ハイブリダイゼーション装置及び方法
【課題】検体濃度が低い場合でもハイブリダイゼーション効率を高めることができる装置および方法を提供すること。
【解決手段】本発明ハイブリダイゼーション装置１、検体液を収容する検体液収容部８と、検体液収容部の深さ方向中間位置あるいはそれより下方に設けられバイオチップ１４を水平に保持するバイオチップ取付部と、検体液収容部の両側の外方に対向して設けられた第１および第２のバッファ液収容部１０、１２と、検体液収容部と第１および第２のバッファ液収容部のそれぞれとを仕切る半透膜４、６と、第１および第２のバッファ液収容部のそれぞれに配置された第１の電極対１８、２０とを備えている。
【解決手段】本発明ハイブリダイゼーション装置１、検体液を収容する検体液収容部８と、検体液収容部の深さ方向中間位置あるいはそれより下方に設けられバイオチップ１４を水平に保持するバイオチップ取付部と、検体液収容部の両側の外方に対向して設けられた第１および第２のバッファ液収容部１０、１２と、検体液収容部と第１および第２のバッファ液収容部のそれぞれとを仕切る半透膜４、６と、第１および第２のバッファ液収容部のそれぞれに配置された第１の電極対１８、２０とを備えている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概略的には、ハイブリダイゼーション装置および方法に関し、詳細には、電気泳動を利用したハイブリダイゼーション装置および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多数遺伝子の一括発現解析を可能とするＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡチップ法）と呼ばれる新しい分析法が開発され、注目を集めている。このＤＮＡマイクロアレイ法は、核酸−核酸間ハイブリダイゼーション反応に基づいて核酸検出・定量を行う手法であり、バイオチップと呼ばれる、平面基板上に多数のＤＮＡ断片（ＤＮＡプローブ）を高密度に固定したものが用いられる。
【０００３】
ＤＮＡマイクロアレイ法では、例えば、研究対象細胞の発現遺伝子等の被験試料（検体）を平面基板上のＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションさせ、互いに相補的な核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）同士を結合させ、その箇所を蛍光色素標識等により高解像度解析装置で高速に読みとる。
このような操作により、被験試料（検体）中の各遺伝子の量を迅速に推定できるため、この方法の導入により、検体の微量化と、その検体を、再現性よく、多量・迅速・系統的に分析、定量することが可能となった（特許文献１参照）。
【０００４】
バイオチップを用いたハイブリダイゼーションを効率よく行うためには、プローブと検体との接触効率を上げることが必要である。このため、検体量が非常に少ない場合には、効率よくプローブと検体とを反応させるべく、バイオチップに接触させた検体液を攪拌する、検体液を濃縮するなどの手法が採られる。
【０００５】
検体液を攪拌して反応効率を向上させる技術としては、ビーズを混合した検体液をバイオチップに接触させた後、カバーガラスなどを用いて検体液をシーリングし、バイオチップを回転させることにより、ビーズを重力方向に落下させることで検体液を攪拌する方法（特許文献２参照）、微粒子や気泡を検体液中で動かし攪拌する方法が知られている（特許文献３参照）。
【０００６】
また、核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）が電解質溶液中で負の電荷を持つという特徴を利用して、核酸検体を溶液中で電気泳動により強制的に移動させながら基盤に固定化したＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションさせ、検体を検出する方法（特許文献４参照）や、核酸検体をゲル内で電気泳動により強制的に移動させながら、ゲル内に固定されたＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションさせ、検体を検出する核酸検出装置及び核酸検出方法も開発されている。（特許文献５参照）
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０００−２７０８７７号公報
【特許文献２】特開２００３−３３９３７５号公報
【特許文献３】ＷＯ０５/０９０９９７
【特許文献４】特許第４１２２８５４号
【特許文献５】特許第３８２９４９１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、検体液を攪拌する技術や電気泳動技術を用いても、プローブと検体とのハイブリダイゼーションが不十分となる場合があった。また、装置等の都合で検体液の量を増やさざるを得ない場合や検体そのものの量が非常に少ない場合には、検体液中の検体濃度が低くなるため検体のプローブへの衝突頻度が小さくなり、十分なハイブリダイゼーションを達成できないことがある。
【０００９】
本発明は、このような従来技術の問題を解決するためになされたものであり、検体濃度が低い場合でもハイブリダイゼーション効率を高めることができる装置および方法を提案することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明によれば、
ハイブリダイゼーション装置であって、
検体液を収容する検体液収容部と、
前記検体液収容部の深さ方向中間位置あるいはそれより下方に設けられバイオチップを水平に保持するバイオチップ取付部と、
前記検体液収容部の両側の外方に対向して設けられた第１および第２のバッファ液収容部と、
前記検体液収容部と前記第１および第２のバッファ液収容部のそれぞれとを仕切る半透膜と、
前記第１および第２のバッファ液収容部のそれぞれに配置された第１の電極対と、を備えている、
ことを特徴とするハイブリダイゼーション装置が提供される。
【００１１】
このような構成によれば、検体液収容部に収容された生体関連物質等の検体は、一対の電極間での電圧印加により、一方の半透膜側に電気泳動されるが、半透膜を透過することができないため、この半透膜近傍には、濃縮された検体が偏在する。
次いで、電極の極性を反転させて一対の電極間に電圧を印加することで、半透膜近傍で濃縮された検体が、重力によってバイオチップに表面に向かって短時間で沈降し、その後バイオチップの表面に沿って、他方の半透膜側に電気泳動される。この結果、検体とバイオチップ内のプローブとの接触効率が向上する。
【００１２】
さらに、極性を反転させて電気泳動を行う作業を繰り返すことで、濃縮された検体が、バイオチップ表面上を繰り返し移動し、ハイブリダイゼーション効率がより向上する。
【００１３】
本発明の他の好ましい態様によれば、前記バイオチップ取付部が、前記検体液収容部の底部に設けられている。
本発明の他の好ましい態様によれば、前記バイオチップ取付部が、前記検体液収容部の深さ方向中間位置に設けられている。
【００１４】
本発明の他の好ましい態様によれば、前記検体液収容部の上下の外方に対向して設けられた第３および第４のバッファ液収容部と、前記検体液収容部と前記第３および第４のバッファ液収容部のそれぞれとを仕切る半透膜と、前記第３および第４のバッファ液収容部のそれぞれに配置された第２の電極対と、を備えている。
【００１５】
このような構成によれば、深さ方向に貫通孔を有するバイオチップを使用し、濃縮された検体を、バイオチップ表面上を繰り返し移動させた後、第２の電極対に電圧印加することにより、検体を上下方向に移動させてバイオチップの貫通孔を通過させ、さらにハイブリダイゼーション効率を上げることができる。
【００１６】
本発明の他の態様によれば、
バイオチップに固定された第１の生体関連物質と検体液中の第２の生体関連物質とをハイブリダイゼーションさせるハイブリダイゼーション方法であって、
前記バイオチップを検体液中に水平に配置するステップと、
前記バイオチップの表面に沿った第１の方向に沿って前記検体液に電圧を印加し、前記バイオチップの一側部側で前記検体液中の検体を濃縮するステップと、
