バイオセンサシステム
【課題】 溶存酸素の影響を受けずに、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を補酵素とする脱水素酵素の基質を正確に定量することができ、安価に製造することができ、かつ携帯性に優れた、バイオセンサシステムを提供すること。
【解決手段】 本発明のバイオセンサは、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を補酵素とする脱水素酵素の基質を検出するバイオセンサシステムであって、光入射用の光ファイバ及び受光用の光ファイバを接続してなる光ファイバプローブ；前記光入射用の光ファイバに、特定の波長の紫外線を入射する紫外線発光ダイオード；及び前記紫外線発光ダイオードから入射した入射光により励起されて発生した蛍光を、前記受光用の光ファイバーを通して検出する検出器を含み、前記光ファイバプローブの先端に、前記脱水素酵素を固定化してなる膜が密着されていることを特徴とする。
【解決手段】 本発明のバイオセンサは、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を補酵素とする脱水素酵素の基質を検出するバイオセンサシステムであって、光入射用の光ファイバ及び受光用の光ファイバを接続してなる光ファイバプローブ；前記光入射用の光ファイバに、特定の波長の紫外線を入射する紫外線発光ダイオード；及び前記紫外線発光ダイオードから入射した入射光により励起されて発生した蛍光を、前記受光用の光ファイバーを通して検出する検出器を含み、前記光ファイバプローブの先端に、前記脱水素酵素を固定化してなる膜が密着されていることを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオセンサシステムに関し、更に詳細には、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を補酵素とする脱水素酵素の基質を検出するバイオセンサシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
アルコールは、人間にとって健康と深く関わり合いを有している他、過剰の摂取によると人間関係に影響を及ぼすなど、アルコールの乱用は、我々の社会に直面する重要な問題の１つである（例えば、非特許文献１〜６）。
健康面においては、例えば、先進国におけるアルコール性肝臓疾患は、全ての慢性肝臓疾患の５０％以上を占めていることが知られている。すなわち、アルコールの過剰摂取は健康を害することから、臨床面から、特に、血液、血清及び尿の解析において、エタノール濃度を正確に測定することが重要である。
【０００３】
また、アルコール飲料は発酵工程を経て製造されているが、発酵工程におけるアルコール飲料の品質を管理するために、工程中のエタノール濃度の測定は重要である。このように、経済的な観点からも、アルコール濃度を正確に測定することは特に重要である。
上述した観点から、エタノールを正確かつ簡便に測定する方法が求められている。
【０００４】
従来より、種々のアルコール定量法が報告されている。例えば、酵素をベースとして用いるバイオセンサーがアルコールセンサとして用いられている（例えば、非特許文献７及び８等）。アルコールオキシダーゼ固定化エタノールセンサは、アルコールを定量することにおける最も一般的な方法の１つである。このようなアルコールセンサは、クロマトグラフィー法、分光分析法や蒸留法と比べた場合、簡便に測定でき、かつ迅速に測定できるという利点がある。また、酵素を用いているため、選択性が高いという利点も有する。しかし、アルコールオキシダーゼを用いているため、センサ特性が、試料中の溶存酸素量に依存するという問題がある。
【０００５】
一方、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）依存アルコールデヒドロゲナーゼを用いたバイオセンサが報告されている（例えば、非特許文献９及び１０）。このようなバイオセンサは、主として光学的方法又は電気化学的方法によって測定されるＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋の比を用いて基質を測定している。また、このようなバイオセンサは、エタノール濃度の測定に用いられるのみならず、種々の基質の濃度を測定することに用いることが可能である。従来のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）依存アルコールデヒドロゲナーゼを用いたバイオセンサには、光源として水銀ランプが用いられている。しかし、水銀ランプは高価であるとともに、非常に重量があり、携帯用には不向きである。
【０００６】
【非特許文献１】G.Heiss, N.J.Johnson, S.Reiland, C.E.Davis, H.A.Tyroler, Circulation 62 (1980) 116
【非特許文献２】M.G. Marmot, Int. J. Epidemiol. 13 (1984) 160
【非特許文献３】S. Linn, M. Carroll, C.Johnson, R.fulwood, W. Kalsbeek, R.Briefel, Am. J. Public Health 83 (1993) 811
【非特許文献４】R.D.Moore, T.A.Pearson, Medicine 65 (1986) 242
【非特許文献５】D.S.Sscovick, N.S.Weiss, N.Fox, Am J. Epidemiol. 123 (1986) 499
【非特許文献６】A.S.Santos, A.C.Pereira, N.Duran, L.T.Kubota, Electrochim. Acta. 52 (2006) 215
【非特許文献７】G. Wen, Y. Zhang, S. Shuang, C. Dong, M.M.F. Choi, Biosens. Bioelectron. 23 (2007) 121
【非特許文献８】L.V. Shkotova, A.P. Soldatkin, M.V. Gomchar, W. Schuhman, S.V. Dzyadevych, Materials Science and Engineering C 26 (2006) 411
【非特許文献９】C. Schelp, Th. Sceper, F. Buckmann, K.F. Reardon, Anal. Chem. Acta 255 (1991) 223
【非特許文献１０】J. Manso, M.L. Mena, P.Y. Sedeno, J.M. Pingarron, Electrochem. Acta (2007), doi;10.1016/j.eleacta.2007.10.0003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の目的は、溶存酸素の影響を受けずに、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を補酵素とする脱水素酵素の基質を正確に定量することができ、安価に製造することができ、かつ携帯性に優れた、バイオセンサシステムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記目的を達成するため検討を重ねた結果、脱水素酵素を固定化してなる膜が密着された光ファイバプローブ、該光ファイバプローブに、紫外線を入射する紫外線発光ダイオード（ＵＶ−ＬＥＤ）、前記紫外線発光ダイオードから入射した入射光により励起された発生した蛍光を検出する検出器を用いることにより、上記目的を達成し得るという知見を得、その知見を素に営々検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明は、上記知見に基づいてなされたものであり、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を補酵素とする脱水素酵素の基質を検出するバイオセンサシステムであって、前記バイオセンサシステムは、光入射用の光ファイバ及び受光用の光ファイバを接続してなる光ファイバプローブ；前記光入射用の光ファイバに、特定の波長の紫外線を入射する紫外線発光ダイオード；及び前記紫外線発光ダイオードから入射した入射光により励起されて発生した蛍光を、前記受光用の光ファイバーを通して検出する検出器を含み、前記光ファイバプローブの先端に、前記脱水素酵素を固定化してなる膜が密着されていることを特徴とするバイオセンサシステムを提供するものである。
【００１０】
前記特定の波長は、好ましくは３００〜３７０ｎｍであり、前記蛍光の波長は、好ましくは４５０〜５１０ｎｍである。
前記脱水素酵素の具体例としてはアルコールデヒドロゲナーゼが挙げられ、前記基質としてはエタノールが挙げられる。
