ハーブ組成物およびその調製方法
有効成分としての治療上有効な量のキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物を、単独でまたは薬学的に許容可能な賦形剤を一緒に含んでなる、ハーブ組成物。ハーブ組成物の調製方法を提供する。ハーブ組成物は、イマチニブ(ｇｌｅｅｖｅｃまたはｇｌｉｖｅｃ)による治療に耐性を示す慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ；慢性の骨髄性白血病)の治療に適応される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有効成分としての治療上有効な量のキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物を、単独でまたは薬学的に許容可能な賦形剤を一緒に含んでなる、ハーブ組成物に関する。本発明の組成物は、イマチニブ（ｇｌｅｅｖｅｃまたはｇｌｉｖｅｃ）による治療に耐性を示す慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ；慢性の骨髄性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ））の治療に適応される。本発明はまた、ハーブ組成物の製造方法およびイマチニブに耐性を示すＣＭＬ患者に組成物を投与する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性の骨髄性白血病（以後、ＣＭＬと称する）としても公知である慢性骨髄性白血病は、骨髄における大部分の骨髄細胞のクローン産生の増加および無秩序化によって特徴付けられる骨髄の悪性癌である。非特許文献１によれば、ＣＭＬは、フィラデルフィア染色体（Ｐｈ）を生じる染色体相互転座９：２２によって特徴付けられる。この現象は、多能性造血幹細胞において生じ、タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）をコードする第９染色体上のｃ−ａｂｌ癌原遺伝子を、第２２染色体上の遺伝子Ｂｃｒの第２のエキソンの下流の新たな位置に転位させる。この転座は、ｃ−Ａｂｌと比較してＰＴＫ活性が異常に調節されるキメラタンパク質、ｐ２１０Ｂｃｒ−Ａｂｌをコードする新規の融合遺伝子、Ｂｃｒ−Ａｂｌを生じる。Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合タンパク質は、一連の不適切な造血細胞増殖を駆動し、それにより、白血病への転換に寄与する（非特許文献２）。さらに加えて、トランスジェニックマウスにおけるｐ２１０Ｂｃｒ−Ａｂｌの発現は、ＣＭＬ様骨髄増殖性疾患を引き起こすことが示されている。従って、ｐ２１０Ｂｃｒ−Ａｂｌは、ＣＭＬの主要な原因因子として基本的な役割を果たすようである（非特許文献３）。
【０００３】
ＣＭＬは３段階で進行する。ほとんどの患者は、４〜６年間の間に平均値を示す慢性期と呼ばれる第１の段階で診断される。それは、時間を経て、移行期と呼ばれる第２の段階、次いで最終的に芽球期または急性転化と呼ばれる第３の段階に発展し得る。慢性期では、血液および骨髄中に通常より多くの白血球細胞が存在する。ほとんどは、正常に作用することができる成熟細胞である。疾患は、血液、骨髄および脾臓における未分化な芽球細胞（未成熟白血球細胞）の出現によって特徴付けられる移行期を介して緩徐に進行する。次いで、移行期は、疾患の末期の急性転化期へと進行する。この段階における平均生存期間は１８週間である。芽球期は、血液および骨髄細胞中の３０％を超える芽細胞の存在によって特徴付けられる。
【０００４】
ＣＭＬの診断後の患者の平均生存期間は、４〜６年であり、１年未満〜１０年を超える範囲を伴う（非特許文献１）。ＣＭＬを伴う患者の治療の選択は限られており、白血病の段階、ならびに患者の年齢および健康状態に基づく。疾患は、骨髄移植（ＢＭＴ）療法または薬物療法によって治療され得る。ＢＭＴ療法では、１つもしくはそれ以上の極めて高用量の薬物を患者に投与して、骨髄における癌細胞のほとんどを死滅させ、破壊された幹細胞を、組織型が患者の組織型とほぼ同一であるドナー由来の健康な細胞で置き換える必要がある。しかし、この治療の使用は、ドナーの利用可能性、ならびに処置に関連する罹患率および死亡率によって限定される。ＣＭＬ患者にとって第２の治療の選択肢は薬物療法である。ヒドロキシ尿素またはブスルファンの使用に関する経口骨髄抑制化学療法は、ＣＭＬ患者における血球数を制御し、症状を改善することが示されているが、生存率にはそれほど影響を及ぼさなかった（非特許文献４）。インターフェロン−アルファは、ＣＭＬの治療で選択される治療の１つであり、ＣＭＬ患者の生存率の改善を示した。しかし、インターフェロン−アルファによる治療に対して耐性を示す患者の存在が報告されている（非特許文献５）。イマチニブ（ｇｌｅｅｖｅｃまたはｇｌｉｖｅｃ）と呼ばれる比較的新しい薬物が、ＣＭＬの治療で現在最も特異的な薬物であり、極めて有効な療法として認識されている。Ｐｈ染色体が、Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合タンパク質を生じ、構成的に活性であり、異常に調節されたタンパク質チロシンキナーゼを産生することは、本明細書において、上記で既に考察された。イマチニブは、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼを阻害することによって作用する（非特許文献６）。薬物は、特に、酵素のＡＴＰ結合部位で競合的な阻害を介して機能し、Ｂｃｒ−Ａｂｌを発現する細胞の増殖停止またはアポトーシスを引き起こす（非特許文献７）。ＣＭＬ患者におけるイマチニブの有効性は、血液学的および細胞遺伝学的応答速度の全体に基づく。有意な血液学的および細胞遺伝学的応答にもかかわらず、イマチニブに対する耐性もまた、ＣＭＬ患者、特に、疾患の進行期または芽球期のいずれかまで進行した患者で観察されている。特許文献１（「US'105 Patent Appln.」）は、ＣＭＬ患者のイマチニブ耐性に関連する可能性のある機序について説明し、イマチニブ耐性に関連する多くのＢｃｒ−Ａｂｌ変異体を開示する。この耐性を予防または克服するための新たな治療ストラテジーを見出す試みが行われている。最近、２つの実験的薬物、即ち、ニロチニブ（ＡＭＮ−１０７）およびダサチニブ（ＢＭＳ−３５４８２５）が、イマチニブ耐性のすべてではないが、いくつかの形態を阻止するのに有効であることが見出された。ニロチニブは、ＣＭＬ患者の治療に有効であることが見出された；しかし、Ｔ３１５Ｉ変異を伴う患者は、この薬物に耐性であった（非特許文献８）。Ｔ３１５Ｉ変異は、イマチニブ耐性患者で見られるより優勢な変異の１つである。このＴ３１５Ｉ変異は、キナーゼ活性を保ちつつ、イマチニブのＢｃｒ−Ａｂｌとの結合を有効でないものとすることが示された。前臨床段階にある別の薬物、ＯＮ−０１２２３８０は、野生型およびＴ３１５Ｉイマチニブ耐性変異体の両方を阻害することが見出されているが、イマチニブ耐性の出現を防止するこの薬物の安全性および有効性は、まだ臨床治験に入っていないため、未だ評価されていない。しかし、これらの開発にもかかわらず、イマチニブ耐性ＣＭＬに対して有効な薬剤の必要性はなおも継続して存在する。
【０００５】
本発明者らは、イマチニブによる治療に耐性を示すＣＭＬ患者の問題に対する解決手段を見出すために、幅広く研究を行った。本発明者らは、予想外にも、キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物を含有する組成物が、イマチニブに耐性であるＢｃｒ−Ａｂｌ変異細胞株に対して強力な抗増殖活性を示すことを見出した。本発明は、ハーブ組成物が簡便な製造方法により得ることができる点で有利である。最も重要なことに、前記組成物は、所望される効力を示すだけではなく、高い安全プロファイルを有することである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】US Patent Application Publication no. 20030158105
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】National Cancer Institute (NCI): Chronic Myeloid Leukemia : Treatment: Health Professional Version: General Information 2006
【非特許文献２】Drucker BJ et al; Chronic myelogenous leukaemia. Hematology. Am. Soc. Hematol. Educ. Program, 111-135 (2002)
【非特許文献３】Clarkson B D et al; Leukemia. : 11:1404-1428 (1997)
【非特許文献４】Hehlmann R et. al.; Blood: 82: 398-407(1993)
【非特許文献５】Kuhr T et al . Leuk. Res. 27(5): 405-411(2003)
【非特許文献６】Buchdunger E. et al; Biochim. Biophys. Acta 1551, M11-M18 (2001)
【非特許文献７】Radford IR et al; Current Opinion Investigational drugs 3, 492-499 (2002)
【非特許文献８】Bocchia M et al: Emerging drugs in CML; Expert Opin. Emerging Drugs (2006) 11(4): 651-664
【発明の概要】
【０００８】
１の態様では、本発明は、治療上有効な量のキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物を、単独で、または少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を一緒に含んでなるハーブ組成物であって、イマチニブ耐性慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の治療に使用するために適応される、ハーブ組成物に関する。
【０００９】
別の態様では、本発明は、治療上有効な量のキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物を、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を一緒に含んでなるハーブ組成物に関し、ここで、前記組成物は、イマチニブ耐性慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の治療に使用するために適応される場合、より高いレベルの安全性という点で有利である。
【００１０】
別のさらなる態様では、本発明は、イマチニブ耐性慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の治療に使用するための治療上有効な量のキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物を、単独でまたは少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を一緒に含んでなるハーブ組成物に関し、ここで、イマチニブに対する耐性は、Ｂｃｒ−Ａｂｌ変異によって生じる。
【００１１】
なお別の態様では、本発明は、治療上有効な量のキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物を、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤と一緒に含んでなるハーブ組成物の製造方法に関する。
【００１２】
なお別のさらなる態様では、本発明は、イマチニブ耐性慢性骨髄性白血病の治療に適応される本発明の組成物の投与のための方法に関する。
【００１３】
別のさらなる態様では、本発明は、有効成分としての治療上有効な量のキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物を、単独で、または少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤と一緒に含んでなる組成物に関し、ここで、前記組成物は、経口、非経口、腹腔内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｉａｌ）、皮下、静脈内または関節内投与のために処方される。
【００１４】
別のさらなる態様では、本発明は、イマチニブ耐性慢性骨髄性白血病の治療のための方法であって、そのような治療を必要とする患者に、治療上有効な量のハーブ組成物を投与することを含んでなる方法に関する。
【００１５】
なお別のさらなる態様では、本発明は、イマチニブ耐性慢性骨髄性白血病の治療のための医薬品の製造のためのハーブ組成物の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、抽出物のＢｃｒ−Ａｂｌキナーゼ阻害活性を示すＫ−５６２細胞株に対するキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物のインビトロ活性を示す。
【図２】図２は、Ｂｃｒ−Ａｂｌ変異イマチニブ耐性細胞株におけるキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物によって誘導されるアポトーシスを示す。
【図３ａ】図３ａは、キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物が、ＳＣＩＤマウスにおける野生型Ｂａ／Ｆ３ Ｂｃｒ−Ａｂｌ／ｐ２１０ＷＴ異種移植片モデル（セットＩ）に対するイマチニブと同等なインビボでの有効性を示すことを表す。
【図３ｂ】図３ｂは、キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物が、Ｂｃｒ−Ａｂｌの最も優勢な変異型、即ち、ＳＣＩＤマウスにおけるＢａ／Ｆ３ Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｔ３１５Ｉ異種移植片モデル（セットＩＩ）を阻害する際に、イマチニブより高いインビボでの有効性を示すことを表す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、有効成分として治療上有効な量のキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物を含んでなるハーブ組成物がＢｃｒ−Ａｂｌ変異イマチニブ耐性細胞株に対して有効であるという知見に基づき、それゆえ、癌、特に、白血病の分野において重要な発明である。より詳細には、本発明は、最近のイマチニブに対する耐性の出現を無効にする解決手段、すなわち、恐ろしい疾患であるＣＭＬの治療のための革新的な薬物を提供する点で注目すべきである。
【００１８】
以下は、本明細書で用いられる用語の定義リストである。これらの定義は、それらが本明細書を通して使用される場合、特定の例示において他で制限されない限り、用語に適用する。
【００１９】
本明細書で用いられる用語「薬学的に許容可能な」は、賦形剤、希釈剤、および／またはその塩が、製剤の他の成分と適合可能でなければならず、そのレシピエントに有害であってはならないことを意味する。
【００２０】
