ノイズ蛍光処理方法及び蛍光検出システム
【課題】 ハイブリダイゼーションなどの物質間の相互作用を蛍光検出する技術に関して、新規バックグラウンドノイズ低減技術を提供すること。
【解決手段】 プローブ分子（例えば、プローブ核酸分子Ｘ）を固相表面の反応領域へ固定しておき、該プローブ分子とターゲット分子（例えば、プローブ核酸分子Ｘと相補的なターゲット核酸分子Ｙ）の間の相互作用（ハイブリダイゼーション）を、蛍光シグナルで検出する方法において、選定された所定波長の光を、前記相互作用検出のノイズ蛍光原因物質（例えば、遊離一本鎖核酸分子Ｘ）が存在する固相表面領域１２ｂに向けて照射することによって、前記ノイズ蛍光原因物質由来の蛍光の発光量を減衰又は消失させる。
【解決手段】 プローブ分子（例えば、プローブ核酸分子Ｘ）を固相表面の反応領域へ固定しておき、該プローブ分子とターゲット分子（例えば、プローブ核酸分子Ｘと相補的なターゲット核酸分子Ｙ）の間の相互作用（ハイブリダイゼーション）を、蛍光シグナルで検出する方法において、選定された所定波長の光を、前記相互作用検出のノイズ蛍光原因物質（例えば、遊離一本鎖核酸分子Ｘ）が存在する固相表面領域１２ｂに向けて照射することによって、前記ノイズ蛍光原因物質由来の蛍光の発光量を減衰又は消失させる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物質間の相互作用を蛍光検出する際のＳ／Ｎを向上するための新規技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、マイクロアレイ技術によって所定のＤＮＡが微細配列された、いわゆるＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイ（以下、本願では「ＤＮＡチップ」と総称。）と呼ばれるバイオアッセイ用の集積基板が、遺伝子の変異解析、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析等に利用されるようになり、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、進化の研究、法医学その他の分野において広範囲に活用され始めている。
【０００３】
この「ＤＮＡチップ」は、ガラス基板やシリコン基板上に多種・多数のＤＮＡオリゴ鎖やｃＤＮＡ（complementary DNA）等のヌクレオチド鎖が集積されていることから、ハイブリダイゼーションの網羅的解析が可能となる点が特徴とされている。
【０００４】
ここで、前記ハイブリダイゼーションの検出は、一般には、どのプローブが試料中のヌクレオチド鎖と二本鎖を形成したかを示す蛍光シグナルを発する基板上の位置を、光学的に検出する。前記蛍光シグナルは、通常、資料中のヌクレオチド鎖に標識された蛍光物質を励起することにより得られるが、近年、二本鎖核酸の塩基対部分に特異的に吸着する蛍光発色性のインターカレーターが提案されている。
【０００５】
ＤＮＡチップを用いたハイブリダイゼーションの検出の精度は、いまだ改善の余地が多い。改善のためのアプローチは、いくつかあるが、中でも前記蛍光シグナルのＳ／Ｎ比の向上が重要である。即ち、検出される蛍光シグナルから、本質的にハイブリダイゼーションとは無関係のノイズ（バックグラウンド蛍光）をどれだけ排除できるかということが、ハイブリダイゼーション検出の精度の向上に直結する。この点、ハイブリダイゼーション以外の分子間相互作用を蛍光検出する技術においても共通である。
【０００６】
特許文献１は、ＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）を用いた蛍光検出におけるバックグラウンドノイズを低減するために、消光剤を用いる技術が開示されている。特許文献２には、プローブＤＮＡがループ構造を形成してその解放末端側が基板側にあるようにすることによって、バックグラウンドノイズを低減しようとする技術が開示されている。特許文献３には、コロナ放電処理を利用して担体表面の親水性を制御し、該担体表面への埃の付着を抑制することによって、蛍光分析に際してのバックグランドノイズを低くする技術が開示されている。
【０００７】
このように、蛍光分析に際してバックグラウンドノイズを低減するためのアプローチとして、他の薬剤を用いる方法（特許文献１）、プローブＤＮＡの構造を工夫する方法（特許文献２）、担体（基板）表面に対する処理を施す方法（特許文献３）などが知られている。さらには、バックグラウンドノイズの原因となる物質を、検出領域から洗浄除去した後に、蛍光検出を行う技術も広く採用されている。
【特許文献１】特開２００３−８４００２号公報（特に、請求項１参照）。
【特許文献２】特開２００３−３２９６７６号公報。
【特許文献１】特開２００３−０２８８６７号公報。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ハイブリダイゼーションなどの物質間の相互作用を蛍光検出する技術に関して、従来とは全く技術的思想を異にする、バックグラウンドノイズ低減技術を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明では、プローブ分子を、基板などの固相表面の反応領域へ固定しておき、該プローブ分子が関与する分子間の相互作用を、蛍光シグナルで検出する方法を対象とし、選定された所定波長の光を、前記相互作用検出の際のノイズ蛍光の原因となる物質（ノイズ蛍光原因物質）が存在する固相表面領域に向けて照射することによって、前記ノイズ蛍光原因物質由来の蛍光の発光量を、減衰又は消失させるという構成のノイズ蛍光処理方法を提供する。この方法により、ノイズ蛍光原因物質を光照射によって分解し、蛍光の発光量を、減衰又は消失させ、検出段階におけるノイズ蛍光原因物質の水溶液洗浄作業を不要化する。
【００１０】
ノイズ蛍光原因分子由来の蛍光の発光量を減衰又は消失させるときに用いる光（以下「蛍光減衰光」と称する。）は、例えば、プローブ分子が存在しない「プローブ不存在領域」だけを狙って照射する。これにより、検出に有用な蛍光の発光量にできるだけ喪失しないようにする。
【００１１】
一例を挙げると、二光子励起原理によって、前記蛍光減衰光を目的の前記プローブ不存在領域にだけ照射するようにしてもよい。二光子励起原理を採用する構成では、三次元的に二光子吸収位置を選択できることから、プローブ存在領域を避けて光を照射する方法をわざわざ採用しなくても、ノイズ蛍光を減衰又は消失させることができる。即ち、二光子吸収は、焦点深度内のみを励起できるため、フォーカスを調整すれば、プローブが存在する表面領域の上方領域に狙いを定めて、該上方領域に遊離しているノイズ蛍光原因分子由来の蛍光の発光量を減衰又は消失させることが可能となる。
【００１２】
また、分子間の相互作用が進行する反応領域へ電界を印加することによって、ノイズ蛍光原因物質を、誘電泳動その他の電気力学的効果によってプローブ不存在領域へ移動させた後、該プローブ不存在領域へ前記蛍光減衰光を照射するように工夫してもよい。これによって、一度の光照射で、より多くのノイズ蛍光原因物質由来の蛍光の発光量を、減衰又は消失させることができる。
【００１３】
前記プローブ分子それ自体は、特に限定されず、本発明の目的に沿う範囲であらゆる生体分子を含む。例えば、プローブＤＮＡなどの検出用核酸分子であり、前記相互作用がハイブリダイゼーションである場合において、本発明に係るノイズ蛍光処理方法は、特に有用である。
【００１４】
前記ノイズ蛍光原因物質として、特に想定されるのは、次の（１）、（２）のいずれかの物質である。即ち、（１）蛍光色素が標識された遊離一本鎖核酸分子、（２）蛍光インターカレーターが結合した遊離一本鎖核酸分子、である。
【００１５】
次に、本発明は、基板などの固相表面の所定位置に存在する分子の相互作用に係わる蛍光シグナルを検出するシステムを提供する。
【００１６】
具体的には、前記固相表面の位置を検出する位置検出手段と、前記手段によって検出された位置へ蛍光励起光を出射する第一光源手段と、前記固相表面に存在するノイズ原因分子由来の蛍光の発光量を、減衰又は消失させる光を前記固相表面へ照射する第二光源手段と、前記光源から照射された光の焦点を定めるフォーカス手段と、を少なくとも備える蛍光検出システムを提供する。
【００１７】
