩＬＲＢ５、転写産物変異体３(配列番号：１９)からなる群から選択される。
更なる実施態様では、複合体はさらにＮｇＲを含む。
【０００８】
異なる実施態様では、候補薬剤は、抗体、ポリペプチド、ペプチド、核酸、小有機分子、多糖およびポリヌクレオチドからなる群から選択され、好ましくは抗体又は短い干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)である。抗体は、ＬＩＲＢ２などのＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢを特異的に結合するのが好ましく、キメラ、ヒト化、ヒトの抗体および抗体断片が含まれるが、これに限定されるものではない。
特定の実施態様では、抗体断片は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'およびＦ(ａｂ')２断片からなる群から選択される。
更なる実施態様では、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢおよびミエリンないしはミエリン関連タンパク質又はその断片の少なくとも一は固定されている。
【０００９】
なお更なる実施態様では、アッセイは細胞に基づくアッセイである。
具体的な実施態様では、細胞に基づくアッセイは、ミエリンないしはミエリン関連タンパク質又はその断片と神経細胞とを候補薬剤の存在下及び非存在下にて培養し、神経突起長の変化を決定することを含み、このとき神経突起長が該候補薬剤の存在下において長い場合に、該候補薬剤がアンタゴニストとして同定される。
上記の細胞に基づくアッセイでは、神経細胞は、原発性ニューロンであってもよいし、例えば、胎仔の幹(ＥＳ)細胞などの幹細胞を含む細胞又は細胞株から得てもよい。他の実施態様では、ニューロンは、例えば、小脳顆粒ニューロン、後根神経節ニューロンおよび皮質ニューロンからなる群から選択される。
一実施態様では、上記の方法はさらに、神経突起の成長を亢進し、および／またはニューロンの成長、修復及び／又は再生を促すために、同定されたアンタゴニストを使用する工程を含む。
他の実施態様では、上記の方法はさらに、神経突起成長の亢進、ニューロンの成長、修復又は再生の促進から利益を得る疾患又は症状を有する被検体に、同定されたアンタゴニストが投与される工程を含む。前記の疾患又は症状は、例えば、物理的に損傷された神経に特徴がある神経学的疾患であってもよいし、又は、物理的な損傷によって生じる末梢神経損傷、糖尿病；中枢神経系への物理的な損傷；脳卒中に関連した脳損傷、三叉神経痛、舌咽神経痛、ベルの麻痺、重症筋無力症、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)、進行性筋萎縮、進行性延髄の遺伝性筋萎縮、ヘルニア状態、破裂性及び脱出性無脊椎ディスク症候群、頸部脊椎症、叢疾患、胸郭出口破壊症候群、末梢性神経障害、ｐｒｏｐｈｙｒｉａ(prophyria)、ギラン-バレー症候群、アルツハイマー病、ハンチントン病およびパーキンソン病からなる群から選択されてもよい。
【００１０】
他の態様では、本発明は、本明細書中の方法のいずれかによって同定された薬剤に関する。
ある実施態様では、薬剤は、抗体、ポリペプチド、ペプチド、核酸、小有機分子、多糖およびポリヌクレオチドからなる群から選択され、好ましくは抗体又は短い干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)である。
更なる態様では、本発明は、ニューロン再生の刺激のための、本明細書中の方法によって同定された薬剤を含有してなる組成物に関する。
なお更なる態様では、本発明は、本明細書中の方法によって同定された薬剤とニューロンの再生のための指示とを具備するキットに関する。
更に他の態様では、本発明は、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストを同定するための、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢおよびミエリンないしはミエリン関連タンパク質又はその断片の複合体の使用に関する。
【００１１】
異なる態様では、本発明は、神経突起成長の亢進、ニューロンの成長、修復又は再生の促進から利益を得る疾患又は症状の治療ための医薬の調製におけるＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストの使用に関する。
他の態様では、本発明は、神経学的疾患の治療のための医薬の調製におけるＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストの使用に関し、該神経学的疾患は、物理的に損傷された神経に特徴があってもよいし、又は、物理的な損傷によって生じる末梢神経損傷、糖尿病；中枢神経系への物理的な損傷；脳卒中に関連した脳損傷、三叉神経痛、舌咽神経痛、ベルの麻痺、重症筋無力症、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)、進行性筋萎縮、進行性延髄の遺伝性筋萎縮、ヘルニア状態、破裂性及び脱出性無脊椎ディスク症候群、頸部脊椎症、叢疾患、胸郭出口破壊症候群、末梢性神経障害、ｐｒｏｐｈｙｒｉａ(prophyria)、ギラン-バレー症候群、アルツハイマー病、ハンチントン病およびパーキンソン病からなる群から選択されてもよい。
更なる態様では、本発明は、神経突起成長の亢進、ニューロンの成長、修復又は再生の促進から利益を得る疾患又は症状の治療に使用するためのＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストに関する。
なお更なる態様では、本発明は、神経学的疾患の治療に使用するためのＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストであって、該神経学的疾患が上記のものである、アンタゴニストに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６と共にインキュベートした後の形質移入ＣＯＳ細胞に対するアルカリホスファターゼを示す。ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６はＰｉｒＢ及びＬＩＬＲＢ２を結合する。
【図２】ＭＡＧ−Ｆｃと共にインキュベートした後の形質移入ＣＯＳ細胞に対する免疫反応を示す。ＭＡＧはＰｉｒＢおよびＬＩＬＲＢ２を結合する。
【図３】神経系の様々な部位におけるＳＭＡＧＰ、ＰＡＮ−ＰｉｒＡ及びＰｉｒＢの発現を示すＲＴ−ＰＣＲ結果を示す。
【図４】成体前脳(Ａ)、成体小脳(Ｂ)およびＰ１０後根神経節(Ｃ)におけるＰｉｒＢの発現をインサイツハイブリダイゼーションによって確認する。
【図５】マウスＰｉｒＢアミノ酸配列(配列番号：１)およびヒトＬＩＬＲＢ２、転写産物変異体１アミノ酸配列(配列番号：２)を示す。
【図６】軸索成長のＮｏｇｏ６６阻害と、ＰｉｒＢ ＥＣＤ(ＰｉｒＢＦｃ及びＰｉｒＢＨｉｓの両方)によるこの阻害の逆転を示す。小脳顆粒ニューロンをこのアッセイに用いた。
【図７】ＰｉｒＢ及びＮｇＲの同時免疫沈降を示す。ＮｇＲはＰｉｒＢと同時に完全に沈降される(左のパネル)。右のパネルは、抗ＮｇＲによりイムノブロットした総細胞可溶化液からの総タンパク質を示す。複数のバンド(矢印)は、グリコシル化により様々な程度に処理されたＮｇＲを表す。
【図８】軸索成長のＮｏｇｏ６６阻害は、小脳顆粒ニューロンにおいて抗ＰｉｒＢ抗体によって部分的に戻ることを示す。
【図９】ＬＩＬＲＢ１、転写産物変異体１(配列番号：１０)のアミノ酸配列を示す。
【図１０】ＬＩＬＲＢ１、転写産物変異体２(配列番号：１１)のアミノ酸配列を示す。
【図１１】ＬＩＬＲＢ１、転写産物変異体３(配列番号：１２)のアミノ酸配列を示す。
【図１２】ＬＩＬＲＢ１、転写産物変異体４(配列番号：１３)のアミノ酸配列を示す。
【図１３】ＬＩＬＲＢ２、転写産物変異体２(配列番号：１４)のアミノ酸配列を示す。
【図１４】ＬＩＬＲＢ３、転写産物変異体１(配列番号：１５)のアミノ酸配列を示す。
【図１５】ＬＩＬＲＢ３、転写産物変異体２(配列番号：１６)のアミノ酸配列を示す。
【図１６】ＬＩＬＲＢ５、転写産物変異体１(配列番号：１７)のアミノ酸配列を示す。
【図１７】ＬＩＬＲＢ５、転写産物変異体２(配列番号：１８)のアミノ酸配列を示す。
【図１８】ＬＩＬＲＢ５、転写産物変異体３(配列番号：１９)のアミノ酸配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（発明のの詳細な説明）
Ａ．定義
「対免疫グロブリン様レセプターＢ(paired-immunoglobulin-like receptor B)」及び「ＰｉｒＢ」なる用語は本明細書において交換可能に用いられ、配列番号：１(図５)(ＮＰ＿０３５２２５)の天然配列８４１アミノ酸マウス阻害性タンパク質、及びラット及び他の非ヒト動物のその天然配列のホモログを指し、オルタナティブスプライス転写変異体及び対立変異体及びアイソフォーム、並びにその可溶性形態などのすべての天然に生じる変異体を含む。
「ＬＩＬＲＢ」、「ＩＬＴ」および「ＭＩＲ」なる用語は本明細書において交換可能に用いられ、ヒトの「白血球免疫グロブリン様レセプター、サブファミリＢ」のすべてのメンバーを指し、オルタナティブスプライス転写変異体及び対立変異体及びアイソフォーム、並びにその可溶性形態などのすべての天然に生じる変異体を含む。このファミリー内の個々のメンバーは、例えばＬＩＬＲＢ３／ＩＬＴ５、ＬＩＬＲＢ１／ＩＬＴ２、ＬＩＬＲＢ５／ＩＬＴ３及びＬＩＲＢ２／ＩＬＴ４など、頭字語の後に数を付して表し、特に断らない限り、任意の個々のメンバーを指す称号には、オルタナティブスプライス転写変異体及び対立変異体及びアイソフォーム、並びにその可溶性形態などのすべての天然に生じる変異体も含まれる。したがって、例えば「ＬＩＬＲＢ１」は、転写変異体１−４(図９−１２に示す、配列番号：１０、１１、１２及び１３)、並びに他のオルタナティブスプライス転写変異体、対立変異体及びアイソフォーム、及びその可溶性形態などのすべての他の天然に生じる変異体を特に包含するために本明細書において用いられる。「ＬＩＬＲＢ２」なる用語は、ＬＩＬＲＢ２、転写変異体１(図５に示す配列番号：２)及び転写変異体２(図１３に示す配列番号：１４)、並びに他のオルタナティブスプライス転写変異体、対立変異体及びアイソフォーム、及びその可溶性形態などのすべての他の天然に生じる変異体を特に包含するために本明細書において用いられる。「ＬＩＬＲＢ３」なる用語は、ＬＩＬＲＢ３、転写変異体１(図１４に示す配列番号：１５)及び転写変異体２(図１５に示す配列番号：１６)、並びに他のオルタナティブスプライス転写変異体、対立変異体及びアイソフォーム、及びその可溶性形態などのすべての他の天然に生じる変異体を特に包含するために本明細書において用いられる。「ＬＩＬＲＢ５」なる用語は、転写変異体１−３(図１６−１８に示す配列番号：１７−１９)、並びに他のオルタナティブスプライス転写変異体、対立変異体及びアイソフォーム、及びその可溶性形態などのすべての他の天然に生じる変異体を特に包含する。
【００１４】
「ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ」なる用語は、簡素化した記載として本明細書において用い、個々のマウスＰｉｒＢ及びヒトＬＩＬＲＢタンパク質及び他の非ヒト哺乳動物の天然配列ホモログのいずれかを指し、オルタナティブスプライス転写物及び対立変異体及びアイソフォーム、並びにその可溶性形態などのすべての天然に生じる変異体を包含する。
「ミエリン関連タンパク質」なる用語は最も広義に用いられ、Ｎｏｇｏ、ＭＡＧおよびＯＭｇｐを含むニューロンの再生を阻害するＣＮＳミエリンに存在するすべてのタンパク質を含む。
【００１５】
「単離された」とは、ここで開示された種々のタンパク質を記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたタンパク質を意味する。その自然環境の汚染成分とは、タンパク質の診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、タンパク質は、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、Ｎ末端あるいは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性が得られるように十分なほど、あるいは、(３)質量分光分析又はペプチドマッピング技術による均一性が得られるように十分なほど精製される。タンパク質の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、単離されたタンパク質には、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたタンパク質は少なくとも１つの精製工程により調製される。
「単離された」核酸分子は、同定され、対象の核酸の天然源に通常付随している少なくとも１つの汚染核酸分子から分離される核酸分子である。単離された核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離された核酸分子は、天然の細胞中に存在する核酸分子とは区別される。しかし、単離された核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にある核酸を通常発現する細胞に含まれる核酸分子を含む。
【００１６】
本明細書中で用いる「ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニスト」なる用語は、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ活性をブロックする、中和する、阻害する、無効にする、低減する、又は干渉することができる薬剤を指す。特に、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストは、ミエリン関連阻害活性を干渉することによって、神経突起の成長を亢進する、および／またはニューロンの成長、修復および／または再生を促進する。好適な実施態様では、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストは、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢに結合することによってＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢのＮｏｇｏ６６及び／又はＭＡＧ及び／又はＯＭｇｐへの結合を阻害する。ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストには、例えば、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢおよびその抗原結合断片に対する抗体、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢとＮｏｇｏ６６との間、又はＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢとＭＡＧとの間、又はＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢとＯＭｇｐの間の結合を隔離することができるＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ、Ｎｏｇｏ６６、ＭＡＧ又はＯＭｇｐの切断型ないしは可溶性断片、及びＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ関連の阻害経路の小分子インヒビターが含まれる。また、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストにも、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ ｍＲＮＡの発現を阻害するかまたは低減することが可能な短い干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)分子が含まれる。
【００１７】
「抗体」という用語は最も広義に使用され、インタクト抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つのインタクト抗体から形成される多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、及びそれらが所望の生物活性を示す限り抗体断片を具体的に包含する。
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が、少量で存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原性部位に対している。さらに、典型的に異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物と比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。これらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体と混ざらないで合成されうる点で有利である。「モノクローナル」なる修飾は、抗体が実質的に均一な集団から得たものである抗体の特徴を指すものであって、ある特定の方法によって抗体が作製されることを必要とすると解釈されるものではない。例えば、本発明において有用なモノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature, 256;495 (1975)によって初めて記載されるハイブリドーマ方法論によって調製されてもよいし、組み換えＤＮＡ法を用いて作製されてもよい(例として米国特許第４８１６５６７号を参照)。また、「モノクローナル抗体」は、例としてClackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)及びMarks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)に記載の技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離されうる。
【００１８】
抗体は、特に「キメラ」抗体を含み、それは特定の種由来又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列に相同な又は同一な重鎖及び／又は軽鎖の一部を含むものであり、残りの鎖は、所望の生物学的活性を表す限り、他の種由来又は他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、並びにその抗体の断片の対応する配列に相同な又は同一なものである(米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。ここで対象とするキメラ抗体には、非ヒト霊長類(例えば、旧世界サル、サルなど)由来の可変ドメイン抗原結合配列とヒト定常領域配列を含む霊長類化抗体を含む。
「抗体断片」は、インタクト抗体の一部、好ましくはインタクト抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ')２、及びＦｖ断片；ダイアボディ(diabodies)；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
