活性の評価のためのアレイにおいて使用するための、タンパク質の迅速な生成を可能にする望ましいヌクレオチド配列を用いて形質転換された細胞から培養された細胞の混合物を利用することにより、ハイスループットプロトコルで発現系およびタンパク質を得る方法。１つの実施形態において、アレイにおけるタンパク質（またはペプチド）を感染病原体についてのこれらの免疫学的活性を分析する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の参照）
本出願は、米国特許仮出願第６０／５８５３５１号（２００４年７月１日出願）および第６０／６３８６２４号（２００４年１２月２３日出願）の利益を主張する。これら出願のそれぞれの内容を参照によりここに取り込む。
（連邦政府の支援によりなされた発明への発明の権利に関する供述）
本研究は国立衛生研究所／国立アレルギー・感染症研究所により一部支援された。米国政府は本発明に対して一定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、コードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からのタンパク質またはペプチドの作製方法および免疫学的活性タンパク質の同定方法に関する。本発明はコードしているＯＲＦの多様性によるタンパク質／ペプチドアレイの作製方法および免疫学的活性タンパク質決定のためのこのようなアレイの使用法にも関する。さらにこれらの免疫学的活性ペプチドおよびそれらの使用方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）および酵母などの微生物が、リガーゼなどの外来酵素の供給なしに相同的組み換えを生じるリコンビナーゼ系を含むことは古くから周知であった。例えば、Ｏｌｉｎｅｒ，Ｊ．Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９３）２１：５１９２−５１９７は線状化ベクターの２つの末端配列と同一の末端配列をＰＣＲ産物に提供することでそれらをクローンする方法を述べている。これら産物およびベクターＤＮＡは大腸菌ＪＣ８６７９株中へ共形質転換され、このベクターおよびこれらＰＣＲ産物はインビボで組み換えられた。組み換えプラスミドを含んだコロニーは診断用ＤＮＡとのハイブリド形成によって同定された。上の著者はこの方法を用いたＥ．コリ中でのゲノムＰＣＲ産物クローニングのための最適化プロトコルを提唱している。
【０００４】
より最近、Ｚａｎｇ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９８） ２０：１２３−１２８はこの方法でクローン化されるＤＮＡの大きさの向上を提示した同様の研究を記載した。
【０００５】
米国公開出願第２００３／００４４８２０号はプロモーター、ターミネーター、選択マーカーなどの機能要素を含みうるアダプター配列を利用することによるＰＣＲを用いて核酸フラグメントをベクター中にクローンする方法について記載している。線状化ベクターは従来のようなクローニングおよびその後の分解による線状化ベクターの調製よりむしろＰＣＲにより増幅された。これはＰＣＲ増幅核酸の付加部分に適合できる線状化ベクターに追加配列を提供する付加的利点を有する。組み換えプラスミドによりコロニーを選択する唯一の方法もまた記載されている。
【０００６】
さらに最近、Ｐａｒｒｉｓｈ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．（２００４） ３：５８２−５８６はＥ．コリにおける一般的組み換え技術を利用したクローニング効率に影響するパラメータについて記載している。本研究において、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）において同定されたリーディングフレームが増幅され、Ｅ．コリ中の線状化ベクターの中に挿入された。個々のコロニーは単離され、クローンが配列決定された。この生物に関してすでに決定されているゲノム配列を予測した１６８５遺伝子のＯＲＦ全長を増幅するためのプライマー対が使用された。１３４６個のＰＣＲ産物がゲル上で観察可能で、これらの７５％がインサートを備えるベクターを有するコロニーを提供した。
【０００７】
Ｅ．コリ以外の細胞もリコンビナーゼ機能を示すことが周知である。例えば、Ｍａ， Ｈ．， Ｋｕｎｅｓ， Ｓ．， Ｓｃｈａｔｚ， Ｐ．Ｊ． ａｎｄ Ｂｏｔｓｔｅｉｎ， Ｄ．， Ｇｅｎｅ（１９８７） ５８：２０１−２１６はサッカロミセス・セレビシェ（Saccharomyces cerevisiae）がこの組み換えを実施できることを示している。
【０００８】
前述の方法のそれぞれが、ハイスループット処理の適用が難しい段階であるそれぞれの標的タンパク質作製のための単一クローンの単離を必要とし、無傷のタンパク質よりむしろ変異型の単離をもたらす可能性がある。したがって、前述の研究は１つとして病原体の全ゲノムの大部分またはすべてを表す大量のタンパク質、例えば生物のすべてのプロテオームを容易に提供することはできなかった。様々な相互作用および特性に対して分析され得るプロテオームアレイを調製するハイスループットプロトコルを可能にする方法の必要性がある。
【０００９】
このようなアレイの利用の１つは、感染性生物に対するワクチンの開発へ向かう段階として、免疫活性がある感染性生物により産生されたそれらのタンパク質を同定することである。感染病原体中のこれらの抗原性タンパク質を同定する取り組みは多くの形式を取っている。タンパク質は、曝露が意図されしたがって免疫系に利用できる領域を確定するために、例えば親水性プロットで分析されてきた。あるいは、（米国特許第６６２０４１２号および第６４５１３０９号に記載のように）４００のモノクロナール抗体がウィルス中和能力およびチャレンジからマウスを保護する能力について検査された。このように同定された抗体はそれらが免疫反応を起こすタンパク質と関連した。多くのこのようなタンパク質が同定された。
【００１０】
米国出願第２００３／００８８２５７９号は、生物または生物の一部により誘発された免疫血清中に存在する少なくとも１つの抗体を用いて感染性生物由来のタンパク質アレイをスクリーニングすることによる抗原の同定方法を記載している。コードしているＤＮＡのＰＣＲ増幅、それに続く転写調節を導入するためのＰＣＲの第２ラウンドによりアレイ中のタンパク質が得られ；第２ラウンド産物はそれからインビトロでタンパク質に翻訳される。しかしながら、記載されたタンパク質アレイを得る方法はハイスループット様式を計画する場合にはタンパク質産出量が明らかに不十分である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
このようにこれらの方法は、ワクチンおよび診断法開発に有益な抗原タンパク質は、免疫応答を誘発するそれらのタンパク質またはタンパク質の一部を同定するために感染病原体のタンパク質をスクリーニングすることにより、見い出し得ることを示している。しかしながら、これらの方法はそれぞれのタンパク質に関して単一クローンを単離する必要があるので、可能性のある抗原タンパク質またはペプチド部分の全範囲の表現型である感染病原体に特有の抗原を同定するためのハイスループット研究を提供しない。新しい感染病原体、例えば、作り出された生物兵器などに対するワクチンまたは診断テストの開発にすばやく対処するために、このような迅速な方法が必要である。本質的に完全なプロテオームを表すタンパク質／ペプチドアレイ合成の可能性および実践的に自動化受け入れ可能な実施方法の提供により、本発明は診断テスト、ワクチンおよびＴ細胞免疫刺激物に関する大部分の有望な候補を素早く同定する機会を提示する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
１つの態様において、本発明は、ウィルス、原生動物、寄生体または細菌などの感染病原体ゲノム由来のタンパク質またはペプチドの実質的部分の調査にまたは実質的に完全な発現範囲に基づくことのできる免疫原性活性を有するタンパク質またはペプチドの同定方法を対象とする。本方法は、このような病原体のゲノム中の基本的にすべてのオープンリーディングフレームに対して４８を表すタンパク質および／またはペプチドを提示すること、およびこのような病原体に曝露されたことのある個体由来の免疫血清または血漿を用いてアレイ中の各タンパク質および／またはペプチドを検査することを可能にする。したがって、最終的に本方法は本質的にすべての病原体のゲノムによりコードされた免疫活性ペプチドの同定を可能にする。
【００１３】
全般的に、本発明は感染病原体由来の免疫活性ペプチドまたはタンパク質の同定に有益なペプチド／タンパク質アレイの調製および一般のタンパク質／ペプチドアレイの調製の双方に関する多くの態様を有する。これらの方法は感染病原体ゲノムの有意な部分を表すペプチドおよびタンパク質を含むアレイの調製を可能にする。これらのアレイは細胞および／または液性応答を誘発できる免疫活性物質の同定に利用できる。本発明はまたそのように同定された特異的抗原およびそれらに免疫反応性のモノクロナール抗体にも関する。抗原、それらの核酸および抗体はすべて感染体に関する診断的、予防的および治療的処置に有益な免疫学的組成物の調製に使用できる。したがって、１つの態様において、本発明は個々のコロニーの選択を利用せず、収集され培養された細胞の混合液から使用者がこれらの発現系を得ることを可能にする、所望のヌクレオチド配列の発現系を得る方法に関する。核酸の細胞に対する抽出されるべき形質転換細胞を得るために使用された比率もまた本発明の態様である。
【００１４】
もう１つの態様は、本発明の方法により調製されるペプチド／タンパク質アレイまたは感染性生物のゲノムの有意な部分を表すペプチド／タンパク質のどちらかのアレイを対象とする。本発明はまた上記のように同定された抗原およびこれらを使用する方法、それらの対応するモノクロナール抗体、およびそれらをコードする核酸分子を対象とする。感染した血清中の抗体に反応する抗原は感染症の患者を診断する血清検査に直接使用できる。
【００１５】
１つの態様において、本発明は所望のヌクレオチド配列の発現系を得る方法を対象とする。この方法は、所望のヌクレオチド配列のための発現系により形質転換された宿主細胞、またはこのような細胞によって発現系に組み合わされ得る成分により形質転換されたリコンビナーゼ−形質転換受容性宿主細胞を利用できる。発現系は通常プラスミドである。宿主細胞は化学的形質転換受容性細菌、酵母、またはエレクトロポレーション−形質転換受容性細胞でよく、いくつかの実施形態において、宿主細胞はサッカロミセス・セレビシェなどの酵母または大腸菌などの細菌であり、およびＪＣ８６７９、ＴＢ１、ＤＨ５アルファ、ＤＨ５、ＨＢ１０１、ＪＭ１０１、ＪＭ１０９およびＬＥ３９２からなる群より選択された大腸菌株の少なくとも１つを含むことができる。
【００１６】
発現系の成分は線状化プラスミド、関与する生物由来の少なくとも１つのオープンリーディングフレーム、またはこのようなＯＲＦの一部、および新しいプラスミドを作製するためにＯＲＦを線状化プラスミドの中に確実に挿入できるよう設計された１つまたは複数のアダプターを含むことができる。したがって、このような各アダプターは線状化プラスミドの１つの末端に相補的な第一のヌクレオチド配列およびゲノムＯＲＦの１つの末端に相補的な第２のヌクレオチド配列を含む。このような適切に設計された２つのアダプターは、ＯＲＦを線状化プラスミドの中へ挿入することに使用でき、そのプラスミドを用いて適切なリーディングフレーム中に挿入されたＯＲＦのヌクレオチド配列を有する新しいプラスミドを作製する。
【００１７】
アダプターは多くの場合さらに、フレーム中のエピトープタグなどの１つまたは複数の付加された特徴をコードするヌクレオチド配列をＯＲＦに含むことができ、そのため発現タンパク質はエピトープタグと連結したＯＲＦによりコードされたペプチドを含む融合タンパク質になる。このようなエピトープタグは、発現ペプチドまたはタンパク質の検出、精製または位置決めに有益であろう。この目的に関するエピトープタグは限定されるものではないが、以下の１つまたは複数を含むことができる：３〜１２の連続したヒスチジン残基、一般に６〜１０のこのような残基、をコードするポリヒスチジンタグ；血球凝集素（ＨＡ）タグ；ｃ−Ｍｙｃタグ；ビオチン−リガーゼ認識部位；グルタチオン−Ｓ−アデノシルトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ；例えば、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質；ＦＬＡＧタグ；およびリンカー。このような２つのアダプターが一般的に使用されるので、これらの要素はこのような２つのアダプターのうち１つまたは両方の上に含まれる可能性がある。例えば、一方の上にポリヒスチジンタグおよび他方の上にＨＡタグを含むことで単一発現タンパク質のための２つの異なる検出または位置決め方法を可能にする。本発明のいくつかの実施形態において、１つまたは複数の他の機能要素もまたアダプターまたは線状化プラスミドのどちらかの上に含まれる。このような要素の配置および選択は当技術分野では周知である。このような要素はプロモーター、終了配列、オペロン、融合タグ、シグナルペプチドまたは他の機能ペプチド、アンチセンス配列およびリボザイムを含むことができる。
【００１８】
発現ヌクレオチド配列は生物のゲノム由来の配列を含むことができ、いくつかの実施形態において対象となる生物の遺伝子由来の１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むことが選択される。いくつかの実施形態では生物は微生物であり、いくつかの実施形態ではそれは感染病原体である。ヌクレオチド配列が感染病原体などの生物のゲノムの一部を含む実施形態において、本明細書中の方法で利用するアダプターは１つまたは複数のエピトープタグを含む。このような標識の代表的な例は、ＨＡ、ｃ−Ｍｙｃおよび少なくとも６つの連続したヒスチジン残基を有するポリヒスチジンを含む。
【００１９】
本発明の１つの態様において、対象となる標的ゲノムヌクレオチド配列および線状化プラスミドの両方を使用前にＰＣＲにより増幅し、百万細胞当たり１〜１０ｎｇの標的ヌクレオチド配列および線状化プラスミドを使用する。他の態様においては標的ヌクレオチド配列および線状化プラスミドの量はより大量である可能性がある。いくつかの実施形態においてはヌクレオチド配列のプラスミドに対するモル比は約１：１でよく、他の実施形態においては１：１０と１０：１の間、さらに別の実施形態においては１００：１と１：１００の間である。
【００２０】
細胞を、これらの成分の存在下でその後培養し、収集し、形質転換細胞の混合体から発現系を抽出する。本発明のもう１つの態様において、発現系の単離に先立つ単一クローンの単離は必要ない。むしろ、培養細胞を混合体として収集し、通常はプラスミドである発現系を収集細胞から直接単離する。したがって本方法はこのような発現系の作製のためのハイスループット・自動化手段に関して有利であり、所望のタンパク質またはペプチドをコードしているプラスミドの回収によりよい結果を残す。後者の有利性は、突然変異を起こしているかまたは求めていたものよりむしろ望ましくないプラスミドを含んでいるコロニーの不適切な選択による、望ましい発現系の損失を防ぐ本発明の方法の能力を反映する。
【００２１】
このように作製された発現系は、コードされたペプチドを作製するために発現系を翻訳できる細胞由来系中の１つまたは複数のペプチドまたはタンパク質を作製するために使用できる。細胞由来系は無傷細胞の内部でよく、または必須な酵素および構成要素の無細胞混合体でもよい。いくつかの実施形態において、細胞由来系はエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））などの細菌；または酵母；または原核細胞である。他の実施形態においては、網状赤血球などの哺乳動物細胞でもよく昆虫細胞でもよい真核細胞である。ある実施形態では、発現系は樹脂状細胞、Ｂ細胞またはマクロファージなどの抗原提示細胞（ＡＰＣ）の中へ導入される。他の実施形態においては、使用する翻訳／転写系は大腸菌などの微生物由来、または網状赤血球などの真核細胞由来、または小麦麦芽などの植物細胞由来でよい無細胞系である。
【００２２】
１つの実施形態において、タンパク質またはペプチドは１つまたは複数の宿主ゲノムの遺伝子を表している。したがって、本発明の方法は、前記ゲノムの遺伝子の任意のサブセットをコードするプラスミドを作製するために使用でき、このようなゲノムの遺伝子の大部分または実質的にすべてをコードするプラスミドのセットまたはアレイを作成するために使用できる。ある実施形態では、該ゲノムは感染病原体のものである。
【００２３】
本発明の方法により得られて発現した発現系は、感染病原体または他の生物のゲノムを表すタンパク質またはペプチドのアレイの作製に使用できる。これらのアレイは本発明のさらなる態様において使用でき、このさらなる態様は液性および／または細胞性免疫応答を起こすであろう抗原の同定方法に関する。この方法は本明細書中の方法により作製された少なくとも１つのタンパク質またはペプチドを曝露すること、または病原体のゲノム中のオープンリーディングフレームによりコードされているタンパク質／ペプチドの実質的にすべてを表すタンパク質および／またはペプチドのアレイを、感染病原体に曝露されたことのある対象からの免疫血清または血漿またはそれらの成分に曝露することを含み、この対象を「免疫された対象」と言い得る。例えば、曝露は感染病原体または感染病原体の一部の弱毒化型を使用したワクチン接種または前記感染病原体による感染経験によるものでよい。前記血清、血漿または成分による免疫反応を示すアレイに含まれるタンパク質／ペプチドはワクチン製造の有望な候補として同定される。アレイがタンパク質の全長を含む場合、ペプチドが抗原性ペプチドのセグメントを表し、タンパク質上の抗原エピトープのより的確な位置決めを可能にする、前述の方法で同定される抗原由来の追加のペプチドアレイを提供する段階をさらに含むことができる。あるいは、最大免疫活性を示すであろう領域を同定するために、親水性プロットなどの当技術分野で周知の方法を使用し、完全長タンパク質またはより長いペプチドを分析できる。免疫反応性でありワクチン処方に潜在的有用性があると同定された同一のタンパク質またはペプチドが、感染患者の疾病原因病原体の同定のための血清学的診断テストに直接有益であり得る。所与の感染病原体によりコードされたタンパク質に対する血清抗体を有さない患者は、該病原体により感染していない。病原体由来のタンパク質に対する抗体を有する患者は、最近感染したかまたは過去のいつかにおいて感染したことがあるかのどちらかである。
【００２４】
免疫活性ペプチドまたはタンパク質の同定に使用されたペプチド／タンパク質アレイは感染病原体のゲノムのかなりの部分−例えば、５０％−を表すことができ、またはそれらはコードされたアミノ酸配列の大部分（＞５０％）または実質的にすべて（少なくとも９８％）を表すことができる。いくつかの実施形態において、タンパク質アレイは本発明の方法により調製される。いくつかの実施形態では、本発明の方法により調製されたタンパク質またはペプチドまたはアレイは複数の免疫された対象の免疫成分に曝露され、少なくとも大部分の免疫された対象からの免疫応答を誘発するそれらのタンパク質またはペプチドは免疫優勢抗原として同定され、ワクチン含有物の適切な候補である。いくつかの実施形態では、これらアレイまたはタンパク質はまた免疫されていない対象由来の血清に曝露され、免疫された対象内で応答を誘発し免疫されていない対象内では誘発しないタンパク質が、ワクチンの使用に適切であるとして選択される。
【００２５】
液性応答が、いくつかの本発明の実施形態において、タンパク質またはペプチドに対する免疫された対象由来の少なくとも１つの抗体の結合を検出することにより検出される。抗体へのタンパク質の結合の検出は当技術分野で周知の方法により観察でき、この方法は、例えば蛍光標識、放射性標識または酵素で標識した第２の抗体の使用を必要とする方法を含む。
【００２６】
いくつかの本発明の実施形態において、細胞性免疫応答が検出できる。関連免疫成分は免疫された対象由来のＴ細胞である。このような実施形態において、Ｔ細胞が１つまたは複数のペプチドまたはタンパク質に接触しているとき、免疫応答は前記Ｔ細胞によるすくなくとも１つのサイトカインの形成を観察することにより検出される。このような実施形態に関して、ペプチドまたはタンパク質は抗原提示細胞（ＡＰＣ）により提示され得、いくつかの実施形態においてＡＰＣを本発明の方法により得られたプラスミド由来のペプチドまたはタンパク質の発現に使用する。他の実施形態において、タンパク質またはペプチドは少なくとも１つのエピトープタグを含む融合タンパク質として発現され、前記エピトープタグはタンパク質またはペプチドを表面上に固定するために使用する。いくつかの実施形態において表面は、ＡＰＣより小さく、したがってＡＰＣにより取り込むことができる、マクロファージなどの粒子またはビーズである。このような１つの実施形態において、粒子はニッケルビーズまたはニッケルもしくはニッケルの塩または錯体で被覆されたビーズで、ペプチドまたはタンパク質は少なくとも６個の連続したヒスチジン残基を有するポリヒスチジンエピトープタグを含む。ペプチドはその結果、ニッケルへのポリヒスチジン標識の親和力によりニッケル含有先端上に固定できる。
【００２７】
他の態様において、本発明は、対象から得られた免疫成分の、検査材料への免疫応答を検出する方法を提供する。この検査材料は、試料中に、この対象が免疫応答を示し得る他の抗原材料と共に含まれている。これらの状況は、例えば、検査されるタンパク質（このタンパク質にこの対象は暴露されたことがあり得て、したがってこのタンパク質に対してこの対象は免疫応答を示す。）が細胞由来の系で発現されたとき起こり得る。この方法において、対象から得られた免疫成分は追加の非関連抗原材料によりまず処理され、その結果、前記検査材料による免疫成分の処理の前に、非関連抗原材料に対する何れの免疫反応も遮断される。例えば、検査されるタンパク質またはペプチドがＥ．コリ由来の系の中に生産されるとき、ヒト対象由来の免疫成分試料はＥ．コリ抽出物により処理され得、ヒトが様々なＥ．コリ抗原に対して示すと思われるバックグラウンド免疫応答を遮断され得る。したがって、Ｅ．コリの溶解物または抽出物が対象由来試料の処理に予備的に使用されるであろう。
【００２８】
要約すると、本発明は、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）またはその一部によりコードされた、個々のタンパク質またはペプチドを提供する方法を対象とし、該オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）またはそれらの一部は発現系（たとえばプラスミド）において前記タンパク質またはペプチドをコードしているインサートの効果的な発現を含み、該発現系は前記インサートおよび線状化プラスミドを含むように修飾されたリコンビナーゼ・形質転換受容性細胞の混合体（クローンでない）より抽出され、ここで前記線状化プラスミドおよび前記インサートはインビボ相同的組み換えにより前記細胞内で連結されており、前期インサートは前記ＯＲＦまたはそれらの一部から増幅される。１つの特有の実施形態において、線状化プラスミドは自分自身で増幅する。増幅はＰＣＲにより可能である。タンパク質作製のための発現は例えば、無細胞系において、または所望の翻訳後修飾を備える細胞において可能である。本方法は同時作製するタンパク質またはペプチドの多様性を可能にする。いくつかの実施形態において、１０、５０、１００、２００、４００、６００、８００、１０００、１５００、２０００または２０００以上の異なるタンパク質またはペプチドが同時に作製できる。
【００２９】
本発明は感染病原体または生物のゲノムによりコードされているタンパク質またはペプチドの大部分または実質的にすべての試料を作製する方法を提供する。このように得られたタンパク質もしくはペプチドは別々に含まれ得、またはこれらはニトロセルロースなどの基材上にもしくは検査表面上のタンパク質またはペプチドのアレイを作製するためのプレートまたはチップ上に配置され得る。いくつかの実施形態において、これらのタンパク質またはペプチドの各々は１つまたは複数のエピトープタグと融合でき、これにより翻訳後にタンパク質の検出、位置決め、精製が可能になる。エピトープタグは、支持表面または例えば発現タンパク質のポリヒスチジンタグに硬く結合できるニッケル表面などの相補的結合材料からなる表面に、タンパク質またはペプチドを固定するために使用できる。したがって、いくつかの実施形態において、対象となるペプチドはエピトープタグに融合発現され、前記エピトープタグはペプチドをビーズまたは分析プレートのウェルなどの表面に固定するために使用される。１つの実施形態において、エピトープタグは少なくとも６つの連続したヒスチジン残基を含むポリヒスチジン配列であり、１つまたは複数の前記タンパク質が固定された表面はニッケルを含む。
【００３０】