前記第１の方向とは逆方向に前記検体液に電圧を印加するステップと、を備えている、
ことを特徴とするハイブリダイゼーション方法が提供される。
【００１７】
このような構成によれば、検体液収容部に収容された生体関連物質等の検体は、一対の電極間での電圧印加により、一方の半透膜側に電気泳動されるが、半透膜を透過することができないため、この半透膜近傍には、検体が濃縮された検体液が偏在する。
次いで、電極の極性を反転させて一対の電極間に電圧を印加することで、一方の半透膜の近傍で濃縮された検体が、重力によってバイオチップの表面に向かって短時間で沈降する。その後バイオチップ表面に沿って、他方の半透膜側に電気泳動される。したがって、検体とバイオチップ内のプローブとの接触効率が向上する。
【００１８】
本発明の他の好ましい態様によれば、前記バイオチップの表面に直交する方向に電圧を印加するステップをさらに備えている。
【００１９】
このような構成によれば、深さ方向に貫通孔を有するバイオチップを使用し、濃縮された検体が、バイオチップ表面上を繰り返し移動した後、バイオチップの表面に直交する方向に電圧印加することにより、バイオチップの貫通孔を通して検体を電気泳動によって通過させ、さらにハイブリダイゼーション効率を上げることができる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、検体液を高度に濃縮することにより、生体関連物質プローブと検体との接触効率を上げ、ハイブリダイゼーション効率を上げることができる。また、それによりハイブリ時間を短縮することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】第１の実施形態のハイブリダイゼーション装置の模式的な縦断面図である。
【図２】本発明の実施形態のハイブリダイゼーション装置で使用されるバイオチップの一例の模式図である。
【図３】本発明の実施形態のハイブリダイゼーション装置で使用されるバイオチップの他の例の模式図である。
【図４】第２の実施形態のハイブリダイゼーション装置の模式的な縦断面図である。
【図５】第３実施形態のハイブリダイゼーション装置の模式的な縦断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明の好ましい実施形態のハイブリダイゼーション装置およびハイブリダイゼーション方法について詳細に説明する。まず、図１に沿って、本発明の第１の実施形態のハイブリダイゼーション装置の構造について説明する。図１は、第１の実施形態のハイブリダイゼーション装置１の模式的な縦断面図である。
【００２３】
本実施形態のハイブリダイゼーション装置１は、バイオチップに固定されているＤＮＡ等の生体関連物質プローブ（第１の生体関連物質）に、検体液に含まれる検体（第２の生体関連物質）をハイブリダイゼーションさせる装置である。
【００２４】
図１に示されているように、本発明のハイブリダイゼーション装置１は、直方体形状を有する本体２を備えている。本体２は、直方体状の内部空間を有し、この内部空間の左右両側部には、第１および第２の半透膜４、６が、上下方向に延びるように配置され、内部空間を中央の検体液収容部８と、左右の第１および第２のバッファ液収容部１０、１２に仕切っている。すなわち、第１および第２のバッファ液収容部１０、１２は、中央の検体液収容部８の側部外方に対向して設けられ、検体液収容部８と第１の半透膜４および第２の半透膜６で仕切られている。
【００２５】
また、検体液収容部８の底部には、薄板状のバイオチップ１４が水平状態で取付けられるバイオチップ取付部１６が設けられている。バイオチップ取付部１６は、バイオチップ１４を検体液収容部８の底部に水平に保持することができれば、その構造は、特に限定されるものではない。
【００２６】
検体液中の検体を重力で落下させてバイオチップ上に濃縮するため、バイオチップは検体液収容部８の深さ方向中間位置あるいはそれより下方に取り付けるのが好ましい。したがって、バイオチップ取付部１６は、検体液収容部８の深さ方向の中間位置あるいはそれより下方に、本実施形態では、検体液収容部８の底部に設けられている。
【００２７】
バイオチップ取付部１６の具体的構造としては、バイオチップ１４が浮き上がらないようにチップの四隅を固定する構成や、半透膜を支持する枠などと一体になって検体液収容部８の底部にバイオチップ１４を固定する構成などがあげられるが、バイオチップ１４を検体液収容部８の底部に水平に保持することができれば、特に限定されるものではない。また、バイオチップ１４を本体２の底部に直接貼り付けるバイオチップ取付部であっても良い。
【００２８】
さらに、第１のバッファ液収容部１０および第２のバッファ液収容部１２内には、それぞれ第１および第２の電極１８、２０が配置されている。それぞれ電極１８、２０は、電源２２と接続され、電圧の印加、および極性の切り換えが可能とされている。ハイブリダイゼーション装置１は、絶縁材料２４によって外部と絶縁されている。
【００２９】
第１の半透膜４および第２の半透膜６は、後述する検体液収容部８に収容するＤＮＡ等の検体を透過させず、検体液中の水や塩類のような低分子は透過させる膜である。第１の半透膜４および第２の半透膜６の材料は、使用する検体、検体液の溶媒の種類に応じて適宜選択されるが、一般に、検出しようとしている検体より小さいカットオフ分子量を示す膜材料が選択される
【００３０】
具体的には、第１の半透膜４および第２の半透膜６は、ゼラチン膜、アセテート膜、アクリルアミド系やポリビニルアルコール等のハイドロゲル、再生セルロース膜等の中から選択される。機械的強度、取り扱い、入手の容易性等の点で、アセテ−ト膜が好ましい。
【００３１】
検体液収容部８は、検体液を収容する空間である。容積は小さいほうが好ましいが、検体を濃縮する半透膜を両側に設置するため、１から５ｍｍ程度の厚さ（深さ）であることが好ましい。
【００３２】
第１のバッファ液収容部１０および第２のバッファ液収容部１２は、バッファ溶液が充填されそのバッファ溶液中に電極１８、２０が配置される空間である。このようなバッファ液収容部１０、１２を設けることで、バイオチップ１４と電極１８、２０を隔離して、バイオチップが電極近傍のｐＨ上昇により劣化したり、反応阻害の影響を受けないようにすることができる。
【００３３】
また、電極近傍で発生する気体によって、バイオチップに印加される電場が不均一になることを防止することができる。バッファ溶液槽の体積及び形状は特に限定されず任意に選択することができる。
【００３４】
バッファ溶液の組成としては、一般的に生体関連物質のハイブリダイズ反応に利用される溶液組成が上げられ、ＳＳＣやＴＮ、ＴＢＥ溶液やＴＡＥ溶液などが挙げられる。
【００３５】
電極１８、２０の大きさ、形状および配置は、検体液収容部８とバイオチップ１４に均一の電圧を印加することができるものであれば特に限定されないが、例えば、平板上または平板メッシュ状の形態であることが好ましい。
【００３６】
電極１８、２０に用いられる材料としては、グラファイト、白金、金、金属に金メッキした材料が挙げられる。電極は、絶縁体に固定され、且つ該絶縁体が透明材料であることが好ましい。そのような例としては、ガラス、ポリエチレンテレフタレートフィルムなどの透明基板に、酸化スズ、ＩＴＯ、金または白金等を主たる構成材料とする薄膜またはその積層体が部分的に形成された透明電極が挙げられる。
【００３７】
次に、図２に沿って、ハイブリダイゼーション装置１で使用されるバイオチップ１４（ゲル保持チップ）の構成を説明する。図２は、バイオチップ１４の模式図である。
バイオチップ１４は、矩形の薄板である基板２６に、厚さ方向に貫通する多数の貫通孔２６ａが形成された構造を有している。各貫通孔２６ａの周縁には、環状断面の中空繊維２８が配置され、その内部空間に核酸、タンパク質等の生体関連物質プローブが固定化された高分子ゲル３０が保持されている。
【００３８】
基板２６の寸法は、各辺の長さが数ミリないし数センチ、厚さが数十ミクロンから１ｍｍ程度の範囲である。基板２６の材料は、ガラス、セラミック、プラスチックなどが好ましいが、特に限定されない。
【００３９】
