バクテリオファージのスクリーニング蛋白質へのランダム配列挿入により改変されたバクテリオファージの作製方法
本発明はランダムに作製されたオリゴヌクレオチドをその遺伝子配列に挿入することにより標的蛋白質を改変した多様な組換えバクテリオファージを取得するための方法と、前記方法により取得可能なバクテリオファージのバンクに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は標的蛋白質がランダムに改変された多様な組換えバクテリオファージを取得するための方法と、前記方法により取得可能なバクテリオファージバンクに関する。
【背景技術】
【０００２】
バクテリオファージは細菌に特異的に感染し、細菌内で複製することが可能なウイルスである。その存在は２０世紀初頭に英国人フレデリック・トウォートとケベック人フェリックス・デレルにより発見された。
【０００３】
バクテリオファージは細菌が存在する全生態学的地位を占める。バクテリオファージはその宿主の内側で休止状態を保つことができる溶原性ファージと、活発に複製し、細菌細胞を溶菌する溶菌性ファージの２種類に大別される。溶菌性の場合には、感染性の多数のバクテリオファージが環境に放出される。
【０００４】
急速に突然変異する可能性のある宿主に対してその感染性を維持するために、バクテリオファージは常に進化し続けている。従って、天然ではそれらが寄生する細菌種に対して特異度が高く、非常に多様化している。
【０００５】
その発見以来、バクテリオファージは抗生物質時代よりもずっと以前から細菌感染に対する防除手段とみなされていた。
【０００６】
そこで、病原性細菌に感染した患者を治療するためにこの細菌に特異的なバクテリオファージを自然界で同定するアプローチがロシアと旧ソビエト連邦諸国で２０世紀前半に開発された。
【０００７】
しかし、２０世紀の後半には、バクテリオファージにより提供される可能性を最大限に活用しないまま、一般にスペクトルの著しく広い抗生物質の大量利用が一般化した。
【０００８】
今日では、抗生物質多耐性細菌株の出現と、科学団体が新規抗生物質を開発する際に直面する問題により、特に院内汚染の場合に根絶しにくい細菌感染を治療するためにバクテリオファージが再び注目されている［Ｔｈｉｅｌ，Ｋ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００４，２２：３１−３６］。
【０００９】
しかし、特に細菌はその外壁の構成成分を遮蔽又は改変することによりバクテリオファージを避けることができるため、バクテリオファージの使用にはいくつかの問題が残っている。
【００１０】
バクテリオファージの複製サイクルには、バクテリオファージが宿主細菌を認識してその壁に接着する段階が実際に必要であり、バクテリオファージが細菌に感染できるか否か、即ちそのキャプシドに含まれる遺伝材料を細菌の細胞質の内側に注入できるか否かはこの段階により決定される。
【００１１】
例えば、バクテリオファージＴ４は大腸菌型の細菌に感染するバクテリオファージであり、その複製サイクルは３７℃で約３０分間である。この複製サイクルはバクテリオファージが細菌を認識した直後に吸収透過段階から開始する。その結果、宿主細菌の遺伝子発現がすぐに停止し、感染から５分後にバクテリオファージの複製に必要な酵素が合成された後、ＤＮＡが複製され（１０分後に開始）、ウイルスが形成される（１２分後に開始）。複製サイクルの結果、細菌は破壊され（３０分後）、溶菌された細菌１個当たり約５０個のバクテリオファージが環境に放出される。
【００１２】
細菌への接着は主にバクテリオファージに結合する役割をもつ基盤の蛋白質により確保され、認識は特に「尾部繊維」と呼ばれる周辺繊維を形成する蛋白質により確保される。但し、尾部繊維と基盤の蛋白質はバクテリオファージの認識と細菌壁接着に同時に関与する場合もある。これらの所謂「標的」蛋白質全体を本願の図１及び３に示す。
【００１３】
バクテリオファージＴ４でこの認識又は接着に関与する蛋白質としては、特に基盤の糖蛋白質ＧＰ１２と、尾部繊維の糖蛋白質ＧＰ３６、ＧＰ３７及びＧＰ３８を挙げることができる。
【００１４】
バクテリオファージの認識システムに対して耐性の細菌の出現を制限するために、同一細菌を標的とすることが可能な異なる型のバクテリオファージを同時に使用することが一般に提案されている。
【００１５】
これらのバクテリオファージを自然界から採取又はコレクションから入手し、「バクテリオファージカクテル」なるものを形成する。
【００１６】
しかし、これらのバクテリオファージカクテルを開発するためには、天然環境で採取されるバクテリオファージが多くの場合にそうであるように、カクテルを構成するバクテリオファージが溶菌性で非溶原性又は部分的に非溶原性となるようにこれらのバクテリオファージを個々に厳密に選択する必要がある。
【００１７】
その実効力を確認するにはバクテリオファージを個々に試験する必要があり、更に該当細菌毎に異なるカクテルを準備する必要があるため、バクテリオファージカクテルの開発には時間と労力がかかる。
【００１８】
国際公開第０１／５１０６６号パンフレットはリステリア症の原因となる細菌リステリア・モノサイトゲネスＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを死滅させるために生鮮食品の防腐剤として使用される６種類の異なるバクテリオファージを含むこのようなバクテリオファージ製剤について記載している。この天然製剤は食肉又は乳製品に噴霧するように噴霧器にパッケージングされている。これらのバクテリオファージはリステリア属の細菌にしか感染せず、多細胞生物の細菌には感染することができないので、この製剤はヒト、動物又は植物に無害である。
【００１９】
天然バクテリオファージの選択に伴う問題を解決するために、国際公開第０６／０６６２２４号パンフレットには所定のビルレンス因子を特異的に標的とするように標的蛋白質を改変したバクテリオファージを取得するための方法が提案されている。ビルレンス因子とは細菌が感染を生じるために必要であると記載されている分子である。これらの分子は例えばリポ多糖等の外部構造の成分よりも感染中に変異を受けにくい安定な成分であるとみなされている。記載されている方法は文献に記載されているビルレンス因子（例えば大腸菌のＯｍｐＣ）を認識することが可能な天然バクテリオファージに由来する蛋白質（例えばバクテリオファージＴ４のＧＰ３７）を選択し、この蛋白質をコードする遺伝子をバクテリオファージλに導入し、この蛋白質を改変するためにバクテリオファージλを利用することを提案している。蛋白質の改変はビルレンス因子の認識に関与する各種ドメイン（例えばＧＰ３７のＨｉｓドメイン）間の交換により実施される。これらの交換はこれらの遺伝子配列に共通の相同ドメイン間の連続組換えにより行われるので、外来ＤＮＡを挿入せずに遺伝子を構成する各種配列が再配列される。
【００２０】
この方法により同一蛋白質の１０５個のオーダーの異なる変異体に相当する多様性を得るためには、細菌宿主でバクテリオファージの多数の連続複製サイクルを実施する必要がある。実際に、連続組換えにより、各種相同領域間の再配列を得ることができ、従って、多様性を生じることができる。
【００２１】
こうして得られたバクテリオファージλを標的ビルレンス因子と接着する能力について試験する。この方法は「ファージディスプレイ」法に類似しており、ビルレンス因子を標的とすることが可能なバクテリオファージλの各種変異体を単離し、こうして各種標的蛋白質を得ることができる。これらの各種標的蛋白質に対応する遺伝子をその後、感染性バクテリオファージに導入することができる。こうしてこれらのバクテリオファージは当初の標的ビルレンス因子をもつ細菌に対して活性のバクテリオファージカクテルを構成することができる。
【００２２】
この方法により、バクテリオファージカクテルを開発するために多様化バクテリオファージを取得する技術は前進した。しかし、この方法はビルレンス因子の同定が予め可能であった培養可能な病原性細菌にしか利用することができない。
【００２３】
更に、従来技術に記載されている同一原理に基づく他の多くの方法と同様に、蛋白質の相同ドメイン間で組換えイベントを得るためには多数の複製サイクルが必要であり、この数はバクテリオファージがその通常の宿主とは異なる宿主に感染する能力を獲得するに十分な数である。このプロセス中に、バクテリオファージはその複製に使用される宿主に感染する能力を失う場合もある。従って、このようなバクテリオファージは選択から除外され、実験者から見逃される。
【００２４】
その結果、これらの方法により獲得可能な改変型バクテリオファージの多用性は著しく低下する。
【００２５】
更に、一般にこれらの方法は感染スペクトルの「広い」組換えバクテリオファージ、即ちその初期宿主（一般に大腸菌）以外に系統発生的に非常に近縁であることが多い他の細菌種（サルモネラ又はシゲラ属のグラム陰性細菌）にも感染することが可能な組換えバクテリオファージしか得ることができない［Ｍａｓａｔｏｓｈｉ Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｉｌ ｆｉｂｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ＧＰ３８ ｅｎａｂｌｅｓ Ｔ２ ｐｈａｇｅ ｔｏ ｉｎｆｅｃｔ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１５：１０１−１０７］。従って、改変型標的蛋白質の作製には、バクテリオファージの取得がバクテリオファージを形質転換後に複製する細菌宿主に依存するという技術的制約がある。
【００２６】
バクテリオファージの利用をより汎用性にするためには、例えばその取得に必要な宿主細菌から独立して感染スペクトルを改変したバクテリオファージを創製することにより、より多数の種に対して感染性のバクテリオファージを得ることが有用であろう。このようなバクテリオファージは新規細菌種、特に新興又は院内感染由来の病原性細菌に対して利用できよう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２７】
【特許文献１】国際公開第０１／５１０６６号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０６／０６６２２４号パンフレット
【非特許文献】
【００２８】
【非特許文献１】Ｔｈｉｅｌ，Ｋ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００４，２２：３１−３６
【非特許文献２】Ｍａｓａｔｏｓｈｉ Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｉｌ ｆｉｂｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ＧＰ３８ ｅｎａｂｌｅｓ Ｔ２ ｐｈａｇｅ ｔｏ ｉｎｆｅｃｔ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１５：１０１−１０７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２９】
上記問題を解決するために、本発明はランダムに作製されたＤＮＡ配列をその遺伝子に挿入することにより、バクテリオファージの標的蛋白質を多様化することからなる新規方法を提案する。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
この方法は宿主細菌における複製サイクルを最小限にし、１サイクルでも実施できるように設計される。
【００３１】
この方法によると、例えば新興又は突然変異細菌に対処するために有用なすぐに使用可能な感染性バクテリオファージのバンクとしての非常に多様な組換えバクテリオファージが得られる。
【００３２】
以下、本発明の方法とその結果として得られる種々の産物について詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】バクテリオファージの各種構成成分を示すバクテリオファージＴ４の図である。本発明の範囲内の該当蛋白質を四角内に示す。
【図２】バクテリオファージＴ４の完全ゲノムの図である。本願に記載する遺伝子をオープンリーディングフレームに垂直な矢印により示す。
【図３】バクテリオファージの認識と宿主細菌接着に関与するバクテリオファージの基盤と尾部繊維の三次元図であり、本発明の方法により改変された標的蛋白質を視覚的に示す。
【図４】本発明による組換えバクテリオファージバンクの取得原理を要約するスキームである。左上の枠内はバクテリオファージの標的蛋白質をコードする３個の遺伝子にランダムに配列を作製したオリゴヌクレオチドを導入するための３個の相同組換えベクターを含む宿主細菌を示す。これらのベクターは遺伝的多様性の高い本発明の意味でのＤＮＡ構築物に相当する。バクテリオファージ感染と相同組換え後に、標的蛋白質を改変した多数のバクテリオファージ（バクテリオファージバンク）が得られ、「標的多様性ソース」を形成する。得られたバクテリオファージを潜在的新規宿主に対してスクリーニングし（ポジティブ選択）、これらの宿主に感染することが可能なバクテリオファージを選択する。ヒト又は動物に無害となるように、非細菌宿主（真核細胞）についても試験することができる。
【図５】バクテリオファージＴ４のＧＰ１２（上段）と、バクテリオファージＲＢ６９に存在するそのホモログ（下段）のポリペプチド配列のＢＬＡＳＴプロトコールによる比較。２個の蛋白質に共通のアミノ酸を中段に示す。記号「＋」はアミノ酸が類似していることを意味する。四角で囲んだＮ末端部分はバクテリオファージを細菌壁に結合することが可能なこれらの２個の蛋白質のドメインに対応する。このアンカードメインを本発明に従ってランダムに突然変異させた後に相同組換えによりバクテリオファージのゲノムに挿入する。内部セグメントＤ１からＤ４は本発明に従ってＰＣＲにより実施されるランダム多様化プロセス中に保存される蛋白質の配列に対応する。
【図６】特に、ランダムに作製されたオリゴヌクレオチドを挿入するｇｐ１２のアンカードメイン１コピーを得るために本発明に従って実施されるＰＣＲ方法の各段階を要約する図である。配列一致度を保存しようとする内部セグメントＤ１からＤ４を長方形内に示す。これらのドメインは上記図５で記載したドメインに対応する。２個の外部セグメントはｇｐ１２のアンカードメインの配列を規定する。Ａ：ｇｐ１２のアンカードメインを高忠実度ＰＣＲにより増幅する。Ｂ：上記オリゴヌクレオチドを使用して独立して４回のエラープローンＰＣＲを実施する。Ｃ：Ｂで得られた増幅産物を精製し、同一の高忠実度ＰＣＲ反応で結合する。前記増幅産物はオーバーラップしているので、ドメインＤ１からＤ４が使用されるプライマーとハイブリダイズできるように十分に保存されている限り、各種フラグメントを結合することが可能である。Ｄ：段階Ｃで実施したＰＣＲの結果、ＰＡ−１とＰＢ−１の２個のフラグメントが得られ、ＧＰ１２のアンカードメインの外部セグメントに対応するプライマーを使用することにより結合する。最終的に、一致度が保存されたドメインＤ１からＤ４のレベル以外は配列がランダムに改変されたｇｐ１２のアンカードメイン１コピーが得られる。実施例で使用したプライマーを本図に記載する各段階に利用した。
【図７Ａ】本発明の方法により得られたＰＣＲ産物（ｇｐ１２−Ｍｕｔ）で直接得られたシーケンシングプロファイルを示す。プロファイルは自動シーケンサーから得られたデータに基づいて無料ＡｐＥ分析ソフトウェアを使用することにより作成した。ヌクレオチド１０８９から１１１０（配列番号１）に位置するｇｐ１２の部分のシーケンシング。保存された左側部分はドメインＤ１の３’部分（ヌクレオチド１０８９から１０９９）に対応する。右側部分はＤ１のすぐ下流に位置する領域（ヌクレオチド１１００から１１１０）内でＰＣＲプロセスにより生じたランダム突然変異を考慮したピーク重畳を示す。
【図７Ｂ】本発明の方法により得られたＰＣＲ産物（ｇｐ１２−Ｍｕｔ）で直接得られたシーケンシングプロファイルを示す。プロファイルは自動シーケンサーから得られたデータに基づいて無料ＡｐＥ分析ソフトウェアを使用することにより作成した。配列番号１のヌクレオチド１１９５から１２１２に位置するｇｐ１２の非突然変異領域で実施したシーケンシング（上段）と、本方法に従って得られたＰＣＲ産物の同一領域について実施したシーケンシング（下段）の比較。シーケンシングした領域は保存ドメインＤ１からＤ２に位置する。ｇｐ１２の初期配列へのランダムなヌクレオチド挿入を考慮した重畳ピークの存在（下段）が認められる。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
従って、本発明は遺伝子改変型バクテリオファージのバンクとしての組換えバクテリオファージの作製方法に関する。
【００３５】
この方法は、
ｉ）バクテリオファージの標的蛋白質をコードする少なくとも１個の遺伝子に配列をランダムに作製したオリゴヌクレオチドを挿入することが可能な少なくとも１個のＤＮＡ構築物により宿主細菌を形質転換する段階と；
ｉｉ）段階ｉ）で形質転換した細菌に前記バクテリオファージを感染させる段階と；
ｉｉｉ）段階ｉｉ）で感染させた細菌を以下の条件下、即ちバクテリオファージが複製することができ、前記バクテリオファージの標的蛋白質をコードする少なくとも１個の遺伝子にランダムに作製されたオリゴヌクレオチドの少なくとも一部を挿入できるような条件下に置く段階と；
ｉｖ）段階ｉｉ）で感染させた細菌で複製したバクテリオファージを回収する段階を含む。
【００３６】
１）ランダムに作製されたオリゴヌクレオチドの挿入を可能にするＤＮＡ構築物
本発明によると、バクテリオファージの標的蛋白質をコードする遺伝子に、ランダムに作製されたオリゴヌクレオチドを挿入する。この挿入の目的は、前記遺伝子によりコードされる標的蛋白質の所定のセグメントのレベルに遺伝子変動を導入することである。こうして翻訳された蛋白質はバクテリオファージの初期蛋白質と異なる認識性又は接着性を示す可能性がある。
【００３７】
バクテリオファージの標的蛋白質とは、バクテリオファージの認識と宿主細菌接着に関与する蛋白質として定義される。これらの蛋白質はファージＴ４の尾部繊維又は基盤を構成するものから選択することが好ましい。本発明の方法に特に適切な蛋白質は基盤の蛋白質ＧＰ１２であり、そのヌクレオチド配列は配列番号１に対応する。他の好ましい標的蛋白質は尾部繊維の遠位部分を構成するＧＰ３６、ＧＰ３７又はＧＰ３８である。当然のことながら、他のバクテリオファージに寄生する上記蛋白質の相同蛋白質も好ましい。「相同配列」とは、上記蛋白質に対する一致度が少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％である蛋白質を意味する。
【００３８】
好ましくは、ランダムに作製されたオリゴヌクレオチドは接着又は認識機能に関与する蛋白質のドメインに対応する標的蛋白質の遺伝子のセグメントに挿入により置換する。好ましくは、これらのセグメントは可変領域、即ちバクテリオファージ種間で保存度の低い認識ドメインの配列に対応する。
【００３９】
逆に、標的蛋白質のより定常的な領域は一般にこれらの蛋白質の三次元構造に必要であるため、保存することが好ましい。
【００４０】
本願では、本発明により特に好ましいバクテリオファージＴ４の蛋白質ＧＰ１２の改変を例にとって説明する。蛋白質ＧＰ１２はＤと呼ぶ所定のセグメントの完全性を維持しながら変異を導入することが望ましいアンカードメインをもち（図５）、前記セグメントはＴ型バクテリオファージの相同蛋白質で保存されたドメインに対応する。
【００４１】