さらにもう１つの実施形態において、本発明はＯＲＦまたはそれらの一部であるヌクレオチド配列からなるインサートを含むプラスミドを得る方法を対象とし、この方法は線状化ベクターおよび前記ＯＲＦまたはその一部を含む増幅された核酸を含むように修飾され、相同的組み換えを介して前記インサートおよび前記線状化プラスミドが組み替えられたリコンビナーゼ・形質転換受容性微生物の混合体（クローンでない）から前記プラスミドを抽出することを含む。
【００３１】
さらにもう１つの態様では、本発明は感染病原体に対して液性応答を生じるであろう抗原の同定方法を対象とし、この方法は本発明の方法で得られたタンパク質および／またはペプチドのアレイと、それぞれが感染病原体、場合によって弱毒化型またはそれらの一部に曝露された対象より得られた免疫血清または血漿またはそれらの中に含まれる免疫グロブリンとを免疫応答の誘発が予測される方法で接触させること、および血漿、血清または分離された免疫グロブリンに免疫反応するそれらのタンパク質またはペプチドを適切な抗原として同定することを含む。いくつかの実施形態において、ペプチド／タンパク質は前記感染病原体のゲノムの大部分または実質的にすべてを表し、免疫反応は感染病原体に応答して対象により産生される少なくとも１つの抗体との結合を含む。これらタンパク質またはペプチドは、上記の方法に従いインビボ組み換えを使用してプラスミドを得て誘導し得る。このプラスミドは、次に、無傷の細胞の内部でもよく無細胞系でもよい細胞由来系において発現に付される。いくつかの事例では、血清または血漿を、背景の免疫反応を最小にするために、タンパク質の発現に使用される細胞由来系を提供する生物の溶解物で処理することが望ましいであろう。いくつかの実施形態において、細胞由来系はＥ．コリより得られ、Ｅ．コリの抽出物または溶解物が細胞由来系の成分に対するバックグランド免疫応答を遮断するために使用される。タンパク質またはペプチドの抗体との結合は、いくつかの実施形態において、検出を容易にするために蛍光性、放射性または酵素性標識基により標識された第２の抗体の使用により検出できる。
【００３２】
他の態様において、本発明は感染病原体に対する細胞応答を生じる抗原を同定する方法を対象とする。この方法は上述したものと似ていようが、対象の樹状細胞または他の免疫系細胞成分を免疫活性の診断用薬として利用し得る。ある実施形態において、上述の方法により提供されたタンパク質またはペプチドはビーズなどの基材上に固定され、例としては、発現タンパク質上にポリヒスチジンエピトープタグを組み込むことによりニッケル被覆ビーズ上にそのタンパク質を固定化し、その後固定されたタンパク質またはペプチドはＡＰＣに曝露される。有利なことに、基材はＡＰＣより小さいビーズ構造であり、したがってこのようなＡＰＣにより内在化させられる。次いで前記ＡＰＣは上述の方法で病原体に対して免疫化された対象由来のＴ細胞のような応答細胞の少なくとも１つの型に曝露される。前記応答者細胞またはＴ細胞による１つまたは複数のサイトカインの産生がこのタンパク質に対する免疫応答の存在を示している。したがって、この実施形態においては、Ｔ細胞がペプチドまたはタンパク質に曝露されたことのあるＡＰＣに曝露されたとき、免疫応答は１つまたは複数のサイトカイン形成を検出することにより検出できる。あるいは、免疫応答は前記応答者細胞またはＴ細胞の細胞毒性活性の増殖を観察することにより検出できる。
【００３３】
ひとたび抗原タンパク質が同定されると、本発明の方法はまた、免疫原性のタンパク質上の領域をより精密に同定するために、タンパク質のスキャンにも使用できる。これはタンパク質セグメントを発現させるように設計されたプライマーを提供することにより実施できる。タンパク質セグメントは例えば、１０から２０、または２０から３０、または２０から５０、または２０から１００のアミノ酸長でよく、必要に応じてこれより短いものまたは長いものも使用できる。これらのより短いペプチドはその後発現され、本発明の方法により分析され、したがって抗原効果を生じるそれらのペプチドは同定される。場合によって、これらのセグメントは、抗原が二つのセグメント間で分断されるために見逃される可能性を最小限にするために重複した設計にしてもよい。
【００３４】
他の態様において本発明は、本発明により得られたタンパク質またはペプチドのアレイ、前記アレイにより同定された抗原、本発明の方法により同定された免疫優勢抗原および少なくとも１つのこのような抗原とそのような抗原の少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列とを含むＤＮＡワクチン組成物を含むワクチン組成物および上記の方法により同定された少なくとも１つの抗原を含む血清学的診断テストを対象とする。他の態様においては、抗体、とりわけ前記抗原の少なくとも１つに特異的なモノクロナール抗体およびこのような抗体を含む組成物を対象とする。その上更なる態様は抗原、抗体、ワクチンおよびＤＮＡワクチンを含めた、本発明の組成物による対象を免疫化する方法、ならびに、これらの方法により治療的または診断的に同定された核酸および／または抗原を使用する方法、例えばある人がすでに特定の生物に感染しているかまたはしていたかどうかをはっきりと決定することを対象とする。
【００３５】
本発明のある実施形態において、発現系の作製に関する本明細書中の方法は、生物のゲノムより選択されたそれぞれの遺伝子セットを、それ自身のプラスミド（場合によって、エピトープタグを含む）の中に組み込むことに適用され、この生物のタンパク質の大部分または実質的にすべて（すべてのプロテオーム）を表すようなタンパク質のアレイが作製される。この生物は、バチルス・アントラシス（Bacillus anthracis）（炭疽菌）、クロストリジウム・ボツリヌム（Clostridium botulinum）、エルシニア・ペスティス（Yersinia pestis）、バリオラ・メジャー（Variola major）（天然痘）および他のポックスウィルス、フランシセラ・ツラレンシス（野兎病）、またはアレナウィルス（Arenaviruses）（例えば、ＬＣＭ、フニンウィルス、マチュポウィルス、グアニトウィルス、ラッサ熱）、ブニヤウィルス（Bunyaviruses）（例えば、ハンタウィルス属（Hantaviruses）、リフトバレー熱）、フラビウィルス（Flaviruses）（例えば、デング）またはフィロウィルス（例えば、エボラ、マールブルグ）を含むウィルス性出血熱などの感染病原体であり得る。この生物はまたバークホリテリア・シェードマレイ、コクシエラ・バーネティー（Coxiella burnetii（Ｑ熱））、ブルセラ（Brucella）種（ブルセラ症）、バークホルデリア・マレイ（Burkholderia mallei）（鼻疽））、リシン毒素（リシナス・コンムニス（Ricinus commnis）由来）、クロストリジウム・パーフリンゲン（Clostridium perfringens）のイプシロン毒素、スタフィロコッカス・エンテロトキシンＢ（Staphylococcus enterotoxin B）、発疹チフス（リケッチア・プロワゼキ（Rickettsia prowazekii））などの感染病原体、または細菌（例えば、下痢原性Ｅ．コリ、病原性ビブリオ、シゲラ（Shigella）種、サルモネラ（Salmonella）、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、エルシニア・エンテロコリチカ（Yersinia enterocoliticd））、ウィルス（カルシウィルス、Ａ型肝炎）または原生生物（例えば、クロストリジウム・パルビス（Cryptosporidium parvum）、シクロスポラ・カヤタネンシス（Cyclospora cayatanensis）、ジアルジア・ランブリア（Giardia lamblia）、エンタモエバ・ヒストリチカ（Entamoeba histolytica）、トキソプラズマ（Toxoplasma）、ミクロスポリディア（Microsporidia）を含む食物および水中病原体であり得る。この生物はまた、西ナイルウィルス、ラ・クロス、カリフォルニア脳炎、ＶＥＥ、ＥＥＥ、ＷＥＥ、日本脳炎ウィルスまたはキャサヌールフォレストウィルス（Kyasanur Forest Virus）を含むウィルス性脳炎群などの感染病原体でもあり得る。さらにこの生物は、ニパウィルス、ハンタウィルス、ダニ媒介出血熱ウィルス（例えば、クリミア・コンゴ出血熱ウィルス）、ダニ媒介脳炎ウィルス、黄熱病、多剤耐性ＴＢ、インフルエンザ、リケッチア、狂犬病または重症急性呼吸器症候群関連コロナウィルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ））などの感染病原体でもあり得る。いくつかの実施形態では、それはフランシセラ・ツラレンシス、ヒトパピローマウィルス、西ナイルウィルス、バークホリデリア・シュードマレイ、またはプラスモジウム・ファルシパルム、マイコバクテリウム・ツベルクロシスまたはワクチニアである。このように作製されたタンパク質はチップなどの検査表面の上に、作製された各々のタンパク質またはペプチドを配置することによって、アレイ中にフォーマットできる。ニトロセルロースなどの検査表面へのタンパク質の非特異的結合により、またはタンパク質もしくはペプチド上にエピトープタグが存在する場合にエピトープタグと結合する表面特徴との特異的結合により、タンパク質はこのようなアレイ中に局在化できる。例えば、タンパク質またはペプチドがポリヒスチジンタグを含む場合、ニッケル含有表面を使用できる。
【００３６】
このアレイはこのような生物のタンパク質の選択された１組を含むことができ、または少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％またはより多く、例えば感染病原体の実質的にすべてのゲノム、を表すタンパク質および／またはペプチドを含むことができる。このようなタンパク質および／またはペプチドの数は少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、１０００、１５００、２０００または２０００より多くの異なる配列であり得る。このような実施形態において、アレイは生物のプロテオームのこのような一部分を集合的に表すいくつかの別々のアレイを調製することによって得ることができる。したがっていくつかの実施形態において、本発明はタンパク質のアレイを検査表面上に作製する方法を提供し、このアレイは感染病原体のプロテオームの選択された一部（最大すべてのプロテオームを本質的に含む）を表す。このようなプロテオームアレイは対象が感染している病原性生物の株の決定と免疫優勢抗原タンパク質の同定およびタンパク質が保有する他の任意の活性または特性の決定に使用できる。さらに他の態様において本発明は、同定された抗原に免疫反応性のモノクロナール抗体およびこのような抗体を使用し受動的免疫を与える方法を対象とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
本発明の１つの実施形態は、これらアレイの液性および／または細胞性免疫応答を生じる能力を検査できるように、感染病原体のゲノムにコードされたものを表すタンパク質および／またはペプチドのアレイを得るためのハイスループットな方法を提供する。このアレイ中のタンパク質の調製に関する方法はどのような供給源由来でも一般的なタンパク質の調製に適用可能である。特に、本ハイスループット法特有の有利性は感染病原体由来のタンパク質およびペプチドのレパートリーの提供に適用可能である。本方法はさらに、個々の増幅された部分またはインサートはリコンビナーゼ含有微生物中で複製可能なプラスミドに提供可能なので、配列が周知である任意の核酸にコードされた多数のタンパク質および／またはペプチドの提供にも使用できる。このようなタンパク質の調製に関する本発明の方法は、すでに採用されている方法とは異なり、単離した個々のクローンよりむしろ形質転換混合物の成分を培養することにより得た微生物の混合物より抽出したＤＮＡを用いる。クローンの単離は、多くの場合所望の天然型タンパク質よりむしろ変異型の獲得をもたらすのでこれは有利である。さらに本発明の方法は、スクリーニング段階において、これらの混合物より得たベクターによりコードされ発現された未精製のタンパク質を利用できる。結果として、本方法は全体的方法の自動化およびハイスループット処理の導入をすばらしく簡略化する。
【００３８】
本発明の方法を使用して、効能のあるワクチンになるであろうワクチニア由来の特定のタンパク質の同定が可能になっている。弱毒化ウィルスの使用は時として好ましくない副作用を伴うため、このことは重要と考えられる。弱毒型感染病原体複合体よりむしろ単一タンパク質または明確なタンパク質混合物の利用の法が好ましいであろう。例えば、現在Ｂ型肝炎表面抗原の使用が行われている。
【００３９】
上記のように本発明の方法は、関連ヌクレオチド配列が周知である場合、一般に多くのタンパク質およびペプチドをコードする核酸に適用可能であり、そのため所望のインサートの増幅のために適切なプライマーを利用できる。例えば、どちらもここに参照により組み込まれる米国第２００３／００８２５７９号および米国第２００３／００４４８２０号に記載のように、設計されたプライマーは線状化ベクターによる所望の相同的組み換えを提供するアダプター配列を含む。伸長されたプライマー自身および／または線状化ベクターは、適切な固体表面への強固な結合または、もし必要であれば、発現タンパク質の精製を可能にするために、その後発現を起こすプロモーターおよびターミネーターなどの適切な制御配列と共にヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグなどの「タグ」、などを提供できる。通例、線状化ベクターはまた、インサートを含まないベクターを生じ得るより伝統的な分解方法を用いるよりむしろ、ＰＣＲにより増幅され得る。
【００４０】
本発明の方法全般において、多様なタンパク質またはペプチドをコードし、そのヌクレオチド配列が周知である感染病原体ゲノムなどの核酸分子を基材として使用する。対象となるタンパク質またはペプチドをコードしている個々のセグメントは個別に（例えば、個々の反応混合物）ＰＣＲまたはコードしている配列の末端部分に相補的な配列および発現を制御しているタグおよび／または配列をコードできるアダプター、しかしいずれにしても線状化ベクター上に提供される配列に相同であるどちらをも含むプライマーを用いた他の増幅技術を使用して増幅される。個別に増幅されたセグメントおよび線状化プラスミドはその後インビボでの組み換えを可能にするために、リコンビナーゼ含有微生物中に共形質転換される。リコンビナーゼ含有生物は、例えば、酵母または化学的形質転換受容性Ｅ．コリでよい（またはそれほどではないが、エレクトロポーション・形質転換受容性Ｅ．コリが望ましい）。適切な化学的形質転換受容性Ｅ．コリはＪＣ８６７９、ＴＢ１、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＪＭ１０１、ＪＭ１０９およびＬＥ３９２株を含む。サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）はリコンビナーゼ含有酵母として特に有効である。
【００４１】
形質移入反応におけるＤＮＡの細胞に対する比は１００ｎｇ／１００万細胞程度の高さでよい。しかし１〜１０ｎｇ、５〜１０ｎｇ、１〜５ｎｇまたは１〜３ｎｇ／１００万細胞程度の低い比率のものも使用できる。多くの場合線状化プラスミドおよび所望のヌクレオチド配列が約１：１のモル比で提供されることが望ましく、しかしながら、５：１から１０：１〜１００：１の比のものを用い、１：５から１：１０〜１：１００の比のものもまた用いることができる。
【００４２】
増幅インサートおよび増幅線状化ベクターにより処理された細胞は適切な培地で、多くの場合一晩培養する。得られるのは細胞混合物であり、その大部分は正しい方向に挿入された所望のヌクレオチド配列の増幅セグメントを有する所望の組み換えベクターを含む。（方向性は線状化プラスミドの相同部分に適合するようなプライマーの設計により確実になる。）例えば突然変異のために、所望のインサートを喪失する危険を冒す個々のコロニーの単離よりむしろ、細胞は、プラスミドＤＮＡを得るために、培養物から回収し直接抽出する。したがって、得られたプラスミド混合物はその後ＤＮＡの適切な宿主細胞への形質移入またはハイスループット目的のために通例インビトロの翻訳系のどちらかにより転写／翻訳される。このようなインビトロ翻訳系は市販されており、その使用法については当分野の技術者には周知である。得られたタンパク質またはペプチドは、それから直接個体支持体にスポットできる。この支持体は、マイクロタイタープレートのウェルまたは分割されたニトロセルロースなどの、任意の適切な表面に調製されたタンパク質およびペプチドのアレイの一部であり得る。必要であれば、タンパク質は当分野で周知の方法によりまたはプライマーまたはプラスミドからタンパク質中にコードされたタグの使用により精製されてよく、あるいは、さらなるタンパク質の精製を行うことなく転写／翻訳混合物を直接使用して、タンパク質またはペプチドを個体支持体に提供できる。本発明の方法により作製された、精製されたまたは実質的に精製されたタンパク質は本発明の１つの態様である。これらのタンパク質またはペプチドは自然発生ペプチドまたは本明細書にさらに記載のエピトープタグなどの１つまたは複数の付加からなる修飾型でよい。タンパク質が支持体に付着された場合、固体支持体は、それ自身、片方のリガンドをタンパク質またはペプチド上のタグに対する対の一方となるリガンドが供給され得る。
【００４３】
タンパク質のアレイを得るために、前述の段階の配列決定が希望のＯＲＦまたはそれらの部分の多くに関して実施される。アレイ上でいずれにしてもスクリーニングを行うための有望な候補がすでに周知である場合、タンパク質／ペプチドのアレイのメンバーとして比較的少数のタンパク質またはペプチドのみを得ることが有利である。しかしながら、５０、１００、５００、１０００ほど多くまたはより多く、多数のヌクレオチド配列がタンパク質またはペプチドに変化させ得る。例えば、感染病原体のゲノムまたは、任意の原核生物のゲノムを使用した場合、アレイは発現タンパク質またはペプチドの少なくとも１０％、２０％、５０％、７５％、９０％、９５％または１００％を含む。得られたアレイは生物の実質的にすべて、すなわち少なくとも９８％のプロテオームまたはそれらの一部のみのプロテオームを表わすことができ、またはプロテオーム中のタンパク質の個々のペプチド部分、または完全長のタンパク質および部分配列の組み合わせを表すことができる。
【００４４】
ペプチドまたはタンパク質のアレイの調製を容易にするために、特定の官能基に結合する通常６から２０アミノ酸長の短鎖ペプチドタグを用いた、対象となるペプチドまたはタンパク質の融合が有利であろう。このような結合タグは次いでタンパク質の精製またはタンパク質の検査表面への固定またはタンパク質の存在の検出に使用できる。短鎖配列アミノ酸からなるこのような結合タグは周知であり、一般的にエピトープタグを指す。例えば、赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、エピトープタグ（ヒトインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質、ＹＰＹＤＶＰＤＹＡなど）またはｃ−Ｍｙｃエピトープタグ（ヒトプロトオンコジーンｍｙｃの１０アミノ酸セグメント、ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）は、ゲノムヌクレオチドを発現プラスミドに挿入するために使用されるアダプターに適切なヌクレオチド配列を組み入れることにより発現すべきタンパク質またはペプチドと融合できる。ｃ−Ｍｙｃ、ＨＡまたは他のエピトープタグに対する抗体が次いで発現ペプチドを検出または位置決めすることに使用できる。
【００４５】
同様に、ポリヒスチジンタグはエピトープタグの役割を果たすことができ、タンパク質の発現に使用するベクターへのゲノム核酸挿入に使用するアダプターの特有の設計により発現タンパク質の中に組み込むことができる。ポリヒスチジンエピトープタグは３から１２の連続したヒスチジン残基を含むことができ、一般的には６から１０の連続したヒスチジン残基である。このようなポリヒスチジンタグはニッケル表面に特異的に強固に結合する。したがって、このようなタグを含む発現ペプチドまたはタンパク質はニッケルビーズ、ニッケル被覆表面またはニッケルもしくはニッケル塩または例えばニッケルニトリロ３酢酸３ナトリウム（Ｎｉ‐ＮＴＡ）などのニッケルの錯体からなる親和性カラムに強固に結合できる。したがって、ポリヒスチジンタグ含有タンパク質またはペプチドのアレイは、ニッケルまたはニッケルの塩または錯体でそれぞれのウェルを被覆し、その後それぞれのタンパク質またはペプチド溶液をこのようなニッケル被覆ウェルに注入して、タンパク質がこの表面に固定されるようにすることにより、９６ウェルフォーマットとして調製することができる。同様に、このようなタンパク質は、ビーズをニッケルで作製することによりまたは他の素材のビーズをニッケルまたはニッケルの塩もしくはニッケル錯体でメッキすることにより、簡易な表示としてビーズに付着させうる。１つの実施形態において、ゲノムタンパク質は少なくとも６つの連続したヒスチジン残基からなるポリヒスチジンタグでタグ付けし、１ｕｍニッケルビーズに付着させられる。これらのビーズはその後実施例９（下記）に記載のようにＴ細胞による免疫応答の分析に使用される。
【００４６】
必要に応じて、２つの異なるタグを付けることも可能である。すなわち、第１のタグをコードするヌクレオチド配列は、プラスミド内に挿入された核酸の５’末端の近くに含ませて、発現タンパク質のＮ末端にタグを付けることができ、第２のタグをコードするヌクレオチド配列は、プラスミド内に挿入された核酸の３’末端の近くに含ませて、発現タンパク質のＣ末端の近くにタグを付けることができる。これらの１つの末端が埋められてアクセス不能な場合、これらのタグは認識を確実にするために同一ということも有り得る。または、これらのタグは、使用される２つの異なる捕捉または検出方法を可能にするために、異なり得る。検出、位置決めまたは精製に有益な他のタグがまた必要に応じてゲノムタンパク質に付加されることができる。このようなタグはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ビオチン標識シグナル、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などを含み、それぞれは当分野で周知の方法により組み入れ得る。
【００４７】
いったん所望のペプチド／タンパク質またはペプチド／タンパク質のアレイが得られたならば、どのような所望の特性または反応性についてもスクリーニング可能である。このような使用の１つの例は免疫活性ペプチドおよびタンパク質についてのスクリーニングである。免疫活性は液性または細胞性の系についてであり得る。いずれの場合も、感染病原体またはそれらのいくつかの部分に曝露されたことのある対象から得られたスクリーニング体が必要である。場合により、タンパク質またはペプチドのアレイは、それぞれが感染病原体またはそのいくつかの部分（そのエンベロープタンパク質もしくは溶解細胞またはそのタンパク質の１つまたはそれ以上）に曝露されたことのある複数の対象から得た、１つまたはそれ以上の免疫成分（血清、唾液、血漿、Ｔ細胞など）に対してスクリーニングされ得る。このことは、多数の対象で免疫応答を誘発する抗原の決定を可能にする。最も一般に認識されるそのような抗原は免疫優勢抗原と呼ぶ。抗原のファミリーは、血清学的診断テストまたはこれら免疫優勢抗原のいくつかを含むワクチンに使用し得る。
【００４８】
本発明の方法は様々なゲノムに適用でき、多くの場合ウィルス、真菌、細菌、原生動物のほかに扁形動物、吸虫、線虫などの多細胞寄生体をも含む感染病原体のゲノムに有効に適用される。このような病原体のプロテオームの大部分を表すタンパク質アレイの迅速な作製方法を提供することにより、本発明はそれらの遺伝子および特定の感染病原体に対するワクチンまたは診断テスト開発にもっとも有益なタンパク質の迅速な同定を可能にする。
【００４９】
したがって、本明細書中で用いたように、「免疫活性の」という用語は、免疫応答が液性であれ細胞性であれその両方であれ、その免疫応答を誘発するタンパク質またはペプチドの能力を指す。液性の免疫応答は抗体を産生することを特徴とする適応性防御機構であり、一方細胞性の免疫応答は活性化ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および細胞障害性Ｔリンパ球（Ｔ細胞またはＣＴＬ）などの細胞の産生および／または活性化を特徴とする。同様に「抗原」は、誘発された免疫応答の性質にかかわらず、このような免疫活性タンパク質またはペプチドを指す。「免疫優勢抗原」は抗原に曝露された大部分またはすべての対象において免疫応答を誘発する抗原を指す。このような免疫優勢抗原は受動的免疫化法に使用するための効果的なワクチン成分または抗体産生のエリシターを提供する高い可能性があり、したがって、しばしば免疫組成物の成分として特に有効であり、血清学的診断テストにも有効である。
【００５０】