本実施形態で使用するバイオチップ１４は特許文献１に記載されているようなバイオチップであり、多数中空繊維を樹脂で一体化して柱状の中空繊維配列体とし、中空繊維の中空部に生体関連物質プローブを高分子ゲル３０と共に注入して高分子ゲル３０内に固定化した後、この中空繊維配列体を中空繊維の長手方向と交叉する方向にスライスすることによって製造されている。
【００４０】
しかしながら、中空繊維のゲル保持体を用いることなく、基板の厚さ方向に延びる貫通孔内に、生体関連物質プローブが固定化された高分子ゲルが充填されているバイオチップでもよい。
中空繊維以外のゲル保持体を用いたバイオチップとしては、例えば、積層された複数のシート状部材やブロック状部材にレーザー等で貫通孔を穿ち、その中に生体関連物質プローブが固定化された高分子ゲルを注入しシート化した電気泳動担体などが挙げられる。
【００４１】
さらに、特開２０００−６０５５４号公報に記載の樹脂板に形成された複数の貫通孔にゲルを介してプローブが保持されているチップも使用可能である。さらにまた、貫通孔を備えず、基板上に生体関連物質を固定化したバイオチップでもよい。
【００４２】
図３は、ハイブリダイゼーション装置で使用される、他のバイオチップ３２の模式図である。このバイオチップ３２では、ガラス、セラミック、プラスチック等の基板３４上に、生体関連物質３６が固定化されている。固定化は、基板に生体関連物質が、共有結合的に固定化されていることが好ましいが、物理的な吸着であってもよい。また、基板３４上に第１の生体関連物質３６が固定化されたゲルを配置してもよい。
【００４３】
バイオチップに固定化される第１の生体関連物質としては、核酸、たんぱく質、アミノ酸、ペプチド、糖、脂質、抗体などを用いることができる。
【００４４】
次に、本実施形態のハイブリダイゼーション装置を用いたハイブリダイゼーション方法について説明する。
【００４５】
所定の生体関連物質プローブが高分子ゲル３０と共に貫通孔に充填されているバイオチップ１４を、検体液収容部８の底部に設けられているバイオチップ取付部１６に水平に取付ける。次に、ＤＮＡ等の生体関連物質（検体）を公知の方法で標識した標識検体を含む検体液で検体液収容部８を満たす。さらに、バッファ液で、第１のバッファ液収容部１０および第２のバッファ液収容部１２を満たす。
【００４６】
次に、第１のバッファ液収容部１０に配置された第１の電極１８を正極とし、第２のバッファ液収容部１２に配置された第２の電極２０を負極として、電極１８、２０に電圧を印加して、検体液収容部８内に注入された検体液に含まれるＤＮＡ等の生体関連物質を泳動させる。ＤＮＡ等の核酸は、負に荷電するので、正極の第１の電極１８に向かって泳動するが、第１の半透膜４を透過することができないため、第１の半透膜４近傍に、濃縮された検体が偏在することになる。検体である第２の生体関連物質としては、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡなどを用いることができ、電荷を持ち、電気泳動に用いられる生体関連物質であれば特に限定されない。
【００４７】
次いで、電極の極性を反転させ、電極１８、２０に電圧を印加する。第１の半透膜４近傍で濃縮された検体は、正極の第２の電極２０に向かって泳動し始めるが、泳動による移動より早く重力によってバイオチップ１４の表面に向かって沈降し始める。この結果、濃縮された検体が、バイオチップ１４の表面に沿って、第２の電極２０（第２の半透膜側）に向かって電気泳動される。このように極性を反転させた泳動を繰り返しながらハイブリダイゼーション操作を行う。
このような操作により、濃縮された検体がバイオチップ表面に沿って移動するので、プローブと検体との接触効率が向上する。
【００４８】
次に、図４に沿って、本発明の第２の実施形態のハイブリダイゼーション装置４０について詳細に説明する。図４は、本発明の第２の実施形態のハイブリダイゼーション装置の模式的な断面図である。第２の実施形態のハイブリダイゼーション装置の基本構造は、上述した第１の実施形態と同一であるため、第１の実施形態のハイブリダイゼーション装置と共通する部分は同一符号を付して説明を省略し、第１の実施形態と異なる部分の構造のみを説明する。
【００４９】
図４に示されているように、第２の実施形態のハイブリダイゼーション装置４０では、バイオチップ取付部４２が、検体液収容部の深さ方向中間位置に配置され、バイオチップ取付部４２に取付けられたバイオチップ１４によって検体液収容部が第１の検体液収容部４４と第２の検体液収容部４６に区切られるように構成されている。
【００５０】
このような構成によれば、第１の検体液収容部４４を上方に配置した状態で検体を濃縮した後、上下をひっくり返して第２の検体液収容部４６を上方に配置させて検体を濃縮することにより、バイオチップの両面から濃縮ハイブリを行うことが可能となる。このような操作には、バイオチップ取付部が、検体液収容部の深さ方向中間位置に設けられていることが最も好ましい。
【００５１】
バイオチップ取付部の構造は、バイオチップによって区切られる第１の検体液収容部４４と第２の検体液収容部４６の深さが略等しくなるように、バイオチップを検体液収納部全体の深さ方向の中間位置に水平に保持することが出来れば、特に限定されない。
例えば半透膜を保持する支持体にバイオチップを取り付け、この支持体を装置の装置の筐体に嵌め込み、バイオチップが動かないように取り付ける構成があげられる。
【００５２】
第２の実施形態のハイブリダイゼーション装置４０を用いたハイブリダイゼーションでは、一定時間毎に、ハイブリダイゼーション装置４０を上下を反転させながら、第１の実施形態のハイブリダイゼーション装置１によるハイブリダイゼーションと同様の操作を行っても良い。
【００５３】
次に、図５に沿って、本発明の第３実施形態のハイブリダイゼーション装置５０について詳細に説明する。図５は、本発明の第３実施形態のハイブリダイゼーション装置５０の模式的な縦断面図である。第３実施形態のハイブリダイゼーション装置の基本構造は、上述した第２の実施形態と同一であるため、第２の実施形態のハイブリダイゼーション装置と共通する部分は同一符号を付して説明を省略し、第２の実施形態と異なる部分の構造のみを説明する。
【００５４】
図５に示されている、第３実施形態のハイブリダイゼーション装置５０では、第１の検体収容部４４の上方に第３の半透膜５２を介して、第３の電極５４が配置された第３のバッファ液収容部５６が設けられ、第２の検体収容部４６の下方に第４の半透膜５８を介して、第４の電極６０が配置された第４のバッファ液収容部６２が設けらている。各電極５４、６０は電源６２に接続されている。
第３実施形態のハイブリダイゼーション装置５０においても、バイオチップ１４が検体液収容部の深さ方向中間位置に配置されるようにバイオチップ取付部が設けられていることが好ましい。
【００５５】
第３実施形態のハイブリダイゼーション装置５０を用いたハイブリダイゼーションでは、第２の実施形態のハイブリダイゼーション装置４０と同様にハイブリダイゼーションを行った後、第３および第４の電極５４、６０に電圧を印加し、バイオチップ１４の貫通孔を通して検体を電気泳動によって通過させる。
【００５６】
ハイブリダイズ操作が終了した後、ハイブリダイズしなかった検体成分は、バイオチップをバッファ液等で洗浄することにより、除去することができるが、貫通孔を有するバイオチップの場合には、バイオチップに電圧を印加し、洗浄することもできる。
【００５７】
上述した各ハイブリダイゼーション方法では、検体を公知の方法で蛍光分子により標識しておけば、ハイブリダイズした検体を蛍光検出により検出することができる。ハイブリダイズした検体の検出は、上記洗浄操作の後、装置から取り出して実施することができる。検出に用いる励起光はレーザー、水銀ランプまたはハロゲンランプ等の光源からフィルターにより濾過した光が用いられる。蛍光は、ＣＣＤ、ホトダイオードなどによって検出することができる。
【００５８】
本発明は上記実施形態に限定されることなく、特許請求の範囲に記載された事項の範囲内で種々の変更又は変形が可能である。
【実施例】
【００５９】
次に、本発明の実施形態を以下の実施例により具体的に説明する。
（実施例１）
直径0.3mmの孔が、孔の中心間距離を0.42mmとして縦横各12列に合計144個配置された厚さ0.1mmの多孔板2枚を重ね、これらの多孔板の各孔に、外径280μm、内径180μm、長さ30cmのカーボンブラック含有ポリカーボネート中空繊維を通過させた。2枚の多孔板の間隔を100mmとし、糸を張った状態で固定した。
