バイオゲル
バイオゲル、バイオゲルを形成させるためのキット、薬物、および方法を記載する。バイオゲルは、止血、創傷封止、組織工学または局所的薬物送達などの種々の用途に用いることができる。本発明によれば、複数の担体、各担体に固定化される複数のフィブリノーゲン結合部分；フィブリノーゲンの各分子が少なくとも２つのフィブリノーゲン結合部分に結合することができるフィブリノーゲンを含むバイオゲルキット（即ち、バイオゲルを形成させるためのキット）が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオゲル、並びにバイオゲルを形成させるためのキット、薬物、および方法に関する。好ましい局面では、バイオゲルは組織接着剤である。バイオゲルまたは組織接着剤は、止血、創傷封止、組織工学または局所的薬物送達を含む種々の用途に用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
凝固過程において、フィブリノーゲンは、トロンビンによってフィブリンへと変換される。フィブリノーゲンは、ジスルフィド結合によって互いに連結された３種の鎖（α、β、およびγ）の２セットを含む。これらの鎖は一緒になって、２つの遠位球状ドメイン（Ｄドメイン）に接続した中心球状ドメイン（Ｅドメイン）を形成する。トロンビンは、フィブリノーゲンの中心Ｅドメインに含まれる４つのアルギニン−グリシンペプチド結合を切断し、２つのα鎖の各々からＡペプチドを放出し、２つのβ鎖の各々からＢペプチドを放出する。ＡペプチドおよびＢペプチドは、フィブリノペプチドと称される。これらのフィブリノペプチドを欠損しているフィブリノーゲン分子は、フィブリンモノマーと呼ばれる。フィブリンモノマーは、フィブリンと呼ばれる規則的な線維性の配列で自然に集合する。フィブリンは、フィブリンファイバーに含まれる異なる分子の側鎖間で共有結合的な架橋の形成によって安定化される。第ＸＩＩＩａ因子によって触媒されるアミノ基転移反応において、特定のグルタミンとリジンとの間でペプチド結合が形成される。
【０００３】
活性化されると、血小板も血液凝固の必須部分を形成する。血小板は、露出した創傷表面に接着し、活性化されるようになる。血小板の膜糖タンパク質であるＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａは、立体構造の変化を受け、フィブリノーゲンに結合し得る。フィブリノーゲンは、１を超える血小板に結合することができ、その結果、血小板は互いに凝集する。血小板凝集体は、フィブリンのメッシュ内で形成される凝血塊の基本構造を形成する。
【０００４】
フィブリン組織接着剤（ＦＴＡ）は、凝固カスケードの最終段階を模倣することによって形成される製造品に与えられた名称であり、フィブリン血栓塊を形成する。市販のＦＴＡキットは、止血用、薬物送達用、並びに外科用接着剤（ｇｌｕｅ）、および組織封止剤として用いられる強力な生分解性ゲルを速やかに生み出す。フィブリノーゲン、第ＸＩＩＩ因子、トロンビン、およびカルシウムイオンは、典型的には、貯蔵中に、フィブリノーゲンと第ＸＩＩＩ因子とをカルシウムイオンとトロンビンとから分離するシリンジデバイスによって到達される。シリンジから送り出している最中に化合物を混合すると、フィブリノーゲンのトロンビン分解（ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｌｙｓｉｓ）が起こり、フィブリンが生じ、これは、カルシウムイオンにより活性化される第ＸＩＩＩ因子によって後に架橋されるゲル内に自己集合する。しかしながら、多くのＦＴＡは、患者のアナフィラキシー反応および自己免疫反応を誘導する場合があるウシトロンビンを利用する。
【０００５】
Ｚｈａｎｇら（非特許文献１）は、リポソームからカルシウムイオンの光活性化放出によるフィブリノーゲン系のハイドロゲルの形成、その後のトランスグルタミナーゼ触媒のフィブリノーゲンの架橋の活性化を記載する。しかしながら、これらのハイドロゲルの形成を困難にし、リポソームと第ＸＩＩＩ因子の個別の製剤化を必要とする。
【０００６】
Ｈｉｄａｓら（非特許文献２）は、縫合なしの腎保存手術におけるアルブミングルタールアルデヒド組織接着剤の使用を記載する。ウシ血清アルブミンとグルタールアルデヒドを混合した。グルタールアルデヒド曝露によって、ウシ血清アルブミンのリジン分子、細胞外マトリックスタンパク質、および細胞表面が互いに結合されるようになり、強力な共有結合が生じる。しかしながら、この接着剤の欠点は、グルタールアルデヒドが毒性であり、ウシ血清アルブミンが患者のアレルギー反応を誘導し得るという危険性があるということである。
【０００７】
したがって、毒性薬物の使用を必要とせず、アレルギー反応の危険性を最小限にし、安定条件で容易に保存可能である成分から製造し易いゲルまたは組織接着剤を提供することが必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２００２（１３）：６４０−６４６
【非特許文献２】Ｕｒｏｌｏｇｙ ６７（４），２００６：６９７−７００
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明によれば、複数の担体、各担体に固定化される複数のフィブリノーゲン結合部分；フィブリノーゲンの各分子が少なくとも２つのフィブリノーゲン結合部分に結合することができるフィブリノーゲンを含むバイオゲルキット（即ち、バイオゲルを形成させるためのキット）が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図式的に示す：（ａ）担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合ペプチドを有するアルブミン担体；（ｂ）フィブリノーゲン分子；（ｃ）フィブリノーゲン分子がフィブリノーゲン結合ペプチドとフィブリノーゲン分子との間の非共有結合によって担体を介して互いに連結されているバイオゲル。
【図２】３２ｍｇ／ｍｌ、２０℃（Ａ）および３７℃（Ｂ）で２５μｌのペプチド修飾されたＨＳＡおよびフィブリノーゲンの混合物におけるひずみ率に対する貯蔵モジュール（四角）および喪失モジュール（三角）のプロットを示す。
【図３】３２ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲンと混合されたペプチド修飾されたＨＳＡの２５μｌに対する２０℃の貯蔵モジュール（四角）および複素粘度（三角）対振動数を示す（１％のひずみ振幅を有する）。
【図４】ペプチド修飾されたＨＳＡの添加前（ａ）および添加後（ｂ）のフィブリノーゲン溶液の写真を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
用語「バイオゲル」とは、本明細書において、天然または組換えの生物学的分子（もしくは化学的に合成された生物学的分子）であるか、あるいは生物学的分子（例えば、生物学的分子の１以上の機能を保持する誘導体）から誘導される１以上の成分を含むゲルが含まれるように用いられる。
【００１２】
バイオゲルは、フィブリノーゲンと担体とを接触させることによって形成することができる。複数のフィブリノーゲン結合部分が各担体に固定化され、各フィブリノーゲン分子が少なくとも２つのフィブリノーゲン部分に結合することができるため、フィブリノーゲン分子は、担体を介して互いに連結されるようになる。フィブリノーゲン分子とフィブリノーゲン結合部分との間に非共有結合が形成される。
【００１３】
したがって、本発明によれば、フィブリノーゲン分子と複数の担体とを接触させることを含む、バイオゲルを形成させるための方法も提供され、ここで、各担体は、その担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分を有し、フィブリノーゲンの各分子は、少なくとも２つのフィブリノーゲン結合部分に結合することができ、その結果、フィブリノーゲン分子は共に、フィブリノーゲン結合部分とフィブリノーゲン分子との間に非共有結合の形成によって担体を介して連結されるようになる。
【００１４】
さらに、本発明によれば、フィブリノーゲン分子と複数の担体を含むバイオゲルが提供され、ここで、各担体は、その担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分を有し、フィブリノーゲンの各分子は、少なくとも２つのフィブリノーゲン分子部分に結合し、その結果、フィブリノーゲン分子は共に、フィブリノーゲン結合部分とフィブリノーゲン分子との間に非共有結合によって担体を介して連結される。
【００１５】
フィブリノーゲン結合部分の代わりに、担体は、各担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合前駆体を有してもよく、ここで、各フィブリノーゲン結合前駆体は、フィブリノーゲン結合部分に変換され得る。このような担体を用いてバイオゲルを形成するためには、フィブリノーゲン結合前駆体をフィブリノーゲン結合部分に変換させることが必要であり、その結果、フィブリノーゲン結合部分がフィブリノーゲン部分に結合することができる。
【００１６】
したがって、本発明によれば、複数の担体、各担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合前駆体であって、各フィブリノーゲン結合前駆体はフィブリノーゲン結合部分に変換されることができる前駆体；フィブリノーゲンであって、フィブリノーゲンの各分子は少なくとも２つのフィブリノーゲン結合部分に結合することができるフィブリノーゲンを含むバイオゲルキット（即ち、バイオゲルを形成するキット）も提供される。
【００１７】
さらに、本発明によれば、バイオゲルを形成させるための方法であって、各担体がその担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合前駆体を含む複数の担体を用意し；フィブリノーゲン結合前駆体をフィブリノーゲン結合部分に変換し；フィブリノーゲンの各分子が少なくとも２つのフィブリノーゲン結合部分に結合することができるフィブリノーゲン分子とフィブリノーゲン結合部分とを接触させることを含み、その結果、フィブリノーゲン分子が共にフィブリノーゲン結合部分とフィブリノーゲン分子との間に非共有結合の形成によって担体を介して連結するようになる。
【００１８】
本発明のバイオゲルは、組織基質に接着することができる必要はない。しかしながら、好ましい局面では、本発明のバイオゲルは、組織接着剤である。用語「組織接着剤」とは、本明細書において、組織基質、例えば、皮膚、または粘膜表面に接着することができる基質を意味するものとして用いられる。本発明のバイオゲルまたは組織接着剤は、止血用、封止剤として、組織工学用（例えば、支持体として）、または局所的薬物送達用に用いられてもよい。
【００１９】
担体は、可溶性または不溶性担体であってもよいが、血小板ではない。担体は、対象の組織部位、例えば、出血創傷部位、または粘膜部位への局所投与に適していなければならない。可溶性担体は、局所投与よりはむしろ静脈に適していてもよい。担体は、可溶性もしくは不溶性タンパク質、治療薬、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコールなどの生体適合性ポリマー）、またはこれらのいずれかの組み合わせを含んでもよい。
【００２０】
タンパク質担体の例には、酵素または酵素ではないタンパク質、例えばヒト血清アルブミンが挙げられる。
【００２１】
不溶性担体は、微粒子（固体、中空、または多孔性微粒子、好ましくは実質的に球状の微粒子を含む）であってもよい。微粒子は、任意の適切な基質、例えば架橋されたタンパク質で形成されてもよい。適切なタンパク質は、アルブミン（順に血清由来または組換え、ヒトまたは非ヒト）である。本発明における不溶性担体としての使用に適した微粒子は、例えば国際公開第ＷＯ９２／１８１６４号に記載される周知の噴霧乾燥技術を用いてヒト血清アルブミンを噴霧乾燥させることによって形成されてもよい。
【００２２】
担体としての微粒子の使用に代えて、リポソーム、合成ポリマー粒子（例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびポリ（乳酸／グリコール酸））、または細胞膜画分が含まれる。
【００２３】
用語「フィブリノーゲン」とは、本明細書において、天然のフィブリノーゲン、組換えフィブリノーゲン、またはトロンビンによってフィブリン（例えば、天然もしくは組換えフィブリンモノマー、または自然集合することができてもよいかもしくはできなくてもよいフィブリンモノマーの誘導体）を形成するように変換され得るフィブリノーゲンの誘導体を含むように用いられる。フィブリノーゲンは、少なくとも２つのフィブリノーゲン結合部分に結合することができなければならない。フィブリノーゲンは、任意の供給源、任意の種（ウシフィブリノーゲンを含む）から得ることができるが、好ましくはヒトフィブリノーゲンである。ヒトフィブリノーゲンは、自己またはドナーの血液から得てもよい。自己のフィブリノーゲンが好ましく、それは、本発明のバイオゲル（または接着剤）が対象に投与された場合の感染の危険性を減らすためである。
【００２４】
好ましくは、フィブリノーゲン結合部分はフィブリノーゲンに結合し、解離定数（ＫＤ）は１０−９〜１０−６Ｍであり、例えば、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００ｎＭまたはそれらを超える。約１００ｎＭのＫＤが好ましい。解離定数は、平衡状態で測定され得る。例えば、既知濃度の放射性標識されたフィブリノーゲンは、フィブリノーゲン結合部分が架橋されたマイクロスフェアとともにインキュベートされ得る。典型的には、５μＭのペプチドを１ｇｍのマイクロスフェアに架橋し、または、１５〜４０μｍｏｌのペプチドを１ｇｍのマイクロスフェアに架橋する。ペプチドを連結したマイクロスフェアは、０．５ｍｇ／ｍｌに希釈され、ｐＨ７．４の等張バッファー（例えば、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む０．０１Ｍ Ｈｅｐｅｓ）中で、０．０５〜０．５ｍｇ／ｍｌの濃度の放射性標識されたフィブリノーゲンとともに最大１時間２０℃でインキュベートされる。マイクロスフェア上のフィブリノーゲン結合部分に結合されたフィブリノーゲンは、遠心分離によって遊離フィブリノーゲンから分離することができ、遊離フィブリノーゲンと結合フィブリノーゲンの量を測定することができる。次に、解離定数は、結合フィブリノーゲン：遊離フィブリノーゲンの濃度比に対して、結合フィブリノーゲンの濃度をプロットすることにより、スキャッチャード分析によって計算することができ、この場合、曲線の傾きがＫＤを表す。
【００２５】
本発明のある態様では、フィブリノーゲン結合部分は、フィブリノーゲンに選択的に結合することが好ましい。他の態様では、フィブリノーゲン結合部分がフィブリノーゲンに結合し、別々にフィブリンモノマーおよび／またはフィブリンに結合し得ることが好ましい。フィブリノーゲンおよびフィブリンモノマーおよび／またはフィブリンへの結合は、好ましくは選択的である。
【００２６】
好ましくは、フィブリノーゲン結合部分は、フィブリノーゲン結合ペプチドまたはペプチド類似体である。任意の適切なフィブリノーゲン結合ペプチドを用いてもよい。例えば、ペプチドは、自然にまたは血小板の膜糖タンパク質であるＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａによってフィブリンに結合されるフィブリノーゲンの領域に結合することができてもよい。フィブリノーゲンへのフィブリン結合は、Ｍｏｓｅｓｓｏｎら，２００１，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９３６，１１−３０において検討されている。ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａのフィブリノーゲンへの結合は、Ｂｅｎｎｅｔｔ，２００１，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９３６，３４０−３５４において検討されている。
【００２７】
ペプチドは、フィブリノーゲンのα−鎖のカルボキシおよび／またはアミノ末端ドメインに結合することができてもよい。特に、ペプチドは、これらのドメインの１つまたは両方のＲＧＤ含有モチーフ（例えば、アミノ酸９５〜９８のＲＧＤＦ（配列番号１）、またはアミノ酸５７２〜５７５のＲＧＤＳ（配列番号２））に結合することができてもよい。ペプチドは、フィブリノーゲンのγ−鎖のカルボキシ末端ドメイン、好ましくはこのドメインの最後の１２個のアミノ酸（配列ＨＨＬＧＧＡＫＱＡＧＤＶ（配列番号３））に結合することができてもよい。ペプチドは、フィブリノーゲンのγ−鎖のＤ−ドメイン、例えば、Ｄ−ドメインのβ−鎖セグメントに結合することができてもよい。
【００２８】
フィブリノーゲン結合ペプチドは、ＧＰＩＩｂまたはＧＰＩＩＩａのフィブリノーゲン結合領域由来の配列を含んでもよい。例えば、ペプチドは、ＧＰＩＩｂのアミノ酸残基２９４〜３１４の配列に対応する配列ＡＶＴＤＶＮＧＤＧＲＨＤＬＬＶＧＡＰＬＹＭ（配列番号４）、またはフィブリノーゲン結合活性を保持するその断片もしくは誘導体を含んでもよい。フィブリノーゲン結合活性を保持することが知られている断片は、ＴＤＶＮＧＤＧＲＨＤＬ（２９６〜３０６）（配列番号５）、ＧＤＧＲＨＤＬＬＶＧＡＰＬ（３００〜３１２）（配列番号６）、およびＧＡＰＬ（配列番号７）である。ＴＤＶＮＧＤＧＲＨＤＬの適切な誘導体には、Ｔ（Ｄ，Ｅ）ＶＮＧ（Ｄ，Ｅ）ＧＲＨ（Ｄ，Ｅ）Ｌ（配列番号８）；ＴＤ（Ｖ，Ｌ）ＮＧＤＧＲＨＤＬ（配列番号９）；ＴＤＶ（Ｎ，Ｑ）ＧＤＧＲＨＤＬ（配列番号１０）；ＴＤＶＮＧＤＧ（Ｒ，Ｋ）ＨＤＬ（配列番号１１）が含まれる。
【００２９】
フィブリノーゲン結合ペプチドは、ＧＰＩＩＩａの残基９５〜２２３の配列、またはフィブリノーゲン結合活性を保持するその断片もしくは誘導体を含んでもよい。例えば、残基２１１〜２２２は、配列ＳＶＳＲＮＲＤＡＰＥＧＧ（配列番号１２）を含み、ＧＰＩＩＩａに含まれる重要なフィブリノーゲン結合ドメインであると考えられている。ＧＰＩＩＩａの他の適切な領域は、残基１０９〜１７１および１６４〜２０２を含む。
【００３０】