「インタクトな」抗体は、抗原-結合可変領域、並びに軽鎖定常ドメイン(ＣＬ)及び重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含むものである。定常ドメインは天然配列定常ドメイン(例えば、ヒト天然配列定常ドメイン)又はそれらのアミノ酸配列変異体であってよい。好ましくは、インタクト抗体は一又は複数のエフェクター機能を有する。
【００１９】
非ヒト(例えば齧歯類)の抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。多くの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種(ドナー抗体)からの高頻度可変領域の残基によって置換されているヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。例として、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいは実質的に全てのＦＲが、ヒト免疫グロブリン配列のものである少なくとも一又は典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう(Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２、Ｆａｂｃ、Ｆｖ)。また、ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含む。さらなる詳細については、Jones等, Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等, Nature 332:323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)を参照のこと。
【００２０】
ここで使用されるところの「高頻度可変領域」なる用語は、配列内で高度に可変性である、及び／又は構造的に定義されるループを形成する抗体の可変ドメインの領域を指す。高頻度可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基(すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２４−３４、５０−５６及び８９−９７、及び重鎖可変ドメインの３１−３５、５０−６５及び９５−１０２；Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest,５版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991))及び／又は「高頻度可変ループ」からの残基(すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２６−３２、５０−５２及び９１−９６、及び重鎖可変ドメインの２６−３２、５３−５５及び９６−１０１；Chothia及びLesk J.Mol.Biol. 196:901-917 (1987))を含む。いずれの場合でも、可変ドメイン残基は以降に詳細に検討するように、上掲のKabat等に従って番号付けする。「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基はここで定義するように高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
「親抗体」又は「野生型」抗体は、本明細書中で開示する抗体変異体と比較して一又は複数のアミノ酸配列の変更が無いアミノ酸配列を含む抗体である。ゆえに、一般に親抗体は、本明細書中で開示する抗体変異体の対応する高頻度可変領域のアミノ酸配列とはアミノ酸配列が異なる少なくとも一の高頻度可変領域を有する。親抗体は、天然の配列(すなわち、天然に生じる)抗体(天然に生じる対立変異体を含む)、又は天然に生じる配列の既存のアミノ酸配列修飾(例えば挿入、欠失及び／又は他の変更)を有してもよい。開示内容全体を通して、「野生型」、「ＷＴ」、「ｗｔ」、及び「親」ないしは「親の」抗体は交換可能に用いられる。
【００２１】
ここで用いる「抗体変異体」又は「変異抗体」は、親抗体のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する抗体を指す。好ましくは、抗体変異体は、天然に見られないアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメインを含む。このような変異体は、必然的に親抗体と１００％未満の配列同一性又は類似性がある。好適な実施態様では、抗体変異体は、親抗体の重鎖又は軽鎖の可変ドメインの何れかのアミノ酸配列と、およそ７５％から１００％未満、より好ましくはおよそ８０％から１００％未満、より好ましくはおよそ８５％から１００％未満、より好ましくはおよそ９０％から１００％未満、最も好ましくはおよそ９５％から１００％未満のアミノ酸配列同一性又は類似性があるアミノ酸配列を有するであろう。抗体変異体は一般に、一又は複数の高頻度可変領域内又は該領域に隣接して一又は複数のアミノ酸変更を有するものである。
「アミノ酸変更」は、既定のアミノ酸配列のアミノ酸配列内の変化を指す。例示的な変更には、挿入、置換及び欠失が含まれる。「アミノ酸置換」とは、既定のアミノ酸配列内の既存のアミノ酸残基の他の異なるアミノ酸残基への置換を指す。
「置換」アミノ酸残基は、アミノ酸配列内の他のアミノ酸残基を置き換える、又は置換するアミノ酸残基を指す。置換残基は天然に生じるアミノ酸残基でも天然に生じないアミノ酸残基であってもよい。
【００２２】
「アミノ酸挿入」とは、既定のアミノ酸配列の中に一又は複数のアミノ酸を取り込ませることを指す。アミノ酸挿入は、ペプチド結合によって結合された２以上のアミノ酸残基を含むペプチドが既定のアミノ酸配列内に導入される場合に「ペプチド挿入」を含みうる。アミノ酸挿入がペプチドの挿入を伴う場合、挿入されたペプチドは、天然に存在しないアミノ酸配列を有するようにランダム突然変異誘発によって生成されてもよい。「高頻度可変領域に隣接する」アミノ酸変更とは、高頻度可変領域のＮ末端及び／又はＣ末端での一又は複数のアミノ酸残基の導入ないしは置換を指し、この挿入ないしは置換アミノ酸残基(一又は複数)の少なくとも一により、対象の高頻度可変領域のＮ末端又はＣ末端のアミノ酸残基とペプチド結合が形成される。
「天然に生じるアミノ酸残基」は遺伝コードによってコードされるものであり、一般に、アラニン(Ａｌａ)；アルギニン(Ａｒｇ)；アスパラギン(Ａｓｎ)；アスパラギン酸(Ａｓｐ)；システイン(Ｃｙｓ)；グルタミン(Ｇｌｎ)；グルタミン酸(Ｇｌｕ)；グリシン(Ｇｌｙ)；ヒスチジン(Ｈｉｓ)；イソロイシン(Ｉｌｅ)：ロイシン(Ｌｅｕ)；リジン(Ｌｙｓ)；メチオニン(Ｍｅｔ)；フェニルアラニン(Ｐｈｅ)；プロリン(Ｐｒｏ)；セリン(Ｓｅｒ)；スレオニン(Ｔｈｒ)；トリプトファン(Ｔｒｐ)；チロシン(Ｔｙｒ)；及び、バリン(Ｖａｌ)からなる群から選択されうる。
【００２３】
「非天然に生じる(天然に生じない)アミノ酸残基」は、上記に挙げる天然に生じるアミノ酸残基以外の、ポリペプチド鎖内の隣接したアミノ酸残基(一又は複数)を共有結合することができるアミノ酸残基を指す。非天然に生じるアミノ酸残基の例には、例えば、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン及び、例えば、Ellman等 Meth. Enzym. 202:301-336 (1991)に記載のものなどの他のアミノ酸残基アナログが含まれる。非天然のアミノ酸残基を産生するためには、Noren 等 Science 244:182 (1989)および上掲のEllman 等の方法を利用することができる。要するに、これらの方法はインビトロにおけるＲＮＡの転写及び翻訳に先立って非天然に生じるアミノ酸残基にてサプレッサーｔＲＮＡを化学的に活性化することを伴う。
【００２４】
この開示内容の全体にわたって、Kabat, E. A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) and (1991)の番号付けシステムを参照のこと。これらの概略では、Kabatは、各サブクラスの抗体について多くのアミノ酸配列を挙げており、そのサブクラス内の各々の残基位置について最も共通して生じるアミノ酸を挙げている。Kabatは列挙した配列の各アミノ酸に残基番号を割り当てるための方法を用い、残基に数を割り当てるこの方法は当分野において標準となっている。カバット番号付けスキームはこの記載に従う。本発明の目的を達成するために、カバット概略に含まれない候補抗体アミノ酸配列に残基番号を割り当てるために、一方法として以下の工程を用いる。通常、候補配列は、任意の免疫グロブリン配列又はカバットの任意のコンセンサス配列と整列配置する。整列配置(アラインメント)は、手動で行うか、一般に是認されたコンピュータプログラムを用いてコンピュータによって行ってもよい。このようなプログラムの例はＡｌｉｇｎ２プログラムである。整列配置は、ほとんどのＦａｂ配列に共通するいくつかのアミノ酸残基を用いて促されうる。例えば、軽鎖および重鎖は、各々典型的に、同じ残基番号を有する２つのシステインを有する。ＶＬドメインでは、２つのシステインは典型的に残基番号２３および８８であり、ＶＨドメインでは、２つのシステイン残基は典型的に番号２２および９２である。必ずではないが、フレームワーク残基は一般に、およそ同じ数の残基を有するが、ＣＤＲの大きさは変化しうる。例えば、整列配置されるカバットの配列のＣＤＲより長い候補配列からのＣＤＲの場合、典型的に、助数詞を残基番号に加えて、更なる残基の挿入を表す(例えば図１Ｂの残基100ａｂｃを参照)。例えば、残基３４及び３６についてカバット配列と整列配置するが残基３５と整列配置させるための残基をこれらの間に持たない候補配列では、番号３５は単に残基を割り当てない。
【００２５】
本明細書中で用いる、「高い親和性」を有する抗体とは、ナノモル(ｎＭ)の範囲かそれより良好なＫＤ又は解離定数を有する抗体である。「ナノモル範囲かそれより良好な」ＫＤは、ＸｎＭで表してもよく、このＸはおよそ１０未満の数である。
「繊維状ファージ」なる用語は、その表面上に異種性のポリペプチドをディスプレイすることが可能なウイルス粒子を指し、ｆ1、ｆｄ、Ｐｆ1およびＭ13が挙げられるが、これらに限定されるものではない。繊維状ファージは、テトラサイクリン(例えば「ｆｄ ｔｅｔ」)などの選択可能なマーカーを含みうる。様々な繊維状ファージディスプレイシステムは当業者に周知である(例えば、Zacher et al. Gene 9: 127-140 (1980)（Smith et al. Science 228: 1315-1317 (1985)；及びParmley and Smith Gene 73: 305-318 (1988)を参照)。
「パニング」なる用語は、標的に対して高親和性および特異性を有する、抗体などの化合物保持するファージの同定および単離におけるスクリーニング工程の複数のラウンドを指すために用いる。
【００２６】
「短い干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)」なる用語は、遺伝子発現を干渉する小さい二本鎖ＲＮＡを指す。ｓｉＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡが相同遺伝子を沈黙(サイレンシング)させる工程であるＲＮＡ干渉の中間生成物である。ｓｉＲＮＡは典型的に、二本鎖を形成するおよそ１５−２５長のヌクレオチドの２つの一本鎖ＲＮＡからなり、一本鎖オーバーハングを含みうる。酵素複合体、例えばポリメラーゼによる二本鎖ＲＮＡのプロセシングにより、二本鎖ＲＮＡの切断が生じ、ｓｉＲＮＡが生成される。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖はＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)サイレンシング複合体に用いられ、ｍＲＮＡ切断が導かれ、これによってｍＲＮＡ分解が促される。例えば哺乳動物細胞において特定の遺伝子をｓｉＲＮＡを用いて沈黙させるために、塩基対領域を、無関係なｍＲＮＡに偶然に相補性を持たないように選択する。例えばFire et al., Nature 391:806-811 (1998)およびMcManus et al., Nat. Rev. Genet. 3(10): 737-47 (2002)にあるように、ＲＮＡｉサイレンシング複合体は、当分野において同定されている。
「干渉ＲＮＡ(ＲＮＡｉ)」なる用語は、特定のｍＲＮＡの触媒的分解をもたらす二本鎖ＲＮＡを指すために本明細書において用い、したがって特定の遺伝子の発現を阻害／低減するために用いられうる。
【００２７】
「多型性」なる用語は、遺伝子ないしはその一部(例えば対立遺伝子変異体)の複数の形態を指すために本明細書において用いる。少なくとも２つの異なる形態があるものの遺伝子一部は遺伝子の「多型性領域」と呼ばれる。遺伝子の多型性領域のある遺伝子配列は「対立遺伝子」である。多型性領域は、異なる対立遺伝子において異なる単一のヌクレオチドであってもよいし、又は長くいくつかのヌクレオチドであってもよい。
【００２８】
本明細書中で用いる「疾患」なる用語は、通常は、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢのアンタゴニストの有効量によって治療されうる任意の疾患又は疾病を含む、本発明の化合物による治療により利益を得る任意の症状を指す。本明細書において治療される疾患の非限定的例には、限定するものではないが、神経突起成長の亢進、ニューロンの成長、修復又は再生の促進から利益を得る疾患及び症状、例えば物理的に損傷を受けた神経および神経変性疾患などの神経学的疾患が含まれる。このような疾患は具体的には、糖尿病などの疾患状態又は物理的損傷に起因する末梢神経損傷；中枢神経系(脊髄索および脳)への物理的な損傷；脳卒中に関連した脳損傷；及び神経変性に関連する神経学的疾患、例えば、三叉神経痛、舌咽神経痛、ベルの麻痺、重症筋無力症、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)、進行性筋萎縮、進行性延髄の遺伝性筋萎縮、ヘルニア状態、破裂性又は脱出性無脊椎ディスク症候群、頸部脊椎症、叢疾患、胸郭出口破壊症候群、鉛によるものなどの末梢性神経障害、ダプソン(dapsone)、チック、ｐｒｏｐｈｙｒｉａ(prophyria)、ギラン-バレー症候群、アルツハイマー病、ハンチントン病又はパーキンソン病が含まれる。
本明細書中で用いる「治療する」、「治療」及び「療法」なる用語は、治癒的な療法、予防的な療法および防止的な療法を指す。連続的な治療又は投与は、治療を中断することなく一又は複数の日による、少なくとも１日を基準とした治療を指す。間欠的な治療ないしは投与、又は間欠的な様式の治療ないしは投与は、連続的でなく、むしろ実際上周期的である治療を指す。
【００２９】
本明細書中で用いる「神経変性を予防する」なる用語には、(1) 新規に神経変性疾患を有すると診断された患者又は新たに神経変性疾患を発症するリスクにある患者の神経変性を阻害するないしは予防する能力、及び(2) 神経変性疾患を既に患っている患者又は神経変性疾患の症状を有する患者の更なる神経変性を阻害する又は予防する能力が含まれる。
本明細書中で用いる「哺乳動物」なる用語は、ヒト、高次非ヒト霊長類、齧歯類、ウシ、ウマ、イヌ及びネコなどの愛玩動物及び家畜動物を含む、哺乳動物として分類される任意の哺乳動物を指す。本発明の好適な実施態様では、哺乳動物はヒトである。
【００３０】
一又は複数の更なる治療剤「と併用した」投与には、同時(並列)及びいずれかの順序での連続的な投与が含まれる。
「有効量」は、有益な又は所望の治療的(防止的なものを含む)結果を生じさせるために十分な量である。有効量は、一又は複数の投与で投与されてもよい。
【００３１】
本明細書中で用いる「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」なる表現は相互に交換可能に用いられ、かかる標記は子孫を含む。よって、「形質転換体」や「形質転換細胞」のような用語には、初代対象細胞と何世代移行したかを問わずそれから由来した培養物とを含む。全ての子孫が、意図的な突然変異あるいは意図せざる突然変異のため、正確に同一のＤＮＡ内容であるわけではないことも理解される。「子孫」なる用語は、最初に形質転換された細胞又は細胞株に続くすべての世代のいずれか及びすべての子孫を指す。最初に形質転換された細胞に対してスクリーニングされたものと同じ機能あるいは生物的活性を有する突然変異子孫も含まれる。区別しての標記を意図している場合は、文脈から明らかなはずである。
【００３２】
本明細書中で同定された配列に対する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないで、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要であれば間隙(ギャップ)を導入して、参照配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法により達成可能であり、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な指定のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。ここでの目的のためには、％アミノ酸同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を用いて得られる。ＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、そのソースコードは米国著作権庁, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ-２プログラムはジェネンテク社、South San Francisco, Californiaを通して公的に入手可能である。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ-２プログラムによって設定され変動しない。
【００３３】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングに必要な温度が高くなり、プローブが短くなるとそれに必要な温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは、一般的に、相補鎖がその融点より低い環境に存在する場合に、変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイゼーション配列の間で所望される同一性の程度が高くなればなるほど、用いることができる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をよりストリンジェントにすることになり、低い温度はストリンジェントを低下させることになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの更なる詳細及び説明については、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology(Wiley Interscience Publishers, 1995)を参照のこと。
【００３４】