前記バイオセンサシステムは、前記光入射用の光ファイバと前記光ファイバプローブとの間に、帯域フィルタを有し、前記受光用の光ファイバと前記光ファイバプローブとの間に長波長透過フィルタを有することが好ましい。
また、前記バイオセンサシステムは、前記光入射用の光ファイバと前記光ファイバプローブとの間に、帯域フィルタを有し、前記受光用の光ファイバと前記光ファイバプローブとの間に帯域フィルタを有してもよい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、溶存酸素の影響を受けずに、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を補酵素とする脱水素酵素の基質の量を正確に定量することができる。本発明のバイオセンサシステムは、安価に製造することができ、かつ携帯性に優れたものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明のバイオセンサシステムは、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を補酵素とする脱水素酵素の基質を検出するバイオセンサシステムであって、
光入射用の光ファイバ及び受光用の光ファイバを接続してなる光ファイバプローブ；
前記光入射用の光ファイバに、特定の波長の紫外線を入射する紫外線発光ダイオード；及び
前記発光ダイオードから入射した入射光により励起されて発生した蛍光を、前記受光用の光ファイバーを通して検出する検出器を含み、
前記光ファイバプローブの先端に、前記脱水素酵素を固定化してなる膜が密着されている。
【００１３】
本発明のバイオセンサシステムは、ＮＡＤ＋（酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）又はＮＡＤＰ＋（酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）を補酵素とする脱水素酵素の基質を検出するためのシステムである。本発明のバイオセンサシステムにおいて用いられる脱水素酵素としては、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を補酵素とするものであれば、特に制限はないが、例えば、アラニン脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、イソクエン酸脱水素酵素、ウリジン−５’−ジホスフォ−グルコース脱水素酵素、ガラクトース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、グリセロール脱水素酵素、グリセロール−３−リン酸脱水素酵素、グルコース脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素、コレステロール脱水素酵素、サルコシン脱水素酵素、ソルビトール脱水素酵素、炭酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、ピルビン酸脱水素酵素、フルクトース脱水素酵素、６−ホスフォグルコン酸脱水素酵素、ホルムアルデヒド脱水素酵素、マンニトール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ロイシン脱水素酵素等が利用できる。また、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を補酵素とする脱水素酵素が関与する酵素反応は数多く存在し様々な分野における測定方法として有用であり、さらに酸化酵素に比べて脱水素酵素を利用することで、試料中の溶存酸素の影響を回避できるという利点もある。
すなわち、本発明のバイオシステムを用いて検出することのできる基質は、上記脱水素酵素の基質となる化合物である。例えば、脱水素酵素としてアルコールデヒドロゲナーゼを用いる場合、エタノールを検出、定量することができる。
【００１４】
脱水素酵素、基質と、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋との酵素反応により、基質濃度に依存したＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）又はＮＡＤＰＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）が生成する。本発明のバイオセンサシステムにおいては、そのＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの濃度を測定することにより基質の濃度を測定する。本発明においては、紫外線発光ダイオードから入射した紫外線により励起した蛍光を検出することにより、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの濃度を測定する。
【００１５】
次に、本発明のバイオセンサシステムについて図面を参照しつつ説明する。図１は、本発明のバイオセンサシステム１０を模式的に示す図面である。本発明のバイオセンサシステムは、光入射用の光ファイバ１１と、受光用の光ファイバ１１’とを接続してなる光ファイバプローブ１２を有する。このようなプローブ１２としては、市販されているものを用いてもよく、例えば、Ｏｃｅａｎ Ｏｐｔｉｃｓ Ｉｎｃ．（米国）から市販されている、２ ｉｎ １ Ｏｐｔｉｃａｌ ｆｉｂｅｒ ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＢＩＦ６００−ＵＶ／ＶＩＳ）とＦ１００−９００９（Ｏｃｅａｎ Ｏｐｔｉｃｓ Ｉｎｃ．社製）とを組み合わせたもの等を用いることができる。
【００１６】
光入射用の光ファイバ１１には、特定の波長の紫外線を入射する紫外線発光ダイオード１４が接続されている。また、図１に示すバイオセンサシステムにおいては、紫外線発光ダイオード１４と光ファイバプローブ１２との間には帯域フィルター（バンドパスフィルター）１６が接続されている。本発明のバイオセンサシステムにおいては、光源として紫外線発光ダイオード１４を用いているため、光源として水銀ランプを用いた場合よりも、装置を簡素化することができ、また、安価で製造でき、携帯用としても用いることが可能となる。
【００１７】
ＮＡＤ＋を補酵素とする脱水素酵素の場合について説明すると、ＮＡＤＨは３４０ｎｍの紫外線を吸収するが、ＮＡＤ＋は３４０ｎｍの紫外線を吸収しないという性質を利用するものであり、従って、紫外線発光ダイオードとしては、３００〜３７０ｎｍ、好ましくは３４０ｎｍ付近の波長の紫外線を励起するものが用いられる。従って、図１に示すように、紫外線発光ダイオード１４と光ファイバプローブ１２との間には帯域フィルター１６が接続することが好ましい。帯域フィルターとは、光源からの光のうち、特定の波長のものだけを透過するフィルターのことを意味し、本発明においては、例えば、３３０〜３５０ｎｍの紫外線を通過させるものが用いられる。このような帯域フィルターとしては市販のものを特に制限なく用いることができる。
【００１８】
図１に示すバイオセンサシステムにおいては、受光用の光ファイバ１１’には、紫外線発光ダイオード１４から入射した入射光により励起されて発生した蛍光を検出する検出器２０が接続されている。検出器２０は、具体的には分光光度計が用いられる。励起された蛍光は、ＮＡＤＨの場合、４５０〜５１０ｎｍ、より具体的には４９１ｎｍ付近であり、従って、図１に示すように、特定の波長よりも大きい波長の蛍光のみを透過させる長波長透過フィルター（ハイパスフィルター）１８を配置することが好ましい。図１においては、４００ｎｍ以上の波長の蛍光を透過させる長波長透過フィルターが用いられている。このような長波長透過フィルターとしては市販のものを特に制限なく用いることができる。
また、図１のバイオセンサシステムにおいては、長波長透過フィルター（ハイパスフィルター）１８を用いているが、長波長透過フィルター（ハイパスフィルター）に変え、帯域フィルターを用いてもよい。この場合、例えば、４５０〜５１０ｎｍの波長の蛍光のみを透過させる帯域フィルターを用いる。
【００１９】
図１に示すバイオセンサシステムにおいては、検出器２０で受信したデータを解析するためのコンピュータシステム２２が接続されており、このようなコンピュータシステム２２を接続させることにより、データの解析が容易である。
【００２０】
次に、図１に示すバイオセンサシステムにおいて用いられる光ファイバプローブ１２について説明する。光ファイバプローブ１２は、その先端に、脱水素酵素を固定化してなる膜が密着されている。
脱水素酵素を固定化してなる膜について説明する。本明細書において、以下、酵素固定化膜と記載する場合は、脱水素酵素を固定化してなる膜を意味する。
酵素固定化膜は、膜材料である担体上に脱水素酵素が固定化されたものである。用いられる担体としては、従来より酵素を固定化するために用いられている材料のものを特に制限なく用いることができる。このような材料としては、例えば、ポリテトラフルオロエチレン、ポリジメチルシロキサン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン等が挙げられる。このような担体の厚みは、特に限定されないが、好ましくは１００ｎｍ〜２００μｍであり、更に好ましくは１０μｍ〜１００μｍである。