【００６０】
次に、樹脂原料を2枚の多孔板の間に流し込んだ。樹脂としては、ポリウレタン樹脂接着剤（日本ポリウレタン工業株式会社製 ニッポラン4276、コロネート4403）を使用した。また、この接着剤の総重量に対し、2.5質量％のカーボンブラックを添加した。室温で24時間静置して樹脂を硬化し中空繊維集束固定物を得た。次に下記に示す配合比になるように重合液を調製した。
【００６１】
【００６２】
次に上記重合液に2,2’-アゾビス[2-(2-イミダゾリン-2-イル)プロパン]二硫酸塩（以下VA044）を0.1質量部添加し、中空繊維集束固定物の中空繊維中に充填した。その後、温度を55℃に上げ重合を行った。なお、１４４配列のうち、１０配列は６５ベースの核酸プローブＡを重合液に加え中空繊維内で重合した。その後、ミクロトームにて、繊維軸と直角方向に、厚さ０．２５ｍｍの薄片を切り出し、図２に示すような縦横15mm角のバイオチップを得た。
【００６３】
得られたバイオチップを図１に示すハイブリダイゼーション装置の検体液収容部の底部に設けたバイオチップ取付部に取り付けた。取り付けたバイオチップは水平に保持されていた。半透膜は横20mm高さ5mm、スぺクトロポア社製 カットオフ分子量３５００を、電極はステンレス製の板に金メッキ処理をしたものを用いた。検体液収容部には、プローブＡと相補的に結合する６５ベースのＣｙ５染料で標識された核酸検体ａの１００ｆｍｏｌを０．５×ＳＳＣ ０．２％ＳＤＳに溶解して充填した。
【００６４】
次に、電極に６Ｖの電圧を２０分印加した後、電極を反転し、６Ｖの電圧を２０分印加する操作を、４回繰り返しハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション終了後、２ｘＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ溶液中で４０分その後、２ｘＳＳＣ溶液中で２０分洗浄をおこなった。
【００６５】
その後、蛍光顕微鏡を用いてバイオチップを観察した。
その結果、プローブを固定化したスポットから光量６０００の蛍光を検出することができた。
【００６６】
（実施例２）
実施例１で作製したバイオチップを図４に示すハイブリダイゼーション装置の検体液収容部の深さ方向中間位置に設けたバイオチップ取付部に取り付けた。取り付けたバイオチップは水平に保持されていた。半透膜の材質および大きさ、検体液収容部の大きさとバッファ液組成は実施例１と同様にし、ハイブリダイゼーションおよび洗浄作業をおこなった。その後、蛍光顕微鏡を用いてバイオチップを観察した。その結果、プローブの固定化したスポットから光量８０００の蛍光を検出することができた。
【００６７】
（実施例３）
実施例１で作製したバイオチップを用い、図５に示すハイブリダイゼーション装置の検体液収容部の深さ方向中間位置に設けたバイオチップ取付部に取り付けた。取り付けたバイオチップは水平に保持されていた。第１および第２の半透膜４、６は横１５ｍｍ高さ５ｍｍのものを、第３および第４の半透膜は１５ｍｍ角のものを用いた。検体液収納部４４、４６の一方に、プローブＡと相補的に結合する６５ベースのＣｙ５染料で標識された核酸検体ａの１００ｆｍｏｌを０．５×ＳＳＣ ０．２％ＳＤＳに溶解して充填した。検体液収納部４４、４６の他方には核酸検体を溶解しない０．５×ＳＳＣ ０．２％ＳＤＳ溶液を充填した。
【００６８】
次に、第１および第２の電極１８、２０間に６Ｖの電圧を２０分印加した後、電極を反転し、１０分間電圧を印加した。電圧をＯＦＦにした後、第３および第４の電極５４、６０間に検体液が充填されている側の電極をマイナスとして６Ｖの電圧を２０分間印加した。この操作により、検体をバイオチップの反対側に移動させた後、装置を１８０度反転し、上記と同様の作業を２回繰り返した。ハイブリダイゼーション終了後、２ｘＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ溶液中で４０分その後、２ｘＳＳＣ溶液中で２０分洗浄をおこなった。その後、蛍光顕微鏡を用いてバイオチップを観察した。その結果、プローブの固定化したスポットから光量２００００の蛍光を検出することができた。ハイブリ時間は８０分であった。
【００６９】
（実施例４）
縦横15mm、厚さ１ｍｍのガラス板に、実施例１で使用した重合液を、スポッターを用いて144箇所スポットした後、温度を55℃に上げ重合を行った。実施例１同様に、１４４スポットのうちの１０スポットには６５ベースの核酸プローブＡを重合液に加え重合し図３に示すバイオチップを作製した。
【００７０】
実施例１と同様の方法にて、バイオチップを用いてハイブリダイゼーションおよび洗浄をおこなった。その後、蛍光顕微鏡を用いてバイオチップを観察した。その結果、プローブの固定化したスポットから光量７０００の蛍光を検出することができた。
【００７１】
（比較例１）
実施例１と同様の方法で、電圧を印加せずにシグナル強度が実施例１と同じ６０００となるまでハイブリダイゼーションを行った。その結果、プローブのシグナル強度が６０００になるまでには１０時間必要であることが分った。
【００７２】
（比較例２）
実施例２と同様の方法で、電圧を印加せずにシグナル強度が実施例２と同じ８０００となるまでハイブリダイゼーションを行った。その結果、プローブのシグナル強度が８０００になるまでには１０時間必要であることが分った。
【００７３】
（比較例３）
実施例４と同様の方法で、電圧を印加せずにシグナル強度が実施例４と同じ７０００となるまでハイブリダイゼーションを行った。その結果、プローブのシグナル強度が７０００になるまでには１０時間必要であることが分った。
（比較例４）
実施例１と同様の装置にて、検体液収納部に直径１ｍｍのジルコニアボールを１０個入れ、左右に装置を浸透することにより溶液を攪拌しながら、電圧を印加せずに、実施例１と同様にシグナル強度が６０００となるまでハイブリダイゼーションを行った。その結果プローブのシグナル強度が６０００になるまでには６時間必要であることが分った。
【符号の説明】
【００７４】
１：ハイブリダイゼーション装置
２：本体
４：第１の半透膜
６：第２の半透膜
８：検体液収容部
１０：第１のバッファ液収容部
１２：第２のバッファ液収容部
１４：バイオチップ
１６：バイオチップ取付部
１８：第１の電極
２０：第２の電極
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概略的には、ハイブリダイゼーション装置および方法に関し、詳細には、電気泳動を利用したハイブリダイゼーション装置および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多数遺伝子の一括発現解析を可能とするＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡチップ法）と呼ばれる新しい分析法が開発され、注目を集めている。このＤＮＡマイクロアレイ法は、核酸−核酸間ハイブリダイゼーション反応に基づいて核酸検出・定量を行う手法であり、バイオチップと呼ばれる、平面基板上に多数のＤＮＡ断片（ＤＮＡプローブ）を高密度に固定したものが用いられる。
【０００３】
ＤＮＡマイクロアレイ法では、例えば、研究対象細胞の発現遺伝子等の被験試料（検体）を平面基板上のＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションさせ、互いに相補的な核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）同士を結合させ、その箇所を蛍光色素標識等により高解像度解析装置で高速に読みとる。
このような操作により、被験試料（検体）中の各遺伝子の量を迅速に推定できるため、この方法の導入により、検体の微量化と、その検体を、再現性よく、多量・迅速・系統的に分析、定量することが可能となった（特許文献１参照）。
【０００４】
バイオチップを用いたハイブリダイゼーションを効率よく行うためには、プローブと検体との接触効率を上げることが必要である。このため、検体量が非常に少ない場合には、効率よくプローブと検体とを反応させるべく、バイオチップに接触させた検体液を攪拌する、検体液を濃縮するなどの手法が採られる。