ここで定義される「高度なストリンジェンシー条件」は、(１)洗浄に低イオン強度及び高温度を用いる、５０℃で、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウム；(２)ハイブリダイゼーション中に変性剤を用いる、４２℃で、５０％(ｖ／ｖ)ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム；又は(３)４２℃で、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ(０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム)、５０ｍＭのリン酸ナトリウム(ｐＨ６．８)、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハード液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ(５０μｇ／ｍｌ)、０．１％ＳＤＳ、及び１０％の硫酸デキストラン溶液を用いて、４２℃の０．２×ＳＳＣ(塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム)中と５５℃の５０％ホルムアミドにて洗浄し、ついで５５℃で、ＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄を行うものによって同定される。
【００３５】
「中程度のストリンジェント条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Press, 1989)に記載されているように同定され、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ(１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム)、５０ｍＭリン酸ナトリウム(ｐＨ７．６)、５×デンハード液、１０％硫酸デキストラン、及び２０ｍｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中にて３７℃で終夜インキュベーションし、次いで１×ＳＳＣ中にて約３７−５０℃でフィルターを洗浄することを含む。当業者であれば、プローブ長などの因子に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかは理解されるであろう。
【００３６】
「コントロール配列」という用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列と、リボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
「小分子」とは、ここでは、約１０００ダルトン未満、好ましくは約５００ダルトン未満の分子量を持つと定義される。
【００３７】
Ｂ．ニューロン(神経細胞)の再生の刺激因子を同定するためのスクリーニングアッセイ
本発明の一次アッセイは、少なくとも一部は、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢがミエリンタンパク質Ｎｏｇｏ(Ｎｏｇｏ６６)及びＭＡＧののレセプターであるという認識と、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢの結合に干渉するＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストが神経突起成長を亢進する、及び／又は神経細胞の成長、修復及び／又は再生を促すことができるという認識に基づく。簡単に言えば、このような薬剤は、本明細書において、ニューロン再生の刺激因子と称される。
アンタゴニスト薬剤候補のためのスクリーニングアッセイは、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢを結合するか又は複合体化する化合物、又はＮｏｇｏ、ＭＡＧないしはミエリン結合阻害システムの他のメンバーとのＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢの相互作用に干渉する化合物を同定するために設定されてもよい。本明細書中に示すスクリーニングアッセイには、それらを小分子薬剤候補を同定するために適する、化学的ライブラリのハイスループットスクリーニングに従うアッセイが含まれる。通常、結合アッセイおよび活性アッセイが提供される。
【００３８】
アッセイは、種々の形式で実施でき、この分野で良く特徴付けられたタンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ及び細胞ベースのアッセイを含む。
アンタゴニストのためのすべてのアッセイは、それらが候補薬をＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢポリペプチドと、それら２成分が相互作用するのに十分な時間と条件で接触させる点において共通している。
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、又は反応混合物中で検出される。特別な実施態様では、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢポリペプチド又は薬剤候補のいずれかが、共有又は非共有結合により固相、例えばマイクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般的に、固体表面をＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢポリペプチドの溶液でコーティングし乾燥させることにより達成される。あるいは、固定化すべきＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢポリペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を、そのペプチドを固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは、検出可能な標識によってラベル化される非固定化成分を、固定化成分、例えば、固着成分を含むコーティング表面などに添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体によって検出できる。
【００３９】
候補化合物がＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢと相互に作用するがＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢに結合しないポリペプチドである場合、それぞれのポリペプチドとＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢとの相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するための周知の方法によって検定されてもよい。このようなアッセイには、従来の手法、例えば、架橋結合、同時免疫沈降法、及び勾配ないしはクロマトカラムによる同時精製が含まれる。更に、Chevray and Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5789-5793 (1991)によって開示されるように、タンパク質−タンパク質相互作用は、Fieldsと共同研究者によって記述される酵母に基づく遺伝システムを用いてモニターすることもできる(Fields and Song, Nature (London), 340:245-246 (1989)；Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582 (1991))。酵母菌ＧＡＬ４などの多くの転写活性化因子は、２つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。以前の文献に記載された酵母発現系(一般に「２−ハイブリッドシステム」と呼ばれる)は、この特性の長所を利用して、２つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合し、他方では、候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。ＧＡＬ１−ｌａｃＺリポーター遺伝子のＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質-タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β-ガラクトシダーゼに対する色素生産性基質で検出される。２−ハイブリッド技術を用いた２つの特定のタンパク質間のタンパク質-タンパク質相互作用を同定するための完全なキット(ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲＴＭ)は、Clontechから購入できる。この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、並びにこの相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定にも拡張することができる。
【００４０】
ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢと他の細胞内ないしは細胞外成分、特にＮｏｇｏ又はＭＡＧとの相互作用を干渉する化合物は以下のように試験することができる。通常、２つの生成物の相互作用を可能にする条件及び時間の下で、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢおよび細胞内ないし細胞外成分を含む反応混合物を調製する。ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ及びＮｏｇｏ又はＭＡＧの相互作用を阻害する候補化合物の能力を試験するために、試験化合物の存在下及び非存在下にて反応を行った。さらに、第３の反応混合物にプラセボを加え、ポジティブコントロールとする。
本明細書において具体的に述べるスクリーニングアッセイは例示のみのためにであることを強調する。スクリーニングしたアンタゴニスト候補(例えば、ポリペプチド、ペプチド、非ペプチド小有機分子、核酸など)の種類に応じて選択されうる、当業者に周知な他のアッセイが多く存在し、本発明の目的に等しく適する。
【００４１】
本明細書中のアッセイを用いて、限定するものではないが、化学ライブラリ、天然の生成物ライブラリ(例えば、微生物、動物、植物などの集積)、及びランダムペプチド、オリゴヌクレオチドないしは小有機分子を含む組み合わせライブラリなどの化合物のライブラリをスクリーニングしてもよい。特定の実施態様では、本明細書中のアッセイを用いて、限定するものではないが、ナイーブヒト抗体、組み換え抗体、合成抗体及び半合成抗体のライブラリをスクリーニングする。抗体ライブラリは、例えば、ウイルス粒子当たり平均１の単鎖抗体ないしは抗体断片をディスプレイする一価ライブラリ、及びウイルス粒子当たり平均２以上の抗体ないしは抗体断片をディスプレイする多価ライブラリを含むファージディスプレイライブラリであってもよい。しかしながら、本発明によってスクリーニングされる抗体ライブラリは、ファージディスプレイライブラリに限らない。他のディスプレイ技術には、例えば、リボソーム又はｍＲＮＡディスプレイ(Mattheakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022-9026 (1994)；Hanes and Pluckthun, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4937-4942 (1997))、微生物細胞ディスプレイ（例えば細菌ディスプレイ(Georgiou et al., Nature Biotech. 15:29-34 (1997))又は酵母菌ディスプレイ(Kieke et al., Protein Eng. 10: 1303-1310 (1997))、哺乳動物細胞上のディスプレイ、胞子ディスプレイ、レトロウイルスディスプレイなどのウイルスディスプレイ(Urban et al., Nucleic Acids Res. 33: e35 (2005)、タンパク質−ＤＮＡ結合に基づくディスプレイ(Odegrip et al., Proc. Acad. Natl. Sci. USA 101:2806-2810 (2004)；Reiersen et al., Nucleic Acids Res. 33: e10 (2005))、及びミクロビーズディスプレイ(Sepp et al., FEBS Lett. 532:455-458 (2002))が含まれる。
【００４２】
本明細書中の一次結合／相互作用アッセイにおいて得られた結果は、ニューロン再生のインビトロおよび／またはインビボのアッセイにおいて確認されうる。あるいは、ニューロン再生のインビトロおよび／またはインビボのアッセイを、本明細書中のＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストを同定するために一次アッセイとして用いてもよい。
【００４３】
神経突起成長のインビトロアッセイは当分野で周知であり、例えばJin and Strittmatter, J Neurosci 17:6256-6263 (1997)；Fournier et al., Methods Enzymol. 325:473-482 (2000)；Zheng et al., Neuron 38:213-224 (2003)；Wang et al., Nature 417:941-944 (2002)、及びNeumann et al., Neuron 34:885-893 (2002)に記載されている。神経突起成長を測定し定量化するためのキットが市販されている。したがって、例えば、ＣＨＥＭＩＣＯＮの神経突起成長アッセイキット(Catalog number NS200)は、神経突起形成及び反発作用に影響する化合物の定量的な試験のために細孔フィルター技術を用いる。このシステムについては、生物学的及び薬理学的な薬剤を同時にスクリーニングし、神経突起伸長及び反発作用に寄与する接着及び誘導レセプター機能を直接評価し、形質移入した細胞における遺伝子機能を分析することができる。細孔フィルターにより、タンパク質発現、シグナル伝達過程及び神経突起成長ないしは退縮過程を調節する薬剤標的の同定の詳細な分子的分析のための、神経突起と細胞体の生化学的な分離と精製が可能である。
【００４４】
代表的なプロトコールでは、齧歯類の神経組織(小脳顆粒ニューロン、後根神経節ニューロンおよび皮質ニューロンを含む)から単離された一次ニューロンを、固定した総ミエリンないしはミエリン関連タンパク質(例えばＮｏｇｏ６６、ＭＡＧ及び／又はＯＭｇｐ)にてコートした９６ウェル組織培養ディッシュ上で培養する。一定期間、一般的に２４〜４８時間培養した後、ニューロンを、４％パラホルムアルデヒドにて固定し、ニューロンマーカー(抗クラスＩＩＩ ｂ-チューブリン、Covance)にて染色する。次いで、画像取込および分析を、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ自動化撮像システム(Molecular Devices)を使用して実行する。データは、ニューロン当たりの最大ないしは総神経突起長の変化について分析する。
インビボアッセイには、様々な神経変性疾患の動物モデル、例として、脊髄損傷モデル、視覚領皮質可塑性モデルの動物モデル、当分野で公知の他のモデルが含まれる。ゆえに、再生および可塑性は、片側の錐体路切断術後の可塑性のモデルおよび外傷性脳損傷のモデルにおいて調べられてもよい。他の神経変性のモデルには、実験的自己免疫性脳炎(ＥＡＥ)などの多発性硬化症のマウスモデル、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)のモデル、例えばＳＯＤＩ変異マウス、アルツハイマー病のトランスジェニック動物モデル、およびパーキンソン病の動物モデルが含まれる。
【００４５】
Ｃ．ニューロン再生の刺激因子として作用する抗体の作製
本発明の結合および活性のアッセイによって同定される抗体は、組換えＤＮＡ技術の技術を含む公知の方法によって製造されうる。
(i) 抗原調製
場合によって他の分子にコンジュゲートした可溶性抗原ないしはその断片は、抗体を生成するための免疫原として用いられうる。レセプターなどの膜貫通分子のために、その断片(例えばレセプターの細胞外ドメイン)が免疫原として用いられうる。あるいは、膜貫通分子を発現する細胞を免疫源として用いてもよい。このような細胞は、天然の供与源(例えば癌細胞株)から得られてもよいし、膜貫通分子を発現するように組換え体技術によって形質転換されている細胞であってもよい。抗体を調製するために有用な他の抗原及びその形態は当分野の技術者に明らかであろう。
【００４６】
(ii) ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、関連する抗原とアジュバントを複数回の皮下(sc)又は腹腔内(ip)注射することにより、動物に産生されることが好ましい。それは、免疫化されるべき種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターへ、二重官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介する抱合)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基を介する抱合)、グルタルアルデヒド、及び無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲ及びＲ１が異なるアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲへ、関連する抗原をコンジュゲートさせるために有用である。
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ(それぞれウサギ又はマウスの場合)を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫する。１ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。好ましくは、動物を、同じ抗原であるが異なるタンパク質にコンジュゲートさせた、及び／又は異なる架橋剤によってコンジュゲートさせたコンジュゲートにより追加免疫する。コンジュゲートはまた、タンパク融合として組換え細胞培養中で調製することができる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。
【００４７】
(iii) モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第４８１６５６７号)によって作成することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスター又はマカクザルを上記のように免疫し、免疫化に用いられたタンパク質と特異的に結合する抗体を産生する、又は産生することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次いで、リンパ球をポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ−欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含有するであろう(ＨＡＴ培地)。