蛋白質の選択領域に挿入するためのオリゴヌクレオチドは当業者に周知の各種技術によりランダムに作製することができる。
【００４２】
「ランダムに作製されたオリゴヌクレオチド」とは本発明の趣旨では、ランダムに配置されたヌクレオチド挿入、欠失又は置換を含む人工的に作製されたヌクレオチド配列を意味する。
【００４３】
本発明の１つの目的は標的遺伝子の機能を妨げずにできるだけ多数の異なるヌクレオチド組み合わせに対応するＤＮＡインサートをこの遺伝子に導入することである。
【００４４】
こうして作製された配列は例えば相同組換えによりバクテリオファージの標的蛋白質をコードする遺伝子にインサートとして導入することができる。従って、これらのインサートは人工的に作製された外来ＤＮＡ配列を構成する。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドないしインサートを合成するためには、天然塩基Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧの配列をランダムに配置した合成オリゴヌクレオチド、あるいはエラープローンＰＣＲによる増幅産物としてのオリゴヌクレオチドを利用することができる。
【００４５】
本発明の特定態様によると、同一の３’又は５’末端をもつように１個以上の遺伝子の異なるセグメントに対応する複数のオリゴヌクレオチドをランダムに作製する。このように、改変後の配列ではオリゴヌクレオチドを相互に交換又は置換することができるので、得られる遺伝子配列の多様性を増加することができる。
【００４６】
ランダムに作製されたオリゴヌクレオチドは更に非天然塩基、特に単一ヌクレオチド配列を各種ペプチドに翻訳することが可能な「多義」塩基も含むことができる。
【００４７】
本発明の１態様によると、標的蛋白質をコードするバクテリオファージの遺伝子にランダムに作製されたオリゴヌクレオチドを相同組換えにより挿入する。
【００４８】
このためには、相同組換えを実施することが可能なＤＮＡ構築物を利用する必要がある。
【００４９】
このような構築物は一般に文献に記載されている当業者に周知のベクターから誘導される［Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．，Ｒｕｓｓｅｌ Ｄ．Ｗ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣＨＳＬ Ｐｒｅｓｓ］。
【００５０】
しかし、本発明の目的に有用なＤＮＡ構築物を得るためには、ゲノムに導入することが所望される遺伝子又は遺伝子部分のコピーをクローニングすることにより公知組換えベクターを適応させることが一般に必要である。
【００５１】
本発明によると、ランダムに作製された複数のオリゴヌクレオチドを好ましくは遺伝子の可変セグメントに対応する場所に導入することにより前記遺伝子を改変する。
【００５２】
この点で、特に上記ＧＰ蛋白質の場合には、本発明によると、ランダムに作製された各種オリゴヌクレオチドを所望の場所に含むことにより、所望の標的蛋白質をコードする遺伝子の全部又は一部を再構成する必要がある。
【００５３】
この再構成は遺伝子又は前記遺伝子の一部の改変型コピーを再構成することにより、即ちランダムに作製されたオリゴヌクレオチドをベクター内の配列の保存セグメントと結合することにより従来通りに実施することができる。しかし、この段階はサブクローニングと多数の検証段階が必要になる場合があるため、非常に繁雑になる可能性がある。
【００５４】
本発明は、その特定態様の１つにおいて、ランダムに作製されたオリゴヌクレオチドを含む遺伝子又は遺伝子の一部のコピーから構成されるインサートの作製を容易にすることを目的とする方法を提案する。
【００５５】
この方法は所定のセグメントを選択的にランダムに変異させることが所望される任意ヌクレオチド配列に適用することができる。実際に、この方法は多数の治療分野で利用することができる。その実施は、その遺伝子配列の標的ドメインを改変することにより蛋白質の活性スペクトルを改変しようとする場合に実際に特に有用である。
【００５６】
この方法は図５に示す所定の定常領域Ｄ１からＤ４を保存することが所望されるｇｐ１２のアンカードメインに特に適用される。
【００５７】
この方法は特に、その５’及び３’末端を２個のセグメントＦ１及びＦ２により規定されるヌクレオチド配列Ｓの少なくとも１個の内部セグメントＤの一致度を保存しながら、前記ヌクレオチド配列をランダムに突然変異させることが可能なＰＣＲ法から構成される。本方法は、
ｉ）セグメントＦ１及びＦ２に対応するプライマーを使用して配列Ｓの全長にエラープローンＰＣＲを実施し、配列Ｓをその全長にわたってランダムに突然変異させる段階と；
ｉｉ）得られた増幅産物を溶出させる段階と；
ｉｉｉ）段階ｉ）で突然変異させたＳのうちで内部セグメントＤがその一致度を保存している少なくともＦ１−Ｄ及びＤ−Ｆ２領域を増幅するように、少なくともＦ１とＤ及びＦ２とＤにそれぞれ対応するプライマー対を使用することにより、段階ｉｉ）で溶出させた増幅産物から出発して高忠実度ＰＣＲを実施する段階と；
ｉｖ）Ｆ１及びＦ２に対応するプライマーを使用することにより、段階ｉｉｉ）で得られた増幅産物から出発して高忠実度ＰＣＲを実施する段階と；
ｖ）ヌクレオチド配列Ｓに対応する寸法をもつ得られたＰＣＲ産物を精製する段階を含む。
【００５８】
本発明のプライマーは配列Ｓの２本鎖ＤＮＡ基質を形成するＤＮＡ鎖の一方と部分的又は完全にハイブリダイズすることが可能な１本鎖核酸である。そのヌクレオチド鎖がＳのコーディングＤＮＡ鎖の一部を数ヌクレオチド以内の誤差で再現するときにプライマーは「センス」であると言う。そのヌクレオチド鎖がＳの非コーディング相補鎖の一部を数ヌクレオチド以内の誤差で再現するときにプライマーは「アンチセンス」であると言う。
【００５９】
プライマーが配列Ｓの所定セグメント「に対応する」と言うときには、プライマーが２本鎖ＤＮＡ分子状の配列Ｓの一部に対してセンスでもアンチセンスでもよいという意味である。
【００６０】
本発明のＰＣＲ法は特に以下及び本願の実施例に記載するようにセンス及びアンチセンスＰＣＲプライマーを使用する。
【００６１】
この方法は（蛋白質ＧＰ１２の場合のように）ヌクレオチド配列Ｓの数個の内部ドメインＤＮの一致度を保存しようとする場合に特に有利である。従って、この方法は、
ｉ）セグメントＦ１及びＦ２のそれぞれセンス及びアンチセンスプライマーである少なくとも２個のプライマーを使用して配列Ｓの全長にエラープローンＰＣＲを実施し、ランダムに突然変異を導入しながら配列Ｓを増幅する段階と；
ｉｉ）ランダムに突然変異させたＳのコピーに対応する得られた増幅産物を精製する段階と；
ｉｉｉ）少なくとも
−突然変異させたＳのコピーの少なくともＦ１−ＤＮ領域を増幅するために、Ｆ１に対応するセンスプライマーと、ＤＮのアンチセンスプライマーと、
−突然変異させたＳのコピーの少なくともＤＮ−Ｆ２配列を増幅するために、ＤＮに対応するセンスプライマーと、Ｆ２のアンチセンスプライマー
をそれぞれセンスプライマーとアンチセンスプライマーの対として使用することにより、段階ｉｉ）で精製した増幅産物から出発して高忠実度ＰＣＲを実施する段階と；
ｉｖ）段階ｉ）で突然変異させた配列ＳのうちでセグメントＤの配列がその一致度を保存しているセグメントＦ１−ＤＮ及びＤＮ−Ｆ２のコピーから構成される段階ｉｉｉ）で得られた増幅産物を精製する段階と；
ｖ）Ｆ１及びＦ２の少なくとも１対のセンスプライマーとアンチセンスプライマーを使用することにより、段階ｉｖ）で得られた増幅産物から出発して高忠実度ＰＣＲを実施する段階と；
ｖｉ）前記インサートのランダムに突然変異させたヌクレオチド配列のうちで少なくともセグメントＤＮの配列がその一致度を保存しているものに対応する段階ｖ）で得られたＰＣＲ産物を精製する段階を含む。
【００６２】
「エラープローンＰＣＲ」とは、ＤＮＡ配列の忠実な複製を実現できない条件下で実施されるポリメラーゼ連鎖反応を意味する。この型の反応は文献に記載されているように、低ストリンジェンシー条件下でマンガン塩の存在下にＴａｑ型の旧来のポリメラーゼを利用することにより実施することができる［Ｃａｄｗｅｌｌ，Ｒ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．１９９２，Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｂｙ ＰＣＲ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．，２：２８−３３］。
【００６３】
他方、高忠実度ＰＣＲは非常に低い複製エラー率でＤＮＡ鋳型を増幅することが可能なポリメラーゼ連鎖反応である。この型の反応は文献に記載されているように、例えばストリンジェント条件下でＰｆｕ型ポリメラーゼを利用することにより実施することができる［Ｉｎｍｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｅｄｓ．，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９８９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ］。
【００６４】
多様化しようとする遺伝子のセグメント自体を鋳型として使用し、エラープローンＰＣＲによりオリゴヌクレオチドを作製すると有利である。この特定方法により得られた増幅産物は内部ドメインＤＮを保存しながらランダムに多様化されたヌクレオチド配列Ｓのバンクを構成し、前記配列は、
−ランダムに作製された１個以上のオリゴヌクレオチドの挿入と、
−その一致度を保存した前記遺伝子の配列セグメントを含む。
【００６５】
一般に、内部ドメインＤＮは本発明の方法によると、使用するＰＣＲ条件、特に本発明の方法の段階ｉｉｉ）及びｖ）で実施する高忠実度ＰＣＲの条件に応じて野生型蛋白質中の元の配列に対して＞５０％、好ましくは＞７０％、より好ましくは＞９０％、更には＞９９％の一致度を保存している。
【００６６】
一旦蛋白質に翻訳されると、上記バンクに含まれるヌクレオチド配列は配列が保存された内部ドメインＤＮを含むランダムに作製された多様なポリペプチド配列を示す蛋白質を発現することができる。
【００６７】
これらの配列は発現ベクターに直接クローニングすることもできるが、当業者に容易に入手可能な相同組換えベクターにクローニングすることがより好ましい。
【００６８】
上記方法によると、同一遺伝子、好ましくはバクテリオファージの標的蛋白質をコードする遺伝子のランダム変異体を含む多様化された相同組換えベクターによりバクテリオファージのゲノムを改変することが可能である。
【００６９】
本発明のＤＮＡ構築物は好ましくは、
−宿主細菌における前記構築物の倍加を可能にする領域と；
−標的蛋白質をコードする遺伝子のレベルでバクテリオファージのゲノムにおける相同組換えを可能にする領域を含み、後者領域は標的蛋白質をコードする前記遺伝子の配列に相同な２個のＤＮＡ配列を含み、前記配列は好ましくは上記ＰＣＲ法により配列をランダムに作製したオリゴヌクレオチドを含む挿入セグメントを規定する。
【００７０】
本発明の好ましい１態様によると、相同組換えを可能にする領域は標的蛋白質をコードする遺伝子の全部又は一部、好ましくは遺伝子の配列の全長を含む。
【００７１】
好ましくは、この第２の領域は上記ランダム突然変異法により取得可能な増幅産物から構成される。
【００７２】
本発明のＤＮＡ構築物は、総じて改変型標的蛋白質をコードする非常に多数の異なるヌクレオチド配列をバクテリオファージのゲノムに組込むことができる。
【００７３】
本発明の好ましい１態様によると、ファージの標的蛋白質をコードする数個の遺伝子を本発明の方法に従って相同組換えにより同時に突然変異させる。このような結果を達成するために、本発明は各々異なる遺伝子を標的とする異なるベクターを使用して宿主細菌を順次形質転換しようとするものである。
【００７４】
大腸菌宿主細菌で本発明によりバクテリオファージＴ４の遺伝子ＧＰ１２、ＧＰ３７又はＧＰ３８を同時に改変することが可能な好ましいベクターは例えばベクターｐＡＣＹＣ１８４（ＡＴＣＣ３７０３３）、ｐＢＡＤ１８−Ｋ（ＡＴＣＣ８７３９７）及びＲＲ１（ＡＴＣＣ８７０７６）である。このようなベクターは各種抗生物質に対する耐性を付与するマーカーをもつという利点があり、宿主細菌に一旦組込まれると、異なるベクター間で組換えを生じることが可能な共通のヌクレオチド配列をもたない。
【００７５】
２）宿主細菌の形質転換
本発明のバクテリオファージは好ましくは天然又は改変型の溶菌性バクテリオファージである。
【００７６】
好ましくは、使用するバクテリオファージは当業者に周知のバクテリオファージＴ４、Ｔ５、Ｔ６及びＴ７等のＴ型ファージ、特にゲノムが配列決定されているファージＴ４である［Ｍｉｌｌｅｒ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ４ ｇｅｎｏｍｅ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，２００３，６７（１）：８６−１５６］。バクテリオファージのゲノムの全長配列はＧｅｎｂａｎｋから入手可能である（ＡＦ１５８１０１）。
【００７７】
本発明の宿主細菌は改変しようとするファージを複製するために一般に使用されている細菌である。好ましくは、宿主細菌は相同組換えによりファージを改変させることが可能な本発明のＤＮＡ構築物を使用して形質転換することが可能な株である。
【００７８】
本発明の方法を実施するためにＴ型バクテリオファージに特に適した宿主細菌は大腸菌、例えばＤＫ８株（ＡＴＣＣ４７０３８）である。
【００７９】
Ｔ型バクテリオファージの改変の範囲内では、λプロファージに由来し、遺伝子ｅｘｏ、ｂｅｔ及びｇａｍを含むＭｉｎｉ−λ型ベクターにより形質転換された大腸菌株を使用すると有利である。このようなベクターは例えば宿主細菌を培養する温度の関数として相同組換えを制御することができ、従って、本発明により予想される複製段階のみに組換えイベントを制限することができる。
【００８０】
本発明を実施するために使用される相同組換え技術は当業者に公知である。例えば［Ｐｏｔｅｅｔｅ，Ａ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２００１，２０１（１）：９−１４；Ｋｕｚｍｉｎｏｖ，Ａ．ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ，２００１，９８（１５）：８２９８−３０５］に記載されている。
【００８１】
従って、バクテリオファージの標的蛋白質をコードする遺伝子を改変することが可能なＤＮＡ構築物により宿主細菌を形質転換することが好ましく、前記構築物は標的蛋白質をコードする遺伝子の全部又は一部のランダムに突然変異させたコピーに対応するインサートを含む。
【００８２】
このインサートは上記ＰＣＲ法により作製することが好ましい。
【００８３】
本発明の方法による宿主細菌の形質転換段階は１回以上実施することが好ましい。標的蛋白質の各種遺伝子を改変するために複数のベクターを使用する場合には、逐次処理すること、即ちベクターを順次導入すると有利である。こうすると、各段階で形質転換された細菌を保存することが可能である。従って、最後に導入したベクターの代わりに新しいベクターを再導入するために前段階に戻ることが常に可能である。このため、宿主細菌に全ベクターを導入しなくてもベクターの多数の組み合わせを試験することができる。
【００８４】
形質転換段階後に、本発明の１個以上の構築物により形質転換された宿主細菌の１個以上のバンクが得られる。
【００８５】
このバンクの細菌は各々バクテリオファージの標的蛋白質の１個以上を異なる方法で相同組換えにより形質転換することが可能な構築物を潜在的に含む。
【００８６】
従って、本発明の１つの目的はバクテリオファージを感染させることが可能な上記ＤＮＡ構築物により形質転換された宿主細菌のバンクである。
【００８７】
宿主細菌のこのようなバンクは複製保存できるという利点がある。このようなバンクは上記組換えバクテリオファージの作製に有用な再生可能な中間産物を構成する。
【００８８】
３）形質転換された宿主細菌におけるバクテリオファージの感染と複製
選択されたバクテリオファージによる宿主細菌の感染段階はバクテリオファージをこの段階で改変させない限り、特に問題ない。感染は宿主細菌の指数増殖期中に約３０℃で開始することが好ましい。
【００８９】
次に、細菌におけるバクテリオファージのゲノムの複製段階中に、ランダムに作製されたオリゴヌクレオチドを含む遺伝子とバクテリオファージのゲノム内に存在する遺伝子の相同領域間で相同組換えを実施することができる。
【００９０】
この複製段階はバクテリオファージによる宿主細菌の感染直後に開始する。
【００９１】
本発明の好ましい１態様によると、約４０から４５℃の熱ショックを与えると同時に形質転換宿主細菌の培養液にバクテリオファージを導入する。この温度を５から１５分間、好ましくは１２から１５分間の限定時間維持し、相同組換えを活性化させる。特に熱ショックの場合に相同組換えを所定の温度条件に調整することが可能なＭｉｎｉ−λベクターにより宿主細菌を形質転換することが好ましく、相同組換えは複製サイクルと同等以下の時間実施される。次に、相同組換えを著しく生じにくい約３０℃の常温の培養液に宿主細菌を移す。この約３０℃での２回目の培養時間は約２５分間、又は１複製サイクルに等価の時間とする。
【００９２】
本発明の方法の特に革新的な態様は２回目の培養時間後、平均して１複製サイクル後、好ましくはバクテリオファージの２回目の複製サイクルが生じる前にバクテリオファージを回収するという点にある。
【００９３】
この手順は、宿主細菌における新しい複製サイクルが生じる前に組換えバクテリオファージを回収するという利点がある。
【００９４】
このように１複製サイクルに制限すると、バクテリオファージは２回目の複製サイクルのために宿主細菌に再感染する時間がなくなる。従って、通常では宿主細菌を認識する能力又は宿主細菌に感染する能力を失った改変型バクテリオファージは後続再感染サイクル中に排除されるが、このようなバクテリオファージを回収することができる。
【００９５】
４）組換えバクテリオファージバンク
本発明の方法によると、非常に多様な組換えバクテリオファージの集合を得ることが可能である。
【００９６】
これらのバクテリオファージは本発明のバクテリオファージバンクを形成する。
【００９７】
従って、本発明の組換えバクテリオファージバンクは標的蛋白質をコードする少なくとも１個の遺伝子の各種コピーを含むポリヌクレオチド変異体から構成され、前記遺伝子はランダムに作製されたオリゴヌクレオチド配列の挿入を含む。
【００９８】
各種コピーをバクテリオファージに含む前記遺伝子は標的蛋白質ＧＰ１２をコードすることが好ましい。
【００９９】
このバンクを構成するバクテリオファージは更に、複数の標的蛋白質をコードする複数の遺伝子の各種コピーを含むことができ、前記遺伝子はランダムに作製されたオリゴヌクレオチド配列の挿入を含む。これらの各種遺伝子は同一バクテリオファージ内又は同一バンクの各種バクテリオファージ内で改変することができる。バクテリオファージバンクを構成する各バクテリオファージ内で複数の標的遺伝子を改変することが好ましい。改変型標的蛋白質はＧＰ１２、ＧＰ３６、ＧＰ３７、ＧＰ３８又はその相同蛋白質であることが好ましい。回収されるバクテリオファージ数を決定するのは形質転換宿主細菌数であるので、本発明のバクテリオファージバンクが最大限多数の異なるバクテリオファージに対応するためには、十分な数の形質転換宿主細菌を使用する必要がある。
【０１００】