フィブリノーゲン結合ペプチドは、トロンビンの作用によって、フィブリノーゲンに露出されるようになり、フィブリンを生産するための重合反応における第１段階としてフィブリノーゲンに結合する残基の配列を含んでもよい。トロンビンは、フィブリノーゲンのα鎖およびβ鎖のＮ末端からペプチド（フィブリノペプチドＡおよびＢを放出する）を切断し、それぞれ配列ＮＨ２−ＧＰＲ−（配列番号１３）およびＮＨ２−ＧＨＲ−（配列番号１４）を露出する。したがって、フィブリノーゲン結合ペプチドの好ましい例には、アミノ末端のアミノ酸配列ＮＨ２−Ｇ（Ｐ，Ｈ）ＲＸ−（配列番号１５）を含み、この場合、Ｘは任意のアミノ酸であり、（Ｐ，Ｈ）はプロリンまたはヒスチジンのいずれかがその位置に存在することを意味する。好ましくは、ペプチドは、アミノ末端の配列ＮＨ２−ＧＰＲＰ−（配列番号１６）を含む。
【００３１】
好ましくは、フィブリノーゲン結合ペプチドは、長さにして４〜３０個、より好ましくは４〜１０個のアミノ酸残基である。
【００３２】
フィブリノーゲン結合前駆体は、担体がフィブリノーゲンと接触すると、フィブリノーゲン分子は共に、固定化されたフィブリノーゲン結合前駆体を有する担体を介して連結されるようになるようにフィブリノーゲンに結合しなくてもよい。好ましくは、フィブリノーゲンに対するフィブリノーゲン結合前駆体の解離定数は、１×１０６Ｍより大きい。フィブリノーゲン結合前駆体は、ペプチドまたはペプチド類似体であってもよいが、好ましくはペプチドである。フィブリノーゲン結合前駆体は、フィブリノーゲンでなくてもよく、フィブリノーゲンを含まなくてもよい。
【００３３】
本発明の好ましい態様では、フィブリノーゲン結合前駆体は、フィブリノーゲン結合ペプチドへのフィブリノーゲンの結合をブロックまたは阻害（即ち、低下）させるブロッキング成分（好ましくはペプチド）に、アミノ末端で接続されたフィブリノーゲン結合ペプチドを含む。変換剤（好ましくは、トロンビンなどの凝固因子）によるフィブリノーゲン結合前駆体の切断は、担体に結合されたフィブリノーゲン結合ペプチドを露出させ、それによって、フィブリノーゲン結合前駆体がフィブリノーゲン結合部分に変換される。このような態様では、ブロッキング成分は、切断が起こるまでフィブリノーゲンに結合するフィブリノーゲン結合ペプチドの能力をブロックまたは阻害する。好ましくは、ブロッキング成分は、長さにして１〜３０個のアミノ酸残基のペプチドである。
【００３４】
このような態様では、フィブリノーゲン結合前駆体は、変換剤によって特異的に認識され、フィブリノーゲン結合ペプチドとブロッキング成分との間に位置される切断部位を含まなければならないことは認識される。トロンビンが好ましい変換剤である。しかしながら、他のセリンプロテアーゼまたは凝固因子を用いて、フィブリノーゲン結合前駆体を切断してもよい。トロンビンは、アルギニン残基に対してカルボキシ末端側のペプチド結合であって、通常、アルギニンとグリシン残基との間で切断することが知られている。
【００３５】
本発明の特に好ましい態様では、フィブリノーゲン結合前駆体は、アミノ末端でアミノ酸配列ＮＨ２−ＺＹＸＲ／ＧＰＲＰ−（配列番号１７）を含むペプチドであり、この場合、「／」はトロンビン切断部位を表し、Ｘは任意のアミノ酸であるが、好ましくはプロリンであり、Ｙは任意のアミノ酸であるが、好ましくはアスパラギン酸またはアラニンであり、Ｚは少なくとも１つのアミノ酸であり、好ましくはロイシンまたはプロリンである。例えば、ＮＨ２−ＬＶＰＲ／ＧＰＲＰ−（配列番号１８）、ＮＨ２−ＡＤＰＲ／ＧＰＲＰ−（配列番号１９）、ＮＨ２−ＬＤＰＲ／ＧＰＲＰ−（配列番号２０）、またはＮＨ２−ＬＶＰＲ／ＧＰＲＶ−（配列番号２１）が挙げられる。
【００３６】
フィブリノーゲン結合部分または前駆体は、任意の適切な手段によって担体に結合させることができるが、典型的には共有結合である。好ましい共有結合の例としては、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、またはアミド結合である。適切な共有結合は、フィブリノーゲン結合部分または前駆体がシステインを含むペプチドであり、担体がチオール反応基を含む場合に形成され得る。これは、担体上のチオール反応基にシステインの−ＳＨ基を連結させることによって担体にペプチドを結合させることできる。好ましくは、末端システイン基は、フィブリノーゲン結合ペプチドまたは前駆体ペプチドに導入されて、担体上のチオール反応基を用いてペプチドを架橋する。あるいは、フィブリノーゲン結合部分または前駆体がマレイミド基（好ましくは、そのカルボキシ末端で、例えば、ペプチドのカルボキシ末端のリジンに結合させて）を含むペプチドであり、担体がスルフヒドリル基を含む場合に共有結合が形成され得る。次に、ペプチドは、ペプチドのマレイミド基と担体のスルフヒドリル基とを反応させることによって担体に結合され得る。
【００３７】
典型的には、フィブリノーゲン結合部分のフィブリノーゲン結合活性（必要であればフィブリノーゲン結合前駆体から一度変換される）が担体によって悪影響を及ぼさないことを確保するために、フィブリノーゲン結合部分または前駆体と担体との間にスペーサーを必要とする。適切なスペーサーは、ペプチドであるかまたはポリエチレングリコールなどの非ペプチドである。
【００３８】
フィブリノーゲン結合部分または前駆体は、フィブリノーゲン結合ペプチドを含むペプチドであり、この部分または前駆体は末端のアミノ酸残基によって不溶性担体に結合される場合、スペーサー配列は、好ましくは、末端のアミノ酸残基とこの部分または前駆体のフィブリノーゲン結合ペプチドとの間に存在する。スペーサー配列は、例えば、長さにして１〜２０個、好ましくは５〜２０個のアミン酸残基であってもよい。スペーサー配列ＧＧＧＧＧＧ（配列番号２２）またはＧＧＧＧＧ（配列番号２３）が好ましい。
【００３９】
担体あたりのフィブリノーゲン結合部分または前駆体の数、最適なバイオゲル（または組織接着剤）形成のために必要とされる担体（担体あたり複数のフィブリノーゲン結合部分または前駆体を有する）とフィブリノーゲンの相対量は、担体とフィブリノーゲンの種々の調製物を用いて変化させてもよいことは承認される。したがって、バイオゲル形成に用いる担体とフィブリノーゲンの最適な相対量を決定するために、担体またはフィブリノーゲンの各々新しいバッチを試験することが必要であるかまたは望ましい場合がある。
【００４０】
好ましくは、各担体は、平均して、担体あたり少なくとも５個のフィブリノーゲン結合部分または前駆体を有する。理論的には、担体あたりのフィブリノーゲン結合部分または前駆体の数の上限はない。最適数は、多くの因子、例えば、担体の性質、フィブリノーゲン結合部分または前駆体を付着させるための各担体上の反応基の数に依存する場合がある。しかしながら、各担体は、平均して、担体あたり最大１００個のフィブリノーゲン結合部分または前駆体を有することが好ましい。好ましい範囲は、担体あたり１０〜２０個のフィブリノーゲン結合部分または前駆体である。
【００４１】
好ましくは、用いられるフィブリノーゲンの量は、フィブリノーゲン結合部分または前駆体のモル数と比較して、存在するフィブリノーゲンのモル数の少なくとも４分の１（好ましくは２分の１）であるようなものである。好ましくは、フィブリノーゲン結合部分または前駆体のモル数に対するフィブリノーゲンのモル数は、１：４〜４：１の範囲である。
【００４２】
動的振動測定を用いて、本発明に従って形成されるバイオゲルの粘弾性特性を評価してもよい。粘弾性固体の貯蔵モジュール（Ｇ’）と喪失モジュール（Ｇ’’）は、弾性部分を表す貯蔵エネルギー、粘性部分を表す熱として消散されるエネルギーを測定する。タンデルタは、貯蔵モジュール（Ｇ’）に対する喪失モジュール（Ｇ’’）の比である。したがって、それは弾性寄与および粘性寄与の定量化であり、この場合、１を超える値は液状粘性挙動を示し、１を下回る値は弾性挙動を表す。本発明のバイオゲルは、好ましくは、１未満のタンデルタ値を有する。これは、ゲルの成分が架橋されるという指示を与える。タンデルタは、１Ｈｚの振動数と１％の一定のひずみで測定され得る。タンデルタを測定するための適切な方法は、下記の実施例においてより詳細に記載されている。
【００４３】
本発明のキットの成分は、互いに別々に保存されてもよく、あるいはキットの成分のいくつかまたは全ては、一緒に保存される成分が互いに反応しないという条件で一緒に保存されてもよい。キットが固定化されたフィブリノーゲン結合部分を有する担体を含む本発明の態様に関して、担体と反応しないように、フィブリノーゲンは担体とは別々に保存されなければならないことは承認される。フィブリノーゲンと、フィブリノーゲンに結合しない固定化されたフィブリノーゲン結合前駆体を有する担体とを含む本発明のキットの重要な利点は、担体とフィブリノーゲンが一緒に保存可能であるということである。
【００４４】
本発明のキットの成分は、組織または他の部位に成分を送達させるために、デバイス（例えば、シリンジ）に互いに別々に保存されてもよい。成分が組織または他の部位で送達されるので、このデバイスは、成分が互いに接触するように配置されてもよい。
【００４５】
本発明のキットは、バイオゲルまたは組織接着剤を生じさせるキットの成分の使用方法に関する取扱説明書を含んでもよい。
【００４６】
本発明のキットは、毒性薬物を必要としない、バイオゲル（または組織接着剤）がキットの成分を用いて簡単に生成され、安定な状態で成分を容易に保存することができるとい利点を有する。また、本発明のキットを用いてバイオゲルまたは組織接着剤を形成させるために、トロンビン（他の酵素）の存在を要件としないことは承認される。トロンビンを含まない本発明のキットは特に有利であり、それは、このようなキットを用いて形成されたバイオゲルまたは組織接着剤に対するアレルギー反応の危険性が、外因性のトロンビンを用いて形成されたバイオゲルまたは組織接着剤と比較して低減されるためである。トロンビン（または他の酵素）を含まない本発明のキットの更なる利点は、酵素活性を維持する条件下でキットの成分を保存する必要がないということである。
【００４７】
本発明のある態様によれば、フィブリノーゲン結合前駆体は、固定化されたフィブリノーゲン結合前駆体を有する担体が投与される部位に存在する変換剤によって、フィブリノーゲン結合部分に変換され得る。これは、変換剤がキットの一部とすべき必要性がないという利点を有する。結論として、変換剤の活性を維持する条件下でキットの成分を保存することを要しない。
【００４８】
好ましくは、変換剤は、創傷部位薬物である。用語「創傷部位薬物」とは、本明細書において、創傷部位に存在する薬物を意味するように用いられる。好ましい態様では、創傷部位薬物は凝固因子である。適切な凝固因子の例には、トロンビン、第ＶＩＩａ因子、第Ｘａ因子、または第ＸＩａ因子が挙げられる。好ましくは、凝固因子はトロンビンである。
【００４９】
他の態様によれば、本発明のキットは、フィブリノーゲン結合前駆体をフィブリノーゲン結合部分に変換するための変換剤をさらに含んでもよい。変換剤は、担体とは分離しなければならない。このような態様では、変換剤は、担体が投与されるべき部位に存在することが期待されない薬物であってもよい。あるいは、変換剤は、担体が投与されるべき部位に存在する薬物であってもよい。変換剤は、トロンビン、第ＶＩＩａ因子、第Ｘａ因子、または第ＸＩａ因子などの凝固因子であってもよい。
【００５０】
固定化されたフィブリノーゲン結合部分を有する担体を含む本発明のキットは、凝固因子をさらに含んでもよい。凝固因子によってフィブリノーゲン結合部分に変換され得るフィブリノーゲン結合前駆体を含む本発明のキットは、フィブリノーゲン結合前駆体をフィブリノーゲン結合部分に変換しない凝固因子を含んでもよい。このような態様では、（フィブリノーゲン結合前駆体を変換しない）凝固因子は、キットの別々の成分として、あるいは担体および／またはフィブリノーゲンとともに提供されてもよい。凝固因子は、例えば各フィブリノーゲン結合前駆体に連結された担体に固定化されてもよい。
【００５１】
本発明のキットが凝固因子（例えば、トロンビン）を含む場合、これは、好ましくは、凝固因子に対するアレルギー反応の危険性を低下させるために、非ヒト（例えば、ウシ凝固因子）というよりはむしろ、ヒト配列である凝固因子である。
【００５２】
本発明のバイオゲルまたは組織接着剤は、組織部位に投与される前に、またはインサイチューで、組織部位、例えば創傷部位で形成されてもよい。組織部位でのバイオゲルまたは組織接着剤は、局所的に投与される担体を含む。
【００５３】
トロンビンは、本発明のバイオゲルまたは組織接着剤が投与されるかまたは形成される組織部位に存在してもよいことは承認される。例えば、組織部位が出血している創傷部位である場合、宿主トロンビンが創傷部位に存在する可能性がある。当然に、トロンビンは、本発明のキットを用いて提供される場合、代替的または付加的に存在してもよい。
【００５４】
フィブリノーゲンに結合し、別々にフィブリンモノマーおよび／またはフィブリンに結合することができるフィブリノーゲン結合部分の使用は、本発明のバイオゲルまたは接着剤がトロンビンの存在下で形成され、あるいは一度形成されるとトロンビンと接触されるようになる場合に有利であり得る。トロンビンが、フィブリノーゲンおよび固定化されたフィブリノーゲン結合部分を有する担体と一緒に存在する場合、トロンビンは、少なくともいくつかのフィブリノーゲンをフィブリンモノマーに変換する。これらの条件下で、フィブリノーゲン結合部分もフィブリンモノマーに結合し、その結果、トロンビンによって形成されたフィブリンモノマーが担体によって互いに連結可能になることが好ましいことは承認される。
【００５５】
本発明のバイオゲルまたは接着剤は、一度形成されるとトロンビンと接触するようになる場合、フィブリノーゲン結合部分に結合されたフィブリノーゲンはフィブリンモノマーに変換されることができ、フィブリノーゲン結合部分はフィブリンモノマーに結合された状態になる場合に有利となり得る。これらの環境下で、フィブリノーゲンとフィブリノーゲン結合部分との間に形成された非共有結合は、フィブリノーゲンのフィブリンモノマーへの変換によって崩壊しない。また、フィブリノーゲン結合部分に結合された少なくともいくつかのフィブリンモノマーは、フィブリノーゲン結合部分に連結された状態でフィブリンを形成するために集合することができる場合に有利であり得る。これらの環境下で、バイオゲルまたは組織接着剤は、フィブリンの形成によって強化され得る。
【００５６】
トロンビン（例えば、本発明のキット由来、または創傷部位での宿主トロンビン由来）がある場合、トロンビンと接触させる前に、担体とフィブリノーゲンとを互いに接触させるか、または担体、フィブリノーゲンおよびトロンビンを互いに実質的に同時に接触させることが好ましい。
【００５７】
担体と接触させる前に、トロンビンとフィブリノーゲンとを互いに接触させる場合に、バイオゲルまたは組織接着剤が形成されてもよい場合があるが、これは、トロンビンの前に担体とフィブリノーゲンとを互いに接触させることによるか、または担体、フィブリノーゲンおよびトロンビンを互いに実質的に同時に接触させることによって形成されたバイオゲルまたは組織接着剤よりも利用性が小さいことが期待される。これは、トロンビンが、フィブリノーゲン分子をフィブリンモノマーに変換し、次に担体との接触させる前に凝集して不溶性フィブリンを形成することが期待されるからである。しかしながら、ある状況では、例えば、トロンビンが担体と接触させるまでまたはその後に不活性となる場合、担体の前にトロンビンとフィブリノーゲンとを接触させることによってバイオゲルおよび組織接着剤を形成することが適切である場合もある。
【００５８】
また、本発明によれば、複数の担体とフィブリノーゲン分子およびトロンビンとを接触させることを含むバイオゲルを形成させるための方法が提供され、ここで、複数のフィブリノーゲン結合部分は、各担体に固定化され、各フィブリノーゲン分子は、少なくとも２つのフィブリノーゲン結合部分に結合して、フィブリノーゲン結合部分とフィブリンモノマーとの間の非共有結合によって担体を介してともに連結されるバイオゲルを形成することができる。
【００５９】
バイオゲルは、フィブリンを含んでもよく、または含まなくてもよい。したがって、フィブリンモノマーは、バイオゲルのフィブリンの一部であってもよく、またはフィブリンモノマーは、バイオゲルのフィブリンの一部でなくてもよい。
【００６０】
また、本発明によれば、フィブリンモノマーおよび複数の担体を含むバイオゲルが提供され、各担体は、その担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分を有し、ここで、フィブリンモノマーはともに、フィブリノーゲン結合部分とフィブリンモノマーとの間の非共有結合によって担体を介して連結される。
【００６１】
さらに、本発明によれば、フィブリンおよび複数の担体を含むバイオゲルが提供され、各担体は、その担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分を有し、ここで、フィブリンのフィブリンモノマーはともに、フィブリノーゲン結合部分とフィブリンモノマーとの間の非共有結合によって担体を介して連結される。
【００６２】
好ましい局面では、バイオゲルは組織接着剤である。
【００６３】
本発明のキットは、第ＸＩＩＩ因子を含み、場合により、第ＸＩＩＩ因子から第ＸＩＩＩａ因子に活性するためのカルシウムイオンおよびトロンビンを含んでもよい（その場合、カルシウムイオンおよびトロンビンは、第ＸＩＩＩ因子とは別々でなければならない）。あるいはまたは加えて、第ＸＩＩＩａ因子は、本発明のバイオゲルまたは組織接着剤が投与または形成される組織部位に存在してもよい。例えば、組織部位が出血している創傷部位であれば、宿主第ＸＩＩＩａ因子は、創傷部位に存在する場合がある。
【００６４】
第ＸＩＩＩａ因子がフィブリンを含む本発明のバイオゲルまたは組織接着剤と接触すると、バイオゲルまたは組織接着剤は、第ＸＩＩＩａ因子がフィブリンと反応して、フィブリンを共有結合的に架橋させることによってさらに強化されてもよい。
【００６５】
また、本発明によれば、バイオゲルを形成させるための方法が提供され、この方法は、複数の担体とフィブリノーゲン分子およびトロンビンとを接触させることを含み、ここで、複数のフィブリノーゲン結合部分は各担体に固定化され、各フィブリノーゲン分子は少なくとも２つのフィブリノーゲン結合部分に結合して、フィブリンを含むバイオゲルを形成し、そこでは、フィブリンのフィブリンモノマーはともに、フィブリノーゲン結合部分とフィブリンモノマーとの間の非共有結合によって担体を介して連結され；バイオゲルと第ＸＩＩＩａ因子とを接触させることを含み、その結果、フィブリンのフィブリンモノマーはともに、ペプチド結合によって共有結合的に架橋されるようになる。
【００６６】