【００４８】
好適な骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの発現を支援し、ＨＡＴ培地などの培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫株化細胞は、マウス骨髄腫ライン、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、ＵＳＡより入手し得るＭＯＰＣ-２１及びＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及び、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビル、メリーランド、ＵＳＡより入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞から誘導されるものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている(Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51-63頁、(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について検定する。好ましくはハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定する。
【００４９】
所望の特異性、親和性、及び／又は活性な抗体を産生するハイブリドーマ細胞が確定された後、そのクローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地は、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地を包含する。また、このハイブリドーマ細胞は、動物の腹水症腫瘍として、インビボで増殖させることができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティクロマトグラフィーのような常套的なイムノグロブリン精製法によって、培地、腹水、又は血清から上手く分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常法を用いて(例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)即座に分離されて、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好適な供給源となる。ひとたび分離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、この状況以外ではイムノグロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入し、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を獲得することができる。抗体の組み換え産生を以下に詳細に記載する。
【００５０】
更なる実施態様では、抗体又は抗体断片は、McCafferty等, Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリから分離することができる。Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)及び Marks等, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリを使用したマウス及びヒト抗体の分離を記述している。続く刊行物は、鎖シャフリングによる高親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の生成(Marks等, Bio/Technology, 10:779-783[1992])、並びに非常に大きなファージライブラリを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouse等, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266[1993])を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の分離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。
また、ＤＮＡは、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメイン(ＣＨ及びＣＬ)のコード配列を、相同的マウス配列に代えて置換することによって(米国特許第４８１６５６７号；Morrison等, Proc.Nat.Acad.Sci., USA, 81:6851(1984))、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部又は一部を共有結合させることによって修飾することができる。
典型的には、前記の非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインと置き代わることができるか、又は抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインが置換されて、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
【００５１】
(iv) ヒト及びヒト化抗体
ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的にウィンター(Winter)及び共同研究者［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第４８１６５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方のヒト可変ドメインの選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のヒトフレームワーク(ＦＲ)として受け入れる(Sims等, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothia等, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta等, J. Immunol., 151:2623(1993))。
【００５２】
更に、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好適な方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、ＣＤＲ残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
あるいは、現在では、免疫化することで、内因性免疫グロブリンの産生がなく、ヒト抗体の全レパートリーを産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子のホモ接合体欠失によって、結果として内因性抗体産生の完全な阻害が起こることが説明されてきた。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子配列の、このような生殖細胞系突然変異体マウスへの転移によって、結果として抗原投与時にヒト抗体の産生がおこる。Jakobovits等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature 362:255-258 (1993); Bruggeman等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；及びDuchosal等 Nature 355:258 (1992)を参照されたい。また、ヒト抗体はファージディスプレイライブラリからも得られる(Hoogenboom等, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)；Vaughan等 Nature Biotech 14:309 (1996))。抗体ファージディスプレイライブラリからのヒト抗体の生成は以下に更に記載する。
【００５３】
(v) 抗体断片
抗体断片を産生するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化によって誘導された(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は、現在は組換え宿主細胞により直接産生することができる。例えば、抗体断片は、上で論じた抗体ファージライブラリから単離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合させてＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。以下の実施例に記載のような他の実施態様では、Ｆ(ａｂ')２は、Ｆ(ａｂ')２分子のアセンブリを促すように、ロイシンジッパーＧＣＮ４を用いて形成される。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。抗体断片を生成するのための他の方法は、当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択する抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦｖ)である。国際公開９３／１６１８５号を参照のこと。
【００５４】
(vi) 多重特異性抗体
多重特異性抗体は、通常異なる抗原に由来する少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する。このような分子は通常２つの異なるエピトープを結合するだけであるが(すなわち二重特異性抗体、ＢｓＡｂ)、本明細書中で用いられる場合には三重特異性抗体などの更なる特異性を有する抗体がこの表現に包含される。ＢｓＡｂの例には、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢに対する一アームと、Ｎｏｇｏ又はＭＡＧ又はＯＭｇｐに対する他のアームとを有するものが含まれる。ＢｓＡＢの更なる例には、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢに対する一アームとＮｇＲに対する他のアームを有するものが含まれる。
二重特異性抗体を作成する方法は当該分野において既知である。完全長二重特異性抗体の伝統的な産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの鎖は異なる特異性を持っている(Millstein等, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公開第９３／０８８２９号及びTraunecker等, EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原-抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むイムノグロブリン重鎖定常ドメインである。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時トランスフェクトする。これにより、組立に使用される３つのポリペプチド鎖の等しくない比率が抗体の最適な収率をもたらす態様において、３つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな(フレキシビリティ)が与えられる。しかし、少なくとも２つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率があまり影響がないときは、２又は３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【００５５】
この手法の好適な実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公開第９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
国際公開第９６／２７０１１号に記載された他の手法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体の定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【００５６】
二重特異性抗体には、交差結合又は「ヘテロコンジュゲート」抗体が含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲートの一抗体はアビジンにカップリングし、他方の抗体はビオチンにカップリングしていてもよい。例えば、このような抗体は、望ましくない細胞へ免疫系細胞を標的化するため(米国特許第４６７６９８０号)、そしてＨＩＶ感染の治療のため(国際公開９１／００３６０、国際公開９２／２００３７３)に提唱されている。ヘテロコンジュゲート抗体は従来のいずれかの交差結合法を用いて作製されてもよい。好適な交差結合剤は当分野で周知であり、多くの交差結合技術と共に米国特許第４６７６９８０号に開示されている。
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤、亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に変換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再変換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
【００５７】
Ｆａｂ'-ＳＨ断片は、大腸菌から直接回収することもできるし、化学的に結合して二重特異性抗体を形成させることもできる。Shalaby等,J.Exp.Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な技術もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生成されている。Kostelny等, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生成に対して使用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、よって２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruber等, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等 J.Immunol. 147:60(1991)。
【００５８】
(vii) エフェクター機能の加工
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、抗体の有効性を向上させることは望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成するようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上したインターナリゼーション能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体−依存細胞性細胞障害性(ＡＤＣＣ)を有する可能性がある。Caron等, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。また、向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体は、Wolff等, Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)に記載されている異種二官能性架橋を用いて調製することができる。あるいは、抗体は、２つのＦｃ領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させることもできる。Stevenson等, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照。
【００５９】
(viii) 抗体−サルベージレセプター結合エピトープ融合
本発明のある実施態様では、例えば腫瘍浸透性を増大させるためにインタクト抗体よりも抗体断片を使用することが望ましい。この場合、その血清半減期を増大させるために抗体断片を改変することが望ましい。これは、例えば、抗体断片にサルベージレセプター結合エピトープを組み込むことにより(例えば、抗体断片中の適当な領域の突然変異により、あるいはついで抗体断片の何れかの末端又は中央に、例えばＤＮＡ又はペプチド合成により融合されるペプチドタグ内にエピトープを組み込むことにより)、達成しうる。
サルベージレセプター結合エピトープは、好ましくは、Ｆｃドメインの一又は二のループ由来の一又は複数の任意のアミノ酸残基が抗体断片の類似位置に転移している領域を構成する。更により好ましくは、Ｆｃドメインの一又は二のループ由来の３以上の残基が転移する。またより好ましくは、エピトープはＦｃ領域の(例えばＩｇＧの)ＣＨ２ドメインから得られ、抗体のＣＨ１、ＣＨ３、又はＶＨ領域、又はそのような領域の一より多くに転移する。あるいは、エピトープは、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインから得られ、抗体断片のＣＬ領域又はＶＬ領域、又はその両方に転移する。
【００６０】
(ix) 抗体の他の共有的修飾
抗体の共有的修飾は本発明の範囲内にある。それらは、適当であれば、化学合成により、又は抗体の酵素的又は化学的切断によりなされうる。抗体の共有的修飾の他のタイプは、選択される側鎖又はＮないしＣ末端の残基と反応できる有機誘導体化剤と抗体の標的とするアミノ酸領域を反応させることにより分子中に導入される。共有的修飾は米国特許第５５３４６１５号に記載されており、出典明記によって特別に本明細書中に援用される。抗体の共有結合的修飾の好適なタイプは、ポリペプチドを、種々の非タンパク質様ポリマーの一つ、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンへ、米国特許第４６４０８３５号；第４４９６６８９号；第４３０１１４４号；第４６７０４１７号；第４７９１１９２号又は第４１７９３３７号に記載された方法で結合させることを含む。
【００６１】
(x) 合成抗体ファージライブラリからの抗体の産生
ある好適な実施態様では、本発明は特有のファージディスプレイアプローチ法を使用して新規な抗体を産生し選択する方法を提供する。該アプローチ法は、単一フレームワーク鋳型に基づく合成抗体ファージライブラリの産生、可変ドメイン内の十分な多様性の設計、多様化した可変ドメインを有するポリペプチドのディスプレイ、抗原を標的とする高親和性を持つ候補抗体の選択、及び選択された抗体の単離を含む。
ファージディスプレイ法の詳細は例えば２００３年１２月１１日公開の国際公開第０３／１０２１５７号に見出すことができ、この開示内容の全体は出典明記によって特別に本明細書中に援用される。
【００６２】