この数が十分であるならば、本発明のバクテリオファージバンクは最低で同一バクテリオファージの少なくとも１０３個、好ましくは１０５個、より好ましくは１０８個の異なる変異体を含み、前記変異体はその標的蛋白質の少なくとも１個の配列が相違する。
【０１０１】
従って、本発明の方法はバクテリオファージにより発現される標的蛋白質の多様性を増加し、組換えバクテリオファージ、特に連続組換えサイクル中に宿主細菌内で複製されないもの又は迅速に複製されないものが排除されないようにすることを第１の目的とする。
【０１０２】
本発明のバンクにおけるバクテリオファージの多様性は単純な計数計算により立証することができる。
【０１０３】
例えば、好ましくは
−少なくとも１２ヌクレオチドのランダム配列から構成される少なくとも３個のオリゴヌクレオチドの挿入により標的蛋白質をコードする３個の遺伝子が改変され；
−ヌクレオチド配列の１／３が標的蛋白質のレベルでポリペプチド修飾を受け；
−４個の塩基（Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇ）うちの３個のみが元の蛋白質に対して突然変異を生じることができると仮定するならば、
ポリペプチドレベルで最低３２４通りの突然変異の可能性が得られ、約２．８×１０１１個の潜在的に異なるバクテリオファージ数に相当する。
【０１０４】
本発明は特に標的細菌に感染してこの細菌で複製することが可能な本発明のバクテリオファージバンクに由来する単離型組換えバクテリオファージに関する。
【０１０５】
このようなバクテリオファージは、
ｉ）上記のように、バクテリオファージの標的蛋白質をコードする少なくとも１個の遺伝子にランダムに配列を作製されたオリゴヌクレオチドを導入する段階と；
ｉｉ）段階ｉ）により得られた遺伝子改変型バクテリオファージを既知又は未知一致度の細胞と接触させる段階と；
ｉｉｉ）段階ｉｉ）で接触させたバクテリオファージのうちで前記既知又は未知一致度の細胞に感染することが可能な少なくとも１個のバクテリオファージを選択する段階に従って処理することにより取得することができる。
【０１０６】
本発明により既知又は未知一致度の細菌に感染することが可能な組換えバクテリオファージの選択を容易にするためには、蛍光又は発光により検出可能なバクテリオファージを利用すると有利である。
【０１０７】
この点で、宿主細菌に感染させるために使用されるバクテリオファージは発光又は蛍光蛋白質をコードする遺伝子の導入により蛍光性に予め改変されたバクテリオファージ自体とすることができる。
【０１０８】
本発明の好ましい１態様によると、バクテリオファージは例えばＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質）等の発光又は蛍光蛋白質と融合したキャプシド蛋白質を含む。
【０１０９】
バクテリオファージのキャプシドのＨｏｃ蛋白質［Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＰ０４９７９３］又はその一部をこの発光又は蛍光蛋白質と融合することが好ましい。この融合は一般にバクテリオファージの認識性又は細菌接着性に何ら影響しない。蛍光蛋白質を介在させると、感染により多数のバクテリオファージを保持する細菌の位置を突き止めることができる。バクテリオファージがその場所に集中すると、当業者に公知の測定機器により検出可能な蛍光レベルに達する。これらの改変型バクテリオファージは細菌を固体培地で平板培養する場合に感染性バクテリオファージをスクリーニングするために特に有用であることが判明した。
【０１１０】
本発明は更に本発明の組換えバクテリオファージから抽出されるか又は前記バクテリオファージに由来するＤＮＡから翻訳された改変型標的蛋白質に関する。
【０１１１】
本発明はバクテリオファージの改変型標的蛋白質を取得するための方法として、本発明の組換えバクテリオファージを利用することを特徴とする任意方法にも関する。
【０１１２】
５）取得された組換えバクテリオファージの利用
本発明のバクテリオファージバンクは既知又は未知の細菌を防除するために使用することができる。実際に、バンクに存在する各種標的蛋白質をもつ組換えバクテリオファージの多様性は高く、これらのバクテリオファージの１個が既知又は未知の細菌に感染する確率は有意に非ゼロである。
【０１１３】
未知の細菌とは本発明の趣旨ではまだ特性決定されていない細菌、又は少なくとも例えばそのアンチバイオグラムを作成できるようにするために十分には特性決定されていない細菌である。有効な抗生物質が存在しない新興細菌や、その存在が立証されていない細菌でもよい。
【０１１４】
本発明のバクテリオファージバンクは物体の表面又は生体内で発生することが可能な既知又は未知の細菌に対して予防的に利用できるという利点がある。
【０１１５】
従って、本発明はバクテリオファージの標的蛋白質をコードする１個以上の遺伝子にランダムに作製されたオリゴヌクレオチドを挿入することにより改変されたバクテリオファージを含むバクテリオファージバンクを利用することを特徴とする殺菌方法に関する。
【０１１６】
本発明の別の目的は本発明のバクテリオファージバンクを含有する固体又は液体組成物、例えば除菌したい表面に噴霧することが可能な散剤に関する。
【０１１７】
好ましい１適用例は本発明のバクテリオファージバンクによる空調装置、特に空冷システムの処理である。
【０１１８】
このような組成物は特に細菌感染症を予防又は治療するため、より詳細には気道又は皮膚疾患を治療するために、医薬品として利用することもできる。
【０１１９】
所定細菌に感染することが可能であるとみなされる本発明の組換えバクテリオファージは上記用途の１種で単独利用することができる。
【０１２０】
本発明の好ましい１態様によると、本発明の組換えバクテリオファージはこのバクテリオファージが感染することが可能な既知又は未知の細菌の検出及び／又は同定用参照バクテリオファージとして利用することができる。
【０１２１】
参照バクテリオファージとは、本発明の趣旨では、検出又は診断ツールとして利用できるように、所定型の細菌を標的にできるようにしたバクテリオファージである。
【０１２２】
本発明の組換えバクテリオファージは一般に培養し易い実験室細菌株を使用して得られる。従って、逆に実験室条件下では培養しにくい細菌に対して有用であると思われる。
【０１２３】
従って、本発明の組換えバクテリオファージは診断法、例えば細菌感染症の検査対象である患者に由来する検体と前記バクテリオファージを接触させる段階を含む方法で利用することができる。
【０１２４】
好ましい１態様によると、バクテリオファージは蛍光又は発光性であるため、特にそれぞれのバクテリオファージにより細菌を追跡できるという点で、感染の進行をリアルタイムで監視することが可能である。
【０１２５】
上記利用及び方法は新興又は耐性細菌を検出又は防除するために緊急事態で特に有用である。
【０１２６】
以下の実施例は本発明の例証を目的とし、その範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１２７】
バクテリオファージＴ４のｇｐ１２、ｇｐ３７及びｇｐ３８の変異体の配列の作製
以下、ｇｐ１２に使用する手順を記載するが、当業者はｇｐ３７やｇｐ３８等の本発明の標的蛋白質をコードする他の遺伝子の改変にも容易に適用することができる。
【０１２８】
ステップ１：ｇｐ１２遺伝子の作製
ｇｐ１２遺伝子は、
ｇｐ１２Ｆ ５’−ＴＧＡＧＴＡＡＴＡＡＴＡＣＡＴＡＴＣＡＡＣＡＣＧ（配列番号２）、及び
ｇｐ１２Ｒ ５’−ＴＧＡＴＴＣＴＴＴＴＡＣＣＴＴＡＡＴＴＡＴＧＴＡＣ（配列番号３）
をプライマーとして使用することにより、バクテリオファージ溶解液の濃縮培養液（上記参照）から得られた野生型Ｔ４のゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅する。
【０１２９】
分取アガロースゲルで精製後、ｇｐ１２の受容体結合ドメインに対応するコーディング領域に点突然変異と挿入を導入する目的で、ＰＣＲ産物（ｇｐ１２Ａ）をエラープローンＰＣＲ反応の鋳型として使用する（図５参照）。
【０１３０】
ステップ２：受容体結合ドメインへのランダム突然変異の導入
ランダムポリメラーゼエラーを誘導するようにＭｎ２の存在下で４回１組のネステッドＰＣＲ（各４０サイクル）を実施する。
【０１３１】
反応容量１００μｌとし、１×反応緩衝液中、それぞれ終濃度４００ｎｇ及び３０ｐｍｏｌの鋳型及びプライマーと、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ及びｄＧＴＰ（各）、１ｍＭ ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ（各）、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．７ｍＭ ＭｎＣｌ２及びＤＮＡ−ポリメラーゼＴａｑ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）５Ｕを使用してエラープローンＰＣＲを実施する。ＰＣＲは９６℃で２分後に、９５℃で１分、５６℃で１分及び７２℃で２分を３０サイクルと、７２℃で７分間最終伸長反応を実施する。
【０１３２】
１回目の反応（Ｐ１−１）はプライマーとして、
ｐ１２ＮＦ１Ｆ ５’−ＴＣＡＡＧＧＴＡＡＣＣＧＣＡＴＣＧＴＡＡＣ（配列番号４）
ｐ１２ＮＦ２Ｒ ５’−ＡＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＡＴＧＴＣＡＧ（配列番号５）
を使用する。
【０１３３】
２回目の反応（Ｐ２−１）はプライマーとして、
ｐ１２ＮＦ２Ｆ ５’−ＴＧＣＣＡＴＧＧＴＧＧＡＡＣＴＧＴＴＣＡ（配列番号６）
ｐ１２ＮＦ３Ｒ ５’−ＣＡＣＣＴＡＡＴＣＴＡＧＧＴＴＴＡＣ（配列番号７）
を使用する。
【０１３４】
３回目の反応（Ｐ３−１）はプライマーとして、
ｐ１２ＮＦ３Ｆ ５’−ＣＴＧＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＣＴＴＴ（配列番号８）
Ｐ１２ＮＦ４Ｒ ５’−ＡＴＧＴＴＴＡＴＧＡＴＡＡＧＡＣＡＴ（配列番号９）
を使用する。
【０１３５】
４回目の反応（Ｐ４−１）はプライマーとして、
Ｐ１２ＮＦ４Ｆ ５’−ＧＴＡＡＡＣＣＴＡＧＡＴＴＡＧＧＴＧ（配列番号１０）
Ｐ１２ＮＦ５Ｒ ５’−ＴＣＡＴＴＣＴＴＴＴＡＣＣＴＴＡＡＴＴＡＴ（配列番号１１）
を使用する。
【０１３６】
これらの反応産物は各々２個の他の反応産物と部分的にオーバーラップしており、使用するプライマーは蛋白質ｇｐ１２で保存された定常領域に対応する。これらのドメインは作製される最終突然変異遺伝子構造で忠実に保存されていなければならない。しかし、エラープローンＰＣＲ反応により作製されるフラグメントのうちには、これらの領域に完全に突然変異誘発されているものもある。無傷の領域を維持するためには、保存ドメインを保持したフラグメントのみを選択的に増幅することを目的とする高忠実度ＰＣＲを上記各産物に実施する必要がある。
【０１３７】
ステップ３：所望フラグメントの選択的増幅
これは各々２５サイクルからなる２組の高忠実度ＰＣＲ反応により実施する。
【０１３８】
反応容量５０μｌとし、１×ｐｆｕ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ９．０，１０ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＭｇＳＯ４，６ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４，０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，０．１ｍｇ／ｍｌ ＳＡＢ）に２００μＭ ｄＮＴＰとポリメラーゼｐｆｕ（Ｐｒｏｍｅｇａ）５Ｕを加え、それぞれ終濃度２５０ｎｇ及び４０ｐＭの鋳型及びプライマーを使用して高忠実度ＰＣＲを実施する。ＰＣＲ条件は、９４℃で２０秒、４５℃で１５秒及び７２℃で３０秒を２０サイクル繰り返す。
【０１３９】
第１組の反応（Ｐ１−２からＰ４−２）では、５’末端をビオチン化した対応する「Ｆ」プライマー（例えば：ｐ１２ＮＦ１Ｆ）を使用することにより、上記各ＰＣＲ産物のアリコート（約２５０ｎｇ）を増幅する。これは、長さが実質的に等しいためにゲル電気泳動により分離できない増幅不能な鋳型（突然変異保存ドメイン）から所望産物を分離するために必要である。
【０１４０】
各反応の産物を次に（過剰のプライマーを除去するために）サイズ排除ミニカラムに通し、ストレプトアビジンビーズで個々に精製し、結合用緩衝液で洗浄し、溶出、沈殿させ、ｄｄＨ２Ｏに再懸濁する。
【０１４１】
第２組の反応では、精製した反応産物Ｐ１−２のアリコートを等量の反応産物Ｐ２−２と混合する。前記反応産物は共通のプライミング部位Ｆ２−Ｒ１及びＦ３−Ｒ２をもつ。従って、反応産物Ｐ２−２の「−」鎖は反応産物Ｐ１−２の「＋」鎖のプライマーとして使用され、Ｐ１−２の内部プライミング部位Ｆ２−Ｒ１でポリメラーゼによる伸長が開始する。この保存部位が有意に突然変異されている反応産物Ｐ１−２では伸長できない。
【０１４２】
同様に、反応産物Ｐ１−２の「＋」鎖は反応産物Ｐ２−２の「−」鎖のプライマーとして使用され、Ｐ２−２の内部Ｆ３−Ｒ２プライミング部位でポリメラーゼによる伸長が開始する。この保存部位が有意に突然変異されている反応産物Ｐ２−２では伸長できない。
【０１４３】
増幅に成功したＰＣＲ産物（ＰＡ−１）は４個の保存ドメイン（Ｆ１ ＋ Ｆ２−Ｒ１ ＋ Ｆ３−Ｒ２ ＋ Ｆ４−Ｒ３）の各々が非突然変異状態に維持されたフラグメントＰ１−２及びＰ２−２の融合体に対応する。
【０１４４】
同様の混合物を反応産物Ｐ３−２及びＰ４−２から作製する。これらの反応では、伸長の成功は無傷の内部保存部位Ｆ４−Ｒ３（Ｐ３−２）及びＦ５−Ｒ４（Ｐ４−２）に基づき、得られるＰＣＲ産物（ＰＡ−１及びＰＢ−１）は４個の保存ドメイン（Ｆ３−Ｒ２ ＋ Ｆ４−Ｒ３ ＋ Ｆ５−Ｒ４ ＋ Ｒ５）の各々が非突然変異状態で得られたフラグメントＰ３−２及びＰ４−２の融合体に対応する。
【０１４５】
融合ＰＣＲ産物の寸法は個々の鋳型の寸法と著しく異なるので、得られた産物を分取ゲル電気泳動により精製する。
【０１４６】
この第２組のＰＣＲ反応の収率を増加させるためには、伸長プロトコールを以下のように改変することができる：
反応混合物中の産物Ｐ１−２及びＰ２−２と、Ｐ３−２及びＰ４−２のみで１０サイクル。
【０１４７】
反応を中断し、プライマーｐ１２ＮＦ１Ｆ及びｐ１２ＮＦ３Ｒ各５０ｎｇを混合物ＰＡ−１に加え、プライマーｐ１２ＮＦ３Ｆ及びｐ１２ＮＦ５Ｒ各５０ｎｇを混合物ＰＢ−１に加えた後、ＰＣＲ反応を更に１５サイクル続ける。
【０１４８】
ステップ４：ｇｐ１２の突然変異アンカードメインの再構成
精製後、上記各種突然変異を導入したユニークなフラグメントにおいてｇｐ１２の全長受容体結合ドメインを再構成する目的で３０サイクルからなる高忠実度ＰＣＲ反応で産物ＰＡ−１及びＰＢ−１の等量アリコートを併用する。
【０１４９】
この場合、前回の反応と同様に、産物ＰＡ−１は産物ＰＢ−１の伸長プライマーとして使用され、産物ＰＢ−１は産物ＰＡ−１の伸長プライマーとして使用される。
【０１５０】
その寸法は個々の鋳型の寸法と著しく異なるので、最終融合ＰＣＲ産物（ｇｐ１２ＢＤ−Ｆｕ）をゲル電気泳動により精製する。
【０１５１】
収率を増加させるためには、反応混合物中の産物Ｐ１−２及びＰ２−２と、Ｐ３−２及びＰ４−２のみで１５サイクルからなる反応を実施することにより、伸長プロトコールを改変することができる。反応を中断し、プライマーｐ１２ＮＦ１Ｆ及びｐ１２ＮＦ５Ｒ各５０ｎｇを混合物に加えた後、ＰＣＲ反応を更に１５サイクル続ける。
【０１５２】
精製後、再構成したｇｐ１２の受容体結合ドメインのアリコート（約２５０ｎｇ）を４回１組の新規エラープローンＰＣＲ反応で鋳型として使用した後、上記のように選択的増幅とドメインの再構成を行う。
【０１５３】
しかし、各融合段階（上記段階３及び４）で各サブドメインに個々に導入される可能な全突然変異は再構成された最終受容体系列ドメインにランダムに混入されるので、保存ドメインに悪影響を与えずに実施可能な突然変異誘発サイクル数には限界がある。必要な選択的増幅段階を考慮すると、４連続サイクルを越える場合には新規に導入される全突然変異が保存ドメインに悪影響を与える確率又は突然変異していない元のＴ４配列に戻る復帰突然変異を導入する確率が高いと考えられる。
【０１５４】
ステップ５：ｇｐ１２遺伝子全体の改変コピーの再構成
１）受容体結合ドメインの上流のｇｐ１２のセグメントの増幅
上記のようにＰＣＲにより作製したｇｐ１２遺伝子（ｇｐ１２Ａ）を鋳型とし、プライマー
ｇｐ１２Ｆ ５’−ＴＧＡＧＴＡＡＴＡＡＴＡＣＡＴＡＴＣＡＡＣＡＣＧ（配列番号１２）、及び
ｇｐ１２ＡＲ ５’−ＧＴＴＡＣＧＡＴＧＣＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴ（配列番号１３）
と共に使用する。
【０１５５】
次に、得られた増幅産物を分取アガロースゲルで精製し、沈殿後、ｄｄＨ２Ｏに再懸濁する。
【０１５６】
２）ｇｐ１２の突然変異結合ドメインの増幅
ＰＣＲ産物（ｇｐ１２Ｂ）のアリコート（約５００ｎｇ）を等量の再構成したｇｐ１２の受容体結合ドメイン（ｇｐ１２ＢＤ−Ｆｕ）と共に高忠実度ＰＣＲ反応で使用する。なお、これらの２種類の産物は２０ｐｂしかオーバーラップしない。従って、ＰＣＲ反応条件はこの点を考慮して改変する必要がある。
【０１５７】
改変ＰＣＲ条件：Ａ）９６℃で３０分→９４℃で１分、４５℃で１０秒を５サイクル→Ｂ）９４℃で１分と５０℃で２０秒を５サイクル→Ｃ）９４℃で１分、５０℃で３０秒を５サイクル→最後にＤ）９４℃で１分、５５℃で１分、７２℃で５秒を１５サイクル。
【０１５８】
収率を増加させるためには、上記サブステップＤで反応を中断し、プライマーｇｐ１２Ｆ及びｐ１２ＮＦ５Ｒを混合物に導入することができる。次に反応を再開し、完了まで実施する。
【０１５９】
最終産物（ｇｐ１２−Ｍｕｔ）を分取アガロースゲルで精製し、沈殿させ、その使用時までｄｄＨ２Ｏに再懸濁する。
【０１６０】
ステップ６：得られたＰＣＲ産物ｇｐ１２−Ｍｕｔのシーケンシングによる検証
ドメインＤ１及びＤ２を無傷に保存しながら、確かに突然変異がランダムにｇｐ１２に導入されていることを検証するために、アガロースゲルで精製したＰＣＲ産物を自動シーケンシンサーによりシーケンシングする。シーケンシングはｇｐ１２（配列番号１）のヌクレオチド１０８９から１１１０（図６Ａ）と１１９５から１２１２（図６Ｂ）にそれぞれ対応する２部分で実施する。典型的に得られたシーケンシングプロファイルを図６に示す。そのプロファイルをｇｐ１２の初期配列のプロファイルと比較すると、ｇｐ１２の予想プロファイルには多数の付加ピークが加わっていることが認められる。これらの付加ピークはＰＣＲ法により配列ｇｐ１２に導入された突然変異が高頻度であることを反映している。これらのピークはドメインＤ１のレベルには認められず、このドメインがｇｐ１２に対してその配列一致度を保存していることが確認される。
【０１６１】
相同組換え用代替ベクターへの突然変異ｇｐ１２−Ｍｕｔのクローニング
上記手順により、ｇｐ１２と同様にＴ４の突然変異遺伝子ｇｐ３７及びｇｐ３８も作製することができた。
【０１６２】
従って、以下の手順の目的は親バクテリオファージと異なる宿主標的親和性をもつＴ４の子孫を作製するように、バクテリオファージＴ４のゲノムへの相同組換えによる導入を助長するようにＴ４のこれらの変異遺伝子を導入することである。
【０１６３】