本明細書で用いられる用語「薬学的に許容可能な賦形剤」は、非毒性、不活性固体、半固体の希釈剤、カプセル化材料またはいずれかのタイプの製剤補助剤を意味する。薬学的に許容可能な賦形剤として供給することができる材料のいくつかの例には、ラクトース、グルコース、およびスクロースのような糖；トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンのようなデンプン；セルロース、ならびにカルボキシルメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースのようなその誘導体；麦芽；ゼラチン；タルク；ならびにラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムのような他の毒性のない適合性潤滑剤、ならびに着色剤、放出剤（ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、コーティング剤、甘味料、風味料および着香料であり；保存剤および抗酸化剤もまた、製剤配合者の判断により、組成物中に存在し得る。
【００２１】
本明細書で用いられる用語「治療上有効な量」は、調節または処置される状態で有益な改変を有意に誘導するのに十分な量であるが、（合理的な利益／リスク比で）副作用が存在するとしても、妥当な医学的判断の範囲内で、副作用を回避するのに十分に低い組成物（例えば、キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物）の量を意味する。化合物または組成物の治療上有効な量は、治療される具体的な状態、患者（ｅｎｄ ｕｓｅｒ）の年齢および身体的状態、治療／予防される状態の重症度、治療期間、併用療法の性質、用いられる特定の化合物または組成物、利用される特定の薬学的に許容可能な賦形剤、および類似する要因によって変動する。
【００２２】
用語「キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物」および「キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部抽出物」は、同義的に使用される。
【００２３】
本明細書で用いられる用語「抽出物（ｅｘｔｒａｃｔ）」または「抽出物（ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔ）」は、キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物を指す。キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物という用語は、植物のキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）の葉部に存在する化合物の混和物を意味する。抽出物は、当該分野において周知の抽出手順（例えば、低級アルコール、アルキルエステル、アルキルエーテル、アルキルケトン、クロロホルム、石油エーテル、ヘキサンのような有機溶媒および／または水のような無機溶媒の使用）を用いて調製される。
【００２４】
用語「ハーブ組成物」または「組成物」は同義的に使用され、治療上有効な量のキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物を、単独でまたは少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を一緒に含んでなる組成物を意味しうる。用語「単独で（ｅｉｔｈｅｒ ａｌｏｎｅ）」は、さらに、前記組成物が、いずれの薬学的に許容可能な賦形剤の添加を伴わずにキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部のみを含有することを示し得る。
【００２５】
本明細書で用いられるように、用語「約」は、特定された値の値±２０％の範囲を指す。例えば、語句「約２０」は、２０の±２０％、すなわち１６〜２４を含む。
【００２６】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が明らかに他を指示しない限り、複数形にも言及する。
【００２７】
キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ Ｌ）は、植物のキンマ（ｂｅｔｅｌ ｖｉｎｅ）の植物学上の名称である。キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）植物のハート型の緑色の葉は、印国においてパーン（ｐａａｎ）として一般に知られている。キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）は、コショウ（Ｐｉｐｅｒａｃｅａｅ）科、即ち、黒コショウ（Ｂｌａｃｋ Ｐｅｐｐｅｒ）科に属する（Gunther E.: The Essential oils, 5:160-161 (1952)）。キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）植物の葉はまた、一般にキンマの葉（ｂｅｔｅｌ ｌｅａｆ）とも呼ばれる。様々な疾患の治療のためのキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）抽出物（本明細書において、以後「抽出物（ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔ）」と称する）の使用が報告されている：日本公開特許出願JP 2001098267は、抗酸化剤としての抽出物の使用を開示する；JP 2002212086は、抽出物が優れた抗菌活性を有することを開示する；JP 9278666は、口腔で微生物を滅菌するため、および齲歯を引き起こす効果を除去するために抽出物を使用できることを教示する；JP 200130685は、抗アレルギー剤としての抽出物の使用を報告する；ＰＣＴ公開特許出願WO 0245730は、その抗単球活性のための抽出物の使用を開示する；WO 0245731は、内臓リ−シュマニア症またはカラアザールの治療のための抽出物の有用性を教示し、ならびにUS Patent No. 6967034は、ＣＤ３３＋急性および慢性骨髄性白血病の治療における抽出物の使用を教示する。
【００２８】
本発明は、有効成分としてのキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物を、単独で、または薬学的に許容可能な賦形剤を一緒に含んでなる、ハーブ組成物に関する。
【００２９】
キンマ（キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ））の葉は、以下のタイプ、即ち、ワイルド（Ｗｉｌｄ）タイプ、クライマー（Ｃｌｉｍｂｅｒ）タイプ、バングラ（Ｂａｎｇｌａ）タイプおよびスイート（Ｓｗｅｅｔ）タイプから選択される。
【００３０】
１の態様では、本発明によるハーブ組成物は、有効成分としての治療上有効な量のキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物（「抽出物（ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔ）」）を、単独でまたは少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤と一緒に含んでなる。
【００３１】
組成物に含まれるべき抽出物の治療量は、組成物の全重量に基づいて、約５％〜約５０％（ｗ／ｗ）の間で変動する。
【００３２】
本発明の組成物は、薬学分野において周知のいずれかの方法により調製されてもよい。すべての方法は、有効成分、すなわち、抽出物を、適宜選択された薬学的に許容可能な賦形剤と接触させる工程を含む。投与可能な組成物を調製するための実際の方法および対象への投与に必要な調整は、当業者に知られているか、または明らかであり、例えば、"Remington: The Science And Practice Of Pharmacy," Gennaro, A., Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia (2000)（以前は、「Remingtons Pharmaceutical Sciences」）により詳細に記載されている。
【００３３】
本発明の１の態様によると、以下の工程を含んでなるハーブ組成物の調製方法が提供される：
（ａ）キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物を調製すること；
（ｂ）工程（ａ）の抽出物と少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤とを混合して、組成物を得ること。
【００３４】
本発明により使用されるキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物は、従来の抽出方法によって調製される。キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部抽出物の調製のための一般的手順は、以下の本明細書中に記載される。
【００３５】
本発明のハーブ組成物は、錠剤、ペレット、顆粒、カプセル、溶液、乳液、懸濁液、および使用に適当ないずれか他の形態について、有効成分、即ち、抽出物を、通常の毒性のない薬学的に許容可能な賦形剤と調合することにより、経口投与用に製剤化されてもよい。本発明の製剤は、タルク、水、グルコース、ラクトース、アカシアガム、ゼラチン、マンニトール、デンプン糊、ケイ酸マグネシウム、トウモロコシデンプン、ケラチン、コロイダルシリカ、ジャガイモデンプン、尿素、および固体、半固体または液体形態の製剤の製造に使用するために適切な他の賦形剤を含む製剤を包含し、さらに、補助剤、安定化剤、増粘剤および着色剤が用いられてもよい。錠剤またはカプセルのような固体組成物を調製するために、抽出物は、医薬用賦形剤（例えば、トウモロコシデンプン、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウムまたはゴムのような従来の打錠成分）およびその他の医薬用希釈剤（例えば、水）と混合されて、固体組成物が形成される。次いで、この固体組成物は、有効量の本発明の組成物を含有する単位剤形に小分けされる。抽出物を含有する錠剤または丸剤は、被覆されるか、あるいは調合されて、長期作用の利点が得られる剤形を提供することができる。例えば、錠剤または丸剤は、内剤（ｉｎｎｅｒ ｄｏｓａｇｅ）、および外剤（ｏｕｔｅｒ ｄｏｓａｇｅ）成分を含むことができ、後者は、前者を覆う外覆の形態である。２つの成分は、胃における分解への抵抗性を提供し、内部成分が無傷（ｉｎｔａｃｔ）のまま十二指腸へ通過させるか、または遊離を遅延させることを可能とする腸溶性の層により分離されうる。腸溶性の層または被覆のために、多様な材料を使用することができ、そのような材料には、多くのポリマー酸（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、ならびにポリマー酸と、シェラック、セチルアルコール、および酢酸セルロースのような材料との混合物が含まれる。
【００３６】
抽出物が経口的または注入による投与に取り入れられてもよい液体形態は、水溶液、適切に風味付けされたシロップ、水性または油性懸濁液、ならびに食用油ならびにエリキシル剤および同様の医薬ビヒクルと一緒に風味付けされた乳剤を含む。水性懸濁液のための適当な分散剤または懸濁剤として、トラガント、アカシア、アルギン酸、デキストラン、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンまたはゼラチンのような合成天然ゴムが挙げられる。経口投与のための液体製剤は、例えば、溶液、シロップ、または懸濁液の形態をとることができ、あるいは、それらは、使用前に水またはその他の適当なビヒクルとの再構成のための乾燥製品として提供されてもよい。そのような液体調製物は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、メチルセルロースまたは硬化食用油脂）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステルまたはエチルアルコール）；保存剤（例えば、メチルもしくはプロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸）；ならびに人工もしくは天然の着色剤および／または甘味料のような薬学的に許容可能な添加剤と一緒に従来の手段により調製されてもよい。
【００３７】
キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物を含有する本発明の組成物はまた、従来のカテーテル挿入技術を用いることを含む注入、または輸液による非経口投与のために製剤化されてもよい。注入のための製剤は、単位剤形、例えば、アンプル、または複数投与用容器において、保存剤の添加とともに保存されてもよい。代替的に、有効成分は、使用前に、適当なビヒクル、例えば、滅菌済みのパイロジェンフリー水による再構成のための粉末形態であってもよい。水性注入懸濁液は、例えば、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランを含む懸濁液の粘性を上昇させる物質を含有してもよい。任意選択的に、懸濁液はまた、安定剤を含有してもよい。リポソームはまた、細胞への送達のための薬剤をカプセル化するのに用いることができる。
【００３８】
本発明を実施する場合、有効成分としてキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物を含んでなる組成物は、単独または他の治療用薬剤との組み合わせで使用されてもよい。一定の具体例では、本発明の組成物は、一般的に許容される医療行為に従って、癌化学療法に典型的に処方される他の薬物と一緒に同時投与されてもよい。
【００３９】
本発明によると、組成物の望ましい用量は、対象の状態および体重、重症度、薬物形態、投与経路および投与期間に依存して変動し、熟練した医療従事者によって容易に決定することができる。しかし、望ましい効果を得るために、一般に、本発明による組成物を、１日あたり１ｇ〜２０ｇの範囲の用量で、１回の投与形態または別々に複数回の投与形態で投与することが推奨される。
【００４０】
本発明によると、ハーブ組成物は、イマチニブ耐性慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の治療における使用に適応される。本発明の組成物は、イマチニブ耐性ＣＭＬの治療に有効に使用することができることが実験結果によって立証されている。本組成物は、調製が容易であるだけではなく、現存する高価な薬物、手術またはその両方に対してより優れた代替物を提供する。より重要なことに、本組成物は、一般に使用されている抗癌薬によって生じる重大な有害作用を有さない。
【００４１】
本発明は、その範囲内において、イマチニブ耐性慢性骨髄性白血病の治療のための方法であって、そのような治療を必要とする患者に、治療上有効な量のハーブ組成物を投与することを含んでなる方法を考慮する。
【００４２】
本発明によると、イマチニブ耐性慢性骨髄性白血病の治療のための方法において、組成物を、１日あたり１ｇ〜２０ｇの範囲の用量で、１回の投与形態または別々に複数回の投与形態において、投与することが推奨される。
【００４３】
本発明のハーブ組成物の有効性は、本発明者らによるインビトロ研究で評価され、それによると、本発明の組成物は、Ｂｃｒ−Ａｂｌ変異イマチニブ耐性細胞株に対して強力な阻害活性を有することが観察された。より興味深いことに、それはまた、イマチニブ耐性であるＢｃｒ−Ａｂｌの最も一般的に観察される変異型であるヒトＢｃｒ−Ａｂｌ／Ｔ３１５Ｉを発現する細胞株に対して強力な抗増殖活性を示した。このことは、Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｔ３１５Ｉ変異が、最も有望な２つの実験薬物、ニロチニブ（ＡＭＮ−１０７）およびダサチニブ（ＢＭＳ−３５４８２５）に対する耐性を示すことから、当該技術分野において著しい進歩である。これにより、この問題に対する解決手段を提供するために、当該分野の科学者らに開かれた挑戦を維持した。本発明者らは、治療上有効な量のキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物を含んでなるハーブ組成物の形態で、この問題に対する実施上の解決手段を提供した。