Ｔ細胞は他の細胞の表面上のペプチド／ＭＨＣ複合体を認識する。このような細胞はしばしば抗原提示細胞（ＡＰＣ）と呼ばれる。エフェクター細胞は実質的にどのような細胞型上のこのような複合体も認識することで自身の機能を仲介できるが、ナイーブ細胞は１組の特殊ＡＰＣ、樹状細胞（ＤＣ）、により最も効果的に活性化される。
【００５１】
本明細書中で使用される「アレイ」は少なくとも１つの検査表面上に組織的に位置づけられた物質の集まりを指し、前記表面上に形成されたウェルまたは凹部中に収容された物質を含み、この物質の配列場所はこの物質の同一性と相互に関連付けられる。アレイは、一般的に上記のように位置づけられた、少なくとも約１０の物質を含み、多くの場合少なくとも１００または２００または５００を含みまたは１０００またはそれより多くの物質を含むことができる。アレイは、該物質がそれらの置かれた位置に留まっている限り、それらが物理的または化学的どちらの力により留まっていようとも、例えばチップ、プレートまたはニトロセルロース基板上に配置された物質および９６−ウェルおよび３８４−ウェルおよび同様のプレートのウェル中に収容された物質を含む。アレイは多数のプレート、チップまたは他の表面を備え得る。例えば、マイクロアレイは試薬量を最小限にするよう設計された、小型化されたアレイである。ここに記載のアレイはしばしば抗原ペプチドのアレイであるが、一方本発明はまたこのような抗原ペプチドに選択的な抗体のアレイをも含む。
【００５２】
本発明の方法により同定された抗原はペプチドまたはタンパク質であり得、対象を感染病原体による感染から保護する免疫学的組成物の調製または受動的免疫の提供または抗原の精製もしくは検出に有効なモノクロナール抗体の産生に使用される。このような免疫学的組成物は対象を抗体産生などの免疫応答を生じるように誘導するワクチンになり得、またはそれら自身が抗体にまたは受動的免疫を提供する能動免疫物質になり得る。抗イディオタイプ抗体またはそれらを産生する核酸は抗原自体の代わりに使用できる。これらはまた１つまたは複数の抗原エピトープを生じる核酸ワクチンでもあり得、この核酸は患者自身の細胞により取り込まれ得る。これら核酸はコードされた抗原的タンパク質またはペプチドの産生をもたらすプロモーターなどの機能的要素を伴うことができ、または裸のＤＮＡであり得る。
【００５３】
本発明は、また、本発明の方法により同定されたペプチドおよび抗原に実質的に相同なペプチドおよび抗原を含み、ならびにこのような相同な抗原に由来する免疫学的組成物をも含む。したがって、本発明は、ここに述べられている方法により同定されたペプチドまたはタンパク質に実質的に相同なペプチドまたはタンパク質を含む診断テストまたはワクチンを含む。本発明はここに述べられている方法により同定された抗原に実質的に相同な抗原に特異的な抗体を含み、および本発明は実質的に相同なペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を含む。
【００５４】
本明細書中でタンパク質またはペプチドに関して使用するとき、「実質的に相同」という用語は、比較タンパク質またはペプチドに相当するタンパク質またはペプチドを意味する。例えばアミノ酸配列が変化しただけで機能に影響がない場合、タンパク質またはペプチドは比較と実質的に同一の構造および機能を有する。したがって、本出願において、実質的に相同なペプチドおよびタンパク質は免疫活性であり比較と類似の構造を有する。構造に関して、実質的に相同なものと比較タンパク質またはペプチドとの間の同一性の割合は、少なくとも６５％または少なくとも７５％または少なくとも８５％または少なくとも９０％または少なくとも９５％または少なくとも９９％である。
【００５５】
同一性の比較のためのタンパク質配列のアライメントは当分野で周知の方法により実施できる。タンパク質配列の比較のための有効な方法はＳｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所ホモロジーアルゴリズム；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３（１９７０）のホモロジーアライメントアルゴリズム；Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似法のサーチ；これらのアルゴリズムのコンピュータ化装置（ＧＡＰ， ＢＥＳＴＦＩＴ， ＦＡＳＴＡ， およびＴＦＡＳＴＡ、ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．）；および目視検査（通常下記のＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ． ａｌ．を参照）を含む。
【００５６】
配列同一性および配列類似性の割合の決定に適したアルゴリズムの例はＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載のＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するソフトウェアはウェブサイトｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにあるアメリカ国立バイオテクノロジー情報センターを通して入手可能である。このアルゴリズムは問い合わせ配列で長さＷの短い文字列を同定することにより、データベース中の配列の同じ長さの文字列と整列させたとき、ある正値評価の閾値Ｔと一致しまたは満たす高スコア配列対を先ず同定する。Ｔは近隣文字列の閾値を指す（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， １９９０）。これらの最初の近隣文字列のヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つけるための初期検索の種としての役割を果たす。文字列ヒットはその後累積アライメントスコアが増加し得る限りそれぞれの配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアはヌクレオチド配列は、パラメーターＭ（一致残基対に関するｒｅｗａｒｄスコア；常に＞０）およびＮ（不一致残基に関するペナルティスコア；常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列に関して、スコア行列が累積スコアの計算に使用される。累積アライメントスコアが最大達成値からＸ量まで低下したとき、累積スコアは１つまたは複数の負のスコアの残基アライメントの集積のために０またはそれより低くなったとき、またはどちらかの配列が末端に達したときに、文字列ヒットの両方向への伸長は停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸはアライメントの検出感度および速さを決定する。アミノ酸配列に関して、ＢＬＡＳＴＰプログラムは文字列長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列をデフォルトとして使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ（１９８９）８９：１０９１５を参照）。
【００５７】
配列アライメントはまたＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピュータソフト（ＤＮＡＳＴＡＲ、ウィスコンシン州マディソン）のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを使用して実施できる。配列の多重アライメントはアライメントのＣｌｕｓｔａｌ法（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ． ５：１５１−１５３）を使用してデフォルトパラメーター（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０，ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）を用いて実施できる。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用したペアワイズアライメントに関するデフォルトパラメーターは、例えばＫＴＵＰＬＥ １， ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝３， ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝５でよい。
【００５８】
あるいは、タンパク質またはペプチドは、免疫交差反応性であるとき、これらはまたここで実質的に相同とみなされる。様々な免疫測定フォーマットが特定のタンパク質またはペプチドに特異的に免疫反応するモノクロナール抗体を選択するために使用することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫学的検定、ウェスタンブロットまたは免疫組織化学が、タンパク質に特異的に免疫反応するモノクロナール抗体を選択するために日常的に使用されている。特異的免疫反応を決定するための免疫学的検定フォーマットおよび状態の説明に関するＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ “Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ”）を参照。通常特異的または選択的反応は、バックグラウンドシグナルまたはノイズの、少なくとも２倍であり、およびより典型的にはバックグラウンドの１０から１００倍である。
【００５９】
当業者は、配列中の単一のアミノ酸をまたはわずかな比率（例えば約５％より少いまたは例えば約１％より少い）のアミノ酸を変更し、付加しまたは削除する、個々の置換、削除または付加は、この変更がアミノ酸の化学的に類似なアミノ酸による置換をもたらす場合、「保存的な修飾変化」であると認識する。機能的に類似のアミノ酸を規定する保存的置換表は当分野では周知である。次の５つの群はそれぞれお互いに保存的置換であるアミノ酸を含む。脂肪族：グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）；芳香族：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；硫黄含有：メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）；塩基性：アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）；酸性：アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）。さらにＣｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙを参照。記載の核酸ヌクレオチド配列またはポリペプチドアミノ酸配列の保存的な修飾変異は、それぞれの記載の配列において、言外に含まれている。
【００６０】
本発明の１つの態様は、本明細書中で同定されたタンパク質またはそれらの実質的部分をコードするアミノ酸配列のすべてまたは実質的部分をコードするヌクレオチド配列に関する。（このようなタンパク質の一例は、Ｈ３Ｌウェスタンリバース株の、Ｈ３Ｌコペンハーゲン株のおよびＨ３Ｌ大痘瘡バングラディシュ株のタンパク質である）。タンパク質の「実質的部分」は、当業者による配列のマニュアル評価か、またはコンピュータ自動配列比較およびＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ． Ｆ．， ｅｔ ａｌ．，（１９９３） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０）などのアルゴリズムを使用した同定のどちらかにより、推定上の同定を可能にする十分なアミノ酸配列を含む。一般に、９個またはそれより多くの隣接したアミノ酸配列が、タンパク質を既知のタンパク質に相同として推定的に同定するために必要である。実質的に相同なタンパク質フラグメントは本明細書中に開示されたタンパク質と比較したフラグメントのアミノ酸配列の同一性割合により同定できる。
【００６１】
以下にさらに詳述するように、免疫原性ペプチドは、化学的合成によりまたは組み換えＤＮＡ技術により合成的に調製でき、または完全なウィルスもしくは他の感染病原体などの天然の源から単離できる。このペプチドは、多くの場合宿主細胞の天然に存在するタンパク質およびそのフラグメントを実質的に含まない。いくつかの実施形態において、このペプチドは天然のフラグメントとまたは粒子と合成的に複合させられる。
【００６２】
所望の活性を有するペプチドは、所望の属性、例えば改良された薬理学的特徴を提供するために、一方で修飾されていないペプチドの抗原的活性を実質的に増加させつつまたは少なくとも維持しつつ、必要ならば修飾することができる。例えば、このペプチドは、種々の変更を、例えば置換（保存的置換であろうと非保存的置換であろうと）を、このような変化がそれらの使用（例えば改良されたＭＨＣ結合など）において特定の有利性を提供するであろう場合、与えることができる。アミノ酸置換の範囲はＤ−アミノ酸の使用を含む。このような修飾は、例えば、それぞれが参照によりここに取り込まれる、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：３４１−３４７（１９８６）， ＢａｒｏｎｙおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ， ＧｒｏｓｓおよびＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ， ｅｄｓ．（Ｎ．Ｙ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）， ｐｐ． １−２８４（１９７９）；ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ， Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， （Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， Ｉ１１．， Ｐｉｅｒｃｅ）， ２ｄ Ｅｄ．（１９８４）に記載の周知のペプチド合成手順の使用により可能である。
【００６３】
治療処置のためのこの医薬組成物は、非経口投与、局所性投与、経口投与または局所投与のためであることを意図している。ある実施形態において、本発明の医薬組成物中にＣＴＬを刺激する少なくとも１つの成分を含むことが望ましい。脂質はウィルス性抗原に対してインビボでＣＴＬを刺激することができる薬剤として同定されている。例えば、パルミチン酸残基はＬｙｓ残基のアルファおよびイプシロンアミノ基に付加され、次いで、例えば１つまたは複数のＧｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒなどの連結残基を介して免疫原性ペプチドに連結され得る。脂質が付加されたペプチドは、次いで、ミセル型に直接注入され、リポソームに組み込まれ、またはアジュバント例えばフロインド不完全アジュバント中に乳化される。１つの実施形態において、特に効果的な免疫原は、Ｌｙｓのアルファおよびイプシロンアミノ基に付加されたパルミチン酸を含み、このパルミチン酸は連結鎖、例えばＳｅｒ−Ｓｅｒを介して免疫原性ペプチドのアミノ末端に付加される。
【００６４】
本発明のペプチドは多種多様の方法で調製できる。これらペプチドの比較的短いサイズのために、このようなペプチド（個別のエピトープまたはポリエピトープペプチド）のあるものは、従来の技術に従って溶液中にまたは個体支持体上で合成できる。様々な自動合成器が市販されており、周知のプロトコルにしたがって使用できる。例えば、ここに参照により組み込まれるＳｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ， Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ２ｄ． ｅｄ．， Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（１９８４）を参照。
【００６５】
本発明のペプチドならびにこれらの医薬およびワクチン組成物は、治療的処置および／または感染予防のための哺乳動物、特にヒトへの投与のために有効である。医薬組成物に関して、本発明の免疫原性ペプチドは対象となる感染病原体にすでに感染した個体に多くの場合投与される。感染の潜伏期間または急性期の個体は、免疫原性ペプチドを用いて、他の処置とは別にまたは必要に応じて併用して処置できる。治療用途において組成物は感染病原体の抗原に対する効果的なＣＴＬ応答を誘発し、回復または少なくとも症状および／または合併症を部分的に抑止する有効量で患者に投与される。これを達成するのに適切な量を「治療的有効量」または「単位用量」と定義する。この使用に効果的な量は、例えばペプチド組成物、投与方法、処置された疾病の段階および重篤性、患者の体重、健康の一般的状況および医師の処方判断に依存する。ヒトについて一般に、初回免疫（これは治療のためのまたは予防のための投与である。）のための用量範囲は、７０ｋｇの患者について約１．０μgから約２０，０００μgペプチド、通常約５０μg、１００μg、１５０μg、２００μg、２５０μg、３００μg、４００μg、５００μg、１０００μg、２０００μg、５，０００μg、１０，０００μg、１５，０００μgまたは２０，０００μgである。時に、同じまたは用量範囲の追加投薬が、必ずしも同じ実際投与量である必要はないが、数週間から数ヶ月にわたる患者の血液中の特異的ＣＴＬ活性を測定することによる患者の応答および状態にしたがって、続く。
【００６６】
このようなワクチン組成物を用いた処置のための患者の特定およびこのようなワクチン組成物の予防的投与のための集団区分の特定は、当業者の技術の十分に範囲内である。治療のための使用について、投与は、感染の最初の兆候において、または急性感染症の場合診断後直ちに、開始されるべきである。次いで、この後の期間、症状が少なくとも実質的に和らぐまで追加免疫投与を行う。慢性的感染症においては、追加免疫投与の後に負荷投与量が必要であろう。
【００６７】
このペプチド組成物は、また、保因者中の例えばウイルス感染細胞を除去する免疫系を刺激して、慢性感染症の治療のために使用できる。多くの場合、免疫を強化するペプチドの調合物中の量をおよび細胞障害性Ｔ細胞の応答を効果的に刺激するのに十分な投与形態を提供することが重要である。このように、慢性的感染の処置のためには、免疫投薬に続いて、追加投薬が、確立された間隔で、例えば１から４週間の間隔で、効果的に個体を免疫化するために、おそらく延長された期間、必要であろう。
【００６８】
ワクチンが幅広い受容者に効果的であることを確実にするために、少なくとも２種または少なくとも３種または５種またはそれより多くの、感染病原体由来の抗原を含むカクテルの調製がしばしば望ましい。ペプチドのこの主となる抗原活性に加えて、免疫されていない対象がこのペプチドに免疫反応を示すかどうか判定することが時として有益である。ワクチンとして使用される免疫原性ペプチドのカクテルは、免疫化された対象由来の血清に反応し免疫化されていない対象由来の血清に反応しない、少なくとも２種またはすくなくとも３種のタンパク質を含むよう、ある場合選択される。
【００６９】
本発明の組成物の送達は、当業者によく知られている、経口法、吸入法、局所投与法および注入法を含むどのような方法によっても可能である。しばしば、この医薬組成物は非経口的に、例えば静脈内に、皮下に、経皮的にまたは筋肉内に、投与される。したがって、本発明は、非経口投与のための許容されるキャリア好ましくは水性のキャリアに溶解または懸濁された免疫原性ペプチドの溶液を含む組成物を提供する。様々な水性キャリアが、例えば水、緩衝用水、０．８％食塩水、０．３％グリシンヒアルロン酸などが、使用できる。これらの組成物は、通常のよく知られている滅菌技術により滅菌でき、または濾過滅菌できる。得られた水性溶液は、使用のために、そのまま容器に入れることができ、または凍結乾燥される。この凍結乾燥調製品は投与に先立って殺菌溶液と組み合わされる。この組成物は、生理学的状態に近づけるための必要に応じて、医薬的に許容される補助物質を、例えばｐＨ調製緩衝剤、等張化剤、湿潤剤などを、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレートなどを、含むことができる。
【００７０】
本発明の組成物はリポソームを介して投与してもよい。リポソームはエマルジョン、気泡、ミセル、不溶性単層膜、液晶、リン脂質分散体、ラメラ層などを含む。これらの調製において、送達されるべきペプチドは、リポソームの一部として、単独で組み入れられ、または、例えばリンパ系細胞の間で一般的な受容体（例えばＣＤ４５抗原に結合するモノクロナール抗体）との組み合わせでもしくは他の治療用または免疫原性組成物との組み合わせで、組み入れられる。したがって、本発明の所望ペプチドにより満たされたまたは装飾されたリポソームは、このリポソームがその後この選択された治療用／免疫原性ペプチド組成物を送達する場所であるリンパ系様細胞の部位に誘導され得る。本発明で使用するリポソームは一般に中性のおよび負に荷電したリン脂質およびコレステロールなどのステロールを含む標準的な小胞形成脂質より形成される。脂質の選択は、例えばリポソームサイズ、血流中でのリポソームの酸耐性および安定性などを考察して処理される。リポソームの調製は、例えばＳｚｏｋａ， ｅｔ ａｌ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｂｉｏｅｎｇ． ９：４６７（１９８０），、米国特許第４２３５８７１号、第４５０１７２８号、第４８３７０２８号および第５０１９３６９号に記載のような、様々な方法が利用可能である。ＳＡＦ−１、ＰＲＯＶＡＸおよびトマチンなどの、他の型の補助剤または乳化剤もまた使用できる。さらにミョウバンもまた調合されたタンパク質またはペプチド抗原に対する免疫応答への刺激を助けるために使用できる。
【００７１】
固体組成物に関して、例えば医薬グレードのマニトール、ラクトース、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、ブドウ糖、蔗糖、炭酸マグネシウムなどを含む通常の非毒性固体キャリアが使用できる。経口投与に関して、医薬的に許容される非毒性組成物は、通常用いられる、すでに記載のキャリアなどの賦形剤のいずれか、ならびに活性成分のすなわち１つまたは複数の本発明のペプチドの、一般に０．０１〜９５％およびより好ましくは０．１〜７５％または０．２〜５０％または１％〜２０％の濃度を、組み込むことにより形成される。
【００７２】
エアロゾール投与に関して、この免疫原性ペプチドは、一般に界面活性剤および噴霧剤とともに微細に分割された形で供給される。通常ペプチドの割合は０．０１〜２０重量％または１〜１０重量％である。界面活性剤はもちろん非毒性でなければならず、一般的に噴霧剤に可溶性である。このような薬剤の代表としては、カプロン酸、オクタン酸、ラウリル酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリン酸（ｏｌｅｓｔｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、オレイン酸などの６から２２個の炭素原子を含む脂肪酸と脂肪族多価アルコールまたはその環状無水物とのエステルまたは部分的エステルである。混合されたグリセリドまたは天然のグリセリドなどの混合エステルを用いることができる。界面活性剤は組成物の重さの０．１％〜２０％を構成することができ、一般に０．２５〜５％である。この組成物の残りは通常噴霧剤である。必要であれば、キャリア、例えば鼻腔内送達のためのレシチンもともに含むことができる。
【００７３】
本発明のペプチドは、ワクチニアまたは鶏痘などの、弱毒化されたウィルス宿主により発現させることもできる。このアプローチは、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現のためのベクターとしての、ワクチニアウィルスの使用を含む。ワクチニアベクターおよび免疫化プロトコルに有益な方法が、例えば米国特許第４７２２８４８号に記載されている。他のベクターはＢＣＧ（カルメットゲラン菌／Bacille Calmette Guerin）である。ＢＣＧベクターは、ここに参照により組み込まれる、例えばＳｔｏｖｅｒ， ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ３５１：４５６−４６０（１９９１））に記載されている。本発明のペプチドの治療のための投与または免疫化に有用な、他の広範なベクターが、例えばサルモネラ・ティフィ（Salmonella typhi）ベクターなどが、ここの説明より当業者に明らかである。
【００７４】