一態様では、本発明において使用される抗体ライブラリは抗体可変ドメインの少なくとも一のＣＤＲにおいて溶媒接近可能な及び／又は高度に多様性の位置を変異させることによってつくることができる。ＣＤＲの幾らか又は全てをここに提供した方法を使用して変異させることができる。ある実施態様では、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３中の位置に変異を施して単一のライブラリを形成するか、又はＣＤＲＬ３及びＣＤＲＨ３中の位置に変異を施して単一のライブラリを形成するか、又はＣＤＲＬ３及びＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３中の位置に変異を施して単一のライブラリを形成することにより、多様な抗体ライブラリをつくることが好ましい。
例えばＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３の溶媒接近可能な及び／又は高度に多様性の位置に変異を有する抗体可変ドメインのライブラリをつくることができる。ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３に変異を有する他のライブラリをつくることができる。これらのライブラリは所望の親和性の結合体をつくるために互いに関連させて使用することもできる。例えば、標的抗原への結合についての重鎖ライブラリの一又は複数回の選択後に、軽鎖ライブラリを結合体の親和性を増加させるために更なる選択回数に対して重鎖結合体の集団中に置き換えることができる。
【００６３】
好ましくは、ライブラリは重鎖配列の可変領域のＣＤＲＨ３領域における変異アミノ酸での元のアミノ酸の置換によりつくられる。得られたライブラリは複数の抗体配列を含み得、ここで配列多様性は主として重鎖配列のＣＤＲＨ３領域にある。
一態様では、ライブラリはヒト化抗体４Ｄ５配列、又はヒト化抗体４Ｄ５配列のフレームワークアミノ酸の配列の態様でつくり出す。好ましくは、ライブラリはＤＶＫコドンセットによってコードされるアミノ酸で重鎖の少なくとも残基９５−１００ａを置換することによりつくられ、ここでＤＶＫコドンセットはこれらの位置の各一に対して変異アミノ酸セットをコードするために使用される。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの一例は配列(ＤＶＫ)７を含む。ある実施態様では、ライブラリはＤＶＫとＮＮＫの双方のコドンセットによってコードされるアミノ酸で残基９５−１００ａを置換することによりつくられる。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの例は配列(ＤＶＫ)６(ＮＮＫ)を含む。他の実施態様では、ライブラリはＤＶＫとＮＮＫの双方のコドンセットによってコードされるアミノ酸で少なくとも残基９５−１００ａを置換することによりつくられる。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの例は配列(ＤＶＫ)５(ＮＮＫ)を含む。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの他の例は配列(ＮＮＫ)６を含む。好適なオリゴヌクレオチド配列の他の例はここに記載された基準に従って当業者によって決定することができる。
【００６４】
他の実施態様では、異なったＣＤＲＨ３設計を使用して高親和性結合体を単離し様々なエピトープに対して結合体を単離する。このライブラリにおいて産生されたＣＤＲＨ３の長さの範囲は１１から１３アミノ酸であるが、これとは異なった長さも産生することができる。Ｈ３多様性はＮＮＫ、ＤＶＫ及びＮＶＫコドンセットを使用し、並びにＮ及び／又はＣ末端での多様性をより制限して、拡張することができる。
多様性をＣＤＲＨ１及びＣＤＲＨ２においてまた生じさせることができる。ＣＤＲ-Ｈ１及びＨ２多様性の設計は、過去の設計よりも天然の多様性により密に適合する多様性に焦点を当てる変更をした上で、上述の天然抗体レパートリーを模倣するターゲティング方策に従う。
【００６５】
ＣＤＲＨ３での多様性に対しては、複数のライブラリを、異なった長さのＨ３と別個に構築し、ついで、標的抗原に対する結合体を選択するために組み合わせる。複数のライブラリをプールし、過去に記載され以下に記載されたような固体支持体選別及び溶液選別方法を使用して選別することができる。複数の選別方策を用いることができる。例えば、一つの変異は固体に結合した標的での選別を含み、融合ポリペプチド上に存在しうるタグ(例えば抗ｇＤタグ)の選別が続く。別法として、ライブラリは固体表面に結合した標的で先ず選別することができ、溶出した結合体がついで標的抗原の濃度を減少させた溶液相結合を使用して選別される。異なった選別法を併用することにより高度に発現した配列のみの選択の最小化がもたらされ、多くの異なった高親和性クローンの選択をもたらす。
標的抗原に対する高親和性結合体はライブラリから単離することができる。Ｈ１／Ｈ２領域における多様性の制限は約１０４から１０５倍縮重を減少させ、より多くのＨ３多様性を許容することによりより多くの高親和性結合体をもたらす。ＣＤＲＨ３において異なったタイプの多様性を持つライブラリを利用することにより(例えばＤＶＫ又はＮＶＴを利用して)標的抗原の異なったエピトープに結合しうる結合体の単離をもたらす。
【００６６】
上述のプールされたライブラリから単離された結合体において、軽鎖において制限された多様性を提供することによって親和性を更に改善することができることが発見された。軽鎖多様性はこの実施態様では以下のように生成される。ＣＤＲＬ１においては：アミノ酸位置２８がＲＤＴによってコードされる；アミノ酸位置２９がＲＫＴによってコードされる；アミノ酸位置３０がＲＶＷによってコードされる；アミノ酸位置３１がＡＮＷによってコードされる；アミノ酸位置３２がＴＨＴによってコードされる；場合によっては、アミノ酸位置３３がＣＴＧによってコードされる；ＣＤＲＬ２においては：アミノ酸位置５０がＫＢＧによってコードされる；アミノ酸位置５３がＡＶＣによってコードされる；場合によっては、アミノ酸位置５５がＧＭＡによってコードされる；ＣＤＲＬ３においては：アミノ酸位置９１がＴＭＴ又はＳＲＴ又はその両方によってコードされる；アミノ酸位置９２がＤＭＣによってコードされる；アミノ酸位置９３がＲＶＴによってコードされる；アミノ酸位置９４がＮＨＴによってコードされる；アミノ酸位置９６がＴＷＴ又はＹＫＧ又は両方によってコードされる。
【００６７】
他の実施態様では、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３領域に多様性を持つライブラリ又はライブラリ群が作製される。この実施態様では、ＣＤＲＨ３における多様性は様々な長さのＨ３領域を用い、主にコドンセットＸＹＺ及びＮＮＫ又はＮＮＳを用いてつくり出される。ライブラリは個々のオリゴヌクレオチドを使用して形成しプールすることができ、又はオリゴヌクレオチドをプールしてライブラリのサブセットを形成することができる。この実施態様のライブラリは固体に結合した標的に対して選別することができる。多重選別から単離されたクローンをＥＬＩＳＡアッセイを使用して特異性及び親和性についてスクリーニングすることができる。特異性については、クローンを所望の標的抗原並びに他の非標的抗原に対してスクリーニングすることができる。標的ＮＲＰ１抗原に対する結合体をついで溶液結合競合ＥＬＩＳＡアッセイ又はスポット競合アッセイでの親和性についてスクリーニングすることができる。高親和性結合体は上に記載したようにして調製されたＸＹＺコドンセットを使用してライブラリから単離することができる。これらの結合体は抗体又は抗原結合断片として細胞培養物中に高収量で直ぐに産生されうる。
ある実施態様では、ＣＤＲＨ３領域の長さに大なる多様性を持つライブラリを作成することが望まれる場合がある。例えば、約７から１９アミノ酸の範囲のＣＤＲＨ３領域を持つライブラリを作成することが望ましい場合がある。
【００６８】
これらの実施態様のライブラリから単離された高親和性結合体は細菌及び真核生物細胞培養で高収量で直ぐに産生される。ベクターはｇＤタグ、ウイルスコートタンパク質成分配列のような配列を直ぐに除去し、及び／又は定常領域配列に加えて完全長抗体又は抗原結合断片を高収量で生産するように設計することができる。
ＣＤＲＨ３での変異を持つライブラリを、例えばＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１及び／又はＣＤＲＨ２のような他のＣＤＲの変異型を含むライブラリと組み合わせることができる。よって、例えば、一実施態様では、ＣＤＲＨ３ライブラリは予め定まったコドンセットを使用して位置２８、２９、３０、３１、及び／又は３２に変異アミノ酸を持つヒト化４Ｄ５抗体配列の形態において作りだしたＣＤＲＬ３ライブラリと組み合わせられる。他の実施態様では、ＣＤＲＨ３に対する変異のライブラリは変異ＣＤＲＨ１及び／又はＣＤＲＨ２重鎖可変ドメインを含むライブラリと組み合わせることができる。一実施態様では、ＣＤＲＨ１ライブラリは位置２８、３０、３１、３２及び３３に変異アミノ酸を持つヒト化抗体４Ｄ５配列を用いてつくり出される。ＣＤＲＨ２ライブラリは予め定まったコドンセットを使用して位置５０、５２、５３、５４、５６及び５８に変異アミノ酸を持つヒト化抗体４Ｄ５の配列を用いてつくり出すことができる。
【００６９】
(xi) 抗体変異体
ファージライブラリから生成される新規の抗体は、さらに修飾して、親抗体よりも改善した物理学的、化学的及び／又は生物学的特性を有する抗体変異体を生成することができる。使用するアッセイが生物学的活性アッセイである場合、抗体変異体は、選択したアッセイにおいて、該アッセイにおける親抗体の生物学的活性よりも少なくともおよそ１０倍良好な、好ましくは少なくともおよそ２０倍良好な、より好ましくは少なくともおよそ５０倍良好な、時には少なくともおよそ１００倍又は２００倍良好な生物学的活性を有する。例えば、抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体変異体は、親抗体の結合親和性より、少なくともおよそ１０倍強力な、好ましくは少なくともおよそ２０倍強力な、より好ましくは少なくともおよそ５０倍強力な、時には少なくともおよそ１００倍又は２００倍強力な、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢに対する結合親和性を有することが好ましい。
【００７０】
抗体変異体を産生するためには、親抗体の高頻度可変領域の一又は複数中に一又は複数のアミノ酸修飾(例えば置換)が導入される。別法として、又は加えて、フレームワーク領域残基の一又は複数の修飾(例えば置換)を親抗体に導入することができ、これらにより第二の哺乳動物種由来の抗原に対する抗体変異体の結合親和性が改善される。修飾するためのフレームワーク領域残基の例には、抗原に非共有的に結合するもの(Amit等, Science 233:747-753 (1986))；ＣＤＲと相互作用し／そのコンホメーションに影響を及ぼすもの(Chothia等 J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))；及び／又はＶＬ−ＶＨ界面に関与するもの(欧州特許第２３９４００号Ｂ１)が含まれる。ある実施態様では、そのようなフレームワーク領域残基の一又は複数の修飾により第二の哺乳動物種由来の抗原に対する抗原の結合親和性が向上する。例えば、約１から約５のフレームワーク残基を本発明のこの実施態様において修飾することができる。しばしば、これは、高頻度可変領域が何ら改変されていない場合でさえ、前臨床試験に使用するのに適した抗体変異体を生じるのに十分でありうる。しかしながら、通常は、抗体は更なる高頻度可変領域の改変を含む。
【００７１】
改変される高頻度可変領域残基は、特に親抗体の出発結合親和性が、無作為に生産された抗体変異体を直ぐにスクリーニングすることができるものである場合には、無作為に変化させることができる。
そのような抗体変異体を産生するための一つの有用な方法は、「アラニンスキャンニング突然変異誘発法」(Cunningham及びWells Science 244:1081-1085 (1989))と呼ばれる。ここで、高頻度可変領域残基の一又は複数が、第二の哺乳動物種由来の抗原とのアミノ酸の相互作用に影響を及ぼすためにアラニン又はポリアラニンによって置換される。ついで置換に対する機能的感受性を示す高頻度可変領域残基は、置換部位において又はそれに対して更なる又は他の置換を導入することにより洗練される。従って、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、変異の種類自体は予め決める必要はない。このようにして産生されるａｌａ変異体をここに記載したその生物活性についてスクリーニングされる。
通常は、「好ましい置換」の項目名で以下に示されているもののような保存的置換で始める。そのような置換が生物活性(例えば結合親和性)の変化を生じるならば、次の表において「例示的置換」と命名され、又はアミノ酸クラスを参照して以下に更に記載されるより実質的な変化が導入され、産物がスクリーニングされる。
【００７２】
好適な置換：
【００７３】
抗体の生物学的性質の更により実質的な修飾は、(ａ)置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋コンホメーション、(ｂ)標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は(ｃ)側鎖の嵩を維持して、それらの効果において有意に異なる置換基を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいてグループ分けすることができる：
(１)疎水性：ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile；
(２)中性の親水性：cys, ser, thr；
(３)酸性：asp, glu；
(４)塩基性：his, lys, arg；
(５)鎖配向に影響する残基：gly, pro；及び
(６)芳香族：trp, tyr, phe。
【００７４】
非保存的置換は、これらのクラスの一つのメンバーを他のクラスと交換することを必要とする。
他の実施態様では、修飾のために選択された部位がファージディスプレイを使用して亜親和性成熟される(上を参照)。
【００７５】
アミノ酸配列変異体をコードしている核酸分子は当該分野で知られている様々な方法により調製される。これらの方法は、限定されるものではないが、親抗体の先に調製された変異体又は非変異体型のオリゴヌクレオチド媒介(又は部位特異的)突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発を含む。変異体を作製するための好ましい方法は部位特異的突然変異誘発(例えばKunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488 (1985)を参照)である。
ある実施態様では、抗体変異体は単一の高頻度可変領域残基が置換されたものである。他の実施態様では、親抗体の高頻度可変領域残基の２又はそれ以上が置換され、例えば約２から約１０の高頻度可変領域置換である。
【００７６】
通常、改善された生物学的性質を有する抗体変異体は親抗体の重鎖又は軽鎖の何れかの可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を有する。この配列に対する同一性又は類似性は、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入し最大の配列同一性パーセントを達成した後に親抗体残基と同一(つまり同じ残基)又は類似(つまり共通の側鎖特性に基づく同じグループのアミノ酸残基、上を参照)である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセントとしてここで定義される。可変ドメインの外側の抗体配列中へのＮ末端、Ｃ末端、又は内部の伸展、欠失、又は挿入は何れも配列同一性又は類似性に影響を及ぼすものとはみなされない。
抗体変異体の産生後に、親抗体に対するその分子の生物活性が決定される。上に述べたように、これは抗体の結合親和性及び／又は他の生物活性を決定することを含みうる。本発明の好適な実施態様では、抗体変異体のパネルを調製し、抗原ないしその断片に対する結合親和性についてスクリーニングする。この最初のスクリーニングから選択される抗体変異体の一又は複数は場合によっては一又は複数の更なる生物活性アッセイにかけて、結合親和性が向上した抗体変異体が例えば前臨床研究に確かに有用であることが確認される。
【００７７】
このように選択された抗体変異体は、しばしば抗体の意図される用途に応じて更なる修飾を受けることができる。そのような修飾は以下に詳細を記載したもののようなアミノ酸配列の更なる改変、異種ポリペプチドに対する融合及び／又は共有的修飾を含む。アミノ酸配列改変については例示的な修飾を上に詳細に説明した。例えば、抗体変異体の正しいコンホメーションを維持することに関与しない任意のシステイン残基はまた一般にはセリンで置換して、分子の酸化安定性を改善し異常な架橋を防止することができる。逆に、システイン結合を抗体に加えてその安定性をかいぜんすることができる(特に抗体がＦｖ断片のような抗体断片である場合)。他のタイプのアミノ酸変異体は改変されたグリコシル化パターンを有する。これは抗体に見出される一又は複数の糖鎖部分を欠失させ、及び／又は抗体中に存在していない一又は複数のグリコシル化部位を加えることによって達成することができる。抗体のグリコシル化は典型的にはＮ結合又はＯ結合の何れかである。Ｎ結合とはアスパラギン残基の側鎖への糖鎖部分の付着を意味する。トリペプチド配列アスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニン(ここで、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である)がアスパラギン側鎖への糖鎖部分の酵素的付着に対する認識配列である。よって、ポリペプチドにおいてこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると潜在的なグリコシル化部位をつくる。Ｏ結合グリコシル化はヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニン(但し５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンもまた使用できる)への糖Ｎ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つの付着を意味する。抗体へのグリコシル化部位の付加は、それが上述のトリペプチド配列(Ｎ結合グリコシル化部位に対する)の一又は複数を含むようにアミノ酸配列を改変することにより簡便に達成される。改変はまた元の抗体の配列への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加又は置換によって行うこともできる(Ｏ結合グリコシル化部位の場合)。
【００７８】
(xii) 抗体の組換え製造
抗体の組換え製造のために、それをコードする核酸が単離され、さらなるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために、複製可能なベクター中に挿入される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは直ぐに単離され、従来の手法を用いて(例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドを使用することによって)配列決定される。多くのベクターが公的に入手可能である。ベクター成分には、一般に、これらに制限されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる：シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列である(例えば米国特許第５５３４６１５号に記載されており、出典明記によって特別に本明細書中に援用される)。