【００４４】
Ｂｃｒ−Ａｂｌ／野生型（Ｂｃｒ−Ａｂｌ／ＷＴ）陽性Ｋ−５６２細胞株（慢性骨髄性白血病患者由来の赤白血病細胞株）に対するインビトロ有効性試験において、本発明者らは、キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物を含んでなる本発明の組成物が、図１に示される自己リン酸化実験で見られるようなＢｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼの直接的な阻害剤であることを観察した。この組成物は、Ｋ−５６２細胞株において、キナーゼ活性の用量依存的に有意な阻害を示した。
【００４５】
本発明者らは、５つの臨床的に観察されたイマチニブ耐性細胞株における本組成物の効果を、イマチニブと比較して試験した。本組成物が変異イマチニブ耐性細胞株を強力に阻害することを観察した。この実験結果を、本明細書において以下に詳細に説明する。表４に示される結果は、劇的に変化するイマチニブの用量と比べて、この組成物の用量が一定のままであることを示す。
【００４６】
本発明の組成物の有効性を実証するために、本発明者らは、完全長の野生型Ｂｃｒ−Ａｂｌを発現する細胞株Ｂａ／Ｆ３トランスフェクタント、およびＳＣＩＤマウスの異種移植片モデルにおける変異Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｔ３１５Ｉ細胞を用いて、キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物のそのインビボにおける抗腫瘍効力について試験した。野生型Ｂｃｒ−Ａｂｌ発現異種移植片、すなわち、ＢＡＦ３ Ｂｃｒ−Ａｂｌ／ｐ２１０ＷＴと同じ用量で試験した場合、キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物は、Ｂｃｒ−Ａｂｌの最も優勢な変異型、すなわち、Ｔ３１５Ｉを阻害する際にイマチニブより有意に高いインビボ有効性を示すことが観察された。図３ａおよび３ｂのグラフ図から、抽出物が野生型Ｂｃｒ−Ａｂｌ異種移植片に対して有効である用量は、抽出物が変異Ｔ３１５Ｉ異種移植片に対して有効である用量とも一致することが明らかである。対照的に、イマチニブは、野生型Ｂｃｒ−Ａｂｌ異種移植片に対して有意な活性を示したが、同じ用量で、変異Ｔ３１５Ｉ異種移植片モデルに対して不活性であることが見出された。
【００４７】
加えて、キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）抽出物はまた、ＨＬ−６０およびＭｏｌｔ−４のような他のヒト白血病細胞株に対して抗増殖活性を示した。
【００４８】
本発明は、発明の範囲を限定するものではなく、むしろ例示するために付与される以下の実施例を参照することにより、より容易に理解される。
【実施例】
【００４９】
実施例１：キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物の調製のための一般的手順
キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）植物の葉部を、直射日光を避け、日陰で乾燥させる。適切な粉砕機を使用して、葉部を粉砕して、６／８メッシュの粒度を有する粉体を得る。約１００Ｋｇの粉体を適当な反応容器に取り、次いで８倍の溶媒（８０％アルコール）をそれに添加する。葉部の粉体を、激しく撹拌しながら、溶媒混合物中で１時間浸漬する。内容物を、７０℃±５℃で（温度到達後）４時間の連続撹拌を伴う還流機構を用いる適当な加熱装置（蒸気）を使用して抽出する。次いで、内容物を室温まで冷まし、遠心分離機、フィルタープレス、篩またはナイロン布のいずれかを用いてろ過して透明なろ過物を得る。絞りかすを取り除き、ろ過物を保存する。このプロセスを繰り返し、ろ過後、絞りかすを取り除く。抽出物を合わせ、溶媒回収のために処理する。透明なろ過物を同じ反応容器に移し、７０℃±５℃および２５ｍｍ±５ｍｍ圧力下における溶媒回収に伴う蒸留により濃縮して、蜂蜜様の粘稠度を有する柔らかい抽出物を得る。この柔らかい抽出物は、最小限からごくわずかな量のアルコールを含有しうる。次いで、生じる柔らかい抽出物を適当な圧力オーブンに移し、その後、内容物を、２５ｍｍ±５ｍｍ圧力下の７０℃±５℃で乾燥させて、厚いペーストを得る。溶媒（水およびアルコール）を、抽出物から完全に取り除く。抽出物を、２５℃／４０％相対湿度（ＲＨ）で貯蔵することができる。
【００５０】
実施例２：キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物を含有するハーブ組成物の調製：顆粒の調製
組成物は、本明細書で特定される量において、以下の表１で列挙した成分を含有する。
【００５１】
表１
【表１】
工程１：
成分：キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物、マンニトールおよびイソプロピルアルコールを、適当な容器に（上記の表１で記載されるような）特定された量で秤量した。成分を均一に混合して懸濁液を得た。懸濁液を、流動層乾燥プロセスによりさらに乾燥させた。
【００５２】
工程２：
成分：アエロジル（Ａｅｒｏｓｉｌ）、クエン酸一水和物、メチルパラベンナトリウム、プロピルパラベンナトリウム、安息香酸ナトリウム、ブロノポール（Ｂｒｏｎｏｐｏｌ）、ラズベリー風味料、糖カラメル着色剤、アスパルテームおよびメントールを、適当な容器に（上記の表１で記載されるような）特定された量で秤量した。内容物を、徹底的に混合し、４０メッシュサイズの篩に通過させた。混合物を均一に混和した。
【００５３】
工程３：
工程１の懸濁液および工程２の混和された混合物を一緒に混合して顆粒を得て、袋に充填した。
【００５４】
顆粒を充填するために用いる袋は、以下の仕様を有しうる。
【００５５】
積層材料グラシン紙（４０ｇｓｍ／アルミニウム（９μｍ／ポリ（１５０ゲージ）
ガセット袋のタイプ
寸法：７０×７０ｍｍ±２ｍｍ
密封：３つのすべての辺で５ｍｍ±１ｍｍおよび充填時の第４の辺で５ｍｍ±１ｍｍ。
重量：１．２００ｇｍｓ±０．１００ｇｍｓ。
【００５６】
実施例３：キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物を含有するハーブ組成物の調製：懸濁液の調製
組成物は、本明細書で特定された量で以下の表２に列挙した成分を含有する。
【００５７】
表２
【表２】
【００５８】
工程１：
成分、プロピレングリコール、マンニトール、ラズベリー風味料およびメントールを、適当な容器に（上記の表２で記載されるような）特定された量で正確に秤量した。成分を、一定の撹拌を伴って均一に混合して懸濁液を得た。
【００５９】
工程２：
成分、メチルパラベンナトリウム、プロピルパラベンナトリウム、安息香酸ナトリウム、ｂｒｏｍｅｒｏｌ、脱塩水およびクエン酸を、適当な容器に（上記の表２で記載されるような）特定された量で正確に秤量した。成分を徹底的に混合して水溶液を得た。
【００６０】
工程３：
成分、ＣＭＣナトリウムおよびＤＭ水を、適当な容器に（上記の表で記載されるような）特定された量で正確に秤量した。成分を、一定の撹拌を伴ってよく混合してゲルを得た。
【００６１】
工程４：
成分、アスパルテームおよびＤＭ水を、適当な容器に（上記の表で記載されるような）特定された量で正確に秤量した。成分を徹底的に混合して溶液を得た。
【００６２】
工程５：
成分：キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物、糖カラメル着色剤およびＤＭ水を、適当な容器に（上記の表で記載されるような）特定された量で正確に秤量した。成分を、一定の撹拌を伴って均一に混合して懸濁液を得た。
【００６３】
工程６：
工程１〜５から得られる上記のすべての内容物を均一に混合し、赤褐色の瓶に充填した。
【００６４】
実施例４：
抽出物のインビトロ抗増殖活性の測定：
細胞増殖アッセイ：
７つの造血細胞株を、詳細を以下の表３に示す異なる入手先から取得した。これらの細胞株を、供給者によって推奨された増殖の至適条件下で維持した。
【００６５】
表３：様々な造血細胞株の説明
【表３】
* Ba/F3細胞はベクター(Ba/F3-pSRα)のみを含有し、ＦＢＳはウシ胎児血清を指す。
入手先: OHSU: 米国のオレゴン保健科学大学
ATCC: 米国のアメリカンタイプカルチャーコレクション
【００６６】
表３に記載の細胞株を、キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物の抗増殖活性を試験するのに用いた。抗増殖剤としての抽出物の能力を、イマチニブ耐性細胞株において、３Ｈ−チミジン取り込みアッセイを用いてイマチニブと比較した。
【００６７】
３Ｈ−チミジン取り込みは、細胞増殖アッセイに用いられる方法である。３Ｈ−チミジン取り込みは、培養中の分裂細胞の数に正比例する。
【００６８】
方法
細胞を、１ウェル（０．０９ｍＬ容積）あたり３〜５×１０３の密度で透明な９６ウェル組織培養プレート（ＮＵＮＣ、米国）に播種し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２〜６時間インキュベートした。イマチニブを、印国のＮａｔｃｏ Ｐｈａｒｍａから購入した。ＤＭＳＯ中でイマチニブの１０ｍｍｏｌ／Ｌストック溶液を調製し、ストック溶液を希釈して実験を行った。抽出物およびイマチニブを、適当な培地に様々な濃度で希釈し、０．０１ｍＬの１０×ストックを、各ウェルに３個ずつ添加した。プレートを、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７２時間インキュベートし、２４時間ごとに断続的に顕微鏡観察を行った。７２時間のインキュベーション後、プレートを、プレート遠心分離機において１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を注意深くアスピレートし、３Ｈ−チミジンを、０．１００ｍＬ完全培地中に０．５μＣｉ／ウェルの濃度で、全てのウェルに添加した。さらに、プレートを、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で６〜１４時間インキュベートした。インキュベーション期間の終了時に、９６ウェルプレートからの細胞を、９６ウェルガラスフィルタープレート（カタログ番号６００５１７７、Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ−９６、ＧＦ／Ｂ、Ｐａｃｋａｒｄ、米国）上で細胞ハーベスター（米国のＰａｃｋａｒｄ）を用いて収集した。フィルタープレートを、６０℃で１時間または室温で一晩完全に乾燥させた。乾燥後、プレートの底をシールで塞ぎ、それに０．０５ｍＬ／ウェルのシンチレント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）液（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ−Ｏ，Ｐａｃｋａｒｄ）を添加した。プレートを上部から密封し、シンチレーションカウンター（ＴｏｐＣｏｕｎｔ，Ｐａｃｋａｒｄ）で読み取り、阻害パーセントおよびＩＣ５０を、コントロール値と比較して計算した。結果を以下の表４に示す。
【００６９】
表４：Ｂｃｒ−Ａｂｌ野生型および変異型イマチニブ耐性細胞株に対するキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物のインビトロ活性
【表４】
【００７０】
上記の表２で示される結果から、キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物が、Ｂｃｒ−Ａｂｌ変異型イマチニブ耐性細胞株（Ｔ３１５Ｉ、Ｅ２５５Ｋ、Ｈ３９６Ｐ、Ｍ３５１ＴおよびＦ３５９Ｖ）に対して有意な抗増殖活性を示したことが明らかである。また、提示されたデータから、本発明の組成物のＩＣ５０値は一貫しているが、一方で、イマチニブのＩＣ５０値はかなりばらつきがあることも注目すべきである。
【００７１】
実施例５：
さらなるＢｃｒ−Ａｂｌ変異型イマチニブ耐性細胞株におけるキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物の細胞傷害性の測定：
【００７２】
表５：:さらなるＢｃｒ−Ａｂｌ変異型イマチニブ耐性細胞株の説明および増殖条件
【表５】
イマチニブ耐性細胞株の入手先：すべての細胞株を、ハワード・ヒューズ医学研究所、米国、オレゴンのオレゴン保健科学大学がん研究センターのＢｒｉａｎ Ｄｒｕｋｅｒ博士の研究室から入手する。
【００７３】
細胞傷害性アッセイ
細胞計数キット−８（ＣＣＫ−８）を、抽出物の細胞傷害性を研究するのに用いた。ＣＣＫ−８は、同仁堂の極めて水溶性のテトラゾリウム塩を利用することにより極めて簡便なアッセイを可能にする。ＷＳＴ−８［２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、一ナトリウム塩］）は、電子伝達体の存在下における還元で水溶性ホルマザン色素を生成する。
【００７４】
細胞を、１ウェル（０．０９ｍＬ容積）あたり３〜５×１０３個の密度で、透明な９６ウェル組織培養プレート（ＮＵＮＣ、米国）に播種し、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で２〜６時間インキュベートした。サンプルを、様々な濃度で培地中に希釈し、０．０１ｍＬの１０×ストックを、各ウェルに３個ずつ添加した。プレートを、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７２時間インキュベートし、２４時間ごとに断続的に顕微鏡観察を行った。７２時間のインキュベーション後、１０μＬのＣＣＫ−８溶液を各ウェルに添加し、プレートをさらに同じインキュベーション条件で４時間インキュベートし、続いて、プレートリーダーで４５０ｎｍの分光光度（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒｉｃ）の吸光度を測定した。結果を以下の表６に示す。
【００７５】
表６：様々なＢｃｒ−Ａｂｌ野生型および変異型イマチニブ耐性細胞株の細胞傷害性に対するキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物の効果
【表６】
Ｒ／Ｓ＝耐性 対 感受性比
【００７６】
上記の表６で特定される結果から、イマチニブは、すべてのイマチニブ耐性Ｂｃｒ−Ａｂｌ変異細胞株において、野生型細胞株と比較して活性が低かったことが明白である。一方で、キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物は、すべての耐性Ｂｃｒ−Ａｂｌ変異細胞株に対して有意な活性を示した。
【００７７】
実施例６：
Ｂｃｒ−Ａｂｌキナーゼ活性におけるキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物の効果
Ｂｃｒ−Ａｂｌキナーゼアッセイ
この目的のために、Ｋ−５６２細胞溶解物由来のＢｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼを、免疫沈降した。これらの免疫複合体を、３２Ｐ−ＡＴＰを用いてキナーゼ反応に使用し、さらに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミド電気泳動）、続いてオートラジオグラフィーで特徴付ける。