この目的のために、上記のように作製した突然変異遺伝子を代替ベクター（遺伝子毎に異なるベクター）に導入する必要がある。本例では、突然変異遺伝子の各々をクローニングするためにベクターｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＡＤ１８−Ｋ及びＲＲ１を使用する。
【０１６４】
選択したベクター（例えばｇｐ１２Ｍｕｔのクローニング用のｐＡＣＹＣ１８４）をＳｍａＩ部位のレベルで切断し、精製し、ｄｄＨ２Ｏ ２０μｌに再懸濁し、ＰＣＲ産物ｇｐ１２Ｍｕｔと１：３の比で混合する。ライゲーション後、ＤＮＡを精製し、ｄｄＨ２Ｏに再懸濁し、「エレクトロコンピテント」細胞ＤＫ８（ＡＴＣＣ４７０３８）に形質転換する。このベクターはクロラムフェニコール耐性遺伝子（Ｃｈｌ）をもつ。従って、エレクトロポレーションと１時間の回復時間後に、クロラムフェニコール１７０μｇ／ｍｌを加えたＬＢ培地１０ｍｌに細胞を移し、常時曝気下に３０℃で４時間培養する。次に細胞をＬＢ培地プレート＋Ｃｈｌに撒き、一晩３０℃で培養する。挿入セグメントｇｐ１２Ｍｕｔの存在をＰＣＲにより検証するために数個のコロニーを採取し、濃縮細胞培養液（ＤＫ８−ｐ１２Ｃ）を調製するために数個の陽性コロニーをＬＢ培地＋Ｃｈｌで培養する。
【０１６５】
宿主細菌への突然変異遺伝子ｇｐ３７及びｇｐ３８の導入
ＤＫ８−ｐ１２Ｃの新鮮な一晩培養液を使用してエレクトロコンピテント細胞を作製する。
【０１６６】
ベクターｐＢＡＤ１８−ＫをＳｍａＩ部位のレベルで切断し、精製し、ｄｄＨ２Ｏ ２０μｌに再懸濁し、ＰＣＲ産物ｇｐ３７Ｍｕｔと１：３の比で混合する。ライゲーション後、ＤＮＡを精製し、ｄｄＨ２Ｏに再懸濁し、「エレクトロコンピテント」細胞ＤＫ８−ｐ１２Ｃに形質転換する。
【０１６７】
この場合に使用するベクターはカナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎ）をもつ。従って、エレクトロポレーションと１時間の回復時間後に、クロラムフェニコール１７０μｇ／ｍｌとカナマイシン５０μｇ／ｍｌを加えたＬＢ培地１０ｍｌに移し、常時曝気下に３０℃で４時間培養する。次に細胞をＬＢ培地プレート＋Ｃｈｌ＋Ｋａｎに撒き、一晩３０℃で培養する。挿入セグメントｇｐ１２Ｍｕｔ及びｇｐ３７Ｍｕｔの存在をＰＣＲにより検証するために数個のコロニーを採取し、濃縮細胞培養液（ＤＫ８−ｐ１２Ｃ−ｐ３７Ｋ）を調製するために数個の陽性コロニーをＬＢ培地＋Ｃｈｌ＋Ｋａｎで培養する。
【０１６８】
ＤＫ８−ｐ１２Ｃ−ｐ３７Ｋの新鮮な一晩培養液を使用してエレクトロコンピテント細胞を作製する。ベクターＲＲ１をＳｍａＩ部位のレベルで切断し、精製し、ｄｄＨ２Ｏ ２０μｌに再懸濁し、ＰＣＲ産物ｇｐ３７Ｍｕｔと１：３の比で混合する。ライゲーション後、ＤＮＡを精製し、ｄｄＨ２Ｏに再懸濁し、「エレクトロコンピテント」細胞ＤＫ８−ｐ１２Ｃ−ｐ３７Ｋに形質転換する。この場合に使用するベクターはアンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐ）をもつ。従って、エレクトロポレーションと１時間の回復時間後に、クロラムフェニコール１７０μｇ／ｍｌ＋カナマイシン５０μｇ／ｍｌ＋アンピシリン６０μｇ／ｍｌを加えたＬＢ培地１０ｍｌに移し、常時曝気下に３０℃で４時間培養する。次に細胞をＬＢ培地プレート＋Ｃｈｌ＋Ｋａｎ＋Ａｍｐに撒き、一晩３０℃で培養する。挿入セグメントｇｐ１２Ｍｕｔ、ｇｐ３７Ｍｕｔ及びｇｐ３８Ｍｕｔの存在をＰＣＲにより検証するために数個のコロニーを採取し、濃縮細胞培養液（ＤＫ８−ｐ１２Ｃ−ｐ３７Ｋ−Ｐ３８Ａ）を調製するために数個の陽性コロニーをＬＢ培地＋Ｃｈｌ＋Ｋａｎ＋Ａｍｐで培養する。
【０１６９】
次に、非常に有効な組換え能を示すことが可能な宿主を構築する。
【０１７０】
大腸菌「ｍｉｎｉ−λ」宿主細菌の構築
ｒｅｃＡ＋又はｒｅｃＡ−バックグラウンドでドナーＤＮＡの有効な組換えを得るために、λの温度感受性リプレッサーｃｌの制御下の組換え遺伝子ｅｘｏ、ｂｅｔ及びｇａｍをもつプロファージλを含む大腸菌宿主を作製する。遺伝子ｅｘｏ、ｂｅｔ及びｇａｍは４２℃で容易に活性化し、３２℃で阻害することができる。λの機能を活性化させる時間を５分間に短縮すると、細胞は組換え能が高まり、線状ＤＮＡを破壊せずに吸収する。λ Ｇａｍは大腸菌のヌクレアーゼＲｅｃＢＣＤによる線状ＤＮＡ攻撃を抑制し、ＥｘｏとＢｅｔａはこの線状ＤＮＡの組換え活性を生じる。更に重要な点として、この組換えは線状ＤＮＡから構成される基質の末端の３０から５０ｐｂに限定されたＤＮＡ相同度で有効である。
【０１７１】
λ ｃｌ８５７のＤＮＡを鋳型として使用し、ａｔｔＰ−ｃｒｏ領域に由来するＤＮＡのＰＣＲ増幅用プライマーとしてオリゴヌクレオチド５’ＧＴＡＴＧＣＡＴＧＣＴＧＧＧＴＧＴＧＧ（ＭλＲｆ）及び５’ＣＧＣＡＣＴＣＴＣＧＡＴＴＣＧＴＡＧＡＧＣＣＴＣＧ（ＭλＲｒ）を使用する。
【０１７２】
一旦プロファージλがＰＣＲにより作製されると、例えばＬａｃＺによる選択によりプロファージλを低コピー数プラスミドｐＦＮ４７６（ＡＴＣＣ８６９６２）にクローニングすることが可能になる。
【０１７３】
ベクターｐＦＮ４７６をＳｍａＩ部位（平滑末端）のレベルで切断し、精製し、ｄｄＨ２Ｏ ２０μｌに再懸濁し、プロファージλのＰＣＲ産物と１：３の比で混合する。ライゲーション後、ＤＮＡを精製し、ｄｄＨ２Ｏに再懸濁し、「エレクトロコンピテント」細胞ＤＫ８−ｐ１２Ｃ−ｐ３７Ｋ−ｐ３８Ａに形質転換する。回復後、細胞をＬＢ培地プレートＸ−ｇａｌ＋Ｃｈｌ＋Ｋａｎ＋Ａｍｐ（上記参照）に撒き、３０℃でインキュベートする。
【０１７４】
プロファージλの存在をＰＣＲにより検証するために数個のブランクコロニーを選択する。次に、後続操作で使用する濃縮細胞培養液（ＤＫ８−Ｔ４Ｍｕｔ−λ）を調製するためにプロファージλの陽性コロニー１個をＬＢ培地＋Ｃｈｌ＋Ｋａｎ＋Ａｍｐで一晩３０℃にて培養する。
【０１７５】
この段階で、形質転換宿主は高温でλにより誘導可能であり、ｌａｃＺ陽性であり、相同組換えにすぐに利用可能なＴ４の突然変異遺伝子ｇｐ１２、ｇｐ３７及びｇｐ３８のコピーを含む。
【０１７６】
宿主範囲を拡大したバクテリオファージＴ４の子孫の作製
ＤＫ８−Ｔ４Ｍｕｔ−λ細胞の新鮮な一晩培養液をＬＢ培地＋Ｃｈｌ＋Ｋａｎ＋Ａｍｐで３０℃にて調製する。
【０１７７】
バクテリオファージの添加前に細胞が指数増殖期に入るように確保するように、ＬＢ培地＋Ｃｈｌ＋Ｋａｎ＋Ａｍｐ １０ｍｌ当たり一晩培養液の細胞０．０５ｍｌ以下の容量でＴ４感染のための培養を開始する。
【０１７８】
曝気を改善するために、これらの培養液は非気密性の栓をした枝付き２５０ｍｌ三角フラスコに入れ、３０℃の振盪機の水浴中で培養する。
【０１７９】
ＬＢ培地＋Ｃｈｌ＋Ｋａｎ＋Ａｍｐ中の細胞２５０ｍｌを細胞３×１０８個／ｍｌの密度で３０℃にて振盪培養する。
【０１８０】
次に指数増殖期の細胞の１０ｍｌアリコートを４２℃に予熱したＬＢ培地＋Ｃｈｌ＋Ｋａｎ＋Ａｍｐ ４０ｍｌに移し、常時曝気下に４２℃で厳密に１５分間インキュベートする。トリプトファンを０．０２ｍｇ／ｍｌの濃度で加えた後、細胞１個当たり粒子約１０個の多重度でバクテリオファージＴ４を加える。培養液を３０℃の水浴に移し、厳密に２５分間増殖を続ける。
【０１８１】
この場合の目的は第１世代の子孫を単離し、この第１世代のバクテリオファージ子孫が繁殖性になる前に増殖を停止させることである。
【０１８２】
バクテリオファージの子孫の回収
５０００ｒｐｍで５分間遠心することにより細胞を採取し、上清を回収し、クロロホルム数滴を加え、混合物を再び１０分間６０００ｒｐｍで遠心する。５倍濃縮緩衝液を使用することにより、クロロホルムを除く上清を１×ＳＭ緩衝液の濃度（１０ｍＭ ＭｇＳＯ４，１００ｍＭ ＮａＣｌ，０．０１％ゼラチン及び５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７，５］）に調整し、分析時まで４℃で保存する。
【０１８３】
ペレットとして集めた細胞を０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ８．０）＋２５％蔗糖の溶液８ｍｌに再懸濁する。リゾチーム（５ｍｇ／ｍｌ）の１．６ｍｌアリコートを加え、混合物を５分間０℃でインキュベートする。０．２Ｍ ＥＤＴＡ溶液３．２ｍｌを加え、混合物を更に１５分間０℃でインキュベートする。細胞溶解液を１０倍濃縮緩衝液により５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１００ｍＭ ＭｎＣｌ２に調整し、１５℃で平衡化し、Ｄｎａｓｅ１（Ｓｉｇｍａ）１０Ｕを加えて２時間インキュベートする。次に混合物を６０００ｒｐｍで１０分間遠心する。透明上清を注意深く分取し、１×ＳＭ緩衝液の濃度に調整し、上記のように保存する。
【０１８４】
宿主範囲拡大の検証
病原性細菌株（エルシニア種、サルモネラ種、大腸菌Ｏ１５７ Ｈ７、エンテロバクター・サカザキ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓａｋａｚａｋｉｉ）等）の培養液を調製する。
【０１８５】
次に３ｍｌアリコートに子孫の濃縮培養液１ｍｌを感染させ、撹拌下に３０℃でインキュベートする。感染直後とその後６０分間おきに培養液の濁度を比色分析により測定する。５時間以内に培養液の濁度が著しく低下した場合には、試験した宿主に感染することが可能な粒子がＴ４の組換え子孫に存在していると判断する。培養液にクロロホルム数滴を加え、濁度の明白な低下を引き起こした後に、培養液を５０００ｒｐｍで５分間遠心する。
【０１８６】
上清を回収し、自然界では野生型バクテリオファージＴ４により攻撃することができない被験細菌に特異的なバクテリオファージ粒子を生産するための感染物質として使用する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は標的蛋白質がランダムに改変された多様な組換えバクテリオファージを取得するための方法と、前記方法により取得可能なバクテリオファージバンクに関する。
【背景技術】
【０００２】
バクテリオファージは細菌に特異的に感染し、細菌内で複製することが可能なウイルスである。その存在は２０世紀初頭に英国人フレデリック・トウォートとケベック人フェリックス・デレルにより発見された。
【０００３】
バクテリオファージは細菌が存在する全生態学的地位を占める。バクテリオファージはその宿主の内側で休止状態を保つことができる溶原性ファージと、活発に複製し、細菌細胞を溶菌する溶菌性ファージの２種類に大別される。溶菌性の場合には、感染性の多数のバクテリオファージが環境に放出される。
【０００４】
急速に突然変異する可能性のある宿主に対してその感染性を維持するために、バクテリオファージは常に進化し続けている。従って、天然ではそれらが寄生する細菌種に対して特異度が高く、非常に多様化している。
【０００５】
その発見以来、バクテリオファージは抗生物質時代よりもずっと以前から細菌感染に対する防除手段とみなされていた。
【０００６】
そこで、病原性細菌に感染した患者を治療するためにこの細菌に特異的なバクテリオファージを自然界で同定するアプローチがロシアと旧ソビエト連邦諸国で２０世紀前半に開発された。
【０００７】
しかし、２０世紀の後半には、バクテリオファージにより提供される可能性を最大限に活用しないまま、一般にスペクトルの著しく広い抗生物質の大量利用が一般化した。
【０００８】
今日では、抗生物質多耐性細菌株の出現と、科学団体が新規抗生物質を開発する際に直面する問題により、特に院内汚染の場合に根絶しにくい細菌感染を治療するためにバクテリオファージが再び注目されている［Ｔｈｉｅｌ，Ｋ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００４，２２：３１−３６］。
【０００９】
しかし、特に細菌はその外壁の構成成分を遮蔽又は改変することによりバクテリオファージを避けることができるため、バクテリオファージの使用にはいくつかの問題が残っている。
【００１０】
バクテリオファージの複製サイクルには、バクテリオファージが宿主細菌を認識してその壁に接着する段階が実際に必要であり、バクテリオファージが細菌に感染できるか否か、即ちそのキャプシドに含まれる遺伝材料を細菌の細胞質の内側に注入できるか否かはこの段階により決定される。
【００１１】
例えば、バクテリオファージＴ４は大腸菌型の細菌に感染するバクテリオファージであり、その複製サイクルは３７℃で約３０分間である。この複製サイクルはバクテリオファージが細菌を認識した直後に吸収透過段階から開始する。その結果、宿主細菌の遺伝子発現がすぐに停止し、感染から５分後にバクテリオファージの複製に必要な酵素が合成された後、ＤＮＡが複製され（１０分後に開始）、ウイルスが形成される（１２分後に開始）。複製サイクルの結果、細菌は破壊され（３０分後）、溶菌された細菌１個当たり約５０個のバクテリオファージが環境に放出される。
【００１２】
細菌への接着は主にバクテリオファージに結合する役割をもつ基盤の蛋白質により確保され、認識は特に「尾部繊維」と呼ばれる周辺繊維を形成する蛋白質により確保される。但し、尾部繊維と基盤の蛋白質はバクテリオファージの認識と細菌壁接着に同時に関与する場合もある。これらの所謂「標的」蛋白質全体を本願の図１及び３に示す。
【００１３】
バクテリオファージＴ４でこの認識又は接着に関与する蛋白質としては、特に基盤の糖蛋白質ＧＰ１２と、尾部繊維の糖蛋白質ＧＰ３６、ＧＰ３７及びＧＰ３８を挙げることができる。
【００１４】
バクテリオファージの認識システムに対して耐性の細菌の出現を制限するために、同一細菌を標的とすることが可能な異なる型のバクテリオファージを同時に使用することが一般に提案されている。
【００１５】
これらのバクテリオファージを自然界から採取又はコレクションから入手し、「バクテリオファージカクテル」なるものを形成する。
【００１６】
しかし、これらのバクテリオファージカクテルを開発するためには、天然環境で採取されるバクテリオファージが多くの場合にそうであるように、カクテルを構成するバクテリオファージが溶菌性で非溶原性又は部分的に非溶原性となるようにこれらのバクテリオファージを個々に厳密に選択する必要がある。
【００１７】
その実効力を確認するにはバクテリオファージを個々に試験する必要があり、更に該当細菌毎に異なるカクテルを準備する必要があるため、バクテリオファージカクテルの開発には時間と労力がかかる。
【００１８】
国際公開第０１／５１０６６号パンフレットはリステリア症の原因となる細菌リステリア・モノサイトゲネスＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを死滅させるために生鮮食品の防腐剤として使用される６種類の異なるバクテリオファージを含むこのようなバクテリオファージ製剤について記載している。この天然製剤は食肉又は乳製品に噴霧するように噴霧器にパッケージングされている。これらのバクテリオファージはリステリア属の細菌にしか感染せず、多細胞生物の細菌には感染することができないので、この製剤はヒト、動物又は植物に無害である。
【００１９】
天然バクテリオファージの選択に伴う問題を解決するために、国際公開第０６／０６６２２４号パンフレットには所定のビルレンス因子を特異的に標的とするように標的蛋白質を改変したバクテリオファージを取得するための方法が提案されている。ビルレンス因子とは細菌が感染を生じるために必要であると記載されている分子である。これらの分子は例えばリポ多糖等の外部構造の成分よりも感染中に変異を受けにくい安定な成分であるとみなされている。記載されている方法は文献に記載されているビルレンス因子（例えば大腸菌のＯｍｐＣ）を認識することが可能な天然バクテリオファージに由来する蛋白質（例えばバクテリオファージＴ４のＧＰ３７）を選択し、この蛋白質をコードする遺伝子をバクテリオファージλに導入し、この蛋白質を改変するためにバクテリオファージλを利用することを提案している。蛋白質の改変はビルレンス因子の認識に関与する各種ドメイン（例えばＧＰ３７のＨｉｓドメイン）間の交換により実施される。これらの交換はこれらの遺伝子配列に共通の相同ドメイン間の連続組換えにより行われるので、外来ＤＮＡを挿入せずに遺伝子を構成する各種配列が再配列される。
【００２０】
この方法により同一蛋白質の１０５個のオーダーの異なる変異体に相当する多様性を得るためには、細菌宿主でバクテリオファージの多数の連続複製サイクルを実施する必要がある。実際に、連続組換えにより、各種相同領域間の再配列を得ることができ、従って、多様性を生じることができる。
【００２１】
こうして得られたバクテリオファージλを標的ビルレンス因子と接着する能力について試験する。この方法は「ファージディスプレイ」法に類似しており、ビルレンス因子を標的とすることが可能なバクテリオファージλの各種変異体を単離し、こうして各種標的蛋白質を得ることができる。これらの各種標的蛋白質に対応する遺伝子をその後、感染性バクテリオファージに導入することができる。こうしてこれらのバクテリオファージは当初の標的ビルレンス因子をもつ細菌に対して活性のバクテリオファージカクテルを構成することができる。
【００２２】
この方法により、バクテリオファージカクテルを開発するために多様化バクテリオファージを取得する技術は前進した。しかし、この方法はビルレンス因子の同定が予め可能であった培養可能な病原性細菌にしか利用することができない。
【００２３】
更に、従来技術に記載されている同一原理に基づく他の多くの方法と同様に、蛋白質の相同ドメイン間で組換えイベントを得るためには多数の複製サイクルが必要であり、この数はバクテリオファージがその通常の宿主とは異なる宿主に感染する能力を獲得するに十分な数である。このプロセス中に、バクテリオファージはその複製に使用される宿主に感染する能力を失う場合もある。従って、このようなバクテリオファージは選択から除外され、実験者から見逃される。
【００２４】
その結果、これらの方法により獲得可能な改変型バクテリオファージの多用性は著しく低下する。
【００２５】
更に、一般にこれらの方法は感染スペクトルの「広い」組換えバクテリオファージ、即ちその初期宿主（一般に大腸菌）以外に系統発生的に非常に近縁であることが多い他の細菌種（サルモネラ又はシゲラ属のグラム陰性細菌）にも感染することが可能な組換えバクテリオファージしか得ることができない［Ｍａｓａｔｏｓｈｉ Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｉｌ ｆｉｂｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ＧＰ３８ ｅｎａｂｌｅｓ Ｔ２ ｐｈａｇｅ ｔｏ ｉｎｆｅｃｔ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１５：１０１−１０７］。従って、改変型標的蛋白質の作製には、バクテリオファージの取得がバクテリオファージを形質転換後に複製する細菌宿主に依存するという技術的制約がある。
【００２６】
バクテリオファージの利用をより汎用性にするためには、例えばその取得に必要な宿主細菌から独立して感染スペクトルを改変したバクテリオファージを創製することにより、より多数の種に対して感染性のバクテリオファージを得ることが有用であろう。このようなバクテリオファージは新規細菌種、特に新興又は院内感染由来の病原性細菌に対して利用できよう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２７】
【特許文献１】国際公開第０１／５１０６６号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０６／０６６２２４号パンフレット
【非特許文献】
【００２８】