治療のためのまたは免疫化のための目的で、本発明のペプチドは、本発明のペプチドの１つまたは複数をコードする核酸の形で投与できる。この核酸は、本発明のペプチドを、場合によって１つまたは複数の追加の分子をコードできる。多くの方法が患者に核酸を送達するために好都合に使用されている。例えば、核酸は「裸のＤＮＡ」として直接送達できる。この研究はそれぞれがここに参照により組み込まれるＷｏｌｆｆ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６５−１４６８（１９９０）ならびに米国特許第５５８０８５９号および第５５８９４６６号とに記載されている。核酸はまた、例えば米国特許第５２０４２５３号に記載されているように弾道送達を使用して投与される。ＤＮＡの単独のみを含む粒子が投与できる。あるいはＤＮＡは、粒子に、例えば金の粒子に、付着され得る。ペプチドの送達と同様に、ＤＮＡワクチンが幅広い受容者に効果的であることを確実にするために、少なくとも２種または少なくとも３種または５種またはそれより多くの、感染種由来の抗原性ペプチドをコードする核酸を含むカクテルの調製がしばしば望ましい。
【００７５】
核酸はまた送達でき、陽イオン脂質などの陽イオン化合物に複合化されて送達できる。脂質介在遺伝子送達方法は、例えばそれぞれ参照によりここに取り込まれるＷＯ９６／１８３７２；ＷＯ９３／２４６４０；Ｍａｎｎｉｎｏ＆Ｇｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６（７）：６８２−６９１（１９８８）；Ｒｏｓｅ Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ Ｎｏ． ５，２７９，８３３；ＷＯ９１／０６３０９；およびＦｅｉｇｎｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１４（１９８７）に記載されている。
【００７６】
精製されたプラスミドＤＮＡはさまざまな調合物を使用して注射用に調製できる。これらのうち最も簡素なものは、凍結乾燥ＤＮＡの殺菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中での再構成である。様々な方法が記載されてきており、また新しい技術が利用できるようになろう。前記のように、核酸は陽イオン性脂質と好都合に調合される。加えて、糖脂質、融合性リポソーム、ペプチドおよび防御的、相互作用的、非凝縮的（ＰＩＮＣ）とまとめて指す化合物が、また精製プラスミドＤＮＡと複合され得て、安定性、筋肉内分散または特定の臓器または細胞型への輸送などの評価項目に影響を与え得よう。
【００７７】
この免疫学的組成物は、適切な賦形剤と共に、本発明の特定された抗原の１つまたは複数の有効量を含む。注射用のワクチンは、安定性を与えるために、通常賦形剤および追加の成分を含む。この組成物の性質は、例えば静脈内、筋肉内、皮下もしくは腹腔内であり得るまたは経粘膜的、経皮的または経口的であり得る投与の経路に依存している。ワクチンのための組成物の設計は十分確立されており、例えばそれぞれがここに参照により取り込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、最新版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， ａｎｄ ｉｎ ＰｌｏｔｋｉｎおよびＯｒｅｎｓｔｅｉｎの書籍、表題 Ｖａｃｃｉｎｅｓ， ４ｔｈ Ｅｄ．， Ｓａｕｎｄｅｒｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡ（２００４）に記載されている。
【００７８】
個別のタンパク質による免疫化は、不活性ウィルス粒子による場合と対照的に、強い免疫応答を誘発するためのアジュバントを必要とし得る。鉱物油で十分であり得る一方、免疫応答の誘発をより優れたものにするために、プルロニックポリオールと呼ばれる線状両親媒性ポリマーにより安定化されたスクワランエマルジョンの使用が報告されている。ここに参照により取り込まれるＨｕｎｔｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｖａｃｃｉｎｅ， ２０ Ｓｕｐｐｌ． ３， Ｓ７−１２（２００２）を参照。さらにリポソームの調合物がタンパク質に対する免疫学的応答を増加させるために有利に使用できる。それぞれのすべてがここに参照により取り込まれるＬｉｄｇａｔｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ５， ｐｇ． ７５９−７６４（１９８８）；Ｈｊｏｒｔｈ， ｅｔ ａｌ．， Ｖａｃｃｉｎｅ １５，５４１−４６（１９９７）を参照。ワクチンの投与のための一般的方法およびプロトコルはまたＰｌｏｔｋｉｎおよびＯｒｅｎｓｔｅｉｎ， Ｖａｃｃｉｎｅｓ， ４ｔｈ ｅｄに記載されている。
【００７９】
本発明により提供された抗原は、また、免疫を誘導する投与のためだけでなく、診断目的のためにも有益である。前記の方法で特定された、１種もしくはそれ以上または２種もしくはそれ以上または好ましくは３種もしくはそれ以上の特異的抗原に対する特異的反応が感染病原体に対する抗体の検出または定量化に使用でき、感染した対象中の病原体および病原体の特定の株の迅速な同定が可能になる。感染病原体の特定の株を非常に正確に識別するために、抗原のアレイを使用できる。これにより、症状が現れる前であってさえも曝露された患者における感染病原体の検出が可能になる。これにより、ある対象が感染病原体に対する免疫を有しているかどうかを決定することが可能になり、必要のない免疫化を避けることができる。これにより、また、さらに抗生物質耐性菌感染または抗ウィルス剤耐性ウィルス感染の同定を可能にし、かくして例えば医師は効果のない薬剤の投与を避けることができ、適した薬剤または治療をすばやく選択することができる。さらに、これにより、使用者が特定の疾病状況を特定することが可能になる。慢性結核患者の血清プロフィールは、新規のまたは活動性感染を有する患者のものとは異なり、したがって疾病状況が本発明により提供された抗原を使用してより精密に診断的に特徴付けられる。
【００８０】
本発明は、また、本発明のタンパク質に対する抗体およびこのような抗体のアレイも網羅している。抗体はいずれかの適した方法により、例えばウサギ、マウスまたは家畜犬などの実験動物中に作製できる。本発明のタンパク質を含む抗体は、不完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント、ミョウバンアジュバントとまたはアジュバントなし（ＰＢＳのみ）で混合され得、１回または複数回実験動物に注射される。どのような形態の抗原も、所与の抗原に関して特異的な抗体を産生するのに十分な抗体の生成に使用できる。この誘発抗原は単一エピトープ、多エピトープまたは単独でのもしくは当分野で周知の免疫原性強化薬剤と組み合わせての全タンパク質であってよい。この誘発抗原は、単離された完全長タンパク質、細胞表面タンパク質（例えば、抗原の少なくとも一部を用いて形質移入された細胞を用いて免疫化する）または可溶性タンパク質（例えば、タンパク質の細胞外ドメイン部分のみを用いて免疫化する）であり得る。
【００８１】
ここで使用されるように、「抗体」という用語は、無傷の免疫グロブリンおよびこの抗体の免疫学的に反応性のフラグメント［例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’_２）、フラグメント、組み換え的に作製された１本鎖可変領域（例えばｓＦｖ型）およびエピトープを特異的に認識できるいずれかの他のフラグメント］の双方を指す。
【００８２】
ある例において、モノクロナール抗体が好ましい。モノクロナール抗体の産生方法は当分野において知られていて、ここに参照により組み込まれるＪａｎｅｗａｙ， ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ， ５ｔｈ ｅｄ．， Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ（２００１）に総合的に記載されている。アレイの作製のための抗体を固定化する方法は、ニトロセルロースなどの保持表面への適用など、当分野において知られている。
【００８３】
抗体は、抗原性タンパク質の正常型または表現型変異体への結合について選別される。ここに参照により組み込まれるＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， １９９６）を参照。これらのモノクロナール抗体は、通常少なくとも約１μＭの、より通常少なくとも３００ｎＭの、典型的に少なくとも約３０ｎＭの、多くの場合少なくとも１０ｎＭのしばしば少なくとも約３ｎＭのまたはよりよいＫ_ｄにより結合し、通常ＥＬＩＳＡにより測定される。モノクローナル抗体の定義にはキメラ型（すなわち異なる種からの重鎖および軽鎖部分を含む）を含み、またはモノクローナル抗体は標準的なヒト化技術もしくは対象への適合技術によってヒト化されたまたはさもなくば特定の対象に適合されたものである。
【００８４】
ここに提供される抗体は、受動的免疫を与えるために有益であるのに加えて、診断的用途にも有益である。これら抗体は、当分野でよく知られている方法を使用して調製され少なくとも部分的に精製された、単離された抗体を含む。これらの抗体は抗原が得られた感染病原体の検出または定量に使用できる。抗体は新しい株に対して非常に迅速に生産できるため、例えば対象中のまたは可能性ある汚染物質中の生物兵器感染病原体の検出に使用できる。これら抗体は、また、治療または疫学目的のための感染病原体の株間の識別のために、または特定の薬剤に感受性または非感受性である株などの特定の同定のために使用できる。これら抗体のアレイは感染病原体の特定の株を同定するために有益である。これら抗体はまた抗原精製のための有効な試薬である。
【００８５】
以下の実施例は例示のために提供するものであり、発明を限定するものではない。これらの実施例において、使用したワクチニア株はＷＲ株であった。この株のゲノムのオープンリーディングフレームの配列はＧｅｎＢａｎｋに番号が続くＶＡＣＷＲ名称をもって寄託された。オープンリーディングフレームの遺伝子座の一覧はこれらの実施例に続く表８に示した。コペンハーゲン株に存在するＷＲ株について表８に一覧表示したオープンリーディングフレームのオルソログは、ＧｅｎＢａｎｋにおけるそれらの配列によっても特徴づけられ、これらは表８の２番目のカラム示したＧｅｎＢａｎｋにおける名称を有している。
【００８６】
ＷＲ株の遺伝子座の１つＶＡＣＷＲ１４８は、コペンハーゲン株中に一致するオルソログを有さないことが理解される。この遺伝子座はバリオラ・マジョール（Variola major）中の名称Ａ２９Ｌを有する抗原に一部一致し、先ずそのように同定された。より詳しく見てみると、ＷＲ１４８は強い主要抗原応答を示すが、関連する種において単一遺伝子に位置しないい。むしろＷＲ１４６、ＷＲ１４７、ＷＲ１４８およびＷＲ１４９の遺伝子がＡ型含有タンパク質群またはＡＴＩ遺伝子座タンパク質に一致する。ＡＴＩ遺伝子座タンパク質は牛痘中のＡ２６ＬおよびＡ２７Ｌならびに痘瘡中のＡ２６Ｌ、Ａ２７Ｌ、Ａ２８Ｌ、Ａ２９ＬおよびＡ３０Ｌに一致する。
【００８７】
実施例および特許請求の範囲において、コペンハーゲンオルソログに相当する名称を他の遺伝子および遺伝子産物ならびにＶＡＣＷＲ１４８抗原についてのＡＴＩ遺伝子座またはＡＴＩ遺伝子座タンパク質に関して使用する。実施例中で使用したＷＲ株との対応は表８に示されている。
【実施例】
【００８８】
（実施例１）
ベクターおよびインサートの調製
Ｎ末端ヒスチジンタグおよびＣ末端ＨＡタグをコードする線状Ｔ７ベクターを広範な制限分解により、その後のＰＣＲにより作製した。この処理は、相補的インサートを用いずに化学的形質転換受容性Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を形質転換したとき、残留環状ベクターおよびバックグラウンドコロニーをほぼ０にまで減少させた。
【００８９】
線状組み換えベクターｐＸＴ７を作製するために使用したプラスミドを図１に表す。このベクターはＴ７プロモーターを含み、次にＡＴＧ開始コドン、１０×ヒスチジン配列、クローン化されるオープンリーディングフレームの第１のコドンの前にスペーサー配列、ＢａｍＨ１部位およびＴ７ターミネーターが続く。不完全に分解されたベクターはインサートを欠くバックグラウンドコロニーを作り出すので、残余の環状ベクターを除去するためにベクターをＢａｍＨ１部位で２回分解した。この線状ベクターをＰＣＲで増幅して線状組み換えベクターのインベントリーを作製した。線状ベクターの各バッチを用いて形質転換受容性Ｅ．コリで形質転換し、それがバックグラウンドコロニーを作らないことを確認した。
【００９０】
さらに詳細には、プラスミドｐＸＴ７（１０μg；３．２ｋｂ、ＫａｎＲ）を、ＢａｍＨ１を用いて線状化した（０．１μg／μl ＤＮＡ、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．２Ｕ／μl ＢａｍＨ１、３７℃、４時間；追加のＢａｍＨ１を０．４Ｕ／μlまで加えた。３７℃、一晩）。分解物を精製し（Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キット）、蛍光定量法により定量化し、アガロースゲル電気泳動（１μg）により検証した。５０μｌＰＣＲ（それぞれ０．５μＭのプライマー：５’ＣＴＡＣＣＣＡＴＡＣＧＡＴＧＴＴＣＣＧＧＡＴＴＡＣ，５’ＣＴＣＧＡＧＣＡＴＡＴＧＣＴＴＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧ；０．０２Ｕ／μl Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ［Ｆｉｄｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、バッファーＡ］；０．１ｍｇ／ｍｌゼラチン［Ｐｏｒｃｉｎｅ， Ｂｌｏｏｍ ３００；Ｓｉｇｍａ、Ｇ−１８９０］；それぞれ０．２ｍＭのｄＮＴＰ；初期変性：９５℃、５分；３０周期：９５℃、０．５分／５０℃、０．５分／７２℃、３．５分；最終伸長：７２℃、１０分）において、この物質の１ナノグラムを線状受容体ベクターを作製するために使用した。ＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動（３μl）により可視化し、精製し（Ｑｉａｇｅｎ、ＰＣＲ精製キット）、ピコグリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を使用し、製造会社の取り扱い説明書に従って、蛍光定量法により定量した。線状受容体ベクターの各バッチはバックグラウンドＫａｎＲ形質転換細胞を調べた（４０ng当たりＫａｎＲ組み換え体は存在しない。）。
【００９１】
ワクチニアウィルスおよびＦ．ツラレンシス由来のＯＲＦを、線状Ｔ７ベクターの末端に相補的な３３ヌクレオチドの伸長を含む遺伝子特異的プライマーを使用して増幅した。
【００９２】
１から１０ナノグラムのゲノムＤＮＡを５０μl−ＰＣＲにおいて鋳型として使用した：プライマー、それぞれ０．５μＭ（５’ＣＡＴＡＴＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＣＡＴＡＴＧＣＴＣＧＡＧ［５’−末端の２０−ｍｅｒ ＯＲＦに特異的］；５’ＡＴＣＴＴＡＡＧＣＧＴＡＡＴＣＣＧＧＡＡＣＡＴＣＧＴＡＴＧＧＧＴＡ［３’末端の２０−ｍｅｒ ＯＲＦに特異的］）；Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ０．０２Ｕ／μl［Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、バッファーＡ］；ゼラチン０．１ｍｇ／ｍｌ［Ｐｏｒｃｉｎｅ， Ｂｌｏｏｍ ３００；Ｓｉｇｍａ， Ｇ−１８９０］；ｄＮＴＰ それぞれ０．２ｍＭ；初期変性９５℃，５ｍｉｎ；３０周期：２０秒 ９５℃、０．５分５０℃、７２℃で１ｋｂ当り１分、ＯＲＦサイズに基づき平均１から３分；最終伸長：７２℃１０分）。産生がより難しいＰＣＲ産物は、５０℃ではなく４５および４０℃で０．５分アニーリングすることにより再増幅した。ＰＣＲ産物を精製し（Ｑｉａｇｅｎ、ＰＣＲ精製キット）、ピコグリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）を使用して蛍光定量法により定量し、アガロースゲル電気泳動によりサイズおよび純度を検証するために可視化した。
【００９３】
各オープンリーディングフレームは遺伝子特異的プライマーを使用したゲノム鋳型から増幅した。この５’オリゴヌクレオチドは５３ヌクレオチドを含んだ。これらの３３ヌクレオチドは５’ユニバーサル末端配列を含み、他の２０ヌクレオチドは遺伝子特有配列から成っている。第１の開始コドンＡＴＧは線状ベクター上のポリヒスチジンタグの上流であり、それぞれのオープンリーディングフレームもまたＡＴＧで始まる。３’カスタムオリゴヌクレオチドもまた５３ヌクレオチドを含み、これらの３３は３’ユニバーサル末端配列からなり、他の２０のヌクレオチドは目的の遺伝子に特有である。終止コドン配列ＴＴＡを、発現遺伝子の翻訳停止を達成するために、遺伝子配列の末端に加えた。
【００９４】
プライマーを図１に表し、ワクチニアおよびＦ．ツラレンシスから増幅され浄化されたＰＣＲ産物のセットを表すゲルを図２に表す。１０００ｂｐより短い遺伝子に関しては予想ＰＣＲ産物を得る成功率は９９％より大である。これらの短鎖遺伝子に関して、失敗は新しいプライマーを整えることで回復できた。１０００から２０００ｂｐの３２の遺伝子のうち２８（８１％）は方法の項で説明する手順を使用して増幅できた。２０００ｂｐより長い８遺伝子のうち３のみがこれらの方法により増幅できた。これらのより長い遺伝子は重複フラグメントとして増幅でき、またはより長い産物の増幅に有利に働く異なるＰＣＲ条件が適用できる。
【００９５】
（実施例１Ａ）：２１３遺伝子に関するプライマーの調製を必要とするワクチニアウィルスにこれらの方法を適用し、２１１ＰＣＲ産物を単離した（＞９９％）。これらの２１１すべてをクローン化し、および産物のうち１８１を配列決定のために提供し；９３％（１８１のうち１６９）が予測配列を提供した。
【００９６】
（実施例１Ｂ）：同様に、これらの方法を７２０遺伝子に関するプライマーの調製を必要とするＰ．ファルシパルムに適用した。これらより４６２のＰＣＲ産物（６４％）を得、２６６クローンを作製した（５８％）。これらのセット（６３）を配列決定のために提供し、９７％が予測配列を与えた。
【００９７】
（実施例１Ｃ）：上記の方法をマイコバクテリウム・ツベルクロシスに適用し１０８遺伝子に関するプライマーを調製した。これらより、８７ＰＣＲ産物が得られ（８０％）、８０クローンを作製し（９２％）、これらのそれぞれは一方の末端に抗Ｈｉｓタグおよび他方の末端に抗ＨＡタグを有した。検査された７９のうち７０（８８％）が予測配列を含むことを配列決定により確認した。生産されたタンパク質の大部分においてＨｉｓおよびＨＡタグの双方が結合に利用可能であるが、多くの事例で一方のタグのみが結合した。一般的に一方のみが利用可能である場合、結合に利用可能なままであるのはＨｉｓタグであり、ＨＡエピトープタグは利用不可能であった。
【００９８】
この方法は、マイコバクテリウム・ツベルクロシスＨ３７Ｒｖからの約４０００の遺伝子ゲノムの内の３１２の発現に拡大された
【００９９】
（実施例１Ｄ）：１９３３遺伝子のプライマーを調製したＦ．ツラレンシスに上記の方法を適用した。これらから１８４２ＰＣＲ産物を得（９５％）、１７２０のクローンを作製した（９３％）。これらの内の６８４の配列決定が６４３（９４％）が予測配列を含むことを示した。
【０１００】
（実施例２）
インビボの組み換えおよびコロニーの選択
ＰＣＲで増幅された実施例１のＯＲＦおよび線状Ｔ７ベクターの混合物を混合し、化学的形質転換受容性Ｅ．コリ内へ導入し、インサートを含むプラスミドを有する形質転換コロニーが生じた。この高効率の形質転換クローニング法はＯＲＦのフレーム方向性挿入をもたらした。
【０１０１】
形質転換受容性細胞を、我々の実験室において１８℃でＳＯＢ培地（トリプトン２％、酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ１０ｍＭ、ＫＣｌ２．５ｍＭ、およびＭｇＳＯ_４２０ｍＭ）の５００ｍｌ中にてＤＨ５α細胞を光学濃度０．５〜０．７Ｏ．Ｄ．まで増殖させて調製した。細胞を浄化し１０ｍｌのあらかじめ冷やした氷上ＰＣＫＭＳバッファー（ＰＩＰＥＳ１０ｍＭ、ＣａＣｌ_２１５ｍＭ、ＫＣｌ５０ｍＭ、ＭｎＣｌ_２５５ｍＭおよび蔗糖５％、ｐＨ６．７）に懸濁し、常に回転させながら７３５μlＤＭＳＯを滴下しつつ加えた。１００μｌアリコートのコンピテント細胞をドライアイスエタノール上で凍結させ、−８０℃で保存した。
【０１０２】
それぞれの形質転換は、１０μlのコンピテントＤＨ５α（上記のように我々の実験室で、スーパーコイル状プラスミドＤＮＡ １０^９ｃｆｕ／μgという効率で調整した。）および１０μｌＤＮＡ混合物（４０ｎｇのＰＣＲ作製線状ベクター、１０ｎｇのＰＣＲ作製ＯＲＦフラグメント；ベクター：１ｋｂＯＲＦフラグメントのモル比１：１）からなった。この混合物を氷上で４５分間インキュベートした。ヒートショック（４２℃、１分）を与え、氷上で１分間冷やし、ＳＯＣ培地（２％トリプトン、０．５５％酵母エキス、１０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ_２、１０ｍＭＭｇＳＯ_４、２０ｍＭブドウ糖）の２５０μlと混合し、３７℃で１時間インキュベートし、５０μgカナマイシン／ml（ＬＢ Ｋａｎ ５０）を加えた３ｍｌのＬＢ（Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ培地）に希釈し、振とうしながら一晩インキュベートした。ＬＢ Ｋａｎ ５０寒天上に画線接種し、一晩培養した物より単一コロニーを得た。それぞれの形質転換より２〜３コロニーを更なる分析のために選択した。Ｑｉａｇｅｎミニプレップより得たプラスミドＤＮＡを、インサートを含むクローンの選択のためにゲル電気泳動により可視化した。
【０１０３】
ＤＨ５α形質転換受容性細胞の形質転換を、モル比１：１のＰＣＲフラグメントおよび線状ベクターの混合物を用い、形質転換に用いられた総ＤＮＡ５０ｎｇを用いて行った。形質転換受容性細胞を形質転換し、一晩成長させ、細菌の成長により生じる濁度を観察し、プレート培養し、コロニーを選択した。これらの条件下でクローニング効率は９０％以上であったが、細胞を形質転換を行った日にプレートに塗布した場合、観察されたクローニング成功率はより低くなった。形質転換に使用する総ＤＮＡが２５ｎｇおよび１０ｎｇに減少されたとき、形質転換の成功率は次第に低下した（示さず。）。
【０１０４】
図３は、図２に示したＰＣＲフラグメントを使用した一晩培養からの「クラックングゲル」（総核酸を表すフェノール−クロロフォルムで溶解された細菌）を示す。これらのゲルの最上バンドはゲノムＤＮＡであり、底部の２本のバンドは重および軽リボソームＲＮＡであり、中間バンドは線状ベクターおよびＰＣＲフラグメントを用いた組み換えにより形成されたプラスミドである。空のベクターが参考のためにこのゲルに含まれている。この図に示された８７のプラスミドの内３つのみが適切なサイズのインサートを欠いている。
【０１０５】
図３に示した一晩培養物を寒天プレートに画線接種し、２つのコロニーを選択し、成長させミニプレップ法によりプラスミドを得た。一晩培養由来の単一コロニーのミニプレッププラスミドを図４に示す。精製されたプラスミドを組み換え産物の忠実度を検証するために配列決定した。インサートの大部分はゲノム配列データベースによれば正確な配列であった。７４％は変異なし、２０％は単一の点変異がありおよび６％は複数点に変異があった。４１％の変異はＡがＧになっていた。残りの変異は他の可能な１１の点変異型の中にランダムに分布していた。
【０１０６】
（実施例３）
インビトロ転写およびタンパク質の翻訳検出
図４に示すプラスミド上にコードされたタンパク質は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが補充されたＥ．コリベースの無細胞インビトロ転写／翻訳系で発現させた。それぞれのミニプレップのプラスミド鋳型０．５μgをＱｉａｇｅｎのミニプレップキットを使用し、ＲＮＡｓｅ活性を枯渇させるためのタンパク質変性剤を含む「任意の」段階を含ませて、調製した。この段階が含まれなかった場合、インビトロ転写／翻訳反応での発現レベルは低くなり不整合なものになる。２５μlの反応量を用いるインビトロ転写／翻訳反応（Ｒｏｃｈｅ ＲＴＳ １００ Ｅ．コリ ＨＹ キット）を、０．２ｍｌＰＣＲ １２−ウェルストリップチューブ中に設定し、製造会社の取り扱い説明書に従って３０℃で５時間インキュベートした。マウス抗ヒスチジン抗体およびアルカリフォスファターゼと結合したヤギ抗マウス抗体を使用してウェスタンブロット法を実施した。
【０１０７】
