バイオフィルム評価方法
【課題】 台所や洗面台などの一般的な生活環境におけるバイオフィルム形成菌を定量可能なバイオフィルム評価方法を提供すること。
【解決手段】 滅菌シャーレに入れたバイオフィルム担体に菌懸濁液を加え、蛍光染色剤を前記バイオフィルム担体の表面を覆うように加え、続いて、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡システムを用いて前記バイオフィルム担体表面のバイオフィルム形成量を測定してヌメリの発生を評価している。
【解決手段】 滅菌シャーレに入れたバイオフィルム担体に菌懸濁液を加え、蛍光染色剤を前記バイオフィルム担体の表面を覆うように加え、続いて、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡システムを用いて前記バイオフィルム担体表面のバイオフィルム形成量を測定してヌメリの発生を評価している。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、バイオフィルム評価方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
例えば浴室の洗い場に設けた排水口や、台所のシンクに設けた排水口等にはヌメリが発生する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
このヌメリの薄膜は、微生物が排出するスライムで囲まれた微生物の集合体であるバイオフィルムであることが分かっているが、このバイオフィルムの定量検査は未だなされていない。
【０００４】
この発明は、上述の事柄に留意してなされたもので、その目的は、台所や洗面台などの一般的な生活環境におけるバイオフィルム形成菌を定量可能なバイオフィルム評価方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するために、この発明のバイオフィルム評価方法は、滅菌シャーレに入れたバイオフィルム担体に菌懸濁液を加え、蛍光染色剤を前記バイオフィルム担体の表面を覆うように加え、続いて、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡システムを用いて前記バイオフィルム担体表面のバイオフィルム形成量を測定してヌメリの発生を評価することを特徴としている（請求項１）。
【０００６】
ここでバイオフィルムとは、微生物が排出するスライムで囲まれた微生物の集合体で、ヌメリの薄膜である。
【０００７】
また、この発明は、滅菌シャーレに入れたバイオフィルム担体に菌懸濁液を加え、前記バイオフィルム担体を別の滅菌シャーレに移し替え、蛍光染色剤を前記バイオフィルム担体の表面を覆うように加え、続いて、前記バイオフィルム担体の洗浄操作を行った後、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡システムを用いて前記バイオフィルム担体表面のバイオフィルム形成量を測定してヌメリの発生を評価することを特徴とするバイオフィルム評価方法を提供する（請求項２）。
【発明の効果】
【０００８】
この発明では、滅菌シャーレに入れたバイオフィルム担体に菌懸濁液を加え、蛍光染色剤を前記バイオフィルム担体の表面を覆うように加え、続いて、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡システムを用いるので、前記バイオフィルム担体表面のバイオフィルム形成量を測定してヌメリの発生を評価することができる。
また、この発明では、滅菌シャーレに入れたバイオフィルム担体に菌懸濁液を加え、前記バイオフィルム担体を別の滅菌シャーレに移し替え、蛍光染色剤を前記バイオフィルム担体の表面を覆うように加え、続いて、前記バイオフィルム担体の洗浄操作を行った後、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡システムを用いるので、前記バイオフィルム担体表面のバイオフィルム形成量を測定してヌメリの発生を評価することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、この発明の実施例について説明する。なお、それによってこの発明は限定されるものではない。
【００１０】
（１）使用菌株
バイオフィルム測定方法を行うにあたり、使用菌株として、台所や洗面台などの一般的な生活環境におけるバイオフィルム形成菌であるAlcaligenes xylosoxydans IFO 15126を供試菌として用いた。
【００１１】
（２）培養および菌懸濁液の調製