前記第二光源手段は、例えば、レーザー、ＬＥＤ、紫外線ランプのいずれかから選択される光源を採用できる。また、前記第一光源手段と前記第二光源手段は、一体共通の光源を用いてもよく、この場合、出射光の出力強度を制御することにより、第一光源手段用途と前記第二光源手段用途を使い分けできるようにする。
【００１８】
ここで、本発明に関連する主たる技術用語について説明する。
【００１９】
「プローブ分子」とは、反応領域に貯留又は保持された媒質中に存在し、当該分子と特異的に相互作用するターゲット分子を検出するための探り針（検出子）として機能する分子である。例えば、ＤＮＡプローブなどのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが代表的である。
【００２０】
「核酸」とは、プリンまたはピリミジン塩基と糖がグリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステルの重合体（ヌクレオチド鎖）を意味し、プローブＤＮＡを含むオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオチオドが重合したＤＮＡ（全長あるいはその断片）、逆転写により得られるｃＤＮＡ（ｃプローブＤＮＡ）、ＲＮＡ、ポリアミドヌクレオチド誘導体（ＰＮＡ）等を広く含む。
【００２１】
「相互作用」とは、物質間の非共有結合、共有結合、水素結合を含む化学的結合あるいは解離を広く意味し、例えば、核酸分子間のハイブリダイゼーション、タンパク質間の相互作用、抗原抗体反応などの物質間の化学的結合あるいは解離を広く含む。なお、「ハイブリダイゼーション」は、相補的な塩基配列構造を備える間の相補鎖（二本鎖）形成反応を意味する。
【００２２】
「固相表面」は、反応領域と固体の臨界表面層を意味し、例えば、基板表面や合成樹脂ビーズなどの粒子表面などを挙げることができる。
【００２３】
「反応領域」は、ハイブリダイゼーションなどの相互作用の場を提供できる領域であり、一例を挙げるなら、液相やゲルなどを貯留できるウエル形状を有する反応場である。
【００２４】
「ノイズ蛍光原因物質」は、蛍光検出において、バックグラウンドノイズとなる蛍光（ノイズ蛍光）を発生する原因となる物質であり、例えば、既述したように、蛍光色素が標識されたり、蛍光インターカレーターが結合したりした遊離一本鎖核酸分子である。場合によっては、目的外の所に非特異的に吸着したり、遊離状態にあったりする蛍光インターカレーターも該当する。
【００２５】
「二光子励起原理」は、二個の光子を非常に短い時間の間に吸収させて蛍光分子を励起させる原理を言う。
【００２６】
「蛍光インターカレーター」は、二本鎖核酸に挿入結合等する蛍光性物質であり、ハイブリダイゼーション検出に用いられる物質である。例えば、ＰＯＰＯ−１やＴＯＴＯ−３、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩなどを挙げることができる。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、効率よく短時間で、ノイズ成分となる蛍光量を消失また減衰させることができる。このため、ハイブリダイゼーション等の相互作用を進行させた後に、ノイズ蛍光の発生原因となる物質を除去するための水溶液洗浄作業を行わなくても、前記相互作用を、良好なＳ／Ｎに基づいて、定量検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、本発明を実施するための好適な形態について、添付図面を参照しながら説明する。なお、添付図面に示された各実施形態は、本発明に係わる物や方法の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００２９】
まず、図１は、本発明に係る方法やシステムに利用又は適用可能な固相表面を提供できる基板の一実施形態例を示す図である。
【００３０】
まず、このような基板は、ＣＤ（Compact Disc）、ＤＶＤ（Degital Versatile Disc）、ＭＤ(Mini Disc)等の光情報記録媒体と同様の基材から形成することができる。また、基板の形状は、特に限定されず、矩形状、多角形状などを広く採用できるが、例えば、図１に示すような円盤状をなす基板（ディスク）を採用することができる。
【００３１】
図１に示されたよう円盤状をなす基板１（１ａ）は、光透過性の石英ガラスやシリコン、ポリカーボネート、ポリスチレン等の合成樹脂、好ましくは射出成形可能な合成樹脂によって円盤状に成形する。基板１を安価な合成樹脂を用いて基板を成形することで、従来使用されていたガラスチップに比して、低ランニングコストを実現できる。
【００３２】
また、基板１（１ａ）の中央部分には、図１中に符号２で示された所定口径の孔１１（又は貫通しない穴でもよい。）を形成しておいてもよい。この孔１１に、スピンドルなどのチャッキング治具を挿着することによって、該基板１を保持したり、回転させたりすることができる。
【００３３】
また、この孔１１に対して給電用の通電治具（図示せず）を挿着すれば、該通電治具及び基板１ａに這い回りされた給電配線を介して、基板１上に配設された各反応領域に対して、電界を印加することが可能となる。
【００３４】
基板１上に配設された反応領域１２は、プローブ分子を化学結合等により固定化できる固相表面構成を備える領域であって、ハイブリダイゼーションやタンパク質間相互作用、抗原抗体反応などに代表される分子間（物質間）の相互作用を進行させることができる条件を有する領域である。
【００３５】
この反応領域１２は、例えば、その周辺領域から親媒性原理によって区画された領域、あるいは物理的構造によって区画された領域（例えば、ウエル状領域）でもよく、さらには、基板１に形成されているような条溝構造部位１３（図１参照）の底面領域でもよい。
【００３６】
円盤状をなす基板１に対して条溝構造１３を形成する場合は、図１に示されているように、基板１の中央から外周方向に向かって延設されており、全体外観視、放射状を呈するような形態としてもよい。
【００３７】
この条溝構造部位１３は、この条溝構造部位１３の幅方向一部断面図である図２に示すように、基板１に上蓋部材２を重ね合せることによって上方が閉塞されており、これにより毛細菅現象や遠心力によって送液可能な微細なチャネル構造（キャピラリー構造）として機能する。また、上蓋部材２は、反応領域１２に滴下された媒質の乾燥を防止する役割を果たす。
【００３８】
また、例えば、ウエル状の反応領域１４を、基板上で同心円状、あるいはスパイラル状などをなすように配列することによって、図３に示すような外観形態の円盤状基板１ｂを設計することも自由である。
【００３９】
いずれにしても、反応領域１２（又は１４）では、プローブ分子を固相表面に予め固定しておいた所に、ターゲット分子を滴下等して供給し、両分子間の相互作用を、好適な条件（例えば、ｐＨ、温度、塩濃度などの条件）で進行させる。
【００４０】
反応領域１２（又は１４）に対するプローブ分子、ターゲット分子などの物質は、図示しない公知のインクジェットノズル、あるいはメカニカルスポット等の滴下手段を用いて、選択された反応領域へ液状、あるいはゲルを含む媒質として、正確に滴下することにより供給する。
【００４１】
ここで、プローブ分子を反応領域１２（又は１４）の固相表面に固定化する工程では、必要に応じて、固定化されなかった余分なプローブ分子を、該反応領域１２（又は１４）から排除するための水溶液洗浄作業を行う。
【００４２】
反応領域１２（又は１４）の固定化用の表面の表面処理法については、例えば、アミノ基含有のシランカップリング剤溶液やポリリシン溶液で予め表面処理しておく方法を採用できる。合成樹脂製基板に対する表面処理加工の場合は、その表面をプラズマ処理及びＤＵＶ（ＤｅｅｐＵＶ、遠赤外）照射処理後、アミノ基含有シランカップリング剤溶液で処理することもできる。例えば、アミノ基含有のシランカップリング剤溶液やポリリシン溶液で表面処理される。合成樹脂製基板であれば、その表面をプラズマ処理及びＤＵＶ（ＤｅｅｐＵＶ、遠赤外）照射処理後、アミノ基含有シランカップリング剤溶液で処理する。
【００４３】
また、固相表面にアミノ基、チオール基、カルボキシル基等の官能基（活性基）を有する物質やシステアミン、ストレプトアビジン等をコートしてもよい。ストレプトアビジンによって表面処理された検出表面の場合には、ビオチン化されたプローブ分子末端の固定に適している。あるいは、チオール（ＳＨ）基によって表面処理された検出表面の場合には、チオール基が末端に修飾されたプローブ分子等をジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−結合）により固定することに適している。