図５に示した結果に関して、５０の異なるＦ．ツラレンシスおよびワクチニアのプラスミドをインビトロの転写／翻訳反応において４時間インキュベートし、産物をＳＤＳポリアクリルアミドゲルにかけ、ゲルをブロットし、抗ポリヒスチジン抗体によりプローブした。図５のウェスタンブロットは予測分子量のヒスチジンタグ産物の発現を示し、５０のプラスミドのうち３つのみが陰性であった。
【０１０８】
無細胞反応からの非変性タンパク質もまたドットブロット法で検出可能であった。（図６）それぞれのインビトロの転写／翻訳反応物の１マイクロリットルをニトロセルロース上に直接スポットし、ＳＤＳ変性はせず、抗ヒスチジン抗体または抗ＨＡ抗体のどちらかを用いてドットブロットをプローブした。５０のワクチニアウィルスクローンからのおよび４５のＦ．ツラレンシスクローンからの反応産物を示す（図６）。抗ヒスチジン抗体を用いてドットブロットをプローブした場合、ワクチニア反応物の１つおよびＦ．ツラレンス反応物の３つがバックグラウンドを超えなかった。抗ＨＡ抗体を用いてドットブロットをプローブした場合、陰性反応の数は増加した。たぶん、電気泳動分析およびウェスタンブロット分析が翻訳中での早期終了の結果十分な未成熟タンパク質産物を示さなかったので、このエピトープはかなりの頻度で非変性タンパク質の３次元的構造の中に隠されてしまうことを示唆している。（ドットブロットの調製の更なる詳細は実施例４に提示する。）
【０１０９】
（実施例４）
マイクロアレイおよび血清学的スクリーニング
Ｃａｎｇｅｎｅ（Ｗｉｎｎｉｐｅｇ、Ｃａｎａｄａ）より市販されているワクチニア免疫グロブリン（ＶＩＧ）を使用した。ＶＩＧは多数のドナーよりプールされた過免疫血清の免疫グロブリン分画である。これは全身性ウィルス血症およびワクチニア予防接種に対する他の副作用に陥っている人々のための緊急治療に使用される。
【０１１０】
免疫ドットブロットのために、全ＲＴＳ反応物の０．３μl量を手作業でニトロセルロース膜上にスポットし、風乾させ、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中の５％脱脂粉乳中でブロッキングした。ブロットは１０％Ｅ．コリ溶解物を含有するまたは含有しないブロッキングバッファー中の１／１０００に希釈したＶＩＧを用いてプローブした。３つの異なるバッチのＶＩＧを使用した、すなわち、ロット♯１７３０２０４（５６ｍｇ／ｍｌ）、ロット♯１７３０２０８（５３ｍｇ／ｍｌ）およびロット♯１７３０３０２（５６ｍｇ／ｍｌ）。結合したヒト抗体をアルカリフォスファターゼと結合させたヤギ抗ヒトＩｇＡ＋ＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）２次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）中でインキュベートすることにより検出し、ニトロ−ＢＴ発色液を用いて可視化した。通常どおり、ドットブロットはまた、モノクロナール抗ポリヒスチジン（クローン Ｈｉｓ−１；Ｓｉｇｍａ Ｈ−１０２９）およびモノクロナールラット抗血球凝集素（ｃｌｏｎｅ ３Ｆ１０；Ｒｏｃｈｅ １ ８６７ ４２３）の両方を用いて染色され、続いて、組み換えタンパク質の存在を確認するために、それぞれＡＰが結合したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＢｉｏＲａｄ）またはＡＰが結合したヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）２次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて染色した。
【０１１１】
インビトロの転写／翻訳反応は２５μl規模で設定され、鋳型として非組み換え発現プラスミドを使用した対照反応もまた大腸菌抗原の存在を使用したものと対照するために設定された。５時間の合成反応の後直ちに、タンパク質はニトロセルロース基板上にそれ以上の精製を行わずに、スポットまたはアレイのどちらかを行い、または転写１２時間前までは４℃に維持した。ＲＴＳ反応物のスポットティングは非変性条件下であり、これ以上の精製は行わなかった（図７）。どのような抗原特異的応答も隠す高いバックグランド染色が原因で遮断された場合を除いて、Ｅ．コリに対する抗体をヒト血清およびＶＩＧ中に高い力価で発見した。この遮断はニトロセルロース膜に固定されたＥ．コリタンパク質を使用した抗Ｅ．コリ反応性の除去による、あるいは血清またはＶＩＧ中に１０％Ｅ．コリ溶解物の包含による抗体の遮断のどちらかにより克服できる。免疫ブロット法に対する吸着の効果に、実際、我々は、溶解物の追加による遮断と比較して、差を認めなかった（データは示さず）。従って後者の技術は、ハイスループットスクリーニングにおける適合性からおよびヒト血清の経済的利用（マイクロアレイあたり通常２〜３μl）を可能にすることから、Ｅ．コリバックグラウンド染色の遮断の日常的な方法として採用した。溶解物が含まれている時、対照反応中のスポットの強度は劇的に減少し、抗原性ワクチニアタンパク質に対するノイズ比へのシグナルが強くなる。ＶＩＧのＡ１１Ｌに対する反応性が構造依存性であることも留意する必要がある。この特有な抗原はすでにウェスタンブロットで認識されているが、ドットブロットの非変性フォーマットでは認識されていない。
【０１１２】
（実施例５）
マイクロアレイ
図８は図７に表した免疫ドットブロットのために使用した同じＲＴＳ反応物を使用するパイロットマイクロアレイを示す。マイクロアレイのために、まず１５μl量を３８４ウェルプレートに移し、１６００ｘｇで遠心分離してすべての沈殿をペレット化し、上清はこれ以上精製は行わずにニトロセルロース被覆ＦＡＳＴ（商標）スライドグラス（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）上にＯｍｎｉ Ｇｒｉｄ １００マイクロアレイプリンター（Ｇｅｎｅ Ｍａｃｈｉｎｅｓ）を使用して転写した。すべての染色のために、スライドはまずタンパク質アレイブロッキングバッファー（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）中で１時間遮断し、ドットブロットのために同一の１次および２次抗体で染色し（ＪａｃｋｓｏｎによるＣｙ３結合２次抗体）、共焦点レーザースキャナーでスキャンした。蛍光強度はＱｕａｎｔＡｒｒａｙソフトウェア（ＧＳＩ Ｌｕｍｏｎｉｃｓ， Ｉｎｃ）を使用して定量した。ドットブロットおよびアレイで全のＲＴＳ反応物を使用するとき、ＶＩＧはどのような抗原特異的応答をも隠す抗Ｅ．コリ抗体の高い力価を有する。これはＥ．コリ溶解物の免疫ブロットに対するＶＩＧの吸着により、またはＶＩＧへの大腸菌溶解物の添加により克服された。前者の方法において、大腸菌はＳＤＳ ＰＡＧＥサンプルバッファーに可溶化され、溶解物はＯｐｔｉｔｒａｎニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）に移す前に調製ゲル上で分離された。ブロットは次に小片（５ｘ５ｍｍ）に切り分け、５％脱脂粉乳中で１時間遮断した。この小片は次いで洗浄し、あらかじめブロッキングバッファーで１／１０００に希釈したＶＩＧ内に置き、一定の撹拌を行いながら１時間インキュベートした。Ｅ．コリ溶解物は１リットルのＥ．コリ（ＤＨ５）の静止期培養物から作製し、２５mlのＴＢＳ‐Ｔｗｅｅｎに再懸濁し、直径２cmのプローブにより超音波で分解する。１mlのアリコートを−８０℃で保存した。
【０１１３】
インビトロの転写／翻訳反応物を精製を行わずにニトロセルロ−ス被覆スライドグラス上に転写し、１０％Ｅ．コリ溶解物を含有するおよび含有しないＶＩＧを用いてプローブした。対照スポットはベクターのような非組み換え型発現プラスミドを用いたＲＴＳ反応で構成する。それより上の染色は陽性とする自由裁量による「カットオフ値」は、対照スポットの蛍光強度の平均および標準偏差を計算することにより得た。ＶＩＧ中に溶解物が存在するときに見られるように、免疫ドットブロットで検出されたものと同一のタンパク質がマイクロアレイによっても検出される。蛍光に結合された２次抗体は免疫ドットブロットに見られるより広い範囲のシグナル強度を提供する。さらに、アレイ中に検出されたタンパク質がドットブロット中の検出閾値より低いいくつかの例を我々は観察したので、マイクロアレイが免疫ドットブロットよりも強い感受性を与えることが明らかになった（示さず。）。
【０１１４】
図９はＰＣＲ Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）のプラットフォーム中で発現した、９６のワクチニアおよびＦ．ツラレンシスタンパク質、および１つの対照反応のより大きなマイクロアレイを示す。このアレイは７種のタンパク質がＶＩＧにより強く認識され、そのうち６種はワクチニアタンパク質であることを示す。これらのうち４種（Ｈ３Ｌ、Ｄ８Ｌ、Ａ５６ＲおよびＦ１３Ｌ）は、無傷のウィルス粒子表面上の抗体にアクセス可能なウィルスエンベロープ抗原である。したがって、この系の中でのタンパク質の検出は高度の抗原特異性および生物学的関連性を示す。非変性フォーマットは、これらタンパク質がそれらの構造依存性エピトープを維持しているであろうという追加の有利性を有する。
【０１１５】
（実施例６）
形質転換混合物からのプラスミドの調製
実施例２から５における更なる評価のために単一コロニーを選択するよりも、実施例２に記載したように得られた形質転換混合物を、所望のインサートを含むプラスミドの源として使用した。上記のように、それぞれの形質転換は：１０μlの形質転換受容性ＤＨ５αおよび１０μlのＤＮＡ混合物（４０ｎｇのＰＣＲ作製線状ベクター、１０ｎｇのワクチニア由来ＰＣＲ作製ＯＲＦフラグメント；ベクター：１ｋｂＯＲＦフラグメントのモル比１：１）で構成した。この混合物を氷上で４５分インキュベートし、ヒートショック（４２℃、１分）を与え、氷上で１分冷やし、２５０μlのＳＯＣ培地（トリプトン２％、酵母エキス０．５５％、ＮａＣｌ１０ｍＭ、ＫＣｌ１０ｍＭ、ＭｇＣｌ_２１０ｍＭ、ＭｇＳＯ_４１０ｍＭ、２０ｍＭブドウ糖）と混合し、３７℃で１時間インキュベートし、ＬＢ（Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ Ｍｅｄｉｕｍ）３ｍｌに、１ｍｌ当り５０μgのカナマイシン（ＬＢ Ｋａｎ ５０）を補って希釈し、振とうしながら一晩インキュベートした。プラスミドをこの培養物からコロニーの選択はせずに単離し、精製した。得られたプラスミド鋳型を上述の実施例で述べたように実質的に翻訳し、以下のように免疫ドットブロットに移した。
【０１１６】
インビトロの転写／翻訳に使用したプラスミド鋳型はＱｉａｇｅｎミニプレップキットを使用し、ＲＮａｓｅ活性を枯渇させるタンパク質の変性を含む任意の段階を含めて調製した。この段階を含めない場合、インビトロの転写／翻訳反応の発現レベルは低く不整合なものになった。図１０はワクチニア由来ＰＣＲフラグメントを使用した一晩培養物からの「クラックゲル」（総核酸を表すフェノール−クロロフォルムで溶解された細菌）を示す。これらのゲル上の最上バンド（右方向の）はゲノムＤＮＡであり、底部の２本のバンドは２３Ｓおよび１６ＳリボソームＲＮＡであり、中央のバンドは線状ベクターおよびＰＣＲフラグメントを用いた組み換えにより形成したプラスミドである。このゲル上には参考のために空のベクターが含まれている。この図に示された４２のプラスミドのうち１つのみが（Ｅ９Ｌ）適切なサイズのインサートを欠いている。総合的な系の効率を測定するためにフランシセラ・ツラレンシス由来遺伝子の検査セットを増幅させ、クローン化し、発現させた。試験した１９３３の遺伝子のうち９６％が順調に増幅され、それらの９３％が順調にクローン化された。
【０１１７】
２５μlの反応量でのインビトロの転写／翻訳反応物（ＲＴＳ１００大腸菌ＨＹキット、Ｒｏｃｈｅ）を０．２ｍｌＰＣＲ１２ウェルストリップチューブ中に設定し、製造業者の取扱説明書に従って、３０℃で５時間インキュベートした。８種のワクチニアおよび４０種のＦ．ツラレンシスタンパク質のセットを表すＴ７プラスミド上にコードされたタンパク質が、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを補ったＥ．コリベースの無細胞インビトロ転写／翻訳系において発現された。２５μｌのインビトロ転写／翻訳反応物を３７℃４時間インキュベートし、未精製の粗製反応物をＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離し、抗ヒスチジン抗体を用いてプローブした（図１１）。ウェスタンブロットは予測分子量のヒスチジンタグを付加した産物の発現を示した。４８の反応物のうち３種が弱すぎて陽性と判断できなかった。
【０１１８】
免疫ドットブロットのために、すべてのＲＴＳ反応物の０．３μl量を手作業でニトロセルロース膜上にスポットし、風乾させ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ中の５％脱脂粉乳中でブロッキングした。ブロットは１０％Ｅ．コリ溶解物を含有するまたは含有しないブロッキングバッファーで１／１０００に希釈したＣａｎｇｅｎｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗｉｎｎｉｐｅｇ， Ｍａｎｉｔｏｂａ， Ｃａｎａｄａ）のワクチニア免疫グロブリン（ＶＩＧ）を用いてプローブした。３つの異なるバッチのＶＩＧを使用した：ロット番号１７３０２０４（５６ｍｇ／ｍｌ），すなわち、ロット番号１７３０２０８（５３ｍｇ／ｍｌ）およびロット番号１７３０３０２（５６ｍｇ／ｍｌ）。結合したヒト抗体は、アルカリフォスファターゼに結合されたヤギ抗ヒトＩｇＡ＋ＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）２次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）中でインキュベートすることにより検出し、ニトロ‐ＢＴ発色液を用いて可視化した。通常のドットブロットはまたモノクロナール抗ポリヒスチジン（クローン Ｈｉｓ−１；Ｓｉｇｍａ Ｈ−１０２９）およびモノクロナールラット抗血球凝集素（ｃｌｏｎｅ ３Ｆ１０；Ｒｏｃｈｅ １ ８６７ ４２３）の両方を用いて染色し、続いて、組み換えタンパク質の存在を確認するために、それぞれＡＰに結合されたヤギ抗‐マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＢｉｏＲａｄ）またはＡＰに結合されたヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）２次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて染色した。マイクロアレイのために、１０μlの０．１２５％Ｔｗｅｅｎ２０を１５μlのＲＴＳ反応物と（最終的な濃度が０．０５％Ｔｗｅｅｎになるように）混合し、１５μl量を３８４ウェルプレートに移した。これらプレートを１６００ｘｇで遠心分離し、すべての沈殿とペレット化し、上清はこれ以上精製は行わずにニトロセルロース被覆ＦＡＳＴ（商標）スライドグラス（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）上にＯｍｎｉ Ｇｒｉｄ １００マイクロアレイプリンター（Ｇｅｎｅ Ｍａｃｈｉｎｅｓ）を使用して転写した。すべての染色について、スライドはまずタンパク質アレイブロッキングバッファー（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）中で３０分間遮断し、ドットブロットのための同一の１次のおよび２次抗体で染色し（Ｃｙ３結合２次抗体、Ｊａｃｋｓｏｎ）、共焦点レーザースキャナーでスキャンした。蛍光強度はＱｕａｎｔＡｒｒａｙソフトウェア（ＧＳＩ Ｌｕｍｏｎｉｃｓ， Ｉｎｃ）を使用して定量した。ドットブロットおよびアレイ上の全ＲＴＳ反応物を使用したとき、ＶＩＧはどのような抗原特異的応答をも隠す抗Ｅ．コリ抗体の高い力価を有する。これはＥ．コリ溶解物の免疫ブロットに対するＶＩＧの吸着により、またはＶＩＧへのＥ．コリ溶解物の添加により克服された。前者の方法において、Ｅ．コリはＳＤＳ ＰＡＧＥサンプルバッファーに可溶化され溶解物はＯｐｔｉｔｒａｎニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）に転写する前に調製ゲル上で分離された。ブロットは次いで小片（５ｘ５ｍｍ）に切り分け５％脱脂粉乳中で１時間ブロックされた。小片を次に洗浄しあらかじめブロッキングバッファーで１／１０００に希釈したＶＩＧ内に置き、一定の撹拌を行いながら１時間インキュベートした。Ｅ．コリ溶解物は１リットルのＥ．コリ（ＤＨ５α）の静止期培養物から作製し、２５mlのＴＢＳ‐Ｔｗｅｅｎに再懸濁し直径２cmのプローブを用いて超音波で分解した。１ミリリットルのアリコートを−８０℃で保存した。内在性抗Ｅ．コリ反応性を欠損したマウスの血清はバックグラウンドを低減するための大腸菌溶解物を用いた前処理を必要としない。
【０１１９】
無細胞反応物からの未変性タンパク質もまた免疫ドットプロット（図１２）上で検出でき得た。１１２の異なるワクチニアタンパク質をコードする１２８のプラスミドをインビトロで発現させ、未精製反応物のそれぞれ１マイクロリットルをニトロセルロース上に二点ずつスポットした。それぞれの遺伝子のオープンリーディングフレームをＮ末端１０ｘヒスチジン（ＨＩＳ）タグおよびＣ末端血球凝集素タグ（配列ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）を含むように設計する。プラスミド鋳型を欠損した対照反応（‘ｃ’）もまた設定した。空のベクターを使用した場合、小さい１０ｘヒスチジン陽性フラグメントが作製されるため陽性シグナルが観察される（データは示さず）。膜を抗ＨＩＳタグ抗体（図１２Ａ）、抗ＨＡタグ抗体（図１２Ｂ）、ワクチニア免疫グロブリン（ＶＩＧ）（図１２Ｃ）、またはＶＩＧ＋１０％Ｅ．コリ溶解物（図１２Ｃ）のいずれかを用いてプローブした。インビトロ反応において、抗ＨＩＳおよびＨＡタグ抗体は他のタンパク質との交差反応性は示さず、したがって大量の反応物の発現を観察するためにそれらを日常的に使用した。発現した異なるタンパク質１１２のうち３種のみがＨＩＳ（パネル１２Ａ）およびＨＡ（パネル１２Ｂ）タグのどちらに関しても陰性であった。全体的な発現効率の評価のために、クローン化されたＦ．ツラレンシス菌遺伝子３９０を発現させ、反応物をニトロセルロース上にスポットし、抗ヒスチジンまたは抗ＨＡ抗体のどちらかを用いてプローブした。反応物の８２％がＨＡに陽性であり、８４％が１０ｘヒスチジンに陽性であり、７３％がヒスチジンおよびＨＡの両方に陽性であり、７％はＨＡおよびヒスチジンに陰性であった。
【０１２０】
パネル１２ＣのブロットよりＶＩＧが抗Ｅ．コリ抗体の高い力価を有することが明らかであり、ワクチニアタンパク質のどのような反応性も隠してしまう。しかしＶＩＧへＥ．コリ溶解物を追加すると（パネル１２Ｄ）このバックグラウンドはワクチニアタンパク質の検出が可能なレベルにまで減少する。このブロット上の陽性タンパク質は、説明文で赤く強調されているＡ１０Ｌ、Ａ２７Ｌ、Ｄ８Ｌ、Ｄ１３Ｌ、Ｆ１３Ｌ、Ｈ３ＬおよびＨ５Ｒである。
【０１２１】
血清のＥ．コリ溶解物処理はマイクロアレイにおいてもＥ．コリバックグラウンド反応性の減少に効果的であった。Ｅ．コリ溶解物を含有しまたは含有しないＶＩＧを用いてプローブした、２３のワクチニアおよび２２のＦ．ツラレンシスタンパク質から構成された試験的マイクロアレイを図１３に示す。図１２Ｃのドットブロットに見られるように抗Ｅ．コリ抗体の高い力価の効果はマイクロアレイについても明らかである（図１３上端のアレイ）。この対照調製物にも存在する高いバックグラウンドはワクチニアタンパク質に対する特異的反応性を隠してしまう。マイクロアレイのプローブ前に、１０％のＥ．コリ溶解物をＶＩＧへ添加することで大腸菌バックグラウンドを減少させ、特異的反応性が明らかになる（図１３下図）。このアレイは、５種のワクチニアタンパク質がＶＩＧ（ボックス化）、Ｄ１３Ｌ、Ｄ８Ｌ、Ｆ１３Ｌ、Ｈ３ＬおよびＨ５Ｌにより強く認識されたことを示している。
【０１２２】
図１４は完全なワクチニアウィルスプロテオームの＞９５％を表すと予測される１９４のタンパク質からなるアレイの結果を示す。このアレイはヒトワクチニア免疫グロブリン（ＶＩＧ）ならびにワクチニアウィルスのワクチン接種前後のマウスおよびマカク由来の血清を用いてスクリーニングされた。図１４Ａは、未処置の非免疫化マウスはアレイ上のすべてのタンパク質に対する反応性を完全に欠落しているが、ワクチニアウィルス免疫化マウスからの血清はアレイ上の抗原のサブセットに反応することを示している。未処置マウスと違い、非免疫化のヒトはアレイ上の抗原のサブセットに反応するが、ワクチニアウィルスによる免疫化の後では反応性抗原のもう１つのサブセットが発達する。データの定量化は図１４Ｂの上のパネルに図式化した。ＶＩＧは２６の異なるタンパク質を認識し、そのうちの１３はワクチン未処置の個体からの血清に見ることができ、したがって、他の環境的抗原に対する抗体による非特異的交差反応を表すと考えられる。残りの１３はワクチニア免疫化の間に産生された抗体により特異的に認識される抗原である。
同様のプロフィールはマカクおよびマウス由来の血清にも見られる（図１４Ｂ）。種特有の応答（例えば、Ａ３ＬまたはＡ４Ｌはマウスのみ）がある一方で、ヒトおよび動物モデルのどちらかに共通に認識されるものも多くあり、１０のタンパク質が３種すべてに認識された（表１）。これら特定の抗原がヒトにおける使用に関するワクチンの前臨床検査のための優先候補であろう。全般的に、ウィルスの構造タンパク質に対する応答は、エンベロープタンパク質であるこれらの半数以上による応答に優勢である（表１）。血清反応陽性であるこれらタンパク質は、膜貫通ドメインを含有しおよび含有しない、シグナルペプチドを含有しおよび含有しない、およびＰＩ範囲が４〜１０のタンパク質を含んでいた。さらに、これらのタンパク質のいくつかは、動物およびヒトにおいて液性応答を生じる一方、他は有さないことがすでに報告されている。
【０１２３】
表１の抗原は、すべてウェスタンリザーブ（ＷＲ）株由来のタンパク質であるが、しかしこのタンパク質の機能はワクチニアウィルスのコペンハーゲン株においてよりよく特徴付けられているので、コペンハーゲン株のもっとも近いオルソログの名前によりここでは同定された。それにもかかわらず、ＷＲ株由来のそれぞれのＯＲＦおよびコードされたタンパク質に関する配列はＧｅｎＢａｎｋのデータベースにて利用可能であり、ＧｅｎＢａｎｋのデータベースはウェブアドレスｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｑｕｅｒｙ／ｇｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉでオンラインで利用可能である。表１に述べられた解説はデータベース中の解説と一致する。ＷＲ株に関するタンパク質および遺伝子配列はワクチニアＷＲゲノム中にあり、表１の遺伝子名を使用してＧｅｎＢａｎｋで特定可能である。これらに実質的に類似のタンパク質およびそれらの一致する遺伝子配列はＧｅｎＢａｎｋを通じて利用可能なｂｌａｓｔユーティリティを使用して容易に同定できる。
【０１２４】
【表１】




【０１２５】
ＶＩＧによる非常に強い血清陽性反応を誘発するタンパク質は、Ａ１４Ｌ、Ａ２７Ｌ、Ｈ５Ｒ、Ｄ８Ｒ、Ｄ１３Ｌ、Ｄ８Ｌ、Ｈ３ＬおよびＦ１３Ｌを含む。中程度の免疫反応性を有するタンパク質をＡ１０Ｌ、Ａ１１Ｒ、Ｌ１Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ａ１７Ｌ、Ｉ１５Ｌ、Ｆ５Ｌ、Ａ３４Ｌ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６ＲおよびＡ１３Ｌと同定した。ＶＩＧに非常に強い血清陽性応答を生じる追加タンパク質もまた同定した。それをＶＡＣＷＲ１４８とし、コペンハーゲン株には近いオルソログがなく、しかし大痘瘡のＡ２９Ｌというタンパク質に相同である。このタンパク質は今までに抗原性として同定されたことはなく、本明細書中ではＡＴＩ遺伝子座タンパク質と呼ぶ。
【０１２６】
例として挙げるのみであり本発明により包含されるタンパク質またはＤＮＡ配列の範囲を限定するものではないが、本方法により同定された免疫活性タンパク質のいくつかに最も近いオルソログのいくつかは以下を含む。
【０１２７】
ＶＡＣＷＲ１０１（ＶＡＣＶ−ＣＯＰ Ｈ３Ｌ）追加オルソログ：
ＶＡＣＶ−ＭＶＡ：ＭＶＡ０９３Ｌ
ＲＰＸＶ−ＵＴＲ：ＲＰＸＶ−ＵＴＲ＿０９０
ＶＡＣＶ−ＡＭＶＡ：ＡＭＶＡ０９５
ＣＰＸＶ−ＧＲＩ：Ｊ３Ｌ
ＶＡＣＶ−ＴＡＮ：Ｔａｎ−ＴＨ３Ｌ
ＶＡＲＶ−ＧＡＲ：Ｊ３Ｌ
ＶＡＲＶ−ＢＳＨ：Ｉ３Ｌ
ＶＡＲＶ−ＩＮＤ：Ｉ３Ｌ
ＣＭＬＶ−ＣＭＳ：９８Ｌ
【０１２８】
ＶＡＣＷＲ１１８（ＶＡＣＶ−ＣＯＰ Ｄ１３Ｌ）追加オルソログ：
ＶＡＣＶ−ＭＶＡ：ＭＶＡ１１０Ｌ
ＶＡＣＶ−ＴＡＮ：ａｎ−ＴＤ１５Ｌ
ＶＡＣＶ−ＡＭＶＡ：ＡＭＶＡ１１２
ＣＰＸＶ−ＧＲＩ：Ｅ１３Ｌ
ＲＰＸＶ−ＵＴＲ：ＲＰＸＶ−ＵＴＲ＿１０７
ＶＡＲＶ−ＢＳＨ：Ｎ３Ｌ
ＶＡＲＶ−ＩＮＤ：Ｎ３Ｌ
ＣＭＬＶ−ＣＭＳ：１１５Ｌ
ＣＭＬＶ−Ｍ９６：ＣＭＬＶ１１６