さらに、本発明によれば、フィブリンおよび複数の担体を含むバイオゲルが提供され、各担体は、その担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分を有し、ここで、フィブリンのフィブリンモノマーはともに、ペプチド結合によって共有結合的に連結され、フィブリンのフィブリンモノマーはともに、フィブリン結合部分とフィブリンモノマーとの間の非共有結合によって担体を介して連結される。
【００６７】
好ましい局面では、バイオゲルは組織接着剤である。
【００６８】
本発明のキットは、さらに、創傷治癒の促進剤を含んでもよい。適切な例には、増殖因子、例えば血小板由来増殖因子が挙げられる。促進剤は、キットの別々の成分であってもよく、または担体に固定化されてもよい。
【００６９】
本発明のキットは、さらに、抗菌剤、例えば抗生物質を含んでもよい。抗菌剤は、キットの別々の成分であってもよく、または担体に固定化されてもよい。
【００７０】
各担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分を有する担体が、宿主フィブリノーゲンが存在する組織部位（例えば、出血している創傷部位）に投与されると、担体は、宿主のフィブリノーゲンと反応して、インサイチューで組織部位にバイオゲルまたは組織接着剤を形成することは承認される。
【００７１】
同様に、各担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合前駆体を有する担体が、フィブリノーゲン結合前駆体をフィブリノーゲン結合部分に変換するための変換剤と宿主フィブリノーゲンとが存在する組織部位（例えば、出血している創傷部位）に投与されると、フィブリノーゲン結合前駆体は、フィブリノーゲン結合部分に変換され、次に、担体は、宿主フィブリノーゲンと反応して、インサイチューで組織部位にバイオゲルまたは組織接着剤を形成する。例えば、フィブリノーゲン結合前駆体は、宿主トロンビン、または別の凝固因子によってフィブリノーゲン結合部分に変換されてもよい。
【００７２】
したがって、さらに、本発明によれば、各担体がその担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分を有する局所的に投与される担体、および内因性フィブリノーゲンを含むバイオゲルが提供され、ここで、内因性フィブリノーゲンの各分子は、少なくとも２つのフィブリノーゲン結合部分に結合され、その結果、フィブリノーゲン分子はともに、フィブリノーゲン結合部分と内因性フィブリノーゲン分子との間の非共有結合によって担体により連結される。
【００７３】
用語「内因性フィブリノーゲン」とは、本明細書において、フィブリノーゲンが、担体が投与される部位に存在する宿主フィブリノーゲンを意味するように用いられる。典型的には、宿主の血液が創傷部位に存在するため、宿主フィブリノーゲンが存在する。
【００７４】
また、本発明によれば、バイオゲルを形成するための担体の使用が提供され、担体は、その担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分またはフィブリノーゲン結合前駆体を有する。
【００７５】
バイオゲルは、好ましくは組織接着剤である。
【００７６】
担体は、止血用、封止剤として、局所的薬物送達用、または組織工学用のバイオゲルまたは組織接着剤を形成させるために用いられてもよい。
【００７７】
バイオゲルまたは組織接着剤を形成させるための担体の投与は、宿主のアレルギー反応の危険性を最小限にする利点があり、それは、外因性のフィブリノーゲンまたはトロンビンを必要とせず、毒性薬物を要せず、担体が安定条件で容易に保存され得るためである。
【００７８】
また、本発明によれば、宿主フィブリノーゲンが存在する部位での出血を調節する方法が提供され、この方法は、その部位に複数の担体を局所的に投与することを含み、ここで、各担体は、その担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部位を有し、この部位の宿主フィブリノーゲン分子は少なくとも２つのフィブリノーゲン結合部分に結合することができる。
【００７９】
さらに、本発明によれば、宿主フィブリノーゲンおよび凝固因子が存在する部位での出血を調節する方法が提供され、この方法は、その部位に複数の担体を局所的に投与することを含み、ここで、各担体は、その担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合前駆体を有し、フィブリノーゲン結合前駆体は、宿主凝固因子によってフィブリノーゲン結合部分に変換されることができ、その部位での宿主フィブリノーゲン分子は少なくとも２つのフィブリノーゲン結合部分に結合することができる。
【００８０】
さらに、本発明によれば、出血を調節するかまたは創傷を処置もしくは封止するための医薬（例えば、バイオゲルまたは組織接着剤）の製造における複数の担体の使用が提供され、ここで、各担体は、その担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分またはフィブリノーゲン結合前駆体を有する。
【００８１】
また、本発明によれば、バイオゲルを形成するための複数の担体の使用が提供され、各担体は、その担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分またはフィブリノーゲン結合前駆体を有する。
【００８２】
さらに、本発明によれば、出血の調節、または創傷の処置もしくは封止において（バイオゲルまたは組織接着剤として）用いるための複数の担体が提供され、ここで、各担体は、担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分またはフィブリノーゲン結合前駆体を有する。
【００８３】
担体は、不溶性または可溶性であってもよい。担体は、局所的に投与されてもよい。
【００８４】
担体が可溶性担体である場合、固定化されたフィブリノーゲン結合部分またはフィブリノーゲン結合前駆体を有する担体の好ましい局所製剤は、液体製剤であり、好ましくは生理学的なｐＨの等張緩衝液に含まれる。
【００８５】
担体が不溶性担体である場合、固定化されたフィブリノーゲン結合部分またはフィブリノーゲン結合前駆体を有する担体の好ましい局所製剤は、例えば組織部位に噴霧することができる粉末の形態である。
【００８６】
粉末化担体は、任意の適切な方法を用いて形成されてもよく、この方法には、（例えば、生理学的なｐＨの等張緩衝液に懸濁された）各担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分またはフィブリノーゲン結合前駆体を有する担体の懸濁液を噴霧乾燥させるかまたは凍結乾燥させることが含まれる。好ましくは、噴霧乾燥が用いられ、これは凍結乾燥よりも迅速であって、簡単に計量できる乾燥方法であり得るためである。適切な噴霧乾燥法は、国際公開第ＷＯ９２／１８１６４号に記載されている。
【００８７】
本発明によれば、バイオゲルを形成させるための薬物が提供され、この薬物は可溶性担体を含み、フィブリノーゲン結合前駆体の複数のフィブリノーゲン結合部分が各担体に固定化されている。
【００８８】
また、本発明によれば、バイオゲルを形成させるための薬物が提供され、この薬物は、各担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分またはフィブリノーゲン結合前駆体を有する不溶性担体を含み、薬物は、凍結乾燥以外によって形成された粉末の形態である。
【００８９】
また、本発明によれば、粉末化された薬物を形成させるための方法が提供され、この薬物は、各担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分またはフィブリノーゲン結合前駆体を有する不溶性担体を含み、この方法は、薬物の懸濁液を噴霧乾燥させることを含む。
【００９０】
好ましくは、薬物は局所投与に適している。薬物が、各担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合前駆体を有する可溶性担体を含む場合、薬物は静脈内投与に適していてもよい。
【００９１】
担体または薬物は、キットの成分として提供されてもよい。キットは、さらに、凝固因子、創傷治癒の促進剤、または抗菌剤を含んでもよい。凝固因子、創傷治癒の促進剤、または抗菌剤は、キットの別々の成分であってもよく、または担体に固定されてもよい。ある好ましい態様では、凝固因子、創傷治癒の促進剤、または抗菌剤は、フィブリノーゲン結合前駆体の一部であってもよく、その結果、フィブリノーゲン結合前駆体がフィブリノーゲン結合部分に変換されると放出される。
【００９２】
本発明のキットは、区分化されたキットであってもよく、互いに別々の状態であることが望まれるキットの成分は別々の区分または容器に含まれる。本発明のキットは、本発明の方法を実施するキット成分を用いるための取扱説明書を含んでもよい。
【００９３】
本発明のバイオゲルまたは組織接着剤は、組織部位、例えば皮膚または粘膜組織に局所的に投与されてもよい。本発明のバイオゲルまたは組織接着剤は、止血用、封止剤として、局所的薬物送達用または組織工学用に用いられてもよい。
【００９４】
本発明のバイオゲルまたは組織接着剤は、ゲルまたは接着剤を投与部位と接触させる前にゲルまたは接着剤を形成させることによって、あるいは投与部位でゲルまたは組織接着剤を形成させることによって投与されてもよい。
【００９５】
また、各々がフィブリノーゲン結合部分に変換され得る複数のフィブリノーゲン結合前駆体が各担体に固定化されている可溶性担体を含む薬物は、例えば、出血を調節するため、または薬物送達用に静脈内に投与されてもよい。好ましい静脈内製剤は、２０％の水性等張溶液である。好ましい態様では、フィブリノーゲン結合前駆体は、トロンビンによって変換され得る。
【００９６】
さらに、本発明によれば、出血を調節するための方法が提供され、この方法は、可溶性担体を含む薬物を静脈内に投与することを含み、ここで、各々がフィブリノーゲン結合部分に変換され得る複数のフィブリノーゲン結合前駆体は、各担体に固定化されている。
【００９７】
さらに、本発明によれば、対象に薬物を送達するための方法が提供され、この方法は、対象に可溶性担体を含む薬物を静脈内投与することを含み、ここで、各々がフィブリノーゲン結合部分に変換され得る複数のフィブリノーゲン結合前駆体は、各担体に固定化され、この担体は薬物を含むかまたは薬物が担体に固定化されている。
【００９８】
当然に、局所または静脈用製剤は無菌でなければならない。
【００９９】
本発明のバイオゲルまたは組織接着剤は、創傷治癒の促進剤、または抗菌剤をさらに含んでもよい。
【０１００】
また、本発明によれば、出血を調節するための方法が提供され、この方法は、出血している部位に本発明のバイオゲルまたは組織接着剤を局所投与することを含む。
【０１０１】
また、本発明によれば、創傷を処置または封止するための方法が提供され、この方法は、創傷部位に本発明のバイオゲルまたは組織接着剤を（好ましくは局所的に）投与することを含む。
【０１０２】
また、本発明によれば、薬剤として用いるための本発明のバイオゲルまたは組織接着剤が提供される。
【０１０３】
さらに、本発明によれば、出血を調節するか、または創傷を処置もしくは封止するための薬剤の製造における本発明のバイオゲルまたは組織接着剤の使用が提供される。
【０１０４】
また、本発明によれば、出血を調節するか、または創傷を処置もしくは封止するための本発明のバイオゲルまたは組織接着剤が提供される。
【０１０５】
本発明のバイオゲルまたは組織接着剤の使用は、局所的な使用であってもよい。バイオゲルまたは組織接着剤は、可溶性担体と、フィブリノーゲン結合前駆体から変換されたフィブリノーゲン結合部分とを用いて形成される場合、この使用は静脈内であってもよい。
【０１０６】
本発明の好ましい態様は、一例としてのみ、ここに記載されている。
【０１０７】
本発明の第１の好ましい態様によれば、各々がアミノ末端でフィブリノーゲン結合配列を含む複数のペプチド（例えば、配列ＧＰＲＰＧＧＧＧＧＧＣ（配列番号２４）のペプチド）は、それらのカルボキシ末端で担体に連結され、それは可溶性タンパク質（例えばアルブミン）である。バイオゲルは、ペプチドを連結した担体とフィブリノーゲンとを接触させることによって形成される。次に、バイオゲルは、創傷の手当てとして局所的に投与されてもよい。
【０１０８】
本発明の第２の好ましい態様によれば、第１の好ましい態様のペプチドを連結した担体とフィブリノーゲンとは、創傷部位で混合され、インサイチューでバイオゲルを形成する。
【０１０９】
本発明の第３の好ましい態様によれば、第１の好ましい態様のペプチドを連結した担体は、宿主血液由来のフィブリノーゲンが存在する創傷部位に投与されて、インサイチューでバイオゲルを形成する。
【０１１０】
本発明の第４の好ましい態様によれば、各々がそのアミノ末端でブロッキングペプチド配列に接続されたフィブリノーゲン結合配列を含む複数のペプチド（例えば、ＬＶＰＲＧＰＲＰＧＧＧＧＧＧＣ（配列番号２５）のペプチド）は、それらのカルボキシ末端で担体に連結され、それは可溶性タンパク質（例えばアルブミン）である。ペプチドを連結した担体は、フィブリノーゲンと組み合わせられ、次に、単一の混合物として創傷に適用され得る。創傷部位に存在する宿主トロンビンは、ペプチドを切断して、ブロッキングペプチドを放出し、フィブリノーゲン結合配列を露出する。フィブリノーゲン結合配列が露出された担体は、フィブリノーゲンと反応して、インサイチューでバイオゲルを形成する。
【０１１１】
あるいは、第４の好ましい態様のペプチドを連結した担体は、静脈内に投与することができる。創傷部位の宿主トロンビンは、ペプチドを切断して、ブロッキングペプチドを放出し、フィブリノーゲン結合配列を露出する。フィブリノーゲン結合配列が露出された担体は、宿主フィブリノーゲンと反応して、創傷部位で出血を調節する。
【０１１２】
上記される第４の好ましい態様のバイオゲルは、組織接着剤であってもよい。
【０１１３】
不溶性担体（例えば、アルブミンマイクロスフェア）は、上記の好ましい態様のいずれか（静脈内投与用以外）において可溶性タンパク質担体の代わりに用いられてもよい。
【０１１４】
分岐したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または任意の他の生体適合性ポリマーは、上記の好ましい態様のいずれかにおいて可溶性タンパク質の代わりに用いられてもよい。
【０１１５】
凝固因子は、上記の好ましい態様のいずれかにおいて担体に固定化されてもよいが、ただし、フィブリノーゲン結合前駆体が担体に固定化されている場合には、凝固因子はフィブリノーゲン結合前駆体をフィブリノーゲン結合部分に変換しない。
【０１１６】
担体は、上記の好ましい態様のいずれかにおいて創傷治癒の促進剤（例えば、血小板由来増殖因子などの増殖因子）をさらに含んでもよい。
【０１１７】
本発明のさらに好ましい態様は、添付の図面を参照して、下記の実施例に記載されている。
【実施例】
【０１１８】
実施例１
ヒト血清アルブミンを含む、担体に固定化されたフィブリノーゲン、及びフィブリノーゲン結合ペプチドを用いたバイオゲルまたは組織接着剤の形成
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と、４０倍の過剰なモル数のリンカーのスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）をｐＨ７．４で反応させた。修飾されたタンパク質（ＨＳＡ−ＳＭＣＣ）を精製し、平均して１モルのＨＳＡが１８モルのＳＭＣＣで修飾されたことを測定した。ＧＰＲＰＧＧＧＧＧＧＣ（Ｂ１０；配列番号２４）またはＬＶＰＲＧＰＲＰＧＧＧＧＧＧＣ（ＴＣ−１５；配列番号２５）のいずれかが、マレイミド部分と比較して過剰な１．５モルでＨＳＡ−ＳＭＣＣに添加された。次に、ペプチド修飾されたＨＳＡタンパク質は、未反応のペプチドから精製され、−８０℃、７ｍｇ／ｍｌで保存された。供給業者（Ｓｃｏｔｔｉｓｈ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ｓｅｒｖｉｃｅ）によって説明されるように、凍結乾燥されたヒトフィブリノーゲンを水に溶かし、１６ｍｇ／ｍｌとした。
【０１１９】
ペプチド修飾されたＨＳＡ（５μｌ）を０．３ｍｌのフィブリノーゲン溶液に添加し、Ｂ１０−ＨＳＡについてはインスタントゲルが観察され、ＴＣ−１５については、ゲルは観察されなかった。露出されたＧＰＲＰペプチド配列は、フィブリノーゲンの２つの遠位ドメイン（Ｄ）のカルボニル領域内の「ａ」ポケットに結合することで知られている（図１ｂ）。複数の露出されたＧＰＲＰ配列（Ｂ１０）で修飾されたＨＳＡは、フィブリノーゲンの重合のための分岐点として働くと考えれる（図１ｃ）。このゲルは、トロンビンがない場合に形成される。
【０１２０】
実施例２〜５の方法
ペプチド修飾されたＨＳＡの合成
１０ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と、全量が０．７ｍｌである５、１０、２０または４０倍の過剰なモル数のリンカーであるスルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ）をｐＨ７．４で反応させた。修飾されたタンパク質（ＨＳＡ−ＳＭＣＣ）をＺｅｂｒａ（商標）脱塩スピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によって精製し、平均して１モルのＨＳＡがそれぞれ５、８、１６または１８モルのＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣにより修飾されたことを確認した。ＨＳＡ１分子あたりに結合したマレイミド基の数を決定するために、３ナノモルのＨＳＡの試料を室温で３０分間、バッファーに含まれる既知量のシステイン（１００ナノモル）とともにインキュベートした。次に、残りのシステインを２０分間、１ｍｍｏｌの５，５−ジチオビス（２−ニトロベンゾエート）（ＤＴＮＢ）と反応させ、Ａ４１２を測定した。マレイミドレベルは、対照およびタンパク質試料の吸光度を比較することによって計算された。ＧＰＲＰＧＧＧＧＧＧＣ（Ｂ１０；配列番号２４）またはＬＶＰＲＧＰＲＰＧＧＧＧＧＧＣ（ＴＣ−１５；配列番号２５）ペプチドのいずれかが、マレイミド部分と比較して過剰な１．５モルでＨＳＡ−ＳＭＣＣに添加された。次に、ペプチド修飾されたＨＳＡタンパク質は、Ｚｅｂｒａ（商標）脱塩スピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて、未反応のペプチドから精製され、−８０℃、７ｍｇ／ｍｌで保存された。凍結乾燥されたヒトフィブリノーゲン（Ｓｃｏｔｔｉｓｈ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）を水に溶解して、８、１６、３２および６４ｍｇ／ｍｌとした。フィブリノーゲンおよびアルブミンの濃度は、１％フィブリノーゲン Ｅ２８０＝１５、および１％ＨＳＡ Ｅ２８０＝１３．８を用いる２８０ｎｍ（Ａ２８０）の吸光度から決定した。