供試菌を、Nutrient Broth（Beef extract 0.3％、Peptone 0.5 ％、pH 6.6-7.0）５ｍｌに一白金耳（いちはっきんじ）植菌し、３７℃、１８時間静置培養を行った。この培養液を、２０倍希釈したNutrient Broth-Sabouraud液体培地（１：１）混合培地で適宜希釈して、使用するまで氷冷しておいた。
なお、一白金耳（いちはっきんじ）とは、菌液または菌叢（コロニー）の「１白金耳量」を１単位分（一回分）ということを意味しており、「１白金耳量」とは、「白金耳（はっきんじ）」（植菌のための器具）の先端部の金属製の小さな輪（直径４ミリ程度）に菌液の液膜を張った状態、または菌叢の塊を付着させた状態で、新しい培地に１回移植した量のことを指す。ちなみに、従来、前記先端部の金属に白金線を使用していたので、白金耳という名称がついているが、最近ではニクロム線で代用することも多い。前記一白金耳（いちはっきんじ）は、ＪＩＳ（Ｚ２９１１、Ｌ１９０２）に掲載されているほか、臨床検査関係のマニュアルにも記載されている。
【００１２】
（３）使用薬剤
また、バイオフィルムの形成予防薬剤として、「お酢」を使用し、薬剤をカートリッジのままガラスシャーレに入れ、カートリッジがすべて浸るように３００ｍｌの蒸留水を加え、２あるいは１２時間、静置した後、水をよくかき混ぜてサンプリングし、薬剤溶液とした。
【００１３】
（４）バイオフィルム担体
バイオフィルム担体は、表面粗さの異なる４種類のステンレス鋼製円盤（直径２８ｍｍ、質量２０ｇ、1,▽▽▽ ;2,▽▽ ;3,▽ ;4,〜）とした。
【００１４】
（５）バイオフィルム形成試験
乾熱滅菌したステンレス鋼製円盤をクリーンベンチ内で滅菌シャーレ（直径９０ｍｍ、深さ２０ｍｍ）に入れ、あらかじめ調製しておいた菌懸濁液（１０6 cells ／シャーレ）を加えた。
なお、前記薬剤溶液を加える場合は、２０倍希釈となるようにシャーレに加えた。そのシャーレを２８℃、７日間培養した。
【００１５】
（６）バイオフィルム形成の観察
ステンレス鋼製円盤を、エタノール消毒したピンセットで取り出し、別の滅菌シャーレに移した。蛍光染色剤（臭化エチジウム水溶液、終濃度１００μg ／ｍｌ）をステンレス鋼製円盤の表面を覆うように加えて３分間静置した。滅菌シャーレにステンレス鋼製円盤が十分に浸るように蒸留水を加え、約５秒間穏やかに振盪し、着色した水を除去した。再び蒸留水を加え、同様にしてステンレス鋼製円盤の洗浄操作を５回繰り返した。ステンレス鋼製円盤の表面に触れないように注意して余分な水分を除去した後、下記の共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡システムでステンレス鋼製円盤表面の写真を撮影し、バイオフィルムの形成を観察した。また、同共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡システムのアプリケーションにより輝度計算を行った。コントロールとして、乾熱滅菌したステンレス鋼製円盤に同様の染色処理を施したものを観察に供した。
【００１６】
なお、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡システム（BioRad、MRC-1024）は、顕微鏡としてECLIPSE E800(Nikon) 、励起光源として水銀ランプ（１００Ｗ）を用い、励起フィルター、ダイクロイックミラーおよび吸収フィルターの組み合わせとして、Ex510-560 、DM575 、BA590 を使用した。
【００１７】
測定結果は以下のようになった。
【００１８】
【表１】
【００１９】
輝度測定結果（表１）より、ステンレス鋼製円盤の表面粗さは輝度に影響を及ぼし、また、表面が粗すぎる場合（4,〜）輝度は低くなることから、ある程度の粗さ（2,▽▽ ;3,▽）があった方が高い輝度、すなわち、バイオフィルム形成量が得られることが分かった。さらに、本方法でバイオフィルムの形成予防効果も確認することができた。
【技術分野】
【０００１】
この発明は、バイオフィルム評価方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
例えば浴室の洗い場に設けた排水口や、台所のシンクに設けた排水口等にはヌメリが発生する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
このヌメリの薄膜は、微生物が排出するスライムで囲まれた微生物の集合体であるバイオフィルムであることが分かっているが、このバイオフィルムの定量検査は未だなされていない。
【０００４】