【００４４】
次に、図４は、図１に示された基板１ａの条溝構造部位１３の長手方向一部断面図である。
【００４５】
この図４には、プローブ分子であるプローブ核酸分子Ｘが固定化されている様子が示されている。加えて、この図４では、プローブ核酸分子Ｘと、反応領域１２へ導入されたターゲット核酸分子Ｙとの間でハイブリダイゼーション（相互作用の一つ）が進行し、二本鎖核酸分子Ｗが形成されている状態が模式的に示されている。
【００４６】
なお、ターゲット核酸分子Ｙは、蛍光色素で標識されている場合（図５参照）と蛍光色素で標識されていない場合（図６参照）の両方が考えられる。前者の場合では、ターゲット核酸分子Ｙに標識された蛍光色素ｆ（図５参照）を励起して得られる蛍光シグナルを検出することでハイブリダイゼーションを検出し、後者の場合は、二本鎖核酸分子Ｗに特異的に吸着する蛍光インターカレーターＩ（図６参照）を励起して得られる蛍光シグナルを検出することによって、ハイブリダイゼーションを検出する。なお、図５、図６における符号Ｐは蛍光励起光、符号１５は反応領域１２に臨む固相表面、符号１６は固相表面１５の表面処理層あるいは絶縁層を示している。
【００４７】
また、反応領域１２には、ハイブリダイゼーションに関与しなかった（関与できなかった）一本鎖核酸分子Ｚが、遊離状態で存在している（図４参照）。該反応領域１２中に遊離するこの一本鎖核酸分子Ｚは、プローブ核酸分子Ｘと相補的ではなかった核酸分子、あるいは相補的であっても立体障害等の原因によりハイブリダイゼーションしなかった核酸分子などが該当し、ノイズ蛍光を発する原因分子（ノイズ蛍光原因物質）となり得るものである。
【００４８】
具体的には、ハイブリダイゼーションに関与しない遊離一本鎖核酸分子Ｚに標識された蛍光色素由来の蛍光、あるいは該遊離一本鎖核酸分子Ｚに非特異的に吸着したインターカレーターＩ由来の蛍光は、ハイブリダイゼーションとは相関しない蛍光シグナルであるため、いわゆるバックグラウンドノイズ（ノイズ蛍光）となる。このノイズ蛍光の発光量が多いと、いわゆる検出測定時のＳ／Ｎが低下し、検出精度において、無視できない程度の悪影響を与える。
【００４９】
そこで、本発明では、前記ノイズ蛍光原因物質が存在する領域を狙って、基板外に設けられた蛍光減衰用光源から所定波長の光Ｑ（以下「蛍光減衰光Ｑ」と称する。）を、焦点絞込み用のレンズＣを介して照射し、ノイズ蛍光原因物質から発生するノイズ蛍光の発光量を減衰又は消失させる。
【００５０】
蛍光減衰用光源としては、例えば、４５０ｎｍＬＤを用いることができる。なお、蛍光減衰用光源は、検出用の蛍光励起光Ｐを出射する光源と別個に設けてもよいし、共通一体化して設けてもよい。
【００５１】
プローブ核酸分子Ｘが固定された領域、すなわちハイブリダイゼーション検出領域は、ハイブリダイゼーションを定量すべき測定エリアであるため、前記蛍光減衰光Ｑの照射を避ける必要がある。
【００５２】
ここで、蛍光減衰光Ｑや蛍光励起光Ｐの光照射領域を特定するため、基板１（１ａ，１ｂ）には、プローブ核酸分子Ｘが固定化されている領域やそれ以外の領域の位置（番地）情報を提供するアドレスピットＡ，Ａ・・・が予め刻んでおくようにする（図４参照）。このアドレスピットＡに基づいて、基板１（１ａ，１ｂ）の位置をトラッキングして検出し、蛍光減衰光Ｑや蛍光励起光Ｐの光照射位置を特定し、あるいは媒質の滴下位置を特定する。
【００５３】
より詳しくは、基板１（１ａ，１ｂ）に刻まれたアドレスピットＡから得られた位置情報を基にして、フォーカシングとトラッキングを、別に設けられたサーボ用光源（例えば７８０ｎｍＬＤ）から出射されるサーボ光Ｂ（図４参照）で追従走査しながら、安定的にサーボをかける。
【００５４】
蛍光減衰光Ｑの場合であれば、プローブ核酸分子Ｘが固定化されている領域１２ａ以外の領域１２ｂを追従走査して検出して照射して、不要な蛍光物質を分解し、ノイズ蛍光の発光量を減衰又は消失させる。
【００５５】
次に、図７に示すように、プローブ核酸分子Ｘが固定化されている領域１２ａとそれ以外の領域１２ｂに対応するように形成されたマスク部材１７を、基板下方に設置しておき、図示しない紫外線ランプなどを利用して、基板全体に一括照射して蛍光減衰光Ｑを照射してもよい。
【００５６】
このような実施形態例では、マスク部材１７を介在させることにより、マスクされていない部分に対応する領域（即ち、光透過領域）１２ｂに存在するノイズ蛍光原因物質の蛍光色素を分解等して、ノイズ蛍光の発光量を減衰又は消失させる。
【００５７】
なお、レーザー及び紫外線ランプなどを用いて励起分解された蛍光色素は、熱を発するので、反応領域１２内の溶液上の媒質は熱を持ち、拡散する。このため、プローブ核酸分子Ｘが固定化されている領域１２ａに留まった状態の遊離一本鎖核酸分子Ｚは、溶液の対流に基づいて周辺領域へ移動し、時間と共にレーザーなどにより同様に蛍光消失する。
【００５８】
蛍光減衰光Ｑの照射は、二光子励起の原理を用いてもよい。一光子励起の場合は、レーザー光の焦点以外の領域でも蛍光分子の蛍光量を減衰又は消失させてしまうので、相互作用検出に寄与する蛍光量をも減衰又は消失させてしまう可能性がある。一方、二光子励起原理を用いると、二個の光子がほぼ同時に来たときにだけ起こるため、レーザーの焦点面だけで蛍光分子の蛍光量を減衰又は消失させることができる。
【００５９】
この結果、プローブ分子が存在しない領域だけを狙って蛍光減衰光Ｑを照射することができる。例えば、反応領域１２（又は１４）の三次元的に特定された領域（プローブ不存在領域）だけを狙って、確実に減衰光Ｑを照射することができる。
【００６０】
図８は、プローブ核酸分子Ｘが固定化されている領域１２ａに留まった状態で遊離している一本鎖核酸分子Ｚを、強制的に前記領域１２ａから他の領域１２ｂへ移動させるときに利用できる基板構成を示す断面図である。
【００６１】
基板に設けられた条溝構造部位（チャネル構造部位）１３内の反応領域１２を挟む如きに、上下に配置された対向電極Ｅ１−Ｅ２と、反応領域１２を挟む如きに、左右に配置された対向電極Ｅ３−Ｅ４と、を備える。対向電極Ｅ１−Ｅ２は、外部電源Ｖ１を介し、スイッチＳ１のオン操作によって、反応領域１２へ電界（例えば、高周波交流電界）を印加可能であり、対向電極Ｅ３−Ｅ４は、外部電源Ｖ２を介し、スイッチＳ２のオン操作によって、反応領域１２へ電界（例えば、高周波交流電界）を印加可能となっている。
【００６２】
本発明では、対向電極Ｅ１−Ｅ２は、必ずしも必要ではないが、この対向電極Ｅ１−Ｅ２を用いることによって、核酸分子を、誘電泳動などの電気力学的作用により、伸張させたり、電極面に向けて移動させたりすることができる。この効果を用いて、ハイブリダイゼーションの際の立体障害を低減したり、プローブ核酸分子Ｘの固定化作業を効率よく進めたりすることができる。
【００６３】
なお、「誘電泳動」とは、電界が一様でない場において、分子が電界の強い方へ駆動する現象であり、交流電圧をかけた場合も、かけた電圧の極性の反転につれて分極の極性も反転するので、直流の場合と同様に駆動効果が得られる（監修・林 輝、「マイクロマシンと材料技術（シーエムシー発行）」、Ｐ３７〜Ｐ４６・第５章・細胞およびＤＮＡのマニピュレーション参照）。
【００６４】
例えば、二本鎖核酸分子は、液相中において電界の作用を受けると伸長又は移動することが知られている。その原理は、骨格をなすリン酸イオン（陰電荷）とその周辺にある水がイオン化した水素原子（陽電荷）とによってイオン曇を作っていると考えられ、これらの陰電荷及び陽電荷により生じる分極ベクトル（双極子）が、高周波高電圧の印加により全体として一方向を向き、その結果として伸長し、加えて、不均一電界が印加された場合、電気力線が集中する部位に向かって移動する（Seiichi Suzuki，Takeshi Yamanashi,Shin-ichiTazawa,Osamu Kurosawa and Masao Washizu:“Quantitative analysis on electrostatic orientation of DNA in stationary AC electric field using fluorescence anisotropy”,IEEE Transaction on Industrial Applications,Vol.34,No.1,P75-83(1998)）。