【００２１】
本発明のバイオセンサシステムは、紫外線発光ダイオードから入射した励起光により励起されて発生した蛍光によりＮＡＤ＋又はＮＡＤ＋の濃度を定量し、それによりＮＡＤ＋又はＮＡＤ＋を補酵素とする脱水素酵素の基質を検出するものである。従って、試料中の基質と酵素固定化膜中の脱水素酵素とが、補酵素の存在下に反応する必要がある。本発明のバイオセンサシステムは、後述するように、補酵素であるＮＡＤ＋又はＮＡＤ＋の存在下に酵素と基質とを反応させるため、試料溶液中に補酵素であるＮＡＤ＋又はＮＡＤ＋を一緒に存在させ、この補酵素と基質とが酵素固定化膜中で酵素と反応する必要がある。従って、酵素固定化膜を構成する担体は多孔性であることが好ましい。担体の孔のサイズに特に制限はないが、通常は、直径が０．１〜１μｍ程度であり、好ましくは０．２μｍ程度でよい。また、担体の空隙率は６０〜９０％であることが好ましい。
【００２２】
前記酵素固定化膜は、脱水素酵素が担体に固定化されてなるものであるが、酵素を、例えばポリマーと混合して担体上に塗布し乾燥して製造される。このようなポリマーとしては、従来より酵素固定化膜を製造するために用いられているものを特に制限なく用いることができ、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール又はポリビニルアルコールにＳｂＱの光官能基を組み合わせたＰＶＡ−ＳｂＱ、ＳＰＰ−Ｈ１３、ホスホリルコリン基を含むポリマー等が挙げられる。
上記の中でも、ホスホリルコリン基を含むポリマーである、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）と他のモノマーとの共重合体を用いた場合、酵素を固定化した後の脱塩処理をする必要がないので好ましい。
また、脱水素酵素を担体に固定化する方法としては、他に、グルタルアルデヒドの架橋による方法を用いてもよいが、本発明においては、方法は特に限定されない。
【００２３】
このような共重合体を製造するために用いられるモノマーとしては、例えば、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、プロピル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、アミル（メタ）アクリレート、ヘキシル（メタ）アクリレート、ヘプチル（メタ）アクリレート、オクチル（メタ）アクリレート、ノニル（メタ）アクリレート、デシル（メタ）アクリレート、ドデシル（メタ）アクリレート、ヘキサデシル（メタ）アクリレート、オクタデシル（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、エチレングリコール（メタ）アクリレート、エチレングリコールメチルエーテル（メタ）アクリレート、ポリ（エチレングリコール）（メタ）アクリレート、ポリ（エチレングリコール）メチルエーテル（メタ）アクリレート、Ｎ−ビニルピロリドン、酢酸ビニル、γ−メタクリルオキシプロピルトリメトキシシラン、γ−メタクリルオキシプロピルトリエトキシシラン、ビニルトリス（２−メトキシエトキシ）シラン、メチルトリビニルメチルジエトキシシラン等が挙げられる。このような共重合体は、ＭＰＣと上記モノマーとのラジカル共重合によって得ることができる。
【００２４】
上記共重合体としては、例えば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）と２−エチルヘキシルメタクリレート（ＥＨＭＡ）との共重合体が挙げられ、該共重合体は、下記一般式（１）で表わされる繰り返し単位を有するポリマーである。
【００２５】
【化１】
【００２６】
一般式（１）において、aは０．１〜０．９であり、好ましくは０．１〜０．４である。また、ｂは０．１〜０．９であり、好ましくは０．６〜０．９である。
【００２７】
一般式（１）で表わされる繰り返し単位を有するポリマーを得るには、公知の方法により反応させて行う。使用する溶媒としては、モノマーを溶解することのできるものであれば制限なく用いることができ、例えば、水、メタノール、エタノール、プロパノール、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、クロロホルム、及びこれらの混合物などが挙げられる。
【００２８】
また、重合開始剤としては、通常に用いられるラジカル開始剤を特に制限なく用いることができ、例えば、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、アゾビスバレロニトリル等の脂肪族アゾ化合物や、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウロイル、加硫酸アンモニウム、加硫酸カリウム等の有機過酸化物等が挙げられる。
【００２９】
一般式（１）で表わされる繰り返し単位を有するポリマーの分子量は、通常、５，０００〜３，０００，０００程度である。
なお、一般式（１）で表わされる繰り返し単位を有するポリマーとしては、市販されているものを用いてもよく、例えば、日本油脂（株）製、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標）シリーズ等が使用可能である。
【００３０】
次に、上記酵素固定化膜の製造方法について図面を参照しつつ説明する。図２は、本発明のバイオセンサシステムにおいて用いられる、酵素固定化膜及び光ファイバプローブの製造方法を概略的に示す図である。
まず、担体３１に、ポリマー及び脱水素酵素の混合溶液３２を塗布する。ポリマーとしては上述したものが用いられ、脱水素酵素も上述したものが用いられる。ポリマー及び脱水素酵素を溶解して混合溶液とするための溶媒としては、例えば、エタノール等が挙げられる。混合溶液中の脱水素酵素及びポリマーの濃度に特に制限はないが、通常は、脱水素酵素を、担体１ｃｍ２あたり５０ユニット程度、ポリマーを、担体１ｃｍ２あたり１μＬ（濃度：１０重量％）程度用いることが好ましい。次いで、担体上に塗布した混合溶液３２を乾燥して酵素を担体３１に固定化し、酵素固定化膜３３を得る。乾燥は、通常、０〜８℃程度の温度で０．５〜６時間行なう。
【００３１】
次に、光ファイバプローブの先端への酵素固定化膜の密着について説明する。図２を参照して明らかなように、光ファイバプローブ１４の先端に、酵素固定化膜３３を密着させ、例えば、シリコンチューブリング３５により、酵素固定化膜３３を光ファイバプローブ１４の先端に固定する。
【００３２】
次に、本発明のバイオセンサシステムを用いて、脱水素酵素の基質となる化合物を検出する方法について図１を参照しつつ説明する。
本発明のバイオセンサシステム１０を用いて、脱水素酵素の基質となる化合物を検出するには、光ファイバプローブ１２を試料溶液に浸す。この試料溶液には、脱水素酵素の補酵素となるＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋が含まれている。
【００３３】
光ファイバプローブ１２の先端には、上述した、酵素固定化膜（脱水素酵素を固定化してなる膜）が密着しており、試料溶液中の基質が、補酵素であるＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋と共に、酵素固定化膜中に浸入し、酵素固定化膜に固定化されている脱水素酵素と基質とが反応し、補酵素であるＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋は、それぞれＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨに変化する。このようにして生成されたＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを蛍光により検出する。補酵素としてＮＡＤ＋を用いる脱水素酵素の場合について説明すると、紫外線発光ダイオード１４から照射される、中心波長３３５ｎｍの紫外線を、帯域フィルター１６を通過させ、波長３３０〜３５０ｎｍの紫外線のみを通過させ、励起した蛍光を長波長透過フィルター１８を通過させ、４００ｎｍ以上の波長の蛍光のみを通過させたのち、検出器（分光高度計）２０により、波長４９１ｎｍの蛍光強度を測定する。検出器２０により測定したデータは、コンピュータ２２によって解析される。
【００３４】