【０１２１】
流動特性
動的振動測定を用いて、ゲルの粘弾性特性を評価した。混合物を室温で一晩平衡化し、２５ｍｍの径、１°の円錐角の円錐および平板を有するＰｈｙｓｉｃａ ＭＣＲ−５０１（Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）流量計の下段プレートにゲルを移した。加湿雰囲気で２０又は３７±℃のいずれかで試験を行った。振動数掃引を１％の一定のひずみ振幅で０．０１〜５０Ｈｚで行った。試験されたレオロジーパラメータは、流動計を備えた専用のＡｎｔｏｎ Ｐａａｒソフトウェアを用いて開始された。
【０１２２】
実施例２ ゲル形成に対するペプチド修飾されたＨＳＡの量およびフィブリノーゲン濃度の影響
フィブリノーゲンの重合は、フィブリノーゲンとＨＳＡ溶液の混合後、最初に視覚的にモニターされた。５、８、１６または１８モルのいずれかのフィブリノーゲン結合ペプチドで修飾されたペプチド修飾されたＨＳＡを１モルのＨＳＡと複合化した。このペプチド修飾されたＨＳＡまたは未修飾のＨＳＡの２５μｌ試料を８、１６、３２または６４ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲンの０．２ｍｌと混合した。ゲルの形成は、室温で０．５時間後に視覚的に測定された。未修飾のＨＳＡまたは５または８モルのペプチドで修飾されたＨＳＡについては、試験されたフィブリノーゲンの全ての濃度でゲル形成が観察されなかった。重合は、３２または６４ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲンでのみ、１６または１８モルの結合ペプチドを有するペプチド修飾されたＨＳＡを用いて観察された。
【０１２３】
図４は、ペプチド修飾されたＨＳＡ（２５μｌ、１８モルのペプチド）の添加の前（ａ）および後（ｂ）のフィブリノーゲン溶液（０．２ｍｌ ３２ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン）の写真を示す。本発明に従って形成されたバイオゲルは（ｂ）に示される。
【０１２４】
実施例３ ペプチド修飾されたＨＳＡの量の影響
混合物のレオロジー特性に対するペプチド修飾されたＨＳＡおよびフィブリノーゲンの量の効果を測定するために、３２および６４ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲンによるペプチド修飾されたＨＳＡの２５または５０μｌを用いて、せん断強度を測定した。ＨＳＡの１モルあたり１６モルの結合ペプチドで修飾されたペプチド修飾されたＨＳＡをこの実験に用いた。ゲルの線形粘弾性ひずみ限度内で動的振動実験が行われたことを確かめるために、ひずみ掃引を行った。図２は、３２ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲンと混合した２５μｌのペプチド修飾されたＨＳＡについての２０および３７℃のひずみ掃引を示す。貯蔵モジュール（Ｇ’）および喪失モジュール（Ｇ’’）は、範囲全体で安定であるように見え、この洗浄粘弾性ひずみ範囲において１％の一定ひずみを選択した。周波数掃引は、架橋ネットワークを示すＧ’’より大きなＧ’値を示した（表１）。表に示される値は、１Ｈｚの振動数で取られる。タンデルタは、貯蔵モジュールに対する喪失モジュールの比である。したがって、それは、弾性と粘性の寄与の定量であり、その場合、１を超える値は粘性様の液体を示し、１未満は弾性を表す。複素粘度η＊は、角振動数（ω）で割った複素モジュールＧ＊として定義され、同条件下で測定された。これらの条件下では、ペプチド修飾されたＨＳＡとフィブリノーゲンの両方の量は、ゲルの機械的強度にほとんど影響を及ぼさないようである。
【０１２５】
【表１】
３２ｍｇ／ｍｌによる、ＨＳＡ（２５μｌ）あたり１８ペプチド結合したペプチド修飾されたＨＳＡの異なるバッチでは、Ｇ’が５２００、複素粘度が８２０、タンデルタが０．１０５であった。
【０１２６】
実施例４ レオロジー特性に対する温度の影響
ゲルに対する温度の効果についての検討は、手術体温時に用いられる場合、又は局所的に適用される場合の製造品の適用に重要である。本発明者らは、２０℃と３７℃でのゲルの機械的強度および表２に示される値は、１Ｈｚの振動数で取られることを評価した。３２ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン、１６モルのペプチドで修飾された２５μＬのＨＳＡから生じたゲルの温度上昇は、Ｇ’と複素粘度との両方の減少をもたらした（表２）。２０℃と３７℃でのタンデルタは１未満であり、したがって、（非共有結合的な）架橋ネットワーク構造は３７℃で維持される。
【０１２７】
【表２】
実施例５ ヒト血漿におけるゲル形成
ペプチド修飾されたＨＳＡがヒト血漿中でフィブリノーゲンを重合し得るかどうかを検討することは、外科用接着剤／粘着材として製造品の応用に重要である。１８モルのペプチドで修飾されたペプチド修飾されたＨＳＡ（７５μｌ）を０．８ｍｌのヒトのプール血漿と混合した。血漿誘導ゲル上のレオロジーを３７℃で行い、Ｇ’値が６１００であり、タンデルタが０．１０４であった。この結果から、ペプチド修飾されたＨＳＡは、３７℃で（非共有結合的な）架橋ネットワーク構造をもたらす、ヒト血漿中でフィブリノーゲンを重合することができるという結論に達する。
【図１（ａ）】
【図１（ｂ）】
【図１（ｃ）】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオゲル、並びにバイオゲルを形成させるためのキット、薬物、および方法に関する。好ましい局面では、バイオゲルは組織接着剤である。バイオゲルまたは組織接着剤は、止血、創傷封止、組織工学または局所的薬物送達を含む種々の用途に用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
凝固過程において、フィブリノーゲンは、トロンビンによってフィブリンへと変換される。フィブリノーゲンは、ジスルフィド結合によって互いに連結された３種の鎖（α、β、およびγ）の２セットを含む。これらの鎖は一緒になって、２つの遠位球状ドメイン（Ｄドメイン）に接続した中心球状ドメイン（Ｅドメイン）を形成する。トロンビンは、フィブリノーゲンの中心Ｅドメインに含まれる４つのアルギニン−グリシンペプチド結合を切断し、２つのα鎖の各々からＡペプチドを放出し、２つのβ鎖の各々からＢペプチドを放出する。ＡペプチドおよびＢペプチドは、フィブリノペプチドと称される。これらのフィブリノペプチドを欠損しているフィブリノーゲン分子は、フィブリンモノマーと呼ばれる。フィブリンモノマーは、フィブリンと呼ばれる規則的な線維性の配列で自然に集合する。フィブリンは、フィブリンファイバーに含まれる異なる分子の側鎖間で共有結合的な架橋の形成によって安定化される。第ＸＩＩＩａ因子によって触媒されるアミノ基転移反応において、特定のグルタミンとリジンとの間でペプチド結合が形成される。
【０００３】
活性化されると、血小板も血液凝固の必須部分を形成する。血小板は、露出した創傷表面に接着し、活性化されるようになる。血小板の膜糖タンパク質であるＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａは、立体構造の変化を受け、フィブリノーゲンに結合し得る。フィブリノーゲンは、１を超える血小板に結合することができ、その結果、血小板は互いに凝集する。血小板凝集体は、フィブリンのメッシュ内で形成される凝血塊の基本構造を形成する。
【０００４】
フィブリン組織接着剤（ＦＴＡ）は、凝固カスケードの最終段階を模倣することによって形成される製造品に与えられた名称であり、フィブリン血栓塊を形成する。市販のＦＴＡキットは、止血用、薬物送達用、並びに外科用接着剤（ｇｌｕｅ）、および組織封止剤として用いられる強力な生分解性ゲルを速やかに生み出す。フィブリノーゲン、第ＸＩＩＩ因子、トロンビン、およびカルシウムイオンは、典型的には、貯蔵中に、フィブリノーゲンと第ＸＩＩＩ因子とをカルシウムイオンとトロンビンとから分離するシリンジデバイスによって到達される。シリンジから送り出している最中に化合物を混合すると、フィブリノーゲンのトロンビン分解（ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｌｙｓｉｓ）が起こり、フィブリンが生じ、これは、カルシウムイオンにより活性化される第ＸＩＩＩ因子によって後に架橋されるゲル内に自己集合する。しかしながら、多くのＦＴＡは、患者のアナフィラキシー反応および自己免疫反応を誘導する場合があるウシトロンビンを利用する。
【０００５】
Ｚｈａｎｇら（非特許文献１）は、リポソームからカルシウムイオンの光活性化放出によるフィブリノーゲン系のハイドロゲルの形成、その後のトランスグルタミナーゼ触媒のフィブリノーゲンの架橋の活性化を記載する。しかしながら、これらのハイドロゲルの形成を困難にし、リポソームと第ＸＩＩＩ因子の個別の製剤化を必要とする。
【０００６】
Ｈｉｄａｓら（非特許文献２）は、縫合なしの腎保存手術におけるアルブミングルタールアルデヒド組織接着剤の使用を記載する。ウシ血清アルブミンとグルタールアルデヒドを混合した。グルタールアルデヒド曝露によって、ウシ血清アルブミンのリジン分子、細胞外マトリックスタンパク質、および細胞表面が互いに結合されるようになり、強力な共有結合が生じる。しかしながら、この接着剤の欠点は、グルタールアルデヒドが毒性であり、ウシ血清アルブミンが患者のアレルギー反応を誘導し得るという危険性があるということである。
【０００７】
したがって、毒性薬物の使用を必要とせず、アレルギー反応の危険性を最小限にし、安定条件で容易に保存可能である成分から製造し易いゲルまたは組織接着剤を提供することが必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２００２（１３）：６４０−６４６
【非特許文献２】Ｕｒｏｌｏｇｙ ６７（４），２００６：６９７−７００
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明によれば、複数の担体、各担体に固定化される複数のフィブリノーゲン結合部分；フィブリノーゲンの各分子が少なくとも２つのフィブリノーゲン結合部分に結合することができるフィブリノーゲンを含むバイオゲルキット（即ち、バイオゲルを形成させるためのキット）が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図式的に示す：（ａ）担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合ペプチドを有するアルブミン担体；（ｂ）フィブリノーゲン分子；（ｃ）フィブリノーゲン分子がフィブリノーゲン結合ペプチドとフィブリノーゲン分子との間の非共有結合によって担体を介して互いに連結されているバイオゲル。
【図２】３２ｍｇ／ｍｌ、２０℃（Ａ）および３７℃（Ｂ）で２５μｌのペプチド修飾されたＨＳＡおよびフィブリノーゲンの混合物におけるひずみ率に対する貯蔵モジュール（四角）および喪失モジュール（三角）のプロットを示す。
【図３】３２ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲンと混合されたペプチド修飾されたＨＳＡの２５μｌに対する２０℃の貯蔵モジュール（四角）および複素粘度（三角）対振動数を示す（１％のひずみ振幅を有する）。
【図４】ペプチド修飾されたＨＳＡの添加前（ａ）および添加後（ｂ）のフィブリノーゲン溶液の写真を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
用語「バイオゲル」とは、本明細書において、天然または組換えの生物学的分子（もしくは化学的に合成された生物学的分子）であるか、あるいは生物学的分子（例えば、生物学的分子の１以上の機能を保持する誘導体）から誘導される１以上の成分を含むゲルが含まれるように用いられる。
【００１２】
バイオゲルは、フィブリノーゲンと担体とを接触させることによって形成することができる。複数のフィブリノーゲン結合部分が各担体に固定化され、各フィブリノーゲン分子が少なくとも２つのフィブリノーゲン部分に結合することができるため、フィブリノーゲン分子は、担体を介して互いに連結されるようになる。フィブリノーゲン分子とフィブリノーゲン結合部分との間に非共有結合が形成される。
【００１３】
したがって、本発明によれば、フィブリノーゲン分子と複数の担体とを接触させることを含む、バイオゲルを形成させるための方法も提供され、ここで、各担体は、その担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分を有し、フィブリノーゲンの各分子は、少なくとも２つのフィブリノーゲン結合部分に結合することができ、その結果、フィブリノーゲン分子は共に、フィブリノーゲン結合部分とフィブリノーゲン分子との間に非共有結合の形成によって担体を介して連結されるようになる。
【００１４】
さらに、本発明によれば、フィブリノーゲン分子と複数の担体を含むバイオゲルが提供され、ここで、各担体は、その担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分を有し、フィブリノーゲンの各分子は、少なくとも２つのフィブリノーゲン分子部分に結合し、その結果、フィブリノーゲン分子は共に、フィブリノーゲン結合部分とフィブリノーゲン分子との間に非共有結合によって担体を介して連結される。
【００１５】
フィブリノーゲン結合部分の代わりに、担体は、各担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合前駆体を有してもよく、ここで、各フィブリノーゲン結合前駆体は、フィブリノーゲン結合部分に変換され得る。このような担体を用いてバイオゲルを形成するためには、フィブリノーゲン結合前駆体をフィブリノーゲン結合部分に変換させることが必要であり、その結果、フィブリノーゲン結合部分がフィブリノーゲン部分に結合することができる。
【００１６】
したがって、本発明によれば、複数の担体、各担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合前駆体であって、各フィブリノーゲン結合前駆体はフィブリノーゲン結合部分に変換されることができる前駆体；フィブリノーゲンであって、フィブリノーゲンの各分子は少なくとも２つのフィブリノーゲン結合部分に結合することができるフィブリノーゲンを含むバイオゲルキット（即ち、バイオゲルを形成するキット）も提供される。
【００１７】
さらに、本発明によれば、バイオゲルを形成させるための方法であって、各担体がその担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合前駆体を含む複数の担体を用意し；フィブリノーゲン結合前駆体をフィブリノーゲン結合部分に変換し；フィブリノーゲンの各分子が少なくとも２つのフィブリノーゲン結合部分に結合することができるフィブリノーゲン分子とフィブリノーゲン結合部分とを接触させることを含み、その結果、フィブリノーゲン分子が共にフィブリノーゲン結合部分とフィブリノーゲン分子との間に非共有結合の形成によって担体を介して連結するようになる。
【００１８】
本発明のバイオゲルは、組織基質に接着することができる必要はない。しかしながら、好ましい局面では、本発明のバイオゲルは、組織接着剤である。用語「組織接着剤」とは、本明細書において、組織基質、例えば、皮膚、または粘膜表面に接着することができる基質を意味するものとして用いられる。本発明のバイオゲルまたは組織接着剤は、止血用、封止剤として、組織工学用（例えば、支持体として）、または局所的薬物送達用に用いられてもよい。
【００１９】
担体は、可溶性または不溶性担体であってもよいが、血小板ではない。担体は、対象の組織部位、例えば、出血創傷部位、または粘膜部位への局所投与に適していなければならない。可溶性担体は、局所投与よりはむしろ静脈に適していてもよい。担体は、可溶性もしくは不溶性タンパク質、治療薬、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコールなどの生体適合性ポリマー）、またはこれらのいずれかの組み合わせを含んでもよい。
【００２０】
タンパク質担体の例には、酵素または酵素ではないタンパク質、例えばヒト血清アルブミンが挙げられる。
【００２１】
不溶性担体は、微粒子（固体、中空、または多孔性微粒子、好ましくは実質的に球状の微粒子を含む）であってもよい。微粒子は、任意の適切な基質、例えば架橋されたタンパク質で形成されてもよい。適切なタンパク質は、アルブミン（順に血清由来または組換え、ヒトまたは非ヒト）である。本発明における不溶性担体としての使用に適した微粒子は、例えば国際公開第ＷＯ９２／１８１６４号に記載される周知の噴霧乾燥技術を用いてヒト血清アルブミンを噴霧乾燥させることによって形成されてもよい。
【００２２】
担体としての微粒子の使用に代えて、リポソーム、合成ポリマー粒子（例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびポリ（乳酸／グリコール酸））、または細胞膜画分が含まれる。
【００２３】
用語「フィブリノーゲン」とは、本明細書において、天然のフィブリノーゲン、組換えフィブリノーゲン、またはトロンビンによってフィブリン（例えば、天然もしくは組換えフィブリンモノマー、または自然集合することができてもよいかもしくはできなくてもよいフィブリンモノマーの誘導体）を形成するように変換され得るフィブリノーゲンの誘導体を含むように用いられる。フィブリノーゲンは、少なくとも２つのフィブリノーゲン結合部分に結合することができなければならない。フィブリノーゲンは、任意の供給源、任意の種（ウシフィブリノーゲンを含む）から得ることができるが、好ましくはヒトフィブリノーゲンである。ヒトフィブリノーゲンは、自己またはドナーの血液から得てもよい。自己のフィブリノーゲンが好ましく、それは、本発明のバイオゲル（または接着剤）が対象に投与された場合の感染の危険性を減らすためである。
【００２４】