【００７９】
ここに記載のベクター中のＤＮＡをクローニングあるいは発現させるために適切な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びに桿菌、例えば枯草菌及びバシリ・リチェフォルミス(licheniformis)(例えば、１９８９年４月１２日に公開された ＤＤ２６６７１０に開示されたバシリ・リチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。一つの好適な大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４(ＡＴＣＣ３１４４６)であるが、他の大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ３１５３７)及び大腸菌Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ２７３２５)のような株も好適である。これらの例は限定するものではなく例示的なものである。
【００８０】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア、又は一般的なパン酵母は下等真核生物宿主微生物のなかで最も一般的に用いられる。しかしながら、多数の他の属、種及び菌株も、一般的に入手可能でここで使用できる、例えば、シゾサッカロマイセスポンベ；クルイベロマイセス宿主、例えばＫ.ラクティス、Ｋ．フラギリス(ＡＴＣＣ１２４２４)、Ｋ.ブルガリカス(ＡＴＣＣ１６０４５)、Ｋ．ウィッケラミイ(ＡＴＣＣ２４１７８)、Ｋ.ワルチイ(ＡＴＣＣ５６５００)、Ｋ．ドロソフィラルム(ＡＴＣＣ３６９０６)、Ｋ．サーモトレランス、及びＫ．マルキシアナス；ヤローウィア(ＥＰ４０２２２６)；ピチアパストリス(ＥＰ１８３０７０)；カンジダ；トリコデルマ・リーシア(ＥＰ２４４２３４)；アカパンカビ；シュワニオマイセス、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス；及び糸状真菌、例えばパンカビ属、アオカビ属、トリポクラジウム、及びコウジカビ属宿主、例えば偽巣性コウジ菌及びクロカビが使用できる。
【００８１】
グリコシル化抗体の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウィルス株及び変異体及び対応する許容可能な昆虫宿主細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ(毛虫)、アエデス・アエジプティ(蚊)、アエデス・アルボピクトゥス(蚊)、ドゥロソフィラ・メラノガスター(ショウジョウバエ)、及びボンビクス・モリが同定されている。トランスフェクションのための種々のウィルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ-１変異体とボンビクス・モリ ＮＰＶのＢｍ-５株が公に利用でき、そのようなウィルスは本発明においてここに記載したウィルスとして使用でき、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞の形質転換に使用できる。綿花、コーン、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコのような植物細胞培養を宿主として利用することができる。
【００８２】
しかしながら、脊椎動物細胞におけるものが最も興味深く、培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (ＣＯＳ-７, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１)；ヒト胚腎臓株(２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977))；ハムスター乳児腎細胞(ＢＨＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ, Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980))；マウスのセルトリ細胞(ＴＭ４, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980))；サルの腎細胞 (ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０)；アフリカミドリザルの腎細胞(ＶＥＲＯ-７６, ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７)；ヒト子宮頸癌細胞 (ＨＥＬＡ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ２)；イヌ腎細胞 (ＭＤＣＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４)；バッファローラット肝細胞 (ＢＲＬ３Ａ, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２)；ヒト肺細胞 (Ｗ１３８, ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５)；ヒト肝細胞 (Ｈｅｐ Ｇ２, ＨＢ８０６５)；マウス乳房腫瘍細胞 (ＭＭＴ０６０５６２, ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞(Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982))；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株(ＨｅｐＧ２)である。
宿主細胞は、抗体生産のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された常套的栄養培地で培養される。
【００８３】
本発明の抗体を産生するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ｈａｍ)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地((ＭＥＭ),(シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((ＤＭＥＭ),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979)、Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980)、米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国再発行特許第３０９８５号に記載された何れの培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地には何れもホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【００８４】
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内、細胞膜周辺腔に生成され、又は培地内に直接分泌される。抗体が細胞内に生成された場合、第１の工程として、宿主細胞か溶解された細胞の何れにしても、粒子状の細片が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。抗体が培地に分泌された場合は、そのような発現系からの上清を、一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＰｅｌｌｉｃｏｎの限外濾過装置を用いて濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めて、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製でき、アフィニティクロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる(Lindmark等, J. immunol. Meth. 62: 1-13 (1983))。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている(Guss等, EMBO J. 5: 16571575 (1986))。アフィニティーリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸＴＭ樹脂(J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂上でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭクロマトグラフィー(ポリアスパラギン酸カラム)、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿法も、回収される多価抗体に応じて利用可能である。
【００８５】
Ｄ．ニューロン再生の刺激因子の使用
本発明のスクリーニングアッセイにおいて同定される分子は、神経細胞の生存を亢進するか又は成長を誘導するための薬剤としての使用を発見したと考えられる。したがって、神経系の変性疾患(「神経変性疾患」)、例えば、物理的な損傷(例えば熱傷、損傷)や糖尿病、腎臓機能不全のような疾患状態によって生じる末梢神経損傷、ないしは癌およびエイズを治療するために用いられる化学療法剤の毒作用によって生じる末梢神経損傷；中枢神経系(脊髄索および脳)への物理的な損傷；脳卒中と関係する脳損傷；及び神経変性に関連する神経学的疾患、例えば、三叉神経痛、舌咽神経痛、ベルの麻痺、重症筋無力症、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)、進行性筋萎縮、進行性延髄の遺伝性筋萎縮、ヘルニア状態、破裂性又は脱出性無脊椎ディスク症候群、頸部脊椎症、叢疾患、胸郭出口破壊症候群、鉛によるものなどの末梢性神経障害、ダプソン(dapsone)、チック、ｐｒｏｐｈｙｒｉａ(prophyria)、ギラン-バレー症候群、アルツハイマー病、ハンチントン病又はパーキンソン病の治療に有用である。
本明細書において同定される化合物は、インビトロで神経細胞を培養するための培養液の構成成分としても有用である。
【００８６】
最後に、放射性ヨード、酵素、蛍光体、スピン標識などによって標識される場合、本明細書中のアッセイによって同定される化合物を含む調製物は、競合結合アッセイの標準物質として有用である。
本明細書中の化合物の治療用製剤は、所望の純度を有する同定された化合物(抗体など)を、任意の生理的に許容される担体、賦形剤又は安定剤(上掲のRemington's Pharmaceutical Sciences)と混合することによって、凍結乾燥されたケーキ又は水溶液の形で保存するために調製される。許容範囲内の担体、賦形剤又は安定剤は、使用する用量及び濃度においてレシピエントに非中毒性であり、これらには、バッファ、例えばリン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量(およそ１０未満の残基)のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン、アミノ酸、例として、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン；単糖、二糖および他の炭水化物、例としてグルコース、マンノース又はデキストリン；ＥＤＴＡなどのキレート剤；糖アルコール、例えばマンニトール又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；および／または非イオン性界面活性剤、例えばツイーン、プルロニック又はＰＥＧが含まれる。
【００８７】
インビボ投与のために使用される化合物は、無菌でなければならない。これは、凍結乾燥および還元の前又は後に、濾過滅菌メンブランによる濾過によって容易に達成される。
治療組成物は、無菌のアクセスポートを有する容器、例えば皮下注射針によって突き刺し可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルに入れられてもよい。
【００８８】
本発明のアッセイによって同定される化合物は、場合によって、ＮＧＦ、ＮＴ−３及び／又はＢＤＮＦを含む神経栄養因子と組み合わされてもよいし、共に投与されてもよく、変性神経疾患のための他の従来の治療法と共に用いられうる。
投与経路は既知の方法、例えば静脈内、腹腔内、大脳内、筋肉内、眼球内、動脈内又は病巣内経路による注射又は注入、局所投与、又は後述する徐放系による。
脳内使用では、ボーラス注入が許容されるが、化合物はＣＮＳの流体リザーバへの注入によって連続的に投与されてもよい。化合物は、脳の室に投与されるか、そうでなければＣＮＳ又は髄液内に導入されるのが好ましい。ポンプのような連続投与手段を用いた留置カテーテルによって投与されてもよいし、徐放性媒介物の移植、例えば脳内移植によって投与されてもよい。より詳しくは、化合物は、慢性的に植設されたカニューレにより注入されてもよいし、浸透圧性ミニポンプを活用して慢性的に注入されてもよい。小さい管を介してタンパク質を脳室に供給する皮下ポンプは有用である。非常に高性能のポンプが皮膚により補充されてもよく、それらの運搬速度は外科的介入なしで設置されうる。全体的に移植されたドラッグデリバリーシステムを介する皮下ポンプ装置又は連続的な脳室内注入を伴う好適な投与プロトコール又はデリバリーシステムの例は、ドーパミン、ドーパミンアゴニストおよびコリン作動性アゴニストのアルツハイマー患者及びパーキンソン病の動物モデルへの投与のために用いられるものである。これはHarbaugh, J. Neural Transm. Suppl., 24:271 (1987)；及びDeYebenes, et al., Mov. Disord. 2:143 (1987)に記載されている。
【００８９】
徐放性調製物の適切な例には、マイクロカプセル又はフィルム等の、成形品の形態である半透性ポリマーマトリックスが含まれる。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド(米国特許第３７７３９１９号、欧州特許第５８４８１号)、Ｌ-グルタミン酸とγエチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー(Sidman等, Biopolymers 22:547 (1983))、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート(Langer, et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167；Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98)、エチレン酢酸ビニル（上掲のLanger等）又はポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシ酪酸(欧州特許第１３３９８８号Ａ)が含まれる。また、徐放性組成物には、当然知られている方法によって調製されうるリポソーマルに取り込まれた組成物が含まれる(Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 3688 (1985)；Hwang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980)；米国特許第４４８５０４５号および同第４５４４５４５号；及び欧州特許第１０２３２４号Ａ)。通常、リポソームは、小さい(およそ２００〜８００オングストローム)単層タイプであり、その中の脂質内容物は最適な治療法のために調製された選択割合であるおよそ３０ｍｏｌ％コレステロールより大きい。
【００９０】
治療に使用される活性化合物の有効量は、例えば、治療の目的、投与の手段および患者の状態に依存するであろう。したがって、用量の力価を測定し、最適な治療効果を得るために必要とされるように投与経路を修飾することが治療者に必要であろう。代表的な１日の用量は、前述の因子に応じて、およそ１ｇ／ｋｇから最高１００ｍｇ／ｋｇ以上まででありうる。典型的には、臨床医は、ニューロンの機能が修復、維持、場合によっては再構築される用量に達するまで、活性化合物を投与するであろう。この治療の進行は従来のアッセイによって容易にモニターされる。
本発明の更なる詳細を以下の非限定的実施例によって例示する。
【実施例】
【００９１】
実施例１ 発現クローニングＬＩＬＲＢ２
阻害性ミエリンタンパク質の新規のレセプターを同定するために、発現クローニング法を行った。バイトとして、以下の特徴付けられたミエリンインヒビター(ヒトｃＤＮＡを用いる)のＮ及び／又はＣ末端にアルカリンホスファターゼ(ＡＰ)を融合させたコンストラクトを生成した。Ｎｏｇｏ６６、ＮｏｇｏＡの２つの付加的阻害ドメイン(ＮｉＲ<ｄｅｌｔａ>Ｄ２及びＮｉＧ<ｄｅｌｔａ>２０)(Oertle T, J Neurosci. 2003, 23(13): 5393-406)、ＭＡＧ及びＯＭｇｐ。バイトタンパク質を含む条件培地(ＤＭＥＭ／２％ＦＢＳ中)を生産するために、２９３細胞にこれらのコンストラクトを形質移入した。スクリーニングに用いるｃＤＮＡライブラリは、完全長ヒトｃＤＮＡクローンを含む、Origeneによって生成される発現容易(expression-ready)ベクターを含む。これらのｃＤＮＡを収集し、配列し、プールした。およそ１００のｃＤＮＡのプールは、ＣＯＳ７細胞に過渡的に形質移入した。
【００９２】
具体的には、１日目に、ＣＯＳ７細胞を、１２ウェルプレートの１ウェル当たり８５０００細胞の密度でプレートに播いた。２日目に、１ウェル当たり１ｍｇのプールされたｃＤＮＡを、脂質ベースの形質移入試薬ＦｕＧＥＮＥ６(Roche)を用いて形質移入した。４日目に、スクリーニングを行った。簡単に言うと、細胞から培養液を取り除き、ＡＰ融合バイトタンパク質(２０〜５０ｎＭ)を含む０．５ｍｌの２９３細胞条件培地に置き換えた。細胞を９０分間、室温でインキュベートした。次いで、リン酸塩緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)にて細胞を３回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドにて７分間固定し、ＨＥＰＥＳ-緩衝生理食塩水(ＨＢＳ)にて３回洗浄し、９０分間、６５℃で熱不活性化して内在性ＡＰ活性を破壊した。ＡＰバッファ(１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ トリスｐＨ９．５)にて細胞を１℃洗浄し、色素生産性基質(Western Blue, Promega)中でインキュベートし、インキュベートの１時間後と終夜インキュベートした後に再度、反応生成物の存在について分析した。膜の表面にかけて濃い青の沈殿物があることによってポジティブ細胞を同定した。ポジティブプールを更に破壊して、後のラウンドのスクリーニングによって個々のポジティブクローンを同定した。