本発明のバイオセンサシステムによって、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を補酵素とする脱水素酵素の基質となる化合物を検出（定量）するには、最初にＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋の標準液を用いて蛍光強度を測定し、検量線を作成した後に試料の測定を実施し、既知量のＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を含む試料について蛍光を測定し、消費されたＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋の量から、試料中に含まれている脱水素酵素の基質となる化合物の量を求める。
【００３５】
本発明のバイオセンサシステムは、光源として紫外線発光ダイオードを用いており、従来用いられている水銀ランプよりも安価に製造することができる。また、紫外線発光ダイオードは水銀ランプよりも重量が小さいため、携帯用として用いることも可能である。本発明のバイオセンサシステムは、例えば、微小化学物質分析システム（μＴＡＳ）に用いることができる。
【実施例】
【００３６】
以下に、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、これらにより本発明は何ら制限を受けるものではない。
実施例１
以下の装置等を用いて、図１に示すバイオセンサシステムを作製した。
紫外線発光ダイオード：ＵＶＴＯＰ ＢＬ３３５（Ｓｅｎｓｏｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．社製）
光ファイバ（光ファイバアセンブリ）：ＢＦ６００−ＵＶ／ＶＩＳ（Ｏｃｅａｎ Ｏｐｔｉｃｓ Ｉｎｃ．社製）
光ファイバープローブ：Ｆ１００−９００９（Ｏｃｅａｎ Ｏｐｔｉｃｓ Ｉｎｃ．社製）
帯域フィルター：（バンドパス波長：３３０〜３５０ｎｍ、朝日分光（株）製）
長波長透過フィルター：（カットオフ波長：４００ｎｍ、朝日分光（株）製）
光ファイバー分光計：ＵＳＢ２０００及びＵＳＢ４０００（Ｏｃｅａｎ Ｏｐｔｉｃｓ Ｉｎｃ．社製）
なお、ＵＳＢ２０００は、図１に示す検出器であり、ＵＳＢ４０００は、紫外線発光ダイオードに接続されている。
【００３７】
光ファイバプローブの先端には、１×１ｃｍに切断したポリテトラフルオロエチレン（空隙率８０％、孔のサイズ０．２μｍ、ＪＧＷＰ１４２２５、ミリポア）をシリコーン−Ｏ−リングを用いてしっかりと密着させた。リン酸バッファー中に、上記光ファイバプローブを浸し、２分毎に、それぞれ、１、２、５、１０、４０、１００、３００、５００、１０００、２０００、５０００マイクロモル／Ｌ）となるように、ＮＡＤＨ溶液を滴下し、蛍光強度をモニターした。
蛍光強度の測定結果のグラフを図３に示す。図３において、横軸は時間（分）を表わし、縦軸は蛍光強度を表す。図３から明らかなように、ＮＡＤＨの濃度が上昇すると、それに伴い蛍光強度が上昇することがわかる。この結果より、上記光ファイバプローブを備えたバイオセンサシステムを用いることにより、ＮＡＤＨの検出及び定量が可能であることが明らかとなった。
【００３８】
次に、上述のようにして得られた蛍光強度と、ＮＡＤＨの濃度との関係を調べ、検量線を作製した。図４は、ＮＡＤＨの濃度と蛍光強度との関係を示す検量線であり、横軸はＮＡＤＨの濃度（マイクロモル／Ｌ）の対数を表し、縦軸は蛍光強度を表す、図４から明らかなように、上記光ファイバプローブを備えたバイオセンサシステムを用いてＮＡＤＨの濃度を測定し、検量線を作成した結果、ＮＡＤＨの濃度が１〜３００マイクロモル／Ｌの範囲で直線を示すことがわかった。すなわち、ＮＡＤＨ濃度が上記範囲である場合、上述したバイオセンサによりＮＡＤＨの定量が可能であることがわかった。
なお、図４に示す検量線は以下の式によって表され、相関係数は０．９９３であった。
蛍光強度（カウント） ＝ １．９７×〔ＮＡＤＨ（マイクロモル／Ｌ）〕０．８９
【００３９】
実施例２
以下の操作により、酵素固定化膜を作製した。
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）と２−エチルヘキシルメタクリレートの共重合体（ＥＨＭＡ）及びアルコールデヒドロゲナーゼの混合溶液（溶媒：エタノール）を、それぞれ１マイクロリットル／ｃｍ２、及び５０単位／ｃｍ２となるように、実施例１で用いたポリテトラフルオロエチレン膜上に塗布し、冷蔵庫（約４℃）内に３時間静置し、上記混合溶液を硬化させた。次いで、不必要なアルコールデヒドロゲナーゼをリン酸バッファーで洗浄し、脱水素酵素が固定化された膜を得た。
得られた膜を、図１に示すバイオセンサシステムにおける光ファイバプローブの先端にシリコーン−Ｏ−リングを用いてしっかりと密着させ、本発明のバイオセンサシステムとした。
【００４０】
次いで、ＮＡＤ＋を含む（２０ミリｍｏｌ／リットル濃度）リン酸バッファーに、上記光ファイバプローブを浸し、２分毎に、それぞれ、０．１、１、５、１０、５０、１００、５００、１０００ミリモル／Ｌ）となるように、エタノールを滴下し、蛍光強度をモニターした。
蛍光強度の測定結果のグラフを図５に示す。図５において、横軸は時間（分）を表わし、縦軸は蛍光強度を表す。図３から明らかなように、エタノールの濃度が上昇すると、それに伴い蛍光強度が上昇することがわかる。この結果より、上記光ファイバプローブを備えた、本発明のバイオセンサシステムを用いることにより、エタノールの検出及び定量が可能であることが明らかとなった。
【００４１】
次に、上述のようにして得られた蛍光強度と、エタノールの濃度との関係を調べ、検量線を作製した。図６は、エタノールの濃度と蛍光強度との関係を示す検量線であり、横軸はエタノールの濃度（ミリモル／Ｌ）の対数を表し、縦軸は蛍光強度を表す、図６から明らかなように、本発明のバイオセンサシステムを用いてエタノールの濃度を測定し、検量線を作成した結果、エタノールの濃度が１〜１００ミリモル／Ｌの範囲で直線を示すことがわかった。すなわち、エタノール濃度が上記範囲である場合、本発明のバイオセンサによりエタノールの定量が可能であることがわかった。
なお、図６に示す検量線は以下の式によって表され、相関係数は０．９９４であった。
蛍光強度（カウント） ＝ １．５４×〔エタノール（ミリモル／Ｌ）〕０．５２
【００４２】
実施例２で作製されたバイオセンサシステムは、光源として紫外線発光バイオードを用いているため、従来の水銀ランプを用いたセンサと比べ、重量が軽いものであるため、携帯用としても適している。また、実施例２のバイオセンサシステムを用いてエタノールの定量を行う場合、全電力消費は１５０ｍＷ程度であり、従来の水銀ランプを用いる場合の約１％であった。また、本発明のバイオセンサシステムは軽量であるため、例えば、微小化学物質分析システム（μＴＡＳ）に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】本発明のバイオセンサシステムを模式的に示す図面である。
【図２】本発明のバイオセンサシステムにおいて用いられる、酵素固定化膜及び光ファイバプローブの製造方法を概略的に示す図である。
【図３】蛍光強度の測定結果を示すグラフである。
【図４】ＮＡＤＨの濃度と蛍光強度との関係を示す検量線である。
【図５】蛍光強度の測定結果を示すグラフである。
【図６】エタノールの濃度と蛍光強度との関係を示す検量線である。
【符号の説明】
【００４４】
１０ バイオセンサシステム １１ 光入射用の光ファイバ
１１’ 受光用の光ファイバ１１’ １２ 光ファイバプローブ
１４ 紫外線発光ダイオード
１６ バンドパスフィルター（帯域フィルター）
１８ 長波長透過フィルター（ハイパスフィルター）
２０ 検出器 ２２ コンピュータシステム
３１ 担体
３２ ポリマー及び脱水素酵素の混合溶液 ３３ 酵素固定化膜
３４ 光ファイバプローブ ３５ シリコンチューブリング
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオセンサシステムに関し、更に詳細には、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を補酵素とする脱水素酵素の基質を検出するバイオセンサシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
アルコールは、人間にとって健康と深く関わり合いを有している他、過剰の摂取によると人間関係に影響を及ぼすなど、アルコールの乱用は、我々の社会に直面する重要な問題の１つである（例えば、非特許文献１〜６）。
健康面においては、例えば、先進国におけるアルコール性肝臓疾患は、全ての慢性肝臓疾患の５０％以上を占めていることが知られている。すなわち、アルコールの過剰摂取は健康を害することから、臨床面から、特に、血液、血清及び尿の解析において、エタノール濃度を正確に測定することが重要である。
【０００３】
また、アルコール飲料は発酵工程を経て製造されているが、発酵工程におけるアルコール飲料の品質を管理するために、工程中のエタノール濃度の測定は重要である。このように、経済的な観点からも、アルコール濃度を正確に測定することは特に重要である。
上述した観点から、エタノールを正確かつ簡便に測定する方法が求められている。
【０００４】