【非特許文献１】Ｔｈｉｅｌ，Ｋ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００４，２２：３１−３６
【非特許文献２】Ｍａｓａｔｏｓｈｉ Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｉｌ ｆｉｂｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ＧＰ３８ ｅｎａｂｌｅｓ Ｔ２ ｐｈａｇｅ ｔｏ ｉｎｆｅｃｔ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１５：１０１−１０７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２９】
上記問題を解決するために、本発明はランダムに作製されたＤＮＡ配列をその遺伝子に挿入することにより、バクテリオファージの標的蛋白質を多様化することからなる新規方法を提案する。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
この方法は宿主細菌における複製サイクルを最小限にし、１サイクルでも実施できるように設計される。
【００３１】
この方法によると、例えば新興又は突然変異細菌に対処するために有用なすぐに使用可能な感染性バクテリオファージのバンクとしての非常に多様な組換えバクテリオファージが得られる。
【００３２】
以下、本発明の方法とその結果として得られる種々の産物について詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】バクテリオファージの各種構成成分を示すバクテリオファージＴ４の図である。本発明の範囲内の該当蛋白質を四角内に示す。
【図２】バクテリオファージＴ４の完全ゲノムの図である。本願に記載する遺伝子をオープンリーディングフレームに垂直な矢印により示す。
【図３】バクテリオファージの認識と宿主細菌接着に関与するバクテリオファージの基盤と尾部繊維の三次元図であり、本発明の方法により改変された標的蛋白質を視覚的に示す。
【図４】本発明による組換えバクテリオファージバンクの取得原理を要約するスキームである。左上の枠内はバクテリオファージの標的蛋白質をコードする３個の遺伝子にランダムに配列を作製したオリゴヌクレオチドを導入するための３個の相同組換えベクターを含む宿主細菌を示す。これらのベクターは遺伝的多様性の高い本発明の意味でのＤＮＡ構築物に相当する。バクテリオファージ感染と相同組換え後に、標的蛋白質を改変した多数のバクテリオファージ（バクテリオファージバンク）が得られ、「標的多様性ソース」を形成する。得られたバクテリオファージを潜在的新規宿主に対してスクリーニングし（ポジティブ選択）、これらの宿主に感染することが可能なバクテリオファージを選択する。ヒト又は動物に無害となるように、非細菌宿主（真核細胞）についても試験することができる。
【図５】バクテリオファージＴ４のＧＰ１２（上段）と、バクテリオファージＲＢ６９に存在するそのホモログ（下段）のポリペプチド配列のＢＬＡＳＴプロトコールによる比較。２個の蛋白質に共通のアミノ酸を中段に示す。記号「＋」はアミノ酸が類似していることを意味する。四角で囲んだＮ末端部分はバクテリオファージを細菌壁に結合することが可能なこれらの２個の蛋白質のドメインに対応する。このアンカードメインを本発明に従ってランダムに突然変異させた後に相同組換えによりバクテリオファージのゲノムに挿入する。内部セグメントＤ１からＤ４は本発明に従ってＰＣＲにより実施されるランダム多様化プロセス中に保存される蛋白質の配列に対応する。
【図６】特に、ランダムに作製されたオリゴヌクレオチドを挿入するｇｐ１２のアンカードメイン１コピーを得るために本発明に従って実施されるＰＣＲ方法の各段階を要約する図である。配列一致度を保存しようとする内部セグメントＤ１からＤ４を長方形内に示す。これらのドメインは上記図５で記載したドメインに対応する。２個の外部セグメントはｇｐ１２のアンカードメインの配列を規定する。Ａ：ｇｐ１２のアンカードメインを高忠実度ＰＣＲにより増幅する。Ｂ：上記オリゴヌクレオチドを使用して独立して４回のエラープローンＰＣＲを実施する。Ｃ：Ｂで得られた増幅産物を精製し、同一の高忠実度ＰＣＲ反応で結合する。前記増幅産物はオーバーラップしているので、ドメインＤ１からＤ４が使用されるプライマーとハイブリダイズできるように十分に保存されている限り、各種フラグメントを結合することが可能である。Ｄ：段階Ｃで実施したＰＣＲの結果、ＰＡ−１とＰＢ−１の２個のフラグメントが得られ、ＧＰ１２のアンカードメインの外部セグメントに対応するプライマーを使用することにより結合する。最終的に、一致度が保存されたドメインＤ１からＤ４のレベル以外は配列がランダムに改変されたｇｐ１２のアンカードメイン１コピーが得られる。実施例で使用したプライマーを本図に記載する各段階に利用した。
【図７Ａ】本発明の方法により得られたＰＣＲ産物（ｇｐ１２−Ｍｕｔ）で直接得られたシーケンシングプロファイルを示す。プロファイルは自動シーケンサーから得られたデータに基づいて無料ＡｐＥ分析ソフトウェアを使用することにより作成した。ヌクレオチド１０８９から１１１０（配列番号１）に位置するｇｐ１２の部分のシーケンシング。保存された左側部分はドメインＤ１の３’部分（ヌクレオチド１０８９から１０９９）に対応する。右側部分はＤ１のすぐ下流に位置する領域（ヌクレオチド１１００から１１１０）内でＰＣＲプロセスにより生じたランダム突然変異を考慮したピーク重畳を示す。
【図７Ｂ】本発明の方法により得られたＰＣＲ産物（ｇｐ１２−Ｍｕｔ）で直接得られたシーケンシングプロファイルを示す。プロファイルは自動シーケンサーから得られたデータに基づいて無料ＡｐＥ分析ソフトウェアを使用することにより作成した。配列番号１のヌクレオチド１１９５から１２１２に位置するｇｐ１２の非突然変異領域で実施したシーケンシング（上段）と、本方法に従って得られたＰＣＲ産物の同一領域について実施したシーケンシング（下段）の比較。シーケンシングした領域は保存ドメインＤ１からＤ２に位置する。ｇｐ１２の初期配列へのランダムなヌクレオチド挿入を考慮した重畳ピークの存在（下段）が認められる。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
従って、本発明は遺伝子改変型バクテリオファージのバンクとしての組換えバクテリオファージの作製方法に関する。
【００３５】
この方法は、
ｉ）バクテリオファージの標的蛋白質をコードする少なくとも１個の遺伝子に配列をランダムに作製したオリゴヌクレオチドを挿入することが可能な少なくとも１個のＤＮＡ構築物により宿主細菌を形質転換する段階と；
ｉｉ）段階ｉ）で形質転換した細菌に前記バクテリオファージを感染させる段階と；
ｉｉｉ）段階ｉｉ）で感染させた細菌を以下の条件下、即ちバクテリオファージが複製することができ、前記バクテリオファージの標的蛋白質をコードする少なくとも１個の遺伝子にランダムに作製されたオリゴヌクレオチドの少なくとも一部を挿入できるような条件下に置く段階と；
ｉｖ）段階ｉｉ）で感染させた細菌で複製したバクテリオファージを回収する段階を含む。
【００３６】
１）ランダムに作製されたオリゴヌクレオチドの挿入を可能にするＤＮＡ構築物
本発明によると、バクテリオファージの標的蛋白質をコードする遺伝子に、ランダムに作製されたオリゴヌクレオチドを挿入する。この挿入の目的は、前記遺伝子によりコードされる標的蛋白質の所定のセグメントのレベルに遺伝子変動を導入することである。こうして翻訳された蛋白質はバクテリオファージの初期蛋白質と異なる認識性又は接着性を示す可能性がある。
【００３７】
バクテリオファージの標的蛋白質とは、バクテリオファージの認識と宿主細菌接着に関与する蛋白質として定義される。これらの蛋白質はファージＴ４の尾部繊維又は基盤を構成するものから選択することが好ましい。本発明の方法に特に適切な蛋白質は基盤の蛋白質ＧＰ１２であり、そのヌクレオチド配列は配列番号１に対応する。他の好ましい標的蛋白質は尾部繊維の遠位部分を構成するＧＰ３６、ＧＰ３７又はＧＰ３８である。当然のことながら、他のバクテリオファージに寄生する上記蛋白質の相同蛋白質も好ましい。「相同配列」とは、上記蛋白質に対する一致度が少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％である蛋白質を意味する。
【００３８】
好ましくは、ランダムに作製されたオリゴヌクレオチドは接着又は認識機能に関与する蛋白質のドメインに対応する標的蛋白質の遺伝子のセグメントに挿入により置換する。好ましくは、これらのセグメントは可変領域、即ちバクテリオファージ種間で保存度の低い認識ドメインの配列に対応する。
【００３９】
逆に、標的蛋白質のより定常的な領域は一般にこれらの蛋白質の三次元構造に必要であるため、保存することが好ましい。
【００４０】
本願では、本発明により特に好ましいバクテリオファージＴ４の蛋白質ＧＰ１２の改変を例にとって説明する。蛋白質ＧＰ１２はＤと呼ぶ所定のセグメントの完全性を維持しながら変異を導入することが望ましいアンカードメインをもち（図５）、前記セグメントはＴ型バクテリオファージの相同蛋白質で保存されたドメインに対応する。
【００４１】
蛋白質の選択領域に挿入するためのオリゴヌクレオチドは当業者に周知の各種技術によりランダムに作製することができる。
【００４２】
「ランダムに作製されたオリゴヌクレオチド」とは本発明の趣旨では、ランダムに配置されたヌクレオチド挿入、欠失又は置換を含む人工的に作製されたヌクレオチド配列を意味する。
【００４３】
本発明の１つの目的は標的遺伝子の機能を妨げずにできるだけ多数の異なるヌクレオチド組み合わせに対応するＤＮＡインサートをこの遺伝子に導入することである。
【００４４】
こうして作製された配列は例えば相同組換えによりバクテリオファージの標的蛋白質をコードする遺伝子にインサートとして導入することができる。従って、これらのインサートは人工的に作製された外来ＤＮＡ配列を構成する。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドないしインサートを合成するためには、天然塩基Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧの配列をランダムに配置した合成オリゴヌクレオチド、あるいはエラープローンＰＣＲによる増幅産物としてのオリゴヌクレオチドを利用することができる。
【００４５】
本発明の特定態様によると、同一の３’又は５’末端をもつように１個以上の遺伝子の異なるセグメントに対応する複数のオリゴヌクレオチドをランダムに作製する。このように、改変後の配列ではオリゴヌクレオチドを相互に交換又は置換することができるので、得られる遺伝子配列の多様性を増加することができる。
【００４６】
ランダムに作製されたオリゴヌクレオチドは更に非天然塩基、特に単一ヌクレオチド配列を各種ペプチドに翻訳することが可能な「多義」塩基も含むことができる。
【００４７】
本発明の１態様によると、標的蛋白質をコードするバクテリオファージの遺伝子にランダムに作製されたオリゴヌクレオチドを相同組換えにより挿入する。
【００４８】
このためには、相同組換えを実施することが可能なＤＮＡ構築物を利用する必要がある。
【００４９】
このような構築物は一般に文献に記載されている当業者に周知のベクターから誘導される［Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．，Ｒｕｓｓｅｌ Ｄ．Ｗ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣＨＳＬ Ｐｒｅｓｓ］。
【００５０】
しかし、本発明の目的に有用なＤＮＡ構築物を得るためには、ゲノムに導入することが所望される遺伝子又は遺伝子部分のコピーをクローニングすることにより公知組換えベクターを適応させることが一般に必要である。
【００５１】
本発明によると、ランダムに作製された複数のオリゴヌクレオチドを好ましくは遺伝子の可変セグメントに対応する場所に導入することにより前記遺伝子を改変する。
【００５２】
この点で、特に上記ＧＰ蛋白質の場合には、本発明によると、ランダムに作製された各種オリゴヌクレオチドを所望の場所に含むことにより、所望の標的蛋白質をコードする遺伝子の全部又は一部を再構成する必要がある。
【００５３】
この再構成は遺伝子又は前記遺伝子の一部の改変型コピーを再構成することにより、即ちランダムに作製されたオリゴヌクレオチドをベクター内の配列の保存セグメントと結合することにより従来通りに実施することができる。しかし、この段階はサブクローニングと多数の検証段階が必要になる場合があるため、非常に繁雑になる可能性がある。
【００５４】
本発明は、その特定態様の１つにおいて、ランダムに作製されたオリゴヌクレオチドを含む遺伝子又は遺伝子の一部のコピーから構成されるインサートの作製を容易にすることを目的とする方法を提案する。
【００５５】
この方法は所定のセグメントを選択的にランダムに変異させることが所望される任意ヌクレオチド配列に適用することができる。実際に、この方法は多数の治療分野で利用することができる。その実施は、その遺伝子配列の標的ドメインを改変することにより蛋白質の活性スペクトルを改変しようとする場合に実際に特に有用である。
【００５６】
この方法は図５に示す所定の定常領域Ｄ１からＤ４を保存することが所望されるｇｐ１２のアンカードメインに特に適用される。
【００５７】
この方法は特に、その５’及び３’末端を２個のセグメントＦ１及びＦ２により規定されるヌクレオチド配列Ｓの少なくとも１個の内部セグメントＤの一致度を保存しながら、前記ヌクレオチド配列をランダムに突然変異させることが可能なＰＣＲ法から構成される。本方法は、
ｉ）セグメントＦ１及びＦ２に対応するプライマーを使用して配列Ｓの全長にエラープローンＰＣＲを実施し、配列Ｓをその全長にわたってランダムに突然変異させる段階と；
ｉｉ）得られた増幅産物を溶出させる段階と；
ｉｉｉ）段階ｉ）で突然変異させたＳのうちで内部セグメントＤがその一致度を保存している少なくともＦ１−Ｄ及びＤ−Ｆ２領域を増幅するように、少なくともＦ１とＤ及びＦ２とＤにそれぞれ対応するプライマー対を使用することにより、段階ｉｉ）で溶出させた増幅産物から出発して高忠実度ＰＣＲを実施する段階と；
ｉｖ）Ｆ１及びＦ２に対応するプライマーを使用することにより、段階ｉｉｉ）で得られた増幅産物から出発して高忠実度ＰＣＲを実施する段階と；
ｖ）ヌクレオチド配列Ｓに対応する寸法をもつ得られたＰＣＲ産物を精製する段階を含む。
【００５８】
本発明のプライマーは配列Ｓの２本鎖ＤＮＡ基質を形成するＤＮＡ鎖の一方と部分的又は完全にハイブリダイズすることが可能な１本鎖核酸である。そのヌクレオチド鎖がＳのコーディングＤＮＡ鎖の一部を数ヌクレオチド以内の誤差で再現するときにプライマーは「センス」であると言う。そのヌクレオチド鎖がＳの非コーディング相補鎖の一部を数ヌクレオチド以内の誤差で再現するときにプライマーは「アンチセンス」であると言う。
【００５９】
プライマーが配列Ｓの所定セグメント「に対応する」と言うときには、プライマーが２本鎖ＤＮＡ分子状の配列Ｓの一部に対してセンスでもアンチセンスでもよいという意味である。
【００６０】
本発明のＰＣＲ法は特に以下及び本願の実施例に記載するようにセンス及びアンチセンスＰＣＲプライマーを使用する。
【００６１】
この方法は（蛋白質ＧＰ１２の場合のように）ヌクレオチド配列Ｓの数個の内部ドメインＤＮの一致度を保存しようとする場合に特に有利である。従って、この方法は、
ｉ）セグメントＦ１及びＦ２のそれぞれセンス及びアンチセンスプライマーである少なくとも２個のプライマーを使用して配列Ｓの全長にエラープローンＰＣＲを実施し、ランダムに突然変異を導入しながら配列Ｓを増幅する段階と；
ｉｉ）ランダムに突然変異させたＳのコピーに対応する得られた増幅産物を精製する段階と；
ｉｉｉ）少なくとも
−突然変異させたＳのコピーの少なくともＦ１−ＤＮ領域を増幅するために、Ｆ１に対応するセンスプライマーと、ＤＮのアンチセンスプライマーと、
−突然変異させたＳのコピーの少なくともＤＮ−Ｆ２配列を増幅するために、ＤＮに対応するセンスプライマーと、Ｆ２のアンチセンスプライマー
をそれぞれセンスプライマーとアンチセンスプライマーの対として使用することにより、段階ｉｉ）で精製した増幅産物から出発して高忠実度ＰＣＲを実施する段階と；
ｉｖ）段階ｉ）で突然変異させた配列ＳのうちでセグメントＤの配列がその一致度を保存しているセグメントＦ１−ＤＮ及びＤＮ−Ｆ２のコピーから構成される段階ｉｉｉ）で得られた増幅産物を精製する段階と；
ｖ）Ｆ１及びＦ２の少なくとも１対のセンスプライマーとアンチセンスプライマーを使用することにより、段階ｉｖ）で得られた増幅産物から出発して高忠実度ＰＣＲを実施する段階と；
ｖｉ）前記インサートのランダムに突然変異させたヌクレオチド配列のうちで少なくともセグメントＤＮの配列がその一致度を保存しているものに対応する段階ｖ）で得られたＰＣＲ産物を精製する段階を含む。
【００６２】
「エラープローンＰＣＲ」とは、ＤＮＡ配列の忠実な複製を実現できない条件下で実施されるポリメラーゼ連鎖反応を意味する。この型の反応は文献に記載されているように、低ストリンジェンシー条件下でマンガン塩の存在下にＴａｑ型の旧来のポリメラーゼを利用することにより実施することができる［Ｃａｄｗｅｌｌ，Ｒ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．１９９２，Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｂｙ ＰＣＲ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．，２：２８−３３］。
【００６３】
他方、高忠実度ＰＣＲは非常に低い複製エラー率でＤＮＡ鋳型を増幅することが可能なポリメラーゼ連鎖反応である。この型の反応は文献に記載されているように、例えばストリンジェント条件下でＰｆｕ型ポリメラーゼを利用することにより実施することができる［Ｉｎｍｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｅｄｓ．，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９８９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ］。
【００６４】
多様化しようとする遺伝子のセグメント自体を鋳型として使用し、エラープローンＰＣＲによりオリゴヌクレオチドを作製すると有利である。この特定方法により得られた増幅産物は内部ドメインＤＮを保存しながらランダムに多様化されたヌクレオチド配列Ｓのバンクを構成し、前記配列は、
−ランダムに作製された１個以上のオリゴヌクレオチドの挿入と、
−その一致度を保存した前記遺伝子の配列セグメントを含む。
【００６５】
一般に、内部ドメインＤＮは本発明の方法によると、使用するＰＣＲ条件、特に本発明の方法の段階ｉｉｉ）及びｖ）で実施する高忠実度ＰＣＲの条件に応じて野生型蛋白質中の元の配列に対して＞５０％、好ましくは＞７０％、より好ましくは＞９０％、更には＞９９％の一致度を保存している。
【００６６】
一旦蛋白質に翻訳されると、上記バンクに含まれるヌクレオチド配列は配列が保存された内部ドメインＤＮを含むランダムに作製された多様なポリペプチド配列を示す蛋白質を発現することができる。
【００６７】
これらの配列は発現ベクターに直接クローニングすることもできるが、当業者に容易に入手可能な相同組換えベクターにクローニングすることがより好ましい。
【００６８】