【０１２９】
ＶＡＣＷＲ１１３（ＶＡＣＶ−ＣＯＰ Ｄ８Ｌ）追加オルソログ：
ＲＰＸＶ−ＵＴＲ：ＲＰＸＶ−ＵＴＲ＿１０２
ＶＡＣＶ−ＭＶＡ：ＭＶＡ１０５Ｌ
ＶＡＣＶ−ＡＭＶＡ：ＡＭＶＡ１０７
ＶＡＣＶ−ＴＡＮ：Ｔａｎ−ＴＤ８Ｌ
ＶＡＲＶ−ＩＮＤ：Ｆ８Ｌ
ＶＡＲＶ−ＢＳＨ：Ｆ８Ｌ
ＶＡＲＶ−ＧＡＲ：Ｆ８Ｌ
ＥＣＴＶ−ＮＡＶ：ＥＶ−Ｎ−１１４
ＥＣＴＶ−ＭＯＳ：ＥＶＭ０９７
【０１３０】
ＶＡＣＷＲ０５２（ＶＡＣＶ−ＣＯＰ Ｆ１３Ｌ）追加オルソログ：
ＶＡＣＶ−ＴＡＮ：ａｎ−ＴＦ１３Ｌ
ＥＣＴＶ−ＮＡＶ：ＥＶ−Ｎ−５３
ＥＣＴＶ−ＭＯＳ：ＥＶＭ０３６
ＣＰＸＶ−ＧＲＩ：Ｇ１３Ｌ
ＲＰＸＶ−ＵＴＲ：ＲＰＸＶ−ＵＴＲ＿０４１
ＶＡＣＶ−ＡＭＶＡ：ＡＭＶＡ０４５
ＶＡＣＶ−ＭＶＡ：ＭＶＡ０４３Ｌ
ＣＰＸＶ−ＢＲ：Ｖ０６１
ＶＡＲＶ−ＧＡＲ：Ｅ１３Ｌ
【０１３１】
ＶＡＣＷＲ１０３（ＶＡＣＶ−ＣＯＰ Ｈ５Ｒ）追加オルソログ：
ＲＰＸＶ−ＵＴＲ：ＲＰＸＶ−ＵＴＲ＿０９２
ＶＡＣＶ−ＴＡＮ：Ｔａｎ−ＴＨ６Ｒ
ＶＡＣＶ−ＡＭＶＡ：ＡＭＶＡ０９７
ＶＡＣＶ−ＭＶＡ：ＭＶＡ０９５Ｒ
ＣＰＸＶ−ＧＲＬ：Ｊ５Ｒ
ＭＰＸＶ−ＺＲＥ：Ｈ５Ｒ
ＶＡＲＶ−ＢＳＨ：Ｉ５Ｒ
ＣＰＸＶ−ＢＲ：Ｖ１１４
ＶＡＲＶ−ＧＡＲ；Ｊ５Ｒ
【０１３２】
ＶＡＣＷＲ１８７（ＶＡＣＶ−ＣＯＰ Ｂ５Ｒ）追加オルソログ：
ＲＰＸＶ−ＵＴＲ：ＲＰＸＶ−ＵＴＲ＿１６７
ＶＡＣＶ−ＴＡＮ：Ｔａｎ−ＴＢ５Ｒ
ＶＡＣＶ−ＭＶＡ：ＭＶＡ１７３Ｒ
ＶＡＣＶ−ＡＭＶＡ：ＡＭＶＡ１７３
ＣＰＸＶ−ＧＲＩ：Ｂ４Ｒ
ＭＰＸＶ−ＺＲＥ：Ｂ６Ｒ
ＥＣＴＶ−ＭＯＳ：ＥＶＭ１５５
ＥＣＴＶ−ＮＡＶ：ＥＶ−Ｎ−１８２
ＶＡＲＶ−ＧＡＲ：Ｈ７Ｒ
【０１３３】
ＶＡＣＷＲ１４９＋ＶＡＣＷＲ１４６（ＶＡＣＶ−ＣＯＰ Ａ２６Ｌ）追加オルソログ：
ＲＰＸＶ−ＵＴＲ：ＲＰＸＶ−ＵＴＲ＿１３４
ＶＡＣＶ−ＭＶＡ：ＭＶＡ１３７Ｌ
ＶＡＣＶ−ＡＭＶＡ：ＡＭＶＡ１３９
ＣＰＸＶ−ＧＲＩ：Ａ２７Ｌ
ＶＡＣＶ−ＴＡＮ：ａｎ−ＴＡ３５Ｌ
ＭＰＸＶ−ＺＲＥ：Ａ２８Ｌ
ＣＭＬＶ−Ｍ９６：ＣＭＬＶ１４５
ＣＭＬＶ−ＣＭＳ：１４３Ｌ
ＣＰＸＶ−ＢＲ：Ｖ１６１
【０１３４】
ＶＡＣＷＲ１２９（ＶＡＣＶ−ＣＯＰ Ａ１０Ｌ）追加オルソログ：
ＶＡＣＶ−ＭＶＡ：ＭＶＡ１２１Ｌ
ＶＡＣＶ−ＡＭＶＡ：ＡＭＶＡ１２３
ＲＰＸＶ−ＵＴＲ：ＲＰＸＶ−ＵＴＲ＿１１８
ＣＰＸＶ−ＧＲＩ：Ａ１１Ｌ
ＶＡＣＶ−ＴＡＮ：ａｎ−ＴＡ１１Ｌ
ＣＭＬＶ−Ｍ９６：ＣＭＬＶ１２７
ＣＭＬＶ−ＣＭＳ：１２６Ｌ
ＶＡＲＶ−ＧＡＲ：Ａ１１Ｌ
ＶＡＲＶ−ＢＳＨ：Ａ１１Ｌ
【０１３５】
ＶＡＣＷＲ１３０（ＶＡＣＶ−ＣＯＰ Ａ１１Ｒ）追加オルソログ：
ＶＡＣＶ−ＡＭＶＡ：ＡＭＶＡ１２４
ＶＡＣＶ−ＭＶＡ：ＭＶＡ１２２Ｒ
ＣＰＸＶ−ＢＲ：Ｖ１４３
ＣＰＸＶ−ＧＲＩ：Ａ１２Ｒ
ＭＰＸＶ−ＺＲＥ：Ａ１２Ｒ
ＲＰＸＶ−ＵＴＲ：ＲＰＸＶ−ＵＴＲ＿１１９
ＶＡＣＶ−ＴＡＮ：ａｎ−ＴＡ１２Ｒ
ＥＣＴＶ−ＮＡＶ：ＥＶ−Ｎ−１３１
ＥＣＴＶ−ＭＯＳ：ＥＶＭ１１４
【０１３６】
ＶＡＣＷＲ１８１（ＶＡＣＶ−ＣＯＰ Ａ５６Ｒ）追加オルソログ：
ＶＡＣＶ−ＡＭＶＡ：ＡＭＶＡ１６７
ＶＡＣＶ−ＭＶＡ：ＭＶＡ１６５Ｒ
ＶＡＣＶ−ＴＡＮ：ａｎ−ＴＡ６６Ｒ
ＣＰＸＶ−ＧＲＩ：Ａ５８Ｒ
ＭＰＸＶ−ＺＲＥ：Ｂ２Ｒ
ＣＭＬＶ−ＣＭＳ：１７３Ｒ
ＶＡＲＶ−ＧＡＲ：Ｋ９Ｒ
ＣＭＬＶ−Ｍ９６：ＣＭＬＶ１７６
ＶＡＲＶ−ＢＳＨ：Ｊ７Ｒ
【０１３７】
ＶＡＣＷＲ０９１（ＶＡＣＶ−ＣＯＰ Ｌ４Ｒ）追加オルソログ：
ＶＡＣＶ−ＭＶＡ：ＭＶＡ０８３Ｒ
ＲＰＸＶ−ＵＴＲ：ＲＰＸＶ−ＵＴＲ＿０８０
ＶＡＣＶ−ＡＭＶＡ：ＡＭＶＡ０８５
ＣＰＸＶ−ＢＲ：Ｖ１０２
ＣＰＸＶ−ＧＲＩ：Ｎ４Ｒ
ＶＡＣＶ−ＴＡＮ：Ｔａｎ−ＴＬ４Ｒ
ＶＡＲＶ−ＩＮＤ：Ｍ４Ｒ
ＣＭＬＶ−Ｍ９６：ＣＭＬＶ０８９
ＶＡＲＶ−ＢＳＨ：Ｍ４Ｒ
ＣＭＬＶ−ＣＭＳ：８８Ｒ
【０１３８】
ＶＡＣＷＲ１５６（ＶＡＣＶ−ＣＯＰ Ａ３３Ｒ）追加オルソログ：
ＲＰＸＶ−ＵＴＲ：ＲＰＸＶ−ＵＴＲ＿１４１
ＣＰＸＶ−ＧＲI：Ａ３４Ｒ
ＶＡＣＶ−ＴＡＮ：Ｒ（ＴＡ４３Ｒ）
ＶＡＣＶ−ＭＶＡ：ＭＶＡ１４４Ｒ
ＶＡＣＶ−ＡＭＶＡ：ＡＭＶＡ１４６
ＣＭＬＶ−Ｍ９６：ＣＭＬＶ１５２
ＣＭＬＶ−ＣＭＳ：１５０Ｒ
ＣＰＸＶ−ＢＲ：Ｖ１６８
ＭＰＸＶ−ＺＲＥ：Ａ３５Ｒ
【０１３９】
これらのオルソログを表すために使用した略語：
ＶＡＣＶ−Ｃｏｐ＝ワクチニアウィルス・コペンハーゲン株
ＶＡＣＶ ＭＶＡ＝ワクチニアウィルス・ウィルス改変アンカラ株
ＶＡＣＶ−ＡＭＶＡ＝ワクチニアウィルス・アカンビス（Ａｃａｍｂｉｓ）３０００ＭＶＡ株
ＶＡＣＶＷＲ＝ワクチニアウィルス・ウェスタンリザーブ（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ）株
ＶＡＣＶ−ＴＡＮ＝ワクチニアウィルス・天壇（Ｔｉａｎ Ｔａｎ）株
ＣＰＸＶ−ＧＲＩ＝牛痘ＧＲＩ−９０株
ＲＰＶ−ＵＴＲ＝家兎痘ウィルス・ユトレヒト株
ＶＡＲＶ−ＧＡＲ＝大痘瘡ウィルス・ガルシア（Ｇａｒｃｉａ）株
ＶＡＲＶ−ＢＳＨ＝大痘瘡ウィルス・バングラデシュ株
ＶＡＲＶ−ＩＮＤ＝大痘瘡ウィルス・インド株
ＣＭＬＶ−ＣＭＳ＝ラクダ痘ウィルス・ＣＭＳ株
ＣＭＬＶ−Ｍ９６＝ラクダ痘ウィルス・Ｍ９６株
ＥＣＴＶ−ＮＡＶ＝欠肢症ウィルス・ナバル（Ｎａｖａｌ）株（未発表）
ＥＣＴＶ−ＭＯＳ＝欠肢症ウィルス・モスクワ株
ＣＰＸＶ−ＢＲ＝牛痘ウィルス・ブライトンレッド（Ｂｒｉｇｈｔｏｎ Ｒｅｄ）株
ＭＰＸＶ−ＺＲＥ＝サル痘ウィルス・ザイール‐９６‐Ｉ‐１６株
【０１４０】
上記に基づき、適切な免疫学的組成物は本明細書中に抗原として同定されたワクチニアタンパク質の群より選択された少なくとも３種のタンパク質を含むであろう。これらのタンパク質の群は、ＡＴＩ遺伝子タンパク質、Ａ１０Ｌ、Ａ１１Ｒ、Ａ１３Ｌ、Ａ３３Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｄ８Ｌ、Ｄ１３Ｌ、Ｆ１３Ｌ、Ｈ３Ｌ、Ｈ５Ｒ、Ａ２６Ｌ、Ａ２７Ｌ、Ｅ３Ｌ、Ｌ４Ｒ、Ｈ７Ｒ、Ａ１７Ｌ、Ａ３Ｌ、Ａ４Ｌ、Ｄ１１Ｌ、Ｈ６Ｒ、Ｋ２Ｌ、Ｎ１Ｌ、Ａ４１Ｌ、Ａ４７Ｌ、Ｂ２Ｒ、Ｄ１０Ｒ、Ｅ１Ｌ、Ｆ２Ｌ、Ｆ９Ｌ、Ｇ５Ｒ、Ｇ７Ｌ、Ｈ７Ｒ、Ｉ１Ｌ、Ｌ５ＲおよびＯ２Ｌを含む。本発明に関する第２の免疫学的組成物は、検査された免疫された哺乳動物種の少なくとも１種において活性のあるタンパク質から選択された少なくとも３種のタンパク質を含む、これらのタンパク質はＡＴＩ遺伝子座タンパク質、Ａ１０Ｌ、Ａ１１Ｒ、Ａ１３Ｌ、Ａ３３Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｄ８Ｌ、Ｄ１３Ｌ、Ｆ１３Ｌ、Ｈ３Ｌ、Ｈ５Ｒ、Ａ２６Ｌ、Ａ２７Ｌ、Ｅ３Ｌ、Ｌ４Ｒ、Ｈ７Ｒ、Ａ１７Ｌ、Ａ３Ｌ、Ａ４Ｌ、Ｄ１１Ｌ、Ｈ６Ｒ、Ｋ２ＬおよびＮ１Ｌを含む。本発明内の第３の組成物は、免疫されたヒトにおいて活性のある群より選択された少なくとも３種のタンパク質を含む。これらのタンパク質群はＡＴＩ遺伝子座タンパク質、Ａ１０Ｌ、Ａ１１Ｒ、Ａ１３Ｌ、Ａ３３Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｄ８Ｌ、Ｄ１３Ｌ、Ｆ１３Ｌ、Ｈ３Ｌ、Ｈ５Ｒ、Ａ２６Ｌ、Ａ２７Ｌ、Ｅ３ＬおよびＬ４Ｒを含む。
【０１４１】
本発明内の他の免疫学的組成物は、本発明の方法により、免疫されたヒト、マウスおよびマカク（３種すべて）において活性のあるとされたタンパク質を少なくとも３種含む組成物である。これらのタンパク質の群はＡ１０Ｌ、Ａ１１Ｒ、Ａ１３Ｌ、Ａ３３Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｄ８Ｌ、Ｄ１３Ｌ、Ｆ１３Ｌ、Ｈ３ＬおよびＨ５Ｒを含む。本発明のもう１つの組成物は、さまざまな免疫された個体により最も一貫して認識される抗原の群より選択された少なくとも１種のタンパク質を含む。これらのタンパク質の群はＡＴＩ遺伝子座タンパク質、Ａ１０Ｌ、Ａ１３Ｌ、Ｈ３Ｌ、Ｄ１３Ｌ、Ａ１１ＲおよびＡ１７Ｒを含む。応答の強度および一貫性、タンパク質の型および同様の考察の全体的印象に基づき、本発明内のもう１つの好ましい免疫学的組成物は以下のワクチニアタンパク質の少なくとも２種またはさらに好ましくは少なくとも３種を含む。ＡＴＩ遺伝子座タンパク質、Ａ１０Ｌ、Ａ１３Ｌ、Ａ２６Ｌ、Ａ５６Ｒ、Ｄ８Ｌ、Ｄ１３Ｌ、Ｆ１３Ｌ、Ｈ５ＲおよびＨ３Ｌ。
【０１４２】
本発明内の好ましい組成物はＡＴＩ遺伝子座タンパク質、Ａ１０Ｌ、Ｄ１３ＬおよびＨ３Ｌからなる群より選択された少なくとも２種のタンパク質を含む組成物を含む。他の好ましい免疫学的組成物は追加のワクチニア抗原と組み合わせた、Ａ１０Ｌ、Ｄ１３Ｌ、Ｈ３ＬおよびＡＴＩ遺伝子座タンパク質からなる群より選択された一貫して免疫活性のあるタンパク質またはペプチドまたはそれらに実質的に相同な型または免疫活性のあるフラグメントのうちの１つを含む。したがって、例えば、特定の好ましい組み合わせはＨ３Ｌ（またはその実質的に相同なまたは免疫活性のあるフラグメント）と追加の免疫原性ワクチニアタンパク質との組み合わせを含むであろう。もう１つのこのような組み合わせはＡＴＩ遺伝子座またはその実質的に相同なまたは免疫活性のあるフラグメントによりコードされているタンパク質と追加の免疫原性タンパク質とを含むであろう。さらにもう１つの実施形態においては、Ａ１１Ｒ、Ａ２３Ｌ、Ａ５６ＲおよびＨ５Ｒからなる新規な抗原の群より選択された少なくとも１種のタンパク質を含む、または少なくとも１種の他の抗原性ワクチニアタンパク質とを組み合わせたこれらの抗原の１つを含む。
【０１４３】
上記のワクチン組成物のそれぞれに関して、本発明はまた対応するＤＮＡワクチンを含む。したがって、本明細書中に記述する各タンパク質群に関して、特定のタンパク質に対応する遺伝子の群からなるワクチン組成物もまた本発明の範囲内であり、ワクチニア抗原性タンパク質遺伝子に対応する遺伝子の一致する組み合わせも同様である。
【０１４４】
したがって、この方法論は新規免疫学的に反応性の抗原を同定し、これらのすべては従来の予測的研究では同定されないであろう。これらアレイから得られたデータはすでに報告（ここに参照によるその全体を取り込むＣｒｏｔｔｙ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００３）１７１：４９６９−４９７３）したように免疫ブロットと一致している。我々は、免疫されたヒトにおいて明白に、初回免疫後の数年の追加免疫の後、優勢抗原のサブセットに対する、とりわけＨ３Ｌ、Ｄ１３ＬおよびＡ１０Ｌタンパク質に対する、強い既往反応を見出す。
【０１４５】
（実施例７）
単一コロニー／クローンよりまたは形質転換培養物の混合物より単離したプラスミドを使用するタンパク質発現の比較
上記のように、Ｆ．ツラレンシス由来のサイズ３００ｂｐから２０００ｂｐまでの範囲の２８の標的遺伝子を選択し、２０ｂｐの遺伝子特異的配列および線状ｐＩＸ発現ベクター（Ｔ７プロモーターおよびＮ末端ポリヒスチジン融合を与える）の対応する末端に相同な３０ｂｐのアダプター配列を含むプライマーを使用してＰＣＲにより増幅した。
【０１４６】
２５ｎｇのＰＣＲ産物を同量の線状ｐＩＸプレップと予め混合した。このＤＮＡ混合物を５０μｌにより化学的形質転換受容性Ｅ．コリＤＨ５α細胞を形質転換し、これら細胞を氷上に３０分放置し、４５℃で４５秒間ヒートショックを与え、５００μｌのＳＯＣ培地に混合し、その後３７℃でインキュベートした。１時間後、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を加えた５００μｌのＬＢ培地を加え、３７℃で１４〜２４時間以上振とうしながら継続してインキュベートした。
【０１４７】
単一コロニー方法に関して、５０μｌの培養物をカナマイシン選択（２５μｇ／ｍｌ）ＬＢ寒天プレート上に次いで平板接種し、３７℃で１２〜１４時間再インキュベートした。次いで単一コロニーを拾い同じ培地を使用して一晩再培養し、その後Ｑｉａｇｅｎのミニプレップキットを使用してＤＮＡの単離を行った。
【０１４８】
あるいは、プラスミドＤＮＡを上記の第１段階の一晩形質転換混合物から直接単離した。
【０１４９】
第２、第３段階からのプラスミドＤＮＡ（５μl）をＲｏｃｈｅのＲＴＳ１００無細胞転写／翻訳ミックス２０μlに加え、３０℃で４時間インキュベートした。０．５μlの発現混合物をニトロセルロース膜上にスポットし、その後抗ポリヒスチジンタグ・モノクロナール抗体を使用した発現タンパク質の標準ウェスタンブロットによる検出を行った。
【０１５０】
【表２】

【０１５１】
単一クローン：２８試料のうち１８が標的遺伝子の発現を示した。１０の試料はどのような検出可能レベルのタンパク質の発現も生じなかった。
【０１５２】
形質転換混合物：２８試料の内の２３が発現を示した。単一クローンプロトコルからの１０の陰性試料の内のの５つが発現を示し、単一コロニー由来のプラスミドはコードされたタンパク質の発現を阻止する変異を含む可能性を示唆した。
【０１５３】
（実施例８）
ワクチニアエンベロープタンパク質Ｈ３Ｌを、図１５に示すように、５０個のアミノ酸の、１０個の重複セグメントに分割した。各セグメントについて、表３に示すように、長さ５３ｂｐのフォワードおよびリバースプライマーを設計した。これらのプライマー配列は、ＢａｍＨ１部位で線状化されたときのｐＸｉベクター（ソース）の末端に相補的なＤＮＡの３３ｂｐおよび特異的セグメントの末端に相補的なＤＮＡの２０ｂｐを含む。
【０１５４】
各セグメントをＰＣＲ増幅するために、ワクチニアゲノムＤＮＡは、特異的なフォワードプライマーおよびリバースプライマー１０μＭ、水およびＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ＨｏｔＭａｓｔｅｒ Ｍｉｘと最終容量５０μｌになるように混合された。３０サイクルの間、９４℃で３０秒間変性し、続いて５０℃で３０秒間アニーリングし、６８℃で３０秒間伸長した。ＰＣＲの後、産物は増幅の結果を評価するために１％アガロースゲルにかけた。１つのゲルはセグメント１、２および６の十分な産物を示し、スキャンしたゲルは３、４、８および１０が十分であることを示し、第３のゲルは９が十分であることを示した。セグメント５および７の増幅はどのＰＣＲ反応でも成功しなかった。したがって、これらの２つの１５０ｂｐのセグメントを増幅する代わりに、それぞれフォワードおよびリバースプライマー４および６を５の増幅に使用し、フォワードおよびリバースプライマー６および８を７の増幅に使用した。これらの４５０ｂｐ配列の増幅に成功した。
【０１５５】
ＰＣＲ増幅の後ＰＣＲ産物をＱｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットを用いて浄化し、これらセグメントを組み換えクローン化法を使用してクローン化した。４０ｎｇの線状化ｐＸｉベクターを１０ngの浄化済みＰＣＲ産物と混合し、この混合物に１０ｕｌのＤＨ５アルファＥ．コリ形質転換受容性細胞を加えた。この混合物は次に氷上で４５分置き、４２℃で１分間ヒートショックを与えその後もう１分氷にもどした。この混合物を取り上げ、ＳＯＣ培地２００ulを各チューブに加え、３７℃のウォーターバスで１時間インキュベートした。形質転換混合物は３mlのＬＢ＋カナマイシンと混合し、３７℃で一晩インキュベートした。
【０１５６】
プラスミドＤＮＡをミニプレップを使用して形質転換混合物から単離した。プラスミドがインサートを有するかどうかを決定するためにゲルにかけた。対照として、環状ｐＸｉベクターをかけた。結果は、セグメント１、２、３、６、８、９および１０を含むように設計したプラスミドがインサートを有することを示した。
【０１５７】
【表３】




【０１５８】
（実施例９）
ビーズに固定したタンパク質を使用したＴ細胞活性化の検出
上記の方法を使用して、問題としている生物（例えば、ワクチニア）の実質的にすべてのプロテオームをＴ７ベクター（ｐＴＸ７）使用してクローン化し、タンパク質をインビトロ無細胞系を使用して発現させた。各タンパク質をベクターに挿入するために使用したアダプターはポリＨｉｓ‐タグを含むので、発現タンパク質はあらかじめローディングバッファー（３００ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）で平衡化してあるニッケル被覆ビーズ上に捕捉される。ニッケル被覆ビーズはさまざまなサイズでよいが、通常直径約１０〜２０ミクロンであるＡＰＣ細胞より小さいほうが有利である。１〜３ミクロンのニッケル被覆ビーズが入手可能であり、この目的に効果的である。タンパク質被覆ビーズは次いで洗浄バッファー（イミダゾールが２０ｍＭである以外は上記の通り）で５回洗浄し、２回の組織培養培地で洗浄し、原体積１２．５μｌの無血清培地に再懸濁した。９６ウェル測定フォーマット中でＴ細胞と組み合わせる前に、これらのビーズを抗原提示細胞とともにインキュベートした。
【０１５９】
応答Ｔ細胞を、病原菌（例えば腹腔内に投与した２ｘ１０^５ｐｆｕワクチニア）を用いて、または腹腔内または尾底部皮下に投与したアジュバント中の個々の組み換え型タンパク質を用いて免疫化したマウスから、あるいは感染した／免疫されたヒトドナーの末梢血から得た。マウスの場合、免疫化の７〜１０日後、脾臓または脱水リンパ節を取り上げた。抗原で被覆されたビーズ（ウェル当り通常１〜５μl）を、次いで、事前に被覆され（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎによる）、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（ハツカネズミ測定用）または５％ヒトＡＢ血清（ヒト測定用）含有組織培養培地で１時間遮断したマルチスクリーン９６ウェルプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＭＡＨＡＳ４５）中のハツカネズミの脾細胞またはヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ；５×１０^５細胞／ウェル）に加えた。抗マウスまたは抗ヒトＩＦＮ−γをニトロセルロース基板上のウェルに固定できる。例えば、この場合、血清による処理はニトロセルロース上のどのような空いている部位も遮断する役割を果たし、さもなければニトロセルロースは捕捉抗体を結合してしまいインターフェロンの検出や他のサイトカイン形成に使用されるＥＬＩＳＰＯＴ分析を妨害することになる。ＩＦＮ‐γ抗体はＴ細胞（脾細胞またはＰＢＭＣ）が認識された抗原により刺激されたときに産生されるどのようなＩＦＮ‐γをも捕捉する。したがって結合していない物質を洗い流した後、形成されたいずれのＩＦＮ‐γもＩＦＮ‐γ捕捉抗体に結合したままであり、結合したＩＦＮ‐γに結合することができる第２の抗体を加えることにより検出できる。この第２の抗体は容易に可視化できるように標識されている。
【０１６０】
使用する培地は、いずれの汚染ＬＰＳをも阻害するためには、ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミンを有しおよび１０〜５０μg／mlのポリミキシンＢを補足したＩｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）でよい。ハツカネズミＴ細胞測定に関して、この培地はまた２‐メルカプトエタノールの最終濃度５ｘ１０^−５Ｍを補う。ヒトの測定のための陽性対照抗原は、１／１６０で使用されるミョウバン（Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｅｒｕｍ Ｃｏ）上に吸着された、ＴＢ‐ワクチン接種ドナーにおける、精製されたタンパク質誘導体（Ｔｕｂｅｒｓｏｌ、Ａｖｅｎｔｉｓ Ｐａｓｔｅｕｒによる）である破傷風トキソイドを含み得る。分析および細胞の生存の確認に使用できるマイトジェンは、マウス細胞のためにコンカナバリンＡをおよびヒト細胞のためにフィトヘマグルチニンを含有し、どちらも１μg／mlで使用した。ＥＬＩＳＰＯＴによるＩＦＮ‐γの検出のための抗体はＰｈａｒｍｉｎｇｅｎの一致する対である。
【０１６１】
共培養の１８から２０時間後、捕捉したインターフェロンをビオチン化抗ＩＦＮ‐γ検出抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて検出し、ストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼを用いて、続けてニトロ‐ＢＴ発色液により可視化した。ヒトおよびマウスの培養物の上清を６時間、１２時間、２４時間および４８時間で採取し、Ｔｈ１（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−１２）Ｔｈ２（ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３）ならびに炎症性サイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ−２およびＧＭ−ＣＳＦ）のための多重サイトカイン測定（Ｌｉｎｃｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃの注文１０‐プレックス・キットを使用）を行い、Ｌｕｍｉｎｅｘ １００測定器を使用して同時分析が可能である。１つまたは複数のこれらサイトカインの存在は、検査したタンパク質が細胞性免疫応答を誘発し、および免疫の誘発に有益なそれらのタンパク質またはペプチドの同定を可能にするものであることを実証する。
【０１６２】
（実施例１０）
ＡＰＣにおけるタンパク質の発現を使用したＴ細胞活性化の検出
問題としている生物（例えば、ワクチニア）の実質的にすべてのプロテオームをＣＭＶ（ｇＷＩＺ）ベクターにクローン化する。プラスミドは、脂質送達を使用して（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）、Ｂｉｏ−Ｒａｄのトランスフェクション試薬・Ｃｙｔｏｆｅｃｔｅｎｅ（商標）またはＲｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅのトランスフェクション試薬・ＦｕＧＥＮＥ６（商標）などの専用の脂質試薬を使用した「リポフェクション（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）」による。ここにこの全体を参照により組み込むＦｅｌｇｎｅｒ， ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ．． Ｎｏｖ． １９８７ ８４（２１）， ７４１３−７，を参照）、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に導入し１日後、タンパク質が９６ウェル測定フォーマットにおいてＴ細胞と組み合わせる前に発現可能にした。病原菌（例えば、腹腔内に投与した２ｘ１０^５ｐｆｕワクチニア）によりあるいは腹腔内または尾底部皮下に投与したアジュバントの個々の組み換えタンパク質により免疫されたマウスから、または感染した／免疫されたヒトドナーの末梢血から応答Ｔ細胞を得た。マウスの場合、免疫化の７〜１０日後、脾臓または脱水リンパ節を取り上げた。次に、形質移入された抗原提示細胞を、抗マウスまたは抗ヒトＩＦＮ‐γ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎによる）を用いて事前に被覆されおよび１０％（ＦＣＳ）（ハツカネズミ測定用）または５％ヒトＡＢ血清（ヒト測定用）含有組織培養培地で１時間遮断されたマルチスクリーン９６ウェルプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＭＡＨＡＳ４５）内のハツカネズミ脾細胞またはヒトＰＢＭＣ（５ｘ１０^５細胞／ウェル）に加えた。
【０１６３】
使用する培地は、いずれの汚染ＬＰＳをも阻害するためには、ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミンを有しおよび１０〜５０μg／mlのポリミキシンＢを補足したＩｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）でよい。ハツカネズミＴ細胞測定に関して、この培地はまた２‐メルカプトエタノールの最終濃度５ｘ１０^−５Ｍを補う。ヒトの測定のための陽性対照抗原は、１／１６０で使用されるミョウバン（Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｅｒｕｍ Ｃｏ）上に吸着された、ＴＢ‐ワクチン接種ドナーにおける、精製されたタンパク質誘導体（Ｔｕｂｅｒｓｏｌ、Ａｖｅｎｔｉｓ Ｐａｓｔｅｕｒによる）である破傷風トキソイドを含み得る。分析および細胞の生存の確認に使用できるマイトジェンは、マウス細胞のためにコンカナバリンＡをおよびヒト細胞のためにフィトヘマグルチニンを含有し、どちらも１μg／mlで使用した。ＥＬＩＳＰＯＴによるＩＦＮ‐γの検出のための抗体はＰｈａｒｍｉｎｇｅｎの一致する対である。
【０１６４】