従来より、種々のアルコール定量法が報告されている。例えば、酵素をベースとして用いるバイオセンサーがアルコールセンサとして用いられている（例えば、非特許文献７及び８等）。アルコールオキシダーゼ固定化エタノールセンサは、アルコールを定量することにおける最も一般的な方法の１つである。このようなアルコールセンサは、クロマトグラフィー法、分光分析法や蒸留法と比べた場合、簡便に測定でき、かつ迅速に測定できるという利点がある。また、酵素を用いているため、選択性が高いという利点も有する。しかし、アルコールオキシダーゼを用いているため、センサ特性が、試料中の溶存酸素量に依存するという問題がある。
【０００５】
一方、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）依存アルコールデヒドロゲナーゼを用いたバイオセンサが報告されている（例えば、非特許文献９及び１０）。このようなバイオセンサは、主として光学的方法又は電気化学的方法によって測定されるＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋の比を用いて基質を測定している。また、このようなバイオセンサは、エタノール濃度の測定に用いられるのみならず、種々の基質の濃度を測定することに用いることが可能である。従来のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）依存アルコールデヒドロゲナーゼを用いたバイオセンサには、光源として水銀ランプが用いられている。しかし、水銀ランプは高価であるとともに、非常に重量があり、携帯用には不向きである。
【０００６】
【非特許文献１】G.Heiss, N.J.Johnson, S.Reiland, C.E.Davis, H.A.Tyroler, Circulation 62 (1980) 116
【非特許文献２】M.G. Marmot, Int. J. Epidemiol. 13 (1984) 160
【非特許文献３】S. Linn, M. Carroll, C.Johnson, R.fulwood, W. Kalsbeek, R.Briefel, Am. J. Public Health 83 (1993) 811
【非特許文献４】R.D.Moore, T.A.Pearson, Medicine 65 (1986) 242
【非特許文献５】D.S.Sscovick, N.S.Weiss, N.Fox, Am J. Epidemiol. 123 (1986) 499
【非特許文献６】A.S.Santos, A.C.Pereira, N.Duran, L.T.Kubota, Electrochim. Acta. 52 (2006) 215
【非特許文献７】G. Wen, Y. Zhang, S. Shuang, C. Dong, M.M.F. Choi, Biosens. Bioelectron. 23 (2007) 121
【非特許文献８】L.V. Shkotova, A.P. Soldatkin, M.V. Gomchar, W. Schuhman, S.V. Dzyadevych, Materials Science and Engineering C 26 (2006) 411
【非特許文献９】C. Schelp, Th. Sceper, F. Buckmann, K.F. Reardon, Anal. Chem. Acta 255 (1991) 223
【非特許文献１０】J. Manso, M.L. Mena, P.Y. Sedeno, J.M. Pingarron, Electrochem. Acta (2007), doi;10.1016/j.eleacta.2007.10.0003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の目的は、溶存酸素の影響を受けずに、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を補酵素とする脱水素酵素の基質を正確に定量することができ、安価に製造することができ、かつ携帯性に優れた、バイオセンサシステムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記目的を達成するため検討を重ねた結果、脱水素酵素を固定化してなる膜が密着された光ファイバプローブ、該光ファイバプローブに、紫外線を入射する紫外線発光ダイオード（ＵＶ−ＬＥＤ）、前記紫外線発光ダイオードから入射した入射光により励起された発生した蛍光を検出する検出器を用いることにより、上記目的を達成し得るという知見を得、その知見を素に営々検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明は、上記知見に基づいてなされたものであり、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を補酵素とする脱水素酵素の基質を検出するバイオセンサシステムであって、前記バイオセンサシステムは、光入射用の光ファイバ及び受光用の光ファイバを接続してなる光ファイバプローブ；前記光入射用の光ファイバに、特定の波長の紫外線を入射する紫外線発光ダイオード；及び前記紫外線発光ダイオードから入射した入射光により励起されて発生した蛍光を、前記受光用の光ファイバーを通して検出する検出器を含み、前記光ファイバプローブの先端に、前記脱水素酵素を固定化してなる膜が密着されていることを特徴とするバイオセンサシステムを提供するものである。
【００１０】
前記特定の波長は、好ましくは３００〜３７０ｎｍであり、前記蛍光の波長は、好ましくは４５０〜５１０ｎｍである。
前記脱水素酵素の具体例としてはアルコールデヒドロゲナーゼが挙げられ、前記基質としてはエタノールが挙げられる。
前記バイオセンサシステムは、前記光入射用の光ファイバと前記光ファイバプローブとの間に、帯域フィルタを有し、前記受光用の光ファイバと前記光ファイバプローブとの間に長波長透過フィルタを有することが好ましい。
また、前記バイオセンサシステムは、前記光入射用の光ファイバと前記光ファイバプローブとの間に、帯域フィルタを有し、前記受光用の光ファイバと前記光ファイバプローブとの間に帯域フィルタを有してもよい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、溶存酸素の影響を受けずに、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を補酵素とする脱水素酵素の基質の量を正確に定量することができる。本発明のバイオセンサシステムは、安価に製造することができ、かつ携帯性に優れたものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明のバイオセンサシステムは、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を補酵素とする脱水素酵素の基質を検出するバイオセンサシステムであって、
光入射用の光ファイバ及び受光用の光ファイバを接続してなる光ファイバプローブ；
前記光入射用の光ファイバに、特定の波長の紫外線を入射する紫外線発光ダイオード；及び
前記発光ダイオードから入射した入射光により励起されて発生した蛍光を、前記受光用の光ファイバーを通して検出する検出器を含み、
前記光ファイバプローブの先端に、前記脱水素酵素を固定化してなる膜が密着されている。
【００１３】
本発明のバイオセンサシステムは、ＮＡＤ＋（酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）又はＮＡＤＰ＋（酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）を補酵素とする脱水素酵素の基質を検出するためのシステムである。本発明のバイオセンサシステムにおいて用いられる脱水素酵素としては、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を補酵素とするものであれば、特に制限はないが、例えば、アラニン脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、イソクエン酸脱水素酵素、ウリジン−５’−ジホスフォ−グルコース脱水素酵素、ガラクトース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、グリセロール脱水素酵素、グリセロール−３−リン酸脱水素酵素、グルコース脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素、コレステロール脱水素酵素、サルコシン脱水素酵素、ソルビトール脱水素酵素、炭酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、ピルビン酸脱水素酵素、フルクトース脱水素酵素、６−ホスフォグルコン酸脱水素酵素、ホルムアルデヒド脱水素酵素、マンニトール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ロイシン脱水素酵素等が利用できる。また、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を補酵素とする脱水素酵素が関与する酵素反応は数多く存在し様々な分野における測定方法として有用であり、さらに酸化酵素に比べて脱水素酵素を利用することで、試料中の溶存酸素の影響を回避できるという利点もある。