上記方法によると、同一遺伝子、好ましくはバクテリオファージの標的蛋白質をコードする遺伝子のランダム変異体を含む多様化された相同組換えベクターによりバクテリオファージのゲノムを改変することが可能である。
【００６９】
本発明のＤＮＡ構築物は好ましくは、
−宿主細菌における前記構築物の倍加を可能にする領域と；
−標的蛋白質をコードする遺伝子のレベルでバクテリオファージのゲノムにおける相同組換えを可能にする領域を含み、後者領域は標的蛋白質をコードする前記遺伝子の配列に相同な２個のＤＮＡ配列を含み、前記配列は好ましくは上記ＰＣＲ法により配列をランダムに作製したオリゴヌクレオチドを含む挿入セグメントを規定する。
【００７０】
本発明の好ましい１態様によると、相同組換えを可能にする領域は標的蛋白質をコードする遺伝子の全部又は一部、好ましくは遺伝子の配列の全長を含む。
【００７１】
好ましくは、この第２の領域は上記ランダム突然変異法により取得可能な増幅産物から構成される。
【００７２】
本発明のＤＮＡ構築物は、総じて改変型標的蛋白質をコードする非常に多数の異なるヌクレオチド配列をバクテリオファージのゲノムに組込むことができる。
【００７３】
本発明の好ましい１態様によると、ファージの標的蛋白質をコードする数個の遺伝子を本発明の方法に従って相同組換えにより同時に突然変異させる。このような結果を達成するために、本発明は各々異なる遺伝子を標的とする異なるベクターを使用して宿主細菌を順次形質転換しようとするものである。
【００７４】
大腸菌宿主細菌で本発明によりバクテリオファージＴ４の遺伝子ＧＰ１２、ＧＰ３７又はＧＰ３８を同時に改変することが可能な好ましいベクターは例えばベクターｐＡＣＹＣ１８４（ＡＴＣＣ３７０３３）、ｐＢＡＤ１８−Ｋ（ＡＴＣＣ８７３９７）及びＲＲ１（ＡＴＣＣ８７０７６）である。このようなベクターは各種抗生物質に対する耐性を付与するマーカーをもつという利点があり、宿主細菌に一旦組込まれると、異なるベクター間で組換えを生じることが可能な共通のヌクレオチド配列をもたない。
【００７５】
２）宿主細菌の形質転換
本発明のバクテリオファージは好ましくは天然又は改変型の溶菌性バクテリオファージである。
【００７６】
好ましくは、使用するバクテリオファージは当業者に周知のバクテリオファージＴ４、Ｔ５、Ｔ６及びＴ７等のＴ型ファージ、特にゲノムが配列決定されているファージＴ４である［Ｍｉｌｌｅｒ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ４ ｇｅｎｏｍｅ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，２００３，６７（１）：８６−１５６］。バクテリオファージのゲノムの全長配列はＧｅｎｂａｎｋから入手可能である（ＡＦ１５８１０１）。
【００７７】
本発明の宿主細菌は改変しようとするファージを複製するために一般に使用されている細菌である。好ましくは、宿主細菌は相同組換えによりファージを改変させることが可能な本発明のＤＮＡ構築物を使用して形質転換することが可能な株である。
【００７８】
本発明の方法を実施するためにＴ型バクテリオファージに特に適した宿主細菌は大腸菌、例えばＤＫ８株（ＡＴＣＣ４７０３８）である。
【００７９】
Ｔ型バクテリオファージの改変の範囲内では、λプロファージに由来し、遺伝子ｅｘｏ、ｂｅｔ及びｇａｍを含むＭｉｎｉ−λ型ベクターにより形質転換された大腸菌株を使用すると有利である。このようなベクターは例えば宿主細菌を培養する温度の関数として相同組換えを制御することができ、従って、本発明により予想される複製段階のみに組換えイベントを制限することができる。
【００８０】
本発明を実施するために使用される相同組換え技術は当業者に公知である。例えば［Ｐｏｔｅｅｔｅ，Ａ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２００１，２０１（１）：９−１４；Ｋｕｚｍｉｎｏｖ，Ａ．ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ，２００１，９８（１５）：８２９８−３０５］に記載されている。
【００８１】
従って、バクテリオファージの標的蛋白質をコードする遺伝子を改変することが可能なＤＮＡ構築物により宿主細菌を形質転換することが好ましく、前記構築物は標的蛋白質をコードする遺伝子の全部又は一部のランダムに突然変異させたコピーに対応するインサートを含む。
【００８２】
このインサートは上記ＰＣＲ法により作製することが好ましい。
【００８３】
本発明の方法による宿主細菌の形質転換段階は１回以上実施することが好ましい。標的蛋白質の各種遺伝子を改変するために複数のベクターを使用する場合には、逐次処理すること、即ちベクターを順次導入すると有利である。こうすると、各段階で形質転換された細菌を保存することが可能である。従って、最後に導入したベクターの代わりに新しいベクターを再導入するために前段階に戻ることが常に可能である。このため、宿主細菌に全ベクターを導入しなくてもベクターの多数の組み合わせを試験することができる。
【００８４】
形質転換段階後に、本発明の１個以上の構築物により形質転換された宿主細菌の１個以上のバンクが得られる。
【００８５】
このバンクの細菌は各々バクテリオファージの標的蛋白質の１個以上を異なる方法で相同組換えにより形質転換することが可能な構築物を潜在的に含む。
【００８６】
従って、本発明の１つの目的はバクテリオファージを感染させることが可能な上記ＤＮＡ構築物により形質転換された宿主細菌のバンクである。
【００８７】
宿主細菌のこのようなバンクは複製保存できるという利点がある。このようなバンクは上記組換えバクテリオファージの作製に有用な再生可能な中間産物を構成する。
【００８８】
３）形質転換された宿主細菌におけるバクテリオファージの感染と複製
選択されたバクテリオファージによる宿主細菌の感染段階はバクテリオファージをこの段階で改変させない限り、特に問題ない。感染は宿主細菌の指数増殖期中に約３０℃で開始することが好ましい。
【００８９】
次に、細菌におけるバクテリオファージのゲノムの複製段階中に、ランダムに作製されたオリゴヌクレオチドを含む遺伝子とバクテリオファージのゲノム内に存在する遺伝子の相同領域間で相同組換えを実施することができる。
【００９０】
この複製段階はバクテリオファージによる宿主細菌の感染直後に開始する。
【００９１】
本発明の好ましい１態様によると、約４０から４５℃の熱ショックを与えると同時に形質転換宿主細菌の培養液にバクテリオファージを導入する。この温度を５から１５分間、好ましくは１２から１５分間の限定時間維持し、相同組換えを活性化させる。特に熱ショックの場合に相同組換えを所定の温度条件に調整することが可能なＭｉｎｉ−λベクターにより宿主細菌を形質転換することが好ましく、相同組換えは複製サイクルと同等以下の時間実施される。次に、相同組換えを著しく生じにくい約３０℃の常温の培養液に宿主細菌を移す。この約３０℃での２回目の培養時間は約２５分間、又は１複製サイクルに等価の時間とする。
【００９２】
本発明の方法の特に革新的な態様は２回目の培養時間後、平均して１複製サイクル後、好ましくはバクテリオファージの２回目の複製サイクルが生じる前にバクテリオファージを回収するという点にある。
【００９３】
この手順は、宿主細菌における新しい複製サイクルが生じる前に組換えバクテリオファージを回収するという利点がある。
【００９４】
このように１複製サイクルに制限すると、バクテリオファージは２回目の複製サイクルのために宿主細菌に再感染する時間がなくなる。従って、通常では宿主細菌を認識する能力又は宿主細菌に感染する能力を失った改変型バクテリオファージは後続再感染サイクル中に排除されるが、このようなバクテリオファージを回収することができる。
【００９５】
４）組換えバクテリオファージバンク
本発明の方法によると、非常に多様な組換えバクテリオファージの集合を得ることが可能である。
【００９６】
これらのバクテリオファージは本発明のバクテリオファージバンクを形成する。
【００９７】
従って、本発明の組換えバクテリオファージバンクは標的蛋白質をコードする少なくとも１個の遺伝子の各種コピーを含むポリヌクレオチド変異体から構成され、前記遺伝子はランダムに作製されたオリゴヌクレオチド配列の挿入を含む。
【００９８】
各種コピーをバクテリオファージに含む前記遺伝子は標的蛋白質ＧＰ１２をコードすることが好ましい。
【００９９】
このバンクを構成するバクテリオファージは更に、複数の標的蛋白質をコードする複数の遺伝子の各種コピーを含むことができ、前記遺伝子はランダムに作製されたオリゴヌクレオチド配列の挿入を含む。これらの各種遺伝子は同一バクテリオファージ内又は同一バンクの各種バクテリオファージ内で改変することができる。バクテリオファージバンクを構成する各バクテリオファージ内で複数の標的遺伝子を改変することが好ましい。改変型標的蛋白質はＧＰ１２、ＧＰ３６、ＧＰ３７、ＧＰ３８又はその相同蛋白質であることが好ましい。回収されるバクテリオファージ数を決定するのは形質転換宿主細菌数であるので、本発明のバクテリオファージバンクが最大限多数の異なるバクテリオファージに対応するためには、十分な数の形質転換宿主細菌を使用する必要がある。
【０１００】
この数が十分であるならば、本発明のバクテリオファージバンクは最低で同一バクテリオファージの少なくとも１０３個、好ましくは１０５個、より好ましくは１０８個の異なる変異体を含み、前記変異体はその標的蛋白質の少なくとも１個の配列が相違する。
【０１０１】
従って、本発明の方法はバクテリオファージにより発現される標的蛋白質の多様性を増加し、組換えバクテリオファージ、特に連続組換えサイクル中に宿主細菌内で複製されないもの又は迅速に複製されないものが排除されないようにすることを第１の目的とする。
【０１０２】
本発明のバンクにおけるバクテリオファージの多様性は単純な計数計算により立証することができる。
【０１０３】
例えば、好ましくは
−少なくとも１２ヌクレオチドのランダム配列から構成される少なくとも３個のオリゴヌクレオチドの挿入により標的蛋白質をコードする３個の遺伝子が改変され；
−ヌクレオチド配列の１／３が標的蛋白質のレベルでポリペプチド修飾を受け；
−４個の塩基（Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇ）うちの３個のみが元の蛋白質に対して突然変異を生じることができると仮定するならば、
ポリペプチドレベルで最低３２４通りの突然変異の可能性が得られ、約２．８×１０１１個の潜在的に異なるバクテリオファージ数に相当する。
【０１０４】
本発明は特に標的細菌に感染してこの細菌で複製することが可能な本発明のバクテリオファージバンクに由来する単離型組換えバクテリオファージに関する。
【０１０５】
このようなバクテリオファージは、
ｉ）上記のように、バクテリオファージの標的蛋白質をコードする少なくとも１個の遺伝子にランダムに配列を作製されたオリゴヌクレオチドを導入する段階と；
ｉｉ）段階ｉ）により得られた遺伝子改変型バクテリオファージを既知又は未知一致度の細胞と接触させる段階と；
ｉｉｉ）段階ｉｉ）で接触させたバクテリオファージのうちで前記既知又は未知一致度の細胞に感染することが可能な少なくとも１個のバクテリオファージを選択する段階に従って処理することにより取得することができる。
【０１０６】
本発明により既知又は未知一致度の細菌に感染することが可能な組換えバクテリオファージの選択を容易にするためには、蛍光又は発光により検出可能なバクテリオファージを利用すると有利である。
【０１０７】
この点で、宿主細菌に感染させるために使用されるバクテリオファージは発光又は蛍光蛋白質をコードする遺伝子の導入により蛍光性に予め改変されたバクテリオファージ自体とすることができる。
【０１０８】
本発明の好ましい１態様によると、バクテリオファージは例えばＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質）等の発光又は蛍光蛋白質と融合したキャプシド蛋白質を含む。
【０１０９】
バクテリオファージのキャプシドのＨｏｃ蛋白質［Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＰ０４９７９３］又はその一部をこの発光又は蛍光蛋白質と融合することが好ましい。この融合は一般にバクテリオファージの認識性又は細菌接着性に何ら影響しない。蛍光蛋白質を介在させると、感染により多数のバクテリオファージを保持する細菌の位置を突き止めることができる。バクテリオファージがその場所に集中すると、当業者に公知の測定機器により検出可能な蛍光レベルに達する。これらの改変型バクテリオファージは細菌を固体培地で平板培養する場合に感染性バクテリオファージをスクリーニングするために特に有用であることが判明した。
【０１１０】
本発明は更に本発明の組換えバクテリオファージから抽出されるか又は前記バクテリオファージに由来するＤＮＡから翻訳された改変型標的蛋白質に関する。
【０１１１】
本発明はバクテリオファージの改変型標的蛋白質を取得するための方法として、本発明の組換えバクテリオファージを利用することを特徴とする任意方法にも関する。
【０１１２】
５）取得された組換えバクテリオファージの利用
本発明のバクテリオファージバンクは既知又は未知の細菌を防除するために使用することができる。実際に、バンクに存在する各種標的蛋白質をもつ組換えバクテリオファージの多様性は高く、これらのバクテリオファージの１個が既知又は未知の細菌に感染する確率は有意に非ゼロである。
【０１１３】
未知の細菌とは本発明の趣旨ではまだ特性決定されていない細菌、又は少なくとも例えばそのアンチバイオグラムを作成できるようにするために十分には特性決定されていない細菌である。有効な抗生物質が存在しない新興細菌や、その存在が立証されていない細菌でもよい。
【０１１４】
本発明のバクテリオファージバンクは物体の表面又は生体内で発生することが可能な既知又は未知の細菌に対して予防的に利用できるという利点がある。
【０１１５】
従って、本発明はバクテリオファージの標的蛋白質をコードする１個以上の遺伝子にランダムに作製されたオリゴヌクレオチドを挿入することにより改変されたバクテリオファージを含むバクテリオファージバンクを利用することを特徴とする殺菌方法に関する。
【０１１６】
本発明の別の目的は本発明のバクテリオファージバンクを含有する固体又は液体組成物、例えば除菌したい表面に噴霧することが可能な散剤に関する。
【０１１７】
好ましい１適用例は本発明のバクテリオファージバンクによる空調装置、特に空冷システムの処理である。
【０１１８】
このような組成物は特に細菌感染症を予防又は治療するため、より詳細には気道又は皮膚疾患を治療するために、医薬品として利用することもできる。
【０１１９】
所定細菌に感染することが可能であるとみなされる本発明の組換えバクテリオファージは上記用途の１種で単独利用することができる。
【０１２０】
本発明の好ましい１態様によると、本発明の組換えバクテリオファージはこのバクテリオファージが感染することが可能な既知又は未知の細菌の検出及び／又は同定用参照バクテリオファージとして利用することができる。
【０１２１】
参照バクテリオファージとは、本発明の趣旨では、検出又は診断ツールとして利用できるように、所定型の細菌を標的にできるようにしたバクテリオファージである。
【０１２２】
本発明の組換えバクテリオファージは一般に培養し易い実験室細菌株を使用して得られる。従って、逆に実験室条件下では培養しにくい細菌に対して有用であると思われる。
【０１２３】
従って、本発明の組換えバクテリオファージは診断法、例えば細菌感染症の検査対象である患者に由来する検体と前記バクテリオファージを接触させる段階を含む方法で利用することができる。
【０１２４】
好ましい１態様によると、バクテリオファージは蛍光又は発光性であるため、特にそれぞれのバクテリオファージにより細菌を追跡できるという点で、感染の進行をリアルタイムで監視することが可能である。
【０１２５】
上記利用及び方法は新興又は耐性細菌を検出又は防除するために緊急事態で特に有用である。
【０１２６】
以下の実施例は本発明の例証を目的とし、その範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１２７】
バクテリオファージＴ４のｇｐ１２、ｇｐ３７及びｇｐ３８の変異体の配列の作製
以下、ｇｐ１２に使用する手順を記載するが、当業者はｇｐ３７やｇｐ３８等の本発明の標的蛋白質をコードする他の遺伝子の改変にも容易に適用することができる。
【０１２８】
ステップ１：ｇｐ１２遺伝子の作製
ｇｐ１２遺伝子は、
ｇｐ１２Ｆ ５’−ＴＧＡＧＴＡＡＴＡＡＴＡＣＡＴＡＴＣＡＡＣＡＣＧ（配列番号２）、及び
ｇｐ１２Ｒ ５’−ＴＧＡＴＴＣＴＴＴＴＡＣＣＴＴＡＡＴＴＡＴＧＴＡＣ（配列番号３）
をプライマーとして使用することにより、バクテリオファージ溶解液の濃縮培養液（上記参照）から得られた野生型Ｔ４のゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅する。
【０１２９】
分取アガロースゲルで精製後、ｇｐ１２の受容体結合ドメインに対応するコーディング領域に点突然変異と挿入を導入する目的で、ＰＣＲ産物（ｇｐ１２Ａ）をエラープローンＰＣＲ反応の鋳型として使用する（図５参照）。
【０１３０】
ステップ２：受容体結合ドメインへのランダム突然変異の導入
ランダムポリメラーゼエラーを誘導するようにＭｎ２の存在下で４回１組のネステッドＰＣＲ（各４０サイクル）を実施する。
【０１３１】
反応容量１００μｌとし、１×反応緩衝液中、それぞれ終濃度４００ｎｇ及び３０ｐｍｏｌの鋳型及びプライマーと、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ及びｄＧＴＰ（各）、１ｍＭ ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ（各）、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．７ｍＭ ＭｎＣｌ２及びＤＮＡ−ポリメラーゼＴａｑ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）５Ｕを使用してエラープローンＰＣＲを実施する。ＰＣＲは９６℃で２分後に、９５℃で１分、５６℃で１分及び７２℃で２分を３０サイクルと、７２℃で７分間最終伸長反応を実施する。
【０１３２】
１回目の反応（Ｐ１−１）はプライマーとして、
ｐ１２ＮＦ１Ｆ ５’−ＴＣＡＡＧＧＴＡＡＣＣＧＣＡＴＣＧＴＡＡＣ（配列番号４）
ｐ１２ＮＦ２Ｒ ５’−ＡＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＡＴＧＴＣＡＧ（配列番号５）
を使用する。
【０１３３】
２回目の反応（Ｐ２−１）はプライマーとして、
ｐ１２ＮＦ２Ｆ ５’−ＴＧＣＣＡＴＧＧＴＧＧＡＡＣＴＧＴＴＣＡ（配列番号６）
ｐ１２ＮＦ３Ｒ ５’−ＣＡＣＣＴＡＡＴＣＴＡＧＧＴＴＴＡＣ（配列番号７）
を使用する。
【０１３４】
３回目の反応（Ｐ３−１）はプライマーとして、
ｐ１２ＮＦ３Ｆ ５’−ＣＴＧＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＣＴＴＴ（配列番号８）
Ｐ１２ＮＦ４Ｒ ５’−ＡＴＧＴＴＴＡＴＧＡＴＡＡＧＡＣＡＴ（配列番号９）
を使用する。
【０１３５】
４回目の反応（Ｐ４−１）はプライマーとして、
Ｐ１２ＮＦ４Ｆ ５’−ＧＴＡＡＡＣＣＴＡＧＡＴＴＡＧＧＴＧ（配列番号１０）
Ｐ１２ＮＦ５Ｒ ５’−ＴＣＡＴＴＣＴＴＴＴＡＣＣＴＴＡＡＴＴＡＴ（配列番号１１）
を使用する。
【０１３６】