好ましくは、フィブリノーゲン結合部分はフィブリノーゲンに結合し、解離定数（ＫＤ）は１０−９〜１０−６Ｍであり、例えば、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００ｎＭまたはそれらを超える。約１００ｎＭのＫＤが好ましい。解離定数は、平衡状態で測定され得る。例えば、既知濃度の放射性標識されたフィブリノーゲンは、フィブリノーゲン結合部分が架橋されたマイクロスフェアとともにインキュベートされ得る。典型的には、５μＭのペプチドを１ｇｍのマイクロスフェアに架橋し、または、１５〜４０μｍｏｌのペプチドを１ｇｍのマイクロスフェアに架橋する。ペプチドを連結したマイクロスフェアは、０．５ｍｇ／ｍｌに希釈され、ｐＨ７．４の等張バッファー（例えば、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む０．０１Ｍ Ｈｅｐｅｓ）中で、０．０５〜０．５ｍｇ／ｍｌの濃度の放射性標識されたフィブリノーゲンとともに最大１時間２０℃でインキュベートされる。マイクロスフェア上のフィブリノーゲン結合部分に結合されたフィブリノーゲンは、遠心分離によって遊離フィブリノーゲンから分離することができ、遊離フィブリノーゲンと結合フィブリノーゲンの量を測定することができる。次に、解離定数は、結合フィブリノーゲン：遊離フィブリノーゲンの濃度比に対して、結合フィブリノーゲンの濃度をプロットすることにより、スキャッチャード分析によって計算することができ、この場合、曲線の傾きがＫＤを表す。
【００２５】
本発明のある態様では、フィブリノーゲン結合部分は、フィブリノーゲンに選択的に結合することが好ましい。他の態様では、フィブリノーゲン結合部分がフィブリノーゲンに結合し、別々にフィブリンモノマーおよび／またはフィブリンに結合し得ることが好ましい。フィブリノーゲンおよびフィブリンモノマーおよび／またはフィブリンへの結合は、好ましくは選択的である。
【００２６】
好ましくは、フィブリノーゲン結合部分は、フィブリノーゲン結合ペプチドまたはペプチド類似体である。任意の適切なフィブリノーゲン結合ペプチドを用いてもよい。例えば、ペプチドは、自然にまたは血小板の膜糖タンパク質であるＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａによってフィブリンに結合されるフィブリノーゲンの領域に結合することができてもよい。フィブリノーゲンへのフィブリン結合は、Ｍｏｓｅｓｓｏｎら，２００１，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９３６，１１−３０において検討されている。ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａのフィブリノーゲンへの結合は、Ｂｅｎｎｅｔｔ，２００１，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９３６，３４０−３５４において検討されている。
【００２７】
ペプチドは、フィブリノーゲンのα−鎖のカルボキシおよび／またはアミノ末端ドメインに結合することができてもよい。特に、ペプチドは、これらのドメインの１つまたは両方のＲＧＤ含有モチーフ（例えば、アミノ酸９５〜９８のＲＧＤＦ（配列番号１）、またはアミノ酸５７２〜５７５のＲＧＤＳ（配列番号２））に結合することができてもよい。ペプチドは、フィブリノーゲンのγ−鎖のカルボキシ末端ドメイン、好ましくはこのドメインの最後の１２個のアミノ酸（配列ＨＨＬＧＧＡＫＱＡＧＤＶ（配列番号３））に結合することができてもよい。ペプチドは、フィブリノーゲンのγ−鎖のＤ−ドメイン、例えば、Ｄ−ドメインのβ−鎖セグメントに結合することができてもよい。
【００２８】
フィブリノーゲン結合ペプチドは、ＧＰＩＩｂまたはＧＰＩＩＩａのフィブリノーゲン結合領域由来の配列を含んでもよい。例えば、ペプチドは、ＧＰＩＩｂのアミノ酸残基２９４〜３１４の配列に対応する配列ＡＶＴＤＶＮＧＤＧＲＨＤＬＬＶＧＡＰＬＹＭ（配列番号４）、またはフィブリノーゲン結合活性を保持するその断片もしくは誘導体を含んでもよい。フィブリノーゲン結合活性を保持することが知られている断片は、ＴＤＶＮＧＤＧＲＨＤＬ（２９６〜３０６）（配列番号５）、ＧＤＧＲＨＤＬＬＶＧＡＰＬ（３００〜３１２）（配列番号６）、およびＧＡＰＬ（配列番号７）である。ＴＤＶＮＧＤＧＲＨＤＬの適切な誘導体には、Ｔ（Ｄ，Ｅ）ＶＮＧ（Ｄ，Ｅ）ＧＲＨ（Ｄ，Ｅ）Ｌ（配列番号８）；ＴＤ（Ｖ，Ｌ）ＮＧＤＧＲＨＤＬ（配列番号９）；ＴＤＶ（Ｎ，Ｑ）ＧＤＧＲＨＤＬ（配列番号１０）；ＴＤＶＮＧＤＧ（Ｒ，Ｋ）ＨＤＬ（配列番号１１）が含まれる。
【００２９】
フィブリノーゲン結合ペプチドは、ＧＰＩＩＩａの残基９５〜２２３の配列、またはフィブリノーゲン結合活性を保持するその断片もしくは誘導体を含んでもよい。例えば、残基２１１〜２２２は、配列ＳＶＳＲＮＲＤＡＰＥＧＧ（配列番号１２）を含み、ＧＰＩＩＩａに含まれる重要なフィブリノーゲン結合ドメインであると考えられている。ＧＰＩＩＩａの他の適切な領域は、残基１０９〜１７１および１６４〜２０２を含む。
【００３０】
フィブリノーゲン結合ペプチドは、トロンビンの作用によって、フィブリノーゲンに露出されるようになり、フィブリンを生産するための重合反応における第１段階としてフィブリノーゲンに結合する残基の配列を含んでもよい。トロンビンは、フィブリノーゲンのα鎖およびβ鎖のＮ末端からペプチド（フィブリノペプチドＡおよびＢを放出する）を切断し、それぞれ配列ＮＨ２−ＧＰＲ−（配列番号１３）およびＮＨ２−ＧＨＲ−（配列番号１４）を露出する。したがって、フィブリノーゲン結合ペプチドの好ましい例には、アミノ末端のアミノ酸配列ＮＨ２−Ｇ（Ｐ，Ｈ）ＲＸ−（配列番号１５）を含み、この場合、Ｘは任意のアミノ酸であり、（Ｐ，Ｈ）はプロリンまたはヒスチジンのいずれかがその位置に存在することを意味する。好ましくは、ペプチドは、アミノ末端の配列ＮＨ２−ＧＰＲＰ−（配列番号１６）を含む。
【００３１】
好ましくは、フィブリノーゲン結合ペプチドは、長さにして４〜３０個、より好ましくは４〜１０個のアミノ酸残基である。
【００３２】
フィブリノーゲン結合前駆体は、担体がフィブリノーゲンと接触すると、フィブリノーゲン分子は共に、固定化されたフィブリノーゲン結合前駆体を有する担体を介して連結されるようになるようにフィブリノーゲンに結合しなくてもよい。好ましくは、フィブリノーゲンに対するフィブリノーゲン結合前駆体の解離定数は、１×１０６Ｍより大きい。フィブリノーゲン結合前駆体は、ペプチドまたはペプチド類似体であってもよいが、好ましくはペプチドである。フィブリノーゲン結合前駆体は、フィブリノーゲンでなくてもよく、フィブリノーゲンを含まなくてもよい。
【００３３】
本発明の好ましい態様では、フィブリノーゲン結合前駆体は、フィブリノーゲン結合ペプチドへのフィブリノーゲンの結合をブロックまたは阻害（即ち、低下）させるブロッキング成分（好ましくはペプチド）に、アミノ末端で接続されたフィブリノーゲン結合ペプチドを含む。変換剤（好ましくは、トロンビンなどの凝固因子）によるフィブリノーゲン結合前駆体の切断は、担体に結合されたフィブリノーゲン結合ペプチドを露出させ、それによって、フィブリノーゲン結合前駆体がフィブリノーゲン結合部分に変換される。このような態様では、ブロッキング成分は、切断が起こるまでフィブリノーゲンに結合するフィブリノーゲン結合ペプチドの能力をブロックまたは阻害する。好ましくは、ブロッキング成分は、長さにして１〜３０個のアミノ酸残基のペプチドである。
【００３４】
このような態様では、フィブリノーゲン結合前駆体は、変換剤によって特異的に認識され、フィブリノーゲン結合ペプチドとブロッキング成分との間に位置される切断部位を含まなければならないことは認識される。トロンビンが好ましい変換剤である。しかしながら、他のセリンプロテアーゼまたは凝固因子を用いて、フィブリノーゲン結合前駆体を切断してもよい。トロンビンは、アルギニン残基に対してカルボキシ末端側のペプチド結合であって、通常、アルギニンとグリシン残基との間で切断することが知られている。
【００３５】
本発明の特に好ましい態様では、フィブリノーゲン結合前駆体は、アミノ末端でアミノ酸配列ＮＨ２−ＺＹＸＲ／ＧＰＲＰ−（配列番号１７）を含むペプチドであり、この場合、「／」はトロンビン切断部位を表し、Ｘは任意のアミノ酸であるが、好ましくはプロリンであり、Ｙは任意のアミノ酸であるが、好ましくはアスパラギン酸またはアラニンであり、Ｚは少なくとも１つのアミノ酸であり、好ましくはロイシンまたはプロリンである。例えば、ＮＨ２−ＬＶＰＲ／ＧＰＲＰ−（配列番号１８）、ＮＨ２−ＡＤＰＲ／ＧＰＲＰ−（配列番号１９）、ＮＨ２−ＬＤＰＲ／ＧＰＲＰ−（配列番号２０）、またはＮＨ２−ＬＶＰＲ／ＧＰＲＶ−（配列番号２１）が挙げられる。
【００３６】
フィブリノーゲン結合部分または前駆体は、任意の適切な手段によって担体に結合させることができるが、典型的には共有結合である。好ましい共有結合の例としては、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、またはアミド結合である。適切な共有結合は、フィブリノーゲン結合部分または前駆体がシステインを含むペプチドであり、担体がチオール反応基を含む場合に形成され得る。これは、担体上のチオール反応基にシステインの−ＳＨ基を連結させることによって担体にペプチドを結合させることできる。好ましくは、末端システイン基は、フィブリノーゲン結合ペプチドまたは前駆体ペプチドに導入されて、担体上のチオール反応基を用いてペプチドを架橋する。あるいは、フィブリノーゲン結合部分または前駆体がマレイミド基（好ましくは、そのカルボキシ末端で、例えば、ペプチドのカルボキシ末端のリジンに結合させて）を含むペプチドであり、担体がスルフヒドリル基を含む場合に共有結合が形成され得る。次に、ペプチドは、ペプチドのマレイミド基と担体のスルフヒドリル基とを反応させることによって担体に結合され得る。
【００３７】
典型的には、フィブリノーゲン結合部分のフィブリノーゲン結合活性（必要であればフィブリノーゲン結合前駆体から一度変換される）が担体によって悪影響を及ぼさないことを確保するために、フィブリノーゲン結合部分または前駆体と担体との間にスペーサーを必要とする。適切なスペーサーは、ペプチドであるかまたはポリエチレングリコールなどの非ペプチドである。
【００３８】
フィブリノーゲン結合部分または前駆体は、フィブリノーゲン結合ペプチドを含むペプチドであり、この部分または前駆体は末端のアミノ酸残基によって不溶性担体に結合される場合、スペーサー配列は、好ましくは、末端のアミノ酸残基とこの部分または前駆体のフィブリノーゲン結合ペプチドとの間に存在する。スペーサー配列は、例えば、長さにして１〜２０個、好ましくは５〜２０個のアミン酸残基であってもよい。スペーサー配列ＧＧＧＧＧＧ（配列番号２２）またはＧＧＧＧＧ（配列番号２３）が好ましい。
【００３９】
担体あたりのフィブリノーゲン結合部分または前駆体の数、最適なバイオゲル（または組織接着剤）形成のために必要とされる担体（担体あたり複数のフィブリノーゲン結合部分または前駆体を有する）とフィブリノーゲンの相対量は、担体とフィブリノーゲンの種々の調製物を用いて変化させてもよいことは承認される。したがって、バイオゲル形成に用いる担体とフィブリノーゲンの最適な相対量を決定するために、担体またはフィブリノーゲンの各々新しいバッチを試験することが必要であるかまたは望ましい場合がある。
【００４０】
好ましくは、各担体は、平均して、担体あたり少なくとも５個のフィブリノーゲン結合部分または前駆体を有する。理論的には、担体あたりのフィブリノーゲン結合部分または前駆体の数の上限はない。最適数は、多くの因子、例えば、担体の性質、フィブリノーゲン結合部分または前駆体を付着させるための各担体上の反応基の数に依存する場合がある。しかしながら、各担体は、平均して、担体あたり最大１００個のフィブリノーゲン結合部分または前駆体を有することが好ましい。好ましい範囲は、担体あたり１０〜２０個のフィブリノーゲン結合部分または前駆体である。
【００４１】
好ましくは、用いられるフィブリノーゲンの量は、フィブリノーゲン結合部分または前駆体のモル数と比較して、存在するフィブリノーゲンのモル数の少なくとも４分の１（好ましくは２分の１）であるようなものである。好ましくは、フィブリノーゲン結合部分または前駆体のモル数に対するフィブリノーゲンのモル数は、１：４〜４：１の範囲である。
【００４２】
動的振動測定を用いて、本発明に従って形成されるバイオゲルの粘弾性特性を評価してもよい。粘弾性固体の貯蔵モジュール（Ｇ’）と喪失モジュール（Ｇ’’）は、弾性部分を表す貯蔵エネルギー、粘性部分を表す熱として消散されるエネルギーを測定する。タンデルタは、貯蔵モジュール（Ｇ’）に対する喪失モジュール（Ｇ’’）の比である。したがって、それは弾性寄与および粘性寄与の定量化であり、この場合、１を超える値は液状粘性挙動を示し、１を下回る値は弾性挙動を表す。本発明のバイオゲルは、好ましくは、１未満のタンデルタ値を有する。これは、ゲルの成分が架橋されるという指示を与える。タンデルタは、１Ｈｚの振動数と１％の一定のひずみで測定され得る。タンデルタを測定するための適切な方法は、下記の実施例においてより詳細に記載されている。
【００４３】
本発明のキットの成分は、互いに別々に保存されてもよく、あるいはキットの成分のいくつかまたは全ては、一緒に保存される成分が互いに反応しないという条件で一緒に保存されてもよい。キットが固定化されたフィブリノーゲン結合部分を有する担体を含む本発明の態様に関して、担体と反応しないように、フィブリノーゲンは担体とは別々に保存されなければならないことは承認される。フィブリノーゲンと、フィブリノーゲンに結合しない固定化されたフィブリノーゲン結合前駆体を有する担体とを含む本発明のキットの重要な利点は、担体とフィブリノーゲンが一緒に保存可能であるということである。
【００４４】
本発明のキットの成分は、組織または他の部位に成分を送達させるために、デバイス（例えば、シリンジ）に互いに別々に保存されてもよい。成分が組織または他の部位で送達されるので、このデバイスは、成分が互いに接触するように配置されてもよい。
【００４５】
本発明のキットは、バイオゲルまたは組織接着剤を生じさせるキットの成分の使用方法に関する取扱説明書を含んでもよい。
【００４６】
本発明のキットは、毒性薬物を必要としない、バイオゲル（または組織接着剤）がキットの成分を用いて簡単に生成され、安定な状態で成分を容易に保存することができるとい利点を有する。また、本発明のキットを用いてバイオゲルまたは組織接着剤を形成させるために、トロンビン（他の酵素）の存在を要件としないことは承認される。トロンビンを含まない本発明のキットは特に有利であり、それは、このようなキットを用いて形成されたバイオゲルまたは組織接着剤に対するアレルギー反応の危険性が、外因性のトロンビンを用いて形成されたバイオゲルまたは組織接着剤と比較して低減されるためである。トロンビン（または他の酵素）を含まない本発明のキットの更なる利点は、酵素活性を維持する条件下でキットの成分を保存する必要がないということである。
【００４７】
本発明のある態様によれば、フィブリノーゲン結合前駆体は、固定化されたフィブリノーゲン結合前駆体を有する担体が投与される部位に存在する変換剤によって、フィブリノーゲン結合部分に変換され得る。これは、変換剤がキットの一部とすべき必要性がないという利点を有する。結論として、変換剤の活性を維持する条件下でキットの成分を保存することを要しない。
【００４８】
好ましくは、変換剤は、創傷部位薬物である。用語「創傷部位薬物」とは、本明細書において、創傷部位に存在する薬物を意味するように用いられる。好ましい態様では、創傷部位薬物は凝固因子である。適切な凝固因子の例には、トロンビン、第ＶＩＩａ因子、第Ｘａ因子、または第ＸＩａ因子が挙げられる。好ましくは、凝固因子はトロンビンである。
【００４９】
他の態様によれば、本発明のキットは、フィブリノーゲン結合前駆体をフィブリノーゲン結合部分に変換するための変換剤をさらに含んでもよい。変換剤は、担体とは分離しなければならない。このような態様では、変換剤は、担体が投与されるべき部位に存在することが期待されない薬物であってもよい。あるいは、変換剤は、担体が投与されるべき部位に存在する薬物であってもよい。変換剤は、トロンビン、第ＶＩＩａ因子、第Ｘａ因子、または第ＸＩａ因子などの凝固因子であってもよい。
【００５０】
固定化されたフィブリノーゲン結合部分を有する担体を含む本発明のキットは、凝固因子をさらに含んでもよい。凝固因子によってフィブリノーゲン結合部分に変換され得るフィブリノーゲン結合前駆体を含む本発明のキットは、フィブリノーゲン結合前駆体をフィブリノーゲン結合部分に変換しない凝固因子を含んでもよい。このような態様では、（フィブリノーゲン結合前駆体を変換しない）凝固因子は、キットの別々の成分として、あるいは担体および／またはフィブリノーゲンとともに提供されてもよい。凝固因子は、例えば各フィブリノーゲン結合前駆体に連結された担体に固定化されてもよい。
【００５１】
本発明のキットが凝固因子（例えば、トロンビン）を含む場合、これは、好ましくは、凝固因子に対するアレルギー反応の危険性を低下させるために、非ヒト（例えば、ウシ凝固因子）というよりはむしろ、ヒト配列である凝固因子である。
【００５２】
本発明のバイオゲルまたは組織接着剤は、組織部位に投与される前に、またはインサイチューで、組織部位、例えば創傷部位で形成されてもよい。組織部位でのバイオゲルまたは組織接着剤は、局所的に投与される担体を含む。
【００５３】
トロンビンは、本発明のバイオゲルまたは組織接着剤が投与されるかまたは形成される組織部位に存在してもよいことは承認される。例えば、組織部位が出血している創傷部位である場合、宿主トロンビンが創傷部位に存在する可能性がある。当然に、トロンビンは、本発明のキットを用いて提供される場合、代替的または付加的に存在してもよい。
【００５４】
フィブリノーゲンに結合し、別々にフィブリンモノマーおよび／またはフィブリンに結合することができるフィブリノーゲン結合部分の使用は、本発明のバイオゲルまたは接着剤がトロンビンの存在下で形成され、あるいは一度形成されるとトロンビンと接触されるようになる場合に有利であり得る。トロンビンが、フィブリノーゲンおよび固定化されたフィブリノーゲン結合部分を有する担体と一緒に存在する場合、トロンビンは、少なくともいくつかのフィブリノーゲンをフィブリンモノマーに変換する。これらの条件下で、フィブリノーゲン結合部分もフィブリンモノマーに結合し、その結果、トロンビンによって形成されたフィブリンモノマーが担体によって互いに連結可能になることが好ましいことは承認される。
【００５５】