【００９３】
スクリーニングから、以下のポジティブクローンが同定された。
ＭＡＧ−ＡＰバイトにより４つのポジティブクローンを得た。１つは既に特徴付けられているＮｏｇｏレセプターであった(Fournier et al., Nature 409, 342-346 (2001)。これらのヒットクローンのうちの２つは、糖分解処理酵素であって、関連しそうにないと考えられた。４つ目を「クローン６４３(ＬＯＣ57228)、ｍＲＮＡからのホモサピエンス推定タンパク質」と注記した。ｃＤＮＡの更なる分析により、既に記載されているタンパク質ＳＭＡＧに相同なオルターナティブＯＲＦが明らかとなった。
ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６バイトにより２つのポジティブクローンが得られた。１つは既に特徴付けられているＮｏｇｏレセプターであった。他方は「ホモサピエンス白血球免疫グロブリン様レセプター、サブファミリＢ(ＴＭおよびＩＴＩＭドメインを有する)、メンバー２(ＬＩＬＲＢ２)、ｍＲＮＡ」(配列番号：２)であった。この遺伝子もまた、ＭＩＧ１０、ＩＬＴ４及びＬＩＲ２などの複数の代替的な命名法で知られている(Kubagawa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:5261-6 (1997)；Colonna et al., J. Exp. Med. 186: 1809-18 (1997))。
【００９４】
実施例２ ＰｉｒＢ及びＬＩＬＲＢ２を結合するＡＰ−Ｎｏｇｏ６６
Ｎｏｇｏ６６のＬＩＬＲＢ２(配列番号：２)への結合を確認するために、そして、Ｎｏｇｏ６６がマウスオルソログＰｉｒＢ(配列番号：１)に結合するか否かを試験するために、実施例１に記載のものと類似の結合アッセイを行った。簡単に言うと、ＣＯＳ７細胞にＰｉｒＢ、ＬＩＬＲＢ２又はポジティブコントロールとしてＮｇＲをコードするｃＤＮＡを形質移入した。形質移入の４８時間後に、細胞をＡＰ−Ｎｏｇｏ６６を含む２９３細胞条件培地と共に９０分間、室温でインキュベートした。細胞を広範囲に洗浄し、固定して、内在性ＡＰ活性を熱失活によって中和した。次いで、細胞を色素生産性基質(Western Blue, Promega)と反応させた。
図１に示すように、ＰｉｒＢ−発現細胞及びＬＩＬＲＢ２−発現細胞の両方において強力なポジティブシグナルが検出された。
【００９５】
実施例３ ＰｉｒＢおよびＬＩＬＲＢ２を結合するＭＡＧ
ＭＡＧもＰｉｒＢおよびＬＩＬＲＢ２を結合するか否かを試験するために、ＭＡＧ−ＡＰより生理活性があると考えられるＭＡＧ−Ｆｃを用いて結合アッセイを行った。ＣＯＳ７細胞にＰｉｒＢ、ＬＩＬＲＢ２又はポジティブコントロールとしてｍＳＭＡＧＰをコードするｃＤＮＡを形質移入した。形質移入の４８時間後に、細胞をＭＡＧ−Ｆｃを含む２９３細胞条件培地と共に９０分間、室温でインキュベートした。ハンクの緩衝生理食塩水溶液(ＨＢＳＳ)にて細胞を４回洗浄し、２％パラホルムアルデヒドにて５分間固定し、ＨＢＳＳにて４回洗浄して、１０％熱不活性化ヤギ血清(ＨＩＧＳ)を含むＨＢＳＳにて１５分間かけてブロックした。次いで、細胞を抗ヒトＦｃ抗体(１:５００、Jackson Immunochemicals)と共に１時間インキュベートし、１０％ＨＩＧＳを含むＰＢＳにて洗浄し、そして、二次抗体(ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５６８−コンジュゲートヤギ抗マウス、Molecular Probes)と共にインキュベートした。細胞をＰＢＳにて洗浄し、カバーガラスで覆い、逆蛍光顕微鏡を用いて免疫蛍光を検出した。
結果を図２に示す。コントロール細胞と比較して、ＰｉｒＢ−発現細胞およびＬＩＬＲＢ２−発現細胞は、ＭＡＧ−Ｆｃへの結合を示す。この実施例において、ｍＳＭＡＧＰ発現細胞は結合のためのポジティブコントロールとした。
【００９６】
実施例４ 神経系において発現されるＰｉｒｂＢ
ＰｉｒＢが神経系において発現されるか否かを試験するために、異なる神経組織から単離されたｍＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。Ｐ７小脳、Ｐ１０後根神経節(ＤＲＧ)、成体脳および成体脾臓(ポジティブコントロール)を、ＣＤ１マウスから解剖し、ＲＮＡｌａｔｅｒ(Ambion)に直ちに配置した。ｍＲＮＡは、ＲＮＥａｓｙ単離キット(Qiagen)を用いて抽出した。InvitrogenのスーパースクリプトＩＩＩファーストストランド合成システムを用いてｍＲＮＡからｃＤＮＡを生成した。次いで、ＰｉｒＢに特異的なプライマー5'TGAAGGCTCTCATTGGAGTGTCTG3'(配列番号：２０)及び5'GGCATAGGTCACATCCTGGGAC3'(配列番号：３)、ＰｉｒＡサブファミリの異なるメンバーと交差反応するプライマー(5'GTCTCAGAAACCATTGAATCC3'(配列番号：４)及び5'GACAGAAAACTTTGGGTCATCAG3'(配列番号：５))、又はマウスＳＭＡＧＰに特異的なプライマー(5'CCCTCAGCAACGATGAACAACC3'(配列番号：６)及び5'TGGACCCTGGAGTCAGTGATTC3'(配列番号：７))と用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行った。
図３に示すように、ＲＴ−ＰＣＲ分析により、ＰｉｒＢ及びＰｉｒＡアイソフォームの両方は小脳、ＤＲＧおよび脳において検出されることが明らかとなった。
【００９７】
実施例５ インサイツハイブリダイゼーション結果
より詳細にＰｉｒＢの神経系発現を分析するために、インサイツハイブリダイゼーションを行った。成体又は出生後のマウスを灌流し、その後脳およびＤＲＧを取り出し、終夜固定した。その後、組織を３０％スクロースにおいて低温保護し、包埋して、Ｏ.Ｃ.Ｔ化合物(Tissue-Tek)にて凍結させた。凍結組織を１２ミクロン厚に切断した。製造業者のプロトコールに従って、ＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔインビトロ転写キット(Ambion)を使用して放射性プローブを調製した。製造業者のプロトコールに従って、mRNAlocator ISHキット(Ambion)を用いてインサイツハイブリダイゼーションを行った。
ＰｉｒＢプローブは、ＰｉｒＢに特有の膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインに存在する、ヌクレオチド＃１９２２−２３８５にハイブリダイズするように設定した。この領域を増幅するために使用するプライマーは、5'TGAAGGCTCTCATTGGAGTGTCTG3'(配列番号：８)および5'GGCATAGGTCACATCCTGGGAC3'(配列番号：９)とした。４６４ｂｐの断片を、ｐＣＲＩＩ-ＴＯＰＯ(Invitrogen)にクローニングした。
インサイツハイブリダイゼーションの結果を図４Ａ−４Ｃに示す。ポジティブハイブリダイゼーションシグナルは、皮質の全体、海馬、小脳、及びＤＲＧの細胞において観察される。
【００９８】
実施例６ 軸索成長のＮｏｇｏ６６阻害と小脳顆粒ニューロンのＰｉｒＢ ＥＣＤによるそのレスキュー
この実施例では、Ｎｏｇｏ６６の軸索成長を阻害する能力を確認した。さらに、ＰｉｒＢ細胞外ドメインコンストラクトを、Ｎｏｇｏ６６阻害活性干渉能について試験した。
ヒト胎盤アルカリホスファターゼ(ＡＰ)遺伝子の下流のＮｏｇｏＡの６６アミノ酸阻害性ループをクローニングしてＡＰ−Ｎｏｇｏ６６を生成した。コンストラクトのＮ末端をＦＬＡＧタグ化して精製可能にし、ｐＲＫベクター主鎖(Genentech)に挿入した。ＰｉｒＢ細胞外ドメイン(ＥＣＤ)タンパク質を生成するために、ＰｉｒＢのアミノ酸＃１−６３８を、ｐＲＫ発現ベクター内の、８-Ｈｉｓタグ(ＰｉｒＢＨｉｓ)又はヒトＦｃ(ＰｉｒＢＦｃ)の上流にクローニングした。これらの発現コンストラクトを、ＣＨＯ細胞に過渡的に形質移入し、分泌されたタンパク質を親和性クロマトグラフィによって条件培地から精製した。
【００９９】
小脳顆粒ニューロン(ＣＧＮ)をＰ７ ＣＤ１マウスから単離し、阻害アッセイのために、固定したＡＰ−Ｎｏｇｏ６６タンパク質上で培養した。簡単に言うと、ポリ−Ｄ−リジン(Biocoat, Becton Dickinson)にて予めコートした９６ウェルプレートを、組み換えＡＰ−Ｎｏｇｏ６６(１８０又は３００ｎｇ／３ｕｌスポット)にてスポットした。ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６単独でコートし、過剰量のＰｉｒＢＦｃ(８５０ｎｇ／３ｕｌスポット)又はＰｉｒＢＨｉｓ(１０００ｎｇ／３ｕｌスポット)のいずれかと混合した。これにより、２〜４倍モル過剰量のＰｉｒＢ ＥＣＤを含むスポットとなった。スポットしたタンパク質を２時間かけて付着させ、その後、プレートを１０ｕｇ／ｍｌのラミニン(Invitrogen)にて処理した。Zheng et al., 2005に記載されているように、マウスＰ７小脳細胞を調製し、２×１０４細胞／ウェルの濃度でプレートに播いた。培養物を３７℃で２２時間インキュベートし、４％パラホルムアルデヒド／４％スクロースにて固定し、抗チューブリン抗体(ＴｕＪ1、Covance)にて染色した。画像は、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ撮像システム(Molecular Devices)にて撮影した。
図６に示すように、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６はＰ７小脳ニューロンからの軸索成長を強力に阻害する。ＰｉｒＢＦｃ又はＰｉｒＢＨｉｓのいずれであっても、過剰量のＰｉｒＢ ＥＣＤの存在により、この阻害は有意に低減された。他のコントロールタンパク質(Ｆｃ又はＲｏｂｏ４Ｆｃ)とＡＰ−Ｎｏｇｏ６６の混合では阻害は低減しなかった。
【０１００】
実施例７ ＰｉｒＢ及びＮｇＲの同時免疫沈降
この実験は、インビトロで宿主細胞中で同時に発現した場合の、ＰｉｒＢとＮｇＲの関係及び潜在的相互作用を調べるものである。
コントロールベクター、完全長ＰｉｒＢ又は完全長ＰｉｒＢと完全長ＮｇＲとの混合をＣＯＳ７細胞に過渡的に形質移入した。形質移入の４８時間後に、細胞溶解バッファ(Cell Signaling Technology)にて細胞を溶解し、可溶化液を抗ＰｉｒＡ／Ｂ(6C1, Pharmingen)を用いて免疫沈降した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて試料を分離し、ニトロセルロースに転写させ、抗ＮｇＲ(Alpha Diagnostics International)にて検索した。
図７に示すように、ＮｇＲはＰｉｒＢと完全に同時に沈降した(左のパネル)。右のパネルは、抗ＮｇＲにてイムノブロットした総細胞可溶化液からの総タンパク質を示す。異なる程度にグリコシル化されてプロセシングされたＮｇＲを表す複数のバンド(矢印)が観察される。
【０１０１】
実施例８ Ｎｏｇｏ６６軸索成長阻害活性を干渉するためのＰｉｒＢ抗体とその使用
この実験では、ＰｉｒＢに対する抗体を、軸索成長のＮｏｇｏ６６誘導性阻害を干渉する能力について試験した。
小脳顆粒ニューロン(ＣＧＮ)をＰ７ ＣＤ１マウスから単離し、前記の実施例に記載したように、阻害アッセイのために固定したＡＰ−Ｎｏｇｏ６６タンパク質上で培養した。基本的にLiang et al., J. Mol. Biol. 366(3): 815-819 (2006)(出典明記によって本明細書中に援用される)に記載されるように、機能−遮断抗体は、ヒト合成抗体ファージライブラリに対してＰｉｒＢ ＥＣＤをスクリーニングすることによって生成した。ＰｉｒＢへのＡＰ−Ｎｏｇｏ６６の結合との競合能についてクローンを選択した。この実験では、抗ＰｉｒＢ又はコントロール抗体をＡＰ−Ｎｏｇｏ６６にて生育させたニューロンと共にインキュベートした。図８に示すように、抗ＰｉｒＢ抗体によりＡＰ−Ｎｏｇｏ６６による阻害が有意に減少した。
【０１０２】
開示内容の全体にわたってすべての参考文献は、その全体が出典明記によって特別に援用される。
本発明は、特定の実施態様であるために考慮されることに関して記載されているが、本発明がこのような実施態様に限定されると解されるものではない。反対に、本発明は、添付の特許請求の範囲と精神に包含される多くの変更と等価物を包含することを意図する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢとミエリンないしはミエリン関連タンパク質又はその断片とを含む複合体に候補薬剤を接触させ、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢとミエリンないしはミエリン関連タンパク質又はその断片との相互作用を阻害する該候補薬剤の能力を検出することを含み、このとき相互作用が阻害される場合に該候補薬剤がアンタゴニストとして同定される、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストを同定するための方法。
【請求項２】
相互作用が結合である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
相互作用が細胞性シグナル伝達である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞性シグナル伝達により軸索の成長又はニューロンの再生が阻害される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ミエリン関連タンパク質がＮｏｇｏ、ＭＡＧおよびＯＭｇｐからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢがＬＩＬＲＢ１、ＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ３およびＬＩＬＲＢ５からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢが、ＬＩＬＲＢ２、転写産物変異体１(配列番号：２)、ＬＩＬＲＢ２、転写産物変異体２(配列番号：１４)、ＬＩＬＲＢ１、転写産物変異体１(配列番号：１０)、ＬＩＬＲＢ１、転写産物変異体２(配列番号：１１)、ＬＩＬＲＢ１、転写産物変異体３(配列番号：１２)、ＬＩＬＲＢ１、転写産物変異体４(配列番号：１３)、ＬＩＬＲＢ３、転写産物変異体１(配列番号：１５)、ＬＩＬＲＢ３、転写産物変異体２(配列番号：１６)、ＬＩＬＲＢ５、転写産物変異体１(配列番号：１７)、ＬＩＬＲＢ５、転写産物変異体２(配列番号：１８)およびＬＩＬＲＢ５、転写産物変異体３(配列番号：１９)からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＰｉｒＢが、ＬＩＬＲＢ２、転写産物変異体１(配列番号：２)又はＬＩＬＲＢ２、転写産物変異体２(配列番号：１４)である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
複合体がさらにＮｇＲを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
候補薬剤が、抗体、ポリペプチド、ペプチド、核酸、短い干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)、小有機分子、多糖およびポリヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
候補薬剤が抗体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体がＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢを特異的に結合する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体がＬＩＬＲＢ２を特異的に結合する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体がキメラ抗体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体がヒト抗体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体が抗原結合性断片である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体断片が、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'およびＦ(ａｂ')２断片からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
候補薬剤が短い干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)である、請求項１０に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢおよび前記ミエリンないしはミエリン関連タンパク質又はその断片の少なくとも一が固定されている、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
細胞に基づくアッセイである、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞に基づくアッセイが、前記ミエリンないしはミエリン関連タンパク質又はその断片と神経細胞とを前記候補薬剤の存在下及び非存在下にて培養し、神経突起長の変化を決定することを含み、このとき神経突起長が該候補薬剤の存在下において長い場合に、該候補薬剤がアンタゴニストとして同定される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記神経細胞が原発性ニューロンである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記神経細胞が胎仔の幹(ＥＳ)細胞又は細胞株由来である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記神経細胞が神経芽細胞腫由来である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記神経細胞が、小脳顆粒ニューロン、後根神経節ニューロンおよび皮質ニューロンからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
さらに、神経突起の成長を亢進し、及び／又はニューロンの成長、修復及び／又は再生を促すために、同定されたアンタゴニストを使用する工程を含む、請求項１から２７の何れか一に記載の方法。
【請求項２９】
さらに、神経突起の成長の亢進、ニューロンの成長、修復又は再生の促進から利益を得る疾患又は症状を有する被検体に、同定されたアンタゴニストが投与される工程を含む、請求項１から２７の何れか一に記載の方法。
【請求項３０】