これらの反応産物は各々２個の他の反応産物と部分的にオーバーラップしており、使用するプライマーは蛋白質ｇｐ１２で保存された定常領域に対応する。これらのドメインは作製される最終突然変異遺伝子構造で忠実に保存されていなければならない。しかし、エラープローンＰＣＲ反応により作製されるフラグメントのうちには、これらの領域に完全に突然変異誘発されているものもある。無傷の領域を維持するためには、保存ドメインを保持したフラグメントのみを選択的に増幅することを目的とする高忠実度ＰＣＲを上記各産物に実施する必要がある。
【０１３７】
ステップ３：所望フラグメントの選択的増幅
これは各々２５サイクルからなる２組の高忠実度ＰＣＲ反応により実施する。
【０１３８】
反応容量５０μｌとし、１×ｐｆｕ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ９．０，１０ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＭｇＳＯ４，６ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４，０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，０．１ｍｇ／ｍｌ ＳＡＢ）に２００μＭ ｄＮＴＰとポリメラーゼｐｆｕ（Ｐｒｏｍｅｇａ）５Ｕを加え、それぞれ終濃度２５０ｎｇ及び４０ｐＭの鋳型及びプライマーを使用して高忠実度ＰＣＲを実施する。ＰＣＲ条件は、９４℃で２０秒、４５℃で１５秒及び７２℃で３０秒を２０サイクル繰り返す。
【０１３９】
第１組の反応（Ｐ１−２からＰ４−２）では、５’末端をビオチン化した対応する「Ｆ」プライマー（例えば：ｐ１２ＮＦ１Ｆ）を使用することにより、上記各ＰＣＲ産物のアリコート（約２５０ｎｇ）を増幅する。これは、長さが実質的に等しいためにゲル電気泳動により分離できない増幅不能な鋳型（突然変異保存ドメイン）から所望産物を分離するために必要である。
【０１４０】
各反応の産物を次に（過剰のプライマーを除去するために）サイズ排除ミニカラムに通し、ストレプトアビジンビーズで個々に精製し、結合用緩衝液で洗浄し、溶出、沈殿させ、ｄｄＨ２Ｏに再懸濁する。
【０１４１】
第２組の反応では、精製した反応産物Ｐ１−２のアリコートを等量の反応産物Ｐ２−２と混合する。前記反応産物は共通のプライミング部位Ｆ２−Ｒ１及びＦ３−Ｒ２をもつ。従って、反応産物Ｐ２−２の「−」鎖は反応産物Ｐ１−２の「＋」鎖のプライマーとして使用され、Ｐ１−２の内部プライミング部位Ｆ２−Ｒ１でポリメラーゼによる伸長が開始する。この保存部位が有意に突然変異されている反応産物Ｐ１−２では伸長できない。
【０１４２】
同様に、反応産物Ｐ１−２の「＋」鎖は反応産物Ｐ２−２の「−」鎖のプライマーとして使用され、Ｐ２−２の内部Ｆ３−Ｒ２プライミング部位でポリメラーゼによる伸長が開始する。この保存部位が有意に突然変異されている反応産物Ｐ２−２では伸長できない。
【０１４３】
増幅に成功したＰＣＲ産物（ＰＡ−１）は４個の保存ドメイン（Ｆ１ ＋ Ｆ２−Ｒ１ ＋ Ｆ３−Ｒ２ ＋ Ｆ４−Ｒ３）の各々が非突然変異状態に維持されたフラグメントＰ１−２及びＰ２−２の融合体に対応する。
【０１４４】
同様の混合物を反応産物Ｐ３−２及びＰ４−２から作製する。これらの反応では、伸長の成功は無傷の内部保存部位Ｆ４−Ｒ３（Ｐ３−２）及びＦ５−Ｒ４（Ｐ４−２）に基づき、得られるＰＣＲ産物（ＰＡ−１及びＰＢ−１）は４個の保存ドメイン（Ｆ３−Ｒ２ ＋ Ｆ４−Ｒ３ ＋ Ｆ５−Ｒ４ ＋ Ｒ５）の各々が非突然変異状態で得られたフラグメントＰ３−２及びＰ４−２の融合体に対応する。
【０１４５】
融合ＰＣＲ産物の寸法は個々の鋳型の寸法と著しく異なるので、得られた産物を分取ゲル電気泳動により精製する。
【０１４６】
この第２組のＰＣＲ反応の収率を増加させるためには、伸長プロトコールを以下のように改変することができる：
反応混合物中の産物Ｐ１−２及びＰ２−２と、Ｐ３−２及びＰ４−２のみで１０サイクル。
【０１４７】
反応を中断し、プライマーｐ１２ＮＦ１Ｆ及びｐ１２ＮＦ３Ｒ各５０ｎｇを混合物ＰＡ−１に加え、プライマーｐ１２ＮＦ３Ｆ及びｐ１２ＮＦ５Ｒ各５０ｎｇを混合物ＰＢ−１に加えた後、ＰＣＲ反応を更に１５サイクル続ける。
【０１４８】
ステップ４：ｇｐ１２の突然変異アンカードメインの再構成
精製後、上記各種突然変異を導入したユニークなフラグメントにおいてｇｐ１２の全長受容体結合ドメインを再構成する目的で３０サイクルからなる高忠実度ＰＣＲ反応で産物ＰＡ−１及びＰＢ−１の等量アリコートを併用する。
【０１４９】
この場合、前回の反応と同様に、産物ＰＡ−１は産物ＰＢ−１の伸長プライマーとして使用され、産物ＰＢ−１は産物ＰＡ−１の伸長プライマーとして使用される。
【０１５０】
その寸法は個々の鋳型の寸法と著しく異なるので、最終融合ＰＣＲ産物（ｇｐ１２ＢＤ−Ｆｕ）をゲル電気泳動により精製する。
【０１５１】
収率を増加させるためには、反応混合物中の産物Ｐ１−２及びＰ２−２と、Ｐ３−２及びＰ４−２のみで１５サイクルからなる反応を実施することにより、伸長プロトコールを改変することができる。反応を中断し、プライマーｐ１２ＮＦ１Ｆ及びｐ１２ＮＦ５Ｒ各５０ｎｇを混合物に加えた後、ＰＣＲ反応を更に１５サイクル続ける。
【０１５２】
精製後、再構成したｇｐ１２の受容体結合ドメインのアリコート（約２５０ｎｇ）を４回１組の新規エラープローンＰＣＲ反応で鋳型として使用した後、上記のように選択的増幅とドメインの再構成を行う。
【０１５３】
しかし、各融合段階（上記段階３及び４）で各サブドメインに個々に導入される可能な全突然変異は再構成された最終受容体系列ドメインにランダムに混入されるので、保存ドメインに悪影響を与えずに実施可能な突然変異誘発サイクル数には限界がある。必要な選択的増幅段階を考慮すると、４連続サイクルを越える場合には新規に導入される全突然変異が保存ドメインに悪影響を与える確率又は突然変異していない元のＴ４配列に戻る復帰突然変異を導入する確率が高いと考えられる。
【０１５４】
ステップ５：ｇｐ１２遺伝子全体の改変コピーの再構成
１）受容体結合ドメインの上流のｇｐ１２のセグメントの増幅
上記のようにＰＣＲにより作製したｇｐ１２遺伝子（ｇｐ１２Ａ）を鋳型とし、プライマー
ｇｐ１２Ｆ ５’−ＴＧＡＧＴＡＡＴＡＡＴＡＣＡＴＡＴＣＡＡＣＡＣＧ（配列番号１２）、及び
ｇｐ１２ＡＲ ５’−ＧＴＴＡＣＧＡＴＧＣＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴ（配列番号１３）
と共に使用する。
【０１５５】
次に、得られた増幅産物を分取アガロースゲルで精製し、沈殿後、ｄｄＨ２Ｏに再懸濁する。
【０１５６】
２）ｇｐ１２の突然変異結合ドメインの増幅
ＰＣＲ産物（ｇｐ１２Ｂ）のアリコート（約５００ｎｇ）を等量の再構成したｇｐ１２の受容体結合ドメイン（ｇｐ１２ＢＤ−Ｆｕ）と共に高忠実度ＰＣＲ反応で使用する。なお、これらの２種類の産物は２０ｐｂしかオーバーラップしない。従って、ＰＣＲ反応条件はこの点を考慮して改変する必要がある。
【０１５７】
改変ＰＣＲ条件：Ａ）９６℃で３０分→９４℃で１分、４５℃で１０秒を５サイクル→Ｂ）９４℃で１分と５０℃で２０秒を５サイクル→Ｃ）９４℃で１分、５０℃で３０秒を５サイクル→最後にＤ）９４℃で１分、５５℃で１分、７２℃で５秒を１５サイクル。
【０１５８】
収率を増加させるためには、上記サブステップＤで反応を中断し、プライマーｇｐ１２Ｆ及びｐ１２ＮＦ５Ｒを混合物に導入することができる。次に反応を再開し、完了まで実施する。
【０１５９】
最終産物（ｇｐ１２−Ｍｕｔ）を分取アガロースゲルで精製し、沈殿させ、その使用時までｄｄＨ２Ｏに再懸濁する。
【０１６０】
ステップ６：得られたＰＣＲ産物ｇｐ１２−Ｍｕｔのシーケンシングによる検証
ドメインＤ１及びＤ２を無傷に保存しながら、確かに突然変異がランダムにｇｐ１２に導入されていることを検証するために、アガロースゲルで精製したＰＣＲ産物を自動シーケンシンサーによりシーケンシングする。シーケンシングはｇｐ１２（配列番号１）のヌクレオチド１０８９から１１１０（図６Ａ）と１１９５から１２１２（図６Ｂ）にそれぞれ対応する２部分で実施する。典型的に得られたシーケンシングプロファイルを図６に示す。そのプロファイルをｇｐ１２の初期配列のプロファイルと比較すると、ｇｐ１２の予想プロファイルには多数の付加ピークが加わっていることが認められる。これらの付加ピークはＰＣＲ法により配列ｇｐ１２に導入された突然変異が高頻度であることを反映している。これらのピークはドメインＤ１のレベルには認められず、このドメインがｇｐ１２に対してその配列一致度を保存していることが確認される。
【０１６１】
相同組換え用代替ベクターへの突然変異ｇｐ１２−Ｍｕｔのクローニング
上記手順により、ｇｐ１２と同様にＴ４の突然変異遺伝子ｇｐ３７及びｇｐ３８も作製することができた。
【０１６２】
従って、以下の手順の目的は親バクテリオファージと異なる宿主標的親和性をもつＴ４の子孫を作製するように、バクテリオファージＴ４のゲノムへの相同組換えによる導入を助長するようにＴ４のこれらの変異遺伝子を導入することである。
【０１６３】
この目的のために、上記のように作製した突然変異遺伝子を代替ベクター（遺伝子毎に異なるベクター）に導入する必要がある。本例では、突然変異遺伝子の各々をクローニングするためにベクターｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＡＤ１８−Ｋ及びＲＲ１を使用する。
【０１６４】
選択したベクター（例えばｇｐ１２Ｍｕｔのクローニング用のｐＡＣＹＣ１８４）をＳｍａＩ部位のレベルで切断し、精製し、ｄｄＨ２Ｏ ２０μｌに再懸濁し、ＰＣＲ産物ｇｐ１２Ｍｕｔと１：３の比で混合する。ライゲーション後、ＤＮＡを精製し、ｄｄＨ２Ｏに再懸濁し、「エレクトロコンピテント」細胞ＤＫ８（ＡＴＣＣ４７０３８）に形質転換する。このベクターはクロラムフェニコール耐性遺伝子（Ｃｈｌ）をもつ。従って、エレクトロポレーションと１時間の回復時間後に、クロラムフェニコール１７０μｇ／ｍｌを加えたＬＢ培地１０ｍｌに細胞を移し、常時曝気下に３０℃で４時間培養する。次に細胞をＬＢ培地プレート＋Ｃｈｌに撒き、一晩３０℃で培養する。挿入セグメントｇｐ１２Ｍｕｔの存在をＰＣＲにより検証するために数個のコロニーを採取し、濃縮細胞培養液（ＤＫ８−ｐ１２Ｃ）を調製するために数個の陽性コロニーをＬＢ培地＋Ｃｈｌで培養する。
【０１６５】
宿主細菌への突然変異遺伝子ｇｐ３７及びｇｐ３８の導入
ＤＫ８−ｐ１２Ｃの新鮮な一晩培養液を使用してエレクトロコンピテント細胞を作製する。
【０１６６】
ベクターｐＢＡＤ１８−ＫをＳｍａＩ部位のレベルで切断し、精製し、ｄｄＨ２Ｏ ２０μｌに再懸濁し、ＰＣＲ産物ｇｐ３７Ｍｕｔと１：３の比で混合する。ライゲーション後、ＤＮＡを精製し、ｄｄＨ２Ｏに再懸濁し、「エレクトロコンピテント」細胞ＤＫ８−ｐ１２Ｃに形質転換する。
【０１６７】
この場合に使用するベクターはカナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎ）をもつ。従って、エレクトロポレーションと１時間の回復時間後に、クロラムフェニコール１７０μｇ／ｍｌとカナマイシン５０μｇ／ｍｌを加えたＬＢ培地１０ｍｌに移し、常時曝気下に３０℃で４時間培養する。次に細胞をＬＢ培地プレート＋Ｃｈｌ＋Ｋａｎに撒き、一晩３０℃で培養する。挿入セグメントｇｐ１２Ｍｕｔ及びｇｐ３７Ｍｕｔの存在をＰＣＲにより検証するために数個のコロニーを採取し、濃縮細胞培養液（ＤＫ８−ｐ１２Ｃ−ｐ３７Ｋ）を調製するために数個の陽性コロニーをＬＢ培地＋Ｃｈｌ＋Ｋａｎで培養する。
【０１６８】
ＤＫ８−ｐ１２Ｃ−ｐ３７Ｋの新鮮な一晩培養液を使用してエレクトロコンピテント細胞を作製する。ベクターＲＲ１をＳｍａＩ部位のレベルで切断し、精製し、ｄｄＨ２Ｏ ２０μｌに再懸濁し、ＰＣＲ産物ｇｐ３７Ｍｕｔと１：３の比で混合する。ライゲーション後、ＤＮＡを精製し、ｄｄＨ２Ｏに再懸濁し、「エレクトロコンピテント」細胞ＤＫ８−ｐ１２Ｃ−ｐ３７Ｋに形質転換する。この場合に使用するベクターはアンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐ）をもつ。従って、エレクトロポレーションと１時間の回復時間後に、クロラムフェニコール１７０μｇ／ｍｌ＋カナマイシン５０μｇ／ｍｌ＋アンピシリン６０μｇ／ｍｌを加えたＬＢ培地１０ｍｌに移し、常時曝気下に３０℃で４時間培養する。次に細胞をＬＢ培地プレート＋Ｃｈｌ＋Ｋａｎ＋Ａｍｐに撒き、一晩３０℃で培養する。挿入セグメントｇｐ１２Ｍｕｔ、ｇｐ３７Ｍｕｔ及びｇｐ３８Ｍｕｔの存在をＰＣＲにより検証するために数個のコロニーを採取し、濃縮細胞培養液（ＤＫ８−ｐ１２Ｃ−ｐ３７Ｋ−Ｐ３８Ａ）を調製するために数個の陽性コロニーをＬＢ培地＋Ｃｈｌ＋Ｋａｎ＋Ａｍｐで培養する。
【０１６９】
次に、非常に有効な組換え能を示すことが可能な宿主を構築する。
【０１７０】
大腸菌「ｍｉｎｉ−λ」宿主細菌の構築
ｒｅｃＡ＋又はｒｅｃＡ−バックグラウンドでドナーＤＮＡの有効な組換えを得るために、λの温度感受性リプレッサーｃｌの制御下の組換え遺伝子ｅｘｏ、ｂｅｔ及びｇａｍをもつプロファージλを含む大腸菌宿主を作製する。遺伝子ｅｘｏ、ｂｅｔ及びｇａｍは４２℃で容易に活性化し、３２℃で阻害することができる。λの機能を活性化させる時間を５分間に短縮すると、細胞は組換え能が高まり、線状ＤＮＡを破壊せずに吸収する。λ Ｇａｍは大腸菌のヌクレアーゼＲｅｃＢＣＤによる線状ＤＮＡ攻撃を抑制し、ＥｘｏとＢｅｔａはこの線状ＤＮＡの組換え活性を生じる。更に重要な点として、この組換えは線状ＤＮＡから構成される基質の末端の３０から５０ｐｂに限定されたＤＮＡ相同度で有効である。
【０１７１】
λ ｃｌ８５７のＤＮＡを鋳型として使用し、ａｔｔＰ−ｃｒｏ領域に由来するＤＮＡのＰＣＲ増幅用プライマーとしてオリゴヌクレオチド５’ＧＴＡＴＧＣＡＴＧＣＴＧＧＧＴＧＴＧＧ（ＭλＲｆ）及び５’ＣＧＣＡＣＴＣＴＣＧＡＴＴＣＧＴＡＧＡＧＣＣＴＣＧ（ＭλＲｒ）を使用する。
【０１７２】
一旦プロファージλがＰＣＲにより作製されると、例えばＬａｃＺによる選択によりプロファージλを低コピー数プラスミドｐＦＮ４７６（ＡＴＣＣ８６９６２）にクローニングすることが可能になる。
【０１７３】
ベクターｐＦＮ４７６をＳｍａＩ部位（平滑末端）のレベルで切断し、精製し、ｄｄＨ２Ｏ ２０μｌに再懸濁し、プロファージλのＰＣＲ産物と１：３の比で混合する。ライゲーション後、ＤＮＡを精製し、ｄｄＨ２Ｏに再懸濁し、「エレクトロコンピテント」細胞ＤＫ８−ｐ１２Ｃ−ｐ３７Ｋ−ｐ３８Ａに形質転換する。回復後、細胞をＬＢ培地プレートＸ−ｇａｌ＋Ｃｈｌ＋Ｋａｎ＋Ａｍｐ（上記参照）に撒き、３０℃でインキュベートする。
【０１７４】
プロファージλの存在をＰＣＲにより検証するために数個のブランクコロニーを選択する。次に、後続操作で使用する濃縮細胞培養液（ＤＫ８−Ｔ４Ｍｕｔ−λ）を調製するためにプロファージλの陽性コロニー１個をＬＢ培地＋Ｃｈｌ＋Ｋａｎ＋Ａｍｐで一晩３０℃にて培養する。
【０１７５】
この段階で、形質転換宿主は高温でλにより誘導可能であり、ｌａｃＺ陽性であり、相同組換えにすぐに利用可能なＴ４の突然変異遺伝子ｇｐ１２、ｇｐ３７及びｇｐ３８のコピーを含む。
【０１７６】
宿主範囲を拡大したバクテリオファージＴ４の子孫の作製
ＤＫ８−Ｔ４Ｍｕｔ−λ細胞の新鮮な一晩培養液をＬＢ培地＋Ｃｈｌ＋Ｋａｎ＋Ａｍｐで３０℃にて調製する。
【０１７７】
バクテリオファージの添加前に細胞が指数増殖期に入るように確保するように、ＬＢ培地＋Ｃｈｌ＋Ｋａｎ＋Ａｍｐ １０ｍｌ当たり一晩培養液の細胞０．０５ｍｌ以下の容量でＴ４感染のための培養を開始する。
【０１７８】
曝気を改善するために、これらの培養液は非気密性の栓をした枝付き２５０ｍｌ三角フラスコに入れ、３０℃の振盪機の水浴中で培養する。
【０１７９】
ＬＢ培地＋Ｃｈｌ＋Ｋａｎ＋Ａｍｐ中の細胞２５０ｍｌを細胞３×１０８個／ｍｌの密度で３０℃にて振盪培養する。
【０１８０】
次に指数増殖期の細胞の１０ｍｌアリコートを４２℃に予熱したＬＢ培地＋Ｃｈｌ＋Ｋａｎ＋Ａｍｐ ４０ｍｌに移し、常時曝気下に４２℃で厳密に１５分間インキュベートする。トリプトファンを０．０２ｍｇ／ｍｌの濃度で加えた後、細胞１個当たり粒子約１０個の多重度でバクテリオファージＴ４を加える。培養液を３０℃の水浴に移し、厳密に２５分間増殖を続ける。
【０１８１】
この場合の目的は第１世代の子孫を単離し、この第１世代のバクテリオファージ子孫が繁殖性になる前に増殖を停止させることである。
【０１８２】
バクテリオファージの子孫の回収
５０００ｒｐｍで５分間遠心することにより細胞を採取し、上清を回収し、クロロホルム数滴を加え、混合物を再び１０分間６０００ｒｐｍで遠心する。５倍濃縮緩衝液を使用することにより、クロロホルムを除く上清を１×ＳＭ緩衝液の濃度（１０ｍＭ ＭｇＳＯ４，１００ｍＭ ＮａＣｌ，０．０１％ゼラチン及び５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７，５］）に調整し、分析時まで４℃で保存する。
【０１８３】
ペレットとして集めた細胞を０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ８．０）＋２５％蔗糖の溶液８ｍｌに再懸濁する。リゾチーム（５ｍｇ／ｍｌ）の１．６ｍｌアリコートを加え、混合物を５分間０℃でインキュベートする。０．２Ｍ ＥＤＴＡ溶液３．２ｍｌを加え、混合物を更に１５分間０℃でインキュベートする。細胞溶解液を１０倍濃縮緩衝液により５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１００ｍＭ ＭｎＣｌ２に調整し、１５℃で平衡化し、Ｄｎａｓｅ１（Ｓｉｇｍａ）１０Ｕを加えて２時間インキュベートする。次に混合物を６０００ｒｐｍで１０分間遠心する。透明上清を注意深く分取し、１×ＳＭ緩衝液の濃度に調整し、上記のように保存する。
【０１８４】
宿主範囲拡大の検証
病原性細菌株（エルシニア種、サルモネラ種、大腸菌Ｏ１５７ Ｈ７、エンテロバクター・サカザキ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓａｋａｚａｋｉｉ）等）の培養液を調製する。
【０１８５】
次に３ｍｌアリコートに子孫の濃縮培養液１ｍｌを感染させ、撹拌下に３０℃でインキュベートする。感染直後とその後６０分間おきに培養液の濁度を比色分析により測定する。５時間以内に培養液の濁度が著しく低下した場合には、試験した宿主に感染することが可能な粒子がＴ４の組換え子孫に存在していると判断する。培養液にクロロホルム数滴を加え、濁度の明白な低下を引き起こした後に、培養液を５０００ｒｐｍで５分間遠心する。
【０１８６】
上清を回収し、自然界では野生型バクテリオファージＴ４により攻撃することができない被験細菌に特異的なバクテリオファージ粒子を生産するための感染物質として使用する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子改変型バクテリオファージバンクの作製方法であって、
ｉ）バクテリオファージの標的蛋白質をコードする少なくとも１個の遺伝子に、配列がランダムに作製されているオリゴヌクレオチドを挿入することが可能な少なくとも１個のＤＮＡ構築物により宿主細菌を形質転換する段階；
ｉｉ）段階ｉ）で形質転換した細菌に前記バクテリオファージを感染させる段階；
ｉｉｉ）段階ｉｉ）で感染させた細菌を、バクテリオファージが複製することができ、並びに前記バクテリオファージの標的蛋白質をコードする少なくとも１個の遺伝子にランダムに作製されたオリゴヌクレオチドの少なくとも一部を挿入できるような条件下に置く段階；