【００７８】
Ｋ−５６２細胞を、抽出物の存在または非存在でインキュベーションした後、１０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により回収した。細胞を、０．２ｍＬの細胞溶解緩衝液（ＣｅｌＬｙｔｉｃ（商標） Ｍ Ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ，ＳＩＧＭＡ）を氷上で用いて溶解した。溶解物を、１０，０００ｇで４℃において３０分間遠心分離し、上清を回収した。タンパク質を、タンパク質推定のブラッドフォード法を用いて評価した。２００〜４００μｇのタンパク質では、ｃ−ａｂｌに対する３μｇのモノクローナル抗体を添加し、４℃で１〜２時間インキュベートした。これに、１μｇモノクローナル抗体あたり３〜５μｌのプロテインＡ−セファロース：希釈緩衝液（１：１スラリー）を添加し、さらに４℃で一晩保持した。遠心分離し、ビーズを０．５ｍｌのキナーゼアッセイ緩衝液（キナーゼアッセイ緩衝液：５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＤＴＴ、２．５ｍＭ．ＥＧＴＡ、１０ｍＭβ−グリセロリン酸、１ｍＭのＮａＦ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２）で２回洗浄した。Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質で被覆したビーズを、３０μｌのキナーゼ緩衝液中で再懸濁した。キナーゼアッセイを、４×ホスファターゼインヒビター（ＰＩ）中の（γ）３２Ｐ−ＡＴＰを室温で３０〜４０分間用いて行った。この反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、オートラジオグラフィーにより検出した。２４時間後のキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物により示されるＢｃｒ−Ａｂｌ＋ｖｅ Ｋ−５６２細胞におけるＢｃｒ−Ａｂｌキナーゼ活性の用量依存的阻害を、図１に示す。
【００７９】
実施例７：
フローサイトメトリーを用いた細胞周期とアポトーシスについてのＢｃｒ−Ａｂｌ変異イマチニブ耐性細胞株におけるキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物の効果
フローサイトメトリー（ｃｙｔｏｍｅｔｅｒｙ）のための細胞を、１０×１０４個の細胞／ｍＬの密度で播種し、抽出物／イマチニブと３７℃で５％ＣＯ２インキュベーター中で２４時間インキュベートした。インキュベーション終了時に、細胞を、１０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により回収し、続いて、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した。最後の洗浄からの細胞沈殿物を、染色の透過処理を促進する７０％氷冷エタノールで徐々に再懸濁した。細胞懸濁液を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）による染色前に最低４時間貯蔵した。固定した細胞を、ＲＮａｓｅ Ａ（５０μｇ／ｍＬ）の存在下でＰＩ（８０μｌ／ｍＬ）で染色し、細胞周期分析のためにＢＤ ＦＡＣＳキャリバーで読み取った。この研究結果を、図２に示し、この図は、イマチニブ耐性細胞株におけるキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物により誘導されるアポトーシスが、顕著であることを明らかに示す。
【００８０】
実施例８：
慢性の骨髄性（ｍｙｌｅｏｇｅｎｏｕｓ）白血病（ＣＭＬ）患者細胞におけるキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物の有効性
すべてのサンプルを、インフォームド・コンセントおよび倫理委員会の承認とともに取得した。本研究で用いたＣＭＬ疾患の診断は、標準的な形態学、免疫表現型、および細胞遺伝学的な基準に基づくものである。血液細胞をＦｉｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心に供し、次いでバフィーコートを収集した。
【００８１】
ＣＭＬサンプルを、ハイデラーバードのニザム（Ｎｉｚａｍ’ｓ）医科学研究所から入手した。サンプルを、低温流通体系でＮＰＲＣまで輸送した。受け取ると、サンプルを、Ｆｉｃｏｌｌ／Ｈａｐａｑｕｅ法による密度勾配遠心によりＰＢＬ（末梢血リンパ球）を単離するためにすぐに処理した。ｆｉｃｏｌによって得られるバフィーコートを、ＲＰＭＩ−１６４０培地で２回洗浄した。細胞を、１０％ＦＢＳおよびＧＭ−ＣＳＦを含有する培地中で０．０２〜０．０８ｎｇ／ｍＬの濃度で再懸濁した。得られた細胞を組織培養フラスコに播種し、調整（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）のために、５％ＣＯ２インキュベーター中において３７℃で１〜２時間保持した。播種２時間後の細胞を、血球計数器で計数し、９６ウェルプレートに、０．１８０ｍＬ培地中１ウェルあたり１〜５×１０４個の細胞の密度で播種した。化合物（抽出物／イマチニブ）を１０×ストックまで希釈し、これらのストックのうち０．０２ｍＬをウェルに３個ずつ導入した。さらに、これらのプレートを、５％ＣＯ２インキュベーター中において３７℃でインキュベートした。トリパンブルー細胞計数を意図したプレートを、２４時間間隔ごとに９６時間まで分析した。３Ｈチミジン取り込みのために保持されたプレートを、チミジン取り込みに供した。この研究の結果を以下の表７に示す。
【００８２】
表７：イマチニブ耐性ＣＭＬ患者サンプルに対するキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物の効果
【表７】
【００８３】
実施例９：
イマチニブ耐性およびイマチニブ感受性腫瘍モデルにおけるキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物のインビボ効力試験
完全長野生型Ｂｃｒ−Ａｂｌまたは変異Ｂｃｒ−Ａｂｌ Ｔ３１５Ｉを発現する細胞株Ｂａ／Ｆ３トランスフェクタントを、本研究に使用する。これらは、ハワード・ヒューズ医学研究所、米国、オレゴン州、ポートランドのオレゴン保健科学大学がん研究センターのＢｒｉａｎ Ｄｒｕｋｅｒ博士の研究室から入手した組み換え細胞株である。
【００８４】
抽出物の貯蔵
すべてのサンプル（抽出物／イマチニブ）を、４〜８℃で赤褐色の瓶に貯蔵した。溶液中のサンプル（抽出物／イマチニブ）もまた、４〜８℃で冷蔵庫中に維持した。動物注入用のサンプルを毎日新たに作製し、余った分はプールし、化学物質廃棄のためのＳＯＰに従って処分した。
【００８５】
投与製剤
サンプル（抽出物／イマチニブ）を秤量し、０．５％（ｗ／ｖ）カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）と混合し、（常法に従い（ｓｅｃｕｎｄｕｍ ａｒｔｕｍ））水を徐々に添加しながらＴｗｅｅｎ−２０で倍散して最終濃度にした。
【００８６】
ＳＣＩＤマウスにおける有効性の研究
６〜８週齢、体重約２０ｇの８５匹の重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ株−ＣＢｙＳｍｎ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊ，Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ストック番号００１８０３）雄マウスのグループを使用した。
【００８７】
ＢＡＦ３ Ｂｃｒ−Ａｂｌ／ｐ２１０ＷＴ細胞およびＢＡＦ３ Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｔ３１５Ｉ細胞を、１０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ１６４０培地において、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で増殖させた。細胞を、１０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により沈殿させた。細胞を食塩水で再懸濁して１ｍＬあたり８０〜１００×１０６個の細胞の数を得、この細胞懸濁液の０．２ｍＬを皮下（ｓ．ｃ．）経路でＳＣＩＤマウスに注入した。触知可能な腫瘍塊について、マウスを１日おきに観察した。腫瘍の大きさが直径で５〜７ｍｍの大きさに達したら、動物を、各処置グループに無作為に分けた。投薬を毎日行った。腫瘍の大きさを２〜５日間隔ごとに記録した。腫瘍の重量（ｍｇ）を、長楕円（ｐｒｏｌａｔｅ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄ）の式：｛長さ（ｍｍ）×［幅（ｍｍ）２］×０．５｝（比重を１とし、πを３とみなす）に従って推定した。化合物で処置した動物における腫瘍増殖を、Ｔ／Ｃ（処置済み／コントロール）×１００％として計算し、増殖阻害パーセント（ＧＩ％）を［１００−Ｔ／Ｃ％］とした。
【００８８】
それぞれの処置グループを以下の表８に示す。
【００８９】
表８： 処置グループ（セットＩおよびセットＩＩ）
（セットＩ）名称：Ｂａ／Ｆ３ Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｐ２１０ ＷＴ
【表８−１】
p.o. = 経口投与
q1d x 13 = １３日間で１回の投与
n = 動物の数
注入容量 １０ｍＬ／ｋｇ体重
【００９０】
（セットＩＩ）名称：Ｂａ／Ｆ３ Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｔ３１５Ｉ
【表８−２】
p.o. = 経口投与
q1d x 13 = １３日間で１回の投与
n = 動物数
注入容量 １０ｍＬ／ｋｇ体重
【００９１】
以下の表９に示すデータは、野生型Ｂｃｒ−Ａｂｌ発現異種移植片、すなわち、ＢＡＦ３ Ｂｃｒ−Ａｂｌ／ｐ２１０ＷＴと同じ用量で試験した場合、キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物が、Ｂｃｒ−Ａｂｌの最も優勢な変異型、すなわち、Ｔ３１５Ｉを阻害する際に、イマチニブより有意に高いインビボでの有効性を示すことを実証する。これらの結果を、図３ａ（セットＩ）および３ｂ（セットＩＩ）においてグラフにより示す。
【００９２】
表９：増殖阻害（セットＩおよびセットＩＩ）
（セットＩ）名称：Ｂａ／Ｆ３ Ｂｃｒ−Ａｂｌ／ｐ２１０ ＷＴ
【表９−１】
【００９３】
（セットＩＩ）名称：Ｂａ／Ｆ３ Ｂｃｒ−Ａｂｌ ／Ｔ３１５Ｉ
【表９−２】
活性な薬物GI % ≧ 50%
極めて活性な薬物GI % > 75%
不活性な薬物GI % < 50%
(強調表示された値は有意な腫瘍阻害を示す)
【００９４】
本発明によると、本発明者らは、増殖阻害（ＧＩ）％≧５０％を示す化合物を活性な化合物；増殖阻害（ＧＩ）％＞７５％を示す化合物を極めて活性な化合物、および５０％未満の増殖阻害を示す化合物を不活性な化合物とみなした。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有効成分としての治療上有効な量のキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物を、単独でまたは薬学的に許容可能な賦形剤を一緒に含んでなる、ハーブ組成物に関する。本発明の組成物は、イマチニブ（ｇｌｅｅｖｅｃまたはｇｌｉｖｅｃ）による治療に耐性を示す慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ；慢性の骨髄性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ））の治療に適応される。本発明はまた、ハーブ組成物の製造方法およびイマチニブに耐性を示すＣＭＬ患者に組成物を投与する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性の骨髄性白血病（以後、ＣＭＬと称する）としても公知である慢性骨髄性白血病は、骨髄における大部分の骨髄細胞のクローン産生の増加および無秩序化によって特徴付けられる骨髄の悪性癌である。非特許文献１によれば、ＣＭＬは、フィラデルフィア染色体（Ｐｈ）を生じる染色体相互転座９：２２によって特徴付けられる。この現象は、多能性造血幹細胞において生じ、タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）をコードする第９染色体上のｃ−ａｂｌ癌原遺伝子を、第２２染色体上の遺伝子Ｂｃｒの第２のエキソンの下流の新たな位置に転位させる。この転座は、ｃ−Ａｂｌと比較してＰＴＫ活性が異常に調節されるキメラタンパク質、ｐ２１０Ｂｃｒ−Ａｂｌをコードする新規の融合遺伝子、Ｂｃｒ−Ａｂｌを生じる。Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合タンパク質は、一連の不適切な造血細胞増殖を駆動し、それにより、白血病への転換に寄与する（非特許文献２）。さらに加えて、トランスジェニックマウスにおけるｐ２１０Ｂｃｒ−Ａｂｌの発現は、ＣＭＬ様骨髄増殖性疾患を引き起こすことが示されている。従って、ｐ２１０Ｂｃｒ−Ａｂｌは、ＣＭＬの主要な原因因子として基本的な役割を果たすようである（非特許文献３）。
【０００３】
ＣＭＬは３段階で進行する。ほとんどの患者は、４〜６年間の間に平均値を示す慢性期と呼ばれる第１の段階で診断される。それは、時間を経て、移行期と呼ばれる第２の段階、次いで最終的に芽球期または急性転化と呼ばれる第３の段階に発展し得る。慢性期では、血液および骨髄中に通常より多くの白血球細胞が存在する。ほとんどは、正常に作用することができる成熟細胞である。疾患は、血液、骨髄および脾臓における未分化な芽球細胞（未成熟白血球細胞）の出現によって特徴付けられる移行期を介して緩徐に進行する。次いで、移行期は、疾患の末期の急性転化期へと進行する。この段階における平均生存期間は１８週間である。芽球期は、血液および骨髄細胞中の３０％を超える芽細胞の存在によって特徴付けられる。
【０００４】