共培養の１８から２０時間後、捕捉したインターフェロンをビオチン化抗ＩＦＮ‐γ検出抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて検出し、ストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼを用いて、続けてニトロ‐ＢＴ発色液で可視化した。ヒトおよびハツカネズミの培養物の上清を６時間、１２時間、２４時間および４８時間で採取し、Ｔｈ１（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１２）Ｔｈ２（ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３）ならびに炎症性サイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ−２およびＧＭ−ＣＳＦ）のための多重サイトカイン測定（Ｌｉｎｃｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈの注文１０‐プレックス・キットを使用）を行い、Ｌｕｍｉｎｅｘ １００測定器を使用して同時分析が可能である。１つまたは複数のこれらサイトカインの存在は、検査したタンパク質が細胞性免疫応答を誘発し、および免疫の誘発に有益なそれらのタンパク質またはペプチドの同定を可能にするものであることを実証する。
【０１６５】
（実施例１１）
マラリア（Ｐ．ファルシパルム）を使用した抗原同定方法の検証
２１８のＰ．ファルシパルム（Ｐｆ）遺伝子のセットをクローニング、発現およびタンパク質マイクロアレイチップ転写のために選択した。これら遺伝子は細胞内局在性（例えば、分泌タンパク質および細胞培養上清におい見られる他のタンパク質）、Ｐ．ファルシパルムのヒトおよび動物モデルにおける周知の免疫原性およびＰ．ファルシパルムの成長状態に対する遺伝子発現パターンに基づいて選択した。それぞれは９の分類のうちの１つに当てはまる：ｉ）バイオインフォマティクス基準のみにより同定されている（ｎ＝２５）；ｉｉ）Ｐ．ヨエリ（P.yoelii）肝臓期のレーザーキュプチャー顕微解剖により同定され、ＭｕｄＰＩＴ（ｎ＝１６）によりスポロゾイトプロテオームにおいて同定されている；ｉｉｉ）Ｐｙ肝臓期のレーザーキュプチャー顕微解剖により同定されているタンパク質のＰｆオルソログ、しかしスポロゾイトのプロテオーム（肝臓期特異的；ｎ＝５２）中には発見されていない；ｉｖ）ＭｕｄＰＩＴによるスポロゾイトのプロテオーム中で高度に発現される（ｎ＝１０）；ｖ）ＭｕｄＰＩＴによるスポロゾイトのプロテオーム中で同定され、放射線照射したスポロゾイト（ｉｒｒ−ｓｐｚ）免疫されたボランティア由来のＰＢＭＣによる免疫認識について測定された（ｎ＝２７）；ｖｉ）臨床開発における知られていてよく特性決定されているＰｆ抗原（ｎ＝２１）；ｖｉｉ）Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子チップによるスポロゾイトの遺伝子転写プロファイルにより示されたスポロゾイト期に高度に発現されるもの（ｎ＝５３）；ｖｉｉｉ）ＭｕｄＰＩＴにより栄養型および繁殖体期プロテオームにおいて同定されているもの（ｎ＝１１）；およびｉｘ）インビトロで保護的であると指摘されているＰ．ヨエリのＰ．ファルシパルムオルソログ（ｎ＝２）。これらの分類のどれにも当てはまらない、対象となる１つの追加の遺伝子、ＰＦＢ０６４５ｃも含まれた。
【０１６６】
Ｐ．ファルシパルムゲノムＤＮＡ鋳型を使用してＰＣＲ増幅を行った。多くのＰ．ファルシパルム遺伝子はイントロンを含んでいるので、プライマーはそれぞれのエクソンにわたるように設計してある。３０００塩基対より長い大きな遺伝子（およびエクソン）は、それぞれ１５０ヌクレオチド（すなわち５０アミノ酸）重複しているセグメントとして増幅された。Ｐ．ファルシパルムゲノムの全体に及ぶプライマー設計がｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ＧｅｎｏｍｉｃｓのＡｒｌｏ ＲａｎｄａｌｌおよびＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｔ ＵＣ Ｉｒｖｉｎｅおよびウェブインターフェイス経由でアクセス可能なプライマーデータベースにより成されている。このデータベースは１４、４４６エンティティを含んでいる。したがって、それぞれの独立したエクソンを増幅するためおよび３０００ｂｐより短いセグメントの中の大きい遺伝子を増幅するために１４、４４６プライマー対が必要であろう。しかし、ＯＲＦの約４０％が５０アミノ酸より短いペプチドをコードし、したがって１５０ヌクレオチドより大きい各々のＯＲＦを増幅するために約８０００プライマー対が必要であろう。このオンラインのデータベースはこれからの研究のためのプライマー配列の元として使用した。
【０１６７】
２１８遺伝子目標セット由来の全部で２６６のＯＲＦを、先に述べた発現系を使用して、増幅し、クローン化し、発現させた。完了までに３日かかる方法を使用して、Ｐ．ファルシパルムゲノムＤＮＡから２６６のＯＲＦをＰＣＲ増幅し、フラグメントをＴ７発現ベクター内にクローン化し、無細胞インビトロ転写／翻訳系で発現させ、発現タンパク質をマイクロアレイチップ上にスポットした。これらチップは放射線照射したスポロゾイトにより免疫されたヒトボランティア由来の、大腸菌溶解物で処理した血清を用いてプローブし、スライドはＣｙ３標識抗ヒト抗体を用いて発色させ共焦点レーザーマイクロアレイチップリーダーにより読み取った。未処置の個体は反応しないのに対して、マラリア免疫個体はＰ．ファルシパルムタンパク質のサブセットに対して反応した。これらタンパク質はマイクロアレイチップ上に転写され、これらチップはケニアの発症頻度の高い地域で自然にマラリアに曝露された、または放射線照射スポロゾイトにより免疫された１１人のドナーからの血清を用いてプローブした。未処置のドナーはチップ上に転写された発現タンパク質の完全セットに対する活性を欠いていたが（図６）、免疫された個体由来の血清はチップ上のタンパク質のサブセットに対して反応した。これらの結果の要約を表４に示した。表４の「遺伝子座」コードはウェブアドレスｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｑｕｅｒｙ／ｇｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉでオンラインで利用可能なＧｅｎＢａｎｋデータベースで利用されている「遺伝子座タグ」に対応する。したがって、これらコードはこの表中のそれぞれのタンパク質に関するＤＮＡ配列およびペプチド配列の双方を得るために容易に使用できる。
【０１６８】
この分析で同定された９個の強い反応性タンパク質があった。９個のうち７個の高反応性タンパク質は知られているよく特性付けされたＰｆ血液期抗原であり、これらの多くは臨床開発および評価中である（ＬＳＡ３、ＭＳＰ４、ＥＢＡ１７５、ＲＥＳＡ）。興味深いことに、ＰＦ１０＿０３５６、肝臓期抗原１、は肝臓期特異的抗原であり、スポロゾイト内または生物の血液期では発現せず、肝臓期においてのみである。１１の内６の血清がこの抗原を認識した事実はプロテオームアレイが血液期抗原だけより多くの同定能力を有することを示している。さらにＰＦＤ０３１０ｗは、ワクチン抗原候補として臨床開発中の有性期抗原ＳＨＥＢＡ／Ｐｆｓ１６である。最も強い反応性抗原の１つであるＰＦＥ１５９０ｗは今までに潜在的ワクチン抗原候補として認められたことはない。
【０１６９】
【表４】

【０１７０】
例として挙げるのみであり本発明の包含するタンパク質およびＤＮＡ配列の範囲を限定するものではないが、免疫活性タンパク質のいくつかに関する最も近いオルソログのいくつかが本方法により同定され、表４に載っていないそのいくつかは以下を含む。
【０１７１】
ＰＦＢ０３１０ｃ：
Ｐ．ヨエリ：ＰＹ０５９６７（ＭＳＰ４／５関連）
Ｐ．ヨエリ：ＰＹ０７５４３（ＭＳＰ４／５）
ＰＦＥ１５９０ｗ：
Ｐ．ヨエリ：ＰＹ０２６６７（内在性膜タンパク質）
ＰＦＢ０７＿０１２８：
Ｐ．ファルシパルム：Ｃｈｒ．１３、ＭＡＬ１３Ｐ１．６０（赤血球結合抗原１４０）
Ｐ．ファルシパルム：Ｃｈｒ．１、ＰＦＡ０１２５ｃ（Ｅｂｌ−１様タンパク質、推定）
Ｐ．ファルシパルム：Ｃｈｒ．１，ＰＦＡ００６５ｗ（仮想タンパク質）
Ｐ．ファルシパルム：Ｃｈｒ．４，ＰＦＤ１１５５ｗ（赤血球結合抗原、推定）
Ｐ．ヨエリ：ＰＹ０４７６４ ダフィー受容体、ベータ型前駆体）
ＰＦ１０＿０３４３：
Ｐ．ヨエリ：ＰＹ０４９２６（仮想タンパク質）
【０１７２】
【表５】

【０１７３】
ＰＦ１１＿０５０９：
ＰＦ１３＿０１９７：
Ｐ．ファルシパルム：ＣＨＲ１３／ＭＡＬ１３Ｐ１．１７３／ＭＳＰ７様タンパク質
Ｐ．ファルシパルム：ＣＨＲ１３／ＭＡＬ１３Ｐ１．１７４／ＭＳＰ７様タンパク質
Ｐ．ファルシパルム：ＣＨＲ１３／ＰＦ１３＿０１９３／ＭＳＰ７様タンパク質
Ｐ．ファルシパルム：ＣＨＲ１３／ＰＦ１３＿０１９６／ＭＳＰ７様タンパク質
Ｐ．ファルシパルム：ＣＨＲ１３／ＰＦ１３＿０１９７／メロゾイト表面タンパク質７前駆体、ＭＳＰ７
Ｐ．ヨエリ：ＰＹ０２１４７／サツマイモネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）ＣＯＬ−ｌ−関連
ＰＦ１４＿０４８６：
Ｐ．ヨエリ ＰＹ０５３５６ （伸長因子２）
ＰＦ０８＿００５４：
Ｐ．ヨエリ ＰＹ０６１５８ （ヒートショックタンパク質７０）
ＰＦ１１＿０３４４：
Ｐ．ヨエリ ＰＹ０１５８１ （頂端膜抗原１）
【０１７４】
これらの別の用途において、Ｐ．ファルシパルム由来の３００の遺伝子が本明細書中に記載の方法を使用して発現されマイクロアレイにおいて表示された。アレイは若年期にマラリアに罹り、したがってそれに対して免疫されている１２人の対象からの血清によりプローブされた。１２の血清試料のうち少なくとも６つについて以下の各遺伝子産物に関して陽性応答を観察した。
【０１７５】
【表６】


【０１７６】
（実施例１２）
マラリアワクチンおよび診断テスト
実施例１１において得たデータセットを基に、タンパク質のまたはこのタンパク質をコードする核酸のカクテルをワクチン組成物のために選択した。これらの結果に基づいたマラリアワクチンカクテルは、以下の遺伝子または対応するペプチドを少なくとも３種および４種もしくはそれ以上または５種もしくはそれ以上を含み、またはこれらのすべてを含むことができる：ＰＦＢ０３００ｃ、ＰＦＥ１５９０ｗ、ＦＢ０９１５ｗ、ＰＦＢ０３１０ｃ、ＰＦＢ０３１０ｗ、ＰＦ１１＿０５０９およびＰＦ１０＿０３４３。このワクチンは、提供された患者の免疫系が弱められることがなければ、賦形剤、マラリアの危機にあるヒト対象を免疫するここに記載の組成物および方法を使用して投与される。
【０１７７】
あるいは、ワクチンは、抗原性タンパク質を発現するものとして表４ｂにおいて同定された遺伝子に対応する、少なくとも３種の核酸または少なくとも３種のタンパク質を含むであろう。好ましい実施形態において、このワクチンはこれらのタンパク質または核酸を３種もしくはそれ以上または４種もしくはそれ以上または少なくとも６種含むであろう。通常、このワクチンは、その遺伝子産物が検査した血清のうち少なくとも６種において、または検査した血清のうち少なくとも８種において、または検査した血清のうち少なくとも９種において、または検査した血清のうち少なくとも１０種において、または検査した血清のうち少なくとも１１種において、陽性応答を示す遺伝子に対応する核酸またはタンパク質の少なくとも３種を含むであろう。ある実施形態において、このワクチンは、検査された血清の１０種またはそれ以上において陽性応答を誘発した遺伝子のうちの１つに対応する少なくとも１種の成分を含むであろう。他の実施形態において、このワクチンは検査された１２の血清のうち１０またはそれ以上において陽性応答を誘発した遺伝子に対応するタンパク質もしくは核酸成分の少なくとも２種またはタンパク質もしくは核酸成分の少なくとも３種を含むであろう。他の実施形態において、免疫優勢抗原は、人がＰ．ファルシパルムに曝露されたことがあるかをまたは感染したことがあるかを明確に診断するためのＥＬＩＳＡなどの血清学的診断テストに使用されるであろう。
【０１７８】
（実施例１３）
フランシセラ・ツラレンシスにおいて同定された抗原性タンパク質
Ｆ．ツラレンシス由来の実施例１Ｄのタンパク質を使用した上記の方法に続いて、野兎病菌の非感染性株に曝露されたマウス由来のまたは毒性のＳｃｈｕ Ｓ４変異株に曝露されたマウス由来の血清と反応性である多くの抗原性タンパク質が同定された。これらのタンパク質のデータは下記の表５および６である。タンパク質に関する配列はウェブアドレスｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｑｕｅｒｙ／ｇｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉでオンラインで利用可能なＧｅｎＢａｍｋのデータベースにおいて利用可能である。表中の遺伝子コードは同定された遺伝子およびタンパク質に関する遺伝子座タグに対応する。
【０１７９】
【表７】

【０１８０】
【表８】

【０１８１】
この表は、毒性生物によりチャレンジされたマウスは、非感染性株のみによりチャレンジされたものより多くの抗体を産生したことを示し、およびある種の抗体は、いずれの株がこれらマウスの免疫化に使用されたかを問わず、高度に一貫して産生されたことを示す。
【０１８２】
例として挙げるのみであり、本発明により包含されるタンパク質またはＤＮＡ配列の範囲を限定するものではなく、本方法により同定されたいくつかの免疫活性タンパク質について最も近い変異型およびオルソログのいくつかは以下を含む。
【０１８３】
ＦＴＴ１２６９（ＤｎａＫ）：
シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）ＰＡＯ１
シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０
レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）
コクシエラ・バーネッティ（Coxiella burnetii）ＲＳＡ ４９３株
レジオネラ・ニューモフィラ ランス（Lens）株
レジオネラ・ニューモフィラ パリ（Paris）株
コクシエラ・バーネッティｄｎａＫ
レジオネラ・ニューモフィラｇｒｐＥ、ｄｎａＫ、ｄｎａＪ
サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）
サルモネラ・エンテリカ 血液型亜型チフス菌（Salmonella enterica serovar Typhi （Salmonella typhi））ＣＴ１８株
【０１８４】
ＦＴＴ１６９６ （Ｈｓｐ６０）：
アシネトバクター種（Acinetobacter sp.）ＡＤＰ１
キセノラブダス・ネマトフィラ（Xenorhabdus nematophila）ＧｒｏＥＬ様タンパク質遺伝子
エルトール型Ｏ１ビブリオコレラ菌 Ｎ１６９６１株 染色体 Ｉ
シュードモナス・エルギノサ（Pseudomonas aeroginosa）ＰＡＯｌ
ＧｒｏＥＳタンパク質相同体、ＧｒｏＥＬタンパク質相同体のクレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）遺伝子
ＧｒｏＥＳタンパク質相同体、ＧｒｏＥＬタンパク質相同体のエンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）遺伝子
ＧｒｏＥＳタンパク質相同体、ＧｒｏＥＬタンパク質相同体のエンテロバクター・アズブリエ（Enterobacter asburiae）遺伝子
シュードモナス・エルギノサＧｒｏＥＬ（ｍｏｐＡ）遺伝子
ＧｒｏＥＳタンパク質相同体、ＧｒｏＥＬタンパク質相同体のシュードモナス・エルギノサ遺伝子
ＧｒｏＥＳ、ＧｒｏＥＬについてのシュードアルテロモナス種（Pseudoalteromonas sp.）ＰＳ１Ｍ３遺伝子
【０１８５】
ＦＴＴ０９０１（１７ｋｄタンパク質）：
デルマセンタ・アルビピクス（Dermacentor albipictus）クローンＴＩＧの野兔病菌内共生体１７kDaリポタンパク質遺伝子
デルマセンタ・バリアビリス（Dermacentor variabilis）クローン０１−１０９の野兔病菌内共生体１７kDaリポタンパク質遺伝子
デルマセンタ・オクシデンタリス（Dermacentor occidentalis）クローン０２−２４１の野兔病菌内共生体１７kDaリポタンパク質遺伝子
デルマセンタ・ハンテリ（Dermacentor hunteri）クローン０１−１１３の野兔病菌内共生体１７kDaリポタンパク質遺伝子
デルマセンタ・アンデルソニ（Dermacentor andersoni）クローン０１−１５１−１の野兔病菌内共生体１７kDaリポタンパク質遺伝子
デルマセンタ・アンデルソニ（Dermacentor andersoni）クローン０１−１７１の野兔病菌内共生体１７kDaリポタンパク質遺伝子
デルマセンタ・ニテンス（Dermacentor nitens）クローンＤｎＴ２−ｌの野兔病菌内共生体１７kDaリポタンパク質遺伝子
デルマセンタ・ハンテリ（Dermacentor hunteri）クローン０２−２４９の野兔病菌内共生体１７kDaリポタンパク質遺伝子
デルマセンタ・ハンテリ（Dermacentor hunteri）クローン０１−１１２の野兔病菌内共生体１７kDaリポタンパク質遺伝子
デルマセンタ・アンデルソニ（Dermacentor andersoni）クローン０２−３１の野兔病菌内共生体１７kDaリポタンパク質遺伝子
【０１８６】
ＦＴＴ１４７７ｃ：
シュードモナス・プチダ ＫＴ２４４０
シュードモナス・シリンゲ・パソバール・トマト（Pseudomonas syringae pv. tomato）ＤＣ３０００株
シュードモナス・エルギノサＰＡＯ１
キサントモナス・アクソノポディス・パソバール・シトリ（Xanthomonas axonopodis pv. citri）３０６株
キサントモナス・カンペストリス・パソバール・カンペリトリス（Xanthomonas campestris pv. campestris）ＡＴＣＣ ３３９１３株
フォトバクテリウム・プロフォンダム（Photobacterium profondum） ＳＳ９
メチロコックス・カプスラタス（Methylococcus capsulatus）バス（Bath）株
レジオネラ・ニューモフィラ パリ株
レジオネラ・ニューモフィラ ランス株
ブラデリゾビウム・ジャポニカム（Bradyrhizobium japonicum）ＵＳＤＡ １１０ ＤＮＡ
【０１８７】
ＦＴＴ０４７２（ビオチンカルボキシルキャリア）：
シュードモナス・エルギノサＰＡＯ１
シュードモナス・エルギノサビオチンカルボキシルキャリアタンパク質およびビオチンカルボキシラーゼ（ａｃｃＢおよびａｃｃＣ）遺伝子
レジオネラ・ニューモフィラ亜種ニューモフィラ フィラデルフィア１株
レジオネラ・ニューモフィラ パリ株
パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）亜種ムルトシダ Ｐｍ７０株
レジオネラ・ニューモフィラ ランス株
メチロコックス・カプスラタス バス（Bath）株
シゲラ・フレックスネリ（Shigella flexneri）２ａ株
サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium） ＬＴ２
シゲラ・フレクスネリ（Shigella flexneri）２ａ ２４５７Ｔ株
【０１８８】
（実施例１４）
マイコバクテリウム・ツベルクロシス由来の抗原性タンパク質
マイコバクテリウム・ツベルクロシスＨ３７Ｒｖ由来の実施例１Ｃのタンパク質を使用した上記の方法にしたがい、以下の抗原性タンパク質が同定された（選択された知られているの変異体およびオルソログもまた限定しない例として記載。）
【０１８９】
Ｒｖ３３３３ｃ不確定なプロリンを富むタンパク質）
変異体／オルソログ：Ｍｂ２７６５ｃ（Ｍ．ボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ））
ＭＬ０９８１（Ｍ．レプラエ（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）
【０１９０】
Ｒｖ０４４０（６０ｋＤａシャペロニン）
変異体／オルソログ：Ｍｂ０４４８（Ｍ．ボビス）
ＭＬ０３１７（Ｍ．レプラエ）
【０１９１】
Ｒｖｌ８６０（アラニンおよびプロリンを富むチ分泌タンパク質ＡＰＡ）
変異体／オルソログ：Ｍｂ１８９１（Ｍ．ボビス）
【０１９２】
Ｒｖ３７６３（１９ｋＤａリポタンパク質抗原前駆体ＬＰＱＨ）
変異体／オルソログ：Ｍｂ３７８９ （Ｍ．ボビス）
ＭＬ１９６６（Ｍ．レプラエ）
【０１９３】
Ｒｖ３８７４（１０ｋＤａ濾過物抗原ＥＳＸＢ）
変異体／オルソログ：Ｍｂ２７６５ｃ（Ｍ．ボビス）
【０１９４】
Ｒｖ３８７５（６ｋＤａ早期分泌抗原標的ＥＳＸＡ）
変異体／オルソログ：Ｍｂ３９０５（Ｍ．ボビス）
【０１９５】
（実施例１５）
マイコバクテリウム・ツベルクロシス由来の抗原性タンパク質
マイコバクテリウム・ツベルクロシスＨ３７Ｒｖの３１２の発現遺伝子由来のタンパク質をウサギ、マウスおよびサルからの血清により、上記の方法および実施例１Ｃで得た遺伝子によるタンパク質を使用して試験した。以下の表はそれぞれの種からの血清を使用して検出した抗原を記載する。各タンパク質は公的に利用可能なＧｅｎＢａｎｋデータベースで使用されている遺伝子に対応する遺伝子座タグにより同定した。非感染動物からの血清は記載の抗原すべてに反応し、ＴＢ‐感染動物からの血清のみにより検出された抗原は太字で強調表示して記載されている。
【０１９６】
【表９】



【０１９７】
（実施例１６）
結核ワクチンおよび診断テスト
実施例１５にて得たデータのセットよりタンパク質またはタンパク質をコードする核酸のカクテルをワクチン組成物のために選択した。これらの結果に基づく結核診断テストまたはワクチンカクテルは以下の遺伝子または対応するペプチドを少なくとも３種含み、または４種もしくはそれ以上または５種もしくはそれ以上またはこれらのすべてを含むことができる。Ｒｖ０４４０、Ｒｖ０４６７、Ｒｖ０４７５、ＲＶ０５３８、Ｒｖ０６７４、Ｒｖ０６８５、Ｒｖ０７９８ｃ、Ｒｖ０９１６ｃ、Ｒｖ０９３４、Ｒｖｌ８０１、Ｒｖｌ８６０、Ｒｖｌ９２６ｃ、Ｒｖｌ９８０ｃ、Ｒｖｌ９８４ｃ、Ｒｖ２００７ｃ、Ｒｖ２０３１ｃ、Ｒｖ２１９０ｃ、Ｒｖ２２２０、Ｒｖ２３７６ｃ、Ｒｖ２３８９ｃ、Ｒｖ２４４６ｃ、Ｒｖ２７４４ｃ、Ｒｖ２８７３、Ｒｖ２８７５、Ｒｖ２８７５、Ｒｖ３２７０、Ｒｖ３３３０、Ｒｖ３３３３ｃ、Ｒｖ３４１８ｃ、Ｒｖ３７６３、Ｒｖ３８０３ｃ、Ｒｖ３８２８ｃ、Ｒｖ３８４６、Ｒｖ３８７４、Ｒｖ３８７５、Ｒｖ３８８１ｃおよびＲｖ３９１４。特に適切な抗原は多種の感染動物からの血清に特異的に反応するものを含み、これら抗原はＲｖ０４４０、Ｒｖｌ８０１、Ｒｖ２０３１ｃ、Ｒｖ２３７６ｃ、Ｒｖ２８７５、およびＲｖ３８７５を含む。さらに特に重要なものは感染したサル由来の血清により特異的に認識される抗原であり、これらはＲｖ０４４０、Ｒｖ０４７５、Ｒｖｌ８０１、Ｒｖｌ９８０ｃ、Ｒｖ２２２０、Ｒｖ２８７３、Ｒｖ２８７５、Ｒｖ３２７０、Ｒｖ３７６３およびＲｖ３８７５を含む。ワクチンまたは診断テストはしたがって、これらの抗原のいずれかから選択された２種もしくはそれ以上または３種もしくはそれ以上または４種より多くのタンパク質または核酸を含む。
【０１９８】
このワクチンは、提供された対象の免疫系が損なわれないなら、結核の危機にあるヒト対象を免疫化するために、賦形剤、本明細書中に記載の組成物または方法を使用して投与される。
【０１９９】
【表１０】





【０２００】
前述の実施例は単に本発明のある実施形態を例示するものみであり、限定と解釈されるべきではない。当業者には明らかであろうこれらの変形もまた本発明の範囲に含まれる。当業者は、ここに述べた発明の多くの態様および実施形態を組み合わせ得ることをならびにこの発明は記載された様々な態様および実施形態のこのような組み合わせを明白に含み得ることを、認識している。
【図面の簡単な説明】
【０２０１】
【図１】宿主ベクターをおよびＢａｍＨＩ部位を囲むヌクレオチド配列を表す図である。示されているように、ゲノム由来のＰＣＲ増幅フラグメントのインフレーム挿入がグルタミン酸コドンＧＡＧの後の塩基番号２０６にある。５’相同クローニング領域が塩基番号２０６に始まり３３塩基上流まで伸長しており、１０ｘヒスチジンタグとのインフレーム融合をもたらしている。３’相同クローニング領域は塩基番号２１２に始まり３３塩基下流に伸長しており、ＨＡタグをもたらし、ＴＡＡ終止コドンにより終了する。
【図２】ワクチニアおよびフランシセラ・ツラレンシス由来のＰＣＲ産物のセットを表すゲルを示す。
【図３】Ｅ．コリの作用による組み換えの一晩培養物由来の全核酸を与えるフェノール‐クロロフォルム溶解細胞のゲルを示す。
【図４】図３に使用した一晩培養物由来の選択されたコロニーのミニプレップ由来のプラスミドを示す。
【図５】図４のミニプレッププラスミドの翻訳産物について行われたＳＤＳ ＰＡＧＥゲルを示す。前記ゲルは抗ポリヒスチジン抗体によりプローブされた。
【図６】抗ヒスチジン抗体または抗ＨＡ抗体によりプローブされた図４のプラスミドのドットプロットを示す。