【０００５】
検体液を攪拌して反応効率を向上させる技術としては、ビーズを混合した検体液をバイオチップに接触させた後、カバーガラスなどを用いて検体液をシーリングし、バイオチップを回転させることにより、ビーズを重力方向に落下させることで検体液を攪拌する方法（特許文献２参照）、微粒子や気泡を検体液中で動かし攪拌する方法が知られている（特許文献３参照）。
【０００６】
また、核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）が電解質溶液中で負の電荷を持つという特徴を利用して、核酸検体を溶液中で電気泳動により強制的に移動させながら基盤に固定化したＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションさせ、検体を検出する方法（特許文献４参照）や、核酸検体をゲル内で電気泳動により強制的に移動させながら、ゲル内に固定されたＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションさせ、検体を検出する核酸検出装置及び核酸検出方法も開発されている。（特許文献５参照）
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０００−２７０８７７号公報
【特許文献２】特開２００３−３３９３７５号公報
【特許文献３】ＷＯ０５/０９０９９７
【特許文献４】特許第４１２２８５４号
【特許文献５】特許第３８２９４９１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、検体液を攪拌する技術や電気泳動技術を用いても、プローブと検体とのハイブリダイゼーションが不十分となる場合があった。また、装置等の都合で検体液の量を増やさざるを得ない場合や検体そのものの量が非常に少ない場合には、検体液中の検体濃度が低くなるため検体のプローブへの衝突頻度が小さくなり、十分なハイブリダイゼーションを達成できないことがある。
【０００９】
本発明は、このような従来技術の問題を解決するためになされたものであり、検体濃度が低い場合でもハイブリダイゼーション効率を高めることができる装置および方法を提案することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明によれば、
ハイブリダイゼーション装置であって、
検体液を収容する検体液収容部と、
前記検体液収容部の深さ方向中間位置あるいはそれより下方に設けられバイオチップを水平に保持するバイオチップ取付部と、
前記検体液収容部の両側の外方に対向して設けられた第１および第２のバッファ液収容部と、
前記検体液収容部と前記第１および第２のバッファ液収容部のそれぞれとを仕切る半透膜と、
前記第１および第２のバッファ液収容部のそれぞれに配置された第１の電極対と、を備えている、
ことを特徴とするハイブリダイゼーション装置が提供される。
【００１１】
このような構成によれば、検体液収容部に収容された生体関連物質等の検体は、一対の電極間での電圧印加により、一方の半透膜側に電気泳動されるが、半透膜を透過することができないため、この半透膜近傍には、濃縮された検体が偏在する。
次いで、電極の極性を反転させて一対の電極間に電圧を印加することで、半透膜近傍で濃縮された検体が、重力によってバイオチップに表面に向かって短時間で沈降し、その後バイオチップの表面に沿って、他方の半透膜側に電気泳動される。この結果、検体とバイオチップ内のプローブとの接触効率が向上する。
【００１２】
さらに、極性を反転させて電気泳動を行う作業を繰り返すことで、濃縮された検体が、バイオチップ表面上を繰り返し移動し、ハイブリダイゼーション効率がより向上する。
【００１３】
本発明の他の好ましい態様によれば、前記バイオチップ取付部が、前記検体液収容部の底部に設けられている。
本発明の他の好ましい態様によれば、前記バイオチップ取付部が、前記検体液収容部の深さ方向中間位置に設けられている。
【００１４】
本発明の他の好ましい態様によれば、前記検体液収容部の上下の外方に対向して設けられた第３および第４のバッファ液収容部と、前記検体液収容部と前記第３および第４のバッファ液収容部のそれぞれとを仕切る半透膜と、前記第３および第４のバッファ液収容部のそれぞれに配置された第２の電極対と、を備えている。
【００１５】
このような構成によれば、深さ方向に貫通孔を有するバイオチップを使用し、濃縮された検体を、バイオチップ表面上を繰り返し移動させた後、第２の電極対に電圧印加することにより、検体を上下方向に移動させてバイオチップの貫通孔を通過させ、さらにハイブリダイゼーション効率を上げることができる。
【００１６】
本発明の他の態様によれば、
バイオチップに固定された第１の生体関連物質と検体液中の第２の生体関連物質とをハイブリダイゼーションさせるハイブリダイゼーション方法であって、
前記バイオチップを検体液中に水平に配置するステップと、
前記バイオチップの表面に沿った第１の方向に沿って前記検体液に電圧を印加し、前記バイオチップの一側部側で前記検体液中の検体を濃縮するステップと、
前記第１の方向とは逆方向に前記検体液に電圧を印加するステップと、を備えている、
ことを特徴とするハイブリダイゼーション方法が提供される。
【００１７】
このような構成によれば、検体液収容部に収容された生体関連物質等の検体は、一対の電極間での電圧印加により、一方の半透膜側に電気泳動されるが、半透膜を透過することができないため、この半透膜近傍には、検体が濃縮された検体液が偏在する。
次いで、電極の極性を反転させて一対の電極間に電圧を印加することで、一方の半透膜の近傍で濃縮された検体が、重力によってバイオチップの表面に向かって短時間で沈降する。その後バイオチップ表面に沿って、他方の半透膜側に電気泳動される。したがって、検体とバイオチップ内のプローブとの接触効率が向上する。
【００１８】
本発明の他の好ましい態様によれば、前記バイオチップの表面に直交する方向に電圧を印加するステップをさらに備えている。
【００１９】
このような構成によれば、深さ方向に貫通孔を有するバイオチップを使用し、濃縮された検体が、バイオチップ表面上を繰り返し移動した後、バイオチップの表面に直交する方向に電圧印加することにより、バイオチップの貫通孔を通して検体を電気泳動によって通過させ、さらにハイブリダイゼーション効率を上げることができる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、検体液を高度に濃縮することにより、生体関連物質プローブと検体との接触効率を上げ、ハイブリダイゼーション効率を上げることができる。また、それによりハイブリ時間を短縮することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】第１の実施形態のハイブリダイゼーション装置の模式的な縦断面図である。
【図２】本発明の実施形態のハイブリダイゼーション装置で使用されるバイオチップの一例の模式図である。
【図３】本発明の実施形態のハイブリダイゼーション装置で使用されるバイオチップの他の例の模式図である。
【図４】第２の実施形態のハイブリダイゼーション装置の模式的な縦断面図である。
【図５】第３実施形態のハイブリダイゼーション装置の模式的な縦断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明の好ましい実施形態のハイブリダイゼーション装置およびハイブリダイゼーション方法について詳細に説明する。まず、図１に沿って、本発明の第１の実施形態のハイブリダイゼーション装置の構造について説明する。図１は、第１の実施形態のハイブリダイゼーション装置１の模式的な縦断面図である。
【００２３】
本実施形態のハイブリダイゼーション装置１は、バイオチップに固定されているＤＮＡ等の生体関連物質プローブ（第１の生体関連物質）に、検体液に含まれる検体（第２の生体関連物質）をハイブリダイゼーションさせる装置である。
【００２４】