すなわち、本発明のバイオシステムを用いて検出することのできる基質は、上記脱水素酵素の基質となる化合物である。例えば、脱水素酵素としてアルコールデヒドロゲナーゼを用いる場合、エタノールを検出、定量することができる。
【００１４】
脱水素酵素、基質と、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋との酵素反応により、基質濃度に依存したＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）又はＮＡＤＰＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）が生成する。本発明のバイオセンサシステムにおいては、そのＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの濃度を測定することにより基質の濃度を測定する。本発明においては、紫外線発光ダイオードから入射した紫外線により励起した蛍光を検出することにより、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの濃度を測定する。
【００１５】
次に、本発明のバイオセンサシステムについて図面を参照しつつ説明する。図１は、本発明のバイオセンサシステム１０を模式的に示す図面である。本発明のバイオセンサシステムは、光入射用の光ファイバ１１と、受光用の光ファイバ１１’とを接続してなる光ファイバプローブ１２を有する。このようなプローブ１２としては、市販されているものを用いてもよく、例えば、Ｏｃｅａｎ Ｏｐｔｉｃｓ Ｉｎｃ．（米国）から市販されている、２ ｉｎ １ Ｏｐｔｉｃａｌ ｆｉｂｅｒ ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＢＩＦ６００−ＵＶ／ＶＩＳ）とＦ１００−９００９（Ｏｃｅａｎ Ｏｐｔｉｃｓ Ｉｎｃ．社製）とを組み合わせたもの等を用いることができる。
【００１６】
光入射用の光ファイバ１１には、特定の波長の紫外線を入射する紫外線発光ダイオード１４が接続されている。また、図１に示すバイオセンサシステムにおいては、紫外線発光ダイオード１４と光ファイバプローブ１２との間には帯域フィルター（バンドパスフィルター）１６が接続されている。本発明のバイオセンサシステムにおいては、光源として紫外線発光ダイオード１４を用いているため、光源として水銀ランプを用いた場合よりも、装置を簡素化することができ、また、安価で製造でき、携帯用としても用いることが可能となる。
【００１７】
ＮＡＤ＋を補酵素とする脱水素酵素の場合について説明すると、ＮＡＤＨは３４０ｎｍの紫外線を吸収するが、ＮＡＤ＋は３４０ｎｍの紫外線を吸収しないという性質を利用するものであり、従って、紫外線発光ダイオードとしては、３００〜３７０ｎｍ、好ましくは３４０ｎｍ付近の波長の紫外線を励起するものが用いられる。従って、図１に示すように、紫外線発光ダイオード１４と光ファイバプローブ１２との間には帯域フィルター１６が接続することが好ましい。帯域フィルターとは、光源からの光のうち、特定の波長のものだけを透過するフィルターのことを意味し、本発明においては、例えば、３３０〜３５０ｎｍの紫外線を通過させるものが用いられる。このような帯域フィルターとしては市販のものを特に制限なく用いることができる。
【００１８】
図１に示すバイオセンサシステムにおいては、受光用の光ファイバ１１’には、紫外線発光ダイオード１４から入射した入射光により励起されて発生した蛍光を検出する検出器２０が接続されている。検出器２０は、具体的には分光光度計が用いられる。励起された蛍光は、ＮＡＤＨの場合、４５０〜５１０ｎｍ、より具体的には４９１ｎｍ付近であり、従って、図１に示すように、特定の波長よりも大きい波長の蛍光のみを透過させる長波長透過フィルター（ハイパスフィルター）１８を配置することが好ましい。図１においては、４００ｎｍ以上の波長の蛍光を透過させる長波長透過フィルターが用いられている。このような長波長透過フィルターとしては市販のものを特に制限なく用いることができる。
また、図１のバイオセンサシステムにおいては、長波長透過フィルター（ハイパスフィルター）１８を用いているが、長波長透過フィルター（ハイパスフィルター）に変え、帯域フィルターを用いてもよい。この場合、例えば、４５０〜５１０ｎｍの波長の蛍光のみを透過させる帯域フィルターを用いる。
【００１９】
図１に示すバイオセンサシステムにおいては、検出器２０で受信したデータを解析するためのコンピュータシステム２２が接続されており、このようなコンピュータシステム２２を接続させることにより、データの解析が容易である。
【００２０】
次に、図１に示すバイオセンサシステムにおいて用いられる光ファイバプローブ１２について説明する。光ファイバプローブ１２は、その先端に、脱水素酵素を固定化してなる膜が密着されている。
脱水素酵素を固定化してなる膜について説明する。本明細書において、以下、酵素固定化膜と記載する場合は、脱水素酵素を固定化してなる膜を意味する。
酵素固定化膜は、膜材料である担体上に脱水素酵素が固定化されたものである。用いられる担体としては、従来より酵素を固定化するために用いられている材料のものを特に制限なく用いることができる。このような材料としては、例えば、ポリテトラフルオロエチレン、ポリジメチルシロキサン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン等が挙げられる。このような担体の厚みは、特に限定されないが、好ましくは１００ｎｍ〜２００μｍであり、更に好ましくは１０μｍ〜１００μｍである。
【００２１】
本発明のバイオセンサシステムは、紫外線発光ダイオードから入射した励起光により励起されて発生した蛍光によりＮＡＤ＋又はＮＡＤ＋の濃度を定量し、それによりＮＡＤ＋又はＮＡＤ＋を補酵素とする脱水素酵素の基質を検出するものである。従って、試料中の基質と酵素固定化膜中の脱水素酵素とが、補酵素の存在下に反応する必要がある。本発明のバイオセンサシステムは、後述するように、補酵素であるＮＡＤ＋又はＮＡＤ＋の存在下に酵素と基質とを反応させるため、試料溶液中に補酵素であるＮＡＤ＋又はＮＡＤ＋を一緒に存在させ、この補酵素と基質とが酵素固定化膜中で酵素と反応する必要がある。従って、酵素固定化膜を構成する担体は多孔性であることが好ましい。担体の孔のサイズに特に制限はないが、通常は、直径が０．１〜１μｍ程度であり、好ましくは０．２μｍ程度でよい。また、担体の空隙率は６０〜９０％であることが好ましい。
【００２２】
前記酵素固定化膜は、脱水素酵素が担体に固定化されてなるものであるが、酵素を、例えばポリマーと混合して担体上に塗布し乾燥して製造される。このようなポリマーとしては、従来より酵素固定化膜を製造するために用いられているものを特に制限なく用いることができ、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール又はポリビニルアルコールにＳｂＱの光官能基を組み合わせたＰＶＡ−ＳｂＱ、ＳＰＰ−Ｈ１３、ホスホリルコリン基を含むポリマー等が挙げられる。
上記の中でも、ホスホリルコリン基を含むポリマーである、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）と他のモノマーとの共重合体を用いた場合、酵素を固定化した後の脱塩処理をする必要がないので好ましい。
また、脱水素酵素を担体に固定化する方法としては、他に、グルタルアルデヒドの架橋による方法を用いてもよいが、本発明においては、方法は特に限定されない。
【００２３】
このような共重合体を製造するために用いられるモノマーとしては、例えば、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、プロピル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、アミル（メタ）アクリレート、ヘキシル（メタ）アクリレート、ヘプチル（メタ）アクリレート、オクチル（メタ）アクリレート、ノニル（メタ）アクリレート、デシル（メタ）アクリレート、ドデシル（メタ）アクリレート、ヘキサデシル（メタ）アクリレート、オクタデシル（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、エチレングリコール（メタ）アクリレート、エチレングリコールメチルエーテル（メタ）アクリレート、ポリ（エチレングリコール）（メタ）アクリレート、ポリ（エチレングリコール）メチルエーテル（メタ）アクリレート、Ｎ−ビニルピロリドン、酢酸ビニル、γ−メタクリルオキシプロピルトリメトキシシラン、γ−メタクリルオキシプロピルトリエトキシシラン、ビニルトリス（２−メトキシエトキシ）シラン、メチルトリビニルメチルジエトキシシラン等が挙げられる。このような共重合体は、ＭＰＣと上記モノマーとのラジカル共重合によって得ることができる。