ＣＭＬの診断後の患者の平均生存期間は、４〜６年であり、１年未満〜１０年を超える範囲を伴う（非特許文献１）。ＣＭＬを伴う患者の治療の選択は限られており、白血病の段階、ならびに患者の年齢および健康状態に基づく。疾患は、骨髄移植（ＢＭＴ）療法または薬物療法によって治療され得る。ＢＭＴ療法では、１つもしくはそれ以上の極めて高用量の薬物を患者に投与して、骨髄における癌細胞のほとんどを死滅させ、破壊された幹細胞を、組織型が患者の組織型とほぼ同一であるドナー由来の健康な細胞で置き換える必要がある。しかし、この治療の使用は、ドナーの利用可能性、ならびに処置に関連する罹患率および死亡率によって限定される。ＣＭＬ患者にとって第２の治療の選択肢は薬物療法である。ヒドロキシ尿素またはブスルファンの使用に関する経口骨髄抑制化学療法は、ＣＭＬ患者における血球数を制御し、症状を改善することが示されているが、生存率にはそれほど影響を及ぼさなかった（非特許文献４）。インターフェロン−アルファは、ＣＭＬの治療で選択される治療の１つであり、ＣＭＬ患者の生存率の改善を示した。しかし、インターフェロン−アルファによる治療に対して耐性を示す患者の存在が報告されている（非特許文献５）。イマチニブ（ｇｌｅｅｖｅｃまたはｇｌｉｖｅｃ）と呼ばれる比較的新しい薬物が、ＣＭＬの治療で現在最も特異的な薬物であり、極めて有効な療法として認識されている。Ｐｈ染色体が、Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合タンパク質を生じ、構成的に活性であり、異常に調節されたタンパク質チロシンキナーゼを産生することは、本明細書において、上記で既に考察された。イマチニブは、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼを阻害することによって作用する（非特許文献６）。薬物は、特に、酵素のＡＴＰ結合部位で競合的な阻害を介して機能し、Ｂｃｒ−Ａｂｌを発現する細胞の増殖停止またはアポトーシスを引き起こす（非特許文献７）。ＣＭＬ患者におけるイマチニブの有効性は、血液学的および細胞遺伝学的応答速度の全体に基づく。有意な血液学的および細胞遺伝学的応答にもかかわらず、イマチニブに対する耐性もまた、ＣＭＬ患者、特に、疾患の進行期または芽球期のいずれかまで進行した患者で観察されている。特許文献１（「US'105 Patent Appln.」）は、ＣＭＬ患者のイマチニブ耐性に関連する可能性のある機序について説明し、イマチニブ耐性に関連する多くのＢｃｒ−Ａｂｌ変異体を開示する。この耐性を予防または克服するための新たな治療ストラテジーを見出す試みが行われている。最近、２つの実験的薬物、即ち、ニロチニブ（ＡＭＮ−１０７）およびダサチニブ（ＢＭＳ−３５４８２５）が、イマチニブ耐性のすべてではないが、いくつかの形態を阻止するのに有効であることが見出された。ニロチニブは、ＣＭＬ患者の治療に有効であることが見出された；しかし、Ｔ３１５Ｉ変異を伴う患者は、この薬物に耐性であった（非特許文献８）。Ｔ３１５Ｉ変異は、イマチニブ耐性患者で見られるより優勢な変異の１つである。このＴ３１５Ｉ変異は、キナーゼ活性を保ちつつ、イマチニブのＢｃｒ−Ａｂｌとの結合を有効でないものとすることが示された。前臨床段階にある別の薬物、ＯＮ−０１２２３８０は、野生型およびＴ３１５Ｉイマチニブ耐性変異体の両方を阻害することが見出されているが、イマチニブ耐性の出現を防止するこの薬物の安全性および有効性は、まだ臨床治験に入っていないため、未だ評価されていない。しかし、これらの開発にもかかわらず、イマチニブ耐性ＣＭＬに対して有効な薬剤の必要性はなおも継続して存在する。
【０００５】
本発明者らは、イマチニブによる治療に耐性を示すＣＭＬ患者の問題に対する解決手段を見出すために、幅広く研究を行った。本発明者らは、予想外にも、キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物を含有する組成物が、イマチニブに耐性であるＢｃｒ−Ａｂｌ変異細胞株に対して強力な抗増殖活性を示すことを見出した。本発明は、ハーブ組成物が簡便な製造方法により得ることができる点で有利である。最も重要なことに、前記組成物は、所望される効力を示すだけではなく、高い安全プロファイルを有することである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】US Patent Application Publication no. 20030158105
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】National Cancer Institute (NCI): Chronic Myeloid Leukemia : Treatment: Health Professional Version: General Information 2006
【非特許文献２】Drucker BJ et al; Chronic myelogenous leukaemia. Hematology. Am. Soc. Hematol. Educ. Program, 111-135 (2002)
【非特許文献３】Clarkson B D et al; Leukemia. : 11:1404-1428 (1997)
【非特許文献４】Hehlmann R et. al.; Blood: 82: 398-407(1993)
【非特許文献５】Kuhr T et al . Leuk. Res. 27(5): 405-411(2003)
【非特許文献６】Buchdunger E. et al; Biochim. Biophys. Acta 1551, M11-M18 (2001)
【非特許文献７】Radford IR et al; Current Opinion Investigational drugs 3, 492-499 (2002)
【非特許文献８】Bocchia M et al: Emerging drugs in CML; Expert Opin. Emerging Drugs (2006) 11(4): 651-664
【発明の概要】
【０００８】
１の態様では、本発明は、治療上有効な量のキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物を、単独で、または少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を一緒に含んでなるハーブ組成物であって、イマチニブ耐性慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の治療に使用するために適応される、ハーブ組成物に関する。
【０００９】
別の態様では、本発明は、治療上有効な量のキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物を、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を一緒に含んでなるハーブ組成物に関し、ここで、前記組成物は、イマチニブ耐性慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の治療に使用するために適応される場合、より高いレベルの安全性という点で有利である。
【００１０】
別のさらなる態様では、本発明は、イマチニブ耐性慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の治療に使用するための治療上有効な量のキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物を、単独でまたは少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を一緒に含んでなるハーブ組成物に関し、ここで、イマチニブに対する耐性は、Ｂｃｒ−Ａｂｌ変異によって生じる。
【００１１】
なお別の態様では、本発明は、治療上有効な量のキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物を、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤と一緒に含んでなるハーブ組成物の製造方法に関する。
【００１２】
なお別のさらなる態様では、本発明は、イマチニブ耐性慢性骨髄性白血病の治療に適応される本発明の組成物の投与のための方法に関する。
【００１３】
別のさらなる態様では、本発明は、有効成分としての治療上有効な量のキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物を、単独で、または少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤と一緒に含んでなる組成物に関し、ここで、前記組成物は、経口、非経口、腹腔内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｉａｌ）、皮下、静脈内または関節内投与のために処方される。
【００１４】
別のさらなる態様では、本発明は、イマチニブ耐性慢性骨髄性白血病の治療のための方法であって、そのような治療を必要とする患者に、治療上有効な量のハーブ組成物を投与することを含んでなる方法に関する。
【００１５】
なお別のさらなる態様では、本発明は、イマチニブ耐性慢性骨髄性白血病の治療のための医薬品の製造のためのハーブ組成物の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、抽出物のＢｃｒ−Ａｂｌキナーゼ阻害活性を示すＫ−５６２細胞株に対するキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物のインビトロ活性を示す。
【図２】図２は、Ｂｃｒ−Ａｂｌ変異イマチニブ耐性細胞株におけるキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物によって誘導されるアポトーシスを示す。
【図３ａ】図３ａは、キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物が、ＳＣＩＤマウスにおける野生型Ｂａ／Ｆ３ Ｂｃｒ−Ａｂｌ／ｐ２１０ＷＴ異種移植片モデル（セットＩ）に対するイマチニブと同等なインビボでの有効性を示すことを表す。
【図３ｂ】図３ｂは、キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物が、Ｂｃｒ−Ａｂｌの最も優勢な変異型、即ち、ＳＣＩＤマウスにおけるＢａ／Ｆ３ Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｔ３１５Ｉ異種移植片モデル（セットＩＩ）を阻害する際に、イマチニブより高いインビボでの有効性を示すことを表す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、有効成分として治療上有効な量のキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物を含んでなるハーブ組成物がＢｃｒ−Ａｂｌ変異イマチニブ耐性細胞株に対して有効であるという知見に基づき、それゆえ、癌、特に、白血病の分野において重要な発明である。より詳細には、本発明は、最近のイマチニブに対する耐性の出現を無効にする解決手段、すなわち、恐ろしい疾患であるＣＭＬの治療のための革新的な薬物を提供する点で注目すべきである。
【００１８】
以下は、本明細書で用いられる用語の定義リストである。これらの定義は、それらが本明細書を通して使用される場合、特定の例示において他で制限されない限り、用語に適用する。
【００１９】
本明細書で用いられる用語「薬学的に許容可能な」は、賦形剤、希釈剤、および／またはその塩が、製剤の他の成分と適合可能でなければならず、そのレシピエントに有害であってはならないことを意味する。
【００２０】
本明細書で用いられる用語「薬学的に許容可能な賦形剤」は、非毒性、不活性固体、半固体の希釈剤、カプセル化材料またはいずれかのタイプの製剤補助剤を意味する。薬学的に許容可能な賦形剤として供給することができる材料のいくつかの例には、ラクトース、グルコース、およびスクロースのような糖；トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンのようなデンプン；セルロース、ならびにカルボキシルメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースのようなその誘導体；麦芽；ゼラチン；タルク；ならびにラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムのような他の毒性のない適合性潤滑剤、ならびに着色剤、放出剤（ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、コーティング剤、甘味料、風味料および着香料であり；保存剤および抗酸化剤もまた、製剤配合者の判断により、組成物中に存在し得る。
【００２１】
本明細書で用いられる用語「治療上有効な量」は、調節または処置される状態で有益な改変を有意に誘導するのに十分な量であるが、（合理的な利益／リスク比で）副作用が存在するとしても、妥当な医学的判断の範囲内で、副作用を回避するのに十分に低い組成物（例えば、キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物）の量を意味する。化合物または組成物の治療上有効な量は、治療される具体的な状態、患者（ｅｎｄ ｕｓｅｒ）の年齢および身体的状態、治療／予防される状態の重症度、治療期間、併用療法の性質、用いられる特定の化合物または組成物、利用される特定の薬学的に許容可能な賦形剤、および類似する要因によって変動する。
【００２２】
用語「キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物」および「キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部抽出物」は、同義的に使用される。
【００２３】
本明細書で用いられる用語「抽出物（ｅｘｔｒａｃｔ）」または「抽出物（ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔ）」は、キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物を指す。キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物という用語は、植物のキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）の葉部に存在する化合物の混和物を意味する。抽出物は、当該分野において周知の抽出手順（例えば、低級アルコール、アルキルエステル、アルキルエーテル、アルキルケトン、クロロホルム、石油エーテル、ヘキサンのような有機溶媒および／または水のような無機溶媒の使用）を用いて調製される。
【００２４】
用語「ハーブ組成物」または「組成物」は同義的に使用され、治療上有効な量のキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物を、単独でまたは少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を一緒に含んでなる組成物を意味しうる。用語「単独で（ｅｉｔｈｅｒ ａｌｏｎｅ）」は、さらに、前記組成物が、いずれの薬学的に許容可能な賦形剤の添加を伴わずにキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部のみを含有することを示し得る。
【００２５】
本明細書で用いられるように、用語「約」は、特定された値の値±２０％の範囲を指す。例えば、語句「約２０」は、２０の±２０％、すなわち１６〜２４を含む。
【００２６】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が明らかに他を指示しない限り、複数形にも言及する。
【００２７】
キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ Ｌ）は、植物のキンマ（ｂｅｔｅｌ ｖｉｎｅ）の植物学上の名称である。キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）植物のハート型の緑色の葉は、印国においてパーン（ｐａａｎ）として一般に知られている。キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）は、コショウ（Ｐｉｐｅｒａｃｅａｅ）科、即ち、黒コショウ（Ｂｌａｃｋ Ｐｅｐｐｅｒ）科に属する（Gunther E.: The Essential oils, 5:160-161 (1952)）。キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）植物の葉はまた、一般にキンマの葉（ｂｅｔｅｌ ｌｅａｆ）とも呼ばれる。様々な疾患の治療のためのキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）抽出物（本明細書において、以後「抽出物（ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔ）」と称する）の使用が報告されている：日本公開特許出願JP 2001098267は、抗酸化剤としての抽出物の使用を開示する；JP 2002212086は、抽出物が優れた抗菌活性を有することを開示する；JP 9278666は、口腔で微生物を滅菌するため、および齲歯を引き起こす効果を除去するために抽出物を使用できることを教示する；JP 200130685は、抗アレルギー剤としての抽出物の使用を報告する；ＰＣＴ公開特許出願WO 0245730は、その抗単球活性のための抽出物の使用を開示する；WO 0245731は、内臓リ−シュマニア症またはカラアザールの治療のための抽出物の有用性を教示し、ならびにUS Patent No. 6967034は、ＣＤ３３＋急性および慢性骨髄性白血病の治療における抽出物の使用を教示する。
【００２８】
本発明は、有効成分としてのキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物を、単独で、または薬学的に許容可能な賦形剤を一緒に含んでなる、ハーブ組成物に関する。
【００２９】
キンマ（キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ））の葉は、以下のタイプ、即ち、ワイルド（Ｗｉｌｄ）タイプ、クライマー（Ｃｌｉｍｂｅｒ）タイプ、バングラ（Ｂａｎｇｌａ）タイプおよびスイート（Ｓｗｅｅｔ）タイプから選択される。
【００３０】
１の態様では、本発明によるハーブ組成物は、有効成分としての治療上有効な量のキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物（「抽出物（ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔ）」）を、単独でまたは少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤と一緒に含んでなる。
【００３１】
組成物に含まれるべき抽出物の治療量は、組成物の全重量に基づいて、約５％〜約５０％（ｗ／ｗ）の間で変動する。
【００３２】
本発明の組成物は、薬学分野において周知のいずれかの方法により調製されてもよい。すべての方法は、有効成分、すなわち、抽出物を、適宜選択された薬学的に許容可能な賦形剤と接触させる工程を含む。投与可能な組成物を調製するための実際の方法および対象への投与に必要な調整は、当業者に知られているか、または明らかであり、例えば、"Remington: The Science And Practice Of Pharmacy," Gennaro, A., Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia (2000)（以前は、「Remingtons Pharmaceutical Sciences」）により詳細に記載されている。
【００３３】
本発明の１の態様によると、以下の工程を含んでなるハーブ組成物の調製方法が提供される：
（ａ）キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物を調製すること；
（ｂ）工程（ａ）の抽出物と少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤とを混合して、組成物を得ること。
【００３４】
本発明により使用されるキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物は、従来の抽出方法によって調製される。キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部抽出物の調製のための一般的手順は、以下の本明細書中に記載される。
【００３５】
本発明のハーブ組成物は、錠剤、ペレット、顆粒、カプセル、溶液、乳液、懸濁液、および使用に適当ないずれか他の形態について、有効成分、即ち、抽出物を、通常の毒性のない薬学的に許容可能な賦形剤と調合することにより、経口投与用に製剤化されてもよい。本発明の製剤は、タルク、水、グルコース、ラクトース、アカシアガム、ゼラチン、マンニトール、デンプン糊、ケイ酸マグネシウム、トウモロコシデンプン、ケラチン、コロイダルシリカ、ジャガイモデンプン、尿素、および固体、半固体または液体形態の製剤の製造に使用するために適切な他の賦形剤を含む製剤を包含し、さらに、補助剤、安定化剤、増粘剤および着色剤が用いられてもよい。錠剤またはカプセルのような固体組成物を調製するために、抽出物は、医薬用賦形剤（例えば、トウモロコシデンプン、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウムまたはゴムのような従来の打錠成分）およびその他の医薬用希釈剤（例えば、水）と混合されて、固体組成物が形成される。次いで、この固体組成物は、有効量の本発明の組成物を含有する単位剤形に小分けされる。抽出物を含有する錠剤または丸剤は、被覆されるか、あるいは調合されて、長期作用の利点が得られる剤形を提供することができる。例えば、錠剤または丸剤は、内剤（ｉｎｎｅｒ ｄｏｓａｇｅ）、および外剤（ｏｕｔｅｒ ｄｏｓａｇｅ）成分を含むことができ、後者は、前者を覆う外覆の形態である。２つの成分は、胃における分解への抵抗性を提供し、内部成分が無傷（ｉｎｔａｃｔ）のまま十二指腸へ通過させるか、または遊離を遅延させることを可能とする腸溶性の層により分離されうる。腸溶性の層または被覆のために、多様な材料を使用することができ、そのような材料には、多くのポリマー酸（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、ならびにポリマー酸と、シェラック、セチルアルコール、および酢酸セルロースのような材料との混合物が含まれる。
【００３６】
抽出物が経口的または注入による投与に取り入れられてもよい液体形態は、水溶液、適切に風味付けされたシロップ、水性または油性懸濁液、ならびに食用油ならびにエリキシル剤および同様の医薬ビヒクルと一緒に風味付けされた乳剤を含む。水性懸濁液のための適当な分散剤または懸濁剤として、トラガント、アカシア、アルギン酸、デキストラン、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンまたはゼラチンのような合成天然ゴムが挙げられる。経口投与のための液体製剤は、例えば、溶液、シロップ、または懸濁液の形態をとることができ、あるいは、それらは、使用前に水またはその他の適当なビヒクルとの再構成のための乾燥製品として提供されてもよい。そのような液体調製物は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、メチルセルロースまたは硬化食用油脂）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステルまたはエチルアルコール）；保存剤（例えば、メチルもしくはプロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸）；ならびに人工もしくは天然の着色剤および／または甘味料のような薬学的に許容可能な添加剤と一緒に従来の手段により調製されてもよい。
【００３７】
キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物を含有する本発明の組成物はまた、従来のカテーテル挿入技術を用いることを含む注入、または輸液による非経口投与のために製剤化されてもよい。注入のための製剤は、単位剤形、例えば、アンプル、または複数投与用容器において、保存剤の添加とともに保存されてもよい。代替的に、有効成分は、使用前に、適当なビヒクル、例えば、滅菌済みのパイロジェンフリー水による再構成のための粉末形態であってもよい。水性注入懸濁液は、例えば、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランを含む懸濁液の粘性を上昇させる物質を含有してもよい。任意選択的に、懸濁液はまた、安定剤を含有してもよい。リポソームはまた、細胞への送達のための薬剤をカプセル化するのに用いることができる。
【００３８】
本発明を実施する場合、有効成分としてキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物を含んでなる組成物は、単独または他の治療用薬剤との組み合わせで使用されてもよい。一定の具体例では、本発明の組成物は、一般的に許容される医療行為に従って、癌化学療法に典型的に処方される他の薬物と一緒に同時投与されてもよい。
【００３９】
本発明によると、組成物の望ましい用量は、対象の状態および体重、重症度、薬物形態、投与経路および投与期間に依存して変動し、熟練した医療従事者によって容易に決定することができる。しかし、望ましい効果を得るために、一般に、本発明による組成物を、１日あたり１ｇ〜２０ｇの範囲の用量で、１回の投与形態または別々に複数回の投与形態で投与することが推奨される。
【００４０】
本発明によると、ハーブ組成物は、イマチニブ耐性慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の治療における使用に適応される。本発明の組成物は、イマチニブ耐性ＣＭＬの治療に有効に使用することができることが実験結果によって立証されている。本組成物は、調製が容易であるだけではなく、現存する高価な薬物、手術またはその両方に対してより優れた代替物を提供する。より重要なことに、本組成物は、一般に使用されている抗癌薬によって生じる重大な有害作用を有さない。
【００４１】
本発明は、その範囲内において、イマチニブ耐性慢性骨髄性白血病の治療のための方法であって、そのような治療を必要とする患者に、治療上有効な量のハーブ組成物を投与することを含んでなる方法を考慮する。
【００４２】
本発明によると、イマチニブ耐性慢性骨髄性白血病の治療のための方法において、組成物を、１日あたり１ｇ〜２０ｇの範囲の用量で、１回の投与形態または別々に複数回の投与形態において、投与することが推奨される。
【００４３】
本発明のハーブ組成物の有効性は、本発明者らによるインビトロ研究で評価され、それによると、本発明の組成物は、Ｂｃｒ−Ａｂｌ変異イマチニブ耐性細胞株に対して強力な阻害活性を有することが観察された。より興味深いことに、それはまた、イマチニブ耐性であるＢｃｒ−Ａｂｌの最も一般的に観察される変異型であるヒトＢｃｒ−Ａｂｌ／Ｔ３１５Ｉを発現する細胞株に対して強力な抗増殖活性を示した。このことは、Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｔ３１５Ｉ変異が、最も有望な２つの実験薬物、ニロチニブ（ＡＭＮ−１０７）およびダサチニブ（ＢＭＳ−３５４８２５）に対する耐性を示すことから、当該技術分野において著しい進歩である。これにより、この問題に対する解決手段を提供するために、当該分野の科学者らに開かれた挑戦を維持した。本発明者らは、治療上有効な量のキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物を含んでなるハーブ組成物の形態で、この問題に対する実施上の解決手段を提供した。
【００４４】
Ｂｃｒ−Ａｂｌ／野生型（Ｂｃｒ−Ａｂｌ／ＷＴ）陽性Ｋ−５６２細胞株（慢性骨髄性白血病患者由来の赤白血病細胞株）に対するインビトロ有効性試験において、本発明者らは、キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物を含んでなる本発明の組成物が、図１に示される自己リン酸化実験で見られるようなＢｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼの直接的な阻害剤であることを観察した。この組成物は、Ｋ−５６２細胞株において、キナーゼ活性の用量依存的に有意な阻害を示した。
【００４５】
本発明者らは、５つの臨床的に観察されたイマチニブ耐性細胞株における本組成物の効果を、イマチニブと比較して試験した。本組成物が変異イマチニブ耐性細胞株を強力に阻害することを観察した。この実験結果を、本明細書において以下に詳細に説明する。表４に示される結果は、劇的に変化するイマチニブの用量と比べて、この組成物の用量が一定のままであることを示す。
【００４６】
本発明の組成物の有効性を実証するために、本発明者らは、完全長の野生型Ｂｃｒ−Ａｂｌを発現する細胞株Ｂａ／Ｆ３トランスフェクタント、およびＳＣＩＤマウスの異種移植片モデルにおける変異Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｔ３１５Ｉ細胞を用いて、キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物のそのインビボにおける抗腫瘍効力について試験した。野生型Ｂｃｒ−Ａｂｌ発現異種移植片、すなわち、ＢＡＦ３ Ｂｃｒ−Ａｂｌ／ｐ２１０ＷＴと同じ用量で試験した場合、キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物は、Ｂｃｒ−Ａｂｌの最も優勢な変異型、すなわち、Ｔ３１５Ｉを阻害する際にイマチニブより有意に高いインビボ有効性を示すことが観察された。図３ａおよび３ｂのグラフ図から、抽出物が野生型Ｂｃｒ−Ａｂｌ異種移植片に対して有効である用量は、抽出物が変異Ｔ３１５Ｉ異種移植片に対して有効である用量とも一致することが明らかである。対照的に、イマチニブは、野生型Ｂｃｒ−Ａｂｌ異種移植片に対して有意な活性を示したが、同じ用量で、変異Ｔ３１５Ｉ異種移植片モデルに対して不活性であることが見出された。
【００４７】
加えて、キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）抽出物はまた、ＨＬ−６０およびＭｏｌｔ−４のような他のヒト白血病細胞株に対して抗増殖活性を示した。
【００４８】
本発明は、発明の範囲を限定するものではなく、むしろ例示するために付与される以下の実施例を参照することにより、より容易に理解される。
【実施例】
【００４９】
実施例１：キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物の調製のための一般的手順
キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）植物の葉部を、直射日光を避け、日陰で乾燥させる。適切な粉砕機を使用して、葉部を粉砕して、６／８メッシュの粒度を有する粉体を得る。約１００Ｋｇの粉体を適当な反応容器に取り、次いで８倍の溶媒（８０％アルコール）をそれに添加する。葉部の粉体を、激しく撹拌しながら、溶媒混合物中で１時間浸漬する。内容物を、７０℃±５℃で（温度到達後）４時間の連続撹拌を伴う還流機構を用いる適当な加熱装置（蒸気）を使用して抽出する。次いで、内容物を室温まで冷まし、遠心分離機、フィルタープレス、篩またはナイロン布のいずれかを用いてろ過して透明なろ過物を得る。絞りかすを取り除き、ろ過物を保存する。このプロセスを繰り返し、ろ過後、絞りかすを取り除く。抽出物を合わせ、溶媒回収のために処理する。透明なろ過物を同じ反応容器に移し、７０℃±５℃および２５ｍｍ±５ｍｍ圧力下における溶媒回収に伴う蒸留により濃縮して、蜂蜜様の粘稠度を有する柔らかい抽出物を得る。この柔らかい抽出物は、最小限からごくわずかな量のアルコールを含有しうる。次いで、生じる柔らかい抽出物を適当な圧力オーブンに移し、その後、内容物を、２５ｍｍ±５ｍｍ圧力下の７０℃±５℃で乾燥させて、厚いペーストを得る。溶媒（水およびアルコール）を、抽出物から完全に取り除く。抽出物を、２５℃／４０％相対湿度（ＲＨ）で貯蔵することができる。