ｉｖ）前記感染宿主細菌で複製した組換えバクテリオファージを回収する段階
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
オリゴヌクレオチドの挿入が相同組換えにより実施されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
宿主細菌が大腸菌ＤＫ８株であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
段階ｉｖ）において、平均して形質転換宿主細菌におけるバクテリオファージの１複製サイクル後で２回目の複製サイクルが生じる前にバクテリオファージが回収されることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
形質転換宿主細菌に感染させるために使用されるバクテリオファージがＴファミリーのバクテリオファージ、好ましくはＴ４型バクテリオファージであることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
形質転換宿主細菌に感染させるために使用されるバクテリオファージが発光又は蛍光蛋白質をコードする遺伝子の導入により蛍光性に改変されたバクテリオファージ自体であることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
形質転換宿主細菌に感染させるために使用されるバクテリオファージが発光又は蛍光蛋白質と融合したキャプシド蛋白質をもつバクテリオファージであることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
発光又は蛍光蛋白質がバクテリオファージのキャプシドのＨｏｃ蛋白質又はその一部と融合されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ランダムな配列をもつオリゴヌクレオチドの挿入により遺伝子を改変するバクテリオファージの標的蛋白質がＧＰ１２、ＧＰ３６、ＧＰ３７及びＧＰ３８蛋白質又はその相同蛋白質から選択されることを特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ランダムな配列をもつオリゴヌクレオチドの挿入により遺伝子を改変するバクテリオファージの標的蛋白質がＧＰ１２蛋白質であることを特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
段階ｉ）において、前記バクテリオファージの遺伝子に挿入するために所定配列をランダムに突然変異させた前記バクテリオファージの前記標的蛋白質をコードする遺伝子の全部又は一部のコピーに対応するインサートを含むＤＮＡ構築物により宿主細菌を形質転換することを特徴とする請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項の方法に従って取得可能なバクテリオファージバンク。
【請求項１３】
組換えバクテリオファージバンクであって、前記バンクを構成するバクテリオファージが標的蛋白質をコードする少なくとも１個の遺伝子の各種コピーを含み、前記遺伝子がランダムに作製されたオリゴヌクレオチド配列の挿入を含むことを特徴とする組換えバクテリオファージバンク。
【請求項１４】
各種コピーをバクテリオファージに含む前記遺伝子が標的蛋白質ＧＰ１２をコードすることを特徴とする請求項１３に記載のバクテリオファージバンク。
【請求項１５】
組換えバクテリオファージバンクであって、前記バンクを構成するバクテリオファージが標的蛋白質をコードする種々の遺伝子の各種コピーを含み、前記遺伝子がランダムに作製されたオリゴヌクレオチド配列の挿入を含むことを特徴とする組換えバクテリオファージバンク。
【請求項１６】
前記標的蛋白質がＧＰ１２、ＧＰ３６、ＧＰ３７、ＧＰ３８又はその相同物である蛋白質から選択されることを特徴とする請求項１２又は１５に記載の組換えバクテリオファージバンク。
【請求項１７】
標的蛋白質をコードする前記遺伝子が同時に改変されていることを特徴とする請求項１２、１５又は１６のいずれか一項に記載の組換えバクテリオファージバンク。
【請求項１８】
同一バクテリオファージの少なくとも１０３個、好ましくは少なくとも１０５個、より好ましくは少なくとも１０８個の変異体を含み、前記変異体はその標的蛋白質の少なくとも１個の配列が相違することを特徴とする請求項１２から１６のいずれか一項に記載のバクテリオファージバンク。
【請求項１９】
バクテリオファージの標的蛋白質をコードする遺伝子を改変するためのＤＮＡ構築物であって、標的蛋白質をコードする前記遺伝子の全部又は一部のランダムに突然変異させたコピーに対応するインサートを含むことを特徴とする前記ＤＮＡ構築物。
【請求項２０】
５’及び３’末端を２個のセグメントＦ１及びＦ２により規定され、一致度を保存した少なくともＮ個の内部セグメントＤ１からＤＮ（ここで、Ｎは１以上の整数である。）を含む前記インサートが、
ｉ）ランダムに突然変異を導入しながら前記インサートの配列を増幅するように、それぞれセグメントＦ１及びＦ２のセンス及びアンチセンスプライマーである少なくとも２個のプライマーを使用して前記インサートの配列の全長にエラープローンＰＣＲを実施する段階；
ｉｉ）前記インサートのランダムに突然変異させたコピーに対応する得られた増幅産物を精製する段階；
ｉｉｉ）それぞれセンスプライマーとアンチセンスプライマーの対として少なくとも
−前記インサートの突然変異コピーの少なくともＦ１−ＤＮ領域を増幅するために、Ｆ１に対応するセンスプライマーと、ＤＮのアンチセンスプライマーと、
−Ｓの突然変異コピーの少なくともＤＮ−Ｆ２配列を増幅するために、ＤＮに対応するセンスプライマーと、Ｆ２のアンチセンスプライマー
を使用することにより、段階ｉｉ）で精製した増幅産物から出発して高忠実度ＰＣＲを実施する段階；
ｉｖ）段階ｉ）で突然変異させた前記インサートのうちでセグメントＤの配列がその一致度を保存しているセグメントＦ１−ＤＮ及びＤＮ−Ｆ２のコピーから構成される段階ｉｉｉ）で得られた増幅産物を精製する段階；
ｖ）Ｆ１及びＦ２の少なくとも１対のセンスプライマーとアンチセンスプライマーを使用することにより、段階ｉｖ）で得られた増幅産物から出発して高忠実度ＰＣＲを実施する段階；
ｖｉ）前記インサートのランダムに突然変異させたヌクレオチド配列のうちで少なくともセグメントＤＮの配列がその一致度を保存しているものに対応する段階ｖ）で得られたＰＣＲ産物を精製する段階
を含む方法を使用してＰＣＲにより得られることを特徴とする請求項１９に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２１】
請求項１９又は２０に記載のＤＮＡ構築物であって、
−宿主細菌における前記構築物の複製を可能にする領域
を更に含むことを特徴とするＤＮＡ構築物。
【請求項２２】
請求項１９から２１のいずれか一項に記載の複数のＤＮＡ構築物により形質転換された細菌から構成される宿主細菌バンク。
【請求項２３】
既知又は未知一致度の細胞を標的とすることが可能な遺伝子改変型バクテリオファージの選択方法であって、
ｉ）請求項１から１１のいずれか一項の方法に従って得られた遺伝子改変型バクテリオファージを既知又は未知一致度の細胞と接触させる段階と；
ｉｉ）前記既知又は未知一致度の細胞と接触させた組換えバクテリオファージのうちで前記細胞に感染することが可能な少なくとも１種の組換えバクテリオファージを選択する段階を含むことを特徴とする前記方法。
【請求項２４】
請求項１２から１８のいずれか一項に記載のバクテリオファージバンクを利用することを特徴とする非治療的殺菌方法。
【請求項２５】
治療剤としての請求項１１から１６のいずれか一項に記載のバクテリオファージバンク。
【請求項２６】
細菌感染症の防除又は予防用医薬の製造のための、請求項１２から１８のいずれか一項に記載の組換えバクテリオファージバンク又は請求項２３の方法に従って選択された少なくとも１種のバクテリオファージの使用。
【請求項２７】
既知又は未知細菌の参照用バクテリオファージを取得するための、請求項１２から１８のいずれか一項に記載の組換えバクテリオファージバンク又は請求項２３の方法に従って選択された少なくとも１種のバクテリオファージの使用。
【請求項２８】
細菌のインビトロ検出及び／又は同定用としての請求項１２から１８のいずれか一項に記載のバクテリオファージバンクの使用。
【請求項２９】
感染のインビトロ診断用としての請求項１１から１６のいずれか一項に記載のバクテリオファージバンクの使用。
【請求項３０】
請求項２３の方法に従って選択された少なくとも１種のバクテリオファージを含有する医薬組成物。
【請求項１】
遺伝子改変型バクテリオファージバンクの作製方法であって、
ｉ）バクテリオファージの標的蛋白質をコードする少なくとも１個の遺伝子に、配列がランダムに作製されているオリゴヌクレオチドを挿入することが可能な少なくとも１個のＤＮＡ構築物により宿主細菌を形質転換する段階；
ｉｉ）段階ｉ）で形質転換した細菌に前記バクテリオファージを感染させる段階；
ｉｉｉ）段階ｉｉ）で感染させた細菌を、バクテリオファージが複製することができ、並びに前記バクテリオファージの標的蛋白質をコードする少なくとも１個の遺伝子にランダムに作製されたオリゴヌクレオチドの少なくとも一部を挿入できるような条件下に置く段階；
ｉｖ）前記感染宿主細菌で複製した組換えバクテリオファージを回収する段階
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
オリゴヌクレオチドの挿入が相同組換えにより実施されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
宿主細菌が大腸菌ＤＫ８株であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
段階ｉｖ）において、平均して形質転換宿主細菌におけるバクテリオファージの１複製サイクル後で２回目の複製サイクルが生じる前にバクテリオファージが回収されることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
形質転換宿主細菌に感染させるために使用されるバクテリオファージがＴファミリーのバクテリオファージ、好ましくはＴ４型バクテリオファージであることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
形質転換宿主細菌に感染させるために使用されるバクテリオファージが発光又は蛍光蛋白質をコードする遺伝子の導入により蛍光性に改変されたバクテリオファージ自体であることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
形質転換宿主細菌に感染させるために使用されるバクテリオファージが発光又は蛍光蛋白質と融合したキャプシド蛋白質をもつバクテリオファージであることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
発光又は蛍光蛋白質がバクテリオファージのキャプシドのＨｏｃ蛋白質又はその一部と融合されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ランダムな配列をもつオリゴヌクレオチドの挿入により遺伝子を改変するバクテリオファージの標的蛋白質がＧＰ１２、ＧＰ３６、ＧＰ３７及びＧＰ３８蛋白質又はその相同蛋白質から選択されることを特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ランダムな配列をもつオリゴヌクレオチドの挿入により遺伝子を改変するバクテリオファージの標的蛋白質がＧＰ１２蛋白質であることを特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
段階ｉ）において、前記バクテリオファージの遺伝子に挿入するために所定配列をランダムに突然変異させた前記バクテリオファージの前記標的蛋白質をコードする遺伝子の全部又は一部のコピーに対応するインサートを含むＤＮＡ構築物により宿主細菌を形質転換することを特徴とする請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項の方法に従って取得可能なバクテリオファージバンク。
【請求項１３】
組換えバクテリオファージバンクであって、前記バンクを構成するバクテリオファージが標的蛋白質をコードする少なくとも１個の遺伝子の各種コピーを含み、前記遺伝子がランダムに作製されたオリゴヌクレオチド配列の挿入を含むことを特徴とする組換えバクテリオファージバンク。
【請求項１４】
各種コピーをバクテリオファージに含む前記遺伝子が標的蛋白質ＧＰ１２をコードすることを特徴とする請求項１３に記載のバクテリオファージバンク。
【請求項１５】
組換えバクテリオファージバンクであって、前記バンクを構成するバクテリオファージが標的蛋白質をコードする種々の遺伝子の各種コピーを含み、前記遺伝子がランダムに作製されたオリゴヌクレオチド配列の挿入を含むことを特徴とする組換えバクテリオファージバンク。
【請求項１６】
前記標的蛋白質がＧＰ１２、ＧＰ３６、ＧＰ３７、ＧＰ３８又はその相同物である蛋白質から選択されることを特徴とする請求項１２又は１５に記載の組換えバクテリオファージバンク。
【請求項１７】
標的蛋白質をコードする前記遺伝子が同時に改変されていることを特徴とする請求項１２、１５又は１６のいずれか一項に記載の組換えバクテリオファージバンク。
【請求項１８】
同一バクテリオファージの少なくとも１０３個、好ましくは少なくとも１０５個、より好ましくは少なくとも１０８個の変異体を含み、前記変異体はその標的蛋白質の少なくとも１個の配列が相違することを特徴とする請求項１２から１６のいずれか一項に記載のバクテリオファージバンク。
【請求項１９】
バクテリオファージの標的蛋白質をコードする遺伝子を改変するためのＤＮＡ構築物であって、標的蛋白質をコードする前記遺伝子の全部又は一部のランダムに突然変異させたコピーに対応するインサートを含むことを特徴とする前記ＤＮＡ構築物。
【請求項２０】
５’及び３’末端を２個のセグメントＦ１及びＦ２により規定され、一致度を保存した少なくともＮ個の内部セグメントＤ１からＤＮ（ここで、Ｎは１以上の整数である。）を含む前記インサートが、
ｉ）ランダムに突然変異を導入しながら前記インサートの配列を増幅するように、それぞれセグメントＦ１及びＦ２のセンス及びアンチセンスプライマーである少なくとも２個のプライマーを使用して前記インサートの配列の全長にエラープローンＰＣＲを実施する段階；
ｉｉ）前記インサートのランダムに突然変異させたコピーに対応する得られた増幅産物を精製する段階；
ｉｉｉ）それぞれセンスプライマーとアンチセンスプライマーの対として少なくとも
−前記インサートの突然変異コピーの少なくともＦ１−ＤＮ領域を増幅するために、Ｆ１に対応するセンスプライマーと、ＤＮのアンチセンスプライマーと、
−Ｓの突然変異コピーの少なくともＤＮ−Ｆ２配列を増幅するために、ＤＮに対応するセンスプライマーと、Ｆ２のアンチセンスプライマー
を使用することにより、段階ｉｉ）で精製した増幅産物から出発して高忠実度ＰＣＲを実施する段階；
ｉｖ）段階ｉ）で突然変異させた前記インサートのうちでセグメントＤの配列がその一致度を保存しているセグメントＦ１−ＤＮ及びＤＮ−Ｆ２のコピーから構成される段階ｉｉｉ）で得られた増幅産物を精製する段階；
ｖ）Ｆ１及びＦ２の少なくとも１対のセンスプライマーとアンチセンスプライマーを使用することにより、段階ｉｖ）で得られた増幅産物から出発して高忠実度ＰＣＲを実施する段階；
ｖｉ）前記インサートのランダムに突然変異させたヌクレオチド配列のうちで少なくともセグメントＤＮの配列がその一致度を保存しているものに対応する段階ｖ）で得られたＰＣＲ産物を精製する段階
を含む方法を使用してＰＣＲにより得られることを特徴とする請求項１９に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２１】
請求項１９又は２０に記載のＤＮＡ構築物であって、
−宿主細菌における前記構築物の複製を可能にする領域
を更に含むことを特徴とするＤＮＡ構築物。
【請求項２２】
請求項１９から２１のいずれか一項に記載の複数のＤＮＡ構築物により形質転換された細菌から構成される宿主細菌バンク。
【請求項２３】
既知又は未知一致度の細胞を標的とすることが可能な遺伝子改変型バクテリオファージの選択方法であって、
ｉ）請求項１から１１のいずれか一項の方法に従って得られた遺伝子改変型バクテリオファージを既知又は未知一致度の細胞と接触させる段階と；
ｉｉ）前記既知又は未知一致度の細胞と接触させた組換えバクテリオファージのうちで前記細胞に感染することが可能な少なくとも１種の組換えバクテリオファージを選択する段階を含むことを特徴とする前記方法。
【請求項２４】
請求項１２から１８のいずれか一項に記載のバクテリオファージバンクを利用することを特徴とする非治療的殺菌方法。
【請求項２５】
治療剤としての請求項１１から１６のいずれか一項に記載のバクテリオファージバンク。
【請求項２６】
細菌感染症の防除又は予防用医薬の製造のための、請求項１２から１８のいずれか一項に記載の組換えバクテリオファージバンク又は請求項２３の方法に従って選択された少なくとも１種のバクテリオファージの使用。
【請求項２７】
既知又は未知細菌の参照用バクテリオファージを取得するための、請求項１２から１８のいずれか一項に記載の組換えバクテリオファージバンク又は請求項２３の方法に従って選択された少なくとも１種のバクテリオファージの使用。
【請求項２８】
細菌のインビトロ検出及び／又は同定用としての請求項１２から１８のいずれか一項に記載のバクテリオファージバンクの使用。
【請求項２９】
感染のインビトロ診断用としての請求項１１から１６のいずれか一項に記載のバクテリオファージバンクの使用。
【請求項３０】
請求項２３の方法に従って選択された少なくとも１種のバクテリオファージを含有する医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【公表番号】特表２０１０−５１２７７４（Ｐ２０１０−５１２７７４Ａ）
【公表日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４２１３３（Ｐ２００９−５４２１３３）
【出願日】平成１９年１２月１８日（２００７．１２．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００７／００２１０１
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０９３００９
【国際公開日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【出願人】（５０９１７４５９８）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月１８日（２００７．１２．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００７／００２１０１
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０９３００９
【国際公開日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【出願人】（５０９１７４５９８）
【Ｆターム（参考）】
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