図１に示されているように、本発明のハイブリダイゼーション装置１は、直方体形状を有する本体２を備えている。本体２は、直方体状の内部空間を有し、この内部空間の左右両側部には、第１および第２の半透膜４、６が、上下方向に延びるように配置され、内部空間を中央の検体液収容部８と、左右の第１および第２のバッファ液収容部１０、１２に仕切っている。すなわち、第１および第２のバッファ液収容部１０、１２は、中央の検体液収容部８の側部外方に対向して設けられ、検体液収容部８と第１の半透膜４および第２の半透膜６で仕切られている。
【００２５】
また、検体液収容部８の底部には、薄板状のバイオチップ１４が水平状態で取付けられるバイオチップ取付部１６が設けられている。バイオチップ取付部１６は、バイオチップ１４を検体液収容部８の底部に水平に保持することができれば、その構造は、特に限定されるものではない。
【００２６】
検体液中の検体を重力で落下させてバイオチップ上に濃縮するため、バイオチップは検体液収容部８の深さ方向中間位置あるいはそれより下方に取り付けるのが好ましい。したがって、バイオチップ取付部１６は、検体液収容部８の深さ方向の中間位置あるいはそれより下方に、本実施形態では、検体液収容部８の底部に設けられている。
【００２７】
バイオチップ取付部１６の具体的構造としては、バイオチップ１４が浮き上がらないようにチップの四隅を固定する構成や、半透膜を支持する枠などと一体になって検体液収容部８の底部にバイオチップ１４を固定する構成などがあげられるが、バイオチップ１４を検体液収容部８の底部に水平に保持することができれば、特に限定されるものではない。また、バイオチップ１４を本体２の底部に直接貼り付けるバイオチップ取付部であっても良い。
【００２８】
さらに、第１のバッファ液収容部１０および第２のバッファ液収容部１２内には、それぞれ第１および第２の電極１８、２０が配置されている。それぞれ電極１８、２０は、電源２２と接続され、電圧の印加、および極性の切り換えが可能とされている。ハイブリダイゼーション装置１は、絶縁材料２４によって外部と絶縁されている。
【００２９】
第１の半透膜４および第２の半透膜６は、後述する検体液収容部８に収容するＤＮＡ等の検体を透過させず、検体液中の水や塩類のような低分子は透過させる膜である。第１の半透膜４および第２の半透膜６の材料は、使用する検体、検体液の溶媒の種類に応じて適宜選択されるが、一般に、検出しようとしている検体より小さいカットオフ分子量を示す膜材料が選択される
【００３０】
具体的には、第１の半透膜４および第２の半透膜６は、ゼラチン膜、アセテート膜、アクリルアミド系やポリビニルアルコール等のハイドロゲル、再生セルロース膜等の中から選択される。機械的強度、取り扱い、入手の容易性等の点で、アセテ−ト膜が好ましい。
【００３１】
検体液収容部８は、検体液を収容する空間である。容積は小さいほうが好ましいが、検体を濃縮する半透膜を両側に設置するため、１から５ｍｍ程度の厚さ（深さ）であることが好ましい。
【００３２】
第１のバッファ液収容部１０および第２のバッファ液収容部１２は、バッファ溶液が充填されそのバッファ溶液中に電極１８、２０が配置される空間である。このようなバッファ液収容部１０、１２を設けることで、バイオチップ１４と電極１８、２０を隔離して、バイオチップが電極近傍のｐＨ上昇により劣化したり、反応阻害の影響を受けないようにすることができる。
【００３３】
また、電極近傍で発生する気体によって、バイオチップに印加される電場が不均一になることを防止することができる。バッファ溶液槽の体積及び形状は特に限定されず任意に選択することができる。
【００３４】
バッファ溶液の組成としては、一般的に生体関連物質のハイブリダイズ反応に利用される溶液組成が上げられ、ＳＳＣやＴＮ、ＴＢＥ溶液やＴＡＥ溶液などが挙げられる。
【００３５】
電極１８、２０の大きさ、形状および配置は、検体液収容部８とバイオチップ１４に均一の電圧を印加することができるものであれば特に限定されないが、例えば、平板上または平板メッシュ状の形態であることが好ましい。
【００３６】
電極１８、２０に用いられる材料としては、グラファイト、白金、金、金属に金メッキした材料が挙げられる。電極は、絶縁体に固定され、且つ該絶縁体が透明材料であることが好ましい。そのような例としては、ガラス、ポリエチレンテレフタレートフィルムなどの透明基板に、酸化スズ、ＩＴＯ、金または白金等を主たる構成材料とする薄膜またはその積層体が部分的に形成された透明電極が挙げられる。
【００３７】
次に、図２に沿って、ハイブリダイゼーション装置１で使用されるバイオチップ１４（ゲル保持チップ）の構成を説明する。図２は、バイオチップ１４の模式図である。
バイオチップ１４は、矩形の薄板である基板２６に、厚さ方向に貫通する多数の貫通孔２６ａが形成された構造を有している。各貫通孔２６ａの周縁には、環状断面の中空繊維２８が配置され、その内部空間に核酸、タンパク質等の生体関連物質プローブが固定化された高分子ゲル３０が保持されている。
【００３８】
基板２６の寸法は、各辺の長さが数ミリないし数センチ、厚さが数十ミクロンから１ｍｍ程度の範囲である。基板２６の材料は、ガラス、セラミック、プラスチックなどが好ましいが、特に限定されない。
【００３９】
本実施形態で使用するバイオチップ１４は特許文献１に記載されているようなバイオチップであり、多数中空繊維を樹脂で一体化して柱状の中空繊維配列体とし、中空繊維の中空部に生体関連物質プローブを高分子ゲル３０と共に注入して高分子ゲル３０内に固定化した後、この中空繊維配列体を中空繊維の長手方向と交叉する方向にスライスすることによって製造されている。
【００４０】
しかしながら、中空繊維のゲル保持体を用いることなく、基板の厚さ方向に延びる貫通孔内に、生体関連物質プローブが固定化された高分子ゲルが充填されているバイオチップでもよい。
中空繊維以外のゲル保持体を用いたバイオチップとしては、例えば、積層された複数のシート状部材やブロック状部材にレーザー等で貫通孔を穿ち、その中に生体関連物質プローブが固定化された高分子ゲルを注入しシート化した電気泳動担体などが挙げられる。
【００４１】
さらに、特開２０００−６０５５４号公報に記載の樹脂板に形成された複数の貫通孔にゲルを介してプローブが保持されているチップも使用可能である。さらにまた、貫通孔を備えず、基板上に生体関連物質を固定化したバイオチップでもよい。
【００４２】
図３は、ハイブリダイゼーション装置で使用される、他のバイオチップ３２の模式図である。このバイオチップ３２では、ガラス、セラミック、プラスチック等の基板３４上に、生体関連物質３６が固定化されている。固定化は、基板に生体関連物質が、共有結合的に固定化されていることが好ましいが、物理的な吸着であってもよい。また、基板３４上に第１の生体関連物質３６が固定化されたゲルを配置してもよい。
【００４３】
バイオチップに固定化される第１の生体関連物質としては、核酸、たんぱく質、アミノ酸、ペプチド、糖、脂質、抗体などを用いることができる。
【００４４】
次に、本実施形態のハイブリダイゼーション装置を用いたハイブリダイゼーション方法について説明する。
【００４５】
所定の生体関連物質プローブが高分子ゲル３０と共に貫通孔に充填されているバイオチップ１４を、検体液収容部８の底部に設けられているバイオチップ取付部１６に水平に取付ける。次に、ＤＮＡ等の生体関連物質（検体）を公知の方法で標識した標識検体を含む検体液で検体液収容部８を満たす。さらに、バッファ液で、第１のバッファ液収容部１０および第２のバッファ液収容部１２を満たす。
【００４６】
次に、第１のバッファ液収容部１０に配置された第１の電極１８を正極とし、第２のバッファ液収容部１２に配置された第２の電極２０を負極として、電極１８、２０に電圧を印加して、検体液収容部８内に注入された検体液に含まれるＤＮＡ等の生体関連物質を泳動させる。ＤＮＡ等の核酸は、負に荷電するので、正極の第１の電極１８に向かって泳動するが、第１の半透膜４を透過することができないため、第１の半透膜４近傍に、濃縮された検体が偏在することになる。検体である第２の生体関連物質としては、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡなどを用いることができ、電荷を持ち、電気泳動に用いられる生体関連物質であれば特に限定されない。
【００４７】