【００５０】
実施例２：キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物を含有するハーブ組成物の調製：顆粒の調製
組成物は、本明細書で特定される量において、以下の表１で列挙した成分を含有する。
【００５１】
表１
【表１】
工程１：
成分：キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物、マンニトールおよびイソプロピルアルコールを、適当な容器に（上記の表１で記載されるような）特定された量で秤量した。成分を均一に混合して懸濁液を得た。懸濁液を、流動層乾燥プロセスによりさらに乾燥させた。
【００５２】
工程２：
成分：アエロジル（Ａｅｒｏｓｉｌ）、クエン酸一水和物、メチルパラベンナトリウム、プロピルパラベンナトリウム、安息香酸ナトリウム、ブロノポール（Ｂｒｏｎｏｐｏｌ）、ラズベリー風味料、糖カラメル着色剤、アスパルテームおよびメントールを、適当な容器に（上記の表１で記載されるような）特定された量で秤量した。内容物を、徹底的に混合し、４０メッシュサイズの篩に通過させた。混合物を均一に混和した。
【００５３】
工程３：
工程１の懸濁液および工程２の混和された混合物を一緒に混合して顆粒を得て、袋に充填した。
【００５４】
顆粒を充填するために用いる袋は、以下の仕様を有しうる。
【００５５】
積層材料グラシン紙（４０ｇｓｍ／アルミニウム（９μｍ／ポリ（１５０ゲージ）
ガセット袋のタイプ
寸法：７０×７０ｍｍ±２ｍｍ
密封：３つのすべての辺で５ｍｍ±１ｍｍおよび充填時の第４の辺で５ｍｍ±１ｍｍ。
重量：１．２００ｇｍｓ±０．１００ｇｍｓ。
【００５６】
実施例３：キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物を含有するハーブ組成物の調製：懸濁液の調製
組成物は、本明細書で特定された量で以下の表２に列挙した成分を含有する。
【００５７】
表２
【表２】
【００５８】
工程１：
成分、プロピレングリコール、マンニトール、ラズベリー風味料およびメントールを、適当な容器に（上記の表２で記載されるような）特定された量で正確に秤量した。成分を、一定の撹拌を伴って均一に混合して懸濁液を得た。
【００５９】
工程２：
成分、メチルパラベンナトリウム、プロピルパラベンナトリウム、安息香酸ナトリウム、ｂｒｏｍｅｒｏｌ、脱塩水およびクエン酸を、適当な容器に（上記の表２で記載されるような）特定された量で正確に秤量した。成分を徹底的に混合して水溶液を得た。
【００６０】
工程３：
成分、ＣＭＣナトリウムおよびＤＭ水を、適当な容器に（上記の表で記載されるような）特定された量で正確に秤量した。成分を、一定の撹拌を伴ってよく混合してゲルを得た。
【００６１】
工程４：
成分、アスパルテームおよびＤＭ水を、適当な容器に（上記の表で記載されるような）特定された量で正確に秤量した。成分を徹底的に混合して溶液を得た。
【００６２】
工程５：
成分：キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物、糖カラメル着色剤およびＤＭ水を、適当な容器に（上記の表で記載されるような）特定された量で正確に秤量した。成分を、一定の撹拌を伴って均一に混合して懸濁液を得た。
【００６３】
工程６：
工程１〜５から得られる上記のすべての内容物を均一に混合し、赤褐色の瓶に充填した。
【００６４】
実施例４：
抽出物のインビトロ抗増殖活性の測定：
細胞増殖アッセイ：
７つの造血細胞株を、詳細を以下の表３に示す異なる入手先から取得した。これらの細胞株を、供給者によって推奨された増殖の至適条件下で維持した。
【００６５】
表３：様々な造血細胞株の説明
【表３】
* Ba/F3細胞はベクター(Ba/F3-pSRα)のみを含有し、ＦＢＳはウシ胎児血清を指す。
入手先: OHSU: 米国のオレゴン保健科学大学
ATCC: 米国のアメリカンタイプカルチャーコレクション
【００６６】
表３に記載の細胞株を、キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物の抗増殖活性を試験するのに用いた。抗増殖剤としての抽出物の能力を、イマチニブ耐性細胞株において、３Ｈ−チミジン取り込みアッセイを用いてイマチニブと比較した。
【００６７】
３Ｈ−チミジン取り込みは、細胞増殖アッセイに用いられる方法である。３Ｈ−チミジン取り込みは、培養中の分裂細胞の数に正比例する。
【００６８】
方法
細胞を、１ウェル（０．０９ｍＬ容積）あたり３〜５×１０３の密度で透明な９６ウェル組織培養プレート（ＮＵＮＣ、米国）に播種し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２〜６時間インキュベートした。イマチニブを、印国のＮａｔｃｏ Ｐｈａｒｍａから購入した。ＤＭＳＯ中でイマチニブの１０ｍｍｏｌ／Ｌストック溶液を調製し、ストック溶液を希釈して実験を行った。抽出物およびイマチニブを、適当な培地に様々な濃度で希釈し、０．０１ｍＬの１０×ストックを、各ウェルに３個ずつ添加した。プレートを、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７２時間インキュベートし、２４時間ごとに断続的に顕微鏡観察を行った。７２時間のインキュベーション後、プレートを、プレート遠心分離機において１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を注意深くアスピレートし、３Ｈ−チミジンを、０．１００ｍＬ完全培地中に０．５μＣｉ／ウェルの濃度で、全てのウェルに添加した。さらに、プレートを、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で６〜１４時間インキュベートした。インキュベーション期間の終了時に、９６ウェルプレートからの細胞を、９６ウェルガラスフィルタープレート（カタログ番号６００５１７７、Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ−９６、ＧＦ／Ｂ、Ｐａｃｋａｒｄ、米国）上で細胞ハーベスター（米国のＰａｃｋａｒｄ）を用いて収集した。フィルタープレートを、６０℃で１時間または室温で一晩完全に乾燥させた。乾燥後、プレートの底をシールで塞ぎ、それに０．０５ｍＬ／ウェルのシンチレント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）液（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ−Ｏ，Ｐａｃｋａｒｄ）を添加した。プレートを上部から密封し、シンチレーションカウンター（ＴｏｐＣｏｕｎｔ，Ｐａｃｋａｒｄ）で読み取り、阻害パーセントおよびＩＣ５０を、コントロール値と比較して計算した。結果を以下の表４に示す。
【００６９】
表４：Ｂｃｒ−Ａｂｌ野生型および変異型イマチニブ耐性細胞株に対するキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物のインビトロ活性
【表４】
【００７０】
上記の表２で示される結果から、キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物が、Ｂｃｒ−Ａｂｌ変異型イマチニブ耐性細胞株（Ｔ３１５Ｉ、Ｅ２５５Ｋ、Ｈ３９６Ｐ、Ｍ３５１ＴおよびＦ３５９Ｖ）に対して有意な抗増殖活性を示したことが明らかである。また、提示されたデータから、本発明の組成物のＩＣ５０値は一貫しているが、一方で、イマチニブのＩＣ５０値はかなりばらつきがあることも注目すべきである。
【００７１】
実施例５：
さらなるＢｃｒ−Ａｂｌ変異型イマチニブ耐性細胞株におけるキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物の細胞傷害性の測定：
【００７２】
表５：:さらなるＢｃｒ−Ａｂｌ変異型イマチニブ耐性細胞株の説明および増殖条件
【表５】
イマチニブ耐性細胞株の入手先：すべての細胞株を、ハワード・ヒューズ医学研究所、米国、オレゴンのオレゴン保健科学大学がん研究センターのＢｒｉａｎ Ｄｒｕｋｅｒ博士の研究室から入手する。
【００７３】
細胞傷害性アッセイ
細胞計数キット−８（ＣＣＫ−８）を、抽出物の細胞傷害性を研究するのに用いた。ＣＣＫ−８は、同仁堂の極めて水溶性のテトラゾリウム塩を利用することにより極めて簡便なアッセイを可能にする。ＷＳＴ−８［２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、一ナトリウム塩］）は、電子伝達体の存在下における還元で水溶性ホルマザン色素を生成する。
【００７４】
細胞を、１ウェル（０．０９ｍＬ容積）あたり３〜５×１０３個の密度で、透明な９６ウェル組織培養プレート（ＮＵＮＣ、米国）に播種し、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で２〜６時間インキュベートした。サンプルを、様々な濃度で培地中に希釈し、０．０１ｍＬの１０×ストックを、各ウェルに３個ずつ添加した。プレートを、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７２時間インキュベートし、２４時間ごとに断続的に顕微鏡観察を行った。７２時間のインキュベーション後、１０μＬのＣＣＫ−８溶液を各ウェルに添加し、プレートをさらに同じインキュベーション条件で４時間インキュベートし、続いて、プレートリーダーで４５０ｎｍの分光光度（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒｉｃ）の吸光度を測定した。結果を以下の表６に示す。
【００７５】
表６：様々なＢｃｒ−Ａｂｌ野生型および変異型イマチニブ耐性細胞株の細胞傷害性に対するキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物の効果
【表６】
Ｒ／Ｓ＝耐性 対 感受性比
【００７６】
上記の表６で特定される結果から、イマチニブは、すべてのイマチニブ耐性Ｂｃｒ−Ａｂｌ変異細胞株において、野生型細胞株と比較して活性が低かったことが明白である。一方で、キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物は、すべての耐性Ｂｃｒ−Ａｂｌ変異細胞株に対して有意な活性を示した。
【００７７】
実施例６：
Ｂｃｒ−Ａｂｌキナーゼ活性におけるキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物の効果
Ｂｃｒ−Ａｂｌキナーゼアッセイ
この目的のために、Ｋ−５６２細胞溶解物由来のＢｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼを、免疫沈降した。これらの免疫複合体を、３２Ｐ−ＡＴＰを用いてキナーゼ反応に使用し、さらに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミド電気泳動）、続いてオートラジオグラフィーで特徴付ける。
【００７８】
Ｋ−５６２細胞を、抽出物の存在または非存在でインキュベーションした後、１０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により回収した。細胞を、０．２ｍＬの細胞溶解緩衝液（ＣｅｌＬｙｔｉｃ（商標） Ｍ Ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ，ＳＩＧＭＡ）を氷上で用いて溶解した。溶解物を、１０，０００ｇで４℃において３０分間遠心分離し、上清を回収した。タンパク質を、タンパク質推定のブラッドフォード法を用いて評価した。２００〜４００μｇのタンパク質では、ｃ−ａｂｌに対する３μｇのモノクローナル抗体を添加し、４℃で１〜２時間インキュベートした。これに、１μｇモノクローナル抗体あたり３〜５μｌのプロテインＡ−セファロース：希釈緩衝液（１：１スラリー）を添加し、さらに４℃で一晩保持した。遠心分離し、ビーズを０．５ｍｌのキナーゼアッセイ緩衝液（キナーゼアッセイ緩衝液：５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＤＴＴ、２．５ｍＭ．ＥＧＴＡ、１０ｍＭβ−グリセロリン酸、１ｍＭのＮａＦ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２）で２回洗浄した。Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質で被覆したビーズを、３０μｌのキナーゼ緩衝液中で再懸濁した。キナーゼアッセイを、４×ホスファターゼインヒビター（ＰＩ）中の（γ）３２Ｐ−ＡＴＰを室温で３０〜４０分間用いて行った。この反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、オートラジオグラフィーにより検出した。２４時間後のキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物により示されるＢｃｒ−Ａｂｌ＋ｖｅ Ｋ−５６２細胞におけるＢｃｒ−Ａｂｌキナーゼ活性の用量依存的阻害を、図１に示す。
【００７９】
実施例７：
フローサイトメトリーを用いた細胞周期とアポトーシスについてのＢｃｒ−Ａｂｌ変異イマチニブ耐性細胞株におけるキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物の効果
フローサイトメトリー（ｃｙｔｏｍｅｔｅｒｙ）のための細胞を、１０×１０４個の細胞／ｍＬの密度で播種し、抽出物／イマチニブと３７℃で５％ＣＯ２インキュベーター中で２４時間インキュベートした。インキュベーション終了時に、細胞を、１０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により回収し、続いて、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した。最後の洗浄からの細胞沈殿物を、染色の透過処理を促進する７０％氷冷エタノールで徐々に再懸濁した。細胞懸濁液を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）による染色前に最低４時間貯蔵した。固定した細胞を、ＲＮａｓｅ Ａ（５０μｇ／ｍＬ）の存在下でＰＩ（８０μｌ／ｍＬ）で染色し、細胞周期分析のためにＢＤ ＦＡＣＳキャリバーで読み取った。この研究結果を、図２に示し、この図は、イマチニブ耐性細胞株におけるキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物により誘導されるアポトーシスが、顕著であることを明らかに示す。
【００８０】
実施例８：
慢性の骨髄性（ｍｙｌｅｏｇｅｎｏｕｓ）白血病（ＣＭＬ）患者細胞におけるキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物の有効性
すべてのサンプルを、インフォームド・コンセントおよび倫理委員会の承認とともに取得した。本研究で用いたＣＭＬ疾患の診断は、標準的な形態学、免疫表現型、および細胞遺伝学的な基準に基づくものである。血液細胞をＦｉｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心に供し、次いでバフィーコートを収集した。
【００８１】