【００６５】
他方の対向電極Ｅ３−Ｅ４は、遊離一本鎖核酸分子Ｚなどのノイズ蛍光原因分子を、前記誘電泳動などの電気力学的作用によって、電極Ｅ３、Ｅ４側に強制的に引き寄せたい場合、即ちプローブ存在領域外へ引き寄せたい場合に用いる。
【００６６】
これにより、プローブ核酸分子Ｘが固定化されている領域１２ａに留まった状態の遊離一本鎖核酸分子Ｚなどのノイズ原因分子を、強制的に前記領域１２ａから他の領域１２ｂへ移動させて、集めることが可能となる。
【００６７】
遊離一本鎖核酸分子Ｚの強制移動に続き、蛍光減衰光Ｑを、領域１２ｂを狙って照射することで、該領域１２ｂに集まっているノイズ蛍光原因物質の蛍光色素を分解等して、ノイズ蛍光の発光量を減衰又は消失させることができる。
【００６８】
図９は、二光子励起原理を用いた場合の実施形態の一例を模式的に示す図である。
【００６９】
この二光子励起原理を用いた構成の実施形態では、ノイズ蛍光を減衰できる領域を三次元的に決定できるので、プローブ核酸分子Ｘが固定化されていない領域１２ｂだけを狙って蛍光減衰光Ｑを照射する手段や、図７に示すようなマスク部材１７を採用して蛍光減衰光Ｇの照射領域を限定する必要がない。
【００７０】
具体的には、本実施形態では、図９に示されているように、サーボ光Ｂによる位置検出に基づいて、蛍光減衰光Ｑをプローブ核酸分子Ｘが固定化されている領域１２ａを狙って照射されているが、二光子励起原理を用いた構成であるため、物質間の相互作用に由来する正規の検出蛍光を減衰又は消失させることなく、領域１２ａの焦点深度内である上方領域Ｕのみを励起できる。これにより、該上方領域Ｕに遊離して存在しているノイズ蛍光原因分子由来の蛍光の発光量を減衰又は消失させることができる。
【００７１】
図１０は、本発明に係る蛍光検出システムの好適な実施形態を示す図である。
【００７２】
本システムは、基板表面、即ち固相表面の所定位置に存在する分子の相互作用に係わる蛍光シグナルを検出するシステムである。
【００７３】
具体的には、前記固相表面の位置を検出する位置検出手段（トラッキングサーボ機構）を備える。そして、該手段によって検出された位置へ蛍光励起光Ｐを出射する第一光源Ｌ１（例えば、４０５ｎｍ,６４０ｎｍなどの半導体レーザー光源）を備える。また、前記固相表面に存在するノイズ原因分子由来の蛍光の発光量を、減衰又は消失させる蛍光減衰光Ｑを前記固相表面へ照射するための、レーザー、ＬＥＤ、紫外線ランプなどからなる第二光源Ｌ２と、前記各光源Ｌ１，Ｌ２から照射された光の焦点を定めるフォーカス手段（フォーカシング機構）と、を少なくとも備える。
【００７４】
なお、前記第一光源Ｌ１と前記第二光源Ｌ２は、出射光の出力強度を制御できる構成とされた一つの共通光源で行ってもよい。この場合、出力強度を制御することによって、出射光を蛍光検出用の蛍光励起光Ｐとしたり、ノイズ原因分子由来の蛍光の発光量を減衰又は消失させるための蛍光減衰光Ｑとしたりする。
【００７５】
トラッキングサーボ機構は、サーボ用光源Ｌ３（例えば、赤外レーザー、７８０ｎｍ）からのサーボ用光Ｂを用いて、基板に刻まれてアドレスピット情報を取得することによって行う。
【００７６】
基板１に媒質を滴下する場合は、前記トラッキング機構１８、フォーカシング機構１９から得られる位置情報と焦点情報に基づいて、符号Ｎで示したノズル（例えば、インクジェットノズル）を介して、行うことができる。また、サーボ光Ｂからの情報を利用して、基板１を保持するスピンドル２０の運動を制御する。
【００７７】
図１０における符号２１は、このスピンドル２０に係わるサーボ機構を示している。また、図１０に示されているＰＭＴは、入射光を内部で増幅して電気信号に変えて出力する光検出器である光電子増倍管（Photo multiplier tube）を示している。ＰＬＬは、受光手段であるＰＤ（フォトダイオード）からの信号を電圧制御発振器（ＲＦ）を介して処理するPhase Locked Loop電子回路を示している。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明は、ＤＮＡチップやプロテインチップなどの分子情報集積基板を用いた方法やシステムとして有用であり、相互作用検出領域以外におけるノイズ蛍光を、効率よく短時間で、消失また減衰させる技術として利用できる。従来採用されているノイズ蛍光原因分子を水溶液洗浄する工程を行わなくてもよい相互作用検出技術、即ち、洗浄フリーの相互作用検出技術として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】本発明に係る方法やシステムに利用又は適用可能な固相表面を提供できる基板（１ａ）の一実施形態例を示す図である。
【図２】基板（１ａ）の条溝構造部位（１３）の幅方向一部断面図である。
【図３】他の実施形態例である円盤状基板（１ｂ）の外観斜視図である。
【図４】図１に示された基板（１ａ）の条溝構造部位（１３）の長手方向一部断面図である。
【図５】ターゲット核酸分子（Ｙ）が蛍光色素で標識されている場合を示す模式図である。
【図６】ターゲット核酸分子（Ｙ）が蛍光色素で標識されていない場合であって、蛍光インターカレーターＩを用いてハイブリダイゼーションを検出する場合を示す模式図である。
【図７】マスク部材（１７）を基板下方に配置したときの構成を示す図である。
【図８】プローブ核酸分子（Ｘ）が固定化されている領域（１２ａ）に留まった状態で遊離している一本鎖核酸分子（Ｚ）を、強制的に他の領域（１２ｂ）へ移動させるときに好適な基板構成を示す断面図である。
【図９】二光子励起原理を用いた場合の実施形態の一例を模式的に示す図である。
【図１０】本発明に係る蛍光検出システムの好適な実施形態を示す図である。
【符号の説明】
【００８０】
１（１ａ，１ｂ） 基板
２ 上蓋
１２，１４ 反応領域
１２ａ プローブが固定された領域
１２ｂ プローブが固定されていない領域
１３ 条溝構造部位
Ｂ サーボ光
Ｐ 検出用の蛍光励起光
Ｑ ノイズ蛍光を減衰又は消失させる光（蛍光減衰光）
Ｘ プローブ分子の一種であるプローブ核酸分子
Ｙ ターゲット分子の一種であるターゲット核酸分子
Ｚ ノイズ蛍光原因分子の一種である遊離一本鎖核酸分子
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物質間の相互作用を蛍光検出する際のＳ／Ｎを向上するための新規技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、マイクロアレイ技術によって所定のＤＮＡが微細配列された、いわゆるＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイ（以下、本願では「ＤＮＡチップ」と総称。）と呼ばれるバイオアッセイ用の集積基板が、遺伝子の変異解析、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析等に利用されるようになり、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、進化の研究、法医学その他の分野において広範囲に活用され始めている。
【０００３】
この「ＤＮＡチップ」は、ガラス基板やシリコン基板上に多種・多数のＤＮＡオリゴ鎖やｃＤＮＡ（complementary DNA）等のヌクレオチド鎖が集積されていることから、ハイブリダイゼーションの網羅的解析が可能となる点が特徴とされている。
【０００４】
ここで、前記ハイブリダイゼーションの検出は、一般には、どのプローブが試料中のヌクレオチド鎖と二本鎖を形成したかを示す蛍光シグナルを発する基板上の位置を、光学的に検出する。前記蛍光シグナルは、通常、資料中のヌクレオチド鎖に標識された蛍光物質を励起することにより得られるが、近年、二本鎖核酸の塩基対部分に特異的に吸着する蛍光発色性のインターカレーターが提案されている。
【０００５】
ＤＮＡチップを用いたハイブリダイゼーションの検出の精度は、いまだ改善の余地が多い。改善のためのアプローチは、いくつかあるが、中でも前記蛍光シグナルのＳ／Ｎ比の向上が重要である。即ち、検出される蛍光シグナルから、本質的にハイブリダイゼーションとは無関係のノイズ（バックグラウンド蛍光）をどれだけ排除できるかということが、ハイブリダイゼーション検出の精度の向上に直結する。この点、ハイブリダイゼーション以外の分子間相互作用を蛍光検出する技術においても共通である。