この発明は、上述の事柄に留意してなされたもので、その目的は、台所や洗面台などの一般的な生活環境におけるバイオフィルム形成菌を定量可能なバイオフィルム評価方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するために、この発明のバイオフィルム評価方法は、滅菌シャーレに入れたバイオフィルム担体に菌懸濁液を加え、蛍光染色剤を前記バイオフィルム担体の表面を覆うように加え、続いて、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡システムを用いて前記バイオフィルム担体表面のバイオフィルム形成量を測定してヌメリの発生を評価することを特徴としている（請求項１）。
【０００６】
ここでバイオフィルムとは、微生物が排出するスライムで囲まれた微生物の集合体で、ヌメリの薄膜である。
【０００７】
また、この発明は、滅菌シャーレに入れたバイオフィルム担体に菌懸濁液を加え、前記バイオフィルム担体を別の滅菌シャーレに移し替え、蛍光染色剤を前記バイオフィルム担体の表面を覆うように加え、続いて、前記バイオフィルム担体の洗浄操作を行った後、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡システムを用いて前記バイオフィルム担体表面のバイオフィルム形成量を測定してヌメリの発生を評価することを特徴とするバイオフィルム評価方法を提供する（請求項２）。
【発明の効果】
【０００８】
この発明では、滅菌シャーレに入れたバイオフィルム担体に菌懸濁液を加え、蛍光染色剤を前記バイオフィルム担体の表面を覆うように加え、続いて、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡システムを用いるので、前記バイオフィルム担体表面のバイオフィルム形成量を測定してヌメリの発生を評価することができる。
また、この発明では、滅菌シャーレに入れたバイオフィルム担体に菌懸濁液を加え、前記バイオフィルム担体を別の滅菌シャーレに移し替え、蛍光染色剤を前記バイオフィルム担体の表面を覆うように加え、続いて、前記バイオフィルム担体の洗浄操作を行った後、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡システムを用いるので、前記バイオフィルム担体表面のバイオフィルム形成量を測定してヌメリの発生を評価することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、この発明の実施例について説明する。なお、それによってこの発明は限定されるものではない。
【００１０】
（１）使用菌株
バイオフィルム測定方法を行うにあたり、使用菌株として、台所や洗面台などの一般的な生活環境におけるバイオフィルム形成菌であるAlcaligenes xylosoxydans IFO 15126を供試菌として用いた。
【００１１】
（２）培養および菌懸濁液の調製
供試菌を、Nutrient Broth（Beef extract 0.3％、Peptone 0.5 ％、pH 6.6-7.0）５ｍｌに一白金耳（いちはっきんじ）植菌し、３７℃、１８時間静置培養を行った。この培養液を、２０倍希釈したNutrient Broth-Sabouraud液体培地（１：１）混合培地で適宜希釈して、使用するまで氷冷しておいた。
なお、一白金耳（いちはっきんじ）とは、菌液または菌叢（コロニー）の「１白金耳量」を１単位分（一回分）ということを意味しており、「１白金耳量」とは、「白金耳（はっきんじ）」（植菌のための器具）の先端部の金属製の小さな輪（直径４ミリ程度）に菌液の液膜を張った状態、または菌叢の塊を付着させた状態で、新しい培地に１回移植した量のことを指す。ちなみに、従来、前記先端部の金属に白金線を使用していたので、白金耳という名称がついているが、最近ではニクロム線で代用することも多い。前記一白金耳（いちはっきんじ）は、ＪＩＳ（Ｚ２９１１、Ｌ１９０２）に掲載されているほか、臨床検査関係のマニュアルにも記載されている。
【００１２】
（３）使用薬剤
また、バイオフィルムの形成予防薬剤として、「お酢」を使用し、薬剤をカートリッジのままガラスシャーレに入れ、カートリッジがすべて浸るように３００ｍｌの蒸留水を加え、２あるいは１２時間、静置した後、水をよくかき混ぜてサンプリングし、薬剤溶液とした。
【００１３】
（４）バイオフィルム担体
バイオフィルム担体は、表面粗さの異なる４種類のステンレス鋼製円盤（直径２８ｍｍ、質量２０ｇ、1,▽▽▽ ;2,▽▽ ;3,▽ ;4,〜）とした。
【００１４】
（５）バイオフィルム形成試験
乾熱滅菌したステンレス鋼製円盤をクリーンベンチ内で滅菌シャーレ（直径９０ｍｍ、深さ２０ｍｍ）に入れ、あらかじめ調製しておいた菌懸濁液（１０6 cells ／シャーレ）を加えた。
なお、前記薬剤溶液を加える場合は、２０倍希釈となるようにシャーレに加えた。そのシャーレを２８℃、７日間培養した。
【００１５】
（６）バイオフィルム形成の観察