本発明のバイオゲルまたは接着剤は、一度形成されるとトロンビンと接触するようになる場合、フィブリノーゲン結合部分に結合されたフィブリノーゲンはフィブリンモノマーに変換されることができ、フィブリノーゲン結合部分はフィブリンモノマーに結合された状態になる場合に有利となり得る。これらの環境下で、フィブリノーゲンとフィブリノーゲン結合部分との間に形成された非共有結合は、フィブリノーゲンのフィブリンモノマーへの変換によって崩壊しない。また、フィブリノーゲン結合部分に結合された少なくともいくつかのフィブリンモノマーは、フィブリノーゲン結合部分に連結された状態でフィブリンを形成するために集合することができる場合に有利であり得る。これらの環境下で、バイオゲルまたは組織接着剤は、フィブリンの形成によって強化され得る。
【００５６】
トロンビン（例えば、本発明のキット由来、または創傷部位での宿主トロンビン由来）がある場合、トロンビンと接触させる前に、担体とフィブリノーゲンとを互いに接触させるか、または担体、フィブリノーゲンおよびトロンビンを互いに実質的に同時に接触させることが好ましい。
【００５７】
担体と接触させる前に、トロンビンとフィブリノーゲンとを互いに接触させる場合に、バイオゲルまたは組織接着剤が形成されてもよい場合があるが、これは、トロンビンの前に担体とフィブリノーゲンとを互いに接触させることによるか、または担体、フィブリノーゲンおよびトロンビンを互いに実質的に同時に接触させることによって形成されたバイオゲルまたは組織接着剤よりも利用性が小さいことが期待される。これは、トロンビンが、フィブリノーゲン分子をフィブリンモノマーに変換し、次に担体との接触させる前に凝集して不溶性フィブリンを形成することが期待されるからである。しかしながら、ある状況では、例えば、トロンビンが担体と接触させるまでまたはその後に不活性となる場合、担体の前にトロンビンとフィブリノーゲンとを接触させることによってバイオゲルおよび組織接着剤を形成することが適切である場合もある。
【００５８】
また、本発明によれば、複数の担体とフィブリノーゲン分子およびトロンビンとを接触させることを含むバイオゲルを形成させるための方法が提供され、ここで、複数のフィブリノーゲン結合部分は、各担体に固定化され、各フィブリノーゲン分子は、少なくとも２つのフィブリノーゲン結合部分に結合して、フィブリノーゲン結合部分とフィブリンモノマーとの間の非共有結合によって担体を介してともに連結されるバイオゲルを形成することができる。
【００５９】
バイオゲルは、フィブリンを含んでもよく、または含まなくてもよい。したがって、フィブリンモノマーは、バイオゲルのフィブリンの一部であってもよく、またはフィブリンモノマーは、バイオゲルのフィブリンの一部でなくてもよい。
【００６０】
また、本発明によれば、フィブリンモノマーおよび複数の担体を含むバイオゲルが提供され、各担体は、その担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分を有し、ここで、フィブリンモノマーはともに、フィブリノーゲン結合部分とフィブリンモノマーとの間の非共有結合によって担体を介して連結される。
【００６１】
さらに、本発明によれば、フィブリンおよび複数の担体を含むバイオゲルが提供され、各担体は、その担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分を有し、ここで、フィブリンのフィブリンモノマーはともに、フィブリノーゲン結合部分とフィブリンモノマーとの間の非共有結合によって担体を介して連結される。
【００６２】
好ましい局面では、バイオゲルは組織接着剤である。
【００６３】
本発明のキットは、第ＸＩＩＩ因子を含み、場合により、第ＸＩＩＩ因子から第ＸＩＩＩａ因子に活性するためのカルシウムイオンおよびトロンビンを含んでもよい（その場合、カルシウムイオンおよびトロンビンは、第ＸＩＩＩ因子とは別々でなければならない）。あるいはまたは加えて、第ＸＩＩＩａ因子は、本発明のバイオゲルまたは組織接着剤が投与または形成される組織部位に存在してもよい。例えば、組織部位が出血している創傷部位であれば、宿主第ＸＩＩＩａ因子は、創傷部位に存在する場合がある。
【００６４】
第ＸＩＩＩａ因子がフィブリンを含む本発明のバイオゲルまたは組織接着剤と接触すると、バイオゲルまたは組織接着剤は、第ＸＩＩＩａ因子がフィブリンと反応して、フィブリンを共有結合的に架橋させることによってさらに強化されてもよい。
【００６５】
また、本発明によれば、バイオゲルを形成させるための方法が提供され、この方法は、複数の担体とフィブリノーゲン分子およびトロンビンとを接触させることを含み、ここで、複数のフィブリノーゲン結合部分は各担体に固定化され、各フィブリノーゲン分子は少なくとも２つのフィブリノーゲン結合部分に結合して、フィブリンを含むバイオゲルを形成し、そこでは、フィブリンのフィブリンモノマーはともに、フィブリノーゲン結合部分とフィブリンモノマーとの間の非共有結合によって担体を介して連結され；バイオゲルと第ＸＩＩＩａ因子とを接触させることを含み、その結果、フィブリンのフィブリンモノマーはともに、ペプチド結合によって共有結合的に架橋されるようになる。
【００６６】
さらに、本発明によれば、フィブリンおよび複数の担体を含むバイオゲルが提供され、各担体は、その担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分を有し、ここで、フィブリンのフィブリンモノマーはともに、ペプチド結合によって共有結合的に連結され、フィブリンのフィブリンモノマーはともに、フィブリン結合部分とフィブリンモノマーとの間の非共有結合によって担体を介して連結される。
【００６７】
好ましい局面では、バイオゲルは組織接着剤である。
【００６８】
本発明のキットは、さらに、創傷治癒の促進剤を含んでもよい。適切な例には、増殖因子、例えば血小板由来増殖因子が挙げられる。促進剤は、キットの別々の成分であってもよく、または担体に固定化されてもよい。
【００６９】
本発明のキットは、さらに、抗菌剤、例えば抗生物質を含んでもよい。抗菌剤は、キットの別々の成分であってもよく、または担体に固定化されてもよい。
【００７０】
各担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分を有する担体が、宿主フィブリノーゲンが存在する組織部位（例えば、出血している創傷部位）に投与されると、担体は、宿主のフィブリノーゲンと反応して、インサイチューで組織部位にバイオゲルまたは組織接着剤を形成することは承認される。
【００７１】
同様に、各担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合前駆体を有する担体が、フィブリノーゲン結合前駆体をフィブリノーゲン結合部分に変換するための変換剤と宿主フィブリノーゲンとが存在する組織部位（例えば、出血している創傷部位）に投与されると、フィブリノーゲン結合前駆体は、フィブリノーゲン結合部分に変換され、次に、担体は、宿主フィブリノーゲンと反応して、インサイチューで組織部位にバイオゲルまたは組織接着剤を形成する。例えば、フィブリノーゲン結合前駆体は、宿主トロンビン、または別の凝固因子によってフィブリノーゲン結合部分に変換されてもよい。
【００７２】
したがって、さらに、本発明によれば、各担体がその担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分を有する局所的に投与される担体、および内因性フィブリノーゲンを含むバイオゲルが提供され、ここで、内因性フィブリノーゲンの各分子は、少なくとも２つのフィブリノーゲン結合部分に結合され、その結果、フィブリノーゲン分子はともに、フィブリノーゲン結合部分と内因性フィブリノーゲン分子との間の非共有結合によって担体により連結される。
【００７３】
用語「内因性フィブリノーゲン」とは、本明細書において、フィブリノーゲンが、担体が投与される部位に存在する宿主フィブリノーゲンを意味するように用いられる。典型的には、宿主の血液が創傷部位に存在するため、宿主フィブリノーゲンが存在する。
【００７４】
また、本発明によれば、バイオゲルを形成するための担体の使用が提供され、担体は、その担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分またはフィブリノーゲン結合前駆体を有する。
【００７５】
バイオゲルは、好ましくは組織接着剤である。
【００７６】
担体は、止血用、封止剤として、局所的薬物送達用、または組織工学用のバイオゲルまたは組織接着剤を形成させるために用いられてもよい。
【００７７】
バイオゲルまたは組織接着剤を形成させるための担体の投与は、宿主のアレルギー反応の危険性を最小限にする利点があり、それは、外因性のフィブリノーゲンまたはトロンビンを必要とせず、毒性薬物を要せず、担体が安定条件で容易に保存され得るためである。
【００７８】
また、本発明によれば、宿主フィブリノーゲンが存在する部位での出血を調節する方法が提供され、この方法は、その部位に複数の担体を局所的に投与することを含み、ここで、各担体は、その担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部位を有し、この部位の宿主フィブリノーゲン分子は少なくとも２つのフィブリノーゲン結合部分に結合することができる。
【００７９】
さらに、本発明によれば、宿主フィブリノーゲンおよび凝固因子が存在する部位での出血を調節する方法が提供され、この方法は、その部位に複数の担体を局所的に投与することを含み、ここで、各担体は、その担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合前駆体を有し、フィブリノーゲン結合前駆体は、宿主凝固因子によってフィブリノーゲン結合部分に変換されることができ、その部位での宿主フィブリノーゲン分子は少なくとも２つのフィブリノーゲン結合部分に結合することができる。
【００８０】
さらに、本発明によれば、出血を調節するかまたは創傷を処置もしくは封止するための医薬（例えば、バイオゲルまたは組織接着剤）の製造における複数の担体の使用が提供され、ここで、各担体は、その担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分またはフィブリノーゲン結合前駆体を有する。
【００８１】
また、本発明によれば、バイオゲルを形成するための複数の担体の使用が提供され、各担体は、その担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分またはフィブリノーゲン結合前駆体を有する。
【００８２】
さらに、本発明によれば、出血の調節、または創傷の処置もしくは封止において（バイオゲルまたは組織接着剤として）用いるための複数の担体が提供され、ここで、各担体は、担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分またはフィブリノーゲン結合前駆体を有する。
【００８３】
担体は、不溶性または可溶性であってもよい。担体は、局所的に投与されてもよい。
【００８４】
担体が可溶性担体である場合、固定化されたフィブリノーゲン結合部分またはフィブリノーゲン結合前駆体を有する担体の好ましい局所製剤は、液体製剤であり、好ましくは生理学的なｐＨの等張緩衝液に含まれる。
【００８５】
担体が不溶性担体である場合、固定化されたフィブリノーゲン結合部分またはフィブリノーゲン結合前駆体を有する担体の好ましい局所製剤は、例えば組織部位に噴霧することができる粉末の形態である。
【００８６】
粉末化担体は、任意の適切な方法を用いて形成されてもよく、この方法には、（例えば、生理学的なｐＨの等張緩衝液に懸濁された）各担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分またはフィブリノーゲン結合前駆体を有する担体の懸濁液を噴霧乾燥させるかまたは凍結乾燥させることが含まれる。好ましくは、噴霧乾燥が用いられ、これは凍結乾燥よりも迅速であって、簡単に計量できる乾燥方法であり得るためである。適切な噴霧乾燥法は、国際公開第ＷＯ９２／１８１６４号に記載されている。
【００８７】
本発明によれば、バイオゲルを形成させるための薬物が提供され、この薬物は可溶性担体を含み、フィブリノーゲン結合前駆体の複数のフィブリノーゲン結合部分が各担体に固定化されている。
【００８８】
また、本発明によれば、バイオゲルを形成させるための薬物が提供され、この薬物は、各担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分またはフィブリノーゲン結合前駆体を有する不溶性担体を含み、薬物は、凍結乾燥以外によって形成された粉末の形態である。
【００８９】
また、本発明によれば、粉末化された薬物を形成させるための方法が提供され、この薬物は、各担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分またはフィブリノーゲン結合前駆体を有する不溶性担体を含み、この方法は、薬物の懸濁液を噴霧乾燥させることを含む。
【００９０】
好ましくは、薬物は局所投与に適している。薬物が、各担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合前駆体を有する可溶性担体を含む場合、薬物は静脈内投与に適していてもよい。
【００９１】
担体または薬物は、キットの成分として提供されてもよい。キットは、さらに、凝固因子、創傷治癒の促進剤、または抗菌剤を含んでもよい。凝固因子、創傷治癒の促進剤、または抗菌剤は、キットの別々の成分であってもよく、または担体に固定されてもよい。ある好ましい態様では、凝固因子、創傷治癒の促進剤、または抗菌剤は、フィブリノーゲン結合前駆体の一部であってもよく、その結果、フィブリノーゲン結合前駆体がフィブリノーゲン結合部分に変換されると放出される。
【００９２】
本発明のキットは、区分化されたキットであってもよく、互いに別々の状態であることが望まれるキットの成分は別々の区分または容器に含まれる。本発明のキットは、本発明の方法を実施するキット成分を用いるための取扱説明書を含んでもよい。
【００９３】
本発明のバイオゲルまたは組織接着剤は、組織部位、例えば皮膚または粘膜組織に局所的に投与されてもよい。本発明のバイオゲルまたは組織接着剤は、止血用、封止剤として、局所的薬物送達用または組織工学用に用いられてもよい。
【００９４】
本発明のバイオゲルまたは組織接着剤は、ゲルまたは接着剤を投与部位と接触させる前にゲルまたは接着剤を形成させることによって、あるいは投与部位でゲルまたは組織接着剤を形成させることによって投与されてもよい。
【００９５】
また、各々がフィブリノーゲン結合部分に変換され得る複数のフィブリノーゲン結合前駆体が各担体に固定化されている可溶性担体を含む薬物は、例えば、出血を調節するため、または薬物送達用に静脈内に投与されてもよい。好ましい静脈内製剤は、２０％の水性等張溶液である。好ましい態様では、フィブリノーゲン結合前駆体は、トロンビンによって変換され得る。
【００９６】
さらに、本発明によれば、出血を調節するための方法が提供され、この方法は、可溶性担体を含む薬物を静脈内に投与することを含み、ここで、各々がフィブリノーゲン結合部分に変換され得る複数のフィブリノーゲン結合前駆体は、各担体に固定化されている。
【００９７】
さらに、本発明によれば、対象に薬物を送達するための方法が提供され、この方法は、対象に可溶性担体を含む薬物を静脈内投与することを含み、ここで、各々がフィブリノーゲン結合部分に変換され得る複数のフィブリノーゲン結合前駆体は、各担体に固定化され、この担体は薬物を含むかまたは薬物が担体に固定化されている。
【００９８】
当然に、局所または静脈用製剤は無菌でなければならない。
【００９９】
本発明のバイオゲルまたは組織接着剤は、創傷治癒の促進剤、または抗菌剤をさらに含んでもよい。
【０１００】
また、本発明によれば、出血を調節するための方法が提供され、この方法は、出血している部位に本発明のバイオゲルまたは組織接着剤を局所投与することを含む。
【０１０１】
また、本発明によれば、創傷を処置または封止するための方法が提供され、この方法は、創傷部位に本発明のバイオゲルまたは組織接着剤を（好ましくは局所的に）投与することを含む。
【０１０２】
また、本発明によれば、薬剤として用いるための本発明のバイオゲルまたは組織接着剤が提供される。
【０１０３】
さらに、本発明によれば、出血を調節するか、または創傷を処置もしくは封止するための薬剤の製造における本発明のバイオゲルまたは組織接着剤の使用が提供される。
【０１０４】
また、本発明によれば、出血を調節するか、または創傷を処置もしくは封止するための本発明のバイオゲルまたは組織接着剤が提供される。
【０１０５】
本発明のバイオゲルまたは組織接着剤の使用は、局所的な使用であってもよい。バイオゲルまたは組織接着剤は、可溶性担体と、フィブリノーゲン結合前駆体から変換されたフィブリノーゲン結合部分とを用いて形成される場合、この使用は静脈内であってもよい。
【０１０６】
本発明の好ましい態様は、一例としてのみ、ここに記載されている。
【０１０７】
本発明の第１の好ましい態様によれば、各々がアミノ末端でフィブリノーゲン結合配列を含む複数のペプチド（例えば、配列ＧＰＲＰＧＧＧＧＧＧＣ（配列番号２４）のペプチド）は、それらのカルボキシ末端で担体に連結され、それは可溶性タンパク質（例えばアルブミン）である。バイオゲルは、ペプチドを連結した担体とフィブリノーゲンとを接触させることによって形成される。次に、バイオゲルは、創傷の手当てとして局所的に投与されてもよい。
【０１０８】
本発明の第２の好ましい態様によれば、第１の好ましい態様のペプチドを連結した担体とフィブリノーゲンとは、創傷部位で混合され、インサイチューでバイオゲルを形成する。
【０１０９】
本発明の第３の好ましい態様によれば、第１の好ましい態様のペプチドを連結した担体は、宿主血液由来のフィブリノーゲンが存在する創傷部位に投与されて、インサイチューでバイオゲルを形成する。
【０１１０】
本発明の第４の好ましい態様によれば、各々がそのアミノ末端でブロッキングペプチド配列に接続されたフィブリノーゲン結合配列を含む複数のペプチド（例えば、ＬＶＰＲＧＰＲＰＧＧＧＧＧＧＣ（配列番号２５）のペプチド）は、それらのカルボキシ末端で担体に連結され、それは可溶性タンパク質（例えばアルブミン）である。ペプチドを連結した担体は、フィブリノーゲンと組み合わせられ、次に、単一の混合物として創傷に適用され得る。創傷部位に存在する宿主トロンビンは、ペプチドを切断して、ブロッキングペプチドを放出し、フィブリノーゲン結合配列を露出する。フィブリノーゲン結合配列が露出された担体は、フィブリノーゲンと反応して、インサイチューでバイオゲルを形成する。