次いで、電極の極性を反転させ、電極１８、２０に電圧を印加する。第１の半透膜４近傍で濃縮された検体は、正極の第２の電極２０に向かって泳動し始めるが、泳動による移動より早く重力によってバイオチップ１４の表面に向かって沈降し始める。この結果、濃縮された検体が、バイオチップ１４の表面に沿って、第２の電極２０（第２の半透膜側）に向かって電気泳動される。このように極性を反転させた泳動を繰り返しながらハイブリダイゼーション操作を行う。
このような操作により、濃縮された検体がバイオチップ表面に沿って移動するので、プローブと検体との接触効率が向上する。
【００４８】
次に、図４に沿って、本発明の第２の実施形態のハイブリダイゼーション装置４０について詳細に説明する。図４は、本発明の第２の実施形態のハイブリダイゼーション装置の模式的な断面図である。第２の実施形態のハイブリダイゼーション装置の基本構造は、上述した第１の実施形態と同一であるため、第１の実施形態のハイブリダイゼーション装置と共通する部分は同一符号を付して説明を省略し、第１の実施形態と異なる部分の構造のみを説明する。
【００４９】
図４に示されているように、第２の実施形態のハイブリダイゼーション装置４０では、バイオチップ取付部４２が、検体液収容部の深さ方向中間位置に配置され、バイオチップ取付部４２に取付けられたバイオチップ１４によって検体液収容部が第１の検体液収容部４４と第２の検体液収容部４６に区切られるように構成されている。
【００５０】
このような構成によれば、第１の検体液収容部４４を上方に配置した状態で検体を濃縮した後、上下をひっくり返して第２の検体液収容部４６を上方に配置させて検体を濃縮することにより、バイオチップの両面から濃縮ハイブリを行うことが可能となる。このような操作には、バイオチップ取付部が、検体液収容部の深さ方向中間位置に設けられていることが最も好ましい。
【００５１】
バイオチップ取付部の構造は、バイオチップによって区切られる第１の検体液収容部４４と第２の検体液収容部４６の深さが略等しくなるように、バイオチップを検体液収納部全体の深さ方向の中間位置に水平に保持することが出来れば、特に限定されない。
例えば半透膜を保持する支持体にバイオチップを取り付け、この支持体を装置の装置の筐体に嵌め込み、バイオチップが動かないように取り付ける構成があげられる。
【００５２】
第２の実施形態のハイブリダイゼーション装置４０を用いたハイブリダイゼーションでは、一定時間毎に、ハイブリダイゼーション装置４０を上下を反転させながら、第１の実施形態のハイブリダイゼーション装置１によるハイブリダイゼーションと同様の操作を行っても良い。
【００５３】
次に、図５に沿って、本発明の第３実施形態のハイブリダイゼーション装置５０について詳細に説明する。図５は、本発明の第３実施形態のハイブリダイゼーション装置５０の模式的な縦断面図である。第３実施形態のハイブリダイゼーション装置の基本構造は、上述した第２の実施形態と同一であるため、第２の実施形態のハイブリダイゼーション装置と共通する部分は同一符号を付して説明を省略し、第２の実施形態と異なる部分の構造のみを説明する。
【００５４】
図５に示されている、第３実施形態のハイブリダイゼーション装置５０では、第１の検体収容部４４の上方に第３の半透膜５２を介して、第３の電極５４が配置された第３のバッファ液収容部５６が設けられ、第２の検体収容部４６の下方に第４の半透膜５８を介して、第４の電極６０が配置された第４のバッファ液収容部６２が設けらている。各電極５４、６０は電源６２に接続されている。
第３実施形態のハイブリダイゼーション装置５０においても、バイオチップ１４が検体液収容部の深さ方向中間位置に配置されるようにバイオチップ取付部が設けられていることが好ましい。
【００５５】
第３実施形態のハイブリダイゼーション装置５０を用いたハイブリダイゼーションでは、第２の実施形態のハイブリダイゼーション装置４０と同様にハイブリダイゼーションを行った後、第３および第４の電極５４、６０に電圧を印加し、バイオチップ１４の貫通孔を通して検体を電気泳動によって通過させる。
【００５６】
ハイブリダイズ操作が終了した後、ハイブリダイズしなかった検体成分は、バイオチップをバッファ液等で洗浄することにより、除去することができるが、貫通孔を有するバイオチップの場合には、バイオチップに電圧を印加し、洗浄することもできる。
【００５７】
上述した各ハイブリダイゼーション方法では、検体を公知の方法で蛍光分子により標識しておけば、ハイブリダイズした検体を蛍光検出により検出することができる。ハイブリダイズした検体の検出は、上記洗浄操作の後、装置から取り出して実施することができる。検出に用いる励起光はレーザー、水銀ランプまたはハロゲンランプ等の光源からフィルターにより濾過した光が用いられる。蛍光は、ＣＣＤ、ホトダイオードなどによって検出することができる。
【００５８】
本発明は上記実施形態に限定されることなく、特許請求の範囲に記載された事項の範囲内で種々の変更又は変形が可能である。
【実施例】
【００５９】
次に、本発明の実施形態を以下の実施例により具体的に説明する。
（実施例１）
直径0.3mmの孔が、孔の中心間距離を0.42mmとして縦横各12列に合計144個配置された厚さ0.1mmの多孔板2枚を重ね、これらの多孔板の各孔に、外径280μm、内径180μm、長さ30cmのカーボンブラック含有ポリカーボネート中空繊維を通過させた。2枚の多孔板の間隔を100mmとし、糸を張った状態で固定した。
【００６０】
次に、樹脂原料を2枚の多孔板の間に流し込んだ。樹脂としては、ポリウレタン樹脂接着剤（日本ポリウレタン工業株式会社製 ニッポラン4276、コロネート4403）を使用した。また、この接着剤の総重量に対し、2.5質量％のカーボンブラックを添加した。室温で24時間静置して樹脂を硬化し中空繊維集束固定物を得た。次に下記に示す配合比になるように重合液を調製した。
【００６１】
【００６２】
次に上記重合液に2,2’-アゾビス[2-(2-イミダゾリン-2-イル)プロパン]二硫酸塩（以下VA044）を0.1質量部添加し、中空繊維集束固定物の中空繊維中に充填した。その後、温度を55℃に上げ重合を行った。なお、１４４配列のうち、１０配列は６５ベースの核酸プローブＡを重合液に加え中空繊維内で重合した。その後、ミクロトームにて、繊維軸と直角方向に、厚さ０．２５ｍｍの薄片を切り出し、図２に示すような縦横15mm角のバイオチップを得た。
【００６３】
得られたバイオチップを図１に示すハイブリダイゼーション装置の検体液収容部の底部に設けたバイオチップ取付部に取り付けた。取り付けたバイオチップは水平に保持されていた。半透膜は横20mm高さ5mm、スぺクトロポア社製 カットオフ分子量３５００を、電極はステンレス製の板に金メッキ処理をしたものを用いた。検体液収容部には、プローブＡと相補的に結合する６５ベースのＣｙ５染料で標識された核酸検体ａの１００ｆｍｏｌを０．５×ＳＳＣ ０．２％ＳＤＳに溶解して充填した。
【００６４】
次に、電極に６Ｖの電圧を２０分印加した後、電極を反転し、６Ｖの電圧を２０分印加する操作を、４回繰り返しハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション終了後、２ｘＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ溶液中で４０分その後、２ｘＳＳＣ溶液中で２０分洗浄をおこなった。
【００６５】
その後、蛍光顕微鏡を用いてバイオチップを観察した。
その結果、プローブを固定化したスポットから光量６０００の蛍光を検出することができた。
【００６６】
（実施例２）
実施例１で作製したバイオチップを図４に示すハイブリダイゼーション装置の検体液収容部の深さ方向中間位置に設けたバイオチップ取付部に取り付けた。取り付けたバイオチップは水平に保持されていた。半透膜の材質および大きさ、検体液収容部の大きさとバッファ液組成は実施例１と同様にし、ハイブリダイゼーションおよび洗浄作業をおこなった。その後、蛍光顕微鏡を用いてバイオチップを観察した。その結果、プローブの固定化したスポットから光量８０００の蛍光を検出することができた。
【００６７】
（実施例３）