【００２４】
上記共重合体としては、例えば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）と２−エチルヘキシルメタクリレート（ＥＨＭＡ）との共重合体が挙げられ、該共重合体は、下記一般式（１）で表わされる繰り返し単位を有するポリマーである。
【００２５】
【化１】
【００２６】
一般式（１）において、aは０．１〜０．９であり、好ましくは０．１〜０．４である。また、ｂは０．１〜０．９であり、好ましくは０．６〜０．９である。
【００２７】
一般式（１）で表わされる繰り返し単位を有するポリマーを得るには、公知の方法により反応させて行う。使用する溶媒としては、モノマーを溶解することのできるものであれば制限なく用いることができ、例えば、水、メタノール、エタノール、プロパノール、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、クロロホルム、及びこれらの混合物などが挙げられる。
【００２８】
また、重合開始剤としては、通常に用いられるラジカル開始剤を特に制限なく用いることができ、例えば、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、アゾビスバレロニトリル等の脂肪族アゾ化合物や、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウロイル、加硫酸アンモニウム、加硫酸カリウム等の有機過酸化物等が挙げられる。
【００２９】
一般式（１）で表わされる繰り返し単位を有するポリマーの分子量は、通常、５，０００〜３，０００，０００程度である。
なお、一般式（１）で表わされる繰り返し単位を有するポリマーとしては、市販されているものを用いてもよく、例えば、日本油脂（株）製、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標）シリーズ等が使用可能である。
【００３０】
次に、上記酵素固定化膜の製造方法について図面を参照しつつ説明する。図２は、本発明のバイオセンサシステムにおいて用いられる、酵素固定化膜及び光ファイバプローブの製造方法を概略的に示す図である。
まず、担体３１に、ポリマー及び脱水素酵素の混合溶液３２を塗布する。ポリマーとしては上述したものが用いられ、脱水素酵素も上述したものが用いられる。ポリマー及び脱水素酵素を溶解して混合溶液とするための溶媒としては、例えば、エタノール等が挙げられる。混合溶液中の脱水素酵素及びポリマーの濃度に特に制限はないが、通常は、脱水素酵素を、担体１ｃｍ２あたり５０ユニット程度、ポリマーを、担体１ｃｍ２あたり１μＬ（濃度：１０重量％）程度用いることが好ましい。次いで、担体上に塗布した混合溶液３２を乾燥して酵素を担体３１に固定化し、酵素固定化膜３３を得る。乾燥は、通常、０〜８℃程度の温度で０．５〜６時間行なう。
【００３１】
次に、光ファイバプローブの先端への酵素固定化膜の密着について説明する。図２を参照して明らかなように、光ファイバプローブ１４の先端に、酵素固定化膜３３を密着させ、例えば、シリコンチューブリング３５により、酵素固定化膜３３を光ファイバプローブ１４の先端に固定する。
【００３２】
次に、本発明のバイオセンサシステムを用いて、脱水素酵素の基質となる化合物を検出する方法について図１を参照しつつ説明する。
本発明のバイオセンサシステム１０を用いて、脱水素酵素の基質となる化合物を検出するには、光ファイバプローブ１２を試料溶液に浸す。この試料溶液には、脱水素酵素の補酵素となるＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋が含まれている。
【００３３】
光ファイバプローブ１２の先端には、上述した、酵素固定化膜（脱水素酵素を固定化してなる膜）が密着しており、試料溶液中の基質が、補酵素であるＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋と共に、酵素固定化膜中に浸入し、酵素固定化膜に固定化されている脱水素酵素と基質とが反応し、補酵素であるＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋は、それぞれＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨに変化する。このようにして生成されたＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを蛍光により検出する。補酵素としてＮＡＤ＋を用いる脱水素酵素の場合について説明すると、紫外線発光ダイオード１４から照射される、中心波長３３５ｎｍの紫外線を、帯域フィルター１６を通過させ、波長３３０〜３５０ｎｍの紫外線のみを通過させ、励起した蛍光を長波長透過フィルター１８を通過させ、４００ｎｍ以上の波長の蛍光のみを通過させたのち、検出器（分光高度計）２０により、波長４９１ｎｍの蛍光強度を測定する。検出器２０により測定したデータは、コンピュータ２２によって解析される。
【００３４】
本発明のバイオセンサシステムによって、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を補酵素とする脱水素酵素の基質となる化合物を検出（定量）するには、最初にＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋の標準液を用いて蛍光強度を測定し、検量線を作成した後に試料の測定を実施し、既知量のＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を含む試料について蛍光を測定し、消費されたＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋の量から、試料中に含まれている脱水素酵素の基質となる化合物の量を求める。
【００３５】
本発明のバイオセンサシステムは、光源として紫外線発光ダイオードを用いており、従来用いられている水銀ランプよりも安価に製造することができる。また、紫外線発光ダイオードは水銀ランプよりも重量が小さいため、携帯用として用いることも可能である。本発明のバイオセンサシステムは、例えば、微小化学物質分析システム（μＴＡＳ）に用いることができる。
【実施例】
【００３６】
以下に、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、これらにより本発明は何ら制限を受けるものではない。
実施例１
以下の装置等を用いて、図１に示すバイオセンサシステムを作製した。
紫外線発光ダイオード：ＵＶＴＯＰ ＢＬ３３５（Ｓｅｎｓｏｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．社製）
光ファイバ（光ファイバアセンブリ）：ＢＦ６００−ＵＶ／ＶＩＳ（Ｏｃｅａｎ Ｏｐｔｉｃｓ Ｉｎｃ．社製）
光ファイバープローブ：Ｆ１００−９００９（Ｏｃｅａｎ Ｏｐｔｉｃｓ Ｉｎｃ．社製）
帯域フィルター：（バンドパス波長：３３０〜３５０ｎｍ、朝日分光（株）製）
長波長透過フィルター：（カットオフ波長：４００ｎｍ、朝日分光（株）製）
光ファイバー分光計：ＵＳＢ２０００及びＵＳＢ４０００（Ｏｃｅａｎ Ｏｐｔｉｃｓ Ｉｎｃ．社製）
なお、ＵＳＢ２０００は、図１に示す検出器であり、ＵＳＢ４０００は、紫外線発光ダイオードに接続されている。
【００３７】
光ファイバプローブの先端には、１×１ｃｍに切断したポリテトラフルオロエチレン（空隙率８０％、孔のサイズ０．２μｍ、ＪＧＷＰ１４２２５、ミリポア）をシリコーン−Ｏ−リングを用いてしっかりと密着させた。リン酸バッファー中に、上記光ファイバプローブを浸し、２分毎に、それぞれ、１、２、５、１０、４０、１００、３００、５００、１０００、２０００、５０００マイクロモル／Ｌ）となるように、ＮＡＤＨ溶液を滴下し、蛍光強度をモニターした。
蛍光強度の測定結果のグラフを図３に示す。図３において、横軸は時間（分）を表わし、縦軸は蛍光強度を表す。図３から明らかなように、ＮＡＤＨの濃度が上昇すると、それに伴い蛍光強度が上昇することがわかる。この結果より、上記光ファイバプローブを備えたバイオセンサシステムを用いることにより、ＮＡＤＨの検出及び定量が可能であることが明らかとなった。
【００３８】