【０００６】
特許文献１は、ＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）を用いた蛍光検出におけるバックグラウンドノイズを低減するために、消光剤を用いる技術が開示されている。特許文献２には、プローブＤＮＡがループ構造を形成してその解放末端側が基板側にあるようにすることによって、バックグラウンドノイズを低減しようとする技術が開示されている。特許文献３には、コロナ放電処理を利用して担体表面の親水性を制御し、該担体表面への埃の付着を抑制することによって、蛍光分析に際してのバックグランドノイズを低くする技術が開示されている。
【０００７】
このように、蛍光分析に際してバックグラウンドノイズを低減するためのアプローチとして、他の薬剤を用いる方法（特許文献１）、プローブＤＮＡの構造を工夫する方法（特許文献２）、担体（基板）表面に対する処理を施す方法（特許文献３）などが知られている。さらには、バックグラウンドノイズの原因となる物質を、検出領域から洗浄除去した後に、蛍光検出を行う技術も広く採用されている。
【特許文献１】特開２００３−８４００２号公報（特に、請求項１参照）。
【特許文献２】特開２００３−３２９６７６号公報。
【特許文献１】特開２００３−０２８８６７号公報。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ハイブリダイゼーションなどの物質間の相互作用を蛍光検出する技術に関して、従来とは全く技術的思想を異にする、バックグラウンドノイズ低減技術を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明では、プローブ分子を、基板などの固相表面の反応領域へ固定しておき、該プローブ分子が関与する分子間の相互作用を、蛍光シグナルで検出する方法を対象とし、選定された所定波長の光を、前記相互作用検出の際のノイズ蛍光の原因となる物質（ノイズ蛍光原因物質）が存在する固相表面領域に向けて照射することによって、前記ノイズ蛍光原因物質由来の蛍光の発光量を、減衰又は消失させるという構成のノイズ蛍光処理方法を提供する。この方法により、ノイズ蛍光原因物質を光照射によって分解し、蛍光の発光量を、減衰又は消失させ、検出段階におけるノイズ蛍光原因物質の水溶液洗浄作業を不要化する。
【００１０】
ノイズ蛍光原因分子由来の蛍光の発光量を減衰又は消失させるときに用いる光（以下「蛍光減衰光」と称する。）は、例えば、プローブ分子が存在しない「プローブ不存在領域」だけを狙って照射する。これにより、検出に有用な蛍光の発光量にできるだけ喪失しないようにする。
【００１１】
一例を挙げると、二光子励起原理によって、前記蛍光減衰光を目的の前記プローブ不存在領域にだけ照射するようにしてもよい。二光子励起原理を採用する構成では、三次元的に二光子吸収位置を選択できることから、プローブ存在領域を避けて光を照射する方法をわざわざ採用しなくても、ノイズ蛍光を減衰又は消失させることができる。即ち、二光子吸収は、焦点深度内のみを励起できるため、フォーカスを調整すれば、プローブが存在する表面領域の上方領域に狙いを定めて、該上方領域に遊離しているノイズ蛍光原因分子由来の蛍光の発光量を減衰又は消失させることが可能となる。
【００１２】
また、分子間の相互作用が進行する反応領域へ電界を印加することによって、ノイズ蛍光原因物質を、誘電泳動その他の電気力学的効果によってプローブ不存在領域へ移動させた後、該プローブ不存在領域へ前記蛍光減衰光を照射するように工夫してもよい。これによって、一度の光照射で、より多くのノイズ蛍光原因物質由来の蛍光の発光量を、減衰又は消失させることができる。
【００１３】
前記プローブ分子それ自体は、特に限定されず、本発明の目的に沿う範囲であらゆる生体分子を含む。例えば、プローブＤＮＡなどの検出用核酸分子であり、前記相互作用がハイブリダイゼーションである場合において、本発明に係るノイズ蛍光処理方法は、特に有用である。
【００１４】
前記ノイズ蛍光原因物質として、特に想定されるのは、次の（１）、（２）のいずれかの物質である。即ち、（１）蛍光色素が標識された遊離一本鎖核酸分子、（２）蛍光インターカレーターが結合した遊離一本鎖核酸分子、である。
【００１５】
次に、本発明は、基板などの固相表面の所定位置に存在する分子の相互作用に係わる蛍光シグナルを検出するシステムを提供する。
【００１６】
具体的には、前記固相表面の位置を検出する位置検出手段と、前記手段によって検出された位置へ蛍光励起光を出射する第一光源手段と、前記固相表面に存在するノイズ原因分子由来の蛍光の発光量を、減衰又は消失させる光を前記固相表面へ照射する第二光源手段と、前記光源から照射された光の焦点を定めるフォーカス手段と、を少なくとも備える蛍光検出システムを提供する。
【００１７】
前記第二光源手段は、例えば、レーザー、ＬＥＤ、紫外線ランプのいずれかから選択される光源を採用できる。また、前記第一光源手段と前記第二光源手段は、一体共通の光源を用いてもよく、この場合、出射光の出力強度を制御することにより、第一光源手段用途と前記第二光源手段用途を使い分けできるようにする。
【００１８】
ここで、本発明に関連する主たる技術用語について説明する。
【００１９】
「プローブ分子」とは、反応領域に貯留又は保持された媒質中に存在し、当該分子と特異的に相互作用するターゲット分子を検出するための探り針（検出子）として機能する分子である。例えば、ＤＮＡプローブなどのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが代表的である。
【００２０】
「核酸」とは、プリンまたはピリミジン塩基と糖がグリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステルの重合体（ヌクレオチド鎖）を意味し、プローブＤＮＡを含むオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオチオドが重合したＤＮＡ（全長あるいはその断片）、逆転写により得られるｃＤＮＡ（ｃプローブＤＮＡ）、ＲＮＡ、ポリアミドヌクレオチド誘導体（ＰＮＡ）等を広く含む。
【００２１】
「相互作用」とは、物質間の非共有結合、共有結合、水素結合を含む化学的結合あるいは解離を広く意味し、例えば、核酸分子間のハイブリダイゼーション、タンパク質間の相互作用、抗原抗体反応などの物質間の化学的結合あるいは解離を広く含む。なお、「ハイブリダイゼーション」は、相補的な塩基配列構造を備える間の相補鎖（二本鎖）形成反応を意味する。
【００２２】
「固相表面」は、反応領域と固体の臨界表面層を意味し、例えば、基板表面や合成樹脂ビーズなどの粒子表面などを挙げることができる。
【００２３】
「反応領域」は、ハイブリダイゼーションなどの相互作用の場を提供できる領域であり、一例を挙げるなら、液相やゲルなどを貯留できるウエル形状を有する反応場である。
【００２４】
「ノイズ蛍光原因物質」は、蛍光検出において、バックグラウンドノイズとなる蛍光（ノイズ蛍光）を発生する原因となる物質であり、例えば、既述したように、蛍光色素が標識されたり、蛍光インターカレーターが結合したりした遊離一本鎖核酸分子である。場合によっては、目的外の所に非特異的に吸着したり、遊離状態にあったりする蛍光インターカレーターも該当する。
【００２５】
「二光子励起原理」は、二個の光子を非常に短い時間の間に吸収させて蛍光分子を励起させる原理を言う。
【００２６】
「蛍光インターカレーター」は、二本鎖核酸に挿入結合等する蛍光性物質であり、ハイブリダイゼーション検出に用いられる物質である。例えば、ＰＯＰＯ−１やＴＯＴＯ−３、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩなどを挙げることができる。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、効率よく短時間で、ノイズ成分となる蛍光量を消失また減衰させることができる。このため、ハイブリダイゼーション等の相互作用を進行させた後に、ノイズ蛍光の発生原因となる物質を除去するための水溶液洗浄作業を行わなくても、前記相互作用を、良好なＳ／Ｎに基づいて、定量検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、本発明を実施するための好適な形態について、添付図面を参照しながら説明する。なお、添付図面に示された各実施形態は、本発明に係わる物や方法の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００２９】