前記疾患又は症状が神経学的疾患である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記神経学的疾患が物理的に損傷された神経に特徴がある、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記神経学的疾患が、物理的な損傷によって生じる末梢神経損傷、糖尿病；中枢神経系への物理的な損傷；脳卒中に関連した脳損傷、三叉神経痛、舌咽神経痛、ベルの麻痺、重症筋無力症、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)、進行性筋萎縮、進行性延髄の遺伝性筋萎縮、ヘルニア状態、破裂性及び脱出性無脊椎ディスク症候群、頸部脊椎症、叢疾患、胸郭出口破壊症候群、末梢性神経障害、ｐｒｏｐｈｙｒｉａ、ギラン-バレー症候群、アルツハイマー病、ハンチントン病およびパーキンソン病からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１から３０の何れか一に記載の方法によって同定される薬剤。
【請求項３４】
抗体、ポリペプチド、ペプチド、核酸、小有機分子、多糖およびポリヌクレオチドからなる群から選択される、請求項３３に記載の薬剤。
【請求項３５】
抗体である、請求項３４に記載の薬剤。
【請求項３６】
短い干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)である、請求項３４に記載の薬剤。
【請求項３７】
ニューロン再生の刺激のための請求項３３に記載の薬剤を含有してなる組成物。
【請求項３８】
請求項３３に記載の薬剤とニューロン再生のための指示とを具備するキット。
【請求項３９】
請求項１から３０のいずれかによって同定されたＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストにＣＮＳのニューロンを接触させることを含む、ＣＮＳのニューロンの軸索成長の阻害を低減する方法。
【請求項４０】
請求項１から３０のいずれかによって同定されたＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストにＣＮＳのニューロンを接触させることを含む、ＣＮＳのニューロンの軸索成長を促進する方法。
【請求項４１】
請求項１から３０のいずれかによって同定されたＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストを被検体に投与することを含む、被検体の神経損傷を治療する方法。
【請求項４２】
請求項１から３０のいずれかによって同定されたＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストにＣＮＳのニューロンを接触させることを含む、ＣＮＳのニューロンの生存度を維持する方法。
【請求項４３】
ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストを同定するための、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢおよびミエリンないしはミエリン関連タンパク質又はその断片の複合体の使用。
【請求項４４】
神経突起の成長の亢進、ニューロンの成長、修復又は再生の促進から利益を得る疾患又は症状の治療ための医薬の調製におけるＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストの使用。
【請求項４５】
神経学的疾患の治療のための医薬の調製におけるＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストの使用。
【請求項４６】
前記神経学的疾患が物理的に損傷された神経に特徴がある、請求項４５に記載の使用。
【請求項４７】
前記神経学的疾患が、物理的な損傷によって生じる末梢神経損傷、糖尿病；中枢神経系への物理的な損傷；脳卒中に関連した脳損傷、三叉神経痛、舌咽神経痛、ベルの麻痺、重症筋無力症、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)、進行性筋萎縮、進行性延髄の遺伝性筋萎縮、ヘルニア状態、破裂性及び脱出性無脊椎ディスク症候群、頸部脊椎症、叢疾患、胸郭出口破壊症候群、末梢性神経障害、ｐｒｏｐｈｙｒｉａ、ギラン-バレー症候群、アルツハイマー病、ハンチントン病およびパーキンソン病からなる群から選択される、請求項４５に記載の使用。
【請求項４８】
神経突起の成長の亢進、ニューロンの成長、修復又は再生の促進から利益を得る疾患又は症状の治療に使用するためのＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニスト。
【請求項４９】
神経学的疾患の治療に使用するためのＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニスト。
【請求項５０】
前記神経学的疾患が物理的に損傷された神経に特徴がある、請求項５０に記載のＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニスト。
【請求項５１】
前記神経学的疾患が、物理的な損傷によって生じる末梢神経損傷、糖尿病；中枢神経系への物理的な損傷；脳卒中に関連した脳損傷、三叉神経痛、舌咽神経痛、ベルの麻痺、重症筋無力症、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)、進行性筋萎縮、進行性延髄の遺伝性筋萎縮、ヘルニア状態、破裂性及び脱出性無脊椎ディスク症候群、頸部脊椎症、叢疾患、胸郭出口破壊症候群、末梢性神経障害、ｐｒｏｐｈｙｒｉａ、ギラン-バレー症候群、アルツハイマー病、ハンチントン病およびパーキンソン病からなる群から選択される、請求項５０に記載のＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニスト。
【請求項１】
ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢとミエリンないしはミエリン関連タンパク質又はその断片とを含む複合体に候補薬剤を接触させ、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢとミエリンないしはミエリン関連タンパク質又はその断片との相互作用を阻害する該候補薬剤の能力を検出することを含み、このとき相互作用が阻害される場合に該候補薬剤がアンタゴニストとして同定される、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストを同定するための方法。
【請求項２】
相互作用が結合である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
相互作用が細胞性シグナル伝達である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞性シグナル伝達により軸索の成長又はニューロンの再生が阻害される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ミエリン関連タンパク質がＮｏｇｏ、ＭＡＧおよびＯＭｇｐからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢがＬＩＬＲＢ１、ＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ３およびＬＩＬＲＢ５からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢが、ＬＩＬＲＢ２、転写産物変異体１(配列番号：２)、ＬＩＬＲＢ２、転写産物変異体２(配列番号：１４)、ＬＩＬＲＢ１、転写産物変異体１(配列番号：１０)、ＬＩＬＲＢ１、転写産物変異体２(配列番号：１１)、ＬＩＬＲＢ１、転写産物変異体３(配列番号：１２)、ＬＩＬＲＢ１、転写産物変異体４(配列番号：１３)、ＬＩＬＲＢ３、転写産物変異体１(配列番号：１５)、ＬＩＬＲＢ３、転写産物変異体２(配列番号：１６)、ＬＩＬＲＢ５、転写産物変異体１(配列番号：１７)、ＬＩＬＲＢ５、転写産物変異体２(配列番号：１８)およびＬＩＬＲＢ５、転写産物変異体３(配列番号：１９)からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＰｉｒＢが、ＬＩＬＲＢ２、転写産物変異体１(配列番号：２)又はＬＩＬＲＢ２、転写産物変異体２(配列番号：１４)である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
複合体がさらにＮｇＲを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
候補薬剤が、抗体、ポリペプチド、ペプチド、核酸、短い干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)、小有機分子、多糖およびポリヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
候補薬剤が抗体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体がＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢを特異的に結合する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体がＬＩＬＲＢ２を特異的に結合する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体がキメラ抗体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体がヒト抗体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体が抗原結合性断片である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体断片が、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'およびＦ(ａｂ')２断片からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
候補薬剤が短い干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)である、請求項１０に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢおよび前記ミエリンないしはミエリン関連タンパク質又はその断片の少なくとも一が固定されている、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
細胞に基づくアッセイである、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞に基づくアッセイが、前記ミエリンないしはミエリン関連タンパク質又はその断片と神経細胞とを前記候補薬剤の存在下及び非存在下にて培養し、神経突起長の変化を決定することを含み、このとき神経突起長が該候補薬剤の存在下において長い場合に、該候補薬剤がアンタゴニストとして同定される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記神経細胞が原発性ニューロンである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記神経細胞が胎仔の幹(ＥＳ)細胞又は細胞株由来である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記神経細胞が神経芽細胞腫由来である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記神経細胞が、小脳顆粒ニューロン、後根神経節ニューロンおよび皮質ニューロンからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
さらに、神経突起の成長を亢進し、及び／又はニューロンの成長、修復及び／又は再生を促すために、同定されたアンタゴニストを使用する工程を含む、請求項１から２７の何れか一に記載の方法。
【請求項２９】
さらに、神経突起の成長の亢進、ニューロンの成長、修復又は再生の促進から利益を得る疾患又は症状を有する被検体に、同定されたアンタゴニストが投与される工程を含む、請求項１から２７の何れか一に記載の方法。
【請求項３０】
前記疾患又は症状が神経学的疾患である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記神経学的疾患が物理的に損傷された神経に特徴がある、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記神経学的疾患が、物理的な損傷によって生じる末梢神経損傷、糖尿病；中枢神経系への物理的な損傷；脳卒中に関連した脳損傷、三叉神経痛、舌咽神経痛、ベルの麻痺、重症筋無力症、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)、進行性筋萎縮、進行性延髄の遺伝性筋萎縮、ヘルニア状態、破裂性及び脱出性無脊椎ディスク症候群、頸部脊椎症、叢疾患、胸郭出口破壊症候群、末梢性神経障害、ｐｒｏｐｈｙｒｉａ、ギラン-バレー症候群、アルツハイマー病、ハンチントン病およびパーキンソン病からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１から３０の何れか一に記載の方法によって同定される薬剤。
【請求項３４】
抗体、ポリペプチド、ペプチド、核酸、小有機分子、多糖およびポリヌクレオチドからなる群から選択される、請求項３３に記載の薬剤。
【請求項３５】
抗体である、請求項３４に記載の薬剤。
【請求項３６】
短い干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)である、請求項３４に記載の薬剤。
【請求項３７】
ニューロン再生の刺激のための請求項３３に記載の薬剤を含有してなる組成物。
【請求項３８】
請求項３３に記載の薬剤とニューロン再生のための指示とを具備するキット。
【請求項３９】
請求項１から３０のいずれかによって同定されたＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストにＣＮＳのニューロンを接触させることを含む、ＣＮＳのニューロンの軸索成長の阻害を低減する方法。
【請求項４０】
請求項１から３０のいずれかによって同定されたＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストにＣＮＳのニューロンを接触させることを含む、ＣＮＳのニューロンの軸索成長を促進する方法。
【請求項４１】
請求項１から３０のいずれかによって同定されたＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストを被検体に投与することを含む、被検体の神経損傷を治療する方法。
【請求項４２】
請求項１から３０のいずれかによって同定されたＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストにＣＮＳのニューロンを接触させることを含む、ＣＮＳのニューロンの生存度を維持する方法。
【請求項４３】
ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストを同定するための、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢおよびミエリンないしはミエリン関連タンパク質又はその断片の複合体の使用。
【請求項４４】
神経突起の成長の亢進、ニューロンの成長、修復又は再生の促進から利益を得る疾患又は症状の治療ための医薬の調製におけるＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストの使用。
【請求項４５】
神経学的疾患の治療のための医薬の調製におけるＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストの使用。
【請求項４６】
前記神経学的疾患が物理的に損傷された神経に特徴がある、請求項４５に記載の使用。
【請求項４７】
前記神経学的疾患が、物理的な損傷によって生じる末梢神経損傷、糖尿病；中枢神経系への物理的な損傷；脳卒中に関連した脳損傷、三叉神経痛、舌咽神経痛、ベルの麻痺、重症筋無力症、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)、進行性筋萎縮、進行性延髄の遺伝性筋萎縮、ヘルニア状態、破裂性及び脱出性無脊椎ディスク症候群、頸部脊椎症、叢疾患、胸郭出口破壊症候群、末梢性神経障害、ｐｒｏｐｈｙｒｉａ、ギラン-バレー症候群、アルツハイマー病、ハンチントン病およびパーキンソン病からなる群から選択される、請求項４５に記載の使用。
【請求項４８】
神経突起の成長の亢進、ニューロンの成長、修復又は再生の促進から利益を得る疾患又は症状の治療に使用するためのＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニスト。
【請求項４９】
神経学的疾患の治療に使用するためのＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニスト。
【請求項５０】
前記神経学的疾患が物理的に損傷された神経に特徴がある、請求項５０に記載のＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニスト。
【請求項５１】
前記神経学的疾患が、物理的な損傷によって生じる末梢神経損傷、糖尿病；中枢神経系への物理的な損傷；脳卒中に関連した脳損傷、三叉神経痛、舌咽神経痛、ベルの麻痺、重症筋無力症、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)、進行性筋萎縮、進行性延髄の遺伝性筋萎縮、ヘルニア状態、破裂性及び脱出性無脊椎ディスク症候群、頸部脊椎症、叢疾患、胸郭出口破壊症候群、末梢性神経障害、ｐｒｏｐｈｙｒｉａ、ギラン-バレー症候群、アルツハイマー病、ハンチントン病およびパーキンソン病からなる群から選択される、請求項５０に記載のＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニスト。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公表番号】特表２０１０−５０９６１２（Ｐ２０１０−５０９６１２Ａ）
【公表日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３７２８５（Ｐ２００９−５３７２８５）
【出願日】平成１９年１１月９日（２００７．１１．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８４２９０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０６１０１９
【国際公開日】平成２０年５月２２日（２００８．５．２２）
【出願人】（５０９０１２６２５）ジェネンテック インコーポレイテッド (357)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１１月９日（２００７．１１．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８４２９０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０６１０１９
【国際公開日】平成２０年５月２２日（２００８．５．２２）
【出願人】（５０９０１２６２５）ジェネンテック インコーポレイテッド (357)
【Ｆターム（参考）】
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