ＣＭＬサンプルを、ハイデラーバードのニザム（Ｎｉｚａｍ’ｓ）医科学研究所から入手した。サンプルを、低温流通体系でＮＰＲＣまで輸送した。受け取ると、サンプルを、Ｆｉｃｏｌｌ／Ｈａｐａｑｕｅ法による密度勾配遠心によりＰＢＬ（末梢血リンパ球）を単離するためにすぐに処理した。ｆｉｃｏｌによって得られるバフィーコートを、ＲＰＭＩ−１６４０培地で２回洗浄した。細胞を、１０％ＦＢＳおよびＧＭ−ＣＳＦを含有する培地中で０．０２〜０．０８ｎｇ／ｍＬの濃度で再懸濁した。得られた細胞を組織培養フラスコに播種し、調整（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）のために、５％ＣＯ２インキュベーター中において３７℃で１〜２時間保持した。播種２時間後の細胞を、血球計数器で計数し、９６ウェルプレートに、０．１８０ｍＬ培地中１ウェルあたり１〜５×１０４個の細胞の密度で播種した。化合物（抽出物／イマチニブ）を１０×ストックまで希釈し、これらのストックのうち０．０２ｍＬをウェルに３個ずつ導入した。さらに、これらのプレートを、５％ＣＯ２インキュベーター中において３７℃でインキュベートした。トリパンブルー細胞計数を意図したプレートを、２４時間間隔ごとに９６時間まで分析した。３Ｈチミジン取り込みのために保持されたプレートを、チミジン取り込みに供した。この研究の結果を以下の表７に示す。
【００８２】
表７：イマチニブ耐性ＣＭＬ患者サンプルに対するキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物の効果
【表７】
【００８３】
実施例９：
イマチニブ耐性およびイマチニブ感受性腫瘍モデルにおけるキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物のインビボ効力試験
完全長野生型Ｂｃｒ−Ａｂｌまたは変異Ｂｃｒ−Ａｂｌ Ｔ３１５Ｉを発現する細胞株Ｂａ／Ｆ３トランスフェクタントを、本研究に使用する。これらは、ハワード・ヒューズ医学研究所、米国、オレゴン州、ポートランドのオレゴン保健科学大学がん研究センターのＢｒｉａｎ Ｄｒｕｋｅｒ博士の研究室から入手した組み換え細胞株である。
【００８４】
抽出物の貯蔵
すべてのサンプル（抽出物／イマチニブ）を、４〜８℃で赤褐色の瓶に貯蔵した。溶液中のサンプル（抽出物／イマチニブ）もまた、４〜８℃で冷蔵庫中に維持した。動物注入用のサンプルを毎日新たに作製し、余った分はプールし、化学物質廃棄のためのＳＯＰに従って処分した。
【００８５】
投与製剤
サンプル（抽出物／イマチニブ）を秤量し、０．５％（ｗ／ｖ）カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）と混合し、（常法に従い（ｓｅｃｕｎｄｕｍ ａｒｔｕｍ））水を徐々に添加しながらＴｗｅｅｎ−２０で倍散して最終濃度にした。
【００８６】
ＳＣＩＤマウスにおける有効性の研究
６〜８週齢、体重約２０ｇの８５匹の重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ株−ＣＢｙＳｍｎ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊ，Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ストック番号００１８０３）雄マウスのグループを使用した。
【００８７】
ＢＡＦ３ Ｂｃｒ−Ａｂｌ／ｐ２１０ＷＴ細胞およびＢＡＦ３ Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｔ３１５Ｉ細胞を、１０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ１６４０培地において、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で増殖させた。細胞を、１０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により沈殿させた。細胞を食塩水で再懸濁して１ｍＬあたり８０〜１００×１０６個の細胞の数を得、この細胞懸濁液の０．２ｍＬを皮下（ｓ．ｃ．）経路でＳＣＩＤマウスに注入した。触知可能な腫瘍塊について、マウスを１日おきに観察した。腫瘍の大きさが直径で５〜７ｍｍの大きさに達したら、動物を、各処置グループに無作為に分けた。投薬を毎日行った。腫瘍の大きさを２〜５日間隔ごとに記録した。腫瘍の重量（ｍｇ）を、長楕円（ｐｒｏｌａｔｅ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄ）の式：｛長さ（ｍｍ）×［幅（ｍｍ）２］×０．５｝（比重を１とし、πを３とみなす）に従って推定した。化合物で処置した動物における腫瘍増殖を、Ｔ／Ｃ（処置済み／コントロール）×１００％として計算し、増殖阻害パーセント（ＧＩ％）を［１００−Ｔ／Ｃ％］とした。
【００８８】
それぞれの処置グループを以下の表８に示す。
【００８９】
表８： 処置グループ（セットＩおよびセットＩＩ）
（セットＩ）名称：Ｂａ／Ｆ３ Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｐ２１０ ＷＴ
【表８−１】
p.o. = 経口投与
q1d x 13 = １３日間で１回の投与
n = 動物の数
注入容量 １０ｍＬ／ｋｇ体重
【００９０】
（セットＩＩ）名称：Ｂａ／Ｆ３ Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｔ３１５Ｉ
【表８−２】
p.o. = 経口投与
q1d x 13 = １３日間で１回の投与
n = 動物数
注入容量 １０ｍＬ／ｋｇ体重
【００９１】
以下の表９に示すデータは、野生型Ｂｃｒ−Ａｂｌ発現異種移植片、すなわち、ＢＡＦ３ Ｂｃｒ−Ａｂｌ／ｐ２１０ＷＴと同じ用量で試験した場合、キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物が、Ｂｃｒ−Ａｂｌの最も優勢な変異型、すなわち、Ｔ３１５Ｉを阻害する際に、イマチニブより有意に高いインビボでの有効性を示すことを実証する。これらの結果を、図３ａ（セットＩ）および３ｂ（セットＩＩ）においてグラフにより示す。
【００９２】
表９：増殖阻害（セットＩおよびセットＩＩ）
（セットＩ）名称：Ｂａ／Ｆ３ Ｂｃｒ−Ａｂｌ／ｐ２１０ ＷＴ
【表９−１】
【００９３】
（セットＩＩ）名称：Ｂａ／Ｆ３ Ｂｃｒ−Ａｂｌ ／Ｔ３１５Ｉ
【表９−２】
活性な薬物GI % ≧ 50%
極めて活性な薬物GI % > 75%
不活性な薬物GI % < 50%
(強調表示された値は有意な腫瘍阻害を示す)
【００９４】
本発明によると、本発明者らは、増殖阻害（ＧＩ）％≧５０％を示す化合物を活性な化合物；増殖阻害（ＧＩ）％＞７５％を示す化合物を極めて活性な化合物、および５０％未満の増殖阻害を示す化合物を不活性な化合物とみなした。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分としての治療上有効な量のキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物を、単独でまたは少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を一緒に含んでなるハーブ組成物であって、イマチニブ耐性慢性骨髄性白血病の治療に適応される、ハーブ組成物。
【請求項２】
前記組成物が、約５％〜約５０％（ｗ／ｗ）のキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物を含んでなり、イマチニブ耐性慢性骨髄性白血病の治療に適応される、請求項１に記載のハーブ組成物。
【請求項３】
イマチニブに対する耐性が、Ｂｃｒ−Ａｂｌ変異によって生じる、請求項１または２に記載のハーブ組成物。
【請求項４】
前記組成物が、経口、非経口、皮下、静脈内または関節内投与用に製剤化される、請求項１または２に記載のハーブ組成物。
【請求項５】
前記組成物が、錠剤、カプセル、顆粒、シロップまたは懸濁液の形態の経口投与用に製剤化される、請求項４に記載のハーブ組成物。
【請求項６】
前記組成物が、非経口投与用に製剤化される、請求項５に記載のハーブ組成物。
【請求項７】
少なくとも１つの化学療法剤をさらに含んでなる、請求項１または２に記載のハーブ組成物。
【請求項８】
前記組成物が、１日あたり約１ｇ〜約２０ｇの用量でイマチニブ耐性慢性骨髄性白血病の治療に適応される、請求項１または２に記載のハーブ組成物。
【請求項９】
イマチニブ耐性慢性骨髄性白血病の治療のための医薬品の製造のための請求項１または２に記載のハーブ組成物の使用。
【請求項１０】
請求項１または２に記載のハーブ組成物の治療上有効な量を、それを必要とする患者に投与することを含んでなる、イマチニブ耐性慢性骨髄性白血病の治療のための方法。
【請求項１１】
イマチニブに対する耐性が、Ｂｃｒ−Ａｂｌ変異によって生じる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ハーブ組成物が、経口的、非経口的、皮下、静脈内または関節内に投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ハーブ組成物が、経口的に投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ハーブ組成物が、錠剤、カプセル、顆粒、シロップまたは懸濁液の形態で製剤化される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ハーブ組成物が、非経口的に投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ハーブ組成物が、１日あたり約１ｇ〜約２０ｇの範囲の用量で投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１に記載のハーブ組成物の調製方法であって、以下の工程：
（ａ）キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物を調製すること；
（ｂ）工程（ａ）の抽出物と少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤とを混合して、組成物を得ること、
を含んでなる、方法。
【請求項１８】
工程（ｂ）において、キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物の約５％〜約５０％（ｗ／ｗ）を、前記薬学的に許容可能な賦形剤と混合して、ハーブ組成物が得られる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１】
有効成分としての治療上有効な量のキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物を、単独でまたは少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を一緒に含んでなるハーブ組成物であって、イマチニブ耐性慢性骨髄性白血病の治療に適応される、ハーブ組成物。
【請求項２】
前記組成物が、約５％〜約５０％（ｗ／ｗ）のキンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物を含んでなり、イマチニブ耐性慢性骨髄性白血病の治療に適応される、請求項１に記載のハーブ組成物。
【請求項３】
イマチニブに対する耐性が、Ｂｃｒ−Ａｂｌ変異によって生じる、請求項１または２に記載のハーブ組成物。
【請求項４】
前記組成物が、経口、非経口、皮下、静脈内または関節内投与用に製剤化される、請求項１または２に記載のハーブ組成物。
【請求項５】
前記組成物が、錠剤、カプセル、顆粒、シロップまたは懸濁液の形態の経口投与用に製剤化される、請求項４に記載のハーブ組成物。
【請求項６】
前記組成物が、非経口投与用に製剤化される、請求項５に記載のハーブ組成物。
【請求項７】
少なくとも１つの化学療法剤をさらに含んでなる、請求項１または２に記載のハーブ組成物。
【請求項８】
前記組成物が、１日あたり約１ｇ〜約２０ｇの用量でイマチニブ耐性慢性骨髄性白血病の治療に適応される、請求項１または２に記載のハーブ組成物。
【請求項９】
イマチニブ耐性慢性骨髄性白血病の治療のための医薬品の製造のための請求項１または２に記載のハーブ組成物の使用。
【請求項１０】
請求項１または２に記載のハーブ組成物の治療上有効な量を、それを必要とする患者に投与することを含んでなる、イマチニブ耐性慢性骨髄性白血病の治療のための方法。
【請求項１１】
イマチニブに対する耐性が、Ｂｃｒ−Ａｂｌ変異によって生じる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ハーブ組成物が、経口的、非経口的、皮下、静脈内または関節内に投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ハーブ組成物が、経口的に投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ハーブ組成物が、錠剤、カプセル、顆粒、シロップまたは懸濁液の形態で製剤化される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ハーブ組成物が、非経口的に投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ハーブ組成物が、１日あたり約１ｇ〜約２０ｇの範囲の用量で投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１に記載のハーブ組成物の調製方法であって、以下の工程：
（ａ）キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物を調製すること；
（ｂ）工程（ａ）の抽出物と少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤とを混合して、組成物を得ること、
を含んでなる、方法。
【請求項１８】
工程（ｂ）において、キンマ（Ｐｉｐｅｒ ｂｅｔｌｅ）葉部の抽出物の約５％〜約５０％（ｗ／ｗ）を、前記薬学的に許容可能な賦形剤と混合して、ハーブ組成物が得られる、請求項１７に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【公表番号】特表２０１０−５１３４６４（Ｐ２０１０−５１３４６４Ａ）
【公表日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４２２８６（Ｐ２００９−５４２２８６）
【出願日】平成１９年２月２０日（２００７．２．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００７／０５０５３６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０７８２０３
【国際公開日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【出願人】（５０８０９７６６３）ピラマル・ライフ・サイエンシーズ・リミテッド (8)
【氏名又は名称原語表記】Ｐｉｒａｍａｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月２０日（２００７．２．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００７／０５０５３６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０７８２０３
【国際公開日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【出願人】（５０８０９７６６３）ピラマル・ライフ・サイエンシーズ・リミテッド (8)
【氏名又は名称原語表記】Ｐｉｒａｍａｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ
【Ｆターム（参考）】
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