まず、図１は、本発明に係る方法やシステムに利用又は適用可能な固相表面を提供できる基板の一実施形態例を示す図である。
【００３０】
まず、このような基板は、ＣＤ（Compact Disc）、ＤＶＤ（Degital Versatile Disc）、ＭＤ(Mini Disc)等の光情報記録媒体と同様の基材から形成することができる。また、基板の形状は、特に限定されず、矩形状、多角形状などを広く採用できるが、例えば、図１に示すような円盤状をなす基板（ディスク）を採用することができる。
【００３１】
図１に示されたよう円盤状をなす基板１（１ａ）は、光透過性の石英ガラスやシリコン、ポリカーボネート、ポリスチレン等の合成樹脂、好ましくは射出成形可能な合成樹脂によって円盤状に成形する。基板１を安価な合成樹脂を用いて基板を成形することで、従来使用されていたガラスチップに比して、低ランニングコストを実現できる。
【００３２】
また、基板１（１ａ）の中央部分には、図１中に符号２で示された所定口径の孔１１（又は貫通しない穴でもよい。）を形成しておいてもよい。この孔１１に、スピンドルなどのチャッキング治具を挿着することによって、該基板１を保持したり、回転させたりすることができる。
【００３３】
また、この孔１１に対して給電用の通電治具（図示せず）を挿着すれば、該通電治具及び基板１ａに這い回りされた給電配線を介して、基板１上に配設された各反応領域に対して、電界を印加することが可能となる。
【００３４】
基板１上に配設された反応領域１２は、プローブ分子を化学結合等により固定化できる固相表面構成を備える領域であって、ハイブリダイゼーションやタンパク質間相互作用、抗原抗体反応などに代表される分子間（物質間）の相互作用を進行させることができる条件を有する領域である。
【００３５】
この反応領域１２は、例えば、その周辺領域から親媒性原理によって区画された領域、あるいは物理的構造によって区画された領域（例えば、ウエル状領域）でもよく、さらには、基板１に形成されているような条溝構造部位１３（図１参照）の底面領域でもよい。
【００３６】
円盤状をなす基板１に対して条溝構造１３を形成する場合は、図１に示されているように、基板１の中央から外周方向に向かって延設されており、全体外観視、放射状を呈するような形態としてもよい。
【００３７】
この条溝構造部位１３は、この条溝構造部位１３の幅方向一部断面図である図２に示すように、基板１に上蓋部材２を重ね合せることによって上方が閉塞されており、これにより毛細菅現象や遠心力によって送液可能な微細なチャネル構造（キャピラリー構造）として機能する。また、上蓋部材２は、反応領域１２に滴下された媒質の乾燥を防止する役割を果たす。
【００３８】
また、例えば、ウエル状の反応領域１４を、基板上で同心円状、あるいはスパイラル状などをなすように配列することによって、図３に示すような外観形態の円盤状基板１ｂを設計することも自由である。
【００３９】
いずれにしても、反応領域１２（又は１４）では、プローブ分子を固相表面に予め固定しておいた所に、ターゲット分子を滴下等して供給し、両分子間の相互作用を、好適な条件（例えば、ｐＨ、温度、塩濃度などの条件）で進行させる。
【００４０】
反応領域１２（又は１４）に対するプローブ分子、ターゲット分子などの物質は、図示しない公知のインクジェットノズル、あるいはメカニカルスポット等の滴下手段を用いて、選択された反応領域へ液状、あるいはゲルを含む媒質として、正確に滴下することにより供給する。
【００４１】
ここで、プローブ分子を反応領域１２（又は１４）の固相表面に固定化する工程では、必要に応じて、固定化されなかった余分なプローブ分子を、該反応領域１２（又は１４）から排除するための水溶液洗浄作業を行う。
【００４２】
反応領域１２（又は１４）の固定化用の表面の表面処理法については、例えば、アミノ基含有のシランカップリング剤溶液やポリリシン溶液で予め表面処理しておく方法を採用できる。合成樹脂製基板に対する表面処理加工の場合は、その表面をプラズマ処理及びＤＵＶ（ＤｅｅｐＵＶ、遠赤外）照射処理後、アミノ基含有シランカップリング剤溶液で処理することもできる。例えば、アミノ基含有のシランカップリング剤溶液やポリリシン溶液で表面処理される。合成樹脂製基板であれば、その表面をプラズマ処理及びＤＵＶ（ＤｅｅｐＵＶ、遠赤外）照射処理後、アミノ基含有シランカップリング剤溶液で処理する。
【００４３】
また、固相表面にアミノ基、チオール基、カルボキシル基等の官能基（活性基）を有する物質やシステアミン、ストレプトアビジン等をコートしてもよい。ストレプトアビジンによって表面処理された検出表面の場合には、ビオチン化されたプローブ分子末端の固定に適している。あるいは、チオール（ＳＨ）基によって表面処理された検出表面の場合には、チオール基が末端に修飾されたプローブ分子等をジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−結合）により固定することに適している。
【００４４】
次に、図４は、図１に示された基板１ａの条溝構造部位１３の長手方向一部断面図である。
【００４５】
この図４には、プローブ分子であるプローブ核酸分子Ｘが固定化されている様子が示されている。加えて、この図４では、プローブ核酸分子Ｘと、反応領域１２へ導入されたターゲット核酸分子Ｙとの間でハイブリダイゼーション（相互作用の一つ）が進行し、二本鎖核酸分子Ｗが形成されている状態が模式的に示されている。
【００４６】
なお、ターゲット核酸分子Ｙは、蛍光色素で標識されている場合（図５参照）と蛍光色素で標識されていない場合（図６参照）の両方が考えられる。前者の場合では、ターゲット核酸分子Ｙに標識された蛍光色素ｆ（図５参照）を励起して得られる蛍光シグナルを検出することでハイブリダイゼーションを検出し、後者の場合は、二本鎖核酸分子Ｗに特異的に吸着する蛍光インターカレーターＩ（図６参照）を励起して得られる蛍光シグナルを検出することによって、ハイブリダイゼーションを検出する。なお、図５、図６における符号Ｐは蛍光励起光、符号１５は反応領域１２に臨む固相表面、符号１６は固相表面１５の表面処理層あるいは絶縁層を示している。
【００４７】
また、反応領域１２には、ハイブリダイゼーションに関与しなかった（関与できなかった）一本鎖核酸分子Ｚが、遊離状態で存在している（図４参照）。該反応領域１２中に遊離するこの一本鎖核酸分子Ｚは、プローブ核酸分子Ｘと相補的ではなかった核酸分子、あるいは相補的であっても立体障害等の原因によりハイブリダイゼーションしなかった核酸分子などが該当し、ノイズ蛍光を発する原因分子（ノイズ蛍光原因物質）となり得るものである。
【００４８】
具体的には、ハイブリダイゼーションに関与しない遊離一本鎖核酸分子Ｚに標識された蛍光色素由来の蛍光、あるいは該遊離一本鎖核酸分子Ｚに非特異的に吸着したインターカレーターＩ由来の蛍光は、ハイブリダイゼーションとは相関しない蛍光シグナルであるため、いわゆるバックグラウンドノイズ（ノイズ蛍光）となる。このノイズ蛍光の発光量が多いと、いわゆる検出測定時のＳ／Ｎが低下し、検出精度において、無視できない程度の悪影響を与える。
【００４９】
そこで、本発明では、前記ノイズ蛍光原因物質が存在する領域を狙って、基板外に設けられた蛍光減衰用光源から所定波長の光Ｑ（以下「蛍光減衰光Ｑ」と称する。）を、焦点絞込み用のレンズＣを介して照射し、ノイズ蛍光原因物質から発生するノイズ蛍光の発光量を減衰又は消失させる。
【００５０】
蛍光減衰用光源としては、例えば、４５０ｎｍＬＤを用いることができる。なお、蛍光減衰用光源は、検出用の蛍光励起光Ｐを出射する光源と別個に設けてもよいし、共通一体化して設けてもよい。
【００５１】
プローブ核酸分子Ｘが固定された領域、すなわちハイブリダイゼーション検出領域は、ハイブリダイゼーションを定量すべき測定エリアであるため、前記蛍光減衰光Ｑの照射を避ける必要がある。
【００５２】
ここで、蛍光減衰光Ｑや蛍光励起光Ｐの光照射領域を特定するため、基板１（１ａ，１ｂ）には、プローブ核酸分子Ｘが固定化されている領域やそれ以外の領域の位置（番地）情報を提供するアドレスピットＡ，Ａ・・・が予め刻んでおくようにする（図４参照）。このアドレスピットＡに基づいて、基板１（１ａ，１ｂ）の位置をトラッキングして検出し、蛍光減衰光Ｑや蛍光励起光Ｐの光照射位置を特定し、あるいは媒質の滴下位置を特定する。