【０１１１】
あるいは、第４の好ましい態様のペプチドを連結した担体は、静脈内に投与することができる。創傷部位の宿主トロンビンは、ペプチドを切断して、ブロッキングペプチドを放出し、フィブリノーゲン結合配列を露出する。フィブリノーゲン結合配列が露出された担体は、宿主フィブリノーゲンと反応して、創傷部位で出血を調節する。
【０１１２】
上記される第４の好ましい態様のバイオゲルは、組織接着剤であってもよい。
【０１１３】
不溶性担体（例えば、アルブミンマイクロスフェア）は、上記の好ましい態様のいずれか（静脈内投与用以外）において可溶性タンパク質担体の代わりに用いられてもよい。
【０１１４】
分岐したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または任意の他の生体適合性ポリマーは、上記の好ましい態様のいずれかにおいて可溶性タンパク質の代わりに用いられてもよい。
【０１１５】
凝固因子は、上記の好ましい態様のいずれかにおいて担体に固定化されてもよいが、ただし、フィブリノーゲン結合前駆体が担体に固定化されている場合には、凝固因子はフィブリノーゲン結合前駆体をフィブリノーゲン結合部分に変換しない。
【０１１６】
担体は、上記の好ましい態様のいずれかにおいて創傷治癒の促進剤（例えば、血小板由来増殖因子などの増殖因子）をさらに含んでもよい。
【０１１７】
本発明のさらに好ましい態様は、添付の図面を参照して、下記の実施例に記載されている。
【実施例】
【０１１８】
実施例１
ヒト血清アルブミンを含む、担体に固定化されたフィブリノーゲン、及びフィブリノーゲン結合ペプチドを用いたバイオゲルまたは組織接着剤の形成
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と、４０倍の過剰なモル数のリンカーのスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）をｐＨ７．４で反応させた。修飾されたタンパク質（ＨＳＡ−ＳＭＣＣ）を精製し、平均して１モルのＨＳＡが１８モルのＳＭＣＣで修飾されたことを測定した。ＧＰＲＰＧＧＧＧＧＧＣ（Ｂ１０；配列番号２４）またはＬＶＰＲＧＰＲＰＧＧＧＧＧＧＣ（ＴＣ−１５；配列番号２５）のいずれかが、マレイミド部分と比較して過剰な１．５モルでＨＳＡ−ＳＭＣＣに添加された。次に、ペプチド修飾されたＨＳＡタンパク質は、未反応のペプチドから精製され、−８０℃、７ｍｇ／ｍｌで保存された。供給業者（Ｓｃｏｔｔｉｓｈ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ｓｅｒｖｉｃｅ）によって説明されるように、凍結乾燥されたヒトフィブリノーゲンを水に溶かし、１６ｍｇ／ｍｌとした。
【０１１９】
ペプチド修飾されたＨＳＡ（５μｌ）を０．３ｍｌのフィブリノーゲン溶液に添加し、Ｂ１０−ＨＳＡについてはインスタントゲルが観察され、ＴＣ−１５については、ゲルは観察されなかった。露出されたＧＰＲＰペプチド配列は、フィブリノーゲンの２つの遠位ドメイン（Ｄ）のカルボニル領域内の「ａ」ポケットに結合することで知られている（図１ｂ）。複数の露出されたＧＰＲＰ配列（Ｂ１０）で修飾されたＨＳＡは、フィブリノーゲンの重合のための分岐点として働くと考えれる（図１ｃ）。このゲルは、トロンビンがない場合に形成される。
【０１２０】
実施例２〜５の方法
ペプチド修飾されたＨＳＡの合成
１０ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と、全量が０．７ｍｌである５、１０、２０または４０倍の過剰なモル数のリンカーであるスルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ）をｐＨ７．４で反応させた。修飾されたタンパク質（ＨＳＡ−ＳＭＣＣ）をＺｅｂｒａ（商標）脱塩スピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によって精製し、平均して１モルのＨＳＡがそれぞれ５、８、１６または１８モルのＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣにより修飾されたことを確認した。ＨＳＡ１分子あたりに結合したマレイミド基の数を決定するために、３ナノモルのＨＳＡの試料を室温で３０分間、バッファーに含まれる既知量のシステイン（１００ナノモル）とともにインキュベートした。次に、残りのシステインを２０分間、１ｍｍｏｌの５，５−ジチオビス（２−ニトロベンゾエート）（ＤＴＮＢ）と反応させ、Ａ４１２を測定した。マレイミドレベルは、対照およびタンパク質試料の吸光度を比較することによって計算された。ＧＰＲＰＧＧＧＧＧＧＣ（Ｂ１０；配列番号２４）またはＬＶＰＲＧＰＲＰＧＧＧＧＧＧＣ（ＴＣ−１５；配列番号２５）ペプチドのいずれかが、マレイミド部分と比較して過剰な１．５モルでＨＳＡ−ＳＭＣＣに添加された。次に、ペプチド修飾されたＨＳＡタンパク質は、Ｚｅｂｒａ（商標）脱塩スピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて、未反応のペプチドから精製され、−８０℃、７ｍｇ／ｍｌで保存された。凍結乾燥されたヒトフィブリノーゲン（Ｓｃｏｔｔｉｓｈ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）を水に溶解して、８、１６、３２および６４ｍｇ／ｍｌとした。フィブリノーゲンおよびアルブミンの濃度は、１％フィブリノーゲン Ｅ２８０＝１５、および１％ＨＳＡ Ｅ２８０＝１３．８を用いる２８０ｎｍ（Ａ２８０）の吸光度から決定した。
【０１２１】
流動特性
動的振動測定を用いて、ゲルの粘弾性特性を評価した。混合物を室温で一晩平衡化し、２５ｍｍの径、１°の円錐角の円錐および平板を有するＰｈｙｓｉｃａ ＭＣＲ−５０１（Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）流量計の下段プレートにゲルを移した。加湿雰囲気で２０又は３７±℃のいずれかで試験を行った。振動数掃引を１％の一定のひずみ振幅で０．０１〜５０Ｈｚで行った。試験されたレオロジーパラメータは、流動計を備えた専用のＡｎｔｏｎ Ｐａａｒソフトウェアを用いて開始された。
【０１２２】
実施例２ ゲル形成に対するペプチド修飾されたＨＳＡの量およびフィブリノーゲン濃度の影響
フィブリノーゲンの重合は、フィブリノーゲンとＨＳＡ溶液の混合後、最初に視覚的にモニターされた。５、８、１６または１８モルのいずれかのフィブリノーゲン結合ペプチドで修飾されたペプチド修飾されたＨＳＡを１モルのＨＳＡと複合化した。このペプチド修飾されたＨＳＡまたは未修飾のＨＳＡの２５μｌ試料を８、１６、３２または６４ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲンの０．２ｍｌと混合した。ゲルの形成は、室温で０．５時間後に視覚的に測定された。未修飾のＨＳＡまたは５または８モルのペプチドで修飾されたＨＳＡについては、試験されたフィブリノーゲンの全ての濃度でゲル形成が観察されなかった。重合は、３２または６４ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲンでのみ、１６または１８モルの結合ペプチドを有するペプチド修飾されたＨＳＡを用いて観察された。
【０１２３】
図４は、ペプチド修飾されたＨＳＡ（２５μｌ、１８モルのペプチド）の添加の前（ａ）および後（ｂ）のフィブリノーゲン溶液（０．２ｍｌ ３２ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン）の写真を示す。本発明に従って形成されたバイオゲルは（ｂ）に示される。
【０１２４】
実施例３ ペプチド修飾されたＨＳＡの量の影響
混合物のレオロジー特性に対するペプチド修飾されたＨＳＡおよびフィブリノーゲンの量の効果を測定するために、３２および６４ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲンによるペプチド修飾されたＨＳＡの２５または５０μｌを用いて、せん断強度を測定した。ＨＳＡの１モルあたり１６モルの結合ペプチドで修飾されたペプチド修飾されたＨＳＡをこの実験に用いた。ゲルの線形粘弾性ひずみ限度内で動的振動実験が行われたことを確かめるために、ひずみ掃引を行った。図２は、３２ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲンと混合した２５μｌのペプチド修飾されたＨＳＡについての２０および３７℃のひずみ掃引を示す。貯蔵モジュール（Ｇ’）および喪失モジュール（Ｇ’’）は、範囲全体で安定であるように見え、この洗浄粘弾性ひずみ範囲において１％の一定ひずみを選択した。周波数掃引は、架橋ネットワークを示すＧ’’より大きなＧ’値を示した（表１）。表に示される値は、１Ｈｚの振動数で取られる。タンデルタは、貯蔵モジュールに対する喪失モジュールの比である。したがって、それは、弾性と粘性の寄与の定量であり、その場合、１を超える値は粘性様の液体を示し、１未満は弾性を表す。複素粘度η＊は、角振動数（ω）で割った複素モジュールＧ＊として定義され、同条件下で測定された。これらの条件下では、ペプチド修飾されたＨＳＡとフィブリノーゲンの両方の量は、ゲルの機械的強度にほとんど影響を及ぼさないようである。
【０１２５】
【表１】
３２ｍｇ／ｍｌによる、ＨＳＡ（２５μｌ）あたり１８ペプチド結合したペプチド修飾されたＨＳＡの異なるバッチでは、Ｇ’が５２００、複素粘度が８２０、タンデルタが０．１０５であった。
【０１２６】
実施例４ レオロジー特性に対する温度の影響
ゲルに対する温度の効果についての検討は、手術体温時に用いられる場合、又は局所的に適用される場合の製造品の適用に重要である。本発明者らは、２０℃と３７℃でのゲルの機械的強度および表２に示される値は、１Ｈｚの振動数で取られることを評価した。３２ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン、１６モルのペプチドで修飾された２５μＬのＨＳＡから生じたゲルの温度上昇は、Ｇ’と複素粘度との両方の減少をもたらした（表２）。２０℃と３７℃でのタンデルタは１未満であり、したがって、（非共有結合的な）架橋ネットワーク構造は３７℃で維持される。
【０１２７】
【表２】
実施例５ ヒト血漿におけるゲル形成
ペプチド修飾されたＨＳＡがヒト血漿中でフィブリノーゲンを重合し得るかどうかを検討することは、外科用接着剤／粘着材として製造品の応用に重要である。１８モルのペプチドで修飾されたペプチド修飾されたＨＳＡ（７５μｌ）を０．８ｍｌのヒトのプール血漿と混合した。血漿誘導ゲル上のレオロジーを３７℃で行い、Ｇ’値が６１００であり、タンデルタが０．１０４であった。この結果から、ペプチド修飾されたＨＳＡは、３７℃で（非共有結合的な）架橋ネットワーク構造をもたらす、ヒト血漿中でフィブリノーゲンを重合することができるという結論に達する。
【図１（ａ）】
【図１（ｂ）】
【図１（ｃ）】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオゲルの形成のためのキットであって、複数の担体であって、各担体がその担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分を有する担体と、個別に、フィブリノーゲンであって、フィブリノーゲンの各分子が少なくとも２つのフィブリノーゲン結合部分に結合することができるフィブリノーゲンとを含む、キット。
【請求項２】
バイオゲルの形成のためのキットであって、複数の担体であって、各担体がその担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合前駆体を有し、各フィブリノーゲン前駆体がフィブリノーゲン結合部分に変換され得る複数の担体と、フィブリノーゲンであって、フィブリノーゲンの各分子が少なくとも２つのフィブリノーゲン結合部分に結合することができるフィブリノーゲンとを含む、キット。
【請求項３】
前記フィブリノーゲン結合前駆体が、創傷部位薬物によってフィブリノーゲン結合部分に変換され得る、請求項２に記載のキット。
【請求項４】
前記創傷部位薬物が凝固因子である、請求項３に記載のキット。
【請求項５】
前記フィブリノーゲン結合前駆体をフィブリノーゲン結合部分に変換しない凝固因子をさらに含む、請求項４に記載のキット。
【請求項６】
各フィブリノーゲン結合前駆体が前記凝固因子に連結される、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
前記フィブリノーゲン結合前駆体をフィブリノーゲン結合部分に変換するための変換剤をさらに含む、請求項２に記載のキット。
【請求項８】
前記変換剤が創傷部位薬物である、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
前記創傷部位薬物が凝固因子である、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
前記フィブリノーゲン結合前駆体をフィブリノーゲン結合部分に変換しない凝固因子をさらに含む、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
凝固因子をさらに含む、請求項１に記載のキット。
【請求項１２】
創傷治癒の促進剤または抗菌剤をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１３】
前記担体が可溶性担体である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１４】
前記担体が生体適合性ポリマーを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１５】
組織接着剤を形成するための請求項１〜１４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１６】
バイオゲルの形成のための薬物であって、該薬剤は可溶性担体を含み、複数のフィブリノーゲン結合部分または各々がフィブリノーゲン結合部分に変換され得る複数のフィブリノーゲン結合前駆体が、各担体に固定化される、薬物。
【請求項１７】
バイオゲルの形成のための薬物であって、各々の担体に固定化されている、複数のフィブリノーゲン結合部分または各々がフィブリノーゲン結合部分に変換され得る複数のフィブリノーゲン結合前駆体を有する不溶性担体を含み、凍結乾燥以外で形成された粉末の形態である薬物。
【請求項１８】
前記フィブリノーゲン結合前駆体が、創傷部位薬物によってフィブリノーゲン結合部分に変換され得る、請求項１６または１７に記載の薬物。
【請求項１９】
前記創傷部位薬物が凝固因子である、請求項１８に記載の薬物。
【請求項２０】
組織接着剤を形成させるための請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の薬物。
【請求項２１】
フィブリノーゲン分子及び複数の担体を含むバイオゲルであって、各担体は、該担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分を有し、フィブリノーゲンの各分子は、少なくとも２つのフィブリノーゲン結合部分に結合して、該フィブリノーゲン分子が共に、該フィブリノーゲン結合部分と該フィブリノーゲン分子との間の非共有結合によって該担体を介して連結されるようになるバイオゲル。
【請求項２２】
フィブリンモノマー及び複数の担体を含むバイオゲルであって、各担体は、該担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分を有し、該フィブリンモノマーは共に、該フィブリノーゲン結合部分と該フィブリンモノマーとの間の非共有結合によって該担体を介して連結されるバイオゲル。
【請求項２３】
フィブリン及び複数の担体を含むバイオゲルであって、各担体は、該担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分を有し、該フィブリンのフィブリンモノマーは共にペプチド結合によって共有結合的に連結され、該フィブリンのフィブリンモノマーは共に、該フィブリノーゲン結合部分と該フィブリンモノマーとの間で非共有結合によって該担体を介して連結されるバイオゲル。
【請求項２４】
組織接着剤である、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載のバイオゲル。
【請求項２５】
フィブリノーゲン分子と複数の担体とを接触させることを含むバイオゲルを形成させるための方法であって、各担体は、該担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分を有し、フィブリノーゲンの各分子は、少なくとも２つのフィブリノーゲン結合部分を結合することができ、それにより、該フィブリノーゲン分子は共に、該フィブリノーゲン結合分子と該フィブリノーゲン分子との間の非共有結合の形成によって該担体を介して連結されるようになる方法。
【請求項２６】
複数の担体を用意し、ここで、各担体は該担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合前駆体を含み；該フィブリノーゲン結合前駆体をフィブリノーゲン結合部分に変換し；フィブリノーゲン分子と該フィブリノーゲン結合部分とを接触させ、ここで、フィブリノーゲンの各分子は少なくとも２つのフィブリノーゲン結合部分に結合することでき、それにより、該フィブリノーゲン分子は共に、該フィブリノーゲン結合分子と該フィブリノーゲン分子との間の非共有結合の形成によって該担体を介して連結されるようになることを含むバイオゲルを形成させるための方法。
【請求項２７】
複数の担体とフィブリノーゲン分子およびトロンビンとを接触させることを含むバイオゲルを形成させるための方法であって、ここで、複数のフィブリノーゲン結合分子は、各担体に固定化され、各フィブリノーゲン分子は、少なくとも２つのフィブリノーゲン結合部分に結合して、フィブリンモノマーが共に、該フィブリノーゲン結合部分と該フィブリンモノマーとの間の非共有結合により該担体を介して連結されるバイオゲルを形成することができる方法。
【請求項２８】