実施例１で作製したバイオチップを用い、図５に示すハイブリダイゼーション装置の検体液収容部の深さ方向中間位置に設けたバイオチップ取付部に取り付けた。取り付けたバイオチップは水平に保持されていた。第１および第２の半透膜４、６は横１５ｍｍ高さ５ｍｍのものを、第３および第４の半透膜は１５ｍｍ角のものを用いた。検体液収納部４４、４６の一方に、プローブＡと相補的に結合する６５ベースのＣｙ５染料で標識された核酸検体ａの１００ｆｍｏｌを０．５×ＳＳＣ ０．２％ＳＤＳに溶解して充填した。検体液収納部４４、４６の他方には核酸検体を溶解しない０．５×ＳＳＣ ０．２％ＳＤＳ溶液を充填した。
【００６８】
次に、第１および第２の電極１８、２０間に６Ｖの電圧を２０分印加した後、電極を反転し、１０分間電圧を印加した。電圧をＯＦＦにした後、第３および第４の電極５４、６０間に検体液が充填されている側の電極をマイナスとして６Ｖの電圧を２０分間印加した。この操作により、検体をバイオチップの反対側に移動させた後、装置を１８０度反転し、上記と同様の作業を２回繰り返した。ハイブリダイゼーション終了後、２ｘＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ溶液中で４０分その後、２ｘＳＳＣ溶液中で２０分洗浄をおこなった。その後、蛍光顕微鏡を用いてバイオチップを観察した。その結果、プローブの固定化したスポットから光量２００００の蛍光を検出することができた。ハイブリ時間は８０分であった。
【００６９】
（実施例４）
縦横15mm、厚さ１ｍｍのガラス板に、実施例１で使用した重合液を、スポッターを用いて144箇所スポットした後、温度を55℃に上げ重合を行った。実施例１同様に、１４４スポットのうちの１０スポットには６５ベースの核酸プローブＡを重合液に加え重合し図３に示すバイオチップを作製した。
【００７０】
実施例１と同様の方法にて、バイオチップを用いてハイブリダイゼーションおよび洗浄をおこなった。その後、蛍光顕微鏡を用いてバイオチップを観察した。その結果、プローブの固定化したスポットから光量７０００の蛍光を検出することができた。
【００７１】
（比較例１）
実施例１と同様の方法で、電圧を印加せずにシグナル強度が実施例１と同じ６０００となるまでハイブリダイゼーションを行った。その結果、プローブのシグナル強度が６０００になるまでには１０時間必要であることが分った。
【００７２】
（比較例２）
実施例２と同様の方法で、電圧を印加せずにシグナル強度が実施例２と同じ８０００となるまでハイブリダイゼーションを行った。その結果、プローブのシグナル強度が８０００になるまでには１０時間必要であることが分った。
【００７３】
（比較例３）
実施例４と同様の方法で、電圧を印加せずにシグナル強度が実施例４と同じ７０００となるまでハイブリダイゼーションを行った。その結果、プローブのシグナル強度が７０００になるまでには１０時間必要であることが分った。
（比較例４）
実施例１と同様の装置にて、検体液収納部に直径１ｍｍのジルコニアボールを１０個入れ、左右に装置を浸透することにより溶液を攪拌しながら、電圧を印加せずに、実施例１と同様にシグナル強度が６０００となるまでハイブリダイゼーションを行った。その結果プローブのシグナル強度が６０００になるまでには６時間必要であることが分った。
【符号の説明】
【００７４】
１：ハイブリダイゼーション装置
２：本体
４：第１の半透膜
６：第２の半透膜
８：検体液収容部
１０：第１のバッファ液収容部
１２：第２のバッファ液収容部
１４：バイオチップ
１６：バイオチップ取付部
１８：第１の電極
２０：第２の電極
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイブリダイゼーション装置であって、
検体液を収容する検体液収容部と、
前記検体液収容部の深さ方向中間位置あるいはそれより下方に設けられバイオチップを水平に保持するバイオチップ取付部と、
前記検体液収容部の両側の外方に対向して設けられた第１および第２のバッファ液収容部と、
前記検体液収容部と前記第１および第２のバッファ液収容部のそれぞれとを仕切る半透膜と、
前記第１および第２のバッファ液収容部のそれぞれに配置された第１の電極対と、を備えている、
ことを特徴とするハイブリダイゼーション装置。
【請求項２】
前記バイオチップ取付部が、前記検体液収容部の底部に設けられている、
請求項１に記載のハイブリダイゼーション装置。
【請求項３】
前記バイオチップ取付部が、前記検体液収容部の深さ方向中間位置に設けられている、
請求項１に記載のハイブリダイゼーション装置。
【請求項４】
前記検体液収容部の上下の外方に対向して設けられた第３および第４のバッファ液収容部と、
前記検体液収容部と前記第３および第４のバッファ液収容部のそれぞれとを仕切る半透膜と、
前記第３および第４のバッファ液収容部のそれぞれに配置された第２の電極対と、を備えている、
請求項３に記載のハイブリダイゼーション装置。
【請求項５】
バイオチップに固定された第１の生体関連物質と検体液中の第２の生体関連物質とをハイブリダイゼーションさせるハイブリダイゼーション方法であって、
前記バイオチップを検体液中に水平に配置するステップと、
前記バイオチップの表面に沿った第１の方向に沿って前記検体液に電圧を印加し、前記バイオチップの一側部側で前記検体液中の検体を濃縮するステップと、
前記第１の方向とは逆方向に前記検体液に電圧を印加するステップと、を備えている、
ことを特徴とするハイブリダイゼーション方法。
【請求項６】
前記バイオチップの表面に直交する方向に電圧を印加するステップをさらに備えている、
請求項５に記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項１】
ハイブリダイゼーション装置であって、
検体液を収容する検体液収容部と、
前記検体液収容部の深さ方向中間位置あるいはそれより下方に設けられバイオチップを水平に保持するバイオチップ取付部と、
前記検体液収容部の両側の外方に対向して設けられた第１および第２のバッファ液収容部と、
前記検体液収容部と前記第１および第２のバッファ液収容部のそれぞれとを仕切る半透膜と、
前記第１および第２のバッファ液収容部のそれぞれに配置された第１の電極対と、を備えている、
ことを特徴とするハイブリダイゼーション装置。
【請求項２】
前記バイオチップ取付部が、前記検体液収容部の底部に設けられている、
請求項１に記載のハイブリダイゼーション装置。
【請求項３】
前記バイオチップ取付部が、前記検体液収容部の深さ方向中間位置に設けられている、
請求項１に記載のハイブリダイゼーション装置。
【請求項４】
前記検体液収容部の上下の外方に対向して設けられた第３および第４のバッファ液収容部と、
前記検体液収容部と前記第３および第４のバッファ液収容部のそれぞれとを仕切る半透膜と、
前記第３および第４のバッファ液収容部のそれぞれに配置された第２の電極対と、を備えている、
請求項３に記載のハイブリダイゼーション装置。
【請求項５】
バイオチップに固定された第１の生体関連物質と検体液中の第２の生体関連物質とをハイブリダイゼーションさせるハイブリダイゼーション方法であって、
前記バイオチップを検体液中に水平に配置するステップと、
前記バイオチップの表面に沿った第１の方向に沿って前記検体液に電圧を印加し、前記バイオチップの一側部側で前記検体液中の検体を濃縮するステップと、
前記第１の方向とは逆方向に前記検体液に電圧を印加するステップと、を備えている、
ことを特徴とするハイブリダイゼーション方法。
【請求項６】
前記バイオチップの表面に直交する方向に電圧を印加するステップをさらに備えている、
請求項５に記載のハイブリダイゼーション方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１１−４７８４８（Ｐ２０１１−４７８４８Ａ）
【公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１９７８０４（Ｐ２００９−１９７８０４）
【出願日】平成２１年８月２８日（２００９．８．２８）
【出願人】（０００００６０３５）三菱レイヨン株式会社 (2,875)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月２８日（２００９．８．２８）
【出願人】（０００００６０３５）三菱レイヨン株式会社 (2,875)
【Ｆターム（参考）】
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