【００５３】
より詳しくは、基板１（１ａ，１ｂ）に刻まれたアドレスピットＡから得られた位置情報を基にして、フォーカシングとトラッキングを、別に設けられたサーボ用光源（例えば７８０ｎｍＬＤ）から出射されるサーボ光Ｂ（図４参照）で追従走査しながら、安定的にサーボをかける。
【００５４】
蛍光減衰光Ｑの場合であれば、プローブ核酸分子Ｘが固定化されている領域１２ａ以外の領域１２ｂを追従走査して検出して照射して、不要な蛍光物質を分解し、ノイズ蛍光の発光量を減衰又は消失させる。
【００５５】
次に、図７に示すように、プローブ核酸分子Ｘが固定化されている領域１２ａとそれ以外の領域１２ｂに対応するように形成されたマスク部材１７を、基板下方に設置しておき、図示しない紫外線ランプなどを利用して、基板全体に一括照射して蛍光減衰光Ｑを照射してもよい。
【００５６】
このような実施形態例では、マスク部材１７を介在させることにより、マスクされていない部分に対応する領域（即ち、光透過領域）１２ｂに存在するノイズ蛍光原因物質の蛍光色素を分解等して、ノイズ蛍光の発光量を減衰又は消失させる。
【００５７】
なお、レーザー及び紫外線ランプなどを用いて励起分解された蛍光色素は、熱を発するので、反応領域１２内の溶液上の媒質は熱を持ち、拡散する。このため、プローブ核酸分子Ｘが固定化されている領域１２ａに留まった状態の遊離一本鎖核酸分子Ｚは、溶液の対流に基づいて周辺領域へ移動し、時間と共にレーザーなどにより同様に蛍光消失する。
【００５８】
蛍光減衰光Ｑの照射は、二光子励起の原理を用いてもよい。一光子励起の場合は、レーザー光の焦点以外の領域でも蛍光分子の蛍光量を減衰又は消失させてしまうので、相互作用検出に寄与する蛍光量をも減衰又は消失させてしまう可能性がある。一方、二光子励起原理を用いると、二個の光子がほぼ同時に来たときにだけ起こるため、レーザーの焦点面だけで蛍光分子の蛍光量を減衰又は消失させることができる。
【００５９】
この結果、プローブ分子が存在しない領域だけを狙って蛍光減衰光Ｑを照射することができる。例えば、反応領域１２（又は１４）の三次元的に特定された領域（プローブ不存在領域）だけを狙って、確実に減衰光Ｑを照射することができる。
【００６０】
図８は、プローブ核酸分子Ｘが固定化されている領域１２ａに留まった状態で遊離している一本鎖核酸分子Ｚを、強制的に前記領域１２ａから他の領域１２ｂへ移動させるときに利用できる基板構成を示す断面図である。
【００６１】
基板に設けられた条溝構造部位（チャネル構造部位）１３内の反応領域１２を挟む如きに、上下に配置された対向電極Ｅ１−Ｅ２と、反応領域１２を挟む如きに、左右に配置された対向電極Ｅ３−Ｅ４と、を備える。対向電極Ｅ１−Ｅ２は、外部電源Ｖ１を介し、スイッチＳ１のオン操作によって、反応領域１２へ電界（例えば、高周波交流電界）を印加可能であり、対向電極Ｅ３−Ｅ４は、外部電源Ｖ２を介し、スイッチＳ２のオン操作によって、反応領域１２へ電界（例えば、高周波交流電界）を印加可能となっている。
【００６２】
本発明では、対向電極Ｅ１−Ｅ２は、必ずしも必要ではないが、この対向電極Ｅ１−Ｅ２を用いることによって、核酸分子を、誘電泳動などの電気力学的作用により、伸張させたり、電極面に向けて移動させたりすることができる。この効果を用いて、ハイブリダイゼーションの際の立体障害を低減したり、プローブ核酸分子Ｘの固定化作業を効率よく進めたりすることができる。
【００６３】
なお、「誘電泳動」とは、電界が一様でない場において、分子が電界の強い方へ駆動する現象であり、交流電圧をかけた場合も、かけた電圧の極性の反転につれて分極の極性も反転するので、直流の場合と同様に駆動効果が得られる（監修・林 輝、「マイクロマシンと材料技術（シーエムシー発行）」、Ｐ３７〜Ｐ４６・第５章・細胞およびＤＮＡのマニピュレーション参照）。
【００６４】
例えば、二本鎖核酸分子は、液相中において電界の作用を受けると伸長又は移動することが知られている。その原理は、骨格をなすリン酸イオン（陰電荷）とその周辺にある水がイオン化した水素原子（陽電荷）とによってイオン曇を作っていると考えられ、これらの陰電荷及び陽電荷により生じる分極ベクトル（双極子）が、高周波高電圧の印加により全体として一方向を向き、その結果として伸長し、加えて、不均一電界が印加された場合、電気力線が集中する部位に向かって移動する（Seiichi Suzuki，Takeshi Yamanashi,Shin-ichiTazawa,Osamu Kurosawa and Masao Washizu:“Quantitative analysis on electrostatic orientation of DNA in stationary AC electric field using fluorescence anisotropy”,IEEE Transaction on Industrial Applications,Vol.34,No.1,P75-83(1998)）。
【００６５】
他方の対向電極Ｅ３−Ｅ４は、遊離一本鎖核酸分子Ｚなどのノイズ蛍光原因分子を、前記誘電泳動などの電気力学的作用によって、電極Ｅ３、Ｅ４側に強制的に引き寄せたい場合、即ちプローブ存在領域外へ引き寄せたい場合に用いる。
【００６６】
これにより、プローブ核酸分子Ｘが固定化されている領域１２ａに留まった状態の遊離一本鎖核酸分子Ｚなどのノイズ原因分子を、強制的に前記領域１２ａから他の領域１２ｂへ移動させて、集めることが可能となる。
【００６７】
遊離一本鎖核酸分子Ｚの強制移動に続き、蛍光減衰光Ｑを、領域１２ｂを狙って照射することで、該領域１２ｂに集まっているノイズ蛍光原因物質の蛍光色素を分解等して、ノイズ蛍光の発光量を減衰又は消失させることができる。
【００６８】
図９は、二光子励起原理を用いた場合の実施形態の一例を模式的に示す図である。
【００６９】
この二光子励起原理を用いた構成の実施形態では、ノイズ蛍光を減衰できる領域を三次元的に決定できるので、プローブ核酸分子Ｘが固定化されていない領域１２ｂだけを狙って蛍光減衰光Ｑを照射する手段や、図７に示すようなマスク部材１７を採用して蛍光減衰光Ｇの照射領域を限定する必要がない。
【００７０】
具体的には、本実施形態では、図９に示されているように、サーボ光Ｂによる位置検出に基づいて、蛍光減衰光Ｑをプローブ核酸分子Ｘが固定化されている領域１２ａを狙って照射されているが、二光子励起原理を用いた構成であるため、物質間の相互作用に由来する正規の検出蛍光を減衰又は消失させることなく、領域１２ａの焦点深度内である上方領域Ｕのみを励起できる。これにより、該上方領域Ｕに遊離して存在しているノイズ蛍光原因分子由来の蛍光の発光量を減衰又は消失させることができる。
【００７１】
図１０は、本発明に係る蛍光検出システムの好適な実施形態を示す図である。
【００７２】
本システムは、基板表面、即ち固相表面の所定位置に存在する分子の相互作用に係わる蛍光シグナルを検出するシステムである。
【００７３】
具体的には、前記固相表面の位置を検出する位置検出手段（トラッキングサーボ機構）を備える。そして、該手段によって検出された位置へ蛍光励起光Ｐを出射する第一光源Ｌ１（例えば、４０５ｎｍ,６４０ｎｍなどの半導体レーザー光源）を備える。また、前記固相表面に存在するノイズ原因分子由来の蛍光の発光量を、減衰又は消失させる蛍光減衰光Ｑを前記固相表面へ照射するための、レーザー、ＬＥＤ、紫外線ランプなどからなる第二光源Ｌ２と、前記各光源Ｌ１，Ｌ２から照射された光の焦点を定めるフォーカス手段（フォーカシング機構）と、を少なくとも備える。
【００７４】
なお、前記第一光源Ｌ１と前記第二光源Ｌ２は、出射光の出力強度を制御できる構成とされた一つの共通光源で行ってもよい。この場合、出力強度を制御することによって、出射光を蛍光検出用の蛍光励起光Ｐとしたり、ノイズ原因分子由来の蛍光の発光量を減衰又は消失させるための蛍光減衰光Ｑとしたりする。
【００７５】
トラッキングサーボ機構は、サーボ用光源Ｌ３（例えば、赤外レーザー、７８０ｎｍ）からのサーボ用光Ｂを用いて、基板に刻まれてアドレスピット情報を取得することによって行う。
【００７６】
基板１に媒質を滴下する場合は、前記トラッキング機構１８、フォーカシング機構１９から得られる位置情報と焦点情報に基づいて、符号Ｎで示したノズル（例えば、インクジェットノズル）を介して、行うことができる。また、サーボ光Ｂからの情報を利用して、基板１を保持するスピンドル２０の運動を制御する。