複数の担体とフィブリノーゲン分子およびトロンビンとを接触させることを含むバイオゲルを形成させるための方法であって、ここで、複数のフィブリノーゲン結合部分は、各担体に固定化され、各フィブリノーゲン分子は、少なくとも２つのフィブリノーゲン結合部分に結合して、フィブリンのフィブリンモノマーが共に、該フィブリノーゲン結合部分と該フィブリンモノマーとの間の非共有結合により該担体を介して連結される該フィブリンを含むバイオゲルを形成することができ；該バイオゲルと第ＸＩＩＩａ因子とを接触させ、それにより、該フィブリンのフィブリンモノマーが共にペプチド結合により共有結合的に連結されるようになる方法。
【請求項２９】
バイオゲルの形成に用いるための粉末化薬物を形成させる方法であって、該薬物は、各担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分またはフィブリノーゲン結合前駆体を含み、ここで、該薬物の懸濁液を噴霧乾燥させることを含む方法。
【請求項３０】
前記バイオゲルが組織接着剤である、請求項２５〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
宿主フィブリノーゲンが存在する部位で出血を調節する方法であって、該部位に複数の担体を局所投与することを含み、ここで、各担体は、その担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分を有し、該部位の宿主フィブリノーゲン分子は、少なくとも２つのフィブリノーゲン結合部分に結合することができる方法。
【請求項３２】
宿主フィブリノーゲンおよび凝固因子が存在する部位で出血を調節する方法であって、該部位に複数の担体を局所投与することを含み、ここで、各担体は、その担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合前駆体を有し、該フィブリノーゲン結合前駆体は、宿主凝固因子によってフィブリノーゲン結合部分に変換されることができ、該部位の宿主フィブリノーゲン分子は、少なくとも２つのフィブリノーゲン結合部分に結合することができる方法。
【請求項３３】
請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のバイオゲルを出血部位に局所投与することを含む出血を調節する方法。
【請求項３４】
請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のバイオゲル、または複数の担体を創傷部位に局所投与することを含む創傷を処置または封止する方法であって、各担体は、その担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分またはフィブリノーゲン結合前駆体を有する方法。
【請求項３５】
可溶性担体を含む薬物を静脈内投与することを含む出血を調節する方法であって、各々がフィブリノーゲン結合部分に変換され得る複数のフィブリノーゲン結合前駆体は、各担体に固定化されている方法。
【請求項３６】
バイオゲルを形成させるための複数の担体の使用であって、各担体が、その担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分またはフィブリノーゲン結合前駆体を有する使用。
【請求項３７】
止血における、封止剤としての、局部的薬物送達のための、または組織工学のための請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
組織接着剤を形成させるための請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
止血における、封止剤としての、局部的薬物送達のための、または組織工学のための請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のバイオゲルの使用。
【請求項４０】
薬剤として用いるための、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のバイオゲル、または請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の薬物。
【請求項４１】
出血を調節するかまたは創傷を処置もしくは封止するための薬剤の製造における、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のバイオゲル、または請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の薬物の使用。
【請求項４２】
出血を調節するかまたは創傷を処置もしくは封止するためのバイオゲルの製造における複数の担体の使用であって、各担体は、その担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分またはフィブリノーゲン結合前駆体を有する使用。
【請求項１】
バイオゲルの形成のためのキットであって、複数の担体であって、各担体がその担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分を有する担体と、個別に、フィブリノーゲンであって、フィブリノーゲンの各分子が少なくとも２つのフィブリノーゲン結合部分に結合することができるフィブリノーゲンとを含む、キット。
【請求項２】
バイオゲルの形成のためのキットであって、複数の担体であって、各担体がその担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合前駆体を有し、各フィブリノーゲン前駆体がフィブリノーゲン結合部分に変換され得る複数の担体と、フィブリノーゲンであって、フィブリノーゲンの各分子が少なくとも２つのフィブリノーゲン結合部分に結合することができるフィブリノーゲンとを含む、キット。
【請求項３】
前記フィブリノーゲン結合前駆体が、創傷部位薬物によってフィブリノーゲン結合部分に変換され得る、請求項２に記載のキット。
【請求項４】
前記創傷部位薬物が凝固因子である、請求項３に記載のキット。
【請求項５】
前記フィブリノーゲン結合前駆体をフィブリノーゲン結合部分に変換しない凝固因子をさらに含む、請求項４に記載のキット。
【請求項６】
各フィブリノーゲン結合前駆体が前記凝固因子に連結される、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
前記フィブリノーゲン結合前駆体をフィブリノーゲン結合部分に変換するための変換剤をさらに含む、請求項２に記載のキット。
【請求項８】
前記変換剤が創傷部位薬物である、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
前記創傷部位薬物が凝固因子である、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
前記フィブリノーゲン結合前駆体をフィブリノーゲン結合部分に変換しない凝固因子をさらに含む、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
凝固因子をさらに含む、請求項１に記載のキット。
【請求項１２】
創傷治癒の促進剤または抗菌剤をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１３】
前記担体が可溶性担体である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１４】
前記担体が生体適合性ポリマーを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１５】
組織接着剤を形成するための請求項１〜１４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１６】
バイオゲルの形成のための薬物であって、該薬剤は可溶性担体を含み、複数のフィブリノーゲン結合部分または各々がフィブリノーゲン結合部分に変換され得る複数のフィブリノーゲン結合前駆体が、各担体に固定化される、薬物。
【請求項１７】
バイオゲルの形成のための薬物であって、各々の担体に固定化されている、複数のフィブリノーゲン結合部分または各々がフィブリノーゲン結合部分に変換され得る複数のフィブリノーゲン結合前駆体を有する不溶性担体を含み、凍結乾燥以外で形成された粉末の形態である薬物。
【請求項１８】
前記フィブリノーゲン結合前駆体が、創傷部位薬物によってフィブリノーゲン結合部分に変換され得る、請求項１６または１７に記載の薬物。
【請求項１９】
前記創傷部位薬物が凝固因子である、請求項１８に記載の薬物。
【請求項２０】
組織接着剤を形成させるための請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の薬物。
【請求項２１】
フィブリノーゲン分子及び複数の担体を含むバイオゲルであって、各担体は、該担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分を有し、フィブリノーゲンの各分子は、少なくとも２つのフィブリノーゲン結合部分に結合して、該フィブリノーゲン分子が共に、該フィブリノーゲン結合部分と該フィブリノーゲン分子との間の非共有結合によって該担体を介して連結されるようになるバイオゲル。
【請求項２２】
フィブリンモノマー及び複数の担体を含むバイオゲルであって、各担体は、該担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分を有し、該フィブリンモノマーは共に、該フィブリノーゲン結合部分と該フィブリンモノマーとの間の非共有結合によって該担体を介して連結されるバイオゲル。
【請求項２３】
フィブリン及び複数の担体を含むバイオゲルであって、各担体は、該担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分を有し、該フィブリンのフィブリンモノマーは共にペプチド結合によって共有結合的に連結され、該フィブリンのフィブリンモノマーは共に、該フィブリノーゲン結合部分と該フィブリンモノマーとの間で非共有結合によって該担体を介して連結されるバイオゲル。
【請求項２４】
組織接着剤である、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載のバイオゲル。
【請求項２５】
フィブリノーゲン分子と複数の担体とを接触させることを含むバイオゲルを形成させるための方法であって、各担体は、該担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分を有し、フィブリノーゲンの各分子は、少なくとも２つのフィブリノーゲン結合部分を結合することができ、それにより、該フィブリノーゲン分子は共に、該フィブリノーゲン結合分子と該フィブリノーゲン分子との間の非共有結合の形成によって該担体を介して連結されるようになる方法。
【請求項２６】
複数の担体を用意し、ここで、各担体は該担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合前駆体を含み；該フィブリノーゲン結合前駆体をフィブリノーゲン結合部分に変換し；フィブリノーゲン分子と該フィブリノーゲン結合部分とを接触させ、ここで、フィブリノーゲンの各分子は少なくとも２つのフィブリノーゲン結合部分に結合することでき、それにより、該フィブリノーゲン分子は共に、該フィブリノーゲン結合分子と該フィブリノーゲン分子との間の非共有結合の形成によって該担体を介して連結されるようになることを含むバイオゲルを形成させるための方法。
【請求項２７】
複数の担体とフィブリノーゲン分子およびトロンビンとを接触させることを含むバイオゲルを形成させるための方法であって、ここで、複数のフィブリノーゲン結合分子は、各担体に固定化され、各フィブリノーゲン分子は、少なくとも２つのフィブリノーゲン結合部分に結合して、フィブリンモノマーが共に、該フィブリノーゲン結合部分と該フィブリンモノマーとの間の非共有結合により該担体を介して連結されるバイオゲルを形成することができる方法。
【請求項２８】
複数の担体とフィブリノーゲン分子およびトロンビンとを接触させることを含むバイオゲルを形成させるための方法であって、ここで、複数のフィブリノーゲン結合部分は、各担体に固定化され、各フィブリノーゲン分子は、少なくとも２つのフィブリノーゲン結合部分に結合して、フィブリンのフィブリンモノマーが共に、該フィブリノーゲン結合部分と該フィブリンモノマーとの間の非共有結合により該担体を介して連結される該フィブリンを含むバイオゲルを形成することができ；該バイオゲルと第ＸＩＩＩａ因子とを接触させ、それにより、該フィブリンのフィブリンモノマーが共にペプチド結合により共有結合的に連結されるようになる方法。
【請求項２９】
バイオゲルの形成に用いるための粉末化薬物を形成させる方法であって、該薬物は、各担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分またはフィブリノーゲン結合前駆体を含み、ここで、該薬物の懸濁液を噴霧乾燥させることを含む方法。
【請求項３０】
前記バイオゲルが組織接着剤である、請求項２５〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
宿主フィブリノーゲンが存在する部位で出血を調節する方法であって、該部位に複数の担体を局所投与することを含み、ここで、各担体は、その担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分を有し、該部位の宿主フィブリノーゲン分子は、少なくとも２つのフィブリノーゲン結合部分に結合することができる方法。
【請求項３２】
宿主フィブリノーゲンおよび凝固因子が存在する部位で出血を調節する方法であって、該部位に複数の担体を局所投与することを含み、ここで、各担体は、その担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合前駆体を有し、該フィブリノーゲン結合前駆体は、宿主凝固因子によってフィブリノーゲン結合部分に変換されることができ、該部位の宿主フィブリノーゲン分子は、少なくとも２つのフィブリノーゲン結合部分に結合することができる方法。
【請求項３３】
請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のバイオゲルを出血部位に局所投与することを含む出血を調節する方法。
【請求項３４】
請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のバイオゲル、または複数の担体を創傷部位に局所投与することを含む創傷を処置または封止する方法であって、各担体は、その担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分またはフィブリノーゲン結合前駆体を有する方法。
【請求項３５】
可溶性担体を含む薬物を静脈内投与することを含む出血を調節する方法であって、各々がフィブリノーゲン結合部分に変換され得る複数のフィブリノーゲン結合前駆体は、各担体に固定化されている方法。
【請求項３６】
バイオゲルを形成させるための複数の担体の使用であって、各担体が、その担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分またはフィブリノーゲン結合前駆体を有する使用。
【請求項３７】
止血における、封止剤としての、局部的薬物送達のための、または組織工学のための請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
組織接着剤を形成させるための請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
止血における、封止剤としての、局部的薬物送達のための、または組織工学のための請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のバイオゲルの使用。
【請求項４０】
薬剤として用いるための、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のバイオゲル、または請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の薬物。
【請求項４１】
出血を調節するかまたは創傷を処置もしくは封止するための薬剤の製造における、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のバイオゲル、または請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の薬物の使用。
【請求項４２】
出血を調節するかまたは創傷を処置もしくは封止するためのバイオゲルの製造における複数の担体の使用であって、各担体は、その担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合部分またはフィブリノーゲン結合前駆体を有する使用。
【図２】
【図３】
【図４ａ）】
【図４ｂ）】
【図３】
【図４ａ）】
【図４ｂ）】
【公表番号】特表２０１０−５１０８１８（Ｐ２０１０−５１０８１８Ａ）
【公表日】平成２２年４月８日（２０１０．４．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３７７０３（Ｐ２００９−５３７７０３）
【出願日】平成１９年１１月２７日（２００７．１１．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００７／００４５３８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０６５３８８
【国際公開日】平成２０年６月５日（２００８．６．５）
【出願人】（５０６１１７１２７）ヘモスタティクス リミテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年４月８日（２０１０．４．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１１月２７日（２００７．１１．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００７／００４５３８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０６５３８８
【国際公開日】平成２０年６月５日（２００８．６．５）
【出願人】（５０６１１７１２７）ヘモスタティクス リミテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
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