【図７】抗ヒスチジンタグ（図７Ａ）、抗ＨＡタグ（図７Ｂ）、大腸菌溶解物なしのＶＩＧ（図７Ｃ）、溶解物存在下のワクチニア免疫グロブリン（ＶＩＧ）（図７Ｄ）によりプローブされたドットプロット上に同定された免疫活性タンパク質のＳＤＳ ＰＡＧＥの例示的結果を示す。
【図８】Ｅ．コリ溶解物を有するＶＩＧで処理したおよび処理していない個々のワクチニアタンパク質のドットブロットの定量的結果を示す。
【図９】ＶＩＧと免疫反応性としてＤ８Ｌ、Ｆ１３Ｌ、Ｈ１３Ｌ、Ｈ５Ｒ、Ａ５６Ｒおよび６４４を同定する、ワクチニアタンパク質のマイクロアレイを示す。
【図１０】上記のワクチニア由来のインサートを含む形質転換混合物より得られた全核酸を示す。
【図１１】抗ポリヒスチジンを用いてプローブした、細胞混合物より得たプラスミドについて行なった翻訳反応のＳＤＳ ＰＡＧＥの結果を示す。
【図１２】ワクチニアタンパク質のアレイを提供するための、精製することなくニトロセルロースへ適用された図１１のタンパク質についてのドットブロットを示す。図１２Ａ−Ｄは、ドットブロットを抗ヒスチジン、抗ＨＡ、溶解物を含有しないＶＩＧおよび溶解物を含有するＶＩＧを用いて解析されたときのそれぞれの結果を示す。
【図１３】Ｅ．コリ溶解物有りおよび無しでの、より小さいタンパク質アレイを示す。
【図１４Ａ】未処理のおよびワクチニアで免疫されたマウスおよびヒトの血清についてのワクチニアドットブロットの結果を示す。
【図１４Ｂ】未処理のおよびワクチニアで免疫されたマウスおよびヒトの血清についてのワクチニアドットブロットの結果を示す。
【図１５】実施例８に記載のように、タンパク質配列が１０の区分に分割され、隣接基または複数の隣接基とのそれぞれの重複が２０アミノ酸ずつである、ワクチニアのＨ３Ｌエンベロープタンパク質のスキャンを示す。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望のヌクレオチド配列のための発現系を得る方法であって、
形質転換された細胞の混合物より前記発現系を抽出することを含み、
前記混合物は、個別のクローンを単離することなく培養物より前記細胞を収集することにより得られたものであり、前記培養物は、前記ヌクレオチド配列のための発現系を用いてまたは前記発現系の成分を用いて、宿主細胞を形質転換することにより得られたものである
前記方法。
【請求項２】
前記発現系がプラスミド上に含まれている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プラスミドが、前記ヌクレオチド配列および線状プラスミドを含む核酸の前記細胞中の相同的組み換えにより得られる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１つのアダプターを含み、前記アダプターは、前記線状プラスミドの少なくとも１つの末端に相補的でありおよび前記ヌクレオチド配列の少なくとも１つの末端に相補的であるポリヌクレオチドであり、それによって前記ヌクレオチド配列の前記線状プラスミドへの連結の方向性を制御する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
２つのアダプターが使用され、前記アダプターは、前記線状プラスミドの第１末端におよび前記ヌクレオチド配列の第１末端に相補的な第１アダプターでありならびに前記線状プラスミドの第２末端におよび前記ヌクレオチド配列の第２末端に相補的な第２アダプターである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ヌクレオチド配列が、プロモーター、終止配列または融合タグもしくはシグナルペプチドをコードする配列に機能可能に連結されている、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記融合タクがポリヒスチジンタグ、血球凝集素タグ、ビオチン−リガーゼ認識部位、ＧＳＴタグ、蛍光タンパク質タグ、ＦＬＡＧタグまたはリンカー配列である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
所望のヌクレオチド配列のための発現系を含むプラスミドを調製する方法であって、
前記ヌクレオチド配列および線状プラスミドを含む核酸により宿主細胞を形質転換することを含み、前記核酸および線状プラスミドの量は１００万細胞当り核酸１ｎｇから１０ｎｇであり、
前記核酸および線状プラスミドはＰＣＲにより増幅されて、前記線状プラスミドと前記核酸の組み換えを達成する形質転換細胞が得られ、前記発現系を含む前記プラスミドがもたらされる、前記方法。
【請求項９】
前記細胞の少なくとも１千万が使用される、請求項８の方法。
【請求項１０】
前記細胞が、化学的に形質転換受容性でありおよび／またはＥ．コリ（E.coli）もしくは酵母を含む、請求項８の方法。
【請求項１１】
前記Ｅ．コリがＪＣ８６７９、ＴＢ１、ＤＨ５アルファ、ＤＨ５、ＨＢ１０１、ＪＭ１０１、ＪＭ１０９およびＬＥ３９２からなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記形質転換細胞由来の前記発現系を含む前記プラスミドを抽出することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記ヌクレオチド配列を発現させて、細胞由来系においてコードされたタンパク質またはペプチドを得ることをさらに含む、請求項１または８に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞由来系が無細胞系である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記無細胞系が微生物、真核細胞または小麦胚芽由来の転写／翻訳系である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞由来系が細胞に内在的である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞が抗原提示細胞（ＡＰＣ）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＡＰＣがマクロファージ、樹状細胞およびＢ細胞からなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記発現が多様なヌクレオチド配列の発現であり、多様なタンパク質またはペプチドが得られる請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記多様なタンパク質またはペプチドが感染病原体のゲノムによりコードされている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記多様なタンパク質またはペプチドが、タンパク質／ペプチドのアレイになるように、検査表面上にて用いられる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記多様性が、前記感染病原体の全ゲノムの少なくとも５０％を表すタンパク質／ペプチドのアレイをもたらす、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記多様性が、前記病原体の全ゲノムの少なくとも９８％を表すペプチドおよび／またはタンパク質のアレイをもたらす、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記感染病原体がワクチニア、フランシセラ・ツラレンシス（Francisella tularensis）、ヒトパピローマウィルス、西ナイルウィルス、バークホリデリア・シュードマレイ（Burkholderia pseudomallei）、マイコバクテリウム・ツベルクロシス（Mycobacterium tuberculosis）またはプラスモジウム・ファシパルム（Plasmodium faciparum）である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
請求項２１の方法により調製されたペプチド／タンパク質のアレイ。
【請求項２６】
タンパク質／ペプチドアレイであって、前記アレイは感染病原体ゲノムの少なくとも５０％を表すタンパク質およびペプチドを含み、前記アレイは少なくとも１００の異なるタンパク質またはペプチドを含む、前記アレイ。
【請求項２７】
前記感染病原体の全ゲノムの少なくとも９８％を表す、請求項２５に記載のタンパク質／ペプチドアレイ。
【請求項２８】
前記感染病原体がワクチニア、フランシセラ・ツラレンシス（Francisella tularensis）、ヒトパピローマウィルス、西ナイルウィルス、バークホリデリア・シュードマレイ（Burkholderia pseudomallei）、プラスモジウム・ファシパルム（Plasmodium faciparum）またはマイコバクテリウム・ツベルクロシス（Mycobacterium tuberculosis）である、請求項２６に記載のタンパク質／ペプチドのアレイ。
【請求項２９】
免疫活性を有するタンパク質またはペプチドを同定する方法であって、
請求項２６のアレイまたは請求項１３の方法により得られたタンパク質もしくはペプチドまたは請求項２０の多様なタンパク質もしくはペプチドを、対象の免疫成分の少なくとも１つを含む試料と接触させることを含み、
前記対象は前記感染病原体に暴露されたことがあり、
前記アレイのタンパク質またはペプチドと免疫成分との相互作用により、前記タンパク質またはペプチドが免疫活性を有すると同定される、前記方法。
【請求項３０】
前記感染病原体が弱毒化型である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記免疫活性が液性活性であり、前記試料が前記対象の血清または血漿を含み、前記相互作用が抗体との相互作用である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記血清または血漿が、抗体とは免疫反応性であるが感染病原体とは反応性でない組成物により前処理される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
かくして同定されたペプチドまたはタンパク質を、前記対象由来のＴ細胞の少なくとも１つの型を含む試料と接触させることをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記免疫活性が細胞性活性であり、前記試料が前記対象由来のＴ細胞の少なくとも１つの型を含む請求項２９の方法。
【請求項３５】
前記免疫活性が少なくとも１種のサイトカインの形成により検出されるおよび／または前記タンパク質がＡＰＣ内で発現される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
（ａ）形質転換された細胞の混合物由来の発現系を抽出することにより得られた発現系由来のヌクレオチド配列を発現させることを含む方法により調製された（前記混合物は、個別のクローンの単離を行わずに培養物より前記細胞を収穫することにより得られたものであり、前記培養物は、前記ヌクレオチド配列のための発現系を用いてまたは前記発現系の成分を用いて、宿主細胞を形質転換することにより得られたものである。）、または
（ｂ）前記ヌクレオチド配列および線状プラスミドを含む核酸を用いて宿主細胞を形質転換することを含む方法により得られた発現系由来のヌクレオチド配列を発現させることを含む方法により調製された（前記核酸および線状プラスミドの量はそれぞれ百万細胞当り核酸１ｎｇから１０ｎｇである。）、
請求項２６に記載のアレイ。
【請求項３７】
ワクチニアタンパク質ＡＴＩ遺伝子座タンパク質、Ａ１０Ｌ、Ａ１１Ｒ、Ａ１３Ｌ、Ａ３３Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｄ８Ｌ、Ｄ１３Ｌ、Ｆ１３Ｌ、Ｈ３Ｌ、Ｈ５Ｒ、Ａ２６Ｌ、Ａ２７Ｌ、Ｅ３Ｌ、Ｌ４Ｒ、Ｈ７Ｒ、Ａ１７Ｌ、Ａ３Ｌ、Ａ４Ｌ、Ｄ１１Ｌ、Ｈ６Ｒ、Ｋ２Ｌ、Ｎ１Ｌ、Ａ４１Ｌ、Ａ４７Ｌ、Ｂ２Ｒ、Ｄ１０Ｒ、Ｅ１Ｌ、Ｆ２Ｌ、Ｆ９Ｌ、Ｇ５Ｒ、Ｇ７Ｌ、Ｈ７Ｒ、Ｉ１Ｌ、Ｌ５ＲおよびＯ２Ｌならびにこれらに実質的に相同なタンパク質およびこれらの免疫学的に活性な断片からなる群より選択される３種またはそれ以上の免疫反応性タンパク質またはペプチドを含んでいる免疫学的組成物。
【請求項３８】
前記免疫反応性タンパク質またはペプチドが、ＡＴＩ遺伝子座タンパク質、Ａ１０Ｌ、Ａ１１Ｒ、Ａ１３Ｌ、Ａ３３Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｄ８Ｌ、Ｄ１３Ｌ、Ｆ１３Ｌ、Ｈ３Ｌ、Ｈ５Ｒ、Ａ２６Ｌ、Ａ２７Ｌ、Ｅ３Ｌ、Ｌ４Ｒ、Ｈ７Ｒ、Ａ１７Ｌ、Ａ３Ｌ、Ａ４Ｌ、Ｄ１１Ｌ、Ｈ６Ｒ、Ｋ２Ｌ、Ｎ１Ｌ、Ａ４１Ｌ、Ａ４７Ｌ、Ｂ２Ｒ、Ｄ１０Ｒ、Ｅ１Ｌ、Ｆ２Ｌ、Ｆ９Ｌ、Ｇ５Ｒ、Ｇ７Ｌ、Ｈ７Ｒ、Ｉ１Ｌ、Ｌ５ＲおよびＯ２Ｌならびにこれらに実質的に相同なタンパク質およびこれらの免疫学的に活性な断片からなる群より選択される、請求項３７に記載の免疫学的組成物。
【請求項３９】
前記免疫反応性タンパク質またはペプチドが、ＡＴＩ遺伝子座タンパク質、Ａ１０Ｌ、Ａ１１Ｒ、Ａ１３Ｌ、Ａ３３Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｄ８Ｌ、Ｄ１３Ｌ、Ｆ１３Ｌ、Ｈ３Ｌ、Ｈ５Ｒ、Ａ２６Ｌ、Ａ２７Ｌ、Ｅ３Ｌ、Ｌ４Ｒ、Ｈ７Ｒ、Ａ１７Ｌ、Ａ３Ｌ、Ａ４Ｌ、Ｄ１１Ｌ、Ｈ６Ｒ、Ｋ２ＬおよびＮ１Ｌならびにこれらにほぼ相同なタンパク質およびこれらの免疫学的に活性な断片からなる群より選択される、請求項３８に記載の免疫学的組成物。
【請求項４０】
前記免疫反応性タンパク質またはペプチドが、ＡＴＩ遺伝子座タンパク質、Ａ１０Ｌ、Ａ１１Ｒ、Ａ１３Ｌ、Ａ３３Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｄ８Ｌ、Ｄ１３Ｌ、Ｆ１３Ｌ、Ｈ３Ｌ、Ｈ５Ｒ、Ａ２６Ｌ、Ａ２７Ｌ、Ｅ３ＬおよびＬ４Ｒならびにこれらに実質的に相同なタンパク質およびこれらの免疫学的に活性な断片からなる群より選択される、請求項３９に記載の免疫学的組成物。
【請求項４１】
前記免疫反応性タンパク質またはペプチドが、Ａ１０Ｌ、Ａ１１Ｒ、Ａ１３Ｌ、Ａ３３Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｄ８Ｌ、Ｄ１３Ｌ、Ｆ１３Ｌ、Ｈ３ＬおよびＨ５Ｒならびにこれらに実質的に相同なタンパク質およびこれらの免疫学的に活性な断片からなる群より選択される、請求項３９に記載の免疫学的組成物。
【請求項４２】
ＡＴＩ遺伝子座タンパク質、Ａ１０Ｌ、Ａ１３Ｌ、Ｈ３Ｌ、Ｄ１３Ｌ、Ａ１１ＲおよびＡ１７Ｒならびにこれらに実質的に相同なタンパク質および免疫学的に活性な断片からなる群より選択される少なくとも１種の免疫反応性ワクチニアタンパク質を含み、前記ワクチニアタンパク質は１種またはそれ以上の追加の免疫反応性ワクチニアタンパク質との混合物中に場合によりあってよい、免疫学的組成物。
【請求項４３】
ＡＴＩ遺伝子座タンパク質、Ａ１０Ｌ、Ａ１３Ｌ、Ａ２６Ｌ、Ａ５６Ｒ、Ｄ８Ｌ、Ｄ１３Ｌ、Ｆ１３Ｌ、Ｈ５ＲおよびＨ３Ｌならびにこれらに実質的に相同なタンパク質およびこれらの免疫学的に活性な断片からなる群より選択され、前記ワクチニアタンパク質は１種またはそれ以上の追加の免疫反応性ワクチニアタンパク質との混合物中に場合によりあってよい、少なくとも１種の免疫反応性ワクチニアタンパク質を含んでいる免疫学的組成物。
【請求項４４】
ワクチニアタンパク質がＡＴＩ遺伝子座タンパク質、Ａ１０Ｌ、Ｄ１３ＬおよびＨ３Ｌならびにこれらに実質的に相同なタンパク質およびこれらの免疫学的に活性な断片からなる群より選択される、請求項４３に記載の免疫学的組成物。
【請求項４５】
ワクチニアタンパク質Ｈ３Ｌ、ならびに
ワクチニアタンパク質Ａ１０Ｌ、Ｄ１３Ｌ、Ａ１１Ｒ、Ａ１３Ｒ、Ａ３３Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｄ１３Ｌ、Ｈ５Ｒ、Ｄ８Ｒ、Ｆ１３Ｌ、Ｈ５Ｒ、Ａ１７Ｒ、ＡＴＩ遺伝子座タンパク質およびＡ２６Ｌならびにこれらに実質的に相同なタンパク質およびこれらの免疫学的に活性な断片からなる群より選択される２種またはそれ以上の免疫反応性タンパク質またはペプチド
を含んでいる免疫学的組成物。
【請求項４６】
ワクチニアタンパク質ＡＴＩ遺伝子座タンパク質またはこれらに実質的に相同なタンパク質およびこれらの免疫学的に活性な断片を含んでいる免疫学的組成物。
【請求項４７】
ワクチニアタンパク質Ａ１０Ｌ、Ｄ１３ＬおよびＨ３Ｌまたはこれらに実質的に相同なタンパク質およびこれらの免疫学的に活性な断片を含んでいる免疫学的組成物。
【請求項４８】
ワクチニアタンパク質Ａ１０Ｌ、Ｄ１３Ｌ、Ｈ３Ｌ、Ａ１１Ｒ、Ａ１３Ｌ、Ｈ５Ｒ、Ａ１７Ｒならびにこれらに実質的に相同なタンパク質およびこれらの免疫学的に活性な断片からなる群より選択される２種またはそれ以上の免疫反応性タンパク質またはペプチドを含んでいる免疫学的組成物。
【請求項４９】
遺伝子座ＰＦＢ０３００ｃ、ＰＦＥ１５９０ｗ、ＰＦＢ０９１５ｗ、ＰＦＢ０３１０ｃ、ＰＦＤ０３１０ｗ、ＰＦ７＿０１２８、ＰＦ１１＿０５０９、ＰＦ１０＿０３５６およびＰＦ１０＿０３４３に伴われているマラリアタンパク質ならびにこれらに実質的に相同なタンパク質およびこれらの免疫学的に活性な断片からなる群より選択される１種またはそれ以上の免疫反応性たんぱく質またはペプチドを含んでいる免疫学的組成物。
【請求項５０】
ＦＴＴ１２６９、ＦＴＴ１７４７、ＦＴＴ１６９６、ＦＴＴ０９７５、ＦＴＴ０９０１、ＦＴＴ１４７７、ＦＴＴ０４７２およびＦＴＴ０２６４によりコードされたフランシセラ・ツラレンシス（Flancisella tularensia）タンパク質およびフランシセラタンパク質ＤｎａＫ、ＴＭタンパク質、ＨＳＰ６０および１７ｋｄタンパク質ならびにこれらに実質的に相同なタンパク質およびこれらの免疫学的に活性な断片からなる群より選択される１種またはそれ以上の免疫反応性タンパク質またはペプチドを含んでいる免疫学的組成物。
【請求項５１】
ワクチニアタンパク質Ａ１０Ｌ、Ｄ１３Ｌ、Ｈ３Ｌ、Ａ１１Ｒ、Ａ１３Ｒ、Ａ３３Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｄ１３Ｌ、Ｈ５Ｒ、Ｄ８Ｒ、Ｆ１３Ｌ、Ｈ５Ｒ、Ａ１７Ｒ、ＡＴＩ遺伝子座タンパク質、Ａ２６Ｌならびにこれらに実質的に相同なタンパク質およびこれらの免疫学的に活性な断片からなる群より選択される１種またはそれ以上の免疫反応性タンパク質またはペプチドを含んでいる組成物。
【請求項５２】
結核菌遺伝子Ｒｖ０４４０、Ｒｖ０４６７、Ｒｖ０４７５、Ｒｖ０５３８、Ｒｖ０６７４、Ｒｖ０６８５、Ｒｖ０７９８ｃ、Ｒｖ０９１６ｃ、Ｒｖ０９３４、Ｒｖｌ８０１、Ｒｖｌ８６０、Ｒｖｌ９２６ｃ、Ｒｖｌ９８０ｃ、Ｒｖｌ９８４ｃ、Ｒｖ２００７ｃ、Ｒｖ２０３１ｃ、Ｒｖ２１９０ｃ、Ｒｖ２２２０、Ｒｖ２３７６ｃ、Ｒｖ２３８９ｃ、Ｒｖ２４４６ｃ、Ｒｖ２７４４ｃ、Ｒｖ２８７３、Ｒｖ２８７５、Ｒｖ２８７５、Ｒｖ３２７０、Ｒｖ３３３０、Ｒｖ３３３３ｃ、Ｒｖ３４１８ｃ、Ｒｖ３７６３、Ｒｖ３８０３ｃ、Ｒｖ３８２８ｃ、Ｒｖ３８４６、Ｒｖ３８７４、Ｒｖ３８７５およびＲｖ３８８１ｃによりコードされたタンパク質またはペプチドからなる群より選択される３種またはそれ以上の免疫反応性のタンパク質またはペプチドを含んでいる免疫学的組成物。
【請求項５３】
前記ペプチドまたはタンパク質が、マイコバクテリウム・ツベルクロシス（Mycobacterium tuberculosis）遺伝子Ｒｖ０４４０、Ｒｖｌ８０１、Ｒｖ２０３１ｃ、Ｒｖ２３７６ｃ、Ｒｖ２８７５およびＲｖ３８７５によりコードされたペプチドからなる群より選択される、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
前記ペプチドまたはタンパク質が、マイコバクテリウム・ツベルクロシス（Mycobacterium tuberculosis）遺伝子Ｒｖ０４４０、Ｒｖ０４７５、Ｒｖｌ８０１、Ｒｖｌ９８０ｃ、Ｒｖ２２２０、Ｒｖ２８７３、Ｒｖ２８７５、Ｒｖ３２７０、Ｒｖ３７６３およびＲｖ３８７５によりコードされたペプチドからなる群より選択される、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５５】
Ｐ．ファルシパルム（Ｐ．falciparum）遺伝子ＰＦＢ０９１５ｗ、ＰＦＢ０３１０ｃ、ＰＦＢ０３００ｃ、ＰＦＢ０３０５ｃ、ＰＦＬ２４１０ｗ、ＰＦＣ０２１０ｃ、ＰＦＤ０３１０ｗ、ＰＦＤ０３１０ｗ、ＰＦ１３＿０１９７、ＰＦ１０＿０１３８、ＰＦＩ１５２０ｗ、ＰＦＩ１５２０ｗ、ＰＦ１１＿０３４４、ＰＦ１３＿００１２、ＰＦＤ０３１０ｗ、ＰＦ１１＿０３５８、ＰＦ０７＿００２９、ＰＦＬ１６０５ｗ、ＰＦＥ１５９０ｗ、ＭＡＬ６Ｐ１．２０１、ＰＦＤ０２３５ｃ、ＰＦ１３＿０２０１、ＰＦ１３＿０２６７、ＰＦ０７＿０１２８、ＰＦ１０＿０３４３、ＰＦ１０＿０３４３、ＰＦＩ１５２０ｗ、ＰＦＩ０５８０ｃ、ＰＦ０７＿００２０、ＰＦＥ０５２０ｃ、ＭＡＬ７Ｐ１．２９およびＰＦ１０＿０２６０によりコードされたタンパク質またはペプチドからなる群より選択される３種またはそれ以上の免疫反応性タンパク質またはペプチドを含んでいる免疫学的組成物。
【請求項５６】
Ｐ．ファルシパルム（Ｐ．falciparum）遺伝子ＰＦＢ０９１５ｗ、ＰＦＢ０３１０ｃ、ＰＦＢ０３００ｃ、ＰＦＢ０３０５ｃ、ＰＦＬ２４１０ｗ、ＰＦＣ０２１０ｃ、ＰＦＤ０３１０ｗ、ＰＦＤ０３１０ｗ、ＰＦ１３＿０１９７、ＰＦ１０＿０１３８、ＰＦＩ１５２０ｗ、ＰＦＩ１５２０ｗ、ＰＦ１１＿０３４４、ＰＦ１３＿００１２、ＰＦＤ０３１０ｗ、ＰＦｌｌ＿０３５８、ＰＦ０７＿００２９、ＰＦＬ１６０５ｗ、ＰＦＥ１５９０ｗおよびＭＡＬ６Ｐ１．２０１によりコードされるタンパク質またはペプチドからなる群より選択される３種またはそれ以上のペプチドまたはタンパク質を含んでいる、請求項５５に記載の免疫学的組成物。
【請求項５７】
請求項３７から５６のいずれか１項のタンパク質またはペプチドの１種またはそれ以上をコードするヌクレオチド配列を含む１種またはそれ以上の単離された核酸分子を含んでいる免疫学的組成物。
【請求項５８】
請求項３７から５６のいずれか１項の組成物の有効量を対象に投与することを含んでいる、前記患者を感染から保護する方法。
【請求項５９】
請求項５７の組成物の有効量を対象に投与することを含んでいる、前記対象を感染から保護する方法。
【請求項６０】
請求項３７から５６のいずれか１項のタンパク質またはペプチドの少なくとも１つに特異的に結合するモノクロナール抗体。
【請求項６１】
請求項６０のモノクロナール抗体を含んでいる免疫学的組成物。
【請求項６２】
請求項６１の免疫学的組成物の有効量を対象に投与することを含んでいる、対象を受動的に免疫する方法。
【請求項６３】
患者の免疫成分と検査材料との相互作用を検出する方法であって、
前記免疫材料は免疫成分を含む患者に関する追加材料を含む第１の試料中に含まれていて、
前記患者より得られる第２の試料を前記追加材料により処理し、それにより、前記第２の試料を第１の試料により処理する前に、前記追加材料に対する相互作用を遮断することを含んでいる、前記検出方法。
【請求項６４】
前記追加材料が細胞の成分を含み、前記検査材料が前記細胞の細胞由来系を使用して生産されたものである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記検査材料が感染病原体由来のタンパク質またはペプチドであり、前記対象が前記感染病原体に暴露されたことがある、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
対象における感染病原体または病状の同定方法であって、前記対象が特徴的なタンパク質またはペプチドに対する抗体を有するかどうかを決定するために、感染病原体または病状に特徴的な免疫活性を有する少なくとも２種のタンパク質またはペプチドを使用することを含んでいる、前記同定方法。
【請求項６７】
前記免疫活性を有する特徴的なタンパク質またはペプチドが請求項２９の方法により同定されたものである、請求項６６に記載の方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４Ａ】

【図１４Ｂ】

【図１５】

【公表番号】特表２００８−５０５１０６（Ｐ２００８−５０５１０６Ａ）
【公表日】平成２０年２月２１日（２００８．２．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１９４５０（Ｐ２００７−５１９４５０）
【出願日】平成１７年７月１日（２００５．７．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２３３５２
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８８４９２
【国際公開日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【出願人】（３０３０２２６１７）ザ・リージエンツ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・カリフオルニア (4)
【Ｆターム（参考）】