【００７７】
図１０における符号２１は、このスピンドル２０に係わるサーボ機構を示している。また、図１０に示されているＰＭＴは、入射光を内部で増幅して電気信号に変えて出力する光検出器である光電子増倍管（Photo multiplier tube）を示している。ＰＬＬは、受光手段であるＰＤ（フォトダイオード）からの信号を電圧制御発振器（ＲＦ）を介して処理するPhase Locked Loop電子回路を示している。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明は、ＤＮＡチップやプロテインチップなどの分子情報集積基板を用いた方法やシステムとして有用であり、相互作用検出領域以外におけるノイズ蛍光を、効率よく短時間で、消失また減衰させる技術として利用できる。従来採用されているノイズ蛍光原因分子を水溶液洗浄する工程を行わなくてもよい相互作用検出技術、即ち、洗浄フリーの相互作用検出技術として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】本発明に係る方法やシステムに利用又は適用可能な固相表面を提供できる基板（１ａ）の一実施形態例を示す図である。
【図２】基板（１ａ）の条溝構造部位（１３）の幅方向一部断面図である。
【図３】他の実施形態例である円盤状基板（１ｂ）の外観斜視図である。
【図４】図１に示された基板（１ａ）の条溝構造部位（１３）の長手方向一部断面図である。
【図５】ターゲット核酸分子（Ｙ）が蛍光色素で標識されている場合を示す模式図である。
【図６】ターゲット核酸分子（Ｙ）が蛍光色素で標識されていない場合であって、蛍光インターカレーターＩを用いてハイブリダイゼーションを検出する場合を示す模式図である。
【図７】マスク部材（１７）を基板下方に配置したときの構成を示す図である。
【図８】プローブ核酸分子（Ｘ）が固定化されている領域（１２ａ）に留まった状態で遊離している一本鎖核酸分子（Ｚ）を、強制的に他の領域（１２ｂ）へ移動させるときに好適な基板構成を示す断面図である。
【図９】二光子励起原理を用いた場合の実施形態の一例を模式的に示す図である。
【図１０】本発明に係る蛍光検出システムの好適な実施形態を示す図である。
【符号の説明】
【００８０】
１（１ａ，１ｂ） 基板
２ 上蓋
１２，１４ 反応領域
１２ａ プローブが固定された領域
１２ｂ プローブが固定されていない領域
１３ 条溝構造部位
Ｂ サーボ光
Ｐ 検出用の蛍光励起光
Ｑ ノイズ蛍光を減衰又は消失させる光（蛍光減衰光）
Ｘ プローブ分子の一種であるプローブ核酸分子
Ｙ ターゲット分子の一種であるターゲット核酸分子
Ｚ ノイズ蛍光原因分子の一種である遊離一本鎖核酸分子
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プローブ分子を固相表面の反応領域へ固定しておき、該プローブ分子が関与する分子間の相互作用を、蛍光シグナルで検出する方法において、
選定された所定波長の光を、前記相互作用検出のノイズ蛍光原因物質が存在する固相表面領域に向けて照射することによって、前記ノイズ蛍光原因物質由来の蛍光の発光量を、減衰又は消失させるノイズ蛍光処理方法。
【請求項２】
前記光は、前記プローブ分子が存在しないプローブ不存在領域だけを狙って照射されることを特徴とする請求項１記載のノイズ蛍光処理方法。
【請求項３】
前記光は、二光子励起原理によって、前記プローブ不存在領域に照射されることを特徴とする請求項２記載のノイズ蛍光処理方法。
【請求項４】
前記相互作用が進行する前記反応領域へ電界を印加することによって、ノイズ原因分子を電気力学的に前記プローブ不存在領域へ移動させた後、該プローブ不存在領域へ前記光を照射することを特徴とする請求項２記載のノイズ蛍光処理方法。
【請求項５】
前記プローブ分子は検出用核酸分子であり、前記相互作用はハイブリダイゼーションであることを特徴とする請求項１記載のノイズ蛍光処理方法。
【請求項６】
前記ノイズ原因分子は、次の（１）、（２）のいずれかの物質であることを特徴とする請求項５記載のノイズ蛍光処理方法。
（１）蛍光色素が標識された遊離一本鎖核酸分子。
（２）蛍光インターカレーターが結合した遊離一本鎖核酸分子。
【請求項７】
固相表面の所定位置に存在する分子の相互作用に係わる蛍光シグナルを検出するシステムであって、
前記固相表面の位置を検出する位置検出手段と、
前記手段によって検出された位置へ蛍光励起光を出射する第一光源手段と、
前記固相表面に存在するノイズ蛍光原因物質由来の蛍光の発光量を、減衰又は消失させる光を前記固相表面へ照射する第二光源手段と、
前記光源から照射された光の焦点を定めるフォーカス手段と、
を少なくとも備える蛍光検出システム。
【請求項８】
前記第二光源手段は、レーザー、ＬＥＤ、紫外線ランプのいずれかから選択される光源であることを特徴とする請求項７記載の蛍光検出システム。
【請求項９】
前記第一光源手段と前記第二光源手段は、一体共通の手段であって、出射光の出力強度を制御できる構成であることを特徴とする請求項７記載の蛍光検出システム。
【請求項１】
プローブ分子を固相表面の反応領域へ固定しておき、該プローブ分子が関与する分子間の相互作用を、蛍光シグナルで検出する方法において、
選定された所定波長の光を、前記相互作用検出のノイズ蛍光原因物質が存在する固相表面領域に向けて照射することによって、前記ノイズ蛍光原因物質由来の蛍光の発光量を、減衰又は消失させるノイズ蛍光処理方法。
【請求項２】
前記光は、前記プローブ分子が存在しないプローブ不存在領域だけを狙って照射されることを特徴とする請求項１記載のノイズ蛍光処理方法。
【請求項３】
前記光は、二光子励起原理によって、前記プローブ不存在領域に照射されることを特徴とする請求項２記載のノイズ蛍光処理方法。
【請求項４】
前記相互作用が進行する前記反応領域へ電界を印加することによって、ノイズ原因分子を電気力学的に前記プローブ不存在領域へ移動させた後、該プローブ不存在領域へ前記光を照射することを特徴とする請求項２記載のノイズ蛍光処理方法。
【請求項５】
前記プローブ分子は検出用核酸分子であり、前記相互作用はハイブリダイゼーションであることを特徴とする請求項１記載のノイズ蛍光処理方法。
【請求項６】
前記ノイズ原因分子は、次の（１）、（２）のいずれかの物質であることを特徴とする請求項５記載のノイズ蛍光処理方法。
（１）蛍光色素が標識された遊離一本鎖核酸分子。
（２）蛍光インターカレーターが結合した遊離一本鎖核酸分子。
【請求項７】
固相表面の所定位置に存在する分子の相互作用に係わる蛍光シグナルを検出するシステムであって、
前記固相表面の位置を検出する位置検出手段と、
前記手段によって検出された位置へ蛍光励起光を出射する第一光源手段と、
前記固相表面に存在するノイズ蛍光原因物質由来の蛍光の発光量を、減衰又は消失させる光を前記固相表面へ照射する第二光源手段と、
前記光源から照射された光の焦点を定めるフォーカス手段と、
を少なくとも備える蛍光検出システム。
【請求項８】
前記第二光源手段は、レーザー、ＬＥＤ、紫外線ランプのいずれかから選択される光源であることを特徴とする請求項７記載の蛍光検出システム。
【請求項９】
前記第一光源手段と前記第二光源手段は、一体共通の手段であって、出射光の出力強度を制御できる構成であることを特徴とする請求項７記載の蛍光検出システム。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２００６−１５３６３９（Ｐ２００６−１５３６３９Ａ）
【公開日】平成１８年６月１５日（２００６．６．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３４４２７９（Ｐ２００４−３４４２７９）
【出願日】平成１６年１１月２９日（２００４．１１．２９）
【出願人】（０００００２１８５）ソニー株式会社 (34,172)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年６月１５日（２００６．６．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１１月２９日（２００４．１１．２９）
【出願人】（０００００２１８５）ソニー株式会社 (34,172)
【Ｆターム（参考）】
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