ステンレス鋼製円盤を、エタノール消毒したピンセットで取り出し、別の滅菌シャーレに移した。蛍光染色剤（臭化エチジウム水溶液、終濃度１００μg ／ｍｌ）をステンレス鋼製円盤の表面を覆うように加えて３分間静置した。滅菌シャーレにステンレス鋼製円盤が十分に浸るように蒸留水を加え、約５秒間穏やかに振盪し、着色した水を除去した。再び蒸留水を加え、同様にしてステンレス鋼製円盤の洗浄操作を５回繰り返した。ステンレス鋼製円盤の表面に触れないように注意して余分な水分を除去した後、下記の共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡システムでステンレス鋼製円盤表面の写真を撮影し、バイオフィルムの形成を観察した。また、同共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡システムのアプリケーションにより輝度計算を行った。コントロールとして、乾熱滅菌したステンレス鋼製円盤に同様の染色処理を施したものを観察に供した。
【００１６】
なお、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡システム（BioRad、MRC-1024）は、顕微鏡としてECLIPSE E800(Nikon) 、励起光源として水銀ランプ（１００Ｗ）を用い、励起フィルター、ダイクロイックミラーおよび吸収フィルターの組み合わせとして、Ex510-560 、DM575 、BA590 を使用した。
【００１７】
測定結果は以下のようになった。
【００１８】
【表１】
【００１９】
輝度測定結果（表１）より、ステンレス鋼製円盤の表面粗さは輝度に影響を及ぼし、また、表面が粗すぎる場合（4,〜）輝度は低くなることから、ある程度の粗さ（2,▽▽ ;3,▽）があった方が高い輝度、すなわち、バイオフィルム形成量が得られることが分かった。さらに、本方法でバイオフィルムの形成予防効果も確認することができた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
滅菌シャーレに入れたバイオフィルム担体に菌懸濁液を加え、蛍光染色剤を前記バイオフィルム担体の表面を覆うように加え、続いて、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡システムを用いて前記バイオフィルム担体表面のバイオフィルム形成量を測定してヌメリの発生を評価することを特徴とするバイオフィルム評価方法。
【請求項２】
滅菌シャーレに入れたバイオフィルム担体に菌懸濁液を加え、前記バイオフィルム担体を別の滅菌シャーレに移し替え、蛍光染色剤を前記バイオフィルム担体の表面を覆うように加え、続いて、前記バイオフィルム担体の洗浄操作を行った後、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡システムを用いて前記バイオフィルム担体表面のバイオフィルム形成量を測定してヌメリの発生を評価することを特徴とするバイオフィルム評価方法。
【請求項１】
滅菌シャーレに入れたバイオフィルム担体に菌懸濁液を加え、蛍光染色剤を前記バイオフィルム担体の表面を覆うように加え、続いて、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡システムを用いて前記バイオフィルム担体表面のバイオフィルム形成量を測定してヌメリの発生を評価することを特徴とするバイオフィルム評価方法。
【請求項２】
滅菌シャーレに入れたバイオフィルム担体に菌懸濁液を加え、前記バイオフィルム担体を別の滅菌シャーレに移し替え、蛍光染色剤を前記バイオフィルム担体の表面を覆うように加え、続いて、前記バイオフィルム担体の洗浄操作を行った後、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡システムを用いて前記バイオフィルム担体表面のバイオフィルム形成量を測定してヌメリの発生を評価することを特徴とするバイオフィルム評価方法。
【公開番号】特開２００６−３１３１２３（Ｐ２００６−３１３１２３Ａ）
【公開日】平成１８年１１月１６日（２００６．１１．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１３６３４１（Ｐ２００５−１３６３４１）
【出願日】平成１７年５月９日（２００５．５．９）
【出願人】（０００１４４０７２）株式会社三栄水栓製作所 (111)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１１月１６日（２００６．１１．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月９日（２００５．５．９）
【出願人】（０００１４４０７２）株式会社三栄水栓製作所 (111)
【Ｆターム（参考）】
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