次に、上述のようにして得られた蛍光強度と、ＮＡＤＨの濃度との関係を調べ、検量線を作製した。図４は、ＮＡＤＨの濃度と蛍光強度との関係を示す検量線であり、横軸はＮＡＤＨの濃度（マイクロモル／Ｌ）の対数を表し、縦軸は蛍光強度を表す、図４から明らかなように、上記光ファイバプローブを備えたバイオセンサシステムを用いてＮＡＤＨの濃度を測定し、検量線を作成した結果、ＮＡＤＨの濃度が１〜３００マイクロモル／Ｌの範囲で直線を示すことがわかった。すなわち、ＮＡＤＨ濃度が上記範囲である場合、上述したバイオセンサによりＮＡＤＨの定量が可能であることがわかった。
なお、図４に示す検量線は以下の式によって表され、相関係数は０．９９３であった。
蛍光強度（カウント） ＝ １．９７×〔ＮＡＤＨ（マイクロモル／Ｌ）〕０．８９
【００３９】
実施例２
以下の操作により、酵素固定化膜を作製した。
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）と２−エチルヘキシルメタクリレートの共重合体（ＥＨＭＡ）及びアルコールデヒドロゲナーゼの混合溶液（溶媒：エタノール）を、それぞれ１マイクロリットル／ｃｍ２、及び５０単位／ｃｍ２となるように、実施例１で用いたポリテトラフルオロエチレン膜上に塗布し、冷蔵庫（約４℃）内に３時間静置し、上記混合溶液を硬化させた。次いで、不必要なアルコールデヒドロゲナーゼをリン酸バッファーで洗浄し、脱水素酵素が固定化された膜を得た。
得られた膜を、図１に示すバイオセンサシステムにおける光ファイバプローブの先端にシリコーン−Ｏ−リングを用いてしっかりと密着させ、本発明のバイオセンサシステムとした。
【００４０】
次いで、ＮＡＤ＋を含む（２０ミリｍｏｌ／リットル濃度）リン酸バッファーに、上記光ファイバプローブを浸し、２分毎に、それぞれ、０．１、１、５、１０、５０、１００、５００、１０００ミリモル／Ｌ）となるように、エタノールを滴下し、蛍光強度をモニターした。
蛍光強度の測定結果のグラフを図５に示す。図５において、横軸は時間（分）を表わし、縦軸は蛍光強度を表す。図３から明らかなように、エタノールの濃度が上昇すると、それに伴い蛍光強度が上昇することがわかる。この結果より、上記光ファイバプローブを備えた、本発明のバイオセンサシステムを用いることにより、エタノールの検出及び定量が可能であることが明らかとなった。
【００４１】
次に、上述のようにして得られた蛍光強度と、エタノールの濃度との関係を調べ、検量線を作製した。図６は、エタノールの濃度と蛍光強度との関係を示す検量線であり、横軸はエタノールの濃度（ミリモル／Ｌ）の対数を表し、縦軸は蛍光強度を表す、図６から明らかなように、本発明のバイオセンサシステムを用いてエタノールの濃度を測定し、検量線を作成した結果、エタノールの濃度が１〜１００ミリモル／Ｌの範囲で直線を示すことがわかった。すなわち、エタノール濃度が上記範囲である場合、本発明のバイオセンサによりエタノールの定量が可能であることがわかった。
なお、図６に示す検量線は以下の式によって表され、相関係数は０．９９４であった。
蛍光強度（カウント） ＝ １．５４×〔エタノール（ミリモル／Ｌ）〕０．５２
【００４２】
実施例２で作製されたバイオセンサシステムは、光源として紫外線発光バイオードを用いているため、従来の水銀ランプを用いたセンサと比べ、重量が軽いものであるため、携帯用としても適している。また、実施例２のバイオセンサシステムを用いてエタノールの定量を行う場合、全電力消費は１５０ｍＷ程度であり、従来の水銀ランプを用いる場合の約１％であった。また、本発明のバイオセンサシステムは軽量であるため、例えば、微小化学物質分析システム（μＴＡＳ）に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】本発明のバイオセンサシステムを模式的に示す図面である。
【図２】本発明のバイオセンサシステムにおいて用いられる、酵素固定化膜及び光ファイバプローブの製造方法を概略的に示す図である。
【図３】蛍光強度の測定結果を示すグラフである。
【図４】ＮＡＤＨの濃度と蛍光強度との関係を示す検量線である。
【図５】蛍光強度の測定結果を示すグラフである。
【図６】エタノールの濃度と蛍光強度との関係を示す検量線である。
【符号の説明】
【００４４】
１０ バイオセンサシステム １１ 光入射用の光ファイバ
１１’ 受光用の光ファイバ１１’ １２ 光ファイバプローブ
１４ 紫外線発光ダイオード
１６ バンドパスフィルター（帯域フィルター）
１８ 長波長透過フィルター（ハイパスフィルター）
２０ 検出器 ２２ コンピュータシステム
３１ 担体
３２ ポリマー及び脱水素酵素の混合溶液 ３３ 酵素固定化膜
３４ 光ファイバプローブ ３５ シリコンチューブリング
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を補酵素とする脱水素酵素の基質を検出するバイオセンサシステムであって、
前記バイオセンサシステムは、
光入射用の光ファイバ及び受光用の光ファイバを接続してなる光ファイバプローブ；
前記光入射用の光ファイバに、特定の波長の紫外線を入射する紫外線発光ダイオード；及び
前記紫外線発光ダイオードから入射した入射光により励起されて発生した蛍光を、前記受光用の光ファイバーを通して検出する検出器を含み、
前記光ファイバプローブの先端に、前記脱水素酵素を固定化してなる膜が密着されていることを特徴とするバイオセンサシステム。
【請求項２】
前記特定の波長が、３００〜３７０ｎｍであり、前記蛍光の波長が４５０〜５１０ｎｍである、請求項１に記載のバイオセンサシステム。
【請求項３】
前記脱水素酵素がアルコールデヒドロゲナーゼであり、前記基質がエタノールである、請求項１又は２に記載のバイオセンサシステム。
【請求項４】
前記光入射用の光ファイバと前記光ファイバプローブとの間に、帯域フィルタを有し、前記受光用の光ファイバと前記光ファイバプローブとの間に長波長透過フィルタを有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のバイオセンサシステム。
【請求項５】
前記光入射用の光ファイバと前記光ファイバプローブとの間に、帯域フィルタを有し、前記受光用の光ファイバと前記光ファイバプローブとの間に帯域フィルタを有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のバイオセンサシステム。
【請求項１】
ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を補酵素とする脱水素酵素の基質を検出するバイオセンサシステムであって、
前記バイオセンサシステムは、
光入射用の光ファイバ及び受光用の光ファイバを接続してなる光ファイバプローブ；
前記光入射用の光ファイバに、特定の波長の紫外線を入射する紫外線発光ダイオード；及び
前記紫外線発光ダイオードから入射した入射光により励起されて発生した蛍光を、前記受光用の光ファイバーを通して検出する検出器を含み、
前記光ファイバプローブの先端に、前記脱水素酵素を固定化してなる膜が密着されていることを特徴とするバイオセンサシステム。
【請求項２】
前記特定の波長が、３００〜３７０ｎｍであり、前記蛍光の波長が４５０〜５１０ｎｍである、請求項１に記載のバイオセンサシステム。
【請求項３】
前記脱水素酵素がアルコールデヒドロゲナーゼであり、前記基質がエタノールである、請求項１又は２に記載のバイオセンサシステム。
【請求項４】
前記光入射用の光ファイバと前記光ファイバプローブとの間に、帯域フィルタを有し、前記受光用の光ファイバと前記光ファイバプローブとの間に長波長透過フィルタを有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のバイオセンサシステム。
【請求項５】
前記光入射用の光ファイバと前記光ファイバプローブとの間に、帯域フィルタを有し、前記受光用の光ファイバと前記光ファイバプローブとの間に帯域フィルタを有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のバイオセンサシステム。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００９−１６８６７１（Ｐ２００９−１６８６７１Ａ）
【公開日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−８１９１（Ｐ２００８−８１９１）
【出願日】平成２０年１月１７日（２００８．１．１７）
【出願人】（５０４１７９２５５）国立大学法人 東京医科歯科大学 (228)
【出願人】（５０６２０９４２２）地方独立行政法人 東京都立産業技術研究センター (134)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１月１７日（２００８．１．１７）
【出願人】（５０４１７９２５５）国立大学法人 東京医科歯科大学 (228)
【出願人】（５０６２０９４２２）地方独立行政法人 東京都立産業技術研究センター (134)
【Ｆターム（参考）】
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